KR102165777B1 - 단백질의 클로닝 및 발현을 위한 벡터, 그 방법 및 적용 - Google Patents
단백질의 클로닝 및 발현을 위한 벡터, 그 방법 및 적용 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102165777B1 KR102165777B1 KR1020187031366A KR20187031366A KR102165777B1 KR 102165777 B1 KR102165777 B1 KR 102165777B1 KR 1020187031366 A KR1020187031366 A KR 1020187031366A KR 20187031366 A KR20187031366 A KR 20187031366A KR 102165777 B1 KR102165777 B1 KR 102165777B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- vector
- fragment
- yeast
- region
- sequence
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
- C12N2830/205—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron bidirectional
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 항체 유전자 또는 그의 일부를 포함하지만 이에 한정되지 않는 유전 물질을 클로닝 및 발현하기 위한 벡터, 및 상기 벡터의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 벡터는 상호 전달 시스템, 내부 전달 시스템, 또는 개별 디스플레이 시스템 내에서의 직접 클로닝 및 발현의 일부로서, Fab 또는 scFv와 같은 상이한 포맷으로 항체 유전자를 발현한다. 특히, 파지 디스플레이 기술은 파지미드 내 잠재적 항체 유전자를 클로닝 및 스크리닝한 후, 항원에 대한 선도 분자의 추가적인 스크리닝 및 동정을 위해 상기 유전자를 효모 벡터에 전달하는 데 사용된다. 본 벡터는 독창적으로 설계된 삽입/발현 카세트를 비롯하여 많은 이점을 가지므로, 파지로부터 효모 벡터로의 클론 집단의 효율적이고 원활한 전달을 유도하여, 효율적인 라이브러리 제조 및 선도 분자의 동정을 가능하게 한다.
Description
본 발명은 생명 공학, 유전 공학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전 물질 클로닝 및 발현을 위한 벡터 및 상기 벡터를 생성하는 방법에 관한 것이다. 자연 발생 항체 유전자 또는 그의 일부, 인위적으로 설계된 합성 항체 유전자 또는 그의 일부, 또는 이 둘의 조합으로부터 얻어진 유전 물질을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 임의의 유전 물질을 본 발명의 벡터를 사용하여 클로닝 및 발현하는 데 사용할 수 있다.
세포 표면 디스플레이는 표적 단백질을, 일반적으로 세포막 관련 단백질 또는 그의 서브유닛인 캐리어 단백질에 융합시킴으로써 세포 외부에 이를 발현시키는 기술이다. 표면 디스플레이 기술은 단백질 공학, 유도 진화 (directed evolution) 및 약물 발견을 위한 라이브러리 스크리닝 툴로서 사용된다. 그러나, 상기 디스플레이 기술은 그 자체의 장단점과 관련이 있다.
예를 들어, RNA 및 리보솜 복합체의 상대적 불안정성으로 인해 리보솜 디스플레이 방법이 기술적으로 더욱 어려워졌다. 이 기술의 또 다른 한계점은 ScFv와 같은 단일 사슬 단백질을 디스플레이할 수 없다는 것이다. 효모-2-하이브리드 시스템 또는 단백질 상보성 분석과 같은 세포내 선택 방법들은 표적 단백질의 세포내 발현에 직접적으로 의존한다. 그러나, 세포내 시나리오에서 응집하는 성향, 짧은 세포 반감기를 비롯한 몇 가지 한계점이 있으며 가장 중요한 것은 스크리닝 대상인 항원 유형에 따라 전체 시스템을 특정 용도에 맞춰야 한다는 것이다. 또한, 파지 디스플레이는 널리 수용되는 방법이지만, 원핵 생물 발현 시스템 및 디스플레이된 단백질의 번역 후 수정의 결여로 인하여, 적절한 단백질 폴딩에 대한 한계점들이 존재한다. 이들 한계점을 극복하기 위하여, 효모 디스플레이 플랫폼, 진핵 생물 디스플레이 시스템이 사용될 수 있다. 그러나, 효모 디스플레이 시스템 및 이와 유사한 다른 모든 진핵 세포 표면 시스템의 경우에서 주요한 문제는, 달성될 수 있는 라이브러리 크기에 대한 제한적인 형질 전환 효율 설정 한계이며, 이는 전체 프로세스의 효율성을 떨어뜨린다.
항원에 대한 스크리닝의 관점에서, 단백질/항체 라이브러리의 성공은 기타 요인들 사이에서 분비 효율, 프로세싱 효율 및 번역 후 효율과 함께 라이브러리의 다양성 및 기능적 크기에 대한 타협 없는 방대한 크기의 독립적 표현에 있다. 이와 관련하여, 파지 및/또는 효모 디스플레이 플랫폼과 같은 디스플레이 시스템의 유연성은 그러한 목적을 달성하기 위한 절대적인 필수 기준이다. 디스플레이 시스템의 유연성은 사용되는 발현 벡터의 종류와 이들 사이의 호환성 여부에 달려 있다. 또한, 벡터의 호환성 및 상보성은 조합 또는 배치 (batch) 전달 접근법을 통해 파지로부터 효모 디스플레이 시스템으로의 다양성의 전달을 의미한다. 상기 호환성 및 상보성 특징은 현재 사용되고 있는 파지 및 효모 디스플레이 시스템의 합성 컨스트럭트/벡터에서 결여되어 있다.
본 발명은 기존 기술의 상술한 한계점을 해결하기 위한 것으로, 이에 따라 조합 프로세스를 통해 크고 다양한 단백질 유전자 라이브러리를 수용 및 교차-전달하는 벡터를 제공함으로써 다양한 친화성 및 특이성을 지닌 단백질을 동정, 전달, 보존 및 생성하는 능력을 향상시키는 것을 목표로 한다.
- 이 섹션은 독립 청구항들의 사본을 포함한다.
본 발명은, 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계된 벡터 컨스트럭트로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
적어도 하나의 선도 서열,
생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하기 위한 적어도 하나의 클로닝 영역,
불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로불린 경쇄, 또는 그의 단편을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열, 및
적어도 하나의 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 상기 발현 카세트의 적어도 하나의 클로닝 영역은 NdeI, BglII, BmtI, HindIII, AscI, NcoI, XbaI, NheI, NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유하는 것인 벡터 컨스트럭트;
제1항에 기재된 벡터 컨스트럭트로부터 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계되거나, 또는 항체 또는 그의 단편을 전달 또는 수용하도록 설계된 벡터 컨스트럭트로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
프로모터 서열,
선도 서열,
단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
제1 효소 절단 부위,
제1 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열,
제1 링커 서열,
제2 효소 절단 부위,
제2 링커 서열의 존재하에 제2 클로닝 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 클로닝 영역으로서, 상기 클로닝 영역은 생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하는 것인 클로닝 영역,
제2 재조합 태그 서열(들) 또는 선택 코딩 핵산 서열(들), 및
터미네이터 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 발현 카세트의 제1 클로닝 영역 또는 제2 클로닝 영역은 NdeI, BglII, HindIII, AscI, NcoI, XbaI, NheI, NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유하는 것인 벡터 컨스트럭트;
전술한 벡터 컨스트럭트의 제조 방법으로서, 다음 단계들: a) 발현 카세트를 합성하는 단계, b) 목적 벡터를 선형화하는 단계, 및 c) 발현 카세트를 선형화된 목적 벡터에 삽입하여 벡터 컨스트럭트를 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법;
벡터 컨스트럭트 라이브러리의 제조 방법으로서, 다음 단계들: a) 전술한 방법에 의해 벡터 컨스트럭트를 제조하는 단계, b) 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역에 클로닝하여 라이브러리를 수득하는 단계, 또는, 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 하나의 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로부터 또 다른 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로 전달하여 라이브러리를 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법;
목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 스크리닝 및 동정하는 방법으로서, 다음 단계들: (a) 전술한 방법에 의해 벡터 컨스트럭트 라이브러리를 제조하고, 상기 벡터 컨스트럭트를 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포 또는 이들의 조합으로 형질 전환시키는 단계, 및 (b) 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 발현하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법;
전술한 벡터 컨스트럭트(들)을 포함하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포, 또는 파지 라이브러리 또는 효모 라이브러리; 및
전술한 벡터 컨스트럭트(들)에 의해 제공되는 발현 카세트로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23 및 SEQ ID No. 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는 것인 발현 카세트에 관한 것이다.
본 발명의 특징은 첨부된 도면들과 함께 하기 설명으로 완전히 명료해질 것이다. 도면들은 본 발명에 따른 일부 구현예만을 도시하고 있으며 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해하면서, 첨부된 도면들을 사용하여 본 발명을 추가적으로 설명하겠다:
도 1은 pADL23c 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위 및 백본 서열이 수정되었으며, 수정-1, 수정-2, 수정-3, 수정-4로 각각 기재되었다.
도 2는 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB001-파지미드 벡터의 생성을 나타낸다
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 불변 경쇄 (CK) 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) BamHI 및 EcoRI 효소를 사용한 pZB001 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) HindIII 및 NcoI 효소를 사용한 pZB001 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
D) 각각의 클로닝 부위에서 가변 항체 중쇄 및 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 삽입/발현 카세트를 포함하는 pZB001 벡터의 개략도.
도 3은 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB001.1-파지미드 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 불변 경쇄 (CL) 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII 효소를 사용한 pZB001.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) NcoI 및 HindIII 효소를 사용한 pZB001.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
D) 각각의 클로닝 부위에서 가변 항체 중쇄 및 항체 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 삽입/발현 카세트를 포함하는 pZB001.1 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 4는 pRS314 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 5는 항체 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004-효모 양방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 경쇄 (CK) 불변 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) EcoRV 및 KpnI 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
D) NdeI 및 KpnI 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
E) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004 컨스트럭트의 개략도.
도 6은 항체 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.1-효모 양방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII , NdeI & NotI 및 NcoI & AscI 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.1 컨스트럭트의 개략도.
도 7은 항체 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.2-효모 일방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도.
B) HindIII , SpeI & SacII 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.2 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.2 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 8은 항체 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.3-효모 일방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) HindIII , SpeI & SacII 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.3 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.3 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 9는 pRS314 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 10은 pZB004.4-효모 scFv 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인에 대한 클로닝 영역 (MCS I 및 MCS II)을 각각 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) EcoRV & XhoI 효소를 사용한 pZB004.4 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.4 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 11은 p414GAL1 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 12는 중쇄 불변 영역을 갖는 pZB002 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) 중쇄 CH1 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용한 pZB002 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
B) 각각의 클로닝 부위에서 항체 중쇄를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB002 컨스트럭트의 개략도.
도 13은 p416 GAL1 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 14는 경쇄 람다 불변 영역을 갖는 pZB003.1 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS01 신호 서열을 갖는 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용한 pZB003.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB003.1 컨스트럭트의 개략도
도 15는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.2 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS01 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용하한 pZB003.2 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB003.2 컨스트럭트의 개략도
도 16은 SS02 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS02 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS02 신호 서열을 갖는 pZB003 컨스트럭트의 개략도.
도 17은 SS03 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.3 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS03 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003.3 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS03 신호 서열을 갖는 pZB003.3 컨스트럭트의 개략도.
도 18은 SS04 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.4 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS04 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003.4 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS04 신호 서열을 갖는 pZB003.4 컨스트럭트의 개략도.
도 19는 pZB001에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다.
A. 항체 경쇄 카파 삽입을 확인하기 위한 HindIII 및 AscI로의 분해
B. 항체 중쇄 삽입을 확인하기 위한 NcoI 및 XbaI로의 분해
도 20은 pZB001.1에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다
A. 항체 경쇄 람다 삽입을 확인하기 위한 HindIII 및 AscI로의 분해,
B. 항체 중쇄 삽입을 확인하기 위한 NcoI 및 XbaI로의 분해
도 21은 효모 접합형 벡터에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다.
A. pZB003.2에 클로닝된 항체 경쇄 유전자 (카파)의 HindIII & AscI를 사용한 제한 효소 분해.
B. pZB002에 클로닝된 항체 중쇄 유전자의 NcoI & NotI를 사용한 제한 효소 분해.
도 22는 항체 Fab 발현을 확인하기 위한 유동 세포 분석을 나타낸다.
A. 항 His 항체를 사용한 유동 세포 분석.
B. 항 c-myc 항체 및 비오틴화된 Her2 항원을 사용한 유동 세포 분석.
도 23은 항-Her2 ScFv 서열을 함유하는 pZB004.4로 형질 전환시킨 후, 효모 표면에서의 항체 ScFv 발현을 확인하기 위한 유동 세포 분석을 나타낸다.
도 1은 pADL23c 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위 및 백본 서열이 수정되었으며, 수정-1, 수정-2, 수정-3, 수정-4로 각각 기재되었다.
도 2는 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB001-파지미드 벡터의 생성을 나타낸다
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 불변 경쇄 (CK) 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) BamHI 및 EcoRI 효소를 사용한 pZB001 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) HindIII 및 NcoI 효소를 사용한 pZB001 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
D) 각각의 클로닝 부위에서 가변 항체 중쇄 및 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 삽입/발현 카세트를 포함하는 pZB001 벡터의 개략도.
도 3은 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB001.1-파지미드 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 불변 경쇄 (CL) 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII 효소를 사용한 pZB001.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) NcoI 및 HindIII 효소를 사용한 pZB001.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
D) 각각의 클로닝 부위에서 가변 항체 중쇄 및 항체 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 삽입/발현 카세트를 포함하는 pZB001.1 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 4는 pRS314 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 5는 항체 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004-효모 양방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 경쇄 (CK) 불변 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) EcoRV 및 KpnI 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
D) NdeI 및 KpnI 효소를 사용한 pZB004 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
E) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004 컨스트럭트의 개략도.
도 6은 항체 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.1-효모 양방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) PvuII , NdeI & NotI 및 NcoI & AscI 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.1 컨스트럭트의 개략도.
도 7은 항체 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.2-효모 일방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도.
B) HindIII , SpeI & SacII 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.2 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.2 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 8은 항체 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 pZB004.3-효모 일방향 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 중쇄 CH1 도메인 및 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) HindIII , SpeI & SacII 효소를 각각의 조합으로 사용한 pZB004.3 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 가변 중쇄 및 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.3 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 9는 pRS314 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 10은 pZB004.4-효모 scFv 벡터의 생성을 나타낸다.
A) 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인에 대한 클로닝 영역 (MCS I 및 MCS II)을 각각 함유하는 설계된 삽입/발현 카세트의 개략도.
B) EcoRV & XhoI 효소를 사용한 pZB004.4 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석.
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB004.4 벡터 컨스트럭트의 개략도.
도 11은 p414GAL1 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 12는 중쇄 불변 영역을 갖는 pZB002 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) 중쇄 CH1 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용한 pZB002 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
B) 각각의 클로닝 부위에서 항체 중쇄를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB002 컨스트럭트의 개략도.
도 13은 p416 GAL1 벡터의 수정을 나타낸다. 다수의 제한 부위가 도면에 기재된 바와 같이 수정되었다.
도 14는 경쇄 람다 불변 영역을 갖는 pZB003.1 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS01 신호 서열을 갖는 람다 경쇄 CL 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용한 pZB003.1 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (람다)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB003.1 컨스트럭트의 개략도
도 15는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.2 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS01 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 XhoI 효소를 사용하한 pZB003.2 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 pZB003.2 컨스트럭트의 개략도
도 16은 SS02 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS02 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS02 신호 서열을 갖는 pZB003 컨스트럭트의 개략도.
도 17은 SS03 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.3 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS03 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003.3 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS03 신호 서열을 갖는 pZB003.3 컨스트럭트의 개략도.
도 18은 SS04 신호 서열을 함유하는 경쇄 카파 불변 영역을 갖는 pZB003.4 컨스트럭트 효모 접합 벡터의 생성을 나타낸다
A) SS04 신호 서열을 갖는 카파 경쇄 CK 도메인을 함유하는 설계된 삽입물의 개략도
B) SpeI -HF 및 HindIII -HF 효소를 사용한 pZB003.4 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 분석
C) 각각의 클로닝 부위에서 항체 경쇄 (카파)를 포함하는 항체 라이브러리 유전자를 클로닝하도록 설계된 SS04 신호 서열을 갖는 pZB003.4 컨스트럭트의 개략도.
도 19는 pZB001에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다.
A. 항체 경쇄 카파 삽입을 확인하기 위한 HindIII 및 AscI로의 분해
B. 항체 중쇄 삽입을 확인하기 위한 NcoI 및 XbaI로의 분해
도 20은 pZB001.1에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다
A. 항체 경쇄 람다 삽입을 확인하기 위한 HindIII 및 AscI로의 분해,
B. 항체 중쇄 삽입을 확인하기 위한 NcoI 및 XbaI로의 분해
도 21은 효모 접합형 벡터에 클로닝된 항체 유전자의 제한 효소 분해 분석을 나타낸다.
A. pZB003.2에 클로닝된 항체 경쇄 유전자 (카파)의 HindIII & AscI를 사용한 제한 효소 분해.
B. pZB002에 클로닝된 항체 중쇄 유전자의 NcoI & NotI를 사용한 제한 효소 분해.
도 22는 항체 Fab 발현을 확인하기 위한 유동 세포 분석을 나타낸다.
A. 항 His 항체를 사용한 유동 세포 분석.
B. 항 c-myc 항체 및 비오틴화된 Her2 항원을 사용한 유동 세포 분석.
도 23은 항-Her2 ScFv 서열을 함유하는 pZB004.4로 형질 전환시킨 후, 효모 표면에서의 항체 ScFv 발현을 확인하기 위한 유동 세포 분석을 나타낸다.
이 섹션은 독립 청구항들의 사본을 포함한다.
본 발명은 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계된 벡터 컨스트럭트에 관한 것으로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
적어도 하나의 선도 서열,
생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하기 위한 적어도 하나의 클로닝 영역,
불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로불린 경쇄, 또는 그의 단편을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열, 및
적어도 하나의 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 상기 발현 카세트의 적어도 하나의 클로닝 영역은 NdeI, BglII, BmtI, HindIII, AscI, NcoI, XbaI, NheI, NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 파지미드 또는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 효모 벡터로부터 항체 또는 그의 단편을 수용하도록 설계되거나, 또는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 효모 벡터로 항체 또는 그의 단편을 전달하도록 설계되고; 여기서 발현 카세트, 파지미드 및 효모 벡터의 적어도 하나의 클로닝 영역은 NdeI , BglII , BmtI, HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공통 제한 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전술한 발현 카세트는 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 효소 절단 부위를 상류에 포함하거나 포함하지 않는 적어도 하나의 터미네이터 서열; 또는, 적어도 하나의 리보솜 결합 부위를 상류에 포함하는 파지 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터 서열, 오퍼레이터 서열 또는 이들의 조합을 함유하거나 함유하지 않고; 전술한 벡터 컨스트럭트는 박테리아 세포 또는 효모 세포에서 항체 또는 그의 단편을 발현할 수 있으며; 전술한 발현 카세트, 파지미드 및 효모 벡터의 클로닝 영역 내 제한 부위는 HindIII 및 AscI; NdeI , BglII , HindIII 및 AscI; NcoI 및 XbaI, NcoI 및 NotI; XbaI , NheI 및 NotI을 포함하는 조합 중에서 선택되고; 프로모터 서열은 Gal1, Gal1/10 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 선도 서열은 pelB 서열, 알파 선도 서열, Aga2P 선도 서열, 알파 접합 인자 1 분비 신호 서열 (SS01), 조작된 알파 인자 (aapS4) 신호 서열 (SS02), 조작된 알파 인자 (aap8) 신호 서열 (SS03), 조작된 알파 인자 (aap8), 신호 서열 (SS04) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열은 FLAG, c-Myc, V5, His 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 터미네이터 서열은 알파 터미네이터, CYC1 터미네이터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 효소 절단 부위는 TEV 프로테아제 절단 부위이며; 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Aga2P 단백질이고; 및 파지 외피 단백질은 pIII 단백질, G8P 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로블린 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 그의 단편, 및 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로블린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 및 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트는 효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 파지미드로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 발현 카세트는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 순차적으로,
프로모터 서열;
선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , BmtI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 클로닝 영역; IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 도메인은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 터미네이터 서열,
(b) 순차적으로,
프로모터 서열;
선도 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열; 및
터미네이터 서열,
(c) 순차적으로,
제1 터미네이터 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제1 세트;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제1 클로닝 영역;
제1 선도 서열,
프로모터 서열;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제2 세트; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 제2 터미네이터 서열,
(d) 순차적으로,
제1 프로모터 서열;
제1 선도 서열,
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제1 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제1 세트;
제1 터미네이터 서열;
제2 프로모터 서열;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열의 제2 세트; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 제2 터미네이터 서열,
및
(e) 순차적으로,
프로모터 서열;
오퍼레이터 서열;
제1 리보솜 결합 부위;
제1 선도 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제1 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
제2 리보솜 결합 부위;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열(들) 또는 선택 코딩 핵산 서열(들); 및
파지 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
본 발명은 또한 제1항에 기재된 벡터 컨스트럭트로부터 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계되거나, 또는 항체 또는 그의 단편을 전달 또는 수용하도록 설계된 벡터 컨스트럭트에 관한 것으로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
프로모터 서열,
선도 서열,
단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
제1 효소 절단 부위,
제1 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열,
제1 링커 서열,
제2 효소 절단 부위,
제2 링커 서열의 존재하에 제2 클로닝 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 클로닝 영역으로서, 상기 클로닝 영역은 생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하는 것인 클로닝 영역,
제2 재조합 태그 서열(들) 또는 선택 코딩 핵산 서열(들), 및
터미네이터 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 발현 카세트의 제1 클로닝 영역 또는 제2 클로닝 영역은 NdeI , BglII, HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제한 부위를 함유한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 벡터 컨스트럭트는 scFv 벡터이고 효모 세포에서 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 그의 단편을 발현할 수 있는 것인 벡터 컨스트럭트이며; 여기서 상기 scFv 벡터 및 전술한 벡터 컨스트럭트의 발현 카세트의 클로닝 영역은 NdeI , BglII , HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공통 제한 부위를 포함하고; 여기서 프로모터 서열은 Gal 1이며; 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Aga2P 단백질이고; 효소 절단 부위는 인자 Xa 절단 부위, TEV 프로테아제 절단 부위 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 절단 부위이며; 재조합 태그 서열 또는 선택 코딩 핵산 서열은 HA 태그, c-Myc 태그, FLAG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 링커 서열은 G4S 서열이며; 제1 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로블린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제2 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 그의 단편이며; 및 터미네이터 서열은 알파 터미네이터, CYC1 터미네이터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트는 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24 및 SEQ ID No. 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트는 복제 기점 (Ori), 항생제 저항성 마커, f1 복제 기점, 프로모터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역 및 이들의 조합을 더 포함하고; 여기서 벡터 컨스트럭트는 원핵 생물 발현 시스템, 효모 발현 시스템 또는 이들의 조합에서 항체 또는 그의 단편을 발현 또는 디스플레이할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, CH1 영역은 SEQ ID No. 27의 핵산 서열을 가지고, Ck 영역은 SEQ ID No. 28의 핵산 서열을 가지며, CL 영역은 SEQ ID No. 29의 핵산 서열을 가지고; Vk, VL 및 VH 서열은 나이브 항체 레퍼토리, 합성 항체 레퍼토리 또는 이들의 조합으로부터 유래된 것이다.
본 발명은 또한, 전술한 벡터 컨스트럭트의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 다음 단계들: a) 발현 카세트를 합성하는 단계, b) 목적 벡터를 선형화하는 단계, 및 c) 발현 카세트를 선형화된 목적 벡터에 삽입하여 벡터 컨스트럭트를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 전술한 벡터 컨스트럭트의 제조 방법은 시퀀싱 기술에 의해 오류가 없는 벡터 클론을 확인하는 단계를 포함하고; 목적 벡터는 pADL23c, pRS314, p414Gal1, p416Gal1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 선형화는 제한 효소(들)로의 분해에 의해 수행되고; 및 선형화된 목적 벡터에의 발현 카세트의 삽입은 상동성 재조합, 제한 효소 분해 후 결찰 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술에 의해 수행된다.
본 발명은 또한, 벡터 컨스트럭트 라이브러리의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 다음 단계들: a) 전술한 방법에 의해 벡터 컨스트럭트를 제조하는 단계, b) 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역에 클로닝하여 라이브러리를 수득하는 단계, 또는, 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 하나의 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로부터 또 다른 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로 전달하여 라이브러리를 수득하는 단계를 포함한다.
상기 벡터 컨스트럭트 라이브러리의 제조 방법의 일 구현예에서, 벡터 컨스트럭트는 파지미드, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터, 효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터 및 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되고; Vk, VL 및 VH 영역은 나이브 항체, 합성 항체 또는 이들의 조합으로부터 유래되며; 벡터 컨스트럭트 라이브러리는 합성 라이브러리, 나이브 라이브러리 또는 이들의 조합이고; 및 뉴클레오티드 서열의 전달은 파지미드 벡터 컨스트럭트와 효모 벡터 컨스트럭트 간 또는 효모 벡터 컨스트럭트들 간에서 수행된다.
본 발명은 또한, 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 스크리닝 및 동정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 다음 단계들: (a) 전술한 방법에 의해 벡터 컨스트럭트 라이브러리를 제조하고, 상기 벡터 컨스트럭트를 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포 또는 이들의 조합으로 형질 전환시키는 단계, 및 (b) 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 발현하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 스크리닝 및 동정은 박테리아 숙주 세포에서의 파지 디스플레이, 효모 숙주 세포에서의 효모 디스플레이 또는 순차적으로 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 수행되고; 여기서 목적하는 기능적 특성(들)은 친화성, 특이성, 항원성, 제조 가능성, 새로운 에피토프의 생성, 내열성, 가용성, 응집성 및 촉매 활성 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 전술한 스크리닝 및 동정은 순차적인 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 수행되고, 다음 단계들:
(i) 파지미드 컨스트럭트 라이브러리를 박테리아 숙주 세포로 형질 전환시켜 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계;
(ii) 항원(들)에 대해 디스플레이된 항체 또는 그의 단편을 스크리닝하여 선택된 클론을 포함하는 패닝된 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계;
(iii) 선택된 클론으로부터 효모 벡터로 항체 또는 그의 단편을 전달한 후 상기 항체 또는 그의 단편의 발현 및 디스플레이를 위하여 효모 숙주 세포로 형질 전환시키는 단계;
(iv) 항원(들)에 대해 효모 디스플레이된 항체 또는 그의 단편을 스크리닝하여 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 동정하는 단계
를 포함한다.
전술한 항체 또는 그의 단편을 스크리닝 및 동정하는 방법의 또 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 파지 또는 효모 벡터로 클로닝하기 위한 Fab 또는 Scfv 포맷이고; 파지 벡터로의 형질 전환 효율은 약 109 내지 약 1011의 범위이며; 및 효모 벡터로의 전달 또는 형질 전환 효율은 약 106 내지 약 108의 범위이다.
본 발명은 또한, 전술한 벡터 컨스트럭트(들)을 포함하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포, 또는 파지 라이브러리 또는 효모 라이브러리에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 전술한 벡터 컨스트럭트(들)에 의해 제공되는 발현 카세트에 관한 것으로서, 상기 발현 카세트는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23 및 SEQ ID No. 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 명세서에 달리 정의되지 않은 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미를 가진다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어들은 복수를 포함하고 복수의 용어들은 문맥 및/또는 적용에 적절하다고 생각되는 단수를 포함한다. 다양한 단수/복수의 치환은 명료성을 위하여 본원에서 명확하게 제시될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 생명 공학, 면역학, 분자 및 세포 생물학, 재조합 DNA 기술과 관련하여 사용되는 명명법은 본 기술 분야에 잘 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본원에 인용된 특정 참고 문헌들은 본원에 참조로서 명확하게 포함되었다. 충돌이 있는 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우선한다. 재료, 방법, 도면 및 실시예는 단지 예시일 뿐이고 한정하고자 하는 것은 아니다.
또한, 개시된 다양한 파지미드 및 효모 발현 벡터의 방법 및 제조는, 달리 지시하지 않은 한 분자 생물학, 생화학, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 기술, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 관련 분야의 기술들을 사용한다. 이들 기술들, 그 원리 및 요구사항은 문헌에 설명되어 있으며 공지되어 있다.
발현 벡터들 및 이들 벡터들을 구성하는 핵산 서열, 및 본 발명의 기타 구현예/방법이 개시되고 기술되기 전에, 본원에서 사용되는 용어들은 특정 구현예들을 설명하기 위한 것을 뿐 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 발명의 상세한 설명 및 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다는 것을 주의하여야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 '벡터'는 외래 유전 물질을, 이 유전 물질이 복제 및/또는 발현될 수 있는 다른 세포로 인위적으로 운반하는 운반체로서 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 본 발명의 벡터는 원핵 세포, 진핵 세포 또는 이들의 조합에서 복제 및/또는 발현할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 체내 면역 반응을 유도하는 임의의 이물질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 또는 “그의 단편”은 천연 공급원으로부터 유래되거나, 전체 또는 일부가 합성적으로 생산될 수 있는 면역 글로불린을 지칭한다. 용어 "항체" 및 "면역 글로불린"은 달리 지시되지 않는 한 발명의 상세한 설명 전체에 걸쳐 동의어로 사용된다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 다클론 및 단일클론 항체 제조물을 모두 포함하고, 또한 키메라 항체 분자, F(ab')2 및 F(ab) 단편, Fv 분자, 단일 사슬 Fv 분자 (ScFv), 다이머 및 트라이머 항체 단편, 미니바디, 인간화 단일클론 항체 분자, 인간 항체, 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이들 분자로부터 유래된 임의의 기능성 단편을 포함하며, 여기서 유도체 분자들은 모체 항체 분자의 면역학적 기능성을 보유한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 용어 "단일클론 항체"는 동종 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 지칭한다. 항체는 항체의 종 또는 공급원 또는 제조 방식에 한정되지 않는다. 상기 용어는 모체 단일클론 항체 분자의 면역학적 결합 성질을 나타내는 키메라 및 인간화 동종 항체 집단뿐만 아니라, 전체 면역 글로불린 및 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv 및 기타 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 단편"은 항원 결합 활성을 나타내는 능력을 보유하고 있는 전체 항체의 일부이다. 용어 Fab 또는 ScFv는 항체 단편으로서 구체적으로 언급되며, 여기서 전자는 중쇄 불변 도메인 (CH1) 및 카파 또는 람다에 대한 경쇄 불변 영역 (Ck 또는 Cλ)과 독점적으로 연관되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 디스플레이 라이브러리"는 표적 항원에 대한 스크리닝 방법에 적합한 세포 또는 무세포 표면상의 항체를 발현하는 플랫폼(들)을 지칭한다. 본원에서, 파지 디스플레이 라이브러리 및 효모 디스플레이 라이브러리는 달리 지시되지 않는 한 정확한 설명서와 함께 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “신호 펩티드” 및 "선도 펩티드"는 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "클로닝 영역", "다중 클로닝 부위" 및 "MCS"는 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명은 유전 물질 클로닝 및 발현을 위한 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 자연 발생 항체 유전자, 인위적으로 설계된 합성 항체 유전자 또는 그의 일부, 또는 이들의 조합으로부터 얻어진 유전 물질을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 유전 물질을 클로닝 및 발현하기 위한 벡터의 생성에 관한 것이다.
본 발명은 파지미드 및 효모 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 파지미드, 효모 바이시스트론 (bicistronic) 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 scFv 벡터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 벡터는 큰 유전자 라이브러리를 클로닝할 수 있도록 설계되었으며, 동시에 클로닝된 라이브러리를 상이한 벡터간 전달하는 데 유연하다. 일 예시적 구현예에서, 본 발명의 벡터는 클로닝된 라이브러리를 파지미드로부터 효모 벡터(들)로, 즉 상호(inter)-전달하는 데 유연하다. 본 발명의 벡터는 고처리량 스크리닝 (high throughput screening) 플랫폼을 통해 발현된 유전자 산물의 적절한 발현 및 스크리닝을 보장하기 위하여, 다중 발현 태그들과 유전적 요소들을 갖추고 있다. 또 다른 예시적 구현예에서, 본 발명의 벡터는 클로닝된 라이브러리를 상이한 효모 벡터간 전달, 즉 내부(intra)-전달하는 데 유연하다.
