ES2837482T3 - Vectores para la clonación y expresión de proteínas, métodos y aplicaciones de estos - Google Patents

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ES2837482T3 ES17722873T ES17722873T ES2837482T3 ES 2837482 T3 ES2837482 T3 ES 2837482T3 ES 17722873 T ES17722873 T ES 17722873T ES 17722873 T ES17722873 T ES 17722873T ES 2837482 T3 ES2837482 T3 ES 2837482T3
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Sunit Maity
Divya Unnikrishnan
Yogendra Manjunath Bangalore Muniraju
Sathyabalan Murugesan
Pavithra Mukunda
Bhargav Prasad
Veeresha Kamanagowda
Sanghamitra Bhattacharjee
Pravin Kumar Dakshinamurthy
Vivek Halan
Sankaranarayanan Srinivasan
Anuradha Hora
Bairavabalakumar Natarajan
Karthika Nair
Aswini Thanigaivel
Amol Maliwalave
Bharath Ravindra Shenoy
Sahana Bhima Rao
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Ashvini Kumar Dubey
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Shivani Patel
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Abstract

Una constructo de vector disenado para recibir un anticuerpo o un fragmento de este a partir de un fagemido que comprende al menos una region de clonacion o a partir de un vector de levadura que comprende al menos una region de clonacion, o, para transferir un anticuerpo o un fragmento de este a un vector de levadura que comprende al menos una region de clonacion, donde dicho constructo de vector contiene un casete de expresion que comprende: al menos una secuencia lider; al menos una region de clonacion para recibir un gen que codifica un peptido o proteina que se une selectivamente a un ligando biologicamente activo; al menos una secuencia de nucleotidos que codifica la region constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o la region constante de la cadena ligera de inmunoglobulina, o fragmentos de estas, o una combinacion de la region constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de esta y la region constante de la cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de esta, en donde dicha region constante comprende al menos una mutacion con respecto a la region constante de una inmunoglobulina nativa o fragmentos de esta; y al menos una secuencia de etiqueta recombinante o secuencia de acido nucleico codificante de seleccion; en donde la al menos una region de clonacion del casete de expresion comprende un sitio de clonacion multiple 1 (MCS I) y un sitio de clonacion multiple 2 (MCS II), un sitio de clonacion multiple 1 (MCS I) solo o un sitio de clonacion multiple 2 (MCS II) solo, y en donde MCS I comprende una combinacion de los sitios de restriccion NdeI y BglII y HindIII y AscI, y el MCS II comprende una combinacion de los sitios de restriccion NcoI y XbaI y NheI y NotI.

Description

DESC
Vectores para la clonación y expresión de proteínas, mét
Campo técnico
La presente descripción se refiere al campo de la Particularmente, la presente descripción se refiere a vec métodos para generar dichos vectores. Cualquier mate genético obtenido a partir de genes de anticuerpos de orig diseñados artificialmente o partes de estos, o una com expresión mediante el uso de los vectores de la presente
Antecedentes de la descripción
La presentación en la superficie celular es una técnica q de la célula al fusionarla con una proteína transportadora celular o su subunidad. La tecnología de presentación e bibliotecas para la modificación genética de proteínas, embargo, dicha tecnología de presentación se asocia co
Por ejemplo, el método de presentación en ribosom inestabilidad del ARN y el complejo ribosómico. Otra lim proteína monocatenaria tal como ScFv. Los métodos de en levadura o el ensayo de complementación de proteín proteína objetivo. Sin embargo, tienen varias limitacione intracelular, una vida media celular baja y, lo que es aplicación específica, en dependencia del tipo de antíg aunque la presentación en fagos es un método ampli apropiado de proteínas debido a que es un sistema d postraduccionales de las proteínas presentadas. Para su presentación en levadura, un sistema de presentación e sistema de presentación en levadura y de manera sim eucarióticas, es la eficiencia de transformación limitada q lograrse, lo que hace que todo el proceso sea menos efic
El éxito de una biblioteca de proteínas/anticuerpos, e representación independiente de gran tamaño sin comp junto con la eficiencia de secreción, la eficiencia de proce Con respecto a esto, la flexibilidad de los sistemas de p fagos y/o levaduras, es un criterio absolutamente esencia presentación depende del tipo de vectores de expresión q la compatibilidad y la complementariedad de los vector sistema de presentación en levadura ya sea mediante características de compatibilidad y complementariedad sistemas de presentación en fagos y levaduras empleado
El documento EP1054018 describe bibliotecas de fra polinucleótidos que codifican una biblioteca de Fab co comprende: una primera y una segunda región de clonaci un sitio de escisión de enzima de restricción para el vect dirección 5' por un sitio de unión al ribosoma y una sec anclaje, ubicado en dirección 3' de la segunda región polinucleótidos variables, donde cada uno codifica una r variable de anticuerpo, posiblemente seguida por una re constante de anticuerpo, donde la primera pluralidad de p de escisión de la enzima de restricción de la primer polinucleótidos variables se clona en el vector en el(los) región de clonación (Figura 1).
Zhao Aizhi y otros ("Rapid isolation of high-affinity Endosialin/TEM1, using a paired yeast display/secretory vol. 363, núm. 2, páginas 221-232) describen el rápido ai marcador vascular tumoral EndosialinITEM1, media secretoria/presentación en levadura emparejada. La bib mediante recombinación homóloga del repertorio de paci CIÓN
s y aplicaciones de estos
otecnología, la ingeniería genética y la inmunología. es para la clonación y expresión de material genético, y l genético, lo que incluye, pero no se limita a, material natural o partes de estos, genes de anticuerpos sintéticos ación de ambos, puede emplearse para la clonación y scripción.
permite que la proteína objetivo se exprese en el exterior ue es típicamente una proteína asociada a la membrana a superficie se emplea como herramienta de tamizaje de evolución dirigida y el descubrimiento de fármacos. Sin s propios méritos y deméritos.
es técnicamente más desafiante debido a la relativa ción de esta técnica es la incapacidad de presentar una cción intracelular, tales como el sistema de doble híbrido dependen directamente de la expresión intracelular de la o que incluye la propensión a agregarse en un escenario s importante, todo el sistema debe adaptarse para una contra el que pretende realizarse el tamizaje. Además, ente aceptado, existen limitaciones en el plegamiento expresión procariótico y la ausencia de modificaciones ar estas limitaciones, puede emplearse una plataforma de ariótico. Sin embargo, el principal desafío en el caso del r todos los demás sistemas en la superficie en células establece límites en el tamaño de la biblioteca que puede te.
érminos de tamizaje contra un antígeno, radica en su eter la diversidad y el tamaño funcional de la biblioteca iento y la eficiencia postraduccional, entre otros factores. entación, tales como las plataformas de presentación en ara lograr dicho objetivo. La flexibilidad de los sistemas de se usen y de si existe compatibilidad entre ellos. Además, significa la transferencia de diversidad desde el fago al oques de transferencia combinatoria o por lotes. Dichas tán ausentes en los constructos/vectores sintéticos de ctualmente.
entos Fab y métodos para su uso. La pluralidad de rende una pluralidad de vectores, en donde el vector , en donde cada región de clonación comprende al menos nico, donde cada región de clonación está flanqueada en ncia señal, un polinucleótido que codifica una región de e clonación, una primera y una segunda pluralidad de n variable de anticuerpo completa o parte de una región constante de anticuerpo completa o parte de una región ucleótidos variables se clona en el vector en el(los) sitio(s) región de clonación, donde la segunda pluralidad de (s) de escisión de la enzima de restricción de la segunda
uman antibodies against the tumor vascular marker v library platform", J Imm. Methods 5 de enero de 2011, miento de anticuerpos humanos de alta afinidad contra el el uso de una plataforma de biblioteca de scFv eca de scFv por presentación en levadura se construyó tes TTP expresado originalmente en el bacteriófago M13 en el nuevo vector pAGA2 para la expresión por presenta TTP (109 miembros) se tamizó mediante clasificación ma Se obtuvo un agolpamiento de scFv por presentación en en scFv secretado por levadura mediante recombinació secreción en levadura del scFv biotinilado. Para construi la secreción de scFv biotinilado N-terminal, el vector de transformó conjuntamente en levadura con un producto d K endopeptidasa fusionadas al sitio aceptor de biotina (B de clonación con un codón de parada y etiquetas V5-HIS.
El documento WO 2011/060233 describe un vector, par que comprende (i) un sitio de inserción para insertar una se va a expresar, (ii) una secuencia líder secretora de lev (iii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio fusionada al extremo 3' o 5' del sitio de inserción, y (iv) selección autónomas en levadura.
La presente descripción se dirige a abordar las limitacion como objetivo proporcionar vectores que acomoden y tra grandes y diversas a través de un proceso combinatorio transferir, conservar y generar proteínas con variadas afi
DECLARACIÓN DE LA DESCRIPCIÓN - Esta sección presente descripción se refiere a un constructo de vector a partir de un fagémido que comprende al menos una r comprende al menos una región de clonación, o, para tra levadura que comprende al menos una región de clonaci expresión que comprende:
al menos una secuencia líder,
al menos una región de clonación para recibir un gen que un ligando biológicamente activo,
al menos una secuencia de nucleótidos que codifica la re región constante de la cadena ligera de inmunoglobulin constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o frag inmunoglobulina o fragmento de esta, en donde dicha respecto a la región constante de una inmunoglobulina n
al menos una secuencia de etiqueta recombinante o secu
en donde la al menos una región de clonación del caset (MCS I) y un sitio de clonación múltiple 2 (MCS II), un siti múltiple 2 (MCS II) solo, y en donde MCS I comprende HindIII y AscI, y el MCS II comprende una combinación d
Un constructo de vector diseñado para clonar un anticu anticuerpo o un fragmento de este a partir del constructo dicho constructo de vector contiene un casete de expresi
una secuencia promotora,
una secuencia líder,
una secuencia de nucleótidos que codifica un producto superficie de un sistema de expresión de proteínas,
un primer sitio de escisión enzimática,
una primera secuencia de etiqueta recombinante o secue
una primera secuencia enlazadora,
un segundo sitio de escisión enzimática,
n en levadura. La biblioteca de presentación en levadura tica y de flujo con proteína recombinante TEMI humana. vadura capaz de detectar 2 nM de TEM1 y se transformó omóloga mediante el uso del vector p416 BCCP para la vector p416 BCCP, el vector acompañante pAGA2 para zadera p416 GAL1 se linealizó por BamHI y Xhol, y se CR que codifica las secuencias de pre-pro líder alfa y de P), bisagra de IgA; etiqueta FLAG, enlazador (G4S3), sitio
xpresar un polipéptido biotinilado secretado en levadura, uencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que ra ubicada adyacente al extremo 5' del sitio de inserción, eptor de biotina para la biotina ligasa localizada en Golgi uencias de ácido nucleico que permiten la replicación y
nteriores de las tecnologías actuales y, por lo tanto, tiene ieran de forma cruzada bibliotecas de genes de proteínas ue, de esta manera, mejora el potencial para identificar, ades y especificidades.
ntiene una copia de reivindicaciones independientes. La eñado para recibir un anticuerpo o un fragmento de este ón de clonación o a partir de un vector de levadura que ferir un anticuerpo o un fragmento de este a un vector de donde dicho constructo de vector contiene un casete de
difica un péptido o proteína que se une selectivamente a
n constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o la o fragmentos de estas, o una combinación de la región nto de estas y la región constante de la cadena ligera de ión constante comprende al menos una mutación con a o fragmentos de esta, y
cia de ácido nucleico codificante de selección,
e expresión comprende un sitio de clonación múltiple 1 e clonación múltiple 1 (MCS I) solo o un sitio de clonación a combinación de los sitios de restricción Ndel y BglII y s sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y Notl.
o o un fragmento de este, o, para transferir o recibir un vector como se reivindicó en la reivindicación 1, donde que comprende:
permite la presentación de un péptido o proteína en la
ia de ácido nucleico codificante de selección,
una primera región de clonación unida operativamente segunda secuencia enlazadora, en donde las regiones de que se une selectivamente a un ligando biológicamente a
una segunda secuencia(s) de etiqueta recombinante o se
una secuencia de terminación,
en donde la primera región de clonación o la segunda re de clonación múltiple 1 (MCS I) y el sitio de clonación combinación de los sitios de restricción Ndel y BglII y Hi sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y Notl.
Un método para preparar el constructo de vector como se de: a) síntesis del casete de expresión definido como ante el vector de destino se selecciona de un grupo que c combinaciones, y la linealización se lleva a cabo por dige expresión en el vector de destino linealizado median recombinación homóloga, digestión por restricción seguid constructo de vector; y en donde el método comprend mediante la técnica de secuenciación.
Un método para preparar una biblioteca de constructo preparar el constructo de vector mediante el método co nucleótidos que codifican regiones seleccionadas a parti de la cadena ligera de inmunoglobulina, la región varia fragmentos de estas, la región variable de la cadena pes combinaciones, en la región de clonación del constru secuencias de nucleótidos que codifican las regiones s variable kappa (Vk) de la cadena ligera de inmunoglobu inmunoglobulina o fragmentos de estas, la región variabl de esta (VH) y sus combinaciones, desde la región de cl de otro constructo de vector para obtener la biblioteca;
en donde el constructo de vector se selecciona de un cadena pesada de tipo apareamiento de levadura, vecto levadura, vector bidireccional bicistrónico de levadura, fragmento variable monocatenario (scFv); las regiones V anticuerpos sintéticos o una combinación de estos; la bi una biblioteca sin exposición previa o una combinación nucleótidos se lleva a cabo entre el constructo de vec constructos de vector de levadura.
Un método para tamizar e identificar un anticuerpo o un deseadas, que comprende las etapas de: (a) preparar la se describió anteriormente y transformar dichos constr huésped de levadura o una combinación de estas, y (b) que expresan el anticuerpo o fragmento de este que teng
en donde el tamizaje e identificación se lleva a cabo medi presentación en levadura en células huésped de levad presentación en levadura; en donde las característica comprende afinidad, especificidad, antigenicidad, cap estabilidad térmica, solubilidad, agregación y actividad ca
en donde el tamizaje e identificación, cuando se lleva levadura secuencial comprende las etapas de:
(i) transformar la biblioteca de constructos de fagémidos anticuerpos en fagos;
(ii) tamizar el anticuerpo presentado o fragmento de este c en fagos seleccionados que comprende los clones selecc una segunda región de clonación en presencia de una onación reciben un gen que codifica un péptido o proteína vo,
encia(s) de ácido nucleico codificante de selección, y
de clonación del casete de expresión comprende el sitio ltiple 2 (MCS II), y en donde el MCS I comprende una II y AscI, y el m Cs II comprende una combinación de los
cribió anteriormente, dicho método comprende las etapas rmente, b) linealización de un vector de destino, en donde prende pADL23c, pRS314, p414Gal1, p416Gal1 y sus ón con enzima(s) de restricción; y c) insertar el casete de técnicas seleccionadas de un grupo que comprende e ligamiento y una combinación de estas, para obtener el demás confirmar los clones de vector libres de errores
e vectores, dicho método comprende las etapas de: a) se describió anteriormente, b) clonar las secuencias de e un grupo que comprende la región variable kappa (Vk) lambda (VL) de la cadena ligera de inmunoglobulina o a de inmunoglobulina o un fragmento de esta (VH) y sus de vector para obtener la biblioteca, o, transferir las cionadas a partir de un grupo que comprende la región a, la región variable lambda (VL) de la cadena ligera de e la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento ción de un constructo de vector a la región de clonación
po que comprende fagémido, vector de expresión de la e expresión de la cadena ligera de tipo apareamiento de ctor unidireccional bicistrónico de levadura y vector de VL y VH se derivan de anticuerpos sin exposición previa, teca de constructos de vector es una biblioteca sintética, estas; y en donde la transferencia de la secuencia de fagémido al constructo de vector de levadura o entre
gmento de este que tiene las características funcionales ioteca de constructos de vector mediante el método como tos de vector en células huésped bacterianas, células leccionar las células huésped bacterianas o de levadura la(s) característica(s) funcional(es) deseada(s);
te presentación en fagos en células huésped bacterianas, o secuencialmente mediante presentación en fagos y uncionales deseadas se seleccionan de un grupo que dad de fabricación, generación de nuevos epítopos, ítica y sus combinaciones;
abo mediante presentación en fagos y presentación en
células huésped bacterianas para obtener la biblioteca de
tra antígeno(s) para obtener una biblioteca de anticuerpos ados;
(iii) transferir el anticuerpo o fragmento de este de los transformación en células huésped de levadura para la e este;
(iv) tamizar el anticuerpo o fragmento de este presentado o fragmento de este que tiene las características funciona en donde el anticuerpo o un fragmento de este está en f de levadura; en donde la eficiencia de transformación en 109 a aproximadamente 1011; y en donde la eficiencia de t en el intervalo de aproximadamente 106 a aproximadame Una célula huésped bacteriana o de levadura, o una bibl comprende el(los) constructo(s) de vector como se descri Un casete de expresión proporcionado por el(los) constru dicho casete de expresión tiene una secuencia de ácido ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SE SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID Breve descripción de las figuras adjuntas
Las características de la presente descripción resultarán tomada junto con las figuras adjuntas. En el entendido acuerdo con la descripción y no deben considerarse limi detalle mediante el uso de las figuras adjuntas.
La Figura 1 ilustra la modificación del vector pADL23c. S la cadena principal, descritas como modificación - 1 respectivamente.
La Figura 2 ilustra la generación de pZB001 - vector fagé A) Representación esquemática del casete de expresión/i pesada y el dominio constante de la cadena ligera kappa B) Análisis de clones independientes a partir del construct C) Análisis de clones independientes a partir del construc D) Representación esquemática del vector pZB001 que clonar los genes de la biblioteca de anticuerpos que com de anticuerpo (kappa) variable en los sitios de clonación r La Figura 3 ilustra la generación de pZB001.1 - vector fa A) Representación esquemática del casete de expresión/i pesada y el dominio constante de la cadena ligera (CL) L B) Análisis de clones independientes a partir del construct C) Análisis de clones independientes a partir del construc D) Representación esquemática del constructo de vecto diseñado para clonar genes de bibliotecas de anticuerp cadena ligera de anticuerpo (lambda) variable en los sitio La Figura 4 ilustra la modificación del vector pRS314. Se en la figura.
La Figura 5 ilustra la generación de pZB004 - vector bidi ligera kappa de anticuerpo.
A) Representación esquemática del casete de expresión pesada y el dominio constante de la cadena ligera kappa nes seleccionados al vector de levadura seguido de la esión y presentación de dicho anticuerpo o fragmento de
levadura contra antígeno(s) para identificar el anticuerpo deseadas;
ato Fab o Scfv para la clonación en un vector de fago o vector de fago está en el intervalo de aproximadamente sferencia o transformación en el vector de levadura está 108.
eca de fagos o una biblioteca de levadura de estas que anteriormente.
(s) de vector como se describió anteriormente, en donde cleico seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, 23 y la SEQ ID No. 25.
pletamente evidentes a partir de la siguiente descripción que las figuras representan sólo varias modalidades de tes de su alcance, la descripción se describirá con más
odificaron múltiples sitios de restricción y secuencias de odificación - 2, modificación - 3, modificación - 4,
do con la región constante de la cadena ligera kappa
erto diseñado que contiene el dominio CH1 de la cadena ).
ZB001 mediante el uso de las enzimas BamHI y EcoRI pZB001 mediante el uso de las enzimas HindIII y NcoI
mprende el casete de expresión/inserto diseñado para nden la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera ectivos.
ido con región constante de la cadena ligera lambda.
erto diseñado que contiene el dominio CH1 de la cadena bda.
ZB001.1 mediante el uso de la enzima PvulI.
pZB001.1 mediante el uso de las enzimas NcoI y HindIII. ZB001.1 que comprende el casete de expresión/inserto que comprenden la cadena pesada de anticuerpo y la e clonación respectivos.
dificaron múltiples sitios de restricción como se describió
cional de levadura con la región constante de la cadena
serto diseñado que contiene el dominio CH1 de la cadena ).
