KR20150125994A - 세포 발현 시스템 - Google Patents
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Abstract
디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) 결함을 갖는 진핵생물 숙주 세포; 및 발현 벡터로서, 상기 발현 벡터는 인간 성장 호르몬 유전자를 코딩하는 것인 발현 벡터; 발현 벡터로서, 상기 숙주 세포에서 DHFR 결함을 보완하기 위한 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 서열의 발현을 구동하는 최소 SV40 조기 프로모터 (minimal SV40 early promoter)를 포함하는 진핵생물 선택 마커; 원핵생물 숙주 세포에 암피실린 저항성을 전달하는 원핵생물 선택 마커; 원핵생물 복제원점; 복수의 다중 클로닝 부위(MCS); 및 72 bp 인핸서 반복서열을 포함하는, SV40(Simian Vacuolating Virus 40) 조기 프로모터; 및 코딩 서열을 수용하고, 그로부터 목적 단백질을 발현하기 위한, 제1 다중 클로닝 부위에 의해 SV40 p A 서열로부터 분리될 수 있는 토끼 β-글로빈 인트론 서열을 포함하는 하나 이상의 단백질 발현 모듈을 포함하는 것인 발현 벡터를 포함하는, 단백질 발현을 위한 발현 시스템.
Description
본 발명은 발현 시스템에 관한 것이고, 구체적으로, 본 발명은 생물학적 치료제의 생산을 위한 발현 시스템에 관한 것이다.
재조합 단백질과 같은, 생물학적 치료제 또는 생물의약품의 생산을 위한 발현 시스템은 일반적으로 목적 재조합 치료제를 코딩하는 핵산 벡터 구조체(construct) 및 선택된 숙주 세포로 구성된다. 벡터가 숙주 세포 내로 도입되고 내생 세포 기구(machinery)가 목적 치료제, 즉, 목적 재조합 단백질의 생산을 위해 이용된다. 허가받을 수 있는 생물학적 치료제의 생산을 위한 효율적이고 신뢰가능한 발현 시스템을 구축하는데 있어서의 복잡한 사항이 많다. 그러나, 제대로 확립된 발현 시스템은 달리 수득하기 어려운 의약품의 생산을 위한 비용-효율적인 대안을 제공할 수 있다.
시스템 자체의 효율성은 벡터의 설계 및 숙주 세포의 선택을 포함한 다양한 인자들에 의존적이다. 벡터 서열 내의 조절 요소, 선택 마커, 및 안정성 요소(stability element)의 전략적 조합은 벡터의 단순한 조작 및 적용과 목적 생물학적 치료제의 고수율 생산의 균형을 맞추어야 한다. 그러한 발현 시스템에서 숙주 세포로서 작용하기 위한 세포의 적합성을 결정하는 것은 주로 최종 산물 중 잠재적인 우발적 오염물을 최소화하면서 내생 세포 기구와 벡터에 존재하는 조절 요소 간의 적합성(compatibility)을 최대화하는 요구에 의해 지배된다. 또한, 이용가능성, 비용, 및 해당 시스템에 의해 생산된 치료제의 감독기관의 허가(regulatory approval)에 대한 허용가능성이 고려되어야 한다.
발현 시스템에서 이용되는 핵산 벡터는 플라스미드, 코스미드, YAC(Yeast Artificial Chromosome), BAC(Bacterial Artificial Chromosome), 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 벡터들은 다수의 특징, 예를 들면, 상이한 크기의 핵산 삽입물을 수용할 수 있는 능력, 숙주 세포로 도입하는 가장 효율적인 방법, 및 특히, 목적 단백질의 충분한 발현을 보장하기 위한 상이한 종류의 숙주 세포의 내생 세포 기구의 이용이 다르다.
이러한 발현 벡터에 공통적으로 존재하는 조절 요소(regulatory element)는 선택 마커 및 목적 생물학적 치료제를 코딩하는 서열의 전사와 번역, 및 단백질 합성에 영향을 미친다. 이러한 조절 요소는 프로모터, 터미네이터(terminator), 변형자(modifier), 인슐레이터(insulator), 스페이서(spacer), 조절 단백질 결합 부위, 인트론, 인듀서(inducer) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
공지된 프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터 (constitutively active promoter), 예를 들면, 티미딘 키나아제 (TK) 프로모터, 액틴 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제 (GAPDH) 프로모터, SV40 (simian vacuolating virus 40) 조기 프로모터, 사이클린 T1 프로모터, RNA 폴리머라아제 III U3 프로모터, 사이클로필린(cyclophillin) 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, AcNPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) P10 프로모터 및 β3GAL-T5(β3-galactosyltransferase 5) 프로모터를 포함한다.
공지된 프로모터는 또한 유도성 프로모터, 예를 들면, HSP70(heat shock protein 700) 프로모터 (스트레스에 의해 유도됨), HSP90 프로모터 (스트레스에 의해 유도됨), alcA (alcoholdehydrogenase I) 프로모터 (알코올에 의해 유도됨), ACE1 (activating copper-metallothionein expression) 프로모터(금속에 의해 유도됨), SSU1 (small subunit of ribulose-1,5-bisphophate-carboxylase) 프로모터 (광에 의해 유도됨), hif1α(hypoxia induced factor 1α) 프로모터, IME2 (inducer of meiosis 2) 프로모터 (기아(starvation)에 의해 유도됨), 글루코코르티코이드 수용체 (호르몬에 의해 유도됨), 에스트로겐 수용체(호르몬에 의해 유도됨), 및 엑디손(ecdysone) 수용체 (호르몬에 의해 유도됨)를 포함한다.
또한, 세포 타입/조직 특이적 프로모터, 예를 들면, nkx2.5 프로모터 (심장 세포), 아일릿 1 프로모터(islet 1 promoter) (췌장 세포), MyoD 프로모터 (근육 세포), CD2 (cluster of differentiation 2) 프로모터 (T-세포) 및 콜라겐 II 프로모터 (연골)가 세포 타입 특이적 자극, 또는 발생 단계의 진행에 따라 그들의 활성 수준을 변화시키는 것으로 알려져 있다.
공지된 터미네이터 요소, 예를 들면, RNA 폴리머라아제 II 터미네이터, snR13 (small nucleolar RNA 13) 터미네이터, BGH(bovine growth hormone) 터미네이터, SV 40(simian virus 40) 터미네이터, TK (thymidine kinase) 터미네이터는 적절한 폴리아데닐화 신호를 제공할 수 있다.
공지된 변형자 및 인슐레이터 요소는 tetO/tetR(tetracycline operator/receptor) 시스템, GAL4 UAS (upstream activating sequence of the galactose dependent GAL4 transcription factor), 아데노바이러스 조기 영역(adenovirus early region) B1 TATA 박스, HSV(herpes simplex virus) 조절 단백질 VP16에 대한 결합 부위, 5'HS4 치킨 β-글로빈 인슐레이터, Peg3(paternally expressed gene 3) 인슐레이터 및 성게 ARS (sea urchin arylsulfatase) 유전자 인슐레이터를 포함한다.
허가가능한 생물학적 치료제의 생산을 위한 효율적이고 신뢰가능한 발현 시스템을 구축하기 위한 다수의 시도가 이루어졌으나, 생산된 생물의약품의 저수율 및 우발적인 오염에 관한 문제가 남아있다. 시스템이 안정성 및 내생 숙주 세포 기구와의 최고의 적합성을 갖도록, 다수의 옵션으로부터 적절한 조절 요소의 가장 효과적인 조합을 선택하는 것이 당해 분야에서 주요한 도전 과제를 제기한다.
생물의약품의 규제적 허가(regulatory approval)를 수득하는 것은 또 다른 도전 과제를 제기한다. 규제적 허가는 시판 전에 의약품의 안전성 및 효능의 결정을 포함한다. 혁신 의약품(innovator drug)에 대한 규제적 허가를 받는 과정은 장시간 및 고비용을 소요한다. 그러나, 일단 허가되면, 이러한 약품은 매우 수익성이 높을 수 있고, 특히, 이들이 특허 보호와 같은 배타적 권리 하에 시판될 때 그러할 수 있다.
혁신 의약품 시장의 수익성은 특허권이 만료되면, 이러한 시장을 이용할 실질적인 인센티브를 제공할 수 있다. 특허 만료 후, 혁신 의약품이 제네릭 약품 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 약품에 대한 바이오시밀러로 판매될 수 있다. 특허 만료에 근접한 블럭버스터 바이오 의약품의 제네릭 버전은 에포젠(Epogen) (에리트로포이에틴, EPO) 및 뉴포젠(Neupogen)(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)을 포함한다. 화이자의 제노트로핀 (재조합 인간 성장 호르몬)의 후발(follow-on) 버전의 허가는 이전에 특허 보호의 만료 이후에도 바이오 의약품이 경쟁으로부터의 면제(immunity)를 누렸던 환경에 변화가 있다는 것을 나타내는 것으로 보인다. 현재, 80개 이상의 바이오의약품의 제네릭 버전이 개발되고 있다 (Datamonitor 2010).