본 발명의 비제한적 구현예에서, 파지미드 벡터는 상동성 재조합 서열, 리보솜 결합 부위, 프로모터, 신호 펩티드/선도 펩티드, 태그, 다중 클로닝 부위 (MCS), 중쇄의 불변 영역 [IgG1 중쇄의 불변 영역(CH1)] 및 경쇄 [카파 경쇄 (Ck) 또는 람다 경쇄 (CL)의 불변 영역] 또는 그의 단편, 및 geneIIIP 파지 외피 단백질을 비롯한 발현 카세트를 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역은 나이브 항체 또는 합성 항체로부터 유래된다. 게다가, 파지미드는 또한 복제 기점 (Ori), 항생제 저항성 마커 및 f1 복제 기점을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 파지미드를 위한 발현 카세트는 도 2A 및 3A에 각각 제공된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에서, 파지미드 벡터 맵은 도 2D 및 3D에 각각 도시된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 파지미드 벡터는 SEQ ID No. 2 및 SEQ ID No. 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 비제한적 구현예에서, 효모 벡터는 접합형 중쇄 발현 벡터, 접합형 경쇄 발현 벡터, 양방향 바이-시스트론 벡터, 일방향 바이-시스트론 벡터 및 모노-시스트론 ScFv 디스플레이 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 비제한적 구현예에서, 효모 벡터는 프로모터, 신호 펩티드, 태그, 다중 클로닝 부위 (MCS), 효소 절단 부위, 전사 터미네이터 및 경우에 따라, 중쇄의 불변 영역 [IgG1 중쇄의 불변 영역(CH1)] 및 경쇄 [카파 경쇄 (Ck) 또는 람다 경쇄 (CL)의 불변 영역] 또는 그의 단편, 및 링커 서열을 비롯한 발현 카세트를 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역은 나이브 항체 또는 합성 항체로부터 유래된다. 일 예시적 구현예에서, 효모 벡터는 항체가 Fab 포맷으로 디스플레이될 때, 중쇄의 불변 영역 [IgG1 중쇄의 불변 영역(CH1)] 및 경쇄 [카파 경쇄 (Ck) 또는 람다 경쇄 (CL)의 불변 영역] 또는 그의 단편을 포함한다. 바람직한 구현예에서, Fab 포맷을 디스플레이하는 이들 효모 벡터는 접합형 중쇄 발현 벡터, 접합형 경쇄 발현 벡터, 양방향 바이-시스트론 벡터 및 일방향 바이-시스트론 벡터 및 모노-시스트론 ScFv 디스플레이 벡터 중에서 선택된다. 또 다른 예시적 구현예에서, 효모 벡터는 항체가 scFv 포맷으로 디스플레이될 때, 중쇄의 불변 영역 [IgG1 중쇄의 불변 영역(CH1)] 및 경쇄 [카파 경쇄 (Ck) 또는 람다 경쇄 (CL)의 불변 영역] 또는 그의 단편이 결여되어 있다. 바람직한 구현예에서, scFv 포맷을 디스플레이하는 이들 효모 벡터는 scFv 벡터이다. 게다가, 효모 벡터는 또한 복제 기점, f1 복제 기점, 항생제 저항성 마커, 영양요구성 마커 및 센트로미어 융합된 자체 복제 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 효모 벡터는 도 5E, 6C, 7C, 8C, 10C, 12C, 14C, 15C, 16C, 17C 및 18C에 각각 도시되어 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 효모 벡터는 SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 24 및 SEQ ID No. 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명은 항체 또는 그의 단편의 발현을 위한 발현 카세트/삽입물을 추가로 제공한다. 본 발명의 일 예시적 구현예에서, 발현 카세트는 항체를 Fab 포맷, scFv 포맷 또는 이들의 조합으로 발현시키기 위하여 제공된다. 또 다른 예시적 구현예에서, 발현 카세트는 파지미드 벡터, 효모 벡터 또는 이들의 조합의 일부를 형성하도록 설계된다. 일 구현예에서, 발현 카세트는 파지미드 벡터가 항체를 Fab 포맷으로 발현하도록 설계된다. 또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 효모 벡터가 항체를 Fab 포맷, scFv 포맷 또는 이들의 조합으로 발현하도록 설계된다. 본 발명의 일 구현예에서, 효모 벡터를 위한 대표적인 발현 카세트는 5A, 6A, 7A, 8A, 10A, 12A, 14A, 15A, 16A, 17A 및 18A에 각각 제공되어 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 효모 발현 카세트는 SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 23 및 SEQ ID No. 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 유전 물질을 클로닝 및 발현하기 위한 발현 카세트 및 벡터의 생성에 관한 것이다. 비제한적 구현예에서, 상기 벡터는 전술한 바와 같이 파지미드, 효모 발현 벡터 또는 이들의 조합이다.
일 구현예에서, 파지미드의 생성 방법은 발현 카세트/삽입 영역을 합성하는 단계 및 상기 영역을 선형화된 벡터 백본 (목적 벡터)에 도입하여 파지미드를 수득하는 단계를 포함한다.
일 예시적 구현예에서, 파지미드의 생성 방법은 다음 단계들을 포함한다:
1. 신호 서열, 리보솜 결합 부위 (RBS), MCS, 태그, 파지 외피 단백질, Fab 디스플레이 포맷에 맞추어 정렬하기 위한 경쇄 및 중쇄의 각 불변 영역, 및 경우에 따라 발현 카세트의 삽입을 돕기 위한 목적 벡터에 대한 상동성 뉴클레오티드 길이를 포함하는 발현 카세트를 설계 및 합성하는 단계;
2. 제한 효소로 pADL23c 등의 목적 벡터를 선형화하는 단계;
3. 각 단편을 정제하고, 합성된 발현 카세트를 선형화된 벡터에 삽입하기 위해 효소-매개 상동성 재조합을 셋업하여 파지미드를 생성하는 단계.
또 다른 구현예에서, 시퀀싱에 의해 오류가 없는 파지미드 클론을 확인하고, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (Vk 또는 VL) 레퍼토리의 가변 영역을 지정된 제한 효소를 사용하여 생성된 파지미드 벡터 내 예정된 위치 (MCS)에 클로닝한다. 일 구현예에서, 상기 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역은 나이브 항체 또는 합성적으로 생성된 항체로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, VH, Vk 및 VL의 나이브 레퍼토리 또는 합성 컨센서스 풀을 벡터 내 특정 위치의 각 MCS에 클로닝하여 라이브러리 컨스트럭트를 생성한다. 또한, 합성적 다양성을 프레임워크 (frame-work) 컨스트럭트의 CDR 영역에 도입하여 파지미드의 합성 항체 유전자 라이브러리를 개발한다.
일 예시적 구현예에서, 상기 단계 (1)의 합성된 뉴클레오티드 서열 (발현 카세트)은 2 개의 세그먼트를 포함하는 ~2 Kb 크기의 큰 DNA 세그먼트이며, 여기서 세그먼트 1은 상동성 영역, 오퍼레이터, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS) 1, 다중 클로닝 부위 (MCS) I, 경쇄 불변 영역 [카파 (Ck) 또는 람다 (CL)]를 포함하고, 세그먼트 2는 RBS 2, MCS II, 중쇄 불변 영역 (CH1), 이어서 융합 단백질로서의 파지 단백질 GeneIIIp 및 상동성 영역을 포함한다. 합성된 발현 카세트는 상동성 재조합에 기초한 클로닝 방법인 효율적이고, 생산적이며, 결찰이 없는 (ligation-free) 인퓨젼 클로닝 방법론을 통해 선형화된 pADL23c 벡터 백본에 도입된다. 나이브 및/또는 합성 항체 레퍼토리로부터의 경쇄 및 중쇄 가변체는 파지미드의 세그먼트 1의 MCS I 및 세그먼트 2의 MCS II에 각각 클로닝된다. 따라서, 카파 또는 람다 불변 영역에 전적으로 기초한 두 개의 지정된 파지미드가 생성되고, 이에 따라 카파 및 람다 경쇄 풀의 각 가변 영역이 각 목적 파지미드 벡터에 수용된다 (도 2D & 3D). 합성 라이브러리의 경우, 이들 파지미드는 경쇄의 불변 영역에 기초한 파지미드 분류/발현 카세트를 보유하는, 컨센서스 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 가능한 조합에서 다중 클론을 생성하는 데 사용된다. 또한, 합성 다양성은 Vh, Vk 및 Vλ 사슬의 CDR 영역에서 지정된 제한 효소 경계에 도입된다. 한편, 카파 및 람다 경쇄에서의 분화를 갖는 나이브 레퍼토리는 지정된 파지미드에 직접 클로닝된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 효모 벡터의 생성 방법은 발현 카세트를 설계하는 단계, 카세트의 삽입을 위하여 목적 벡터를 선형화한 후 상동성 재조합하는 단계 또는 제한 효소 분해를 사용한 후 카세트를 선형화된 벡터에 결찰시켜 효모 벡터를 생성하는 단계를 포함한다. 또한, 가변 중쇄 및 경쇄 레퍼토리는 각 벡터 내의 예정된 위치에 클로닝된다.
일 예시적 구현예에서, 효모 벡터의 생성 방법은 다음 단계들을 포함한다:
1. 목적하는 프로모터, 터미네이터, 신호 서열, MCS, 태그, 삽입을 돕기 위한 목적 벡터에 대한 제한 부위를 갖고, 링커, 상동성 재조합 서열, 디스플레이를 위한 융합 단백질을 비롯한 선택적 요소들을 가지며, 경우에 따라, Fab 디스플레이 포맷에 맞추어 정렬하기 위한 중쇄 및 경쇄의 각 불변 영역을 갖거나 또는 항체가 ScFv 포맷으로 디스플레이될 경우 중쇄 및 경쇄의 상기 불변 영역이 없는 발현 카세트를 설계 및 합성하는 단계;
2. 제한 효소로 pRS314, p414GAL1 또는 p416GAL1 등의 목적 벡터를 선형화하는 단계;
3. 각 단편을 정제하고, 합성된 발현 카세트를 선형화된 목적 벡터에 삽입하기 위해 효소-매개 상동성 재조합을 셋업하거나; 또는 합성된 카세트를 선형화된 벡터에 도입하기 위해 제한 효소 분해 및 결찰을 셋업하여 효모 벡터를 생성하는 단계.
또 다른 구현예에서, 시퀀싱에 의해 오류가 없는 효모 벡터 클론을 확인하고, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (Vk 또는 VL) 레퍼토리의 가변 영역을 지정된 제한 효소를 사용하여 각 효모 벡터 내 예정된 MCS 위치에 클로닝한다. 일 구현예에서, 상기 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역은 나이브 항체 또는 합성적으로 생성된 항체로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, Vh, Vk 및 VL의 나이브 풀 및/또는 합성 풀을 파지미드로부터 효모 벡터로 전달하거나, 이들 영역을 효모 벡터의 각 MCS에 직접 클로닝하여 진핵 생물 항체 유전자 라이브러리 컨스트럭트를 생성한다.
또 다른 예시적 구현예에서, 대표적인 효모 벡터는 도 5E, 6C, 7C, 8C, 10C, 12C, 14C, 15C, 16C, 17C 및 18C에 각각 도시되어 있다. 제한 부위들 및 관련 호환성 요인들 외에, Fab 및 ScFv 포맷으로 예시되는 바와 같이, 효모 벡터에는 디스플레이 포맷 등의 다른 특성들이 있으며, 한편 발현 시스템을 통해 Fab 포맷이 추가로 투영된다: 1) Fab 포맷으로 더 큰 라이브러리 크기를 산출하는 상이한 효모 균주에서의 상이한 벡터상에 2 개의 상이한 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 접합형 효모 벡터; 2) 단일 효모 디스플레이 벡터가 동일하거나 상이한 유도성 프로모터에 의해 유도되는 2 개의 발현 카세트를 포함하여 구성되는 바이-시스트론 효모 벡터. 이 바이-시스트론 효모 벡터 포맷은 화학량론적 양의 분리된 경쇄 및 중쇄 단백질의 생산을 유도하고 이로써 기능성 Fab 항체의 산출을 최적화한다; 그리고 3) VH 및 VL 영역을 분리하는 특정 길이의 링커를 갖는 항체 유전자의 ScFv 단편을 클로닝하기 위한 ScFv 벡터가 있다.
비제한적 구현예에서, 본 발명의 효모 벡터는 형광에 기초한 검출 및 분리를 위한 적절한 융합 태그를 갖는다. 단백질 태그는 적용 가능한 경우 N-말단과 C-말단 태그 모두로 배치된다. 이들 태그의 유용성은 검출, 단리, 정제 및 분석 개발을 비롯하여 다양하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 항원/단백질에 대한 단백질/항체 라이브러리 스크리닝 툴로 보이게 하는, 적절하게 설계된 벡터를 사용하여 표면 디스플레이 기술의 몇 가지 고유한 특징이 존재한다. 첫째, 세포 표면에서의 조합 단백질 라이브러리의 디스플레이는 DNA와 단백질 사이에 물리적 연결고리를 형성하여, ELISA 또는 형광 활성화 세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting; FACS)와 같은 고처리량 방법을 정량적인 방식으로 편리하고 효율적으로 사용할 수 있도록 한다. 둘째, 표적 기질 또는 리간드/수용체는 세포막 장벽을 가로지르지 않으면서 표면에 디스플레이된 단백질에 직접 접근할 수 있어, 이에 따라 어떠한 노동 집약적인 단백질 정제 단계도 필요하지 않도록 한다. 셋째, 세포 부착은 표면에 디스플레이된 단백질을 안정화시킨다. 디스플레이 시스템 및 이들의 상호-연결성의 설계로 인하여, 다른 시스템으로 전달되는 동안 분자의 손실이 없는지 확인하여야 하며, 이는 다시 오류가 없어야 한다. 이는 원핵 생물/파지 디스플레이 시스템으로부터 진핵 생물/효모 디스플레이 시스템으로의 유전자의 원활하고 오류가 없는 전달을 위한 벡터를 제공하는 본 발명에서 성공적으로 달성된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상업적으로 입수 가능한 벡터 pADL23c, pRS314 및 p414GAL1 & p416GAL1을 파지 및 효모 디스플레이 플랫폼용 벡터를 설계하기 위하여 각각 사용하였다. 각 디스플레이 시스템에서 나이브 또는 합성 항체 레퍼토리로부터의 가변 중쇄 및 경쇄의 효율적인 클로닝 및 디스플레이 시스템을 통한 전달을 위하여, 제한 효소 부위는 이들이 벡터 백본, 중쇄 & 경쇄의 불변 영역, 태그, 파지 벡터의 경우 GeneIIIp 또는 G3P 및 효모 벡터의 경우 Aga2P 등의 디스플레이 단백질, 선도 및 터미네이터 서열에 존재하지 않는 방식으로 신중하게 제공되었다. 또한, 상기 고유하게 설계되고 배치된 제한 효소 부위들은 VH (7 패밀리), Vk (4 패밀리) 및 VL (3 패밀리) 사슬과 같은 가변 영역의 지정된 컨센서스 서열에 존재하여서는 안 된다. 또한, 모든 CDR을 통한 합성 다양성의 도입을 위하여 선택되는 경계 효소들은 고유하며, 합성 항체 유전자 레퍼토리를 운반하는 임의의 벡터에 존재하지 않는다.
따라서, 본 발명의 벡터는 내부-전달 (즉, 동일한 발현 시스템의 벡터 내에서의 전달)뿐만 아니라 상호-전달 (즉, 한 발현 시스템의 벡터로부터 다른 발현 시스템의 벡터로의 항체 유전자의 전달)을 위한 특정 제한 부위를 포함하도록 고유하게 설계된다. 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 시스템 간 (intersystem) 전달, 즉 파지 시스템으로부터 효모 발현 시스템으로의 항체 유전자의 전달이 가능하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터는 시스템 내 (intra-system) 전달, 즉 Fab으로부터 ScFv로 또는 그 역으로의 디스플레이 포맷 변경, 또는 동일한 포맷이지만 상이한 발현 벡터, 예컨대 접합형 효모 벡터로부터 바이-시스트론 효모 벡터로 MCS 효소의 각 세트를 통한 전달이 가능하다. 일 구현예에서, 벡터, 즉 파지미드 및 효모 벡터의 클로닝 영역 (MCS)은 NdeI , BglII , BmtI , HindIII , AscI , NcoI , XbaI , NheI, NotI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 균일한 제한 부위들을 포함한다. 일 예시적 구현예에서, 가변 경쇄 서열을 클로닝하기 위한 파지미드 벡터 및 효모 벡터 (효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 scFv 벡터)의 MCS I/MCS 영역은 NdeI , BglII , HindIII , AscI 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택되는 제한 부위들을 포함한다. 또 다른 예시적 구현예에서, 가변 중쇄 서열을 클로닝하기 위한 파지미드 벡터 및 효모 벡터 (효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 scFv 벡터)의 MCS II/MCS 영역은 NcoI , XbaI , NheI , NotI 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택되는 제한 부위들을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 가변 경쇄에 대한 클로닝 영역 (MCS I/MCS)은 HindIII와 AscI, 및 NdeI와 AscI 중에서 선택되는 제한 부위의 조합을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 가변 중쇄에 대한 클로닝 영역 (MCS II/MCS)은 NcoI와 XbaI, 및 NcoI와 NotI 중에서 선택되는 제한 부위의 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 단백질 라이브러리를 구축함에 있어서의 인스턴트 벡터의 적용에 관한 것이다. 일 구현예에서, 단백질 라이브러리는 항체 라이브러리이다. 또 다른 구현예에서, 항체 라이브러리는 합성 항체 유전자 발현 라이브러리, 나이브 항체 라이브러리 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 전술한 바와 같은 벡터는 합성 항체 유전자 발현 라이브러리, 나이브 항체 유전자 발현 라이브러리 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 유전자 발현 라이브러리의 생성 방법에 사용되며, 여기서 상기 방법은 조합 툴을 사용하여 특정 항원(들)을 스크리닝하는 단계를 포함한다.
일 예시적 구현예에서, 조합 툴은 파지 디스플레이 기술 및 효모 디스플레이 기술을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 항체 유전자 발현 라이브러리를 생성하기 위하여, 파지 디스플레이 기술 단독으로, 효모 디스플레이 기술 단독으로, 또는 파지 및 효모 디스플레이 기술을 조합하여 스크리닝하는 단계를 사용한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 항체 유전자 발현 라이브러리를 생성하기 위하여, 파지 디스플레이 기술에 이어서 순차적으로 효모 디스플레이 기술로 스크리닝하는 단계를 사용한다.
본 발명의 비제한적 구현예에서, 합성 항체 유전자 발현 라이브러리는 향상된 친화성 및 특이성을 갖는 특정 치료 표적, 즉 항원에 대해 목적하는 기능적 특성을 갖는 고유 항체 분자의 단리를 허용한다.
본 발명의 또 다른 비제한적 구현예에서, 항체의 목적하는 기능적 특성은 친화성, 특이성, 제조 가능성, 새로운 에피토프의 생성, 내열성, 항원성, 가용성, 응집성 및 촉매 활성, 또는 이들의 임의의 조합 및 성공적인 제품 상용화화 관련된 임의의 다른 특성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 비제한적 구현예에서, 항체 유전자 발현 라이브러리의 생성 방법은 순차적으로 파지 디스플레이 기술 및 효모 디스플레이 기술을 탐구하는 단계를 포함하며, 이는 파지 기반 라이브러리의 특성인 항체 유전자 다양성의 더 큰 세트를 활용할 수 있도록 한다. 그 후에 항체 클론을 효모 디스플레이 시스템을 통해 스크리닝한다. 항체 유전자 발현을 위한 효모 시스템의 사용은 세포 표면의 항체 생성물의 진핵 생물 단백질 번역, 가공 및 적절한 폴딩 때문에 유리하다. 또한, 효모 발현은 높은 특이성을 갖는 항원성 표적과의 적절한 상호 작용을 가능하게 한다. 이들 두 상보적인 시스템을 사용하여 얻은 정보는 상용화 가능성의 관점에서 보다 높은 성공률로 "선도 분자 (lead molecules)" (즉, 항원에 특이적인 항체)를 생성한다. 본 발명의 벡터는 전술한 벡터의 다양한 특징으로 인하여 순차적인 파지 디스플레이 기술 및 효모 디스플레이 기술에 의해 항체 유전자 발현 라이브러리를 생성하는 데 성공적으로 도움을 준다.
본 발명의 파지미드 및 효모 벡터는 오류가 없는 프로세스를 통해 크고 다양한 항체 유전자 라이브러리를 수용 및 교차 전달 (cross-transfer)하고, 이로써 다양한 친화성 및 특이성을 갖는 다수의 항원에 대한 고유/선도 분자를 동정, 전달, 보존 및 생성하는 능력을 증강시킨다.
본 발명의 비제한적 구현예에서, 원핵 생물 파지 디스플레이 표면 발현 시스템은 약 109 내지 약 1011, 바람직하게는 >1011의 큰 항체 유전자 라이브러리를 수용하기 위하여, 그러한 라이브러리에 내재된 광범위한 다양성이 유지되는 방식으로 본 발명에서 사용된다. 동시에, 원핵 생물 스크리닝 시스템을 사용하는 것이 항체 분자의 우수한 기능성을 확인하는 데 최적이 아닐 수 있으므로, 파지 디스플레이 시스템은 우수한 기능성을 위하여 번역 후 수정을 허용하는 진핵성 효모 디스플레이 플랫폼과 통합된다. 이러한 위업을 달성하기 위하여, 고도로 다양화된 항체 유전자 라이브러리 (>1011의 클론들)의 클로닝 및 발현을 위한 파지미드 벡터가 본 발명에서 설계 및 사용된다. 이들 유전자 라이브러리는 인위적으로 설계되고 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 수집되거나, 또는 자연 발생 항체 유전자 서열로부터 수집된다. 벡터의 모든 세트는 표적화된 항체 유전자의 효율적인 단리 및 정제를 허용하는 다중 단백질 태그뿐만 아니라 융합 단백질로서의, 항체 유전자의 높은 수준의 발현을 보장하는 상기 단락에서 전술한 바와 같은 유전적 요소들로 설계된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 전략은 우선 파지 디스플레이 기술을 통해 큰 항체 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것이며, 여기서 선택된 클론은 그 후에 효모 디스플레이 벡터에서 재클로닝되어 ScFv 또는 Fab 또는 다른 항체 포맷을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 유전자 포맷을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 파지미드 벡터는 파지미드를 통해 항체 유전자의 예비 스크리닝을 완료한 후, 클론을 다양한 효모 발현 벡터로 전달하여 ScFv, Fab 또는 다른 항체 포맷을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 유전자 포맷을 발현하는 방식으로 설계된다. 본 발명의 파지미드 벡터는 클로닝된 유전자를 다양한 유형의 효모 디스플레이 벡터로 전달하는 데 적합하다. 본 효모 발현 벡터는 또한 ScFv, Fab 및 다른 포맷을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 포맷의 항체 유전자의 클로닝 및 발현 관점에서 고유하다. 또한, 본 효모 발현 벡터는 부분적으로 스크리닝된 클론을 파지 디스플레이 시스템으로부터 효모 디스플레이 시스템으로 전달하거나, 조합적 또는 비조합적으로 효모 시스템 내 나이브 또는 합성 라이브러리를 직접 생성하는데 사용되며, 여기서 후자의 전략은 파지 디스플레이 시스템으로부터 직접 전달되는 중쇄 및 경쇄의 특정 조합을 보존한다. 클론의 전달은 바람직하게는 제한 효소 분해에 기초한 방법을 통해 효모 균주 내로 수행되는 것이 바람직하다. 유전자 전달 또는 새로운 클로닝을 위한 제한 부위는 상이한 벡터 간에 유전자 전달이 호환 가능하도록 신중하고 고유하게 설계된다. 효모 발현 플라스미드는 다수의 융합 단백질 태그 및 절단 부위를 함유하여 전장 단백질의 발현을 보장하고 고처리량 방법을 통해 단리 및 정제되도록 설계된다. 효모 내에서 일단 발현된 다양한 항체 포맷의 분비를 최적화하기 위하여 신호 서열의 다양한 변이체가 사용되었다. 일 구현예에서, 고처리량 방법은 ELISA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 고처리량 비드 기반의 선택 방법, 세포 분리 기술, 자동화된 고처리량 현미경 검사, 자기 분리 기술 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 선택된 클론 집단은 또한 전략적으로 위치된 단백질 절단 부위들을 사용하여 항체 유전자 산물의 신속한 정제에도 유용하다.
따라서, 본 벡터 및 방법은 고유한 설계 및 독점적인 스크리닝/선택 기준에 기초한 항체 유전자 라이브러리의 다양하고 독창적인 항체 레퍼토리 모두를 활용한다. 본원에서 채택된 벡터 설계, 발현 프로파일링 및 스크리닝 전략은 파지와 효모 디스플레이 플랫폼 간 또는 다양한 벡터 자체 간의 효율적인 전이를 가능하게 한다. 상기 설계는 또한 파지 디스플레이 스크리닝으로부터 얻어진 클론을 효모 디스플레이 시스템에 비조합적으로 전달할 수 있도록 한다. 파지 디스플레이는 고처리량 포맷의 항체-항원 상호 작용의 엄격성 및 특이성에 중점을 둔 1차 스크리닝을 위한 라이브러리 크기 (>1011)를 수용하며, 스크리닝된 분자는 효모 플랫폼을 통한 나이브 디스플레이를 모방하기 위하여 무작위화 프로세스를 다시 거친다. 본 발명의 파지미드 및 효모 벡터 모두에서 사용된 고유한 제한 효소/부위 세트는 PCR과 같은 어떠한 증폭 기반 방법의 도입 없이 가변 중쇄 및 경쇄의 전달을 가능하게 하여, 이로써 라이브러리의 기존 스크리닝된 다양성을 보존한다. 이러한 접근법은 항체 유전자 라이브러리를 성공적으로 생성하고, 선도 항체 분자/산물을 스크리닝하는 데 매우 중요/중대하다. 따라서, 각 종류의 벡터들 (파지 디스플레이용 벡터 및 효모 디스플레이용 벡터)은 기능적으로 특이적이지만 구조적으로 다양한 항체 모이어티/선도 분자를 개발하는 파이프라인에 조합적으로 기여한다. 상기 발현 단계는 또한 Fab 및 scFv 단편 또는 유사한 항체 단편이 효모 표면상에 디스플레이되는 동안 파지상에 Fab 모이어티 또는 이러한 유형의 항체 단편의 고유한 디스플레이를 보장한다. 또한, 효모 디스플레이 플랫폼은 바이시스트론 및 접합형 접근법으로의 벡터 선택을 제공하여 Fab 또는 유사한 항체 단편을 디스플레이한다. 이 특별한 전략, 특히 접합형 전략은 E. coli 형질 전환 효율에 비하여 효모 세포에서 일반적으로 관찰되는 낮은 형질 전환 효율의 문제를 회피하기 위해 채택됨으로써, 더 많은 수의 클론을 스크리닝한다. 두 가지 상이한 디스플레이 시스템을 통해 항원 또는 항원-발현 세포에서 여러 차례의 선택을 하는 전체 프로세스는 친화성, 특이성, 제조 가능성 및 촉매 활성과 같은 목적하는 항체 특성의 범위를 양성 또는 음성 선택하는 데 매우 중요하다. 본 발명의 벡터의 전략적 설계 및 조합적 사용은 다양한 항원성 표적에 대한 고유 분자를 동정할 수 있는 항체 유전자 라이브러리의 다양성을 보존할 수 있도록 한다. 따라서, 본 벡터 및 두 가지 상이한 디스플레이 시스템의 일부로서의 이들의 사용은, 새롭고 기능적으로 개선된 항체 동정 및 추가적인 상업적 개발에 대한 엄청난 자원으로서의 역할을 하는 다양성이 높은 인간 항체의 나이브 또는 합성 라이브러리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 유전자 라이브러리의 생성을 돕는다.
종합하여, 파지 디스플레이 기술에서, 본 발명의 파지미드 벡터는 특정 항원에 대한 높은 내지 중간 정도의 친화성을 갖는 잠재적 항체 유전자를 클로닝 및 스크리닝하는 데 사용된다. 이어서, 이들 유전자는 선도 분자를 추가로 스크리닝 및 동정하기 위하여 본 발명의 효모 디스플레이 벡터로 전달된다. 파지 디스플레이 기술은 큰 다양화된 항체 라이브러리의 클로닝 및 발현을 가능하게 하고, 효모 디스플레이 기술은 진핵 세포 발현 시스템 및 적절한 단백질 폴딩의 관점에서 우수하기 때문에, 본 발명의 벡터를 사용하여 이들 두 가지 기술을 사용하는 것은 유리하다. 따라서, 효모 디스플레이 기술은 효모 세포의 표면에서 발현될 때의 더 우수한 항원 인식을 위하여 항체 구조적 모티프를 모방하는 것을 돕는다.
따라서, 본 발명의 원핵성 및 진핵성 벡터를 사용함으로써 이들 두 상보적인 기술을 조합하는 것은 매우 다양한 항체 라이브러리를 스크리닝하고 특정 항원에 대한 새로운 항체 분자를 개발하는 데 유리하다. 본 발명의 전략이 보다 높은 항체 라이브러리 다양화, 진핵 시스템을 통한 스크리닝 및 이론적 설계의 통합을 설명하기 때문에, 동정된 선도 분자는 상품화 가능성이 더 높다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 벡터의 고유/중요 특징이 표 1에 더 요약되어 있다.
| 본 발명의 파지미드 | 본 발명의 효모 벡터 - ScFv 디스플레이 | 본 발명의 효모 벡터 (양방향 바이-시스트론) | 본 발명의 효모 벡터 ( 일방향 바이 - 시스트론 ) | 본 발명의 효모 벡터 - 접합형 |
| 항체 Fab 라이브러리 개발을 위해 설계됨 | 항체 ScFv 개발을 위해 설계됨 | 항체 Fab 개발을 위해 설계됨 | 항체 Fab 및 ScFv 라이브러리 개발을 위해 설계됨 | 최종 항체 Fab 포맷을 디스플레이하기 위해 중쇄/경쇄를 독립적으로 수용함 |
| 안정성 및 고복제수 (High copy number)를 위해 설계됨 | 고발현 (high expression)을 위해 설계됨. 효모 내 복제수를 유지함 | 고발현을 위해 설계됨. 효모 내 복제수를 유지함 | 고발현을 위해 설계됨. 효모 내 복제수를 유지함 | 고발현을 위해 설계됨. 효모 내 복제수를 유지함. |
| 표면에 Fab의 독립적 및 개별적 표현 | 독점적 재조합 기반 형질 전환 도입 | 독점적 재조합 기반 형질 전환 도입 | 독점적 재조합 기반 형질 전환 도입 | 독점적 재조합 기반 형질 전환 도입 |
| 고유 제한 부위 및 항체 레퍼토리를 수용하기 위한 발현 카세트의 설계 | 독창적으로 설계된 발현 카세트 및 파지미드와 호환 가능한 조작된 다중 클로닝 부위 | 독창적으로 설계된 발현 카세트 및 파지미드와 호환 가능한 조작된 다중 클로닝 부위 | 독창적으로 설계된 발현 카세트 및 파지미드와 호환 가능한 조작된 다중 클로닝 부위 | 독창적으로 설계된 발현 카세트 및 파지미드와 호환 가능한 조작된 다중 클로닝 부위 |
| 백본 벡터의 큰 변경 없이 DNA 수준에서의 용이한 수정 가능 | 형질 전환 효율을 개선하기 위하여 추가된 특징 | 형질 전환 효율을 개선하기 위하여 추가된 특징 | 형질 전환 효율을 개선하기 위하여 추가된 특징 | 형질 전환 효율을 개선하기 위하여 추가된 특징 |
| 발현을 확인하기 위한 다중 태그 | 박테리아 내 증폭에 필요하고 향후 수정에 호환되는 보존된 유전적 요소를 유지함 | 박테리아 내 증폭에 필요하고 향후 수정에 호환되는 보존된 유전적 요소를 유지함. | 박테리아 내 증폭에 필요하고 향후 수정에 호환되는 보존된 유전적 요소를 유지함. | 박테리아 내 증폭에 필요하고 향후 수정에 호환되는 보존된 유전적 요소를 유지함. |
| 개선된 단백질 정제 | 항체 ScFv를 정제하기 위한 절단 태그 | 항체 Fab를 정제하기 위한 절단 태그 | 항체 Fab 및 ScFv를 정제하기 위한 절단 태그 | 항체 Fab를 정제하기 위한 절단 태그 |
| 약 1011 이상의 클론을 수용할 수 있는 디스플레이 시스템의 중요 부분 | 호환 가능한 디스플레이 시스템으로 >108의 클론 다양성을 수용함 | 호환 가능한 디스플레이 시스템으로 >108의 클론 다양성을 수용함 | 호환 가능한 디스플레이 시스템으로 >108의 클론 다양성을 수용함. | 호환 가능한 디스플레이 시스템으로 >108의 클론 다양성을 수용함 |
| 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 | 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 | 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 | 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 | 클론을 생성 또는 전달하는 동안 추가적인 PCR 기반 방법이 필요 없음 |
| 고처리량 분석 호환성 | 인비트로 분석에적합함. 고처리량 분석 호환성 | 인비트로 분석에적합함. 고처리량 분석 호환성 | 인비트로 분석에적합함. 고처리량 분석 호환성 | 인비트로 분석에적합함. 고처리량 분석 호환성 |
본 발명은 하기 실시예들을 참조하여 추가로 설명되며, 이는 본질적으로 단지 예시적일 뿐이고 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.본 발명/실시예에 사용된 모든 생물학적 물질들은 인도 밖에서 수득한 것이다.
실시예
사용된 재료:
본 실시예에 이르기 위하여 다음 재료들을 사용하였다:
1 Kb Ladder (Invitrogen, USA); 아가로스 (SIGMA, USA); 겔 용출 키트 (Qiagen, USA); 미니 프렙 키트 (Qiagen, USA); Taq 폴리머라제 (NEB, USA); dATP (NEB, USA); T4 DNA 리가아제 (NEB, USA); LB-한천, dam-/dcm- (NEB, USA), Neb5알파 (NEB, USA); 암피실린 (MP Biomedicals, USA); NcoI-HF, (NEB, USA); XbaI, (NEB, USA); HindIII-HF, (NEB, USA); AscI (NEB, USA); HindIII-HF, (NEB, USA); AscI (NEB, USA); NotI (NEB, USA), SpeI -HF (NEB, USA), SacII (NEB, USA), XhoI (NEB, USA); TG1 세포 (Lucigen, USA); T4 DNA 리가아제 (NEB, USA); PCR 정제 키트 (Qiagen, USA); LB-한천; 미니 프렙 키트 (Qiagen, USA); LB-브로스; 암피실린 (MP Biomedicals, USA); 카나마이신 (MP biomedicals, USA); 인퓨젼 HD (Clontech, USA); 글리세롤 (Fischer Scientific, USA); 덱스트로스 (Merck, USA); Cas-아미노산 (BD, USA); 효모 질소 베이스 (SIGMA, USA); 인산수소이나트륨(Di sodium hydrogen Phosphate) (SIGMA, USA); 갈락토스 (SIGMA, USA); YPD 브로스 (SIGMA, USA); Ura Trp 이중 드롭아웃 보충제 (Clontech,USA).
