CN105018507B - 一种用于双表位展示的噬菌体载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于双表位展示的噬菌体载体及其构建方法。本发明所提供的用于双表位展示的噬菌体载体，为含有源自丝状噬菌体的用于展示外源肽的pⅢ蛋白和pⅧ蛋白的编码基因的环形载体。本发明首次将噬菌体pⅢ展示系统和pⅧ展示系统整合到一起，形成了噬菌体pⅢ和pⅧ双表位展示系统，可以在同一噬菌体的pⅢ蛋白和pⅧ蛋白上展示不同的外源多肽，从而丰富了噬菌体展示系统的种类，并为其生物学和医学应用提供了新的工具和方法。

Description

一种用于双表位展示的噬菌体载体及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种用于双表位展示的噬菌体载体及其构建方法。

背景技术

噬菌体展示技术就是指以噬菌体为载体，将外源基因插入到噬菌体的基因组中，并伴随着噬菌体基因组的表达而表达，在噬菌体自我组装时，外源基因所表达的蛋白或多肽作为外壳蛋白的一部分，以融合蛋白的形式被展示到噬菌体的表面。

自1985年Gorge P.Smith首次提出噬菌体展示以来，噬菌体展示技术已经得到了广泛应用，并形成了多种噬菌体展示系统，包括pⅢ展示系统、pⅧ展示系统和pⅥ展示系统等。pⅢ蛋白是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，由于pⅢ蛋白的拷贝数较少，所以特异性较强，在文库筛选时就能得到亲和力较高的多肽或噬菌体。而pⅧ蛋白是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体背部，约有2700个左右的拷贝，能够大量展示外源多肽，但是不能展示过长的片段，否则会影响噬菌体的组装。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于双表位展示的噬菌体载体。

本发明所提供的用于双表位展示的噬菌体载体，为含有源自丝状噬菌体的用于展示外源肽1的pⅢ蛋白和用于展示外源肽2的pⅧ蛋白的编码基因的环形载体。

其中，所述外源肽1和所述外源肽2既可为不同外源肽，也可为相同外源肽。

在本发明中，所述pⅢ蛋白的编码基因源自噬菌体载体fUSE55；所述pⅧ蛋白的编码基因源自噬菌体载体f88-4。

进一步，所述pⅢ蛋白的编码基因为序列表中序列1的第1589-2876位；所述p Ⅷ蛋白的编码基因为序列表中序列1的第5771-6001位。

更加具体的，本发明所提供的所述用于双表位展示的噬菌体载体的序列为序列表中序列1。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述用于双表位展示的噬菌体载体的方法。

本发明所提供的制备所述用于双表位展示的噬菌体载体的方法，具体可包括如下步骤：

（1）以噬菌体载体f88-4为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增，得到PCR产物（含有用于展示外源肽的pⅧ蛋白的编码基因）；

所述引物1为根据所述噬菌体载体f88-4上酶切位点Msc I上游的序列设计的正向引物；所述引物2为根据所述菌体载体f88-4上酶切位点Sac II下游的序列设计的反向引物；

（2）用限制性内切酶Msc I和Sac II双酶切步骤（1）所得PCR产物，将酶切产物胶回收后与经过限制性内切酶Msc I和Sac II双酶切的噬菌体载体fUSE55的骨架片段相连，得到所述用于双表位展示的噬菌体载体。

更加具体的，在本发明中，所述引物1为序列表中序列2所示单链DNA分子；所述引物2为序列表中序列3所示单链DNA分子。

所述用于双表位展示的噬菌体载体在展示两种不同外源肽中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，所述两种不同外源肽分别直接融合于所述pⅢ蛋白的氨基末端以及所述pⅧ蛋白的氨基末端。

本发明的又一个目的是提供一种利用所述用于双表位展示的噬菌体载体展示两种不同外源肽的方法。

本发明所提供的利用所述用于双表位展示的噬菌体载体展示两种不同外源肽的方法，具体可包括如下步骤：

（a）将所述两种不同外源肽的编码基因分别插入到所述pⅢ蛋白的编码基因的两个酶切位点Bgl I之间，以及所述pⅧ蛋白的编码基因的酶切位点Pst I和Hind III之间，得到重组噬菌体载体；