B) Análisis de clones independientes a partir del construc C) Análisis de clones independientes a partir del construc D) Análisis de clones independientes a partir del construc E) Representación esquemática del constructo pZB004 di comprenden la cadena pesada del anticuerpo y la cad clonación respectivos.
La Figura 6 ilustra la generación de pZB004.1 - vector bi ligera lambda de anticuerpo.
A) Representación esquemática del casete de expresión/ pesada y el dominio CL de la cadena ligera lambda.
B) Análisis de clones independientes a partir del constru Notl y Ncol y Ascl en combinaciones respectivas.
C) Representación esquemática del constructo pZB004.1 que comprenden la cadena pesada y la cadena ligera respectivos.
La Figura 7 ilustra la generación de pZB004.2 - vector uni ligera kappa de anticuerpo.
A) Representación esquemática del inserto diseñado que CK de la cadena ligera kappa.
B) Análisis de clones independientes a partir del construc Sacll en combinaciones respectivas.
C) Representación esquemática del constructo de vecto anticuerpos que comprenden la cadena pesada y la ca clonación respectivos.
La Figura 8 ilustra la generación de pZB004.3 - vector uni ligera lambda de anticuerpo.
A) Representación esquemática del casete de expresión/ pesada y el dominio CL de la cadena ligera lambda.
B) Análisis de clones independientes a partir del construc Sacll en combinaciones respectivas.
C) Representación esquemática del constructo de vecto anticuerpos que comprenden la cadena pesada y la cad clonación respectivos.
La Figura 9 ilustra la modificación del vector pRS314. Se en la figura.
La Figura 10 ilustra la generación de pZB004.4 - vector A) Representación esquemática del casete de expresió (MCS I y MCS II) para el dominio variable de cadena pe de anticuerpo, respectivamente.
B) Análisis de clones independientes a partir del construc C) Representación esquemática del constructo de vecto anticuerpos que comprenden la región variable de la cad ligera en los sitios de clonación respectivos.
La Figura 11 ilustra la modificación del vector p414GA describió en la figura.
pZB004 mediante el uso de la enzima PvulI.
pZB004 mediante el uso de las enzimas EcoRV y Kpnl. pZB004 mediante el uso de las enzimas Ndel y Kpnl.
ñado para clonar genes de bibliotecas de anticuerpos que ligera del anticuerpo (kappa) variable en los sitios de
ccional de levadura con la región constante de la cadena
erto diseñado que contiene el dominio CH1 de la cadena
pZB004.1 mediante el uso de las enzimas PvulI, Ndel y
iseñado para clonar genes de bibliotecas de anticuerpos iable del anticuerpo (lambda) en los sitios de clonación
eccional de levadura con la región constante de la cadena
ntiene el dominio CH1 de la cadena pesada y el dominio
pZB004.2 mediante el uso de las enzimas Hindlll, Spel y
ZB004.2 diseñado para clonar genes de la biblioteca de a ligera variable (kappa) del anticuerpo en los sitios de
eccional de levadura con la región constante de la cadena
erto diseñado que contiene el dominio CH1 de la cadena
pZB004.3 mediante el uso de las enzimas Hindlll, Spel y
ZB004.3 diseñado para clonar genes de la biblioteca de a ligera variable del anticuerpo (lambda) en los sitios de
odificaron múltiples sitios de restricción como se describió
scFv de levadura.
serto diseñado que contiene las regiones de clonación a de anticuerpo y el dominio variable de la cadena ligera
pZB004.4 mediante el uso de las enzimas EcoRV y Xhol. ZB004.4 diseñado para clonar genes de la biblioteca de a pesada de anticuerpo y la región variable de la cadena
. Se modificaron múltiples sitios de restricción como se La Figura 12 ilustra la generación del vector de apar constante de la cadena pesada
A) Representación esquemática del inserto diseñado q de clones independientes a partir del constructo pZB00 B) Representación esquemática del constructo pZB002 comprenden la cadena pesada del anticuerpo en el sitio La Figura 13 ilustra la modificación del vector p416
describió en la figura.
La Figura 14 ilustra la generación del vector de apare constante de la cadena ligera lambda
A) Representación esquemática del inserto diseñado q secuencia señal SS01
B) Análisis de clones independientes a partir del constru C) Representación esquemática del constructo pZB003. que comprenden la cadena ligera del anticuerpo (Lamb La Figura 15 ilustra la generación del vector de apare constante de la cadena ligera kappa
A) Representación esquemática del inserto diseñado q secuencia señal SS01
B) Análisis de clones independientes a partir del constru C) Representación esquemática del constructo pZB003. que comprenden la cadena ligera del anticuerpo (kappa La Figura 16 ilustra la generación del vector de apar constante kappa de cadena ligera que contiene la secu A) Representación esquemática del inserto diseñado q secuencia señal SS02
B) Análisis de clones independientes a partir del constru HF
C) Representación esquemática del constructo pZB003 la biblioteca de anticuerpos que comprenden la cadena li La Figura 17 ilustra la generación del constructo pZB003 de la cadena ligera kappa que contiene la secuencia se A) Representación esquemática del inserto diseñado q secuencia señal SS03
B) Análisis de clones independientes a partir del cons Hindlll-HF
C) Representación esquemática del constructo pZB003 de la biblioteca de anticuerpos que comprenden la c respectivo.
La Figura 18 ilustra la generación del constructo pZB003 de la cadena ligera kappa que contiene la secuencia se A) Representación esquemática del inserto diseñado q secuencia señal SS04
ento de levadura del constructo pZB002 con la región
ntiene el dominio CH1 de la cadena pesada B) Análisis iante el uso de las enzimas Spel-HF y XhoI
ado para clonar genes de biblioteca de anticuerpos que lonación respectivo.
Se modificaron múltiples sitios de restricción como se
nto de levadura del constructo pZB003.1 con la región
ntiene el dominio CL de la cadena ligera lambda con la
ZB003.1 mediante el uso de las enzimas Spel-HF y XhoI eñado para clonar genes de la biblioteca de anticuerpos el sitio de clonación respectivo
nto de levadura del constructo pZB003.2 con la región
ntiene el dominio CK de la cadena ligera Kappa con la
ZB003.2 mediante el uso de las enzimas Spel-HF y XhoI eñado para clonar genes de la biblioteca de anticuerpos l sitio de clonación respectivo
ento de levadura del constructo pZB003 con la región señal SS02
ntiene el dominio CK de la cadena ligera Kappa con la
B003 mediante el uso de las enzimas Spel-HF y Hindlll-
la secuencia señal SS02 diseñada para clonar genes de del anticuerpo (kappa) en el sitio de clonación respectivo. ctor de apareamiento de levadura con la región constante S03
ntiene el dominio CK de la cadena ligera Kappa con la
pZB003.3 mediante el uso de las enzimas Spel-HF y
n la secuencia señal SS03 diseñada para clonar genes ligera del anticuerpo (kappa) en el sitio de clonación
ctor de apareamiento de levadura con la región constante S04
ntiene el dominio CK de la cadena ligera Kappa con la B) Análisis de clones independientes a partir del cons Hindlll-HF
C) Representación esquemática del constructo pZB003 de la biblioteca de anticuerpos que comprenden la ca respectivo.
La Figura 19 ilustra el análisis de digestión por restricci A. Digestión con Hindlll y Ascl para confirmar el inserto B. Digestión con Ncol y Xbal para confirmar el inserto d La Figura 20 ilustra el análisis de digestión por restricci A. Digestión con Hindlll y Ascl para confirmar el inserto B. Digestión con Ncol y Xbal para confirmar el inserto d La Figura 21 ilustra el análisis de digestión por restric apareamiento de levadura.
A. Digestión con enzimas de restricción de genes de la mediante el uso de Hindlll y Ascl.
B. Digestión con enzimas de restricción de genes de la el uso de Ncol y Notl.
La Figura 22 ilustra el análisis de citometría de flujo par A. Análisis de flujo con anticuerpo anti His.
B. Análisis de flujo con anticuerpo anti c-myc y antígeno La Figura 23 ilustra el análisis por citometría de flujo par de la levadura después de la transformación con pZB00 Descripción detallada de la invención
Esta sección comienza con una copia de todo nuestro c La presente descripción se refiere a un constructo de v este a partir de un fagémido que comprende al menos u comprende al menos una región de clonación, o, para tr levadura que comprende al menos una región de clona expresión que comprende:
al menos una secuencia líder,
al menos una región de clonación para recibir un gen q un ligando biológicamente activo,
al menos una secuencia de nucleótidos que codifica la r región constante de la cadena ligera de inmunoglobuli constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o fr inmunoglobulina o fragmento de esta, en donde dich respecto a la región constante de una inmunoglobulina al menos una secuencia de etiqueta recombinante o se en donde la al menos una región de clonación del cas (MCS I) y un sitio de clonación múltiple 2 (MCS II), un sit múltiple 2 (MCS II) solo, y en donde MCS I comprend Hindlll y Ascl, y el MCS II comprende una combinación to pZB003.4 mediante el uso de las enzimas Spel-HF y
on la secuencia señal SS04 diseñada para clonar genes a ligera del anticuerpo (kappa) en el sitio de clonación
e genes de anticuerpos clonados en pZB001.
a cadena ligera del anticuerpo Kappa,
cadena pesada del anticuerpo
e genes de anticuerpos clonados en pZB001.1
a cadena ligera Lambda del anticuerpo,
cadena pesada del anticuerpo
de genes de anticuerpos clonados en vectores de tipo
ena ligera de anticuerpo (Kappa) clonados en pZB003.2
na pesada de anticuerpos clonados en pZB002 mediante
nfirmar la expresión de Fab del anticuerpo.
r2 biotinilado.
nfirmar la expresión de ScFv del anticuerpo en la superficie que contiene secuencias de ScFv anti-Her2.
nto de reivindicaciones.
r diseñado para recibir un anticuerpo o un fragmento de egión de clonación o a partir de un vector de levadura que ferir un anticuerpo o un fragmento de este a un vector de , donde dicho constructo de vector contiene un casete de
odifica un péptido o proteína que se une selectivamente a
n constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o la o fragmentos de estas, o una combinación de la región ento de estas y la región constante de la cadena ligera de gión constante comprende al menos una mutación con a o fragmentos de esta, y
cia de ácido nucleico codificante de selección,
de expresión comprende un sitio de clonación múltiple 1 e clonación múltiple 1 (MCS I) solo o un sitio de clonación a combinación de los sitios de restricción Ndel y Bglll y os sitios de restricción Ncol y Xbal y Nhel y Notl.
En una modalidad de la presente descripción, en el constr una región de clonación del casete de expresión, el fagémi múltiple 1 (MCS I) y el sitio de clonación múltiple 2 (MCS clonación múltiple 2 (MCS II) solo, y en donde MCS I com y HindIII y AscI, y el MCS II comprende una combinación
En otra modalidad de la presente descripción, el casete d menos una secuencia de terminación que carece o compr con una secuencia de nucleótidos que codifica un produc la superficie de un sistema de expresión de proteínas; o cubierta del fago que comprende aguas arriba al menos u
En otra modalidad más de la presente descripción, el cas una o más secuencias promotoras, contiene o carece de de expresar el anticuerpo o un fragmento de este en un promotora se selecciona de un grupo que comprende Gal se selecciona de un grupo que comprende la secuencia secuencia señal secretora del factor de apareamiento al (aapS4) (SS02), la secuencia señal del factor alfa modific señal (SS04) y sus combinaciones; la secuencia de etiquet de selección se selecciona de un grupo que comprende F terminación se selecciona de un grupo que comprende el el sitio de escisión de la enzima es el sitio de escisión de un producto que permite la presentación de un péptido proteínas es la proteína Aga2P; y la proteína de la cubie proteína pIII, G8P y una combinación de estas.
En otra modalidad más de la presente descripción, la sec cadena pesada de inmunoglobulina o la región constante una mutación se selecciona de un grupo que comprende inmunoglobulina o un fragmento de esta, una región cons un fragmento de esta y la región constante lambda (CL) esta; y en donde el gen de la región de clonación se selec (Vk) de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragment de inmunoglobulina o un fragmento de esta y la región v fragmento de esta.
En otra modalidad más de la presente descripción, el selecciona de un grupo que comprende vector bidireccion de levadura, vector de expresión de la cadena pesada d cadena ligera de tipo apareamiento de levadura y fagémi grupo que comprende:
(a) secuencialmente,
una secuencia promotora;
una secuencia líder;
una región de clonación capaz de recibir un gen qu inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica el primer domini IgG1, en donde dicho dominio constante comprende al m cadena pesada de inmunoglobulina nativa o fragmento de
secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias de á
una secuencia de terminación que comprende aguas a secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Aga2P
(b) secuencialmente,
una secuencia promotora;
una secuencia líder;
o de vector como se describió anteriormente, la al menos y el vector de levadura comprenden el sitio de clonación el sitio de clonación múltiple 1 (MCS I) solo, o el sitio de nde una combinación de sitios de restricción Ndel y BglII sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y Notl.
xpresión como se describió anteriormente comprende al e aguas arriba un sitio de escisión enzimática fusionado que permite la presentación de un péptido o proteína en secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la itio de unión al ribosoma.
de expresión como se describió anteriormente contiene secuencia operadora; el constructo de vector es capaz élula bacteriana o una célula de levadura; la secuencia Gal 1/10 y una combinación de estas; la secuencia líder lB, la secuencia líder alfa, la secuencia líder Aga2P, la 1 (SS01), la secuencia señal del factor alfa modificado (aap8) (SS03), factor alfa modificado (aap8), secuencia ecombinante o la secuencia de ácido nucleico codificante G, c-Myc, V5, His y sus combinaciones; la secuencia de rminador alfa, el terminador CYC1 y sus combinaciones; proteasa TEV; la secuencia de nucleótidos que codifica roteína en la superficie de un sistema de expresión de del fago se selecciona de un grupo que comprende la
cia de nucleótidos que codifica la región constante de la la cadena ligera de inmunoglobulina que tiene al menos rimer dominio constante (CH1) de la cadena pesada de te kappa (Ck) de la cadena ligera de inmunoglobulina o la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de na de un grupo que comprende la región variable kappa e esta, la región variable lambda (VL) de la cadena ligera ble de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH) o un
structo de vector como se describió anteriormente se icistrónico de levadura, vector unidireccional bicistrónico po apareamiento de levadura, vector de expresión de la y en donde el casete de expresión se selecciona de un
odifica una región variable de la cadena pesada de s sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y Notl;
onstante (CH1) de la cadena pesada de inmunoglobulina s una mutación con respecto al dominio constante de la ta;
nucleico codificantes de selección; y
a un sitio de escisión de proteasa fusionado con una avés de una secuencia enlazadora,
una región de clonación capaz de recibir un gen q inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprend una secuencia de nucleótidos que codifica la región const región constante lambda (CL) de la cadena ligera de inm constante comprende al menos una mutación con res inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias de á una secuencia de terminación,
(c) secuencialmente,
una primera secuencia de terminación;
un primer conjunto de secuencias de etiquetas recombina secuencias;
una primera secuencia de nucleótidos que codifica l inmunoglobulina o la región constante lambda (CL) de la c donde dicha región constante comprende al menos una ligera de una inmunoglobulina nativa o un fragmento de e una primera región de clonación capaz de recibir un ge inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprend una primera secuencia líder,
una secuencia promotora;
una segunda secuencia líder;
una segunda región de clonación capaz de recibir un ge inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprend una segunda secuencia de nucleótidos que codifica el inmunoglobulina IgG1, en donde dicha región constante constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina n un segundo conjunto de secuencias de etiqueta reco selección; y
una segunda secuencia de terminación que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Ag (d) secuencialmente,
una primera secuencia promotora;
una primera secuencia líder,
una primera región de clonación capaz de recibir un ge inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprend una primera secuencia de nucleótidos que codifica l inmunoglobulina o la región constante lambda (CL) de la c donde dicho dominio constante comprende al menos un ligera de inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
un primer conjunto de secuencias de etiqueta recombinant una primera secuencia de terminación;
una segunda secuencia promotora;
codifica una región variable de la cadena ligera de s sitios de restricción Ndel y BglII y HindIII y AscI;
te kappa (Ck) de la cadena ligera de inmunoglobulina o la globulina, o fragmentos de estas, en donde dicha región cto a la región constante de la cadena ligera de una
o nucleico codificantes de selección; y
s o ácido nucleico codificante de selección
región constante kappa (Ck) de la cadena ligera de ena ligera de inmunoglobulina, o fragmentos de estas, en tación con respecto a la región constante de la cadena ;
que codifica una región variable de la cadena ligera de s sitios de restricción Ndel y BglII y HindIII y AscI;
ue codifica una región variable de la cadena pesada de s sitios de restricción NcoI y XbaI y NheI y NotI;
mer dominio constante (CH1) de la cadena pesada de prende al menos una mutación con respecto a la región va o fragmento de esta;
antes o secuencias de ácido nucleico codificantes de
as arriba un sitio de escisión de proteasa fusionado con a través de una secuencia enlazadora,
que codifica una región variable de la cadena ligera de s sitios de restricción NdeI y BglII y HindIII y AscI;
región constante kappa (Ck) de la cadena ligera de ena ligera de inmunoglobulina, o fragmentos de estas, en utación con respecto al dominio constante de la cadena
o secuencias de ácido nucleico codificantes de selección; una segunda secuencia líder;
una segunda región de clonación capaz de recibir un ge inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprend una segunda secuencia de nucleótidos que codifica el inmunoglobulina IgG1, en donde dicho dominio constante constante de la cadena pesada de inmunoglobulina nativ un segundo conjunto de secuencias de etiqueta reco selección; y
una segunda secuencia de terminación que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Ag y
(e) secuencialmente,
una secuencia promotora;
una secuencia operadora;
un primer sitio de unión al ribosoma;
una primera secuencia líder;
una primera región de clonación capaz de recibir un ge inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprend una primera secuencia de nucleótidos que codifica l inmunoglobulina o la región constante lambda (CL) de la c donde dicho dominio constante comprende al menos un ligera de inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
un segundo sitio de unión al ribosoma;
una segunda secuencia líder;
una segunda región de clonación capaz de recibir un ge inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprend una segunda secuencia de nucleótidos que codifica el inmunoglobulina IgG1, en donde dicho dominio constante constante de la cadena pesada de inmunoglobulina nativ una(s) secuencia(s) de etiqueta recombinante(s) o secue una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de La presente descripción se refiere además a un const fragmento de este, o, para transferir o recibir un anticuer reivindica en la reivindicación 1, donde dicho constructo d una secuencia promotora,
una secuencia líder,
una secuencia de nucleótidos que codifica un producto superficie de un sistema de expresión de proteínas,
un primer sitio de escisión enzimática,
una primera secuencia de etiqueta recombinante o secue una primera secuencia enlazadora,
ue codifica una región variable de la cadena pesada de s sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y Notl;
mer dominio constante (CH1) de la cadena pesada de mprende al menos una mutación con respecto al dominio fragmento de esta;
antes o secuencias de ácido nucleico codificantes de
as arriba un sitio de escisión de proteasa fusionado con a través de una secuencia enlazadora,
que codifica una región variable de la cadena ligera de s sitios de restricción Ndel y Bglll y Hindlll y Ascl;
región constante kappa (Ck) de la cadena ligera de ena ligera de inmunoglobulina, o fragmentos de estas, en utación con respecto al dominio constante de la cadena
ue codifica una región variable de la cadena pesada de s sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y Notl,
mer dominio constante (CH1) de la cadena pesada de mprende al menos una mutación con respecto al dominio fragmento de esta;
a(s) de ácido nucleico codificante(s) de selección; y
ubierta del fago.
to de vector diseñado para clonar un anticuerpo o un o un fragmento de este del constructo de vector como se ector contiene un casete de expresión que comprende:
permite la presentación de un péptido o proteína en la
a de ácido nucleico codificante de selección, un segundo sitio de escisión enzimática,
una primera región de clonación unida operativamente segunda secuencia enlazadora, en donde las regiones de que se une selectivamente a un ligando biológicamente a
una segunda secuencia(s) de etiqueta recombinante o se una secuencia de terminación,
en donde la primera región de clonación o la segunda reg de clonación múltiple 1 (MCS I) y el sitio de clonación combinación de los sitios de restricción Ndel y BglII y Hi sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y Notl. En una mo es un vector de scFv y es capaz de expresar un fragmen una célula de levadura; en donde la secuencia promot producto que permite la presentación de un péptido o prot es la proteína Aga2P; los sitios de escisión enzimática so que comprende el sitio de escisión del factor Xa, el sitio las secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias d un grupo que comprende la etiqueta HA, la etiqueta C-M la secuencia G4S; el gen de la primera región de clonación kappa (Vk) de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fr ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta y u clonación es una región variable de la cadena pesada de i de terminación se selecciona de un grupo que comprende de estos.
