ES2255616T3 - Vectores fagemidos. - Google Patents
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Abstract
Vector fagémido, que comprende: un marcador seleccionable, un origen ColE1, un origen f1, y después del origen ColE1 pero antes del origen f1, que comprende además los elementos siguientes: un terminador de transcripción bacteriana, un promotor, un primer sitio de unión ribosómica, una primera secuencia líder, una primera región de clonación, un segundo sitio de unión ribosómica, una segunda secuencia líder, una segunda región de clonación para recibir un gen codificante de un polipéptido que se va a expresar, y una secuencia de nucleótidos que codifica un producto que permite la expresión de un polipéptido sobre la superficie de una partícula fagémida.
Description
Vectores fagémidos.
La presente exposición se refiere a vectores de
clonación. Más específicamente, se dan a conocer vectores fagémidos
que resultan útiles en la clonación y en la expresión de información
genética foránea.
Los plásmidos son elementos genéticos
extracromosómicos capaces de replicación autónoma dentro de sus
huéspedes. Los plásmidos bacterianos presentan un tamaño de entre 1
Kb y 200 Kb o superior y codifican una diversidad de propiedades
útiles. Entre las características codificadas en los plásmidos se
incluyen la resistencia a antibióticos, la producción de
antibióticos, la degradación de moléculas orgánicas complejas, la
producción de bacteriocinas, tales como las colicinas, la
producción de enterotoxinas y la producción de enzimas de
restricción y de modificación de ADN.
Aunque los plásmidos han sido estudiados durante
varios años por derecho propio, particularmente en términos de su
replicación, transmisibilidad, estructura y evolución, con la
llegada de la tecnología de ingeniería genética, la investigación
de los plásmidos se ha centrado en la utilización de éstos en la
clonación y expresión de información genética foránea. En su
aplicación como vector, el plásmido debe poseer una o más de las
propiedades siguientes. El plásmido de ADN debe ser relativamente
pequeño, aunque capaz de incorporar cantidades relativamente
grandes de ADN foráneo. El tamaño de la inserción de ADN resulta
relevante en los vectores basados en bacteriófagos, en los que el
empaquetamiento del ácido nucleico en las partículas de fago puede
determinar un límite máximo. El plásmido debe encontrarse sometido
un control de la replicación relajado. Es decir, un control en el
que la replicación de la molécula de plásmido no se encuentre
estrictamente acoplada a la replicación del ADN huésped (control
estricto), resultando de esta manera en múltiples copias del
plásmido de ADN por cada célula huésped. El plásmido debe expresar
uno o más marcadores seleccionables, tales como los marcadores de
resistencia a fármaco, indicados anteriormente, con el fin de
permitir la identificación de las células huésped que contienen el
plásmido y también para proporcionar una presión de selección
positiva para el mantenimiento del plásmido en la célula huésped.
Finalmente, el plásmido debe contener un solo sitio de restricción
para una o más endonucleasas en una región del plásmido que no
resulte esencial para la replicación del mismo. Un vector tal como
se ha descrito anteriormente resulta útil, por ejemplo, para la
clonación de información genética, implicando la integración de un
segmento de ADN foráneo en el vector y la reproducción de copias
idénticas de dicha información en virtud de la replicación del ADN
del plásmido.
La etapa siguiente en la evolución de la
tecnología de vectores fue la construcción de los denominados
vectores de expresión. Estos vectores se caracterizan por su
capacidad de no sólo replicar la información genética foránea que
se ha insertado sino también de promover la transcripción de la
información genética en ARNm y su posterior traducción en proteína.
Esta expresión requiere una diversidad de secuencias genéticas
reguladoras, entre ellas, aunque no necesariamente limitándose a
ellas, promotores, operadores, terminadores de transcripción,
sitios de unión ribosómica y codones de inicio y terminación de la
síntesis de proteína. Estos elementos de expresión pueden
proporcionarse junto con el segmento de ADN foráneo como partes del
mismo o pueden integrarse en el vector en una región contigua al
sitio de restricción, de manera que cuando se introduzca un segmento
de ADN foráneo en el vector, se encuentre bajo el control de dichos
elementos a los que ahora se encuentra unido químicamente.
Un bacteriófago filamentoso consiste en una
molécula de ADN circular de cadena única rodeada de un cilindro de
proteínas de cubierta. El fago se encuentra envuelto por
aproximadamente 2.700 moléculas de la proteína principal de
cubierta pVIII. En un polo de la partícula de fago, existen
aproximadamente cinco copias de cada una de las proteínas de los
genes III y VI (pIII y pVI), las cuales se encuentran implicadas en
la unión a la célula huésped y en la terminación del proceso de
ensamblaje. El otro polo contiene cinco copias de cada una de pVII
y pIX, las cuales resultan necesarias para el inicio del ensamblaje
y para el mantenimiento de la estabilidad del virión. En los
últimos años, se han desarrollado y utilizado vectores para la
expresión de péptidos y proteínas foráneas sobre la superficie de
fagos filamentosos o de partículas fagémidas.
