JP2016510592A - 細胞発現系 - Google Patents

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Abstract

タンパク質を発現させるための発現系であって、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)欠損を有する真核生物宿主細胞と、ヒト成長ホルモンの遺伝子をコードする発現ベクターと、宿主細胞におけるDHFR欠損を補完するためのジヒドロ葉酸還元酵素をコードする配列の発現を推進する最小SV40初期プロモーターを含む真核生物選択マーカー、原核生物宿主細胞に対するアンピシリン耐性を与える原核生物選択マーカー、原核生物複製起点、複数の多重クローニング部位(MCS)、並びに72bpのエンハンサーリピートを含むサル空胞ウイルス40(SV40)初期プロモーター及びコード配列を入れてそこから所望のタンパク質を発現させるための第1の多重クローニング部位によってSV40 pA配列から分離できるウサギβ-グロビンイントロン配列を含む少なくとも1つのタンパク質発現モジュールを含む発現ベクターとを含む発現系。

Description

本発明は、発現系に関し、特に、本発明は、生物学的治療薬を生成するための発現系に関する。
組換えタンパク質などの生物学的治療薬又はバイオ医薬品を生成するための発現系は、一般に、所望の組換え治療薬をコードする核酸ベクターコンストラクト及び選択された宿主細胞からなる。ベクターを宿主細胞に導入し、所望の治療薬、すなわち、所望の組換えタンパク質を生成するために、内因性の細胞機構を利用する。認可されうる生物学的治療薬を生成するための効率的かつ信頼できる発現系を確立することの複雑さは、多岐にわたる。しかし、しっかりと確立された発現系は、他の方法では得ることが困難な医薬品を生成するための費用対効果に優れた代替手段を提供しうる。
系自体の効率は、ベクターの設計及び宿主細胞の選択を含めた様々な因子に依存している。ベクター配列中の調節エレメント、選択マーカー、及び安定性エレメントの戦略的組合せは、ベクターの操作及び適用が簡単であることと、所望の生物学的治療薬の生成収率が高いこととのバランスをとらなければならない。そのような発現系で宿主細胞として働く細胞の適切さは、主に、最終生成物における潜在的な外来混入物を最小に保ちながら、内因性の細胞機構とベクター内に存在する調節エレメントの間の適合性を最大にする必要性によって決まる。更に、系によって生成されるいかなる治療薬についても、利用性、費用、及び規制認可の受けやすさを考慮しなければならない。
発現系で使用される核酸ベクターには、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターが含まれる。これらのベクターは、大きさの異なる核酸インサートを収容するそれらの能力、及びそれらを宿主細胞内に導入するのに最も効率的な方法などの多くの特徴が異なり、とりわけ、所望のタンパク質の十分な発現を確実にするためにそれらのベクターが利用する、様々なタイプの宿主細胞における内因性の細胞機構が異なる。
そのような発現ベクターで一般的に存在する調節エレメントは、選択マーカー及び所望の生物学的治療薬をコードする配列の転写、翻訳、及びタンパク質合成に影響を与える。そのような調節エレメントには、プロモーター、ターミネーター、モディファイヤー、インスレーター、スペーサー、調節タンパク質結合部位、イントロン、インデューサーなどが含まれるが、これらに限定されない。
知られているプロモーターには、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、アクチンプロモーター、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーター、サル空胞ウイルス40(SV40)初期プロモーター、サイクリンT1プロモーター、RNAポリメラーゼIII U3プロモーター、シクロフィリンプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、オートグラファ核多角体ウイルス(AcNPV)P10プロモーター、及びβ3-ガラクトシルトランスフェラーゼ5(β3GAL-T5)プロモーターなどの構成的に活性なプロモーターが含まれる。
知られているプロモーターには、熱ショックタンパク質70(HSP70)プロモーター(ストレス誘導性)、熱ショックタンパク質90(HSP90)プロモーター(ストレス誘導性)、アルコールデヒドロゲナーゼI(alcA)プロモーター(アルコール誘導性)、活性化銅-メタロチオネイン発現(ACE1)プロモーター(金属誘導性)、リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼスモールサブユニット(SSU1)プロモーター(光誘導性)、低酸素誘導因子1α(hif1α) プロモーター(低酸素誘導性)、減数分裂のインデューサー2(IME2)プロモーター(飢餓誘導性)、グルココルチコイド受容体(ホルモン誘導性)、エストロゲン受容体(ホルモン誘導性)、及びエクジソン受容体(ホルモン誘導性)などの誘導性プロモーターも含まれる。
更に、nkx2.5プロモーター(心臓細胞)、islet-1プロモーター(膵臓細胞)、MyoDプロモーター(筋肉細胞)、分化クラスター2(CD2)プロモーター(T細胞)、及びコラーゲンIIプロモーター(軟骨)など、細胞型/組織特異的プロモーターは、細胞型の特異的な刺激又は発生段階の進行に反応して、それらの活性レベルを変えることが知られている。
RNAポリメラーゼIIターミネーター、核小体低分子RNA13(snR13)ターミネーター、ウシ成長ホルモン(BGH)ターミネーター、シミアンウイルス40(SV40)ターミネーター、及びチミジンキナーゼ(TK)ターミネーターなどの公知のターミネーターエレメントは、適したポリアデニル化シグナルを提供しうる。
公知のモディファイヤー及びインスレーターエレメントには、テトラサイクリンオペレーター/受容体(tetO/tetR)系、ガラクトース依存性GAL4転写因子の上流活性化配列(GAL4 UAS)、アデノウイルス初期領域B1 TATAボックス、単純ヘルペスウイルス(HSV)調節タンパク質VP16の結合部位、5'HS4ニワトリβグロビンインスレーター、父性発現遺伝子3(Peg3)インスレーター、及びウニアリールスルファターゼ(ARS)遺伝子インスレーターが含まれる。
認可されうる生物学的治療薬を生成するための効率的かつ信頼できる発現系を確立するために多くの試みがなされているが、生成されるバイオ医薬品の低収率及び外来混入に関する問題が残っている。おびただしい数の選択肢から、適した調節エレメントの最も有効な組合せを選択して、系が、安定性及び内因性の宿主細胞機構との最も高度な適合性をもたらすようにすることは、当技術分野における大きな課題となっている。
バイオ医薬品の規制認可を得ることが、更なる課題となっている。規制認可は、販売に先だつ医薬品の安全性及び有効性の決定を伴う。革新的薬品の規制認可を得るプロセスは、非常に時間と費用がかかる。しかし、いったん認可されれば、これらの薬品は、極めて大きな利益をもたらし、そのような薬品が、特許権保護などの排他的権利の下に販売される場合には、とりわけ大きな利益となる。