En otra modalidad de la presente descripción, los constr una secuencia de ácido nucleico seleccionada de un gru No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SE SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24 y la SEQ ID No. 26.
En otra modalidad más de la presente descripción, los comprenden además regiones seleccionadas de un grup resistencia a antibióticos, origen de replicación f1, prom los constructos de vector son capaces de expresar o pre de expresión procariótico, sistema de expresión en levad
en donde la región CH1 tiene una secuencia de ácido n de ácido nucleico de SEQ ID No. 28 y la región CL tien donde las secuencias Vk, VL y VH se derivan a partir repertorio de anticuerpos sintéticos o una combinación d
La presente descripción se refiere además a un métod anteriormente, dicho método comprende las etapas anteriormente, b) linealización de un vector de destino, e comprende pADL23c, pRS314, p414Gal1, p416Gal1 y s vector de destino linealizado mediante técnicas seleccion digestión por restricción seguida de ligamiento y una com donde el método comprende además confirmar los cl secuenciación.
La presente descripción se refiere además a un método método comprende las etapas de: a) preparar el con anteriormente, b) clonar las secuencias de nucleótidos comprende la región variable kappa (Vk) de la cadena lig cadena ligera de inmunoglobulina o fragmentos de estas, o un fragmento de esta (VH) y sus combinaciones, en la biblioteca, o, transferir las secuencias de nucleótidos q comprende la región variable kappa (Vk) de la cadena lig cadena ligera de inmunoglobulina o fragmentos de estas, o un fragmento de esta (VH) y sus combinaciones, desde de clonación de otro constructo de vector para obtener l de un grupo que comprende fagémido, vector de expre vector de expresión de la cadena ligera de tipo apareamie vector unidireccional bicistrónico de levadura y vector de una segunda región de clonación en presencia de una nación reciben un gen que codifica un péptido o proteína o,
encia(s) de ácido nucleico codificante de selección, y
de clonación del casete de expresión comprende el sitio ltiple 2 (MCS II), y en donde el MCS I comprende una II y AscI, y el m Cs II comprende una combinación de los idad de la presente descripción, este constructo de vector variable monocatenario (scFv) o un fragmento de este en es Gal 1; la secuencia de nucleótidos que codifica un a en la superficie de un sistema de expresión de proteínas itios de escisión por proteasa seleccionados de un grupo escisión de la proteasa TEV y una combinación de estos; cido nucleico codificantes de selección se seleccionan de FLAG y sus combinaciones; la secuencia enlazadora es selecciona de un grupo que comprende la región variable ento de esta, la región variable lambda (VL) de la cadena combinación de estas; el gen de la segunda región de unoglobulina (VH) o un fragmento de esta; y la secuencia terminador alfa, un terminador CYC1 y una combinación
tos de vector como se describieron anteriormente tienen que comprende la SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID D No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20,
nstructos de vector como se describieron anteriormente ue comprende el origen de replicación (Ori), marcador de r y sus combinaciones y sus combinaciones; y en donde ntar un anticuerpo o un fragmento de este en un sistema o una combinación de estos;
ico de SEQ ID No. 27, la región Ck tiene una secuencia na secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 29; y en un repertorio de anticuerpos sin exposición previa, un stos.
ara preparar el constructo de vector como se describió : a) síntesis del casete de expresión definido como onde el vector de destino se selecciona de un grupo que combinaciones, y c) insertar el casete de expresión en el as de un grupo que comprende recombinación homóloga, ación de estas, para obtener el constructo de vector; y en es de vector libres de errores mediante la técnica de
a preparar una biblioteca de constructos de vector, dicho cto de vector mediante el método como se describió codifican las regiones seleccionadas de un grupo que de inmunoglobulina, la región variable lambda (VL) de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina ión de clonación del constructo de vector para obtener la codifican las regiones seleccionadas de un grupo que de inmunoglobulina, la región variable lambda (VL) de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina región de clonación de un constructo de vector a la región iblioteca, en donde el constructo de vector se selecciona n de cadena pesada de tipo apareamiento de levadura, de levadura, vector bidireccional bicistrónico de levadura, gmento variable monocatanerio (scFv); las regiones Vk, VL y VH se derivan de anticuerpos sin exposición pre biblioteca de constructos de vector es una biblioteca sinté de estas; y en donde la transferencia de la secuencia d fagémido al constructo de vector de levadura o entre con
La presente descripción se refiere además a un método de este que tiene las características funcionales deseada constructos de vector mediante el método como se descri en células huésped bacterianas, células huésped de levad huésped bacterianas o de levadura que expresan el anti funcionales deseadas,
en donde el tamizaje e identificación se lleva a cabo medi presentación en levadura en células huésped de levad presentación en levadura; en donde las característica comprende afinidad, especificidad, antigenicidad, cap estabilidad térmica, solubilidad, agregación y actividad ca
en donde el tamizaje e identificación, cuando se lleva levadura secuencial comprende las etapas de:
(i) transformar la biblioteca de constructos de fagémidos anticuerpos en fagos;
(ii) tamizar el anticuerpo presentado o fragmento de este c en fagos seleccionados que comprende los clones selecc
(iii) transferir el anticuerpo o fragmento de este de los transformación en células huésped de levadura para la e este;
(iv) tamizar el anticuerpo o fragmento de este presentado o fragmento de este que tiene las características funcion
en donde el anticuerpo o un fragmento de este está en f de levadura; en donde la eficiencia de transformación en 109 a aproximadamente 1011; y en donde la eficiencia de en el intervalo de aproximadamente 106 a aproximadame
La presente descripción se refiere además a una célula o una biblioteca de levadura de estas que comprende el(l
La presente descripción se refiere además a un casete d como se describió anteriormente, en donde dicho cas seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID No.
9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ la SEQ ID No. 25.
A menos que se defina de cualquier otra manera en la pre en relación con la presente descripción tendrán los signifi técnica. Además, a menos que se requiera de cualquier o el plural y los términos en plural incluirán el singular, se Las diversas permutaciones de singular/plural pueden est de la claridad. Generalmente, las nomenclaturas usadas biología molecular y celular y tecnología de ADN recombi conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Ciertas r expresamente en la presente descripción como referenci incluidas las definiciones. Los materiales, métodos, figu limitantes.
Además, los métodos y la preparación de los diversos emplean, a menos que se indique de otra forma, técnica cultivo celular, tecnología de a Dn recombinante, reacció Estas técnicas, sus principios y requisitos se explican en anticuerpos sintéticos o una combinación de estos; la a, una biblioteca sin exposición previa o una combinación ucleótidos se lleva a cabo entre el constructo de vector ctos de vector de levadura.
tamizaje e identificación de un anticuerpo o un fragmento ue comprende las etapas de: (a) preparar la biblioteca de anteriormente y transformar dichos constructos de vector o una combinación de estas, y (b) seleccionar las células erpo o el fragmento de este que tiene las características
te presentación en fagos en células huésped bacterianas, o secuencialmente mediante presentación en fagos y uncionales deseadas se seleccionan de un grupo que dad de fabricación, generación de nuevos epítopos, ítica y sus combinaciones;
abo mediante presentación en fagos y presentación en
células huésped bacterianas para obtener la biblioteca de
tra antígeno(s) para obtener una biblioteca de anticuerpos ados;
nes seleccionados al vector de levadura seguido de la esión y presentación de dicho anticuerpo o fragmento de
levadura contra antígeno(s) para identificar el anticuerpo deseadas;
ato Fab o Scfv para la clonación en un vector de fago o vector de fago está en el intervalo de aproximadamente nsferencia o transformación en el vector de levadura está 108.
sped bacteriana o de levadura, o una biblioteca de fagos constructo(s) de vector como se describió anteriormente.
xpresión proporcionado por el(los) constructo(s) de vector de expresión tiene una secuencia de ácido nucleico SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23 y
nte descripción, los términos científicos y técnicos usados dos que se entienden comúnmente por los expertos en la manera por el contexto, los términos singulares incluirán se considere apropiado para el contexto y/o aplicación. lecerse expresamente en la presente descripción en aras relación con las técnicas de biotecnología, inmunología, te descritas en la presente descripción son aquellas bien rencias citadas en la presente descripción se incorporan n caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción, y ejemplos son solo ilustrativos y no se destinan a ser
tores de expresión de fagémidos y levaduras descritos n biología molecular, bioquímica, química computacional, n cadena de la polimerasa (PCR) y campos relacionados. literatura y se conocen.
Antes de que se divulguen y describan los vectores de e estos vectores y otras modalidades/métodos de la pre usadas en la presente descripción tienen el propósito destinan a ser limitantes. Debe señalarse que, tal como s formas singulares "un," "una" y "el/la" incluyen referentes otra manera.
Como se usa en la presente, el término 'vector' se refiere a artificialmente material genético extraño a otra célula, don descripción es capaz de replicarse y/o expresarse en cé estas.
Como se usa en la presente, el término "antígeno" se refi inmunitaria en el cuerpo.
Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" o " puede derivarse a partir de fuentes naturales o producir "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan como sinónimos de cualquier otra manera. Además, como se usa en la anticuerpos tanto policlonales como monoclonales y quiméricos, fragmentos F(ab')2 y F(ab), moléculas F anticuerpos diméricos y triméricos, minicuerpos, molécul humanos, proteínas de fusión que comprenden la región surjan de estas moléculas, donde las moléculas derivad anticuerpo parental.
Como se usa en la presente, el término "anticuerpo composición de anticuerpos que tiene una población de a o fuente del anticuerpo ni a la forma en que se elabora también fragmentos tales como Fab, F(ab')2, Fv y otros homogéneos quiméricos y humanizados que exhiben l anticuerpo monoclonal parental.
Como se usa en la presente, "fragmento de anticuerpo" capacidad de exhibir actividad de unión a antígeno. Los té con mención específica, en donde el primero se asocia ex (CH1) y la región constante de la cadena ligera para kap
Como se usa en la presente, "biblioteca de presentación d anticuerpos en la superficie de la célula o libre de cél antígenos objetivo. En la presente descripción, la bibliote en levadura se usan con una especificación precisa a me
Como se usa en la presente, los términos "péptido señal"
Como se usa en la presente, los términos "región de indistintamente.
La presente descripción se refiere a vectores para la cl descripción se refiere a la generación de vectores para cl limita a, material genético obtenido a partir de genes de a diseñados artificialmente o partes de ellos, o una combin
La presente descripción proporciona fagémidos y vectore descripción incluyen, pero no se limitan a, fagémido, vect bicistrónico de levadura, vector de expresión de la cad expresión de la cadena ligera de tipo apareamiento de l clonación de una biblioteca de genes grande y, al mism entre diferentes vectores. En una modalidad ilustrativa, transferir la biblioteca clonada de fagémido a vector(es) presente descripción están equipados con múltiples etiq expresión y el tamizaje apropiados de los productos géni rendimiento. En otra modalidad ilustrativa, los vectores biblioteca clonada entre diferentes vectores de levadura, esión y las secuencias de ácido nucleico que constituyen te descripción, debe entenderse que las terminologías describir modalidades particulares únicamente y no se sa en esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, las plural a menos que el contexto claramente lo indique de
a molécula de ADN usada como vehículo para transportar puede replicarse y/o expresarse. El vector de la presente as procariotas, células eucariotas o una combinación de
a cualquier sustancia extraña que induce una respuesta
fragmento de este" se refiere a una inmunoglobulina que sintéticamente, en su totalidad o en parte. Los términos lo largo de la memoria descriptiva a menos que se indique sente, el término "anticuerpo" incluye preparaciones de mbién incluye lo siguiente: Moléculas de anticuerpos moléculas Fv monocatenarias (ScFv), fragmentos de de anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos de anticuerpo y cualesquiera fragmentos funcionales que retienen la funcionalidad inmunológica de la molécula de
noclonal" en la presente descripción, se refiere a una uerpos homogénea. El anticuerpo no se limita a la especie l término abarca inmunoglobulinas completas, así como gmentos, así como también poblaciones de anticuerpos propiedades de unión inmunológica de la molécula de
una porción de un anticuerpo completo que conserva la inos Fab o ScFv se usan como fragmentos de anticuerpos sivamente con el dominio constante de la cadena pesada o lambda (Ck o CA).
nticuerpos" se refiere a una(s) plataforma(s) que expresan s adecuadas para una metodología de tamizaje contra de presentación en fagos y la biblioteca de presentación s que se indique de cualquier otra manera.
"péptido líder" se usan indistintamente.
nación", "sitio de clonación múltiple" y "MCS" se usan
ación y expresión de material genético. En particular, la r y expresar material genético, lo que incluye, pero no se uerpos de origen natural, genes de anticuerpos sintéticos ón de estos.
e levadura. En una modalidad, los vectores de la presente idireccional bicistrónico de levadura, vector unidireccional a pesada de tipo apareamiento de levadura, vector de adura y vector de scFv. Los vectores se diseñan para la tiempo, son flexibles para transferir la biblioteca clonada vectores de la presente descripción son flexibles para levadura, es decir, intertransferencia. Los vectores de la s de expresión y elementos genéticos para garantizar la s expresados a través de plataformas de tamizaje de alto la presente descripción son flexibles para transferir la decir, intratransferencia.
En una modalidad no limitante de la presente descripción incluye secuencias de recombinación homólogas, sitios etiquetas, sitios de clonación múltiple (MCS) de acuerdo cadena pesada [región constante de la cadena pesada cadena ligera kappa (Ck) o la cadena ligera lambda (C genIIIP. En una modalidad, las regiones constantes de anticuerpo sin exposición previa o un anticuerpo sintético se limita a, el origen de replicación (Ori), un marcador de
En una modalidad de la presente descripción, los casetes 2A y 3A, respectivamente. En otra modalidad de la prese de ácido nucleico seleccionada de un grupo que compre
En una modalidad de la presente descripción, el mapa respectivamente. En otra modalidad de la presente des nucleico seleccionada de un grupo que comprende la SE
En otra modalidad no limitante de la presente descripci comprende vector de expresión de la cadena pesada de de tipo apareamiento, vector bidireccional bicistrónico, v presentación de ScFv.
En otra modalidad no limitante de la presente descripció que incluye promotor, péptido señal, etiqueta, sitios de cl adjuntas, sitios de escisión enzimática, terminador de l cadena pesada [región constante de la cadena pesada cadena ligera kappa (Ck) o la cadena ligera lambda (CL modalidad, las regiones constantes de la cadena pes exposición previa o un anticuerpo sintético. En una mod constantes de la cadena pesada [región constante de la constante de la cadena ligera kappa (Ck) o la cadena lige se presentará en formato de Fab. En una modalidad pref se selecciona de un vector de expresión de la cadena pes ligera de tipo apareamiento, vector bicistrónico bidireccion de presentación de ScFv. En otra modalidad ilustrativa, cadena pesada [región constante de la cadena pesada cadena ligera kappa (Ck) o la cadena ligera lambda (CL) en formato scFv. En una modalidad preferida, dicho vect scFv. Adicionalmente, los vectores de levadura también origen de replicación, origen de replicación f1, marcador d de replicación autónoma fusionada con centrómero.
En una modalidad de la presente descripción, los vectore 10C, 12C, 14C, 15C, 16C, 17C y 18C, respectivamente. levadura tiene una secuencia de ácido nucleico seleccio No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, S 18, SEQ ID No. 24 y la SEQ ID No. 26.
La presente descripción proporciona además un casete d fragmento de este. En una modalidad ilustrativa de la p para expresar el anticuerpo en formato Fab, formato scF el casete de expresión se diseña para formar una parte d estos. En una modalidad, el casete de expresión se dis formato Fab. En otra modalidad, el casete de expresión se en formato Fab, formato scFv o una combinación de esto de expresión representativos para vectores de levadura 14A, 15A, 16A, 17A y 18A, respectivamente. En otra mod levadura tiene una secuencia de ácido nucleico seleccio No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SE SEQ ID No. 23 y la SEQ ID No. 25.
La presente descripción se refiere además a la generaci expresión de material genético. En una modalidad no lim levadura o una combinación de estos, como se describió l vector fagémido comprende un casete de expresión que unión al ribosoma, promotor, péptido señal/péptido líder, las reivindicaciones adjuntas, regiones constantes de la IgG1 (CH1)] y la cadena ligera [región constante de la o fragmentos de estas, y proteína de cubierta del fago cadena pesada y/o la cadena ligera se derivan de un dicionalmente, el fagémido también comprende, pero no istencia a antibióticos y un origen de replicación f1.
expresión para fagémidos se proporcionan en las Figuras descripción, el casete de expresión tiene una secuencia la SEQ ID No. 1 y la SEQ ID No. 3.
vector fagémido se representa en las Figuras 2D y 3D, pción, el vector fagémido tiene una secuencia de ácido ID No. 2 y la SEQ ID No. 4.
, el vector de levadura se selecciona de un grupo que o apareamiento, vector de expresión de la cadena ligera tor unidireccional bicistrónico y vector monocistrónico de
el vector de levadura comprende un casete de expresión ción múltiple (MCS) de acuerdo con las reivindicaciones anscripción y opcionalmente, regiones constantes de la IgG1 (CH1)] y la cadena ligera [región constante de la o fragmentos de estas, y secuencia enlazadora. En una y/o la cadena ligera se derivan de un anticuerpo sin ad ilustrativa, el vector de levadura comprende regiones dena pesada de IgG1 (CH1)] y la cadena ligera [región lambda (CL)] o fragmentos de estas cuando el anticuerpo da, dicho vector de levadura que muestra el formato Fab a de tipo apareamiento, vector de expresión de la cadena vector bicistrónico unidireccional y vector monocistrónico vector de levadura carece de regiones constantes de la IgG1 (CH1)] y la cadena ligera [región constante de la fragmentos de estas cuando el anticuerpo se presentará de levadura que muestra el formato scFv es un vector de mprenden regiones que incluyen, pero no se limitan a, el sistencia a antibióticos, marcador auxotrófico y secuencia
e levadura se representan en las Figuras 5E, 6C, 7C, 8C, otra modalidad de la presente descripción, el vector de a de un grupo que comprende la SEQ ID No. 6, SEQ ID ID No. 16, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No.
xpresión/inserto para la expresión de un anticuerpo o un ente descripción, el casete de expresión se proporciona una combinación de estos. En otra modalidad ilustrativa, ector fagémido, vector de levadura o una combinación de a para que el vector fagémido exprese el anticuerpo en seña para que el vector de levadura exprese el anticuerpo En una modalidad de la presente descripción, los casetes proporcionan en las Figuras 5A, 6A, 7a , 8A, 10A, 12A, dad de la presente descripción, el casete de expresión de a de un grupo que comprende la SEQ ID No. 5, SEQ ID D No. 15, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 17,
de casetes de expresión y vectores para la clonación y nte, dicho vector es un fagémido, vector de expresión de teriormente.
En una modalidad, el método de generación de fagémido e incorporar dicha región en una cadena principal de vec el método de generación de fagémido comprende las eta
1. diseño y síntesis de un casete de expresión que comp MCS, etiquetas, proteína de la cubierta del fago, región c para alinearse con el formato de presentación de Fab de junto con la longitud del nucleótido homólogo frente al expresión;
2. linealización de un vector de destino, en donde el vect
3. purificación de los fragmentos respectivos y configuraci insertar el casete de expresión sintetizado en el vector lin
y en donde el método comprende además confirmar los secuenciación.
