JP6987076B2 - クローニング及びタンパク質発現のためのベクター、その方法、並びにその用途 - Google Patents

Description

本開示は、バイオテクノロジー、遺伝子工学、及び免疫学の分野に関する。特に、本開示は、遺伝物質をクローニングして発現するベクター、及び前記ベクターを生成する方法に関する。以下に限定されないが、天然に存在する抗体遺伝子若しくはその一部、人工的に設計された合成抗体遺伝子若しくはその一部、又は双方の組合せから得られる遺伝物質が挙げられるあらゆる遺伝物質が、本開示のベクターを用いるクローニング及び発現に使用され得る。

細胞表面ディスプレイは、典型的には細胞膜関連タンパク質又はそのサブユニットであるキャリアタンパク質に標的タンパク質を融合させることによって、標的タンパク質を細胞外部上に発現させる技術である。表面ディスプレイ技術は、タンパク質工学、directed evolution、及び創薬のためのライブラリースクリーニングツールとして使用される。しかしながら、前記ディスプレイ技術は、それ自体の利点及び欠点を伴う。

例えば、リボソームディスプレイ法は、RNA及びリボソーム複合体の相対的な不安定性に起因して、技術的により困難である。この技術の別の限界は、単鎖タンパク質、例えばScFvをディスプレイすることができないことである。細胞内選択法、例えば酵母ツーハイブリッドシステム又はタンパク質相補性アッセイは、標的タンパク質の細胞内発現に直接依拠している。しかしながら、それらには、細胞内シナリオにおいて凝集する性質、低い細胞半減期が挙げられるいくつかの制限が付随し、最も重要なことに、システム全体が、スクリーニングが意図される抗原の型に応じて、特定の用途のために調整される必要がある。更に、ファージディスプレイは広く受け入れられている方法であるが、原核生物の発現システムであること、及びディスプレイされたタンパク質の翻訳後修飾の欠如のために適切なタンパク質のフォールディングに限界がある。当該限界を克服するために、酵母ディスプレイプラットフォーム、真核生物ディスプレイシステムが使用され得る。しかしながら、酵母ディスプレイシステムにおける、また同様に他の全真核生物細胞表面システムの場合における主な困難は、形質転換効率が限られるため、達成され得るライブラリーサイズに限界があり、プロセス全体の効率が下がることである。

抗原に対するスクリーニングに関して、タンパク質/抗体ライブラリーの成功の鍵は、数ある因子の中でも、ライブラリーの多様性及び機能サイズ、並びに分泌効率、処理効率、及び翻訳後効率を損なわずに、莫大なサイズを独立して表示することにある。この点に関して、ディスプレイシステム、例えばファージディスプレイプラットフォーム及び/又は酵母ディスプレイプラットフォームのフレキシビリティが、そのような目的を達成するための絶対的必須基準である。ディスプレイシステムのフレキシビリティは、用いられることになる発現ベクターの種類、及びそれらの間に適合性が存在するか次第である。更に、ベクターの適合性及び相補性は、コンビナトリアルアプローチ又はバッチトランスファーアプローチを介した、ファージから酵母ディスプレイシステムへ多様性をトランスファーすることを意味する。前記適合性及び相補性の特徴は、ファージディスプレイシステム及び酵母ディスプレイシステムの現在使用されている合成構築体/ベクターにおいて欠如している。

本開示は、現行の技術の先の制限に対応することに関し、したがって、コンビナトリアルプロセスを介して、大きくて多様なタンパク質遺伝子ライブラリーを収容してcross-transferすることによって、多様な親和性及び特異性を有するタンパク質を同定し、トランスファーし、保存し、かつ生成する潜在性を向上させるベクターを提供することを目的とする。

この節は、独立請求項のコピーを含有する。
本開示は、抗体又はそのフラグメントをクローニングするように設計されたベクター構築体に関し、前記ベクター構築体は、
少なくとも1つのリーダー配列、
生物学的に活性なリガンドに選択的に結合するペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を受け入れるための少なくとも1つのクローニング領域、
定常領域免疫グロブリン重鎖若しくは定常領域免疫グロブリン軽鎖又はそれらのフラグメントをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列であって、前記定常領域は、天然の免疫グロブリンの定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、少なくとも1つのヌクレオチド配列、及び
少なくとも1つの組換えタグ配列又は選択コード核酸配列
を含む発現カセットを含有し、
発現カセットの少なくとも1つのクローニング領域は、NdeI、BglII、BmtI、HindIII、AscI、NcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含有し;
請求項1において特許請求されるベクター構築体に由来の、抗体若しくはそのフラグメントをクローニングするように、又は抗体若しくはそのフラグメントをトランスファーし、若しくは受け入れるように設計されたベクター構築体に関し、前記ベクター構築体は、
プロモーター配列、
リーダー配列、
タンパク質発現システムの表面上でのペプチド又はタンパク質のディスプレイを可能にする生成物をコードするヌクレオチド配列、
第1の酵素切断部位、
第1の組換えタグ配列又は選択コード核酸配列、
第1のリンカー配列、
第2の酵素切断部位、
第2のリンカー配列の存在下で第2のクローニング領域に作動可能に連結されている第1のクローニング領域であって、両クローニング領域は、生物学的に活性なリガンドに選択的に結合するペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を受け入れる、第1のクローニング領域、
第2の組換えタグ配列又は選択コード核酸配列、及び
ターミネーター配列、
を含む発現カセットを含有し、
発現カセットの第1のクローニング領域又は第2のクローニング領域は、NdeI、BglII、HindIII、AscI、NcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含有し;
先に記載されるベクター構築体を調製する方法に関し、前記方法は、a)発現カセットの合成の工程、b)デスティネーションベクターの線状化の工程、及びc)ベクター構築体を得るために、線状化デスティネーションベクター中に発現カセットを挿入する工程含み;
ベクター構築体のライブラリーを調製する方法に関し、前記方法は、a)先に記載される方法によってベクター構築体を調製する工程、b)免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)、若しくはそれらのフラグメント、免疫グロブリン重鎖の可変領域若しくはそのフラグメント(VH)、及びそれらの組合せを含む群から選択される領域をコードするヌクレオチド配列を、ベクター構築体のクローニング領域中にクローニングして、ライブラリーを得、又は免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)、若しくはそれらのフラグメント、免疫グロブリン重鎖の可変領域若しくはそのフラグメント(VH)、及びそれらの組合せを含む群から選択される領域をコードするヌクレオチド配列を、1つのベクター構築体のクローニング領域から、別のベクター構築体のクローニング領域にトランスファーして、ライブラリーを得る工程を含み;
所望される機能特性を有する抗体又はそのフラグメントをスクリーニングし、かつ同定する方法であって、(a)先に記載される方法によってベクター構築体のライブラリーを調製して、前記ベクター構築体を細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、又はそれらの組合せ中に形質転換する工程、及び(b)所望される機能特性を有する抗体又はそのフラグメントを発現する細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を選択する工程を含む方法に関し;
先に記載されるベクター構築体を含む細菌宿主細胞若しくは酵母宿主細胞に、又はそのファージライブラリー若しくは酵母ライブラリーに関し;
先に記載されるベクター構築体によって提供される発現カセットに関し、前記発現カセットは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、及び配列番号25を含む群から選択される核酸配列を有する。

本開示の特徴は、添付の図と併せて記載する以下の説明から完全に明らかとなろう。図は、本開示に従ういくつかの実施形態を表すだけであり、その範囲を限定すると考慮されるべきでないことが理解される。本開示を、添付の図を用いて更に説明することとする。

図1は、pADL23cベクターの修飾を示す図である。複数の制限酵素認識部位及び骨格配列を修飾しており、修飾-1、修飾-2、修飾-3、修飾-4と記載した。 図2は、pZB001-カッパ軽鎖定常領域を有するファージミドベクターの生成を示す図である。図2A:重鎖CH1ドメイン及びカッパ定常軽鎖(CK)ドメインを含有する、設計した挿入/発現カセットの概略図。 図2B:BamHI酵素及びEcoRI酵素を用いた、pZB001構築体由来の独立したクローンの分析。 図2C:HindIII酵素及びNcoI酵素を用いた、pZB001構築体由来の独立したクローンの分析。 図2D:可変抗体重鎖及び抗体軽鎖(カッパ)を各クローニングサイト中に含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計した挿入/発現カセットを含むpZB001ベクターの概略図。 図3は、pZB001.1-ラムダ軽鎖定常領域を有するファージミドベクターの生成を示す図である。図3A:重鎖CH1ドメイン及びラムダ定常軽鎖(CL)ドメインを含有する、設計した挿入/発現カセットの概略図。 図3B:PvuII酵素を用いた、pZB001.1構築体由来の独立したクローンの分析。 図3C:NcoI酵素及びHindIII酵素を用いた、pZB001.1構築体由来の独立したクローンの分析。 図3D:可変抗体重鎖及び抗体軽鎖(ラムダ)を各クローニングサイト中に含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計した挿入/発現カセットを含むpZB001.1ベクター構築体の概略図。 図4は、pRS314ベクターの修飾を示す図である。複数の制限酵素認識部位を、図に記載するように修飾した。 図5は、pZB004-抗体カッパ軽鎖定常領域を有する酵母双方向性ベクターの生成を示す図である。図5A:重鎖CH1ドメイン及びカッパ軽鎖(CK)定常ドメインを含有する、設計した挿入/発現カセットの概略図。 図5B:PvuII酵素を用いた、pZB004構築体由来の独立したクローンの分析。 図5C:EcoRV酵素及びKpnI酵素を用いた、pZB004構築体由来の独立したクローンの分析。 図5D:NdeI酵素及びKpnI酵素を用いた、pZB004構築体由来の独立したクローンの分析。 図5E:抗体可変重鎖及び抗体軽鎖(カッパ)を各クローニングサイト中に含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計したpZB004構築体の概略図。 図6は、pZB004.1-抗体ラムダ軽鎖定常領域を有する酵母双方向性ベクターの生成を示す図である。図6A:重鎖CH1ドメイン及びラムダ軽鎖CLドメインを含有する、設計した挿入/発現カセットの概略図。 図6B:PvuII酵素、NdeI酵素、及びNotI酵素、並びにNcoI酵素及びAscI酵素をそれぞれ組み合わせて用いた、pZB004.1構築体由来の独立したクローンの分析。 図6C:抗体可変重鎖及び軽鎖(ラムダ)を各クローニングサイト中に含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計したpZB004.1構築体の概略図。 図7は、pZB004.2-抗体カッパ軽鎖定常領域を有する酵母片方向性ベクターの生成を示す図である。図7A:重鎖CH1ドメイン及びカッパ軽鎖CKドメインを含有する、設計した挿入物の概略図。 図7B:HindIII酵素、SpeI酵素、及びSacII酵素をそれぞれ組み合わせて用いた、pZB004.2構築体由来の独立したクローンの分析。 図7C:抗体可変重鎖及び軽鎖(カッパ)を各クローニングサイト中に含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計したpZB004.2ベクター構築体の概略図。 図8は、pZB004.3-抗体ラムダ軽鎖定常領域を有する酵母片方向性ベクターの生成を示す図である。図8A:重鎖CH1ドメイン及びラムダ軽鎖CLドメインを含有する、設計した挿入/発現カセットの概略図。 図8B:HindIII酵素、SpeI酵素、及びSacII酵素をそれぞれ組み合わせて用いた、pZB004.3構築体由来の独立したクローンの分析。 図8C:抗体可変重鎖及び軽鎖(ラムダ)を各クローニングサイト中に含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計したpZB004.3ベクター構築体の概略図。 図9は、pRS314ベクターの修飾を示す図である。複数の制限酵素認識部位を、図に記載するように修飾した。 図10は、pZB004.4-酵母scFvベクターの生成を示す。図10A:抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメイン用のクローニング領域(それぞれMCS I及びMCS II)を含有する、設計した挿入/発現カセットの概略図。 図10B:EcoRV酵素及びXhoI酵素を用いた、pZB004.4構築体由来の独立したクローンの分析。 図10C:抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を各クローニングサイトに含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計したpZB004.4ベクター構築体の概略図。 図11は、p414GAL1ベクターの修飾を示す図である。複数の制限酵素認識部位を、図に記載するように修飾した。 図12は、重鎖定常領域を有するpZB002構築体酵母接合ベクターの生成を示す図である。図12A:重鎖CH1ドメインを含有する、設計した挿入物の概略図。 図12B:SpeI-HF酵素及びXhoI酵素を用いた、pZB002構築体由来の独立したクローンの分析。 図12C:抗体重鎖を各クローニングサイト中に含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計したpZB002構築体の概略図。 図13は、p416 GAL1ベクターの修飾を示す図である。複数の制限酵素認識部位を、図に記載するように修飾した。 図14は、軽鎖ラムダ定常領域を有するpZB003.1構築体酵母接合ベクターの生成を示す図である。図14A:SS01シグナル配列を有するラムダ軽鎖CLドメインを含有する、設計した挿入物の概略図。 図14B:SpeI-HF酵素及びXhoI酵素を用いた、pZB003.1構築体由来の独立したクローンの分析。 図14C:抗体軽鎖(ラムダ)を各クローニングサイト中に含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計したpZB003.1構築体の概略図。 図15は、軽鎖カッパ定常領域を有するpZB003.2構築体酵母接合ベクターの生成を示す図である。図15A:SS01シグナル配列を有するカッパ軽鎖CKドメインを含有する、設計した挿入物の概略図。 図15B:SpeI-HF酵素及びXhoI酵素を用いた、pZB003.2構築体由来の独立したクローンの分析。 図15C:抗体軽鎖(カッパ)を各クローニングサイト中に含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計したpZB003.2構築体の概略図。 図16は、SS02シグナル配列を含有する軽鎖カッパ定常領域を有するpZB003構築体酵母接合ベクターの生成を示す図である。図16A:SS02シグナル配列を有するカッパ軽鎖CKドメインを含有する、設計した挿入物の概略図。 図16B:SpeI-HF酵素及びHindIII-HF酵素を用いた、pZB003構築体由来の独立したクローンの分析。 図16C:抗体軽鎖(カッパ)を各クローニングサイトに含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計した、SS02シグナル配列を有するpZB003構築体の概略図。 図17は、SS03シグナル配列を含有する軽鎖カッパ定常領域を有するpZB003.3構築体酵母接合ベクターの生成を示す図である。図17A:SS03シグナル配列を有するカッパ軽鎖CKドメインを含有する、設計した挿入物の概略図。 図17B:SpeI-HF酵素及びHindIII-HF酵素を用いた、pZB003.3構築体由来の独立したクローンの分析。 図17C:抗体軽鎖(カッパ)を各クローニングサイトに含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計した、SS03シグナル配列を有するpZB003.3構築体の概略図。 図18は、SS04シグナル配列を含有する軽鎖カッパ定常領域を有するpZB003.4構築体酵母接合ベクターの生成を示す図である。図18A:SS04シグナル配列を有する、カッパ軽鎖CKドメインを含有する、設計した挿入物の概略図。 図18B:SpeI-HF酵素及びHindIII-HF酵素を用いた、pZB003.4構築体由来の独立したクローンの分析。 図18C:抗体軽鎖(カッパ)を各クローニングサイトに含む抗体ライブラリー遺伝子をクローニングするように設計した、SS04シグナル配列を有するpZB003.4構築体の概略図。 図19は、pZB001中にクローニングした抗体遺伝子の制限消化分析を示す図である。図19A:抗体軽鎖カッパ挿入物を確認するための、HindIII及びAscIによる消化。図19B:抗体重鎖挿入物を確認するための、NcoI及びXbaIによる消化。 図20は、pZB001.1中にクローニングした抗体遺伝子の制限消化分析を示す図である。図20A:抗体軽鎖ラムダ挿入物を確認するための、HindIII及びAscIによる消化。図20B:抗体重鎖挿入物を確認するための、NcoI及びXbaIによる消化。 図21は、酵母接合型ベクター中にクローニングした抗体遺伝子の制限消化分析を示す図である。図21A:pZB003.2中にクローニングした抗体軽鎖遺伝子(カッパ)の、HindIII及びAscIを用いた制限酵素消化。 図21B:pZB002中にクローニングした抗体重鎖遺伝子の、NcoI及びNotIを用いた制限酵素消化。 図22は、抗体Fab発現を確認するためのフローサイトメトリ分析を示す。図22A:抗His抗体によるフロー分析。 図22B:抗c-myc抗体及びビオチン化したHer2抗原によるフロー分析。 図23は、抗Her2 ScFv配列を含有するpZB004.4による形質転換後の酵母の表面上での抗体ScFv発現を確認するためのフローサイトメトリ分析を示す図である。

この節は、規定した特許請求の範囲全体のコピーから始める。

本開示は、抗体又はそのフラグメントをクローニングするように設計されたベクター構築体に関し、前記ベクター構築体は、
少なくとも1つのリーダー配列、
生物学的に活性なリガンドに選択的に結合するペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を受け入れるための少なくとも1つのクローニング領域、
定常領域免疫グロブリン重鎖若しくは定常領域免疫グロブリン軽鎖又はそれらのフラグメントをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列であって、前記定常領域は、天然の免疫グロブリンの定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、少なくとも1つのヌクレオチド配列、及び
少なくとも1つの組換えタグ配列又は選択コード核酸配列
を含む発現カセットを含有し、
発現カセットの少なくとも1つのクローニング領域は、NdeI、BglII、BmtI、HindIII、AscI、NcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含有する。