La expresión de péptidos y proteínas sobre la
superficie del fago o de las partículas fagémidas representa una
potente metodología para la selección de elementos raros en una
biblioteca compleja y para llevar a cabo evolución molecular en el
laboratorio. La capacidad de construir bibliotecas de enorme
diversidad molecular y de seleccionar moléculas con propiedades
predeterminadas ha hecho que esta tecnología sea aplicable a un
amplio abanico de problemas. Unas cuantas de las muchas aplicaciones
de esta tecnología son: i) la expresión de péptidos naturales en
fagos, incluyendo el mapado de epítopos de anticuerpos monoclonales
y policlonales y la producción de inmunógenos; ii) la expresión
fágica de péptidos aleatorios, incluyendo el mapado de epítopos de
anticuerpos monoclonales y policlonales, la identificación de
ligandos peptídicos y el mapado de sitios sustrato para proteasas y
quinasas; e iii) la expresión fágica de proteínas y de dominios de
proteína, incluyendo la evolución dirigida de proteínas, el
aislamiento de anticuerpos y el cribado de expresión de ADNc.
Se han desarrollado vectores que incorporan ADN
de plásmidos y de bacteriófagos. Estos vectores fagémidos se
derivan mediante modificaciones de un genoma de plásmido que
contiene un origen de replicación de un bacteriófago (por ejemplo
f1, M13, fd), así como el origen de replicación del plásmido. Los
fagémidos resultan útiles para la expresión de información genética
foránea.
Un vector fagémido conocido es el pBluescript II
KS+ (pBS II KS+) (Stratagene, La Jolla, California), el cual es un
punto de inicio útil para la construcción del presente vector debido
a su pequeño tamaño y al hecho de que contiene el origen de
replicación del plásmido colE1 y el origen de replicación del fago
f1 en la orientación deseada. El plásmido también porta un gen de
resistencia a la ampicilina.
Resultan deseables los vectores que, por su
estructura, proporcionan una mejor funcionalidad.
En la presente memoria se describen nuevos
vectores plásmidos capaces de replicar y de expresar información
genética foránea en bacterias, tales como, por ejemplo, una
cianobacteria y E. coli. Estos nuevos vectores contienen una
secuencia de elementos específica después del origen ColE1 pero
antes del origen f1. Específicamente, el presente vector fagémido
contiene, después del origen ColE1 pero antes del origen f1, un
terminador de transcripción bacteriana, un promotor, un primer
sitio de unión ribosómica, una primera secuencia líder y una
primera región de clonación, un segundo sitio de unión ribosómica,
una segunda secuencia líder y una segunda región de clonación. La
segunda región de clonación está adaptada para recibir un gen que
codifica un polipéptido que se va a expresar y una secuencia de
nucleótidos que codifica por lo menos un dominio funcional de una
proteína expresada.
De acuerdo con la presente invención se da a
conocer un vector fagémido que comprende:
un marcador seleccionable,
un origen colE1,
un origen f1, y
después del origen ColE1 pero antes del origen
f1, comprende además los elementos siguientes:
un terminador de transcripción bacteriana,
un promotor,
un primer sitio de unión ribosómica;
una primera secuencia líder,
una primera región de clonación;
un segundo sitio de unión ribosómica;
una segunda secuencia líder;
una segunda región de clonación para recibir un
gen que codifique un polipéptido que se va a expresar; y
una secuencia de nucleótidos que codifica un
producto que permite la expresión de un polipéptido sobre la
superficie de una partícula fagémida.
En una forma de realización adicional preferente
de la invención, por lo menos uno de entre los primer y segundo
sitios de unión ribosómica del vector fagémico comprende la SEC. ID
nº 13, por lo menos una de entre las primera o segunda secuencias
líder comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que
consiste en las SEC ID nº 14 e ID nº 17.
En una forma de realización adicional preferente,
la secuencia de nucleótidos que codifica un producto codifica una
proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en pIII y
pVIII, preferentemente la secuencia de nucleótidos que codifica un
producto codifica una pIII truncada, o una pIII sintética.
Además, el marcador seleccionable se selecciona
de entre el grupo que consiste en los genes de resistencia a la
ampicilina, de la resistencia a la cloranfenicol transferasa, de
resistencia a la tetraciclina y de resistencia a la canamicina.
En una forma de realización más preferida de la
invención, el vector fagémido comprende la SEC. ID nº 18, o
comprende una secuencia relacionada con el grupo que consiste en las
SEC ID nº 19, 20 y 21.
Los vectores descritos en la presente memoria se
construyen mediante una serie de etapas que convierten un vector
inicial a través de una serie de plásmidos intermedios en el
presente nuevo vector que puede utilizarse para la expresión de
bibliotecas de anticuerpos.