En otra modalidad, la región variable del repertorio de ca ubicación de destino (MCS) mediante el empleo de enz generados. En una modalidad, dicha región variable d anticuerpos sin exposición previa o anticuerpos generado sin exposición previa o un agrupamiento consenso sinté específica en vectores para generar constructos de bibl regiones CDR de constructos de marco para desarrol fagémidos.
En una modalidad ilustrativa, la secuencia de nucleótidos un segmento de ADN grande de ~ 2 Kb de tamaño comprende región homóloga, operador, promotor, sitios (MCS) I, región constante de la cadena ligera [kappa (Ck MCS II, región constante de la cadena pesada (CH1) s fusión y región homóloga. El casete de expresión sintetiz linealizado mediante una metodología de clonación por método de clonación basado en recombinación homóloga de anticuerpos sin exposición previa y/o sintéticos se clo fagémido, respectivamente. Por lo tanto, se generan dos constantes kappa o lambda, lo que acomoda de esta ma cadenas ligeras kappa y lambda en los vectores fagémido sintética, estos fagémidos se usan para generar múltiples cadena pesada y ligera consenso que conservan los ca las regiones constantes de las cadenas ligeras. Además, de restricción designados en las regiones CDR de las ca previa con diferenciación en cadenas ligeras kappa y lam
En otra modalidad de la presente descripción, el método casete de expresión, linealizar el vector de destino segui o mediante el uso de digestión por restricción seguida de el vector de levadura. Además, el repertorio de cadenas li dentro del vector respectivo.
El método de generación de vectores de levadura compr
1. diseño y síntesis del casete de expresión con los pro sitios de restricción deseados contra el vector de destin incluye enlazador, secuencia de recombinación homólog región constante respectiva de cadenas pesadas y ligera ausencia de dicha región constante de cadenas pesadas
2. linealización del vector de destino seleccionado del gr enzimas de restricción;
3. purificación de los respectivos fragmentos y configuraci la inserción del casete de expresión sintetizado en el restricción y ligamientos para incorporar un casete sint levadura,
prende sintetizar la región de casete de expresión/inserto linealizada (vector de destino) para obtener el fagémido, de:
de secuencias señal, sitios de unión al ribosoma (RBS), stante de la cadena ligera y la cadena pesada respectiva erdo con las reivindicaciones adjuntas, y opcionalmente, tor de destino para ayudar a la inserción del casete de
e destino es pADL23c, con enzimas de restricción;
de la recombinación homóloga mediada por enzimas para lizado para generar el fagémido,
lones de vector libres de errores mediante la técnica de
na pesada (VH) y cadena ligera (Vk o VL) se clona en la as de restricción designadas en los vectores fagémidos la cadena pesada o de la cadena ligera se deriva de intéticamente. En otra modalidad, se clonan un repertorio o de VH, Vk y VL en los respectivos MCS de ubicación ca. Además, la diversidad sintética se introduce en las una biblioteca de genes de anticuerpos sintéticos de
tetizada (casete de expresión) de la etapa anterior (1) es comprende dos segmentos, en donde el segmento 1 unión al ribosoma (RBS) 1, sitio de clonación múltiple lambda (CL)] mientras el segmento 2 comprende RBS 2, ida de una proteína de fago GeneIIIp como proteína de o se incorpora en la cadena principal del vector pADL23c fusión eficiente, productiva y sin ligamiento, que es un a cadena ligera y la cadena pesada variable del repertorio n en MCS I del segmento 1 y MCS II del segmento 2 del gémidos designados basado únicamente en las regiones a las regiones variables respectivas de agrupamientos de e destino respectivos (Figuras 2D y 3D). Para la biblioteca ones en posibles combinaciones de regiones variables de es de expresión/categorización de fagémidos basado en introduce diversidad sintética en los límites de enzimas as Vh, Vk y VA. Por otro lado, el repertorio sin exposición a se clona directamente en los fagémidos designados.
generación de vector de levadura comprende diseñar el de recombinación homóloga para la inserción del casete amiento del casete en el vector linealizado para generar as y pesadas variables se clona en la ubicación de destino
e las etapas de:
tores, terminadores, secuencias señal, MCS, etiquetas, ara ayudar a la inserción, elementos opcionales, lo que roteína de fusión para presentación y, opcionalmente, la ara alinearse con el formato de presentación de Fab o la igeras si el anticuerpo se presentará en formato ScFv;
o que comprende pRS314, p414GAL1 o p416GAL1 con
de la recombinación homóloga mediada por enzimas para tor de destino linealizado; o configurar digestiones por ado en un vector linealizado para generar el vector de y en donde el método comprende además confirmar l secuenciación.
En otra modalidad, el repertorio de las regiones variabl clona en la ubicación de MCS destinada con enzima levadura. En una modalidad, dicha región variable de la sin exposición previa o anticuerpos generados sintética exposición previa y/o un agrupamiento sintético de Vh, se clonan directamente en los respectivos MCS de vec de genes de anticuerpos eucarióticos.
En otra modalidad ilustrativa, los vectores de levadura r 10C, 12C, 14C, 15C, 16C, 17C y 18C, respectivame compatibilidad relacionados, otras características tales vectores de levadura, como lo ejemplifican los formatos sistemas de expresión: 1) vector de levadura de tipo cadenas pesadas y ligeras diferentes de diferentes vect de biblioteca más grande en formato Fab; 2) vector de l presentación en levadura que comprende dos casetes diferentes. Este formato de vector de levadura bicistrón de proteínas de la cadena ligera y la cadena pesada se Fab funcionales; y 3) vector de ScFv para clonar el fragm específica que separa las regiones Vh y Vl.
En una modalidad no limitante, los vectores de leva adecuadas para la detección y separación basadas en fl etiquetas N-terminales como C-terminales según corr incluye, pero no se limita a, la detección, el aislamiento,
Existen varias características inherentes de la tecnologí diseñado adecuadamente que lo convertiría en una he contra un antígeno/proteína específico. En primer lugar, en la superficie celular establece un vínculo físico entre eficiente el uso de métodos de alto rendimiento tales co (FACS) de manera cuantitativa. En segundo lugar, lo accesibles a las proteínas presentadas en la superficie que evita de esta manera que se requieran etapas de p la célula estabiliza las proteínas presentadas en la su interconectividad, es necesario asegurarse de que no sistema, que nuevamente debe ser libre de errores. L proporciona vectores para la transferencia suave y libr fagos/procariótico al sistema de presentación en levadu
Los vectores disponibles comercialmente pADL23c, pR vectores para plataformas de presentación en fagos y cadenas pesadas y cadenas ligeras variables de un rep respectivos sistemas de presentación y transferencia cuidadosamente sitios de las enzimas de restricción de regiones constantes de cadenas pesadas y ligeras, etiq para el vector de fagos y Aga2P para el vector de levad de restricción diseñados y colocados de forma única no de regiones variables: cadenas VH (7 familias), Vk (4 fa seleccionadas para la incorporación de diversidad sinté los vectores que portan el repertorio de genes de anticu
En consecuencia, los vectores de la presente descrip restricción específicos para la intertransferencia (es de un sistema de expresión a otro) así como también la intr del mismo sistema de expresión). En una modalidad transferencia entre sistemas, a saber, transferencia d expresión en levaduras. En otra modalidad, los vector dentro del sistema, es decir, alterar el formato de prese un vector de expresión diferente, tal como la transferen levadura bicistrónico a través del conjunto respectivo d los vectores de levadura (vector bidireccional bicistróni vector de expresión de la cadena pesada de tipo apare nes de vector libres de errores mediante la técnica de
la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (Vk o VL) se restricción designadas en los respectivos vectores de a pesada o de la cadena ligera se deriva de anticuerpos e. En otra modalidad, se transfiere un agolpamiento sin A de fagémidos a vectores de levadura o estas regiones de levadura para generar una biblioteca de constructos
entativos se representan en las Figuras 5E, 6C, 7C, 8C, Además de los sitios de restricción y los factores de o el formato de presentación se han presentado en los ScFv, mientras que el formato Fab se proyecta mediante amiento, que comprende genes que codifican las dos n diferentes cepas de levadura que producen un tamaño ra bicistrónico en donde se construye un único vector de xpresión dirigidos por promotores inducibles idénticos o onduce a la producción de cantidades estequiométricas as y, por lo tanto, optimiza el rendimiento de anticuerpos ScFv del gen del anticuerpo con un enlazador de longitud
de la presente descripción tienen etiquetas de fusión cencia. Las etiquetas de proteína se colocan tanto como da. La utilidad de estas etiquetas es múltiple, lo que rificación y el desarrollo de ensayos.
presentación en superficie mediante el uso de un vector enta de tamizaje de biblioteca de proteínas/anticuerpos resentación de una biblioteca combinatoria de proteínas N y la proteína, lo que permite de manera conveniente y ISA o clasificación de células activadas por fluorescencia tratos o ligandos/receptores objetivo son directamente cesidad de cruzar la barrera de la membrana celular, lo ción de proteínas laboriosas. En tercer lugar, la unión a ie. Debido al diseño del sistema de presentación y su a pérdida de moléculas mientras se transfieren a otro mo se logra con éxito en la presente descripción que errores de genes desde el sistema de presentación en ucariótico.
y p414GAL1 y p416GAL1 se emplearon para diseñar los duras, respectivamente. Para la clonación eficiente de o de anticuerpos sin exposición previa o sintéticos en los és de los sistemas de presentación, se proporcionaron ra que están ausentes en la cadena principal del vector, , proteínas de presentación tales como GenelIIp o G3P ecuencias líder y de terminación. Además, dichos sitios n estar presentes en la secuencia de consenso diseñada ) y VL (3 familias). Además, las enzimas de delimitación n todas las CDR son únicas y no existen en ninguno de sintéticos.
se diseñan de forma única para comprender sitios de transferencia de genes de anticuerpos de un vector de ferencia (es decir, la transferencia dentro de los vectores vectores de la presente descripción son capaces de es de anticuerpos del sistema en fagos al sistema de la presente descripción son capaces de transferencia ón de Fab a ScFv o viceversa, o el mismo formato pero vectores de levadura de tipo apareamiento a vector de imas MCS. La región MCS I/MCS del vector fagémido y levadura, vector unidireccional bicistrónico de levadura, to de levadura, vector de expresión de la cadena ligera de tipo apareamiento de levadura y vector de scFv) pa comprende los sitios de restricción Ndel, y BglII, y Hin vectores de levadura (vector bidireccional bicistrónico vector de expresión de la cadena pesada de tipo apare de tipo apareamiento de levadura y vector de scFv) p comprende los sitios de restricción NcoI, y Xbal, y Nhel, la cadena ligera variable (MCS I/MCS) comprende un HindlII y AscI, y Ndel y AscI. En otra modalidad preferida I/MCS) comprende una combinación de los sitios de res
La presente descripción se refiere además a la aplicación de anticuerpos. En otra modalidad, la biblioteca de antic génica de anticuerpos sintéticos, una biblioteca de antic
En la presente descripción, los vectores como se descri biblioteca de expresión génica de anticuerpos, lo que in de anticuerpos sintéticos, una biblioteca de expresión g de estos, en donde dicho método comprende un proce empleo de herramientas combinatorias.
En una modalidad ilustrativa, las herramientas comb tecnología de presentación en levadura. En otra moda presentación en fagos solo, tecnología de presentaci presentación en fagos y levadura para crear una biblio preferida, el método emplea el tamizaje mediante tecno tecnología de presentación en levadura para crear una
En una modalidad no limitante de la presente descripció permite el aislamiento de moléculas de anticuerpos ú objetivo terapéutico específico, es decir, un antígeno, co
En otra modalidad no limitante de la presente descripci se seleccionan de un grupo que comprende, pero no generación de nuevos epítopos, estabilidad térmica, a cualquier combinación de estas y cualesquiera otras p producto.
En otra modalidad no limitante más de la presente de génica de anticuerpos incluye explorar secuencialment presentación en levaduras lo que permite aprovechar un un carácter de la biblioteca basada en fagos. Subsecue sistema de presentación en levadura. El uso de un siste ventajoso debido a la traducción de las proteínas eu productos de anticuerpos en la superficie celular. Ademá con objetivos antigénicos con alta especificidad. La in complementarios genera "moléculas primarias" (es deci tasa de éxito en términos de potencial de comercializaci a generar una biblioteca de expresión génica de anticu tecnología de presentación en levadura secuencial de describió anteriormente.
Los vectores de fagémidos y levaduras de la prese bibliotecas de genes de anticuerpos grandes y diversas manera el potencial para identificar, transferir, preservar antígenos con afinidades y especificidades variadas.
En una modalidad no limitante de la presente descripci fagos procarióticos se emplea en la presente descripc grande de aproximadamente 109 a aproximadamente 1 amplia diversidad inherente a dicha biblioteca. Al mismo t puede no ser lo mejor para identificar la funcionalidad su en fagos se integra por lo tanto con la plataforma de pre postraduccionales para una funcionalidad superior. Para expresión de una biblioteca de genes de anticuerpos alt la presente descripción. Estas bibliotecas de genes artificialmente y sintetizados químicamente o a partir de a clonación de la secuencia de la cadena ligera variable y AscI. La región MCS II/MCS del vector fagémido y los levadura, vector unidireccional bicistrónico de levadura, ento de levadura, vector de expresión de la cadena ligera la clonación de la secuencia de cadena pesada variable otl. En una modalidad preferida, la región de clonación de mbinación de los sitios de restricción seleccionados de región de clonación para la cadena pesada variable (MCS ión seleccionados de NcoI y XbaI, y NcoI y NotI.
vectores instantáneos en la construcción de una biblioteca os incluye, pero no se limita a, una biblioteca de expresión os sin exposición previa o una combinación de estas.
nteriormente se emplean en un método para generar una e, pero no se limita a, una biblioteca de expresión génica a de anticuerpos sin exposición previa o una combinación ento de tamizaje para antígeno específico(s), mediante el
torias incluyen tecnología de presentación en fagos y d, el método emplea el tamizaje mediante tecnología de en levadura sola o una combinación de tecnología de de expresión génica de anticuerpos. En una modalidad a de presentación en fagos seguida secuencialmente por oteca de expresión génica de anticuerpos.
a biblioteca de expresión génica de anticuerpos sintéticos s con las propiedades funcionales deseadas para una na mayor afinidad y especificidad.
las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos mita a, afinidad, especificidad, capacidad de fabricación, enicidad, solubilidad, agregación y actividad catalítica, o iedades relacionadas con la comercialización exitosa del
ción, el método de generar una biblioteca de expresión tecnología de presentación en fagos y la tecnología de junto más grande de diversidad de genes de anticuerpos, mente, los clones de anticuerpos se tamizan a través del de levadura para la expresión de genes de anticuerpos es óticas, el procesamiento y el plegado apropiado de los expresión en levadura permite una interacción adecuada ación obtenida mediante el uso de estos dos sistemas nticuerpos específicos para un antígeno) con una mayor Los vectores de la presente descripción ayudan con éxito os mediante la tecnología de presentación en fagos y la a las diversas características de los vectores como se
descripción acomodan y transfieren de forma cruzada avés de un proceso libre de errores lo que mejora de esta enerar moléculas primarias/únicas contra una multitud de
el sistema de expresión en superficie de presentación en para acomodar una biblioteca de genes de anticuerpos y preferentemente, > 1011 de manera que se mantenga la po, dado que el uso de un sistema de tamizaje procariótico r de la molécula de anticuerpo, el sistema de presentación tación en levadura eucariótica que permite modificaciones rar esta tarea, los vectores fagémidos para la clonación y nte diversificada (>1011 clones) se diseñan y emplean en ecopilan ya sea a partir de oligonucleótidos diseñados uencias de genes de anticuerpos de origen natural. Todos los conjuntos de vectores se diseñan con elementos g aseguran un alto nivel de expresión de genes de anticue etiquetas de proteínas lo que permite el aislamiento y pur
En una modalidad específica de la descripción, la estrateg grande a través de la tecnología de presentación en fago vuelven a clonar en vectores de presentación en levadur que incluye, pero no se limita a, ScFv o Fab u otros form la presente descripción se diseñan de manera que el tami de fagémidos y después los clones se transfieren a d diferentes formatos de genes de anticuerpos, lo que in anticuerpos. Los vectores fagémidos de la presente desc múltiples tipos de vectores de presentación en levadura. son únicos en términos de clonación y expresión de difer no se limita a, ScFv, Fab y otros formatos. Además, los transferir los clones parcialmente tamizados del sistem levaduras o para generar directamente una biblioteca sin forma combinatoria o no combinatoria, en donde la est cadena pesada y cadena ligera que se transfiere dire transferencia de clones tiene lugar, preferentemente, a cepas de levadura. Los sitios de restricción para la transfe cuidadosa y única para hacer que la transferencia de ge de expresión de levadura contienen múltiples etiquetas expresión de proteínas de longitud completa y se diseñan rendimiento. Se usaron múltiples variantes de secuencia anticuerpos una vez expresados dentro de la levadura. E pero no se limita a, ELISA, clasificación de células activad en perlas de alto rendimiento, tecnologías de separación tecnología de separación magnética y sus combinaciones en la purificación rápida del producto génico del antic estratégicamente ubicados.
Por lo tanto, los presentes vectores y métodos aprovech la biblioteca de genes de anticuerpos basado en un diseñ de vectores, el perfil de expresión y las estrategias de t transición eficiente entre plataformas de presentación en El diseño también acomoda la transferencia no combin fagos al sistema de presentación en levadura. La presen para el tamizaje primario que se centra en la rigurosidad y formato de alto rendimiento y las moléculas tamizadas p la presentación nativa a través de la plataforma de levadu en fagémidos y vectores de levadura de la presente descri y ligeras sin la introducción de ninguna metodología bas manera la diversidad tamizada existente de la biblioteca. exitosa de bibliotecas de genes de anticuerpos y el ta primarios. Por lo tanto, cada tipo de vectores (vectores p en levaduras) contribuyen de manera combinatoria al primarias funcionalmente específicas pero estructuralmen una presentación única del resto Fab o dicho tipo de frag Fab y scFv o fragmentos de anticuerpos similares se ex de presentación en levadura tiene la posibilidad de s apareamiento para presentar Fab o fragmentos de anticu el tipo apareamiento, se adopta para eludir el probl generalmente en las células de levadura en comparación de esta manera un mayor número de clones. El proceso en células que expresan antígeno a través de dos siste para seleccionar positiva o negativamente una gama de especificidad, capacidad de fabricación y actividad cat vectores de la presente descripción permite conservar la capaz de identificar moléculas únicas contra objetivos anti parte de dos sistemas de presentación diferentes, por lo anticuerpos, lo que incluye, pero no se limita a, biblioteca con alta diversidad que sirven como un recurso tremendo mejorados y su posterior desarrollo comercial.
ticos como se describió en los párrafos anteriores que s como proteínas de fusión, así como también múltiples ación eficiente de genes de anticuerpos dirigidos.
es tamizar primero una biblioteca de genes de anticuerpos n donde los clones seleccionados subsecuentemente se ara representar los formatos de genes de anticuerpos lo s de anticuerpos. Por lo tanto, los vectores fagémidos de e preliminar de genes de anticuerpos se completa a través rsos vectores de expresión en levadura para expresar ye, pero no se limita a, ScFv, Fab u otros formatos de ión son compatibles para transferir los genes clonados a s presentes vectores de expresión en levadura también s formatos de genes de anticuerpos, lo que incluye, pero sentes vectores de expresión en levaduras se usan para e presentación en fagos al sistema de presentación en posición previa o sintética en los sistemas de levadura de egia posterior conserva una combinación específica de mente desde el sistema de presentación en fagos. La vés de métodos basados en digestión por restricción en cia de genes o la nueva clonación se diseñan de manera sea compatible entre diferentes vectores. Los plásmidos proteínas de fusión y sitios de escisión para asegurar la ra aislarse y purificarse a través de metodologías de alto eñal para optimizar la secreción de diversos formatos de na modalidad, la metodología de alto rendimiento incluye, por fluorescencia (FACS), métodos de selección basados células, microscopía automatizada de alto rendimiento, as poblaciones clonales seleccionadas también son útiles po mediante el uso de sitios de escisión de proteínas
tanto el repertorio de anticuerpos diverso como único de nico y criterios exclusivos de tamizaje/selección. El diseño izaje adoptadas en la presente descripción permiten una gos y levaduras, o entre diversos vectores en sí mismos. ia de clones obtenidos del tamizaje de presentación en ión en fagos acomoda el tamaño de la biblioteca (>1011) especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno en un n de nuevo por un proceso de aleatorización para imitar El conjunto único de enzimas/sitios de restricción usados ión permite la transferencia de cadenas variables pesadas en amplificación tal como PCR, lo que preserva de esta ho enfoque es muy importante/crucial para la generación je para determinar moléculas/productos de anticuerpos la presentación en fagos y vectores para la presentación ceso de desarrollo de restos de anticuerpos/moléculas variadas. El procedimiento de expresión también asegura tos de anticuerpos en fagos mientras que los fragmentos n en la superficie de la levadura. Además, la plataforma cionar vectores con un enfoque bicistrónico y de tipo os similares. Esta estrategia en particular, especialmente a de la baja eficiencia de transformación observada n la eficiencia de transformación en E. coli, lo que tamiza neral con múltiples rondas de selección en un antígeno o s de presentación diferentes es extremadamente valioso piedades de anticuerpos deseadas, tales como afinidad, ica. El diseño estratégico y el uso combinatorio de los ersidad en la biblioteca de genes de anticuerpos que es nicos variados. Los presentes vectores y su empleo como nto, ayudan en la generación de bibliotecas de genes de in exposición previa o sintéticas de anticuerpos humanos a la identificación de anticuerpos nuevos y funcionalmente En conjunto, en la tecnología de presentación en fagos, para clonar y tamizar genes de anticuerpos potenciales c continuación, estos genes se transfieren a los vectores d un tamizaje adicional y para identificar moléculas primari los presentes vectores es beneficioso ya que la tecnologí de bibliotecas de anticuerpos grandes diversificadas,
superior en términos de sistema de expresión eucarióti tecnología de presentación en levadura ayuda a imitar l reconocimiento de los antígenos cuando se expresan en
Por lo tanto, la combinación de estas dos tecnología procarióticos y eucarióticos de la presente descripción diversas y desarrollar nuevas moléculas de anticuerp identificadas tienen un mayor potencial de producció diversificación de la biblioteca de anticuerpos, el tamizaj diseño racional.