本開示の一実施形態において、先に記載されるベクター構築体は、少なくとも1つのクローニング領域を含むファージミドから、若しくは少なくとも1つのクローニング領域を含む酵母ベクターから、抗体若しくはそのフラグメントを受け入れるように、又は抗体若しくはそのフラグメントを、少なくとも1つのクローニング領域を含む酵母ベクターにトランスファーするように設計されており;発現カセット、ファージミド、及び酵母ベクターの少なくとも1つのクローニング領域は、NdeI、BglII、BmtI、HindIII、AscI、NcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される1つ又は複数の一般的な制限酵素認識部位を含む。

本開示の別の実施形態において、先に記載される発現カセットは、タンパク質発現システムの表面上のペプチド若しくはタンパク質のディスプレイを可能にする生成物をコードするヌクレオチド配列と融合した酵素切断部位を欠く、若しくは上流に含む少なくとも1つのターミネーター配列;又は少なくとも1つのリボソーム結合部位を上流に含むファージコートタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

本開示の更に別の実施形態において、先に記載される発現カセットは、1つ又は複数のプロモーター配列、オペレータ配列、又はそれらの組合せを含有し、又は欠いており;先に記載されるベクター構築体は、細菌細胞又は酵母細胞中で、抗体又はそのフラグメントを発現することができ;先に記載される発現カセットのクローニング領域中の制限酵素認識部位、ファージミド、及び酵母ベクターは、HindIII及びAscI;NdeI、BglII、HindIII、及びAscI;NcoI及びXbaI;NcoI及びNotI;XbaI、NheI、及びNotIを含む組合せから選択され;プロモーター配列は、Gal1、Gal1/10、及びそれらの組合せを含む群から選択され;リーダー配列は、pelB配列、アルファリーダー配列、Aga2Pリーダー配列、アルファ接合第1因子分泌シグナル配列(SS01)、操作されたアルファ因子(aapS4)シグナル配列(SS02)、操作されたアルファ因子(aap8)シグナル配列(SS03)、操作されたアルファ因子(aap8)シグナル配列(SS04)、及びそれらの組合せを含む群から選択され;組換えタグ配列又は選択コード核酸配列は、FLAG、c-Myc、V5、His、及びそれらの組合せを含む群から選択され;ターミネーター配列は、アルファターミネーター、CYC1ターミネーター、及びそれらの組合せを含む群から選択され;酵素切断部位は、TEVプロテアーゼ切断部位であり;タンパク質発現システムの表面上でのペプチド又はタンパク質のディスプレイを可能にする生成物をコードするヌクレオチド配列は、Aga2Pタンパク質であり;ファージコートタンパク質は、pIIIタンパク質、G8P、及びそれらの組合せを含む群から選択される。

本開示の更に別の実施形態において、少なくとも1つの変異を有する定常領域免疫グロブリン重鎖又は定常領域免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)又はそのフラグメント、免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)又はそのフラグメント、及び免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)又はそのフラグメントを含む群から選択され;クローニング領域の遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)又はそのフラグメント、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)又はそのフラグメント、及び免疫グロブリン重鎖(VH)の可変領域又はそのフラグメントを含む群から選択される。

本開示の更に別の実施形態において、先に記載されるベクター構築体は、酵母双シストロン性双方向性ベクター(yeast bicistronic bidirectional vector)、酵母双シストロン性片方向性ベクター(yeast bicistronic unidirectional vector)、酵母接合型重鎖発現ベクター(yeast mating type heavy chain expressing vector)、酵母接合型軽鎖発現ベクター(yeast mating type light chain expressing vector)、及びファージミドを含む群から選択され;発現カセットは、
(a)順に、
プロモーター配列;
リーダー配列;
免疫グロブリン重鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつNcoI、BmtI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含むことができるクローニング領域;
IgG1免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)をコードするヌクレオチド配列であって、前記定常ドメインは、天然の免疫グロブリンの重鎖定常ドメイン又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、ヌクレオチド配列;
組換えタグ配列又は選択コード核酸配列;並びに
Aga2Pタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、リンカー配列を介して融合したプロテアーゼ切断部位を上流に含むターミネーター配列、
(b)順に、
プロモーター配列;
リーダー配列;
免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつNdeI、BglII、HindIII、AscI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含むことができるクローニング領域;
免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)若しくは免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)、又はそれらのフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記定常領域は、天然の免疫グロブリンの軽鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、ヌクレオチド配列;
組換えタグ配列又は選択コード核酸配列;並びに
ターミネーター配列、
(c)順に、
第1のターミネーター配列;
組換えタグ配列又は選択コード核酸配列の第1のセット;
免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)若しくは免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)、又はそれらのフラグメントをコードする第1のヌクレオチド配列であって、前記定常領域は、天然の免疫グロブリンの軽鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第1のヌクレオチド配列;
免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつNdeI、BglII、HindIII、AscI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含むことができる第1のクローニング領域;
第1のリーダー配列;
プロモーター配列;
第2のリーダー配列;
免疫グロブリン重鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつNcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含むことができる第2のクローニング領域;
IgG1免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)をコードする第2のヌクレオチド配列であって、前記定常領域は、天然の免疫グロブリンの重鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第2のヌクレオチド配列;
組換えタグ配列又は選択コード核酸配列の第2のセット;並びに
Aga2Pタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、リンカー配列を介して融合したプロテアーゼ切断部位を上流に含む第2のターミネーター配列、
(d)順に、
第1のプロモーター配列;
第1のリーダー配列;
免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつNdeI、BglII、HindIII、AscI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含むことができる第1のクローニング領域;
免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)若しくは免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)、又はそれらのフラグメントをコードする第1のヌクレオチド配列であって、前記定常ドメインは、天然の免疫グロブリンの軽鎖定常ドメイン又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第1のヌクレオチド配列;
組換えタグ配列又は選択コーディング核酸配列の第1のセット;
第1のターミネーター配列;
第2のプロモーター配列;
第2のリーダー配列;
免疫グロブリン重鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつNcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含むことができる第2のクローニング領域;
IgG1免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)をコードする第2のヌクレオチド配列であって、前記定常ドメインは、天然の免疫グロブリンの重鎖定常ドメイン又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第2のヌクレオチド配列;
組換えタグ配列又は選択コード核酸配列の第2のセット;並びに
Aga2Pタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、リンカー配列を介して融合したプロテアーゼ切断部位を上流に含む第2のターミネーター配列、
並びに
(e)順に、
プロモーター配列;
オペレータ配列;
第1のリボソーム結合部位;
第1のリーダー配列;
免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつNdeI、BglII、HindIII、AscI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含むことができる第1のクローニング領域;
免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)若しくは免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)、又はそれらのフラグメントをコードする第1のヌクレオチド配列であって、前記定常ドメインは、天然の免疫グロブリンの軽鎖定常ドメイン又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第1のヌクレオチド配列;
第2のリボソーム結合部位;
第2のリーダー配列;
免疫グロブリン重鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつNcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含むことができる第2のクローニング領域;
IgG1免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)をコードする第2のヌクレオチド配列であって、前記定常ドメインは、天然の免疫グロブリンの重鎖定常ドメイン又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第2のヌクレオチド配列;
組換えタグ配列又は選択コード核酸配列;並びに
ファージコートタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む群から選択される。

本開示は更に、請求項1において特許請求されるベクター構築体から、抗体若しくはそのフラグメントをクローニングするように、又は抗体若しくはそのフラグメントをトランスファーし、若しくは受け入れるように設計されたベクター構築体に関し、前記ベクター構築体は、
プロモーター配列、
リーダー配列、
タンパク質発現システムの表面上でのペプチド又はタンパク質のディスプレイを可能にする生成物をコードするヌクレオチド配列、
第1の酵素切断部位、
第1の組換えタグ配列又は選択コーディング核酸配列、
第1のリンカー配列、
第2の酵素切断部位、
第2のリンカー配列の存在下で第2のクローニング領域に作動可能に連結されている第1のクローニング領域であって、両クローニング領域は、生物学的に活性なリガンドに選択的に結合するペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を受け入れる、第1のクローニング領域、
第2の組換えタグ配列又は選択コード核酸配列、及び
ターミネーター配列
を含む発現カセットを含有し、
発現カセットの第1のクローニング領域又は第2のクローニング領域は、NdeI、BglII、HindIII、AscI、NcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される制限酵素認識部位を含有する。本開示の一実施形態において、このベクター構築体は、scFvベクターであり、酵母細胞において単鎖可変フラグメント(scFv)又はそのフラグメントを発現することができ;前記scFvベクター及び先に更に記載されるベクター構築体の発現カセットのクローニング領域は、NdeI、BglII、HindIII、AscI、NcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される1つ又は複数の一般的な制限酵素認識部位を含み;プロモーター配列は、Gal 1であり;タンパク質発現システムの表面上でのペプチド又はタンパク質のディスプレイを可能にする生成物をコードするヌクレオチド配列は、Aga2Pタンパク質であり;酵素切断部位は、Xa因子切断部位、TEVプロテアーゼ切断部位、及びそれらの組合せを含む群から選択されるプロテアーゼ切断部位であり;組換えタグ配列又は選択コード核酸配列は、HAタグ、c-Mycタグ、FLAG、及びそれらの組合せを含む群から選択され;リンカー配列は、G4S配列であり;第1のクローニング領域の遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)又はそのフラグメント、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)又はそのフラグメント、及びそれらの組合せを含む群から選択され;第2のクローニング領域の遺伝子は、免疫グロブリン重鎖(VH)の可変領域又はそのフラグメントであり;ターミネーター配列は、アルファターミネーター、CYC1ターミネーター、及びそれらの組合せを含む群から選択される。

本開示の別の実施形態において、先に記載されるベクター構築体は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、及び配列番号26を含む群から選択される核酸配列を有する。

本開示の更に別の実施形態において、先に記載されるベクター構築体は更に、複製起点(Ori)、抗生物質耐性マーカー、f1複製起点、プロモーター、及びそれらの組合せを含む群から選択される領域を含み;ベクター構築体は、原核生物発現システム、酵母発現システム、又はそれらの組合せにおいて、抗体又はそのフラグメントを発現又はディスプレイすることできる。

本開示の更に別の実施形態において、CH1領域は、配列番号27の核酸配列を有し、Ck領域は、配列番号28の核酸配列を有し、CL領域は、配列番号29の核酸配列を有し;Vk、VL、及びVH配列は、ナイーブ抗体レパートリー、合成抗体レパートリー、又はそれらの組合せに由来する。

本開示は更に、先に記載されるベクター構築体を調製する方法に関し、前記方法は、a)発現カセットの合成の工程、b)デスティネーションベクターの線状化の工程、及びc)ベクター構築体を得るために、線状化デスティネーションベクター中に発現カセットを挿入する工程を含む。

本開示の実施形態において、先に記載されるベクター構築体を調製する方法は、配列決定技術によってエラーがないベクタークローンを確認する工程を含み;デスティネーションベクターは、pADL23c、pRS314、p414Gal1、p416Gal1、及びそれらの組合せを含む群から選択され;線状化は、制限酵素による消化によって実行され;発現カセットを線状化デスティネーションベクター中に挿入する工程は、相同組換え、制限消化に続くライゲーション、及びそれらの組合せを含む群から選択される技術によって実行される。

本開示は更に、ベクター構築体のライブラリーを調製する方法に関し、前記方法は、a)先に記載される方法によってベクター構築体を調製する工程、b)免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)、若しくはそれらのフラグメント、免疫グロブリン重鎖の可変領域若しくはそのフラグメント(VH)、及びそれらの組合せを含む群から選択される領域をコードするヌクレオチド配列を、ベクター構築体のクローニング領域中にクローニングして、ライブラリーを得、又は免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)、若しくはそれらのフラグメント、免疫グロブリン重鎖の可変領域若しくはそのフラグメント(VH)、及びそれらの組合せを含む群から選択される領域をコードするヌクレオチド配列を、1つのベクター構築体のクローニング領域から、別のベクター構築体のクローニング領域にトランスファーして、ライブラリーを得る工程を含む。

ベクター構築体のライブラリーを調製する先の方法の実施形態において、ベクター構築体は、ファージミド、酵母接合型重鎖発現ベクター、酵母接合型軽鎖発現ベクター、酵母双シストロン性双方向性ベクター、酵母双シストロン性片方向性ベクター、及び単鎖可変フラグメント(scFv)ベクターを含む群から選択され;Vk、VL、及びVH領域は、ナイーブ抗体、合成抗体、又はそれらの組合せに由来し;ベクター構築体のライブラリーは、合成ライブラリー、ナイーブライブラリー、又はそれらの組合せであり;ヌクレオチド配列のトランスファーは、ファージミドベクター構築体と酵母ベクター構築体との間で、又は酵母ベクター構築体の間で実行される。

本開示は更に、所望される機能特性を有する抗体又はそのフラグメントをスクリーニングし、かつ同定する方法であって、(a)先に記載される方法によってベクター構築体のライブラリーを調製して、前記ベクター構築体を細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、又はそれらの組合せ中に形質転換する工程、及び(b)所望される機能特性を有する抗体又はそのフラグメントを発現する細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を選択する工程を含む方法に関する。

本開示の実施形態において、スクリーニング及び同定は、細菌宿主細胞でのファージディスプレイによって、酵母宿主細胞での酵母ディスプレイによって、又は順にファージディスプレイ及び酵母ディスプレイによって実行され;所望される機能特性は、親和性、特異性、抗原性、製造容易性、新しいエピトープの生成、熱安定性、溶解性、凝集、及び触媒活性、並びにそれらの組合せを含む群から選択される。

本開示の別の実施形態において、先に記載されるスクリーニング及び同定は、
(i)ファージミド構築体のライブラリーを細菌宿主細胞中に形質転換して、ファージ抗体ライブラリーを得る工程;
(ii)ディスプレイされた抗体又はそのフラグメントを抗原に対してスクリーニングして、選択されたクローンを含むパンニングしたファージ抗体ライブラリーを得る工程;
(iii)選択されたクローンから抗体又はそのフラグメントを酵母ベクター中にトランスファーした後に、酵母宿主細胞中に形質転換して、前記抗体又はそのフラグメントを発現かつディスプレイさせる工程;
(iv)酵母がディスプレイした抗体又はそのフラグメントを、抗原に対してスクリーニングして、所望される機能特性を有する抗体又はそのフラグメントを同定する工程
を含む順次のファージディスプレイ及び酵母ディスプレイによって実行される。

先に記載される、抗体又はそのフラグメントをスクリーニングし、かつ同定する方法の更に別の実施形態において、抗体又はそのフラグメントは、ファージ又は酵母ベクター中へのクローニング用のFabフォーマット又はScfvフォーマットであり;ファージベクター中への形質転換効率は、約10⁹〜約10¹¹の範囲内であり;酵母ベクター中へのトランスファー効率又は形質転換効率は、約10⁶〜約10⁸の範囲内である。

本開示は更に、先に記載されるベクター構築体を含む細菌宿主細胞若しくは酵母宿主細胞に、又はそのファージライブラリー若しくは酵母ライブラリーに関する。

本開示は更に、先に記載されるベクター構築体によって提供される発現カセットに関し、前記発現カセットは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、及び配列番号25を含む群から選択される核酸配列を有する。

本明細書中で定義されている場合を除き、本開示に関連して用いられる科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって必要とされる場合を除き、文脈及び/又は用途に適すると考えられるように、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。種々の単数/複数の入替えは、明確にする目的で、本明細書中で明示的に示されるかもしれない。通常、本明細書中に記載されるバイオテクノロジー、免疫学、分子細胞生物学、組換えDNA技術に関連して用いられる命名法、又はこれらの手法は、当該技術において周知であり、かつ汎用されているものである。本明細書中で引用される参考文献は、参照によって本明細書中に明示的に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配することとなる。材料、方法、図、及び例は、例示のためだけのものであり、限定することは意図されない。

更に、開示される種々のファージミド発現ベクター及び酵母発現ベクターの方法及び調製は、特に明記されない限り、分子生物学、生化学、コンピュータ化学、細胞培養、組換えDNA技術、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、及び関連する分野における手法を使用する。これらの手法、それらの原理、及び要件は、文献において説明されており、公知である。

発現ベクター及び当該ベクターを構成する核酸配列、並びに本開示の他の実施形態/方法を開示かつ記載する前に、本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明することしか目的としておらず、限定することは意図されないことが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲に用いられているように、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明確に指示する場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。

本明細書中で用いられる用語「ベクター」は、外来の遺伝物質を別の細胞中に人工的に運ぶビヒクルとして用いられるDNA分子を指し、これは複製かつ/又は発現され得る。本開示のベクターは、原核細胞、真核細胞、又はそれらの組合せにおいて複製かつ/又は発現することができる。