바이오시밀러는 이상적으로는 혁신 의약품의 생물학적 동등물이고, 따라서, 바이오시밀러의 규제적 허가를 위한 경로는 안전성 및 효능을 확인하는 임상 데이터가 제출되었기 때문에 오리지널 혁신 의약품에 대한 것보다 이론적으로 덜 어렵다.
제네릭 바이오의약품의 허가는 허가된 바이오의약품 (즉, 대조 등재 약품(referenced listed drug)) 대비 유사한(comparable) 투여 제형, 강도, 투여 경로, 품질, 성능 특징, 및 의도된 용도에 의존적이다. 예를 들면, 미국 식품의약국(FDA) 하에, 제네릭 의약품의 허가는 일반적으로 안전성 및 유효성을 정립하기 위한 전임상 및 임상 데이터를 포함하지 않는, "약식 신약 허가 신청(Abbreviated New Drug Application)" (ANDA)을 수반한다. 허가는 또한 생동성(bioequivalence) 심사를 포함하고, 이는 제시된 제네릭 의약품이 대조-등재 약품과 생물학적으로 동등하다는 것을 규명한다. 이러한 생동성은 제네릭 의약품 중 활성 성분의 흡수 속도 및 정도가 대조 등재 약품의 파라미터의 범위 내에 속한다는 것의 입증에 근거한다.
중요한 것은, 약품이 안전하고 허용가능한 방식으로 작용할 것이라는 것을 보장하기 위해 제네릭 약품이 제어된 조건 하에 재현가능한 방식으로 제조될 것이라는 보장을 제공하는 화학/미생물학 심사 과정이 있다는 것이다.
바이오시밀러 약품의 허가를 위한 가이드라인이 존재하나, 바이오시밀러의 규제적 허가의 적용(practicality)과 관련하여 불확실성이 있다. 불활실성의 대부분은 이러한 약품의 허가를 위한 명확하고 실질적이며 상세한 규제 경로의 부재 및 제품 유사성(comparability) 및 호환성(interchangeability)에 대한 과학적 논란에 의해 유발된다. 혁신 제약사(innovator)에 의해 사용된 조건과 상이한 조건 하에 바이오시밀러 약품의 제조로부터 기인되는 불확실성은 생물 의약품(biotechnology drug)의 진정한 "제네릭(generic)" 버전을 개발하는 것은 불가능할 수 있다는 것을 시사한다. 실제로, 유럽 및 미국의 규제 당국은 용어 "바이오제네릭(biogeneric)"의 사용을 피하고, 명명 "바이오시밀러(biosimilar)" 및 "후발 생물의약품(follow-on biologics)"를 선호한다.
발현 시스템-유래 생물의약품에 대한 다수의 품질 우려는 우발적 오염물의 존재 또는 제품을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포의 특성으로부터 기인되었다. 이러한 제품들 중 다수는 또한 시스템의 발현 벡터에 대한 품질 우려를 갖는다. 세포 배양과 연관된 세포 특성 및 이벤트가 제품 품질 및 안전성에 영향을 미칠 수 있다는 것이 정립되어 있다. 재조합 제품의 효과적인 품질 관리(quality control)는 세포 및 세포 배양의 취급의 모든 측면에 대한 적절한 관리를 요구한다. 이는 특히 바이오시밀러의 개발과 관련이 있다.
이전에, 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) (CHO) 세포가 인슐린을 생산하도록 변형되고 공학적으로 개발되었다(engineered). 그러나, 그러한 CHO 세포들은 생물학적 활성 인슐린을 발현하지 못했고, 따라서, 이러한 타입 또는 CHO 세포 변형 방법과 연관된 특허는 상업적으로 이용되지 않았다. CHO 세포의 번역 기구에 의한 인슐린 유전자 메시지의 난해한 스플라이싱 때문에 완전한 기능성 인슐린이 CHO 세포에서 생산되지 않았다.
본 명세서의 선행기술의 논의는 어떠한 방식으로도 그러한 선행기술이 당해 분야에서 널리 공지되었거나 또는 일반적인 상식의 일부라는 인정으로 간주되어서는 안 된다.
본 발명의 목적은 선행기술의 단점 중 하나 이상을 극복하거나 또는 개선하거나, 또는 유용한 대안을 제공하는 것이다.
요약
문제 해결 수단
본 발명의 제 1 양태는 신규한 발현 시스템 및 특정 구체예에서 수율을 증가시키고, 제조 비용을 감소시킬 수 있는, 본 발명에 따른 발현 시스템을 이용하는 방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 포유동물 세포 배양을 이용한 재조합 바이오시밀러(biosimilar), 바이오-의약품(bio-pharmaceutical), 및 기타 바람직한 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드의 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 저비용 배지에서 복잡한 단백질의 생산을 위한 특별하게 바이오공학적으로 개발된(bioengineered) 포유동물 세포주의 이용을 포함한다. 이러한 세포주는 값싸고, 재현가능하고, 완전히 정의된 무단백질 배지(fully-defined protein-free medium)에서 자율적 성장을 위한 획득된 능력을 가지며, 이 세포들은 필요한 성장 인자(growth factor requirement)를 발현하고 분비한다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 단백질을 발현하는 발현 시스템으로서,
디하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 결함(deficiency)을 갖는 진핵생물 숙주 세포;
인간 성장 호르몬 유전자를 코딩하는 발현 벡터;
발현 벡터로서:
상기 숙주 세포에서 DHFR 결함을 보완하는 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 서열의 발현을 위해 하류에 있는 진핵세포 선택 마커;
원핵 숙주 세포에 암피실린 저항성을 전달하는 원핵세포 선택 마커;
원핵세포 복제 원점(prokaryotic Origin of Replication);
복수의 다중 클로닝 부위(MCS); 및
72 bp 인핸서 반복서열(enhancer repeat)을 포함하는 SV40 (Simian Vaculating Virus 40) 조기 프로모터(early promoter); 및 코딩 서열을 수용하고 그로부터 목적 단백질 (desired protein)을 발현하기 위한, 제1 다중 클로닝 부위에 의해 SV40 폴리아데닐화 서열로부터 분리될 수 있는 토끼 β-글로빈 인트론 서열;을 포함하는, 하나 이상의 단백질 발현 모듈을 포함하는 것인 발현 시스템을 제공한다.
바람직하게는, 발현 시스템은 또한 제2 단백질 발현 모듈을 포함하고, 상기 제2 단백질 발현 모듈은 상기 발현 모듈로부터 2개 이상의 단백질의 공-발현(co-expression)을 위한 제2 다중 클로닝 부위에 의해 SV40 폴리아데닐화 서열로부터 분리될 수 있는 사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus) 프로모터를 포함한다.
바람직하게는, 단백질은 규제적 허가에 대한 요구의 대상이고, 상기 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하기 위해, 상기 숙주 세포를 복수의 미리 결정된 조작(manipulation)에 적용하고, 각 조작에 대한 정보가 기록되고, 각 조작은 상기 숙주 세포와 오염물과의 접촉을 방지하는 방식으로 수행되고; 상기 정보는 약품의 안전성 및 효능의 평가에 관련된 감독 기관(regulatory agency)으로의 제출에 포함시키기 위한 상기 숙주 세포의 이력(history record)을 생성하기 위해 이용되고 그에 의해 단백질의 규제적 허가를 촉진한다.
미리 결정된 조작은 바람직하게는 하기를 포함한다:
(i) 목적 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 발현 벡터 내로 라이게이션시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(ii) 상기 재조합 벡터를 상기 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및
(iii) 상기 단백질이 상기 숙주 세포에 의해 발현되게 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계.
바람직하게는 상기 재조합 벡터는 상기 숙주 세포의 게놈 내로 적어도 부분적으로 통합(incorporate)된다. 단계 (iii)은 상기 숙주 세포를 동물 또는 식물 유래 단백질 또는 펩티드 및 정의되지 않은(undefined) 가수분해물 또는 용해물을 포함하지 않는 배지에서 배양하여, 상기 숙주 세포와 오염물(contaminating agent) 간의 접촉을 감소시키는 것을 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary) DG44 세포이다.
특정한 바람직한 구체예에서, 숙주 CHO DG44는 성장 호르몬을 발현한다. 특정한 바람직한 구체예에서, 상기 성장 호르몬은 인간 성장 호르몬이다. 특정한 바람직한 구체예에서, 상기 단백질은 바이오시밀러 약품이다.
제2 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따른 발현 시스템에 의해 발현되는 단백질의 개발을 관리하는 방법을 제공하고, 상기 단백질은 규제적 허가에 대한 요구의 대상이고, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
a. 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하기 위해 상기 숙주 세포에 복수의 미리 정해진 조작을 적용하는 단계;
b. 각 조작에 대한 정보를 기록하는 단계로서, 각 조작은 상기 숙주 세포와 오염물 간의 접촉을 방지하는 방식으로 수행되는 것인 단계;
c. 상기 정보를 이용하여, 약품의 안전성 및 효능의 평가에 관련된 감독 기관으로의 제출에 포함시키기 위해 상기 숙주 세포의 이력(history record)을 생성하는 단계; 및
d. 상기 이력을 제품의 규제적 허가를 위해 감독 기관으로의 제출에 포함시키는 단계.