（b）利用步骤（a）得到的所述重组噬菌体载体包装得到重组噬菌体；所述重组噬菌体上展示所述两种不同外源肽，且所述两种不同外源肽分别直接融合于所述pⅢ蛋白的氨基末端以及所述pⅧ蛋白的氨基末端。

在本发明中，以上所有的所述外源肽（即所述外源肽1和/或所述外源肽2）均可为金纳米颗粒结合多肽GBP和/或P53结合蛋白多肽PBP。

所述金纳米颗粒结合多肽GBP的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述P53结合蛋白多肽PBP的氨基酸序列如序列表中序列5所示。在基因水平上，所述金纳米颗粒结合多肽GBP的编码基因如序列表中序列6的第6-29位所示；所述P53结合蛋白多肽PBP的编码基因如序列表中序列7的第3-47位所示。

利用所述方法制备得到的重组噬菌体也属于本发明的保护范围。

本发明首次将噬菌体pⅢ展示系统和pⅧ展示系统整合到一起，形成了噬菌体p Ⅲ和pⅧ双表位展示系统，可以在同一噬菌体的pⅢ蛋白和pⅧ蛋白上展示不同的外源多肽，从而丰富了噬菌体展示系统的种类，并为其生物学和医学应用提供了新的工具和方法。

附图说明

图1为噬菌体载体f88-4和噬菌体载体fUSE55的图谱。其中，A为噬菌体载体f88-4；B为噬菌体载体fUSE55。

图2为引物f88s和f88a在噬菌体载体f88-4上的位置，以及酶切位点Msc Ⅰ和SacⅡ的位置。

图3为以噬菌体载体f88-4为模板，用引物f88a和f88s进行PCR扩增的结果。1，Marker DL2000；2，3：PCR产物。

图4为噬菌体载体fUSE55的Msc I和Sac II双酶切电泳图。1，marker，Trans2000；2，未经酶切的噬菌体载体fUSE55；3，Msc I单酶切验证；4，Sac II单酶切验证；5，Msc I和Sac II双酶切。

图5为实施例1构建得到的用于双表位展示的噬菌体载体的图谱。

图6为重组噬菌体的SDS-PAGE电泳结果。1，重组噬菌体；2，野生型噬菌体。

图7为重组噬菌体的Western Blot检测结果。1，重组噬菌体；2，野生型噬菌体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

噬菌体载体f88-4（A filamentous phage vector called f88-4）：记载于“Zhong,G.,Smith,G.P.,Berry,J.,Brunham,R.C.,Conformational mimicry of achlamydial neutralization epitope on filamentous phage.J Biol Chem1994,269(39),24183-24188.”一文中，由George P.Smith实验室捐赠。噬菌体载体f88-4由野生型噬菌体（fd丝状噬菌体）衍生而来，用于噬菌体的pⅧ展示，其噬菌体基因组全长为9234bp，含有两种pⅧ蛋白编码基因，一种是野生型，一种是重组型（见图1），所以其表达的噬菌体pⅧ蛋白是杂合的，重组型的pⅧ蛋白上用于展示外源多肽。

噬菌体载体fUSE55（The fUSE5vector）：记载于“Scott,J.K.;Smith,G.P.,Searching for peptide ligands with an epitope library.Science1990,249(4967),386-390.”一文中，由George P.Smith实验室捐赠。噬菌体载体fUSE55由野生型噬菌体（fd丝状噬菌体）衍生而来，用于噬菌体的pⅢ展示，其噬菌体基因组全长为9206bp，只含有一种重组型pⅢ蛋白编码基因（见图1），其表达的每个噬菌体pⅢ蛋白上都会展示有外源多肽。

野生型噬菌体（fd丝状噬菌体）：记载于“Allan N.Zacher III,Carolyn A.Stock,James W.Golden II,et al.A new filamentous phage cloning vector:fd-tet.Gene,9(1980)127-140.”一文中。