En una modalidad de la descripción, las características resumen además en la Tabla 1.
T l 1: r rí i vectores fagémidos de la presente descripción se usan afinidad alta a moderada hacia el antígeno específico. A resentación en levadura de la presente descripción para El uso de estas dos tecnologías mediante el empleo de e presentación en fagos permite la clonación y expresión tras que la tecnología de presentación en levadura es y plegamiento adecuado de proteínas. Por lo tanto, la motivos estructurales de los anticuerpos para un mejor uperficie de la célula de levadura.
complementarias mediante el empleo de los vectores ventajosa para tamizar bibliotecas de anticuerpos muy contra antígenos específicos. Las moléculas primarias ya que la presente estrategia representa una mayor través de sistemas eucarióticos y la incorporación de un
as/cruciales de los vectores de la presente invención se
l r n v r
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Todos los materiales biológicos empleados en la present
EJEMPLOS
Materiales empleados:
Se emplearon los siguientes materiales para llegar a los
Escalera de 1 Kb (Invitrogen, EE. UU.); Agarosa (SIGMA prep (Qiagen, EE. UU.); polimerasa Taq (NEB, EE.UU.); Agar, dam-/dcm- (NEB, EE.UU.), Neb5alpha (NEB, EE. EE. UU.); Xbal, (NEB, EE. UU.); HindIII-HF, (NEB, EE.
(NEB, EE. UU.); Notl (NEB, EE. UU.), Spel-HF (NEB, E TG1 (Lucigen, EE.UU.); ADN ligasa T4 (NEB, EE. UU.); Mini prep (Qiagen, EE. UU.); Caldo LB; ampicilina (MP Bi infusión HD (Clontech, EE. UU.); Glicerol (Fischer Sci aminoácido (BD, EE.UU.); base de nitrógeno para levad EE. UU.); galactosa (SiGmA, EE. UU.); caldo YPD (S (Clontech, EE. UU.).
Además, los siguientes constructos de vector/cadenas Culture Collection and Gene Bank (MTCC), India.
escripción/ejemplos se obtuvieron de fuera de la India.
mplos actuales:
E. UU.); Kit de elución en gel (Qiagen, EE. UU.); kit mini TP (NEB, EE. UU.); ADN ligasa T4 (NEB, EE. UU.); LB-); ampicilina (MP Biomedicals, EE.UU.); NcoI-HF, (NEB, ); AscI (NEB, EE. UU.); HindIII-HF, (NEB, EE. UU.); AscI U.), SacII (NEB, EE. UU.), Xhol (NEB, EE. UU.); células de purificación por PCR (Qiagen, EE. UU.); Agar-LB; kit edicals, EE.UU.); kanamicina (MP biomedicals, EE. UU.); ific, EE. UU.); dextrosa (Merck, Estados Unidos); Cas-(SIGMA, EE. UU.); hidrogenofosfato de sodio (SIGMA, A, EE. UU.); suplemento doble deficiente en Ura Trp
ncipales de vector se depositaron en el Microbial Type
Figure imgf000023_0001
EJEMPLO 1
Estrategia general de diseño del vector:
El éxito de las bibliotecas de anticuerpos tales como b depende únicamente del diseño único que debe ser suficientemente grande. Cualquier tamaño y diversidad d los anticuerpos están directamente vinculados. Aparte de variables - sintéticas o sin exposición previa; el desarro diferente para acomodar el repertorio grande es extrem estratégicamente la utilidad de cada vector es el elemento
El método actual implica el desarrollo de dos vectores f formato Fab con modificaciones específicas designadas lambda junto con la región constante de la cadena pesad
Los vectores desarrollados se usan para acomodar el re fuente diseñada sintéticamente, de manera intercambi sintéticos o sin exposición previa, estos se usan para inmunooncología.
El método implica el uso de los presentes fagémidos presentación de proteínas separadas para expresar l exposición previa y/o sintética. En primer lugar, la tecnol genes de anticuerpos potenciales con afinidad alta a mo genes se transfieren a plásmidos de presentación en leva primarias. La combinación de estas dos tecnologías com anticuerpos muy diversas y el desarrollo de nuevas molé La transferencia suave de la población clonal desde el fag de restricción usadas en MCS I y MCS II son idénticas c enzimas de restricción cuidadosamente colocados permi variables de MCS I de fagémido a MCS I de cualquier reubican a MCS II de cualesquiera vectores de levadura. intrasistema, es decir, la alteración del formato de prese un vector de expresión diferente, tal como la transferenci es posible mediante el conjunto respectivo de enzimas d todos los sistemas y formatos posibles también proporc permite compensar las diferencias entre los dos sistemas
EJEMPLO 2
Generación de vector fagémido:
Para obtener una biblioteca de proteínas/péptidos altame de anticuerpos, se tomaron las siguientes consideracion anticuerpos grande y funcional ya sea con un agrupa moléculas diseñado in silico y desarrollado sintéticamente y vector de clonación y expresión compatible, lo que per como se ejemplifica por la compatibilidad con el método seleccionados para varios experimentos de caracterizaci
Para acomodar un número grande de moléculas en for donde se confirma la presencia de ambos tipos de inserto pesada, a nivel de constructo.
iotecas sin exposición previa o inmunitarias o sintéticas rso y del tamaño final de la biblioteca, que debe ser biblioteca de anticuerpos y la especificidad y afinidad de iseño crucial del repertorio de cadenas ligeras y pesadas de un sistema de vectores de expresión especialmente mente importante. Además del hecho declarado, alinear ve para la generación y selección de bibliotecas exitosas.
midos únicos para acomodar y expresar anticuerpos en cia las regiones constantes de la cadena ligera kappa y unto con otras características/modificaciones.
rtorio de anticuerpos a partir de una fuente natural y una le. Después de la generación de bibliotecas de fagos amizaje contra antígenos objetivo de diversas redes de
plásmidos de expresión en levadura en tecnologías de genes de proteínas/anticuerpos de una biblioteca sin a de presentación en fagos se usa para clonar y tamizar rada hacia un antígeno específico. A continuación, estos a para un tamizaje adicional e identificación de moléculas entarias da como resultado el tamizaje de bibliotecas de as de anticuerpos primarios contra antígenos específicos.
los vectores de levadura es eficiente, ya que las enzimas respecto a los dos sistemas de expresión. Estos sitios de transferir la población seleccionada de cadenas ligeras ctor de levadura, mientras que las cadenas pesadas se demás de la transferencia intersistemas, la transferencia ción de Fab a ScFv o viceversa, o el mismo formato pero e vectores de tipo apareamiento a un vector bicistrónico, estricción basado en MCS. La transición libre a través de a una aleatorización de cadenas ligeras y pesadas que presentación.
eficiente y funcionalmente grande, tal como una biblioteca importantes: 1) Generación eficiente de un repertorio de nto natural amplificado por PCR o un agrupamiento de vectores fagémidos; 2) Escoger un formato de anticuerpo ía el análisis rápido aguas abajo de clones seleccionados tamizaje adecuado seguido de la transferencia de clones posteriores.
o Fab, se adoptó el método de clonación en dos etapas, s decir, regiones variables de la cadena ligera y la cadena En la presente descripción, los vectores fagémidos tie anticuerpos humanos específicos unidas tanto a cade (dominio IgG1-CH1 humano). Otras características es señal PelB, sitios de clonación múltiple (MGS I para el cadenas pesadas), etiquetas FLAG y C-Myc, están pre continuación del dominio GH1 y se usarán para la detec con la proteína PIII de la cubierta del fago, GenelIIP. pesada se presenta en el fago en una forma asociada cadena ligera se expresa como un fragmento separado, pesada y completa la configuración de presentación. U entre los genes del anticuerpo y la proteína del fago Ge cepa no supresora de E. coli como las células TG1 eje ligera se clonará en la región MGS I que consiste de lo las regiones variables de la cadena pesada se destinar diseño y empleo de las enzimas de restricción se bas codificantes de las cadenas pesadas y ligeras variable nucleótidos o más, lo que conduce a una eficiencia de cl su eficiencia en las digestiones dobles recomendadas constantes a través de múltiples vectores en diversos si sitios de clonación en todo momento, se realizaron vari en levadura. Gomo se describió anteriormente, estos v nucleótidos de origen tanto sin exposición previa como para facilitar el proceso de generación de bibliotecas y l disminuyeron los sitios de restricción específicos o ciert el marco de traducción.
Algunas de las modificaciones llevadas a cabo en la individuales son las siguientes:
1. Natl, Eagl, Spel, Xmal, Smal, Sfil (SEQ ID No. 30, p que se eliminaron del vector pADL23c (Figura 1).
2. Se modifican los sitios de enzimas EcoRI(SEQ ID No pb 2127) de la cadena principal del vector.
3. Se eliminaron las regiones específicas (SEQ ID No. de la cadena principal del vector pADL23c.
4. El sitio de restricción BamHI (SEQ ID No. 30, pb 2754
5. Se modificaron los sitios de enzimas BstEII, (SEQ ID a pb 2786) y BbcI (SEQ ID No. 27, pb 2733 a pb 2738)
6. Se modificó el sitio HindIII de la etiqueta C-Myc (SEQ
7. Se eliminó BlpI (SEQ ID No. 28, pb 2345 a pb 2351)
Algunos de los cambios antes mencionados también se
Como puede entenderse, los vectores fagémidos qu (bibliotecas de anticuerpos sintéticos o sin exposición pr cuenta los diversos procesos posteriores. En conjunto, e y avanzar junto con el tamizaje.
Al tener en cuenta todas las modificaciones y el objetivo 2A y SEQ ID No. 1) y Lambda (Figura 3A y SEQ ID No expresión/inserto en la cadena principal del vector pADL a varias modificaciones antes de la linealización y clona una cadena principal de vector para la generación de do diferenciarán principalmente mediante las regiones con de la cadena ligera kappa y lambda. Se adoptó un en casete de expresión/inserto en la cadena principal de inserto lambda sintetizados se transformaron en célula cantidades mediante el uso del kit midi prep de Qiagen del inserto kappa fueron ligeramente diferentes en comp 10 |jg de pADL23c se linealizaron mediante el uso de en n operón bicistrónico que tiene regiones constantes de igeras (Ck o CK y CA o CL) como a cadenas pesadas les tales como el sitio de unión al ribosoma, secuencia rtorio de cadenas ligeras y MGS II para el repertorio de s en los vectores fagémidos. Las etiquetas se asocian a de la expresión de Fab. El dominio IgG1-CH1 está unido o parte del formato de presentación de Fab, la cadena vés de la proteína GenelIIP expresada, mientras que la tado en el periplasma, donde se empareja con la cadena ón de parada ámbar (TAG) se coloca estratégicamente , lo que permite la producción de fragmentos Fab en una adas. El agrupamiento de regiones variables de cadena s de restricción Ndel, BglII, HindIII y AscI, mientras que GS II que contiene los sitios NcoI, Xbal, Nhel y Notl. El su baja probabilidad de cortar dentro de las regiones anas. Adicionalmente, producen superposiciones de 4 ión óptima. Las enzimas no dependen de la metilación y perior al 90 %. Estos sitios de restricción se mantienen s de expresión, tal como la levadura. Para mantener los dificaciones en los fagémidos y los vectores posteriores s se usan para acomodar el conjunto de secuencias de tico, por lo tanto, se incorporaron varios cambios únicos terior transferencia a la levadura. Estos cambios también ptidos sin cambiar las composiciones de aminoácidos o
ena principal del vector y otros elementos/secuencias
5 a pb 2106) son algunas de las enzimas de restricción
pb 2004 a pb 2009) y BstXI (SEQ ID No. 30, pb 2116 a
b 2108 a pb 2128 y SEQ ID No. 30, pb 2132 a pb 2161)
2760) se modificó de la proteína GeneIIIP.
7, pb 2882 a pb 2888) Bsu36I (SEQ ID No. 27, pb 2779 región GH1.
o. 2, pb 2958 a pb 2963).
.
ltan en la Figura 1 de la presente descripción.
la primera etapa para generar y tamizar bibliotecas se diseñaron con la máxima atención, donde se tuvo en e la ruta más eficiente para la construcción de bibliotecas
asete de expresión/inserto se diseñó para kappa (Figura y se sintetizó seguido de la incorporación del casete de dquirido comercialmente que posteriormente se sometió del casete de expresión/inserto. Se usó pADL23c como tores fagémidos diferentes. Estos vectores fagémidos se es de la cadena ligera, es decir, las regiones constantes basado en la recombinación homóloga para clonar el 23c modificada. Los constructos de inserto kappa y de m-/dcm- y los ADN respectivos se aislaron en grandes su posterior digestión. Las estrategias para la clonación n con la clonación del inserto lambda. Aproximadamente s BamHI-HF y EcoRI-HF mientras que aproximadamente de 5 |jg de inserto-kappa se digirieron con la enzima Sfi digirieron primero con Pvul aproximadamente a 37 °C d aproximadamente a 37 °C durante aproximadamente 2 tamaño de banda deseado era ~2,3 kb. El vector pADL2 se eluyen en gel, en donde el gel escindido se disuelv tampón QX1. Se añaden aproximadamente 30 j l de segundos seguido de incubación a aproximadamente 5 de lavados a las perlas; primero con aproximadamente 500 j l de tampón PE. El ADN se eluye con aproximada abajo representan los componentes/reactivos usados p fagémidos basados en inserto kappa e inserto lambda.
T r otro lado, aproximadamente 5 jg de inserto lambda se aproximadamente 2 horas seguido de la adición de Sfil s, lo que dio como resultado tres bandas, en donde el ealizado y el inserto kappa y el inserto Lambda digeridos mezclar aproximadamente 3 volúmenes de solución de s QIAEX II mediante agitación con vórtex durante 30 durante aproximadamente 10 minutos. Se le dan series j l de QX1 seguido de 2 lavados con aproximadamente e 30 j l de agua libre de nucleasas. Las Tablas 2-4 más nealizar el vector pADL23c y la generación de vectores
2
Figure imgf000025_0001
T 3
Figure imgf000025_0003
T 4
Figure imgf000025_0002
Se configuró la reacción de infusión para el vector y el ins a aproximadamente 50 °C durante aproximadament aproximadamente 2,5 j l de la mezcla de reacción In-Fu reacción se incubó durante aproximadamente 30 minut de medio SOC para la recuperación de las células transf ampicilina seguido de incubación durante la noche a apr y se inocularon en 5 ml de LB-Amp y se aisló el plásmi digestión por restricción con BamHl/EcoRl y Ncol/Hindll mientras que para el vector lambda, los clones se proba o en combinaciones respectivas (Figura 3B y 3C). Los c que estaban libres de errores. Los vectores fagémidos s 2 D y SEQ ID No. 2) y fagémido pZB001.1 con inserto l presentado al MTCC en virtud del tratado de Budapest c Además, el vector fagémido que tiene una región consta por un experto en la técnica basado en el procedimien vector fagémido depositado (inserto kappa).
insertos kappa y lambda (Tabla 5) seguido de incubación minutos. Después de la incubación, se añadieron a los 50 j l de células Stellar competentes. La mezcla de hielo seguido de la adición de aproximadamente 500 j l das. Las células se sembraron en placas de agar LB con damente 37 °C. Las colonias aparecieron al día siguiente os plásmidos aislados se comprobaron para análisis de confirmó la presencia de inserto kappa (Figura 2 B y C) ara Pvull, Ncol/Hindlll-HF, Ncol/Pvull y Ndel/Pvull solos positivos se enviaron para secuenciación y se encontró ominaron pZB001 - fagémido con inserto kappa (Figura a (Figura 3 D y SEQ ID No. 4). El vector pZB001 se ha número de acceso MTCC 25125 y denominado pZB001. la cadena ligera (inserto lambda - CL) puede prepararse perimental mencionado anteriormente y los detalles del Ta 5
Figure imgf000026_0001
Se usaron los vectores fagémidos pZB001 y pZB001.1 co de fagos sintética y sin exposición previa para el tami diversidad de la biblioteca se estimaron tanto por los enfo generación. Los resultados de la secuenciación de la mol diversidad de las moléculas seleccionadas. El ADN mon se transfirió a vectores de expresión de levadura.