제3 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따른 발현 시스템에 의해 발현되는 단백질의 규제적 허가를 촉진시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은
b. 숙주 세포가 산물을 발현하도록 하기 위해 상기 숙주 세포에 복수의 미리 정해진 조작을 적용하는 단계;
c. 각 조작에 대한 정보를 기록하는 단계로서, 각 조작은 상기 숙주 세포와 오염물 간의 접촉을 방지하는 방식으로 수행되는 것인 단계;
d. 상기 정보를 이용하여, 약품의 안전성 및 효능의 평가에 관련된 감독 기관으로의 제출에 포함시키기 위해 상기 숙주 세포의 이력을 생성하는 단계; 및
e. 상기 이력을 단백질의 규제적 허가를 위해 감독 기관으로의 제출에 포함시키는 단계.
바람직하게는, 제2 양태 및 제3 양태에 따른 방법의 단계 (a)는
(i) 목적 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 발현 벡터 내로 라이게이션시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(ii) 상기 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및
(iii) 상기 단백질이 상기 숙주 세포에 의해 발현되도록 하게 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
재조합 벡터는 바람직하게는 숙주 세포의 게놈 내로 적어도 부분적으로 통합된다.
바람직하게는, 제2 양태 및 제3 양태에 따른 방법의 단계 (iii)은 상기 숙주 세포를 동물 또는 식물 유래 단백질 또는 펩티드 및 정의되지 않은(undefined) 가수분해물 또는 용해물을 포함하지 않아, 상기 숙주 세포와 오염물 간의 접촉을 감소시키는 배지에서 배양하는 것을 포함한다.
제2 양태 및 제3 양태에 따른 방법의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 단백질은 바이오시밀러 약품이다.
본 발명에 따른 또 다른 양태는 또한 포유동물 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 재조합 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 숙주 세포는
(i) 구성적 프로모터 (예를 들면, CMV 및 SV40 프로모터)에 발현가능하게 연결된, 상기 배양 배지에서 상기 숙주 세포의 성장을 위해 요구되는 단백질, 폴리펩티드, 및/또는 펩티드 인자를 코딩하는 하나 이상의 도입된 DNA 서열을 포함하는 것인 방법을 제공한다. 이에 의해, 본 발명은 그러한 배지에서 그의 성장을 위해 요구되는 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드 성장 인자를 생산할 수 있는, 숙주 세포를 이용하는 것에 의해, 저비용, 단백질/혈청-불포함 배지의 이용을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 배양 배지는 바람직하게는 무혈청이거나, 또는 그렇지 않으면 특정한 숙주 세포 타입의 성장에 필요한 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드 성장 인자-불포함이다. 그러나, 배양 배지가 하나 이상의 요구되는 성장 인자를 포함하고, 숙주 세포 자체가 하나 이상의 동일하고 및/또는 다른 요구되는 성장 인자를 발현하는 것인 방법도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다.
포유동물 숙주 세포는 재조합 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현을 위해 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것들일 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포는 CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 예를 들면, CHO-K1, CHO-DG44 DHFR- 및 CHO-S일 수 있다. 이들은 부착성(adherent) 세포주 및 현탁(suspension) 세포주를 포함한다. 또한, 본 발명의 구체예 내에서 기재된 다른 세포주도 사용될 수 있거나 또는 바람직할 수 있다.
도입되는 DNA 서열은 플라스미드 상에 존재할 수 있거나, 또는 그렇지 않으면 (예를 들면, 상동성 재조합에 의해) 숙주 세포 염색체 내에 통합될 수 있다.
숙주 세포의 성장을 위해 요구되는 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드 인자를 코딩하는 DNA 서열은 인간 성장 호르몬 (hGH), 변형된 hGH, 및 기타 성장 인자 및 이들의 혼합물을 코딩하는 DNA 서열로부터 선택될 수 있다. 숙주 세포가 CHO인 경우, 숙주 세포가 인간 성장 호르몬 (hGH)을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 단어 "포함하다(comprise)", "포함하는(comprising)" 등은 그들의 배제와 대조적으로, 포함하는 것으로 해석되며, 즉, "포함하나, 그에 한정되지 않는(including, but not limited to)"의 의미이다.
본 발명에서, 단어 "포함하다(comprise)", "포함하는(comprising)" 등은 그들의 배제와 대조적으로, 포함하는 것으로 해석되며, 즉, "포함하나, 그에 한정되지 않는(including, but not limited to)"의 의미이다.
본 발명은 배경기술에 기재되거나 또는 그와 관련된 기술적 문제들 중 하나 이상을 참조하여 해석된다. 본 발명은 이러한 기술적 문제들 중 하나 이상을 해결하거나 또는 개선하는 것을 목적으로 하고, 이는 본 명세서에 의해 정의되고, 본 발명의 바람직한 구체예를 참조하여 상세하게 기술되는 하나 이상의 유리한 효과를 가져올 수 있다.
도 1a는 NeuCHO 세포주와 사용되는, pNAS 벡터 내에 삽입된 인간 성장 호르몬 (hGH)의 고수준 발현을 위한 "NAS-hGH"로 지칭된 플라스미드 벡터 맵이다;
도 1b는 CHO DG44 세포에서 단일 사슬 단백질의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeu"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1c는 CHO D44 세포에서 단일 사슬 단백질의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeu-IRES-DHFR"로 지칭된 발현 벡터 맵이다. 제1 시스트론의 재조합 유전자 및 뒤이은 제2 시스트론의 DHFR 유전자를 갖는 디시스트론 발현 카세트(dicistronic expression cassette);
도 1d는 중쇄 및 경쇄 항체 사슬 및/또는 재조합 단일클론 항체의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeuMAB"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1e는 중쇄 및 경쇄 항체 사슬의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeuMAB-IRES-DHFR"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1f는 중쇄 및 경쇄 항체 사슬의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeuMAB-IRES-DHFR (CMV)"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1g는 경쇄 (LC)의 발현을 위해 이용되는 "pMAB LC (IRES-DHFR)"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1h는 중쇄 (HC)의 발현을 위해 이용되는 "pMAB HC"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 2는 사용된 다양한 배양물 및 세포에 대해 도시된 생존 세포의 밀도를 보여주는 성장 도표(growth chart)를 도시한다. 부모(parental) DG44 세포주 및 IGF-1 유전자를 발현하는 DG44 세포주 대비 hGH를 발현하는 DG44 세포주의 성장;
도 3은 다양한 바람직한 개체 및 배양물에 대한 시간 대비 생존 세포 밀도의 적분값(integral)을 비교하는 그래프를 도시한다; 및
도 4는 CHO DG44 세포 또는 NeuCHO 세포주로부터의 단백질의 상대적 발현 수준을 보여주는 비교 도표를 도시한다.
본 명세서는 또한 발현 벡터에 대한 하기의 유전 서열 정보를 포함한다:
서열번호 1은 발현 벡터 pMAB HC의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 2는 발현 벡터 pMAB LC(ires-dhfr)의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 3은 발현 벡터 pNAS-hGH의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 4는 발현 벡터 pNeu의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 5는 발현 벡터 pNeu-IRES-DHFR의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 6은 발현 벡터 pNeuMAB의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 7은 발현 벡터 pNeuMAB-IRES-DHFR (CMV)의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 8은 발현 벡터 pNeuMAB-IRES-DHFR의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
본 명세서에서 서열(sequence)은 서열번호(SEQ ID NO)와 동일하고 동등한 용어라는 것에 주의한다.
도 1b는 CHO DG44 세포에서 단일 사슬 단백질의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeu"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1c는 CHO D44 세포에서 단일 사슬 단백질의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeu-IRES-DHFR"로 지칭된 발현 벡터 맵이다. 제1 시스트론의 재조합 유전자 및 뒤이은 제2 시스트론의 DHFR 유전자를 갖는 디시스트론 발현 카세트(dicistronic expression cassette);
도 1d는 중쇄 및 경쇄 항체 사슬 및/또는 재조합 단일클론 항체의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeuMAB"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1e는 중쇄 및 경쇄 항체 사슬의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeuMAB-IRES-DHFR"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1f는 중쇄 및 경쇄 항체 사슬의 고수준 발현을 위해 이용되는 "pNeuMAB-IRES-DHFR (CMV)"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1g는 경쇄 (LC)의 발현을 위해 이용되는 "pMAB LC (IRES-DHFR)"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 1h는 중쇄 (HC)의 발현을 위해 이용되는 "pMAB HC"로 지칭된 발현 벡터 맵이다;
도 2는 사용된 다양한 배양물 및 세포에 대해 도시된 생존 세포의 밀도를 보여주는 성장 도표(growth chart)를 도시한다. 부모(parental) DG44 세포주 및 IGF-1 유전자를 발현하는 DG44 세포주 대비 hGH를 발현하는 DG44 세포주의 성장;
도 3은 다양한 바람직한 개체 및 배양물에 대한 시간 대비 생존 세포 밀도의 적분값(integral)을 비교하는 그래프를 도시한다; 및
도 4는 CHO DG44 세포 또는 NeuCHO 세포주로부터의 단백질의 상대적 발현 수준을 보여주는 비교 도표를 도시한다.