大肠杆菌JM109：NEB公司产品，其产品目录号为E4107S。

实施例1、用于双表位展示的噬菌体载体的构建

本实施例拟将噬菌体载体f88-4上的重组型pⅧ蛋白的编码基因（记为rgⅧ基因）剪切下来，插入到噬菌体载体fUSE55上，从而构建用于双表位展示的噬菌体载体。

设计思路：在噬菌体载体f88-4上，于rgⅧ基因的两端分别找到一个专一的限制性酶切位点，这两个限制性酶切位点不但要能将rgⅧ基因剪切下来，而且保证在噬菌体载体fUSE55只有相应的单一位点，不会将噬菌体载体fUSE55的其它结构或功能元件切断。通过分析发现噬菌体f88-4基因组中含有很多个不同的限制性内切酶酶切位点，但是满足上述条件的只有Msc Ⅰ和Sac Ⅱ限制性内切酶。所以，本发明的发明人决定采用这两种限制性内切酶进行载体的构建。

一、引物的设计

根据噬菌体载体f88-4上酶切位点Msc I上游的序列设计的正向引物f88s；根据所述菌体载体f88-4上酶切位点Sac II下游的序列设计的反向引物f88a（图2）。序列如下：

f88s（序列2）：5’-CGCTTTCAGGTCAGAAGGGTT-3’（序列1的第5073-5093位）；

f88a（序列3）：5’-CAAGTGCTTAGTTATTTCGTC-3’（序列1的第6303-6323位的反向互补序列）。

二、用于双表位展示的噬菌体载体的构建

1、PCR扩增

以噬菌体载体f88-4为模板，采用引物f88s和f88a进行PCR扩增，得到含有用于展示外源肽的重组型pⅧ蛋白的编码基因（rgⅧ基因）的PCR产物。

PCR反应体系（20μl）：Taq酶10μl；模版（1ng/μl）1μl；引物f88a（10μM）1μl；引物f88s（10μM）1μl；无菌水7μl。

PCR反应程序：94℃预变性8min；94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；72℃后延伸8min。

反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图3所示，所得PCR产物大小约为1251bp，与预期结果一致。将PCR扩增所得目的片段记为f88as片段。

2、酶切f88as片段

将步骤1得到的f88as片段进行双酶切，所用限制性内切酶为Msc Ⅰ和Sac Ⅱ。37℃酶切反应2h后，跑琼脂糖凝胶电泳，进行胶回收纯化酶切产物，并将其作为目的片段。

酶切反应体系（20μl）：限制性内切酶Msc Ⅰ1μl；限制性内切酶Sac Ⅱ1μl；f88as片段≤1μg；无菌水补足到20μl。

3、酶切噬菌体载体fUSE55

利用限制性内切酶为Msc Ⅰ和Sac Ⅱ双酶切噬菌体载体fUSE55，回收纯化酶切产物（记为f55），作为下一步实验的载体。酶切体系参照步骤2。同时设置用Msc Ⅰ和Sac Ⅱ分别进行单酶切的对照。酶切结果如图4所示。

4、连接

利用T4连接酶，将步骤2获得目的片段f88as与步骤3获得的酶切产物f55进行16℃过夜连接。

连接体系（10μl）：T4连接酶1μl；T4连接缓冲液2μl；载体大片段f550.03pmol；目的片段f88as0.3pmol；无菌水补足到10μl。

5、转化

将步骤4所得连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，涂平板37℃过夜培养。

6、挑取单克隆鉴定

挑取单克隆，培养后进行PCR验证，采用引物为f88s和f88a（序列同上）。将PCR初步鉴定正确（目的条带大小约为1251bp）的载体送样测序。

将经测序表明在噬菌体载体fUSE55的酶切位点Msc Ⅰ和Sac Ⅱ之间插入序列表中序列1的第5109-6166位所示DNA片段的重组载体即为用于双表位展示的噬菌体载体（载体图谱如图5所示）。

进一步，对所得用于双表位展示的噬菌体载体进行全序列测定，为序列表中序列1。其中，第1301-1522位为野生型pⅧ蛋白的编码序列，第1589-2876位为pⅢ蛋白的编码序列，第5771-6001位为重组型pⅧ蛋白的编码序列。

对比例：直接酶切构建用于双表位展示的噬菌体载体

思路：用限制性内切酶Msc Ⅰ和Sac Ⅱ直接双酶切噬菌体载体f88-4，将重组型pⅧ蛋白的编码基因（rgⅧ基因）剪切下来，插入到噬菌体载体fUSE55的相应酶切位点，得到用于双表位展示的噬菌体载体。