La figura 1 ilustra esquemáticamente la
estructura de pBS II KS+, un vector inicial útil para preparar los
nuevos vectores descritos en la presente memoria;
la figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra
el procedimiento para la preparación de los nuevos vectores
descritos en la presente memoria;
la figura 3 ilustra esquemáticamente la digestión
del vector inicial y la inserción del promotor;
las figuras 4A-C muestra la
secuencia (SEC. ID nº 19) del vector intermedio
p110-81.6;
la figura 5 ilustra esquemáticamente la inserción
del terminador;
las figuras 6A-C muestran la
secuencia (SEC. ID nº 20) del vector intermedio
p131-03.7;
la figura 7 ilustra esquemáticamente la inserción
de múltiples sitios de clonación;
las figuras 8A-C muestran la
secuencia (SEC. ID nº 21) del vector intermedio
p131-39.1;
la figura 9 ilustra esquemáticamente la inserción
de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína que se va a
expresar y los dos casetes de control transcripcional;
la figura 10 es un mapa del plásmido pAX131;
las figuras 11A-D muestran la
secuencia de ácidos nucleicos (SEC. ID nº 18) del plásmido pAX131,
incluyendo los dominios que corresponden a genes particulares;
las figuras 12A-G muestran las
secuencias de ácidos nucleicos de secuencias de relleno
ilustrativas; y
las figuras 13A-C muestran la
secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pAX131 Xba/Not.
Los presentes nuevos vectores fagémidos resultan
útiles para la expresión de polipéptidos tales como, por ejemplo,
las bibliotecas de anticuerpos. Los vectores descritos en la
presente memoria pueden prepararse utilizando cualquier vector
comercialmente disponible que contenga los orígenes de replicación
ColE1 y f1 como material de partida. Dichos materiales de partida
son conocidos y se encuentran disponibles comercialmente. Un
material de partida adecuado es el vector pBS II KS+, que se
encuentra disponible comercialmente en Strategene Corp., La Jolla,
California (ver la figura 1).
La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra
una forma de realización de las etapas implicadas en la conversión
de un vector de partida en uno de los presentes nuevos vectores. Los
expertos en la materia preverán fácilmente otros esquemas para
preparar los presentes vectores. De acuerdo con lo expuesto, la
presente exposición no se encuentra limitada a la secuencia de
etapas mostrada en la figura 2.
En la primera etapa, el vector de partida se
digiere con enzimas de restricción para eliminar una porción
sustancial del vector entre los orígenes de replicación ColE1 y f1.
Típicamente, la porción a eliminar del vector de partida incluye
múltiples sitios de clonación. Dependiendo de los sitios de
restricción particulares que se hallen presentes en el vector de
partida, el experto en la materia conocerá y seleccionará fácilmente
los procedimientos adecuados para digerir el vector de partida.
A continuación, se inserta un promotor corriente
abajo del origen ColE1 del vector de partida digerido. Puede
utilizarse cualquier promotor reconocido por una célula huésped.
Entre los promotores adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a
ellos, los promotores ara, lac y trc. El promotor regula la
expresión de otras secuencias insertadas en el vector, tales como,
por ejemplo, la expresión de polipéptidos. En las formas de
realización particularmente útiles, una secuencia promotora
producida a partir del vector de partida se utiliza como promotor
insertado corriente abajo del origen ColE1, tal como se describe en
más detalle posteriormente.
En la etapa siguiente, se inserta un terminador
de transcripción bacteriano corriente abajo del origen ColE1 y
corriente arriba del promotor. Puede utilizarse cualquier terminador
reconocido por una célula huésped. Entre los terminadores adecuados
se incluyen, pero sin limitarse a ellos, el terminador t_{HP}, el
terminador bgIG y el terminador crp. Debe indicarse que el análisis
bioinformático ha permitido identificar más de 100 terminadores de
transcripción rho-independientes en el genoma de
E. coli, todos los cuales resultarían adecuados para este
propósito (Ermolaeva et al., J. Mol. Biol.
301:27-33, 2000).
En la etapa siguiente, se insertan múltiples
sitios de restricción corriente abajo del promotor. El sitio de
restricción puede ser cualquier sitio de restricción conocido. Entre
los sitios de restricción adecuados se incluyen, pero sin limitarse
a ellos, NheI, HindIII, NcoI, XmaI, BglII, BstI, PvuI, etc. El
número de sitios de restricción insertados no es crítico, con la
condición de que se inserte un número suficiente de sitios de
restricción para permitir que se complete la totalidad de las etapas
necesarias para crear los presentes nuevos vectores. De esta
manera, pueden insertarse en esta etapa únicamente 2 y hasta 10 o
más sitios de restricción. Debe entenderse que si uno o más de los
sitios de restricción seleccionados para la inserción se encuentran
presentes en el vector de partida, puede resultar deseable eliminar
o desactivar el sitio de restricción nativo con el fin de evitar la
digestión no deseada durante el procesamiento posterior. El sitio de
restricción puede insertarse utilizando cualquier técnica conocida
por el experto en la materia. Una combinación particularmente
preferente de sitios de restricción insertados en esta etapa es
NotI, SfiI, SpeI, XhoI, XbaI y EcoRI.
