KR20190015700A - 단백질의 클로닝 및 발현을 위한 벡터, 그 방법 및 적용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항체 유전자 또는 그의 일부를 포함하지만 이에 한정되지 않는 유전 물질을 클로닝 및 발현하기 위한 벡터, 및 상기 벡터의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 벡터는 상호 전달 시스템, 내부 전달 시스템, 또는 개별 디스플레이 시스템 내에서의 직접 클로닝 및 발현의 일부로서, Fab 또는 scFv와 같은 상이한 포맷으로 항체 유전자를 발현한다. 특히, 파지 디스플레이 기술은 파지미드 내 잠재적 항체 유전자를 클로닝 및 스크리닝한 후, 항원에 대한 선도 분자의 추가적인 스크리닝 및 동정을 위해 상기 유전자를 효모 벡터에 전달하는 데 사용된다. 본 벡터는 독창적으로 설계된 삽입/발현 카세트를 비롯하여 많은 이점을 가지므로, 파지로부터 효모 벡터로의 클론 집단의 효율적이고 원활한 전달을 유도하여, 효율적인 라이브러리 제조 및 선도 분자의 동정을 가능하게 한다.
Description
본 발명은 생명 공학, 유전 공학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전 물질 클로닝 및 발현을 위한 벡터 및 상기 벡터를 생성하는 방법에 관한 것이다. 자연 발생 항체 유전자 또는 그의 일부, 인위적으로 설계된 합성 항체 유전자 또는 그의 일부, 또는 이 둘의 조합으로부터 얻어진 유전 물질을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 임의의 유전 물질을 본 발명의 벡터를 사용하여 클로닝 및 발현하는 데 사용할 수 있다.
세포 표면 디스플레이는 표적 단백질을, 일반적으로 세포막 관련 단백질 또는 그의 서브유닛인 캐리어 단백질에 융합시킴으로써 세포 외부에 이를 발현시키는 기술이다. 표면 디스플레이 기술은 단백질 공학, 유도 진화 (directed evolution) 및 약물 발견을 위한 라이브러리 스크리닝 툴로서 사용된다. 그러나, 상기 디스플레이 기술은 그 자체의 장단점과 관련이 있다.
예를 들어, RNA 및 리보솜 복합체의 상대적 불안정성으로 인해 리보솜 디스플레이 방법이 기술적으로 더욱 어려워졌다. 이 기술의 또 다른 한계점은 ScFv와 같은 단일 사슬 단백질을 디스플레이할 수 없다는 것이다. 효모-2-하이브리드 시스템 또는 단백질 상보성 분석과 같은 세포내 선택 방법들은 표적 단백질의 세포내 발현에 직접적으로 의존한다. 그러나, 세포내 시나리오에서 응집하는 성향, 짧은 세포 반감기를 비롯한 몇 가지 한계점이 있으며 가장 중요한 것은 스크리닝 대상인 항원 유형에 따라 전체 시스템을 특정 용도에 맞춰야 한다는 것이다. 또한, 파지 디스플레이는 널리 수용되는 방법이지만, 원핵 생물 발현 시스템 및 디스플레이된 단백질의 번역 후 수정의 결여로 인하여, 적절한 단백질 폴딩에 대한 한계점들이 존재한다. 이들 한계점을 극복하기 위하여, 효모 디스플레이 플랫폼, 진핵 생물 디스플레이 시스템이 사용될 수 있다. 그러나, 효모 디스플레이 시스템 및 이와 유사한 다른 모든 진핵 세포 표면 시스템의 경우에서 주요한 문제는, 달성될 수 있는 라이브러리 크기에 대한 제한적인 형질 전환 효율 설정 한계이며, 이는 전체 프로세스의 효율성을 떨어뜨린다.
항원에 대한 스크리닝의 관점에서, 단백질/항체 라이브러리의 성공은 기타 요인들 사이에서 분비 효율, 프로세싱 효율 및 번역 후 효율과 함께 라이브러리의 다양성 및 기능적 크기에 대한 타협 없는 방대한 크기의 독립적 표현에 있다. 이와 관련하여, 파지 및/또는 효모 디스플레이 플랫폼과 같은 디스플레이 시스템의 유연성은 그러한 목적을 달성하기 위한 절대적인 필수 기준이다. 디스플레이 시스템의 유연성은 사용되는 발현 벡터의 종류와 이들 사이의 호환성 여부에 달려 있다. 또한, 벡터의 호환성 및 상보성은 조합 또는 배치 (batch) 전달 접근법을 통해 파지로부터 효모 디스플레이 시스템으로의 다양성의 전달을 의미한다. 상기 호환성 및 상보성 특징은 현재 사용되고 있는 파지 및 효모 디스플레이 시스템의 합성 컨스트럭트/벡터에서 결여되어 있다.
본 발명은 기존 기술의 상술한 한계점을 해결하기 위한 것으로, 이에 따라 조합 프로세스를 통해 크고 다양한 단백질 유전자 라이브러리를 수용 및 교차-전달하는 벡터를 제공함으로써 다양한 친화성 및 특이성을 지닌 단백질을 동정, 전달, 보존 및 생성하는 능력을 향상시키는 것을 목표로 한다.
- 이 섹션은 독립 청구항들의 사본을 포함한다.
본 발명은, 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계된 벡터 컨스트럭트로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
적어도 하나의 선도 서열,
생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하기 위한 적어도 하나의 클로닝 영역,
불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로불린 경쇄, 또는 그의 단편을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열, 및
적어도 하나의 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 상기 발현 카세트의 적어도 하나의 클로닝 영역은 NdeI, BglII, BmtI, HindIII, AscI, NcoI, XbaI, NheI, NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유하는 것인 벡터 컨스트럭트;
제1항에 기재된 벡터 컨스트럭트로부터 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계되거나, 또는 항체 또는 그의 단편을 전달 또는 수용하도록 설계된 벡터 컨스트럭트로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
프로모터 서열,
선도 서열,
단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
제1 효소 절단 부위,
제1 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열,
제1 링커 서열,
제2 효소 절단 부위,
제2 링커 서열의 존재하에 제2 클로닝 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 클로닝 영역으로서, 상기 클로닝 영역은 생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하는 것인 클로닝 영역,
제2 재조합 태그 서열(들) 또는 선택 코딩 핵산 서열(들), 및
터미네이터 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 발현 카세트의 제1 클로닝 영역 또는 제2 클로닝 영역은 NdeI, BglII, HindIII, AscI, NcoI, XbaI, NheI, NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유하는 것인 벡터 컨스트럭트;
전술한 벡터 컨스트럭트의 제조 방법으로서, 다음 단계들: a) 발현 카세트를 합성하는 단계, b) 목적 벡터를 선형화하는 단계, 및 c) 발현 카세트를 선형화된 목적 벡터에 삽입하여 벡터 컨스트럭트를 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법;
벡터 컨스트럭트 라이브러리의 제조 방법으로서, 다음 단계들: a) 전술한 방법에 의해 벡터 컨스트럭트를 제조하는 단계, b) 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역에 클로닝하여 라이브러리를 수득하는 단계, 또는, 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 하나의 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로부터 또 다른 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로 전달하여 라이브러리를 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법;
목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 스크리닝 및 동정하는 방법으로서, 다음 단계들: (a) 전술한 방법에 의해 벡터 컨스트럭트 라이브러리를 제조하고, 상기 벡터 컨스트럭트를 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포 또는 이들의 조합으로 형질 전환시키는 단계, 및 (b) 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 발현하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법;
전술한 벡터 컨스트럭트(들)을 포함하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포, 또는 파지 라이브러리 또는 효모 라이브러리; 및
전술한 벡터 컨스트럭트(들)에 의해 제공되는 발현 카세트로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23 및 SEQ ID No. 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는 것인 발현 카세트에 관한 것이다.
본 발명의 특징은 첨부된 도면들과 함께 하기 설명으로 완전히 명료해질 것이다. 도면들은 본 발명에 따른 일부 구현예만을 도시하고 있으며 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해하면서, 첨부된 도면들을 사용하여 본 발명을 추가적으로 설명하겠다:
도 1은 pADL23c 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위 및 백본 서열이 수정되었으며, 수정-1, 수정-2, 수정-3, 수정-4로 각각 기재되었다.
도 2는 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB001-파지미드 벡터의 생성을 나타낸다
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 불변 경쇄 (CK) 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) BamHI 및 EcoRI 효소를 사용한 pZB001 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) HindIII 및 NcoI 효소를 사용한 pZB001 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
D) 각각의 클로닝 부위에서 가변 항체 중쇄 및 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 삽입/발현 카세트를 포함하는 pZB001 벡터의 개략도.
도 3은 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB001.1-파지미드 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 불변 경쇄 (CL) 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII 효소를 사용한 pZB001.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) NcoI 및 HindIII 효소를 사용한 pZB001.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
D) 각각의 클로닝 부위에서 가변 항체 중쇄 및 항체 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 삽입/발현 카세트를 포함하는 pZB001.1 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 4는 pRS314 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 5는 항체 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004-효모 양방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 경쇄 (CK) 불변 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) EcoRV 및 KpnI 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
D) NdeI 및 KpnI 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
E) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004 컨스트럭트의 개략도.
도 6은 항체 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.1-효모 양방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII , NdeI & NotI 및 NcoI & AscI 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.1 컨스트럭트의 개략도.
도 7은 항체 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.2-효모 일방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도.
B) HindIII , SpeI & SacII 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.2 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.2 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 8은 항체 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.3-효모 일방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) HindIII , SpeI & SacII 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.3 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.3 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 9는 pRS314 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 10은 pZB004.4-효모 scFv 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인에 대한 클로닝 영역 (MCS I 및 MCS II)을 각각 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) EcoRV & XhoI 효소를 사용한 pZB004.4 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.4 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 11은 p414GAL1 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 12는 중쇄 불변 영역을 갖는 pZB002 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) 중쇄 CH1 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용한 pZB002 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
B) 각각의 클로닝 부위에서 항체 중쇄를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB002 컨스트럭트의 개략도.
도 13은 p416 GAL1 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 14는 경쇄 람다 불변 영역을 갖는 pZB003.1 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS01 신호 서열을 갖는 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용한 pZB003.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB003.1 컨스트럭트의 개략도
도 15는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.2 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS01 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용하한 pZB003.2 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB003.2 컨스트럭트의 개략도
도 16은 SS02 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS02 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS02 신호 서열을 갖는 pZB003 컨스트럭트의 개략도.
도 17은 SS03 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.3 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS03 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003.3 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS03 신호 서열을 갖는 pZB003.3 컨스트럭트의 개략도.
도 18은 SS04 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.4 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS04 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003.4 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS04 신호 서열을 갖는 pZB003.4 컨스트럭트의 개략도.
도 19는 pZB001에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다.
A. 항체 경쇄 카파 삽입을 확인하기 위한 HindIII 및 AscI로의 분해
B. 항체 중쇄 삽입을 확인하기 위한 NcoI 및 XbaI로의 분해
도 20은 pZB001.1에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다
A. 항체 경쇄 람다 삽입을 확인하기 위한 HindIII 및 AscI로의 분해,
B. 항체 중쇄 삽입을 확인하기 위한 NcoI 및 XbaI로의 분해
도 21은 효모 접합형 벡터에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다.
A. pZB003.2에 클로닝된 항체 경쇄 유전자 (카파)의 HindIII & AscI를 사용한 제한 효소 분해.
B. pZB002에 클로닝된 항체 중쇄 유전자의 NcoI & NotI를 사용한 제한 효소 분해.
도 22는 항체 Fab 발현을 확인하기 위한 유동 세포 분석을 나타낸다.
A. 항 His 항체를 사용한 유동 세포 분석.
B. 항 c-myc 항체 및 비오틴화된 Her2 항원을 사용한 유동 세포 분석.
도 23은 항-Her2 ScFv 서열을 함유하는 pZB004.4로 형질 전환시킨 후, 효모 표면에서의 항체 ScFv 발현을 확인하기 위한 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 1은 pADL23c 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위 및 백본 서열이 수정되었으며, 수정-1, 수정-2, 수정-3, 수정-4로 각각 기재되었다.
도 2는 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB001-파지미드 벡터의 생성을 나타낸다
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 불변 경쇄 (CK) 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) BamHI 및 EcoRI 효소를 사용한 pZB001 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) HindIII 및 NcoI 효소를 사용한 pZB001 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
D) 각각의 클로닝 부위에서 가변 항체 중쇄 및 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 삽입/발현 카세트를 포함하는 pZB001 벡터의 개략도.
도 3은 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB001.1-파지미드 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 불변 경쇄 (CL) 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII 효소를 사용한 pZB001.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) NcoI 및 HindIII 효소를 사용한 pZB001.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
D) 각각의 클로닝 부위에서 가변 항체 중쇄 및 항체 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 삽입/발현 카세트를 포함하는 pZB001.1 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 4는 pRS314 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 5는 항체 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004-효모 양방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 경쇄 (CK) 불변 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) EcoRV 및 KpnI 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
D) NdeI 및 KpnI 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
E) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004 컨스트럭트의 개략도.
도 6은 항체 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.1-효모 양방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII , NdeI & NotI 및 NcoI & AscI 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.1 컨스트럭트의 개략도.
도 7은 항체 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.2-효모 일방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도.
B) HindIII , SpeI & SacII 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.2 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.2 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 8은 항체 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.3-효모 일방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) HindIII , SpeI & SacII 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.3 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.3 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 9는 pRS314 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 10은 pZB004.4-효모 scFv 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인에 대한 클로닝 영역 (MCS I 및 MCS II)을 각각 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) EcoRV & XhoI 효소를 사용한 pZB004.4 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.4 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 11은 p414GAL1 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 12는 중쇄 불변 영역을 갖는 pZB002 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) 중쇄 CH1 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용한 pZB002 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
B) 각각의 클로닝 부위에서 항체 중쇄를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB002 컨스트럭트의 개략도.
도 13은 p416 GAL1 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 14는 경쇄 람다 불변 영역을 갖는 pZB003.1 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS01 신호 서열을 갖는 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용한 pZB003.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB003.1 컨스트럭트의 개략도
도 15는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.2 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS01 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용하한 pZB003.2 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB003.2 컨스트럭트의 개략도
도 16은 SS02 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS02 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS02 신호 서열을 갖는 pZB003 컨스트럭트의 개략도.
도 17은 SS03 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.3 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS03 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003.3 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS03 신호 서열을 갖는 pZB003.3 컨스트럭트의 개략도.
도 18은 SS04 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.4 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS04 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003.4 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS04 신호 서열을 갖는 pZB003.4 컨스트럭트의 개략도.
도 19는 pZB001에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다.
A. 항체 경쇄 카파 삽입을 확인하기 위한 HindIII 및 AscI로의 분해
B. 항체 중쇄 삽입을 확인하기 위한 NcoI 및 XbaI로의 분해
도 20은 pZB001.1에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다
A. 항체 경쇄 람다 삽입을 확인하기 위한 HindIII 및 AscI로의 분해,
B. 항체 중쇄 삽입을 확인하기 위한 NcoI 및 XbaI로의 분해
도 21은 효모 접합형 벡터에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다.
A. pZB003.2에 클로닝된 항체 경쇄 유전자 (카파)의 HindIII & AscI를 사용한 제한 효소 분해.
B. pZB002에 클로닝된 항체 중쇄 유전자의 NcoI & NotI를 사용한 제한 효소 분해.
도 22는 항체 Fab 발현을 확인하기 위한 유동 세포 분석을 나타낸다.
A. 항 His 항체를 사용한 유동 세포 분석.
B. 항 c-myc 항체 및 비오틴화된 Her2 항원을 사용한 유동 세포 분석.
도 23은 항-Her2 ScFv 서열을 함유하는 pZB004.4로 형질 전환시킨 후, 효모 표면에서의 항체 ScFv 발현을 확인하기 위한 유동 세포 분석을 나타낸다.
이 섹션은 독립 청구항들의 사본을 포함한다.
본 발명은 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계된 벡터 컨스트럭트에 관한 것으로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
적어도 하나의 선도 서열,
생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하기 위한 적어도 하나의 클로닝 영역,
불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로불린 경쇄, 또는 그의 단편을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열, 및
적어도 하나의 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 상기 발현 카세트의 적어도 하나의 클로닝 영역은 NdeI, BglII, BmtI, HindIII, AscI, NcoI, XbaI, NheI, NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 파지미드 또는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 효모 벡터로부터 항체 또는 그의 단편을 수용하도록 설계되거나, 또는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 효모 벡터로 항체 또는 그의 단편을 전달하도록 설계되고; 여기서 발현 카세트, 파지미드 및 효모 벡터의 적어도 하나의 클로닝 영역은 NdeI , BglII , BmtI, HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공통 제한 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전술한 발현 카세트는 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 효소 절단 부위를 상류에 포함하거나 포함하지 않는 적어도 하나의 터미네이터 서열; 또는, 적어도 하나의 리보솜 결합 부위를 상류에 포함하는 파지 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터 서열, 오퍼레이터 서열 또는 이들의 조합을 함유하거나 함유하지 않고; 전술한 벡터 컨스트럭트는 박테리아 세포 또는 효모 세포에서 항체 또는 그의 단편을 발현할 수 있으며; 전술한 발현 카세트, 파지미드 및 효모 벡터의 클로닝 영역 내 제한 부위는 HindIII 및 AscI; NdeI , BglII , HindIII 및 AscI; NcoI 및 XbaI, NcoI 및 NotI; XbaI , NheI 및 NotI을 포함하는 조합 중에서 선택되고; 프로모터 서열은 Gal1, Gal1/10 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 선도 서열은 pelB 서열, 알파 선도 서열, Aga2P 선도 서열, 알파 접합 인자 1 분비 신호 서열 (SS01), 조작된 알파 인자 (aapS4) 신호 서열 (SS02), 조작된 알파 인자 (aap8) 신호 서열 (SS03), 조작된 알파 인자 (aap8), 신호 서열 (SS04) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열은 FLAG, c-Myc, V5, His 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 터미네이터 서열은 알파 터미네이터, CYC1 터미네이터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 효소 절단 부위는 TEV 프로테아제 절단 부위이며; 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Aga2P 단백질이고; 및 파지 외피 단백질은 pIII 단백질, G8P 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로블린 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 그의 단편, 및 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로블린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 및 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트는 효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 파지미드로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 발현 카세트는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 순차적으로,
프로모터 서열;
선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , BmtI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 클로닝 영역; IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 도메인은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 터미네이터 서열,
(b) 순차적으로,
프로모터 서열;
선도 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열; 및
터미네이터 서열,
(c) 순차적으로,
제1 터미네이터 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제1 세트;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제1 클로닝 영역;
제1 선도 서열,
프로모터 서열;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제2 세트; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 제2 터미네이터 서열,
(d) 순차적으로,
제1 프로모터 서열;
제1 선도 서열,
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제1 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제1 세트;
제1 터미네이터 서열;
제2 프로모터 서열;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제2 세트; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 제2 터미네이터 서열,
및
(e) 순차적으로,
프로모터 서열;
오퍼레이터 서열;
제1 리보솜 결합 부위;
제1 선도 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제1 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
제2 리보솜 결합 부위;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열(들) 또는 선택 코딩 핵산 서열(들); 및
파지 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
본 발명은 또한 제1항에 기재된 벡터 컨스트럭트로부터 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계되거나, 또는 항체 또는 그의 단편을 전달 또는 수용하도록 설계된 벡터 컨스트럭트에 관한 것으로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
프로모터 서열,
선도 서열,
단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
제1 효소 절단 부위,
제1 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열,
제1 링커 서열,
제2 효소 절단 부위,
제2 링커 서열의 존재하에 제2 클로닝 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 클로닝 영역으로서, 상기 클로닝 영역은 생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하는 것인 클로닝 영역,
제2 재조합 태그 서열(들) 또는 선택 코딩 핵산 서열(들), 및
터미네이터 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 발현 카세트의 제1 클로닝 영역 또는 제2 클로닝 영역은 NdeI , BglII, HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 벡터 컨스트럭트는 scFv 벡터이고 효모 세포에서 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 그의 단편을 발현할 수 있는 것인 벡터 컨스트럭트이며; 여기서 상기 scFv 벡터 및 전술한 벡터 컨스트럭트의 발현 카세트의 클로닝 영역은 NdeI , BglII , HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공통 제한 부위를 포함하고; 여기서 프로모터 서열은 Gal 1이며; 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Aga2P 단백질이고; 효소 절단 부위는 인자 Xa 절단 부위, TEV 프로테아제 절단 부위 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 절단 부위이며; 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열은 HA 태그, c-Myc 태그, FLAG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 링커 서열은 G4S 서열이며; 제1 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로블린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제2 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 그의 단편이며; 및 터미네이터 서열은 알파 터미네이터, CYC1 터미네이터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트는 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24 및 SEQ ID No. 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트는 복제 기점 (Ori), 항생제 저항성 마커, f1 복제 기점, 프로모터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역 및 이들의 조합을 더 포함하고; 여기서 벡터 컨스트럭트는 원핵 생물 발현 시스템, 효모 발현 시스템 또는 이들의 조합에서 항체 또는 그의 단편을 발현 또는 디스플레이할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, CH1 영역은 SEQ ID No. 27의 핵산 서열을 가지고, Ck 영역은 SEQ ID No. 28의 핵산 서열을 가지며, CL 영역은 SEQ ID No. 29의 핵산 서열을 가지고; Vk, VL 및 VH 서열은 나이브 항체 레퍼토리, 합성 항체 레퍼토리 또는 이들의 조합으로부터 유래된 것이다.