또한, 하기 벡터 컨스트럭트/벡터 백본을 인도의 Microbial Type Culture Collection and Gene Bank (MTCC)에 기탁하였다.
실시예
1
일반 벡터 설계 전략:
나이브 또는 면역 또는 합성 라이브러리와 같은 항체 라이브러리의 성공 여부는 다양해야 하는 독창적 설계 및 충분히 커야 하는 최종 라이브러리 크기에 전적으로 달려있다. 모든 항체 라이브러리 크기 & 다양성 및 항체 특이성 & 친화성은 직접적으로 연관되어 있다. 가변 경쇄 및 중쇄 레퍼토리 - 합성 또는 나이브의 중요 설계 외에도; 큰 레퍼토리를 수용하기 위한 시스템, 특히 다양한 발현 벡터의 개발이 매우 중요하다. 언급된 사실 외에도, 각 벡터의 유용성을 전략적으로 조정하는 것이 성공적인 라이브러리 생성 및 스크리닝을 위한 핵심 특징이다.
본 방법은 기타 특징/수정과 함께, 카파 및 람다 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 지정된 특정 수정을 갖는 Fab 포맷의 항체를 수용 및 발현하기 위한 2 개의 고유 파지미드 벡터의 개발을 포함한다.
개발된 벡터를 천연 공급원 및 합성적으로 설계된 공급원으로부터의 항체 레퍼토리를 수용하기 위하여 사용하였다. 나이브 또는 합성 파지 라이브러리를 생성한 후, 이들을 다양한 면역-종양 네트워크의 표적 항원을 스크리닝하기 위하여 사용하였다.
상기 방법은 별도의 단백질 디스플레이 기술에서 본 파지미드 및 효모 발현 플라스미드를 사용하여 나이브 및/또는 합성 라이브러리로부터 단백질/항체 유전자를 발현하는 것을 포함한다. 첫째, 파지 디스플레이 기술을 특정 항원에 대한 높은 내지 중간 정도의 친화성을 갖는 잠재적 항체 유전자를 클로닝 및 스크리닝하는 데 사용하였다. 이어서, 이들 유전자를 선도 분자의 추가적인 스크리닝 및 동정을 위해 효모 디스플레이 플라스미드로 전달하였다. 이들 두 상보적인 기술을 결합하면, 매우 다양한 항체 라이브러리를 스크리닝하고 특정 항원에 대한 새로운/선도 항체 분자를 개발할 수 있다. MCS I 및 MCS II에 사용된 제한 효소가 두 가지 발현 시스템에 관하여 동일하기 때문에, 파지로부터 효모 벡터로의 클론 집단의 원활한 전달은 효율적이다. 이들 신중하게 배치된 제한 효소 부위는, 중쇄가 임의의 효모 벡터의 MCS II로 재배치되는 한편 가변 경쇄의 선택된 집단을 파지미드의 MCS I로부터 임의의 효모 벡터의 MCS I으로 전달할 수 있도록 한다. 시스템 간 전달 외에, 시스템 내 전달, 즉 Fab에서 ScFv로 또는 그 반대로의 디스플레이 포맷 변경, 또는 동일한 포맷이지만 상이한 발현 벡터로의 전달, 예컨대 접합형 벡터로부터 바이-시스트론 벡터로의 전달은 MCS 기반 제한 효소의 각 세트를 통해 가능하다. 모든 가능한 시스템 및 포맷에서의 자유로운 전이는 중쇄 또는 경쇄의 무작위화를 제공하여 두 가지 디스플레이 시스템의 차이를 보완할 수 있도록 한다.
실시예
2
파지미드
벡터의 생성:
항체 라이브러리와 같은 매우 효율적이고 기능적으로 큰 단백질/펩티드 라이브러리를 수득하기 위하여, 다음과 같은 중요 사항을 고려하여야 한다: 1) 파지미드 벡터에서 PCR 증폭된 천연 풀 또는 인실리코 (in silico) 설계되고 합성적으로 개발된 분자 풀을 사용한 기능적이고 큰 항체 레퍼토리의 효율적 생성; 2) 적합한 스크리닝 방법과의 호환 가능성, 이어서 여러 차례의 특성화 실험을 위해 선택된 클론의 전달에 의하여 예시된 바와 같이, 선택된 클론의 신속한 하류 분석을 가능하게 하는 선택된 항체 포맷 및 호환 가능한 클로닝 & 발현 벡터.
Fab 포맷의 다수의 분자를 수용하기 위하여, 두 단계의 클로닝 방법을 채택하여 두 가지 유형의 삽입물, 즉 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 구축 수준에서 존재함을 확인하였다.
본원에서, 파지미드 벡터는 경쇄 (Ck 또는 CK & Cλ 또는 CL) 및 중쇄 (인간 IgG1-CH1 도메인) 둘 모두에 부착된 특정 인간 항체 불변 영역을 갖는 바이시스트론 오페론을 갖는다. 다른 필수적 특징들, 예컨대 리보솜 결합 부위, PelB 신호 서열, 다중 클로닝 부위 (경쇄 레퍼토리의 경우 MCS I 및 중쇄 레퍼토리의 경우 MCS II), FLAG 및 c-Myc 태그도 파지미드 벡터에 존재한다. 태그는 CH1 도메인의 연속과 연관되어 있으며 Fab 발현의 검출에 사용될 것이다. IgG1-CH1 도메인은 파지 외피 PIII 단백질, GeneIIIP와 연결되어 있다. Fab 디스플레이 포맷의 일부로서, 중쇄는 발현된 GeneIIIP 단백질을 통해 관련 형태로 파지상에 디스플레이되는 한편, 경쇄는 주변 세포질 (periplasm)로 분비되는 별도의 단편으로서 발현되고, 이는 중쇄와 쌍을 이루어 디스플레이 구성을 완성한다. 앰버 (amber) 종결 코돈 (TAG)은 항체 유전자와 파지 GeneIIIP 단백질 사이에 전략적으로 위치하여, 예시된 TG1 세포와 같이 E. coli의 비-억제자 (non-suppressor) 균주에서 Fab 단편의 생산을 가능하게 한다. 경쇄 가변 영역의 풀은 NdeI , BglII , HindIII 및 AscI 제한 부위로 구성되는 MCS I 영역으로 클로닝될 것인 한편, 중쇄 가변 영역은 NcoI , XbaI , NheI 및 NotI 부위를 함유하는 MCS II로 예정되어 있다. 상기 제한 효소들의 설계 및 사용은, 인간의 가변 중쇄 및 경쇄 코딩 영역 내 이들의 낮은 절단 가능성에 기초한다. 또한, 이들은 4 개 이상의 뉴클레오티드 중복을 만들어 최적의 클로닝 효율을 이끌어낸다. 효소들은 메틸화에 좌우되지 않으며, 권장 이중 분해에서의 이들의 효율은 90 % 이상이다. 이들 제한 부위는 효모 등의 다양한 발현 시스템에서 여러 벡터에 걸쳐 일정하게 유지된다. 클로닝 부위를 내내 유지하기 위하여, 효모 내 파지미드 및 후속 벡터에서 여러 가지 수정이 이루어졌다. 전술한 바와 같이, 이들 벡터는 나이브 및 합성 기원 둘 모두의 뉴클레오티드 서열의 풀을 수용하는 데 사용되며, 이로써 몇 가지 독특한 변화들이 도입되어 라이브러리 생성 프로세스 및 효모 내로의 후속적인 전달을 용이하게 하였다. 이들 변화는 또한 아미노산 조성 또는 번역 프레임을 변화시키지 않으면서 특정 제한 부위 또는 특정 펩티드를 감소시켰다.
벡터 백본 및 기타 개별 요소/서열에서 수행된 일부 수정은 다음과 같다:
1. NotI , EagI , SpeI , XmaI , SmaI , SfiI (SEQ ID No. 30, 2045 bp 내지 2106 bp)는 pADL23c 벡터로부터 제거된 제한 효소 중 일부이다 (도 1).
2. 벡터 백본의 EcoRI (SEQ ID No. 30, 2004 bp 내지 2009 bp) 및 BstXI (SEQ ID No. 30, 2116 bp 내지 2127 bp) 효소 부위를 수정하였다.
3. 특정 영역 (SEQ ID No. 30, 2108 bp 내지 2128 bp 및 SEQ ID No. 30, 2132 bp 내지 2161 bp)을 pADL23c 벡터 백본으로부터 제거하였다.
4. BamHI 제한 부위 (SEQ ID No. 30, 2754 bp 내지 2760 bp)를 GeneIIIP 단백질로부터 수정하였다.
5. BstEII (SEQ ID No. 27, 2882 bp 내지 2888 bp) Bsu36I (SEQ ID No. 27, 2779 bp 내지 2786 bp) 및 BbeI (SEQ ID No. 27, 2733 bp 내지 2738 bp) 효소 부위를 CH1 영역에서 수정하였다.
6. HindIII 부위를 c-Myc 태그로부터 수정하였다 (SEQ ID No. 2, 2958 bp 내지 2963 bp).
7. BlpI (SEQ ID No. 28, 2345 bp 내지 2351 bp)를 CK로부터 제거하였다.
전술한 변화 중 일부는 또한 본 발명의 도 1에도 강조되어 있다.
이해할 수 있는 바와 같이, 라이브러리 (나이브 또는 합성 항체 라이브러리)를 생성 및 스크리닝하는 첫 번째 단계가 되는 파지미드 벡터를 다양한 후속 프로세스를 염두에 두고 최대한 신중하게 설계하였다. 종합하여, 이는 스크리닝과 함께 라이브러리 구축 및 이동의 가장 효율적인 경로였다.
모든 수정 및 목표를 염두에 두고 고려하여, 삽입/발현 카세트를 카파 (도 2A 및 SEQ ID No. 1) 및 람다 (도 3A 및 SEQ ID No. 3)에 대해 설계하였고, 합성한 후, 삽입/발현 카세트의 선형화 및 클로닝 전에 여러 가지 수정의 대상이 되었던 시판하는 pADL23c 벡터 백본에 상기 삽입/발현 카세트를 도입하였다. pADL23c는 두 개의 상이한 파지미드 벡터의 생성을 위한 벡터 백본으로서 사용하였다. 이들 파지미드 벡터는 경쇄 불변 영역, 즉 카파 및 람다 경쇄 불변 영역으로 크게 구분될 것이다. 상동성 재조합에 기초한 접근법이 삽입/발현 카세트를 수정된 pADL23c 백본으로 클로닝하는 데 채택되었다. 합성된 카파-삽입 및 람다-삽입 컨스트럭트를 dam-/dcm- 세포로 형질 전환시키고, 각 DNA를 추가적인 분해를 위하여 qiagen의 미디 프렙 키트를 사용하여 대량으로 단리하였다. 카파 삽입물의 클로닝 전략은 람다 삽입물의 클로닝과 비교하여 약간 상이하였다. 약 10 ㎍의 pADL23c를 BamHI -HF 및 EcoRI-HF 효소를 사용하여 선형화하는 한편 약 5 ㎍의 삽입-카파를 SfiI 효소로 분해하였다. 다른 한편으로는, 약 5 ㎍의 람다-삽입물을 약 37℃에서 약 2 시간 동안 PvuI로 먼저 분해한 후, 약 37℃에서 약 2 시간 동안 SfiI를 첨가하여 목적하는 ~2.3 kb의 밴드 크기를 갖는 3 개의 밴드를 생성하였다. 선형화된 벡터 pADL23c 및 분해된 카파-삽입물 및 람다-삽입물을 겔 용출하였고 여기서 절제된 겔을 약 3 부피의 완충액 QX1 용액과 혼합하여 용해시켰다. 약 30 ㎕의 QIAEX II 비드를 30 초 동안 볼텍싱하여 첨가한 후 약 50℃에서 약 10 분 동안 배양하였다. 비드에 일련의 세척을 가하였으며; 먼저 약 500 ㎕의 QX1 및 이어서 약 500 ㎕의 PE 완충액으로 2 회 세척하였다. DNA를 약 30 ㎕의 뉴클레아제가 없는 (nuclease-free) 물로 용출하였다. 아래의 표 2-4는 pADL23c 벡터를 선형화하고 카파-삽입물 및 람다-삽입물 기반의 파지미드 벡터를 생성하는 데 사용되는 성분/시약들을 나타낸다.
| DNA (벡터/pADL23c) | 5 ㎍ |
| BamHI -HF (20U/㎕) | 2 ㎕ |
| EcoRI (20U/㎕) | 2 ㎕ |
| Cut smart 완충액 | 5 ㎕ |
| 물 | milli-Q 물의 개별 부피 |
| 총 | 50 ㎕ |
| DNA (카파_삽입) | 5 ㎍ |
| SfiI (20U/㎕) | 2 ㎕ |
| Cut smart 완충액 | 5 ㎕ |
| 물 | milli-Q 물의 개별 부피 |
| 총 | 50 ㎕ |
| DNA (람다_삽입) | 5 ㎍ |
| PvuII (20U/㎕) | 1 ㎕ |
| SfiI (20U/㎕) | 1 ㎕ |
| Cut smart 완충액 | 5 ㎕ |
| 물 | milli-Q 물의 개별 부피 |
| 총 | 50 ㎕ |
인퓨젼 반응을 벡터 및 삽입물, 즉 카파 및 람다 삽입물에 대해 셋업한 후 (표 5) 약 50℃에서 약 15 분 동안 배양하였다. 배양 후 약 2.5 ㎕의 인퓨전 (In-Fusion) 반응 혼합물을 50 ㎕의 Stellar 컴피턴트 세포에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 얼음상에서 약 30 분 동안 배양한 후, 형질 전환된 세포의 회수를 위해 약 500 ㎕의 SOC 배지를 첨가하였다. 세포를 암피실린이 있는 LB 한천 플레이트에 도말한 후 약 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날에 나타난 콜로니들을 5 mL LB-Amp에 접종하였고 플라스미드를 단리하였다. 단리된 플라스미드를 BamHI /EcoRI 및 NcoI / HindIII로 제한 효소 분해 분석하고 카파 삽입물의 존재를 확인한 반면 (도 2B & 2C), 람다 벡터의 경우, 클론을 PvuII , NcoI / HindIII -HF, NcoI / PvuII 및 NdeI/PvuII 단독으로 또는 각 조합으로 시험하였다 (도 3B & 3C). 양성 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다. 파지미드 벡터를 카파 삽입물을 갖는 pZB001-파지미드 (도 2D 및 SEQ ID No. 2) 및 람다 삽입물을 갖는 pZB001.1 파지미드 (도 3D 및 SEQ ID No. 4)로 명명하였다. 벡터 pZB001은 부다페스트 조약에 따라 MTCC 25125의 수탁 번호로 제출되었고 pZB001로 명명되었다. 또한, 경쇄 불변 영역을 갖는 파지미드 벡터 (람다 삽입-CL)는 전술한 실험 절차 및 기탁된 파지미드 벡터 (카파 삽입)의 세부 사항에 기초하여 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다.
| DNA (선형화된 벡터) | 91.8 ng | DNA (선형화된 벡터) | 91.8 ng |
| 삽입물 (카파) | 178.5 ng | 삽입물 (람다) | 299 ng |
| 5X In-Fusion HD Enzyme Premix | 2 ㎕ | 5X In-Fusion HD Enzyme Premix | 2 ㎕ |
| 물 | milli-Q 물의 개별 부피 | 물 | milli-Q 물의 개별 부피 |
| 총 | 10 ㎕ | 총 | 10 ㎕ |
서열 확인된 파지미드 벡터 pZB001 및 pZB001.1를 표적 항원에 대한 스크리닝/패닝을 위한 나이브 및 합성 파지 라이브러리를 생성하는 데 사용하였다. 라이브러리의 크기 및 다양성을 피어 그룹 및 차세대 시퀀싱 접근법 둘 모두에 의해 평가하였다. 패닝된 분자의 시퀀싱 결과로부터 패닝된 분자의 다양성이 유지된다는 것 또한 확인하였다. 단일 가닥 DNA를 패닝된 분자로부터 단리하고 효모 발현 벡터로 전달하였다.
실시예
3
효모 발현 벡터의 생성:
항체 디스플레이 라이브러리는 다른 세포 단백질에 연결된 세포 표면에서 발현되는 부분 또는 완전한 항체의 라이브러리를 나타낸다. 파지 디스플레이는 클로닝의 용이함으로 인해 가장 많이 받아들여지는 방법이고, 큰 라이브러리 크기, 1가 디스플레이를 허용하며 다양한 안정성 파라미터를 용이하게 결정할 수 있도록 한다. 그러나, 파지 디스플레이의 경우, 원핵 생물 발현 시스템 및 그에 의한 디스플레이된 항체 단편의 번역 후 수정 결여로 인하여, 적절한 단백질 폴딩에 대한 관련 한계점들이 존재한다. 이들 한계점을 극복하기 위하여, 효모 디스플레이 플랫폼, 즉 항체 단편을 단리하고 조작하기 위한 견고하고, 다목적이며, 정량적인 방법론이 사용된다. 효모, 즉 진핵 생물 디스플레이 시스템은 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)-분류 기술을 사용하는 정량 및 실시간 평가와 호환되므로 선택된다.
다른 인비트로 (in vitro) 디스플레이 기술들에 비하여, 응집소 (agglutinin) 접착 수용체 복합체 Aga1P 및 Aga2P를 사용하는 나이브/비-면역 항체 라이브러리의 효모 디스플레이는 상당한 이점을 가지고 있다. 예를 들어, 유동 세포 분석을 사용하면 K D 결정, K off 측정 및 효모 표면에 직접적으로 상호 배타적인 클론의 에피토프 결합을 비롯한 신속한 클론 특성화가 가능하다. 이렇게 하면 이들 특성화를 수행하기 위한 단백질 정제가 필요 없다. Fab 항체 단편의 효모 상에의 성공적인 디스플레이는 큰 라이브러리 구축에 대한 더 간단한 접근을 제안한다. Fab 단편이 중쇄 및 경쇄로 구성되어 있기 때문에, 상이한 효모 균주 내 상이한 벡터상에 두 폴리펩티드를 코딩하는 것이 가능하며, 여기서 두 사슬은 접합, 즉 고도로 효율적인 프로세스에 의해 단일 이배체 효모 내 결합될 수 있다. 그러나, 효모 디스플레이의 경우 주요 문제점은 효모에서의 보다 낮은 형질 전환 효율로 인한 상대적으로 더 작은 라이브러리 크기이며, 이는 파지 및/또는 효모 디스플레이의 조합 개념을 사용하는 본 발명의 측면에 의해 극복된다.
전술한 사실로부터 이해할 수 있는 바와 같이, 파지 패닝된 분자는 ScFv, Fab 등과 같은 다양한 포맷으로 조합적으로 또는 비조합적으로 다양한 효모 발현 벡터로 전달되어야 한다. 파지미드로부터 효모 벡터로의 편리한 전달을 위하여, 다중 클로닝 부위를 동일하게 유지하였다. 본원에서, 효모 발현 벡터는 경쇄 (Ck 또는 CK & Cλ 또는 CL) 및 중쇄 (인간 IgG1-CH1 도메인) 둘 모두에 부착된 특정 인간 항체 불변 영역을 갖는 바이시스트론 양방향성 또는 바이시스트론 일방향성을 갖는다. 선도 신호 서열 (경쇄의 경우 접합형 알파 인자; 중쇄의 경우 Aga2P 선도 펩티드), 다중 클로닝 부위 (경쇄 레퍼토리의 경우 MCS I 및 중쇄 레퍼토리의 경우 MCS II), 태그 (경쇄의 경우 V5 에피토프 태그 및 6xHis 태그; 중쇄 레퍼토리의 경우 FLAG 및 c-Myc 태그)와 같은 다른 중요한 특징들은 모든 종류의 효모 벡터에 존재한다. 태그는 불변 도메인의 연속과 연관되어 있으며 Fab 발현의 검출에 사용될 것이다. 표면 디스플레이에 의한 효모 라이브러리를 수득하기 위한 스크리닝은 경쟁적 항원 에피토프, 항체 파라토프 구조, 서열 및 서열 모티프 또는 이들의 임의의 조합을 사용함으로써 수행되어, 중쇄 내 태그 뒤에 전략적으로 위치한 담배 식각 바이러스 (Tobacco Etch Virus; TEV), 엔테로키나제 (Ek) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 절단 부위를 사용하여 Fab 또는 ScFv 분자를 단리한다.
개발되어 온 효모 벡터의 생성에 대한 접근 방식에는, 세 가지 유형이 존재한다: 1) 바이-시스트론 양방향 벡터; 2) 바이 시스트론 일방향 벡터 3) ScFv 벡터 및 4) 접합형 벡터.
(A) 효모
바이시스트론
양방향 벡터의 생성: (
pZB004
및
pZB004
.1)
효모 바이시스트론 양방향 벡터를 생성하기 위하여, pRS314벡터 (ATCC, USA)를 백본으로 사용하였다 (도 4). 벡터 백본 및 기타 개별 요소/서열에서 수행된 일부 수정은 다음과 같다:
1. SacI , SacII , EagI , NotI , SpeI , BamHI , XmaI , SmaI , PstI , EcoRI, EcoRV, SalI , XhoI , ApaI는 pRS314벡터로부터 제거된 제한 효소 중 일부이다 (SEQ ID No. 31, 1893 bp 내지 1989 bp, 도 4에 나타냄).
2. SpeI 부위 (SEQ ID No. 29, 2600 bp 내지 2605 bp)를 람다 경쇄 불변 영역 (CL)으로부터 손상시켰다.
또한, Gal1/10 프로모터, 알파 선도 펩티드, Aga2P 선도 펩티드, MCS I & II, 태그 (경쇄의 경우 V5 및 His-태그 및 중쇄의 경우 FLAG, c-Myc), 경쇄 (Ck 또는 Cλ) 및 중쇄 (인간 IgG1-CH1 도메인) 둘 모두에 부착된 각 불변 영역을 포함하는, 카파 (도 5A 및 SEQ ID No. 5) 및 람다 (도 6A 및 SEQ ID No. 7)에 대한 삽입/발현 카세트를 설계 및 합성하였다. SpeI 제한 부위는 Cλ 영역으로부터 제거하였다.
Fab 디스플레이 포맷의 일부로서, 중쇄는 발현된 Aga2P 단백질을 통해 연관된 형태로 효모 상에 디스플레이될 것인 한편 경쇄는 별도의 단편으로서 발현된다. 단백질 성숙 프로세스 중에, 이는 중쇄와 쌍을 이루어 Fab 디스플레이 구성을 완성한다. 별도의 터미네이터 서열은 중쇄의 경우 CYC1 터미네이터 및 경쇄의 경우 알파 터미네이터에 의해 예시된 바와 같이 유지되었다. 가용성 Fab을 사용한 추가적인 스크리닝 프로세스를 돕기 위하여, TEV 프로테아제 절단 부위를 태그 뒤 및 Aga2P 단백질 서열 앞에 고정시켰다. 단백질 구조에 유연성을 도입하기 위하여, (G4S)3 링커 영역이 Aga2P 단백질의 시작점 앞에 전략적으로 위치한다.
약 10 ㎍의 pRS314 벡터 및 삽입-카파-효모를 EcoRV 및 KpnI로 각각 약 37℃에서 밤새 분해한 후 (표 6), 겔 용출하였으며, 여기서 절제된 겔을 약 3 부피의 완충액 QX1 용액과 혼합하여 용해시켰다. 약 30 ㎕의 QIAEX II 비드를 약 30 초 동안 볼텍싱하여 첨가한 후 약 50℃에서 약 10 분 동안 배양하였다. 비드에 일련의 세척을 가하였으며, 먼저 약 500 ㎕의 QX1 및 이어서 약 500 ㎕의 PE 완충액으로 2 회 세척하였다. DNA를 약 30 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물로 용출하였다. 분해되고 용출된, 약 3 μg의 pRS314 및 삽입-카파-효모를 KpnI 및 EcoRV로 약 37℃에서 밤새 추가로 절단한 후, 각각 겔 용출 및 결찰을 셋업하였다.
[표 6a]
[표 6b]
| DNA (벡터) | 35.8 ng |
| DNA (카파-삽입-효모) | 76 ng |
| T4 DNA 리가아제 | 2 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10X) | 2 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 |
| 총 | 20 ㎕ |
결찰 셋업을 카파 벡터에 대하여 1:5의 비율로 개별적으로 수행한 후, TG1, 즉 고도의 컴피턴트 세포로 개별적으로 형질 전환시켰다. 개별 콜로니를 추출하고, 접종한 후, 플라스미드 DNA를 단리하고 PvuII 효소를 사용하여 제한 효소 분해를 셋업하였다. 확인된 클론은 ~4.3 Kb 및 ~2.9 Kb 단편의 밴드를 생성하였다 (도 5B). 양성 클론은 EcoRV / KpnI 및 NdeI / KpnI 효소를 각각의 조합으로 사용한 제한 효소 분해에 의해 추가로 확인하였으며, 여기서 전자는 ~3.7 Kb & ~3.5 Kb의 크기를 생성하였고, 후자는 ~5.5 Kb & ~1.8 Kb 단편을 생성하였다 (도 5C & D). 확인된 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다 (도 5E 및 SEQ ID No. 6). 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 확인된 효모 양방향 벡터는 부다페스트 조약에 따라 MTCC 25128의 수탁 번호로 MTCC에 제출되었고 pZB004로 명명되었다.
또한, 카파 삽입물을 갖는 상기 부착된 (deposited) 벡터 효모 바이시스트론 양방향 벡터를 사용하여, 람다 경쇄 불변 영역을 갖는 효모 바이시스트론 양방향 벡터를 제조하였다. 10 μg의 확인되고 부착된 카파 벡터 (pZB004) 및 삽입-람다-효모 (SEQ ID No. 7)를 SpeI -HF/ SacII (표 8)로 분해한 후 약 4℃에서 밤새 겔 용출 및 결찰 (표 9)하여, 상기와 동일한 것을 제조하였다. 25 ng의 결찰 혼합물을 TG1 컴피턴트 세포로 형질 전환시켰다. 개별 콜로니를 접종하고, PvuII , NdeI / NotI 및 NcoI / AscI 효소로 삽입물 방출에 대해 스크리닝하였다 (도 6B). 양성 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다 (도 6C). 람다 경쇄 불변 영역을 함유하는 확인된 효모 바이시스트론 양방향 벡터는 pZB004.1 (SEQ ID No. 8)로 명명되었다.
| 벡터 | 삽입물 | |
| DNA | 10 ㎍ | 10 ㎍ |
| Cut smart 완충액 (10X) | 10 ㎕ | 10 ㎕ |
| SpeI -HF (20U/㎕) | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| SacII (20U/㎕) | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 | 물의 개별 부피 |
| 총 부피 | 100 ㎕ | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 51 ng |
| DNA (삽입물) | 74.6 ng |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10X) | 2 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 |
| 총 | 20 ㎕ |
(B) 효모
바이시스트론
일방향
벡터 (
pZB004
.2 및
pZB004
.
3)의
생성:
비조합
적 전달의 개념
효모 바이시스트론 일방향 벡터는 중쇄 및 경쇄를 Fab 포맷으로 발현하기 위한 2 개의 분리된 프로모터 옵션을 갖도록 설계되었다. 또한, 이 벡터의 독특한 구성은 파지 시스템으로부터 효모 시스템으로의 Fab 분자의 비조합적 전달을 허용할 것이다. 이는 진핵 생물 시스템 내 탐구할 중쇄 및 경쇄의 특정 조합을 차례로 보존할 것이다.
효모 바이시스트론 일방향 벡터를 생성하기 위하여, 부착된 효모 바이시스트론 양방향 벡터를 백본으로서 사용하였고, 여기서 2 개의 Gal1/10 프로모터 (경쇄 및 중쇄), 알파 선도 펩티드, Aga2P 선도 펩티드, MCS I & II, 태그 (경쇄의 경우 V5 및 His-태그 및 중쇄의 경우 FLAG, c-Myc), 경쇄 (CK 또는 CL) 및 중쇄 (인간 IgG1-CH1 도메인) 둘 모두에 부착된 각 불변 영역을 포함하는, 카파 (도 7A 및 SEQ ID No. 9) 및 람다 (도 8A 및 SEQ ID No. 11)에 대한 삽입물을 설계 및 합성하였다. 확인된 효모 바이시스트론 양방향 벡터 카파 및 람다를 합성된 카파 및 람다 삽입물과 함께 약 37℃에서 약 3 시간 동안 SpeI -HF 및 SacII 제한 효소로 분해하였다 (표 10). 분해된 벡터 (~4.8 Kb) 및 삽입물 (카파 및 람다, ~2.9 Kb)을 겔 용출하였고 결찰 반응 (표 11)을 약 4℃에서 밤새 셋업한 후 NEB 5-알파 컴피턴트 E.coli 세포에서 열충격 방법에 의해 형질 전환시켰다. 개별 콜로니를 접종하고, SpeI-HF/SacII 효소 (~2.9 Kb)로 삽입물 방출, 및 HindIII -HF 효소 (~1.7 Kb)로 내부 분해에 대해 스크리닝하였다 (도 7B 및 8B). 양성 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다 (도 7C & 8C). 카파 및 람다 경쇄 불변 영역을 함유하는 확인된 효모 일방향 벡터는 pZB004.2 (SEQ ID No. 10) 및 pZB004.3 (SEQ ID No. 12)로 각각 명명되었다.
| DNA (1 ㎍) | 3 ㎕ |
| SpeI-HF | 1 ㎕ |
| SacII | 1 ㎕ |
| 10X Cut Smart | 2 ㎕ |
| 물 | 13 ㎕ |
| 총 부피 | 20 ㎕ |
| 샘플 | 대조군 | |
| DNA (벡터) ~50ng | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) ~160ng | 4 ㎕ | 0 ㎕ |
| 10X T4 DNA 리가아제 완충액 | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ | 1 ㎕ |
| 물 | 개별 부피 | 개별 부피 |
| 총 부피 | 10 ㎕ | 10 ㎕ |
(C) 효모
ScFv
벡터의 생성:
pZB004
.4
효모 디스플레이 연구를 위해 생성된 또 다른 대체 벡터는 ScFv 분자와 호환 가능하였다. 이 컨스트럭트의 산물은 Fab 포맷과는 상이한 ScFv 포맷의 항체 분자이며, 여기서 중쇄 및 경쇄 모두에 대한 불변 영역은 제거되었다. 이 벡터는 pRS314 벡터 (ATCC, USA)로부터 유래된 컨스트럭트의 백본을 기반으로 한다 (도 9). 벡터 백본 및 기타 개별 요소/서열에서 수행된 일부 수정은 다음과 같다.
1. EagI , NotI , SpeI , BamHI , XmaI , SmaI , PstI , EcoRI, EcoRV , SalI , XhoI는 pRS314 벡터로부터 제거된 제한 효소 중 일부이다 (SEQ ID No. 31, 1904 bp 내지 1984 bp, 도 9에 나타냄).
벡터 백본 내 유전자는 ApaI 및 SacII 효소 사이에 설계 및 합성된 삽입/발현 카세트 (도 10A 및 SEQ ID No. 13)로 대체되었다. 상기 설계된 삽입물은 Gal1 프로모터, 뉴클레오티드 코딩 Aga2P 단백질 서열, Aga2P 선도 서열, 인자 Xa 부위, HA 태그, TEV 절단 부위, MCS I (경쇄 가변 영역 도입의 경우, NdeI , BglII , HindIII 및 AscI), 링커 영역 (G4S), MCS II (중쇄 가변 영역 도입의 경우, NcoI , XbaI, NheI 및 NotI), c-Myc 태그, FLAG 태그, 알파 터미네이터를 함유한다.