本明細書中で用いられる用語「抗原」は、体内で免疫応答を誘導するあらゆる外来物質を指す。

本明細書中で用いられる用語「抗体」又は「そのフラグメント」は、全部又は一部が、天然のソースに由来してもよいし、合成的に生成されてもよい免疫グロブリンを指す。用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、特に明記されない限り、本明細書の全体を通して同義的に用いられる。更に、本明細書中で用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体調製物及びモノクローナル抗体調製物の双方を含み、また以下を含む:キメラ抗体分子、F(ab')2フラグメント及びF(ab)フラグメント、Fv分子、単鎖Fv分子(ScFv)、二量体、及び三量体の抗体フラグメント、ミニボディ、ヒト化モノクローナル抗体分子、ヒト抗体、抗体のFc領域を含む融合タンパク質、並びにこれらの分子から生じるあらゆる機能的フラグメントであり、派生的な分子は、親抗体分子の免疫機能性を保持する。

本明細書中で用いられる、本開示における用語「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団を有する抗体組成物を指す。抗体は、抗体の種又はソースにも、それが製造される様式によっても限定されない。当該用語は、免疫グロブリン全体、並びにフラグメント、例えばFab、F(ab')2、Fv、及び他のフラグメント、並びに親モノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す均質なキメラ抗体集団及びヒト化抗体集団を包含する。

本明細書中で用いられる「抗体フラグメント」は、抗原結合活性を示す能力を保持する抗体全体の一部である。用語Fab又はScFvは、具体的に言及される抗体フラグメントとして用いられ、前者は、重鎖定常ドメイン(CH1)、及びカッパ又はラムダ(Ck又はCλ)の軽鎖定常領域を排他的に伴う。

本明細書中で用いられる「抗体ディスプレイライブラリー」は、標的抗原に対するスクリーニング方法論に適した、細胞又は無細胞の表面上で抗体を発現するプラットフォームを指す。本明細書中では、特に明記されない限り、ファージディスプレイライブラリー及び酵母ディスプレイライブラリーが、正確に特定して用いられる。

本明細書中で用いられる用語「シグナルペプチド」及び「リーダーペプチド」は、互換的に用いられる。

本明細書中で用いられる用語「クローニング領域」、「マルチクローニングサイト」、及び「MCS」は、互換的に用いられる。

本開示は、遺伝物質をクローニングして発現するベクターに関する。特に、本開示は、以下に限定されないが、天然に存在する抗体遺伝子、人工的に設計された合成抗体遺伝子、若しくはその一部、又はそれらの組合せから得られる遺伝物質が挙げられる遺伝物質をクローニングして発現するためのベクターの生成に関する。

本開示は、ファージミドベクター及び酵母ベクターを提供する。一実施形態において、本開示のベクターとして、以下に限定されないが、ファージミド、酵母双シストロン性双方向性ベクター、酵母双シストロン性片方向性ベクター、酵母接合型重鎖発現ベクター、酵母接合型軽鎖発現ベクター、及びscFvベクターが挙げられる。ベクターは、大きな遺伝子ライブラリーのクローニング用に設計されており、かつ同時に、クローニングされたライブラリーを、異なるベクター間でトランスファーするフレキシビリティがある。例示的な実施形態において、本開示のベクターは、クローニングされたライブラリーを、ファージミドから酵母ベクターにトランスファーする、すなわちinter-transferするフレキシビリティがある。本開示のベクターは、高スループットスクリーニングプラットフォームにより発現される遺伝子産物の適切な発現及びスクリーニングを確実にするための、多様な発現タグ及び遺伝的要素を備えている。別の例示的な実施形態において、本開示のベクターは、クローニングされたライブラリーを、異なる酵母ベクター間でトランスファーする、すなわちintra-transferするフレキシビリティがある。

本開示の非限定的な実施形態において、ファージミドベクターは、相同組換え配列、リボソーム結合部位、プロモーター、シグナルペプチド/リーダーペプチド、タグ、マルチクローニングサイト(MCS)、重鎖の定常領域[IgG1重鎖の定常領域(CH1)]及び軽鎖の定常領域[カッパ軽鎖(Ck)又はラムダ軽鎖(CL)の定常領域]又はそれらのフラグメント、並びにgeneIIIPファージコートタンパク質を含む発現カセットを含む。一実施形態において、重鎖及び/又は軽鎖の定常領域は、ナイーブ抗体又は合成抗体に由来する。加えて、ファージミドはまた、以下に限定されないが、複製起点(Ori)、抗生物質耐性マーカー、及びf1複製起点を含む。

本開示の実施形態において、ファージミド用の発現カセットは、図2A及び図3Aに記載されている。本開示の別の実施形態において、発現カセットは、配列番号1及び配列番号3を含む群から選択される核酸配列を有する。

本開示の実施形態において、ファージミドベクターマップは、図2D及び図3Dに示されている。本開示の別の実施形態において、ファージミドベクターは、配列番号2及び配列番号4を含む群から選択される核酸配列を有する。

本開示の別の非限定的な実施形態において、酵母ベクターは、接合型重鎖発現ベクター、接合型軽鎖発現ベクター、双方向性双シストロン性ベクター、片方向性双シストロン性ベクター、及びモノシストロンScFvディスプレイベクターを含む群から選択される。

本開示の更に別の非限定的な実施形態において、酵母ベクターは、プロモーター、シグナルペプチド、タグ、マルチクローニングサイト(MCS)、酵素切断部位、転写ターミネーター、並びに場合によっては、重鎖の定常領域[IgG1重鎖の定常領域(CH1)]及び軽鎖の定常領域[カッパ軽鎖(Ck)又はラムダ軽鎖(CL)の定常領域]又はそれらのフラグメント、並びにリンカー配列を含む発現カセットを含む。一実施形態において、重鎖及び/又は軽鎖の定常領域は、ナイーブ抗体又は合成抗体に由来する。例示的な実施形態において、酵母ベクターは、抗体がFabフォーマットでディスプレイされることになる場合、重鎖の定常領域[IgG1重鎖の定常領域(CH1)]及び軽鎖の定常領域[カッパ軽鎖(Ck)又はラムダ軽鎖(CL)の定常領域]又はそれらのフラグメントを含む。好ましい実施形態において、そのような酵母ベクターディスプレイFabフォーマットは、接合型重鎖発現ベクター、接合型軽鎖発現ベクター、双方向性双シストロン性ベクター、片方向性双シストロン性ベクター、及びモノシストロン性ScFvディスプレイベクターから選択される。別の例示的な実施形態において、酵母ベクターは、抗体がscFvフォーマットでディスプレイされることになる場合、重鎖の定常領域[IgG1重鎖の定常領域(CH1)]及び軽鎖の定常領域[カッパ軽鎖(Ck)又はラムダ軽鎖(CL)の定常領域]又はそれらのフラグメントを欠いている。好ましい実施形態において、そのような酵母ベクターディスプレイscFvフォーマットは、scFvベクターである。加えて、酵母ベクターはまた、以下に限定されないが、複製起点、f1複製起点、抗生物質耐性マーカー、栄養要求性マーカー、及びセントロメア融合自律複製配列が挙げられる領域を含む。

本開示の実施形態において、酵母ベクターは、図5E、図6C、図7C、図8C、図10C、図12C、図14C、図15C、図16C、図17C、及び図18Cに示されている。本開示の別の実施形態において、酵母ベクターは、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号18、配列番号24、及び配列番号26を含む群から選択される核酸配列を有する。

本開示は更に、抗体又はそのフラグメントの発現用の発現カセット/挿入を提供する。本開示の例示的な実施形態において、発現カセットは、抗体を、Fabフォーマット、scFvフォーマット、又はそれらの組合せで発現するために提供される。別の例示的な実施形態において、発現カセットは、ファージミドベクター、酵母ベクター、又はそれらの組合せの一部を形成するように設計されている。一実施形態において、発現カセットは、ファージミドベクターが抗体をFabフォーマットで発現するように設計されている。別の実施形態において、発現カセットは、酵母ベクターが抗体をFabフォーマット、scFvフォーマット、又はそれらの組合せで発現するように設計されている。本開示の一実施形態において、酵母ベクター用の代表的な発現カセットは、図5A、6A、7A、8A、10A、12A、14A、15A、16A、17A、及び18Aに示されている。本開示の別の実施形態において、酵母発現カセットは、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号19、配列番号21、配列番号17、配列番号23、及び配列番号25を含む群から選択される核酸配列を有する。

本開示は更に、遺伝物質をクローニングして発現するための発現カセット及びベクターの生成に関する。非限定的な実施形態において、前記ベクターは、先に記載されるように、ファージミド、酵母発現ベクター、又はそれらの組合せである。

一実施形態において、ファージミドを生成する方法は、発現カセット/挿入領域を合成する工程、及び前記領域を、線状化ベクター骨格(デスティネーションベクター)中に組み込んで、ファージミドを得る工程を含む。

例示的な実施形態において、ファージミドを生成する方法は、以下の工程を含む:
1.Fabディスプレイフォーマットとアラインするような、シグナル配列、リボソーム結合部位(RBS)、MCS、タグ、ファージコートタンパク質、軽鎖及び重鎖の各定常領域を含む発現カセットの設計及び合成であって、場合によっては、発現カセットの挿入の一助となるような、デスティネーションベクターに対する相同ヌクレオチド長に沿う、設計及び合成;
2.デスティネーションベクター、例えばpADL23cの、制限酵素による線状化;
3.各フラグメントの精製、及び合成された発現カセットを線状化ベクター中に挿入してファージミドを生成するための、酵素媒介相同組換えのセットアップ。

別の実施形態において、エラーがないファージミドクローンの確認が、配列決定によって実行され、並びに重鎖(VH)及び軽鎖(Vk又はVL)レパートリーの可変領域は、指定された制限酵素を、生成されたファージミドベクターに使用することによって、定められた位置(MCS)にクローニングされる。一実施形態において、重鎖又は軽鎖の前記可変領域は、ナイーブ抗体又は合成的に生成された抗体に由来する。別の実施形態において、VH、Vk、及びVLのナイーブレパートリー又は合成コンセンサスプールが、ベクター中の特定の位置の各MCS中にクローニングされて、ライブラリー構築体が生成される。更に、合成多様性が、フレームワーク構築体のCDR領域中に導入されて、ファージミドの合成抗体遺伝子ライブラリーが開発される。

例示的な実施形態において、先の工程(1)の合成されたヌクレオチド配列(発現カセット)は、2つのセグメントを含む約2Kbサイズの大きなDNAセグメントであり、セグメント1は、相同領域、オペレータ、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)1、マルチクローニングサイト(MCS)I、軽鎖定常領域[カッパ(Ck)又はラムダ(CL)]を含む一方、セグメント2は、RBS 2、MCS II、重鎖定常領域(CH1)に続き、ファージタンパク質GeneIIIpを融合タンパク質及び相同領域として含む。合成された発現カセットは、相同組換えベースのクローニング法である、効率的であり、生産的であり、かつライゲーションフリーのInfusion cloning方法論を介して、線状化pADL23cベクター骨格中に組み込まれる。ナイーブ抗体レパートリー及び/又は合成抗体レパートリー由来の軽鎖可変部分及び重鎖可変部分がそれぞれ、ファージミドのセグメント1のMCS I及びセグメント2のMCS II中にクローニングされる。したがって、カッパ定常領域又はラムダ定常領域に単独で基づく2つの指定されたファージミドが生成されるので、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖のプールの各可変領域が、それぞれのデスティネーションファージミドベクター中で対処される(図2D及び図3D)。合成ライブラリーに、これらのファージミドが用いられて、軽鎖の定常領域に基づいたファージミド分類/発現カセットを保持する、コンセンサス重鎖可変領域及びコンセンサス軽鎖可変領域の考えられる組合せで、多様なクローンが生成される。更に、合成多様性が、Vh、Vk、及びVλ鎖のCDR領域内の指定された制限酵素境界に導入される。他方では、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖において分化を有するナイーブレパートリーが、指定されたファージミド中に直接クローニングされる。

本開示の別の実施形態において、酵母ベクターを生成する方法は、酵母ベクターを生成するための、発現カセットの設計、デスティネーションベクターの線状化に続く、カセットの挿入のための相同組換え、又は制限消化に続く、カセットの、線状化ベクター中へのライゲーションの使用を含む。更に、可変重鎖レパートリー及び可変軽鎖レパートリーが、各ベクター内の定められた位置にクローニングされる。

例示的な実施形態において、酵母ベクターを生成する方法は、以下の工程を含む:
1.所望されるプロモーター、ターミネーター、シグナル配列、MCS、タグ、挿入の一助となる、デスティネーションベクターに対する制限酵素認識部位、任意選択の要素(リンカー、相同組換え配列、ディスプレイ用の融合タンパク質が挙げられる)を有する発現カセットの設計及び合成であって、場合によっては、Fabディスプレイフォーマットとアラインする、重鎖及び軽鎖の各定常領域を有し、又は、抗体がScFvフォーマットでディスプレイされるならば、重鎖及び軽鎖の前記定常領域が欠如している、発現カセットの設計及び合成;
2.デスティネーションベクター、例えばpRS314、p414GAL1、又はp416GAL1の、制限酵素による線状化;
3.各フラグメントの精製、及び合成された発現カセットの、線状化デスティネーションベクター中への挿入のための、酵素媒介相同組換えのセットアップ;又は合成されたカセットを線状化ベクター中に組み込んで酵母ベクターを生成するための、制限消化及びライゲーションのセットアップ。

別の実施形態において、エラーがない酵母ベクタークローンの確認が、配列決定によって実行され、並びに可変領域の重鎖(VH)及び軽鎖(Vk又はVL)レパートリーが、各酵母ベクターで指定された制限酵素により、定められたMCS位置にクローニングされる。一実施形態において、重鎖又は軽鎖の前記可変領域は、ナイーブ抗体又は合成的に生成された抗体に由来する。別の実施形態において、Vh、Vk、及びVλのナイーブプール及び/若しくは合成プールは、ファージミドから酵母ベクターにトランスファーされ、又は当該領域は、酵母ベクターの各MCS中に直接クローニングされて、構築体の真核生物抗体遺伝子ライブラリーが生成される。

別の例示的な実施形態において、代表的な酵母ベクターは、図5E、図6C、図7C、図8C、図10C、図12C、図14C、図15C、図16C、図17C、及び図18Cに示されている。制限酵素認識部位及び関連する適合性因子以外に、他の特性、例えばディスプレイフォーマット（Fabフォーマット及びScFvフォーマットによって例示される）が、酵母ベクターに特徴付けられ、Fabフォーマットは、更に、以下の発現システムを介して提案される:1)2つの異なる重鎖及び軽鎖を様々な酵母株において様々なベクター上にコードする遺伝子を含み、より大きなライブラリーサイズをFabフォーマットで与える接合型酵母ベクター;2)同一の、又は異なる誘導プロモーターによって駆動される2つの発現カセットを含む単一の酵母ディスプレイベクターが構築される、双シストロン性酵母ベクター。この双シストロン性酵母ベクターフォーマットは、化学量論的な量の別個の軽鎖タンパク質及び重鎖タンパク質の生成に至るので、機能的Fab抗体の収量を最適化する);並びに3)V_H領域及びV_L領域を分離する特定の長さのリンカーを有する抗体遺伝子のScFvフラグメントをクローニングするためのScFvベクター。

非限定的な実施形態において、本開示の酵母ベクターは、蛍光ベースの検出及び分離に適した融合タグを有する。タンパク質タグは、該当する場合には、N末端タグ及びC末端タグの双方として配置される。これらのタグの実用性は多様であり、以下に限定されないが、検出、単離、精製、及びアッセイ開発が挙げられる。

特定の抗原/タンパク質に対してふさわしいタンパク質/抗体ライブラリースクリーニングツールにするであろう適切に設計されたベクターの使用を介した、表面ディスプレイ技術のいくつかの固有の特徴が存在する。第1に、細胞表面上のコンビナトリアルタンパク質ライブラリーのディスプレイは、DNAとタンパク質との間に物理リンクを確立して、好都合に、かつ効率的に、高スループット法、例えば定量的なELISA又は蛍光活性化細胞選別(FACS)の使用が可能となる。第2に、標的基質又はリガンド/受容体は、表面上にディスプレイされるタンパク質に、細胞膜障壁を越える必要なく、直接的にアクセス可能であるので、労力を要するいかなるタンパク質精製工程も回避される。第3に、細胞付着が、表面上にディスプレイされたタンパク質を安定化させる。ディスプレイシステムの設計及びそれらの相互関係により、分子の損失がないこと、一方で、別のシステムにトランスファーされることを確認することが必須であり、それらはここでもエラーフリーであるべきである。同じことが、原核/ファージディスプレイシステムから真核生物/酵母ディスプレイシステムへの、円滑かつエラーがない遺伝子トランスファー用のベクターを提供する本開示において、首尾よく達成される。

本開示の実施形態において、市販のベクターpADL23c、pRS314、及びp414GAL1 & p416GAL1が、ファージディスプレイプラットフォーム及び酵母ディスプレイプラットフォーム用にベクターを設計するのに使用された。各ディスプレイシステムにおけるナイーブ抗体レパートリー又は合成抗体レパートリーからの可変重鎖及び可変軽鎖の効率的なクローニング、並びにディスプレイシステムを横断する効率的なトランスファーのために、制限酵素部位が、ベクター骨格、重鎖及び軽鎖の定常領域、タグ、ディスプレイタンパク質、例えばファージベクター用のGeneIIIp又はG3P及び酵母ベクター用のAga2P、リーダー配列及びターミネーター配列には含まれないように、注意深く提供された。更に、前記一意的に設計され、かつ配置された制限酵素認識部位は、可変領域(VH(7ファミリー)、Vk(4ファミリー)、及びVL(3ファミリー)鎖)の設計されたコンセンサス配列内に存在するべきでない。また、全てのCDRにわたる合成された多様性の組込みのために選択される境界酵素は、特有であり、かつ、合成抗体遺伝子レパートリーを運ぶいずれのベクターにも存在しない。