但是，由于噬菌体载体f88-4的复杂性，进行Msc Ⅰ和Sac Ⅱ双酶切后，通过胶回收得到的酶切产物浓度过低，不能用于下一步实验。直接酶切法构建失败。

实施例2、实施例1构建得到的用于双表位展示的噬菌体载体的应用实例

本实施例通过常规分子克隆方法，将金纳米颗粒结合多肽GBP（氨基酸序列如序列表中序列4所示）和P53蛋白结合多肽PBP（氨基酸序列如序列表中序列5所示），分别展示在实施例1构建得到的用于双表位展示的噬菌体载体的重组型pⅧ蛋白和p Ⅲ蛋白上，并对展示效果进行检测。具体如下：

一、重组噬菌体载体的构建

利用商业生物公司的DNA合成仪进行金纳米颗粒结合多肽GBP的基因片段的合成，即合成如下两个互补的DNA片段，并于沸水浴5min条件下使其互补结合成具有粘性末端的双链DNA（记为DNA片段GBP）。

GBP-F：5’-AGCTTTGCCGTCTCGGGCTCGTCCCCAGATTCAGCTGCA-3’；

GBP-R：5’-GCTGAATCTGGGGACGAGCCCGAGACGGCAA-3’。

将所得DNA片段GBP与经过Pst Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的实施例1构建得到的用于双表位展示的噬菌体载体的骨架大片段相连，得到中间载体。

利用商业生物公司的DNA合成仪进行P53蛋白结合多肽PBP的基因片段的合成，即合成如下两个互补的DNA片段，并于沸水浴5min条件下使其互补结合成具有粘性末端的双链DNA（记为DNA片段PBP）。

PBP-F：5’-GAGCGCTCACGCACTTCTCGTCCCCGTTCACGAACAATCACTCGTTCGCTG-3’；

PBP-R：5’-CGAACGAGTGATTGTTCGTGAACGGGGACGAGAAGTGCGTGAGCGCTCCGT-3’。

将所得DNA片段PBP与经过Bgl I酶切的中间载体的骨架大片段相连，得到重组载体。

对所得重组载体进行序列测定。经测序表明在实施例1构建得到的用于双表位展示的噬菌体载体的两个酶切位点Bgl I之间插入序列7所示DNA片段，且同时在酶切位点PstI和Hind Ⅲ之间插入序列6所示DNA片段的重组载体为阳性，即为重组噬菌体载体。

二、噬菌体包装及外源肽展示

1、重组噬菌体包装

将测序成功的阳性重组噬菌体载体克隆接种到5ml含四环素抗性的LB液体培养基中，过夜培养。第二天，将培养液转移到500ml LB液体培养基中进行噬菌体扩增培养24h后，10000rpm，4℃离心30min，收集上清。加入1/6体积的16.7%的PEG/NaCl（配方：溶剂为水，溶质及其浓度为16.7g/100ml PEG8000，3.3M NaCl），4℃静止过夜。然后，12000rpm，4℃离心20min，收集沉淀。继续，加入1ml无菌水进行悬浮后，12000rpm，4℃离心5min，去除杂质，并将上清转移到新的EP管中。再次加入1/6体积的16.7%的PEG/NaCl（配方同上），室温静止1h。最后，12000rpm，4℃离心20min，加入适当体积的无菌水或PBS缓冲液悬浮，即得到重组噬菌体。可通过分光光度计测定噬菌体的浓度。

2、外源肽展示情况检测

（1）rpⅧ检测

将步骤1制备的重组噬菌体和野生型噬菌体（fd丝状噬菌体）分别稀释后，加入等体积的上样缓冲液（配方：4%(w/v)SDS，20%(v/v)甘油，100mM Tris-HCl，0.2%(w/v)溴酚蓝），沸水浴5min，跑SDS-PAGE。

SDS-PAGE电泳结果如图6所示，由图可见，与野生型噬菌体相比，重组噬菌体样品得到了比野生型噬菌体pⅧ蛋白（大约5KD）略大一些的rpⅧ蛋白（重组型pⅧ蛋白与金纳米颗粒结合多肽形成的融合蛋白）。