아래의 표 12 및 13에서 제공된 바와 같이, 약 10 ㎍의 벡터 및 삽입물을 약 25℃에서 밤새 ApaI로 분해한 후 약 37℃에서 약 3 시간 동안 SacII 효소를 첨가하였다. 분해된 재료를 겔 용출하고 약 4℃에서 밤새 결찰시켰다. 2 ㎕의 결찰된 혼합물을 NEB 알파 컴피턴트 세포로 형질 전환시켰다. 개별 콜로니를 접종하고 EcoRV/XhoI 효소 (~2.9 Kb)로 내부 분해에 대해 스크리닝하였다 (도 10B). 양성 클론은 시퀀싱을 위해 보내졌으며 오류가 없는 것으로 밝혀졌다 (도 10C). 중쇄 및 경쇄 도입 부위를 함유하는 확인된 효모 ScFv 벡터는 pZB004.4 (SEQ ID No. 14)로 명명되었다.
| 벡터 | 삽입물 | |
| DNA | 10 ㎍ | 10 ㎍ |
| Cut smart 완충액 (10X) | 10 ㎕ | 10 ㎕ |
| ApaI(20U/㎕) | 2 ㎕ | 2 ㎕ |
| SacII (20U/㎕) | 2 ㎕ | 2 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 | 물의 개별 부피 |
| 총 부피 | 100 ㎕ | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 106.8 ng |
| DNA (삽입물) | 161.2 ng |
| T4 DNA 리가아제 | 0.5 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10X) | 2 ㎕ |
| 물 | 물의 개별 부피 |
| 총 | 20 ㎕ |
(D) 효모 접합형 벡터 (
YMT
벡터)의 구축:
효모 표면 디스플레이 기술은 그의 효모 형질 전환 효율에서의 한계점들로 인해, 파지 (109 내지 1011) 또는 리보솜 (1011 내지 1012) 디스플레이 기술에 비하여 라이브러리 크기에 제약이 있다 (일반적으로 106 내지 108). 개선된 효모 형질 전환 방법은 이 한계점을 극복할 수 있다. 그러나, 다양한 개선된 효모 형질 전환 프로토콜은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 따라서 효모 접합은 큰 항체 라이브러리를 생성하기 위한 강력한 툴로서 사용될 수 있다. 효모 접합은 MATa 세포의 a-응집소 (agglutinin) 및 MATα 세포의 α-응집소와의 상호 작용을 통하여, 반대되는 접합형의 두 반수체 세포 간 세포 융합에 의해 달성된다. 접합 후, 각 반수체 세포 내의 2 개의 뚜렷한 플라스미드가 하나의 이배체 세포로 결합되어, 후속 이배체 세포에서 각 플라스미드로부터 코딩된 항체 단편을 동시에 발현한다. Fab 항체 단편은 2 개의 사슬을 포함한다; VH와 CH1 (중쇄 불변 영역의 제1 도메인)을 갖는 중쇄 (HC) 및 VL과 CL (경쇄 불변 도메인)을 갖는 경쇄 (LC). 따라서, 효모 접합은 HC 및 LC 라이브러리를 함유하는 반대되는 접합형의 두 반수체 세포로부터의 조합 Fab 라이브러리의 구축에 적합하다. CH1과 CL (경쇄 불변 도메인)의 두 C-말단 Cys 잔기 간의 이황화 결합 형성에 의하여, 분비된 LC의 효모 표면-고정 HC로의 헤테로다이머화는 효모 세포 표면의 디스플레이 Fab의 구축을 용이하게 한다.
(D.1)
사카로마이세스
세레비지애
(
Saccharomyces
cerevisiae
)에서의 접합형 중쇄 (HC) 발현 벡터 (
pZB002
)의 구축
접합형 중쇄 발현 벡터는 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에서 효모 세포 표면에 태그 및 TEV 절단 부위를 갖는 HC 사슬 (VH+CH1)을 발현하도록 설계되었다. 이 벡터에 존재하는 Aga2P 신호 서열은 HC 사슬을 분비 경로로 용이하게 한다. 파지 패닝된 분자들 (VH)을 파지미드로부터 HC 발현 벡터로 전달하는 데에는 다양한 제한 부위들의 조합이 중요하다. 이를 달성하기 위하여, 고유 제한 부위들 (NcoI , BmtI , NheI , NotI)은 Aga2P 신호 서열 및 CH1 오픈 리딩 프레임 사이에 유지된다. 유동 세포 스크리닝 동안 HC 사슬을 검출하기 위하여 myc 및 FLAG 태그의 존재가 제공된다. Fab 단편 형태의 효모 세포 표면을 절단하기 위하여, 고도의 서열-특이적 시스테인 프로테아제인 담배 식각 바이러스 프로테아제 (TEV) 및 엔테로키나제 (EK) 부위들이 HC 발현 벡터에 도입된다.
접합형 중쇄 HC 벡터 (pZB002)의 구축에 있어서, p414GAL1 및 HC DNA 카세트 (SEQ ID No. 15)를 사용하였다. HC DNA 카세트를 수용하기 위하여, ATCC (Cat. No. ATCC® 87328TM)의 TRP1 마커를 갖는 CEN-기반 셔틀 벡터인 p414 GAL1을 수정하였다. 상기 수정을 도 11에 제공하였으며, 아래에 요약하였다:
1) BamHI , SmaI , PstI , EcoRI, BspDI , SalI , TspMI , ClaI , HincII 및 XmaI 제한 부위가 수정되었다. 상기 언급된 제한 부위를 수정하기 위하여, 2208 bp 내지 2158 bp의 뉴클레오티드를 p414 GAL1으로부터 제거하였다 (SEQ ID No. 32 및 도 11).
HC DNA 카세트 (SEQ ID No. 15)는 고유 AGA2P 단일 서열 코딩 영역, 다중 클로닝 부위 (NcoI , BmtI , NheI , NotI), 마지막 위치에 손상되지 않은 시스테인 잔기를 갖는 중쇄 불변 영역1 (CH1), 이어서 태그 (c-myc 및 FLAG), C-말단의 AGA2P 오픈 리딩 프레임과 융합된 TEV 절단 부위로 구성된다. HC DNA 카세트는 Gene Art를 통해 합성하였다. HC DNA 카세트 (도 12A) 및 p414 GAL1을 37℃에서 SpeI 및 XhoI로 분해하고 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB002를 생성하였다 (도 12B). 합성된 pZB002 HC 발현 벡터는 수탁 번호 MTCC 25126으로 MTCC에 기탁되었다. HC DNA 카세트는 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에 있다. 고유 NcoI , BmtI , NheI 및 NotI 부위는 AGA2P 신호 서열 뒤에 유지되어, pZB002에서 파지 패닝된 라이브러리로부터 수용된 VH 부위를 클로닝하였다.
| DNA p414 GAL1 또는 HC 카세트 | ~3 ㎍ |
| SpeI | 3 ㎕ |
| XhoI | 3 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) | 5 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 2 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB002의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다 (도 12C 및 SEQ ID No. 16).
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| AGA2P 신호 서열 | 중쇄의 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NcoI, BmtI, NheI, NotI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VH의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 CH1 | 중쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 경쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| FLAG 및 c-myc 에피토프 | 항 flag 또는 항 myc 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| TEV 절단 부위 | 효모 세포 표면으로부터 Fab 포맷 항체 절단 가능 |
| AGA2P 코딩 서열 | 효모 세포 표면에 중쇄-Aga2p 융합 단백질 부착 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| TRP1 유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.2)
사카로마이세스
세레비지애에서의
접합형
경쇄
(
LCλ
) 발현 벡터 (pZB003.1)의 구축:
접합형 경쇄 발현 벡터는 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에서 효모 세포 표면에 태그를 갖는 LC 사슬 (VL+LCλ)을 발현 및 분비하도록 설계되었다. 이 벡터에 존재하는 접합 알파 인자 단일 서열 (pre 영역)은 LC 사슬을 분비 경로로 용이하게 한다. 파지 패닝된 분자들 (VL)을 파지미드로부터 HC 발현 벡터로 전달하는 데에는 다양한 제한 부위들의 조합이 중요하다. 이를 달성하기 위하여, 고유 제한 부위들 (NdeI , BglII , HindIII 및 AscI)은 접합 알파 인자 단일 및 LCλ 오픈 리딩 프레임 사이에 유지된다. 유동 세포 스크리닝 동안 V5 및 His 태그의 존재가 제공되어 LCλ 사슬을 검출한다.
p416 GAL1은 ATCC (ATCC®87332TM)의 URA3 마커를 갖는 CEN-기반 셔틀 벡터이다 (도 13). 이는 상이한 신호 서열을 갖는 몇 개의 경쇄 컨스트럭트를 생성하는 데 사용되었다. 상기 p416 GAL1 벡터 백본을 도 13에 제시된 바와 같이 수정하였으며, 아래에 요약하였다:
1) BamHI , SmaI , XmaI , TspMI , EcoRI, HindIII , BspDI , ClaI 및 SaII 제한 부위가 수정되었다. 상기 언급된 제한 부위를 수정하기 위하여, 2318 bp 내지 2268 bp의 뉴클레오티드를 p416 GAL1으로부터 제거하였다.
SS01에 기초한 LCλ의 분비 플라스미드의 구축을 위하여, 수정된 p416 GAL1 및 LCλ DNA 카세트 (SEQ ID No. 19)를 사용하였다. LCλ 카세트는 알파 인자 단일 서열 (SS01), 고유 다중 클로닝 부위 (NdeI , BglII , HindIII 및 AscI) 및 마지막 위치에 손상되지 않은 시스테인 잔기를 갖는 경쇄 불변 영역 (LCλ), 이어서 태그 (V5 및 His)로 구성된다. LCλ DNA 카세트 (도 14A)는 Gene Art를 통해 합성하였다. 수정된 p416 GAL1 및 LCλ를 37℃에서 SpeI 및 XhoI로 분해하고 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003.1을 생성하였다 (표 18 및 19; 도 14B). LCλ DNA 카세트는 pZB003.1 벡터 내 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에 있게 된다. 고유 NdeI , BglII, HindIII 및 AscI 부위는 SS01 신호 서열 뒤에 유지되어, pZB003.1 벡터에서 파지 패닝된 라이브러리로부터 VL 영역을 클로닝하였다 (도 14C). 생성된 pZB003.1 벡터는 SEQ ID No. 20으로 제공된다.
| DNA (p416 GAL1 또는 LCλ DNA) | ~3 ㎍ |
| SpeI | 3 ㎕ |
| XhoI | 3 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | ~3 ㎍ |
| DNA (삽입물) | 3 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 3 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
아래는 pZB003.1의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표 19이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| 알파 접합 인자 1 분비 신호 서열 | 경쇄의 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VL의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCλ | λ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.3)
사카로마이세스
세레비지애에서의
SS01 신호 서열을 갖는 접합형
경쇄
(LCκ) 발현 벡터 (pZB003.2)의 구축:
접합형 경쇄 발현 벡터는 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에서 효모 세포 표면에 태그를 갖는 LC 사슬 (VL+LCκ)을 발현 및 분비하도록 설계되었다. 이 벡터에 존재하는 접합 알파 인자 단일 서열 (pre 영역)은 LC 사슬을 분비 경로로 용이하게 한다. 파지 패닝된 분자들 (VL)을 파지미드로부터 HC 발현 벡터로 전달하는 데에는 다양한 제한 부위들의 조합이 중요하다. 이를 달성하기 위하여, 고유 제한 부위들 (NdeI , BglII , HindIII 및 AscI)은 접합 알파 인자 단일 및 LCκ 오픈 리딩 프레임 사이에 유지된다. 유동 세포 스크리닝 동안 V5 및 His 태그의 존재가 LCκ 사슬을 검출한다.
SS01에 기초한 LCκ의 분비 플라스미드의 구축을 위하여, 수정된 p416 GAL1 및 SS01-LCκ DNA (SEQ ID No. 21) 카세트를 사용하였다. p416 GAL1은 ATCC (ATCC® 87332TM)의 URA3 마커를 갖는 CEN-기반 셔틀 벡터이다. LCκ 카세트는 접합 알파 인자 단일 서열 (SS01), 고유 다중 클로닝 부위 (NdeI , BglII , HindIII 및 AscI), 마지막 위치에서 손상되지 않은 시스테인 잔기를 갖는 경쇄 불변 영역 (LCκ), 이어서 태그 (V5 및 His)로 구성된다. LCκ 카세트 (도 15A)는 Gene Art를 통해 합성하였다. p416 GAL1 및 LCκ를 약 37℃에서 SpeI 및 XhoI로 분해하고 약 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003.2 벡터를 생성하였다 (표 21 및 22; 도 15B). LCκ DNA 카세트는 pZB003.2 내 GAL1 프로모터 및 CYC1 터미네이터의 조절하에 있게 된다. 고유 NdeI , BglII, HindIII 및 AscI 부위는 SS01 신호 서열 뒤에 유지되어, pZB003.2 벡터에서 파지 패닝된 라이브러리로부터 VL 영역을 클로닝하였다 (도 15C). 합성된 pZB003.2 벡터는 SEQ ID No. 22로 제공된다.
| DNA (p416 GAL1 또는 LCκ DNA) | ~3 ㎍ |
| SpeI | 3 ㎕ |
| XhoI | 3 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) | 5 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 2 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB003.2의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| 알파 접합 인자 1 분비 신호 서열 | 경쇄의 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VH의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCκ | κ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.4)
사카로마이세스
세레비지애에서의
SS02 신호 서열을 갖는 접합형
경쇄
LCκ 발현 벡터 (pZB003)의 구축:
LC 사슬의 분비를 원활하게 하기 위하여, SS02 신호 서열을 접합 인자 알파 1 신호 서열 (pre 영역)의 위치에 도입하였다. SS02는 pre 및 pro 영역을 비롯한 조적된 접합 인자 알파 인자 1 신호 서열이며, appS4로 불린다. appS4는 pre 및 pro 영역을 비롯한 접합 인자 알파 1 신호 서열보다 16배 더 우수한 분비 능력을 가지는 것이 이전에 입증되었다.
SS02에 기조한 LCκ의 분비 플라스미드의 구축를 위하여, pZB003.2 및 SS02-LCκ 카세트 (도 16A) (SEQ ID No. 17)를 사용하였다. SS02 DNA 카세트는 조작된 알파 인자 단일 서열 (appS4) 코딩 영역을 함유한다. SS02 DNA 카세트는 Gene Art를 통해 합성하였다. pZB003.2 및 SS02-LCκ를 약 37℃에서 SpeI 및 HindIII로 분해하고 약 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003을 생성하였다 (표 24 및 25; 도 16B). 합성된 pZB003 벡터 (도 16C)는 SEQ ID No. 18로 제공되며, 수탁 번호 MTCC 25127로 MTCC에 기탁되었다.
| DNA (pZB003.2 또는 SS02-LCκ 카세트의 유도체) | ~4 ㎍ |
| HindIII | 4 ㎕ |
| AscI | 4 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) | 7 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 0 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB003의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| 조작된 알파 인자 단일 서열 (appS4) 신호 서열 | 야생형 알파 접합 인자 1보다 단백질을 16 배 이상 효율적으로 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VL의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCκ | κ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.5)
사카로마이세스
세레비지애에서의
SS03 신호 서열을 갖는 접합형
경쇄
LCκ 발현 벡터 (pZB003.3)의 구축:
LC 사슬의 분비를 원활하게 하기 위하여, SS03 신호 서열을 접합 인자 알파 1 신호 서열 (pre 영역)의 위치에 도입하였다. SS03은 pre 및 pro 영역을 비롯한 조적된 접합 인자 알파 인자 1 신호 서열이며, app8로 불린다. app8은 pre 및 pro 영역을 비롯한 접합 인자 알파 1 신호 서열보다 16배 더 우수한 분비 능력을 가진다.
SS03에 기조한 LCκ의 분비 플라스미드의 구축를 위하여, pZB003.2 및 SS03-LCκ DNA (SEQ ID No. 23)를 사용하였다. SS03 DNA 카세트는 조작된 알파 인자 단일 서열 (app8) 코딩 영역을 함유한다. pZB003.2 및 SS03-LCκ DNA를 약 37℃에서 SpeI 및 HindIII로 분해하고 약 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003.3을 생성하였다 (표 27 및 28; 도 17A & B). 합성된 pZB003.3 벡터 (도 17C)는 SEQ ID No. 24로 제공된다.
| DNA (pZB003.2 또는 SS03-LCκ DNA의 유도체) | ~4 ㎍ |
| HindIII | 4 ㎕ |
| AscI | 4 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (삽입물) | 7 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 0 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB003.3의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| 조작된 알파 인자 단일 서열 (app8) 신호 서열 | 야생형 알파 접합 인자 1보다 단백질을 16 배 이상 효율적으로 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VL의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCκ | κ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
(D.6)
사카로마이세스
세레비지애에서의
SS04 신호 서열을 갖는 접합형
경쇄
LCκ 발현 벡터 (pZB003.4)의 구축:
LC 사슬의 분비를 원활하게 하기 위하여, SS04 신호 서열을 접합 인자 알파 1 신호 서열 (pre 영역)의 위치에 도입하였다. SS04는 효모 내 다양한 단백질에 대한 분비 능력을 갖는 Suc2p 신호 서열이다.
SS04에 기초한 LCκ의 분비 플라스미드의 구축를 위하여, pZB003.2 및 SS04 DNA-LCκ 카세트 (SEQ ID No. 25) 를 사용하였다. SS04 DNA 카세트는 Suc2p 신호 서열 코딩 영역을 함유한다. pZB003.2 및 SS04 DNA-LCκ를 약 37℃에서 SpeI 및 HindIII로 분해하고 약 4℃에서 추가로 결찰하여 pZB003.4를 생성하였다 (표 30 및 31; 도 18A & B). 합성된 pZB003.4 벡터 (도 18C)는 SEQ ID No. 26으로 제공된다.
| DNA (pZB003.2 또는 SS04 DNA-LCκ의 유도체) | ~4 ㎍ |
| HindIII | 4 ㎕ |
| AscI | 4 ㎕ |
| 10 X Cut Smart 완충액 | 10 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 개별적임 |
| 총 부피 | 100 ㎕ |
| DNA (벡터) | 1 ㎕ |
| DNA (벡터) | 7 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 | 1 ㎕ |
| T4 DNA 리가아제 완충액 (10 X) | 1 ㎕ |
| Milli-Q 물 | 0 ㎕ |
| 총 부피 | 10 ㎕ |
아래는 pZB003.4의 특징을 이해할 수 있도록 하는 표이다.
| 특징 | 이점 |
| GAL1 프로모터 | 귀하의 재조합 단백질의 조절된 발현 허용 |
| Suc2p 신호 서열 | 단백질의 효율적인 분비 가능 |
| 다중 클로닝 부위 (NdeI, BglII , HindIII 및 AscI) | 파지 패닝된 라이브러리로부터의 VL의 삽입 가능 |
| 마지막 위치에 시스테인 잔기를 갖는 LCκ | κ 경쇄의 불변 영역 형성 및 시스테인 잔기는 중쇄와 이황화 결합 형성 가능 |
| V5 에피토프 및 폴리히스티딘 에피토프 (6xHis tag) 에피토프 | 항 V5 또는 항 his 항체를 갖는 융합 단백질의 검출 가능 |
| CYC1 터미네이터 | mRNA의 효율적인 전사 종결 |
| URA3유전자 | 효모 형질 전환체의 선택 가능 |
| CEN6/ARS | 안정한 에피솜 복제 및 효모 내 딸 세포로의 분열 가능 |
| 암피실린 저항성 유전자 (β-락타마제) | E. coli 내 선택 |
실시예
3항체
라이브러리의 생성 및
파지미드로부터
효모 접합 벡터로의 라이브러리의 전달
파지미드 벡터 (각각 카파 pZB001 및 람다 pZB001.1)와 함께 건강한 인간 기증자로부터의 나이브 레퍼토리를 나타내는 2차 PCR 풀의 카파 및 람다 경쇄 5 ㎍을 약 37℃에서 밤새 HindIII -HF 및 AscI로 약 100 ㎕의 총 부피에서 분해하였다. 분해된 샘플을 겔 용출한 후 약 4℃에서 밤새 결찰하였다. 25-50 ng의 결찰 혼합물을 일렉트로포레이션을 통해 약 25 ㎕의 TG1 세포로 형질 전환시켰으며, 여기서 1.0 mm의 큐벳을 최적의 설정인 1800 볼트, 600 ohm 및 10 μF로 사용하였다. 회수 배지에서의 회수 후, 약 200 ㎕의 형질 전환 세포를 144 mm 플레이트에 도말하고 약 37℃에서 밤새 배양하였다. 총, 약 6-8 개의 플레이트가 존재하며, 다음 날 이들 플레이트로부터 콜로니를 긁어 내고, 약 20%의 글리세롤로 스톡을 제조하였다. 형질 전환 효율은 희석 플레이팅에 의해 계산하였으며, 약 108 내지 약 1010의 범위, 바람직하게는 ~108인 것으로 밝혀졌다.
희석 플레이팅을 통해 글리세롤 스톡의 바이알 당 총 세포 수를 결정하였으며, 1012인 것으로 밝혀졌다. 콜로니를 약 5 mL LB-Amp에 접종하고 플라스미드를 단리하였다. 단리된 플라스미드를 제한 효소 분해 분석을 위해 검사하였다. ~300 bp의 삽입물 방출로 경쇄, 즉 풀 내 카파 및 람다 둘 모두의 존재를 확인하였다.
일 바이알의 경쇄 풀 (카파 및 람다 모두)을 약 100 mL의 LB-Amp에 접종하고 약 37℃의 쉐이커-인큐베이터에서 약 2-3 시간 동안 성장시킨 후, qiagen 미디 프렙 키트에 의해 제조사의 프로토콜에 따라 플라스미드를 단리하였다. 경쇄 둘 모두에 대한 미디 프렙 (prepped) DNA는 중쇄가 도입되기 전에 제한 효소 분해 분석으로 확인되었다. 대표 클론들 중 일부는 플라스미드 단리에 사용하였고 이는 ~100%의 경쇄 삽입물 존재를 나타내는 제한 효소 분해에 의해 확인되었다. 별도의 미디 프렙은 경쇄, 즉 풀의 카파 및 람다 둘 모두의 라이브러리 DNA를 단리하기 위해 수행되었다. 미디 프렙 DNA는 중쇄 풀의 추가적인 삽입을 위한 사용 전에 제한 효소 분해를 통해 다시 확인되었다.
중쇄의 2차 PCR 풀과 함께 카파 및 람다 경쇄 라이브러리 DNA 약 5μg을 약 37℃에서 밤새 NcoI 및 XbaI로 약 100 ㎕의 총 부피에서 분해하였다. 분해된 샘플을 겔 용출한 후 약 4℃에서 밤새 결찰하였다. 25-50 ng의 결찰 혼합물을 일렉트로포레이션을 통해 25 ㎕의 TG1 세포로 형질 전환시켰으며, 1.0 mm의 큐벳을 최적의 설정인 1800 볼트, 600 ohm 및 10μF로 사용하였다. 회수 배지에서의 회수 후, 약 200 ㎕의 형질 전환 세포를 144 mm 플레이트에 도말하고 약 37℃에서 밤새 배양하였다. 총, 6-8 개의 플레이트가 존재하며, 다음 날 이들 플레이트에서 콜로니를 긁어 내고, 약 20%의 글리세롤로 스톡을 제조하여 -80℃의 냉동고에 보관하였다. 형질 전환 효율은 희석 플레이팅에 의해 계산하였으며, 약 108 내지 약 1010의 범위, 바람직하게는 ~108인 것으로 밝혀졌다.
희석 플레이팅을 통해 글리세롤 스톡의 바이알 당 총 세포 수를 결정하였으며, 1012인 것으로 밝혀졌다. 콜로니를 5 mL LB-Amp에 접종하고 플라스미드를 단리하였다. 단리된 플라스미드를 중쇄의 경우 NcoI 및 XbaI 및 카파 & 람다 경쇄의 경우 HindIII 및 AscI로 제한 효소 분해 분석을 위해 검사하였다. ~400 bp의 삽입물 방출로 카파 풀 (도 19A & B) 및 람다 풀 (도 20A & B) 내 중쇄의 존재를 확인하였다.
DNA 라이브러리를 함유하는 카파 및 람다 경쇄 2차 PCR 풀과 함께 중쇄를 NcoI 및 XbaI로 각각 분해한 후, TG1, 즉 고도의 컴피턴트 E. coli 세포로 각각 결찰 및 형질 전환시켰다.
약 1 ml의 카파 및 람다 박테리아 글리세롤 스톡을 약 37℃에서 600 nm OD가 0.8에 도달할 때까지 약 200 ml LB-AMP 배지로 성장시켰다. 또한, 박테리아에 대한 감염다중도 (multiplicity of infection; MOI)가 10인 M13KO7 헬퍼 파지를 첨가하고 약 37℃에서 30 분 동안 더 배양하였다. 감염 후, 감염된 박테리아를 원심 분리하고 그 펠렛을 100 μg/ml 암피실린 및 25 μg/ml 카나마이신을 함유한 LB 약 200 ml에 재현탁한 후, 약 30℃에서 밤새 250 rpm으로 성장시켰다. 현탁액을 약 4℃에서 약 15 분 동안 약 8000 rpm으로 스핀다운시킨 후 펠렛을 버렸다. 분리된 상층액을 상층액 ¼ 부피의 PEG/NaCl 용액과 혼합하고 그 혼합물을 약 1 시간 동안 얼음상에서 배양하였다. 상기 혼합물을 10000 g에서 약 15 분 동안 원심 분리하고 그 파지 펠렛을 PBS 약 20 ml로 재현탁하였다. 글리세롤을 전체 파지 현탁액에 최종 농도 50%로 첨가하고 파지 라이브러리 스톡으로서 약 -80℃에서 약 1 ml의 부분 표본 (aliquots)으로 동결시켰다.
카파 및 람다 박테리아 라이브러리 둘 모두의 글리세롤 스톡을 혼합 및 접종하였으며, 파지 라이브러리의 생성에 사용하였다. 헬퍼 파지를 첨가함으로써, 다양성을 디스플레이하는 파지 입자는 침전 및 정제되어, 향후 사용을 위한 글리세롤 스톡으로서 저장하였다. 플라크 형성 분석으로부터 유도된 파지 라이브러리의 추산된 수는 약 1010 내지 약 1011, 바람직하게는 ~1011 pfu/mL인 것으로 밝혀졌다. 플라크의 형성은 Her2 항원에 대해 스크리닝될 Fab 단편을 디스플레이하는 파지미드 라이브러리의 기능성을 나타낸다. 패닝 실험을 수행하여 비결합자 (non-binders)를 나이브 풀로부터 제거한 후 플라크 형성 분석을 수행하여 결합자의 수를 측정하였다. 결합자의 추정치는 성공적인 패닝을 나타내는, 초기 파지 수보다 4 디케이드 더 낮은 ~107인 것으로 밝혀졌다.
전체 전략의 계획은 효모 시스템에서 스크리닝 및 분류를 수행하기 위하여 특정 결합자를 파지로부터 효모 발현 벡터로 전달하는 것이다. 친화성 기반 방법을 호환 가능한 방법, 즉 FACS를 사용하여 수행하였으며 최상의 결합자를 추가로 선택하고 등급을 매겼다. 패닝된 파지를 증폭시키고 ssDNA를 단리한 후, 효모 접합형 벡터에 도입하기 위해 PCR 증폭시켰다; 중쇄 및 경쇄 도입을 위함. Fab 라이브러리를 접합 시스템을 이용하여 개발하였으며, 여기서 경쇄 라이브러리 및 중쇄 라이브러리는 상이한 효모 발현 벡터에 클로닝된다. 그러나, 경쇄에 대해 독점적으로 설계 및 생성된 인하우스 효모 발현 벡터 (pZB003.1 & pZB003.2)와 함께 패닝된 분자의 카파 및 람다 경쇄 PCR 풀을 HindIII 및 AscI로 분해한 후, TG1, 즉 고도의 컴피턴트 세포로 각각 결찰 및 형질 전환시켰다. 이와 마찬가지로, HC 사슬 풀 및 각 벡터 (pZB002)를 NcoI 및 NotI로 분해한 후, TG1, 즉 고도의 컴피턴트 세포로 결찰 및 형질 전환시켰다. 중쇄 및 경쇄 패닝된 라이브러리 둘 모두에 대해 얻어진 형질 전환 효율은 >107 cfu이었다. 글리세롤 스톡 제조를 위해 긁어 내기 전에, 중쇄 및 경쇄 라이브러리 둘 모두에 대해 수득된 형질 전환된 콜로니들을 경쇄의 경우 HindIII/AscI (도 21A) 및 중쇄의 경우 NcoI / NotI (도 21B)를 사용하여 삽입물 방출에 대해 검사하였다. 두 사슬에 모두에 대한 삽입물 방출로 패닝된 분자의 존재를 확인하였다. 글리세롤 스톡은 향후 사용을 위하여 -80℃에서 저장하였다.
검증시, 약 1 μg의 각 DNA를 채취하여 일렉트로포레이션의 방법으로 ~5 x 106-2 x 107 cells/ml의 효모 세포로 형질 전환시켰다. 형질 전환을 위한 균주와 관련하여, EBY100은 중쇄 라이브러리의 세포 표면 디스플레이를 위한 숙주로서 사용된 한편, YVH10은 경쇄 라이브러리를 발현하는 데 사용된다. 형질 전환 후, 플레이트들을 약 30℃에서 2-4 일 동안 배양하여 형질 전환체를 성장시켰다. 중쇄 및 경쇄 패닝된 라이브러리 둘 모두를 >106의 효율로 효모 균주 (EBY100-ura3Δ 및 YVH10)로 성공적으로 형질 전환시켰다.
표면에 라이브러리의 Fab 포맷을 디스플레이하기 위하여, 중쇄 및 경쇄 라이브러리를 나타내는 2 개의 성장한 반수체 세포의 접합을 동일한 수의 반수체 세포를 혼합함으로써 수행하였다. 접합 효율은 이중-선택 플레이트에서의 이배체 콜로니 수를 단일 선택 플레이트에서의 총 콜로니 수로 나눔으로써 계산하였으며, 여기서 계산된 접합 퍼센트는 ~40%이었다. 또한, 이배체 세포를 임의의 성장 및 발현 분석 전에 이중 드롭아웃 배지 (ura-, Trp-)에서 농축하였다.
중쇄 풀 및 경쇄 카파 풀을 발현하는 플라스미드를 갖는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 2N 라이브러리를 10 ml의 SDCAA 이중 드롭아웃 배지에 접종하고 약 30℃에서 밤새 (16-20 시간) 성장시켰다. 밤새 성장한 배양물의 600 nm OD를 측정하고 약 10 ml의 SDCAA 이중 드롭아웃 글루코스 배지 (비유도 배양물) 및 약 10 ml의 2XSGCAA 배지 (유도된 배양물)에 600 nm 최종 OD가 0.2 내지 0.3이 되도록 접종하였다. 비유도 세포 및 유도된 세포를 약 20℃에서 24 시간 내지 48 시간에 이르는 범위 내 상이한 시간 동안 성장시켰다.
경쇄 및 중쇄의 발현은 상당한 퍼센트로 관찰되었다. 경쇄 발현은 항-His 항체에 의해 탐침 (probed)되고 >7%로 밝혀진 한편 (도 22A), 중쇄는 항-c-Myc 항체로 탐침되고 비오틴화된 Her2를 사용한 이중 양성 사분면에서 7.2%의 비율로 나타남이 밝혀졌다 (도 22B). 이 결과는 Fab 형성 및 이와 표적 항원과의 성공적인 결합을 나타낸다. 이 결과는 듀얼 영양요구성 마커 선택된 이배체가 중쇄와 관련된 경쇄를 발현함을 나타낸다. 클론의 파지로부터 효모 시스템으로의 성공적인 전달, 이어서 Fab의 발현 및 그의 Her2 항원과의 결합은 본 발명의 효모 벡터 및 파지미드의 기능성 및 효율성을 입증한다.
이와 유사하게, 상기 접근법은 또한 합성 항체/레퍼토리로부터 얻어진 가변 경쇄 (카파 및 람다 경쇄) 및 중쇄 영역을 사용하여 수행될 수도 있다.
실시예
4
효모
scFv
벡터를 사용한 항체 라이브러리의 생성 및 스크리닝
또 다른 효모 발현 컨스트럭트, 즉 효모 ScFv 발현 컨스트럭트 (pZB004.4)를 항-Her2 ScFv 유전자 서열의 발현 및 Her2 항원과의 결합에 대해 시험하였다. 항-Her2 유전자, VH 및 VL을 pZB004.4 벡터의 NdeI / AscI 및 NcoI / NotI 효소 사이의 MCS I 및 II에 각각 클로닝하였다. 클론을 효모 EBY100으로 형질 전환시킨 후 발현을 유도하고 전술한 바와 같이 결합 연구를 수행하였다. 유도된 효모 세포의 유동 세포 분석은 Her2 항원과의 상호 작용을 밝혀냈다. 유동 세포 분석은 스트렙타비딘 Alexa 633 접합체 (conjugate)로 검출되는, 비오틴화된 Her2 항원으로 수행되었다. 또한, 항 c-myc 항체 (alexa flour 488, 접합체)를 사용하여 C-말단의 c-myc 태그 발현을 검출하였다. 그 결과는 효모 세포 표면에서 항 Her2 ScFv 분자의 발현을 나타내는 뚜렷한 이중 양성 형광 신호를 밝혀냈다 (도 23).
종합하여, 본 발명은 단백질 디스플레이 기술에서 본 파지미드 및 효모 발현 플라스미드를 사용하여 나이브 및/또는 합성 라이브러리로부터 단백질/항체 유전자를 발현하는 것에 관한 것이다. 첫째, 파지 디스플레이 기술을 특정 항원에 대한 높은 내지 중간 정도의 친화성을 갖는 잠재적 항체 유전자를 클로닝 및 스크리닝하는 데 사용하였다. 이어서, 이들 유전자를 선도 분자의 추가적인 스크리닝 및 동정을 위해 효모 디스플레이 플라스미드로 전달하였다. 이들 두 상보적인 기술을 결합하면, 매우 다양한 항체 라이브러리를 스크리닝하고 특정 항원에 대한 새로운/선도 항체 분자를 개발할 수 있다. MCS I 및 MCS II에 사용된 제한 효소가 두 가지 발현 시스템에 관하여 동일하기 때문에, 파지로부터 효모 벡터로의 클론 집단의 원활한 전달은 효율적이다. 이들 신중하게 선택된 제한 효소는, 중쇄가 임의의 효모 벡터의 MCS II로 재배치되는 한편 가변 경쇄의 선택된 집단을 파지미드의 MCS I로부터 임의의 효모 벡터의 MCS I으로 전달할 수 있도록 한다.
또한, 나이브 및/또는 합성 항체로부터의 가변 중쇄 및 경쇄 레퍼토리를 본 발명의 파지미드 및 효모 벡터에 직접 클로닝할 수도 있으며 목적하는 결과를 얻을 수 있다.