La etapa siguiente implica insertar una secuencia
de nucleótidos que codifica un producto que permite la expresión de
un polipéptido sobre la superficie de una partícula fagémida. El
producto codificado puede de esta manera considerarse por lo menos
un dominio funcional de una proteína expresada. La proteína
expresada puede ser cualquier polipéptido natural o sintético al
que pueda fusionarse un polipéptido que se va a expresar y que
puede presentar el polipéptido que se va a expresar para los
procedimientos de cribado. Entre los polipéptidos expresados que
resultan adecuados se incluyen proteínas que pueden incorporarse en
la cubierta de una partícula fágica. Como apreciará el experto en
la materia, los bacteriófagos filamentosos consisten en una molécula
de ADN circular de cadena única rodeada de un cilindro de proteínas
de cubierta. Existen aproximadamente 2.700 moléculas de la proteína
principal de cubierta pVIII que encapsidan el fago. En un polo de la
partícula fágica, existen aproximadamente cinco copias de cada una
de las proteínas de los genes III y VI (pIII y pVI) que se
encuentran implicadas en la unión a la célula huésped y en la
terminación del proceso de ensamblaje. El otro polo contiene cinco
copias de cada uno de pVII y pIX, que resultan necesarias para el
inicio del ensamblaje y para el mantenimiento de la estabilidad del
virión. Puede utilizarse una secuencia de nucleótidos que codifique
cualquiera de estas proteínas de cubierta para preparar los nuevos
vectores de la presente invención. Son particularmente preferentes
las secuencias de nucleótidos que codifican por lo menos un dominio
funcional de pIII. La secuencia de nucleótidos que codifica por lo
menos un dominio funcional de pIII puede ser natural o sintética.
La secuencia de nucleótidos insertada puede codificar una pIII
truncada con la condición de que se conserve la función de
expresión de la proteína. Un ejemplo de una proteína de cubierta
sintética o artificial que resulta útil en la presente invención es
la que se da a conocer en Weiss et al., J. Mol. Biol.
300(1):213-219 (2000).
En la etapa siguiente, se insertan dos casetes de
control transcripcional, un casete de control transcripcional
corriente arriba y otro corriente abajo. Cada uno de ellos incluye
un sitio de unión ribosómica, una secuencia líder y un sitio de
clonación para recibir un gen que codifica un polipéptido que se va
a expresar. Pueden utilizarse cualquier sitio de unión ribosómica
(RBS) y cualquier secuencia líder conocidos y que sean reconocidos
por la célula huésped. Preferentemente, las secuencias RBS y líder
utilizadas se optimizan para la expresión en E. coli. El
sitio de clonación es una región del ácido nucleico entre dos sitios
de restricción, típicamente con una región no esencial de secuencia
de nucleótidos (denominada comúnmente secuencia "de relleno")
situada entre ambos. Alternativamente, la secuencia de relleno
puede contener una región no esencial y una porción de un dominio
constante para todos los anticuerpos. Entre las secuencias de
relleno adecuadas se incluyen, por ejemplo, aquéllas que se muestran
en las figuras 12A-G.
El casete de control transcripcional corriente
abajo se inserta en posición contigua a la secuencia de nucleótidos
que codifica por lo menos el dominio funcional de la proteína
expresada. De esta manera, se expresará una proteína de fusión al
insertar un gen que codifica un polipéptido que se va a expresar en
el sitio de clonación del casete de control transcripcional situado
corriente abajo. Como apreciarán los expertos en la materia, puede
insertarse un codón de parada suprimible entre el gen que codifica
el polipéptido que se va a expresar y la secuencia de nucleótidos
que codifica por lo menos un dominio funcional de la proteína
expresada, de manera que se expresa la proteína de fusión en un
huésped supresor (con la condición de que se inserte el gen dentro
del marco de lectura) y se obtiene una proteína secretada sin la
proteína de expresión en un huésped no supresor.