（2）rpⅢ检测

将步骤1制备的重组噬菌体或野生型噬菌体（fd丝状噬菌体）跑SDS-PAGE后，转到硝酸纤维素膜上，丽春红染色5-10min后，流水冲洗至出现蛋白条带。用PBST（配方：含0.05%（v/v）tween-20的PBS溶液）冲洗两次后，加入封闭液（含5%（w/v）脱脂奶粉的PBST溶液）4℃过夜。第二天，加入P53蛋白（GenBank号：CAA42635.1）溶液，37℃反应1h。PBST冲洗3次，每次5-10min。接着加入小鼠抗P53单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology公司产品，其产品目录号为sc-47698），室温反应45min。同上冲洗。然后，加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗（北京康为生物科技有限公司产品，其产品目录号为CW0102），室温反应45min。同上冲洗。最后，将膜放入AEC显色液（配方：ACE2mg，二甲基甲酰胺250μl，0.05M乙酸钠5ml，30%双氧水2μl）中，显色5min后，用超纯水冲洗以终止显色反应。

Western Blot结果如图7所示，由图可见，重组噬菌体样品能与P53蛋白结合，并在大约42KD处出现了明显条带，而野生噬菌体没有此条带，证明P53蛋白结合多肽已经成功展示在噬菌体的pⅢ部位。

以上结果证明实施例1构建得到的用于双表位展示的噬菌体载体可成功同时展示两种外源肽。

Claims (9)

1.用于双表位展示的噬菌体载体，为含有源自丝状噬菌体的用于展示外源肽1的pⅢ蛋白和用于展示外源肽2的pⅧ蛋白的编码基因的环形载体；

所述pⅢ蛋白的编码基因源自噬菌体载体fUSE55；所述pⅧ蛋白的编码基因源自噬菌体载体f88-4；

所述用于双表位展示的噬菌体载体，是按照包括如下步骤的方法制备获得的：

(1)以噬菌体载体f88-4为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增，得到PCR产物；

所述引物1为根据所述噬菌体载体f88-4上酶切位点MscI上游的序列设计的正向引物；所述引物2为根据所述菌体载体f88-4上酶切位点SacII下游的序列设计的反向引物；

(2)用限制性内切酶MscI和SacII双酶切步骤(1)所得PCR产物，将酶切产物胶回收后与经过限制性内切酶MscI和SacII双酶切的噬菌体载体fUSE55的骨架片段相连，得到所述用于双表位展示的噬菌体载体。

2.根据权利要求1所述的用于双表位展示的噬菌体载体，其特征在于：所述pⅢ蛋白的编码基因为序列表中序列1的第1589-2876位；所述pⅧ蛋白的编码基因为序列表中序列1的第5771-6001位。

3.根据权利要求1或2所述的用于双表位展示的噬菌体载体，其特征在于：所述用于双表位展示的噬菌体载体的序列为序列表中序列1。

4.制备权利要求1-3中任一所述的用于双表位展示的噬菌体载体的方法，包括如下步骤：

(1)以噬菌体载体f88-4为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增，得到PCR产物；

所述引物1为根据所述噬菌体载体f88-4上酶切位点MscI上游的序列设计的正向引物；所述引物2为根据所述菌体载体f88-4上酶切位点SacII下游的序列设计的反向引物；

(2)用限制性内切酶MscI和SacII双酶切步骤(1)所得PCR产物，将酶切产物胶回收后与经过限制性内切酶MscI和SacII双酶切的噬菌体载体fUSE55的骨架片段相连，得到所述用于双表位展示的噬菌体载体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述引物1为序列表中序列2所示单链DNA分子；所述引物2为序列表中序列3所示单链DNA分子。

6.权利要求1-3中任一所述的用于双表位展示的噬菌体载体在展示两种不同外源肽中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用中，所述两种不同外源肽分别直接融合于权利要求1或2中所述的pⅢ蛋白的氨基末端以及权利要求1或2中所述的pⅧ蛋白的氨基末端。

8.利用权利要求1-3中任一所述的用于双表位展示的噬菌体载体展示两种不同外源肽的方法，包括如下步骤：

(a)将所述两种不同外源肽的编码基因分别插入到权利要求1或2中所述的pⅢ蛋白的编码基因的两个酶切位点BglI之间，以及权利要求1或2中所述的pⅧ蛋白的编码基因的酶切位点PstI和Hind III之间，得到重组噬菌体载体；

(b)利用步骤(a)得到的所述重组噬菌体载体包装得到重组噬菌体；所述重组噬菌体上展示所述两种不同外源肽。

9.利用权利要求8所述的方法制备得到的重组噬菌体。