EJEMPLO 3
Generación de vectores de expresión de levadura:
La biblioteca de presentación de anticuerpos represe expresados en la superficie celular unidos a otras proteí aceptado debido a la facilidad de clonación, lo que permit y es fácil determinar diversos parámetros de estabilid limitaciones asociadas con el plegamiento de proteínas ausencia de modificaciones postraduccionales de los fra superar estas limitaciones, se emplea la plataforma de pr y versátil para aislar y manipular fragmentos de antic eucariótico, ya que es compatible con la evaluación cuant clasificación de células activadas por fluorescencia (FAC
En comparación con otras tecnologías de presentació anticuerpos sin exposición previa/no inmunitarias median Aga1P y Aga2P tiene un número significativo de ventajas. una rápida caracterización de clones lo que incluye la d epítopos de clones mutuamente excluyentes directament de purificación de proteínas para realizar estas cara anticuerpos Fab en levadura sugiere un enfoque más si fragmentos Fab se componen de cadenas pesadas y lig diferentes vectores en diferentes cepas de levadura, en diploide mediante apareamiento, un proceso muy efici presentación en levadura es un tamaño de biblioteca re transformación en levadura, que se supera en la presente que emplea una combinación del concepto de presentaci
Como puede entenderse a partir de los hechos mencio deben transferirse a diversos vectores de expresión de l diversos formatos tales como ScFv, Fab, etc. Para tener levadura, se mantuvieron idénticos los sitios de clona expresión en levadura son bidireccionales bicistrónicos o de anticuerpos humanos específicos unidas tanto para las pesadas (dominio IgG1-CH1 humano). Otras característi alfa de tipo apareamiento para la cadena ligera; péptid múltiple (MCS I para el repertorio de cadenas ligeras y (etiqueta de epítopo V5 y etiqueta 6xHis para la cadena li pesadas) están presentes en todo tipo de vectores de le constante y se usarán para la detección de la expresión mediante la presentación en superficie se lleva a cabo conformación de paratopos de anticuerpos, secuencias y aislar la molécula Fab o ScFv mediante el uso de sitio comprende el virus del grabado del tabaco (TEV), entero las etiquetas en la cadena pesada.
ecuencia confirmada para la generación de una biblioteca e/selección contra el antígeno objetivo. El tamaño y la s del grupo de pares como por secuenciación de próxima ula seleccionada también confirmaron que se conserva la tenario se aisló a partir de las moléculas seleccionadas y
una biblioteca de anticuerpos parciales o completos s celulares. La presentación en fagos es el método más randes tamaños de biblioteca, presentación monovalente . Sin embargo, con la presentación en fagos existen ropiado debido al sistema de expresión procariótico y la entos de anticuerpo representados de esta manera. Para ntación en levadura, una metodología cuantitativa robusta pos. Se elige la levadura, un sistema de presentación iva y en tiempo real que emplea técnicas de clasificación-
in vitro, la presentación en levadura de bibliotecas de el uso del complejo de receptor de adhesión de aglutinina r ejemplo, el uso de análisis por citometría de flujo permite rminación de la Kd, la medición de la Koff y la unión de bre la superficie de la levadura. Esto elimina la necesidad rizaciones. La presentación exitosa de fragmentos de le para la construcción de bibliotecas grandes. Como los s, es posible por lo tanto codificar los dos polipéptidos en de las dos cadenas pueden unirse en una sola levadura e. Sin embargo, el principal desafío en el caso de la ivamente más pequeño debido a la menor eficiencia de r los aspectos proporcionados por la presente descripción, en fagos y/o levadura.
os anteriormente, las moléculas seleccionadas en fago dura ya sea de forma combinatoria o no combinatoria en a transferencia conveniente de fagémidos a vectores de múltiple. En la presente descripción, los vectores de direccionales bicistrónicos que tienen regiones constantes denas ligeras (Ck o CK y CÁ o CL) como para las cadenas cruciales tales como la secuencia de señal líder (factor íder Aga2P para la cadena pesada), sitios de clonación CS II para el repertorio de cadenas pesadas), etiquetas a; etiquetas FLAg y C-Myc para el repertorio de cadenas ura. Las etiquetas se asocian a continuación del dominio Fab. El tamizaje para obtener la biblioteca de levaduras diante el empleo de epítopos antigénicos competidores, tivos de secuencia o cualquier combinación de estos para e escisión de proteasa seleccionados de un grupo que inasa (Ek), etc., colocadas estratégicamente después de Los enfoques para la generación de vectores de lev bidireccional bicistrónico; 2) vector unidireccional bicistr
(A) Generación de vector bidireccional bicistrónico
Para generar el vector bidireccional bicistrónico de leva EE. UU.) (Figura 4). Algunas de las modificaciones elementos/secuencias individuales son las siguientes:
1. SacI, SacII, EagI, Notl, Spel, BamHI, Xmal, Smal, PstI de restricción que se eliminaron del vector pRS314 (SE 4).
2. El sitio Spel (SEQ ID No. 29, pb 2600 a pb 2605) se (CL).
Además, se diseñaron y sintetizaron para casetes de ex 6 A y SEQ ID No. 7) que comprenden el promotor Gal etiquetas (etiquetas V5 e His para las cadenas ligeras respectivas unidas tanto a las cadenas ligeras (Ck o C restricción Spel se ha eliminado de la región CA.
Como parte del formato de presentación de Fab, la cade mediante la proteína Aga2P expresada, mientras que Durante el proceso de maduración de la proteína, se e presentación de Fab. Las secuencias de terminación se CYC1 para la cadena pesada y el terminador alfa para l con Fab soluble, se fijó el sitio de escisión de la proteas la proteína Aga2P. Existe una región enlazadora (G4S Aga2P para introducir flexibilidad en la conformación de
Aproximadamente 10 pg de vector pRS314 e inserto-ka (Tabla 6) a aproximadamente 37 °C durante la noche se al mezclar con aproximadamente 3 volúmenes de soluci QIAEX II mediante agitación con vórtex durante a aproximadamente 50 °C durante aproximadamente 10 aproximadamente 500 pl de QX1 seguido de 2 lavados con aproximadamente 30 pl de agua libre de nucleasa inserto-kappa-levadura se escindieron adicionalmente c seguido respectivamente de la elución en gel y la config
T que se han desarrollado son de tres tipos: 1) vector 3) vector de ScFv y 4) vectores de tipo apareamiento.
levadura: (pZB004 y pZB004.1)
, se usó como cadena principal el vector pRS314 (ATCC, das a cabo en la cadena principal del vector y otros
oRI, EcoRV, SalI, Xhol, Apal, son algunas de las enzimas No. 31, pb 1893 a pb 1989, como se muestra en la Figura
inuyó de la región constante de la cadena ligera lambda
ión/insertos (Figura 5 A y SEQ ID No. 5) y lambda (Figura el péptido líder alfa, el péptido líder Aga2P, MCS I y II, AG, c-Myc para la cadena pesada), regiones constantes mo pesadas (dominio IgG1-CH1 humano). A El sitio de
sada se presentará en la levadura en una forma asociada adena ligera se expresa como un fragmento separado. eja con la cadena pesada y completa la configuración de das se mantuvieron como se ejemplifica por el terminador dena ligera. Para ayudar al proceso de tamizaje posterior TEV después de las etiquetas y antes de la secuencia de locada estratégicamente antes del inicio de la proteína roteína.
evadura se digirieron con EcoRV y Kpnl, respectivamente a de elución en gel, en donde el gel escindido se disuelve mpón QX1. Se añaden aproximadamente 30 pl de perlas imadamente 30 segundos seguido de incubación a tos. Se le dan series de lavados a las perlas, primero con aproximadamente 500 pl de tampón PE. El a Dn se eluye igeridos y eluidos, aproximadamente 3 pg de pRS314 e pnl y EcoRV durante la noche a aproximadamente 37 °C, ión del ligamiento.
6a
Figure imgf000027_0001
T 6b
Figure imgf000027_0002
T 7
Figure imgf000028_0003
La configuración del ligamiento se realizó individualmen transformación individualmente en células altamente co inocularon seguido de aislamiento de ADN plasmídico y enzima PvulI. Los clones confirmados producen bandas positivos se confirmaron adicionalmente mediante dige en combinaciones respectivas, en donde la primera prod produce fragmentos de ~5,5 Kb y ~1,8 Kb (Figura 5 C y se encontró que estaban libres de errores (Figura 5 E y que contiene la región constante de la cadena ligera ka con el número de acceso MTCC 25128 y denominado p
Además, el vector bidireccional bicistrónico de levadura prepara mediante el uso de dicho vector bidireccional bi Se prepara el mismo, en donde se digirieron 10 pg de lambda-levadura (SEQ ID No. 7) con SpeI-HF/SacII ( aproximadamente 4 °C durante la noche. Se transform TG1. Se inocularon colonias individuales y se tamizaron Ndel/Notl y Ncol/Ascl (Figura 6 B). Los clones positivos libres de errores (Figura 6 C). El vector bidireccional constante de la cadena ligera lambda se denomina pZB
T ra los vectores kappa en una relación de 1:5 seguido de tentes TG1. Las colonias individuales se recogieron, se onfiguró la digestión por restricción mediante el uso de la 4,3 Kb y fragmentos de ~ 2,9 Kb (Figura 5 B). Los clones es por restricción con enzimas EcoRV/Kpnl y Ndel/Kpnl tamaños de ~ 3,7 Kb y ~ 3,5 Kb mientras que la segunda Los clones confirmados se enviaron para secuenciación ID No.6). El vector bidireccional de levadura confirmado e ha enviado al MTCC en virtud del tratado de Budapest 4.
iene una región constante de la cadena ligera lambda se nico de levadura depositado que tiene el inserto kappa. tor kappa confirmado y depositado (pZB004) e inserto-8) seguido de elución en gel y ligamiento (Tabla 9) a 25 ng de mezcla de ligamiento en células competentes a determinar la liberación del inserto con enzimas PvulI, enviaron para secuenciación y se encontró que estaban trónico de levadura confirmado que contiene la región (SEQ ID No. 8).
8
Figure imgf000028_0001
T 9
Figure imgf000028_0002
(B) Generación de vectores unidireccionales bicistró transferencia no combinatoria
El vector unidireccional bicistrónico de levadura se dise expresar la cadena pesada y la cadena ligera en formato la transferencia no combinatoria de moléculas Fab de conservará una combinación específica de cadena pesa s de levadura (pZB004.2 y pZB004.3): concepto de
ra tener una opción de dos promotores separados para . Además, la configuración única de este vector permitirá tema de fago al sistema de levadura. Esto, a su vez, de cadena ligera para explorar en el sistema eucariótico.
Para generar el vector unidireccional bicistrónico de le bicistrónico de levadura depositado, en donde se diseña No. 9) y lambda (Figura 8 A y SEQ ID No. 11) que co péptido líder alfa, péptido líder Aga2P, MCS I y II, etiqu para la cadena pesada), regiones constantes respecti pesadas (dominio IgG1-CH1 humano). Se digirieron los v kappa y lambda junto con el inserto kappa y lambda aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 3 h (kappa y lambda, ~2,9 Kb) se eluyeron en gel y la reacc aproximadamente 4 °C seguido de transformación en choque térmico. Se inocularon colonias individuales y enzimas Spel-HF/Sacll ~2,9 Kb) y digestión interna con positivos se enviaron para secuenciación y se encontró unidireccionales de levadura confirmados que contiene denominan pZB004.2 (SEQ ID No. 10) y pZB004.3 (SE
Ta ura se usó como cadena principal el vector bidireccional y sintetizaron el inserto para kappa (Figura 7 A y SEQ ID ende dos promotores Gal1/10 (cadena ligera y pesada), (V5 e His-Tags para las cadenas ligeras y FLAG, C-Myc unidas tanto para las cadenas ligeras (CK o CL) como ores bidireccionales bicistrónicos de levadura confirmados tetizados con enzimas de restricción Spel-HF y SacII a (Tabla 10). Los vectores digeridos (~4,8 Kb) e insertos de ligamiento (Tabla 11) se configuró durante la noche a las de E. coli NEB 5-alfa competentes por el método de tamizaron para determinar la liberación del inserto con zima Hindlll-HF (~1,7 Kb) (Figura 7 B y 8 B). Los clones estaban libres de errores (Figura 7 C y 8 C). Los vectores giones constantes de cadena ligera kappa y lambda se No. 12), respectivamente.
10:
Figure imgf000029_0002
T 11:
Figure imgf000029_0001
(C) Generación del vector de ScFv de levadura: pZB00
Otro vector alternativo que se generó para los estudios d ScFv. El producto de este constructo son moléculas de en donde se eliminan las regiones constantes tanto para se basó en una cadena principal de constructo que se o Algunas de las modificaciones llevadas a cabo en la individuales son las siguientes:
1. Eagl, Votl, Spel, BamHI, Xmal, Smal, Pstl, EcoRI, Ec se eliminaron del vector pRS314 (SEQ ID No. 31, pb 19
El gen en la cadena principal del vector se reemplazó po 10 A y SEQ ID. No. 13) entre enzimas Apal y SacII. El i codifica la secuencia de la proteína Aga2P, la secuenci de escisión de TEV, MCS I (para la incorporación de la r región enlazadora (G4S), m Cs II (para la incorporación Notl), etiqueta C-Myc, etiqueta FLAG, terminador alfa.
Como se proporciona en las Tablas 12 y 13 más abajo, Apal a aproximadamente 25 °C durante la noche seguid durante aproximadamente 3 horas. El material digerido noche. Los 2 pl de la mezcla ligada se transformaron individuales y se tamizaron para determinar la digestión clones positivos se enviaron para secuenciación y se en esentación en levaduras era compatible con las moléculas uerpo en formato ScFv que es diferente del formato Fab, adena pesada como para las cadenas ligeras. Este vector nó a partir del vector pRS314 (ATCC, EE.UU.) (Figura 9). dena principal del vector y otros elementos/secuencias
, Sall, Xhol son algunas de las enzimas de restricción que pb 1984, y como se muestra en la Figura 9).
casete de expresión/inserto diseñado y sintetizado (Figura rto diseñado contiene el promotor Gall, el nucleótido que er de Aga2P, el sitio del factor Xa, la etiqueta HA, el sitio n variable de la cadena ligera, Ndel, Bglll, Hindlll y Ascl), a región variable de la cadena pesada, Ncol, Xbal, Nhel y
igirieron aproximadamente 10 pg de vector e inserto con e la adición de la enzima SacII a aproximadamente 37 °C luyó en gel y se ligó a aproximadamente 4 °C durante la células competentes NEB alfa. Se inocularon colonias rna con enzima EcoRV/Xhol (~2,9 Kb) (Figura 10 B). Los tró que estaban libres de errores (Figura 10 C). El vector de ScFv de levadura confirmado que contiene sitios d pZB004.4 (SEQ ID No. 14).
Ta incorporación de cadena pesada y ligera se denomina
12
Figure imgf000030_0001
Ta 13
Figure imgf000030_0002
(D) Construcción de vectores de tipo apareamiento de le
La tecnología de presentación en superficie de levadura 106~108) en comparación con ya sea las tecnologías de debido a sus limitaciones en las eficiencias de transforma en levadura podrían superar esta limitación. Sin emb mejorados requieren mucho tiempo y son laboriosos. Por una herramienta poderosa para generar una biblioteca d mediante la fusión celular entre dos células haploides de la a-aglutinina de las células MATa y la a-aglutinina de la distintos en cada célula haploide se combinan en una cél anticuerpo codificado de cada plásmido en las células comprenden dos cadenas; una cadena pesada (HC) con la cadena pesada) y una cadena ligera (LC) con VL y apareamiento de levadura es adecuado para la construc células haploides de tipos de apareamiento opuestos que LC secretada a HC anclada a la superficie de levadura residuos Cys C-terminales de CH1 y CL (dominio cons presentado en la superficie de la célula de levadura.
(D.1) Construcción del vector de expresión de la c Saccharomyces cerevisiae
El vector de expresión de la cadena pesada de tipo apar con etiquetas y el sitio de escisión de TEV en la superfici y el terminador CYC1. La secuencia señal de Aga2P secretora. La combinación de diversos sitios de restricció en fagos (VH) del fagémido al vector que expresa HC.
Nhel, Notl) se mantienen entre la secuencia señal Aga2 presencia de etiquetas myc y FLAG para detectar la cad escindir el fragmento Fab de la superficie de la célula grabado del tabaco (TEV) y enteroquinasa (EK) de cisteí de expresión de HC.
Para la construcción del vector HC de cadena pesada de de ADN de HC (SEQ ID No. 15). p414 GAL1, un vector de (núm. cat. ATCC® 87328™) se modificó para acomo proporcionan en la Figura 11 y se resumen más abajo: dura (Vectores YMT):
e limitaciones en el tamaño de la biblioteca (típicamente sentación en fago (109 a 1011) o ribosomas (1011 a 1012) n en levadura. Los métodos mejorados de transformación o, diversos protocolos de transformación en levadura tanto, el apareamiento de levaduras puede usarse como nticuerpos grande. El apareamiento de levadura se logra s de apareamiento opuestos mediante la interacción con élulas MATa. Después del apareamiento, dos plásmidos diploide, que expresan simultáneamente el fragmento de ploides posteriores. Los fragmentos de anticuerpo Fab y CH1 (el primer dominio de las regiones constantes de (dominio constante de la cadena ligera). Por lo tanto, el n de una biblioteca de Fab combinatoria a partir de dos ntienen bibliotecas de HC y LC. La heterodimerización de diante la formación de un enlace disulfuro entre los dos te de la cadena ligera) facilita la construcción del Fab
na pesada (HC) de tipo apareamiento (pZB002) en
miento se diseña para expresar la cadena HC (VH+CH1) e la célula de levadura bajo el control del promotor GAL1 sente en este vector facilita la cadena de HC a la ruta s importante para transferir las moléculas seleccionadas a lograr esto, los sitios de restricción únicos (NcoI, Bmtl, y el marco de lectura abierto de CH1. Se proporciona la a de HC durante el tamizaje por citometría de flujo. Para levadura, se incorporan sitios de proteasa del virus del proteasa altamente específicos de secuencia en el vector
o apareamiento (pZB002), se usó p414GAL1 y el casete nzadera basado en CEN con el marcador TRP1 de ATCC el casete de ADN de HC. Dichas modificaciones se 1) Se modificaron los sitios de restricción BamHI, Smal modificar los sitios de restricción mencionados anteriorm p414 GAL1 (SEQ ID No. 32 y Figura 11).
El casete de ADN de HC (SEQ ID No. 15) se compone única, sitios de clonación múltiples (Neol, Bmtl, Nhel, Notl) de cisteína intacto en la última posición seguida de etiquet con el marco de lectura abierto de AGA2P c-terminal. El casete de ADN de HC (Figura 12 A) y p414 GAL1 se digier para crear pZB002 (Figura 12 B). El vector que expresa de acceso MTCC 25126. El casete de ADN de h C está b sitios únicos NcoI, BmtI, NheI y NotI se mantuvieron des VH recibida de la biblioteca seleccionada de fagos en pZ
Ta tI, EcoRI, BspDI, SalI, SalI, Clal, HincII y Xmal. Para , se eliminan los nucleótidos de pb 2208 a pb 2158 de
una región codificante de secuencia simple de AGA2P gión constante de la cadena pesada 1 (CH1) con residuo C-myc y FLAG), sitio de escisión de TEV que se fusiona ete de ADN de HC se sintetiza mediante Gene Art. El on Spel y Xhol a 37 °C y se ligan (a 4 °C) posteriormente e pZB002 sintetizado se deposita en MTCc con el núm. el control del promotor GAL1 y el terminadorCYC1. Los de la secuencia señal de AGA2P para clonar la región .
4
Figure imgf000031_0002
Ta 5
Figure imgf000031_0003
Más abajo se muestra la tabla que permite comprender la Ta racterísticas de pZB002 (Figura 12 C y SEQ ID No. 16).
6
Figure imgf000031_0001
(D.2) Construcción del vector de expresión de la ca Saccharomyces cerevisiae:
El vector de expresión de la cadena ligera de tipo apar (VL+LCA) con etiquetas de la superficie de la célula de l CYC1. La secuencia única del factor alfa de apareamient la ruta secretora. La combinación de diversos sitios
seleccionadas en fagos (VL) del fagémido al vector que ex única (Ndel, BglII, HindIII y AscI) entre el factor alfa de a presencia de etiquetas V5 e His proporciona detectar la c
p416 GAL1 es un vector de lanzadera basado en CEN co Que se usó para generar varios constructos de caden principal del vector p416 GAL1 se modificó como se prop
1) Se modificaron los sitios de restricción BamHI, Smal, X los sitios de restricción mencionados anteriormente, se GAL1.
Para la construcción del plásmido de secreción basado LCA modificado (SEQ ID No. 19). El casete LCA se co clonación múltiple únicos (NdeI, BglII, HindIII y AscI) y r cisteína intactos en la última posición seguida de etique sintetiza mediante Gene Art. P416 GAL1 y LCA modifica posteriormente para crear pZB003.1 (Tablas 18 y 19; Fig promotor GAL1 y el terminador CYC1 en el vector pZ mantuvieron después de la secuencia señal SS01 para c el vector pZB003.1 (Figura 14 C). El vector pZB003.1 gen
Ta a ligera de tipo apareamiento (LCA) (pZB003.1) en
iento se diseña para expresar y secretar la cadena LC dura bajo el control del promotor GAL1 y el terminador gión pre) presente en este vector facilita la cadena LC a estricción es importante para transferir las moléculas a HC. Para lograr esto, se mantienen sitios de restricción amiento simple y el marco de lectura abierto de LCA. La na LCA durante el tamizaje por citometría de flujo.
arcador URA3 de ATCC (ATCC® 87332™) (Figura 13). igeras con diferentes secuencias señal. Dicha cadena na en la Figura 13 y se resume más abajo:
TspMI, EcoRI, HindlII, BspDI, Clal y SalI. Para modificar inaron los nucleótidos de pb 2318 a pb 2268 de p416
S01 de LCA, se usó el casete de ADN de p416 GAL1 y ne de secuencia única de factor alfa (SS01), sitios de n constante de la cadena ligera (LCA) con residuos de (V5 e His). El casete de ADN de LCA (Figura 14 A) se se digieren con SpeI y XhoI a 37 °C y se ligaron a 4 °C 4 B). El casete de ADN de LCA estará bajo el control del .1. Los sitios únicos de NdeI, BglII, HindIII y AscI se r la región VL de la biblioteca seleccionada de fagos en do se proporciona como la SEQ ID No. 20.