革新的薬品の市場の収益性は、特許権が期限切れとなったときには、この市場の利用を促す大きな誘因となりうる。特許の期限切れに続いて、革新的薬品が、ジェネリック薬品として、又は組換えDNA技術で生成された薬品の場合にはバイオシミラーとして販売される可能性がある。特許の期限切れが近いブロックバスターバイオ医薬品のジェネリック品には、Epogen(エリスロポエチン、EPO)及びNeupogen(顆粒球コロニー刺激因子、G-CSF)が含まれる。以前には、バイオ医薬品は、その特許権保護の期限切れ後でさえ競争を免れていたが、Pfizer社のGenotropin(組換え型ヒト成長ホルモン)の後発品の認可は、そのような状況の変化を示しているようだ。開発中となっているバイオ医薬品のジェネリック品は、現在、80を超える(Datamonitor社、2010年)。
バイオシミラーは、理想的には、革新的薬品の生物学的同等物であり、したがって、臨床データによる安全性及び有効性の立証が既に行われているので、バイオシミラーについての規制認可への道筋は、理論的には、先発品である革新的薬品ほど大変ではない。
ジェネリックバイオ医薬品の認可は、認可済みのバイオ医薬品(すなわち、参照リスト薬)と比較して、剤形、強度、投与経路、品質、性能特性、及び意図された使用が類似していることに依存している。例えば、米国食品医薬品局(FDA)の下では、ジェネリック薬品への認可は、「簡略化新薬申請書」(ANDA)を用いる。これは、一般に、安全性及び有用性を立証するための前臨床及び臨床データを含んでいない。また、認可には、生物学的同等性の審査が伴う。これは、提案されたジェネリック薬品が、参照リスト薬に生物学的に同等であることを立証するものである。この生物学的同等性は、ジェネリック薬品における、有効成分の吸収の速度及び程度が参照リスト薬のパラメーターの範囲内にあることの実証に基づいている。
重要なことは、ジェネリック薬品が、制御された条件下で再現可能な様式で製造され、その薬品が確実に安全かつ許容できる様式で作用することを保証する化学/微生物学審査プロセスがあることである。
バイオシミラー薬品認可のためのガイドラインは存在しているが、バイオシミラーの規制認可の実務事項に関しては不確実性がある。不確実性の多くは、そのような薬品の認可のための明確、実務的、かつ詳細な規制経路の不足及び生成物の類似性及び互換性に関する科学的な議論の不足によって生じている。革新的薬品で使用された条件とは異なる条件下でバイオシミラー薬品が製造されたことによって不確実性が生じていることは、バイオテクノロジー薬品の真の「ジェネリック」品の開発が不可能かもしれないことを示唆している。実際、欧州及び米国の規制当局は、「バイオジェネリック」という用語の使用を避け、「バイオシミラー」及び「後発生物製剤」という用語を好んで使用している。
発現系から得られるバイオ医薬品についての多くの品質上の懸念は、外来混入物の存在又は生成物を調製するのに使用される宿主細胞の特性から生じている。これらの生成物のうちいくつかは、系の発現ベクターに関する品質上の懸念も有している。細胞培養に関連する細胞特性及びイベントが、その結果生じる生成物の品質及び安全性に影響を与えうることは十分に立証されている。組換え生成物を有効に品質管理するためには、細胞及び細胞培養物の取り扱いの全側面について適切に制御する必要がある。これは、バイオシミラーの開発において特に重要である。
以前、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が、インスリンを生成するように改変及び遺伝子操作された。しかし、これらのCHO細胞は生物学的に活性なインスリンを発現することができなかった。そのため、このタイプのCHO細胞改変又はその方法に関連する特許は、商業利用されていなかった。インスリン遺伝子メッセージが、CHO細胞における翻訳機構によって、原因不明のスプライシングを受けるため、完全に機能的なインスリンはCHO細胞では生成されなかった。
本明細書中全体において、従来技術についてどのように論じてあっても、そのような従来技術が当該技術分野で広く知られている、又は技術知識常識の一部を形成していると認めているわけでは決してない。
本発明の目的は、従来技術の難点の少なくとも1つを克服若しくは改善すること、又はその有用な代替を提供することである。
本発明の第1の態様は、新規な発現系及び本発明による発現系を利用する方法に関するものでありうる。特定の実施形態では、それらは、収率を増大させ、かつ製造コストを低減するものでありうる。
本発明は、哺乳動物細胞培養を用いて、組換えバイオシミラー、バイオ医薬品、他の望ましいタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを生成する方法に関する。特に、本発明の方法は、低コスト培地中で複雑なタンパク質を生成するための特別にバイオエンジニアリングされた哺乳動物細胞系統の使用を伴う。これらの細胞系統は、安価であり、再現性があり、無タンパク質の完全人工培地中において、細胞が、その増殖因子要件を発現及び分泌して、自律的に増殖するための後天的な能力を有する。
したがって、第1の態様では、本発明は、タンパク質を発現させるための発現系であって、
ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)欠損を有する真核生物宿主細胞と、
ヒト成長ホルモン遺伝子をコードする発現ベクターと、
宿主細胞のDHFR欠損を補完するための、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする配列の下流にあり、それを発現させるための真核生物選択マーカー、
原核生物宿主細胞に対するアンピシリン耐性を与える原核生物選択マーカー、
原核生物複製起点、
複数の多重クローニング部位(MCS)、並びに
72bpのエンハンサーリピートを含むサル空胞ウイルス40(SV40)初期プロモーター、及びコード配列を入れて、そこから所望のタンパク質を発現させるための第1の多重クローニング部位によってSV40ポリアデニル化配列から分離できるウサギβ-グロビンイントロン配列
を含む少なくとも1つのタンパク質発現モジュール
を含む発現ベクターと
を含む発現系を提供する。
好ましくは、発現系は、第2のタンパク質発現モジュールを更に含み、第2のタンパク質発現モジュールは、少なくとも2つのタンパク質を発現モジュールから同時発現させるための第2の多重クローニング部位によってSV40ポリアデニル化配列から分離できるサイトメガロウイルスプロモーターを含む。
好ましくは、タンパク質が、規制認可を求める対象であり、宿主細胞が前記タンパク質を発現するように、宿主細胞が複数の所定の操作を受け、各操作に関する情報が記録され、混入物質との宿主細胞の接触を防止するように各操作が実行され、前記情報が、薬品の安全及び有効性の評価に関与する規制機関への提出物に含める、宿主細胞の履歴記録を作成するのに使用され、それによって、タンパク質の規制認可を早める。
所定の操作は、好ましくは、
(i)組換えベクターを生成するために、所望のタンパク質をコードするコード配列を発現ベクターにライゲーションする工程と、
(ii)宿主細胞に組換えベクターを導入する工程と、