したがって、本開示のベクターは、inter-transfer(すなわち、一発現システムのベクターから別の発現システムへの抗体遺伝子のトランスファー)及びintra-transfer (すなわち、同じ発現システムのベクター内でのトランスファー)用の特定の制限酵素認識部位を含むように一意的に設計されている。一実施形態において、本開示のベクターは、intersystem transferトランスファー、すなわち、ファージシステムから酵母発現システムへの抗体遺伝子のトランスファーができる。別の実施形態において、本開示のベクターは、intra-system transferができる、すなわち、FabからScFvへの、若しくはその逆のディスプレイフォーマットの変更、又はフォーマットは同じであるが発現ベクターが異なる変更、例えば接合型酵母ベクターから双シストロン性酵母ベクターへの、MCS酵素の各セットを介したトランスファー等ができる。一実施形態において、ベクター、すなわちファージミドベクター及び酵母ベクターのクローニング領域(MCS)は、NdeI、BglII、BmtI、HindIII、AscI、NcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらの組合せを含む群から選択される一律の制限酵素認識部位を含む。例示的な実施形態において、可変軽鎖配列をクローニングするためのファージミドベクター及び酵母ベクター(酵母双シストロン性双方向性ベクター、酵母双シストロン性片方向性ベクター、酵母接合型重鎖発現ベクター、酵母接合型軽鎖発現ベクター、及びscFvベクター)のMCS I/MCS領域は、NdeI、BglII、HindIII、AscI、及びそれらのあらゆる組合せから選択される制限酵素認識部位を含む。別の例示的な実施形態において、可変重鎖配列をクローニングするファージミドベクター及び酵母ベクター(酵母双シストロン性双方向性ベクター、酵母双シストロン性片方向性ベクター、酵母接合型重鎖発現ベクター、酵母接合型軽鎖発現ベクター、及びscFvベクター)のMCS II/MCS領域は、NcoI、XbaI、NheI、NotI、及びそれらのあらゆる組合せから選択される制限酵素認識部位を含む。好ましい実施形態において、可変軽鎖(MCS I/MCS)用のクローニング領域は、HindIII及びAscI、並びにNdeI及びAscIから選択される制限酵素認識部位の組合せを含む。別の好ましい実施形態において、可変重鎖(MCS I/MCS)用のクローニング領域は、NcoI及びXbaI、並びにNcoI及びNotIから選択される制限酵素認識部位の組合せを含む。

本開示は更に、タンパク質ライブラリーを構築する際の本ベクターの用途に関する。一実施形態において、タンパク質ライブラリーは、抗体ライブラリーである。別の実施形態において、抗体ライブラリーとして、以下に限定されないが、合成抗体遺伝子発現ライブラリー、ナイーブ抗体ライブラリー、又はそれらの組合せが挙げられる。

本開示において、先に記載されるベクターは、抗体遺伝子発現ライブラリーを生成する方法に使用され、以下に限定されないが、合成抗体遺伝子発現ライブラリー、ナイーブ抗体遺伝子発現ライブラリー、又はそれらの組合せが挙げられ、前記方法は、コンビナトリアルツールを使用することによって、特定の抗原についてスクリーニングする手順を含む。

例示的な実施形態において、コンビナトリアルツールとして、ファージディスプレイ技術及び酵母ディスプレイ技術が挙げられる。別の実施形態において、当該方法は、ファージディスプレイ技術のみ、酵母ディスプレイ技術のみ、又はファージディスプレイ技術及び酵母ディスプレイ技術の組合せによるスクリーニングを使用して、抗体遺伝子発現ライブラリーを生じさせる。好ましい実施形態において、当該方法は、ファージディスプレイ技術に続く酵母ディスプレイ技術によるスクリーニングを使用して、抗体遺伝子発現ライブラリーを生じさせる。

本開示の非限定的な実施形態において、合成抗体遺伝子発現ライブラリーは、特定の治療標的、すなわち抗原について、親和性及び特異性が増強された所望される機能特性を有する特有の抗体分子の単離を可能にする。

本開示の別の非限定的な実施形態において、抗体の所望される機能特性は、以下に限定されないが、親和性、特異性、製造容易性、新しいエピトープの生成、熱的安定性、抗原性、溶解性、凝集、及び触媒活性、又はそれらのあらゆる組合せ、並びに製品化の成功に関係するその他のあらゆる特性を含む群から選択される。

本開示の更に別の非限定的な実施形態において、抗体遺伝子発現ライブラリーを生成する方法は、ファージディスプレイ技術及び酵母ディスプレイ技術を順に検討する工程を含み、これにより、ファージベースのライブラリーの特性である、より大きなセットの抗体遺伝子多様性を活かすことができる。抗体クローンはその後、酵母ディスプレイシステムによってスクリーニングされる。抗体遺伝子発現のための酵母システムの使用は、真核生物タンパク質の翻訳、プロセシング、及び細胞表面上での抗体生成物の適切なフォールディングのため、有利である。更に、酵母発現は、高い特異性による抗原性標的との適切な相互作用を可能にする。これらの2つの補完システムを用いて得られる情報が、商業化の可能性に関して成功率がより高い「リード分子」(すなわち、抗原に特異的な抗体)を生成する。本開示のベクターは、順次のファージディスプレイ技術及び酵母ディスプレイ技術によって、先に記載されるベクターの種々の特徴に起因して、抗体遺伝子発現ライブラリーの生成を首尾よく補助する。

本開示のファージミド及び酵母ベクターは、エラーがないプロセスを介して、大きくて多様な抗体遺伝子ライブラリーに対処し、かつこれをcross-transferすることによって、親和性及び特異性が変化に富む多数の抗原に対して特有の分子/リード分子を同定し、トランスファーし、保存し、かつ生成する可能性を向上させる。

本開示の非限定的な実施形態において、原核ファージディスプレイ表面発現システムは、本開示において使用されて、約10⁹〜約10¹¹個、好ましくは>10¹¹個の大きな抗体遺伝子ライブラリーに、そのようなライブラリーに内在する広範囲にわたる多様性が維持されるように対処する。同時に、原核生物スクリーニングシステムの使用が、抗体分子の優れた機能性を同定するのに最良でなくてよいので、ファージディスプレイシステムは、真核生物酵母ディスプレイプラットフォームと統合されて、機能性が優れた翻訳後修飾を可能にする。この偉業を達成するために、高度に多様化された抗体遺伝子ライブラリー(>10¹¹クローン)のクローニング及び発現用のファージミドベクターが、本開示において設計されて、使用される。当該遺伝子ライブラリーは、人工的に設計され、かつ化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから、又は天然に存在する抗体遺伝子配列から集められる。ベクターのセットは全て、先の段落に記載される遺伝的要素で設計されて、抗体遺伝子の、融合タンパク質としての高いレベルの発現が確実にされ、多様なタンパク質タグが、標的抗体遺伝子の効率的な単離及び精製を可能にする。

本開示の特定の実施形態において、ストラテジーは、第1に、大きな抗体遺伝子ライブラリーをファージディスプレイ技術によってスクリーニングすることであり、選択されたクローンはその後、酵母ディスプレイベクター中に再クローニングされて、以下に限定されないが、ScFv若しくはFab、又は他の抗体フォーマットが挙げられる抗体遺伝子フォーマットが表される。したがって、本開示のファージミドベクターは、抗体遺伝子の予備的スクリーニングが、ファージミドにより完了してから、クローンが種々の酵母発現ベクターにトランスファーされて、以下に限定されないが、ScFv、Fab、又は他の抗体フォーマットが挙げられる様々な抗体遺伝子フォーマットが発現されるように設計されている。本開示のファージミドベクターは、クローニングされた遺伝子を、多様な型の酵母ディスプレイベクターにトランスファーする適合性がある。本酵母発現ベクターはまた、以下に限定されないが、ScFv、Fab、及び他のフォーマットが挙げられる抗体遺伝子の様々なフォーマットのクローニング及び発現に関して、特有である。更に、本酵母発現ベクターは、部分的にスクリーニングされたクローンを、ファージディスプレイシステムから酵母ディスプレイシステムにトランスファーするのに、又はナイーブライブラリー若しくは合成ライブラリーを、酵母システム中でコンビナトリアル式に、若しくは非コンビナトリアル式に直接生成するために用いられ、後者のストラテジーは、ファージディスプレイシステムから直接トランスファーされることになる重鎖及び軽鎖の特定の組合せを保存する。クローンのトランスファーが、好ましくは、好ましくは制限消化ベースの方法を介して、酵母株中に行われる。遺伝子トランスファー又は新しいクローニング用の制限酵素認識部位が、遺伝子トランスファーを様々なベクター間で適合性があるようにするように、注意深く、かつ一意的に設計されている。酵母発現プラスミドは、完全長のタンパク質の発現を確実にするように、多様な融合タンパク質タグ及び切断部位を含有し、高スループット方法論によって単離かつ精製されるように設計されている。酵母の内側で一旦発現された種々の抗体フォーマットの分泌を最適化するのに、シグナル配列の多様な変異体が用いられた。一実施形態において、高スループット方法論は、以下に限定されないが、ELISA、蛍光活性化細胞選別(FACS)、ビーズベースの高スループット選択法、細胞分離技術、自動化された高スループット顕微鏡観察、磁気分離技術、及びそれらの組合せが挙げられる。選択されたクローン集団はまた、戦略的に配置されたタンパク質切断部位を用いた、抗体遺伝子産物の迅速な精製にも有用である。

ゆえに、本ベクター及び本方法は、特有の設計及び排他的なスクリーニング/選択基準に基づいて、抗体遺伝子ライブラリーの多様かつ特有の抗体レパートリーの双方を開発する。本明細書中で採用されるベクターの設計、発現プロファイリング、及びスクリーニングストラテジーにより、ファージディスプレイプラットフォームと酵母ディスプレイプラットフォームとの間での、又は種々のベクターそれら自体の間での効率的な移行が可能となる。設計はまた、ファージディスプレイスクリーニングから得られたクローンの、酵母ディスプレイシステムへの非コンビナトリアルトランスファーに対処する。ファージディスプレイは、高スループットフォーマットにおける抗体-抗原相互作用のストリンジェンシー及び特異性に焦点を定めた第1のスクリーニングのためのライブラリーサイズ(>10¹¹)に対処し、スクリーニングされた分子はここでも、ランダム化プロセスを経験して、酵母プラットフォームを介した天然ディスプレイを模倣する。本開示のファージミドベクター及び酵母ベクターの双方に用いられる特有のセットの制限酵素/部位により、いかなる増幅ベースの方法論、例えばPCRの導入もなしで、重鎖及び可変軽鎖のトランスファーが可能となり、これによって、ライブラリーの既存の、スクリーニングされた多様性が保存される。そのようなアプローチは、抗体遺伝子ライブラリーの生成及びリード抗体分子/生成物のスクリーニングを成功させるのに非常に重要である。ゆえに、各種のベクター(ファージディスプレイ用ベクター及び酵母ディスプレイ用ベクター)は、コンビナトリアル式に、開発中の、機能的に特異的であるが構造的に多種多様な抗体部分/リード分子のパイプラインに寄与する。また、発現手順は、ファージ上でのFab部分又はそのような型の抗体フラグメントの特有のディスプレイを確実にする一方、Fabフラグメント及びscFvフラグメント又は類似の抗体フラグメントが、酵母の表面上でディスプレイされる。また、酵母ディスプレイプラットフォームは、双シストロン性アプローチ及び接合型アプローチでベクターを選択して、Fab又は類似の抗体フラグメントをディスプレイする設備を有する。この特定のストラテジー、とりわけ接合型が採用されて、大腸菌(E. coli)形質転換効率と比較して、酵母細胞において一般に観察される不十分な形質転換効率の問題を回避することによって、更に数多くのクローンがスクリーニングされる。2つの異なるディスプレイシステムを介した抗原上での、又は抗原発現細胞上での複数ラウンドの選択を有するプロセス全体が、所望される広範な抗体特性、例えば親和性、特異性、製造容易性、及び触媒活性を正に、又は負に選択するのに、極めて価値がある。本開示のベクターの戦略的な設計及びコンビナトリアル使用により、多種多様な抗原性標的に対して特有の分子を同定することができる抗体遺伝子ライブラリー中の多様性を保存することが可能となる。本ベクター及びその、2つの異なるディスプレイシステムの一部としての使用は、以下に限定されないが、新しい、機能的に向上した抗体の同定及び更なる商品開発のための膨大な資源として役に立つ、多様性が高いヒト抗体のナイーブライブラリー又は合成ライブラリーが挙げられる抗体遺伝子ライブラリーの生成の一助となる。

まとめると、ファージディスプレイ技術において、本開示のファージミドベクターは、特定の抗原に対する親和性が高〜中程度である潜在的な抗体遺伝子をクローニングし、かつスクリーニングするのに用いられる。当該遺伝子は、次に、リード分子を更にスクリーニングして同定するために、本開示の酵母ディスプレイベクターにトランスファーされる。本ベクターを使用することによるこれらの2つの技術の使用は、ファージディスプレイ技術により、大きな、多様化された抗体ライブラリーのクローニング及び発現が可能となる一方、酵母ディスプレイ技術が、真核生物発現システム及び適切なタンパク質のフォールディングに関して優れているので、有益である。したがって、酵母ディスプレイ技術は、酵母細胞の表面上に発現される場合に、より良好な抗原認識用の抗体構造モチーフを模倣する一助となる。

ゆえに、本開示の原核生物ベクター及び真核生物ベクターを使用することによるこれらの2つの補完的な技術の組合せは、高度に多様な抗体ライブラリーのスクリーニング、及び特定の抗原に対する新しい抗体分子の開発に有利である。同定されたリード分子は、製品化の可能性がより高い。というのも、本ストラテジーは、より高い抗体ライブラリー多様化、真核生物システムによるスクリーニング、及び合理的な設計の組込みを考慮しているからである。

本開示の一実施形態において、本発明のベクターの特有の/重要な特徴は、Table 1(表1)において更に要約されている。

本開示は、以下の実施例を参照して更に説明され、これは事実上、例示のためだけのものであり、本開示の範囲をいかなる形であれ限定すると解釈されるべきでない。

本開示/実施例で使用される生物材料は全て、インド国外から得られた。

使用した材料:
以下の材料を使用して、本実施例に至った:

1Kbラダー(Invitrogen社、USA);アガロース(SIGMA社、USA);ゲル溶出キット(Qiagen社、USA);Mini prepキット(Qiagen社、USA);Taqポリメラーゼ(NEB社、USA);dATP(NEB社、USA);T4 DNAリガーゼ(NEB社、USA);LB-アガー,dam-/dcm-(NEB社、USA)、Neb5alpha(NEB社、USA);アンピシリン(MP Biomedicals社、USA);NcoI-HF(NEB社、USA);XbaI(NEB社、USA);HindIII-HF(NEB社、USA);AscI(NEB社、USA);HindIII-HF(NEB社、USA);AscI(NEB社、USA);NotI(NEB社、USA)、SpeI-HF(NEB社、USA)、SacII(NEB社、USA)、XhoI(NEB社、USA);TG1細胞(Lucigen社、USA);T4 DNAリガーゼ(NEB社、USA);PCR精製キット(Qiagen社、USA);LB-アガー;Mini prepキット(Qiagen社、USA);LB-ブロス;アンピシリン(MP Biomedicals社、USA);カナマイシン(MP biomedicals社、USA);Infusion HD(Clontech社、USA);グリセロール(Fischer Scientific社、USA);デキストロース(Merck社、USA);カザミノ酸(BD社、USA);Yeast Nitrogen Base(SIGMA社、USA);リン酸水素二ナトリウム(SIGMA社、USA);ガラクトース(SIGMA社、USA);YPDブロス(SIGMA社、USA);Ura Trpダブルドロップアウトサプリメント(Clontech社、USA)。

更に、以下のベクター構築体/ベクター骨格を、Microbial Type Culture Collection and Gene Bank(MTCC)インドに寄託した。

(実施例1)
一般的なベクター設計ストラテジー:
ナイーブな又は免疫性の又は合成のライブラリー等の抗体ライブラリーの成功は、専ら、多様でなければならない特有の設計、及び十分に大きくなければならない最終のライブラリーサイズ次第である。あらゆる抗体ライブラリーのサイズ及び多様性と、抗体の特異性及び親和性とは、直接関連している。可変軽鎖及び可変重鎖のレパートリー(合成又はナイーブ)の重大な設計以外に、大きなレパートリーに対処するためのシステムの、とりわけ様々な発現ベクターの開発が、極めて重要である。述べられた事実に加えて、各ベクターの有用性を戦略的にアラインすることは、ライブラリーの生成及びスクリーニングを成功させるのに重要な特徴である。