7
Figure imgf000032_0002
Tabla 18
Más abajo se muestra la Tabla 19 que permite comprend Ta s características de pZB003.1.
9
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
(D.3) Construcción del vector de expresión de cadena l secuencia señal SS01 en Saccharomyces cerevisiae:
El vector de expresión de la cadena ligera de tipo apar (VL+LCk) con etiquetas en la superficie de la célula de l CYC1. La secuencia única del factor de apareamiento alf la ruta secretora. La combinación de diversos sitios
seleccionadas en fagos (VL) del fagémido al vector que ex únicos (NdeI, BglII, HindIII y AscI) entre el factor de apare presencia de etiquetas V5 e His detecta la cadena lCk d
Para la construcción del plásmido de secreción basado e SS01-LCk modificado (s Eq ID No. 21). p416 GAL1 es un de ATCC (ATCC® 87332™). El casete LCk se compon (SS01), sitios de clonación múltiple únicos (NdeI, BglII, Hi residuos de cisteína intactos en la última posición segui sintetiza mediante Gene Art. p416 GAL1 y LCk se digier aproximadamente 4 °C posteriormente para crear el vect de LCk estará bajo el control del promotor GAL1 y el ter HindIII y AscI se mantuvieron después de la secuenc seleccionada de fagos en el vector pZB003.2 (Figura 15 SEQ ID No. 22.
Ta ra de tipo apareamiento (LCk) (pZB003.2) que tiene la
iento se diseña para expresar y secretar la cadena LC adura bajo el control del promotor GAL1 y el terminador egión pre) presente en este vector facilita la cadena LC a restricción es importante para transferir las moléculas sa HC. Para lograr esto, se mantienen sitios de restricción iento alfa simple y el marco de lectura abierto de LCk. La nte el tamizaje por citometría de flujo.
S01 de LCk, se usó un casete de ADN de p416 GAL1 y ctor de lanzadera basado en CEN con el marcador URA3 e una secuencia única del factor alfa de apareamiento III y AscI), región constante de la cadena ligera (LCk) con de etiquetas (V5 e His). El casete LCk (Figura 15 A) se con SpeI y XhoI a aproximadamente 37 °C y se ligaron a ZB003.2 (Tablas 21 y 22; Figura 15 B). El casete de ADN ador CYC1 en pZB003.2. Los sitios únicos de NdeI, BglII, señal SS01 para clonar la región VL de la biblioteca . El vector pZB003.2 sintetizado se proporciona como la
20
Figure imgf000033_0002
Ta 21
Figure imgf000033_0003
Más abajo se m uestra la tabla que perm ite com prender la aracterísticas de pZB003.2.
T 2
Figure imgf000034_0001
(D.4) Construcción de vectores que expresan la cadena lig con la secuencia señal SS02 (pZB003):
Para facilitar una mejor secreción de la cadena LC, la se señal del factor de apareamiento alfa 1 (región pre). S apareamiento modificada genéticamente que incluye la re que appS4 tiene 16 veces mejor capacidad de secreción que incluye las regiones pre y pro.
Para la construcción del plásmido de secreción basado LCk (Figura 16 A) (SEQ ID No. 17). El casete de ADN d del factor alfa modificada genéticamente (appS4). El c pZB003.2 y SS02-LCk se digieren a aproximadamente 3 posteriormente para crear pZB003 (Tablas 24 y 25; Fig proporciona como la SEQ iD No. 18 y se deposita en MT
Ta LCk de tipo apareamiento en Saccharomyces cerevisiae
cia señal SS02 se introduce en el lugar de la secuencia es una secuencia señal del factor alfa 1 del factor de pre y pro denominada appS4. Previamente se demostró la secuencia señal del factor de apareamiento alfa 1, lo
S02 de LCk, se usaron pZB003.2 y el casete de SS02-02 contiene la región codificante de la secuencia única te de ADN de SS02 se sintetiza mediante Gene Art. con Spel y HindIII y se ligaron a aproximadamente 4 °C 16 B). El vector pZB003 sintetizado (Figura 16 C) se on el núm. de acceso MTCC 25127.
3
Figure imgf000034_0002
Ta 4
Figure imgf000034_0003
Más abajo se m uestra la tabla que perm ite com prender la racterísticas de pZB003.
T 25
Figure imgf000035_0001
(D.5) Construcción de vectores que expresan LCk d cerevisiae con secuencia señal SS03 (pZB003.3):
Para facilitar una mejor secreción de la cadena LC, la s señal del factor de apareamiento alfa 1 (región Pre). S apareamiento modificada genéticamente que incluye la de secreción 16 veces mejor que la secuencia señal del y pro.
Para la construcción del plásmido de secreción basado (SEQ ID No. 23). El casete de ADN de SS03 contiene l modificada genéticamene. pZB003.2 y ADN de SS03-L se ligaron a aproximadamente 4 °C posteriormente par pZB003.3 sintetizado (Figura 17 C) se proporciona com
T adena ligera de tipo apareamiento en Saccharomyces
ncia señal SS03 se introduce en el lugar de la secuencia es una secuencia de señal del factor alfa 1 del factor de n pre y pro denominada app8. app8 tiene una capacidad or de apareamiento alfa 1, lo que incluye las regiones pre
SS03 de LCk, se usaron pZB003.2 y ADN de SS03-LCk gión codificante de secuencia única (app8) del factor alfa e digieren con Spel y HindIII a aproximadamente 37 °C y ar pZB003.3 (Tablas 27 y 28; Figura 17 A y B). El vector Se Q ID No. 24.
26
Figure imgf000035_0002
T 27
Figure imgf000035_0003
Más abajo se m uestra la tabla que perm ite com prender aracterísticas de pZB003.3.
T 28
Figure imgf000036_0001
(D.6) Construcción de vectores que expresan LCk d cerevisiae con secuencia señal SS04 (pZB003.4):
Para facilitar una mejor secreción de la cadena LC, la s señal del factor de apareamiento alfa 1 (región pre). SS secreción para diversas proteínas en levadura.
Para la construcción del plásmido de secreción basado de SS04 (SEQ ID No. 25). El casete de ADN de SS04 pZB003.2 y ADN-LCk de SS04 se digieren con S aproximadamente 4 °C posteriormente para crear pZB sintetizado (Figura 18 C) se proporciona como la s Eq I
T adena ligera de tipo apareamiento en Saccharomyces
ncia señal SS04 se introduce en el lugar de la secuencia s una secuencia señal de Suc2p que tiene capacidad de
SS04 de LCk, se usaron pZB003.2 y el casete ADN-LCk tiene la región codificante de la secuencia señal Suc2p. y HindIII a aproximadamente 37 °C y se ligaron a 4 (Tablas 30 y 31; Figura 18 A y B). El vector pZB003.4 . 26.
29
Figure imgf000036_0002
T 30
Figure imgf000036_0003
Más abajo se muestra la tabla que permite comprender aracterísticas de pZB003.4.
TA 1
Figure imgf000037_0001
EJEMPLO 3
Generación de la biblioteca de anticuerpos y tran apareamiento de levadura
Se digieren 5 pg de la cadena ligera kappa y lambda a p repertorio sin exposición previa a partir de un donante hu y pZB001.1 lambda, respectivamente) con HindIII-HF y As total de aproximadamente 100 pl. Las muestras digeridas 4 °C durante la noche. Los 25-50 ng de mezcla de liga TG1 mediante electroporación, en donde se usa una cub 600 ohmios y 10 pF. Después de la recuperación en el m de células transformadas en placas de 144 mm y se inc hay aproximadamente 6-8 placas de las que se raspan aproximadamente un 20 % de glicerol. La eficiencia de tra que está en el intervalo de aproximadamente 108 a aprox
El número total de células se determina por vial de rese que es 1012. Se inoculan las colonias en aproximadame aislados se comprueban para el análisis de digestión por presencia de la cadena ligera, tanto kappa como lambda
Se inocula un vial de agrupamiento de cadenas ligeras ( LB-Amp y se cultivan durante aproximadamente 2-3 hor del aislamiento del plásmido con el kit de preparación mi midi prep para ambas cadenas ligeras se confirma con u la incorporación de la cadena pesada en él. Algunos de plásmidos y se confirman por digestión por restricción qu Se realiza una Midi prep separada para aislar el ADN de del agrupamiento. El ADN de Midi prep se confirma nue para la inserción posterior del agrupamiento de cadenas
Aproximadamente 5 pg del ADN de la biblioteca de cad PCR secundario de cadena pesada se digieren con Nco volumen total de aproximadamente 100 pl. Las muest aproximadamente 4 °C durante la noche. Los 25-50 ng TG1 mediante electroporación, en donde se usa una cub 600 ohmios y 10 pF. Después de la recuperación en el m de células transformadas en placas de 144 mm y se inc hay aproximadamente 6-8 placas de las que se raspan rencia de la biblioteca de fagémido a vectores de
del agolpamiento por PCR secundario que representa el no sano junto con los vectores fagémidos (pZB001 kappa aproximadamente 37 °C durante la noche en un volumen eluyen en gel seguido del ligamiento a aproximadamente to se transforman en aproximadamente 25 pl de células de 1,0 mm con una configuración óptima de 1800 voltios, io de recuperación, se esparcen aproximadamente 200 pl an durante la noche a aproximadamente 37 °C. En total, s colonias al día siguiente y se preparan reservas con formación se calcula por dilución en placas y se encuentra adamente 1010, preferentemente, a ~108.
s en glicerol mediante dilución en placas y se encuentra 5 ml de LB-Amp y se aísla el plásmido. Los plásmidos stricción. La liberación del inserto de ~300 pb confirmó la el agrupamiento.
to kappa como lambda) en aproximadamente 100 ml de aproximadamente 37 °C en agitador-incubador seguido rep de Qiagen según el protocolo del fabricante. El ADN nálisis de digestión por restricción antes de proceder con s clones representativos se usan para el aislamiento de dicó la presencia de ~100 % de inserto de cadena ligera. biblioteca de cadenas ligeras, tanto kappa como lambda ente mediante digestión por restricción antes de usarlo adas.
as ligeras kappa y lambda junto con el agrupamiento de Xbal a aproximadamente 37 °C durante la noche en un digeridas se eluyen en gel seguido del ligamiento a mezcla de ligamiento se transforman en 25 pl de células de 1,0 mm con una configuración óptima de 1800 voltios, io de recuperación, se esparcen aproximadamente 200 pl an durante la noche a aproximadamente 37 °C. En total, s colonias al día siguiente y se preparan reservas con aproximadamente un 20 % de glicerol y se almacenan e calcula por dilución en placas y se encuentra que está 1010, preferentemente, a ~108.
El número total de células se determina por vial de rese que es 1012. Las colonias se inoculan en 5 ml de LB-Amp para análisis de digestión por restricción con NcoI y Xb ligeras Kappa y Lambda. La liberación del inserto de agrupamiento kappa (Figura 19 A y B) y en el agrupamie
La cadena pesada junto con el agrupamiento de PCR s biblioteca de ADN se digieren individualmente con NcoI y en células de E. coli altamente competentes TG1.
Aproximadamente 1 ml de reserva en glicerol bacteriana de medio LB-AMP a aproximadamente 37 °C hasta qu auxiliar M13KO7 a una multiplicidad de infección (MOI) durante otros 30 minutos. Después de la infección, l resuspende en aproximadamente 200 ml de LB con crecimiento a aproximadamente 30 °C durante la noche 8000 rpm durante aproximadamente 15 minutos a apr sobrenadante separado se mezcla con una solución de incuba en hielo durante aproximadamente 1 hora. La m minutos y el sedimento de fagos se resuspende en a concentración final del 50 % a toda la suspensión de fag °C como reserva de biblioteca de fagos.
Las reservas en glicerol de las bibliotecas bacterianas generación de bibliotecas de fagos. Con la adición de diversidad se precipitan y purifican, y se almacenan com de bibliotecas de fagos que se deriva del ensayo de for 1010 a aproximadamente 1011, preferentemente, -1011 biblioteca de fagémidos que presenta el fragmento Fab experimentos de selección para eliminar los no ligantes de formación de placa para estimar el número de ligante cuatro décadas menor que el número de fagos inicial, lo
El plan de toda la estrategia es transferir los ligantes es para realizar el tamizaje y la clasificación en el sistema de el uso de un método compatible, es decir, FACS para se amplificó el fago seleccionado y se aisló el ADNmc seg de tipo apareamiento de levadura; para la incorporación desarrolla al aprovechar el sistema de apareamiento, e cadenas pesadas se clonan en diferentes vectores de e de cadenas ligeras kappa y lambda de moléculas selecc (pZB003.1 y pZB003.2) diseñado y generado exclusiva seguido de ligamiento y transformación individualment agrupamiento de cadenas HC y el vector respectivo ( transformación en células altamente competentes TG1. seleccionada de cadena pesada y ligera es >107 ufc. La de cadenas pesadas como ligeras se comprueban para l la cadena ligera (Figura 21 A) y NcoI/NotI para la cadena de la reserva en glicerol. La liberación del inserto par seleccionadas. Las reservas en glicerol se almacenan a
Tras la validación, aproximadamente 1 pg de cada ADN 2 x 107 células/ml por método de electroporación. Con r como huésped para la presentación en la superficie celul se usa para expresar la biblioteca de cadenas ligeras aproximadamente 30 °C durante 2-4 días para permitir como la cadena ligera de la biblioteca seleccionada se tr YVH10) con una eficiencia de >106.
Para mostrar el formato Fab de la biblioteca en la superf que representan las bibliotecas de cadena pesada y de c haploides. La eficiencia de apareamiento se calcula co congelador a -80 °C. La eficiencia de transformación se l intervalo de aproximadamente 108 a aproximadamente
en glicerol mediante dilución en placas y se encuentra aísla el plásmido. Los plásmidos aislados se comprueban ara la cadena pesada y HindIII y AscI para las cadenas pb confirmó la presencia de la cadena pesada, en el lambda (Figura 20 A y B).
dario de cadena ligera kappa y lambda que contiene la l seguido de ligamiento y transformación individualmente
kappa y lambda se cultivan en aproximadamente 200 ml DO a 600 nm alcanza 0,8. Después, se añade el fago 0 a las bacterias y se incuba a aproximadamente 37 °C acterias infectadas se centrifugan y el sedimento se icilina 100 pg/ml y kanamicina 25 pg/ml seguido de 0 rpm. La suspensión se centrifuga a aproximadamente adamente 4 °C seguido de descarte del sedimento. El /NaCl en % de volumen de sobrenadante y la mezcla se se centrifuga a 10000 g durante aproximadamente 15 imadamente 20 ml de PBS. Se añade glicerol a una se congela en alícuotas de aproximadamente 1 ml a -80
a y lambda se mezclan, se inoculan y se usan para la os auxiliares, las partículas de fagos que presentan la ervas en glicerol para su uso futuro. El número estimado ón de placas, se encuentra que es de aproximadamente ml. La formación de placa indica la funcionalidad de la se tamizará contra el antígeno Her2. Se llevaron a cabo grupamiento sin exposición previa seguido de un ensayo encontró que la estimación de ligantes era ~107 que es indica una selección exitosa.
ficos de los vectores de expresión de fagos a levaduras dura. Se emplea un método basado en afinidad mediante ionar y clasificar posteriormente los mejores ligantes. Se de amplificación por PCR para incorporarlo en vectores adenas pesadas y cadenas ligeras. La biblioteca Fab se nde la biblioteca de cadenas ligeras y la biblioteca de sión de levadura. Sin embargo, el agrupamiento de PCR das junto con el vector de expresión de levadura interno te para cadenas ligeras se digieren con HindIII y AscI n células altamente competentes TG1. Igualmente, el 02) se digieren con NcoI y NotI seguido de ligación y eficiencia de transformación obtenida para la biblioteca onias transformadas obtenidas para tanto las bibliotecas eración de insertos mediante el uso de HindIII/AscI para ada (Figura 21 B) antes de rasparlos para la preparación bas cadenas confirmó la presencia de las moléculas °C para su uso futuro.
ma y se transforma en células de levadura en ~5 x 106­ cto a las cepas para la transformación, EBY100 se usa la biblioteca de cadenas pesadas, mientras que YVH10 espués de la transformación, las placas se incuban a recimiento de transformantes. Tanto la cadena pesada orman con éxito en cepas de levadura (EBY100-ura3A y
el apareamiento de las dos células haploides cultivadas a ligera se realiza al mezclar números iguales de células l número de colonias diploides en las placas selectivas dobles dividido por el número de colonias totales en la apareamiento calculado es ~40 %. Además, las células antes de cualquier análisis de crecimiento y expresión.
Saccharomyces cerevisiae la biblioteca 2N que tiene plá y el agolpamiento de cadenas ligeras kappa se inocula durante la noche a aproximadamente 30 °C (16-20 hora mide y se inocula en consecuencia en aproximadamente no inducido) y aproximadamente 10 ml de medio 2XSGC vuelve de 0,2 a 0,3. Las células inducidas y no inducidas de 24 a 48 horas a aproximadamente 20 °C.
La expresión de la cadena ligera y la cadena pesada s cadena ligera se prueba mediante anticuerpo anti-His y cadena pesada que se prueba con el anticuerpo anti-ccon Her2 biotinilado a un porcentaje de 7,2 (Figura 22 B) del mismo con el antígeno objetivo. Este resultado indic dual expresan la cadena ligera asociada con la cadena p de levadura seguida de la expresión de Fab y su unión vectores de fagémidos y levaduras de la presente descri
De manera similar, el enfoque anterior también puede variables (cadenas ligeras kappa y lambda) y de cadena
EJEMPLO 4
Generación de biblioteca de anticuerpos y tamizaje
Se evaluó otro constructo de expresión de levadura, (pZB004.4) para determinar la expresión de la secuencia genes anti-Her2, Vh y Vl se clonaron en el vector pZ NdeI/AscI y NcoI/Notl. Los clones se transformaron en expresión y unión como se describió anteriormente. El inducidas reveló interacción con el antígeno Her2. La cito que se detecta con el conjugado de estreptavidina Alexa fluor 488, conjugado) para detectar la expresión de la eti señal de fluorescencia doble positiva distinta que indica de la célula de levadura (Figura 23).
En conjunto, la presente descripción se refiere al uso de l en tecnologías de presentación de proteínas para expre exposición previa y/o sintética. En primer lugar, la tecno genes de anticuerpos potenciales con afinidad alta a m genes se transfieren a plásmidos de presentación en lev primarias. La combinación de estas dos tecnologías com anticuerpos muy diversas y el desarrollo de nuevas molé La transferencia suave de la población clonal desde el fa de restricción usadas en MCS I y MCS II son idénticas c de restricción cuidadosamente elegidas permiten transfe MCS I de fagémido a MCS I de cualquier vector de levad II de cualesquiera vectores de levadura.
Además, el repertorio de cadenas ligeras y pesadas v también puede clonarse directamente en los vectores d obtenerse los resultados deseados.
Además de la transferencia intersistemas, la transfer presentación de Fab a ScFv o viceversa, o el mismo transferencia de vectores de tipo apareamiento a un vec de MCS respectivo. La transición libre entre todos lo aleatorización de cadenas pesadas y ligeras que p presentación, mientras que la disponibilidad de un siste los sistemas es definitivamente un beneficio.