본 명세서는 또한 발현 벡터에 대한 하기의 유전 서열 정보를 포함한다:
서열번호 1은 발현 벡터 pMAB HC의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 2는 발현 벡터 pMAB LC(ires-dhfr)의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 3은 발현 벡터 pNAS-hGH의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 4는 발현 벡터 pNeu의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 5는 발현 벡터 pNeu-IRES-DHFR의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 6은 발현 벡터 pNeuMAB의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 7은 발현 벡터 pNeuMAB-IRES-DHFR (CMV)의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
서열번호 8은 발현 벡터 pNeuMAB-IRES-DHFR의 바람직한 코딩 서열을 기재한다;
본 명세서에서 서열(sequence)은 서열번호(SEQ ID NO)와 동일하고 동등한 용어라는 것에 주의한다.
발명의 설명
본 발명의 바람직한 구체예가 하기에서 첨부된 도면 및 비-한정적 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
세포의 배양 동안 이벤트는 단백질 및 보다 구체적으로 치료적 용도의 단백질의 생산을 위한 특정한 세포의 용도와 연관된 위험의 평가에 유의성 있게 기여할 수 있다는 것이 확인되었다.
발생 동안 세포의 이력 및 그 세포가 유래된 부모 세포주의 이력을 포함한 모든 조작의 성실한 기록이 최종 산물의 품질 및 안전성에 기여할 수 있다.
하나의 시나리오에서, 그러한 정보는 세포로부터 발현된 단백질 치료제의 규제적 허가를 얻기 위해 중요할 수 있다. 구체적으로, 바이오시밀러는 독특한 이슈를 제시한다. 이러한 이슈는 바이오시밀러의 면역원성이 대조 등재 약품 대비 변하지 않았다는 것을 입증하는 것, 및 약품의 안전성 및 효능에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 제품 중 검출되지 않는 차이가 없다는 것을 보장하는 것을 포함한다. 이러한 이슈를 해소하는 것은 광범위한 임상 시험의 수행 없이는 문제가 될 것이다. 따라서, 바이오시밀러에 대한 신청은 바이오시밀러와 대조 등재 약품 간에 안전성, 순도 및 강도에 있어서 임상적으로 유의한 차이가 없다는 것을 입증하는 것이 요구될 것이다. 또한, 바이오시밀러에 대한 신청은 (동일한 생물학적 제품을 입증하는 것은 비현실적이므로) 바이오시밀러가 "매우 높은 유사성(profound similarity)"를 갖고, 바이오시밀러가 환자에서 대조 등재 약품과 동일한 임상 결과를 생성할 것이라는 증거를 제공하는 것이 필요할 것이다.
규제적 허가를 얻기 위해, 전통적인 제네릭 제조사들은 그들의 약품이 대조 등재 약품과 화학적으로 동일하고 인간 신체에서 오리지널 약품과 동일한 특성을 보일 것을 입증하도록 요구된다. 바이오시밀러의 경우, 잠재적으로 개별적인(disparate) 생물학적 시스템에서 약품의 합성의 복잡성 때문에, 제2-소스(second-source) 생물학적 약품이 혁신 약품과 명백하게 동일하다는 것을 용이하게 입증하는 것이 이전에 가능하지 않았다. 따라서, 바이오시밀러는 오리지널 약품 대비 약간 상이한 특성을 보일 수 있고, 규제적 허가를 얻기 위해 약식 임상 시험이 요구될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "오염물(contaminating agent)"은 감독 기관에 의한 제품의 규제적 허가를 잠재적으로 손상시킬 수 있는 물질을 의미한다. 이러한 물질은 우발적 물질, 예를 들면, 바이러스, 박테리아, 균류, 및 마이코플라스마, 또는 그들로부터 유래된 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포에서 발현된 산물(cell expressed product)"은 세포에 의해 생성되는 산물을 의미하고, 단백질, 펩티드, 당단백질(glycoprotein), 탄수화물, 지질, 당지질(glycolipid) 및 핵산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "규제적 허가(regulatory approval)"는 본 명세서에서 정의된 산물과 관련되는 한, 제품의 시판을 허용하는 감독 기관으로부터의 허가를 의미한다.
용어 "안전성 및 유효성 연구(safety and effectiveness studies)"는 인간 및/또는 동물 투여를 위한 제품(산물)의 안전성 및 효능을 평가하는, 제품에 대해 수행된 연구를 의미한다.
용어 "임상 시험(clinical trial)"은 치료적 적용을 위한 제품의 안전성 및/또는 효능을 평가하도록 설계된, 동물 또는 인간을 포함하는 연구를 의미한다.
용어 "약식 안전성 효능성 연구 및/또는 약식 임상 시험(abbreviated safety effectiveness studies and/or abbreviated clinical trials)"은 완전한 I, II, 및III 상 임상 시험을 수반하지 않는 약품에 대해 수행되는 연구를 의미한다. 이러한 연구는 미국 식품의약국 (FDA)에 의해 정의된 생동성 심사 및 화학/미생물 심사를 포함할 수 있다.
용어 "바이오시밀러 약품(biosimilar drug)" 및 "바이오시밀러(biosimilar)"는 특허 보호가 만료된 약품의 생동성 약품으로서, 이전의 보호된 약품이 규제적 허가를 받은 것인 약품을 의미한다. 구체적으로, 이는 재조합 DNA 기술에 의한 세포 배양에서 제조된 산물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "바이오시밀러 약품(biosimilar drug)" 및 "바이오시밀러(biosimilar)"는 용어 "후속 생물의약품 (follow-on biological)" 또는 "바이오시밀러"와 동등하다.
용어 "단백질(protein)"은 "완전한(complete)" 단백질, 및 하나 이상의 아미노산 첨가, 결실, 또는 치환을 포함하나, 완전한 단백질의 생물학적 활성을 실질적으로 유지하는 그의 단편, 유도체, 또는 동족체(homolog) 또는 키메라를 의미한다.
본 발명의 구체예가 하기의 비-한정적 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
실시예 1
재조합 치료 단백질의 고 수준 발현을 위한 pNeu 및 pNAS 벡터의 작제
치료 단백질의 제조를 위한 단일 사슬 펩티드의 고-수준 발현을 위해 벡터 pNeu를 설계하였다. 상기 벡터는 CHO 세포에서의 발현을 위해 알맞은 다중 클로닝 부위로의 DNA 서열의 삽입을 촉진한다. 상기 벡터 및 그의 성분 특징의 설명에 대해 표 1 및 도 1a를 참조한다.
이 5026 bp 벡터는 재조합 유전자의 효율적인 발현을 위한 필수적인 코딩 및 조절 서열, 및 박테리아에서 플라스미드의 선택 및 증식을 위한 필수적 서열을 코딩한다. 이 벡터는 화학적 합성을 위해 설계되었고, 상업적 발현 벡터에서 통상적 성분인 비필수적이고 중복된 서열을 포함하지 않는다. 이는 플라스미드 증식 동안, 발현의 상실을 초래하는 서열 결실의 더 낮은 가능성으로, 게놈 삽입의 용이성을 가능하게 한다. 다중 클로닝 부위는 신속한 유전자 클로닝을 위한 최소 두 개의 독특한 제한효소 인식 부위(restriction stie)를 코딩한다.
실시예 2
인간 성장 호르몬 (hGH) cDNA의 합성 및 pNAS로의 클로닝
hGH를 코딩하는 아미노산 서열에 독일, 레젠버그, GENEART AG에 의한, 사유 제3자 소프트웨어(proprietary third party software)를 통한 생물정보학 분석을 수행하였다. CHO 세포에서 mRNA 유지 및 이용가능한 tRNA 풀의 이용을 개선하는 것에 의해 발현을 최대화하기 위해 코돈 옵션(codon option)이 이용되었다. 코딩 서열에 대해 RNA 및 코돈 최적화를 수행하였다. CHO 세포에서 유전자 발현을 증가시킬 목적으로 스플라이싱 부위 인식(splice site recognition), mRNA 안정성, 리보솜 결합 부위(ribosomal entry site)의 존재, mRNA 이차 구조, 자가-상동성(self-homology)에 대해 유전자를 분석하였다. hGH 유전자를 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 AgeI 및 EcoRV 제한효소 인식 부위를 이용하여 pNAS로 클로닝시켰다.
실시예 3
재조합 단일클론 항체의 발현을 위한 pNeuMAB 벡터의 작제
재조합 단일클론 항체의 클로닝 및 발현을 위해 pNeuMAB 벡터를 설계하였다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA가 벡터에서 두 개의 별개의 탠덤 전사 유닛(distinct and tandem transcription unit)으로 배열된다. 벡터의 설명 및 그의 구성성분 특징은 표 1 및 도 1b를 참조한다.