시스템 간 전달 외에, 시스템 내 전달, 즉 Fab에서 ScFv로 또는 그 반대로의 디스플레이 포맷 변경, 또는 동일한 포맷이지만 상이한 발현 벡터로의 전달, 예컨대 접합형 벡터로부터 바이-시스트론 벡터로의 전달은 MCS 효소의 각 세트를 통해 가능하다. 모든 가능한 시스템 및 포맷에서의 자유로운 전이는 중쇄 또는 경쇄의 무작위화를 제공하여 두 가지 디스플레이 시스템의 차이를 보완할 수 있도록 하는 한편, 특정 조합이 시스템들에 걸쳐 보존되는 것인 시스템의 유용성은 분명히 이점이다.
따라서, 본 발명의 벡터는 단백질 디스플레이 기술에서 다음을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다수의 이점을 제공한다:
·상호 전달 접근법으로, 여기서 두 상보적인 기술 (파지 디스플레이 및 효모 디스플레이)은 고도로 다양한 항체 라이브러리의 스크리닝, 및 특정 항원에 대한 새로운/선도 항체 분자의 개발을 유도한다.
·독창적으로 설계된 삽입/발현 카세트로, 이는 파지로부터 효모 벡터로의 클론 집단의 효율적이고 원활한 전달을 유도하여, 항체 분자/단편의 다양성을 유지한다.
·작은 라이브러리를 수용하는 효모 디스플레이 기술의 단점 및 파지 디스플레이와 같은 원핵 생물 디스플레이 시스템을 이용한 진핵 생물 단백질 발현/디스플레이의 한계를 극복한다.
·내부 전달 접근법으로, 여기서 디스플레이 포맷은 Fab에서 ScFv로 또는 그 반대로 변경될 수 있고, 또는 동일한 포맷이 하나의 효모 벡터에서 다른 효모 벡터로 전달될 수 있으며, MCS 효소의 각 세트를 통한 접합형 벡터로부터 바이-시스트론 벡터로의 전달이 그 예이다.
SEQUENCE LISTING
<110> ZUMUTOR BIOLOGICS, INC.
<120> VECTORS FOR CLONING AND EXPRESSION OF PROTEINS, METHODS AND
APPLICATIONS THEREOF
<130> IP34109
<150> IN 201641012164
<151> 2016-04-06
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2205
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB001 - Phagemid Kappa Insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2205)
<400> 1
caattcaagg agacagtcat aatgaaatac ctgctgccga ccgctgctgc tggtctgctg 60
ctcctcgctg cccagccggc gatggcccat atgaaaagat ctgcgaagct tgctggcgcg 120
cccggaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 180
tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 240
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 300
gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgtcgaa agcagactac 360
gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 420
aagagcttca acaggggaga gtgtacgcgt gtttaaacat aagccgcgcc aattctattt 480
caaggagaca gtcataaaat gaaatacctg ctgccgaccg ctgctgctgg tctgctgctc 540
ctcgctgccc agccggcgat ggccccatgg acatctagaa aagctagcac agcggccgca 600
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 660
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 720
tggaactcag gcgcgctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcatca 780
ggactctact ccctcagcag cgtagtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 840
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 900
aaatcttgtg aattcgacta caaagacgat gacgacaagg gggccgcaga acaaaaactt 960
atttctgaag aggacttgtc ttaggccgaa actgttgaaa gttgtttagc aaaacctcat 1020
acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa gacgacaaaa ctttagatcg ttacgctaac 1080
tatgagggct gtctgtggaa tgctacaggc gttgtggttt gtactggtga cgaaactcag 1140
tgttacggta catgggttcc tattgggctt gctatccctg aaaatgaggg tggtggctct 1200
gagggtggcg gttctgaggg tggcggttct gagggtggcg gtactaaacc tcctgagtac 1260
ggtgatacac ctattccggg ctatacttat atcaaccctc tcgacggcac ttatccgcct 1320
ggtactgagc aaaaccccgc taatcctaat ccttctcttg aggagtctca gcctcttaat 1380
actttcatgt ttcagaataa taggttccga aataggcagg gtgcattaac tgtttatacg 1440
ggcactgtta ctcaaggcac tgaccccgtt aaaacttatt accagtacac tcctgtatca 1500
tcaaaagcca tgtatgacgc ttactggaac ggtaaattca gagactgcgc tttccattct 1560
ggctttaatg aggacccatt cgtttgtgaa tatcaaggcc aatcgtctga cctgcctcaa 1620
cctcctgtca atgctggcgg cggctctggt ggtggttctg gtggcggctc tgagggtggc 1680
ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc ggctctgagg gtggcggttc cggtggcggc 1740
tccggttccg gtgattttga ttatgaaaaa atggcaaacg ctaataaggg ggctatgacc 1800
gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct gacgctaaag gcaaacttga ttctgtcgct 1860
actgattacg gtgctgctat cgatggtttc attggtgacg tttccggcct tgctaatggt 1920
aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct aattcccaaa tggctcaagt cggtgacggt 1980
gataattcac ctttaatgaa taatttccgt caatatttac cttctttgcc tcagtcggtt 2040
gaatgtcgcc cttatgtctt tggcgctggt aaaccatatg aattttctat tgattgtgac 2100
aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg tttcttttat atgttgccac ctttatgtat 2160
gtattttcga cgtttgctaa catactgcgt aataaggagt cttaa 2205
<210> 2
<211> 4780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB001 - Phagemid Kappa Vector Construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(4780)
<400> 2
gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 60
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 120
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 180
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 240
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 300
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 360
tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 420
acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 480
aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 540
cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 600
gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 660
cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 720
tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 780
tgcgctcggc gcttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 840
ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 900
tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 960
gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1020
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1080
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1140
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1200
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1260
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1320
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1380
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1440
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1500
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1560
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1620
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1680
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1740
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1800
acatgcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 1860
ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 1920
agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 1980
gaattgtgag cggataacaa tttcaattca aggagacagt cataatgaaa tacctgctgc 2040
cgaccgctgc tgctggtctg ctgctcctcg ctgcccagcc ggcgatggcc catatgaaaa 2100
gatctgcgaa gcttgctggc gcgcccggaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc 2160
cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact 2220
tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact 2280
cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc 2340
tgacgctgtc gaaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc 2400
agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtacg cgtgtttaaa 2460
cataagccgc gccaattcta tttcaaggag acagtcataa aatgaaatac ctgctgccga 2520
ccgctgctgc tggtctgctg ctcctcgctg cccagccggc gatggcccca tggacatcta 2580
gaaaagctag cacagcggcc gcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac 2640
cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact 2700
tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgcgct gaccagcggc gtgcacacct 2760
tcccggctgt cctacagtca tcaggactct actccctcag cagcgtagtg accgtgccct 2820
ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca 2880
aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgaattcga ctacaaagac gatgacgaca 2940
agggggccgc agaacaaaaa cttatttctg aagaggactt gtcttaggcc gaaactgttg 3000
aaagttgttt agcaaaacct catacagaaa attcatttac taacgtctgg aaagacgaca 3060
aaactttaga tcgttacgct aactatgagg gctgtctgtg gaatgctaca ggcgttgtgg 3120
tttgtactgg tgacgaaact cagtgttacg gtacatgggt tcctattggg cttgctatcc 3180
ctgaaaatga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga gggtggcggt tctgagggtg 3240
gcggtactaa acctcctgag tacggtgata cacctattcc gggctatact tatatcaacc 3300
ctctcgacgg cacttatccg cctggtactg agcaaaaccc cgctaatcct aatccttctc 3360
ttgaggagtc tcagcctctt aatactttca tgtttcagaa taataggttc cgaaataggc 3420
agggtgcatt aactgtttat acgggcactg ttactcaagg cactgacccc gttaaaactt 3480
attaccagta cactcctgta tcatcaaaag ccatgtatga cgcttactgg aacggtaaat 3540
tcagagactg cgctttccat tctggcttta atgaggaccc attcgtttgt gaatatcaag 3600
gccaatcgtc tgacctgcct caacctcctg tcaatgctgg cggcggctct ggtggtggtt 3660
ctggtggcgg ctctgagggt ggcggctctg agggtggcgg ttctgagggt ggcggctctg 3720
agggtggcgg ttccggtggc ggctccggtt ccggtgattt tgattatgaa aaaatggcaa 3780
acgctaataa gggggctatg accgaaaatg ccgatgaaaa cgcgctacag tctgacgcta 3840
aaggcaaact tgattctgtc gctactgatt acggtgctgc tatcgatggt ttcattggtg 3900
acgtttccgg ccttgctaat ggtaatggtg ctactggtga ttttgctggc tctaattccc 3960
aaatggctca agtcggtgac ggtgataatt cacctttaat gaataatttc cgtcaatatt 4020
taccttcttt gcctcagtcg gttgaatgtc gcccttatgt ctttggcgct ggtaaaccat 4080
atgaattttc tattgattgt gacaaaataa acttattccg tggtgtcttt gcgtttcttt 4140
tatatgttgc cacctttatg tatgtatttt cgacgtttgc taacatactg cgtaataagg 4200
agtcttaagc tagctaacag tcctatgaat caactactta gatggtatta gtgacctgta 4260
acagagcatt agcgcaaggt gatttttgtc ttcttgcgct aattttttgt catcaaacct 4320
gtcgcactcc ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 4380
tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 4440
gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 4500
gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 4560
tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 4620
cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 4680
aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 4740
cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcaggtg 4780
<210> 3
<211> 2202
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB001.1 - Phagemid Lambda Insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2202)
<400> 3
caattcaagg agacagtcat aatgaaatac ctgctgccga ccgctgctgc tggtctgctg 60
ctcctcgctg cccagccggc gatggcccat atgaaaagat ctgcgaagct tgctggcgcg 120
cccggtcagc ccaaggccaa ccccactgtc actctgttcc cgccctcctc tgaggagctc 180
caagccaaca aggccacact agtgtgtctg atcagtgact tctacccggg agctgtgaca 240
gtggcctgga aggcagatgg cagccccgtc aaggcgggag tggagaccac caaaccctcc 300
aaacagagca acaacaagta cgcggccagc agctacctga gcctgacgcc cgagcagtgg 360
aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca 420
gtggccccta cagaatgttc aacgcgtgtt taaacataag ccgcgccaat tctatttcaa 480
ggagacagtc ataaaatgaa atacctgctg ccgaccgctg ctgctggtct gctgctcctc 540
gctgcccagc cggcgatggc cccatggaca tctagaaaag ctagcacagc ggccgcagcc 600
tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 660
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 720
aactcaggcg cgctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcatcagga 780
ctctactccc tcagcagcgt agtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 840
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 900
tcttgtgaat tcgactacaa agacgatgac gacaaggggg ccgcagaaca aaaacttatt 960
tctgaagagg acttgtctta ggccgaaact gttgaaagtt gtttagcaaa acctcataca 1020
gaaaattcat ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat 1080
gagggctgtc tgtggaatgc tacaggcgtt gtggtttgta ctggtgacga aactcagtgt 1140
tacggtacat gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag 1200
ggtggcggtt ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt 1260
gatacaccta ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt 1320
actgagcaaa accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact 1380
ttcatgtttc agaataatag gttccgaaat aggcagggtg cattaactgt ttatacgggc 1440
actgttactc aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca 1500
aaagccatgt atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc 1560
tttaatgagg acccattcgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct 1620
cctgtcaatg ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggcggc 1680
tctgagggtg gcggttctga gggtggcggc tctgagggtg gcggttccgg tggcggctcc 1740
ggttccggtg attttgatta tgaaaaaatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa 1800
aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact 1860
gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat 1920
ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat 1980
aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ctttgcctca gtcggttgaa 2040
tgtcgccctt atgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa 2100
ataaacttat tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta 2160
ttttcgacgt ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aa 2202
<210> 4
<211> 4777
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB001.1 - Phagemid lambda Vector Construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(4777)
<400> 4
gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 60
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 120
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 180
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 240
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 300
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 360
tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 420
acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 480
aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 540
cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 600
gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 660
cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 720
tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 780
tgcgctcggc gcttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 840
ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 900
tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 960
gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1020
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1080
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1140
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1200
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1260
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1320
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1380
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1440
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1500
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1560
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1620
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1680
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1740
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1800
acatgcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 1860
ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 1920
agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 1980
gaattgtgag cggataacaa tttcaattca aggagacagt cataatgaaa tacctgctgc 2040
cgaccgctgc tgctggtctg ctgctcctcg ctgcccagcc ggcgatggcc catatgaaaa 2100
gatctgcgaa gcttgctggc gcgcccggtc agcccaaggc caaccccact gtcactctgt 2160
tcccgccctc ctctgaggag ctccaagcca acaaggccac actagtgtgt ctgatcagtg 2220
acttctaccc gggagctgtg acagtggcct ggaaggcaga tggcagcccc gtcaaggcgg 2280
gagtggagac caccaaaccc tccaaacaga gcaacaacaa gtacgcggcc agcagctacc 2340
tgagcctgac gcccgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag gtcacgcatg 2400
aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttcaacgcgt gtttaaacat 2460
aagccgcgcc aattctattt caaggagaca gtcataaaat gaaatacctg ctgccgaccg 2520
ctgctgctgg tctgctgctc ctcgctgccc agccggcgat ggccccatgg acatctagaa 2580
aagctagcac agcggccgca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct 2640
cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc 2700
ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgcgctgac cagcggcgtg cacaccttcc 2760
cggctgtcct acagtcatca ggactctact ccctcagcag cgtagtgacc gtgccctcca 2820
gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg 2880
tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg aattcgacta caaagacgat gacgacaagg 2940
gggccgcaga acaaaaactt atttctgaag aggacttgtc ttaggccgaa actgttgaaa 3000
gttgtttagc aaaacctcat acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa gacgacaaaa 3060
ctttagatcg ttacgctaac tatgagggct gtctgtggaa tgctacaggc gttgtggttt 3120
gtactggtga cgaaactcag tgttacggta catgggttcc tattgggctt gctatccctg 3180
aaaatgaggg tggtggctct gagggtggcg gttctgaggg tggcggttct gagggtggcg 3240
gtactaaacc tcctgagtac ggtgatacac ctattccggg ctatacttat atcaaccctc 3300
tcgacggcac ttatccgcct ggtactgagc aaaaccccgc taatcctaat ccttctcttg 3360
aggagtctca gcctcttaat actttcatgt ttcagaataa taggttccga aataggcagg 3420
gtgcattaac tgtttatacg ggcactgtta ctcaaggcac tgaccccgtt aaaacttatt 3480
accagtacac tcctgtatca tcaaaagcca tgtatgacgc ttactggaac ggtaaattca 3540
gagactgcgc tttccattct ggctttaatg aggatccatt cgtttgtgaa tatcaaggcc 3600
aatcgtctga cctgcctcaa cctcctgtca atgctggcgg cggctctggt ggtggttctg 3660
gtggcggctc tgagggtggc ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc ggctctgagg 3720
gtggcggttc cggtggcggc tccggttccg gtgattttga ttatgaaaaa atggcaaacg 3780
ctaataaggg ggctatgacc gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct gacgctaaag 3840
gcaaacttga ttctgtcgct actgattacg gtgctgctat cgatggtttc attggtgacg 3900
tttccggcct tgctaatggt aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct aattcccaaa 3960
tggctcaagt cggtgacggt gataattcac ctttaatgaa taatttccgt caatatttac 4020
cttctttgcc tcagtcggtt gaatgtcgcc cttatgtctt tggcgctggt aaaccatatg 4080
aattttctat tgattgtgac aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg tttcttttat 4140
atgttgccac ctttatgtat gtattttcga cgtttgctaa catactgcgt aataaggagt 4200
cttaagctag ctaacagtcc tatgaatcaa ctacttagat ggtattagtg acctgtaaca 4260
gagcattagc gcaaggtgat ttttgtcttc ttgcgctaat tttttgtcat caaacctgtc 4320
gcactcctta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt 4380
aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg 4440
ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc 4500
aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc accctaatca 4560
agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga 4620
tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa 4680
ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc 4740
gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcaggtg 4777
<210> 5
<211> 3940
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004 - Bicistronic Bidirectional Kappa insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(3940)
<400> 5
gcccatgagg ccagttaatt aagaggtacc tagaattctg ggatcctaag gaggatgttt 60
tggctctggt caatgattac ggcattgata tcgtccaact gcatggagat gagtcgtggc 120
aagaatacca agagttcctc ggtttgccag ttattaaaag actcgtattt ccaaaagact 180
gcaacatact actcagtgca gcttcacaga aacctcattc gtttattccc ttgtttgatt 240
cagaagcagg tgggacaggt gaacttttgg attggaactc gatttctgac tgggttggaa 300
ggcaagagag ccccgaaagc ttacatttta tgttagctgg tggactgacg ccagaaaatg 360
ttggtgatgc gcttagatta aatggcgtta ttggtgttga tgtaagcgga ggtgtggaga 420
caaatggtgt aaaagactct aacaaaatag caaatttcgt caaaaatgct aagaaatagg 480
ttattactga gtagtattta tttaagtatt gtttgtgcac ttgcctgcgg tgtgaaatac 540
cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggaaatt gtaaacgtta atattttgtt 600
aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg 660
caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg 720
gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta 780
tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg 840
ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa 900
gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct 960
ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct 1020
acagggcgcg tcgcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 1080
gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaagggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 1140
ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattgta 1200
atacgactca ctatagggcg aattggagct cttaattaat tacatttaca tttacattta 1260
catttacatt tacatttaca tccgcgggcg aattggagct caattctctt aggattcgat 1320
tcacattcat ctttttttag ctactaatag gataaattat aggaatttat aacaaattga 1380
aatatggcag gcagcaaaat taaaattgtc ttagtttttt agtgtataga agtgaatagc 1440
tatataaagt atgtgtaaag ttggtaacgg aacgaaaaat agaaaaggat attacatggg 1500
aaaacatgtt gtttacggag aaatgaaaag tatattgtat tttgtacgag ctaaaagtac 1560
agtgggaaca aagtcgattt tgttacatct acactgttgt tatcagattc aatggtgatg 1620
gtgatgatga ccggtacgcg tagaatcgag accgaggaga gggttaggga taggcttacc 1680
gtcgactgta acacgcgtac actctcccct gttgaagctc tttgtgacgg gcgagctcag 1740
gccctgatgg gtgacttcgc aggcgtagac tttgtgtttc tcgtagtctg ctttcgacag 1800
cgtcagggtg ctgctgaggc tgtaggtgct gtccttgctg tcctgctctg tgacactctc 1860
ctgggagtta cccgattgga gggcgttatc caccttccac tgtactttgg cctctctggg 1920
atagaagtta ttcagcaggc acacaacaga ggcagttcca gatttcaact gctcatcaga 1980
tggcgggaag atgaagacag atggtgcagc cacagttccg ggcgcgccag caagcttcgc 2040
agatcttttc atatgagcta atgcggagga tgctgcgaat aaaactgcag taaaaattga 2100
aggaaatctc atggttttca aaaattctta cttttttttt ggatggacgc aaagaagttt 2160
aataatcata ttacatggca ttaccaccat atacatatcc atatacatat ccatatctaa 2220
tcttacttat atgttgtgga aatgtaaaga gccccattat cttagcctaa aaaaaccttc 2280
tctttggaac tttcagtaat acgcttaact gctcattgct atattgaagt acggattaga 2340
agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt cctcgtcttc 2400
accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga acaataaaga 2460
ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac ctggccccac 2520
aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga ttagtttttt 2580
agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat 2640
ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc ggtttgtatt 2700
acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt 2760
taacgtcaag gagaaaaaac accatgcagt tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta 2820
ttgcttcagt tttagcacca tggacatcta gaaaagctag cacagcggcc gcagcctcca 2880
ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag 2940
cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact 3000
caggcgcgct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtca tcaggactct 3060
actccctcag cagcgtagtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct 3120
gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt 3180
gtgaattcga acaaaaactt atttctgaag aggacttgga ctacaaagac gatgacgaca 3240
aggaaaacct gtattttcag ggcctgcagg ctagtggtgg aggaggctct ggtggaggcg 3300
gtagcggagg cggagggtcg atgactggtc aggaactgac aactatatgc gagcaaatcc 3360
cctcaccaac tttagaatcg acgccgtact ctttgtcaac gactactatt ttggccaacg 3420
ggaaggcaat gcaaggagtt tttgaatatt acaaatcagt aacgtttgtc agtaattgcg 3480
gttctcaccc ctcaacaact agcaaaggca gccccataaa cacacagtat gttttttaat 3540
catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc cccacatccg ctctaaccga 3600
aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta tagttatgtt 3660
agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca gacgcgtgta 3720
cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt 3780
aatttgcact agtatgtaaa tgtaaatgta aatgtaaatg taaatgtaaa tgtaaggcca 3840
tataggccgg tacccagctt ttgttccctt tagtgagggt taattccgag cttgctcgag 3900
cgaagcttta gagctcatgg cgcgcctagg ccttgacggc 3940
<210> 6
<211> 7304
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004 - Bicistronic Bidirectional Kappa vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(7304)
<400> 6
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgcctg cggtgtgaaa 1200
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 1260
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1320
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1380
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1440
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 1500
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 1560
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 1620
gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 1680
gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1740
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaagggg ggatgtgctg caaggcgatt 1800
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1860
gtaatacgac tcactatagg gcgaattgga gctcttaatt aattacattt acatttacat 1920
ttacatttac atttacattt acatccgcgg gcgaattgga gctcaattct cttaggattc 1980
gattcacatt catctttttt tagctactaa taggataaat tataggaatt tataacaaat 2040
tgaaatatgg caggcagcaa aattaaaatt gtcttagttt tttagtgtat agaagtgaat 2100
agctatataa agtatgtgta aagttggtaa cggaacgaaa aatagaaaag gatattacat 2160
gggaaaacat gttgtttacg gagaaatgaa aagtatattg tattttgtac gagctaaaag 2220
tacagtggga acaaagtcga ttttgttaca tctacactgt tgttatcaga ttcaatggtg 2280
atggtgatga tgaccggtac gcgtagaatc gagaccgagg agagggttag ggataggctt 2340
accgtcgact gtaacacgcg tacactctcc cctgttgaag ctctttgtga cgggcgagct 2400
caggccctga tgggtgactt cgcaggcgta gactttgtgt ttctcgtagt ctgctttcga 2460
cagcgtcagg gtgctgctga ggctgtaggt gctgtccttg ctgtcctgct ctgtgacact 2520
ctcctgggag ttacccgatt ggagggcgtt atccaccttc cactgtactt tggcctctct 2580
gggatagaag ttattcagca ggcacacaac agaggcagtt ccagatttca actgctcatc 2640
agatggcggg aagatgaaga cagatggtgc agccacagtt ccgggcgcgc cagcaagctt 2700
cgcagatctt ttcatatgag ctaatgcgga ggatgctgcg aataaaactg cagtaaaaat 2760
tgaaggaaat ctcatggttt tcaaaaattc ttactttttt tttggatgga cgcaaagaag 2820
tttaataatc atattacatg gcattaccac catatacata tccatataca tatccatatc 2880
taatcttact tatatgttgt ggaaatgtaa agagccccat tatcttagcc taaaaaaacc 2940
ttctctttgg aactttcagt aatacgctta actgctcatt gctatattga agtacggatt 3000
agaagccgcc gagcgggtga cagccctccg aaggaagact ctcctccgtg cgtcctcgtc 3060
ttcaccggtc gcgttcctga aacgcagatg tgcctcgcgc cgcactgctc cgaacaataa 3120
agattctaca atactagctt ttatggttat gaagaggaaa aattggcagt aacctggccc 3180
cacaaacctt caaatgaacg aatcaaatta acaaccatag gatgataatg cgattagttt 3240
tttagcctta tttctggggt aattaatcag cgaagcgatg atttttgatc tattaacaga 3300
tatataaatg caaaaactgc ataaccactt taactaatac tttcaacatt ttcggtttgt 3360
attacttctt attcaaatgt aataaaagta tcaacaaaaa attgttaata tacctctata 3420
ctttaacgtc aaggagaaaa aacaccatgc agttacttcg ctgtttttca atattttctg 3480
ttattgcttc agttttagca ccatggacat ctagaaaagc tagcacagcg gccgcagcct 3540
ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 3600
cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga 3660
actcaggcgc gctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcatcaggac 3720
tctactccct cagcagcgta gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 3780
tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat 3840
cttgtgaatt cgaacaaaaa cttatttctg aagaggactt ggactacaaa gacgatgacg 3900
acaaggaaaa cctgtatttt cagggcctgc aggctagtgg tggaggaggc tctggtggag 3960
gcggtagcgg aggcggaggg tcgatgactg gtcaggaact gacaactata tgcgagcaaa 4020
tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt actctttgtc aacgactact attttggcca 4080
acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt 4140
gcggttctca cccctcaaca actagcaaag gcagccccat aaacacacag tatgtttttt 4200
aatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct ccccccacat ccgctctaac 4260
cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct atttattttt ttatagttat 4320
gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt ttttttctgt acagacgcgt 4380
gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc 4440
tttaatttgc actagtatgt aaatgtaaat gtaaatgtaa atgtaaatgt aaatgtaagg 4500
ccatataggc cggtacccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaattcc gagcttggcg 4560
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 4620
ataggagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag gtaactcaca 4680
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 4740
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 4800
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 4860
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 4920
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 4980
ctcggccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 5040
acaggactat aaagatacca ggcgttcccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 5100
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 5160
tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 5220
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 5280
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 5340
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 5400
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 5460
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 5520
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 5580
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 5640
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 5700
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 5760
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tgcccgtcgt gtagataact 5820
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 5880
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 5940
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 6000
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 6060
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 6120
acatgatccc ccatgttgtg aaaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 6180
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 6240
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 6300
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 6360
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 6420
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 6480
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 6540
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 6600
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 6660
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 6720
gggtcctttt catcacgtgc tataaaaata attataattt aaatttttta atataaatat 6780
ataaattaaa aatagaaagt aaaaaaagaa attaaagaaa aaatagtttt tgttttccga 6840
agatgtaaaa gactctaggg ggatcgccaa caaatactac cttttatctt gctcttcctg 6900
ctctcaggta ttaatgccga attgtttcat cttgtctgtg tagaagacca cacacgaaaa 6960
tcctgtgatt ttacatttta cttatcgtta atcgaatgta tatctattta atctgctttt 7020
cttgtctaat aaatatatat gtaaagtacg ctttttgttg aaatttttta aacctttgtt 7080
tatttttttt tcttcattcc gtaactcttc taccttcttt atttactttc taaaatccaa 7140
atacaaaaca taaaaataaa taaacacaga gtaaattccc aaattattcc atcattaaaa 7200
gatacgaggc gcgtgtaagt tacaggcaag cgatccgtcc taagaaacca ttattatcat 7260
gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 7304
<210> 7
<211> 2509
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.1 - Bicistronic Bidirectional Lambda insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2509)
<400> 7
ccgcgggcga attggagctc aattctctta ggattcgatt cacattcatc tttttttagc 60
tactaatagg ataaattata ggaatttata acaaattgaa atatggcagg cagcaaaatt 120
aaaattgtct tagtttttta gtgtatagaa gtgaatagct atataaagta tgtgtaaagt 180
tggtaacgga acgaaaaata gaaaaggata ttacatggga aaacatgttg tttacggaga 240
aatgaaaagt atattgtatt ttgtacgagc taaaagtaca gtgggaacaa agtcgatttt 300
gttacatcta cactgttgtt atcagattca atggtgatgg tgatgatgac cggtacgcgt 360
agaatcgaga ccgaggagag ggttagggat aggcttaccg tcgactgtaa cacgcgttga 420
acattctgta ggggccactg tcttctccac ggtgctccct tcatgcgtga cctggcagct 480
gtagcttctg tgggacttcc actgctcggg cgtcaggctc aggtagctgc tggccgcgta 540
cttgttgttg ctctgtttgg agggtttggt ggtctccact cccgccttga cggggctgcc 600
atctgccttc caggccactg tcacagctcc cgggtagaag tcactgatca gacacactag 660
ggtggccttg ttggcttgga gctcctcaga ggagggcggg aacagagtga cagtggggtt 720
ggccttgggc tgaccgggcg cgccagcaag cttcgcagat cttttcatat gagctaatgc 780
ggaggatgct gcgaataaaa ctgcagtaaa aattgaagga aatctcatgg ttttcaaaaa 840
ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata atcatattac atggcattac 900
caccatatac atatccatat acatatccat atctaatctt acttatatgt tgtggaaatg 960
taaagagccc cattatctta gcctaaaaaa accttctctt tggaactttc agtaatacgc 1020
ttaactgctc attgctatat tgaagtacgg attagaagcc gccgagcggg tgacagccct 1080
ccgaaggaag actctcctcc gtgcgtcctc gtcttcaccg gtcgcgttcc tgaaacgcag 1140
atgtgcctcg cgccgcactg ctccgaacaa taaagattct acaatactag cttttatggt 1200
tatgaagagg aaaaattggc agtaacctgg ccccacaaac cttcaaatga acgaatcaaa 1260
ttaacaacca taggatgata atgcgattag ttttttagcc ttatttctgg ggtaattaat 1320
cagcgaagcg atgatttttg atctattaac agatatataa atgcaaaaac tgcataacca 1380
ctttaactaa tactttcaac attttcggtt tgtattactt cttattcaaa tgtaataaaa 1440
gtatcaacaa aaaattgtta atatacctct atactttaac gtcaaggaga aaaaacacca 1500
tgcagttact tcgctgtttt tcaatatttt ctgttattgc ttcagtttta gcaccatgga 1560
catctagaaa agctagcaca gcggccgcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc 1620
tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 1680
actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgcgctgacc agcggcgtgc 1740
acaccttccc ggctgtccta cagtcatcag gactctactc cctcagcagc gtagtgaccg 1800
tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca 1860
acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga attcgaacaa aaacttattt 1920
ctgaagagga cttggactac aaagacgatg acgacaagga aaacctgtat tttcagggcc 1980
tgcaggctag tggtggagga ggctctggtg gaggcggtag cggaggcgga gggtcgatga 2040
ctggtcagga actgacaact atatgcgagc aaatcccctc accaacttta gaatcgacgc 2100
cgtactcttt gtcaacgact actattttgg ccaacgggaa ggcaatgcaa ggagtttttg 2160
aatattacaa atcagtaacg tttgtcagta attgcggttc tcacccctca acaactagca 2220
aaggcagccc cataaacaca cagtatgttt tttaatcatg taattagtta tgtcacgctt 2280
acattcacgc cctcccccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga 2340
agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt 2400
tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac 2460
cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgcactagt 2509
<210> 8
<211> 7301
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.1 - Bicistronic Bidirectional lambda vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(7301)
<400> 8
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgcctg cggtgtgaaa 1200
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 1260
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1320
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1380
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1440
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 1500
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 1560
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 1620
gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 1680
gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1740
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaagggg ggatgtgctg caaggcgatt 1800
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1860
gtaatacgac tcactatagg gcgaattgga gctcttaatt aattacattt acatttacat 1920
ttacatttac atttacattt acatccgcgg gcgaattgga gctcaattct cttaggattc 1980
gattcacatt catctttttt tagctactaa taggataaat tataggaatt tataacaaat 2040
tgaaatatgg caggcagcaa aattaaaatt gtcttagttt tttagtgtat agaagtgaat 2100
agctatataa agtatgtgta aagttggtaa cggaacgaaa aatagaaaag gatattacat 2160
gggaaaacat gttgtttacg gagaaatgaa aagtatattg tattttgtac gagctaaaag 2220
tacagtggga acaaagtcga ttttgttaca tctacactgt tgttatcaga ttcaatggtg 2280
atggtgatga tgaccggtac gcgtagaatc gagaccgagg agagggttag ggataggctt 2340
accgtcgact gtaacacgcg ttgaacattc tgtaggggcc actgtcttct ccacggtgct 2400
cccttcatgc gtgacctggc agctgtagct tctgtgggac ttccactgct cgggcgtcag 2460
gctcaggtag ctgctggccg cgtacttgtt gttgctctgt ttggagggtt tggtggtctc 2520
cactcccgcc ttgacggggc tgccatctgc cttccaggcc actgtcacag ctcccgggta 2580
gaagtcactg atcagacaca ctagggtggc cttgttggct tggagctcct cagaggaggg 2640
cgggaacaga gtgacagtgg ggttggcctt gggctgaccg ggcgcgccag caagcttcgc 2700
agatcttttc atatgagcta atgcggagga tgctgcgaat aaaactgcag taaaaattga 2760
aggaaatctc atggttttca aaaattctta cttttttttt ggatggacgc aaagaagttt 2820
aataatcata ttacatggca ttaccaccat atacatatcc atatacatat ccatatctaa 2880
tcttacttat atgttgtgga aatgtaaaga gccccattat cttagcctaa aaaaaccttc 2940
tctttggaac tttcagtaat acgcttaact gctcattgct atattgaagt acggattaga 3000
agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt cctcgtcttc 3060
accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga acaataaaga 3120
ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac ctggccccac 3180
aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga ttagtttttt 3240
agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat 3300
ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc ggtttgtatt 3360
acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt 3420
taacgtcaag gagaaaaaac accatgcagt tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta 3480
ttgcttcagt tttagcacca tggacatcta gaaaagctag cacagcggcc gcagcctcca 3540
ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag 3600
cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact 3660
caggcgcgct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtca tcaggactct 3720
actccctcag cagcgtagtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct 3780
gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt 3840
gtgaattcga acaaaaactt atttctgaag aggacttgga ctacaaagac gatgacgaca 3900
aggaaaacct gtattttcag ggcctgcagg ctagtggtgg aggaggctct ggtggaggcg 3960
gtagcggagg cggagggtcg atgactggtc aggaactgac aactatatgc gagcaaatcc 4020
cctcaccaac tttagaatcg acgccgtact ctttgtcaac gactactatt ttggccaacg 4080
ggaaggcaat gcaaggagtt tttgaatatt acaaatcagt aacgtttgtc agtaattgcg 4140
gttctcaccc ctcaacaact agcaaaggca gccccataaa cacacagtat gttttttaat 4200
catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc cccacatccg ctctaaccga 4260
aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta tagttatgtt 4320
agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca gacgcgtgta 4380
cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt 4440
aatttgcact agtatgtaaa tgtaaatgta aatgtaaatg taaatgtaaa tgtaaggcca 4500
tataggccgg tacccagctt ttgttccctt tagtgagggt taattccgag cttggcgtaa 4560
tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 4620
ggagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgaggta actcacatta 4680
attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 4740
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 4800
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 4860
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 4920
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 4980
ggcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 5040
ggactataaa gataccaggc gttcccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 5100
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 5160
caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 5220
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 5280
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 5340
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 5400
actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 5460
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 5520
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 5580
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 5640
aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 5700
atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 5760
gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactgc ccgtcgtgta gataactacg 5820
atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 5880
ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 5940
cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 6000
agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 6060
cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 6120
tgatccccca tgttgtgaaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 6180
agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 6240
gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 6300
gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 6360
ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 6420
tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 6480
tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 6540
gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 6600
caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 6660
atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctggg 6720
tccttttcat cacgtgctat aaaaataatt ataatttaaa ttttttaata taaatatata 6780
aattaaaaat agaaagtaaa aaaagaaatt aaagaaaaaa tagtttttgt tttccgaaga 6840
tgtaaaagac tctaggggga tcgccaacaa atactacctt ttatcttgct cttcctgctc 6900
tcaggtatta atgccgaatt gtttcatctt gtctgtgtag aagaccacac acgaaaatcc 6960
tgtgatttta cattttactt atcgttaatc gaatgtatat ctatttaatc tgcttttctt 7020
gtctaataaa tatatatgta aagtacgctt tttgttgaaa ttttttaaac ctttgtttat 7080
ttttttttct tcattccgta actcttctac cttctttatt tactttctaa aatccaaata 7140
caaaacataa aaataaataa acacagagta aattcccaaa ttattccatc attaaaagat 7200
acgaggcgcg tgtaagttac aggcaagcga tccgtcctaa gaaaccatta ttatcatgac 7260
attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt c 7301
<210> 9
<211> 2951
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.2 - Bicistronic Unidirectional kappa insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2951)
<400> 9
ccgcgggttt tttctccttg acgttaaagt atagaggtat attaacaatt ttttgttgat 60
acttttatta catttgaata agaagtaata caaaccgaaa atgttgaaag tattagttaa 120
agtggttatg cagtttttgc atttatatat ctgttaatag atcaaaaatc atcgcttcgc 180
tgattaatta ccccagaaat aaggctaaaa aactaatcgc attatcatcc tatggttgtt 240
aatttgattc gttcatttga aggtttgtgg ggccaggtta ctgccaattt ttcctcttca 300
taaccataaa agctagtatt gtagaatctt tattgttcgg agcagtgcgg cgcgaggcac 360
atctgcgttt caggaacgcg accggtgaag acgaggacgc acggaggaga gtcttccttc 420
ggagggctgt cacccgctcg gcggcttcta atccgtactt caatatagca atgagcagtt 480
aagcgtatta ctgaaagttc caaagagaag gtttttttag gctaagataa tggggctctt 540
tacatttcca caacatataa gtaagattag atatggatat gtatatggat atgtatatgg 600
tggtaatgcc atgtaatatg attattaaac ttctttgcgt ccatccaaaa aaaaagtaag 660
aatttttgaa aaccatgaga tttccttcaa tttttactgc agttttattc gcagcatcct 720
ccgcattagc tcatatgaaa agatctgcga agcttgctgg cgcgcccgga actgtggctg 780
caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg 840
ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata 900
acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca 960
cctacagcct cagcagcacc ctgacgctgt cgaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct 1020
acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg 1080
gagagtgtac gcgtgttaca gtcgacggta agcctatccc taaccctctc ctcggtctcg 1140
attctacgcg taccggtcat catcaccatc accatatctg ataacaacag tgtagatgta 1200
acaaaatcga ctttgttccc actgtacttt tagctcgtac aaaatacaat atacttttca 1260
tttctccgta aacaacatgt tttcccatgt aatatccttt tctatttttc gttccgttac 1320
caactttaca catactttat atagctattc acttctatac actaaaaaac taagacaatt 1380
ttaattttgc tgcctgccat atttcaattt gttataaatt cctataattt atcctattag 1440
tagctaaaaa aagatgaatg tgaatcgaat cctaagagaa ttgagctcca attcgccgga 1500
ttagaagccg ccgagcgggt gacagccctc cgaaggaaga ctctcctccg tgcgtcctcg 1560
tcttcaccgg tcgcgttcct gaaacgcaga tgtgcctcgc gccgcactgc tccgaacaat 1620
aaagattcta caatactagc ttttatggtt atgaagagga aaaattggca gtaacctggc 1680
cccacaaacc ttcaaatgaa cgaatcaaat taacaaccat aggatgataa tgcgattagt 1740
tttttagcct tatttctggg gtaattaatc agcgaagcga tgatttttga tctattaaca 1800
gatatataaa tgcaaaaact gcataaccac tttaactaat actttcaaca ttttcggttt 1860
gtattacttc ttattcaaat gtaataaaag tatcaacaaa aaattgttaa tatacctcta 1920
tactttaacg tcaaggagac catgcagtta cttcgctgtt tttcaatatt ttctgttatt 1980
gcttcagttt tagcaccatg gacatctaga aaagctagca cagcggccgc agcctccacc 2040
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 2100
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 2160
ggcgcgctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcatc aggactctac 2220
tccctcagca gcgtagtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 2280
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 2340
gaattcgaac aaaaacttat ttctgaagag gacttggact acaaagacga tgacgacaag 2400
gaaaacctgt attttcaggg cctgcaggct agtggtggag gaggctctgg tggaggcggt 2460
agcggaggcg gagggtcgat gactggtcag gaactgacaa ctatatgcga gcaaatcccc 2520
tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga ctactatttt ggccaacggg 2580
aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa cgtttgtcag taattgcggt 2640
tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca cacagtatgt tttttaatca 2700
tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctccccc cacatccgct ctaaccgaaa 2760
aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta tttttttata gttatgttag 2820
tattaagaac gttatttata tttcaaattt ttcttttttt tctgtacaga cgcgtgtacg 2880
catgtaacat tatactgaaa accttgcttg agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa 2940
tttgcactag t 2951
<210> 10
<211> 7743
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.2 - Bicistronic Unidirectional kappa vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(7743)
<400> 10
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgcctg cggtgtgaaa 1200
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 1260
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1320
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1380
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1440
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 1500
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 1560
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 1620
gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 1680
gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1740
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaagggg ggatgtgctg caaggcgatt 1800
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1860
gtaatacgac tcactatagg gcgaattgga gctcccgcgg atgtaaatgt aaatgtaaat 1920
gtaaatgtaa atgtaaatgt aattaattaa gttttttctc cttgacgtta aagtatagag 1980
gtatattaac aattttttgt tgatactttt attacatttg aataagaagt aatacaaacc 2040
gaaaatgttg aaagtattag ttaaagtggt tatgcagttt ttgcatttat atatctgtta 2100
atagatcaaa aatcatcgct tcgctgatta attaccccag aaataaggct aaaaaactaa 2160
tcgcattatc atcctatggt tgttaatttg attcgttcat ttgaaggttt gtggggccag 2220
gttactgcca atttttcctc ttcataacca taaaagctag tattgtagaa tctttattgt 2280
tcggagcagt gcggcgcgag gcacatctgc gtttcaggaa cgcgaccggt gaagacgagg 2340
acgcacggag gagagtcttc cttcggaggg ctgtcacccg ctcggcggct tctaatccgt 2400
acttcaatat agcaatgagc agttaagcgt attactgaaa gttccaaaga gaaggttttt 2460
ttaggctaag ataatggggc tctttacatt tccacaacat ataagtaaga ttagatatgg 2520
atatgtatat ggatatgtat atggtggtaa tgccatgtaa tatgattatt aaacttcttt 2580
gcgtccatcc aaaaaaaaag taagaatttt tgaaaaccat gagatttcct tcaattttta 2640
ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctcatat gaaaagatct gcgaagcttg 2700
ctggcgcgcc cggaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc 2760
agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg 2820
ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca 2880
cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgtcgaaag 2940
cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc 3000
ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtacgcgtgt tacagtcgac ggtaagccta 3060
tccctaaccc tctcctcggt ctcgattcta cgcgtaccgg tcatcatcac catcaccata 3120
tctgataaca acagtgtaga tgtaacaaaa tcgactttgt tcccactgta cttttagctc 3180
gtacaaaata caatatactt ttcatttctc cgtaaacaac atgttttccc atgtaatatc 3240
cttttctatt tttcgttccg ttaccaactt tacacatact ttatatagct attcacttct 3300
atacactaaa aaactaagac aattttaatt ttgctgcctg ccatatttca atttgttata 3360
aattcctata atttatccta ttagtagcta aaaaaagatg aatgtgaatc gaatcctaag 3420
agaattgagc tccaattcgc cggattagaa gccgccgagc gggtgacagc cctccgaagg 3480
aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt tcctgaaacg cagatgtgcc 3540
tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac tagcttttat ggttatgaag 3600
aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa tgaacgaatc aaattaacaa 3660
ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc tggggtaatt aatcagcgaa 3720
gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa aactgcataa ccactttaac 3780
taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc aaatgtaata aaagtatcaa 3840
caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg agaccatgca gttacttcgc 3900
tgtttttcaa tattttctgt tattgcttca gttttagcac catggacatc tagaaaagct 3960
agcacagcgg ccgcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 4020
aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 4080
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcg ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 4140
gtcctacagt catcaggact ctactccctc agcagcgtag tgaccgtgcc ctccagcagc 4200
ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 4260
aagaaagttg agcccaaatc ttgtgaattc gaacaaaaac ttatttctga agaggacttg 4320
gactacaaag acgatgacga caaggaaaac ctgtattttc agggcctgca ggctagtggt 4380
ggaggaggct ctggtggagg cggtagcgga ggcggagggt cgatgactgg tcaggaactg 4440
acaactatat gcgagcaaat cccctcacca actttagaat cgacgccgta ctctttgtca 4500
acgactacta ttttggccaa cgggaaggca atgcaaggag tttttgaata ttacaaatca 4560
gtaacgtttg tcagtaattg cggttctcac ccctcaacaa ctagcaaagg cagccccata 4620
aacacacagt atgtttttta atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc 4680
cccccacatc cgctctaacc gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta 4740
tttatttttt tatagttatg ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt 4800
tttttctgta cagacgcgtg tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg 4860
ttttgggacg ctcgaaggct ttaatttgca ctagtatgta aatgtaaatg taaatgtaaa 4920
tgtaaatgta aatgtaaggc catataggcc ggtacccagc ttttgttccc tttagtgagg 4980
gttaattccg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 5040
gctcacaatt ccacacaaca taggagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 5100
atgagtgagg taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 5160
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 5220
tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 5280
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 5340
aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 5400
gctggcgttt ttccataggc tcggcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 5460
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgttccccc ctggaagctc 5520
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 5580
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 5640
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 5700
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 5760
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 5820
gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 5880
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 5940
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 6000
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 6060
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 6120
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 6180
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 6240
gcccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 6300
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 6360
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 6420
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 6480
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 6540
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtga aaaaaagcgg ttagctcctt 6600
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 6660
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 6720
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 6780
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 6840
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 6900
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 6960
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 7020
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 7080
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 7140
tccccgaaaa gtgccacctg ggtccttttc atcacgtgct ataaaaataa ttataattta 7200
aattttttaa tataaatata taaattaaaa atagaaagta aaaaaagaaa ttaaagaaaa 7260
aatagttttt gttttccgaa gatgtaaaag actctagggg gatcgccaac aaatactacc 7320
ttttatcttg ctcttcctgc tctcaggtat taatgccgaa ttgtttcatc ttgtctgtgt 7380
agaagaccac acacgaaaat cctgtgattt tacattttac ttatcgttaa tcgaatgtat 7440
atctatttaa tctgcttttc ttgtctaata aatatatatg taaagtacgc tttttgttga 7500
aattttttaa acctttgttt attttttttt cttcattccg taactcttct accttcttta 7560
tttactttct aaaatccaaa tacaaaacat aaaaataaat aaacacagag taaattccca 7620
aattattcca tcattaaaag atacgaggcg cgtgtaagtt acaggcaagc gatccgtcct 7680
aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc 7740
gtc 7743
<210> 11
<211> 2948
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.3 - Bicistronic Unidirectional lambda insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2948)
<400> 11
ccgcgggttt tttctccttg acgttaaagt atagaggtat attaacaatt ttttgttgat 60
acttttatta catttgaata agaagtaata caaaccgaaa atgttgaaag tattagttaa 120
agtggttatg cagtttttgc atttatatat ctgttaatag atcaaaaatc atcgcttcgc 180
tgattaatta ccccagaaat aaggctaaaa aactaatcgc attatcatcc tatggttgtt 240
aatttgattc gttcatttga aggtttgtgg ggccaggtta ctgccaattt ttcctcttca 300
taaccataaa agctagtatt gtagaatctt tattgttcgg agcagtgcgg cgcgaggcac 360
atctgcgttt caggaacgcg accggtgaag acgaggacgc acggaggaga gtcttccttc 420
ggagggctgt cacccgctcg gcggcttcta atccgtactt caatatagca atgagcagtt 480
aagcgtatta ctgaaagttc caaagagaag gtttttttag gctaagataa tggggctctt 540
tacatttcca caacatataa gtaagattag atatggatat gtatatggat atgtatatgg 600
tggtaatgcc atgtaatatg attattaaac ttctttgcgt ccatccaaaa aaaaagtaag 660
aatttttgaa aaccatgaga tttccttcaa tttttactgc agttttattc gcagcatcct 720
ccgcattagc tcatatgaaa agatctgcga agcttgctgg cgcgcccggt cagcccaagg 780
ccaaccccac tgtcactctg ttcccgccct cctctgagga gctccaagcc aacaaggcca 840
ccctagtgtg tctgatcagt gacttctacc cgggagctgt gacagtggcc tggaaggcag 900
atggcagccc cgtcaaggcg ggagtggaga ccaccaaacc ctccaaacag agcaacaaca 960
agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgcccgagca gtggaagtcc cacagaagct 1020
acagctgcca ggtcacgcat gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat 1080
gttcaacgcg tgttacagtc gacggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt 1140
ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc atatctgata acaacagtgt agatgtaaca 1200
aaatcgactt tgttcccact gtacttttag ctcgtacaaa atacaatata cttttcattt 1260
ctccgtaaac aacatgtttt cccatgtaat atccttttct atttttcgtt ccgttaccaa 1320
ctttacacat actttatata gctattcact tctatacact aaaaaactaa gacaatttta 1380
attttgctgc ctgccatatt tcaatttgtt ataaattcct ataatttatc ctattagtag 1440
ctaaaaaaag atgaatgtga atcgaatcct aagagaattg agctccaatt cgccggatta 1500
gaagccgccg agcgggtgac agccctccga aggaagactc tcctccgtgc gtcctcgtct 1560
tcaccggtcg cgttcctgaa acgcagatgt gcctcgcgcc gcactgctcc gaacaataaa 1620
gattctacaa tactagcttt tatggttatg aagaggaaaa attggcagta acctggcccc 1680
acaaaccttc aaatgaacga atcaaattaa caaccatagg atgataatgc gattagtttt 1740
ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat 1800
atataaatgc aaaaactgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcggtttgta 1860
ttacttctta ttcaaatgta ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac 1920
tttaacgtca aggagaccat gcagttactt cgctgttttt caatattttc tgttattgct 1980
tcagttttag caccatggac atctagaaaa gctagcacag cggccgcagc ctccaccaag 2040
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 2100
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 2160
gcgctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcatcagg actctactcc 2220
ctcagcagcg tagtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 2280
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgaa 2340
ttcgaacaaa aacttatttc tgaagaggac ttggactaca aagacgatga cgacaaggaa 2400
aacctgtatt ttcagggcct gcaggctagt ggtggaggag gctctggtgg aggcggtagc 2460
ggaggcggag ggtcgatgac tggtcaggaa ctgacaacta tatgcgagca aatcccctca 2520
ccaactttag aatcgacgcc gtactctttg tcaacgacta ctattttggc caacgggaag 2580
gcaatgcaag gagtttttga atattacaaa tcagtaacgt ttgtcagtaa ttgcggttct 2640
cacccctcaa caactagcaa aggcagcccc ataaacacac agtatgtttt ttaatcatgt 2700
aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctccccccac atccgctcta accgaaaagg 2760
aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt ttttatagtt atgttagtat 2820
taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct gtacagacgc gtgtacgcat 2880
gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg acgctcgaag gctttaattt 2940
gcactagt 2948
<210> 12
<211> 7740
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.3 - Bicistronic Unidirectional lambda vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(7740)
<400> 12
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgcctg cggtgtgaaa 1200
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 1260
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1320
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1380
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1440
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 1500
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 1560
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 1620
gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 1680
gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1740
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaagggg ggatgtgctg caaggcgatt 1800
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1860
gtaatacgac tcactatagg gcgaattgga gctcttaatt aattacattt acatttacat 1920
ttacatttac atttacattt acatccgcgg gttttttctc cttgacgtta aagtatagag 1980
gtatattaac aattttttgt tgatactttt attacatttg aataagaagt aatacaaacc 2040
gaaaatgttg aaagtattag ttaaagtggt tatgcagttt ttgcatttat atatctgtta 2100
atagatcaaa aatcatcgct tcgctgatta attaccccag aaataaggct aaaaaactaa 2160
tcgcattatc atcctatggt tgttaatttg attcgttcat ttgaaggttt gtggggccag 2220
gttactgcca atttttcctc ttcataacca taaaagctag tattgtagaa tctttattgt 2280
tcggagcagt gcggcgcgag gcacatctgc gtttcaggaa cgcgaccggt gaagacgagg 2340
acgcacggag gagagtcttc cttcggaggg ctgtcacccg ctcggcggct tctaatccgt 2400
acttcaatat agcaatgagc agttaagcgt attactgaaa gttccaaaga gaaggttttt 2460
ttaggctaag ataatggggc tctttacatt tccacaacat ataagtaaga ttagatatgg 2520
atatgtatat ggatatgtat atggtggtaa tgccatgtaa tatgattatt aaacttcttt 2580
gcgtccatcc aaaaaaaaag taagaatttt tgaaaaccat gagatttcct tcaattttta 2640
ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctcatat gaaaagatct gcgaagcttg 2700
ctggcgcgcc cggtcagccc aaggccaacc ccactgtcac tctgttcccg ccctcctctg 2760
aggagctcca agccaacaag gccaccctag tgtgtctgat cagtgacttc tacccgggag 2820
ctgtgacagt ggcctggaag gcagatggca gccccgtcaa ggcgggagtg gagaccacca 2880
aaccctccaa acagagcaac aacaagtacg cggccagcag ctacctgagc ctgacgcccg 2940
agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg agcaccgtgg 3000
agaagacagt ggcccctaca gaatgttcaa cgcgtgttac agtcgacggt aagcctatcc 3060
ctaaccctct cctcggtctc gattctacgc gtaccggtca tcatcaccat caccatatct 3120
gataacaaca gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta 3180
caaaatacaa tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt 3240
ttctattttt cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata 3300
cactaaaaaa ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat 3360
tcctataatt tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga 3420
attgagctcc aattcgccgg attagaagcc gccgagcggg tgacagccct ccgaaggaag 3480
actctcctcc gtgcgtcctc gtcttcaccg gtcgcgttcc tgaaacgcag atgtgcctcg 3540
cgccgcactg ctccgaacaa taaagattct acaatactag cttttatggt tatgaagagg 3600
aaaaattggc agtaacctgg ccccacaaac cttcaaatga acgaatcaaa ttaacaacca 3660
taggatgata atgcgattag ttttttagcc ttatttctgg ggtaattaat cagcgaagcg 3720
atgatttttg atctattaac agatatataa atgcaaaaac tgcataacca ctttaactaa 3780
tactttcaac attttcggtt tgtattactt cttattcaaa tgtaataaaa gtatcaacaa 3840
aaaattgtta atatacctct atactttaac gtcaaggaga ccatgcagtt acttcgctgt 3900
ttttcaatat tttctgttat tgcttcagtt ttagcaccat ggacatctag aaaagctagc 3960
acagcggccg cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 4020
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 4080
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgcgctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 4140
ctacagtcat caggactcta ctccctcagc agcgtagtga ccgtgccctc cagcagcttg 4200
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 4260
aaagttgagc ccaaatcttg tgaattcgaa caaaaactta tttctgaaga ggacttggac 4320
tacaaagacg atgacgacaa ggaaaacctg tattttcagg gcctgcaggc tagtggtgga 4380
ggaggctctg gtggaggcgg tagcggaggc ggagggtcga tgactggtca ggaactgaca 4440
actatatgcg agcaaatccc ctcaccaact ttagaatcga cgccgtactc tttgtcaacg 4500
actactattt tggccaacgg gaaggcaatg caaggagttt ttgaatatta caaatcagta 4560
acgtttgtca gtaattgcgg ttctcacccc tcaacaacta gcaaaggcag ccccataaac 4620
acacagtatg ttttttaatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc 4680
ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt 4740
atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt 4800
ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt 4860
tgggacgctc gaaggcttta atttgcacta gtatgtaaat gtaaatgtaa atgtaaatgt 4920
aaatgtaaat gtaaggccat ataggccggt acccagcttt tgttcccttt agtgagggtt 4980
aattccgagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 5040
cacaattcca cacaacatag gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 5100
agtgaggtaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 5160
gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 5220
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 5280
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 5340
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 5400
ggcgtttttc cataggctcg gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 5460
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg ttcccccctg gaagctccct 5520
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 5580
gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 5640
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5700
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5760
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5820
gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 5880
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 5940
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 6000
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 6060
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 6120
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 6180
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactgcc 6240
cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 6300
accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 6360
ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 6420
ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 6480
tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 6540
acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgaaaa aaagcggtta gctccttcgg 6600
tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 6660
actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 6720
ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 6780
aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 6840
ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 6900
cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 6960
aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 7020
actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 7080
cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 7140
ccgaaaagtg ccacctgggt ccttttcatc acgtgctata aaaataatta taatttaaat 7200
tttttaatat aaatatataa attaaaaata gaaagtaaaa aaagaaatta aagaaaaaat 7260
agtttttgtt ttccgaagat gtaaaagact ctagggggat cgccaacaaa tactaccttt 7320
tatcttgctc ttcctgctct caggtattaa tgccgaattg tttcatcttg tctgtgtaga 7380
agaccacaca cgaaaatcct gtgattttac attttactta tcgttaatcg aatgtatatc 7440
tatttaatct gcttttcttg tctaataaat atatatgtaa agtacgcttt ttgttgaaat 7500
tttttaaacc tttgtttatt tttttttctt cattccgtaa ctcttctacc ttctttattt 7560
actttctaaa atccaaatac aaaacataaa aataaataaa cacagagtaa attcccaaat 7620
tattccatca ttaaaagata cgaggcgcgt gtaagttaca ggcaagcgat ccgtcctaag 7680
aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 7740
<210> 13
<211> 1446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.4 - Yeast ScFv insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1446)
<400> 13
ccgcggacgg attagaagcc gccgagcggg tgacagccct ccgaaggaag actctcctcc 60
gtgcgtcctc gtcttcaccg gtcgcgttcc tgaaacgcag atgtgcctcg cgccgcactg 120
ctccgaacaa taaagattct acaatactag cttttatggt tatgaagagg aaaaattggc 180
agtaacctgg ccccacaaac cttcaaatga acgaatcaaa ttaacaacca taggatgata 240
atgcgattag ttttttagcc ttatttctgg ggtaattaat cagcgaagcg atgatttttg 300
atctattaac agatatataa atgcaaaaac tgcataacca ctttaactaa tactttcaac 360
attttcggtt tgtattactt cttattcaaa tgtaataaaa gtatcaacaa aaaattgtta 420
atatacctct atactttaac gtcaaggaga aaaaaccccg gatcgaattc cctacttcat 480
acattttcaa ttaagatgca gttacttcgc tgtttttcaa tattttctgt tattgcttca 540
gttttagcac aggaactgac aactatatgc gagcaaatcc cctcaccaac tttagaatcg 600
acgccgtact ctttgtcaac gactactatt ttggccaacg ggaaggcaat gcaaggagtt 660
tttgaatatt acaaatcagt aacgtttgtc agtaattgcg gttctcaccc ctcaacaact 720
agcaaaggca gccccataaa cacacagtat gtttttaagg acaatagctc gacgattgaa 780
ggtagatacc catacgacgt tccagactac gctctgcagg ctagtggtgg aggaggctct 840
ggtggaggcg gtagcggagg cggagggtcg atgactggtg aaaacctgta ttttcagggc 900
gctagcacta gtcatatgaa aagatctgcg aagcttgctg gcgcgcccgg tggttcctct 960
agatcttcct cctctggtgg cggtggctcg ggcggtggtg ggccatggac atctagaaaa 1020
gctagcacag cggccgccct cgagggatcc gaacaaaagc ttatttctga agaggacttg 1080
cgtacccgtg actacaaaga cgatgacgac aagtaataga tctgataaca acagtgtaga 1140
tgtaacaaaa tcgactttgt tcccactgta cttttagctc gtacaaaata caatatactt 1200
ttcatttctc cgtaaacaac atgttttccc atgtaatatc cttttctatt tttcgttccg 1260
ttaccaactt tacacatact ttatatagct attcacttct atacactaaa aaactaagac 1320
aattttaatt ttgctgcctg ccatatttca atttgttata aattcctata atttatccta 1380
ttagtagcta aaaaaagatg aatgtgaatc gaatcctaag agaattgagc tccaattcgc 1440
gggccc 1446
<210> 14
<211> 6135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB004.4 - Yeast ScFv vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(6135)
<400> 14
gggcccggta cccagctttt gttcccttta gtgagggtta attccgagct tggcgtaatc 60
atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatagg 120
agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgaggtaac tcacattaat 180
tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 240
aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 300
cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 360
ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 420
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctcgg 480
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 540
actataaaga taccaggcgt tcccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 600
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 660
atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 720
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 780
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 840
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 900
tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 960
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 1020
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 1080
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 1140
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 1200
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 1260
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactgccc gtcgtgtaga taactacgat 1320
acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 1380
ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 1440
tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 1500
ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 1560
ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 1620
atcccccatg ttgtgaaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 1680
taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 1740
catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 1800
atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 1860
acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 1920
aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 1980
ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 2040
cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 2100
atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 2160
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgggtc 2220
cttttcatca cgtgctataa aaataattat aatttaaatt ttttaatata aatatataaa 2280
ttaaaaatag aaagtaaaaa aagaaattaa agaaaaaata gtttttgttt tccgaagatg 2340
taaaagactc tagggggatc gccaacaaat actacctttt atcttgctct tcctgctctc 2400
aggtattaat gccgaattgt ttcatcttgt ctgtgtagaa gaccacacac gaaaatcctg 2460
tgattttaca ttttacttat cgttaatcga atgtatatct atttaatctg cttttcttgt 2520
ctaataaata tatatgtaaa gtacgctttt tgttgaaatt ttttaaacct ttgtttattt 2580
ttttttcttc attccgtaac tcttctacct tctttattta ctttctaaaa tccaaataca 2640
aaacataaaa ataaataaac acagagtaaa ttcccaaatt attccatcat taaaagatac 2700
gaggcgcgtg taagttacag gcaagcgatc cgtcctaaga aaccattatt atcatgacat 2760
taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg 2820
gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 2880
ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc 2940
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccataaacga cattactata 3000
tatataatat aggaagcatt taatagacag catcgtaata tatgtgtact ttgcagttat 3060
gacgccagat ggcagtagtg gaagatattc tttattgaaa aatagcttgt caccttacgt 3120
acaatcttga tccggagctt ttcttttttt gccgattaag aattaattcg gtcgaaaaaa 3180
gaaaaggaga gggccaagag ggagggcatt ggtgactatt gagcacgtga gtatacgtga 3240
ttaagcacac aaaggcagct tggagtatgt ctgttattaa tttcacaggt agttctggtc 3300
cattggtgaa agtttgcggc ttgcagagca cagaggccgc agaatgtgct ctagattccg 3360
atgctgactt gctgggtatt atatgtgtgc ccaatagaaa gagaacaatt gacccggtta 3420
ttgcaaggaa aatttcaagt cttgtaaaag catataaaaa tagttcaggc actccgaaat 3480
acttggttgg cgtgtttcgt aatcaaccta aggaggatgt tttggctctg gtcaatgatt 3540
acggcattga tatcgtccaa ctgcatggag atgagtcgtg gcaagaatac caagagttcc 3600
tcggtttgcc agttattaaa agactcgtat ttccaaaaga ctgcaacata ctactcagtg 3660
cagcttcaca gaaacctcat tcgtttattc ccttgtttga ttcagaagca ggtgggacag 3720
gtgaactttt ggattggaac tcgatttctg actgggttgg aaggcaagag agccccgaaa 3780
gcttacattt tatgttagct ggtggactga cgccagaaaa tgttggtgat gcgcttagat 3840
taaatggcgt tattggtgtt gatgtaagcg gaggtgtgga gacaaatggt gtaaaagact 3900
ctaacaaaat agcaaatttc gtcaaaaatg ctaagaaata ggttattact gagtagtatt 3960
tatttaagta ttgtttgtgc acttgcctgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 4020
gaaaataccg catcaggaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt 4080
ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc 4140
aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt 4200
aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact 4260
acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg 4320
gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag 4380
aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac 4440
gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtcgcgcca 4500
ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt 4560
acgccagctg gcgaaggggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt 4620
ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggg 4680
cgaattggag ctccaccgcg gacggattag aagccgccga gcgggtgaca gccctccgaa 4740
ggaagactct cctccgtgcg tcctcgtctt caccggtcgc gttcctgaaa cgcagatgtg 4800
cctcgcgccg cactgctccg aacaataaag attctacaat actagctttt atggttatga 4860
agaggaaaaa ttggcagtaa cctggcccca caaaccttca aatgaacgaa tcaaattaac 4920
aaccatagga tgataatgcg attagttttt tagccttatt tctggggtaa ttaatcagcg 4980
aagcgatgat ttttgatcta ttaacagata tataaatgca aaaactgcat aaccacttta 5040
actaatactt tcaacatttt cggtttgtat tacttcttat tcaaatgtaa taaaagtatc 5100
aacaaaaaat tgttaatata cctctatact ttaacgtcaa ggagaaaaaa ccccggatcg 5160
aattccctac ttcatacatt ttcaattaag atgcagttac ttcgctgttt ttcaatattt 5220
tctgttattg cttcagtttt agcacaggaa ctgacaacta tatgcgagca aatcccctca 5280
ccaactttag aatcgacgcc gtactctttg tcaacgacta ctattttggc caacgggaag 5340
gcaatgcaag gagtttttga atattacaaa tcagtaacgt ttgtcagtaa ttgcggttct 5400
cacccctcaa caactagcaa aggcagcccc ataaacacac agtatgtttt taaggacaat 5460
agctcgacga ttgaaggtag atacccatac gacgttccag actacgctct gcaggctagt 5520
ggtggaggag gctctggtgg aggcggtagc ggaggcggag ggtcgatgac tggtgaaaac 5580
ctgtattttc agggcgctag cactagtcat atgaaaagat ctgcgaagct tgctggcgcg 5640
cccggtggtt cctctagatc ttcctcctct ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggcca 5700
tggacatcta gaaaagctag cacagcggcc gccctcgagg gatccgaaca aaagcttatt 5760
tctgaagagg acttgcgtac ccgtgactac aaagacgatg acgacaagta atagatctga 5820
taacaacagt gtagatgtaa caaaatcgac tttgttccca ctgtactttt agctcgtaca 5880
aaatacaata tacttttcat ttctccgtaa acaacatgtt ttcccatgta atatcctttt 5940
ctatttttcg ttccgttacc aactttacac atactttata tagctattca cttctataca 6000
ctaaaaaact aagacaattt taattttgct gcctgccata tttcaatttg ttataaattc 6060
ctataattta tcctattagt agctaaaaaa agatgaatgt gaatcgaatc ctaagagaat 6120
tgagctccaa ttcgc 6135
<210> 15
<211> 759
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB002 - Aga2P Heavy chain Mating Type insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(759)
<400> 15
actagtatgc agttacttcg ctgtttttca atattttctg ttattgcttc agttttagca 60
ccatggacat ctagaaaagc tagcacagcg gccgcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 120
ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 180
gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc gctgaccagc 240
ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcatcaggac tctactccct cagcagcgta 300
gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 360
cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgaatt cgaacaaaaa 420
cttatttctg aagaggactt ggactacaaa gacgatgacg acaaggaaaa cctgtatttt 480
cagggcctgc aggctagtgg tggaggaggc tctggtggag gcggtagcgg aggcggaggg 540
tcgcaggaac tgacaactat atgcgagcaa atcccctcac caactttaga atcgacgccg 600
tactctttgt caacgactac tattttggcc aacgggaagg caatgcaagg agtttttgaa 660
tattacaaat cagtaacgtt tgtcagtaat tgcggttctc acccctcaac aactagcaaa 720
ggcagcccca taaacacaca gtatgttttt tgactcgag 759
<210> 16
<211> 6169
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB002 - Aga2P Heavy chain Mating Type vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(6169)
<400> 16
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgccta tgcggtgtga 1200
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt 1260
ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 1320
atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 1380
gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 1440
gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 1500
aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 1560
ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 1620
gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 1680
ccgctacagg gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1740
tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 1800
ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag 1860
cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg gccgcaaatt aaagccttcg 1920
agcgtcccaa aaccttctca agcaaggttt tcagtataat gttacatgcg tacacgcgtc 1980
tgtacagaaa aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt tcttaatact aacataacta 2040
taaaaaaata aatagggacc tagacttcag gttgtctaac tccttccttt tcggttagag 2100
cggatgtggg gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac taattacatg actcgagtca 2160
aaaaacatac tgtgtgttta tggggctgcc tttgctagtt gttgaggggt gagaaccgca 2220
attactgaca aacgttactg atttgtaata ttcaaaaact ccttgcattg ccttcccgtt 2280
ggccaaaata gtagtcgttg acaaagagta cggcgtcgat tctaaagttg gtgaggggat 2340
ttgctcgcat atagttgtca gttcctgcga ccctccgcct ccgctaccgc ctccaccaga 2400
gcctcctcca ccactagcct gcaggccctg aaaatacagg ttttccttgt cgtcatcgtc 2460
tttgtagtcc aagtcctctt cagaaataag tttttgttcg aattcacaag atttgggctc 2520
aactttcttg tccaccttgg tgttgctggg cttgtgattc acgttgcaga tgtaggtctg 2580
ggtgcccaag ctgctggagg gcacggtcac tacgctgctg agggagtaga gtcctgatga 2640
ctgtaggaca gccgggaagg tgtgcacgcc gctggtcagc gcgcctgagt tccacgacac 2700
cgtcaccggt tcggggaagt agtccttgac caggcagccc agggccgctg tgcccccaga 2760
ggtgctcttg gaggagggtg ccagggggaa gaccgatggg cccttggtgg aggctgcggc 2820
cgctgtgcta gcttttctag atgtccatgg tgctaaaact gaagcaataa cagaaaatat 2880
tgaaaaacag cgaagtaact gcatactagt tctagatata gttttttctc cttgacgtta 2940
aagtatagag gtatattaac aattttttgt tgatactttt attacatttg aataagaagt 3000
aatacaaacc gaaaatgttg aaagtattag ttaaagtggt tatgcagttt ttgcatttat 3060
atatctgtta atagatcaaa aatcatcgct tcgctgatta attaccccag aaataaggct 3120
aaaaaactaa tcgcattatc atcctatggt tgttaatttg attcgttcat ttgaaggttt 3180
gtggggccag gttactgcca atttttcctc ttcataacca taaaagctag tattgtagaa 3240
tctttattgt tcggagcagt gcggcgcgag gcacatctgc gtttcaggaa cgcgaccggt 3300
gaagacgagg acgcacggag gagagtcttc cttcggaggg ctgtcacccg ctcggcggct 3360
tctaatccgt acttcagagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct 3420
tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 3480
acaacatagg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgaggtaac 3540
tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 3600
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 3660
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 3720
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 3780
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 3840
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 3900
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 3960
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 4020
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 4080
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 4140
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 4200
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 4260
acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 4320
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 4380
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 4440
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 4500
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 4560
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 4620
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 4680
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 4740
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 4800
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 4860