본 발명은 또한, 전술한 벡터 컨스트럭트의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 다음 단계들: a) 발현 카세트를 합성하는 단계, b) 목적 벡터를 선형화하는 단계, 및 c) 발현 카세트를 선형화된 목적 벡터에 삽입하여 벡터 컨스트럭트를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트의 제조 방법은 시퀀싱 기술에 의해 오류가 없는 벡터 클론을 확인하는 단계를 포함하고; 목적 벡터는 pADL23c, pRS314, p414Gal1, p416Gal1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 선형화는 제한 효소(들)로의 분해에 의해 수행되고; 및 선형화된 목적 벡터에의 발현 카세트의 삽입은 상동성 재조합, 제한 효소 분해 후 결찰 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술에 의해 수행된다.
본 발명은 또한, 벡터 컨스트럭트 라이브러리의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 다음 단계들: a) 전술한 방법에 의해 벡터 컨스트럭트를 제조하는 단계, b) 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역에 클로닝하여 라이브러리를 수득하는 단계, 또는, 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 하나의 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로부터 또 다른 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로 전달하여 라이브러리를 수득하는 단계를 포함한다.
상기 벡터 컨스트럭트 라이브러리의 제조 방법의 일 구현예에서, 벡터 컨스트럭트는 파지미드, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터, 효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터 및 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되고; Vk, VL 및 VH 영역은 나이브 항체, 합성 항체 또는 이들의 조합으로부터 유래되며; 벡터 컨스트럭트 라이브러리는 합성 라이브러리, 나이브 라이브러리 또는 이들의 조합이고; 및 뉴클레오티드 서열의 전달은 파지미드 벡터 컨스트럭트와 효모 벡터 컨스트럭트 간 또는 효모 벡터 컨스트럭트들 간에서 수행된다.
본 발명은 또한, 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 스크리닝 및 동정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 다음 단계들: (a) 전술한 방법에 의해 벡터 컨스트럭트 라이브러리를 제조하고, 상기 벡터 컨스트럭트를 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포 또는 이들의 조합으로 형질 전환시키는 단계, 및 (b) 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 발현하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 스크리닝 및 동정은 박테리아 숙주 세포에서의 파지 디스플레이, 효모 숙주 세포에서의 효모 디스플레이 또는 순차적으로 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 수행되고; 여기서 목적하는 기능적 특성(들)은 친화성, 특이성, 항원성, 제조 가능성, 새로운 에피토프의 생성, 내열성, 가용성, 응집성 및 촉매 활성 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 스크리닝 및 동정은 순차적인 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 수행되고, 다음 단계들:
(i) 파지미드 컨스트럭트 라이브러리를 박테리아 숙주 세포로 형질 전환시켜 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계;
(ii) 항원(들)에 대해 디스플레이된 항체 또는 그의 단편을 스크리닝하여 선택된 클론을 포함하는 패닝된 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계;
(iii) 선택된 클론으로부터 효모 벡터로 항체 또는 그의 단편을 전달한 후 상기 항체 또는 그의 단편의 발현 및 디스플레이를 위하여 효모 숙주 세포로 형질 전환시키는 단계;
(iv) 항원(들)에 대해 효모 디스플레이된 항체 또는 그의 단편을 스크리닝하여 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 동정하는 단계
를 포함한다.
전술한 항체 또는 그의 단편을 스크리닝 및 동정하는 방법의 또 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 파지 또는 효모 벡터로 클로닝하기 위한 Fab 또는 Scfv 포맷이고; 파지 벡터로의 형질 전환 효율은 약 109 내지 약 1011의 범위이며; 및 효모 벡터로의 전달 또는 형질 전환 효율은 약 106 내지 약 108의 범위이다.
본 발명은 또한, 전술한 벡터 컨스트럭트(들)을 포함하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포, 또는 파지 라이브러리 또는 효모 라이브러리에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 전술한 벡터 컨스트럭트(들)에 의해 제공되는 발현 카세트에 관한 것으로서, 상기 발현 카세트는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23 및 SEQ ID No. 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 명세서에 달리 정의되지 않은 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미를 가진다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어들은 복수를 포함하고 복수의 용어들은 문맥 및/또는 적용에 적절하다고 생각되는 단수를 포함한다. 다양한 단수/복수의 치환은 명료성을 위하여 본원에서 명확하게 제시될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 생명 공학, 면역학, 분자 및 세포 생물학, 재조합 DNA 기술과 관련하여 사용되는 명명법은 본 기술 분야에 잘 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본원에 인용된 특정 참고 문헌들은 본원에 참조로서 명확하게 포함되었다. 충돌이 있는 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우선한다. 재료, 방법, 도면 및 실시예는 단지 예시일 뿐이고 한정하고자 하는 것은 아니다.
또한, 개시된 다양한 파지미드 및 효모 발현 벡터의 방법 및 제조는, 달리 지시하지 않은 한 분자 생물학, 생화학, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 기술, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 관련 분야의 기술들을 사용한다. 이들 기술들, 그 원리 및 요구사항은 문헌에 설명되어 있으며 공지되어 있다.
발현 벡터들 및 이들 벡터들을 구성하는 핵산 서열, 및 본 발명의 기타 구현예/방법이 개시되고 기술되기 전에, 본원에서 사용되는 용어들은 특정 구현예들을 설명하기 위한 것을 뿐 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 발명의 상세한 설명 및 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다는 것을 주의하여야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 '벡터'는 외래 유전 물질을, 이 유전 물질이 복제 및/또는 발현될 수 있는 다른 세포로 인위적으로 운반하는 운반체로서 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 본 발명의 벡터는 원핵 세포, 진핵 세포 또는 이들의 조합에서 복제 및/또는 발현할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 체내 면역 반응을 유도하는 임의의 이물질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 또는 “그의 단편”은 천연 공급원으로부터 유래되거나, 전체 또는 일부가 합성적으로 생산될 수 있는 면역 글로불린을 지칭한다. 용어 "항체" 및 "면역 글로불린"은 달리 지시되지 않는 한 발명의 상세한 설명 전체에 걸쳐 동의어로 사용된다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 다클론 및 단일클론 항체 제조물을 모두 포함하고, 또한 키메라 항체 분자, F(ab')2 및 F(ab) 단편, Fv 분자, 단일 사슬 Fv 분자 (ScFv), 다이머 및 트라이머 항체 단편, 미니바디, 인간화 단일클론 항체 분자, 인간 항체, 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이들 분자로부터 유래된 임의의 기능성 단편을 포함하며, 여기서 유도체 분자들은 모체 항체 분자의 면역학적 기능성을 보유한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 용어 "단일클론 항체"는 동종 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 지칭한다. 항체는 항체의 종 또는 공급원 또는 제조 방식에 한정되지 않는다. 상기 용어는 모체 단일클론 항체 분자의 면역학적 결합 성질을 나타내는 키메라 및 인간화 동종 항체 집단뿐만 아니라, 전체 면역 글로불린 및 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv 및 기타 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 단편"은 항원 결합 활성을 나타내는 능력을 보유하고 있는 전체 항체의 일부이다. 용어 Fab 또는 ScFv는 항체 단편으로서 구체적으로 언급되며, 여기서 전자는 중쇄 불변 도메인 (CH1) 및 카파 또는 람다에 대한 경쇄 불변 영역 (Ck 또는 Cλ)과 독점적으로 연관되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 디스플레이 라이브러리"는 표적 항원에 대한 스크리닝 방법에 적합한 세포 또는 무세포 표면상의 항체를 발현하는 플랫폼(들)을 지칭한다. 본원에서, 파지 디스플레이 라이브러리 및 효모 디스플레이 라이브러리는 달리 지시되지 않는 한 정확한 설명서와 함께 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “신호 펩티드” 및 "선도 펩티드"는 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "클로닝 영역", "다중 클로닝 부위" 및 "MCS"는 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명은 유전 물질 클로닝 및 발현을 위한 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 자연 발생 항체 유전자, 인위적으로 설계된 합성 항체 유전자 또는 그의 일부, 또는 이들의 조합으로부터 얻어진 유전 물질을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 유전 물질을 클로닝 및 발현하기 위한 벡터의 생성에 관한 것이다.
본 발명은 파지미드 및 효모 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 파지미드, 효모 바이시스트론 (bicistronic) 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 scFv 벡터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 벡터는 큰 유전자 라이브러리를 클로닝할 수 있도록 설계되었으며, 동시에 클로닝된 라이브러리를 상이한 벡터간 전달하는 데 유연하다. 일 예시적 구현예에서, 본 발명의 벡터는 클로닝된 라이브러리를 파지미드로부터 효모 벡터(들)로, 즉 상호(inter)-전달하는 데 유연하다. 본 발명의 벡터는 고처리량 스크리닝 (high throughput screening) 플랫폼을 통해 발현된 유전자 산물의 적절한 발현 및 스크리닝을 보장하기 위하여, 다중 발현 태그들과 유전적 요소들을 갖추고 있다. 또 다른 예시적 구현예에서, 본 발명의 벡터는 클로닝된 라이브러리를 상이한 효모 벡터간 전달, 즉 내부(intra)-전달하는 데 유연하다.
본 발명의 비제한적 구현예에서, 파지미드 벡터는 상동성 재조합 서열, 리보솜 결합 부위, 프로모터, 신호 펩티드/선도 펩티드, 태그, 다중 클로닝 부위 (MCS), 중쇄의 불변 영역 [IgG1 중쇄의 불변 영역(CH1)] 및 경쇄 [카파 경쇄 (Ck) 또는 람다 경쇄 (CL)의 불변 영역] 또는 그의 단편, 및 geneIIIP 파지 외피 단백질을 비롯한 발현 카세트를 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역은 나이브 항체 또는 합성 항체로부터 유래된다. 게다가, 파지미드는 또한 복제 기점 (Ori), 항생제 저항성 마커 및 f1 복제 기점을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 파지미드를 위한 발현 카세트는 도 2A 및 3A에 각각 제공된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에서, 파지미드 벡터 맵은 도 2D 및 3D에 각각 도시된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 파지미드 벡터는 SEQ ID No. 2 및 SEQ ID No. 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 비제한적 구현예에서, 효모 벡터는 접합형 중쇄 발현 벡터, 접합형 경쇄 발현 벡터, 양방향 바이-시스트론 벡터, 일방향 바이-시스트론 벡터 및 모노-시스트론 ScFv 디스플레이 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 비제한적 구현예에서, 효모 벡터는 프로모터, 신호 펩티드, 태그, 다중 클로닝 부위 (MCS), 효소 절단 부위, 전사 터미네이터 및 경우에 따라, 중쇄의 불변 영역 [IgG1 중쇄의 불변 영역(CH1)] 및 경쇄 [카파 경쇄 (Ck) 또는 람다 경쇄 (CL)의 불변 영역] 또는 그의 단편, 및 링커 서열을 비롯한 발현 카세트를 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역은 나이브 항체 또는 합성 항체로부터 유래된다. 일 예시적 구현예에서, 효모 벡터는 항체가 Fab 포맷으로 디스플레이될 때, 중쇄의 불변 영역 [IgG1 중쇄의 불변 영역(CH1)] 및 경쇄 [카파 경쇄 (Ck) 또는 람다 경쇄 (CL)의 불변 영역] 또는 그의 단편을 포함한다. 바람직한 구현예에서, Fab 포맷을 디스플레이하는 이들 효모 벡터는 접합형 중쇄 발현 벡터, 접합형 경쇄 발현 벡터, 양방향 바이-시스트론 벡터 및 일방향 바이-시스트론 벡터 및 모노-시스트론 ScFv 디스플레이 벡터 중에서 선택된다. 또 다른 예시적 구현예에서, 효모 벡터는 항체가 scFv 포맷으로 디스플레이될 때, 중쇄의 불변 영역 [IgG1 중쇄의 불변 영역(CH1)] 및 경쇄 [카파 경쇄 (Ck) 또는 람다 경쇄 (CL)의 불변 영역] 또는 그의 단편이 결여되어 있다. 바람직한 구현예에서, scFv 포맷을 디스플레이하는 이들 효모 벡터는 scFv 벡터이다. 게다가, 효모 벡터는 또한 복제 기점, f1 복제 기점, 항생제 저항성 마커, 영양요구성 마커 및 센트로미어 융합된 자체 복제 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 효모 벡터는 도 5E, 6C, 7C, 8C, 10C, 12C, 14C, 15C, 16C, 17C 및 18C에 각각 도시되어 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 효모 벡터는 SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 24 및 SEQ ID No. 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명은 항체 또는 그의 단편의 발현을 위한 발현 카세트/삽입물을 추가로 제공한다. 본 발명의 일 예시적 구현예에서, 발현 카세트는 항체를 Fab 포맷, scFv 포맷 또는 이들의 조합으로 발현시키기 위하여 제공된다. 또 다른 예시적 구현예에서, 발현 카세트는 파지미드 벡터, 효모 벡터 또는 이들의 조합의 일부를 형성하도록 설계된다. 일 구현예에서, 발현 카세트는 파지미드 벡터가 항체를 Fab 포맷으로 발현하도록 설계된다. 또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 효모 벡터가 항체를 Fab 포맷, scFv 포맷 또는 이들의 조합으로 발현하도록 설계된다. 본 발명의 일 구현예에서, 효모 벡터를 위한 대표적인 발현 카세트는 5A, 6A, 7A, 8A, 10A, 12A, 14A, 15A, 16A, 17A 및 18A에 각각 제공되어 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 효모 발현 카세트는 SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 23 및 SEQ ID No. 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 유전 물질을 클로닝 및 발현하기 위한 발현 카세트 및 벡터의 생성에 관한 것이다. 비제한적 구현예에서, 상기 벡터는 전술한 바와 같이 파지미드, 효모 발현 벡터 또는 이들의 조합이다.
일 구현예에서, 파지미드의 생성 방법은 발현 카세트/삽입 영역을 합성하는 단계 및 상기 영역을 선형화된 벡터 백본 (목적 벡터)에 도입하여 파지미드를 수득하는 단계를 포함한다.
일 예시적 구현예에서, 파지미드의 생성 방법은 다음 단계들을 포함한다:
1. 신호 서열, 리보솜 결합 부위 (RBS), MCS, 태그, 파지 외피 단백질, Fab 디스플레이 포맷에 맞추어 정렬하기 위한 경쇄 및 중쇄의 각 불변 영역, 및 경우에 따라 발현 카세트의 삽입을 돕기 위한 목적 벡터에 대한 상동성 뉴클레오티드 길이를 포함하는 발현 카세트를 설계 및 합성하는 단계;
2. 제한 효소로 pADL23c 등의 목적 벡터를 선형화하는 단계;
3. 각 단편을 정제하고, 합성된 발현 카세트를 선형화된 벡터에 삽입하기 위해 효소-매개 상동성 재조합을 셋업하여 파지미드를 생성하는 단계.
또 다른 구현예에서, 시퀀싱에 의해 오류가 없는 파지미드 클론을 확인하고, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (Vk 또는 VL) 레퍼토리의 가변 영역을 지정된 제한 효소를 사용하여 생성된 파지미드 벡터 내 예정된 위치 (MCS)에 클로닝한다. 일 구현예에서, 상기 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역은 나이브 항체 또는 합성적으로 생성된 항체로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, VH, Vk 및 VL의 나이브 레퍼토리 또는 합성 컨센서스 풀을 벡터 내 특정 위치의 각 MCS에 클로닝하여 라이브러리 컨스트럭트를 생성한다. 또한, 합성적 다양성을 프레임워크 (frame-work) 컨스트럭트의 CDR 영역에 도입하여 파지미드의 합성 항체 유전자 라이브러리를 개발한다.
일 예시적 구현예에서, 상기 단계 (1)의 합성된 뉴클레오티드 서열 (발현 카세트)은 2 개의 세그먼트를 포함하는 ~2 Kb 크기의 큰 DNA 세그먼트이며, 여기서 세그먼트 1은 상동성 영역, 오퍼레이터, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS) 1, 다중 클로닝 부위 (MCS) I, 경쇄 불변 영역 [카파 (Ck) 또는 람다 (CL)]를 포함하고, 세그먼트 2는 RBS 2, MCS II, 중쇄 불변 영역 (CH1), 이어서 융합 단백질로서의 파지 단백질 GeneIIIp 및 상동성 영역을 포함한다. 합성된 발현 카세트는 상동성 재조합에 기초한 클로닝 방법인 효율적이고, 생산적이며, 결찰이 없는 (ligation-free) 인퓨젼 클로닝 방법론을 통해 선형화된 pADL23c 벡터 백본에 도입된다. 나이브 및/또는 합성 항체 레퍼토리로부터의 경쇄 및 중쇄 가변체는 파지미드의 세그먼트 1의 MCS I 및 세그먼트 2의 MCS II에 각각 클로닝된다. 따라서, 카파 또는 람다 불변 영역에 전적으로 기초한 두 개의 지정된 파지미드가 생성되고, 이에 따라 카파 및 람다 경쇄 풀의 각 가변 영역이 각 목적 파지미드 벡터에 수용된다 (도 2D & 3D). 합성 라이브러리의 경우, 이들 파지미드는 경쇄의 불변 영역에 기초한 파지미드 분류/발현 카세트를 보유하는, 컨센서스 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 가능한 조합에서 다중 클론을 생성하는 데 사용된다. 또한, 합성 다양성은 Vh, Vk 및 Vλ 사슬의 CDR 영역에서 지정된 제한 효소 경계에 도입된다. 한편, 카파 및 람다 경쇄에서의 분화를 갖는 나이브 레퍼토리는 지정된 파지미드에 직접 클로닝된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 효모 벡터의 생성 방법은 발현 카세트를 설계하는 단계, 카세트의 삽입을 위하여 목적 벡터를 선형화한 후 상동성 재조합하는 단계 또는 제한 효소 분해를 사용한 후 카세트를 선형화된 벡터에 결찰시켜 효모 벡터를 생성하는 단계를 포함한다. 또한, 가변 중쇄 및 경쇄 레퍼토리는 각 벡터 내의 예정된 위치에 클로닝된다.