本方法は、カッパ及びラムダ軽鎖定常領域及び重鎖定常領域に向けて指定した特定の修飾を、他の特徴/修飾と共に有する抗体に対処して、これをFabフォーマットで発現するための、2つの特有のファージミドベクターの開発に関する。

開発されたベクターを用いて、天然のソース及び合成的に設計されたソースに互換的に由来する抗体レパートリーに対処する。ナイーブファージライブラリー又は合成ファージライブラリーの生成後、これらを、様々な免疫-腫瘍学ネットワークの標的抗原に対するスクリーニングに用いる。

本方法は、本ファージミド及び本酵母発現プラスミドの、ナイーブライブラリー及び/又は合成ライブラリーからタンパク質/抗体遺伝子を発現するための、分離したタンパク質ディスプレイ技術での使用に関する。第1に、ファージディスプレイ技術を用いて、特定の抗原に対する親和性が高〜中程度である潜在的な抗体遺伝子をクローニングしてスクリーニングする。当該遺伝子を、次に、リード分子を更にスクリーニングして同定するために、酵母ディスプレイプラスミドにトランスファーする。これらの2つの補完的な技術を組み合わせることで、高度に多様な抗体ライブラリーをスクリーニングでき、かつ特定の抗原に対する新しい/リード抗体分子を開発できる。MCS I及びMCS IIに用いる制限酵素が2つの発現システムに関して同一であるので、ファージベクターから酵母ベクターへのクローン集団の円滑なトランスファーが有効である。これらの注意深く配置した制限酵素部位により、可変軽鎖の選択された集団の、ファージミドのMCS Iから、あらゆる酵母ベクターのMCS Iへのトランスファーが可能となる一方、重鎖が、あらゆる酵母ベクターのMCS IIに再配置される。intersystem transfer以外に、intra-system transfer、すなわちFabからScFvへの、若しくはその逆のディスプレイフォーマットの変更、又はフォーマットは同じであるが発現ベクターが異なる変更、例えば接合型ベクターから双シストロン性ベクター(bi-cistronic vector)へのトランスファーが、MCSベースの制限酵素の各セットを介して可能である。また、考えられる全てのシステム及びフォーマットを横断する自由な移行が、重鎖及び軽鎖のランダム化をもたらして、2つのディスプレイシステム間の差異を補うことができる。

(実施例2)
ファージミドベクターの生成:
高度に効率的かつ機能的に大きなタンパク質/ペプチドライブラリー、例えば抗体ライブラリーを得るために、以下の重要な点を考慮した:1)ファージミドベクター中の分子のPCR増幅天然プール又はインシリコで設計し、かつ合成的に開発したプールを有する、機能的かつ大きな抗体レパートリーの効率的な生成;2)抗体フォーマット、並びに適合性があるクローニングベクター及び発現ベクターの選択(これにより、適切なスクリーニング法との適合性によって例示される、選択したクローンの迅速なダウンストリーム分析に続く、いくつかのその後の特性評価実験のための選択クローンのトランスファーが可能となろう)。

Fabフォーマットの多数の分子に対処するために、2工程クローニング法を採用して、挿入物の双方の型、すなわち軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の存在を構築レベルにて確認した。

本明細書中で、ファージミドベクターは、軽鎖(Ck又はCK及びCλ又はCL)及び重鎖(ヒトIgG1-CH1ドメイン)に取り付けられた特定のヒト抗体定常領域を有する双シストロン性オペロンを有する。他の必須の特徴、例えばリボソーム結合部位、PelBシグナル配列、マルチクローニングサイト(軽鎖レパートリーについてMCS I、及び重鎖レパートリーについてMCS II)、FLAG、及びc-Mycタグが、ファージミドベクター内に存在する。タグは、CH1ドメインの延長に関連しており、Fab発現の検出に用いられることとなる。IgG1-CH1ドメインは、ファージコートPIIIタンパク質、GeneIIIPと連結している。Fabディスプレイフォーマットの一部として、重鎖が、発現されたGeneIIIPタンパク質を介して結合した形態でファージ上にディスプレイされる一方、軽鎖は、別個のフラグメントとして発現されて、周縁細胞質中に分泌され、そこで重鎖と対形成して、ディスプレイ構成を完成させる。アンバー終止コドン(TAG)を、抗体遺伝子とファージGeneIIIPタンパク質との間に戦略的に配置して、例示されるTG1細胞としての大腸菌の非サプレッサー株におけるFabフラグメントの生成が可能となる。軽鎖可変領域のプールを、NdeI、BglII、HindIII、及びAscI制限酵素認識部位からなるMCS I領域中にクローニングすることとした一方、重鎖可変領域を、NcoI、XbaI、NheI、及びNotI部位を含有するMCS II中に定めた。制限酵素の設計及び使用は、ヒト可変重鎖コード領域及び可変軽鎖コード領域内で切れる可能性の低さに基づいた。加えて、それらは、4ヌクレオチド以上のオーバーラップを生成して、最適なクローニング効率を導く。酵素は、メチル化によらず、推奨される二重消化の効率は、90%を超える。これらの制限酵素認識部位は、様々な発現システム、例えば酵母において、複数のベクター間で一定に維持された。クローニングサイトを一貫して維持するために、ファージミドベクター及びその後の酵母中のベクターにおいて、いくつかの修飾を行った。先に記載したように、これらのベクターを用いて、ナイーブ起源の、及び合成起源のヌクレオチド配列のプールに対処するので、ライブラリー生成プロセス及びその後の酵母中へのトランスファーを容易にするために、いくつかの特有の変化が組み込まれる。また、これらの変化は、アミノ酸組成物又は翻訳のフレームを変えることなく、特定の制限酵素認識部位又は特定のペプチドを消失させた。

一部の修飾を、ベクター骨格中で実行した。他の個々の要素/配列は、以下の通りである:
1.NotI、EagI、SpeI、XmaI、SmaI、SfiI(配列番号30、2045bp〜2106bp)は、pADL23cベクターから除去したごく少数の制限酵素である(図1)。
2.ベクター骨格由来のEcoRI(配列番号30、2004bp〜2009bp)及びBstXI(配列番号30、2116bp〜2127bp)酵素部位を修飾している。
3.特定の領域(配列番号30、2108bp〜2128bp、及び配列番号30、2132bp〜2161bp)を、pADL23cベクター骨格から除去した。
4.BamHI制限酵素認識部位(配列番号30、2754bp〜2760bp)を、GeneIIIPタンパク質から修飾した。
5.BstEII(配列番号27、2882bp〜2888bp)、Bsu36I(配列番号27、2779bp〜2786bp)、及びBbeI(配列番号27、2733bp〜2738bp)酵素部位を、CH1領域中で修飾した。
6.HindIII部位を、c-Mycタグ(配列番号2、2958bp〜2963bp)から修飾した。
7.BlpI(配列番号28、2345bp〜2351bp)を、CKから除去した。

前述の変化の一部を、本開示の図1においても強調している。

よく理解できるように、ライブラリー(ナイーブ抗体ライブラリー又は合成抗体ライブラリー)を生成してスクリーニングする第1の工程であるファージミドベクターを、その後の様々なプロセスを最大限考慮して設計した。まとめると、これは、ライブラリー構築、及びスクリーニングに沿う動きにとって最も効率的な経路であった。

全ての修飾及び目的を考慮して、挿入/発現カセットを、カッパ(図2A及び配列番号1)及びラムダ(図3A及び配列番号3)について設計して合成してから、挿入/発現カセットを、商業的に調達したpADL23cベクター骨格中に組み込んだ。これをその後、いくつかの修飾にかけてから、挿入/発現カセットを線状化及びクローニングした。2つの異なるファージミドベクターの生成に向けて、pADL23cをベクター骨格として用いた。これらのファージミドベクターは、軽鎖定常領域、すなわち、カッパ軽鎖定常領域及びラムダ軽鎖定常領域により、極めて分化することとなる。相同組換えベースのアプローチを採用して、挿入/発現カセットを、修飾pADL23c骨格中にクローニングした。合成したカッパ挿入構築体及びラムダ挿入構築体を、dam-/dcm-細胞中に形質転換して、各DNAを、qiagen社のmidi prepキットを用いてバルク量で単離して、更に消化した。カッパ挿入物をクローニングするストラテジーは、ラムダ挿入物のクローニングと比較して、僅かに異なった。約10μgのpADL23cを、BamHI-HF及びEcoRI-HF酵素を用いて線状化した一方、約5μgの挿入物カッパを、SfiI酵素で消化した。他方では、約5μgのラムダ挿入物を、第1に、PvuIで約37℃にて約2時間消化してから、SfiIを加えて約37℃にて約2時間消化した。これは、3つのバンドを生じ、所望のバンドサイズは約2.3kbであった。線状化ベクターpADL23c並びに消化したカッパ挿入物及びラムダ挿入物をゲル溶出する。そこでは、切り出したゲルを、約3容量のBuffer QX1溶液を混合することによって、溶解させる。約30μLのQIAEX IIビーズを加えて、30秒間ボルテックスしてから、約50℃にて約10分間インキュベートする。一連の洗浄をビーズに施す;第1に、約500μLのQX1による洗浄、続いて約500μLのPEバッファによる2回の洗浄。DNAを、約30μLのヌクレアーゼフリー水で溶出する。以下のTable 2〜Table 4(表3〜表5)は、pADL23cベクターを線状化するのに用いた成分/試薬を、並びにカッパ挿入物及びラムダ挿入物ベースのファージミドベクターの生成を示している。

Infusion反応を、ベクター、並びに挿入物のカッパ挿入物及びラムダ挿入物(Table 5(表6))用にセットアップしてから、約50℃にて約15分間インキュベーションした。インキュベーション後、約2.5μlのIn-Fusion反応混合物を、50μLのStellarコンピテント細胞に加えた。反応混合物を、氷上で約30分間インキュベートしてから、約500μLのSOC培地を加えて、形質転換細胞を回収した。細胞を、アンピシリン入りLBアガープレート上にプレーティングしてから、約37℃にて一晩インキュベートした。コロニーが翌日に出現し、これを5mL LB-Amp中に植菌して、プラスミドを単離した。単離したプラスミドを、BamHI/EcoRI及びNcoI/HindIIIによる制限消化分析についてチェックして、カッパ挿入物の存在について確認し(図2B及び図2C)、ラムダベクターについては、クローンを、PvuII、NcoI/HindIII-HF、NcoI/PvuII、及びNdeI/PvuII単独について、又はそれぞれ組み合わせて、試験した(図3B及び図3C)。陽性クローンを配列決定に出して、エラーがないことが見出された。ファージミドベクターを、カッパ挿入物を有するpZB001ファージミド(図2D及び配列番号2)及びラムダ挿入物を有するpZB001.1ファージミド(図3D及び配列番号4)と命名した。ベクターpZB001を、Budapest条約に基づいて、MTCCに、MTCC25125の受託番号でpZB001と命名して付託した。更に、軽鎖定常領域(ラムダ挿入物CL)を有するファージミドベクターは、上述の実験手順及び寄託したファージミドベクター(カッパ挿入物)の詳細に基づいて、当業者が調製することができる。

配列確認したファージミドベクターpZB001及びpZB001.1を、標的抗原に対するスクリーニング/パンニング用のナイーブファージライブラリー及び合成ファージライブラリーの生成に用いた。ライブラリーのサイズ及び多様性を、ピアグループ及び次世代シーケンシングアプローチの双方によって推定した。パンニングした分子の配列決定結果もまた、パンニングした分子の多様性が保持されることを確認した。一本鎖DNAを、パンニングした分子から単離して、酵母発現ベクターにトランスファーすることとした。

(実施例3)
酵母発現ベクターの生成:
抗体ディスプレイライブラリーは、他の細胞タンパク質に連結した、細胞表面上に発現される部分的な、又は完全な抗体のライブラリーを表す。ファージディスプレイは、クローニングの容易さに起因して、最も受け入れられている方法であり、大きなライブラリーサイズ、一価のディスプレイ、及び様々な安定性パラメータの判定の容易さが許容される。しかしながら、ファージディスプレイでは、これに付随して、原核発現システム、及びそれによってディスプレイされる抗体フラグメントの翻訳後修飾の欠如のために適切なタンパク質のフォールディングに限界がある。当該限界を克服するために、酵母ディスプレイプラットフォームの、ロバストな、可変性の、抗体フラグメントを単離して操作する定量的方法論を使用する。酵母の、真核生物ディスプレイシステムはそのまま、蛍光活性化細胞選別(FACS)ソーティング手法を使用する定量的かつリアルタイムの評価と適合性がある選択である。

他のインビトロディスプレイ技術と比較すると、凝集素接着受容体複合体Aga1P及びAga2Pを用いたナイーブ/非免疫性抗体ライブラリーの酵母ディスプレイは、相当数の利点を有する。例えば、フローサイトメトリ分析の使用により、相互排他的なクローンのK_D判定、K_off測定、及びエピトープ結合が挙げられる迅速なクローン特性評価が、酵母の表面上で直接可能となる。これは、当該特性評価を実行するためのタンパク質の精製の必要性を除外する。酵母上でのFab抗体フラグメントのディスプレイの成功は、大きなライブラリー構築へのより単純なアプローチを示唆している。Fabフラグメントが重鎖及び軽鎖で構成されるので、異なる酵母株中で異なるベクター上に2つのポリペプチドをコードすることが可能であり、2本の鎖が一緒に、接合の高度に効率的なプロセスによって、単一の二倍体酵母内に取り込まれ得る。しかしながら、酵母ディスプレイの場合における主な困難は、酵母における形質転換効率がより低いことに起因する、比較的小さなライブラリーサイズであり、これは、ファージ及び/又は酵母ディスプレイの組合せ概念を使用する本開示によって提供される態様によって、ここに克服される。

上述の事実からよく理解できるように、ファージパンニングした分子は、様々な酵母発現ベクターにコンビナトリアル式に、又は非コンビナトリアル式に、ScFv、Fab等の様々なフォーマットでトランスファーされるはずである。ファージミドから酵母ベクターへの使い勝手の良いトランスファーを達成するために、マルチクローニングサイトを全く同じに維持した。本明細書中で、酵母発現ベクターは、軽鎖(Ck又はCK及びCλ又はCL)及び重鎖(ヒトIgG1-CH1ドメイン)に取り付けられた特定のヒト抗体定常領域を有する双シストロン性双方向性又は双シストロン性片方向性のいずれかである。他の重大な特徴、例えばリーダーシグナル配列(軽鎖について接合型アルファ因子;重鎖についてAga2Pリーダーペプチド)、マルチクローニングサイト(軽鎖レパートリーについてMCS I、及び重鎖レパートリーについてMCS II)、タグ(軽鎖についてV5エピトープタグ及び6×Hisタグ;重鎖レパートリーについてFLAGタグ及びc-Mycタグ)が、酵母ベクターの全種類に存在する。タグは、定常ドメインの延長に関連しており、Fab発現の検出に用いられることとなる。表面ディスプレイによって酵母ライブラリーを得るためのスクリーニングは、競合する抗原性エピトープ、抗体パラトープ構造、配列、及び配列モチーフ、又はそれらのあらゆる組合せを使用して、Fab分子又はScFv分子を、重鎖中のタグの後に戦略的に配置したタバコエッチウイルス(TEV)、エンテロキナーゼ(Ek)その他を含む群から選択されるプロテアーゼ切断部位を用いて単離することによって、実行する。

開発した酵母ベクターの生成アプローチは、3つのタイプ:1)双シストロン性双方向性ベクター;2)双シストロン性片方向性ベクター;3)ScFvベクター、及び4)接合型ベクターのものがある。

(A)酵母双シストロン性双方向性ベクター(pZB004及びpZB004.1)の生成:
酵母双シストロン性双方向性ベクターを生成するために、pRS314ベクター(ATCC、USA)を骨格として用いた(図4)。修飾の一部をベクター骨格内に実行した。他の個々の要素/配列は、以下の通りである:
1.SacI、SacII、EagI、NotI、SpeI、BamHI、XmaI、SmaI、PstI、EcoRI、EcoRV、SalI、XhoI、ApaIは、pRS314ベクターから除去したごく少数の制限酵素である(配列番号31、図4に示す1893bpから1989bp)。
2.SpeI部位(配列番号29、2600bpから2605bp)を、ラムダ軽鎖定常領域(CL)から消失させた。

更に、カッパ(図5A及び配列番号5)及びラムダ(図6A及び配列番号7)についての挿入/発現カセットを、Gal1/10プロモーター、アルファリーダーペプチド、Aga2Pリーダーペプチド、MCS I及びMCS II、タグ(軽鎖についてV5及びHis-タグ、並びに重鎖についてFLAG、c-Myc)を含み、各定常領域が、軽鎖(Ck又はCλ)及び重鎖(ヒトIgG1-CH1ドメイン)の双方に取り付けられるように、設計して合成した。SpeI制限酵素認識部位を、Cλ領域から除去した。