El casete de control transcripcional de corriente
arriba se inserta corriente arriba del casete de control
transcripcional de corriente abajo. El casete de control
transcripcional de corriente arriba proporciona una segunda región
de clonación para recibir un segundo gen que codifica un polipéptido
que puede dimerizarse con el polipéptido que se va a expresar. Por
ejemplo, cuando el vector exprese un Fd de cadena pesada fusionado
con una proteína de expresión, el segundo gen preferentemente
codifica la cadena ligera de un anticuerpo. Al igual que con el
sitio de clonación del casete de control transcripcional de
corriente abajo, el sitio de clonación del casete de control
transcripcional de corriente arriba es una región del vector situada
entre dos sitios de restricción, típicamente con un relleno entre
ambos. Evidentemente debe entenderse que en el caso de que deba
expresarse un polipéptido que no es un anticuerpo (tal como, por
ejemplo, cuando se desea la expresión monomérica de un solo
polipéptido o proteína) no resulta necesario clonar un segundo gen
en el vector en el sitio de clonación del casete de control
transcripcional de corriente arriba. En estos casos, el segundo
sitio de clonación puede simplemente dejarse sin utilizar. Como
también apreciarán los expertos en la materia, en el caso de que un
gen insertado en el sitio de clonación del casete de control
transcripcional de corriente abajo codifique la cadena ligera de un
anticuerpo, no resulta necesario insertar un segundo gen en el
vector en el sitio de clonación del casete de control
transcripcional de corriente arriba.
De esta manera, el vector fagémido producido
mediante el procedimiento ilustrado en la figura 2 contendrá,
después del origen ColE1 pero antes del origen f1, un terminador, un
promotor, un primer sitio de unión ribosómica, una primera
secuencia líder y una primera región de clonación, un segundo sitio
de unión ribosómica, una segunda secuencia líder y una segunda
región de clonación para recibir un gen que codifique un polipéptido
que se va a expresar y una secuencia de nucleótidos que codifique
por lo menos un dominio funcional de una proteína de expresión.
Los presentes vectores también incluyen un
marcador seleccionable. Puede producirse un vector resistente a la
ampicilina o resistente CAT de acuerdo con la presente exposición.
La resistencia a la ampicilina o resistencia CAT pueden
proporcionarse simplemente seleccionando un vector de partida que
presente la resistencia deseada. Alternativamente, si el vector de
partida es resistente a la ampicilina, para producir un vector
resistente CAT se elimina el gen de resistencia a la ampicilina y
se sustituye con el gen de la cloranfenicol transferasa. Las
técnicas para proporcionar resistencia a la ampicilina o resistencia
CAT en los presentes vectores resultarán muy evidentes al experto
en la materia. Entre otros marcadores seleccionables adecuados se
incluyen, pero sin limitarse a ellos, los genes de resistencia a la
tetraciclina o a la canamicina.
Los vectores descritos en la presente memoria
pueden transformarse en una célula huésped utilizando técnicas
conocidas (por ejemplo la electroporación) y amplificarse. Los
vectores descritos en la presente memoria también pueden digerirse
y presentan un primer gen y opcionalmente un segundo gen ligado
dentro de los mismos de acuerdo con la presente exposición. El
vector construido de esta manera puede transformarse en una célula
huésped utilizando técnicas conocidas y amplificarse, o utilizarse
para expresar polipéptidos y/o proteínas codificadas y producir de
esta manera partículas de fago que expresen polipéptidos únicos o
especies diméricas. El experto en la materia preverá fácilmente
otros usos para los nuevos vectores descritos en la presente
memoria.
Los ejemplos siguientes ilustran la presente
invención sin limitar su alcance. Las etapas implicadas en la
construcción de los vectores descritas en la presente memoria se
comentan en detalle en los Ejemplos. Los expertos en la materia
conocen las técnicas adecuadas para llevar a cabo las etapas
descritas posteriormente sin llevar a cabo experimentación
innecesaria, siendo conocidas dichas técnicas por los expertos en la
materia.
El presente ejemplo ilustra los procedimientos y
composiciones para la construcción de una forma de realización de
un vector fagémido de acuerdo con la presente exposición. El
fagémido de partida seleccionado para la construcción era pBS II
KS+, el cual contiene un gen de resistencia a la ampicilina que
resulta en un vector final, pAX131, que es resistente a la
ampicilina.
El vector comercialmente disponible pBS II KS+
(Stratagene, La Jolla, California) se digirió con Pvu I y con Sap I
para producir un fragmento pBS II KS+ de 2.424 pb que carecía de las
bases en las posiciones 500 a 1.037 correspondientes a la región de
clonación múltiple. El fragmento resultante contenía el gen de
resistencia a la ampicilina (AmpR), el origen f1 de fago y el
origen ColE1 (ver la figura 3). A continuación, se utilizaron dos
cebadores mutagénicos con el fragmento pBS II KS+ en una reacción de
PCR seguida de digestión con EcoRI y con Sap I para producir un
fragmento de 209 pb que contenía el promotor lac. Los cebadores
utilizados eran los siguientes:
- 5' AAC CGT ATT ACC GCC TTT GAG TG 3' (SEC ID nº 1), y
- 5' CCT GAA TTC AAT TGT TAT CCG CTC ACA ATT CCA C 3' (SEC ID nº 2).