En consecuencia, los presentes vectores proporcionan proteínas, lo que incluye, pero no se limita a:
cas selectivas individuales, en donde el porcentaje de ides se enriquecen en medio doble deficiente (ura-, Trp-)
os que expresan el agolpamiento de cadenas pesadas 10 ml de medio doble deficiente SDCAA y se cultivan a DO a 600 nm del cultivo crecido durante la noche se ml de medio de glucosa doble deficiente SDCAA (cultivo (cultivo inducido) de manera que la DO final a 600 nm se ultivan durante diferentes puntos temporales que varían
serva en porcentajes significativos. La expresión de la encuentra que es >7 % (Figura 22 A), mientras que la e encuentra que aparece en el cuadrante doble positivo e resultado indica la formación de Fab y la unión exitosa e los diploides seleccionados con marcador auxotrófico a. La transferencia exitosa de clones del fago al sistema tígeno Her2 valida la funcionalidad y la eficiencia de los .
learse mediante el uso de regiones de cadenas ligeras da obtenidas a partir de anticuerpos sintéticos/repertorio.
ante el uso de un vector de scFv de levadura
ecir, el constructo de expresión de ScFv de levadura gen ScFv anti-Her2 y la unión con el antígeno Her2. Los .4 en MCS I y II, respectivamente, entre las enzimas adura EBY100 seguido de inducción para estudios de lisis por citometría de flujo de las células de levadura ría de flujo se llevó a cabo con antígeno Her2 biotinilado, . Adicionalmente, se usó el anticuerpo anti c-myc (Alexa a c-myc del extremo C-terminal. El resultado reveló una presión de moléculas de ScFv anti Her2 en la superficie
esentes fagémidos y plásmidos de expresión en levadura os genes de proteínas/anticuerpos de una biblioteca sin de presentación en fagos se usa para clonar y tamizar da hacia un antígeno específico. A continuación, estos para un tamizaje adicional e identificación de moléculas entarias da como resultado el tamizaje de bibliotecas de s de anticuerpos primarios contra antígenos específicos. los vectores de levadura es eficiente, ya que las enzimas specto a los dos sistemas de expresión. Estas enzimas población seleccionada de cadenas ligeras variables de mientras que las cadenas pesadas se reubican en MCS
les de anticuerpos sin exposición previa y/o sintéticos émido y levadura de la presente descripción y pueden
intrasistema, es decir, la alteración del formato de ato pero un vector de expresión diferente, tal como la icistrónico, es posible mediante el conjunto de enzimas stemas y formatos posibles también proporciona una e compensar las diferencias entre dos sistemas de n donde se conserva una combinación específica entre
erosas ventajas en la tecnología de presentación de

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una constructo de vector diseñado para recibir un anticuerpo o un fragmento de este a partir de un fagémido que comprende al menos una región de clonación o a partir de un vector de levadura que comprende al menos una región de clonación, o, para transferir un anticuerpo o un fragmento de este a un vector de levadura que comprende al menos una región de clonación, donde dicho constructo de vector contiene un casete de expresión que comprende:
al menos una secuencia líder;
al menos una región de clonación para recibir un gen que codifica un péptido o proteína que se une selectivamente a un ligando biológicamente activo;
al menos una secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina, o fragmentos de estas, o una combinación de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de esta y la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de esta, en donde dicha región constante comprende al menos una mutación con respecto a la región constante de una inmunoglobulina nativa o fragmentos de esta; y
al menos una secuencia de etiqueta recombinante o secuencia de ácido nucleico codificante de selección; en donde la al menos una región de clonación del casete de expresión comprende un sitio de clonación múltiple 1 (MCS I) y un sitio de clonación múltiple 2 (MCS II), un sitio de clonación múltiple 1 (MCS I) solo o un sitio de clonación múltiple 2 (MCS II) solo, y en donde MCS I comprende una combinación de los sitios de restricción Ndel y BglII y HindlII y AscI, y el m Cs II comprende una combinación de los sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y Notl.
2. El constructo de vector como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la al menos una región de clonación del casete de expresión, el fagémido y el vector de levadura comprende el sitio de clonación múltiple 1 (MCS I) y el sitio de clonación múltiple 2 (MCS II), el sitio de clonación múltiple 1 (MCS I) solo, o el sitio de clonación múltiple 2 (MCS II) solo, y en donde el m Cs I comprende una combinación de los sitios de restricción Ndel y BglII y HindlII y AscI, y el MCS II comprende una combinación de los sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y NotI.
3. El constructo de vector como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el casete de expresión comprende:
al menos una secuencia de terminación que carece o comprende aguas arriba un sitio de escisión enzimática fusionado con una secuencia de nucleótidos que codifica un producto que permite la presentación de un péptido o proteína en la superficie de un sistema de expresión de proteínas;
o,
una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cubierta del fago que comprende aguas arriba al menos un sitio de unión al ribosoma.
4. El constructo de vector como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el casete de expresión contiene una o más secuencias promotoras, contiene o carece de secuencia operadora; el constructo de vector es capaz de expresar el anticuerpo o un fragmento de este en una célula bacteriana o una célula de levadura; la secuencia promotora se selecciona de un grupo que comprende Gal 1, Gal 1/10 y una combinación de estas; la secuencia líder se selecciona de un grupo que comprende la secuencia pelB, la secuencia líder alfa, la secuencia líder Aga2P, la secuencia señal secretora del factor de apareamiento alfa 1 (SS01), la secuencia señal del factor alfa modificado (aapS4) (SS02), la señal del factor alfa modificado (aap8) secuencia (SS03), factor alfa modificado (aap8), secuencia señal (SS04) y combinaciones de estos; la secuencia de etiqueta recombinante o la secuencia de ácido nucleico codificante de selección se selecciona de un grupo que comprende FLAG, c-Myc, V5, His y sus combinaciones; la secuencia de terminación se selecciona de un grupo que comprende terminador alfa, terminador CYC1 y sus combinaciones; el sitio de escisión de la enzima es el sitio de escisión de la proteasa TEV; la secuencia de nucleótidos que codifica un producto que permite la presentación de un péptido o proteína en la superficie de un sistema de expresión de proteínas es la proteína Aga2P; y la proteína de la cubierta del fago se selecciona de un grupo que comprende la proteína pIII, G8P y una combinación de estas.
5. El constructo de vector como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina que tiene al menos una mutación se selecciona de un grupo que comprende el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de esta, la región constante kappa (Ck) de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta y la región constante lambda (CL) de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta; y en donde el gen de la región de clonación se selecciona de un grupo que comprende la región variable kappa (Vk) de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta, la región variable lambda (VL) de la cadena esta.
6. El constructo de vector como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde el constructo de vector se selecciona de un grupo que comprende un vector bidireccional bicistrónico de levadura, un vector unidireccional bicistrónico de levadura, un vector de expresión de cadena pesada de tipo apareamiento de levadura, vector de expresión de cadena ligera de tipo apareamiento de levadura y fagémido; y en donde el casete de expresión se selecciona de un grupo que comprende:
(a) secuencialmente,
una secuencia promotora;
una secuencia líder;
una región de clonación capaz de recibir un gen que codifica una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprende los sitios de restricción NcoI y Xbal y Nhel y Notl; una secuencia de nucleótidos que codifica el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada de inmunoglobulina IgG1, en donde dicho dominio constante comprende al menos una mutación con respecto al dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias de ácido nucleico codificantes de selección; y una secuencia de terminación que comprende aguas arriba un sitio de escisión de proteasa fusionado con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Aga2P a través de una secuencia enlazadora,
(b) secuencialmente,
una secuencia promotora;
una secuencia líder;
una región de clonación capaz de recibir un gen que codifica una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprende los sitios de restricción Ndel y Bglll y Hindlll y Ascl; una secuencia de nucleótidos que codifica la región constante kappa (Ck) de la cadena ligera de inmunoglobulina o la región constante lambda (CL) de la cadena ligera de inmunoglobulina, o fragmentos de estas, en donde dicha región constante comprende al menos una mutación con respecto a la región constante de la cadena ligera de una inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias de ácido nucleico codificantes de selección; y una secuencia de terminación,
(c) secuencialmente,
una primera secuencia de terminación;
un primer conjunto de secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias de ácido nucleico codificantes de selección;
una primera secuencia de nucleótidos que codifica la región constante kappa (Ck) de la cadena ligera de inmunoglobulina o la región constante lambda (CL) de la cadena ligera de inmunoglobulina, o fragmentos de estas, en donde dicha región constante comprende al menos una mutación con respecto a la región constante de la cadena ligera de una inmunoglobulina nativa o un fragmento de esta;
una primera región de clonación capaz de recibir un gen que codifica una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprende los sitios de restricción Ndel y Bglll y Hindlll y Ascl;
una primera secuencia líder,
una secuencia promotora;
una segunda secuencia líder;
una segunda región de clonación capaz de recibir un gen que codifica una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprende los sitios de restricción Ncol y Xbal y Nhel y Notl; una segunda secuencia de nucleótidos que codifica el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada de inmunoglobulina IgG1, en donde dicha región constante comprende al menos una mutación con respecto a la región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
un segundo conjunto de secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias de ácido nucleico codificantes de selección; y
una segunda secuencia de terminación que comprende aguas arriba un sitio de escisión de proteasa fusionado con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Aga2P a través de una secuencia enlazadora, (d) secuencialmente,
una primera secuencia promotora;
una primera secuencia líder,
una primera región de clonación capaz de recibir un gen que codifica una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprende los sitios de restricción Ndel y Bglll y Hindlll y Ascl;
una primera secuencia de nucleótidos que codifica la región constante kappa (Ck) de la cadena ligera de inmunoglobulina o la región constante lambda (CL) de la cadena ligera de inmunoglobulina, o fragmentos de estas, en donde dicho dominio constante comprende al menos una mutación con respecto al dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
un primer conjunto de secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias de ácido nucleico codificantes de selección; una primera secuencia de terminación;
una segunda secuencia promotora;
una segunda secuencia líder;
una segunda región de clonación capaz de recibir un gen que codifica una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprende los sitios de restricción Ncol y Xbal y Nhel y Notl; una segunda secuencia de nucleótidos que codifica el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada de inmunoglobulina IgG1, en donde dicho dominio constante comprende al menos una mutación con respecto al dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
un segundo conjunto de secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias de ácido nucleico codificantes de selección; y
una segunda secuencia de terminación que comprende aguas arriba un sitio de escisión de proteasa fusionado con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Aga2P a través de una secuencia enlazadora, y
(e) secuencialmente,
una secuencia promotora;
una secuencia operadora;
un primer sitio de unión al ribosoma;
una primera secuencia líder;
una primera región de clonación capaz de recibir un gen que codifica una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprende los sitios de restricción Ndel y BglII y HindIII y AscI;
una primera secuencia de nucleótidos que codifica la región constante kappa (Ck) de la cadena ligera de inmunoglobulina o la región constante lambda (CL) de la cadena ligera de inmunoglobulina, o fragmentos de estas, en donde dicho dominio constante comprende al menos una mutación con respecto al dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
un segundo sitio de unión al ribosoma;
una segunda secuencia líder;
una segunda región de clonación capaz de recibir un gen que codifica una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de esta y que comprende los sitios de restricción Ncol y Xbal y Nhel y NotI; una segunda secuencia de nucleótidos que codifica el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada de inmunoglobulina IgG1, en donde dicho dominio constante comprende al menos una mutación con respecto al dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina nativa o fragmento de esta;
una(s) secuencia(s) de etiqueta recombinante(s) o secuencia(s) de ácido nucleico codificante(s) de selección; y
una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cubierta del fago.
7. Un constructo de vector diseñado para clonar un anticuerpo o un fragmento de este, o, para transferir o recibir un anticuerpo o un fragmento de este a partir del constructo de vector como se reivindicó en la reivindicación 1, donde dicho constructo de vector contiene un casete de expresión que comprende:
una secuencia promotora;
una secuencia líder;
una secuencia de nucleótidos que codifica un producto que permite la presentación de un péptido o proteína en la superficie de un sistema de expresión de proteínas;
un primer sitio de escisión enzimática;
una primera secuencia de etiqueta recombinante o secuencia de ácido nucleico codificante de selección; una primera secuencia enlazadora;
un segundo sitio de escisión enzimática;
una primera región de clonación unida operativamente a una segunda región de clonación en presencia de una segunda secuencia enlazadora, en donde las regiones de clonación reciben un gen que codifica un péptido o proteína que se une selectivamente a un ligando biológicamente activo;
una(s) segunda(s) secuencia(s) de etiqueta recombinante(s) o secuencia(s) de ácido nucleico codificante(s) de selección; y
una secuencia de terminación
en donde la primera región de clonación o la segunda región de clonación del casete de expresión comprende el sitio de clonación múltiple 1 (MCS I) y el sitio de clonación múltiple 2 (MCS II), y en donde el MCS I comprende una combinación de los sitios de restricción Ndel y BglII y HindIII y AscI, y el MCS II comprende una combinación de los sitios de restricción NcoI y XbaI y NheI y NotI.
8. El constructo de vector como se reivindicó en la reivindicación 7, en donde dicho constructo de vector es un vector de scFv y es capaz de expresar un fragmento variable monocatenario (scFv) o un fragmento de este en una célula de levadura; y en donde la secuencia promotora es Gal 1; la secuencia de nucleótidos que codifica un producto que permite la presentación de un péptido o proteína en la superficie de un sistema de expresión de proteínas es la proteína Aga2P; los sitios de escisión enzimática son sitios de escisión por proteasa seleccionados de un grupo que comprende el sitio de escisión del factor Xa, el sitio de escisión de la proteasa TEV y una combinación de estos; las secuencias de etiqueta recombinantes o secuencias de ácido nucleico codificantes de selección se seleccionan de un grupo que comprende la etiqueta HA, la etiqueta C-Myc, FLAG y sus combinaciones; la secuencia enlazadora es la secuencia G4S; el gen de la primera región de clonación se selecciona de un grupo que comprende la región variable kappa (Vk) de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta, la región variable lambda (VL) de la cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento de esta y una combinación de estas; el gen de la segunda región de clonación es una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH) o un fragmento de esta; y la secuencia de terminación se selecciona de un grupo que comprende un terminador alfa, un terminador CYC1 y una combinación de estos.
9. El constructo de vector como se reivindicó en la reivindicación 1 o la reivindicación 7, en donde el constructo tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID No. 2, SEQ ID No.
4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No.
18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24 y la SEQ ID No. 26.
10. El constructo de vector como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el constructo de vector comprende además regiones seleccionadas de un grupo que comprende el origen de replicación (Ori), marcador de resistencia a antibióticos, origen de replicación f1, promotor y sus combinaciones; en donde el constructo de vector es capaz de expresar o mostrar un anticuerpo o un fragmento de este en un sistema de expresión procariótico, sistema de expresión de levadura o una combinación de estos;
en donde la región CH1 tiene una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 27, la región Ck tiene una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 28 y la región CL tiene una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 29; y en donde las secuencias Vk, VL y VH se derivan a partir de un repertorio de anticuerpos sin exposición previa, un repertorio de anticuerpos sintéticos o una combinación de estos.
11. Un método para preparar el constructo de vector como se reivindicó en la reivindicación 1 o la reivindicación 7, dicho método comprende las etapas de:
a) síntesis del casete de expresión definido en la reivindicación 1 o la reivindicación 7;
b) linealización de un vector de destino, en donde el vector de destino se selecciona de un grupo que comprende pADL23c, pRS314, p414Gal1, p416Gal1 y sus combinaciones, y la linealización se lleva a cabo mediante digestión con enzima(s) de restricción; e
c) insertar el casete de expresión en el vector de destino linealizado mediante técnicas seleccionadas de un grupo que comprende recombinación homóloga, digestión por restricción seguida de ligamiento y una combinación de estas, para obtener el constructo de vector;
y en donde el método comprende además confirmar los clones de vector libres de errores mediante la técnica de secuenciación.
12. Un método para preparar una biblioteca de constructos de vectores, dicho método comprende las etapas de:
a) preparar el constructo de vector mediante el método como se reivindicó en la reivindicación 11;
b) clonar secuencias de nucleótidos que codifican regiones seleccionadas de un grupo que comprende la región variable kappa (Vk) de la cadena ligera de inmunoglobulina, la región variable lambda (VL) de la cadena ligera de inmunoglobulina o fragmentos de estas, la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de esta (VH) y sus combinaciones, en la región de clonación del constructo de vector para obtener la biblioteca,
o
transferir las secuencias de nucleótidos que codifican regiones seleccionadas de un grupo que comprende la región variable kappa (Vk) de la cadena ligera de inmunoglobulina, la región variable lambda (VL) de la cadena ligera de inmunoglobulina o fragmentos de estas, la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de esta (VH) y sus combinaciones, desde la región de clonación de un constructo de vector a la región de clonación de otro constructo de vector para obtener la biblioteca;
en donde el constructo de vector se selecciona de un grupo que comprende fagémido, vector de expresión de la cadena pesada de tipo apareamiento de levadura, vector de expresión de la cadena ligera de tipo apareamiento de levadura, vector bidireccional bicistrónico de levadura, vector unidireccional bicistrónico de levadura y vector de fragmento variable de la cadena sencilla (scFv); las regiones Vk, VL y VH se derivan a partir de un anticuerpo sin exposición previa, un anticuerpo sintético o una combinación de estos; la biblioteca de constructos de vectores es una biblioteca sintética, una biblioteca sin exposición previa o una combinación de estas; y en donde la transferencia de la secuencia de nucleótidos se lleva a cabo entre el constructo de vector de fagémido al constructo de vector de levadura o entre constructos de vector de levadura.
13. Un método para tamizar e identificar un anticuerpo o un fragmento de este que tiene las características funcionales deseadas, que comprende las etapas de: (a) preparar la biblioteca de constructos de vector mediante el método como se reivindicó en la reivindicación 12 y transformar dichos constructos de vector en células huésped bacterianas, células huésped de levadura o una combinación de estas; y (b) seleccionar las células huésped bacterianas o de levadura que expresan el anticuerpo o fragmento de este que tiene las características funcionales deseadas;
en donde el tamizaje e identificación se lleva a cabo mediante presentación en fagos en células huésped bacterianas, presentación en levadura en células huésped de levadura o secuencialmente mediante presentación en fagos y presentación en levadura; en donde las características funcionales deseadas se seleccionan de un grupo que comprende afinidad, especificidad, antigenicidad, capacidad de fabricación, generación de nuevos epítopos, estabilidad térmica, solubilidad, agregación y actividad catalítica y sus combinaciones;
en donde el tamizaje e identificación, cuando se lleva a cabo mediante presentación en fagos y presentación en levadura secuencial comprende las etapas de:
(i) transformar la biblioteca de constructos de fagémidos en células huésped bacterianas para obtener la biblioteca de anticuerpos en fagos;
(ii) tamizar el anticuerpo presentado o fragmento de este contra antígeno(s) para obtener una biblioteca de anticuerpos en fagos seleccionados que comprende los clones seleccionados;
(iii) transferir el anticuerpo o fragmento de este de los clones seleccionados al vector de levadura seguido de la transformación en células huésped de levadura para la expresión y presentación de dicho anticuerpo o fragmento de este;
(iv) tamizar el anticuerpo o fragmento de este presentado en levadura contra antígeno(s) para identificar el anticuerpo o fragmento de este que tiene las características funcionales deseadas;
en donde el anticuerpo o un fragmento de este está en formato Fab o Scfv para la clonación en un vector de fago o de levadura; en donde la eficiencia de transformación en el vector de fago está en el intervalo de aproximadamente 109 a aproximadamente 1011; y en donde la eficiencia de transferencia o transformación en el vector de levadura está en el intervalo de aproximadamente 106 a aproximadamente 108.
14. Una célula huésped bacteriana o de levadura, o una biblioteca de fagos o una biblioteca de levadura de esta que comprende el(los) constructo(s) de vector como se reivindicó en la reivindicación 1 o la reivindicación 7.
15. Un casete de expresión proporcionado por el(los) constructo(s) de vector como se reivindicó en la reivindicación 1 o la reivindicación 7, en donde dicho casete de expresión tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada de un grupo que comprende la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23 y la SEQ ID No. 25.
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