항체-인플릭시맙의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA의 합성
단일클론 항체, 인플릭시맙(Infliximab)의 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 코딩하는 아미노산 서열에 독일, 레젠버그, GENEART AG에 의한, 사유 제3자 소프트웨어를 통한 생물정보학 분석을 수행하였다. CHO 세포에서 mRNA 유지 및 이용가능한 tRNA 풀의 이용을 개선하는 것에 의해 발현을 최대화하기 위해 코돈 옵션(codon option)이 이용되었다. 코딩 서열에 대해 RNA 및 코돈 최적화를 수행하였다. CHO 세포에서 유전자 발현을 증가시킬 목적으로 스플라이싱 부위 인식, mRNA 안정성, 리보솜 결합 부위의 존재, mRNA 이차 구조, 자가-상동성에 대해 유전자를 분석하였다.
인플릭시맙의 중쇄를 코딩하는 유전자의 클로닝
인플릭시맙의 중쇄를 코딩하는 합성 유전자를 합성 올리고뉴클레오티드 및/또는 PCR 산물로부터 조립하였다. 단편을 AscI 및 PacI 제한효소 인식 부위를 이용하여 pGA14 (ampR) 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고(Pure Yield™ Plasmid Midiprep, Promega) UV 분광분석법에 의해 농도를 결정하였다. 최종 구조체를 서열결정에 의해 확인하였다. 사용된 제한효소 부위 내에서 서열 일치(sequence congruence)는 100%였다. 동일한 제한효소 인식부위로 처리된 NewClone의 항체 발현 벡터, pNewMAB의 제1 다중 클로닝 부위 내로의 방향성 클로닝(directional cloning)을 위해 인플릭시맙의 중쇄를 코딩하는 합성 cDNA 서열을 각각 5' 및 3' 말단에 고유한 제한효소 인식 부위 AgeI 및 EcoRV를 내포하도록 설계하였다.
인플릭시맙의 경쇄를 코딩하는 유전자의 클로닝
인플릭시맙의 경쇄를 코딩하는 합성 유전자를 합성 올리고뉴클레오티드 및/또는 PCR 산물로부터 조립하였다. 단편을 AscI 및 PacI 제한효소 인식 부위를 이용하여 pGA18 (ampR) 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고(Pure Yield™ Plasmid Midiprep, Promega) UV 분광분석법에 의해 농도를 결정하였다. 최종 구조체를 서열결정에 의해 확인하였다. 사용된 제한효소 부위 내에서 서열 일치는 100%였다. 동일한 제한효소 인식부위로 처리된 NewClone의 항체 발현 벡터, pNewMAB의 제2 다중 클로닝 부위 내로의 방향성 클로닝을 위해 인플릭시맙의 경쇄를 코딩하는 합성 cDNA 서열을 각각 5' 및 3' 말단에 고유한 제한효소 인식 부위 SalI 및 MluI를 내포하도록 설계하였다.
NeuCHO의 생성
pNAS-hGH에 의한 DG44 세포의 형질감염(transfection)
인간 성장 호르몬을 코딩하는 발현 벡터를 숙주 CHO DG44 세포주 및 숙주 내의 rDNA 상태(카피수 등)로 도입하는 바람직한 방법 중 하나는 하기와 같다. 요약하면, 총 1.5 x 10e7 개의 세포를 30 ml의 용량으로 15 ㎕의 FreeStyle MAX Reagent (Invitrogen)과 함께 1.8 ㎍의 선형화된(linearized) 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포 배양물을 회전 진탕기 플랫폼(orbital shaker platform) 상에서 37℃, 8% CO2로 인큐베이션시켰다. 형질감염 후 48시간차에, 세포를 플라스미드 DNA의 흡수의 선택을 위해 500 ㎍/ml의 최종 농도로 겐타마이신으로 보충된 하이포크산틴(hypoxanthine)- 및 티미딘-결핍 배지에서 배양하였다. 한계 희석 클로닝(limiting dilution cloning)에 의해 클론을 선택하였다. 단일 세포로부터 유래된 여러 개의 단일 클론을 확장시키고, 인간 성장 호르몬의 생산에 대해 세포주를 동정하였다. 결과적으로 수득된 클론을 표준 CHO DG44 세포주 대비 성장 특성에 대해 조사하였다.
인플릭시맙 유전자를 코딩하는 pNeuMAB에 의한 NeuCHO의 형질감염
인플릭시맙 유전자를 코딩하는 선형화된 플라스미드 pNeuMAB DNA를 이용하여 NeuCHO 세포 배양물을 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 차에, DHFR 유전자를 발현하는 세포를 선택하기 위해, 세포를 하이포크산틴(hypoxanthine)- 및 티미딘-결핍 배지에서 배양하였다. 그 후, 안정한 세포 집단을 단계적으로 증가되는 메토트렉세이트(MTX) 농도 (50-, 100-, 200-, 400-, 800nM, 1μM)에 노출시켜 주형(template) DNA 카피 수 및 유전자 발현을 증폭시켰다. 한계 희석 클로닝에 의해 클론을 선택하였다. 인플릭시맙 단백질의 고 수준 발현을 갖는 클론을 단백질 생산을 위해 확대(scale up)시켰다.
실시예 4
세포 은행 작제(Cell Banking)
품질 관리의 중대한 부분은 세포의 완전한 동정(characterization)을 포함한다. 세포 은행을 우발적인 물질(adventitious agent)(바이러스, 박테리아, 균류, 및 마이코플라스마)에 대해 조사한다. 사용된 은행 시스템(banking system)의 타입, 세포 은행의 크기, 용기(사용된 바이알, 앰플, 및 폐쇄(closure) 시스템), 사용된 동결보존제 및 배지를 포함한, 세포 은행의 제조를 위해 사용된 방법, 및 동결보존 및 보관을 위해 이용된 조건을 기술하는 기록(documentation)이 제공된다.
미생물 오염 및 실험실에 존재하는 다른 세포 타입에 의한 교차-오염(cross-contamination)을 피하기 위해 사용된 절차, 및 세포 은행 용기가 추적될 수 있게 하는 절차가 모두 이용가능하다. 이는 기록(documentation) 시스템의 설명 및 용기 상의 라벨링(labelling) 정보의 소실 없이 보존, 보관 및 보관으로부터의 회수 과정을 견딜 수 있는 라벨링 시스템의 설명을 포함한다.
생산이 잘-정의된 마스터(master) 세포 은행 및 워킹(working) 세포 은행 시스템에 기초하는 것이 필수적이다. 세포 은행의 구축 동안, 동일한 실험실이나 또는 동일인에 의해 다른 세포주가 동시에 취급되어서는 안 된다. 모든 세포 은행에 대해 기원, 형태, 보관, 사용 및 사용 예상 속도에 따른 기대되는 사용 기간(expected duration)이 모두 기재된다.
하기 표는 CHO DG44 또는 NeuCHO 세포주를 이용한 다양한 발현 벡터의 구성성분 및 특징을 확인한다. 데이터는 이 특허 명세서에서 제시의 목적으로 3개의 표로 분리되었다.
도 1a 내지 1h는 CHO DG44 세포주 또는 NeuCHO 세포주를 이용한 발현에 관련된 일련의 발현 벡터 맵을 도시한다.
보다 구체적으로, 도 1a는 CHO DG44로부터 NeuCHO 세포주를 구축하는데 이용하기 위한 hGH 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터 pNAS를 도시한다. 바람직하게는, NeuCHO 세포주는 CHO-DG44 세포주 내에 도 1a에 도시된 벡터의 내포에 의해 제조된다. 이 발현 벡터의 유전자 서열은 이 출원과 함께 제출되며 서열번호 1로 표시된다.
CHO DG44 세포주는 내재적으로 장기적 생존력(viability), 세포 밀도 및 집단 안정성에 대한 이슈 및 문제를 갖는 상대적으로 취약한 세포주를 포함한다는 것이 주목된다.
이 바람직한 구체예에서, 세포 배양 벡터로의 hGH의 첨가는 기존의 기법 및 서열을 이용하여 이전에 실현가능하지 않았던 세포 밀도 또는 생산의 증가를 가져올 수 있다. 이전에, CHO 세포 (예를 들면, DG44)를 보완하기 위해 IGF-1 및 인슐린과 같은 성장 인자가 이용되었다. 그러나, 이러한 이전의 방법은 세포 생존력(viability) 및/또는 생존률(survival) 측면에서 실망스러운 결과를 가져온다. 본 발명의 구체예에서, CHO 세포에 hGH 코딩 서열을 첨가하는 것은 CHO-DG44 세포에 의한 hGH의 분비를 가능하게 한다. 이러한 hGH의 발현 및 세포 배지로의 분비는 CHO 세포의 세포 생존률의 증가를 가져온다.
또한, hGH의 발현은 다른 CHO 세포주 대비 NeuCHO 세포주의 강건성(robustness)을 개선시킬 수 있다.
보다 구체적으로, CHO-DG44 세포에 hGH 발현 서열을 첨가하는 것은 새로운 세포주, NeuCHO 세포주를 생성시켰다. NeuCHO 세포주는 도 1a 내지 1h에 대해 기재되고 표시된 발현 벡터를 포함할 수 있다.
부다페스트 조약에 따라, 2013년 2월 4일, 호주, 웨스트미드, NSW, 2145, 헉스베리 로드, 214(214 Hawkesbury Rd, Westmead, NSW, 2145, Australia)에 위치한 호주 세포 은행(Cell Bank Austrailia)에 기탁되고, 수탁번호 CBA20130024를 부여받은 NeuCho 세포주는 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 의약품 제조에서 사용하기에 특히 적합하다.
바람직하게는, CHO-DG44 세포주를 pNAS-hGH 벡터로 형질감염시켜 NeuCHO 세포주를 생성했다. 가능한 형질감염(transfection) 방법은 칼슘 포스페이트 침전, PEI, 전기천공 및 리포펙션(lipofection)을 포함하는, 과학 문헌에 기재된 표준 방법들을 포함한다. 당해 분야에서 이전의 교시는 종종 보다 우수한 결과를 얻기 위해 형질감염에 의해 보다 높은 상대적 수준의 DNA를 세포로 전달하는 것이 바람직하다고 주장했다는 것이 주목된다. 그러나, 보다 많은 DNA를 세포로 전달하는 형질감염 방법은, 세포주가 덜 안정하고 덜 강건할 수 있기 때문에 더 안정하거나 또는 생산성이 높은(high producing) 세포주를 생성하지 않는다.
도 1b는 CHO DG44 세포에서 단일 사슬 단백질의 발현을 위해 이용된 발현 벡터를 도시한다. 바람직하게는, 재조합 유전자 발현은 벡터 내의 SV40 조기 프로모터/인핸서에 의해 구동(drive)될 수 있다. 이 발현 벡터의 유전 서열은 이 출원과 함께 제출되었고 서열번호 2로 표시된다.
도 1c는 CHO DG44 세포에서 단일 사슬 단백질의 발현을 위해 이용된 발현 벡터를 도시한다. 바람직하게는, 이 실시예에서 제1 시스트론에 재조합 유전자를 갖고, 뒤이어 제2 시스트론에 DHFR 유전자를 갖는 디시스트론 발현 카세트(dicistronic expression cassette)가 기재된다. 이 벡터에서 유전자 발현은 바람직하게는 SV40 조기 프로모터 또는 인핸서에 의해 구동된다. 이 발현 벡터의 유전 서열은 이 출원과 함께 제출되었고 서열번호 3으로 표시된다.
도 1d는 중쇄 및 경쇄 유전자를 단일 벡터로 삽입하기 위한 2개의 클로닝 카세트를 포함하는 이중 발현 벡터(dual expression vector)인 pNeuMAB를 도시한다. 이 발현 벡터는 복수의 재조합 유전자의 삽입을 위한 두 개의 유전자 발현 카세트를 갖는다. 각 카세트는 SV40 조기 프로모터 및 하류 폴리 A 서열을 포함한다. 각 유전자는 인핸서 서열 내에 있는 SV40 조기 프로모터에 의해 구동된다. 이 발현 벡터는 항체의 경쇄 및 중쇄 발현을 위해 적합하다. 이 발현 벡터의 유전 서열은 이 출원과 함께 제출되었고 서열번호 4로 표시된다.
도 1e는 SV40 프로모터 및 인핸서에 의해 구동되는 단일 벡터 상에서 재조합 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 고 수준 발현을 위한 추가적인 발현 벡터, pNeuMAB-IRES-DHFR을 도시한다. 이 발현 벡터는 항체의 경쇄 및 중쇄의 발현을 위해 이용될 수 있다. 이 발현 벡터는 일반적으로 재조합 유전자의 삽입을 위한 두 개의 유전자 발현 카세트를 포함한다. 각 카세트는 SV40 조기 프로모터/인핸서 및 하류 폴리 A 서열로 구성된다. 중쇄 및 경쇄가 각각 제1 카세트 및 제2 카세트에 삽입된다. 제2 카세트는 경쇄 및 뒤이어 IRES의 하류에 DHFR을 갖는 디시스트론 구조이다. 이 발현 벡터의 유전 서열은 이 출원과 함께 제출되었고 서열번호 5로 표시된다.
도 1f는 각각 항체의 중쇄 및 경쇄의 CMV 및 SV40 프로모터에 의해 구동되는 단일 벡터 상에서 재조합 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 고 수준 발현을 위한 추가적인 발현 벡터, pNeuMAB-IRES-DHFR-(CMV)를 도시한다. DHFR 유전자는 경쇄 유전자의 하류에 있는 IRES에 의해 구동된다; 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현을 위해 상호 간에 반대 배향을 갖는다. 중쇄는 CMV 프로모터에 의해 구동되고, 반면에, 경쇄는 SV40 프로모터/인핸서에 의해 구동된다. 경쇄 및 DHFR 유전자는 DHFR이 IRES의 하류에 있는 디시스트론 배열(dicistronic configuration)을 갖는다. 이 발현 벡터의 유전 서열은 이 출원과 함께 제출되었고 서열번호 6으로 표시된다.
도 1g는 항체의 경쇄 (LC) 만의 발현을 위한, 추가적인 발현 벡터, pMAB-LC (ires-dhfr)를 도시한다. 제1 시스트론에 LC를 클로닝하고, IRES의 하류에 있는 제2 카세트에 DHFR을 클로닝하는 디시스트론 카세트이다. 이 벡터는 도 1h에 도시된 발현 벡터인 pMAB HC와의 공-형질감염(co-transfection)을 위해 이용된다. 이 발현 벡터의 유전 서열은 이 출원과 함께 제출되었고, 서열번호 7로 표시된다.
도 1h는 항체의 중쇄 (HC) 만의 발현을 위한, 추가적인 발현 벡터, pMAB-HC 를 도시한다. pMAB-LC 및 pMAb-HC가 완전한 항체의 발현을 위해 공-형질감염된다. 이 발현 벡터의 유전 서열은 이 출원과 함께 제출되었고, 서열번호 8로 표시된다.
추가적인 그래프가 도 2에 도시된다. 도 2의 그래프는 부모 DG44 세포주 및 모의 세포주 (Mock Cell Line) 대비, IGF-1 또는 hGH를 발현하는 DG44 세포주의 성장을 나타낸다. 대조(모의) 세포주는 선택 마커를 포함하나, 목적 유전자(gene of interest) (GOI)를 포함하지 않는 DNA 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 부모 세포주로부터 유래된다.
바람직한 NeuCHO 세포주는 최초의 부모 DG44 세포주 대비 탁월한 성장 잇점을 보인다. 이 실시예에서, NeuCHO 세포의 성장은 IGF-1 유전자를 발현하는 DG44 세포주의 생존 세포 밀도보다 더 높은 생존 세포 밀도를 보인다.
이 그래프는 DG44 세포가 인간 성장 호르몬을 발현하는 경우, (라인 그래프 E 및 F), 세포는 비형질감염 DG44 부모 세포주, 모의 형질감염 세포주, 및 고 수준 또는 저 수준의 IGF-1 단백질을 발현하는 DG44 세포주에 비해 매우 높은 최대 생존 세포 밀도(Maximum Viable Cell Density) (최대 425%까지)를 갖는다는 것을 보여준다.
NeuCHO 세포주는 최대 3.67 X 107 세포/일/mL의 총 세포 밀도(Integral Cell Density)를 갖고, 이는 부모 DG44 세포주의 총 세포 밀도, 1.57 X 107 세포/일/mL의 230%이다.
또한 도 2에서, 생존 세포 밀도는 Y-축 상에 세포/mL로 도시되고, 배양일수(number of days in culture)가 X-축에 도시된다. 6개의 라인 그래프, 즉, 라인 그래프 A, B, C, D, E, 및 F가 이 도면에 표시된다.
라인 A는 DNA로 형질감염되지 않은 부모 DG44 세포주의 성장 패턴을 나타낸다.
라인 B는 선택 마커를 포함하나, 목적 유전자(GOI)를 포함하지 않는 DNA 플라스미드로 형질감염된 부모 DG44 세포주의 성장 패턴을 나타낸다.
라인 C는 선택 마커 및 목적 유전자 (GOI)를 포함하는 DNA 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 부모 DG44 세포주의 성장 패턴을 나타낸다. 여기에서 GOI는 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1)이다.
라인 D는 선택 마커 및 목적 유전자 (GOI)를 모두 포함하는 DNA 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 부모 DG44 세포주의 성장 패턴을 나타낸다. 여기에서 GOI는 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1)이다.
라인 E는 선택 마커 및 목적 유전자 (GOI)를 모두 포함하는 DNA 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 부모 DG44 세포주의 성장 패턴을 나타낸다. 여기에서 GOI는 인간 성장 호르몬 (hGH)이다.