일 예시적 구현예에서, 효모 벡터의 생성 방법은 다음 단계들을 포함한다:
1. 목적하는 프로모터, 터미네이터, 신호 서열, MCS, 태그, 삽입을 돕기 위한 목적 벡터에 대한 제한 부위를 갖고, 링커, 상동성 재조합 서열, 디스플레이를 위한 융합 단백질을 비롯한 선택적 요소들을 가지며, 경우에 따라, Fab 디스플레이 포맷에 맞추어 정렬하기 위한 중쇄 및 경쇄의 각 불변 영역을 갖거나 또는 항체가 ScFv 포맷으로 디스플레이될 경우 중쇄 및 경쇄의 상기 불변 영역이 없는 발현 카세트를 설계 및 합성하는 단계;
2. 제한 효소로 pRS314, p414GAL1 또는 p416GAL1 등의 목적 벡터를 선형화하는 단계;
3. 각 단편을 정제하고, 합성된 발현 카세트를 선형화된 목적 벡터에 삽입하기 위해 효소-매개 상동성 재조합을 셋업하거나; 또는 합성된 카세트를 선형화된 벡터에 도입하기 위해 제한 효소 분해 및 결찰을 셋업하여 효모 벡터를 생성하는 단계.
또 다른 구현예에서, 시퀀싱에 의해 오류가 없는 효모 벡터 클론을 확인하고, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (Vk 또는 VL) 레퍼토리의 가변 영역을 지정된 제한 효소를 사용하여 각 효모 벡터 내 예정된 MCS 위치에 클로닝한다. 일 구현예에서, 상기 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역은 나이브 항체 또는 합성적으로 생성된 항체로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, Vh, Vk 및 VL의 나이브 풀 및/또는 합성 풀을 파지미드로부터 효모 벡터로 전달하거나, 이들 영역을 효모 벡터의 각 MCS에 직접 클로닝하여 진핵 생물 항체 유전자 라이브러리 컨스트럭트를 생성한다.
또 다른 예시적 구현예에서, 대표적인 효모 벡터는 도 5E, 6C, 7C, 8C, 10C, 12C, 14C, 15C, 16C, 17C 및 18C에 각각 도시되어 있다. 제한 부위들 및 관련 호환성 요인들 외에, Fab 및 ScFv 포맷으로 예시되는 바와 같이, 효모 벡터에는 디스플레이 포맷 등의 다른 특성들이 있으며, 한편 발현 시스템을 통해 Fab 포맷이 추가로 투영된다: 1) Fab 포맷으로 더 큰 라이브러리 크기를 산출하는 상이한 효모 균주에서의 상이한 벡터상에 2 개의 상이한 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 접합형 효모 벡터; 2) 단일 효모 디스플레이 벡터가 동일하거나 상이한 유도성 프로모터에 의해 유도되는 2 개의 발현 카세트를 포함하여 구성되는 바이-시스트론 효모 벡터. 이 바이-시스트론 효모 벡터 포맷은 화학량론적 양의 분리된 경쇄 및 중쇄 단백질의 생산을 유도하고 이로써 기능성 Fab 항체의 산출을 최적화한다; 그리고 3) VH 및 VL 영역을 분리하는 특정 길이의 링커를 갖는 항체 유전자의 ScFv 단편을 클로닝하기 위한 ScFv 벡터가 있다.
비제한적 구현예에서, 본 발명의 효모 벡터는 형광에 기초한 검출 및 분리를 위한 적절한 융합 태그를 갖는다. 단백질 태그는 적용 가능한 경우 N-말단과 C-말단 태그 모두로 배치된다. 이들 태그의 유용성은 검출, 단리, 정제 및 분석 개발을 비롯하여 다양하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 항원/단백질에 대한 단백질/항체 라이브러리 스크리닝 툴로 보이게 하는, 적절하게 설계된 벡터를 사용하여 표면 디스플레이 기술의 몇 가지 고유한 특징이 존재한다. 첫째, 세포 표면에서의 조합 단백질 라이브러리의 디스플레이는 DNA와 단백질 사이에 물리적 연결고리를 형성하여, ELISA 또는 형광 활성화 세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting; FACS)와 같은 고처리량 방법을 정량적인 방식으로 편리하고 효율적으로 사용할 수 있도록 한다. 둘째, 표적 기질 또는 리간드/수용체는 세포막 장벽을 가로지르지 않으면서 표면에 디스플레이된 단백질에 직접 접근할 수 있어, 이에 따라 어떠한 노동 집약적인 단백질 정제 단계도 필요하지 않도록 한다. 셋째, 세포 부착은 표면에 디스플레이된 단백질을 안정화시킨다. 디스플레이 시스템 및 이들의 상호-연결성의 설계로 인하여, 다른 시스템으로 전달되는 동안 분자의 손실이 없는지 확인하여야 하며, 이는 다시 오류가 없어야 한다. 이는 원핵 생물/파지 디스플레이 시스템으로부터 진핵 생물/효모 디스플레이 시스템으로의 유전자의 원활하고 오류가 없는 전달을 위한 벡터를 제공하는 본 발명에서 성공적으로 달성된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상업적으로 입수 가능한 벡터 pADL23c, pRS314 및 p414GAL1 & p416GAL1을 파지 및 효모 디스플레이 플랫폼용 벡터를 설계하기 위하여 각각 사용하였다. 각 디스플레이 시스템에서 나이브 또는 합성 항체 레퍼토리로부터의 가변 중쇄 및 경쇄의 효율적인 클로닝 및 디스플레이 시스템을 통한 전달을 위하여, 제한 효소 부위는 이들이 벡터 백본, 중쇄 & 경쇄의 불변 영역, 태그, 파지 벡터의 경우 GeneIIIp 또는 G3P 및 효모 벡터의 경우 Aga2P 등의 디스플레이 단백질, 선도 및 터미네이터 서열에 존재하지 않는 방식으로 신중하게 제공되었다. 또한, 상기 고유하게 설계되고 배치된 제한 효소 부위들은 VH (7 패밀리), Vk (4 패밀리) 및 VL (3 패밀리) 사슬과 같은 가변 영역의 지정된 컨센서스 서열에 존재하여서는 안 된다. 또한, 모든 CDR을 통한 합성 다양성의 도입을 위하여 선택되는 경계 효소들은 고유하며, 합성 항체 유전자 레퍼토리를 운반하는 임의의 벡터에 존재하지 않는다.
따라서, 본 발명의 벡터는 내부-전달 (즉, 동일한 발현 시스템의 벡터 내에서의 전달)뿐만 아니라 상호-전달 (즉, 한 발현 시스템의 벡터로부터 다른 발현 시스템의 벡터로의 항체 유전자의 전달)을 위한 특정 제한 부위를 포함하도록 고유하게 설계된다. 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 시스템 간 (intersystem) 전달, 즉 파지 시스템으로부터 효모 발현 시스템으로의 항체 유전자의 전달이 가능하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터는 시스템 내 (intra-system) 전달, 즉 Fab으로부터 ScFv로 또는 그 역으로의 디스플레이 포맷 변경, 또는 동일한 포맷이지만 상이한 발현 벡터, 예컨대 접합형 효모 벡터로부터 바이-시스트론 효모 벡터로 MCS 효소의 각 세트를 통한 전달이 가능하다. 일 구현예에서, 벡터, 즉 파지미드 및 효모 벡터의 클로닝 영역 (MCS)은 NdeI , BglII , BmtI , HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI, NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 균일한 제한 부위들을 포함한다. 일 예시적 구현예에서, 가변 경쇄 서열을 클로닝하기 위한 파지미드 벡터 및 효모 벡터 (효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 scFv 벡터)의 MCS I/MCS 영역은 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택되는 제한 부위들을 포함한다. 또 다른 예시적 구현예에서, 가변 중쇄 서열을 클로닝하기 위한 파지미드 벡터 및 효모 벡터 (효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 scFv 벡터)의 MCS II/MCS 영역은 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택되는 제한 부위들을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 가변 경쇄에 대한 클로닝 영역 (MCS I/MCS)은 HindIII와 AscI, 및 NdeI와 AscI 중에서 선택되는 제한 부위의 조합을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 가변 중쇄에 대한 클로닝 영역 (MCS II/MCS)은 NcoI와 XbaI, 및 NcoI와 NotI 중에서 선택되는 제한 부위의 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 단백질 라이브러리를 구축함에 있어서의 인스턴트 벡터의 적용에 관한 것이다. 일 구현예에서, 단백질 라이브러리는 항체 라이브러리이다. 또 다른 구현예에서, 항체 라이브러리는 합성 항체 유전자 발현 라이브러리, 나이브 항체 라이브러리 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 전술한 바와 같은 벡터는 합성 항체 유전자 발현 라이브러리, 나이브 항체 유전자 발현 라이브러리 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 유전자 발현 라이브러리의 생성 방법에 사용되며, 여기서 상기 방법은 조합 툴을 사용하여 특정 항원(들)을 스크리닝하는 단계를 포함한다.
일 예시적 구현예에서, 조합 툴은 파지 디스플레이 기술 및 효모 디스플레이 기술을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 항체 유전자 발현 라이브러리를 생성하기 위하여, 파지 디스플레이 기술 단독으로, 효모 디스플레이 기술 단독으로, 또는 파지 및 효모 디스플레이 기술을 조합하여 스크리닝하는 단계를 사용한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 항체 유전자 발현 라이브러리를 생성하기 위하여, 파지 디스플레이 기술에 이어서 순차적으로 효모 디스플레이 기술로 스크리닝하는 단계를 사용한다.
본 발명의 비제한적 구현예에서, 합성 항체 유전자 발현 라이브러리는 향상된 친화성 및 특이성을 갖는 특정 치료 표적, 즉 항원에 대해 목적하는 기능적 특성을 갖는 고유 항체 분자의 단리를 허용한다.
본 발명의 또 다른 비제한적 구현예에서, 항체의 목적하는 기능적 특성은 친화성, 특이성, 제조 가능성, 새로운 에피토프의 생성, 내열성, 항원성, 가용성, 응집성 및 촉매 활성, 또는 이들의 임의의 조합 및 성공적인 제품 상용화화 관련된 임의의 다른 특성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 비제한적 구현예에서, 항체 유전자 발현 라이브러리의 생성 방법은 순차적으로 파지 디스플레이 기술 및 효모 디스플레이 기술을 탐구하는 단계를 포함하며, 이는 파지 기반 라이브러리의 특성인 항체 유전자 다양성의 더 큰 세트를 활용할 수 있도록 한다. 그 후에 항체 클론을 효모 디스플레이 시스템을 통해 스크리닝한다. 항체 유전자 발현을 위한 효모 시스템의 사용은 세포 표면의 항체 생성물의 진핵 생물 단백질 번역, 가공 및 적절한 폴딩 때문에 유리하다. 또한, 효모 발현은 높은 특이성을 갖는 항원성 표적과의 적절한 상호 작용을 가능하게 한다. 이들 두 상보적인 시스템을 사용하여 얻은 정보는 상용화 가능성의 관점에서 보다 높은 성공률로 "선도 분자 (lead molecules)" (즉, 항원에 특이적인 항체)를 생성한다. 본 발명의 벡터는 전술한 벡터의 다양한 특징으로 인하여 순차적인 파지 디스플레이 기술 및 효모 디스플레이 기술에 의해 항체 유전자 발현 라이브러리를 생성하는 데 성공적으로 도움을 준다.
본 발명의 파지미드 및 효모 벡터는 오류가 없는 프로세스를 통해 크고 다양한 항체 유전자 라이브러리를 수용 및 교차 전달 (cross-transfer)하고, 이로써 다양한 친화성 및 특이성을 갖는 다수의 항원에 대한 고유/선도 분자를 동정, 전달, 보존 및 생성하는 능력을 증강시킨다.
본 발명의 비제한적 구현예에서, 원핵 생물 파지 디스플레이 표면 발현 시스템은 약 109 내지 약 1011, 바람직하게는 >1011의 큰 항체 유전자 라이브러리를 수용하기 위하여, 그러한 라이브러리에 내재된 광범위한 다양성이 유지되는 방식으로 본 발명에서 사용된다. 동시에, 원핵 생물 스크리닝 시스템을 사용하는 것이 항체 분자의 우수한 기능성을 확인하는 데 최적이 아닐 수 있으므로, 파지 디스플레이 시스템은 우수한 기능성을 위하여 번역 후 수정을 허용하는 진핵성 효모 디스플레이 플랫폼과 통합된다. 이러한 위업을 달성하기 위하여, 고도로 다양화된 항체 유전자 라이브러리 (>1011의 클론들)의 클로닝 및 발현을 위한 파지미드 벡터가 본 발명에서 설계 및 사용된다. 이들 유전자 라이브러리는 인위적으로 설계되고 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 수집되거나, 또는 자연 발생 항체 유전자 서열로부터 수집된다. 벡터의 모든 세트는 표적화된 항체 유전자의 효율적인 단리 및 정제를 허용하는 다중 단백질 태그뿐만 아니라 융합 단백질로서의, 항체 유전자의 높은 수준의 발현을 보장하는 상기 단락에서 전술한 바와 같은 유전적 요소들로 설계된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 전략은 우선 파지 디스플레이 기술을 통해 큰 항체 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것이며, 여기서 선택된 클론은 그 후에 효모 디스플레이 벡터에서 재클로닝되어 ScFv 또는 Fab 또는 다른 항체 포맷을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 유전자 포맷을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 파지미드 벡터는 파지미드를 통해 항체 유전자의 예비 스크리닝을 완료한 후, 클론을 다양한 효모 발현 벡터로 전달하여 ScFv, Fab 또는 다른 항체 포맷을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 유전자 포맷을 발현하는 방식으로 설계된다. 본 발명의 파지미드 벡터는 클로닝된 유전자를 다양한 유형의 효모 디스플레이 벡터로 전달하는 데 적합하다. 본 효모 발현 벡터는 또한 ScFv, Fab 및 다른 포맷을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 포맷의 항체 유전자의 클로닝 및 발현 관점에서 고유하다. 또한, 본 효모 발현 벡터는 부분적으로 스크리닝된 클론을 파지 디스플레이 시스템으로부터 효모 디스플레이 시스템으로 전달하거나, 조합적 또는 비조합적으로 효모 시스템 내 나이브 또는 합성 라이브러리를 직접 생성하는데 사용되며, 여기서 후자의 전략은 파지 디스플레이 시스템으로부터 직접 전달되는 중쇄 및 경쇄의 특정 조합을 보존한다. 클론의 전달은 바람직하게는 제한 효소 분해에 기초한 방법을 통해 효모 균주 내로 수행되는 것이 바람직하다. 유전자 전달 또는 새로운 클로닝을 위한 제한 부위는 상이한 벡터 간에 유전자 전달이 호환 가능하도록 신중하고 고유하게 설계된다. 효모 발현 플라스미드는 다수의 융합 단백질 태그 및 절단 부위를 함유하여 전장 단백질의 발현을 보장하고 고처리량 방법을 통해 단리 및 정제되도록 설계된다. 효모 내에서 일단 발현된 다양한 항체 포맷의 분비를 최적화하기 위하여 신호 서열의 다양한 변이체가 사용되었다. 일 구현예에서, 고처리량 방법은 ELISA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 고처리량 비드 기반의 선택 방법, 세포 분리 기술, 자동화된 고처리량 현미경 검사, 자기 분리 기술 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 선택된 클론 집단은 또한 전략적으로 위치된 단백질 절단 부위들을 사용하여 항체 유전자 산물의 신속한 정제에도 유용하다.
따라서, 본 벡터 및 방법은 고유한 설계 및 독점적인 스크리닝/선택 기준에 기초한 항체 유전자 라이브러리의 다양하고 독창적인 항체 레퍼토리 모두를 활용한다. 본원에서 채택된 벡터 설계, 발현 프로파일링 및 스크리닝 전략은 파지와 효모 디스플레이 플랫폼 간 또는 다양한 벡터 자체 간의 효율적인 전이를 가능하게 한다. 상기 설계는 또한 파지 디스플레이 스크리닝으로부터 얻어진 클론을 효모 디스플레이 시스템에 비조합적으로 전달할 수 있도록 한다. 파지 디스플레이는 고처리량 포맷의 항체-항원 상호 작용의 엄격성 및 특이성에 중점을 둔 1차 스크리닝을 위한 라이브러리 크기 (>1011)를 수용하며, 스크리닝된 분자는 효모 플랫폼을 통한 나이브 디스플레이를 모방하기 위하여 무작위화 프로세스를 다시 거친다. 본 발명의 파지미드 및 효모 벡터 모두에서 사용된 고유한 제한 효소/부위 세트는 PCR과 같은 어떠한 증폭 기반 방법의 도입 없이 가변 중쇄 및 경쇄의 전달을 가능하게 하여, 이로써 라이브러리의 기존 스크리닝된 다양성을 보존한다. 이러한 접근법은 항체 유전자 라이브러리를 성공적으로 생성하고, 선도 항체 분자/산물을 스크리닝하는 데 매우 중요/중대하다. 따라서, 각 종류의 벡터들 (파지 디스플레이용 벡터 및 효모 디스플레이용 벡터)은 기능적으로 특이적이지만 구조적으로 다양한 항체 모이어티/선도 분자를 개발하는 파이프라인에 조합적으로 기여한다. 상기 발현 단계는 또한 Fab 및 scFv 단편 또는 유사한 항체 단편이 효모 표면상에 디스플레이되는 동안 파지상에 Fab 모이어티 또는 이러한 유형의 항체 단편의 고유한 디스플레이를 보장한다. 또한, 효모 디스플레이 플랫폼은 바이시스트론 및 접합형 접근법으로의 벡터 선택을 제공하여 Fab 또는 유사한 항체 단편을 디스플레이한다. 이 특별한 전략, 특히 접합형 전략은 E. coli 형질 전환 효율에 비하여 효모 세포에서 일반적으로 관찰되는 낮은 형질 전환 효율의 문제를 회피하기 위해 채택됨으로써, 더 많은 수의 클론을 스크리닝한다. 두 가지 상이한 디스플레이 시스템을 통해 항원 또는 항원-발현 세포에서 여러 차례의 선택을 하는 전체 프로세스는 친화성, 특이성, 제조 가능성 및 촉매 활성과 같은 목적하는 항체 특성의 범위를 양성 또는 음성 선택하는 데 매우 중요하다. 본 발명의 벡터의 전략적 설계 및 조합적 사용은 다양한 항원성 표적에 대한 고유 분자를 동정할 수 있는 항체 유전자 라이브러리의 다양성을 보존할 수 있도록 한다. 따라서, 본 벡터 및 두 가지 상이한 디스플레이 시스템의 일부로서의 이들의 사용은, 새롭고 기능적으로 개선된 항체 동정 및 추가적인 상업적 개발에 대한 엄청난 자원으로서의 역할을 하는 다양성이 높은 인간 항체의 나이브 또는 합성 라이브러리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 유전자 라이브러리의 생성을 돕는다.
종합하여, 파지 디스플레이 기술에서, 본 발명의 파지미드 벡터는 특정 항원에 대한 높은 내지 중간 정도의 친화성을 갖는 잠재적 항체 유전자를 클로닝 및 스크리닝하는 데 사용된다. 이어서, 이들 유전자는 선도 분자를 추가로 스크리닝 및 동정하기 위하여 본 발명의 효모 디스플레이 벡터로 전달된다. 파지 디스플레이 기술은 큰 다양화된 항체 라이브러리의 클로닝 및 발현을 가능하게 하고, 효모 디스플레이 기술은 진핵 세포 발현 시스템 및 적절한 단백질 폴딩의 관점에서 우수하기 때문에, 본 발명의 벡터를 사용하여 이들 두 가지 기술을 사용하는 것은 유리하다. 따라서, 효모 디스플레이 기술은 효모 세포의 표면에서 발현될 때의 더 우수한 항원 인식을 위하여 항체 구조적 모티프를 모방하는 것을 돕는다.
따라서, 본 발명의 원핵성 및 진핵성 벡터를 사용함으로써 이들 두 상보적인 기술을 조합하는 것은 매우 다양한 항체 라이브러리를 스크리닝하고 특정 항원에 대한 새로운 항체 분자를 개발하는 데 유리하다. 본 발명의 전략이 보다 높은 항체 라이브러리 다양화, 진핵 시스템을 통한 스크리닝 및 이론적 설계의 통합을 설명하기 때문에, 동정된 선도 분자는 상품화 가능성이 더 높다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 벡터의 고유/중요 특징이 표 1에 더 요약되어 있다.
| 본 발명의 파지미드 | 본 발명의 효모 벡터 - ScFv 디스플레이 | 본 발명의 효모 벡터 (양방향 바이-시스트론) | 본 발명의 효모 벡터 ( 일방향 바이 - 시스트론 ) | 본 발명의 효모 벡터 - 접합형 |
| 항체 Fab 라이브러리 개발을 위해 설계됨 | 항체 ScFv 개발을 위해 설계됨 | 항체 Fab 개발을 위해 설계됨 | 항체 Fab 및 ScFv 라이브러리 개발을 위해 설계됨 | 최종 항체 Fab 포맷을 디스플레이하기 위해 중쇄/경쇄를 독립적으로 수용함 |
| 안정성 및 고복제수 (High copy number)를 위해 설계됨 | 고발현 (high expression)을 위해 설계됨. 효모 내 복제수를 유지함 | 고발현을 위해 설계됨. 효모 내 복제수를 유지함 | 고발현을 위해 설계됨. 효모 내 복제수를 유지함 | 고발현을 위해 설계됨. 효모 내 복제수를 유지함. |
| 표면에 Fab의 독립적 및 개별적 표현 | 독점적 재조합 기반 형질 전환 도입 | 독점적 재조합 기반 형질 전환 도입 | 독점적 재조합 기반 형질 전환 도입 | 독점적 재조합 기반 형질 전환 도입 |
| 고유 제한 부위 및 항체 레퍼토리를 수용하기 위한 발현 카세트의 설계 | 독창적으로 설계된 발현 카세트 및 파지미드와 호환 가능한 조작된 다중 클로닝 부위 | 독창적으로 설계된 발현 카세트 및 파지미드와 호환 가능한 조작된 다중 클로닝 부위 | 독창적으로 설계된 발현 카세트 및 파지미드와 호환 가능한 조작된 다중 클로닝 부위 | 독창적으로 설계된 발현 카세트 및 파지미드와 호환 가능한 조작된 다중 클로닝 부위 |
| 백본 벡터의 큰 변경 없이 DNA 수준에서의 용이한 수정 가능 | 형질 전환 효율을 개선하기 위하여 추가된 특징 | 형질 전환 효율을 개선하기 위하여 추가된 특징 | 형질 전환 효율을 개선하기 위하여 추가된 특징 | 형질 전환 효율을 개선하기 위하여 추가된 특징 |
| 발현을 확인하기 위한 다중 태그 | 박테리아 내 증폭에 필요하고 향후 수정에 호환되는 보존된 유전적 요소를 유지함 | 박테리아 내 증폭에 필요하고 향후 수정에 호환되는 보존된 유전적 요소를 유지함. | 박테리아 내 증폭에 필요하고 향후 수정에 호환되는 보존된 유전적 요소를 유지함. | 박테리아 내 증폭에 필요하고 향후 수정에 호환되는 보존된 유전적 요소를 유지함. |
| 개선된 단백질 정제 | 항체 ScFv를 정제하기 위한 절단 태그 | 항체 Fab를 정제하기 위한 절단 태그 | 항체 Fab 및 ScFv를 정제하기 위한 절단 태그 | 항체 Fab를 정제하기 위한 절단 태그 |
| 약 1011 이상의 클론을 수용할 수 있는 디스플레이 시스템의 중요 부분 | 호환 가능한 디스플레이 시스템으로 >108의 클론 다양성을 수용함 | 호환 가능한 디스플레이 시스템으로 >108의 클론 다양성을 수용함 | 호환 가능한 디스플레이 시스템으로 >108의 클론 다양성을 수용함. | 호환 가능한 디스플레이 시스템으로 >108의 클론 다양성을 수용함 |
| 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 | 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 | 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 | 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 | 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 |
| 고처리량 분석 호환성 | 인비트로 분석에적합함. 고처리량 분석 호환성 | 인비트로 분석에적합함. 고처리량 분석 호환성 | 인비트로 분석에적합함. 고처리량 분석 호환성 | 인비트로 분석에적합함. 고처리량 분석 호환성 |
본 발명은 하기 실시예들을 참조하여 추가로 설명되며, 이는 본질적으로 단지 예시적일 뿐이고 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.본 발명/실시예에 사용된 모든 생물학적 물질들은 인도 밖에서 수득한 것이다.
실시예
사용된 재료:
본 실시예에 이르기 위하여 다음 재료들을 사용하였다:
1 Kb Ladder (Invitrogen, USA); 아가로스 (SIGMA, USA); 겔 용출 키트 (Qiagen, USA); 미니 프렙 키트 (Qiagen, USA); Taq 폴리머라제 (NEB, USA); dATP (NEB, USA); T4 DNA 리가아제 (NEB, USA); LB-한천, dam-/dcm- (NEB, USA), Neb5알파 (NEB, USA); 암피실린 (MP Biomedicals, USA); NcoI-HF, (NEB, USA); XbaI, (NEB, USA); HindIII-HF, (NEB, USA); AscI (NEB, USA); HindIII-HF, (NEB, USA); AscI (NEB, USA); NotI (NEB, USA), SpeI -HF (NEB, USA), SacII (NEB, USA), XhoI (NEB, USA); TG1 세포 (Lucigen, USA); T4 DNA 리가아제 (NEB, USA); PCR 정제 키트 (Qiagen, USA); LB-한천; 미니 프렙 키트 (Qiagen, USA); LB-브로스; 암피실린 (MP Biomedicals, USA); 카나마이신 (MP biomedicals, USA); 인퓨젼 HD (Clontech, USA); 글리세롤 (Fischer Scientific, USA); 덱스트로스 (Merck, USA); Cas-아미노산 (BD, USA); 효모 질소 베이스 (SIGMA, USA); 인산수소이나트륨(Di sodium hydrogen Phosphate) (SIGMA, USA); 갈락토스 (SIGMA, USA); YPD 브로스 (SIGMA, USA); Ura Trp 이중 드롭아웃 보충제 (Clontech,USA).
또한, 하기 벡터 컨스트럭트/벡터 백본을 인도의 Microbial Type Culture Collection and Gene Bank (MTCC)에 기탁하였다.
실시예
1
일반 벡터 설계 전략:
나이브 또는 면역 또는 합성 라이브러리와 같은 항체 라이브러리의 성공 여부는 다양해야 하는 독창적 설계 및 충분히 커야 하는 최종 라이브러리 크기에 전적으로 달려있다. 모든 항체 라이브러리 크기 & 다양성 및 항체 특이성 & 친화성은 직접적으로 연관되어 있다. 가변 경쇄 및 중쇄 레퍼토리 - 합성 또는 나이브의 중요 설계 외에도; 큰 레퍼토리를 수용하기 위한 시스템, 특히 다양한 발현 벡터의 개발이 매우 중요하다. 언급된 사실 외에도, 각 벡터의 유용성을 전략적으로 조정하는 것이 성공적인 라이브러리 생성 및 스크리닝을 위한 핵심 특징이다.
본 방법은 기타 특징/수정과 함께, 카파 및 람다 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 지정된 특정 수정을 갖는 Fab 포맷의 항체를 수용 및 발현하기 위한 2 개의 고유 파지미드 벡터의 개발을 포함한다.
개발된 벡터를 천연 공급원 및 합성적으로 설계된 공급원으로부터의 항체 레퍼토리를 수용하기 위하여 사용하였다. 나이브 또는 합성 파지 라이브러리를 생성한 후, 이들을 다양한 면역-종양 네트워크의 표적 항원을 스크리닝하기 위하여 사용하였다.
상기 방법은 별도의 단백질 디스플레이 기술에서 본 파지미드 및 효모 발현 플라스미드를 사용하여 나이브 및/또는 합성 라이브러리로부터 단백질/항체 유전자를 발현하는 것을 포함한다. 첫째, 파지 디스플레이 기술을 특정 항원에 대한 높은 내지 중간 정도의 친화성을 갖는 잠재적 항체 유전자를 클로닝 및 스크리닝하는 데 사용하였다. 이어서, 이들 유전자를 선도 분자의 추가적인 스크리닝 및 동정을 위해 효모 디스플레이 플라스미드로 전달하였다. 이들 두 상보적인 기술을 결합하면, 매우 다양한 항체 라이브러리를 스크리닝하고 특정 항원에 대한 새로운/선도 항체 분자를 개발할 수 있다. MCS I 및 MCS II에 사용된 제한 효소가 두 가지 발현 시스템에 관하여 동일하기 때문에, 파지로부터 효모 벡터로의 클론 집단의 원활한 전달은 효율적이다. 이들 신중하게 배치된 제한 효소 부위는, 중쇄가 임의의 효모 벡터의 MCS II로 재배치되는 한편 가변 경쇄의 선택된 집단을 파지미드의 MCS I로부터 임의의 효모 벡터의 MCS I으로 전달할 수 있도록 한다. 시스템 간 전달 외에, 시스템 내 전달, 즉 Fab에서 ScFv로 또는 그 반대로의 디스플레이 포맷 변경, 또는 동일한 포맷이지만 상이한 발현 벡터로의 전달, 예컨대 접합형 벡터로부터 바이-시스트론 벡터로의 전달은 MCS 기반 제한 효소의 각 세트를 통해 가능하다. 모든 가능한 시스템 및 포맷에서의 자유로운 전이는 중쇄 또는 경쇄의 무작위화를 제공하여 두 가지 디스플레이 시스템의 차이를 보완할 수 있도록 한다.
실시예
2
파지미드
벡터의 생성:
항체 라이브러리와 같은 매우 효율적이고 기능적으로 큰 단백질/펩티드 라이브러리를 수득하기 위하여, 다음과 같은 중요 사항을 고려하여야 한다: 1) 파지미드 벡터에서 PCR 증폭된 천연 풀 또는 인실리코 (in silico) 설계되고 합성적으로 개발된 분자 풀을 사용한 기능적이고 큰 항체 레퍼토리의 효율적 생성; 2) 적합한 스크리닝 방법과의 호환 가능성, 이어서 여러 차례의 특성화 실험을 위해 선택된 클론의 전달에 의하여 예시된 바와 같이, 선택된 클론의 신속한 하류 분석을 가능하게 하는 선택된 항체 포맷 및 호환 가능한 클로닝 & 발현 벡터.
Fab 포맷의 다수의 분자를 수용하기 위하여, 두 단계의 클로닝 방법을 채택하여 두 가지 유형의 삽입물, 즉 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 구축 수준에서 존재함을 확인하였다.
본원에서, 파지미드 벡터는 경쇄 (Ck 또는 CK & Cλ 또는 CL) 및 중쇄 (인간 IgG1-CH1 도메인) 둘 모두에 부착된 특정 인간 항체 불변 영역을 갖는 바이시스트론 오페론을 갖는다. 다른 필수적 특징들, 예컨대 리보솜 결합 부위, PelB 신호 서열, 다중 클로닝 부위 (경쇄 레퍼토리의 경우 MCS I 및 중쇄 레퍼토리의 경우 MCS II), FLAG 및 c-Myc 태그도 파지미드 벡터에 존재한다. 태그는 CH1 도메인의 연속과 연관되어 있으며 Fab 발현의 검출에 사용될 것이다. IgG1-CH1 도메인은 파지 외피 PIII 단백질, GeneIIIP와 연결되어 있다. Fab 디스플레이 포맷의 일부로서, 중쇄는 발현된 GeneIIIP 단백질을 통해 관련 형태로 파지상에 디스플레이되는 한편, 경쇄는 주변 세포질 (periplasm)로 분비되는 별도의 단편으로서 발현되고, 이는 중쇄와 쌍을 이루어 디스플레이 구성을 완성한다. 앰버 (amber) 종결 코돈 (TAG)은 항체 유전자와 파지 GeneIIIP 단백질 사이에 전략적으로 위치하여, 예시된 TG1 세포와 같이 E. coli의 비-억제자 (non-suppressor) 균주에서 Fab 단편의 생산을 가능하게 한다. 경쇄 가변 영역의 풀은 NdeI , BglII , HindIII 및 AscI 제한 부위로 구성되는 MCS I 영역으로 클로닝될 것인 한편, 중쇄 가변 영역은 NcoI , XbaI , NheI 및 NotI 부위를 함유하는 MCS II로 예정되어 있다. 상기 제한 효소들의 설계 및 사용은, 인간의 가변 중쇄 및 경쇄 코딩 영역 내 이들의 낮은 절단 가능성에 기초한다. 또한, 이들은 4 개 이상의 뉴클레오티드 중복을 만들어 최적의 클로닝 효율을 이끌어낸다. 효소들은 메틸화에 좌우되지 않으며, 권장 이중 분해에서의 이들의 효율은 90 % 이상이다. 이들 제한 부위는 효모 등의 다양한 발현 시스템에서 여러 벡터에 걸쳐 일정하게 유지된다. 클로닝 부위를 내내 유지하기 위하여, 효모 내 파지미드 및 후속 벡터에서 여러 가지 수정이 이루어졌다. 전술한 바와 같이, 이들 벡터는 나이브 및 합성 기원 둘 모두의 뉴클레오티드 서열의 풀을 수용하는 데 사용되며, 이로써 몇 가지 독특한 변화들이 도입되어 라이브러리 생성 프로세스 및 효모 내로의 후속적인 전달을 용이하게 하였다. 이들 변화는 또한 아미노산 조성 또는 번역 프레임을 변화시키지 않으면서 특정 제한 부위 또는 특정 펩티드를 감소시켰다.
벡터 백본 및 기타 개별 요소/서열에서 수행된 일부 수정은 다음과 같다:
1. NotI , EagI , SpeI , XmaI , SmaI , SfiI (SEQ ID No. 30, 2045 bp 내지 2106 bp)는 pADL23c 벡터로부터 제거된 제한 효소 중 일부이다 (도 1).
2. 벡터 백본의 EcoRI (SEQ ID No. 30, 2004 bp 내지 2009 bp) 및 BstXI (SEQ ID No. 30, 2116 bp 내지 2127 bp) 효소 부위를 수정하였다.
3. 특정 영역 (SEQ ID No. 30, 2108 bp 내지 2128 bp 및 SEQ ID No. 30, 2132 bp 내지 2161 bp)을 pADL23c 벡터 백본으로부터 제거하였다.
4. BamHI 제한 부위 (SEQ ID No. 30, 2754 bp 내지 2760 bp)를 GeneIIIP 단백질로부터 수정하였다.
5. BstEII (SEQ ID No. 27, 2882 bp 내지 2888 bp) Bsu36I (SEQ ID No. 27, 2779 bp 내지 2786 bp) 및 BbeI (SEQ ID No. 27, 2733 bp 내지 2738 bp) 효소 부위를 CH1 영역에서 수정하였다.
6. HindIII 부위를 c-Myc 태그로부터 수정하였다 (SEQ ID No. 2, 2958 bp 내지 2963 bp).
7. BlpI (SEQ ID No. 28, 2345 bp 내지 2351 bp)를 CK로부터 제거하였다.
전술한 변화 중 일부는 또한 본 발명의 도 1에도 강조되어 있다.
이해할 수 있는 바와 같이, 라이브러리 (나이브 또는 합성 항체 라이브러리)를 생성 및 스크리닝하는 첫 번째 단계가 되는 파지미드 벡터를 다양한 후속 프로세스를 염두에 두고 최대한 신중하게 설계하였다. 종합하여, 이는 스크리닝과 함께 라이브러리 구축 및 이동의 가장 효율적인 경로였다.
모든 수정 및 목표를 염두에 두고 고려하여, 삽입/발현 카세트를 카파 (도 2A 및 SEQ ID No. 1) 및 람다 (도 3A 및 SEQ ID No. 3)에 대해 설계하였고, 합성한 후, 삽입/발현 카세트의 선형화 및 클로닝 전에 여러 가지 수정의 대상이 되었던 시판하는 pADL23c 벡터 백본에 상기 삽입/발현 카세트를 도입하였다. pADL23c는 두 개의 상이한 파지미드 벡터의 생성을 위한 벡터 백본으로서 사용하였다. 이들 파지미드 벡터는 경쇄 불변 영역, 즉 카파 및 람다 경쇄 불변 영역으로 크게 구분될 것이다. 상동성 재조합에 기초한 접근법이 삽입/발현 카세트를 수정된 pADL23c 백본으로 클로닝하는 데 채택되었다. 합성된 카파-삽입 및 람다-삽입 컨스트럭트를 dam-/dcm- 세포로 형질 전환시키고, 각 DNA를 추가적인 분해를 위하여 qiagen의 미디 프렙 키트를 사용하여 대량으로 단리하였다. 카파 삽입물의 클로닝 전략은 람다 삽입물의 클로닝과 비교하여 약간 상이하였다. 약 10 ㎍의 pADL23c를 BamHI -HF 및 EcoRI-HF 효소를 사용하여 선형화하는 한편 약 5 ㎍의 삽입-카파를 SfiI 효소로 분해하였다. 다른 한편으로는, 약 5 ㎍의 람다-삽입물을 약 37℃에서 약 2 시간 동안 PvuI로 먼저 분해한 후, 약 37℃에서 약 2 시간 동안 SfiI를 첨가하여 목적하는 ~2.3 kb의 밴드 크기를 갖는 3 개의 밴드를 생성하였다. 선형화된 벡터 pADL23c 및 분해된 카파-삽입물 및 람다-삽입물을 겔 용출하였고 여기서 절제된 겔을 약 3 부피의 완충액 QX1 용액과 혼합하여 용해시켰다. 약 30 ㎕의 QIAEX II 비드를 30 초 동안 볼텍싱하여 첨가한 후 약 50℃에서 약 10 분 동안 배양하였다. 비드에 일련의 세척을 가하였으며; 먼저 약 500 ㎕의 QX1 및 이어서 약 500 ㎕의 PE 완충액으로 2 회 세척하였다. DNA를 약 30 ㎕의 뉴클레아제가 없는 (nuclease-free) 물로 용출하였다. 아래의 표 2-4는 pADL23c 벡터를 선형화하고 카파-삽입물 및 람다-삽입물 기반의 파지미드 벡터를 생성하는 데 사용되는 성분/시약들을 나타낸다.