(iii)宿主細胞によってタンパク質が発現されるような条件下で宿主細胞を培養する工程と
を含む。
好ましくは、組換えベクターが、宿主細胞のゲノムに少なくとも一部組み入れられる。工程(iii)は、動物又は植物由来のタンパク質又はペプチドも、未定義の加水分解物又は溶解物も含有しない培地中で宿主細胞を培養することを含み、それによって、混入物質との宿主細胞の接触を低減させる。
特に好ましい実施形態では、宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)DG44細胞である。
特定の好ましい実施形態では、宿主CHO DG44が成長ホルモンを発現する。特定の好ましい実施形態では、成長ホルモンがヒト成長ホルモンである。特定の好ましい実施形態では、タンパク質がバイオシミラー薬品でありうる。
第2の態様では、本発明は、第1の態様による発現系によって発現されるタンパク質の開発を管理する方法であって、タンパク質が、規制認可を求める対象であり、
a.細胞がタンパク質を発現するように、宿主細胞に複数の所定の操作を施す工程と、
b.混入物質との宿主細胞の接触を防止するように行われる各操作に関する情報を記録する工程と、
c.薬品の安全性及び有効性の評価に関与する規制機関への提出物に含める、宿主細胞に関する履歴記録を作成するのに情報を使用する工程と、
d.生成物の規制認可のための規制機関への提出物に履歴記録を含める工程と
を含む方法を提供する。
第3の態様では、本発明は、第1の態様による発現系によって発現されるタンパク質の規制認可を早める方法であって、
b.細胞が生成物を発現するように、宿主細胞に複数の所定の操作を施す工程と、
c.混入物質との宿主細胞の接触を防止するように行われる各操作に関する情報を記録する工程と、
d.薬品の安全性及び有効性の評価に関与する規制機関への提出物に含める、宿主細胞に関する履歴記録を作成するのに情報を使用する工程と、
e.タンパク質の規制認可のための規制機関への提出物に履歴記録を含める工程と
を含む方法を提供する。
好ましくは、第2及び第3の態様による方法の工程(a)が、
(i)組換えベクターを生成するために、所望のタンパク質をコードするコード配列を発現ベクターにライゲーションすること、
(ii)宿主細胞に組換えベクターを導入すること、及び
(iii)宿主細胞によってタンパク質が発現されるような条件下で宿主細胞を培養すること
を含む。
組換えベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノムに少なくとも一部組み入れられる。
好ましくは、第2及び第3の態様による方法の工程(iii)が、動物又は植物由来のタンパク質又はペプチドも、未定義の加水分解物又は溶解物も含有しない培地中で宿主細胞を培養することを含み、それによって、混入物質との宿主細胞の接触を低減させる。
第2及び第3の態様による方法の特に好ましい実施形態では、タンパク質がバイオシミラー薬品である。
本発明の別の態様は、所望の組換えタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを生成するための方法であって、培養培地中で哺乳動物宿主細胞を培養する工程を含み、前記宿主細胞が、
(i)前記培養培地中の宿主細胞の成長に必要である少なくとも1つはタンパク質、ポリペプチド、及び/又はペプチド因子をコードし、構成的プロモーター(例えば、CMV及びSV40プロモーター)に発現可能に連結されているDNA配列が導入されている細胞
を含む方法も提供しうる。本発明は、それによって、そのような培地中での成長に必要なタンパク質、ポリペプチド、及び/又はペプチド増殖因子を生成することができる宿主細胞を利用することにより低コストの無タンパク質/血清培地の使用を可能にする。したがって、本発明の方法で使用される培養培地は、好ましくは、無血清であるか、他の理由で、特定の宿主細胞型の成長に必要なタンパク質、ポリペプチド、及び/又はペプチド増殖因子を含まない。しかし、培養培地が1つ又は複数の必要な増殖因子を含み、宿主細胞自体が、同じ及び/又は他の必要な増殖因子の1つ又は複数を発現する方法も、本発明の範囲内に包含されるものである。
哺乳動物宿主細胞は、組換えタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現するのに当技術分野で一般的に使用されるものなら、いかなるものでもよい。例えば、宿主細胞は、CHO-Kl、CHO-DG44、DHFR-及びCHO-Sなどのチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞でもよい。これらには、接着細胞系統及び懸濁細胞系統の両方が含まれる。また、本発明の実施形態内で記載される他の細胞系統も使用してよく、それが好ましい場合もある。
導入されたDNA配列は、プラスミド上に存在するか、又は別の方法で(例えば、相同組換えにより)宿主細胞染色体に組み込むことができる。
宿主細胞の成長に必要なタンパク質、ポリペプチド、及び/又はペプチド因子をコードするDNA配列は、ヒト成長ホルモン(hGH)、改変hGH、及び他の増殖因子並びにこれらの混合物をコードするDNA配列から選択することができる。宿主細胞がCHOである場合、宿主細胞は、ヒト成長ホルモン(hGH)をコードするDNA配列を含んでいることが好ましい。
本発明の文脈において、「を含む」("comprise", "comprising")及び同様の語は、排他的とは反対に、包括的である、すなわち、「を含むが、これだけに限定されない」という意味であると解釈される。
本発明の文脈において、「を含む」("comprise"、"comprising")及び同様の語は、排他的とは反対に、包括的である、すなわち、「を含むが、これだけに限定されない」という意味であると解釈される。
本発明は、記載されているか、又は背景技術に属する技術的課題の少なくとも1つに関して解釈される。本発明の目的は、技術的課題の少なくとも1つを解決するか、又は改善することである。これは、この明細書によって定義され、本発明の好ましい実施形態に関して詳述されるような1つ又は複数の有利な効果をもたらしうる。
NeuCHO細胞系統と共に使用され、pNASベクターに挿入されたヒト成長ホルモン(hGH)の高レベル発現用である、「pNAS-hGH」という名のプラスミドベクターのマップである。 CHO DG44細胞における一本鎖タンパク質の高レベル発現に用いられる「pNeu」という名の発現ベクターのマップである。 CHO DG44細胞における一本鎖タンパク質の高レベル発現に用いられる「pNeu-IRES-DHFR」という名の発現ベクターのマップである。第1のシストロンに組換え遺伝子を有し、これに続く第2のシストロンにDHFR遺伝子を有する2シストロン性発現カセット。 抗体重鎖及び軽鎖並びに/又は組換えモノクローナル抗体の高レベル発現に用いられる「pNeuMAB」という名の発現ベクターのマップである。 抗体重鎖及び軽鎖の高レベル発現に用いられる「pNeuMAB-IRES-DHFR」という名の発現ベクターのマップである。 抗体重鎖及び軽鎖の高レベル発現に用いられる「pNeuMAB-IRES-DHFR(CMV)」という名の発現ベクターのマップである。 軽鎖(LC)の発現に用いられる「pMAB LC(IRES-DHFR)」という名の一本鎖発現ベクターのマップである。 重鎖(HC)の発現に用いられる「pMAB HC」という名の一本鎖発現ベクターのマップである。 使用された様々な培養及び細胞について、時間に対してプロットした生存細胞密度を示す成長グラフである。親のDG44細胞系統及びIGF-1遺伝子を発現するDG44細胞系統と比較した、hGHを発現するDG44細胞系統の成長。 様々な好ましい生物及び培養について、時間に対しする生存細胞密度の積分を比較するグラフである。 CHO DG44細胞又はNeuCHO細胞系統からの相対的なタンパク質発現レベルを示す比較図である。