라인 F는 선택 마커 및 목적 유전자 (GOI)를 모두 포함하는 DNA 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 부모 DG44 세포주의 성장 패턴을 나타낸다. 이 실시예에서 바람직한 GOI는 인간 성장 호르몬 (hGH)이다.
도 3에서, NeuCHO의 생존 세포 밀도의 적분값(integral of viable cell densities) (IVCD)을 표준 CHO DG44 세포와 비교하는 추가적인 그래프가 도시된다. 이 도면은 부모 CHO 세포 대비 부모 세포주 NeuCHO로 달성된 생존 세포 밀도의 적분값의 차이를 보여준다.
NeuCHO 세포주는 성장 능력이 탁월하고, 이는 보다 높은 생산 속도, 보다 적은 생산 운영(production run), 및 따라서 더 낮은 생산 비용, 더 낮은 매출 원가(Cost of Goods)(COGS)를 갖는 것에 의해 비용을 최소화할 수 있는 더 효율적인 생산 공정으로 전환된다.
재조합 mAB를 발현하는 NeuCHO 세포주의 성장 및 생산성.
바람직한 NeuCHO 세포주는 전통적인 CHO 발현 시스템에 비해 mAB x의 높은 역가(titre)를 보인다.
도 5는 그래프 형태로, NeuCHO 세포가 CHO 세포 (예를 들면, CHO DG44 세포)보다 더 안정한 형질감염 효율성을 가질 수 있다는 것을 보여준다. 세포 (NeuCHO 및 CHO)를 안정한 풀로부터의 선택 및 단일 세포 클로닝 전에 mAB 'x'를 코딩하는 DNA에 의해 형질감염시켰다. 데이터가 도 5에 표시되며, NeuCHO 세포의 안정한 형질감염이 표준 CHO 세포보다 고 생산성을 갖는 보다 많은 수의 클론을 가져온다는 것을 보여준다. 이 그래프는 주어진 시간에 상대적인 양으로 표시된 다양한 단백질의 수준을 보여준다.
NeuCHO 세포는 CHO DG44 세포주보다 약 230% 더 높은 생존 세포 밀도의 적분값을 갖는다. 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)을 발현하는 CHO DG44 세포주는 NeuCHO 세포주가 일반적으로 달성할 수 있는 것과 같은 높은 세포 밀도까지 성장하는 능력을 보이지 않는다. NeuCHO 세포는 CHO DG44 세포보다 일반적으로 더 높은 형질감염 효율성을 갖는다. 형질감염된 NeuCHO 세포의 생존율은 일반적으로 형질감염된 CHO DG44 세포보다 높다. 추가적으로, NeuCHO 세포의 형질감염은 표준 CHO DG44 세포의 생산성보다 더 높은 생산성을 갖는 더 많은 수의 클론을 생성할 수 있다.
바람직하게는, 본 명세서에 기재된 발현 시스템 및 벡터는 NeuCHO 세포 또는 CHO DG44 세포와 같은 CHO 세포가 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 약제학적 제제를 위해 적합한 목적 단백질을 생산할 수 있게 하거나 또는 촉진할 수 있다: 인플릭시맙(Infliximab) 종양 괴사 인자(Remicab™으로 지칭됨); 아달리무맙(Adalimumab) 종양 괴사 인자(Humira™로 지칭됨); 에타네르셉트(Etanercept) 종양 괴사 인자(Enbrel™로 지칭됨); 리툭시맙(Rituximab) CD20 (Rituxan™ & MabThera™로 지칭됨); 베바시주맙(Bevacizumab) 혈관 내피 성장 인자(Avastin™으로 지칭됨); 트라스투주맙(Trastuzumab) HER2 (Herceptin™으로 지칭됨); 라니비주맙(Ranibizumab) 혈관 내피 성장 인자(Lucentis™로 지칭됨); 세툭시맙(Cetuximab) 표피 성장 인자 수용체 (Erbitux™); 에리트로포이에틴 α; 인터페론 α- 페길화 인터페론 알파-2a; 인터페론 α- 페길화 인터페론 알파-2b 및 hGH.
피더층(feeder layer)으로 사용될 때, NeuCHO 세포는 또한 단일 세포 클로닝의 효율성을 증가시킬 수 있다. NeuCHO 세포를 안정한 형질감염 풀의 단일 세포 클로닝 전에 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)의 단일 웰들에 접종했다. NeuCHO 세포로부터 분비되는 인간 성장 호르몬의 분비는 한계 희석 클로닝(Limiting Dilution Cloning) 후에 단일 세포의 증가된 생존율을 가져온다.
본 발명은 구체적인 실시예를 참조하여 설명되나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 본 명세서에 기재된 본 발명의 광범위한 원리 및 사상을 유지하면서, 다수의 다른 형태로 구현될 수 있는 것으로 이해할 것이다.
본 발명 및 기재된 바람직한 구체예는 구체적으로 산업상 이용가능한 하나 이상의 특징을 포함한다.
<110> NeuClone Biologics Pty Ltd
<120> A Cell Expression System
<130> 516448
<150> AU2013900808
<151> 2013-03-08
<150> AU2013900804
<151> 2013-03-08
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4183
<212> DNA
<213> Chinese Hamster Ovary (CHO) DG44 Cell
<400> 1
ccggtctagt taactagcac cgatatcaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat 60
tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 120
tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 180
aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 240
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 300
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 360
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 420
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 480
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 540
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 600
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 660
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 720
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 780
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 840
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 900
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 960
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 1020
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 1080
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 1140
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 1200
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 1260
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 1320
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1380
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1440
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 1500
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 1560
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 1620
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 1680
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 1740
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 1800
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 1860
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 1920
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 1980
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 2040
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 2100
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 2160
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 2220
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 2280
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 2340
ccacctgacg tccacacaaa aaaccaacac acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat 2400
tgcggccatc gtgatggcag gttgggcgtc gcttggtcgg tcatttcgaa ccccagagtc 2460
ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg 2520
cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat 2580
cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga 2640
tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg 2700
tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg 2760
gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc 2820
gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat 2880
caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa 2940
ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg 3000
cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata 3060
gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa 3120
gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct 3180
gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca 3240
atccatcttg ttcaatcata gctcagaggc cgaggcggcc tcggcctctg cataaataaa 3300
aaaaattagt cagccatggg gcggagaatg ggcggaactg ggcggagctc agaggccgag 3360
gcggcctcgg cctctgcata aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg agaatgggcg 3420
gaactgggcg gggatcctca atattggcca ttagccatat tattcattgg ttatatagca 3480
taaatcaata ttggctattg gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt 3540
tatattggct catgtccaat atgaccgcca tgttggcatt gattattgac tagttattaa 3600
tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 3660
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 3720
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 3780
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc 3840
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 3900
cgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 3960
cggttttggc agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 4020
ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 4080
aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 4140
gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatca aaa 4183
<210> 2
<211> 5122
<212> DNA
<213> Chinese Hamster Ovary (CHO) DG44 Cell
<400> 2
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gctattgtaa aattcatgtt atatggaggg ggcaaagttt tcagggtgtt gtttagaatg 540
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gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 3480
ctatgaccat gattacgaat tccagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 3540
cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag 3600
gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 3660
gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 3720
cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 3780
ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 3840
caaaaagcga tcctgagaac ttcagggtga gtttggggac ccttgattgt tctttctttt 3900
tcgctattgt aaaattcatg ttatatggag ggggcaaagt tttcagggtg ttgtttagaa 3960
tgggaagatg tcccttgtat caccatggac cctcatgata attttgtttc tttcactttc 4020
tactctgttg acaaccattg tctcctctta ttttcttttc attttctgta actttttcgt 4080
taaactttag cttgcatttg taacgaattt ttaaattcac ttttgtttat ttgtcagatt 4140
gtaagtactt tctctaatca cttttttttc aaggcaatca gggtatatta tattgtactt 4200
cagcacagtt ttagagaaca attgttataa ttaaatgata aggtagaata tttctgcata 4260
taaattctgg ctggcgtgga aatattctta ttggtagaaa caactacatc ctggtcatca 4320
tcctgccttt ctctttatgg ttacaatgat atacactgtt tgagatgagg ataaaatact 4380
ctgagtccaa accgggcccc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 4440
tcctgggcaa cgtgctggtt gttgtgctgt ctcatcattt tggcaaaacc ggttagtgat 4500
atcaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 4560
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 4620
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc ccgggcgcag caccatggcc 4680
tgaaataacc tctgaaagag gaacttggtt aggtaccttc tgaggcggaa agaaccagct 4740
gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 4800
gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc 4860
aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac 4920
tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 4980
aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 5040
gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctgatcctga gaacttcagg 5100
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ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 5280
cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 5340
atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 5400
tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 5460
ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 5520
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aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttgttgtg 5700
ctgtctcatc attttggcaa agtcgacgac gaacgcgtta acgttactgg ccgaagccgc 5760
ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgtgatttt ccaccatatt gccgtctttt 5820
ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt 5880
tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg 5940
gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca 6000
cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg 6060
gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc 6120
tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct 6180
gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta 6240
ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata at 6292
Claims (30)
- 단백질 발현을 위한 발현 시스템으로서,
디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 결함을 갖는 진핵생물 숙주 세포; 및
인간 성장 호르몬 (hGH) 유전자를 코딩하는 발현 벡터; 및
발현 벡터로서,
상기 숙주 세포에서 DHFR 결함을 보완하기 위한 디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 서열의 발현을 구동하는 최소(minimal) SV40 조기 프로모터를 포함하는 진핵생물 선택 마커;
원핵 생물에 암피실린 저항성을 전달하는 원핵생물 선택 마커;
원핵 생물 복제 원점(prokaryotic Origin of Replication);
복수의 다중 클로닝 부위(MCS); 및
하나 이상의 단백질 발현 모듈로서,
72 bp 인핸서 반복 서열(enhancer repeat)을 포함하는, SV40(Simian Vacuolating Virus 40) 조기 프로모터, 및 코딩 서열을 수용하고, 그로부터 목적 단백질(desired protein)을 발현시키기 위한, 제1 다중 클로닝 부위에 의해 SV40 pA 서열로부터 분리가능한 토끼 β-글로빈 인트론 서열을 포함하는 것인 하나 이상의 단백질 발현 모듈을 포함하는 단백질 발현 모듈을 포함하는 것인 발현 벡터를 포함하는, 발현 시스템. - 청구항 1에 있어서, 제2 단백질 발현 모듈을 더 포함하고, 상기 제2 단백질 발현 모듈은 상기 발현 모듈로부터 두 개 이상의 단백질의 공-발현을 위해 제2 다중 클로닝 부위에 의해 SV40 pA 서열로부터 분리가능한 사이토메갈로바이러스를 포함하는 것인 발현 시스템.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 단백질은 규제적 허가에 대한 요구의 대상이고, 상기 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하기 위해 상기 숙주 세포에 복수의 미리 정해진 조작(manipulation)이 수행되며, 각 조작에 대한 정보가 기록되고, 각 조작은 상기 숙주 세포와 오염물 간의 접촉을 피하는 방식으로 수행되고, 상기 정보는 약품의 안전성 및 효능을 평가하는데 관련된 감독 기관으로의 제출에 포함되어 상기 단백질의 규제적 허가를 촉진하기 위한 상기 숙주 세포의 이력의 생성에 이용되는 것인 발현 시스템.
- 청구항 3에 있어서, 상기 미리 결정된 조작은
(i) 상기 목적 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 상기 발현 벡터 내로 라이게이션시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(ii) 상기 재조합 벡터를 상기 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및
(iii) 상기 단백질이 상기 숙주 세포에 의해 발현되게 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 발현 시스템. - 청구항 4에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 숙주 세포의 게놈 내로 적어도 부분적으로 통합되는 것인 발현 시스템.
- 청구항 4 또는 5에 있어서, 단계 (iii)은 상기 숙주 세포를 동물 또는 식물 유래 단백질 또는 펩티드 및 정의되지 않은(undefined) 가수분해물 또는 용해물을 포함하지 않는 배지에서 배양하여, 상기 숙주 세포와 오염물(contaminating agent) 간의 접촉을 감소시키는 것을 포함하는 것인 발현 시스템.
- 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary) DG44 세포인 것인 발현 시스템.
- 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 바이오시밀러 약품인 것인 발현 시스템.
- 청구항 1 또는 2에 따른 발현 시스템에 의해 발현되는 단백질의 개발을 관리하는 방법으로서, 상기 단백질은 규제적 허가의 요구의 대상이고, 상기 방법은:
a. 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하기 위해 상기 숙주 세포에 복수의 미리 정해진 조작을 적용하는 단계;
b. 각 조작에 대한 정보를 기록하는 단계로서, 각 조작은 상기 숙주 세포와 오염물 간의 접촉을 방지하는 방식으로 수행되는 것인 단계;
c. 상기 정보를 이용하여, 약물의 안전성 및 효능의 평가에 관련된 감독 기관으로의 제출에 포함시키기 위해 상기 숙주 세포의 이력(history record)을 생성하는 단계; 및
d. 상기 이력을 제품의 규제적 허가를 위해 감독 기관으로의 제출에 포함시키는 단계를 포함하는 것인 방법. - 청구항 11 또는 12에 있어서, 단계 (a)는
(i) 목적 단백질을 코딩하는 코딩 서열을 발현 벡터 내로 라이게이션시켜 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(ii) 상기 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및
(iii) 상기 단백질이 상기 숙주 세포에 의해 발현되게 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 청구항 13에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 숙주 세포의 게놈 내로 적어도 부분적으로 통합되는 것인 방법.
- 청구항 13 또는 14에 있어서, 단계 (iii)은 상기 숙주 세포를 동물 또는 식물 유래 단백질 또는 펩티드 및 정의되지 않은(undefined) 가수분해물 또는 용해물을 포함하지 않아, 상기 숙주 세포와 오염물 간의 접촉을 감소시키는 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 11 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 바이오시밀러 약품인 것인 방법.
- 청구항 11 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 규제적 허가는 약식 안전성 및 유효성 연구(abbreviated safety and effectiveness study) 및/또는 약식 임상 시험을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 11 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 규제적 허가는 안정성 유효성 연구 또는 임상 시험을 요구하지 않는 것인 방법.
- 호주 세포 은행(Cell Bank Austrailia)에 기탁되고, 수탁번호 20130024를 부여받은 NeuCHO 세포주, 또는 그의 계대배양물(subculture).
- 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) 결함을 갖는 진핵생물 숙주 세포;
인간 성장 호르몬 (hGH)을 코딩하는 발현 벡터; 및
발현 벡터로서,
진핵생물 선택 마커;
원핵생물 복제 원점; 및
프로모터, 코딩 서열을 수용하고, 그로부터 목적 단백질을 발현하기 위한 제1 다중 클로닝 부위에 의해 상기 프로모터부터 분리될 수 있는 인트론 서열을 포함하는 하나 이상의 단백질 발현 모듈을 포함하는 것인 발현 벡터를 포함하는, 단백질 발현을 위한 발현 시스템. - 청구항 17에 있어서, 상기 목적 단백질은 인플릭시맙(Infliximab) 종양 괴사 인자; 아달리무맙(Adalimumab) 종양 괴사 인자; 에타네르셉트(Etanercept) 종양 괴사 인자; 리툭시맙(Rituximab) CD20; 베바시주맙(Bevacizumab) 혈관 내피 성장 인자; 트라스투주맙(Trastuzumab) HER2; 라니비주맙(Ranibizumab) 혈관 내피 성장 인자; 세툭시맙(Cetuximab) 표피 성장 인자 수용체; 에리트로포이에틴 α; 인터페론 α-페길화 인터페론 알파 2a; 인터페론 α-페길화 인터페론 알파 2b 및 hGH로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 발현 시스템.
- 청구항 17에 있어서, 상기 숙주 세포는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포인 것인 발현 시스템.
- 청구항 18에 있어서, 상기 숙주 세포는 NeuCHO 세포주인 것인 발현 시스템.
- 청구항 19에 있어서, 상기 NeuCHO 세포주는 호주 세포 은행(Cell Bank Austrailia)에 기탁되고, 수탁번호 CBA20130024를 부여받은 NeuCHO 세포주, 또는 그의 계대배양물인 것인 발현 시스템.
- 목적 단백질의 생산을 위한 CHO 세포로서, 상기 세포는 상기 목적 단백질 및 hGH를 코딩하는 발현 벡터를 포함하고, 상기 목적 단백질은 상기 세포에 의해 분비되며, 상기 목적 단백질은 인플릭시맙 종양 괴사 인자; 아달리무맙 종양 괴사 인자; 에타네르셉트 종양 괴사 인자; 리툭시맙 CD20; 베바시주맙 혈관 내피 성장 인자; 트라스투주맙 HER2; 라니비주맙 혈관 내피 성장 인자; 세툭시맙 표피 성장 인자 수용체; 에리트로포이에틴 α; 인터페론 α-페길화 인터페론 알파 2a; 인터페론 α-페길화 인터페론 알파 2b 및 hGH로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 CHO 세포.
- 서열번호 1에 의해 형질감염된 CHO 세포.
- 서열번호 2에 의해 형질감염된 CHO 세포.
- 서열번호 3에 의해 형질감염된 CHO 세포로서, 상기 세포는 추가적으로 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 결함을 포함하는 것인 CHO 세포.
- 서열번호 4에 의해 형질감염된 CHO 세포.
- 서열번호 5에 의해 형질감염된 CHO 세포.
- 서열번호 6에 의해 형질감염된 CHO 세포.
- 서열번호 7에 의해 형질감염된 CHO 세포.
- 서열번호 8에 의해 형질감염된 CHO 세포.
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