| DNA (벡터/pADL23c) | 5 ㎍ |
| BamHI -HF (20U/㎕) | 2 ㎕ |
| EcoRI (20U/㎕) | 2 ㎕ |
| Cut smart 완충액 | 5 ㎕ |
| 물 | milli-Q 물의 개별 부피 |
| 총 | 50 ㎕ |
| DNA (카파_삽입) | 5 ㎍ |
| SfiI (20U/㎕) | 2 ㎕ |
| Cut smart 완충액 | 5 ㎕ |
| 물 | milli-Q 물의 개별 부피 |
| 총 | 50 ㎕ |
| DNA (람다_삽입) | 5 ㎍ |
| PvuII (20U/㎕) | 1 ㎕ |
| SfiI (20U/㎕) | 1 ㎕ |
| Cut smart 완충액 | 5 ㎕ |
| 물 | milli-Q 물의 개별 부피 |
| 총 | 50 ㎕ |
인퓨젼 반응을 벡터 및 삽입물, 즉 카파 및 람다 삽입물에 대해 셋업한 후 (표 5) 약 50℃에서 약 15 분 동안 배양하였다. 배양 후 약 2.5 ㎕의 인퓨전 (In-Fusion) 반응 혼합물을 50 ㎕의 Stellar 컴피턴트 세포에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 얼음상에서 약 30 분 동안 배양한 후, 형질 전환된 세포의 회수를 위해 약 500 ㎕의 SOC 배지를 첨가하였다. 세포를 암피실린이 있는 LB 한천 플레이트에 도말한 후 약 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날에 나타난 콜로니들을 5 mL LB-Amp에 접종하였고 플라스미드를 단리하였다. 단리된 플라스미드를 BamHI /EcoRI 및 NcoI / HindIII로 제한 효소 분해 분석하고 카파 삽입물의 존재를 확인한 반면 (도 2B & 2C), 람다 벡터의 경우, 클론을 PvuII , NcoI / HindIII -HF, NcoI / PvuII 및 NdeI/PvuII 단독으로 또는 각 조합으로 시험하였다 (도 3B & 3C). 양성 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다. 파지미드 벡터를 카파 삽입물을 갖는 pZB001-파지미드 (도 2D 및 SEQ ID No. 2) 및 람다 삽입물을 갖는 pZB001.1 파지미드 (도 3D 및 SEQ ID No. 4)로 명명하였다. 벡터 pZB001은 부다페스트 조약에 따라 MTCC 25125의 수탁 번호로 제출되었고 pZB001로 명명되었다. 또한, 경쇄 불변 영역을 갖는 파지미드 벡터 (람다 삽입-CL)는 전술한 실험 절차 및 기탁된 파지미드 벡터 (카파 삽입)의 세부 사항에 기초하여 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다.
| DNA (선형화된 벡터) | 91.8 ng | DNA (선형화된 벡터) | 91.8 ng |
| 삽입물 (카파) | 178.5 ng | 삽입물 (람다) | 299 ng |
| 5X In-Fusion HD Enzyme Premix | 2 ㎕ | 5X In-Fusion HD Enzyme Premix | 2 ㎕ |
| 물 | milli-Q 물의 개별 부피 | 물 | milli-Q 물의 개별 부피 |
| 총 | 10 ㎕ | 총 | 10 ㎕ |
서열 확인된 파지미드 벡터 pZB001 및 pZB001.1를 표적 항원에 대한 스크리닝/패닝을 위한 나이브 및 합성 파지 라이브러리를 생성하는 데 사용하였다. 라이브러리의 크기 및 다양성을 피어 그룹 및 차세대 시퀀싱 접근법 둘 모두에 의해 평가하였다. 패닝된 분자의 시퀀싱 결과로부터 패닝된 분자의 다양성이 유지된다는 것 또한 확인하였다. 단일 가닥 DNA를 패닝된 분자로부터 단리하고 효모 발현 벡터로 전달하였다.
실시예
3
효모 발현 벡터의 생성:
항체 디스플레이 라이브러리는 다른 세포 단백질에 연결된 세포 표면에서 발현되는 부분 또는 완전한 항체의 라이브러리를 나타낸다. 파지 디스플레이는 클로닝의 용이함으로 인해 가장 많이 받아들여지는 방법이고, 큰 라이브러리 크기, 1가 디스플레이를 허용하며 다양한 안정성 파라미터를 용이하게 결정할 수 있도록 한다. 그러나, 파지 디스플레이의 경우, 원핵 생물 발현 시스템 및 그에 의한 디스플레이된 항체 단편의 번역 후 수정 결여로 인하여, 적절한 단백질 폴딩에 대한 관련 한계점들이 존재한다. 이들 한계점을 극복하기 위하여, 효모 디스플레이 플랫폼, 즉 항체 단편을 단리하고 조작하기 위한 견고하고, 다목적이며, 정량적인 방법론이 사용된다. 효모, 즉 진핵 생물 디스플레이 시스템은 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)-분류 기술을 사용하는 정량 및 실시간 평가와 호환되므로 선택된다.
다른 인비트로 (in vitro) 디스플레이 기술들에 비하여, 응집소 (agglutinin) 접착 수용체 복합체 Aga1P 및 Aga2P를 사용하는 나이브/비-면역 항체 라이브러리의 효모 디스플레이는 상당한 이점을 가지고 있다. 예를 들어, 유동 세포 분석을 사용하면 K D 결정, K off 측정 및 효모 표면에 직접적으로 상호 배타적인 클론의 에피토프 결합을 비롯한 신속한 클론 특성화가 가능하다. 이렇게 하면 이들 특성화를 수행하기 위한 단백질 정제가 필요 없다. Fab 항체 단편의 효모 상에의 성공적인 디스플레이는 큰 라이브러리 구축에 대한 더 간단한 접근을 제안한다. Fab 단편이 중쇄 및 경쇄로 구성되어 있기 때문에, 상이한 효모 균주 내 상이한 벡터상에 두 폴리펩티드를 코딩하는 것이 가능하며, 여기서 두 사슬은 접합, 즉 고도로 효율적인 프로세스에 의해 단일 이배체 효모 내 결합될 수 있다. 그러나, 효모 디스플레이의 경우 주요 문제점은 효모에서의 보다 낮은 형질 전환 효율로 인한 상대적으로 더 작은 라이브러리 크기이며, 이는 파지 및/또는 효모 디스플레이의 조합 개념을 사용하는 본 발명의 측면에 의해 극복된다.
전술한 사실로부터 이해할 수 있는 바와 같이, 파지 패닝된 분자는 ScFv, Fab 등과 같은 다양한 포맷으로 조합적으로 또는 비조합적으로 다양한 효모 발현 벡터로 전달되어야 한다. 파지미드로부터 효모 벡터로의 편리한 전달을 위하여, 다중 클로닝 부위를 동일하게 유지하였다. 본원에서, 효모 발현 벡터는 경쇄 (Ck 또는 CK & Cλ 또는 CL) 및 중쇄 (인간 IgG1-CH1 도메인) 둘 모두에 부착된 특정 인간 항체 불변 영역을 갖는 바이시스트론 양방향성 또는 바이시스트론 일방향성을 갖는다. 선도 신호 서열 (경쇄의 경우 접합형 알파 인자; 중쇄의 경우 Aga2P 선도 펩티드), 다중 클로닝 부위 (경쇄 레퍼토리의 경우 MCS I 및 중쇄 레퍼토리의 경우 MCS II), 태그 (경쇄의 경우 V5 에피토프 태그 및 6xHis 태그; 중쇄 레퍼토리의 경우 FLAG 및 c-Myc 태그)와 같은 다른 중요한 특징들은 모든 종류의 효모 벡터에 존재한다. 태그는 불변 도메인의 연속과 연관되어 있으며 Fab 발현의 검출에 사용될 것이다. 표면 디스플레이에 의한 효모 라이브러리를 수득하기 위한 스크리닝은 경쟁적 항원 에피토프, 항체 파라토프 구조, 서열 및 서열 모티프 또는 이들의 임의의 조합을 사용함으로써 수행되어, 중쇄 내 태그 뒤에 전략적으로 위치한 담배 식각 바이러스 (Tobacco Etch Virus; TEV), 엔테로키나제 (Ek) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 절단 부위를 사용하여 Fab 또는 ScFv 분자를 단리한다.
개발되어 온 효모 벡터의 생성에 대한 접근 방식에는, 세 가지 유형이 존재한다: 1) 바이-시스트론 양방향 벡터; 2) 바이 시스트론 일방향 벡터 3) ScFv 벡터 및 4) 접합형 벡터.
(A) 효모
바이시스트론
양방향 벡터의 생성: (
pZB004
및
pZB004
.1)
효모 바이시스트론 양방향 벡터를 생성하기 위하여, pRS314벡터 (ATCC, USA)를 백본으로 사용하였다 (도 4). 벡터 백본 및 기타 개별 요소/서열에서 수행된 일부 수정은 다음과 같다:
1. SacI , SacII , EagI , NotI , SpeI , BamHI , XmaI , SmaI , PstI , EcoRI, EcoRV, SalI , XhoI , ApaI는 pRS314벡터로부터 제거된 제한 효소 중 일부이다 (SEQ ID No. 31, 1893 bp 내지 1989 bp, 도 4에 나타냄).
2. SpeI 부위 (SEQ ID No. 29, 2600 bp 내지 2605 bp)를 람다 경쇄 불변 영역 (CL)으로부터 손상시켰다.
또한, Gal1/10 프로모터, 알파 선도 펩티드, Aga2P 선도 펩티드, MCS I & II, 태그 (경쇄의 경우 V5 및 His-태그 및 중쇄의 경우 FLAG, c-Myc), 경쇄 (Ck 또는 Cλ) 및 중쇄 (인간 IgG1-CH1 도메인) 둘 모두에 부착된 각 불변 영역을 포함하는, 카파 (도 5A 및 SEQ ID No. 5) 및 람다 (도 6A 및 SEQ ID No. 7)에 대한 삽입/발현 카세트를 설계 및 합성하였다. SpeI 제한 부위는 Cλ 영역으로부터 제거하였다.
Fab 디스플레이 포맷의 일부로서, 중쇄는 발현된 Aga2P 단백질을 통해 연관된 형태로 효모 상에 디스플레이될 것인 한편 경쇄는 별도의 단편으로서 발현된다. 단백질 성숙 프로세스 중에, 이는 중쇄와 쌍을 이루어 Fab 디스플레이 구성을 완성한다. 별도의 터미네이터 서열은 중쇄의 경우 CYC1 터미네이터 및 경쇄의 경우 알파 터미네이터에 의해 예시된 바와 같이 유지되었다. 가용성 Fab을 사용한 추가적인 스크리닝 프로세스를 돕기 위하여, TEV 프로테아제 절단 부위를 태그 뒤 및 Aga2P 단백질 서열 앞에 고정시켰다. 단백질 구조에 유연성을 도입하기 위하여, (G4S)3 링커 영역이 Aga2P 단백질의 시작점 앞에 전략적으로 위치한다.
약 10 ㎍의 pRS314 벡터 및 삽입-카파-효모를 EcoRV 및 KpnI로 각각 약 37℃에서 밤새 분해한 후 (표 6), 겔 용출하였으며, 여기서 절제된 겔을 약 3 부피의 완충액 QX1 용액과 혼합하여 용해시켰다. 약 30 ㎕의 QIAEX II 비드를 약 30 초 동안 볼텍싱하여 첨가한 후 약 50℃에서 약 10 분 동안 배양하였다. 비드에 일련의 세척을 가하였으며, 먼저 약 500 ㎕의 QX1 및 이어서 약 500 ㎕의 PE 완충액으로 2 회 세척하였다. DNA를 약 30 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물로 용출하였다. 분해되고 용출된, 약 3 μg의 pRS314 및 삽입-카파-효모를 KpnI 및 EcoRV로 약 37℃에서 밤새 추가로 절단한 후, 각각 겔 용출 및 결찰을 셋업하였다.
[표 6a]
[표 6b]
| DNA (벡터) | 35.8 ng |
| DNA (카파-삽입-효모) | 76 ng |
| T4 DNA 리가아제 | 2 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10X) | 2 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 |
| 총 | 20 ㎕ |
결찰 셋업을 카파 벡터에 대하여 1:5의 비율로 개별적으로 수행한 후, TG1, 즉 고도의 컴피턴트 세포로 개별적으로 형질 전환시켰다. 개별 콜로니를 추출하고, 접종한 후, 플라스미드 DNA를 단리하고 PvuII 효소를 사용하여 제한 효소 분해를 셋업하였다. 확인된 클론은 ~4.3 Kb 및 ~2.9 Kb 단편의 밴드를 생성하였다 (도 5B). 양성 클론은 EcoRV / KpnI 및 NdeI / KpnI 효소를 각각의 조합으로 사용한 제한 효소 분해에 의해 추가로 확인하였으며, 여기서 전자는 ~3.7 Kb & ~3.5 Kb의 크기를 생성하였고, 후자는 ~5.5 Kb & ~1.8 Kb 단편을 생성하였다 (도 5C & D). 확인된 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다 (도 5E 및 SEQ ID No. 6). 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 확인된 효모 양방향 벡터는 부다페스트 조약에 따라 MTCC 25128의 수탁 번호로 MTCC에 제출되었고 pZB004로 명명되었다.
또한, 카파 삽입물을 갖는 상기 부착된 (deposited) 벡터 효모 바이시스트론 양방향 벡터를 사용하여, 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 효모 바이시스트론 양방향 벡터를 제조하였다. 10 μg의 확인되고 부착된 카파 벡터 (pZB004) 및 삽입-람다-효모 (SEQ ID No. 7)를 SpeI -HF/ SacII (표 8)로 분해한 후 약 4℃에서 밤새 겔 용출 및 결찰 (표 9)하여, 상기와 동일한 것을 제조하였다. 25 ng의 결찰 혼합물을 TG1 컴피턴트 세포로 형질 전환시켰다. 개별 콜로니를 접종하고, PvuII , NdeI / NotI 및 NcoI / AscI 효소로 삽입물 방출에 대해 스크리닝하였다 (도 6B). 양성 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다 (도 6C). 람다 경쇄 불변 영역을 함유하는 확인된 효모 바이시스트론 양방향 벡터는 pZB004.1 (SEQ ID No. 8)로 명명되었다.
| 벡터 | 삽입물 | |
| DNA | 10 ㎍ | 10 ㎍ |
| Cut smart 완충액 (10X) | 10 ㎕ | 10 ㎕ |
| SpeI -HF (20U/㎕) | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| SacII (20U/㎕) | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 | 물의 개별 부피 |
| 총 부피 | 100 ㎕ | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 51 ng |
| DNA (삽입물) | 74.6 ng |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10X) | 2 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 |
| 총 | 20 ㎕ |
(B) 효모
바이시스트론
일방향
벡터 (
pZB004
.2 및
pZB004
.
3)의
생성:
비조합
적 전달의 개념
효모 바이시스트론 일방향 벡터는 중쇄 및 경쇄를 Fab 포맷으로 발현하기 위한 2 개의 분리된 프로모터 옵션을 갖도록 설계되었다. 또한, 이 벡터의 독특한 구성은 파지 시스템으로부터 효모 시스템으로의 Fab 분자의 비조합적 전달을 허용할 것이다. 이는 진핵 생물 시스템 내 탐구할 중쇄 및 경쇄의 특정 조합을 차례로 보존할 것이다.
효모 바이시스트론 일방향 벡터를 생성하기 위하여, 부착된 효모 바이시스트론 양방향 벡터를 백본으로서 사용하였고, 여기서 2 개의 Gal1/10 프로모터 (경쇄 및 중쇄), 알파 선도 펩티드, Aga2P 선도 펩티드, MCS I & II, 태그 (경쇄의 경우 V5 및 His-태그 및 중쇄의 경우 FLAG, c-Myc), 경쇄 (CK 또는 CL) 및 중쇄 (인간 IgG1-CH1 도메인) 둘 모두에 부착된 각 불변 영역을 포함하는, 카파 (도 7A 및 SEQ ID No. 9) 및 람다 (도 8A 및 SEQ ID No. 11)에 대한 삽입물을 설계 및 합성하였다. 확인된 효모 바이시스트론 양방향 벡터 카파 및 람다를 합성된 카파 및 람다 삽입물과 함께 약 37℃에서 약 3 시간 동안 SpeI -HF 및 SacII 제한 효소로 분해하였다 (표 10). 분해된 벡터 (~4.8 Kb) 및 삽입물 (카파 및 람다, ~2.9 Kb)을 겔 용출하였고 결찰 반응 (표 11)을 약 4℃에서 밤새 셋업한 후 NEB 5-알파 컴피턴트 E.coli 세포에서 열충격 방법에 의해 형질 전환시켰다. 개별 콜로니를 접종하고, SpeI-HF/SacII 효소 (~2.9 Kb)로 삽입물 방출, 및 HindIII -HF 효소 (~1.7 Kb)로 내부 분해에 대해 스크리닝하였다 (도 7B 및 8B). 양성 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다 (도 7C & 8C). 카파 및 람다 경쇄 불변 영역을 함유하는 확인된 효모 일방향 벡터는 pZB004.2 (SEQ ID No. 10) 및 pZB004.3 (SEQ ID No. 12)로 각각 명명되었다.
| DNA (1 ㎍) | 3 ㎕ |
| SpeI-HF | 1 ㎕ |
| SacII | 1 ㎕ |
| 10X Cut Smart | 2 ㎕ |
| 물 | 13 ㎕ |
| 총 부피 | 20 ㎕ |
| 샘플 | 대조군 | |
| DNA (벡터) ~50ng | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) ~160ng | 4 ㎕ | 0 ㎕ |
| 10X T4 DNA 리가아제 완충액 | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| 물 | 개별 부피 | 개별 부피 |
| 총 부피 | 10 ㎕ | 10 ㎕ |
(C) 효모
ScFv
벡터의 생성:
pZB004
.4
효모 디스플레이 연구를 위해 생성된 또 다른 대체 벡터는 ScFv 분자와 호환 가능하였다. 이 컨스트럭트의 산물은 Fab 포맷과는 상이한 ScFv 포맷의 항체 분자이며, 여기서 중쇄 및 경쇄 모두에 대한 불변 영역은 제거되었다. 이 벡터는 pRS314 벡터 (ATCC, USA)로부터 유래된 컨스트럭트의 백본을 기반으로 한다 (도 9). 벡터 백본 및 기타 개별 요소/서열에서 수행된 일부 수정은 다음과 같다.
1. EagI , NotI , SpeI , BamHI , XmaI , SmaI , PstI , EcoRI, EcoRV , SalI , XhoI는 pRS314 벡터로부터 제거된 제한 효소 중 일부이다 (SEQ ID No. 31, 1904 bp 내지 1984 bp, 도 9에 나타냄).
벡터 백본 내 유전자는 ApaI 및 SacII 효소 사이에 설계 및 합성된 삽입/발현 카세트 (도 10A 및 SEQ ID No. 13)로 대체되었다. 상기 설계된 삽입물은 Gal1 프로모터, 뉴클레오티드 코딩 Aga2P 단백질 서열, Aga2P 선도 서열, 인자 Xa 부위, HA 태그, TEV 절단 부위, MCS I (경쇄 가변 영역 도입의 경우, NdeI , BglII , HindIII 및 AscI), 링커 영역 (G4S), MCS II (중쇄 가변 영역 도입의 경우, NcoI , XbaI, NheI 및 NotI), c-Myc 태그, FLAG 태그, 알파 터미네이터를 함유한다.
아래의 표 12 및 13에서 제공된 바와 같이, 약 10 ㎍의 벡터 및 삽입물을 약 25℃에서 밤새 ApaI로 분해한 후 약 37℃에서 약 3 시간 동안 SacII 효소를 첨가하였다. 분해된 재료를 겔 용출하고 약 4℃에서 밤새 결찰시켰다. 2 ㎕의 결찰된 혼합물을 NEB 알파 컴피턴트 세포로 형질 전환시켰다. 개별 콜로니를 접종하고 EcoRV/XhoI 효소 (~2.9 Kb)로 내부 분해에 대해 스크리닝하였다 (도 10B). 양성 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다 (도 10C). 중쇄 및 경쇄 도입 부위를 함유하는 확인된 효모 ScFv 벡터는 pZB004.4 (SEQ ID No. 14)로 명명되었다.
| 벡터 | 삽입물 | |
| DNA | 10 ㎍ | 10 ㎍ |
| Cut smart 완충액 (10X) | 10 ㎕ | 10 ㎕ |
| ApaI(20U/㎕) | 2 ㎕ | 2 ㎕ |
| SacII (20U/㎕) | 2 ㎕ | 2 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 | 물의 개별 부피 |
| 총 부피 | 100 ㎕ | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 106.8 ng |
| DNA (삽입물) | 161.2 ng |
| T4 DNA 리가아제 | 0.5 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10X) | 2 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 |
| 총 | 20 ㎕ |
(D) 효모 접합형 벡터 (
YMT
벡터)의 구축:
효모 표면 디스플레이 기술은 그의 효모 형질 전환 효율에서의 한계점들로 인해, 파지 (109 내지 1011) 또는 리보솜 (1011 내지 1012) 디스플레이 기술에 비하여 라이브러리 크기에 제약이 있다 (일반적으로 106 내지 108). 개선된 효모 형질 전환 방법은 이 한계점을 극복할 수 있다. 그러나, 다양한 개선된 효모 형질 전환 프로토콜은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 따라서 효모 접합은 큰 항체 라이브러리를 생성하기 위한 강력한 툴로서 사용될 수 있다. 효모 접합은 MATa 세포의 a-응집소 (agglutinin) 및 MATα 세포의 α-응집소와의 상호 작용을 통하여, 반대되는 접합형의 두 반수체 세포 간 세포 융합에 의해 달성된다. 접합 후, 각 반수체 세포 내의 2 개의 뚜렷한 플라스미드가 하나의 이배체 세포로 결합되어, 후속 이배체 세포에서 각 플라스미드로부터 코딩된 항체 단편을 동시에 발현한다. Fab 항체 단편은 2 개의 사슬을 포함한다; VH와 CH1 (중쇄 불변 영역의 제1 도메인)을 갖는 중쇄 (HC) 및 VL과 CL (경쇄 불변 도메인)을 갖는 경쇄 (LC). 따라서, 효모 접합은 HC 및 LC 라이브러리를 함유하는 반대되는 접합형의 두 반수체 세포로부터의 조합 Fab 라이브러리의 구축에 적합하다. CH1과 CL (경쇄 불변 도메인)의 두 C-말단 Cys 잔기 간의 이황화 결합 형성에 의하여, 분비된 LC의 효모 표면-고정 HC로의 헤테로다이머화는 효모 세포 표면의 디스플레이 Fab의 구축을 용이하게 한다.
(D.1)
사카로마이세스
세레비지애
(
Saccharomyces
cerevisiae
)에서의 접합형 중쇄 (HC) 발현 벡터 (
pZB002
)의 구축
접합형 중쇄 발현 벡터는 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에서 효모 세포 표면에 태그 및 TEV 절단 부위를 갖는 HC 사슬 (VH+CH1)을 발현하도록 설계되었다. 이 벡터에 존재하는 Aga2P 신호 서열은 HC 사슬을 분비 경로로 용이하게 한다. 파지 패닝된 분자들 (VH)을 파지미드로부터 HC 발현 벡터로 전달하는 데에는 다양한 제한 부위들의 조합이 중요하다. 이를 달성하기 위하여, 고유 제한 부위들 (NcoI , BmtI , NheI , NotI)은 Aga2P 신호 서열 및 CH1 오픈 리딩 프레임 사이에 유지된다. 유동 세포 스크리닝 동안 HC 사슬을 검출하기 위하여 myc 및 FLAG 태그의 존재가 제공된다. Fab 단편 형태의 효모 세포 표면을 절단하기 위하여, 고도의 서열-특이적 시스테인 프로테아제인 담배 식각 바이러스 프로테아제 (TEV) 및 엔테로키나제 (EK) 부위들이 HC 발현 벡터에 도입된다.
접합형 중쇄 HC 벡터 (pZB002)의 구축에 있어서, p414GAL1 및 HC DNA 카세트 (SEQ ID No. 15)를 사용하였다. HC DNA 카세트를 수용하기 위하여, ATCC (Cat. No. ATCC® 87328TM)의 TRP1 마커를 갖는 CEN-기반 셔틀 벡터인 p414 GAL1을 수정하였다. 상기 수정을 도 11에 제공하였으며, 아래에 요약하였다:
1) BamHI , SmaI , PstI , EcoRI, BspDI , SalI , TspMI , ClaI , HincII 및 XmaI 제한 부위가 수정되었다. 상기 언급된 제한 부위를 수정하기 위하여, 2208 bp 내지 2158 bp의 뉴클레오티드를 p414 GAL1으로부터 제거하였다 (SEQ ID No. 32 및 도 11).
HC DNA 카세트 (SEQ ID No. 15)는 고유 AGA2P 단일 서열 코딩 영역, 다중 클로닝 부위 (NcoI , BmtI , NheI , NotI), 마지막 위치에 손상되지 않은 시스테인 잔기를 갖는 중쇄 불변 영역1 (CH1), 이어서 태그 (c-myc 및 FLAG), C-말단의 AGA2P 오픈 리딩 프레임과 융합된 TEV 절단 부위로 구성된다. HC DNA 카세트는 Gene Art를 통해 합성하였다. HC DNA 카세트 (도 12A) 및 p414 GAL1을 37℃에서 SpeI 및 XhoI로 분해하고 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB002를 생성하였다 (도 12B). 합성된 pZB002 HC 발현 벡터는 수탁 번호 MTCC 25126으로 MTCC에 기탁되었다. HC DNA 카세트는 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에 있다. 고유 NcoI , BmtI , NheI 및 NotI 부위는 AGA2P 신호 서열 뒤에 유지되어, pZB002에서 파지 패닝된 라이브러리로부터 수용된 VH 부위를 클로닝하였다.
| DNA p414 GAL1 또는 HC 카세트 | ~3 ㎍ |
| SpeI | 3 ㎕ |
| XhoI | 3 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) | 5 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 2 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB002의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다 (도 12C 및 SEQ ID No. 16).
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| AGA2P 신호 서열 | 중쇄의 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NcoI, BmtI, NheI, NotI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VH의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 CH1 | 중쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 경쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| FLAG 및 c-myc 에피토프 | 항 flag 또는 항 myc 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| TEV 절단 부위 | 효모 세포 표면으로부터 Fab 포맷 항체 절단 가능 |
| AGA2P 코딩 서열 | 효모 세포 표면에 중쇄-Aga2p 융합 단백질 부착 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| TRP1 유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.2)
사카로마이세스
세레비지애에서의
접합형
경쇄
(
LCλ
) 발현 벡터 (pZB003.1)의 구축:
접합형 경쇄 발현 벡터는 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에서 효모 세포 표면에 태그를 갖는 LC 사슬 (VL+LCλ)을 발현 및 분비하도록 설계되었다. 이 벡터에 존재하는 접합 알파 인자 단일 서열 (pre 영역)은 LC 사슬을 분비 경로로 용이하게 한다. 파지 패닝된 분자들 (VL)을 파지미드로부터 HC 발현 벡터로 전달하는 데에는 다양한 제한 부위들의 조합이 중요하다. 이를 달성하기 위하여, 고유 제한 부위들 (NdeI , BglII , HindIII 및 AscI)은 접합 알파 인자 단일 및 LCλ 오픈 리딩 프레임 사이에 유지된다. 유동 세포 스크리닝 동안 V5 및 His 태그의 존재가 제공되어 LCλ 사슬을 검출한다.
p416 GAL1은 ATCC (ATCC®87332TM)의 URA3 마커를 갖는 CEN-기반 셔틀 벡터이다 (도 13). 이는 상이한 신호 서열을 갖는 몇 개의 경쇄 컨스트럭트를 생성하는 데 사용되었다. 상기 p416 GAL1 벡터 백본을 도 13에 제시된 바와 같이 수정하였으며, 아래에 요약하였다:
1) BamHI , SmaI , XmaI , TspMI , EcoRI, HindIII , BspDI , ClaI 및 SaII 제한 부위가 수정되었다. 상기 언급된 제한 부위를 수정하기 위하여, 2318 bp 내지 2268 bp의 뉴클레오티드를 p416 GAL1으로부터 제거하였다.
SS01에 기초한 LCλ의 분비 플라스미드의 구축을 위하여, 수정된 p416 GAL1 및 LCλ DNA 카세트 (SEQ ID No. 19)를 사용하였다. LCλ 카세트는 알파 인자 단일 서열 (SS01), 고유 다중 클로닝 부위 (NdeI , BglII , HindIII 및 AscI) 및 마지막 위치에 손상되지 않은 시스테인 잔기를 갖는 경쇄 불변 영역 (LCλ), 이어서 태그 (V5 및 His)로 구성된다. LCλ DNA 카세트 (도 14A)는 Gene Art를 통해 합성하였다. 수정된 p416 GAL1 및 LCλ를 37℃에서 SpeI 및 XhoI로 분해하고 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003.1을 생성하였다 (표 18 및 19; 도 14B). LCλ DNA 카세트는 pZB003.1 벡터 내 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에 있게 된다. 고유 NdeI , BglII, HindIII 및 AscI 부위는 SS01 신호 서열 뒤에 유지되어, pZB003.1 벡터에서 파지 패닝된 라이브러리로부터 VL 영역을 클로닝하였다 (도 14C). 생성된 pZB003.1 벡터는 SEQ ID No. 20으로 제공된다.
| DNA (p416 GAL1 또는 LCλ DNA) | ~3 ㎍ |
| SpeI | 3 ㎕ |
| XhoI | 3 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | ~3 ㎍ |
| DNA (삽입물) | 3 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 3 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
아래는 pZB003.1의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표 19이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| 알파 접합 인자 1 분비 신호 서열 | 경쇄의 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VL의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCλ | λ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.3)
사카로마이세스
세레비지애에서의
SS01 신호 서열을 갖는 접합형
경쇄
(LCκ) 발현 벡터 (pZB003.2)의 구축:
접합형 경쇄 발현 벡터는 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에서 효모 세포 표면에 태그를 갖는 LC 사슬 (VL+LCκ)을 발현 및 분비하도록 설계되었다. 이 벡터에 존재하는 접합 알파 인자 단일 서열 (pre 영역)은 LC 사슬을 분비 경로로 용이하게 한다. 파지 패닝된 분자들 (VL)을 파지미드로부터 HC 발현 벡터로 전달하는 데에는 다양한 제한 부위들의 조합이 중요하다. 이를 달성하기 위하여, 고유 제한 부위들 (NdeI , BglII , HindIII 및 AscI)은 접합 알파 인자 단일 및 LCκ 오픈 리딩 프레임 사이에 유지된다. 유동 세포 스크리닝 동안 V5 및 His 태그의 존재가 LCκ 사슬을 검출한다.
SS01에 기초한 LCκ의 분비 플라스미드의 구축을 위하여, 수정된 p416 GAL1 및 SS01-LCκ DNA (SEQ ID No. 21) 카세트를 사용하였다. p416 GAL1은 ATCC (ATCC® 87332TM)의 URA3 마커를 갖는 CEN-기반 셔틀 벡터이다. LCκ 카세트는 접합 알파 인자 단일 서열 (SS01), 고유 다중 클로닝 부위 (NdeI , BglII , HindIII 및 AscI), 마지막 위치에서 손상되지 않은 시스테인 잔기를 갖는 경쇄 불변 영역 (LCκ), 이어서 태그 (V5 및 His)로 구성된다. LCκ 카세트 (도 15A)는 Gene Art를 통해 합성하였다. p416 GAL1 및 LCκ를 약 37℃에서 SpeI 및 XhoI로 분해하고 약 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003.2 벡터를 생성하였다 (표 21 및 22; 도 15B). LCκ DNA 카세트는 pZB003.2 내 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에 있게 된다. 고유 NdeI , BglII, HindIII 및 AscI 부위는 SS01 신호 서열 뒤에 유지되어, pZB003.2 벡터에서 파지 패닝된 라이브러리로부터 VL 영역을 클로닝하였다 (도 15C). 합성된 pZB003.2 벡터는 SEQ ID No. 22로 제공된다.
| DNA (p416 GAL1 또는 LCκ DNA) | ~3 ㎍ |
| SpeI | 3 ㎕ |
| XhoI | 3 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) | 5 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 2 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB003.2의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| 알파 접합 인자 1 분비 신호 서열 | 경쇄의 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VH의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCκ | κ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.4)
사카로마이세스
세레비지애에서의
SS02 신호 서열을 갖는 접합형
경쇄
LCκ 발현 벡터 (pZB003)의 구축:
LC 사슬의 분비를 원활하게 하기 위하여, SS02 신호 서열을 접합 인자 알파 1 신호 서열 (pre 영역)의 위치에 도입하였다. SS02는 pre 및 pro 영역을 비롯한 조적된 접합 인자 알파 인자 1 신호 서열이며, appS4로 불린다. appS4는 pre 및 pro 영역을 비롯한 접합 인자 알파 1 신호 서열보다 16배 더 우수한 분비 능력을 가지는 것이 이전에 입증되었다.
SS02에 기조한 LCκ의 분비 플라스미드의 구축를 위하여, pZB003.2 및 SS02-LCκ 카세트 (도 16A) (SEQ ID No. 17)를 사용하였다. SS02 DNA 카세트는 조작된 알파 인자 단일 서열 (appS4) 코딩 영역을 함유한다. SS02 DNA 카세트는 Gene Art를 통해 합성하였다. pZB003.2 및 SS02-LCκ를 약 37℃에서 SpeI 및 HindIII로 분해하고 약 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003을 생성하였다 (표 24 및 25; 도 16B). 합성된 pZB003 벡터 (도 16C)는 SEQ ID No. 18로 제공되며, 수탁 번호 MTCC 25127로 MTCC에 기탁되었다.
| DNA (pZB003.2 또는 SS02-LCκ 카세트의 유도체) | ~4 ㎍ |
| HindIII | 4 ㎕ |
| AscI | 4 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) | 7 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 0 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB003의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| 조작된 알파 인자 단일 서열 (appS4) 신호 서열 | 야생형 알파 접합 인자 1보다 단백질을 16 배 이상 효율적으로 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VL의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCκ | κ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.5)
사카로마이세스
세레비지애에서의
SS03 신호 서열을 갖는 접합형
경쇄
LCκ 발현 벡터 (pZB003.3)의 구축:
LC 사슬의 분비를 원활하게 하기 위하여, SS03 신호 서열을 접합 인자 알파 1 신호 서열 (pre 영역)의 위치에 도입하였다. SS03은 pre 및 pro 영역을 비롯한 조적된 접합 인자 알파 인자 1 신호 서열이며, app8로 불린다. app8은 pre 및 pro 영역을 비롯한 접합 인자 알파 1 신호 서열보다 16배 더 우수한 분비 능력을 가진다.
SS03에 기조한 LCκ의 분비 플라스미드의 구축를 위하여, pZB003.2 및 SS03-LCκ DNA (SEQ ID No. 23)를 사용하였다. SS03 DNA 카세트는 조작된 알파 인자 단일 서열 (app8) 코딩 영역을 함유한다. pZB003.2 및 SS03-LCκ DNA를 약 37℃에서 SpeI 및 HindIII로 분해하고 약 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003.3을 생성하였다 (표 27 및 28; 도 17A & B). 합성된 pZB003.3 벡터 (도 17C)는 SEQ ID No. 24로 제공된다.
| DNA (pZB003.2 또는 SS03-LCκ DNA의 유도체) | ~4 ㎍ |
| HindIII | 4 ㎕ |
| AscI | 4 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) | 7 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 0 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB003.3의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| 조작된 알파 인자 단일 서열 (app8) 신호 서열 | 야생형 알파 접합 인자 1보다 단백질을 16 배 이상 효율적으로 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VL의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCκ | κ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.6)
사카로마이세스
세레비지애에서의
SS04 신호 서열을 갖는 접합형
경쇄
LCκ 발현 벡터 (pZB003.4)의 구축:
LC 사슬의 분비를 원활하게 하기 위하여, SS04 신호 서열을 접합 인자 알파 1 신호 서열 (pre 영역)의 위치에 도입하였다. SS04는 효모 내 다양한 단백질에 대한 분비 능력을 갖는 Suc2p 신호 서열이다.
SS04에 기초한 LCκ의 분비 플라스미드의 구축를 위하여, pZB003.2 및 SS04 DNA-LCκ 카세트 (SEQ ID No. 25) 를 사용하였다. SS04 DNA 카세트는 Suc2p 신호 서열 코딩 영역을 함유한다. pZB003.2 및 SS04 DNA-LCκ를 약 37℃에서 SpeI 및 HindIII로 분해하고 약 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003.4를 생성하였다 (표 30 및 31; 도 18A & B). 합성된 pZB003.4 벡터 (도 18C)는 SEQ ID No. 26으로 제공된다.
| DNA (pZB003.2 또는 SS04 DNA-LCκ의 유도체) | ~4 ㎍ |
| HindIII | 4 ㎕ |
| AscI | 4 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (벡터) | 7 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 0 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB003.4의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| Suc2p 신호 서열 | 단백질의 효율적인 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VL의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCκ | κ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
실시예
3항체
라이브러리의 생성 및
파지미드로부터
효모 접합 벡터로의 라이브러리의 전달
파지미드 벡터 (각각 카파 pZB001 및 람다 pZB001.1)와 함께 건강한 인간 기증자로부터의 나이브 레퍼토리를 나타내는 2차 PCR 풀의 카파 및 람다 경쇄 5 ㎍을 약 37℃에서 밤새 HindIII -HF 및 AscI로 약 100 ㎕의 총 부피에서 분해하였다. 분해된 샘플을 겔 용출한 후 약 4℃에서 밤새 결찰하였다. 25-50 ng의 결찰 혼합물을 일렉트로포레이션을 통해 약 25 ㎕의 TG1 세포로 형질 전환시켰으며, 여기서 1.0 mm의 큐벳을 최적의 설정인 1800 볼트, 600 ohm 및 10 μF로 사용하였다. 회수 배지에서의 회수 후, 약 200 ㎕의 형질 전환 세포를 144 mm 플레이트에 도말하고 약 37℃에서 밤새 배양하였다. 총, 약 6-8 개의 플레이트가 존재하며, 다음 날 이들 플레이트로부터 콜로니를 긁어 내고, 약 20%의 글리세롤로 스톡을 제조하였다. 형질 전환 효율은 희석 플레이팅에 의해 계산하였으며, 약 108 내지 약 1010의 범위, 바람직하게는 ~108인 것으로 밝혀졌다.
희석 플레이팅을 통해 글리세롤 스톡의 바이알 당 총 세포 수를 결정하였으며, 1012인 것으로 밝혀졌다. 콜로니를 약 5 mL LB-Amp에 접종하고 플라스미드를 단리하였다. 단리된 플라스미드를 제한 효소 분해 분석을 위해 검사하였다. ~300 bp의 삽입물 방출로 경쇄, 즉 풀 내 카파 및 람다 둘 모두의 존재를 확인하였다.
일 바이알의 경쇄 풀 (카파 및 람다 모두)을 약 100 mL의 LB-Amp에 접종하고 약 37℃의 쉐이커-인큐베이터에서 약 2-3 시간 동안 성장시킨 후, qiagen 미디 프렙 키트에 의해 제조사의 프로토콜에 따라 플라스미드를 단리하였다. 경쇄 둘 모두에 대한 미디 프렙 (prepped) DNA는 중쇄가 도입되기 전에 제한 효소 분해 분석으로 확인되었다. 대표 클론들 중 일부는 플라스미드 단리에 사용하였고 이는 ~100%의 경쇄 삽입물 존재를 나타내는 제한 효소 분해에 의해 확인되었다. 별도의 미디 프렙은 경쇄, 즉 풀의 카파 및 람다 둘 모두의 라이브러리 DNA를 단리하기 위해 수행되었다. 미디 프렙 DNA는 중쇄 풀의 추가적인 삽입을 위한 사용 전에 제한 효소 분해를 통해 다시 확인되었다.
중쇄의 2차 PCR 풀과 함께 카파 및 람다 경쇄 라이브러리 DNA 약 5μg을 약 37℃에서 밤새 NcoI 및 XbaI로 약 100 ㎕의 총 부피에서 분해하였다. 분해된 샘플을 겔 용출한 후 약 4℃에서 밤새 결찰하였다. 25-50 ng의 결찰 혼합물을 일렉트로포레이션을 통해 25 ㎕의 TG1 세포로 형질 전환시켰으며, 1.0 mm의 큐벳을 최적의 설정인 1800 볼트, 600 ohm 및 10μF로 사용하였다. 회수 배지에서의 회수 후, 약 200 ㎕의 형질 전환 세포를 144 mm 플레이트에 도말하고 약 37℃에서 밤새 배양하였다. 총, 6-8 개의 플레이트가 존재하며, 다음 날 이들 플레이트에서 콜로니를 긁어 내고, 약 20%의 글리세롤로 스톡을 제조하여 -80℃의 냉동고에 보관하였다. 형질 전환 효율은 희석 플레이팅에 의해 계산하였으며, 약 108 내지 약 1010의 범위, 바람직하게는 ~108인 것으로 밝혀졌다.
희석 플레이팅을 통해 글리세롤 스톡의 바이알 당 총 세포 수를 결정하였으며, 1012인 것으로 밝혀졌다. 콜로니를 5 mL LB-Amp에 접종하고 플라스미드를 단리하였다. 단리된 플라스미드를 중쇄의 경우 NcoI 및 XbaI 및 카파 & 람다 경쇄의 경우 HindIII 및 AscI로 제한 효소 분해 분석을 위해 검사하였다. ~400 bp의 삽입물 방출로 카파 풀 (도 19A & B) 및 람다 풀 (도 20A & B) 내 중쇄의 존재를 확인하였다.
DNA 라이브러리를 함유하는 카파 및 람다 경쇄 2차 PCR 풀과 함께 중쇄를 NcoI 및 XbaI로 각각 분해한 후, TG1, 즉 고도의 컴피턴트 E. coli 세포로 각각 결찰 및 형질 전환시켰다.
약 1 ml의 카파 및 람다 박테리아 글리세롤 스톡을 약 37℃에서 600 nm OD가 0.8에 도달할 때까지 약 200 ml LB-AMP 배지로 성장시켰다. 또한, 박테리아에 대한 감염다중도 (multiplicity of infection; MOI)가 10인 M13KO7 헬퍼 파지를 첨가하고 약 37℃에서 30 분 동안 더 배양하였다. 감염 후, 감염된 박테리아를 원심 분리하고 그 펠렛을 100 μg/ml 암피실린 및 25 μg/ml 카나마이신을 함유한 LB 약 200 ml에 재현탁한 후, 약 30℃에서 밤새 250 rpm으로 성장시켰다. 현탁액을 약 4℃에서 약 15 분 동안 약 8000 rpm으로 스핀다운시킨 후 펠렛을 버렸다. 분리된 상층액을 상층액 ¼ 부피의 PEG/NaCl 용액과 혼합하고 그 혼합물을 약 1 시간 동안 얼음상에서 배양하였다. 상기 혼합물을 10000 g에서 약 15 분 동안 원심 분리하고 그 파지 펠렛을 PBS 약 20 ml로 재현탁하였다. 글리세롤을 전체 파지 현탁액에 최종 농도 50%로 첨가하고 파지 라이브러리 스톡으로서 약 -80℃에서 약 1 ml의 부분 표본 (aliquots)으로 동결시켰다.
카파 및 람다 박테리아 라이브러리 둘 모두의 글리세롤 스톡을 혼합 및 접종하였으며, 파지 라이브러리의 생성에 사용하였다. 헬퍼 파지를 첨가함으로써, 다양성을 디스플레이하는 파지 입자는 침전 및 정제되어, 향후 사용을 위한 글리세롤 스톡으로서 저장하였다. 플라크 형성 분석으로부터 유도된 파지 라이브러리의 추산된 수는 약 1010 내지 약 1011, 바람직하게는 ~1011 pfu/mL인 것으로 밝혀졌다. 플라크의 형성은 Her2 항원에 대해 스크리닝될 Fab 단편을 디스플레이하는 파지미드 라이브러리의 기능성을 나타낸다. 패닝 실험을 수행하여 비결합자 (non-binders)를 나이브 풀로부터 제거한 후 플라크 형성 분석을 수행하여 결합자의 수를 측정하였다. 결합자의 추정치는 성공적인 패닝을 나타내는, 초기 파지 수보다 4 디케이드 더 낮은 ~107인 것으로 밝혀졌다.
전체 전략의 계획은 효모 시스템에서 스크리닝 및 분류를 수행하기 위하여 특정 결합자를 파지로부터 효모 발현 벡터로 전달하는 것이다. 친화성 기반 방법을 호환 가능한 방법, 즉 FACS를 사용하여 수행하였으며 최상의 결합자를 추가로 선택하고 등급을 매겼다. 패닝된 파지를 증폭시키고 ssDNA를 단리한 후, 효모 접합형 벡터에 도입하기 위해 PCR 증폭시켰다; 중쇄 및 경쇄 도입을 위함. Fab 라이브러리를 접합 시스템을 이용하여 개발하였으며, 여기서 경쇄 라이브러리 및 중쇄 라이브러리는 상이한 효모 발현 벡터에 클로닝된다. 그러나, 경쇄에 대해 독점적으로 설계 및 생성된 인하우스 효모 발현 벡터 (pZB003.1 & pZB003.2)와 함께 패닝된 분자의 카파 및 람다 경쇄 PCR 풀을 HindIII 및 AscI로 분해한 후, TG1, 즉 고도의 컴피턴트 세포로 각각 결찰 및 형질 전환시켰다. 이와 마찬가지로, HC 사슬 풀 및 각 벡터 (pZB002)를 NcoI 및 NotI로 분해한 후, TG1, 즉 고도의 컴피턴트 세포로 결찰 및 형질 전환시켰다. 중쇄 및 경쇄 패닝된 라이브러리 둘 모두에 대해 얻어진 형질 전환 효율은 >107 cfu이었다. 글리세롤 스톡 제조를 위해 긁어 내기 전에, 중쇄 및 경쇄 라이브러리 둘 모두에 대해 수득된 형질 전환된 콜로니들을 경쇄의 경우 HindIII/AscI (도 21A) 및 중쇄의 경우 NcoI / NotI (도 21B)를 사용하여 삽입물 방출에 대해 검사하였다. 두 사슬에 모두에 대한 삽입물 방출로 패닝된 분자의 존재를 확인하였다. 글리세롤 스톡은 향후 사용을 위하여 -80℃에서 저장하였다.
검증시, 약 1 μg의 각 DNA를 채취하여 일렉트로포레이션의 방법으로 ~5 x 106-2 x 107 cells/ml의 효모 세포로 형질 전환시켰다. 형질 전환을 위한 균주와 관련하여, EBY100은 중쇄 라이브러리의 세포 표면 디스플레이를 위한 숙주로서 사용된 한편, YVH10은 경쇄 라이브러리를 발현하는 데 사용된다. 형질 전환 후, 플레이트들을 약 30℃에서 2-4 일 동안 배양하여 형질 전환체를 성장시켰다. 중쇄 및 경쇄 패닝된 라이브러리 둘 모두를 >106의 효율로 효모 균주 (EBY100-ura3Δ 및 YVH10)로 성공적으로 형질 전환시켰다.
표면에 라이브러리의 Fab 포맷을 디스플레이하기 위하여, 중쇄 및 경쇄 라이브러리를 나타내는 2 개의 성장한 반수체 세포의 접합을 동일한 수의 반수체 세포를 혼합함으로써 수행하였다. 접합 효율은 이중-선택 플레이트에서의 이배체 콜로니 수를 단일 선택 플레이트에서의 총 콜로니 수로 나눔으로써 계산하였으며, 여기서 계산된 접합 퍼센트는 ~40%이었다. 또한, 이배체 세포를 임의의 성장 및 발현 분석 전에 이중 드롭아웃 배지 (ura-, Trp-)에서 농축하였다.
중쇄 풀 및 경쇄 카파 풀을 발현하는 플라스미드를 갖는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 2N 라이브러리를 10 ml의 SDCAA 이중 드롭아웃 배지에 접종하고 약 30℃에서 밤새 (16-20 시간) 성장시켰다. 밤새 성장한 배양물의 600 nm OD를 측정하고 약 10 ml의 SDCAA 이중 드롭아웃 글루코스 배지 (비유도 배양물) 및 약 10 ml의 2XSGCAA 배지 (유도된 배양물)에 600 nm 최종 OD가 0.2 내지 0.3이 되도록 접종하였다. 비유도 세포 및 유도된 세포를 약 20℃에서 24 시간 내지 48 시간에 이르는 범위 내 상이한 시간 동안 성장시켰다.
경쇄 및 중쇄의 발현은 상당한 퍼센트로 관찰되었다. 경쇄 발현은 항-His 항체에 의해 탐침 (probed)되고 >7%로 밝혀진 한편 (도 22A), 중쇄는 항-c-Myc 항체로 탐침되고 비오틴화된 Her2를 사용한 이중 양성 사분면에서 7.2%의 비율로 나타남이 밝혀졌다 (도 22B). 이 결과는 Fab 형성 및 이와 표적 항원과의 성공적인 결합을 나타낸다. 이 결과는 듀얼 영양요구성 마커 선택된 이배체가 중쇄와 관련된 경쇄를 발현함을 나타낸다. 클론의 파지로부터 효모 시스템으로의 성공적인 전달, 이어서 Fab의 발현 및 그의 Her2 항원과의 결합은 본 발명의 효모 벡터 및 파지미드의 기능성 및 효율성을 입증한다.
이와 유사하게, 상기 접근법은 또한 합성 항체/레퍼토리로부터 얻어진 가변 경쇄 (카파 및 람다 경쇄) 및 중쇄 영역을 사용하여 수행될 수도 있다.
실시예
4
효모
scFv
벡터를 사용한 항체 라이브러리의 생성 및 스크리닝
또 다른 효모 발현 컨스트럭트, 즉 효모 ScFv 발현 컨스트럭트 (pZB004.4)를 항-Her2 ScFv 유전자 서열의 발현 및 Her2 항원과의 결합에 대해 시험하였다. 항-Her2 유전자, VH 및 VL을 pZB004.4 벡터의 NdeI / AscI 및 NcoI / NotI 효소 사이의 MCS I 및 II에 각각 클로닝하였다. 클론을 효모 EBY100으로 형질 전환시킨 후 발현을 유도하고 전술한 바와 같이 결합 연구를 수행하였다. 유도된 효모 세포의 유동 세포 분석은 Her2 항원과의 상호 작용을 밝혀냈다. 유동 세포 분석은 스트렙타비딘 Alexa 633 접합체 (conjugate)로 검출되는, 비오틴화된 Her2 항원으로 수행되었다. 또한, 항 c-myc 항체 (alexa flour 488, 접합체)를 사용하여 C-말단의 c-myc 태그 발현을 검출하였다. 그 결과는 효모 세포 표면에서 항 Her2 ScFv 분자의 발현을 나타내는 뚜렷한 이중 양성 형광 신호를 밝혀냈다 (도 23).
종합하여, 본 발명은 단백질 디스플레이 기술에서 본 파지미드 및 효모 발현 플라스미드를 사용하여 나이브 및/또는 합성 라이브러리로부터 단백질/항체 유전자를 발현하는 것에 관한 것이다. 첫째, 파지 디스플레이 기술을 특정 항원에 대한 높은 내지 중간 정도의 친화성을 갖는 잠재적 항체 유전자를 클로닝 및 스크리닝하는 데 사용하였다. 이어서, 이들 유전자를 선도 분자의 추가적인 스크리닝 및 동정을 위해 효모 디스플레이 플라스미드로 전달하였다. 이들 두 상보적인 기술을 결합하면, 매우 다양한 항체 라이브러리를 스크리닝하고 특정 항원에 대한 새로운/선도 항체 분자를 개발할 수 있다. MCS I 및 MCS II에 사용된 제한 효소가 두 가지 발현 시스템에 관하여 동일하기 때문에, 파지로부터 효모 벡터로의 클론 집단의 원활한 전달은 효율적이다. 이들 신중하게 선택된 제한 효소는, 중쇄가 임의의 효모 벡터의 MCS II로 재배치되는 한편 가변 경쇄의 선택된 집단을 파지미드의 MCS I로부터 임의의 효모 벡터의 MCS I으로 전달할 수 있도록 한다.
또한, 나이브 및/또는 합성 항체로부터의 가변 중쇄 및 경쇄 레퍼토리를 본 발명의 파지미드 및 효모 벡터에 직접 클로닝할 수도 있으며 목적하는 결과를 얻을 수 있다.
시스템 간 전달 외에, 시스템 내 전달, 즉 Fab에서 ScFv로 또는 그 반대로의 디스플레이 포맷 변경, 또는 동일한 포맷이지만 상이한 발현 벡터로의 전달, 예컨대 접합형 벡터로부터 바이-시스트론 벡터로의 전달은 MCS 효소의 각 세트를 통해 가능하다. 모든 가능한 시스템 및 포맷에서의 자유로운 전이는 중쇄 또는 경쇄의 무작위화를 제공하여 두 가지 디스플레이 시스템의 차이를 보완할 수 있도록 하는 한편, 특정 조합이 시스템들에 걸쳐 보존되는 것인 시스템의 유용성은 분명히 이점이다.
따라서, 본 발명의 벡터는 단백질 디스플레이 기술에서 다음을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다수의 이점을 제공한다:
·상호 전달 접근법으로, 여기서 두 상보적인 기술 (파지 디스플레이 및 효모 디스플레이)은 고도로 다양한 항체 라이브러리의 스크리닝, 및 특정 항원에 대한 새로운/선도 항체 분자의 개발을 유도한다.
·독창적으로 설계된 삽입/발현 카세트로, 이는 파지로부터 효모 벡터로의 클론 집단의 효율적이고 원활한 전달을 유도하여, 항체 분자/단편의 다양성을 유지한다.
·작은 라이브러리를 수용하는 효모 디스플레이 기술의 단점 및 파지 디스플레이와 같은 원핵 생물 디스플레이 시스템을 이용한 진핵 생물 단백질 발현/디스플레이의 한계를 극복한다.
·내부 전달 접근법으로, 여기서 디스플레이 포맷은 Fab에서 ScFv로 또는 그 반대로 변경될 수 있고, 또는 동일한 포맷이 하나의 효모 벡터에서 다른 효모 벡터로 전달될 수 있으며, MCS 효소의 각 세트를 통한 접합형 벡터로부터 바이-시스트론 벡터로의 전달이 그 예이다.
SEQUENCE LISTING
<110> ZUMUTOR BIOLOGICS, INC.
<120> VECTORS FOR CLONING AND EXPRESSION OF PROTEINS, METHODS AND
APPLICATIONS THEREOF
<130> IP34109
<150> IN 201641012164
<151> 2016-04-06
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2205
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB001 - Phagemid Kappa Insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2205)
<400> 1
caattcaagg agacagtcat aatgaaatac ctgctgccga ccgctgctgc tggtctgctg 60
ctcctcgctg cccagccggc gatggcccat atgaaaagat ctgcgaagct tgctggcgcg 120
cccggaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 180
tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 240
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 300
gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgtcgaa agcagactac 360
gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 420
aagagcttca acaggggaga gtgtacgcgt gtttaaacat aagccgcgcc aattctattt 480
caaggagaca gtcataaaat gaaatacctg ctgccgaccg ctgctgctgg tctgctgctc 540
ctcgctgccc agccggcgat ggccccatgg acatctagaa aagctagcac agcggccgca 600
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 660
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 720
tggaactcag gcgcgctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcatca 780
ggactctact ccctcagcag cgtagtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 840
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 900
aaatcttgtg aattcgacta caaagacgat gacgacaagg gggccgcaga acaaaaactt 960
atttctgaag aggacttgtc ttaggccgaa actgttgaaa gttgtttagc aaaacctcat 1020
acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa gacgacaaaa ctttagatcg ttacgctaac 1080
tatgagggct gtctgtggaa tgctacaggc gttgtggttt gtactggtga cgaaactcag 1140
tgttacggta catgggttcc tattgggctt gctatccctg aaaatgaggg tggtggctct 1200
gagggtggcg gttctgaggg tggcggttct gagggtggcg gtactaaacc tcctgagtac 1260
ggtgatacac ctattccggg ctatacttat atcaaccctc tcgacggcac ttatccgcct 1320
ggtactgagc aaaaccccgc taatcctaat ccttctcttg aggagtctca gcctcttaat 1380
actttcatgt ttcagaataa taggttccga aataggcagg gtgcattaac tgtttatacg 1440
ggcactgtta ctcaaggcac tgaccccgtt aaaacttatt accagtacac tcctgtatca 1500
tcaaaagcca tgtatgacgc ttactggaac ggtaaattca gagactgcgc tttccattct 1560
ggctttaatg aggacccatt cgtttgtgaa tatcaaggcc aatcgtctga cctgcctcaa 1620
cctcctgtca atgctggcgg cggctctggt ggtggttctg gtggcggctc tgagggtggc 1680
ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc ggctctgagg gtggcggttc cggtggcggc 1740
tccggttccg gtgattttga ttatgaaaaa atggcaaacg ctaataaggg ggctatgacc 1800
gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct gacgctaaag gcaaacttga ttctgtcgct 1860
actgattacg gtgctgctat cgatggtttc attggtgacg tttccggcct tgctaatggt 1920
aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct aattcccaaa tggctcaagt cggtgacggt 1980
gataattcac ctttaatgaa taatttccgt caatatttac cttctttgcc tcagtcggtt 2040
gaatgtcgcc cttatgtctt tggcgctggt aaaccatatg aattttctat tgattgtgac 2100
aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg tttcttttat atgttgccac ctttatgtat 2160
gtattttcga cgtttgctaa catactgcgt aataaggagt cttaa 2205
<210> 2
<211> 4780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB001 - Phagemid Kappa Vector Construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(4780)
<400> 2
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agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 180
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 240
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 300
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gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgcctg cggtgtgaaa 1200
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 1260
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1320
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1380
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1440
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 1500
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 1560
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 1620
gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 1680
gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1740
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaagggg ggatgtgctg caaggcgatt 1800
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1860
gtaatacgac tcactatagg gcgaattgga gctcttaatt aattacattt acatttacat 1920
ttacatttac atttacattt acatccgcgg gcgaattgga gctcaattct cttaggattc 1980
gattcacatt catctttttt tagctactaa taggataaat tataggaatt tataacaaat 2040
tgaaatatgg caggcagcaa aattaaaatt gtcttagttt tttagtgtat agaagtgaat 2100
agctatataa agtatgtgta aagttggtaa cggaacgaaa aatagaaaag gatattacat 2160
gggaaaacat gttgtttacg gagaaatgaa aagtatattg tattttgtac gagctaaaag 2220
tacagtggga acaaagtcga ttttgttaca tctacactgt tgttatcaga ttcaatggtg 2280
atggtgatga tgaccggtac gcgtagaatc gagaccgagg agagggttag ggataggctt 2340
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cagcgtcagg gtgctgctga ggctgtaggt gctgtccttg ctgtcctgct ctgtgacact 2520
ctcctgggag ttacccgatt ggagggcgtt atccaccttc cactgtactt tggcctctct 2580
gggatagaag ttattcagca ggcacacaac agaggcagtt ccagatttca actgctcatc 2640
agatggcggg aagatgaaga cagatggtgc agccacagtt ccgggcgcgc cagcaagctt 2700
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tttaataatc atattacatg gcattaccac catatacata tccatataca tatccatatc 2880
taatcttact tatatgttgt ggaaatgtaa agagccccat tatcttagcc taaaaaaacc 2940
ttctctttgg aactttcagt aatacgctta actgctcatt gctatattga agtacggatt 3000
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attacttctt attcaaatgt aataaaagta tcaacaaaaa attgttaata tacctctata 3420
ctttaacgtc aaggagaaaa aacaccatgc agttacttcg ctgtttttca atattttctg 3480
ttattgcttc agttttagca ccatggacat ctagaaaagc tagcacagcg gccgcagcct 3540
ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 3600
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 3660
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cttgtgaatt cgaacaaaaa cttatttctg aagaggactt ggactacaaa gacgatgacg 3900
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tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt actctttgtc aacgactact attttggcca 4080
acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt 4140
gcggttctca cccctcaaca actagcaaag gcagccccat aaacacacag tatgtttttt 4200
aatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct ccccccacat ccgctctaac 4260
cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct atttattttt ttatagttat 4320
gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt ttttttctgt acagacgcgt 4380
gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc 4440
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taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 4620
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tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 4860
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 4920
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 4980
ctcggccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 5040
acaggactat aaagatacca ggcgttcccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 5100
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 5160
tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 5220
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 5280
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 5340
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 5400
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 5460
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 5520
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 5580
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 5640
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 5700
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 5760
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tgcccgtcgt gtagataact 5820
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 5880
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 5940
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 6000
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 6060
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 6120
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tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 6360
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 6420
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 6480
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 6540
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tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 6660
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 6720
gggtcctttt catcacgtgc tataaaaata attataattt aaatttttta atataaatat 6780
ataaattaaa aatagaaagt aaaaaaagaa attaaagaaa aaatagtttt tgttttccga 6840
agatgtaaaa gactctaggg ggatcgccaa caaatactac cttttatctt gctcttcctg 6900
ctctcaggta ttaatgccga attgtttcat cttgtctgtg tagaagacca cacacgaaaa 6960
tcctgtgatt ttacatttta cttatcgtta atcgaatgta tatctattta atctgctttt 7020
cttgtctaat aaatatatat gtaaagtacg ctttttgttg aaatttttta aacctttgtt 7080
tatttttttt tcttcattcc gtaactcttc taccttcttt atttactttc taaaatccaa 7140
atacaaaaca taaaaataaa taaacacaga gtaaattccc aaattattcc atcattaaaa 7200
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<210> 7
<211> 2509
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.1 - Bicistronic Bidirectional Lambda insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2509)
<400> 7
ccgcgggcga attggagctc aattctctta ggattcgatt cacattcatc tttttttagc 60
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aatgaaaagt atattgtatt ttgtacgagc taaaagtaca gtgggaacaa agtcgatttt 300
gttacatcta cactgttgtt atcagattca atggtgatgg tgatgatgac cggtacgcgt 360
agaatcgaga ccgaggagag ggttagggat aggcttaccg tcgactgtaa cacgcgttga 420
acattctgta ggggccactg tcttctccac ggtgctccct tcatgcgtga cctggcagct 480
gtagcttctg tgggacttcc actgctcggg cgtcaggctc aggtagctgc tggccgcgta 540
cttgttgttg ctctgtttgg agggtttggt ggtctccact cccgccttga cggggctgcc 600
atctgccttc caggccactg tcacagctcc cgggtagaag tcactgatca gacacactag 660
ggtggccttg ttggcttgga gctcctcaga ggagggcggg aacagagtga cagtggggtt 720
ggccttgggc tgaccgggcg cgccagcaag cttcgcagat cttttcatat gagctaatgc 780
ggaggatgct gcgaataaaa ctgcagtaaa aattgaagga aatctcatgg ttttcaaaaa 840
ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata atcatattac atggcattac 900
caccatatac atatccatat acatatccat atctaatctt acttatatgt tgtggaaatg 960
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ttaacaacca taggatgata atgcgattag ttttttagcc ttatttctgg ggtaattaat 1320
cagcgaagcg atgatttttg atctattaac agatatataa atgcaaaaac tgcataacca 1380
ctttaactaa tactttcaac attttcggtt tgtattactt cttattcaaa tgtaataaaa 1440
gtatcaacaa aaaattgtta atatacctct atactttaac gtcaaggaga aaaaacacca 1500
tgcagttact tcgctgtttt tcaatatttt ctgttattgc ttcagtttta gcaccatgga 1560
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actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgcgctgacc agcggcgtgc 1740
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acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga attcgaacaa aaacttattt 1920
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aatattacaa atcagtaacg tttgtcagta attgcggttc tcacccctca acaactagca 2220
aaggcagccc cataaacaca cagtatgttt tttaatcatg taattagtta tgtcacgctt 2280
acattcacgc cctcccccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga 2340
agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt 2400
tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac 2460
cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgcactagt 2509
<210> 8
<211> 7301
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.1 - Bicistronic Bidirectional lambda vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(7301)
<400> 8
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
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gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgcctg cggtgtgaaa 1200
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 1260
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1320
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1380
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1440
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 1500
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 1560
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 1620
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ttacatttac atttacattt acatccgcgg gcgaattgga gctcaattct cttaggattc 1980
gattcacatt catctttttt tagctactaa taggataaat tataggaatt tataacaaat 2040
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agctatataa agtatgtgta aagttggtaa cggaacgaaa aatagaaaag gatattacat 2160
gggaaaacat gttgtttacg gagaaatgaa aagtatattg tattttgtac gagctaaaag 2220
tacagtggga acaaagtcga ttttgttaca tctacactgt tgttatcaga ttcaatggtg 2280
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accgtcgact gtaacacgcg ttgaacattc tgtaggggcc actgtcttct ccacggtgct 2400
cccttcatgc gtgacctggc agctgtagct tctgtgggac ttccactgct cgggcgtcag 2460
gctcaggtag ctgctggccg cgtacttgtt gttgctctgt ttggagggtt tggtggtctc 2520
cactcccgcc ttgacggggc tgccatctgc cttccaggcc actgtcacag ctcccgggta 2580
gaagtcactg atcagacaca ctagggtggc cttgttggct tggagctcct cagaggaggg 2640
cgggaacaga gtgacagtgg ggttggcctt gggctgaccg ggcgcgccag caagcttcgc 2700
agatcttttc atatgagcta atgcggagga tgctgcgaat aaaactgcag taaaaattga 2760
aggaaatctc atggttttca aaaattctta cttttttttt ggatggacgc aaagaagttt 2820
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tctttggaac tttcagtaat acgcttaact gctcattgct atattgaagt acggattaga 3000
agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt cctcgtcttc 3060
accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga acaataaaga 3120
ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac ctggccccac 3180
aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga ttagtttttt 3240
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ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc ggtttgtatt 3360
acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt 3420
taacgtcaag gagaaaaaac accatgcagt tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta 3480
ttgcttcagt tttagcacca tggacatcta gaaaagctag cacagcggcc gcagcctcca 3540
ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag 3600
cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact 3660
caggcgcgct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtca tcaggactct 3720
actccctcag cagcgtagtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct 3780
gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt 3840
gtgaattcga acaaaaactt atttctgaag aggacttgga ctacaaagac gatgacgaca 3900
aggaaaacct gtattttcag ggcctgcagg ctagtggtgg aggaggctct ggtggaggcg 3960
gtagcggagg cggagggtcg atgactggtc aggaactgac aactatatgc gagcaaatcc 4020
cctcaccaac tttagaatcg acgccgtact ctttgtcaac gactactatt ttggccaacg 4080
ggaaggcaat gcaaggagtt tttgaatatt acaaatcagt aacgtttgtc agtaattgcg 4140
gttctcaccc ctcaacaact agcaaaggca gccccataaa cacacagtat gttttttaat 4200
catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc cccacatccg ctctaaccga 4260
aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta tagttatgtt 4320
agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca gacgcgtgta 4380
cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt 4440
aatttgcact agtatgtaaa tgtaaatgta aatgtaaatg taaatgtaaa tgtaaggcca 4500
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.3 - Bicistronic Unidirectional lambda insert
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<213> Artificial Sequence
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cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 1980
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2040
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gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 2880
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<212> DNA
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<211> 4783
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ScFv vector backbone
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<222> (1)..(4783)
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ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgcctg cggtgtgaaa 1200
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 1260
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1320
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1380
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1440
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gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 3060
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catgatcccc catgttgtga aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 3660
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 3720
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 3780
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cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 3900
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gatgtaaaag actctagggg gatcgccaac aaatactacc ttttatcttg ctcttcctgc 4380
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<211> 5473
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p414Gal1 - Vector backbone for Mating Type Heavy Chain
<220>
<221> old_sequence
<222> (1)..(5473)
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Claims (21)
- 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계된 벡터 컨스트럭트로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
적어도 하나의 선도 서열 (leader sequence);
생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하기 위한 적어도 하나의 클로닝 영역;
불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로불린 경쇄, 또는 그의 단편을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열; 및
적어도 하나의 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고;
여기서, 상기 발현 카세트의 적어도 하나의 클로닝 영역은 NdeI , BgIII , BmtI, HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유하는 것인 벡터 컨스트럭트. - 제1항에 있어서, 컨스트럭트는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 파지미드 또는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 효모 벡터로부터 항체 또는 그의 단편을 수용하도록 설계되거나, 또는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 효모 벡터로 항체 또는 그의 단편을 전달하도록 설계되고; 여기서 발현 카세트, 파지미드 및 효모 벡터의 적어도 하나의 클로닝 영역은 NdeI , BgIII , BmtI , HindIII , AscI , NcoI, XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공통 제한 부위를 포함하는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, 발현 카세트는:
단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 효소 절단 부위를 상류에 포함하거나 포함하지 않는 적어도 하나의 터미네이터 서열;
또는,
적어도 하나의 리보솜 결합 부위를 상류에 포함하는 파지 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
을 포함하는 것인 벡터 컨스트럭트. - 제1항에 있어서, 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터 서열, 오퍼레이터 서열 또는 이들의 조합을 함유하거나 함유하지 않고; 벡터 컨스트럭트는 박테리아 세포 또는 효모 세포에서 항체 또는 그의 단편을 발현할 수 있으며; 여기서 발현 카세트, 파지미드 및 효모 벡터의 클로닝 영역 내 제한 부위는 HindIII 및 AscI; NdeI, BgIII , HindIII 및 AscI; NcoI 및 XbaI; NcoI 및 NotI; XbaI , NheI 및 NotI을 포함하는 조합 중에서 선택되고; 프로모터 서열은 Gal1, Gal1/10 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 선도 서열은 pelB 서열, 알파 선도 서열, Aga2P 선도 서열, 알파 접합 인자 1 분비 신호 서열 (SS01), 조작된 알파 인자 (aapS4) 신호 서열 (SS02), 조작된 알파 인자 (aap8) 신호 서열 (SS03), 조작된 알파 인자 (aap8), 신호 서열 (SS04) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열은 FLAG, c-Myc, V5, His 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 터미네이터 서열은 알파 터미네이터, CYC1 터미네이터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 효소 절단 부위는 TEV 프로테아제 절단 부위이며; 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Aga2P 단백질이고; 및 파지 외피 단백질은 pIII 단백질, G8P 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로블린 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 그의 단편, 및 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로블린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 및 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, 벡터 컨스트럭트는 효모 바이시스트론(bicistronic) 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 파지미드로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 발현 카세트는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터 컨스트럭트:
(a) 순차적으로,
프로모터 서열;
선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , BmtI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 클로닝 영역; IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 도메인은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 터미네이터 서열,
(b) 순차적으로,
프로모터 서열;
선도 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BgIII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열; 및
터미네이터 서열,
(c) 순차적으로,
제1 터미네이터 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제1 세트;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BgIII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제1 클로닝 영역;
제1 선도 서열,
프로모터 서열;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제2 세트; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 제2 터미네이터 서열,
(d) 순차적으로,
제1 프로모터 서열;
제1 선도 서열,
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BgIII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제1 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제1 세트;
제1 터미네이터 서열;
제2 프로모터 서열;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제2 세트; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 제2 터미네이터 서열,
및
(e) 순차적으로,
프로모터 서열;
오퍼레이터 서열;
제1 리보솜 결합 부위;
제1 선도 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BgIII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제1 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
제2 리보솜 결합 부위;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열(들) 또는 선택 코딩 핵산 서열(들); 및
파지 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열. - 제1항에 기재된 벡터 컨스트럭트로부터 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계되거나, 또는 항체 또는 그의 단편을 전달 또는 수용하도록 설계된 벡터 컨스트럭트로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
프로모터 서열;
선도 서열;
단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
제1 효소 절단 부위;
제1 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열;
제1 링커 서열;
제2 효소 절단 부위;
제2 링커 서열의 존재하에 제2 클로닝 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 클로닝 영역으로서, 상기 클로닝 영역은 생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하는 것인 클로닝 영역;
제2 재조합 태그 서열(들) 또는 선택 코딩 핵산 서열(들);
및
터미네이터 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 발현 카세트의 제1 클로닝 영역 또는 제2 클로닝 영역은 NdeI , BgIII, HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유하는 것인 벡터 컨스트럭트. - 제7항에 있어서, 상기 벡터 컨스트럭트는 scFv 벡터이고 효모 세포에서 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 그의 단편을 발현할 수 있는 것인 벡터 컨스트럭트이며; 여기서 상기 scFv 벡터 및 제1항에 기재된 벡터 컨스트럭트의 발현 카세트의 클로닝 영역은 NdeI , BgIII , HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공통 제한 부위를 포함하고; 여기서 프로모터 서열은 Gal 1이며; 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Aga2P 단백질이고; 효소 절단 부위는 인자 Xa 절단 부위, TEV 프로테아제 절단 부위 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 절단 부위이며; 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열은 HA 태그, c-Myc 태그, FLAG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 링커 서열은 G4S 서열이며; 제1 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로블린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제2 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 그의 단편이며; 및 터미네이터 서열은 알파 터미네이터, CYC1 터미네이터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항 또는 제7항에 있어서, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24 및 SEQ ID No. 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 벡터 컨스트럭트는 복제 기점 (Ori), 항생제 저항성 마커, f1 복제 기점, 프로모터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역 및 이들의 조합을 더 포함하고; 원핵 생물 발현 시스템, 효모 발현 시스템 또는 이들의 조합에서 항체 또는 그의 단편을 발현 또는 디스플레이할 수 있는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, CH1 영역은 SEQ ID No. 27의 핵산 서열을 가지고, Ck 영역은 SEQ ID No. 28의 핵산 서열을 가지며, CL 영역은 SEQ ID No. 29의 핵산 서열을 가지고; Vk, VL 및 VH 서열은 나이브 항체 레퍼토리, 합성 항체 레퍼토리 또는 이들의 조합으로부터 유래된 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항 또는 제7항에 기재된 벡터 컨스트럭트의 제조 방법으로서, 다음 단계들:
a) 발현 카세트를 합성하는 단계;
b) 목적 벡터를 선형화하는 단계; 및
c) 발현 카세트를 선형화된 목적 벡터에 삽입하여 벡터 컨스트럭트를 수득하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제12항에 있어서, 상기 방법은 시퀀싱 기술에 의해 오류가 없는 벡터 클론을 확인하는 단계를 포함하고; 목적 벡터는 pADL23c, pRS314, p414Gal1, p416Gal1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 선형화는 제한 효소(들)로의 분해에 의해 수행되고; 선형화된 목적 벡터에의 발현 카세트의 삽입은 상동성 재조합, 제한 효소 분해 후 결찰 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술에 의해 수행되는 것인 방법.
- 벡터 컨스트럭트 라이브러리의 제조 방법으로서, 다음 단계들:
a) 제12항에 기재된 방법에 의해 벡터 컨스트럭트를 제조하는 단계;
b) 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역에 클로닝하여 라이브러리를 수득하는 단계,
또는
면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 하나의 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로부터 또 다른 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로 전달하여 라이브러리를 수득하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제14항에 있어서, 벡터 컨스트럭트는 파지미드, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터, 효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터 및 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되고; Vk, VL 및 VH 영역은 나이브 항체, 합성 항체 또는 이들의 조합으로부터 유래되며; 벡터 컨스트럭트 라이브러리는 합성 라이브러리, 나이브 라이브러리 또는 이들의 조합이고; 및 뉴클레오티드 서열의 전달은 파지미드 벡터 컨스트럭트와 효모 벡터 컨스트럭트 간 또는 효모 벡터 컨스트럭트들 간에서 수행되는 것인 방법.
- 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 스크리닝 및 동정하는 방법으로서, 다음 단계들: (a) 제14항에 기재된 방법에 의해 벡터 컨스트럭트 라이브러리를 제조하고, 상기 벡터 컨스트럭트를 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포 또는 이들의 조합으로 형질 전환시키는 단계; 및 (b) 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 발현하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 스크리닝 및 동정은 박테리아 숙주 세포에서의 파지 디스플레이, 효모 숙주 세포에서의 효모 디스플레이 또는 순차적으로 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 수행되고; 여기서 목적하는 기능적 특성(들)은 친화성, 특이성, 항원성, 제조 가능성, 새로운 에피토프의 생성, 내열성, 가용성, 응집성 및 촉매 활성 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 스크리닝 및 동정은 순차적인 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 수행되고, 다음 단계들:
(i) 파지미드 컨스트럭트 라이브러리를 박테리아 숙주 세포로 형질 전환시켜 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계;
(ii) 항원(들)에 대해 디스플레이된 항체 또는 그의 단편을 스크리닝하여 선택된 클론을 포함하는 패닝된 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계;
(iii) 선택된 클론으로부터 효모 벡터로 항체 또는 그의 단편을 전달한 후 상기 항체 또는 그의 단편의 발현 및 디스플레이를 위하여 효모 숙주 세포로 형질 전환시키는 단계;
(iv) 항원(들)에 대해 효모 디스플레이된 항체 또는 그의 단편을 스크리닝하여 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 동정하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제16항에 있어서, 항체 또는 그의 단편은 파지 또는 효모 벡터로 클로닝하기 위한 Fab 또는 Scfv 포맷이고; 파지 벡터로의 형질 전환 효율은 약 109 내지 약 1011의 범위이며; 및 효모 벡터로의 전달 또는 형질 전환 효율은 약 106 내지 약 108의 범위인 것인 방법.
- 제1항 또는 제7항에 기재된 벡터 컨스트럭트(들)을 포함하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포, 또는 파지 라이브러리 또는 효모 라이브러리.
- 제1항 또는 제7항에 기재된 벡터 컨스트럭트(들)에 의해 제공되는 발현 카세트로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23 및 SEQ ID No. 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는 것인 발현 카세트.
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