El fragmento de 2.424 pb y el fragmento de 209 pb
se combinaron en una reacción de ligación a tres vías con dos
oligonucleótidos solapantes que contenían los sitios NotI, EcoRI y
PvuI con el fin de formar un primer plásmido intermediario
(denominado p110-81.6) (ver la figura 3). Los
oligonucleótidos utilizados para esta reacción eran los
siguientes:
- 5' CGG TAA TGC GGC CGC TAC ATG 3' (SEC ID nº 3), y
- 5' AAT TCA TGT AGC GGC CGC ATT ACC GAT 3' (SEC ID nº 4).
El plásmido resultante p110-81.6
se digirió y se secuenció en la región alterada con el fin de
identificar un clon con la incorporación correcta del promotor lac
y de los sitios Pvu I, Sap I, EcoR y Not I. La secuenciación de
p110-81.6 reveló un cambio de los ácidos nucleicos
en la posición nº 875 dentro del promotor lac. La secuencia
publicada de pBS II KS+ presenta una adenina en la posición nº 875.
Sin embargo, la secuenciación de p110-81.6 y el pBS
II KS+ original revelaron una guanina en la posición nº 875. La
secuencia (SEC ID nº 19) del plásmido intermediario
p110-81.6 se muestra en las figuras
4A-C.
Se insertó una secuencia de terminación de
transcripción en el primer plásmido intermediario
(p110-81.6) corriente arriba del promotor lac en el
sitio SapI (ver la figura 5).
El plásmido 110-81.6 se digirió
con SapI con el fin de crear un punto de inserción para los
oligonucleótidos que contenía un terminador t_{HP} (Nohno et
al., Molecular and General Genetics, vol. 205, páginas
260-269, 1986). Los oligonucleótidos utilizados en
esta ligación eran:
El vector intermediario resultante (denominado
p131-03.7) se digirió y se secuenció en la región
alterada para determinar su identidad. La secuencia (SEC ID nº 20)
del vector intermediario p131-03.7 se muestra en las
figuras 6A-C.
Los oligonucleótidos que contenían los sitios
XbaI, XhoI, SpeI y SfiI se insertaron seguidamente en el plásmido
intermediario p131-03.7 (ver la figura 7).
El vector intermediario p131-03.7
se digirió con EcoRI y con NotI y después se purificó en gel. A
continuación, los oligonucleótidos solapantes que contenían los
sitios XbaI, XhoI, SpeI y SfiI se ligaron en el esqueleto de
p131-03.7. Los oligonucleótidos insertados eran:
El plásmido intermediario resultante (denominado
p131-39.1) se secuenció y se analizó para determinar
su identidad. La secuencia (SEC ID nº 21) del plásmido
intermediario p131-39.1 se muestra en las figuras
8A-C.
Se utilizó ADN de cadena única del fago f1 (ATCC
nº 15766-B2) como molde para la clonación del gen
III (ver la figura 9).
Los cebadores utilizados eran:
5' AGT GGC CAG GCC GGC CTT GAA ACT GTT GAA AGT
TGT TTA GCA AA 3' (SEC ID nº 9) que contiene el sitio SfiI, bases
para mantener el marco codificante y una porción del gen III, y
5' TCT GCG GCC GCT TAG CTA GCT TAA GAC TCT TTA
TTA CGC AGT ATG TTA GCA 3' (SEC ID nº 10), que contiene el extremo
del gen III en el que se ha eliminado un sitio interno de unión
ribosómica utilizado habitualmente para el siguiente gen corriente
abajo mediante el cambio de una tercera posición base silenciosa en
el codón correspondiente. Este oligonucleótido también contiene un
codón de parada, un sitio NheI para su utilización potencial en la
eliminación de la fusión, un segundo codón de parada para su
utilización con la fusión y el sitio NotI para la clonación. El
fragmento de PCR se digirió con SfiI y con NotI y se insertó en
p131-39.1 digerido con SfiI y con NotI para crear
el vector intermediario p131-44.2. La integridad de
la región del gen III y de la secuencias flanqueantes se confirmó
mediante análisis de las secuencias.
Se utilizó el plásmido 131-39.1
como vector lanzadera para la clonación de los oligonucleótidos que
contenían la secuencia codificante del péptido señal ompA. Se
produjo el casete de control transcripcional de corriente arriba
dentro del plásmido intermediario 131-39.1 mediante
la inserción de un par de oligonucleótidos que contenían EcoR I, el
líder del péptido señal ompA, seguido de un sitio SacI, una pequeña
región de relleno y un sitio de unión ribosómica (ver la figura 9).
Los oligonucleótidos utilizados eran:
\newpage
Eco Xba:
Xba Eco:
Las secuencias RBS y líder incluidas en el casete
de control transcripcional de corriente arriba se optimizaron para
su utilización en E. coli. Estas nuevas secuencias eran:
5' AAG GAG 3' (SEC ID nº 13) para la secuencia
RBS, y
5' ATG AAA AAA ACC GCG ATT GCG ATT GCG GTG GCG
CTG GCG GGC TTT GCG ACC GTG GCC CAG GCG GCC 3' (SEC ID nº 14) para
el líder OmpA. El plásmido resultante se secuenció para confirmar la
identidad de la inserción y se digirió en los sitios EcoR I y XbaI
para producir un fragmento de 94 pb que es el casete de control
transcripcional de corriente arriba.
El plásmido intermediario
131-39.1 se utilizó como vector lanzadera para la
clonación de los oligonucleótidos que contenían la secuencia
codificante del péptido señal pelB. El casete de control
transcripcional de corriente abajo se produjo dentro del plásmido
intermediario 131-39.1 mediante la inserción de un
par de oligonucleótidos que contenían el péptido señal pelB, el
sitio XbaI y un sitio de unión ribosómica. Los oligonucleótidos
utilizados eran:
XbaXho:
XhoXba:
La nueva secuencia líder pelB se optimizó para su
utilización en E. coli y presentaba la secuencia:
5' TAT GAA ATA TCT GCT GCC GAC CGC GGC GGC GGG
CCT GCT GCT GCT GGC GGC GCA GCC GGC GAT GGC G 3' (SEC ID nº 17). El
plásmido resultante se secuenció para confirmar la identidad de la
inserción y se digirió en los sitios XbaI y XhoI para producir un
fragmento de 91 pb que es el casete de control transcripcional de
corriente abajo.
Se combinaron el casete de control
transcripcional de corriente arriba y el casete de control
transcripcional de corriente abajo con el plásmido intermediario
p131-44.2 digerido con EcoRI y con XhoI en una
reacción de ligación a 3 vías con el fin de producir pAX131 (ver la
figura 9). La figura 10 es un mapa del vector resultante pAX131. El
pAX131 se analizó para determinar su secuencia de ácidos nucleicos
(SEC ID nº 18), que se muestra en las figuras
11A-D.
El vector PAX131 se digirió con el enzima de
restricción NotI. El ADN protuberante que resultó seguidamente se
rellenó con fragmento klenow de la polimerasa para crear extremos
romos en el ADN, seguido de ligación. Lo anterior se llevó a cabo
con el fin de eliminar el sitio NotI existente. El vector PAX131 con
deleción de NotI se digirió con EcoRI/XbaI y se ligó con un
oligonucleótido dúplex que contenía fragmentos protuberantes con
EcoRI y SpeI (XbaI y SpeI presentan extremos compatibles).
Oligonucleótido Eco/Spe:
Oligonucleótido Spe/Eco:
El vector resultante (pAX131 Xba/Not) presentaba
sitios XbaI y NotI para la clonación de un gen, tales como cadenas
ligeras, y no sitios SacI y XabI. Las figuras 13A-C
muestran la secuencia de ácidos nucleicos para el vector pAX131
Xba/Not.
Se contempla que los presentes nuevos vectores
puedan utilizarse en la producción y cribado de bibliotecas
preparadas de acuerdo con las tecnologías convencionales de
expresión en fagos. Se han producido repertorios de anticuerpos
tanto naturales como sintéticos como bibliotecas de expresión en
fagos. Los anticuerpos naturales pueden clonarse a partir de ARNm
de células B procedente de linfocitos de sangre periférica, médula
ósea, bazo u otro tejido linfático de un donante humano o no
humano. Los donantes con una respuesta inmunológica al antígeno o
antígenos de interés pueden utilizarse para crear bibliotecas de
anticuerpos inmunes. Alternativamente, pueden producirse
bibliotecas no inmunes a partir de donantes mediante el aislamiento
de genes de célula B de anticuerpos no expuestos. La PCR con
cebadores específicos de anticuerpos en la primera hebra de ADNc
permite el aislamiento de los fragmentos de cadena ligera y cadena
pesada de los anticuerpos, que después pueden clonarse en el vector
de expresión.
Los anticuerpos sintéticos o bibliotecas de
anticuerpos pueden construirse en parte o completamente con regiones
de secuencias derivadas sintéticamente. La diversidad de la
biblioteca puede construirse a partir de las regiones variables,
particularmente en las CDR, mediante la utilización de
oligonucleótidos degenerados. Por ejemplo, puede modificarse un
solo gen Fab en la posición CDR3 de la cadena pesada para que
contenga secuencias aleatorias de oligonucleótidos. La secuencia
aleatoria puede introducirse en el gen de cadena pesada utilizando
un oligonucleótido que contenga la región codificante degenerada en
un enfoque de PCR solapante. Alternativamente, pueden clonarse los
casetes de oligonucleótidos degenerados en los sitios de restricción
que flanquean los CDR para producir diversidad. La biblioteca
resultante producida mediante éste u otros enfoques seguidamente
puede clonarse en un vector de expresión de acuerdo con la presente
exposición.