Fabディスプレイフォーマットの一部として、重鎖が、発現されたAga2Pタンパク質を介して結合した形態で酵母上にディスプレイされることとなる一方、軽鎖は、別個のフラグメントとして発現される。軽鎖は、タンパク質成熟プロセス中に、重鎖と対形成して、Fabディスプレイ構成を完成させる。重鎖用のCYC1ターミネーター及び軽鎖用のアルファターミネーターによって例示されるように、別個のターミネーター配列を維持した。可溶性のFabによる更なるスクリーニングプロセスを補助するために、TEVプロテアーゼ切断部位を、タグの後ろに、及びAga2Pタンパク質配列の前に固定した。タンパク質構造内にフレキシビリティを導入するために、(G4S)₃リンカー領域を、Aga2Pタンパク質の開始点の前に戦略的に配置する。

約10μgのpRS314ベクター及びカッパ挿入物酵母を、EcoRV及びKpnI(Table 6(表7及び表8))で約37℃にて一晩消化してから、ゲル溶出した。そこでは、切り出したゲルを、約3容量のBuffer QX1溶液を混合することによって、溶解させる。約30μLのQIAEX IIビーズを加えて、約30秒間ボルテックスしてから、約50℃にて約10分間インキュベートする。一連の洗浄をビーズに施す。第1に、約500μLのQX1による洗浄、続いて約500μLのPEバッファによる2回の洗浄。DNAを、約30μLのヌクレアーゼフリー水で溶出する。消化かつ溶出した、約3μgのpRS314及びカッパ挿入物酵母を、KpnI及びEcoRVで約37℃にて一晩更に切断してから、ゲル溶出及びライゲーションをセットアップした。

ライゲーションセットアップを個々に、カッパベクターについて、1:5の比率で行ってから、高コンピテント細胞TG1中に個々に形質転換した。個々のコロニーをピックアップして、植菌してから、プラスミドDNAを単離して、PvuII酵素を用いた制限消化をセットアップした。確認したクローンは、約4.3Kbのフラグメント及び約2.9Kbのフラグメントのバンドを生成する(図5B)。陽性クローンを、EcoRV/KpnI酵素及びNdeI/KpnI酵素の各組合せによる制限消化によって、更に確認した。前者は、約3.7Kb及び約3.5Kbのサイズをもたらす一方、後者は、約5.5Kb及び約1.8Kbのフラグメントをもたらす(図5C及び図5D)。確認したクローンを配列決定に出して、エラーがないことが見出された(図5E及び配列番号6)。カッパ軽鎖定常領域を含有する、確認した酵母双方向性ベクターを、Budapest条約に基づいて、MTCCに、MTCC 25128の受託番号でpZB004と命名して付託した。

更に、ラムダ軽鎖定常領域を有する酵母双シストロン性双方向性ベクターを、カッパ挿入物を有する、寄託した前記ベクター酵母双シストロン性双方向性ベクターを用いることによって、調製する。同じものを調製し、確認して寄託した10μgのカッパベクター(pZB004)及びラムダ挿入物酵母(配列番号7)をSpeI-HF/SacIIで消化してから(Table 8(表10))、ゲル溶出して、約4℃にて一晩ライゲーションした(Table 9(表11))。25ngのライゲーション混合物を、TG1コンピテント細胞中に形質転換した。個々のコロニーを植菌して、PvuII、NdeI/NotI、及びNcoI/AscI酵素による挿入物放出に関してスクリーニングした(図6B)。陽性クローンを配列決定に出して、エラーがないことが見出された(図6C)。ラムダ軽鎖定常領域を含有する、確認した酵母双シストロン性双方向性ベクターを、pZB004.1(配列番号8)と命名する。

(B)酵母双シストロン性片方向性ベクター(pZB004.2及びpZB004.3)の生成:非コンビナトリアルトランスファーの概念
重鎖及び軽鎖をFabフォーマットで発現する2つの別個のプロモーターの選択肢を有するように、酵母双シストロン性片方向性ベクターを設計した。その上、当該ベクターの特有の構成が、ファージシステムから酵母システムへのFab分子の非コンビナトリアルトランスファーを可能にすることとなる。これが今度は、真核生物システムで検討するために特定の組合せの重鎖及び軽鎖を保存することとなる。

酵母双シストロン性片方向性ベクターを生成するために、寄託した酵母双シストロン性双方向性ベクターを骨格として用い、そこではカッパ(図7A及び配列番号9)及びラムダ(図8A及び配列番号11)についての挿入物を、2つのGal1/10プロモーター(軽鎖及び重鎖)、アルファリーダーペプチド、Aga2Pリーダーペプチド、MCS I及びMCS II、タグ(軽鎖についてV5及びHis-タグ、並びに重鎖についてFLAG、c-Myc)を含み、各定常領域が、軽鎖(CK又はCL)及び重鎖(ヒトIgG1-CH1ドメイン)の双方に取り付けられるように、設計して合成した。確認された酵母双シストロン性双方向性ベクターのカッパ及びラムダ、並びに合成されたカッパ及びラムダ挿入物を、SpeI-HF及びSacII制限酵素で約37℃にて約3時間消化した(表12(Table 10))。消化したベクター(約4.8Kb)及び挿入物(カッパ及びラムダ、約2.9Kb)をゲル溶出して、ライゲーション反応(表13(Table 11))を、約4℃にて一晩セットアップしてから、ヒートショック法によってNEB 5-アルファコンピテント大腸菌細胞中で形質転換した。個々のコロニーを植菌して、SpeI-HF/SacII酵素による挿入物放出(約2.9Kb)及びHindIII-HF酵素による内部消化(約1.7Kb)に関してスクリーニングした(図7B及び図8B)。陽性クローンを配列決定に出して、エラーがないことを見出した(図7C及び図8C)。カッパ軽鎖定常領域及びラムダ軽鎖定常領域を含有する、確認された酵母片方向性ベクターを、それぞれpZB004.2(配列番号10)及びpZB004.3(配列番号12)と命名する。

(C)酵母ScFvベクター:pZB004.4の生成
酵母ディスプレイ研究のために生成した別の代替ベクターが、ScFv分子について適合性があった。この構築体の生成物は、Fabフォーマットと異なるScFvフォーマットの抗体分子であり、重鎖及び軽鎖双方の定常領域が除去されている。当該ベクターは、pRS314ベクター(ATCC、USA)に由来した構築体の骨格に基づいた(図9)。修飾の一部をベクター骨格内に実行した。他の個々の要素/配列は、以下の通りである:
1.EagI、NotI、SpeI、BamHI、XmaI、SmaI、PstI、EcoRI、EcoRV、SalI、XhoIは、pRS314ベクターから除去したごく少数の制限酵素である(配列番号31、1904bp〜1984bp、図9に示す)。

ベクター骨格中の遺伝子を、設計して合成した挿入/発現カセット(図10A及び配列番号13)と、ApaI酵素とSacII酵素との間で置換した。設計した挿入物は、Gal1プロモーター、Aga2Pタンパク質配列をコードするヌクレオチド、Aga2Pリーダー配列、Xa因子部位、HAタグ、TEV切断部位、MCS I(軽鎖可変領域の組込み用に、NdeI、BglII、HindIII、及びAscI)、リンカー領域(G₄S)、MCS II(重鎖可変領域の組込み用に、NcoI、XbaI、NheI、及びNotI)、c-Mycタグ、FLAGタグ、アルファターミネーターを含有する。

以下のTable 12(表14)及びTable 13(表15)に示すように、約10μgのベクター及び挿入物を、ApaIで約25℃にて一晩消化してから、SacII酵素を加えて約37℃にて約3時間消化した。消化した材料をゲル溶出して、約4℃にて一晩ライゲーションした。2μLのライゲーションした混合物を、NEBアルファコンピテント細胞中に形質転換した。個々のコロニーを植菌して、EcoRV/XhoI酵素による内部消化(約2.9Kb)に関してスクリーニングした(図10B)。陽性クローンを配列決定に出して、エラーがないことが見出された(図10C)。重鎖及び軽鎖の組込み部位を含有する、確認された酵母ScFvベクターを、pZB004.4(配列番号14)と命名する。

(D)酵母接合型ベクター(YMTベクター)の構築:
酵母表面ディスプレイ技術は、その酵母形質転換効率の限界に起因して、ファージ(10⁹〜10¹¹)又はリボソーム(10¹¹〜10¹²)ディスプレイ技術と比較すると、ライブラリーサイズに制約がある(典型的には10⁶〜10⁸)。酵母形質転換法の向上により、この限界を克服することができる。しかしながら、向上した様々な酵母形質転換プロトコルは、時間を浪費し、かつ労力を要するものである。そこで、大きな抗体ライブラリーを生成する強力なツールとして、酵母接合を用いることができる。酵母接合は、MATa細胞のa-凝集素とMATα細胞のα-凝集素との相互作用を通して、相対する接合型の2つの一倍体細胞間の細胞融合によって達成される。接合の後、各一倍体細胞中の2つの異なるプラスミドが、1つの二倍体細胞中に組み合わされて、以降の二倍体細胞中の各プラスミドから、コードされた抗体フラグメントが同時に発現される。Fab抗体フラグメントは、2つの鎖;VH及びCH1による重鎖(HC)(重鎖定常領域の第1のドメイン)並びにVL及びCLによる軽鎖(LC)(軽鎖定常ドメイン)を含む。ゆえに、酵母接合は、HCライブラリー及びLCライブラリーを含有する、相対する接合型の2つの一倍体細胞からのコンビナトリアルFabライブラリーの構築に適している。CH1及びCL(軽鎖定常ドメイン)の2つのC末端Cys残基間のジスルフィド結合の形成による酵母表面固定HCとの、分泌されたLCのヘテロ二量体化が、酵母細胞表面上でのディスプレイFabの構築を促進する。

(D.1)出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)中の接合型重鎖(HC)発現ベクター(pZB002)の構築
タグ及びTEV切断部位を有するHC鎖(VH+CH1)を、GAL1プロモーター及びCYC1ターミネーターの制御下で、酵母細胞の表面上に発現させるように、接合型重鎖発現ベクターを設計する。当該ベクター中に存在するAga2Pシグナル配列が、HC鎖が分泌経路に向かうように促進する。様々な制限酵素認識部位の組合せが、ファージミドからHC発現ベクターに、ファージパンニングした分子(VH)をトランスファーするのに重要である。これを達成するために、特有の制限酵素認識部位(NcoI、BmtI、NheI、NotI)を、Aga2Pシグナル配列とCH1オープンリーディングフレームとの間に維持する。mycタグ及びFLAGタグを、フローサイトメトリスクリーニング中にHC鎖を検出するために存在させる。酵母細胞表面からFabフラグメントを切断するために、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼ、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ(TEV)及びエンテロキナーゼ(EK)部位を、HC発現ベクター中に組み込む。

接合型重鎖HCベクター(pZB002)の構築のために、p414GAL1及びHC DNAカセット(配列番号15)を用いた。ATCC(Cat.No.ATCC(登録商標)87328(商標))由来の、TRP1マーカーを有するCENベースのシャトルベクター、p414 GAL1を、HC DNAカセットに適合するように修飾した。前記修飾を図11に示し、以下に要約する:
1)BamHI、SmaI、PstI、EcoRI、BspDI、SalI、TspMI、ClaI、HincII、及びXmaI制限酵素認識部位を修飾した。先で言及した制限酵素認識部位を修飾するために、2208bpから2158bpまでのヌクレオチドを、p414 GAL1から除去する(配列番号32及び図11)。

HC DNAカセット(配列番号15)を、特有のAGA2P単一配列コード領域、マルチクローニングサイト(NcoI、BmtI、NheI、NotI)、最後の位置に無傷のシステイン残基を有する重鎖定常領域1(CH1)に続くタグ(c-myc及びFLAG)、c末端でAGA2Pオープンリーディングフレームと融合するTEV切断部位で構成する。HC DNAカセットを、Gene Art社で合成する。HC DNAカセット(図12A)及びp414 GAL1を、SpeI及びXhoIで37℃にて消化して、更に(4℃にて)ライゲーションして、pZB002を生じさせる(図12B)。合成pZB002 HC発現ベクターを、MTCCに、受託番号MTCC 25126で寄託する。HC DNAカセットを、GAL1プロモーター及びCYC1ターミネーターの制御下に置いた。pZB002中に、ファージパンニングしたライブラリーから受け取ったVH領域をクローニングするために、AGA2Pシグナル配列の後に、特有のNcoI、BmtI、NheI、及びNotI部位を維持した。

以下の表により、pZB002(図12C及び配列番号16)の特徴を理解することができる。

(D.2)出芽酵母中の接合型軽鎖(LCλ)発現ベクター(pZB003.1)の構築:
タグを有するLC鎖(VL+LCλ)を、GAL1プロモーター及びCYC1ターミネーターの制御下で、酵母細胞の表面上に発現かつ分泌させるように、接合型軽鎖発現ベクターを設計する。当該ベクター中に存在する接合アルファ因子単一配列(pre領域)は、LC鎖が分泌経路に向かうように促進する。様々な制限酵素認識部位の組合せが、ファージミドからHC発現ベクターに、ファージパンニングした分子(VL)をトランスファーするのに重要である。これを達成するために、特有の制限酵素認識部位(NdeI、BglII、HindIII、及びAscI)を、単一の接合アルファ因子とLCλオープンリーディングフレームとの間に維持する。V5タグ及びHisタグの存在によって、フローサイトメトリスクリーニング中におけるLCλ鎖の検出がもたらされる。

p416 GAL1は、ATCC(ATCC(登録商標)87332(商標))由来の、URA3マーカーを有するCENベースのシャトルベクターである(図13)。これを用いて、シグナル配列が異なるいくつかの軽鎖構築体を生成した。前記p416 GAL1ベクター骨格を、図13に示すように修飾して、以下に要約する:
1)BamHI、SmaI、XmaI、TspMI、EcoRI、HindIII、BspDI、ClaI、及びSaII制限酵素認識部位を修飾した。先で言及した制限酵素認識部位を修飾するために、2318bpから2268bpまでのヌクレオチドを、p416 GAL1から除去する。

LCλのSS01ベースの分泌プラスミドの構築のために、修飾p416 GAL1及びLCλDNAカセット(配列番号19)を用いた。LCλカセットを、アルファ因子単一配列(SS01)、特有のマルチクローニングサイト(NdeI、BglII、HindIII、及びAscI)、及び最後の位置に無傷のシステイン残基を有する軽鎖定常領域(LCλ)に続くタグ(V5及びHis)で構成する。LCλDNAカセット(図14A)を、Gene Art社で合成する。修飾したp416 GAL1及びLCλを、SpeI及びXhoIで37℃にて消化して、更に4℃にてライゲーションして、pZB003.1を生じさせる(Table 18(表20)及びTable 19(表21);図14B)。LCλDNAカセットを、pZB003.1ベクター中でGAL1プロモーター及びCYC1ターミネーターの制御下に置くこととする。pZB003.1ベクター(図14C)中に、ファージパンニングしたライブラリーからVL領域をクローニングするために、SS01シグナル配列の後に、特有のNdeI、BglII、HindIII、及びAscI部位を維持した。生成したpZB003.1ベクターを、配列番号20として提供する。

以下のTable 19(表21)により、pZB003.1の特徴を理解することができる。

(D.3)出芽酵母中のSS01シグナル配列を有する接合型軽鎖(LCκ)発現ベクター(pZB003.2)の構築:
タグを有するLC鎖(VL+LCκ)を、GAL1プロモーター及びCYC1ターミネーターの制御下で、酵母細胞の表面上に発現かつ分泌させるように、接合型軽鎖発現ベクターを設計する。当該ベクター中に存在する接合アルファ因子単一配列(pre領域)は、LC鎖が分泌経路上に向かうように促進する。様々な制限酵素認識部位の組合せが、ファージミドからHC発現ベクターに、ファージパンニングした分子(VL)をトランスファーするのに重要である。これを達成するために、特有の制限酵素認識部位(NdeI、BglII、HindIII、及びAscI)を、単一の接合アルファ因子とLCκオープンリーディングフレームとの間に維持する。V5タグ及びHisタグの存在によって、フローサイトメトリスクリーニング中に、LCκ鎖が検出される。

LCκのSS01ベースの分泌プラスミドの構築のために、修飾p416 GAL1及びSS01-LCκDNA(配列番号21)カセットを用いた。p416 GAL1は、ATCC(ATCC(登録商標)87332(商標))由来の、URA3マーカーを有するCENベースのシャトルベクターである。LCκカセットを、接合アルファ因子単一配列(SS01)、特有のマルチクローニングサイト(NdeI、BglII、HindIII、及びAscI)、最後の位置に無傷のシステイン残基を有する軽鎖定常領域(LCκ)に続くタグ(V5及びHis)で構成する。LCκカセット(図15A)を、Gene Art社で合成する。p416 GAL1及びLCκを、SpeI及びXhoIで約37℃にて消化して、更に約4℃にてライゲーションして、pZB003.2ベクターを生じさせる(Table 21(表23)及びTable 22(表24);図15B)。LCκDNAカセットを、pZB003.2中でGAL1プロモーター及びCYC1ターミネーターの制御下に置くこととする。pZB003.2ベクター(図15C)中に、ファージパンニングしたライブラリーからVL領域をクローニングするために、SS01シグナル配列の後に、特有のNdeI、BglII、HindIII、及びAscI部位を維持した。合成したpZB003.2ベクターを、配列番号22として提供する。