本明細書には、発現ベクターに関係する以下の遺伝子の配列情報も含まれている。
配列番号1は、発現ベクターpMAB HCの好ましいコード配列を示す。
配列番号2は、発現ベクターpMAB LC(ires-dhfr)の好ましいコード配列を示す。
配列番号3は、発現ベクターpNAS-hGHの好ましいコード配列を示す。
配列番号4は、発現ベクターpNeuの好ましいコード配列を示す。
配列番号5は、発現ベクターpNeu-IRES-DHFRの好ましいコード配列を示す。
配列番号6は、発現ベクターpNeuMABの好ましいコード配列を示す。
配列番号7は、発現ベクターpNeuMAB-IRES-DHFR(CMV)の好ましいコード配列を示す。
配列8は、発現ベクターpNeuMAB-IRES-DHFRの好ましいコード配列を示す。
本明細書では、配列番号(Sequence No.)は、配列番号(SEQ ID NO.)と同じであり、等価語であることに留意されたい。
これより、本発明の好ましい実施形態を、添付の図面及び非限定的実施例を参照して説明する。
ある細胞の培養中のイベントが、その特定の細胞をタンパク質生成用、より特定すると治療利用するためのタンパク質の生成用に用いることに伴うリスクの査定に大きく寄与しうることが見出された。
開発を通して、その細胞が由来した親の細胞系統に至るまで、細胞の履歴を含めたすべての操作の念入りな記録を取っておけば、最終生成物の品質及び安全性に寄与しうる。
1つのシナリオでは、そのような情報は、細胞から発現されるタンパク質治療薬について規制認可を得るのに重要でありうる。特に、バイオシミラーには特有の課題がある。これらの課題には、参照リスト薬と比べて、バイオシミラーの免疫原性が改変していないことの実証、並びにその生成物には、潜在的に薬品の安全性及び有効性に影響を与えうるいかなる未検出の相違もないことを確実にすることが含まれる。広範な臨床試験を行わずにそのような課題を解決することは問題となりうる。したがって、バイオシミラーのいかなる申請も、バイオシミラーと参照リスト薬の間には、安全性、純度、及び効力についての臨床的に重要ないかなる相違もないことの実証が必要となる可能性が高い。更に、バイオシミラーの申請には、そのバイオシミラーが「全面的な類似性」を有し(同一な生物学的生成物であることを実証するのは非実用的なので)、そのバイオシミラーが、所与のいかなる患者についても参照リスト薬と同じ臨床結果を生むことになるという証拠を提示することが必要となろう。
規制認可を得るために、昔からのジェネリック製造業者は、そのようなジェネリック薬品が、参照リスト薬と化学的に同一であり、人体において先発薬品と同じ特性を示すことを実証する必要がある。バイオシミラーに関しては、潜在的に相互に異なる生物系における薬品合成が複雑であるため、セカンドソースの生物学的薬品が革新的薬品と明確に同一であることを簡単に実証することが以前には不可能であった。したがって、バイオシミラーは、先発薬品とはわずかに異なる特性を示す可能性があり、それにより、規制認可を得るのに簡略化された臨床試験が必要となりうる。
本発明の文脈において、「混入物質」という用語は、規制機関による生成物の規制認可を潜在的に危うくしうるいかなる物質も指す。そのような物質は、限定されるものではないが、それには、ウイルス、細菌、真菌、及びマイコプラズマ又はそれらに由来するタンパク質などの外来物質が含まれうる。
本明細書で使用される場合、「細胞発現生成物」という用語は、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、炭化水素、脂質、糖脂質、及び核酸を含めた、細胞によって生成されるいかなる生成物も指す。
「規制認可」という用語は、本明細書の文脈で定義される生成物に関する限り、生成物の販売を許可する規制当局による規制認可を指す。
「安全性及び有効性研究」という用語は、ヒト及び/又は動物投与用の生成物の安全性及び有効性を評価する、生成物について行われたいかなる研究も指す。
「臨床試験」という用語は、療法適用のための生成物の安全性及び/又は有効性を評価するように設計された動物又はヒトのいずれかが関与する研究を指す。
「簡略化された安全性、有効性研究、及び/又は簡略化された臨床試験」という用語は、完全なフェーズI、II、及びIII臨床試験を伴わない、薬品について行われる研究を指す。そのような研究は、米国食品医薬品局(FDA)によって定義される生物学的同等性の審査及び化学/微生物学審査を含みうる。
「バイオシミラー薬品」及び「バイオシミラー」という用語は、特許権保護が期限切れしている薬品と生物学的に同等な医薬品であって、以前に保護されていた薬品が規制認可されている医薬品を指す。特に、これには、組換えDNA技術によって細胞培養物中に調製された生成物が含まれる。本明細書で使用される場合、「バイオシミラー薬品」又は「バイオシミラー」という用語は、「後発生物製剤」又は「バイオシミラー」という用語と等しい。
「タンパク質」という用語は、「完全な」タンパク質と、1つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含むが、完全なタンパク質の生物活性を実質的に保持している、その断片、誘導体、若しくは相同体、又はキメラとを指す。
これより、本発明の実施形態を、以下の非限定的実施例を参照して説明する。
組換え治療用タンパク質の高レベル発現のためのpNeu及びpNASベクターの構築
ベクターpNeuは、治療用タンパク質の生成のための一本鎖ペプチドの高レベル発現用に設計された。ベクターは、CHO細胞で発現させるためのDNA配列を、好都合な多重クローニング部位に挿入するのを助ける。ベクター及びその構成要素の特徴の説明についてはTable 1(表1)及び図1Aを参照のこと。
この5026bpのベクターは、組換え遺伝子の効率的な発現のために必須であるコード配列及び調節配列と、細菌におけるプラスミドの選択及び増殖に必須な配列とをコードしている。このベクターは、化学合成用に設計されており、市販の発現ベクターにおける共通の構成要素である必須でない配列及び冗長な配列は除かれている。これにより、ゲノムへの挿入が容易になっており、発現の減失をもたらす配列の欠失がプラスミド増殖中に起こる可能性が小さくなっている。多重クローニング部位は、高速遺伝子クローニング用に最少2つのユニークな制限部位をコードする。
ヒト成長ホルモン(hGH)cDNAの合成及びpNASへのクローニング
hGHをコードするアミノ酸配列の生命情報工学分析を、GENEART AG社(Regensburg Germany所在)による専売の第三者ソフトウェアを介して行った。コドンの選択肢を利用して、CHO細胞におけるmRNA維持及び利用可能なtRNAプールの活用を改善することによって、発現の最大化を行った。RNA及びコドンの最適化はコード配列について行った。CHO細胞における遺伝子発現を増強する目的で、スプライシング部位認識、mRNAの安定性、リボソーム進入部位の存在、mRNA二次構造、自己相同性に関して遺伝子を分析した。当技術分野でよく知られている方法を用い、AgeI及びEcoRV制限部位を用いて、hGH遺伝子をpNASにクローニングした。
組換えモノクローナル抗体を発現させるためのpNeuMABベクターの構築
pNeuMABベクターは、組換えモノクローナル抗体のクローニング及び発現用に設計した。重鎖及び軽鎖をコードしているDNAは、2つの別々の直列な転写ユニットとして、ベクター内に構成した。ベクター及びその構成要素の特徴の説明についてはTable 1(表1)及び図1Bを参照のこと。
抗体-インフリキシマブの重鎖及び軽鎖をコードするcDNAの合成
モノクローナル抗体、インフリキシマブの重鎖(HC)及び軽鎖(LC)をコードするアミノ酸配列の生命情報工学分析を、GENEART AG社(Regensburg Germany所在)による、専売の第三者ソフトウェアを介して行った。コドンの選択肢を利用して、CHO細胞におけるmRNA維持及び利用可能なtRNAプールの活用を改善することによって、発現の最大化を行った。RNA及びコドンの最適化はコード配列について行った。CHO細胞における遺伝子発現を増強する目的で、スプライシング部位認識、mRNAの安定性、リボソーム進入部位の存在、mRNA二次構造、自己相同性に関して遺伝子を分析した。
インフリキシマブの重鎖をコードする遺伝子のクローニング
インフリキシマブの重鎖をコードする合成遺伝子は、合成オリゴヌクレオチド及び/又はPCR産物から組み立てた。AscI及びPacI制限部位を用いて、断片をpGA14(ampR)にクローニングした。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し(Pure Yield(商標)プラスミドミディプレップ、Promega社)、濃度をUV分光学によって決定した。最終コンストラクトは、シーケンシングによって確かめた。用いた制限部位内の配列適合性は100%であった。インフリキシマブの重鎖をコードする合成cDNA配列の5'及び3'末端に、それぞれユニークな制限部位Age I及びEco RVを組み込むように設計し、同じ制限部位で消化された、NeuClone社製の抗体発現ベクターpNeuMABの第1の多重クローニング部位に定方向クローニングできるようにした。
インフリキシマブの軽鎖をコードする遺伝子のクローニング
インフリキシマブの軽鎖をコードする合成遺伝子は、合成オリゴヌクレオチド及び/又はPCR産物から組み立てた。AscI及びPacI制限部位を用いて、断片をpGA18(ampR)にクローニングした。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し(Pure Yield(商標)プラスミドミディプレップ、Promega社)、濃度をUV分光学によって決定した。最終コンストラクトは、シーケンシングによって確かめた。用いた制限部位内の配列適合性は100%であった。インフリキシマブの軽鎖をコードする合成cDNA配列の5'及び3'末端に、それぞれユニークな制限部位Sal I及びMlu Iを組み込み、同じ制限部位で消化されたNeuClone社製の抗体発現ベクターpNeuMABの第2の多重クローニング部位に定方向クローニングできるようにした。
NeuCHOの生成
pNAS-hGHによるDG44細胞の形質移入
ヒト成長ホルモンをコードする発現ベクターを宿主CHO DG44細胞系統に導入する好ましい方法の1つ及び宿主内におけるrDNAの状態(コピー数など)は、以下の通りである。簡潔には、30ml容積中、1.8μgの線状化されたプラスミドDNAと15μlのFreeStyle MAX試薬(Invitrogen社)で合計1.5×10e7細胞を形質移入した。形質移入細胞培養物を、37℃、8%CO2、オービタルシェーカープラットホーム上でインキュベートした。形質移入の48時間後に、プラスミドDNA取り込みを選択するために、最終濃度500μg/mlのゲンタマイシンを補充したヒポキサンチン欠失チミジン欠失培地中で細胞を培養した。クローンを限界希釈法クローニングによって選択した。単一細胞から生じるいくつかの単一のクローンは拡大し、細胞系統はヒト成長ホルモンを生成することを特徴とした。この結果得られたクローンを、標準的なCHO DG44細胞系統と比較して、成長特性について検査した。
インフリキシマブ遺伝子をコードするpNeuMABによるNeuCHOの形質移入
NeuCHO細胞培養物を形質移入するのに、インフリキシマブ遺伝子をコードする線状化されたプラスミドpNeuMABのDNAを用いた。形質移入の48時間後に、DHFR遺伝子を発現する細胞を求めて選択するために、細胞をヒポキサンチン欠失チミジン欠失培地中で培養した。その後、鋳型DNAのコピー数及び遺伝子発現を増幅するために、安定な細胞集団を、段階的に増大するメトトレキサート(MTX)濃度(50、100、200、400、800nM、及び1μM)で処置した。クローンを限界希釈法クローニングによって選択した。インフリキシマブタンパク質の高レベル発現があるクローンをタンパク質生成用にスケールアップした。
細胞バンク
品質管理の極めて重要な部分は、細胞の完全な特徴づけを必要とする。細胞バンクは、外来物質(ウイルス性、細菌性、真菌性、及びマイコプラズマ性)について検査される。使用されたバンキングシステムのタイプ、細胞バンクのサイズ、使用された容器(バイアル、アンプル、及び閉鎖システム)、使用された凍結保護物質及び培地を含めた細胞バンクの調製に用いた方法、並びに冷凍保存及び貯蔵に利用された条件について記載する文書が提供される。
実験室に存在する他の細胞型による微生物混入及び交差混入を避けるのに用いた手順及び細胞バンク容器の追跡を可能にする手順はすべて利用可能にされる。これには、文書化システムの記述に加えて、容器上の標識化情報を失わずに保存、貯蔵、及び貯蔵からの回収のプロセスに耐えることができる標識化システムの記述も含まれる。
生成が、明確に定義されたマスターバンク及び作業バンクのシステムに基づいていることが必須である。バンク樹立中には、他の細胞系統が同じ実験室スイート内で又は同じ作業者によって同時に取り扱われることはない。出自、形態、貯蔵、使用、及び予期された速度の使用で予測される使用時間が、すべての細胞バンクについて完全に記載される。
下記の表では、CHO DG44又はNeuCHO細胞系統のいずれかと共に使用される様々な発現ベクターの構成要素及び特徴の一部が特定されている。この特許明細書に提示する目的で、データを3つの表に分割した。
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図1A〜図1Hは、CHO DG44細胞系統又はNeuCHO細胞系統を用いた発現に適切な発現ベクターのマップのシリーズを示している。
より具体的には、図1Aは、発現ベクターpNASを示し、pNASは、hGHコード配列を含み、CHO DG44からNeuCHO細胞系統を構築する際に使用する。NeuCHO細胞系統は、図1Aに示すベクターを含有させることによって、CHO-DG44細胞系統内で生成することが好ましい。この発現ベクターの遺伝子配列を本願と共に提出し、配列番号1に指定する。
CHO DG44細胞系統には、長期生存率、細胞密度、及び集団の安定性に関して課題及び問題を本質的に有する比較的脆弱な細胞系統が含まれることが知られている。
この好ましい実施形態では、細胞培養物にhGHを添加することによって、以前の技法及び配列を用いて以前には実現不可能であった細胞密度又は生成率の増大を得ることができる。以前には、CHO細胞(DG44などの)への補充に、IGF-1及びインスリンなどの増殖因子が使用された。しかし、これらの以前の方法では、細胞の生存率及び/又は生存時間について満足な結果が得られなかった。この実施形態では、hGHコード配列をCHO細胞に加えることによって、CHO-DG44細胞によるhGHの分泌が可能となる。hGHのこの発現及び細胞培地中への分泌は、CHO細胞の細胞生存時間の増大をもたらす。
更に、hGHの発現は、他のCHO細胞系統と比較して、NeuCHO細胞系統の頑健さも改善しうる。
より具体的には、hGHを発現する配列をCHO-DG44細胞に加えることによって、新規の細胞系統(NeuCHO細胞系統)を生み出した。NeuCHO細胞系統は、図1A〜図1Hに関して記載され、示されている発現ベクターのいずれを含むものでもありうる。
NeuCho細胞系統は、ブダペスト条約の規定に基づき、2013年2月4日にオーストラリア細胞バンク(the Cell Bank Australia、214 Hawkesbury Rd, Westmead, NSW, 2145, Australia所在)に寄託され、受託番号CBA20130024が割り当てられており、本願に記載されているように、医薬品を製造する際の使用に特に適している。
CHO-DG44細胞系統は、pNAS-hGHベクターを形質移入して、NeuCHO細胞系統を生成させるのが好ましい。形質移入の可能な方法には、リン酸カルシウム沈殿、PEI、エレクトロポレーション、及びリポフェクションを含めた、科学文献に記載されている標準的方法が含まれる。当該技術分野の以前の教示は、しばしば、より良い結果を得るには、相対的に高いレベルのDNAを形質移入によって細胞に送達することが好ましいと論じてきたことが一般に知られている。しかし、より多くのDNAを細胞内に送達する形質移入の方法によって、安定性及び頑健性が低い細胞系統が生じる可能性があるので、より安定で生成率の高い細胞系統が生じるわけではない。
図1Bは、CHO DG44細胞で一本鎖タンパク質の発現に使用される発現ベクターを示す。好ましくは、ベクター内のSV40初期プロモーター/エンハンサーによって、組換え遺伝子発現が推進されうる。この発現ベクターの遺伝子配列は本願と共に提出されており、配列番号2に指定されている。
図1Cは、CHO DG44細胞で一本鎖タンパク質の発現に使用される発現ベクターを示す。この実施例では、好ましくは、第1のシストロンに組換え遺伝子を有し、それに続く第2のシストロンにDHFR遺伝子を有する2シストロン性発現カセットについて記載する。このベクターの遺伝子発現は、SV40初期のプロモーター又はエンハンサーによって推進されることが好ましい。この発現ベクターの遺伝子配列は本願と共に提出されており、配列番号3に指定されている
図1Dは、pNeuMABを示す。pNeuMABは、重鎖及び軽鎖遺伝子を単一のベクターに挿入するための2つのクローニングカセットを含有する二重発現ベクターである。この発現ベクターは、複数の組換え遺伝子を挿入するための2つの遺伝子発現カセットを有する。各カセットが、SV40初期プロモーター及び下流のポリA配列を含んでいる。各遺伝子は、エンハンサー配列なしで、SV40プロモーターによって推進される。この発現ベクターは、抗体の軽鎖及び重鎖の発現に適している。この発現ベクターの遺伝子配列は本願と共に提出されており、配列番号4に指定されている。
図1Eは、組換えモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖を単一のベクター上で1つのSV40プロモーター及びエンハンサーによって推進される高レベル発現のための発現ベクター、pNeuMAB-IRES-DHFRを示す。この発現ベクターは、抗体軽鎖及び重鎖の発現に使用できる。この発現ベクターは、一般に、組換え遺伝子を挿入するための2つの遺伝子発現カセットを含んでいる。各カセットは、SV40初期プロモーター/エンハンサー及び下流のポリA配列からなる。重鎖及び軽鎖は、それぞれ第1及び第2のカセットに挿入される。第2のカセットは、軽鎖を有し、それに続いて、IRESの下流にDHFRを有する2シストロン性である。この発現ベクターの遺伝子配列は本願と共に提出されており、配列番号5に指定されている。
図1Fは、抗体の重鎖及び軽鎖がそれぞれCMVプロモーター及びSV40プロモーターによって推進される、単一のベクター上での組換えモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の高レベル発現のための更に別の発現ベクター、pNeuMAB-IRES-DHFR(CMV)を示す。DHFR遺伝子は、抗体の重鎖及び軽鎖を相互に反対の方向性で発現させるために、軽鎖遺伝子の下流にあるIRESによって推進される。重鎖はCMVプロモーターによって推進され、軽鎖はSV40プロモーター/エンハンサーによって推進される。軽鎖及びDHFR遺伝子は、DHFRがIRESの下流にある2シストロン性の構成を有する。この発現ベクターの遺伝子配列は本願と共に提出されており、配列番号6に指定されている。
図1Gは、抗体の軽鎖(LC)のみを発現させるための更に別の発現ベクター、pMAB-LC(ires-dhfr)を示す。IRESの下流の第2のシストロンにDHFRを有し、第1のシストロンにLCをクローニングするための2シストロン性カセット。このベクターは、図1Hに示す発現ベクターpMAB HCとの同時形質移入で使用される。この発現ベクターの遺伝子配列は本願と共に提出されており、配列番号7に指定されている。
図1Hは、抗体の重鎖(HC)のみを発現させるための更に別の発現ベクター、pMAB-HCを示す。完全な抗体を発現するには、pMAB-LCとpMAb-HCの両方を同時形質移入する。この発現ベクターの遺伝子配列は本願と共に提出されており、配列番号8に指定されている。
更なるグラフを図2に示す。図2のグラフは、親のDG44細胞系統及び偽細胞系統と比較した、IGF-1又はhGHを発現するDG44細胞系統の成長を表す。対照(偽)細胞系統は、親細胞系統から派生しており、親細胞系統を、選択マーカーを含有するが、目的の遺伝子(GOI)を含有しないDNAプラスミドで安定的に形質移入したものである。
オリジナルである親のDG44細胞系統と比較して、好ましいNeuCHO細胞系統は、優れた成長上の利点を示す。この実施例では、NeuCHO細胞の成長は、IGF-1遺伝子を発現するDG44細胞系統の成長より、高い生存細胞密度を示している。
このグラフは、DG44細胞がヒト成長ホルモンを発現すると(線グラフE及びF)、形質移入されていないDG44親細胞系統、偽形質移入細胞系統、及び高又は低レベルのIGF-1タンパク質を発現するDG44細胞系統と比較して、細胞が極めて高い最大生存細胞密度(最大425%)を有することを示している。
NeuCHO細胞系統は、最大3.67×107細胞/日/mLの積分細胞密度を有し、これは、親DG44細胞系統の1.57×107細胞/日/mLの230%である。
図2には、生存細胞密度(細胞/mL)がY軸上にプロットされ、培養の日数がX軸上にプロットされている。この図には、6本の線グラフ、すなわち線グラフA、B、C、D、E、及びFが示されている。
線Aは、DNAを形質移入していない親DG44細胞系統の成長パターンを表す。
線Bは、選択マーカーは含有するが、目的の遺伝子(GOI)は含有しないDNAプラスミドを形質移入した親DG44細胞系統の成長パターンを表す。
線Cは、選択マーカー及び目的の遺伝子(GOI)の両方を含有するDNAプラスミドで安定的に形質移入された親DG44細胞系統の成長パターンを表す。ここで、GOIはインスリン様増殖因子1(IGF-1)である。
線Dは、選択マーカー及び目的の遺伝子(GOI)の両方を含有するDNAプラスミドで安定的に形質移入された親DG44細胞系統の成長パターンを表す。ここで、GOIはインスリン様増殖因子1(IGF-1)である。
線Eは、選択マーカー及び目的の遺伝子(GOI)の両方を含有するDNAプラスミドで安定的に形質移入された親DG44細胞系統の成長パターンを表す。ここでGOIは、ヒト成長ホルモン(hGH)である。
線Fは、選択マーカー及び目的の遺伝子(GOI)の両方を含有するDNAプラスミドで安定的に形質移入された親DG44細胞系統の成長パターンを表す。この実施例における好ましいGOIは、ヒト成長ホルモン(hGH)である。
図3には、NeuCHOの積分生存細胞密度(IVCD)を標準的なCHO DG44細胞と比較する更に別のグラフが示されている。この図は、親細胞系統NeuCHOで得られた積分生存細胞密度の、親CHOと比較した相違を示している。
NeuCHO細胞系統は成長力に優れており、これは、より効率的な生成プロセスに変換される。すなわち、より高い生成率を有し、生成に必要な運転回数が少なく、したがって、生成コストが低く、商品原価(COGS)が低いことによって、費用を最小にできるプロセスである。
組換えmABを発現するNeuCHO細胞系統の成長及び生産性
好ましいNeuCHO細胞系統は、伝統的なCHO発現系と比較して、高力価のmAB xを示す。
図3は、NeuCHO細胞が、CHO細胞(CHO DG44細胞など)より、安定的な形質移入効率が高い可能性のあることを示すグラフである。mAB「x」をコードするDNAで細胞(NeuCHO及びCHO)を形質移入し、その後、選択及び安定なプールからの単一細胞クローニングを行った。データは、図4に示されており、NeuCHO細胞の安定的な形質移入は、標準的なCHO細胞よりも多数の高生産性クローンをもたらすことを示している。グラフは、所与の時点における相対量で表した様々なタンパク質の発現レベルを示す。
NeuCHO細胞は、CHO DG44細胞系統よりも約230%大きい積分生存細胞密度を有する。インスリン様増殖因子1(IGF-1)を発現するCHO DG44細胞系統は、NeuCHO細胞系統が一般に到達しうる高細胞密度にまで成長する能力を示さない。NeuCHO細胞は、CHO DG44細胞よりも概して大きな形質移入効率を有する。形質移入されたNeuCHO細胞の生存率は、形質移入されたCHO DG44細胞より概して大きい。更に、NeuCHO細胞の形質移入は、標準的なCHO DG44細胞のものよりも多数の高生産性クローンをもたらしうる。
好ましくは、本明細書に記載の発現系及びベクターは、NeuCHO又はCHO DG44細胞などのCHO細胞が、製剤に適した所望のタンパク質を生成するのを可能にするか、又は促進することができる可能性があり、そのような製剤には、インフリキシマブ腫瘍壊死因子(Remicab(商標)と呼ばれる);アダリムマブ腫瘍壊死因子(Humira(商標)と呼ばれる);エタネルセプト腫瘍壊死因子(Enbrel(商標)と呼ばれる);リツキシマブCD20(Rituxan(商標)及びMabThera(商標)と呼ばれる);ベバシズマブ血管内皮増殖因子(Avastin(商標)と呼ばれる);トラスズマブHER2(Herceptin(商標)と呼ばれる);ラニビズマブ血管内皮増殖因子(Lucentis(商標)と呼ばれる);セツキシマブ上皮増殖因子受容体(Erbitux(商標)と呼ばれる);エリスロポエチンα;インターフェロンα-ペグ化されたインターフェロンアルファ-2a;インターフェロンα-ペグ化されたインターフェロンアルファ-2b、及びhGHが含まれるが、これらに限定されない。
NeuCHO細胞は、フィーダー細胞層として使用される場合、単一細胞クローニングの効率も増強できる。NeuCHO細胞は、安定的な形質移入プールの単一細胞クローニングに先だって、マイクロタイタープレートの単一ウェルに播種した。NeuCHO細胞からのヒト成長ホルモンの分泌は、限定希釈クローニング後における、単一細胞の生存率の増大をもたらした。
本発明を特定の実施例に関して記載したが、本発明は、本明細書に記載されている本発明の広大な原理及び趣旨を保持しながら、他の多くの形態でも実施できることを当業者ならば理解するであろう。
本発明及び記載した好ましい実施形態は、産業に利用可能な少なくとも1つの特徴を明示的に含んでいる。

Claims (30)

  1. タンパク質を発現させるための発現系であって、
    ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)欠損を有する真核生物宿主細胞と、
    ヒト成長ホルモンの遺伝子をコードする発現ベクターと、
    宿主細胞におけるDHFR欠損を補完するためのジヒドロ葉酸還元酵素をコードする配列の発現を推進する最小SV40初期プロモーターを含む真核生物選択マーカー、
    原核生物宿主細胞に対するアンピシリン耐性を与える原核生物選択マーカー、
    原核生物複製起点、
    複数の多重クローニング部位(MCS)、並びに
    72bpのエンハンサーリピートを含むサル空胞ウイルス40(SV40)初期プロモーター、及びコード配列を入れて、そこから所望のタンパク質を発現させるための第1の多重クローニング部位によってSV40 pA配列から分離できるウサギβ-グロビンイントロン配列
    を含む少なくとも1つのタンパク質発現モジュール
    を含む発現ベクターと
    を含む発現系。
  2. 発現モジュールから少なくとも2つのタンパク質を同時発現させるための第2の多重クローニング部位によってSV40 pA配列から分離できるサイトメガロウイルスを含む第2のタンパク質発現モジュールを更に含む、請求項1に記載の発現系。
  3. タンパク質が、規制認可を求める対象であり、宿主細胞が前記タンパク質を発現するように、宿主細胞が複数の所定の操作を受け、各操作に関する情報が記録され、混入物質との宿主細胞の接触を防止するように各操作が実行され、情報が、薬品の安全性及び有効性の評価に関与する規制機関への提出物に含める、宿主細胞の履歴記録を作成するのに使用され、それによって、タンパク質の規制認可を早める、請求項1又は2に記載の発現系。
  4. 所定の操作が、
    (i)組換えベクターを生成するために、所望のタンパク質をコードするコード配列を発現ベクターにライゲーションする工程と、
    (ii)宿主細胞に組換えベクターを導入する工程と、
    (iii)宿主細胞によってタンパク質が発現されるような条件下で宿主細胞を培養する工程と
    を含む、請求項3に記載の発現系。
  5. 組換えベクターが、宿主細胞のゲノムに少なくとも一部組み入れられる、請求項4に記載の発現系。
  6. 工程(iii)が、動物又は植物由来のタンパク質又はペプチドも、未定義の加水分解物又は溶解物も含有しない培地中で宿主細胞を培養することを含み、それによって、混入物質との宿主細胞の接触を低減させる、請求項4又は5に記載の発現系。
  7. 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)DG44細胞である、請求項1から6のいずれか一項に記載の発現系。
  8. タンパク質がバイオシミラー薬品である、請求項1から7のいずれか一項に記載の発現系。
  9. 請求項1又は請求項2に記載の発現系によって発現されるタンパク質の開発を管理する方法であって、
    タンパク質が、規制認可を求める対象であり、
    a. 細胞がタンパク質を発現するように、宿主細胞に複数の所定の操作を施す工程と、
    b.混入物質との宿主細胞の接触を防止するように行われる各操作に関する情報を記録する工程と、
    c. 薬品の安全性及び有効性の評価に関与する規制機関への提出物に含める、宿主細胞に関する履歴記録を作成するのに情報を使用する工程と、
    d. 生成物の規制認可のための規制機関への提出物に履歴記録を含める工程と
    を含む、方法。
  10. 工程(a)が、
    (i)組換えベクターを生成するために、所望のタンパク質をコードするコード配列を発現ベクターにライゲーションすること、
    (ii)宿主細胞に組換えベクターを導入すること、及び
    (iii)宿主細胞によってタンパク質が発現されるような条件下で宿主細胞を培養すること
    を含む、請求項11又は12に記載の方法。
  11. 組換えベクターが、宿主細胞のゲノムに少なくとも一部組み入れられる、請求項13に記載の方法。
  12. 工程(iii)が、動物又は植物由来のタンパク質又はペプチドも、未定義の加水分解物又は溶解物も含有しない培地中で宿主細胞を培養することを含み、それによって、混入物質との宿主細胞の接触を低減させる、請求項13又は14に記載の方法。
  13. タンパク質がバイオシミラー薬品である、請求項11から15のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記規制認可が、簡略化された安全性及び有効性研究並びに/又は簡略化された臨床試験を含む、請求項11から16のいずれか一項に記載の方法。
  15. 規制認可が、安全性有効性研究又は臨床試験を必要としない、請求項11から16のいずれか一項に記載の方法。
  16. オーストラリア細胞バンク(the Cell Bank Australia)に寄託され、寄託番号20130024が割り当てられている、NeuCHO細胞系統、又はその継代培養物。
  17. タンパク質を発現させるための発現系であって、
    ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)欠損を有する真核生物宿主細胞と、
    ヒト成長ホルモン遺伝子をコードする発現ベクターと、
    真核生物選択マーカー、
    原核生物複製起点、並びに
    プロモーター、及びコード配列を入れて、そこから所望のタンパク質を発現させるための第1の多重クローニング部位によってプロモーターから分離できるイントロン配列
    を含む少なくとも1つのタンパク質発現モジュール
    を含む発現ベクターと
    を含む発現系。
  18. 所望のタンパク質が、以下の群:インフリキシマブ腫瘍壊死因子、アダリムマブ腫瘍壊死因子、エタネルセプト腫瘍壊死因子、リツキシマブCD20、ベバシズマブ血管内皮増殖因子、トラスズマブHER2、ラニビズマブ血管内皮増殖因子、セツキシマブ上皮増殖因子受容体、エリスロポエチンα、インターフェロンα-ペグ化インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンα-ペグ化インターフェロンアルファ-2b、及びhGHから選択される少なくとも1つのタンパク質を含む、請求項17に記載の系。
  19. 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項17に記載の系。
  20. 宿主細胞がNeuCHO細胞系統である、請求項18に記載の系。
  21. NeuCHO細胞系統が、オーストラリア細胞バンク(the Cell Bank Australia)に寄託され、寄託番号20130024が割り当てられているもの、又はその継代培養物である、請求項19に記載の系。
  22. 所望のタンパク質を生成するためのチャイニーズハムスター卵巣細胞であって、所望のタンパク質及びhGHをコードする発現ベクターを含み、所望のタンパク質が細胞によって分泌され、更に、所望のタンパク質が、以下の群:インフリキシマブ腫瘍壊死因子、アダリムマブ腫瘍壊死因子、エタネルセプト腫瘍壊死因子、リツキシマブCD20、ベバシズマブ血管内皮増殖因子、トラスズマブHER2、ラニビズマブ血管内皮増殖因子、セツキシマブ上皮増殖因子受容体、エリスロポエチンα、インターフェロンα-ペグ化インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンα-ペグ化インターフェロンアルファ-2b、及びhGHから選択される少なくとも1つのタンパク質を含む、細胞。
  23. 配列番号1を形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞。
  24. 配列番号2を形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞。
  25. 配列番号3を形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞であって、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)欠損を更に含むチャイニーズハムスター卵巣細胞。
  26. 配列番号4を形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞。
  27. 配列番号5を形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞。
  28. 配列番号6を形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞。
  29. 配列番号7を形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞。
  30. 配列番号8を形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞。
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