Al introducir la biblioteca de expresión en las
bacterias, se producirán partículas de fago que presentan
anticuerpo expresado en su superficie. La colección resultante de
anticuerpos expresados en el fago puede seleccionarse según la
capacidad de unirse al antígeno de interés utilizando técnicas
conocidas por el experto en la materia. Los anticuerpos
identificados mediante este sistema pueden utilizarse
terapéuticamente como reactivos diagnósticos o como herramientas de
investigación.
Se contempla que las versiones de una cadena y de
doble cadena de los vectores indicados en la presente memoria se
encuentran dentro del alcance de la presente invención. Se encuentra
totalmente dentro del alcance del experto en la materia la
preparación de vectores de una o dos cadenas que presenten las
características descritas en la presente memoria.
Se entenderá que pueden llevarse a cabo diversas
modificaciones de las formas de realización descritas en la
presente memoria. Por ejemplo, tal como apreciarán los expertos en
la materia, un primer gen codificante de una proteína de fusión que
presenta la cadena ligera de un anticuerpo que se fusionará y será
expresada por pVIII y un segundo gen codificante de una cadena
pesada de Fd pueden insertarse en el vector en el sitio de
restricción creado nuevamente para proporcionar una expresión
efectiva del anticuerpo. Por lo tanto, la descripción anterior no
debe interpretarse como limitada, sino meramente a título de ejemplo
de las formas de realización preferidas. Los expertos en la materia
apreciarán que pueden realizarse otras modificaciones sin apartarse
por ello del alcance y espíritu de la invención según las
reivindicaciones adjuntas.
<110> Bowdish, Katherine S.
\hskip1cmFrederickson, Shana
\hskip1cmWild, Martha
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VECTORES FAGÉMIDOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1087-22 (70)
\vskip0.400000\baselineskip
<140> US 10/134.188
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-04-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/287.355
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-04-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccgtatta ccgcctttga gtg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgaattca attgttatcc gctcacaatt ccac
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtaatgcg gccgctacat g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattcatgta gcggccgcat taccgat
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgtacccg ataaaagcgg cttcctgaca ggaggccgtt ttgttttgca gcccacct
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctaggtggg ctgcaaaaca aaacggcctc ctgtcaggaa gccgctttta tcgggtac
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattcacatc tagatatctc gagtcaatac tagtggccag gccggccagc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgctggc cggcctggcc actagtattg actcgagata tctagatgtg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtggccagg ccggccttga aactgttgaa agttgtttag caaa
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgcggccg cttagctagc ttaagactct ttattacgca gtatgttagc a
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> RBS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggag
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> líder ompA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> líder pelB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4154
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2654
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector plásmido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2712
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2750
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> vector plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<212> ADN
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<223> secuencia de relleno
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<223> secuencia de relleno
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<212> ADN
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<223> secuencia de relleno
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<223> secuencia de relleno
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<212> ADN
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<223> secuencia de relleno
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<400> 30
Claims (9)
1. Vector fagémido, que comprende:
un marcador seleccionable,
un origen ColE1,
un origen f1, y
después del origen ColE1 pero antes del origen
f1, que comprende además los elementos siguientes:
un terminador de transcripción bacteriana,
un promotor,
un primer sitio de unión ribosómica,
una primera secuencia líder,
una primera región de clonación,
un segundo sitio de unión ribosómica,
una segunda secuencia líder,
una segunda región de clonación para recibir un
gen codificante de un polipéptido que se va a expresar, y
una secuencia de nucleótidos que codifica un
producto que permite la expresión de un polipéptido sobre la
superficie de una partícula fagémida.
2. Vector fagémido según la reivindicación 1, en
el que por lo menos uno de entre los primer y segundo sitios de
unión ribosómica comprende la SEC ID nº 13.
3. Vector fagémido según la reivindicación 1, en
el que por lo menos una de entre las primera y segunda secuencias
líder comprenden una secuencia seleccionada de entre el grupo
constituido por las SEC ID nº 14 e ID nº 17.
4. Vector fagémido según la reivindicación 1, en
el que la secuencia de nucleótidos que codifica un producto codifica
una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por pIII y
pVIII.
5. Vector fagémido según la reivindicación 1, en
el que la secuencia de nucleótidos que codifica un producto codifica
un pIII truncado.
6. Vector fagémido según la reivindicación 1, en
el que la secuencia de nucleótidos que codifica un producto codifica
un pIII sintético.
7. Vector fagémido según la reivindicación 1, en
el que el marcador seleccionable se selecciona de entre el grupo
constituido por resistencia a la ampicilina, resistencia a la
cloranfenicol transferasa, resistencia a la tetraciclina y
resistencia a la canamicina.
8. Vector fagémido que comprende la SEC ID nº
18.
9. Vector fagémido que comprende una secuencia
seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 19, 20
y 21.
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