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 4920
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 4980
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 5040
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 5100
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 5160
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 5220
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 5280
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 5340
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 5400
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 5460
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 5520
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 5580
cacctgggtc cttttcatca cgtgctataa aaataattat aatttaaatt ttttaatata 5640
aatatataaa ttaaaaatag aaagtaaaaa aagaaattaa agaaaaaata gtttttgttt 5700
tccgaagatg taaaagactc tagggggatc gccaacaaat actacctttt atcttgctct 5760
tcctgctctc aggtattaat gccgaattgt ttcatcttgt ctgtgtagaa gaccacacac 5820
gaaaatcctg tgattttaca ttttacttat cgttaatcga atgtatatct atttaatctg 5880
cttttcttgt ctaataaata tatatgtaaa gtacgctttt tgttgaaatt ttttaaacct 5940
ttgtttattt ttttttcttc attccgtaac tcttctacct tctttattta ctttctaaaa 6000
tccaaataca aaacataaaa ataaataaac acagagtaaa ttcccaaatt attccatcat 6060
taaaagatac gaggcgcgtg taagttacag gcaagcgatc cgtcctaaga aaccattatt 6120
atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 6169
<210> 17
<211> 501
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003 - Light chain (Kappa) ss02 Mating Type insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(501)
<400> 17
actagtatga gatttccttc aatttttact gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta 60
gctcatatga aaagatctgc gaagcttgct ggcgcgccag gtcagcccaa ggccaacccc 120
actgtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagctccaag ccaacaaggc caccctagtg 180
tgtctgatca gtgacttcta cccgggagct gtgacagtgg cctggaaggc agatggcagc 240
cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaaa ccctccaaac agagcaacaa caagtacgcg 300
gccagcagct acctgagcct gacgcccgag cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc 360
caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcagtc 420
gacggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat 480
caccatcacc attgactcga g 501
<210> 18
<211> 6021
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003 - Light chain (Kappa) ss02 Mating Type vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(6021)
<400> 18
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataccac agcttttcaa ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc 240
ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg 300
agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca tgaaattgcc 360
cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatcatgt 420
cgaaagctac atataaggaa cgtgctgcta ctcatcctag tcctgttgct gccaagctat 480
ttaatatcat gcacgaaaag caaacaaact tgtgtgcttc attggatgtt cgtaccacca 540
aggaattact ggagttagtt gaagcattag gtcccaaaat ttgtttacta aaaacacatg 600
tggatatctt gactgatttt tccatggagg gcacagttaa gccgctaaag gcattatccg 660
ccaagtacaa ttttttactc ttcgaagaca gaaaatttgc tgacattggt aatacagtca 720
aattgcagta ctctgcgggt gtatacagaa tagcagaatg ggcagacatt acgaatgcac 780
acggtgtggt gggcccaggt attgttagcg gtttgaagca ggcggcagaa gaagtaacaa 840
aggaacctag aggccttttg atgttagcag aattgtcatg caagggctcc ctatctactg 900
gagaatatac taagggtact gttgacattg cgaagagcga caaagatttt gttatcggct 960
ttattgctca aagagacatg ggtggaagag atgaaggtta cgattggttg attatgacac 1020
ccggtgtggg tttagatgac aagggagacg cattgggtca acagtataga accgtggatg 1080
atgtggtctc tacaggatct gacattatta ttgttggaag aggactattt gcaaagggaa 1140
gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca gaaaagcagg ctgggaagca tatttgagaa 1200
gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat tataagtaaa tgcatgtata ctaaactcac 1260
aaattagagc ttcaatttaa ttatatcagt tattacccta tgcggtgtga aataccgcac 1320
agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat 1380
tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa 1440
tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca 1500
agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg 1560
gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta 1620
aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg 1680
cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa 1740
gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg 1800
gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg 1860
cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg 1920
taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat 1980
acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg gccgcaaatt aaagccttcg agcgtcccaa 2040
aaccttctca agcaaggttt tcagtataat gttacatgcg tacacgcgtc tgtacagaaa 2100
aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt tcttaatact aacataacta taaaaaaata 2160
aatagggacc tagacttcag gttgtctaac tccttccttt tcggttagag cggatgtggg 2220
gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac taattacatg actcgagtca atggtgatgg 2280
tgatgatgac cggtacgcgt agaatcgaga ccgaggagag ggttagggat aggcttaccg 2340
tcgactgaac attctgtagg ggccactgtc ttctccacgg tgctcccttc atgcgtgacc 2400
tggcagctgt agcttctgtg ggacttccac tgctcgggcg tcaggctcag gtagctgctg 2460
gccgcgtact tgttgttgct ctgtttggag ggtttggtgg tctccactcc cgccttgacg 2520
gggctgccat ctgccttcca ggccactgtc acagctcccg ggtagaagtc actgatcaga 2580
cacactaggg tggccttgtt ggcttggagc tcctcagagg agggcgggaa cagagtgaca 2640
gtggggttgg ccttgggctg acctggcgcg ccagcaagct tcgcagatct tttcatatga 2700
gctaatgcgg aggatgctgc gaataaaact gcagtaaaaa ttgaaggaaa tctcatacta 2760
gttctagata tagttttttc tccttgacgt taaagtatag aggtatatta acaatttttt 2820
gttgatactt ttattacatt tgaataagaa gtaatacaaa ccgaaaatgt tgaaagtatt 2880
agttaaagtg gttatgcagt ttttgcattt atatatctgt taatagatca aaaatcatcg 2940
cttcgctgat taattacccc agaaataagg ctaaaaaact aatcgcatta tcatcctatg 3000
gttgttaatt tgattcgttc atttgaaggt ttgtggggcc aggttactgc caatttttcc 3060
tcttcataac cataaaagct agtattgtag aatctttatt gttcggagca gtgcggcgcg 3120
aggcacatct gcgtttcagg aacgcgaccg gtgaagacga ggacgcacgg aggagagtct 3180
tccttcggag ggctgtcacc cgctcggcgg cttctaatcc gtacttcaga gctccagctt 3240
ttgttccctt tagtgagggt taattgcgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 3300
tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata ggagccggaa gcataaagtg 3360
taaagcctgg ggtgcctaat gagtgaggta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 3420
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 3480
gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 3540
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 3600
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 3660
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 3720
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 3780
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 3840
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 3900
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 3960
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 4020
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 4080
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 4140
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 4200
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 4260
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 4320
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 4380
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 4440
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 4500
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 4560
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 4620
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 4680
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 4740
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 4800
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 4860
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 4920
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 4980
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 5040
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 5100
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 5160
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 5220
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 5280
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 5340
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 5400
aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctggg tccttttcat cacgtgctat 5460
aaaaataatt ataatttaaa ttttttaata taaatatata aattaaaaat agaaagtaaa 5520
aaaagaaatt aaagaaaaaa tagtttttgt tttccgaaga tgtaaaagac tctaggggga 5580
tcgccaacaa atactacctt ttatcttgct cttcctgctc tcaggtatta atgccgaatt 5640
gtttcatctt gtctgtgtag aagaccacac acgaaaatcc tgtgatttta cattttactt 5700
atcgttaatc gaatgtatat ctatttaatc tgcttttctt gtctaataaa tatatatgta 5760
aagtacgctt tttgttgaaa ttttttaaac ctttgtttat ttttttttct tcattccgta 5820
actcttctac cttctttatt tactttctaa aatccaaata caaaacataa aaataaataa 5880
acacagagta aattcccaaa ttattccatc attaaaagat acgaggcgcg tgtaagttac 5940
aggcaagcga tccgtcctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 6000
gtatcacgag gccctttcgt c 6021
<210> 19
<211> 501
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003.1 - Light chain (Lambda)ss01 Mating Type insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(501)
<400> 19
actagtatga gatttccttc aatttttact gcagttttat tcgcagcatc ctccgcatta 60
gctcatatga aaagatctgc gaagcttgct ggcgcgccaa ctgtggctgc accatctgtc 120
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 180
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 240
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 300
agcagcaccc tgacgctgtc gaaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 360
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtgtc 420
gacggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat 480
caccatcacc attgactcga g 501
<210> 20
<211> 6021
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003.1 - Light chain (Lambda)ss01 Mating Type vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(6021)
<400> 20
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataccac agcttttcaa ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc 240
ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg 300
agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca tgaaattgcc 360
cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatcatgt 420
cgaaagctac atataaggaa cgtgctgcta ctcatcctag tcctgttgct gccaagctat 480
ttaatatcat gcacgaaaag caaacaaact tgtgtgcttc attggatgtt cgtaccacca 540
aggaattact ggagttagtt gaagcattag gtcccaaaat ttgtttacta aaaacacatg 600
tggatatctt gactgatttt tccatggagg gcacagttaa gccgctaaag gcattatccg 660
ccaagtacaa ttttttactc ttcgaagaca gaaaatttgc tgacattggt aatacagtca 720
aattgcagta ctctgcgggt gtatacagaa tagcagaatg ggcagacatt acgaatgcac 780
acggtgtggt gggcccaggt attgttagcg gtttgaagca ggcggcagaa gaagtaacaa 840
aggaacctag aggccttttg atgttagcag aattgtcatg caagggctcc ctatctactg 900
gagaatatac taagggtact gttgacattg cgaagagcga caaagatttt gttatcggct 960
ttattgctca aagagacatg ggtggaagag atgaaggtta cgattggttg attatgacac 1020
ccggtgtggg tttagatgac aagggagacg cattgggtca acagtataga accgtggatg 1080
atgtggtctc tacaggatct gacattatta ttgttggaag aggactattt gcaaagggaa 1140
gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca gaaaagcagg ctgggaagca tatttgagaa 1200
gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat tataagtaaa tgcatgtata ctaaactcac 1260
aaattagagc ttcaatttaa ttatatcagt tattacccta tgcggtgtga aataccgcac 1320
agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat 1380
tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa 1440
tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca 1500
agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg 1560
gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta 1620
aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg 1680
cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa 1740
gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg 1800
gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg 1860
cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg 1920
taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat 1980
acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg gccgcaaatt aaagccttcg agcgtcccaa 2040
aaccttctca agcaaggttt tcagtataat gttacatgcg tacacgcgtc tgtacagaaa 2100
aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt tcttaatact aacataacta taaaaaaata 2160
aatagggacc tagacttcag gttgtctaac tccttccttt tcggttagag cggatgtggg 2220
gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac taattacatg actcgagtca atggtgatgg 2280
tgatgatgac cggtacgcgt agaatcgaga ccgaggagag ggttagggat aggcttaccg 2340
tcgacacact ctcccctgtt gaagctcttt gtgacgggcg agctcaggcc ctgatgggtg 2400
acttcgcagg cgtagacttt gtgtttctcg tagtctgctt tcgacagcgt cagggtgctg 2460
ctgaggctgt aggtgctgtc cttgctgtcc tgctctgtga cactctcctg ggagttaccc 2520
gattggaggg cgttatccac cttccactgt actttggcct ctctgggata gaagttattc 2580
agcaggcaca caacagaggc agttccagat ttcaactgct catcagatgg cgggaagatg 2640
aagacagatg gtgcagccac agttggcgcg ccagcaagct tcgcagatct tttcatatga 2700
gctaatgcgg aggatgctgc gaataaaact gcagtaaaaa ttgaaggaaa tctcatacta 2760
gttctagata tagttttttc tccttgacgt taaagtatag aggtatatta acaatttttt 2820
gttgatactt ttattacatt tgaataagaa gtaatacaaa ccgaaaatgt tgaaagtatt 2880
agttaaagtg gttatgcagt ttttgcattt atatatctgt taatagatca aaaatcatcg 2940
cttcgctgat taattacccc agaaataagg ctaaaaaact aatcgcatta tcatcctatg 3000
gttgttaatt tgattcgttc atttgaaggt ttgtggggcc aggttactgc caatttttcc 3060
tcttcataac cataaaagct agtattgtag aatctttatt gttcggagca gtgcggcgcg 3120
aggcacatct gcgtttcagg aacgcgaccg gtgaagacga ggacgcacgg aggagagtct 3180
tccttcggag ggctgtcacc cgctcggcgg cttctaatcc gtacttcaga gctccagctt 3240
ttgttccctt tagtgagggt taattgcgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 3300
tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata ggagccggaa gcataaagtg 3360
taaagcctgg ggtgcctaat gagtgaggta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 3420
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 3480
gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 3540
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 3600
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 3660
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 3720
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 3780
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 3840
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 3900
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 3960
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 4020
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 4080
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 4140
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 4200
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 4260
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 4320
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 4380
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 4440
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 4500
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 4560
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 4620
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 4680
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 4740
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 4800
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 4860
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 4920
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 4980
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 5040
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 5100
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 5160
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 5220
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 5280
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 5340
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 5400
aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctggg tccttttcat cacgtgctat 5460
aaaaataatt ataatttaaa ttttttaata taaatatata aattaaaaat agaaagtaaa 5520
aaaagaaatt aaagaaaaaa tagtttttgt tttccgaaga tgtaaaagac tctaggggga 5580
tcgccaacaa atactacctt ttatcttgct cttcctgctc tcaggtatta atgccgaatt 5640
gtttcatctt gtctgtgtag aagaccacac acgaaaatcc tgtgatttta cattttactt 5700
atcgttaatc gaatgtatat ctatttaatc tgcttttctt gtctaataaa tatatatgta 5760
aagtacgctt tttgttgaaa ttttttaaac ctttgtttat ttttttttct tcattccgta 5820
actcttctac cttctttatt tactttctaa aatccaaata caaaacataa aaataaataa 5880
acacagagta aattcccaaa ttattccatc attaaaagat acgaggcgcg tgtaagttac 5940
aggcaagcga tccgtcctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 6000
gtatcacgag gccctttcgt c 6021
<210> 21
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003.2 - Light chain (Kappa) ss01 Mating Type insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(711)
<400> 21
actagtatga gatttccttc aatttttact gctgttgttt tcgcagcatc ctccgcatta 60
gctgctccag ctaacactac agctgaagat gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc 120
atcggttact taggtttaga aggggattca gatgttgctg ctttgccatt atccgatagc 180
acaaataacg ggtcattgtc aactaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa 240
ggggtacaac tcgataaaag agaggctgaa gctcatatga aaagatctgc gaagcttgct 300
ggcgcgccaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360
aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420
gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 480
caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgtc gaaagcagac 540
tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 600
acaaagagct tcaacagggg agagtgtgtc gacggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 660
ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attgactcga g 711
<210> 22
<211> 6231
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003.2 - Light chain (Kappa) ss01 Mating Type vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(6231)
<400> 22
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata 120
atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt 180
aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa 240
atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata 300
gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct 360
tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata 420
aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact 480
attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa 540
atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg 600
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 660
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 720
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 780
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 840
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 900
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 960
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 1020
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 1080
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 1140
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 1200
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 1260
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 1320
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 1380
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 1440
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 1500
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 1560
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 1620
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 1680
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 1740
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 1800
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 1860
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 1920
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 1980
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2040
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2100
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 2160
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 2220
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 2280
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 2340
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 2400
cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 2460
gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 2520
ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 2580
aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttacctcact 2640
cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc ctatgttgtg tggaattgtg 2700
agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gcgcgcaatt 2760
aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctctgaagta cggattagaa gccgccgagc 2820
gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 2880
tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 2940
tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 3000
tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 3060
tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 3120
aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 3180
aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 3240
agaaaaaact atatctagaa ctagtatgag atttccttca atttttactg ctgttgtttt 3300
cgcagcatcc tccgcattag ctgctccagc taacactaca gctgaagatg aaacggcaca 3360
aattccggct gaagctgtca tcggttactt aggtttagaa ggggattcag atgttgctgc 3420
tttgccatta tccgatagca caaataacgg gtcattgtca actaatacta ctattgccag 3480
cattgctgct aaagaagaag gggtacaact cgataaaaga gaggctgaag ctcatatgaa 3540
aagatctgcg aagcttgctg gcgcgccaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc 3600
gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt 3660
ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc 3720
ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct 3780
gacgctgtcg aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca 3840
gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgtgtcg acggtaagcc 3900
tatccctaac cctctcctcg gtctcgattc tacgcgtacc ggtcatcatc accatcacca 3960
ttgactcgag tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc 4020
gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt 4080
atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac 4140
agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc 4200
tcgaaggctt taatttgcgg ccggtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattacgcgc 4260
gctcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 4320
atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 4380
atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcgacgcg ccctgtagcg 4440
gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 4500
ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 4560
cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 4620
tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 4680
cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 4740
ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga 4800
tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 4860
aaatattaac gtttacaatt tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 4920
ttcacaccgc atagggtaat aactgatata attaaattga agctctaatt tgtgagttta 4980
gtatacatgc atttacttat aatacagttt tttagttttg ctggccgcat cttctcaaat 5040
atgcttccca gcctgctttt ctgtaacgtt caccctctac cttagcatcc cttccctttg 5100
caaatagtcc tcttccaaca ataataatgt cagatcctgt agagaccaca tcatccacgg 5160
ttctatactg ttgacccaat gcgtctccct tgtcatctaa acccacaccg ggtgtcataa 5220
tcaaccaatc gtaaccttca tctcttccac ccatgtctct ttgagcaata aagccgataa 5280
caaaatcttt gtcgctcttc gcaatgtcaa cagtaccctt agtatattct ccagtagata 5340
gggagccctt gcatgacaat tctgctaaca tcaaaaggcc tctaggttcc tttgttactt 5400
cttctgccgc ctgcttcaaa ccgctaacaa tacctgggcc caccacaccg tgtgcattcg 5460
taatgtctgc ccattctgct attctgtata cacccgcaga gtactgcaat ttgactgtat 5520
taccaatgtc agcaaatttt ctgtcttcga agagtaaaaa attgtacttg gcggataatg 5580
cctttagcgg cttaactgtg ccctccatgg aaaaatcagt caagatatcc acatgtgttt 5640
ttagtaaaca aattttggga cctaatgctt caactaactc cagtaattcc ttggtggtac 5700
gaacatccaa tgaagcacac aagtttgttt gcttttcgtg catgatatta aatagcttgg 5760
cagcaacagg actaggatga gtagcagcac gttccttata tgtagctttc gacatgattt 5820
atcttcgttt cctgcaggtt tttgttctgt gcagttgggt taagaatact gggcaatttc 5880
atgtttcttc aacactacat atgcgtatat ataccaatct aagtctgtgc tccttccttc 5940
gttcttcctt ctgttcggag attaccgaat caaaaaaatt tcaaagaaac cgaaatcaaa 6000
aaaaagaata aaaaaaaaat gatgaattga attgaaaagc tgtggtatgg tgcactctca 6060
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 6120
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 6180
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg a 6231
<210> 23
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003.3 - Light chain (Kappa) ss03 Mating Type insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(711)
<400> 23
actagtatga gatttccttc aatttttact gctgttttat tcgcagcatc ctccgcatta 60
gctgctccag ctaacactac aacagaagat gaaacggcac aaattccggc tgaagctgtc 120
atcgattact cagatttaga aggggatttc gatgctgctg ctttgccatt atccaacagc 180
acaaataacg ggttatcatc aactaatact actattgcca gcattgctgc taaagaagaa 240
ggggtacaac tcgataaaag agaggctgaa gctcatatga aaagatctgc gaagcttgct 300
ggcgcgccaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360
aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420
gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 480
caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgtc gaaagcagac 540
tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 600
acaaagagct tcaacagggg agagtgtgtc gacggtaagc ctatccctaa ccctctcctc 660
ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat caccatcacc attgactcga g 711
<210> 24
<211> 6231
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003.3 - Light chain (Kappa) ss03 Mating Type vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(6231)
<400> 24
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata 120
atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt 180
aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa 240
atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata 300
gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct 360
tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata 420
aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact 480
attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa 540
atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg 600
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 660
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 720
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 780
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 840
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 900
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 960
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 1020
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 1080
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 1140
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 1200
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 1260
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 1320
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 1380
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 1440
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 1500
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 1560
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 1620
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 1680
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 1740
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 1800
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 1860
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 1920
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 1980
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2040
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2100
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 2160
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 2220
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 2280
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 2340
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 2400
cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 2460
gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 2520
ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 2580
aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttacctcact 2640
cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc ctatgttgtg tggaattgtg 2700
agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gcgcgcaatt 2760
aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctctgaagta cggattagaa gccgccgagc 2820
gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 2880
tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 2940
tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 3000
tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 3060
tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 3120
aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 3180
aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 3240
agaaaaaact atatctagaa ctagtatgag atttccttca atttttactg ctgttttatt 3300
cgcagcatcc tccgcattag ctgctccagc taacactaca acagaagatg aaacggcaca 3360
aattccggct gaagctgtca tcgattactc agatttagaa ggggatttcg atgctgctgc 3420
tttgccatta tccaacagca caaataacgg gttatcatca actaatacta ctattgccag 3480
cattgctgct aaagaagaag gggtacaact cgataaaaga gaggctgaag ctcatatgaa 3540
aagatctgcg aagcttgctg gcgcgccaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc 3600
gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt 3660
ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc 3720
ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct 3780
gacgctgtcg aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca 3840
gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgtgtcg acggtaagcc 3900
tatccctaac cctctcctcg gtctcgattc tacgcgtacc ggtcatcatc accatcacca 3960
ttgactcgag tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc 4020
gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt 4080
atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac 4140
agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc 4200
tcgaaggctt taatttgcgg ccggtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattacgcgc 4260
gctcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 4320
atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 4380
atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcgacgcg ccctgtagcg 4440
gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 4500
ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 4560
cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 4620
tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 4680
cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 4740
ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga 4800
tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 4860
aaatattaac gtttacaatt tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 4920
ttcacaccgc atagggtaat aactgatata attaaattga agctctaatt tgtgagttta 4980
gtatacatgc atttacttat aatacagttt tttagttttg ctggccgcat cttctcaaat 5040
atgcttccca gcctgctttt ctgtaacgtt caccctctac cttagcatcc cttccctttg 5100
caaatagtcc tcttccaaca ataataatgt cagatcctgt agagaccaca tcatccacgg 5160
ttctatactg ttgacccaat gcgtctccct tgtcatctaa acccacaccg ggtgtcataa 5220
tcaaccaatc gtaaccttca tctcttccac ccatgtctct ttgagcaata aagccgataa 5280
caaaatcttt gtcgctcttc gcaatgtcaa cagtaccctt agtatattct ccagtagata 5340
gggagccctt gcatgacaat tctgctaaca tcaaaaggcc tctaggttcc tttgttactt 5400
cttctgccgc ctgcttcaaa ccgctaacaa tacctgggcc caccacaccg tgtgcattcg 5460
taatgtctgc ccattctgct attctgtata cacccgcaga gtactgcaat ttgactgtat 5520
taccaatgtc agcaaatttt ctgtcttcga agagtaaaaa attgtacttg gcggataatg 5580
cctttagcgg cttaactgtg ccctccatgg aaaaatcagt caagatatcc acatgtgttt 5640
ttagtaaaca aattttggga cctaatgctt caactaactc cagtaattcc ttggtggtac 5700
gaacatccaa tgaagcacac aagtttgttt gcttttcgtg catgatatta aatagcttgg 5760
cagcaacagg actaggatga gtagcagcac gttccttata tgtagctttc gacatgattt 5820
atcttcgttt cctgcaggtt tttgttctgt gcagttgggt taagaatact gggcaatttc 5880
atgtttcttc aacactacat atgcgtatat ataccaatct aagtctgtgc tccttccttc 5940
gttcttcctt ctgttcggag attaccgaat caaaaaaatt tcaaagaaac cgaaatcaaa 6000
aaaaagaata aaaaaaaaat gatgaattga attgaaaagc tgtggtatgg tgcactctca 6060
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 6120
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 6180
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg a 6231
<210> 25
<211> 501
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003.4 - Light chain (Kappa) ss04 Mating Type insert
<220>
<221> gene
<222> (1)..(501)
<400> 25
actagtatgc ttttgcaagc attccttttc cttttggctg gttttgcagc caaaatatct 60
gcacatatga aaagatctgc gaagcttgct ggcgcgccaa ctgtggctgc accatctgtc 120
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 180
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 240
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 300
agcagcaccc tgacgctgtc gaaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 360
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtgtc 420
gacggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat 480
caccatcacc attgactcga g 501
<210> 26
<211> 6021
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pZB003.4 - Light chain (Kappa) ss04 Mating Type vector construct
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(6021)
<400> 26
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata 120
atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt 180
aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa 240
atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata 300
gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct 360
tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata 420
aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact 480
attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa 540
atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg 600
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 660
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 720
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 780
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 840
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 900
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 960
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 1020
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 1080
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 1140
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 1200
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 1260
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 1320
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 1380
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 1440
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 1500
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 1560
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 1620
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 1680
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 1740
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 1800
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 1860
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 1920
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 1980
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2040
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2100
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 2160
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 2220
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 2280
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 2340
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 2400
cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 2460
gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 2520
ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 2580
aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttacctcact 2640
cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc ctatgttgtg tggaattgtg 2700
agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gcgcgcaatt 2760
aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctctgaagta cggattagaa gccgccgagc 2820
gggtgacagc cctccgaagg aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt 2880
tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac 2940
tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa 3000
tgaacgaatc aaattaacaa ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc 3060
tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa 3120
aactgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc 3180
aaatgtaata aaagtatcaa caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg 3240
agaaaaaact atatctagaa ctagtatgct tttgcaagca ttccttttcc ttttggctgg 3300
ttttgcagcc aaaatatctg cacatatgaa aagatctgcg aagcttgctg gcgcgccaac 3360
tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac 3420
tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa 3480
ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa 3540
ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgtcg aaagcagact acgagaaaca 3600
caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt 3660
caacagggga gagtgtgtcg acggtaagcc tatccctaac cctctcctcg gtctcgattc 3720
tacgcgtacc ggtcatcatc accatcacca ttgactcgag tcatgtaatt agttatgtca 3780
cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa 3840
cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag aacgttattt 3900
atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg 3960
aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcgg ccggtaccca 4020
attcgcccta tagtgagtcg tattacgcgc gctcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 4080
actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 4140
gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 4200
atggcgaatg gcgcgacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 4260
cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc 4320
cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 4380
tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg 4440
gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 4500
cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct 4560
attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga 4620
tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt tcctgatgcg 4680
gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atagggtaat aactgatata 4740
attaaattga agctctaatt tgtgagttta gtatacatgc atttacttat aatacagttt 4800
tttagttttg ctggccgcat cttctcaaat atgcttccca gcctgctttt ctgtaacgtt 4860
caccctctac cttagcatcc cttccctttg caaatagtcc tcttccaaca ataataatgt 4920