以下の表により、pZB003.2の特徴を理解することができる。

(D.4)SS02シグナル配列を有する出芽酵母中の接合型軽鎖LCκ発現ベクター(pZB003)の構築:
LC鎖のより良好な分泌を促進するために、SS02シグナル配列を、接合因子アルファ1シグナル配列(pre領域)の代わりに導入する。SS02は、pre及びpro領域を含む操作された接合因子アルファ第1因子シグナル配列であり、appS4と呼ばれる。appS4は、pre及びpro領域を含む接合因子アルファ1シグナル配列よりも分泌能力が16倍良好であることが以前に実証された。

LCκのSS02ベースの分泌プラスミドの構築のために、pZB003.2及びSS02-LCκカセット(図16A)(配列番号17)を用いた。SS02 DNAカセットは、操作されたアルファ因子単一配列(appS4)コード領域を含有する。SS02 DNAカセットを、Gene Art社で合成する。pZB003.2及びSS02-LCκを、SpeI及びHindIIIで約37℃にて消化して、更に約4℃にてライゲーションして、pZB003を生じさせる(Table 24(表26)及びTable 25(表27);図16B)。合成したpZB003ベクター(図16C)を、配列番号18として提供し、MTCCに、受託番号MTCC 25127で寄託する。

以下の表により、pZB003の特徴を理解することができる。

(D.5)SS03シグナル配列を有する出芽酵母中の接合型軽鎖LCκ発現ベクター(pZB003.3)の構築:
LC鎖のより良好な分泌を促進するために、SS03シグナル配列を、接合因子アルファ1シグナル配列(Pre領域)の代わりに導入する。SS03は、pre及びpro領域を含む操作された接合因子アルファ第1因子シグナル配列であり、app8と呼ばれる。app8は、pre及びpro領域を含む接合因子アルファ1シグナル配列よりも分泌能力が16倍良好である。

LCκのSS03ベースの分泌プラスミドの構築のために、pZB003.2及びSS03-LCκDNA(配列番号23)を用いた。SS03 DNAカセットは、操作されたアルファ因子単一配列(app8)コード領域を含有する。pZB003.2及びSS03-LCκDNAを、SpeI及びHindIIIで約37℃にて消化して、更に約4℃にてライゲーションして、pZB003.3を生じさせる(Table 27(表29)及びTable 28(表30);図17A及び図17B)。合成pZB003.3ベクター(図17C)を、配列番号24として提供する。

以下の表により、pZB003.3の特徴を理解することができる。

(D.6)SS04シグナル配列を有する出芽酵母中の接合型軽鎖LCκ発現ベクター(pZB003.4)の構築:
LC鎖のより良好な分泌を促進するために、SS04シグナル配列を、接合因子アルファ1シグナル配列(pre領域)の代わりに導入する。SS04は、酵母中の様々なタンパク質について分泌能力を有するSuc2pシグナル配列である。

LCκのSS04ベースの分泌プラスミドの構築のために、pZB003.2及びSS04 DNA-LCκカセット(配列番号25)を用いた。SS04 DNAカセットは、Suc2pシグナル配列コード領域を含有する。pZB003.2及びSS04 DNA-LCκを、SpeI及びHindIIIで約37℃にて消化して、更に約4℃にてライゲーションして、pZB003.4を生じさせる(Table 30(表32)及びTable 31(表33);図18A及び図18B)。合成したpZB003.4ベクター(図18C)を、配列番号26として提供する。

以下の表により、pZB003.4の特徴を理解することができる。

(実施例3)
抗体ライブラリーの生成及びファージミドから酵母接合ベクターへのライブラリーのトランスファー
健康なヒトドナー由来のナイーブレパートリーを表す二次PCRプール由来の5μgのカッパ及びラムダ軽鎖、並びにファージミドベクター(それぞれカッパpZB001及びラムダpZB001.1)を、HindIII-HF及びAscIにより約37℃にて一晩、約100μLの総容量で消化する。消化したサンプルをゲル溶出してから、約4℃にて一晩のライゲーションをセットアップした。25〜50ngのライゲーション混合物を、約25μLのTG1細胞中に電気穿孔法によって形質転換する。1.0mmキュベットを用い、最適な設定は1800ボルト、600オーム、及び10μFである。回収培地中への回収後、約200μLの形質転換細胞を、144mmプレート上に広げて、約37℃にて一晩インキュベートする。翌日に、合計で約6〜8プレートからコロニーをこすり取って、約20%グリセロールのストックを作製する。希釈プレーティングによって形質転換効率を算出し、約10⁸〜約10¹⁰の範囲にある、好ましくは約10⁸であることが見出される。

細胞の総数を、希釈プレーティングによりグリセロールストックのバイアルあたりで判定して、10¹²個であることが見出される。コロニーを、約5mLのLB-Amp中に植菌して、プラスミドを単離する。単離したプラスミドを、制限消化分析についてチェックする。約300bpの挿入物放出により、プール中のカッパ及びラムダの双方の軽鎖の存在が確認された。

軽鎖プール(カッパ及びラムダ双方)の1本のバイアルを、約100mLのLB-Amp中に植菌して、約37℃のシェーカー-インキュベーターにて約2〜3時間増殖させてから、プラスミドを、qiagen midi prepキットによって、メーカーのプロトコルに従って単離する。双方の軽鎖についてmidi prepしたDNAを、制限消化分析で確認してから、その中への重鎖の組込みを続行する。少数の代表的なクローンだけを、プラスミド単離に用いて、制限消化によって確認して、軽鎖挿入物の約100%の存在が示された。別々のMidi prepを行って、プール由来のカッパ及びラムダ双方の軽鎖ライブラリーDNAを単離する。Midi prepしたDNAを、ここでも、制限消化により確認してから、重鎖プールの更なる挿入に用いる。

約5μgのカッパ及びラムダ軽鎖ライブラリーDNA、並びに重鎖の二次PCRプールを、NcoI及びXbaIにより約37℃にて一晩、約100μLの総容量で消化する。消化したサンプルをゲル溶出してから、約4℃にて一晩のライゲーションをセットアップした。25〜50ngのライゲーション混合物を、25μLのTG1細胞中に電気穿孔法によって形質転換する。1.0mmキュベットを用い、最適な設定は1800ボルト、600オーム、及び10μFである。回収培地中への回収後、約200μLの形質転換細胞を、144mmプレート上に広げて、約37℃にて一晩インキュベートする。翌日に、合計で約6〜8プレートからコロニーをこすり取って、約20%グリセロールのストックを作製し、-80℃のフリーザー内で保存する。希釈プレーティングによって形質転換効率を算出し、約10⁸〜約10¹⁰の範囲にある、好ましくは約10⁸であることが見出される。

細胞の総数を、希釈プレーティングによりグリセロールストックのバイアルあたりで判定して、10¹²個であることが見出される。コロニーを、5mLのLB-Amp中に植菌して、プラスミドを単離する。単離したプラスミドを、重鎖についてNcoI及びXbaI、並びにカッパ軽鎖及びラムダ軽鎖についてHindIII及びAscIによる制限消化分析についてチェックする。約400bpの挿入物放出により、カッパプール中の(図19A及び図19B)、及びラムダプール中の(図20A及び図20B)重鎖の存在が確認された。

重鎖、並びにカッパ及びラムダ軽鎖二次PCRプール含有DNAライブラリーを、個々に、NcoI及びXbaIで消化してからライゲーションして、高コンピテント大腸菌細胞TG1中に個々に形質転換する。

約1mlのカッパ及びラムダ細菌グリセロールストックを、約200mlのLB-AMP培地中で37℃にて、600nmでのODが0.8に達するまで増殖させる。更に、細菌に対する感染多重性(MOI)が10であるM13KO7ヘルパーファージを加えて、約37℃にてもう30分間インキュベートする。感染後、感染した細菌を遠心分離して、ペレットを、100μg/mlアンピシリン及び25μg/mlカナマイシンを有する約200mlのLB中に再懸濁させてから、約30℃にて250rpmで一晩増殖させる。懸濁液を、約4℃にて約8000rpmで約15分間スピンダウンさせてから、ペレットを破棄する。分離した上清を、上清の1/4容量のPEG/NaCl溶液と混合して、混合物を氷上で約1時間インキュベートする。混合物を10000gで約15分間遠心分離して、ファージペレットを約20mlのPBS中に再懸濁させる。グリセロールをファージ懸濁液全体に、50%の最終濃度になるまで加えて、約1mlのアリコートのファージライブラリーストックとして-80℃にて凍結させる。

カッパ及びラムダ双方の細菌ライブラリーのグリセロールストックを混合して、植菌して、ファージライブラリー生成に用いる。ヘルパーファージの付加により、多様性をディスプレイするファージ粒子を析出させて精製して、今後用いるグリセロールストックとして保存する。プラーク形成アッセイに由来するファージライブラリーの推定数は、約10¹⁰〜約10¹¹、好ましくは約10¹¹pfu/mLであると見出される。プラークの形成は、Her2抗原に対してスクリーニングされることとなるFabフラグメントをディスプレイするファージミドライブラリーの機能性を示す。パンニング実験を実行して、ナイーブプールから非結合物質を除去してから、プラーク形成アッセイを続けて、結合物質の数を推定した。結合物質の評価は、約10⁷であると見出された。これは、パンニングの成功を示す初期のファージ数よりも40低い。

ストラテジー全体の計画は、ファージから酵母発現ベクターに特定の結合物質をトランスファーして、酵母システム中でスクリーニング及びソーティングを行うことである。適合性がある方法、すなわちFACSを用いた親和性ベースの方法を使用して、最良の結合物質を更に選択して順位付けする。パンニングしたファージを増幅して、ssDNAを単離してからPCR増幅して、酵母接合型ベクター中に組み込んだ(重鎖及び軽鎖の組込みについて)。異なる酵母発現ベクター中で軽鎖ライブラリー及び重鎖ライブラリーをクローニングする接合システムを利用することによって、Fabライブラリーを開発する。しかしながら、パンニングした分子のカッパ及びラムダ軽鎖PCRプール、並びに軽鎖用に排他的に設計して生成した自社の酵母発現ベクター(pZB003.1及びpZB003.2)を、HindIII及びAscIで消化してからライゲーションして、個々に、高コンピテント細胞TG1中に形質転換する。同様に、HC鎖プール及び各ベクター(pZB002)を、NcoI及びNotIで消化してからライゲーションして、高コンピテント細胞TG1中に形質転換する。重鎖及び軽鎖双方のパンニングしたライブラリーについて得られた形質転換効率は、>10⁷cfuである。重鎖ライブラリー及び軽鎖ライブラリーの双方について得た形質転換されたコロニーを、挿入物放出について、軽鎖についてHindIII/AscIを(図21A)、及び重鎖についてNcoI/NotI(図21B)を用いてチェックしてから、グリセロールストック調製用にこすり取る。双方の鎖についての挿入物放出により、パンニングした分子の存在が確認された。グリセロールストックを、今後に用いるために-80℃にて保存する。

確認して直ぐに、約1μgの各DNAをとって、電気穿孔法によって酵母細胞中に、約5×10⁶〜2×10⁷細胞/mlにて形質転換する。形質転換用の株に関して、重鎖ライブラリーの細胞表面ディスプレイ用の宿主としてEBY100を用いる一方、軽鎖ライブラリーを発現させるのにYVH10を用いる。形質転換後、プレートを約30℃にて2〜4日間インキュベートして、形質転換体を増殖させる。重鎖及び軽鎖双方のパンニングしたライブラリーを、酵母株(EBY100-ura3Δ及びYVH10)中に首尾よく形質転換する。効率は>10⁶である。

ライブラリーのFabフォーマットを表面上にディスプレイするために、重鎖ライブラリー及び軽鎖ライブラリーを表す2つの増殖した一倍体細胞の接合を、等しい数の一倍体細胞を混合することによって実行する。接合効率を、単選択プレートにおける総コロニーの数で割った、二重選択プレートにおける二倍体コロニーの数として算出し、算出された接合パーセンテージは約40%である。更に、二倍体細胞を、あらゆる増殖及び発現分析の前に、二重脱落培地(ura^-、Trp^-)中で富化する。

重鎖プール及び軽鎖カッパプールを発現するプラスミドを有する出芽酵母2Nライブラリーを、10mlのSDCAA二重脱落培地中に植菌して、約30℃にて一晩(16〜20時間)増殖させる。一晩増殖させた培養体の600nmでのODを測定して、約10mlのSDCAA二重脱落グルコース培地(非誘導培養)、及び約10mlの2XSGCAA培地(誘導培養)中に、600nmでの最終ODが0.2〜0.3になるように然るべく植菌する。非誘導細胞及び誘導細胞を、約20℃にて24から48時間に及ぶ異なる時間、増殖させる。

軽鎖及び重鎖の発現が、かなりのパーセンテージで観察される。抗His抗体によって軽鎖発現を探索して、>7%であることが見出される(図22A)一方、抗c-Myc抗体で探索される重鎖が、ビオチン化したHer2による二重陽性クォードラントで、7.2のパーセンテージにて出現することが見出される(図22B)。この結果は、Fab形成、及び同じ標的抗原との結合の成功を示している。この結果は、二重栄養要求性マーカー選択二倍体が、重鎖を伴う軽鎖を発現していることを示している。ファージから酵母システムへのクローンのトランスファーに続く、Fabの発現及びその、Her2抗原への結合の成功により、本開示のファージミドベクター及び酵母ベクターの機能性及び有効性が実証される。

同様に、先のアプローチを、合成抗体/レパートリーから得た可変軽鎖(カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖)領域及び重鎖領域を用いて使用することもできる。

(実施例4)
抗体ライブラリーの生成及び酵母scFvベクターを用いたスクリーニング
別の酵母発現構築体、すなわち酵母ScFv発現構築体(pZB004.4)を、抗Her2 ScFv遺伝子配列の発現及びHer2抗原との結合について試験した。抗Her2遺伝子、V_H及びV_Lを、pZB004.4ベクター中に、NdeI/AscI酵素間とNcoI/NotI酵素間のそれぞれMCS IとMCS II内にてクローニングした。先に記載するように、クローンを酵母EBY100中に形質転換してから、発現を誘導して結合研究を行った。誘導した酵母細胞のフローサイトメトリ分析により、Her2抗原との相互作用が明らかとなった。フローサイトメトリを、ビオチン化したHer2抗原で実行した。当該抗原は、ストレプトアビジンAlexa 633結合体で検出される。加えて、抗c-myc抗体(alexa flour 488、結合体)を用いて、C末端c-mycタグの発現を検出した。結果は、識別可能な二重陽性蛍光シグナルを明らかにした。これにより、酵母細胞表面上での抗Her2 ScFv分子の発現が示される(図23)。

まとめると、本開示は、タンパク質ディスプレイ技術における本ファージミド及び酵母発現プラスミドの、ナイーブライブラリー及び/又は合成ライブラリーからタンパク質/抗体遺伝子を発現させるための使用に関する。第1に、ファージディスプレイ技術を用いて、特定の抗原に対する親和性が高〜中程度の潜在的抗体遺伝子をクローニングしてスクリーニングする。次に、当該遺伝子を、酵母ディスプレイプラスミドにトランスファーして、更にリード分子をスクリーニングして同定する。これらの2つの補完的な技術を組み合わせることで、高度に多様な抗体ライブラリーがスクリーニングされ、かつ特定の抗原に対する新しい/リード抗体分子が開発される。ファージベクターから酵母ベクターへのクローン集団の円滑なトランスファーが有効である。というのも、MCS I及びMCS II中に用いられる制限酵素が、2つの発現システムに関して同一であるからである。これらの制限酵素を注意深く選択することで、可変軽鎖の選択集団を、ファージミドのMCS Iから、あらゆる酵母ベクターのMCS Iにトランスファーすることができる一方、重鎖を、あらゆる酵母ベクターのMCS IIに再配置することができる。

更に、ナイーブ抗体及び/又は合成抗体からの可変重鎖及び軽鎖レパートリーを、本開示のファージミドベクター及び酵母ベクター中に直接クローニングすることもできて、所望の結果を得ることができる。

intersystem transferの他に、intra-system trasfer、すなわちFabからScFvへの、若しくはその逆のディスプレイフォーマットの変更、又はフォーマットは同じであるが発現ベクターが異なる変更、例えば接合型ベクターから双シストロン性ベクターへのトランスファーが、MCS酵素の各セットを介して可能である。また、考えられる全てのシステム及びフォーマットを横断する自由な移行が、重鎖及び軽鎖のランダム化をもたらして、2つのディスプレイシステム間の差異を補うことができ、特定の組合せがシステムを横断して保存されるようなシステムを利用できることは、明らかに利点がある。

したがって、本ベクターは、タンパク質ディスプレイ技術において、以下が挙げられるがこれらに限定されない多数の利点を提供する:
・2つの補完的な技術(ファージディスプレイ及び酵母ディスプレイ)により、高度に多様な抗体ライブラリーがスクリーニングされ、かつ特定の抗原に対する新しい/リード抗体分子が開発される、inter-transferアプローチ。
・ファージベクターから酵母ベクターへのクローン集団の効率的かつ円滑なトランスファーをもたらすことで、抗体分子/フラグメントの多様性を維持するように一意的に設計された挿入/発現カセット。
・ファージディスプレイ等の原核ディスプレイシステムを用いた、ライブラリーの小ささ及び真核生物タンパク質の発現/ディスプレイの限界に対処する、酵母ディスプレイ技術の欠点の克服。
・ディスプレイフォーマットが、FabからScFvに、若しくはその逆に変更され得、又は同じフォーマットが、MCS酵素の各セットを介して、一酵母ベクターから別の酵母ベクターにトランスファー、例えば接合型ベクターから双シストロン性ベクターにトランスファーされ得る、intra-transferアプローチ。

Claims (13)

1. 抗体若しくはそのフラグメントを、少なくとも1つのクローニング領域を含むファージミドから、若しくは少なくとも1つのクローニング領域を含む酵母ベクターから受け入れるように、又は抗体若しくはそのフラグメントを、少なくとも1つのクローニング領域を含む酵母ベクターにトランスファーするように設計されたベクター構築体であって、前記ベクター構築体が、
   少なくとも1つのリーダー配列;
   生物学的に活性なリガンドに選択的に結合するペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を受け入れるための少なくとも1つのクローニング領域;
   定常領域免疫グロブリン重鎖若しくは定常領域免疫グロブリン軽鎖又はそれらのフラグメント、或いは定常領域免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント及び定常領域免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントの組合せをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列であって、前記定常領域免疫グロブリン重鎖又は定常領域免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)又はそのフラグメント、免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)又はそのフラグメント、及び免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)又はそのフラグメントを含む群から選択され、及び、前記定常領域が、天然の免疫グロブリンの定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、少なくとも1つのヌクレオチド配列;並びに
   少なくとも1つの組換えタグ配列又は選択コード核酸配列;
   を含む発現カセットを含有し、
   発現カセットの少なくとも1つのクローニング領域が、マルチクローニングサイト1(MCS I)及びマルチクローニングサイト2(MCS II)、マルチクローニングサイト1(MCS I)のみ、又はマルチクローニングサイト2(MCS II)のみを含み、MCS Iが、制限酵素認識部位の組合せNdeI、BglII、HindIII、及びAscIを含み、MCS IIが、制限酵素認識部位の組合せNcoI、XbaI、NheI、及びNotIを含み、
   前記発現カセットが、
   タンパク質発現システムの表面上のペプチド若しくはタンパク質のディスプレイを可能にする生成物をコードするヌクレオチド配列と融合した酵素切断部位を欠く、若しくは前記酵素切断部位を上流に含む少なくとも1つのターミネーター配列、又は、
   少なくとも1つのリボソーム結合部位を上流に含むファージコートタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
   1つ又は複数のプロモーター配列、又は、
   オペレータ配列、又は、
   前記ターミネーター配列、前記ファージコートタンパク質をコードするヌクレオチド配列、前記プロモーター配列、及び、前記オペレータ配列の任意の組合せ
   をさらに含み、
   前記発現カセットが、以下の(a)〜(e):
   (a)順に、
   プロモーター配列;
   リーダー配列;
   免疫グロブリン重鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつ制限酵素認識部位NcoI、XbaI、NheI、及びNotIを含むクローニング領域;
   IgG1免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)をコードするヌクレオチド配列であって、前記定常ドメインが、天然の免疫グロブリンの重鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、ヌクレオチド配列;
   組換えタグ配列又は選択コード核酸配列;並びに
   Aga2Pタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、リンカー配列を介して融合したプロテアーゼ切断部位を上流に含むターミネーター配列、
   (b)順に、
   プロモーター配列;
   リーダー配列;
   免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつ制限酵素認識部位NdeI、BglII、HindIII、及びAscIを含むクローニング領域;
   免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)若しくは免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)、又はそれらのフラグメントをコードするヌクレオチド配列であって、前記定常領域が、天然の免疫グロブリンの軽鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、ヌクレオチド配列;
   組換えタグ配列又は選択コード核酸配列;並びに
   ターミネーター配列、
   (c)順に、
   第1のターミネーター配列;
   組換えタグ配列又は選択コード核酸配列の第1のセット;
   免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)若しくは免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)、又はそれらのフラグメントをコードする第1のヌクレオチド配列であって、前記定常領域が、天然の免疫グロブリンの軽鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第1のヌクレオチド配列;
   免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつ制限酵素認識部位NdeI、BglII、HindIII、及びAscIを含む第1のクローニング領域;
   第1のリーダー配列;
   プロモーター配列;
   第2のリーダー配列;
   免疫グロブリン重鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつ制限酵素認識部位NcoI、XbaI、NheI、及びNotIを含む第2のクローニング領域;
   IgG1免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)をコードする第2のヌクレオチド配列であって、前記定常ドメインが、天然の免疫グロブリンの重鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第2のヌクレオチド配列;
   組換えタグ配列又は選択コード核酸配列の第2のセット;並びに
   Aga2Pタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、リンカー配列を介して融合したプロテアーゼ切断部位を上流に含む第2のターミネーター配列、
   (d)順に、
   第1のプロモーター配列;
   第1のリーダー配列;
   免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつ制限酵素認識部位NdeI、BglII、HindIII、及びAscIを含む第1のクローニング領域;
   免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)若しくは免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)、又はそれらのフラグメントをコードする第1のヌクレオチド配列であって、前記定常領域が、天然の免疫グロブリンの軽鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第1のヌクレオチド配列;
   組換えタグ配列又は選択コーディング核酸配列の第1のセット;
   第1のターミネーター配列;
   第2のプロモーター配列;
   第2のリーダー配列;
   免疫グロブリン重鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつ制限酵素認識部位NcoI、XbaI、NheI、及びNotIを含む第2のクローニング領域;
   IgG1免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)をコードする第2のヌクレオチド配列であって、前記定常ドメインが、天然の免疫グロブリンの重鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第2のヌクレオチド配列;
   組換えタグ配列又は選択コード核酸配列の第2のセット;並びに
   Aga2Pタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、リンカー配列を介して融合したプロテアーゼ切断部位を上流に含む第2のターミネーター配列、
   並びに
   (e)順に、
   プロモーター配列;
   オペレータ配列;
   第1のリボソーム結合部位;
   第1のリーダー配列;
   免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつ制限酵素認識部位NdeI、BglII、HindIII、及びAscIを含む第1のクローニング領域;
   免疫グロブリン軽鎖のカッパ定常領域(Ck)若しくは免疫グロブリン軽鎖のラムダ定常領域(CL)、又はそれらのフラグメントをコードする第1のヌクレオチド配列であって、前記定常領域が、天然の免疫グロブリンの軽鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第1のヌクレオチド配列;
   第2のリボソーム結合部位;
   第2のリーダー配列;
   免疫グロブリン重鎖の可変領域又はそのフラグメントをコードする遺伝子を受け入れることができ、かつ制限酵素認識部位NcoI、XbaI、NheI、及びNotIを含む第2のクローニング領域;
   IgG1免疫グロブリン重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)をコードする第2のヌクレオチド配列であって、前記定常ドメインが、天然の免疫グロブリンの重鎖定常領域又はそのフラグメントに対して少なくとも1つの変異を含む、第2のヌクレオチド配列;
   組換えタグ配列又は選択コード核酸配列;並びに
   ファージコートタンパク質をコードするヌクレオチド配列
   を含む群から選択される、
   ベクター構築体。
2. 発現カセット、ファージミド、及び酵母ベクターの少なくとも1つのクローニング領域が、マルチクローニングサイト1(MCS I)及びマルチクローニングサイト2(MCS II)、マルチクローニングサイト1(MCS I)のみ、又はマルチクローニングサイト2(MCS II)のみを含み、MCS Iが、制限酵素認識部位の組合せNdeI、BglII、HindIII、及びAscIを含み、MCS IIが、制限酵素認識部位の組合せNcoI、XbaI、NheI、及びNotIを含む、請求項1に記載のベクター構築体。
3. ベクター構築体が、細菌細胞又は酵母細胞中で、抗体又はそのフラグメントを発現することができ;プロモーター配列が、Gal1、Gal1/10、及びそれらの組合せを含む群から選択され;リーダー配列が、pelB配列、アルファリーダー配列、Aga2Pリーダー配列、アルファ接合第1因子分泌シグナル配列(SS01)、操作されたアルファ因子(aapS4)シグナル配列(SS02)、操作されたアルファ因子(aap8)シグナル配列(SS03)、操作されたアルファ因子(aap8)シグナル配列(SS04)、及びそれらの組合せを含む群から選択され;組換えタグ配列又は選択コード核酸配列が、FLAG、c-Myc、V5、His、及びそれらの組合せを含む群から選択され;ターミネーター配列が、アルファターミネーター、CYC1ターミネーター、及びそれらの組合せを含む群から選択され;酵素切断部位が、TEVプロテアーゼ切断部位であり;タンパク質発現システムの表面上でのペプチド又はタンパク質のディスプレイを可能にする生成物をコードするヌクレオチド配列が、Aga2Pタンパク質であり;ファージコートタンパク質が、pIIIタンパク質、G8P、及びそれらの組合せを含む群から選択される、請求項1に記載のベクター構築体。
4. クローニング領域の遺伝子が、免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)又はそのフラグメント、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)又はそのフラグメント、及び免疫グロブリン重鎖(VH)の可変領域又はそのフラグメントを含む群から選択される、請求項1に記載のベクター構築体。
5. 請求項1に記載のベクター構築体から、抗体若しくはそのフラグメントをクローニングするように、又は抗体若しくはそのフラグメントをトランスファーし、若しくは受け入れるように設計されたベクター構築体であって、前記ベクター構築体が、
   順に、
   プロモーター配列;
   リーダー配列;
   タンパク質発現システムの表面上でのペプチド又はタンパク質のディスプレイを可能にする生成物をコードするヌクレオチド配列;
   第1の酵素切断部位;
   第1の組換えタグ配列又は選択コーディング核酸配列;
   第1のリンカー配列;
   第2の酵素切断部位;
   第1のクローニング領域;
   第2のリンカー配列;
   第2のクローニング領域;
   第2の組換えタグ配列又は選択コード核酸配列;及び
   ターミネーター配列
   を含む発現カセットを含有し、
   前記第1のクローニング領域が、前記第2のクローニング領域に前記第2のリンカー配列を介して連結され、前記クローニング領域が、生物学的に活性なリガンドに選択的に結合するペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を受け入れ、並びに、
   発現カセットの第1のクローニング領域又は第2のクローニング領域が、マルチクローニングサイト1(MCS I)及びマルチクローニングサイト2(MCS II)を含み、MCS Iが、制限酵素認識部位の組合せNdeI、BglII、HindIII、及びAscIを含み、MCS IIが、制限酵素認識部位の組合せNcoI、XbaI、NheI、及びNotIを含む、ベクター構築体。
6. 前記ベクター構築体が、scFvベクターであり、酵母細胞において単鎖可変フラグメント(scFv)又はそのフラグメントを発現することができ;プロモーター配列が、Gal 1であり;タンパク質発現システムの表面上でのペプチド又はタンパク質のディスプレイを可能にする生成物をコードするヌクレオチド配列が、Aga2Pタンパク質であり;酵素切断部位が、Xa因子切断部位、TEVプロテアーゼ切断部位、及びそれらの組合せを含む群から選択されるプロテアーゼ切断部位であり;組換えタグ配列又は選択コード核酸配列が、HAタグ、c-Mycタグ、FLAG、及びそれらの組合せを含む群から選択され;リンカー配列が、G₄S配列であり;第1のクローニング領域の遺伝子が、免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)又はそのフラグメント、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)又はそのフラグメント、及びそれらの組合せを含む群から選択され;第2のクローニング領域の遺伝子が、免疫グロブリン重鎖(VH)の可変領域又はそのフラグメントであり;ターミネーター配列が、アルファターミネーター、CYC1ターミネーター、及びそれらの組合せを含む群から選択される、請求項5に記載のベクター構築体。
7. 構築体が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、及び配列番号26を含む群から選択される核酸配列を有する、請求項1又は5に記載のベクター構築体。
8. ベクター構築体が更に、複製起点(Ori)、抗生物質耐性マーカー、f1複製起点、プロモーター、及びそれらの組合せを含む群から選択される領域を含み;ベクター構築体が、原核生物発現システム、酵母発現システム、又はそれらの組合せにおいて、抗体又はそのフラグメントを発現又はディスプレイすることができ;
   CH1領域が、配列番号27の核酸配列を有し、Ck領域が、配列番号28の核酸配列を有し、CL領域が、配列番号29の核酸配列を有し;Vk、VL、及びVH配列が、ナイーブ抗体レパートリー、合成抗体レパートリー、又はそれらの組合せに由来する、請求項1から7のいずれか一項に記載のベクター構築体。
9. 請求項1又は5に記載のベクター構築体を調製する方法であって、前記方法が、
   a)請求項1又は5に規定の発現カセットの合成の工程;
   b)デスティネーションベクターの線状化の工程であって、デスティネーションベクターが、pADL23c、pRS314、p414Gal1、p416Gal1、及びそれらの組合せを含む群から選択され;線状化が、制限酵素による消化によって実行される、工程;並びに
   c)ベクター構築体を得るために、相同組換え、制限消化に続くライゲーション、及びそれらの組合せを含む群から選択される技術による、線状化したデスティネーションベクター中に発現カセットを挿入する工程
   を含み、
   配列決定技術によってエラーがないベクタークローンを確認する工程を更に含む方法。
10. ベクター構築体のライブラリーを調製する方法であって、
    a)請求項9に記載の方法によってベクター構築体を調製する工程;
    b)免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)、若しくはそれらのフラグメント、免疫グロブリン重鎖の可変領域若しくはそのフラグメント(VH)、及びそれらの組合せを含む群から選択される領域をコードするヌクレオチド配列を、ベクター構築体のクローニング領域中にクローニングして、ライブラリーを得る工程、又は
    免疫グロブリン軽鎖のカッパ可変領域(Vk)、免疫グロブリン軽鎖のラムダ可変領域(VL)、若しくはそれらのフラグメント、免疫グロブリン重鎖の可変領域若しくはそのフラグメント(VH)、及びそれらの組合せを含む群から選択される領域をコードするヌクレオチド配列を、1つのベクター構築体のクローニング領域から、別のベクター構築体のクローニング領域にトランスファーして、ライブラリーを得る工程
    を含み;
    ベクター構築体が、ファージミド、酵母接合型重鎖発現ベクター、酵母接合型軽鎖発現ベクター、酵母双シストロン性双方向性ベクター、酵母双シストロン性片方向性ベクター、及び単鎖可変フラグメント(scFv)ベクターを含む群から選択され;Vk、VL、及びVH領域が、ナイーブ抗体、合成抗体、又はそれらの組合せに由来し;ベクター構築体のライブラリーが、合成ライブラリー、ナイーブライブラリー、又はそれらの組合せであり;ヌクレオチド配列のトランスファーが、ファージミドベクター構築体と酵母ベクター構築体との間で、又は酵母ベクター構築体の間で実行される、方法。
11. 所望される機能特性を有する抗体又はそのフラグメントをスクリーニングし、かつ同定する方法であって、(a)請求項10に記載の方法によってベクター構築体のライブラリーを調製して、前記ベクター構築体を細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、又はそれらの組合せ中に形質転換する工程、及び(b)所望される機能特性を有する抗体又はそのフラグメントを発現する細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を選択する工程を含み;
    スクリーニング及び同定が、細菌宿主細胞でのファージディスプレイによって、酵母宿主細胞での酵母ディスプレイによって、又は順にファージディスプレイ及び酵母ディスプレイによって実行され;所望される機能特性が、親和性、特異性、抗原性、製造容易性、新しいエピトープの生成、熱安定性、溶解性、凝集、及び触媒活性、並びにそれらの組合せを含む群から選択され;
    ファージディスプレイ及び酵母ディスプレイを順に実行する場合、スクリーニング及び同定が、
    (i)ファージミド構築体のライブラリーを細菌宿主細胞中に形質転換して、ファージ抗体ライブラリーを得る工程;
    (ii)ディスプレイされた抗体又はそのフラグメントを抗原に対してスクリーニングして、選択されたクローンを含むパンニングしたファージ抗体ライブラリーを得る工程;
    (iii)選択されたクローンに由来する抗体又はそのフラグメントを酵母ベクター中にトランスファーした後に、前記抗体又はそのフラグメントを発現かつディスプレイさせるための酵母宿主細胞中に形質転換する工程;
    (iv)酵母がディスプレイした抗体又はそのフラグメントを、抗原に対してスクリーニングして、所望される機能特性を有する抗体又はそのフラグメントを同定する工程
    を含み;
    抗体又はそのフラグメントが、ファージ又は酵母ベクター中へのクローニング用のFabフォーマット又はScfvフォーマットであり;ファージベクター中への形質転換効率が、約10⁹〜約10¹¹の範囲内であり;酵母ベクター中へのトランスファー効率又は形質転換効率が、約10⁶〜約10⁸の範囲内である、方法。
12. 請求項1又は5に記載のベクター構築体を含む、細菌宿主細胞若しくは酵母宿主細胞、又はそのファージライブラリー若しくは酵母ライブラリー。
13. 請求項1又は5に記載のベクター構築体によって提供される発現カセットであって、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、及び配列番号25を含む群から選択される核酸配列を有する発現カセット。

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