cagatcctgt agagaccaca tcatccacgg ttctatactg ttgacccaat gcgtctccct 4980
tgtcatctaa acccacaccg ggtgtcataa tcaaccaatc gtaaccttca tctcttccac 5040
ccatgtctct ttgagcaata aagccgataa caaaatcttt gtcgctcttc gcaatgtcaa 5100
cagtaccctt agtatattct ccagtagata gggagccctt gcatgacaat tctgctaaca 5160
tcaaaaggcc tctaggttcc tttgttactt cttctgccgc ctgcttcaaa ccgctaacaa 5220
tacctgggcc caccacaccg tgtgcattcg taatgtctgc ccattctgct attctgtata 5280
cacccgcaga gtactgcaat ttgactgtat taccaatgtc agcaaatttt ctgtcttcga 5340
agagtaaaaa attgtacttg gcggataatg cctttagcgg cttaactgtg ccctccatgg 5400
aaaaatcagt caagatatcc acatgtgttt ttagtaaaca aattttggga cctaatgctt 5460
caactaactc cagtaattcc ttggtggtac gaacatccaa tgaagcacac aagtttgttt 5520
gcttttcgtg catgatatta aatagcttgg cagcaacagg actaggatga gtagcagcac 5580
gttccttata tgtagctttc gacatgattt atcttcgttt cctgcaggtt tttgttctgt 5640
gcagttgggt taagaatact gggcaatttc atgtttcttc aacactacat atgcgtatat 5700
ataccaatct aagtctgtgc tccttccttc gttcttcctt ctgttcggag attaccgaat 5760
caaaaaaatt tcaaagaaac cgaaatcaaa aaaaagaata aaaaaaaaat gatgaattga 5820
attgaaaagc tgtggtatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa 5880
gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg 5940
catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac 6000
cgtcatcacc gaaacgcgcg a 6021
<210> 27
<211> 309
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH1 - Modified CH1 domain
<220>
<221> gene
<222> (1)..(309)
<400> 27
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgcgctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcatca 180
ggactctact ccctcagcag cgtagtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgt 309
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ck - Modified Ck domain
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(321)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(321)
<400> 28
ggaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgtcgaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 29
<211> 332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CL - Modified CL domain
<220>
<221> gene
<222> (1)..(332)
<400> 29
gtcagcccaa ggccaacccc actgtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagctccaag 60
ccaacaaggc caccctagtg tgtctgatca gtgacttcta cccgggagct gtgacagtgg 120
cctggaaggc agatggcagc cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaaa ccctccaaac 180
agagcaacaa caagtacgcg gccagcagct acctgagcct gacgcccgag cagtggaagt 240
cccacagaag ctacagctgc caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300
cccctacaga atgttcaacg cgtgttacag tc 332
<210> 30
<211> 3960
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pADL23c - Phagemid vector backbone
<220>
<221> old_sequence
<222> (1)..(3960)
<400> 30
gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 60
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 120
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 180
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 240
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 300
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 360
tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 420
acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 480
aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 540
cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 600
gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 660
cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 720
tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 780
tgcgctcggc gcttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 840
ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 900
tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 960
gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1020
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1080
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1140
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1200
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1260
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1320
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1380
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1440
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1500
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1560
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1620
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1680
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1740
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1800
acatgcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 1860
ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 1920
agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 1980
gaattgtgag cggataacaa tttgaattca aggagacagt cataatgaaa tacctattgc 2040
ctacggcggc cgctggattg ttattactcg cggcccagcc ggcctaacta gtggcccggg 2100
aggccaacac catcaccacc atcatggcgc agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct 2160
gtcttaggcc gaaactgttg aaagttgttt agcaaaacct catacagaaa attcatttac 2220
taacgtctgg aaagacgaca aaactttaga tcgttacgct aactatgagg gctgtctgtg 2280
gaatgctaca ggcgttgtgg tttgtactgg tgacgaaact cagtgttacg gtacatgggt 2340
tcctattggg cttgctatcc ctgaaaatga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga 2400
gggtggcggt tctgagggtg gcggtactaa acctcctgag tacggtgata cacctattcc 2460
gggctatact tatatcaacc ctctcgacgg cacttatccg cctggtactg agcaaaaccc 2520
cgctaatcct aatccttctc ttgaggagtc tcagcctctt aatactttca tgtttcagaa 2580
taataggttc cgaaataggc agggtgcatt aactgtttat acgggcactg ttactcaagg 2640
cactgacccc gttaaaactt attaccagta cactcctgta tcatcaaaag ccatgtatga 2700
cgcttactgg aacggtaaat tcagagactg cgctttccat tctggcttta atgaggatcc 2760
attcgtttgt gaatatcaag gccaatcgtc tgacctgcct caacctcctg tcaatgctgg 2820
cggcggctct ggtggtggtt ctggtggcgg ctctgagggt ggcggctctg agggtggcgg 2880
ttctgagggt ggcggctctg agggtggcgg ttccggtggc ggctccggtt ccggtgattt 2940
tgattatgaa aaaatggcaa acgctaataa gggggctatg accgaaaatg ccgatgaaaa 3000
cgcgctacag tctgacgcta aaggcaaact tgattctgtc gctactgatt acggtgctgc 3060
tatcgatggt ttcattggtg acgtttccgg ccttgctaat ggtaatggtg ctactggtga 3120
ttttgctggc tctaattccc aaatggctca agtcggtgac ggtgataatt cacctttaat 3180
gaataatttc cgtcaatatt taccttcttt gcctcagtcg gttgaatgtc gcccttatgt 3240
ctttggcgct ggtaaaccat atgaattttc tattgattgt gacaaaataa acttattccg 3300
tggtgtcttt gcgtttcttt tatatgttgc cacctttatg tatgtatttt cgacgtttgc 3360
taacatactg cgtaataagg agtcttaagc tagctaacag tcctatgaat caactactta 3420
gatggtatta gtgacctgta acagagcatt agcgcaaggt gatttttgtc ttcttgcgct 3480
aattttttgt catcaaacct gtcgcactcc ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt 3540
tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat 3600
caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat 3660
taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac 3720
tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc 3780
ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga 3840
gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca 3900
cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcaggtg 3960
<210> 31
<211> 4783
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pRS314 - Yeast Bicistronic bidirectional, Uni directional and
ScFv vector backbone
<220>
<221> old_sequence
<222> (1)..(4783)
<400> 31
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgcctg cggtgtgaaa 1200
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 1260
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1320
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1380
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1440
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 1500
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 1560
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 1620
gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 1680
gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1740
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaagggg ggatgtgctg caaggcgatt 1800
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1860
gtaatacgac tcactatagg gcgaattgga gctccaccgc ggtggcggcc gctctagaac 1920
tagtggatcc cccgggctgc aggaattcga tatcaagctt atcgataccg tcgacctcga 1980
gggggggccc ggtacccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattccg agcttggcgt 2040
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 2100
taggagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagg taactcacat 2160
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 2220
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 2280
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2340
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2400
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2460
tcggcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2520
caggactata aagataccag gcgttccccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2580
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2640
ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2700
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2760
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 2820
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 2880
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 2940
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 3000
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 3060
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 3120
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 3180
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 3240
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact gcccgtcgtg tagataacta 3300
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 3360
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 3420
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 3480
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 3540
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 3600
catgatcccc catgttgtga aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 3660
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 3720
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 3780
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 3840
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 3900
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 3960
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 4020
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 4080
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 4140
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 4200
ggtccttttc atcacgtgct ataaaaataa ttataattta aattttttaa tataaatata 4260
taaattaaaa atagaaagta aaaaaagaaa ttaaagaaaa aatagttttt gttttccgaa 4320
gatgtaaaag actctagggg gatcgccaac aaatactacc ttttatcttg ctcttcctgc 4380
tctcaggtat taatgccgaa ttgtttcatc ttgtctgtgt agaagaccac acacgaaaat 4440
cctgtgattt tacattttac ttatcgttaa tcgaatgtat atctatttaa tctgcttttc 4500
ttgtctaata aatatatatg taaagtacgc tttttgttga aattttttaa acctttgttt 4560
attttttttt cttcattccg taactcttct accttcttta tttactttct aaaatccaaa 4620
tacaaaacat aaaaataaat aaacacagag taaattccca aattattcca tcattaaaag 4680
atacgaggcg cgtgtaagtt acaggcaagc gatccgtcct aagaaaccat tattatcatg 4740
acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtc 4783
<210> 32
<211> 5473
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p414Gal1 - Vector backbone for Mating Type Heavy Chain
<220>
<221> old_sequence
<222> (1)..(5473)
<400> 32
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgccta tgcggtgtga 1200
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt 1260
ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 1320
atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 1380
gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 1440
gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 1500
aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 1560
ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 1620
gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 1680
ccgctacagg gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1740
tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 1800
ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag 1860
cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg gccgcaaatt aaagccttcg 1920
agcgtcccaa aaccttctca agcaaggttt tcagtataat gttacatgcg tacacgcgtc 1980
tgtacagaaa aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt tcttaatact aacataacta 2040
taaaaaaata aatagggacc tagacttcag gttgtctaac tccttccttt tcggttagag 2100
cggatgtggg gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac taattacatg actcgaggtc 2160
gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc ctgcagcccg ggggatccac tagttctaga 2220
tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 2280
ttttattaca tttgaataag aagtaataca aaccgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 2340
tggttatgca gtttttgcat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 2400
attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccta tggttgttaa 2460
tttgattcgt tcatttgaag gtttgtgggg ccaggttact gccaattttt cctcttcata 2520
accataaaag ctagtattgt agaatcttta ttgttcggag cagtgcggcg cgaggcacat 2580
ctgcgtttca ggaacgcgac cggtgaagac gaggacgcac ggaggagagt cttccttcgg 2640
agggctgtca cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca gagctccagc ttttgttccc 2700
tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 2760
attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca taggagccgg aagcataaag tgtaaagcct 2820
ggggtgccta atgagtgagg taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 2880
agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 2940
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 3000
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 3060
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 3120
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 3180
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 3240
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 3300
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 3360
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 3420
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 3480
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 3540
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 3600
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 3660
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 3720
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 3780
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 3840
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 3900
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 3960
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 4020
gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 4080
agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 4140
ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 4200
ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 4260
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 4320
ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 4380
tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 4440
tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 4500
cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 4560
tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 4620
gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 4680
tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 4740
ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 4800
attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 4860
cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg ggtccttttc atcacgtgct ataaaaataa 4920
ttataattta aattttttaa tataaatata taaattaaaa atagaaagta aaaaaagaaa 4980
ttaaagaaaa aatagttttt gttttccgaa gatgtaaaag actctagggg gatcgccaac 5040
aaatactacc ttttatcttg ctcttcctgc tctcaggtat taatgccgaa ttgtttcatc 5100
ttgtctgtgt agaagaccac acacgaaaat cctgtgattt tacattttac ttatcgttaa 5160
tcgaatgtat atctatttaa tctgcttttc ttgtctaata aatatatatg taaagtacgc 5220
tttttgttga aattttttaa acctttgttt attttttttt cttcattccg taactcttct 5280
accttcttta tttactttct aaaatccaaa tacaaaacat aaaaataaat aaacacagag 5340
taaattccca aattattcca tcattaaaag atacgaggcg cgtgtaagtt acaggcaagc 5400
gatccgtcct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 5460
aggccctttc gtc 5473
<210> 33
<211> 5583
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p416Gal1 - Vector backbone for Mating Type Light Chain
<220>
<221> old_sequence
<222> (1)..(5583)
<400> 33
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataccac agcttttcaa ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc 240
ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg 300
agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca tgaaattgcc 360
cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatcatgt 420
cgaaagctac atataaggaa cgtgctgcta ctcatcctag tcctgttgct gccaagctat 480
ttaatatcat gcacgaaaag caaacaaact tgtgtgcttc attggatgtt cgtaccacca 540
aggaattact ggagttagtt gaagcattag gtcccaaaat ttgtttacta aaaacacatg 600
tggatatctt gactgatttt tccatggagg gcacagttaa gccgctaaag gcattatccg 660
ccaagtacaa ttttttactc ttcgaagaca gaaaatttgc tgacattggt aatacagtca 720
aattgcagta ctctgcgggt gtatacagaa tagcagaatg ggcagacatt acgaatgcac 780
acggtgtggt gggcccaggt attgttagcg gtttgaagca ggcggcagaa gaagtaacaa 840
aggaacctag aggccttttg atgttagcag aattgtcatg caagggctcc ctatctactg 900
gagaatatac taagggtact gttgacattg cgaagagcga caaagatttt gttatcggct 960
ttattgctca aagagacatg ggtggaagag atgaaggtta cgattggttg attatgacac 1020
ccggtgtggg tttagatgac aagggagacg cattgggtca acagtataga accgtggatg 1080
atgtggtctc tacaggatct gacattatta ttgttggaag aggactattt gcaaagggaa 1140
gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca gaaaagcagg ctgggaagca tatttgagaa 1200
gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat tataagtaaa tgcatgtata ctaaactcac 1260
aaattagagc ttcaatttaa ttatatcagt tattacccta tgcggtgtga aataccgcac 1320
agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat 1380
tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa 1440
tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca 1500
agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg 1560
gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta 1620
aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg 1680
cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa 1740
gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg 1800
gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg 1860
cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg 1920
taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat 1980
acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg gccgcaaatt aaagccttcg agcgtcccaa 2040
aaccttctca agcaaggttt tcagtataat gttacatgcg tacacgcgtc tgtacagaaa 2100
aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt tcttaatact aacataacta taaaaaaata 2160
aatagggacc tagacttcag gttgtctaac tccttccttt tcggttagag cggatgtggg 2220
gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac taattacatg actcgaggtc gacggtatcg 2280
ataagcttga tatcgaattc ctgcagcccg ggggatccac tagttctaga tatagttttt 2340
tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac ttttattaca 2400
tttgaataag aagtaataca aaccgaaaat gttgaaagta ttagttaaag tggttatgca 2460
gtttttgcat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg attaattacc 2520
ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccta tggttgttaa tttgattcgt 2580
tcatttgaag gtttgtgggg ccaggttact gccaattttt cctcttcata accataaaag 2640
ctagtattgt agaatcttta ttgttcggag cagtgcggcg cgaggcacat ctgcgtttca 2700
ggaacgcgac cggtgaagac gaggacgcac ggaggagagt cttccttcgg agggctgtca 2760
cccgctcggc ggcttctaat ccgtacttca gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg 2820
gttaattgcg cgcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 2880
gctcacaatt ccacacaaca taggagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 2940
atgagtgagg taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3000
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3060
tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 3120
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 3180
aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 3240
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 3300
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 3360
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 3420
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 3480
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 3540
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 3600
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 3660
gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 3720
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 3780
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 3840
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 3900
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 3960
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 4020
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 4080
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 4140
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 4200
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 4260
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 4320
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 4380
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 4440
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 4500
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 4560
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 4620
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 4680
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 4740
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 4800
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 4860
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 4920
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 4980
tccccgaaaa gtgccacctg ggtccttttc atcacgtgct ataaaaataa ttataattta 5040
aattttttaa tataaatata taaattaaaa atagaaagta aaaaaagaaa ttaaagaaaa 5100
aatagttttt gttttccgaa gatgtaaaag actctagggg gatcgccaac aaatactacc 5160
ttttatcttg ctcttcctgc tctcaggtat taatgccgaa ttgtttcatc ttgtctgtgt 5220
agaagaccac acacgaaaat cctgtgattt tacattttac ttatcgttaa tcgaatgtat 5280
atctatttaa tctgcttttc ttgtctaata aatatatatg taaagtacgc tttttgttga 5340
aattttttaa acctttgttt attttttttt cttcattccg taactcttct accttcttta 5400
tttactttct aaaatccaaa tacaaaacat aaaaataaat aaacacagag taaattccca 5460
aattattcca tcattaaaag atacgaggcg cgtgtaagtt acaggcaagc gatccgtcct 5520
aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc 5580
gtc 5583
Claims (21)
- 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 파지미드 또는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 효모 벡터로부터 항체 또는 그의 단편을 수용하도록 설계되거나, 또는 적어도 하나의 클로닝 영역을 포함하는 효모 벡터로 항체 또는 그의 단편을 전달하도록 설계된 벡터 컨스트럭트로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
적어도 하나의 선도 서열 (leader sequence);
생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하기 위한 적어도 하나의 클로닝 영역;
불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로불린 경쇄, 또는 그의 단편, 또는 불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 그의 단편과 불변 영역 면역 글로불린 경쇄 또는 그의 단편의 조합을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열; 및
적어도 하나의 재조합 태그 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고;
여기서, 상기 발현 카세트의 적어도 하나의 클로닝 영역은 다중 클로닝 부위 1 (MCS I) 및 다중 클로닝 부위 2 (MCS II), 다중 클로닝 부위 1 (MCS I) 단독, 또는 다중 클로닝 부위 2 (MCS II) 단독을 포함하고, 여기서 상기 MCS I은 제한 부위 조합 NdeI 및 BglII 및 HindIII 및 AscI를 포함하고, 상기 MCS II는 제한 부위 조합 NcoI 및 XbaI 및 NheI 및 NotI를 포함하는 것인 벡터 컨스트럭트. - 제1항에 있어서, 발현 카세트의 적어도 하나의 클로닝 영역, 파지미드의 적어도 하나의 클로닝 영역 및 효모 벡터의 적어도 하나의 클로닝 영역은 다중 클로닝 부위 1 (MCS I) 및 다중 클로닝 부위 2 (MCS II), 다중 클로닝 부위 1 (MCS I) 단독, 또는 다중 클로닝 부위 2 (MCS II) 단독을 포함하고, 여기서 상기 MCS I은 제한 부위 조합 NdeI 및 BglII 및 HindIII 및 AscI를 포함하고, 상기 MCS II는 제한 부위 조합 NcoI 및 XbaI 및 NheI 및 NotI를 포함하는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, 발현 카세트는:
단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 효소 절단 부위를 상류에 포함하거나 포함하지 않는 적어도 하나의 터미네이터 서열;
또는,
적어도 하나의 리보솜 결합 부위를 상류에 포함하는 파지 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
을 포함하는 것인 벡터 컨스트럭트. - 제1항 또는 제3항에 있어서, 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터 서열을 함유하고, 오퍼레이터 서열을 함유하거나 함유하지 않으며; 벡터 컨스트럭트는 박테리아 세포 또는 효모 세포에서 항체 또는 그의 단편을 발현할 수 있고; 프로모터 서열은 Gal1, Gal1/10 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 선도 서열은 pelB 서열, 알파 선도 서열, Aga2P 선도 서열, 알파 접합 인자 1 분비 신호 서열 (SS01), 알파 인자 (aapS4) 신호 서열 (SS02), 알파 인자 (aap8) 신호 서열 (SS03), 알파 인자 (aap8), 신호 서열 (SS04) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 재조합 태그 서열은 FLAG, c-Myc, V5, His 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 터미네이터 서열은 알파 터미네이터, CYC1 터미네이터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 효소 절단 부위는 TEV 프로테아제 절단 부위이며; 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Aga2P 단백질이고; 및 파지 외피 단백질은 pIII 단백질, G8P 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항에 있어서, 벡터 컨스트럭트는 효모 바이시스트론(bicistronic) 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터 및 파지미드로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 발현 카세트는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터 컨스트럭트:
(a) 순차적으로,
프로모터 서열;
선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 제한 부위 NcoI 및 XbaI 및 NheI 및 NotI를 포함하는 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 불변 도메인은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 터미네이터 서열,
(b) 순차적으로,
프로모터 서열;
선도 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 제한 부위 NdeI 및 BglII 및 HindIII 및 AscI를 포함하는 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열; 및
터미네이터 서열,
(c) 순차적으로,
제1 터미네이터 서열;
재조합 태그 서열의 제1 세트;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 제한 부위 NdeI 및 BglII 및 HindIII 및 AscI를 포함하는 제1 클로닝 영역;
제1 선도 서열,
프로모터 서열;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 제한 부위 NcoI 및 XbaI 및 NheI 및 NotI를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열의 제2 세트; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 제2 터미네이터 서열,
(d) 순차적으로,
제1 프로모터 서열;
제1 선도 서열,
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 제한 부위 NdeI 및 BglII 및 HindIII 및 AscI를 포함하는 제1 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열의 제1 세트;
제1 터미네이터 서열;
제2 프로모터 서열;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 제한 부위 NcoI 및 XbaI 및 NheI 및 NotI를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열의 제2 세트; 및
링커 서열을 통해 Aga2P 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합된 프로테아제 절단 부위를 상류에 포함하는 제2 터미네이터 서열,
및
(e) 순차적으로,
프로모터 서열;
오퍼레이터 서열;
제1 리보솜 결합 부위;
제1 선도 서열;
면역 글로불린 경쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 제한 부위 NdeI 및 BglII 및 HindIII 및 AscI를 포함하는 제1 클로닝 영역;
면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 경쇄 불변 도메인 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열;
제2 리보솜 결합 부위;
제2 선도 서열;
면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 유전자를 수용할 수 있고 제한 부위 NcoI 및 XbaI 및 NheI 및 NotI를 포함하는 제2 클로닝 영역;
IgG1 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 불변 영역은 천연 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 관한 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 제2 뉴클레오티드 서열;
재조합 태그 서열(들); 및
파지 외피 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열. - 제1항에 기재된 벡터 컨스트럭트로부터 항체 또는 그의 단편을 클로닝하도록 설계되거나, 또는 항체 또는 그의 단편을 전달 또는 수용하도록 설계된 벡터 컨스트럭트로서, 상기 벡터 컨스트럭트는:
프로모터 서열;
선도 서열;
단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
제1 효소 절단 부위;
제1 재조합 태그 서열;
제1 링커 서열;
제2 효소 절단 부위;
제2 링커 서열의 존재하에 제2 클로닝 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 클로닝 영역으로서, 상기 클로닝 영역은 생물학적 활성 리간드에 선택적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 수용하는 것인 클로닝 영역;
제2 재조합 태그 서열(들);
및
터미네이터 서열
을 포함하는 발현 카세트를 함유하고,
여기서, 발현 카세트의 제1 클로닝 영역 또는 제2 클로닝 영역은 다중 클로닝 부위 1 (MCS I) 및 다중 클로닝 부위 2 (MCS II)를 포함하고, 여기서 상기 MCS I은 제한 부위 조합 NdeI 및 BglII 및 HindIII 및 AscI를 포함하고, 상기 MCS II는 제한 부위 조합 NcoI 및 XbaI 및 NheI 및 NotI를 포함하는 것인 벡터 컨스트럭트. - 제6항에 있어서, 상기 벡터 컨스트럭트는 scFv 벡터이고 효모 세포에서 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 그의 단편을 발현할 수 있는 것인 벡터 컨스트럭트이며; 여기서 프로모터 서열은 Gal 1이며; 단백질 발현 시스템의 표면에 펩티드 또는 단백질의 디스플레이를 가능하게 하는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Aga2P 단백질이고; 효소 절단 부위는 인자 Xa 절단 부위, TEV 프로테아제 절단 부위 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 절단 부위이며; 재조합 태그 서열은 HA 태그, c-Myc 태그, FLAG 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 링커 서열은 G4S 서열이며; 제1 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로블린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제2 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 그의 단편이며; 및 터미네이터 서열은 알파 터미네이터, CYC1 터미네이터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항 또는 제6항에 있어서, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24 및 SEQ ID No. 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항 또는 제6항에 있어서, 벡터 컨스트럭트는 복제 기점 (Ori), 항생제 저항성 마커, f1 복제 기점, 프로모터 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역 및 이들의 조합을 더 포함하고; 원핵 생물 발현 시스템, 효모 발현 시스템 또는 이들의 조합에서 항체 또는 그의 단편을 발현 또는 디스플레이할 수 있는 것인 벡터 컨스트럭트.
- 제1항 또는 제7항에 있어서,
적어도 하나의 돌연변이를 갖는 불변 영역 면역 글로불린 중쇄 또는 불변 영역 면역 글로블린 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 면역 글로불린 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 카파 불변 영역 (Ck) 또는 그의 단편, 및 면역 글로불린 경쇄의 람다 불변 영역 (CL) 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 클로닝 영역의 유전자는 면역 글로블린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 및 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 (VH) 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 및
CH1 영역은 SEQ ID No. 27의 핵산 서열을 가지고, Ck 영역은 SEQ ID No. 28의 핵산 서열을 가지며, CL 영역은 SEQ ID No. 29의 핵산 서열을 가지고; Vk, VL 및 VH 서열은 나이브 항체 레퍼토리, 합성 항체 레퍼토리 또는 이들의 조합으로부터 유래된 것인 벡터 컨스트럭트. - 제1항 또는 제6항에 기재된 벡터 컨스트럭트의 제조 방법으로서, 다음 단계들:
a) 제1항 또는 제6항에서 정의된 발현 카세트를 합성하는 단계;
b) 목적 벡터를 선형화하는 단계로서, 여기서 목적 벡터는 pADL23c, pRS314, p414Gal1, p416Gal1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선형화는 제한 효소(들)로의 분해에 의해 수행되는 것인 단계; 및
c) 상동성 재조합, 제한 효소 분해 후 결찰 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기술에 의해 발현 카세트를 선형화된 목적 벡터에 삽입하여 벡터 컨스트럭트를 수득하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제11항에 있어서, 상기 방법은 시퀀싱 기술에 의해 오류가 없는 벡터 클론을 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 벡터 컨스트럭트 라이브러리의 제조 방법으로서, 다음 단계들:
a) 제11항에 기재된 방법에 의해 벡터 컨스트럭트를 제조하는 단계;
b) 면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역에 클로닝하여 라이브러리를 수득하는 단계,
또는
면역 글로불린 경쇄의 카파 가변 영역 (Vk), 면역 글로불린 경쇄의 람다 가변 영역 (VL) 또는 그의 단편, 면역 글로불린 중쇄의 가변 영역 또는 그의 단편 (VH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 하나의 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로부터 또 다른 벡터 컨스트럭트의 클로닝 영역으로 전달하여 라이브러리를 수득하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제13항에 있어서, 벡터 컨스트럭트는 파지미드, 효모 접합형 중쇄 발현 벡터, 효모 접합형 경쇄 발현 벡터, 효모 바이시스트론 양방향 벡터, 효모 바이시스트론 일방향 벡터 및 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되고; Vk, VL 및 VH 영역은 나이브 항체, 합성 항체 또는 이들의 조합으로부터 유래되며; 벡터 컨스트럭트 라이브러리는 합성 라이브러리, 나이브 라이브러리 또는 이들의 조합이고; 및 뉴클레오티드 서열의 전달은 파지미드 벡터 컨스트럭트와 효모 벡터 컨스트럭트 간 또는 효모 벡터 컨스트럭트들 간에서 수행되는 것인 방법.
- 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 스크리닝 및 동정하는 방법으로서, 다음 단계들: (a) 제13항에 기재된 방법에 의해 벡터 컨스트럭트 라이브러리를 제조하고, 상기 벡터 컨스트럭트를 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포 또는 이들의 조합으로 형질 전환시키는 단계; 및 (b) 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 발현하는 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 스크리닝 및 동정은 박테리아 숙주 세포에서의 파지 디스플레이, 효모 숙주 세포에서의 효모 디스플레이 또는 순차적으로 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 수행되고; 여기서 목적하는 기능적 특성(들)은 친화성, 특이성, 항원성, 새로운 에피토프의 생성, 내열성, 가용성, 응집성 및 촉매 활성 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 스크리닝 및 동정은 순차적인 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 수행되고, 다음 단계들:
(i) 파지미드 컨스트럭트 라이브러리를 박테리아 숙주 세포로 형질 전환시켜 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계;
(ii) 항원(들)에 대해 디스플레이된 항체 또는 그의 단편을 스크리닝하여 선택된 클론을 포함하는 패닝된 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계;
(iii) 선택된 클론으로부터 효모 벡터로 항체 또는 그의 단편을 전달한 후 상기 항체 또는 그의 단편의 발현 및 디스플레이를 위하여 효모 숙주 세포로 형질 전환시키는 단계;
(iv) 항원(들)에 대해 효모 디스플레이된 항체 또는 그의 단편을 스크리닝하여 목적하는 기능적 특성(들)을 갖는 항체 또는 그의 단편을 동정하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제15항에 있어서, 항체 또는 그의 단편은 파지 또는 효모 벡터로 클로닝하기 위한 Fab 또는 Scfv 포맷이고; 파지 벡터로의 형질 전환 효율은 109 내지 1011의 범위이며; 및 효모 벡터로의 전달 또는 형질 전환 효율은 106 내지 108의 범위인 것인 방법.
- 제1항 또는 제6항에 기재된 벡터 컨스트럭트(들)을 포함하는 숙주 세포로서,
상기 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포 또는 효모 숙주 세포인, 숙주 세포. - 제1항 또는 제6항에 기재된 벡터 컨스트럭트(들)을 포함하는 라이브러리로서,
상기 라이브러리는 파지 라이브러리 또는 효모 라이브러리인, 라이브러리. - 제1항 또는 제6항에 기재된 벡터 컨스트럭트(들)에 의해 제공되는 발현 카세트로서, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23 및 SEQ ID No. 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는 것인 발현 카세트.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN201641012164 | 2016-04-06 | ||
| IN201641012164 | 2016-04-06 | ||
| PCT/IB2017/051990 WO2017175176A1 (en) | 2016-04-06 | 2017-04-06 | Vectors for cloning and expression of proteins, methods and applications thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190015700A KR20190015700A (ko) | 2019-02-14 |
| KR102165777B1 true KR102165777B1 (ko) | 2020-10-14 |
Family
ID=58699192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020187031366A KR102165777B1 (ko) | 2016-04-06 | 2017-04-06 | 단백질의 클로닝 및 발현을 위한 벡터, 그 방법 및 적용 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11549119B2 (ko) |
| EP (1) | EP3440208B1 (ko) |
| JP (1) | JP6987076B2 (ko) |
| KR (1) | KR102165777B1 (ko) |
| CA (1) | CA3018936C (ko) |
| DK (1) | DK3440208T3 (ko) |
| ES (1) | ES2837482T3 (ko) |
| PT (1) | PT3440208T (ko) |
| WO (1) | WO2017175176A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210035753A (ko) * | 2019-09-24 | 2021-04-01 | 성균관대학교산학협력단 | 항-바이러스 활성이 향상된 나노천공자 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3584258A1 (en) | 2018-06-19 | 2019-12-25 | IEO - Istituto Europeo di Oncologia Srl | Antibodies anti tumor associated antigens and method for obtaining them |
| CN112646833A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-04-13 | 杭州阿诺生物医药科技有限公司 | 一种全人源抗体酵母展示技术的设计与构建 |
| CN115109794A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-27 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种噬菌粒载体及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| US5667988A (en) * | 1992-01-27 | 1997-09-16 | The Scripps Research Institute | Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains |
| US6300065B1 (en) * | 1996-05-31 | 2001-10-09 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
| NZ525134A (en) * | 1999-03-02 | 2004-09-24 | Invitrogen Corp | Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids |
| PT2067788E (pt) | 1999-05-18 | 2015-10-29 | Dyax Corp | Bibliotecas de fragmentos fab e métodos para a sua utilização |
| ES2255616T3 (es) * | 2001-04-27 | 2006-07-01 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Vectores fagemidos. |
| GB0111015D0 (en) * | 2001-05-04 | 2001-06-27 | Norsk Hydro As | Genetic material |
| US7244592B2 (en) * | 2002-03-07 | 2007-07-17 | Dyax Corp. | Ligand screening and discovery |
| JP4748984B2 (ja) * | 2002-06-16 | 2011-08-17 | ダイアックス、コープ | 核酸ライブラリーメンバーの組換え |
| US7795411B2 (en) * | 2006-10-05 | 2010-09-14 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Vectors for expressing in vivo biotinylated recombinant proteins |
| WO2011060233A1 (en) * | 2009-11-11 | 2011-05-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Anti-tem1 antibodies and uses thereof |
| US20130085072A1 (en) * | 2011-10-03 | 2013-04-04 | Los Alamos National Security, Llc | Recombinant renewable polyclonal antibodies |
| CA2972568A1 (en) * | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Abcelex Technologies Inc. | Anti-salmonella antibodies and uses thereof |
-
2017
- 2017-04-06 DK DK17722873.1T patent/DK3440208T3/da active
- 2017-04-06 EP EP17722873.1A patent/EP3440208B1/en active Active
- 2017-04-06 JP JP2018553115A patent/JP6987076B2/ja active Active
- 2017-04-06 CA CA3018936A patent/CA3018936C/en active Active
- 2017-04-06 US US16/090,783 patent/US11549119B2/en active Active
- 2017-04-06 KR KR1020187031366A patent/KR102165777B1/ko active IP Right Grant
- 2017-04-06 WO PCT/IB2017/051990 patent/WO2017175176A1/en active Application Filing
- 2017-04-06 ES ES17722873T patent/ES2837482T3/es active Active
- 2017-04-06 PT PT177228731T patent/PT3440208T/pt unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210035753A (ko) * | 2019-09-24 | 2021-04-01 | 성균관대학교산학협력단 | 항-바이러스 활성이 향상된 나노천공자 |
| KR102675750B1 (ko) | 2019-09-24 | 2024-06-18 | 엠브릭스 주식회사 | 항-바이러스 활성이 향상된 나노천공자 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2019510505A (ja) | 2019-04-18 |
| WO2017175176A1 (en) | 2017-10-12 |
| EP3440208A1 (en) | 2019-02-13 |
| CA3018936C (en) | 2021-10-19 |
| DK3440208T3 (da) | 2020-12-07 |
| PT3440208T (pt) | 2020-12-04 |
| EP3440208B1 (en) | 2020-09-16 |
| KR20190015700A (ko) | 2019-02-14 |
| US11549119B2 (en) | 2023-01-10 |
| US20190119691A1 (en) | 2019-04-25 |
| ES2837482T3 (es) | 2021-06-30 |
| CA3018936A1 (en) | 2017-10-12 |
| JP6987076B2 (ja) | 2021-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102165777B1 (ko) | 단백질의 클로닝 및 발현을 위한 벡터, 그 방법 및 적용 | |
| AU2020264412B2 (en) | Dna-binding protein using ppr motif, and use thereof | |
| KR20180056772A (ko) | 세포내 유전자 변형 및 증가된 상동 재조합을 위한 보호 dna 주형 및 이용 방법 | |
| KR20180043297A (ko) | 조작된 내수송/외수송을 가진 미생물 숙주에서 모유 올리고당류의 생산 | |
| KR20050044856A (ko) | 항체의 폴리시스트론 발현 | |
| KR102652494B1 (ko) | 전장 t-세포 수용체 오픈 리딩 프레임의 신속한 조립 및 다양화를 위한 2-성분 벡터 라이브러리 시스템 | |
| KR20150125994A (ko) | 세포 발현 시스템 | |
| KR20210105382A (ko) | 단백질을 코딩하는 rna | |
| KR102584628B1 (ko) | T-세포 수용체, t-세포 항원 및 이들의 기능성 상호작용의 식별 및 특징규명을 위한 조작된 다성분 시스템 | |
| CN112877292A (zh) | 产生人抗体的细胞 | |
| CN111094569A (zh) | 光控性病毒蛋白质、其基因及包含该基因的病毒载体 | |
| KR20240037185A (ko) | 키메라 공동자극 수용체, 케모카인 수용체, 및 세포 면역치료에서의 이의 용도 | |
| CN109843909A (zh) | 利用替代的葡萄糖转运蛋白产生鼠李糖脂的细胞和方法 | |
| AU2024205017A1 (en) | An engineered multi-component system for identification and characterisation of T-cell receptors and T-cell antigens | |
| DK2935601T3 (en) | RECOMBINANT MICROBELL CELLS PRODUCING AT LEAST 28% EICOSAPENTAIC ACID AS DRY WEIGHT | |
| KR20140043890A (ko) | 조절된 유전자 발현 시스템 및 그의 작제물 | |
| US11814412B2 (en) | Artificial proteins and compositions and methods thereof | |
| KR20150100606A (ko) | 아테리바이러스 단백질 및 발현 메커니즘 | |
| KR20230112625A (ko) | 나이세리아 고노레아에 대한 백신접종을 위한 조성물 및 방법 | |
| KR20230159994A (ko) | 하이브리드 신호서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 인간 인슐린 유사 성장인자-1의 분비 생산방법 | |
| AU2022331118A1 (en) | Burden-addicted production strains | |
| CN116121090A (zh) | 提高红法夫酵母生产类胡萝卜素的方法 | |
| RU2798786C2 (ru) | Производство молочных олигосахаридов человека в микробных продуцентах с искусственным импортом/экспортом | |
| EP4433592A1 (en) | Compositions and methods for production of circular nucleic acid molecules | |
| CN117377752A (zh) | 用于生产具有减少的或不含n-连接的糖基化的外源蛋白的遗传修饰的丝状真菌 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |