ES2275280T3

ES2275280T3 - Procedimientos de produccion de miembros de pares de ligandos especificos.

Info

Publication number: ES2275280T3
Application number: ES97120149T
Authority: ES
Inventors: John Mccafferty; Anthony Richard Pope; Kevin Stuart Johnson; Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom; Andrew David Griffiths; Ronald Henry Jackson; Kaspar Philipp Holliger; James David Marks; Timothy Piers Clackson; David John Chiswell; Gregory Paul Winter; Timothy Peter Bonnert
Original assignee: Medical Research Council; Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: Medical Research Council; MedImmune Ltd
Priority date: 1990-07-10
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 2007-06-01
Anticipated expiration: 2011-07-10
Also published as: DE122010000026I2; JP3176917B2; EP0589877B2; US7723270B1; DE69133545T2; EP1847605A3; DE69133545D1; DE69132920D1; AU8221691A; ATE339497T1; CA2086936C; EP1847605A2; US20070148774A1; EP1754787A3; ES2322323T1; DE69132920C5; ATE145237T1; DE122010000026I1; AU664155B2; NL300423I1

Abstract

SE IDENTIFICA UN MIEMBRO DE UN PAR DE UNION ESPECIFICO (SBP) POR EXPRESION DE UN ADN QUE CODIFICA UNA POBLACION GENETICAMENTE DIVERSA DE TALES MIEMBROS SBP EN CELULAS HUESPED RECOMBINANTES EN LAS QUE LOS MIEMBROS SBP SE MUESTRAN EN FORMA FUNCIONAL EN LA SUPERFICIE DE UN CONJUNTO SEGREGADO DE PRESENTACION GENETICA RECOMBINANTE (RGDP) QUE CONTIENE EL ADN QUE CODIFICA EL MIEMBRO SBP O UN COMPONENTE POLIPEPTIDICO DE ESTE, EN VIRTUD DE LO CUAL UN MIEMBRO SBP O UN COMPONENTE POLIPEPTIDICO DE ESTE SE EXPRESA COMO UNA FUSION CON UN COMPONENTE DE LA CAPSIDE DEL RGDP. LOS SBP MOSTRADOS PUEDEN SER SELECCIONADOS POR AFINIDAD CON UN MIEMBRO SBP COMPLEMENTARIO, Y EL ADN PUEDE SER RECUPERADO DE RGDP SELECCIONADOS PARA QUE SE PRODUZCA EXPRESION DE LOS MIEMBROS SBP SELECCIONADOS. PUEDEN OBTENERSE ASI ANTICUERPOS FRENTE A MIEMBROS SBP, CON EXPRESION DE SUS DIFERENTES CADENAS, UNA FUSIONADA AL COMPONENTE DE LA CAPSIDE Y LA OTRA EN FORMA LIBRE PARA SU ASOCIACION CON SU PAR POLIPEPT DICO DE FUSION. PUEDE USARSEUN FAGEMIDO COMO VECTOR DE EXPRESION, EN DONDE DICHA FUSION CON LA CAPSIDE AYUDA A EMPAQUETAR EL ADN FAGEMIDO. CON LA UTILIZACION DE ESTE METODO PUEDEN COMBINARSE BIBLIOTECAS DE ADN QUE CODIFICAN LAS CADENAS RESPECTIVAS DE TALES MIEMBROS SBP MULTIMERICOS, OBTENIENDO ASI UNA DIVERSIDAD GENETICA MUCHO MAYOR DE LOS MIEMBROS SBP DE LA QUE SE OBTENDR A POR METODOS CONVENCIONALES.

Description

Procedimientos de producción de miembros de pares de ligandos específicos.

La presente invención está relacionada con procedimientos para producir miembros de pares de unión específicos. La presente invención está también relacionada con las moléculas de unión biológica producidas a través de estos procedimientos.

Debido a su elevada especificidad para un determinado antígeno, la llegada de anticuerpos monoclonales (Kohler, G y Milstein, C; 1975 Nature 256: 495) representó un acontecimiento técnico significativo con importantes consecuencias, tanto científica como comercialmente.

Los anticuerpos monoclonales son obtenidos tradicionalmente mediante el establecimiento de una línea celular de mamífero inmortal, la cual procede de una célula única productora de inmunoglobulina que secreta una forma de una molécula anticuerpo biológicamente funcional, con una especificidad particular. Debido al hecho de que la línea celular de mamífero que secreta el anticuerpo es inmortal, las características del anticuerpo son reproducibles de lote a lote. Las propiedades clave de los anticuerpos monoclonales son su especificidad para un antígeno particular y la reproducibilidad con la que los mismos pueden ser manufacturados.

Estructuralmente, el anticuerpo más simple (IgG) comprende cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), interconectadas mediante enlaces disulfuro (ver la Figura 1). Las cadenas ligeras existen bajo dos formas distintas, denominadas kappa (K) y lambda (\lambda). Cada una de las cadenas tiene una región constante (C) y una región variable (V). Cada una de las cadenas está organizada en series de dominios. Las cadenas ligeras tienen dos dominios, correspondientes a la región (C) y el otro a la región (V). Las cadenas pesadas tienen cuatro dominios, uno correspondiente a la región V y tres dominios (1, 2 y 3) en la región C. El anticuerpo tiene dos brazos (siendo cada uno de los brazos una región Fab), cada uno de los cuales tiene una región VL y una región VH asociadas las unas con las otras. Es este par de regiones V (VL y VH) las que difieren de un anticuerpo a otro (debido a las variaciones en la secuencia de aminoácidos) y las que, conjuntamente, son responsables de reconocer al antígeno y de proporcionar un punto de unión a antígeno (ABS). Incluso con mayor detalle, cada una de las regiones V está compuesta de tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), separadas por cuatro regiones marco (FR). Las CDRs constituyen la parte más variable de las regiones variables y llevan a cabo la crítica función de unión a antígeno. Las regiones CDR proceden de muchas secuencias de líneas germinales potenciales, a través de un procedimiento complejo que conlleva la recombinación, la mutación y la selección.

Se ha demostrado que la función de los antígenos de unión puede ser llevada a cabo a través de fragmentos de un anticuerpo completo. Constituyen ejemplos de fragmentos de unión (i) el fragmento Fab que comprende los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que comprende los dominios variables VH y CH1: (iii) el fragmento Fv que comprende los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341: 544-546 (1989), que comprende un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas, y (vi) fragmentos F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos a través de un puente disulfuro a la región colgante.

Si bien los dos dominios del fragmento Fv son codificados a través de genes separados, se ha demostrado posible preparar un componente de unión sintético que permite que los mismos pueden ser obtenidos en forma de cadena de proteína única (conocida como cadena Fv única (scFv); Bird, R: E et al., Science 242, 423-426 (1988) Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85, 5879-5883 (1988), a través de procedimientos recombinantes. Estos fragmentos scFv fueron ensamblados a partir de genes procedentes de monoclonales que habían sido aislados previamente. En esta solicitud, los solicitantes describen un procedimiento para ensamblar fragmentos scFv procedentes de dominios VH y VL, que no forman parte de un anticuerpo que ha sido aislado previamente.

Si bien los anticuerpos monoclonales, sus fragmentos y derivados, han resultado enormemente ventajosos, existe sin embargo un número de limitaciones asociados con los mismos.

Primeramente, las aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos monoclonales producidos mediante líneas celulares inmortales humanas, representan una gran promesa para el tratamiento de una amplia diversidad de enfermedades (Clinical Applications of Monoclonal Antibodies. Editado por E.S. Lennox. British Medical Bulletin 1984. Publishers Churchill Livingstone). Desgraciadamente, las líneas celulares inmortales que producen anticuerpo resultan muy difíciles de establecer y las mismas proporcionan bajos rendimientos de anticuerpo (aproximadamente 1 \mug/ml). Por el contrario, líneas celulares de roedor equivalentes producen cantidades elevadas de anticuerpo (aproximadamente 100 \mug/ml). No obstante, la administración repetida de estas proteínas de roedor extrañas a humanos puede conducir a reacciones de hipersensibilidad dañinas, Por consiguiente, estos anticuerpos monoclonales derivados de roedor presentan un uso terapéutico limitado.

En segundo lugar, un aspecto clave en el aislamiento de anticuerpos monoclonales reside en saber cuantos diferentes clones de células productoras de anticuerpos con diferentes especificidades pueden ser establecidos y muestreados en la práctica, en comparación con los que, en teoría, necesitan ser muestreados con vistas a aislar una célula productora de anticuerpo con las características específicamente deseadas (Milstein, C., Royal Soc. Croonian Lectura, Proc. R. Soc. London B. 239; 1-16 (1990)). Por ejemplo, se considera que el número de diferentes especificidades expresado en cualquier momento por medio de linfocitos del sistema inmune es de aproximadamente 10^{7} y esto constituye tan solo una pequeña proporción del repertorio potencial de especificidades. No obstante, durante el aislamiento de una célula productora de antibiótico típica, con una especificidad deseada, el investigador es tan solo capaz de muestrear entre 10^{3} y 10^{4} especificidades individuales. El problema es peor en humanos, donde existen aproximadamente 10^{12} especificidades de linfocitos, permaneciendo la limitación de muestreo entre 10^{3} y 10^{4}.

Este problema se ha visto aliviado, en cierta medida, en animales de laboratorio, mediante la utilización de regímenes de inmunización. Así pues, cuando uno quiere producir anticuerpos monoclonales que tengan una especificidad frente a un epítope en particular, se inmuniza un animal con un inmunogen que exprese el citado epítope. El animal generará entonces una respuesta inmune frente al inmunogen y existirá una proliferación de linfocitos que presentan especificidad frente al epítope. Debido a esta proliferación de linfocitos con la especificidad deseada, su detección en el procedimiento de muestreo deviene más fácil. No obstante, este enfoque no resulta exitoso en todos los casos, dado que puede que un inmunogen no se encuentre disponible. Además, cuando uno quiere producir anticuerpos monoclonales humanos (por ejemplo, para administración terapéutica, tal y como se ha comentado anteriormente) el citado planteamiento no resulta factible desde el punto de vista práctico o ético.

En los últimos años, estos problemas han sido, en parte, tratados mediante la aplicación de procedimientos de ADN recombinante para el aislamiento y la producción de, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con capacidad de unión a antígeno, en bacterias tales como E. coli.

Esta sustitución simple de células inmortalizadas por células bacterianas como "factoría" simplifica de modo considerable los procedimientos de preparación de grandes cantidades de moléculas de unión. Además, un sistema de producción recombinante otorga espacio para producir anticuerpos y fragmentos de los mismos hechos a medida. Por ejemplo, resulta posible producir moléculas quiméricas con nuevas combinaciones de funciones de unión y efectoras, anticuerpos humanizados (por ejemplo, regiones variables murinas combinadas con dominios constantes humanos o CDRs murino-anticuerpo injertadas en humanos (FR) y nuevas moléculas para unión a antígenos. Además, la utilización de amplificación mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Saiki, R.K. et al., Science 239, 487-491 (1988)) para aislar secuencias productoras de anticuerpo procedentes de células (por ejemplo, células B e hibridomas) presenta un elevado potencial para acelerar el período de tiempo bajo el cual pueden aislarse las especificidades. Los genes VH y VL amplificados son clonados directamente en vectores para expresión en bacterias o en células de mamífero (Orlandi, R.; et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86, 3833-3837; Ward, E.S., et al., 1989 supra; Larrick, J.W., et al., 1989, Biochem Biophys. Res. Común. 160, 1250-1255; Sastry, L. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 5728-5732). Los fragmentos de anticuerpo solubles secretados a partir de bacterias son después cribados para determinar las actividades de unión.

No obstante, al igual que ocurre con el sistema de producción basado en células inmortalizadas, el sistema de producción recombinante sufre todavía los problemas de selección discutidos anteriormente y, por tanto, confía en la inmunización animal para incrementar la proporción de células con la especificidad deseada. Además, algunas de estas técnicas pueden exacerbar los problemas de cribado. Por ejemplo, grandes librerías de cadenas L y H separadas han sido producidas a partir de ratones inmunizados y combinadas conjuntamente de una manera aleatoria con anterioridad al cribado (Huse, W.D. et al., 1989, Science 246, 1275-1281, WO90/14443; WO90/14424 y WO90/14430). No obstante, la información retenida dentro de cada una de las células, a saber, el emparejamiento original de una cadena L con una cadena H, se pierde. Esto reduce algunas de las ventajas ganadas mediante la utilización de protocolos de inmunización en el animal. Actualmente, tan solo aquellas librerías que proceden de dominios VH sencillos (dAbs; Ward, E.S., et al., 1989, supra) no padecen este inconveniente. No obstante, dado que no todos los dominios de anticuerpo VH resultan capaces de unirse a antígeno, muchos de ellos tienen que ser cribados. Además, continua sin estar resuelto el problema de cribar directamente muchas especificidades diferentes en procariotas.

Así pues, existe la necesidad de disponer de un sistema de cribado que mejore o supere uno o más de los problemas mencionados anteriormente u otros problemas. El sistema ideal debería permitir la obtención de muestras de números muy elevados de especificidades (por ejemplo del orden de 10^{6} o superior); la clasificación rápida en cada una de las rondas de clonado y la rápida transferencia del material genético que codifica para la molécula de unión a partir de un estadio del proceso de producción, hacia el siguiente estadio.

Los candidatos más atractivos para este tipo de cribado serían organismos procariotas (debido a que crecen rápidamente y resultan relativamente simples de manipular y debido al gran número de clones que pueden ser creados), los cuales expresan y presentan en sus superficies un dominio de unión funcional, por ejemplo, un antibiótico, receptor, enzima, etc. En la patente del Reino Unido GB 2137631B se describen procedimientos para la co-expresión en una célula huésped única de la variable H y genes de cadena L de inmonuglobulinas. No obstante, la proteína fue expresada intracelularmente y resultaba insoluble. Además, la proteína requería un procesado amplio para generar fragmentos de anticuerpo con actividad de unión y esto generaba material con tan solo una fracción de la actividad de unión esperada para los fragmentos de anticuerpo a esta concentración. Ya se ha demostrado que los fragmentos de anticuerpo pueden ser secretados a través de membranas bacterianas, con el péptido señal adecuado (Skerra, A and Pluckthun, A. 1988 Science 240 1038-1040; Better, M et al 1988, Science 240 1041-1043), con un incremento consecuente en la actividad de unión de fragmentos de anticuerpo. Estos procedimientos requieren el cribado de clones individuales para actividad de unión de la misma manera que lo hacen los anticuerpos monoclonales de ratón.

No obstante, no se ha demostrado de que forma un dominio de unión funcional, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, receptor, enzima, etc, puede ser retenido sobre una superficie de bacteria en una configuración que permite el muestreo de digamos su propiedades de unión a antígeno y la selección de clones con propiedades deseables. En gran parte, esto es debido a que la superficie bacteriana tiene una estructura compleja, y en organismos gram-negativos existe una pared exterior que complica adicionalmente la posición. Además, no se ha demostrado que, por ejemplo, un dominio de anticuerpo se doblará correctamente cuando es expresado como una fusión con una proteína superficial de bacteria o bacteriófago.

Los bacteriófagos son organismos relacionados con procariotas atractivos para este tipo de cribado. En general, su superficie es una estructura relativamente simple, los mismos pueden ser cultivados fácilmente en grandes cantidades, presentan facilidades para la manipulación práctica, necesaria en muchos potenciales programas de cribado de masa, y los mismos pueden soportar mucha información genética para su propia síntesis en el interior de un envase sencillo, pequeño. La dificultad ha sido la de prácticamente resolver el problema de cómo utilizar los bacteriófagos de esta forma. Una solicitud de patente de Genex Corporation, nº WO88/06630, ha propuesto que el bacteriófago lambda sería un vehículo adecuado para la expresión de moléculas anticuerpo, pero no proporciona una descripción que permite que la idea general sea llevada a la práctica. Por ejemplo, el documento WO88/06630 no demuestra que ninguna secuencia: (a) haya sido expresada como una fusión con el gen V; (b) haya sido expresada sobre la superficie de lambda; y (c) haya sido expresada a los efectos de que la proteína conserve la actividad biológica. Además, no se ha descrito como cribar para determinar las fusiones adecuadas. También, dado que los viriones lambda están ensamblados dentro de la célula, la proteína de fusión sería expresada de forma intracelular y resultaría, de forma predictiva, inactiva. Bass et al., en Diciembre 1990 (después de la prioridad más antigua para la presente solicitud) describen la supresión de parte del gen III del bacteriófago filamentoso 13 y la inserción de la secuencia de codificación para la hormona del crecimiento humana (hGH) en el punto N-terminal del gen. Se demostró que la hormona del crecimiento presentada por M13 era funcional (Bass, S., et al. Proteins, Structure, Function and Genetics (1990) 8: 309-314). Una copia funcional del gen III se encontraba además siempre presente cuando se expresaba esta fusión. Una solicitud de patente a nombre de Protein Engineering Corporation, WO90/02809, propone la inserción de la secuencia de codificación para el inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI) en el gen VIII de M13. No obstante, no se demostró que la propuesta resultase operativa. Por ejemplo, no se ha demostrado la expresión de las secuencias BPTI como fusiones con proteína VIII y del despliegue sobre la superficie de M13. Además, este documento describe que cuando se lleva a cabo una fusión con el gen III, resulta necesario utilizar una segunda copia sintética del gen III, a los efectos de que algo de proteína del gen III no alterado se encuentre presente. Las realizaciones de la presente solicitud no hacen esto. En realizaciones en las cuales se rescatan los fagémidos con el fago de supresión del gen III M13K07, el gen III no modificado no se encuentra presente.

El documento WO 90/02809 describe también que fagémidos que no contienen el genoma completo de M13 y que requieren rescate a través de co-infección con fago auxiliar no resultan adecuados para estos propósitos, dado que la co-infección podría conducir a la recombinación. En la totalidad de realizaciones en las que los presentes solicitantes han utilizado fagémidos, los mismos han utilizado un fago auxiliar y las únicas secuencias que proceden de bacteriófagos filamentosos en los fagémidos constituyen el origen de replicación de las secuencias de gen III.

El documento WO 90/02809 describe también que su procedimiento necesita disponer de información tal como la secuencia de nucleótidos de la molécula de partida y su estructura tridimensional. La utilización de un repertorio pre-existente de moléculas de unión para seleccionar en búsqueda de un componente de unión, tal y como se ha descrito en el presente documento, utilizando por ejemplo un repertorio de genes de inmunoglobulina de animales, no fue descrita. Además, no discuten el abigarramiento favorecedor de sus moléculas de unión en bloques naturales de variación, tales como CDRs de inmunoglobulinas, con vistas a favorecer la generación de moléculas mejoradas y de evitar las variaciones desfavorables. El documento WO 90/02809 excluía también específicamente la aplicación de sus procedimientos a la producción de moléculas scFv.

En cada una de las patentes discutidas anteriormente (WO 88/06630 y WO 90/02809), la proteína propuesta para ser mostrada en una cadena de polipéptido Single. No existe descripción alguna acerca de un procedimiento para mostrar una molécula dímera mediante la expresión de otro monómero, como una fusión con una proteína cápsido y la otra proteína en una forma libre.

El documento WO 91/17271, citable bajo el Artículo 54(3) EPC y tan solo como beneficiario de su fecha de prioridad más antigua, describe la inserción de una proteína en una proteína de revestimiento de un bacteriófago y la utilización de técnicas de purificación por afinidad para seleccionar las partículas fago.

El documento WO 92/06204, citable también de acuerdo con el Artículo 54(3) del EPC tan solo como beneficiario de la fecha de prioridad más antigua, muestra proteínas de receptores heterómeros sobre la superficie de las células, citando bacteriófagos filamentosos como una de las realizaciones preferidas.

Otra descripción publicada en mayo de 1991 después de la fecha de prioridad más antigua para la presente solicitud) describe la inserción de M13 en el gen VIII, las secuencias de codificación para una de las dos cadenas de la parte Fab de un anticuerpo con co-expresión de la otra forma de un plásmido. Se demostró que las dos cadenas se expresaban como un fragmento Fab funcional sobre la superficie del fago (Kang A.S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 p4363-4366). No se hizo descripción alguna del punto de inserción en el gen VIII y el ensayo para determinar la actividad de unión de pAb mediante ELISA utilizó un reactivo específico para la cadena L de anticuerpo, más que para fago. Una descripción adicional publicada en marzo de 1991 (después de la fecha de prioridad más antigua para la presente solicitud) describe la inserción de un fragmento de proteína gag de virus AIDS en la parte N-terminal del gen III del bacteriófago fd. La expresión del fragmento de proteína gag fue detectada mediante procedimientos inmunológicos, pero no indicó si la proteína era expresada o no de una forma funcional (Tsunetsugu-Yokota Y et al., (1991) Gene 99 p261-265).

El problema de cómo utilizar bacteriófagos de este modo es, en realidad, difícil. La proteína tiene que ser insertada en el fago de tal forma que la integridad del revestimiento del fago no resulte socavada y la propia proteína funcional reteniendo su actividad biológica en relación con la unión a antígeno. Así pues, cuando la proteína de elección es un anticuerpo, la misma debería doblarse de forma eficaz y correctamente y ser presentada para unión a antígeno. La solución de problemas para moléculas y fragmentos de anticuerpo proporcionaría también un procedimiento general para cualquier biomolécula que es un componente de un par de unión específico, por ejemplo, moléculas receptoras y enzimas.

De forma sorprendente, los solicitantes han sido capaces de construir un bacteriófago que expresa y presenta en su superficie una gran molécula de unión biológicamente funcional (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo y enzimas y receptores), la cual permanece intacta e infecciosa. Los solicitantes han denominado a la estructura que comprende una partícula vírica y una molécula de unión mostrada en la superficie vírica un "envase". Cuando la molécula de unión es un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento o un dominio que resulta homólogo a un dominio de inmunoglobulina, los solicitantes denominan al envase como un "anticuerpo fago" (pAb).No obstante, excepto cuando del contexto de entienda lo contrario, cuando el término anticuerpo fago se utiliza en sentido general, el mismo debe ser también interpretado como referido a un envase que comprende una partícula vírica y una molécula de unión mostrada en la superficie vírica.

Los pABs presentan una amplia variedad de aplicaciones en la selección de genes de anticuerpos que codifican para actividades de unión a antígeno. Por ejemplo, pAbs podría ser utilizado para clonar y rescatar hibridomas (Orlando, R., (1989) PNAS 86 p3833 y en el cribado de grandes librerías combinatorias (tales como las encontradas en Huse, W.D. et al., 1989, Science 246, 1275-1281). En particular, rondas de selección utilizando pAbs pueden contribuir a rescatar los anticuerpos de afinidad más elevada de las librerías últimas. Puede resultar preferible cribar librerías pequeñas que proceden de células seleccionadas para antígeno (Casali, P., et al., (1986) Science 234 p476-479), para rescatar los pares VH/VL que comprenden la región Fv de un anticuerpo. La utilización de pAbs puede también permitir la construcción de anticuerpos enteramente sintéticos. Además, pueden prepararse anticuerpos, los cuales disponen de algunas secuencias sintéticas, por ejemplo CDRs, y algunas secuencias de origen natural. Por ejemplo, repertorios de genes V pudieron ser obtenidos in vitro mediante la combinación de genes no reordenados V con segmentos D y J. Librerías de pAbs pudieron entonces ser seleccionadas mediante la unión a antígeno, hipermutadas in vitro, en los bucles de unión a antígeno o regiones de dominio marco V y sometidas a nuevas rondas de selección de
mutagénesis.

Tal y como se ha discutido anteriormente, las librerías de cadena L y de cadena H separadas pierden el emparejamiento original entre las cadenas. Resulta difícil preparar y cribar una librería lo suficientemente grande para una combinación particularmente ventajosa de cadenas L y H.

Por ejemplo, en un ratón existen aproximadamente 10^{7} posibles cadenas H y 10^{7} posibles cadenas L. Por lo tanto, existen 10^{14} posibles combinaciones de cadenas L y H y para comprobar un número similar de combinaciones se debería crear y cribar una librería de aproximadamente 10^{14} clones. Ello no se había contemplado con anterioridad como una posibilidad práctica.

La presente invención proporciona un número de planteamientos que mejoran este problema.

En un primer planteamiento, (un planteamiento combinatorio aleatorio, ver los ejemplos 16 y 17), se crea una librería lo más grande posible, la cual expresa tantas de las 10^{14} potenciales combinaciones como resulte posible. No obstante, en virtud de la expresión de las cadenas L y H sobre la superficie del fago, resulta razonablemente practicable seleccionar la combinación deseada a partir de la totalidad de las combinaciones generadas, mediante técnicas de afinidad (ver más adelante para la descripción de los formatos de selección).

En un segundo planteamiento (denominado planteamiento de combinación dual, por parte de los presentes solicitantes, ver ejemplo 22) se crea una gran librería, a partir de dos librerías más pequeñas, para la selección de la combinación deseada. Ello mejora los problemas todavía más. El planteamiento conlleva la creación de: (i) a primera librería de, digamos 10^{7}, por ejemplo, cadenas H que se muestran sobre un bacteriófago (como una fusión con la proteína codificada por el gen III), que es resistente a, por ejemplo, tetraciclina; y (ii) una segunda librería de, digamos 10^{7}, por ejemplo cadenas L, en las cuales las secuencias de codificación para estas cadenas ligeras se encuentran dentro de un vector plásmido que contiene un origen de replicación para un bacteriófago (un fagémido) que es resistente a, por ejemplo, ampicilina (a saber, un antibiótico diferente) y son expresadas en el espacio periplásmico de una bacteria perdida. La primera librería es después utilizada para infectar las bacterias que contiene la segunda librería, para proporcionar 10^{14} combinaciones de cadenas H y L sobre la superficie del fago resultante en el sobrenadante bacteriano.

La ventaja de este planteamiento reside en que se crean dos librerías separadas, de por ejemplo 10^{7}, con vistas a producir 10^{14} combinaciones. La creación de una librería de 10^{7} constituye una posibilidad práctica.

Las 10^{14} combinaciones son después sometidas a selección (ver más adelante para la descripción de los formatos de selección), tal y como se describe en la presente solicitud. Esta selección generará, después, una población de fagos que muestra una combinación particular de cadenas H y L que presentan la especificidad deseada. No obstante, los fagos seleccionados contendrán únicamente ADN que codifica para un socio de la cadenas H y L emparejadas (procedente o bien del fago o del fagémido). El eluido de muestra que contiene la población es después dividido en dos partes. Una primera parte es cultivada sobre, por ejemplo placas de tetraciclina, para seleccionar aquellos bacteriófagos que contienen el ADN que codifica para cadenas H, las cuales están involucradas en la unión a antígeno deseada. Una segunda parte es cultivada sobre, por ejemplo, placas de ampicilina, para seleccionar aquellos bacteriófagos que contienen el ADN fagémido que codifica para cadenas L, las cuales están involucradas en la unión con el antígeno deseado. Para infectar colonias específicas, procedentes por ejemplo de las placas de ampicilina, se utiliza un juego de colonias procedente de clones aislados individualmente, por ejemplo, procedentes de las placas de tetraciclina. Ello se traduce en que el bacteriófago expresa combinaciones específicas de cadenas H y L, las cuales pueden ser después ser sometidas a ensayo para determinar la unión a antígeno.

En un tercer planteamiento (denominado un planteamiento de combinación dual jerárquica, por parte de los presentes solicitantes), una colonia individual procedente o bien de clon de cadena L o de cadena H, seleccionada mediante crecimiento sobre placas de antibiótico, se utiliza para infectar una librería completa de clones que codifican para la otra cadena (H ó L). La selección se efectúa tal y como se describe anteriormente. Esto favorece el aislamiento de la combinación más favorable.

En un cuarto planteamiento (denominado planteamiento jerárquico por parte de los presente solicitantes, ver ejemplos 18 y 36), ambas cadenas son clonadas en el mismo vector No obstante, una de las cadenas, en relación con la cual se tiene conocimiento de que posee las propiedades deseables, es mantenida fija. Una librería de la cadena complementaria es insertada en el mismo vector. Los socios adecuados para la cadena fijada son seleccionados después de la presentación sobre la superficie del bacteriófago.

En un quinto planteamiento (ver ejemplo 38), para mejorar las oportunidades de recuperar los pares originales, puede reducirse la complejidad de las librerías combinatorias utilizando pequeñas poblaciones B de linfocitos B seleccionados para unión a un antígeno deseado. Las células proporcionan, por ejemplo, mARN o ADN, para la preparación de librerías de genes de anticuerpo para ser presentadas sobre el fago. Esta técnica puede ser utilizada en combinación con los cuatro planteamientos mencionados anteriormente, en la búsqueda de la selección de especificidades para anticuerpos.

Los fagémidos han sido mencionados anteriormente. Los solicitantes han entendido y demostrado que, en muchos casos, los fagémidos resultarán preferidos a los fagos para el clonado de los anticuerpos, dado que son más fáciles de utilizar para generar más librerías completas del repertorio inmune. Ello es debido a que el ADN fagémido es aproximadamente 100 veces más eficaz que el ADN bacteriófago en las bacterias transformantes (ver ejemplo 15). Asimismo, la utilización de fagémidos proporciona la capacidad de variar el número de proteínas de fusión con moléculas de unión a gen III presentadas sobre la superficie del bacteriófago (ver ejemplo 13). Por ejemplo, en un sistema que comprende una célula bacteriana que contiene un fagémido que codifica para una proteína de fusión del gen III e infectada por un fago auxiliar, la inducción de la expresión de la proteína de fusión del gen III a diferentes extensiones determinará el número de proteínas de fusión de gen III presentes en el espacio definido entre las membranas bacterianas interior y exterior, después de la superinfección. Ello determinará la relación de proteína de fusión de gen III en relación con la proteína de gen III de origen natural presentada por parte del fago ensamblado.

La expresión de una proteína de fusión única por virión puede contribuir a la selección de especificidades de anticuerpo en base a la afinidad, evitando el efecto "avidez", cuando un fago que expresa dos copias de anticuerpo de baja afinidad tuviera, aparentemente, la misma afinidad que un fago que expresa una copia del anticuerpo de afinidad más elevada. No obstante, en algunos casos, resultará importante presentar la totalidad de moléculas del gen III derivado mediante superinfección de células que contienen fagémidos para efectuar fusiones (por ejemplo, para selección de moléculas de unión a baja afinidad o mejorar la sensibilidad de ELISA). Una vía para hacer esto reside en superinfectar con un bacteriófago que contiene un gen III defectuoso. Los solicitantes han desarrollado, por tanto, un fago que es suprimido en el gen III. Esto es completamente nuevo.

La demostración de que un dominio de unión a antígeno funcional puede ser presentado sobre la superficie del fago tiene implicaciones que van más allá de la construcción de nuevos anticuerpos. Por ejemplo, si pueden presentarse otros dominios proteínicos en la superficie del fago, podrían utilizarse vectores fago para clonar y seleccionar genes, en base a las propiedades de unión de la proteína expuesta. Además, variantes de proteínas, incluyendo librerías de epítope construidas sobre la superficie de la proteína, podrían ser obtenidas y seleccionadas de forma rápida, para determinar actividades de unión. En efecto, otras arquitecturas de proteína podrían servir como anticuerpos "nuevos".

La técnica proporciona la posibilidad de construir anticuerpos a partir de primeros principios, sacando ventaja del marco estructural sobre el cual los bucles de unión a antígeno se doblan, teniendo estos bucles un número limitado de conformaciones que generan una diversidad de puntos de unión mediante combinaciones de bucle alternativas y mediante diversas cadenas laterales. Éxitos recientes en el modelado de puntos de unión a antígeno auguran favorables posibilidades para el diseño de novo. En cualquier caso, se necesita una estructura de elevada resolución del antígeno. No obstante, el planteamiento resulta atractivo para preparar, por ejemplo, anticuerpos catalíticos, particularmente para sustratos pequeños. Aquí podrían introducirse cadenas laterales o puntos de unión para grupos prostéticos, no tal solo para unión selectiva al estado de transición del sustrato sino también para participar directamente en la creación y en la rotura de enlaces. La única cuestión reside en saber si la arquitectura del anticuerpo, especializada para la unión, constituye el mejor punto de partida para la unión con catalizadores. Las arquitecturas de enzima genuinas, tales como el barril de triosa fosfato isomerasa (TIM), podrían resultar más adecuadas. Al igual que los anticuerpos, los enzimas TIM presentan también una estructura marco (un barril de hebras \beta y de hélices \alpha) y bucles para unión a sustrato. Muchos enzimas con una diversidad de propiedades catalíticas están basados en esta arquitectura y los bucles podrían ser manipulados de forma independiente sobre los marcos para diseñar nuevas propiedades catalíticas y de unión. El sistema de selección de fago proporcionado por la presente descripción puede ser utilizado para seleccionar actividades de unión a antígeno y los bucles de CDR seleccionados de este modo utilizados o bien sobre un marco de anticuerpo o sobre un marco de barril TIM. Los bucles colocados sobre, por ejemplo, un marco de barril TIM podían ser modificados adicionalmente mediante mutagénesis y sometidos a una nueva selección. Así pues, no hay necesidad de seleccionar actividades de unión de elevada afinidad en un paso único. La estrategia del sistema inmune, en el cual la baja afinidad evoluciona hacia elevada afinidad, parece más realista y puede ser imitada utilizando esta invención.

Si bien a lo largo de esta solicitud los solicitantes discuten la posibilidad de cribar en búsqueda de variantes de pAbs de afinidad más elevada, ellos reconocen que, en algunas aplicaciones, por ejemplo, en cromatografía de baja afinidad (Ohlson, S. et al., Anal. Biochem. 169, p204-208 (1988)), puede resultar aconsejable aislar variantes de más baja afinidad.

Los ejemplos 17 y 19 muestran que la presente invención proporciona un camino para la producción de anticuerpos con afinidades bajas (tal y como se ha observado en la respuesta inmune primaria o en animales inmunizados). Ello ha resultado posible mediante la presentación de múltiples copias de anticuerpo sobre la superficie del fago, en asociación con la proteína del gen III. Así pues, pAbs permite que los genes para estos anticuerpos sean aislados y, si ello resulta necesario, mutados, para proporcionar anticuerpos mejorados.

Los pAbs permiten también la selección de anticuerpos para estabilidad mejorada. Se ha observado que para muchos anticuerpos, el rendimiento y la estabilidad resultan mejoradas cuando los anticuerpos se expresan a 30ºC más que a 37ºC. Si los pAbs se presentan a 37ºC, tan solo aquellos que sean estables estarán disponibles para la selección por afinidad. Cuando los anticuerpos tienen que ser utilizados in vivo, para usos terapéuticos o de diagnosis, la estabilidad incrementada extendería la semi-vida de los anticuerpos en circulación.

Resultará a menudo necesario incrementar la diversidad de una población de genes clonados para la presentación de sus proteínas sobre fagos o para mutar una secuencia de nucleótido individual. Si bien podían utilizarse técnicas de mutagénesis in vitro o in vivo para el citado propósito, un procedimiento particularmente adecuado pasaría por utilizar cepas mutadoras. Una cepa mutadora es una cepa que contiene un defecto genético que provoca que el ADN replicado dentro de la misma resulte mutado con relación a su ADN padre. Por lo tanto, si una población de genes, como fusiones de gen III, es introducida en estas cepas resultará después diversificada adicionalmente y podrá ser transferida después a una cepa no mutadora, si se desea, para presentación y selección. El ejemplo 29 cubre la utilización de cepas mutadoras con anticuerpos fago (un ejemplo de mutagénesis y selección de anticuerpos fago in vitro es proporcionado en el ejemplo 35).

Transferencia genética dirigida a objetivo

Un nuevo y útil conjunto de aplicaciones hace uso de la proteína de unión sobre el fago, para dirigir el genoma del fago hacia una célula en particular o hacia un grupo de células. Por ejemplo, un pAb específico para una molécula de superficie celular podía ser utilizado para unión con la célula objetivo a través de la molécula superficial. El fago podía ser después internalizado, ya sea a través de la acción del propio receptor o como resultado de otro acontecimiento (por ejemplo, una descarga eléctrica, tal como ocurre en la técnica de electroporación). El genoma del fago sería entonces expresado si las señales de control relevantes para transcripción y traducción y posiblemente replicación) estuvieran presentes. Esto resultaría particularmente útil si el genoma del fago contuviera una secuencia cuya expresión fuera deseada en la célula objetivo junto con las secuencias de control de expresión apropiadas). Una secuencia útil podría conferir resistencia antibiótica a la célula receptora o marcar la célula mediante la expresión de su producto (por ejemplo, si la secuencia expresara un producto genético detectable, tal como una luciferasa, ver White, M. et al. Techniques 2(4), p194-201 (1990)), o confiriera una propiedad particular sobre la célula objetivo (por ejemplo, si la célula objetivo fuera una célula tumoral y la nueva secuencia dirigiera la expresión de un gen supresor de tumor), o expresara una construcción antisentido diseñada para suprimir un gen o un conjunto de genes en la célula objetivo, o un gen o un producto genético diseñado para que resulte tóxico para la célula objetivo.

Alternativamente, la secuencia cuya expresión se desea en la célula objetivo puede ser codificada sobre un fagémido. El ADN del fagémido puede ser después incorporado en un fago que presentase un anticuerpo específico para un receptor de superficie celular. Por ejemplo, la incorporación puede producirse mediante superinfección de bacterias que contienen el fagémido, con un fago auxiliar cuyo genoma codifica para el fragmento de anticuerpo específico para la célula objetivo. El envase es después utilizado para dirigir el fagémido hacia la célula objetivo.

Esta técnica de "transferencia genética dirigida a objetivo" presenta un determinado número de usos en investigación y también en terapia y en diagnóstico. Por ejemplo, la terapia genética intenta, a menudo, dirigir el gen de sustitución hacia un tipo específico de célula que es deficiente en su actividad. La dirección hacia objetivo de pAbs proporciona un medio para lograr esto.

En diagnóstico, se han utilizado fagos específicos para bacterias particulares o grupos de bacterias, para ser dirigidos hacia genes marcadores, por ejemplo luciferasa para el huésped bacteriano (ver, por ejemplo, Utilzer, S., and Kuhn, J., EPA 85303913.9). Si el rango de hospitalidad del gen es adecuado, tan solo aquellas bacterias que estén siendo objeto de comprobación resultarán infectadas por el fago, expresarán el gen de luciferasa y serán detectadas por la luz que emitan. Este sistema ha sido utilizado para detectar la presencia de Salmonella. Un problema importante con este planteamiento es el aislamiento inicial de un bacteriófago con la banda de hospitalidad correcta y después el clonado de un casette de gen de luciferasa en el fago, de tal modo que el mismo resulte funcional. El sistema pAb permite que el casette de luciferasa sea clonado en forma de un sistema bien caracterizado (fago filamentosos) y permite la selección simple de una banda de hospitalidad apropiada, mediante la modificación de la especificidad del anticuerpo (u otra molécula de unión) que es codificada por pAb.

Los presentes solicitantes han sido también capaces de desarrollar nuevos sistemas de selección y formatos de ensayo que dependen de las propiedades únicas de estos pAbs.

Terminología

La mayor parte de la terminología utilizada en esta sección ha sido mencionada en el texto, cuando ha resultado apropiado

Par de unión específico

Este describe un par de moléculas (cada una de ellas siendo un componente de un par de unión específico), las cuales son de origen natural o son producidas de forma sintética. Uno de los pares de moléculas presenta un área sobre su superficie o una cavidad para unión específica y es por ello definida como complementaria con una organización polar y espacial particular de la otra molécula, por lo que el par presenta la propiedad de unión específica de la una con la otra. Entre los ejemplos de pares de unión específicos se mencionan antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando, enzima-sustrato, 1gG-proteína A.

Componente multímero

Este describe un primer polipéptido que se asociará al menos con un segundo polipéptido cuando los polipéptidos son expresados en forma libre y/o sobre la superficie de un sustrato. El sustrato puede ser proporcionado por un bacteriófago. Cuando se dispone de dos bacteriófagos asociados, el complejo polipéptido asociado es un dímero, si hay tres es un trímero, etc. El componente dímero, prímero, multímero, etc puede comprender un componente de un par de unión específico.

Entre los ejemplos de componentes multímeros se encuentran los dominios basados en una molécula de inmunoglobulina, los dominios ligeros basados en una molécula de inmunoglobulina, las sub-unidades de receptores de células T.

Envase

Este describe una partícula de bacteriófago filamentoso en la que la partícula presenta un componente de un par de unión específico en su superficie. El envase es un bacteriófago que presenta un dominio de unión a antígeno en su superficie. En tipo de envase ha sido denominado un anticuerpo fago (pAb).

Anticuerpo

Este describe una inmunoglobulina, ya sea obtenida de forma natural o parcial o completamente sintética. El término cubre también cualquier proteína que tiene un dominio de unión que es homólogo a un dominio de unión a inmunoglobulina. Estas proteínas pueden ser obtenidas a partir de fuentes de origen natural o parcial o totalmente sintéticas.

Los ejemplos de anticuerpos son los isótopos de inmunoglobulina y los fragmentos Fab, F(ab^{1})_{2}, scFv, Fv, dAb, y Fd.

Superfamilia de inmunoglobulinas

Esta describe una familia de polipéptidos, cuyos componentes tienen al menos un dominio con una estructura relacionada con la del dominio variable o constante de moléculas de inmunoglobulina. El dominio contiene dos láminas \beta y habitualmente un enlace disulfuro conservado (ver A.F. Williams and A.N. Barclay 1988 Ann. Rev. Immunol. 6 381-405).

Los componentes ejemplo de una superfamilia de inmunoglobulinas son CD4, receptores del factor de crecimiento derivados de plaqueta (PDGFR), moléculas de adhesión intracelular (ICAM). Salvo cuando del contexto se derive lo contrario, la referencia a inmunoglobulinas y a homólogos de inmunoglobulina en esta solicitud incluye componentes de la superfamilia de inmunoglobulinas y sus homólogos.

Homólogos

Este término indica polipéptidos que tienen los mismos restos o restos conservados en una posición correspondiente es su estructura primaria, secundaria o terciaria. El término también se extiende a dos o más secuencias de nucleótido que codifican para polipéptidos homólogos.

Los isótopos de inmunoglobulina son ejemplos de péptidos homólogos.

Funcional

En relación a un componente sbp presentado sobre la superficie de una partícula de bacteriófago filamentoso, significa que el componente sbp es presentado en forma doblada, en la cual su dominio de unión específico por su complementariedad con el componente sbp es el mismo, o su análogo próximo, a su configuración de origen natural, por lo que muestra especificidad similar con respecto al componente sbp complementario. En este sentido, el mismo difiere de los péptidos de Smith et al., supra, los cuales no tienen una configuración doblada definida y pueden asumir una variedad
de configuraciones, determinadas por los componentes complementarios con los cuales pueden estar conectados.

Población genéticamente diversa

En relación con componentes sbp o sus componentes de polipéptido, este término se refiere no tan solo a la diversidad que puede existir en la población natural de células u organismos, sino también a la diversidad que puede ser creada mediante mutación artificial in vitro o in vivo.

La mutación in vitro puede, por ejemplo, conllevar mutagénesis aleatoria utilizando oligonucleótidos que tienen mutaciones aleatorias de la secuencia que se desea variar. La mutagénesis in vivo puede, por ejemplo, utilizar cepas mutadoras de microorganismos huésped para albergar el ADN (ver Ejemplo 38, más adelante).

Dominio

Un dominio es una parte de una proteína que está doblada dentro de si misma e independiente de otras partes de la misma proteína e independientemente de un componente de unión complementario.

Unidad doblada

Esta es una combinación específica de una hélice \alpha y/o de una hebra \beta y/o de una estructura girada \beta. Los dominios y las unidades dobladas contienen estructuras que reúnen aminoácidos que no son adyacentes en la estructura primaria.

Forma libre

Esta describe el estado de un polipéptido que no es presentado por un envase de presentación genética replicable.

Defectuoso condicionalmente

Describe un gen que no expresa un polipéptido en particular, bajo un determinado conjunto de condiciones, pero si lo expresa bajo otro conjunto de condiciones. Constituye un ejemplo un gen que contiene una mutación ámbar expresada, respectivamente, en huéspedes supresores o no supresores.

Alternativamente, un gen puede expresar una proteína que sea defectuosa bajo un conjunto de condiciones pero no bajo otro conjunto. Constituye un ejemplo, un gen con una mutación sensible a la temperatura.

Codón de finalización traslacional suprimible

Describe un codón que permite la traducción de secuencias de nucleótido aguas abajo del codón, bajo un conjunto de condiciones, pero bajo otro conjunto de condiciones la traducción finaliza en el codón. Constituyen ejemplos de codones de finalización traslacional suprimibles los codones ámbar, ocre y ópalo.

Cepa mutadora

Es una célula huésped que tiene un defecto genético que provoca que el ADN replicado en su interior mute en relación con su ADN padre. Las cepas NR9046mutD5 y NR9046mutT1 son ejemplos de cepas mutadoras (ver

\hbox{Ejemplo 38).}

Fago auxiliar

Este es un fago que se utiliza para infectar células que contienen un genoma de fago defectuoso y que funciona para complementar el defecto. El genoma de fago defectuoso puede ser un fagémido o un fago con alguna función que codifica para las secuencias genéticas eliminadas. Constituyen ejemplos de fagos auxiliares los M13K07, M13K07 gen III no 3 y los fagos que presentan o codifican para una molécula de unión fusionada con una proteína cápsido.

Vector

Se trata de una molécula de ADN, capaz de replicación en un organismo huésped, en cuyo interior se inserta un gen para construir una molécula de ADN recombinante.

Vector fago

Se trata de un vector que procede de una modificación de un genoma de fago, que contiene un origen de replicación para un bacteriófago pero no para un plásmido.

Vector fagémido

Es un vector obtenido por modificación de un genoma de plásmido, que contiene un origen de replicación para un bacteriófago, al igual que el plásmido origen de replicación.

Secretado

Describe una partícula o molécula de bacteriófago asociada con el componente de un sbp presentado sobre la partícula de bacteriófago, en la que el componente sbp y/o la molécula han sido doblados y el envase ensamblado externamente al citosol celular.

Repertorio de genes de inmunoglobulina reordenados

Una colección de nucleótidos de origen natural, por ejemplo secuencias de ADN que codificaban para genes de inmunoglobulina expresados en un animal. Las secuencias son generadas por medio de la reordenación in vivo de, por ejemplo, segmentos V, D y J para cadenas H y, por ejemplo, segmentos V y J para cadenas L. Alternativamente, las secuencias pueden ser generadas a partir de una línea celular inmunizada in vitro en la cual la reordenación, como respuesta frente a inmunización, se produce intracelularmente.

Librería

Una colección de secuencias de nucleótidos, por ejemplo ADN, dentro de clones.

Repertorio de genes de inmunoglobulina reordenados artificialmente

Una colección de secuencias de nucleótidos, por ejemplo NA, derivada total o parcialmente de una fuente diferente a la de las secuencias de inmunoglobulina reordenadas, procedentes de un animal. Esto puede incluir, por ejemplo, secuencias de ADN que codifican para dominios VH, mediante la combinación de segmentos V no reordenados con segmentos D y J y secuencias de ADN que codifican para dominios VL, mediante la combinación de segmentos
V y J.

Parte de las secuencias de ADN pueden ser derivadas por medio de síntesis de oligonucleótidos.

Péptido líder secretor

Se trata de una secuencia de aminoácidos unida al extremo N Terminal de un polipéptido y que dirige el movimiento del polipéptido fuera del citosol.

Eluyente

Es una solución utilizada para romper la unión entre dos moléculas. La unión puede ser un enlace(s) covalente o no covalente. Las dos moléculas pueden ser componentes de un sbp.

Derivado

Es una sustancia que deriva de un polipéptido que es codificado por el ADN dentro de una partícula de bacteriófago seleccionada. El derivado polipéptido puede diferir del polipéptido codificado por la adición, supresión, sustitución, o inserción de aminoácidos o a través de la unión de otras moléculas al polipéptido codificado. Estos cambios pueden ser efectuados a nivel de nucleótido o de proteína. Por ejemplo, el polipéptido codificado puede ser un fragmento Fab que es después unido a una cola Fc procedente de otra fuente. Alternativamente, marcadores tales como enzimas, fluoresceínas, etc, pueden ser unidos a, por ejemplo, fragmentos Fab, scFv.

La presente invención proporciona un procedimiento para producir una partícula de bacteriófago filamentoso que presenta en su superficie una molécula de unión específica para un epítope o antígeno objetivo particular, comprendiendo dicho procedimiento los pasos de:

: producir una población de partículas de bacteriófago filamentoso que presentan es sus superficies una población de moléculas de unión que tienen una banda de especificidades de unión, en donde las moléculas de unión son moléculas de anticuerpo Fab capaces de unirse a un epítope objetivo o a un antígeno, y en donde cada una de las partículas de bacteriófago filamentoso contiene un vector fago que comprende ácido nucleico que codifica para la molécula de unión expresada a partir del ácido nucleico y presentada por la partícula en su superficie, en donde el ácido nucleico que codifica para las moléculas de unión en la población se obtiene mediante la combinación, in vitro, de segmentos V no reordenados con segmentos D y J o derivados por medio de mutagénesis in vitro de una secuencia de codificación de anticuerpo existente, y/o en donde la cadena pesada de cada una de las moléculas de anticuerpo Fab presentada por la partícula en su superficie es expresada como una fusión con una proteína de gen III del bacteriófago filamentoso;

: seleccionar una partícula de bacteriófago filamentoso que presenta una molécula de unión con una especificidad deseada, mediante la puesta en contacto de la población de partículas de bacteriófago filamentoso con un epítope objetivo o un antígeno, a los efectos de que las moléculas de unión individuales presentadas sobre las partículas de bacteriófago filamentoso con la especificidad deseada se unan al citado epítope o antígeno objetivo.

El procedimiento puede comprender, adicionalmente, (i) la separación de las partículas de bacteriófago filamentoso del epítope objetivo o del antígeno. El procedimiento puede comprender, adicionalmente, (ii) la recuperación de las partículas de bacteriófago filamentoso que presentan una molécula de unión con la especificidad deseada. El procedimiento puede comprender, adicionalmente, (iii) aislar ácido nucleico que codifica para la molécula de unión a partir de partículas de bacteriófago filamentoso, someter el ácido nucleico a hipermutación en bucle de unión a antígeno, para proporcionar ácido nucleico que codifica para una población adicional de moléculas de unión, las cuales son después sometidas a nuevas rondas de selección y mutagénesis, que comprenden nueva aplicación del procedimiento presentado en el párrafo precedente. La presente invención proporciona también un procedimiento para la producción de una molécula de unión específica para un epítope o antígeno particular, comprendiendo dicho
procedimiento:

: llevar a cabo el procedimiento, tal y como se ha presentado en el párrafo precedente, e incluir los pasos (i) y (ii) mencionados anteriormente y, opcionalmente, el (iii);

: aislar, a partir de las partículas de bacteriófago filamentoso separadas, recuperadas de este modo, el ácido nucleico que codifica para la molécula de unión;

: insertar ácido nucleico que codifica para la molécula de unión o un fragmento o derivado de la misma con especificidad de unión para el epítope objetivo o un antígeno, en un sistema recombinante y producir la molécula de unión, o fragmento o derivado de la misma, con especificidad de unión para el epítope objetivo o antígeno, en el sistema recombinante separado de las partículas de bacteriófago filamentoso.

La presente invención proporciona además una partícula de bacteriófago filamentoso que presenta en su superficie una molécula de unión que es una molécula de anticuerpo Fab que comprende un dominio de unión capaz de unirse a antígeno o epítope objetivo, conteniendo la partícula un vector fago que comprende ácido nucleico que codifica para la molécula de unión expresada a partir del ácido nucleico mostrado por la partícula en su superficie, en donde la cadena pesada de cada una de las moléculas de anticuerpo Fab presentadas por una partícula en su superficie es expresada como una fusión con una proteína del gen III del bacteriófago filamentoso. Se proporciona también una población de las citadas partículas de bacteriófago filamentoso que presentan una población de las citadas moléculas de unión que tienen una banda de especificidades de unión.

La proteína cápsido puede estar ausente, ser defectuosa o condicionalmente defectuosa en el fago auxiliar.

La célula huésped puede ser una cepa mutadora que introduce diversidad genética en el ácido nucleico componente sbp.

El huésped puede ser una bacteria, y el citado componente de la partícula de bacteriófago filamentoso una proteína cápsido para el bacteriófago. El fago puede ser seleccionado a partir de fagos de clase I, M13, f1, lf1, Ike, ZJ/Z, Ff y los fagos de clase II, Xf, Pf1 y Pf3. El fago puede ser fd o un derivado de fd. El derivado puede ser resistente a tetraciclina. El citado componente sbp o la cadena de polipéptido de la misma puede ser expresado como una fusión con la proteína cápsido de gen III de fago fd o su contrapartida en otro fago filamentoso. El componente sbp o su cadena de polipéptido puede ser insertado en la región N Terminal de la proteína cápsido madura aguas debajo de un péptido líder secretor. La secuencia puede ser insertada después del aminoácido +1 de la proteína madura. El punto de inserción puede estar flanqueado por secuencias cortas que corresponden a secuencias que ocurren en cada uno de los extremos del ácido nucleico que tiene que ser insertado. Por ejemplo, cuando el dominio de proteína es un dominio de inmunoglobulina, el punto de inserción en el fago puede ser flanqueado por secuencias de nucleótido que codifican para los cinco primeros aminoácidos y los cinco últimos aminoácidos del dominio Ig. Las citadas secuencias de nucleótido flanqueantes se muestran en la figura 4(2) B y C, en donde las secuencias de nucleótido que flanquean al punto codifican para secuencias de aminoácidos QVQLQ y VTVSS, que ocurren en cualquier extremo del dominio VH o QVQLQ y LEIKR, que ocurren en cualquier extremo del dominio Fv (VH + VL combinados). Cada una de estas secuencias que flanquean el punto de inserción puede incluir un punto de rotura adecuado, tal y como se muestra en la Figura 4.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos flanqueantes mostradas en las figuras 4(2)B y C, tal y como se ha descrito anteriormente, pueden ser utilizadas para flanquear el punto de inserción para cualquier ácido nucleico que tenga que ser insertado, codifique o no el citado ácido nucleico para una inmunoglobulina.

El huésped puede ser E. coli.

El ácido nucleico que codifica para un polipéptido componente sbp puede estar unido aguas abajo a una proteína cápsida vírica, a través de un codón de finalización traslacional suprimible.

En un procedimiento para la producción de una molécula de unión, tal y como se ha definido anteriormente, la secuencia genética que codifica para la molécula de unión de especificidad deseada es separada de una población general de partículas de bacteriófagos filamentosos que tienen una banda de especificidades, por el hecho de su unión a un objetivo específico (por ejemplo al antígeno o epítope). Así pues, la partícula de bacteriófago filamentoso formada a través de la citada expresión puede ser seleccionada o cribada para proporcionar un componente sbp individual o una población mezclada seleccionada de los citados componentes sbp asociados en sus respectivas partículas de bacteriófago filamentoso con ácido nucleico que codifica para el citado componente sbp o una de sus cadenas de polipéptidos. La partícula de bacteriófago filamentoso puede ser seleccionada por afinidad con un componente complementario al citado componente sbp.

Cualquier partícula de bacteriófago filamentoso unida al citado segundo componente puede ser recuperada mediante lavado con un eluyente. Las condiciones de lavado pueden ser variadas, con vistas a obtener partículas de bacteriófagos filamentosos con diferentes afinidades de unión para el citado epítope. Alternativamente, para obtener, por ejemplo, partículas de bacteriófago filamentoso de elevada afinidad, el componente complementario (por ejemplo, un epítope) puede ser presentado a la población de partículas de bacteriófagos filamentosos (pAbs) ya unida a un componente de unión, en cuyo caso, el pAbs con una afinidad más elevada para el epítope desplazará al componente de unión ya unido. Así pues, el eluyente puede contener una molécula que compite con la citada partícula de bacteriófago filamentoso para su unión al componente sbp complementario. La partícula de bacteriófago filamentoso puede ser aplicada al citado componente sbp complementario, en presencia de una molécula que compite con el citado envase para la unión al citado componente sbp complementario. Para expresar el citado componente sbp o un fragmento o derivado del mismo en un organismo huésped recombinante puede utilizarse ácido nucleico procedente de una o más partículas de bacteriófago filamentoso. El ácido nucleico procedente de una o más partículas de bacteriófago filamentoso puede ser tomado y utilizado para codificar para ácido nucleico nuevamente en el citado procedimiento, con vistas a obtener un componente sbp individual o una población mezclada de componentes sbp, o para que codifique para ácido nucleico. El producto final de expresión puede ser modificado para producir uno de sus derivados.

El producto final de expresión o uno de sus derivados puede ser utilizado para preparar un medicamento terapéutico o profiláctico o un producto de diagnóstico.

La presente invención puede utilizar un fago auxiliar cuyo genoma carezca de ácido nucleico que codifique para uno de sus proteínas cápsido o cuyo ácido nucleico codificante para la misma sea condicionalmente defectuoso o codifique para la citada proteína cápsido de una forma defectuosa o condicionalmente defectuosa.

La presente invención puede utilizar una célula huésped bacteriana que contiene un genoma de fago filamentoso defectuoso para una proteína cápsido y en el que la célula huésped es capaz de expresar la proteína cápsido que complementa el citado defecto, de tal forma que las partículas de fago infeccioso pueden ser obtenidas a partir del mismo. La proteína de cápsido defectuosa puede ser expresada en el citado huésped a partir de otro vector contenido en el mismo. La proteína de cápsido defectuosa puede ser el gen III del fago fd o su contrapartida en otro fago filamentoso.

La presente invención puede utilizar E. coli TG1 M13K07 gIII No.3 (NCTC 12478) recombinante.

La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de moléculas de unión, fragmentos y derivados de las mismas. Los derivados pueden comprender componentes de los pares de unión específicos fusionados con otra molécula, tal como un enzima o una cola Fc.

La invención puede utilizar kits para llevar a cabo los procedimientos descritos en este documento. Los kits incluirán los vectores necesarios. Uno de los citados vectores tendrá habitualmente un origen de replicación para bacteriófagos de hebra única y contendrá o bien el ácido nucleico componente sbp o tendrá un punto de restricción para su inserción en la región Terminal 5’ de la secuencia de codificación madura de una proteína cápsido fago y con una secuencia de codificación líder secretora aguas arriba del citado punto, la cual dirige una fusión del polipéptido exógeno de proteína de cápsido hacia el espacio periplásmico.

Los puntos de restricción en los vectores son preferiblemente los de enzimas que cortan tan solo raramente las secuencias de codificación de proteínas.

El kit incluye preferiblemente un vector fagémido que puede tener las características mencionadas anteriormente o puede contener o tener un punto para inserción de ácido nucleico componente sbp para expresión del polipéptido codificado en forma libre.

Los kits contendrán también componentes auxiliares requeridos para llevar a cabo el procedimiento, dependiendo la naturaleza de los citados componentes del procedimiento particular que esté siendo utilizado.

La relación de componentes auxiliares puede comprender fago auxiliar, cebadores PCR, y tampones y enzimas de diversos tipos.

Los cebadores PCR y reactivos asociados para ser utilizados cuando los componentes sbp son anticuerpos pueden tener las siguientes características:

(i): cebadores que tienen homología con el extremo 5' de la hebra sentido o anti-sentido de secuencias que codifican para dominios de anticuerpos; y

(ii): cebadores que incluyen secuencias tag 5' para estas secuencias homólogas, que incorporan puntos de restricción para permitir la inserción en vectores; conjuntamente con secuencias para permitir el ensamblaje de regiones VH y VJ amplificadas para permitir la expresión como fragmentos Fv, scFv o Fab.

Para permitir la preparación de secuencias de nucleótido que codifican para Fv, scFv o fragmentos Fab derivados de reordenación o de no reordenación de genes de inmunoglobulina, de acuerdo con las estrategias descritas en el presente documento, se utilizan habitualmente tampones y enzimas.

Los solicitantes han elegido los bacteriófagos filamentosos específicos para F como ejemplo del tipo de fago que podría proporcionar un vehículo para la presentación de moléculas de unión, por ejemplo de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpo y derivados de los mismos, sobre sus superficies y facilitar la subsiguiente selección y manipulación. Los fagos específicos de F (por ejemplo, fl, fd y M13) han desarrollado un procedimiento de propagación, el cual no destruye la célula huésped y los mismos son utilizados habitualmente como vehículos para ADN recombinante (Komberg. A., ADN Replication, W.H., Freeman and Co., San Francisco, 1980). El genoma de ADN de hebra única (aproximadamente 6,4 Kb) de fd es extruído a través de la membrana bacteriana en la que secuestra subunidades cápsidas para producir viriones maduros. Estos viriones tienen un diámetro de 6 nm, una longitud de 1 \mum y cada uno de ellos contiene aproximadamente 2.800 moléculas de la principal proteína de revestimiento codificada por el gen VIII vírico y cuatro moléculas de la molécula de adsorción de la proteína del gen III (g3p), estando ésta última localizada en uno de los extremos del virión. La estructura ha sido revisada por Webster et al., 1978 en The Single Stranded ADN Phages, 557-569, Cold Spring Harbor Laboratory Press. El producto del gen III está involucrado en la unión del fago al F-pilus bacteriano.

Si bien estos fagos no destruyen a sus huéspedes durante la replicación normal, la interrupción de alguno de los genes puede conducir a la muerte celular (Komberg, A., 1980, supra). Ello coloca algunas restricciones a su utilización. Los solicitantes han reconocido que el gen III del fago fd constituye una posibilidad atractiva para la inserción de secuencias extrañas biológicamente activas. Existen, no obstante, otros puntos candidatos, incluyendo, por ejemplo, el gen VIII y el gen VI.

La propia proteína constituye únicamente un componente menor del revestimiento de fago y la interrupción del gen no conduce a la muerte celular (Smith, G., 1988, Virology 167: 156-165). Además, resulta posible insertar algunas secuencias extrañas (sin función biológica) en diversas posiciones dentro de este gen (Smith, G., 1985 Science 228: 1315-1317, Parmley, S.F. and Smith, G.P. Gene: 73 (1988) p. 305-318, and De la Cruz, V.F. et al., 1988, J. Biol. Chem., 263: 4318-4322). Smith et al describieron la presentación de péptidos sobre la superficie externa de fago, pero no describieron la presentación de dominios de proteína. Los péptidos pueden adoptar una banda de estructuras que pueden ser diferente cuando se trata de una solución libre de cuando están unidos, por ejemplo, a un anticuerpo, o cuando forman parte de una proteína (Stanfield, R.I. et al., (1990) Science 248, p712-719). Generalmente, las proteínas presentan una estructura terciaria bien definida y desarrollan su función biológica tan solo cuando adoptan esta estructura. Por ejemplo, la estructura del anticuerpo D1.3 ha sido resuelta en la forma libre y cuando se encuentra unida a antígeno (Bhat, T.N., et al., (1990) Nature 347, p483-485). La gran estructura de la proteína es idéntica en cada uno de los casos, con tan solo menores variaciones alrededor del punto de unión para el antígeno. Otras proteínas presentan cambios conformacionales más sustanciales en su unión a ligandos, por ejemplo, los enzimas hexoquinasa y piruvato deshidrogenada durante sus ciclos catalíticos, pero todavía mantienen sus patrones globales de doblado. Esta integridad estructural no está confinada a proteínas completas sino que es mostrada por dominios de proteína. Esto conduce al concepto de una unidad doblada que es parte de una proteína, a menudo un dominio, el cual presenta una estructura primaria, secundaria y terciaria bien definida y que mantiene el mismo patrón de doblaje global, ya sea cuando se une a un socio de unión o no. La única secuencia genética que Smith et al describió como poseedora del suficiente tamaño como para codificar un dominio de un mínimo de quizás 50 aminoácidos, era un fragmento 335 bp de \beta-galactosidasa, correspondiente a los nucleótidos 861-1195 en la secuencia genética de la \beta-galactosidasa (Parmley, S. + Smith, G.P. 1988 supra). Esta codificaría para 112 aminoácidos de un dominio más largo de 380 aminoácidos. Por consiguiente, con anterioridad a la presente solicitud, no se ha presentado sobre fago ningún dominio sustancialmente completo o unidad doblada. En estos casos, si bien la infectividad del virión resultaba interrumpida, las secuencias insertadas podían ser detectadas sobre la superficie del fago, mediante la utilización de, por ejemplo, anticuerpos.

La proteína codificada por el gen III tiene varios dominios (Pratt, D., et al., 1969 Virology 39: 42-53., Grant. R.A. et al., 1981, J. Biol. Chem, 256: 539-546 and Armstrong, J. et al., FEBS Lett. 135: 167-172 1981), incluyendo: (i) una secuencia señal que dirige la proteína hacia la membrana celular y que es después rota; (ii) un dominio que fija la proteína madura a la membrana celular bacteriana (y también al revestimiento de fago); y (iii) un dominio que se une de forma específica al receptor de fago, el F-pilus de la bacteria huésped. Secuencias cortas procedentes de las moléculas de proteína han sido insertadas en dos lugares dentro de la molécula madura (Smith, G., 1985 supra y Parmley, S.F. y Smith G. P., 1988 supra). Es decir, entre una región de interdominio y también entre los aminoácidos 2 y 3 del N terminal. Los puntos de inserción en el N terminal resultaron más exitosos a la hora de mantener la integridad de la estructura de la proteína del gen III y de presentar los péptidos sobre la superficie del fago. Mediante la utilización de un antisuero específico para los péptidos, se observó que los péptidos insertados en esta posición se encontraban sobre la superficie del fago. Estos autores han sido también capaces de purificar el fago, utilizando esta propiedad. No obstante, los péptidos expresados por el fago no poseían funciones biológicas medibles
propias.

La retención de la función biológica de una molécula cuando la misma es expresada en un contexto radicalmente diferente a su estado natura resulta difícil. Las demandas sobre la estructura de la molécula son elevadas. Por el contrario, la retención de la capacidad de unión por parte de antisueros específicos constituye un proceso positivo que impone demandas mucho menos rigurosas sobre la estructura de la molécula. Por ejemplo, constituye la regla más que la excepción el hecho de que los antisueros policlonales reconocen proteínas totalmente desnaturalizadas y biológicamente inactivas en el ensayo de Western (ver, por ejemplo, Harlow, E. y Lane, D. Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)). Por consiguiente, la inserción de péptidos en una región que permite que sus estructuras sean sondadas con anticuerpos describe tan solo que la región permite que las secuencias insertadas sean presentadas y no que la región resulte adecuada para inserción de secuencias grandes con necesidades de restricciones estructurales para la presentación de molécula con una función de unión o biológica. En particular, no muestra que los dominios o las unidades dobladas de proteínas puedan ser presentados a partir de secuencias insertadas en esta región.

Esta experiencia con el ensayo Western constituye una demostración gráfica práctica que muestra que la retención de la capacidad de ser objeto de unión por parte de antisueros específicos impone demandas mucho menos rigurosas sobre la estructura de un polipéptido que el doblado para la retención de una función biológica.

Se han llevado a cabo estudios en los cuales se ha manipulado E. coli para expresar el receptor \beta-adrenérgico de proteína como una fusión con la proteína de la membrana exterior lamB. El receptor \beta-adrenérgico era expresado en su forma funcional tal como determina la presencia de actividad de unión. No obstante, cuando se preparó una fusión de anticuerpo equivalente con lamB, la fusión de anticuerpo resultó ser tóxica para la célula huésped.

Los solicitantes han investigado la posibilidad de insertar la secuencia de codificación genética en búsqueda de fragmentos de anticuerpos biológicamente activos en la región del gen III de fd, para expresar una proteína de fusión grande. Tal y como resulta aparente a partir de la discusión anterior, este planteamiento efectúa demandas onerosas sobre la funcionalidad de la proteína de fusión. La inserción es grande, codifica para fragmentos de anticuerpos de al menos 100-200 aminoácidos; el dominio derivado de anticuerpo tiene que doblarse de forma eficaz y correctamente para mostrar unión a antígeno; y la mayor parte de las funciones del gen III tienen que ser conservadas. El planteamiento de los solicitantes para la construcción de la molécula de fusión fue diseñado para minimizar el riesgo de interrupción de estas funciones. En una realización de la invención, el vector inicial utilizado era fd-tet (Zacher, A.N. et al., 1980, Gene 9, 127-140), una versión resistente a la tetraciclina del bacteriófago fd que puede ser propagada como plásmido que confiere resistencia a la tetraciclina al huésped E. coli infectado. Los solicitantes eligieron insertar después de la secuencia señal de la proteína del gen III fd, por diversas razones. En particular, los solicitantes decidieron insertar después del aminoácido 1 de la proteína madura para conservar el contexto para la rotura con peptidasa señal. Para conservar la estructura y la función del propio gen III, la mayoría de los aminoácidos originales fueron sintetizados después de la inserción de secuencias de imunoglobulina. Las secuencias de inmunoglobulina insertadas fueron diseñadas para incluir restos procedentes de la región de cambio que une VH-VL a CHI-CL (Lesk, A., and Chothia, C., Nature 335, 188-190, 1988).

Sorprendentemente, mediante la manipulación del gen III del bacteriófago fd, los presentes solicitantes han sido capaces de construir un bacteriófago que presenta sobre su superficie un anticuerpo, un enzima y moléculas de receptor biológicamente funcionales grandes, mientras permanece intacto e infeccioso. Además, los fagos que soportan los anticuerpos de la especificidad deseada pueden ser seleccionados a partir de antecedentes de fagos que no muestran esta especificidad.

Las secuencias que codifican para una población de moléculas de anticuerpo y para la inserción en el vector para proporcionar la expresión de funciones de unión a anticuerpo sobre la superficie el fago pueden ser derivadas a partir de una diversidad de fuentes. Por ejemplo, secuencias inmunizadas o no inmunizadas de roedores o humanos y a partir de órganos tales como bazo y linfocitos sanguíneos periféricos. Las secuencias de codificación proceden de estas fuentes a través de técnicas que resultan familiares para los expertos en la materia (Orlando, R., et al., 1989 supra Larrick J.W. et al., 1989 supra; Chiang., L. et al., 1989 Bio Techniques 7, p.360-366; Ward, E.S. et al., 1989, supra; Sastry, L., 1989, supra) o a través de estrategias de unión nuevas descritas en los ejemplos 12, 26, 30 y 32. Las nuevas estrategias se describen en los ejemplos 7, 21, 26 y 30, para la presentación de moléculas dímeras, por ejemplo fragmentos Fab y Fv sobre la superficie de un fago. Cada uno de los pAb individuales en la librería resultante de pAbs expresará anticuerpos o fragmentos derivados de anticuerpo que son monoclonales con relación a sus características de unión a antígeno.

La descripción efectuada por los presentes solicitantes es importante y proporciona un avance significativo en la tecnología relacionada con la producción de moléculas de unión biológicas, sus fragmentos y derivados, a través de la utilización de procedimientos recombinantes.

En técnicas recombinantes habituales para la producción de anticuerpos, se utiliza un vector de expresión que contiene secuencias que codifican para cadenas de polipéptido anticuerpo para transformar E. coli. Los polipéptidos de anticuerpo son expresados y detectados mediante la utilización de sistemas de cribado habituales. Cuando la criba detecta un polipéptido de anticuerpo de la especificidad deseada, uno tiene que volver a la E. coli transformada en particular que expresa el polipéptido de anticuerpo deseado. Además, el vector que contiene la secuencia de codificación para el polipéptido de anticuerpo deseado tiene que ser después aislado para ser utilizado a partir de E. coli en nuevos pasos de proceso.

No obstante, en la presente invención, el polipéptido de anticuerpo deseado, cuando es expresado, ya está envasado con su secuencia de codificación genética. Esto significa que cuando un polipéptido de anticuerpo de especificidad deseada es seleccionado, no existe necesidad de regresar al cultivo original para el aislamiento de esa secuencia. Además, en procedimientos previos en técnicas recombinantes habituales, cada uno de los clones que expresan anticuerpos necesita ser cribado individualmente. La presente solicitud proporciona la selección de clones que expresan anticuerpos con las propiedades deseadas y, por tanto, tan solo requiere el cribado de clones a partir de un grupo
enriquecido.

Debido al hecho de que el pAb es una nueva estructura que presenta un componente de un par de unión específico (un anticuerpo de especificidad de unión a antígeno monoclonal) en la superficie de una estructura replicable relativamente simple, que también contiene la información genética que codifica para el componente, el pAbs, que se une al componente complementario del par de unión específico (antígeno), puede ser recuperado muy eficazmente ya sea mediante elución del componente complementario utilizando por ejemplo dietilamina, sal elevada, etc., e infectando las bacterias adecuadas, o a través de desnaturalización de la estructura y específicamente amplificando las secuencias que codifican para el componente que utiliza PCR. Es decir, no hay necesidad de volverse a referir al clon bacteriano original que dio lugar al pAb.

Para algunos propósitos, por ejemplo, inmunoprecipitación y algunas pruebas de diagnóstico, resulta ventajoso utilizar anticuerpos policlonales o fragmentos de anticuerpo. La presente invención permite que esto se alcance, ya sea mediante la selección de un grupo enriquecido de pAbs con las propiedades deseadas o mezclando clones aislados individualmente con las deseadas propiedades. Los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo pueden después ser expresados en forma soluble, si así se desea. La citada población de pAb policlonal seleccionada puede ser cultivada a partir de stocks de fago, bacterias que contienen fagémidos o bacterias que expresan fragmentos solubles derivados de población policlonal seleccionada. Así pues, se crea un reactivo equivalente a un antisuero policlonal, el cual puede ser replicado y manufacturado de forma rutinaria en cultivo, sin la utilización de animales.

Formatos de selección y maduración por afinidad

pAbs individuales que expresan la especificidad deseada, por ejemplo para un antígeno, pueden ser aislados a partir del complejo librería utilizando técnicas de cribado convencionales (por ejemplo, tal y como se describe en Harlow, E., y Lane, D., 1988, supra. Ghererdi, E. et al., 1990. J. Immunol. meth. 126 p61-6B).

Los solicitantes también han inventado una serie de nuevas técnicas de selección que resultan practicables tan solo debido a las propiedades únicas de las partículas de bacteriófago filamentoso. La visión general de algunos procedimientos de cribado es ilustrada en la Figura 2.

La población/librería de pAbs que tiene que ser cribada podría ser generada a partir de animales inmunizados o de otros animales; o creada in vitro sometiendo a mutagénesis anticuerpos de fago pre-existentes (utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, tal como mutagénesis dirigida a oligonucleótido (Sambrook, J et al., 1989 Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Esta población puede ser cribada en uno o más de los formatos descritos más adelante, con relación a la Figura 2, para derivar aquellos pAbs individuales cuyas propiedades de unión a antígeno sean diferentes a partir de la muestra c.

Elución de unión

La Figura 2(i) muestra el antígeno (ag) unido(s) a una(s) superficie(s) sólida(s), pudiendo la superficie(s) sólida ser proporcionada por un plato de petri, bolitas de cromatografía, bolitas magnéticas y similares. La población/librería de pAbs es después pasada sobre el ag y aquellos individuos p que se unen son retenidos después del lavado y opcionalmente detectados con el sistema de detección d. Un sistema de detección basado en antisueros anti-fd es ilustrado con mayor detalle más adelante en el Ejemplo 4. Si las muestras de población p unida son eliminadas en condiciones de creciente restricción, la afinidad de unión representada en cada una de las muestras se incrementará. Pueden obtenerse condiciones de restricción creciente, por ejemplo, incrementando el tiempo de inmersión o modificando el pH de la solución de inmersión, etc.

Competencia

En referencia a la Figura 2(ii) el antígeno ag puede estar unido a un soporte sólido s y unido hasta saturación a través de la molécula de unión original c. Si la población de pAb mutante (o de un conjunto de pAbs no relacionados) es ofrecida al complejo, únicamente aquellos que presentan una afinidad más elevada para el antígeno ag que c quedarán unidos. En muchos ejemplos, tan solo una minoría de la población c será desplazada por individuos procedentes de la población p. Si c es una molécula de anticuerpo tradicional, la totalidad de material unido puede ser recuperado y el p unido recuperado mediante la infección de bacterias adecuadas y/o mediante la utilización de técnicas habituales, tales como la PCR.

Una aplicación ventajosa tiene lugar cuando ag es un anticuerpo y c su antígeno. La población p unida recuperada es entonces un anticuerpo anti-idiotipo que presenta numerosos usos en investigación y en las industrias farmacéuticas y de diagnóstico.

En el presente resulta difícil seleccionar directamente anticuerpos anti-idiotipo, los pAbs proporcionarían la capacidad de hacer esto directamente mediante la unión de librerías pAb (por ejemplo una librería sencilla) a células B (las cuales expresan anticuerpos sobre su superficie) y el aislamiento de esos fagos que se unen bien.

En algunos casos, puede resultar ventajoso preseleccionar la población p. Por ejemplo, en el ejemplo de anti-idiotipo mostrado anteriormente, p puede ser absorbido frente a un anticuerpo relacionado que no se una al antígeno.

No obstante, si c es un pAb, entonces cualquiera o ambos c y p pueden ser marcados de forma ventajosa de alguna manera para distinguir y seleccionar el p unido del c unido. Este marcaje puede ser físico, por ejemplo, mediante el pre-marcado de p con biotina; o de forma más ventajosa, genético. Por ejemplo, c puede ser marcado con un punto de restricción EcoB, mientras que p puede ser después marcado con un punto de restricción EcoK (ver Carter, P. et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13, 4431-4443). Cuando p+c unidos son eluidos del antígeno y utilizados para infectar bacterias adecuadas, existe una restricción (y por tanto ausencia de crecimiento) de la población c (a saber, bacterias restrictivas EcoB en este ejemplo). Cualquier fago que se cultivase resultaría enriquecido en gran manera por estos individuos procedentes de p, con afinidades de unión más elevadas. Alternativamente, el marcaje genético puede ser logrado marcando p con nuevas secuencias, las cuales pueden ser utilizadas para amplificar p de forma específica a partir de la mezcla, utilizando PCR.

Dado que los pAbs pueden ser amplificados utilizando, por ejemplo, PCR o infección bacteriana, resulta también posible rescatar la especificidad deseada, incluso cuando individuos insuficientes son unidos para permitir la detección a través de técnicas convencionales.

El procedimiento preferido para la selección de un fago que presenta una molécula de proteína con una afinidad o especificidad deseada será habitualmente la elución a partir de una matriz de afinidad con un ligando (por ejemplo, el ejemplo 17). La elución con concentraciones crecientes de ligando debería eluir los fagos que muestran moléculas de unión de creciente afinidad. No obstante, cuando, por ejemplo, un pAb se une a su antígeno con elevada avidez o afinidad (u otra proteína a su socio de unión), puede no resultar posible eluir el pAb a partir de una matriz de afinidad con una molécula relacionada con el antígeno. Alternativamente, puede que no exista una molécula específica que resulte adecuada para la elución que pueda ser preparada con la concentración suficientemente elevada. En estos casos, resulta necesario utilizar un procedimiento de elución que no sea específico para, por ejemplo el complejo antígeno-anticuerpo. Algunos de los procedimientos de elución no específicos utilizados por regla general reducen la viabilidad del fago, por ejemplo, la viabilidad del fago se reduce con el tiempo a pH 12 (Rossomando, E.F. y Zinder, N.D., J. Mol. Biol. 36 387-399 1968). Pueden existir interacciones entre, por ejemplo, anticuerpos eg y matrices de afinidad que no pueden ser interrumpidas sin eliminar completamente la infectividad del fago. En estos casos, se requiere un procedimiento para eluir el fago que no esté basado en la interrupción de, por ejemplo, la interacción anticuerpo-antígeno. Se diseñó por tanto un procedimiento que permite la elución de pAbs unidos en condiciones moderadas (reducción de un grupo ditiol con ditiotreitol), que no interrumpa la estructura del fago
(Ejemplo 37).

Este procedimiento de elución representa tan solo un ejemplo de procedimiento de elución en condiciones moderadas. Un procedimiento particularmente ventajoso consistiría en introducir una secuencia de nucleótido que codificase para aminoácidos que constituyen un punto de reconocimiento para rotura por medio de una proteasa altamente específica entre el gen extraño insertado, en este caso un gen para un fragmento de anticuerpo, y la secuencia del resto del gen III. El Factor X y la trombina constituyen ejemplos de las citadas proteasas altamente específicas. Tras la unión del fago a una matriz de elevada afinidad y de elución para eliminar el fago de unión no específico y el fago de unión débil, el fago unido fuertemente sería eliminado mediante lavado de la columna con proteasa en condiciones adecuadas para digestión en el punto de rotura. Ello rompería el fragmento de anticuerpo a partir de la partícula de fago que eluye el fago. Cabría esperar que estos fagos resultasen infecciosos, dado que el único punto de proteasas debería ser el introducido de forma específica. Los fagos unidos fuertemente podrían ser después recuperados por medio de infección de, por ejemplo, células E. coli TG1.

Un procedimiento alternativo al anterior se basa en tomar la matriz de afinidad que ha retenido al pAb unido fuertemente y extraer el ADN, por ejemplo, hirviendo en solución de SDS. El ADN extraído puede ser entonces directamente utilizado para transformar células huésped de E. coli o, alternativamente, pueden amplificarse las secuencias que codifican para el anticuerpo, por ejemplo utilizando PCR con cebadores adecuados, tales como los descritos en el presente documento e insertarlas después en un vector para expresión como un anticuerpo soluble para estudios adicionales o un pAb para rondas adicionales de selección.

Otro procedimiento preferido para selección según afinidad residiría en la unión a una matriz de afinidad que contiene bajas cantidades de ligando.

Si lo que se desea es seleccionar a partir de una población de fagos que muestran una molécula de proteína con una afinidad elevada para su ligando, una estrategia preferida se basa en la unión de una población de fago a una matriz de anticuerpo que contiene una baja cantidad de ligando. Se genera competencia entre el fago que muestra elevada afinidad y las proteínas de baja afinidad para unirse al ligando en la matriz. El fago que presenta proteína de elevada afinidad se une preferencialmente y la proteína de baja afinidad es eliminada por lavado. La proteína de elevada afinidad es después recuperada mediante elución con el ligando o mediante otros procedimientos que eluyen el fago a partir de la matriz de afinidad (el ejemplo 35 demuestra este procedimiento).

En resumen pues, para la recuperación del ADN envasado desde el paso de afinidad, el envase puede ser simplemente eluido, y puede ser eluido en presencia de un componente sbp homólogo que compite con el citado envase para su unión a un componente sbp complementario; podría ser eliminado por ebullición, podría ser eliminado mediante rotura proteolítica de la proteína; y otros procedimientos resultarán evidentes para los expertos en la materia, por ejemplo, la destrucción del enlace entre el sustrato y el componente sbp complementario para liberar el citado ADN envasado y el componente sbp. En cualquier caso, el objetivo es obtener el ADN procedente del envase, a los efectos de que el mismo pueda ser utilizado, directa o indirectamente, para expresar el componente sbp codificado por tal motivo.

La eficacia de este procedimiento de selección para pAbs y la capacidad de crear librerías muy grandes significa que las técnicas de inmunización desarrolladas para incrementar la proporción de células cribadas que producen anticuerpos de interés no constituirá un requisito absoluto. La técnica permite el aislamiento rápido de especificidades de unión, por ejemplo de especificidades de unión a antígeno, incluyendo aquellas que serían difíciles de obtener, o incluso no obtenibles, a través de técnicas convencionales, por ejemplo, anticuerpos catalíticos o anti-idiotípicos. La eliminación del animal conjuntamente resulta ahora posible, una vez una librería completa del repertorio inmune ha sido construida. La nueva estructura de la molécula pAb puede ser utilizada en un determinado número de otras aplicaciones, algunos ejemplos de los cuales con:

Amplificación de señal

Actuando como una entidad molecular nueva en si misma, el pAbs combina la capacidad de unirse a una molécula específica, por ejemplo antígeno, con amplificación, si la proteína más importante de revestimiento se utiliza para unir otro resto. Este resto puede ser unido a través de medios inmunológicos, químicos o cualquier otro medio que puede ser utilizado, por ejemplo, para marcar el complejo con reactivos de detección o moléculas citotóxicas para ser utilizadas in vivo o in vitro.

Detección física

El tamaño de rgdps, eg pAbs, puede ser utilizado como un marcador, particularmente con relación a procedimientos físicos de detección tales como la microscopía electrónica y/o algunos biosensores, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial.

Ensayos de diagnóstico

Los rgdps, eg pAbs, presentan también usos ventajosos en ensayos de diagnóstico, particularmente cuando la separación puede ser efectuada utilizando sus propiedades físicas, por ejemplo centrifugación, filtración, etc.

Con vistas a que la invención pueda ser completamente entendida, las realizaciones se describirán ahora con mayor detalle, tan solo por vía de ejemplo y no por medio de limitación con relación a las figuras descritas más adelante. En todas las realizaciones de la invención, las moléculas de anticuerpo Fab son mostradas sobre partículas de bacteriófago filamentoso. La presentación de otras moléculas no forma parte de la invención. La mención de las citadas moléculas en este documento es a efectos ilustrativos.

La Figura 1 muestra la estructura básica de IgG, la molécula anticuerpo más simple.

La Figura 2 muestra, esquemáticamente, las técnicas de selección que utilizan las propiedades únicas de pAbs: 2i) muestra un sistema de unión/elución; y (2ii) muestra un sistema de competición (p=pAb); ag=antígeno que requiere la unión a través de pAb; c= población competidora, por ejemplo, anticuerpo, pAb, ligando; s= sustrato (por ejemplo, bolitas de plástico); d= sistema de detección.

La Figura 3 muestra el vector fd-tet y un esquema para la construcción de vectores, fdTPs/Bs (para inserción de secuencias de codificación VH) y fdTPs/Xh, para la inserción de secuencias de codificación scFv.

La Figura 4 muestra las secuencias de nucleótido para los oligonucleótidos y vectores. Todas las secuencias son dibujadas 5’ a 3’ y son numeradas según Beck et al., 1978, Nucl. Acid Res., 5: 4495-4503. 4.1 muestra las secuencias de los oligonucleótidos utilizados para mutagénesis (oligo’s 1 y 2) o secuenciado (oligo 3). Las secuencias mostradas fueron sintetizadas en un sintetizador de oligonucleótidos Applied Biosystems, y son complementarias a la forma de hebra única de fd-tet (las mismas están en forma anti-sentido con relación al gen III). 4.2 muestra las secuencias de las diversas construcciones alrededor del punto de inserción del gen III. Estas secuencias son dibujadas en el sentido de orientación con relación al gen III; (A) fd-tet (y fdT6Bst) (B) fdTPs/Bs y (C) fdTPs/Xh. Los puntos de enzima de restricción claves se muestran conjuntamente con los aminoácidos de inmunoglobulina contribuidos por los vectores (se utiliza un código de aminoácidos de letra única, ver Harlow, E., y Lane, D., 1988, supra).

La Figura 5 muestra las secuencias de nucleótido y de aminoácido para scFv en el vector scFvD1.3 myc. Esto proporciona la secuencia de la cadena única Fv de anti-lisozima y las secuencias vecinas en scFvD1.3 myc, mostrando la secuencia de péptido de señal pel B N Terminal y la secuencia myc tag C-terminal (Ward, E.S. et al., 1989, supra. Se muestra también la secuencia de péptido que une las regiones VH y VL. La secuencia de aminoácido está representada encima de la secuencia de nucleótidos por un código de letra única, ver Harlow, E., y Lane D., 1988 supra.

La Figura 6 muestra la unión de pAbs a lisozima y el efecto de variar la cantidad de sobrenadante. Cada uno de los puntos es el promedio de muestras duplicadas. La lisozima estaba revestida a 1 mg/ml en NaHCO_{3} 50 mM.

La Figura 7 muestra el efecto de variar la concentración de revestimiento de lisozima o de sueroalbúmina bovina sobre la unión de pAbs a lisozima en forma gráfica. Cada uno de los puntos es el promedio de muestras duplicadas.

La Figura 8 muestra la secuencia alrededor del punto de clonación en el gen III de fd-CAT2. Se muestran los puntos de enzima de restricción, al igual que los aminoácidos codificados por las secuencias derivadas de anticuerpo. Estas son flanqueadas en el extremo 5’ por el péptido señal del gen III y en el extremo 3’ por restos 3 alanina (codificados por el punto de restricción Not 1) y el resto de proteína del gen III madura. La flecha muestra el punto de rotura para el corte del péptido señal.

La Figura 9 muestra la unión de pAb (1.3) a lisozimas. Unión de fago, tal y como se detecta por medio de ELISA a (a) lisozima de clara de huevo de gallina (HEL) (b) lisozima de clara de huevo de pavo (TEL), (c) lisozima humana (HUL), (d) sueroalbúmina bovina (BSA). Un control adicional de (e) fdTPs/Bs a HEL.

La Figura 10 muestra un mapa de FabD1.3 en pUC19.

La Figura 11 muestra los resultados ELISA que proporcionan una comparación de unión a lisozima por medio de fago-Fab y fago-scFv. Vector=fdCAT2 (Ejemplo 5); fdscFv(OX)=pAbNQ11 (Ejemplo 9); fdVHCHI(D1.3)= cultivado en células normales (a saber, no cadena L, ver Ejemplo 7); fdFAb (D1.3) a saber fdVHCH1 (D1.3) cultivado en células que contienen cadena D1.3L; fdscFv (D1.3)=pAbD1.3.

La Figura 12 muestra el sondado de oligonucleótidos de fago purificado por afinidad. 10^{12} fagos en la relación de 1 pAb (D1.3) en 4 x 10^{4}. Fagos fdTPS/Bs fueron purificados por afinidad y sondados con un oligonucleótido específico para pAb(D1.3). A es un filtro después de una operación de purificación por afinidad (900 colonias en total) y B es un filtro después de dos operaciones (372 colonias en total).

La Figura 13 muestra la secuencia del fragmento de anticuerpo anti-oxazolona NQ11 scFv. La secuencia contribuida por el componente de unión es mostrada en letra pequeña. La secuencia para VH es anterior a la secuencia del elemento de unión y la secuencia para VL posterior a la del elemento de unión.

La Figura 14 muestra los resultados ELISA para la unión de pAb NQ11 y pAb D1.3 y el vector fdTPs/xh a antígenos específicos;

La Figura 15 muestra la secuencia que rodea a la inserción phoA en fd-phoAla166. Se muestran los puntos de restricción utilizados para clonar, al igual que los aminoácidos codificados por phoA alrededor del punto de inserción. Los cinco primeros aminoácidos de la fusión madura proceden del gen III.

La Figura 16(1) muestra la estructura del gen III y el punto BamHI natural en el que se insertó una secuencia de codificación scFv en el ejemplo 11 y la Figura 16(2) muestra los puntos A y B de elemento de unión de péptido natural para posible inserción de secuencias de codificación scFv.

La Figura 17 muestra, esquemáticamente, el protocolo para ensamblaje PCR de repertorios VH y VLK de ratón para la presentación de fago descrita en el ejemplo 12.

La Figura 18 muestra ejemplos de productos finales obtenidos con el procedimiento del ejemplo 12. Las líneas a y b muestran los productos de PCR inicial, utilizando materiales cebadores de cadena ligera y pesada, respectivamente, la línea c muestra el producto 700 bp completamente ensamblado antes de la digestión final con Not1 y ApaL 1; el digerido \Phi174 Hae III de los marcadores M1, M2 y la escalera de par de base 123 (BRL Limited, P. Box 35, Washington Road, Paisley, Scottland), respectivamente.

La Figura 19 muestra los resultados de un ELISA de unión a lisozima mediante un fagémido pCAT-3 scFv D1.3, en comparación con un vector pCAT-3 (ambos rescatados por M13KO7) y fdCAT2 scFv 1.3, tal y como se describe en el Ejemplo 13. El ELISA fue llevado a cabo tal y como se describe e el ejemplo 6, con las modificaciones detalladas en el ejemplo 14.

La Figura 20 muestra el patrón de digestión observado cuando clones individuales, seleccionados al azar a partir de una librería de genes de anticuerpo Fv de cadena sencilla procedentes de un ratón inmunizado, son digeridos con Bst1.

La Figura 21 muestra secuencias de genes VH y VK derivadas de la librería combinatoria en el ejemplo 17 y de la librería jerárquica en el ejemplo 18.

La Figura 22 muestra una matriz de señales de ELISA para clones derivados de librería combinatoria aleatoria. La designación de los clones es la misma que en la Figura 21. El número de clones encontrado con cada una de las combinaciones es mostrado a través de los números.

La Figura 23 muestra a) el fagémido pHEN1, un derivado del pUC119 descrito en el ejemplo 20; y b) los puntos de clonación en el fagémido pHEN.

La figura 24 muestra las construcciones de anticuerpo clonados en fd-CAT2 y pHEN 1, para presentación sobre la superficie del fago. Las construcciones I, II, III y IV fueron clonadas tanto en fd-CAT2 (como fragmentos ApaLI-Notl) como en pHEN1 (como fragmentos Sfil-Notl) y pHEN1 (como fragmentos Sfil-Notl). Todas las construcciones contenían las regiones variables de la cadena pesada (VH) y en la cadena ligera (VK) del anticuerpo NQ10.12.5 anti-phOx de ratón. Los dominios constantes eran el CK y el CHI humanos (isotipo \gamma1).

Figura 25. Tres modos de presentar fragmentos de anticuerpo sobre la superficie del fago, mediante fusión con la proteína del gen III.

Figura 26. Ensayo Western del sobrenadante obtenido a partir de cultivos pHEN1-II(+) o pHEN1(-) en E. Coli HB2151, que muestran la secreción de fragmento Fab a partir de tan solo pHEN1-II. El Fab anti-humano detecta tanto la cadena H como la cadena L. Debido a los añadidos c-myc tag, la cadena L, destacada tanto a través de los antisueros anti-c-myc tag como anti-humano CK, es ligeramente más grande (calculada Mr 24625) que la cadena H (calculada Mr 23145). 2-7.

La Figura 27 es una gráfica que muestra el efecto de la disolución de lisozima sobre la relación de señales ELISA obtenidas utilizando pAbD1.3 o scfv D1.3 soluble.

La Figura 28 es una gráfica que muestra el efecto de la dilución de lisozima sobre las señales de ELISA obtenidas utilizando fdTscFvD1.3 y scFvD1.3 soluble.

La Figura 29 muestra los resultados positivos obtenidos a partir de un cribado ELISA de fago que presenta fragmentos scFv derivados de la línea celular 013, que expresan un anticuerpo monoclonal dirigido contra oestriol.

La Figura 30 es una gráfica que muestra resultados positivos a partir de un cribado ELISA de fago que presenta fragmentos scFv derivados de la línea celular 014, que expresan un anticuerpo monoclonal dirigido frente a oestriol.

Figura 31. Electroforesis de muestras obtenidas de las etapas de un ensamblaje Fab. Muestras procedentes de diferentes etapas en el proceso de ensamblaje Fab PCR escrito en el Ejemplo 26 fueron sometidas a electroforesis sobre un gel TAE-agarosa al 1%. Las muestras procedentes de un proceso de ensamblaje scFv comparable (como el del ejemplo 14) se muestran a afectos comparativos. Las muestras de izquierda a derecha son:

M: = marcadores

VHCHI: = secuencias que codifican para dominios VHCHI amplificados por PCR

VKCK: = secuencias que codifican para dominios VKCK amplificados por PCR

-L: = reacción de ensamblaje Fav llevada a cabo en ausencia de elemento de unión

+L: = producto de unión de ensamblaje Fab PCR más VKCK más componente de unión

M: = marcadores

VK: = secuencias que codifican para el dominio VK amplificado mediante PCR

VL: = secuencias que codifican para el dominio VH amplificado mediante PCR

-L: = reacción de ensamblaje scFv en ausencia de componente de unión

+L: = reacción de ensamblaje scFv en presencia de elemento de unión.

M: = marcadores.

Figura 32. Comparación de señales ELISA con scFv D1.3 clonado en fd-CAT2 (fd) o pCAT-3. El pCAT-3 scFv1.3 ha sido rescatado con M13K07 (K07). M13K07\DeltagIIINo3 (gIIINo3) o M13K07 gIII\DeltaNo2 (g111No2). Los anticuerpos fago son comparados a concentraciones 10 veces (10x) 1 vez (1x) ó 0,1 veces (0,1x) en relación con la concentración en el sobrenadante después de transcurrida una noche de crecimiento. Las señales de los vectores fdCAT2 y pCAT-3 no recombinantes eran <0,01, a una concentración 10x. El M13K07 gIII\DeltaNo1 no se rescató en absoluto, tal y como se comprobó por la ausencia de señal por encima del fondo en este ELISA.

Figura 33. Análisis Western del fago precipitado con PEG utilizado en ELISA sondado con anti-g3p. Las bandas de fusión de g3p y g3p-scFvD1.3 libre son marcadas con flechas.

Muestra 1-: fdscFvD1.3

Muestra 2-: vector pCAT3

Muestra 3-: pCAT3scFvD1.3 rescatado con M13K07, no IPTG

Muestra 4-: pCAT3scFvD1.3 rescatado con M13K07, IPTG 50 \muM

Muestra 5-: pCAT3scFvD1.3 rescatado con M13K07, rescatado con IPTG 100 \muM

Muestra 6-: pCAT3scFvD1.3 rescatado con M13K07gIII\DeltaNo3 (no IPTG)

Muestra 7-: pCAT3scFvD1.3 rescatado con M13K07dIII\DeltaNo2 (no IPTG).

Las muestras del panel A contienen el equivalente a 8 \mul de sobrenadante de cultivo de fagémido por pista y 80 \mul del sobrenadante fd (10 veces menos rendimiento en fago que el fagémido). Las muestras de fagémido del panel B son las utilizadas a una carga de muestra cinco veces más elevada (equivalente a 40 \mul de sobrenadante de cultivo por pista), para permitir la visualización de la banda de fusión en muestras rescatadas con M13K07 parental.

La Figura 34 es una gráfica que muestra el enriquecimiento fdCAT2scFvD1.3 producido a partir de una mezcla de fdCAT2scFvD1.3 y fdCAT2TPB4, por una ronda de reconocimiento y selección.

La Figura 35 es una gráfica que muestra el enriquecimiento de fdCAT2scFvD1.3 producido a partir de una mezcla de fdCAT2scFvD1.3 y fdCAT2TPB1, a través de una ronda de reconocimiento y selección.

La Figura 36 muestra la secuencia de scFvB18 (anti-NP).

Figura 37. Muestra un esquema de representación de los pasos involucrados en el ensamblaje PCR de secuencias de nucleótido que codifican para fragmentos Fab humanos. Los detalles se proporcionan en el ejemplo 30.

Figura 38. Muestra A. un mapa de plásmido PJM1-FabD1.3 que es utilizado para la expresión de fragmentos Fab humanos solubles y como plantilla para la síntesis del ADN de unión para el ensamblaje Fab. B. una representación esquemática de secuencias que codifican para una construcción Fab. C. la secuencia de plantilla ADN para la síntesis de ADN de unión para el ensamblaje Fab.

Figura 39. muestra una representación esquemática de los pasos involucrados en el ensamblaje PCR de secuencias de nucleótidos que codifican para fragmentos scFv humanos. En el ejemplo 32 se proporcionan detalles.

Figura 40. Ensayo ELISA de anticuerpos fago que utilizan placas revestidas con lisozima de huevo de pavo. Se muestran dos clones B1 y A4, derivados por mutagénesis y selección a partir de pAbD1.3 (ejemplo 35). La concentración (eje x) se refiere a la concentración de fago para cada una de las muestras en relación con la concentración en el sobrenadante de cultivo. B1 ha incrementado la unión a lisozima de huevo de pavo en comparación con D1.3. A4 ha reducido la unión a lisozima de huevo de gallina, en comparación con D1.3.

Figura 41. ELISA de anticuerpos de fago que se unen a HEL y TEL. El clon 1 es fdCAT2scFvD1.3. Los clones 2 y 10 fueron obtenidos a partir de una librería (ejemplo 36) después de selección. Los valores de fondo, definidos mediante la unión de estos clones a BSA, fueron sustraídos.

La Figura 42 muestra la secuencia de ADN de las cadenas ligeras D1.3M1F y M21, derivadas por selección a partir de librería jerárquica, en el ejemplo 36.

La Figura 43 muestra un vector de expresión lambda (ejemplo 38) derivado de pUC119. Contiene el gen de la línea germinal lambda reordenado. Los casettes de cadena ligera y pesada contienen un punto de unión a ribosoma aguas arriba del líder pel B (puntos de restricción mostrados como: H=Hind III; Sp=Sphl; B=BamHI, E=EcoRI.

Materiales y procedimientos

Los siguientes procedimientos utilizados por los presentes solicitantes se describen en Sambrook, J. et al., 1989, supra: digestión por restricción, unión, preparación de células competitivas (procedimiento Hanahan), transformación, análisis de productos de digestión por enzima de restricción sobre geles de agarosa, purificación de ADN utilizando fenol/cloroformo, marcaje en 5’ de oligonucleótidos, cribado por filtro de colonias bacterianas, preparación de medio 2xTY y placas, preparación de soluciones stock de tetraciclina, PAGE de proteínas, preparación de solución salina tamponada con fosfato.

Todos los enzimas fueron suministrados por New England Biolabs (CP Laboratories, PO Box 22, Bishop’s Stortford, Herts., England) y se utilizaron según las instrucciones del fabricante, salvo que se declare lo contrario.

El vector fd-tet (Zacher., N. et al., 1980, supra) fue obtenido a partir de la American Type Culture Collection (ATCC Nº. 37.000) y transformado en células TG1 competitivas (genotipo: K12\delta (lac-pro), sup E, thi, hsdD5/F traD36, pro A+B+, Lac 1^{q}, lac \deltaM15).

Se prepararon partículas víricas cultivando células TG1 que contienen la construcción deseada en 10 a 100 ml de medio 2xTY con tetraciclina 15 \mug/ml durante 16-24 horas. El sobrenadante del cultivo fue recogido por medio de centrifugación durante 10 minutos a 10.000 rpm, en un rotor de 8x50, Sorval RC-58 centrífugo. Las partículas de fago fueron precipitadas tras la adición de 1/5 del volumen de polietilenglicol (PEG) 20%/NaCl 2,5M y dejando en reposo a 4ºC durante 1 hora. Las partículas fueron centrifugadas durante 15 minutos, tal y como se ha descrito anteriormente y los pellets resuspendidos en Tris 10 mM/HCl pH 8, EDTA 1 mM hasta 1/100 del volumen original. Las bacterias residuales y el material no disuelto fueron eliminados por centrifugación durante 2 minutos en una microcentrifugadora. Se preparó ADN de hebra única por mutagénesis o secuenciado a partir de fago concentrado, según Sambrook et al., 1989, supra.

Índice de ejemplos Ejemplo 1 Diseño de componentes puntuales de inserción y construcción de vectores

Este ejemplo cubre la construcción de dos derivados del vector fago fd-tet: a) fdTPs/Bs para la inserción de secuencias de codificación VH; y b) fdTPs/Xh para la inserción de secuencias de codificación scFv. Los vectores derivados tienen un nuevo punto BstEII para la inserción de secuencias.

Ejemplo 2 Inserción de dominio Fv de inmunoglobulina en fago

Este ejemplo cubre la inserción de secuencias de codificación scFv derivadas de un anticuerpo anti-lisozima D1.3 en fdTPs/Xh, para proporcionar la construcción fdTscFvD1.3.

Ejemplo 3 Inserción de dominio VH de inmunoglobulina en fago

Este ejemplo cubre la inserción de secuencias de codificación VH derivadas de un anticuerpo anti-lisozima D1.3 en fdTPs/Bs, para proporcionar la construcción fdTVHD1.3.

Ejemplo 4 Análisis de especificidad de unión de anticuerpos fago

Este ejemplo investiga las especificidades de unión de las construcciones fdTscFvD1.3 y fdTVHD1.3.

Ejemplo 5 Construcción de fdCAT2

Este ejemplo cubre la construcción del derivado fdCAT2 del vector fago fdTPs/Xh. El derivado presenta puntos de restricción para enzimas que cortan el ADN infrecuentemente.

Ejemplo 6 Unión específica de anticuerpo de fago (pAb) a antígeno

Este ejemplo muestra la unión de pAb fdTscFvD1.3 a lisozima por medio de ELISA.

Ejemplo 7 Expresión de FabD1.3

Este ejemplo está relacionado con la presentación de un fragmento Fab de anticuerpo en la superficie del fago. La cadena VH-CHI es expresada por fdCAT2- La cadena VL-CL es expresada por pUC19 en una célula huésped bacteriana también infectada con fdCAT2.

Ejemplo 8 Aislamiento del fago deseado, específico, a partir de una mezcla de fago vector

Este ejemplo muestra como un fago (por ejemplo, fdTscFvD1.3) que presenta una molécula de unión puede ser aislado a partir del fago vector por medio de técnicas de afinidad.

Ejemplo 9 Construcción de pAb que expresa actividad anti-hapteno

Este ejemplo concierne a la inserción de secuencias que codifican para scFv derivadas del anticuerpo anti-oxazolona NQ11 en fdTPs/Xh para generar la construcción pAbNQ11. El ejemplo muestra la unión de pAbNQ11 a oxazolona por medio de ELISA.

Ejemplo 10 Enriquecimiento de pAbD1.3 a partir de mezclas de otros pAbs mediante purificación por afinidad

Este ejemplo muestra como un fago (por ejemplo, pAbD1.3), que presenta un tipo de molécula de unión, puede ser aislado a partir del fago (por ejemplo, pAbNQ11) que presenta otro tipo de molécula de unión, por medio de técnicas de afinidad.

Ejemplo 11 Inserción de moléculas de unión en puntos alternativos en el fago

Este ejemplo cubre la inserción de secuencias que codifican para scFv, derivadas de a) el anticuerpo anti-lisozima D1.3; y b) el anticuerpo anti-oxazolona NQ11 en un punto BamHI de fdTPs/Xh, para proporcionar las construcciones fdTBam1 que tienen el inserto NQ11.

Ejemplo 12 Ensamblaje PCR de VH de ratón y repertorios VLK para presentación de fago

Este ejemplo está relacionado con un sistema para la presentación sobre fago de todos los repertorios VH y VLK codificados por un ratón. El sistema conlleva los siguientes pasos. 1) preparación de ARN a partir de bazo. 2) Preparación de cADN a partir de ARN. 3) Uso de cebadores específicos para secuencias de anticuerpo para amplificar con PCR todas las secuencias que codifican para VH y cADN y VLK cADN. 4) Uso de PCR para crear una molécula de unión a partir de pares de unión de secuencias VLK y VH. 5) Uso de PCR para ensamblar moléculas de ADN contiguas, comprendiendo cada una de ellas una secuencia VH, un componente de unión y una secuencia VLK. La combinación VH/VLK específica es derivada al azar. 6) Uso de PCR para introducir puntos de restricción.

Ejemplo 13 Construcción de fagémido que contiene el gen III

Fusionado con la secuencia de codificación para una molécula de unión. Este ejemplo está relacionado con la construcción de dos fagémidos basados en pUC119, los cuales contienen, de forma separada, el gen III procedente de fdCAT2 y la fusión de gen IIIscFv fdCAT2seFvD1.3, para generar pCAT2 y pCAT3 scFvD1.3, respectivamente.

Ejemplo 14 Rescate de especificidad de anticuerpo anti-lisozima a partir de pCAT3scFvD1.3 mediante M13K07

Este ejemplo describe el rescate de la secuencia de codificación para la fusión gen IIIscFv a partir de pCAT3scFv
D1.3, mediante crecimiento de fago auxiliar M13M07. Se demostró que los fagos mostraban actividad anti-lisozima scFv, mediante ELISA.

Ejemplo 15 Eficacia de transformación de fagémidos PCAT-3 y PCAT-3scFvD1.3

Este ejemplo comparó la eficacia de los fagémidos pVC119, pCAT-3 y pCAT3scFvD1.3 y el fago fdCAT2, para transformar E. coli.

Ejemplo 16 Ensamblaje PCR de una librería Fv de cadena única procedente de un ratón inmunizado

Este ejemplo está relacionado con un sistema para la presentación sobre fago de scFv (que comprende VH y VL) procedente de un ratón inmunizado, utilizando la técnica básica expuesta en el ejemplo 14 (preparación de cADN y ensamblaje PCR de los repertorios VH y VLK de ratón) y unión de secuencias ensambladas por PCR en fdCAT2, para crear una librería de fagos de 10^{5} clones. La comprobación de 500 clones mostró que ninguno mostraba especificidad frente a phox.

Ejemplo 17 Selección de anticuerpos específicos para 2-fenil-5-oxazolona a partir de un repertorio procedente de un ratón inmunizado

Este ejemplo muestra que el fago cultivado a partir de una librería establecida en el ejemplo 16 puede ser sometido a selección por afinidad utilizando phOx para seleccionar aquellos fagos que muestran scFv con la especificidad deseada.

Ejemplo 18 Generación de nuevas especificidades de anticuerpo a través de ensamblaje de librerías jerárquicas

Este ejemplo está relacionado con la construcción de librerías jerárquicas en las cuales una determinada secuencia VH es combinada con el repertorio VLK completo y una secuencia VLK determinada es combinada con el repertorio VH completo y la selección a partir de estas librerías de pares VH y VL nuevos.

Ejemplo 19 Selección de anticuerpos presentados sobre bacteriófago con diferentes afinidades para 2-fenil-5-oxazolona, utilizando cromatografía de afinidad

Este ejemplo está relacionado con la separación, mediante técnicas de afinidad, de fagos que presentan fragmentos scFv con diferentes afinidades de unión para un determinado antígeno.

Ejemplo 20 Construcción de fagémido pHEN1 para la expresión de fragmentos de anticuerpo expresados sobre la superficie de bacteriófago después de superinfección

Este ejemplo está relacionado con la construcción del fagémido pHEN1, derivado de pUC119. El pHEN1 tiene las características mostradas en la Figura 26.

Ejemplo 21 Presentación de Fv de cadena única y de fragmentos Fab derivados de anticuerpo anti-oxazolona NQ 10.12.5 sobre bacteriófago fd, utilizando pHEN1 y fdCAT2

Este ejemplo describe la presentación de scFv y de un fragmento Fab con una especificidad frente a phox sobre la superficie de un bacteriófago. Para la presentación de scFv el fagémido pHEN1 comprende las secuencias que codifican para scFv (VH y VL) para rescate por o bien los fagos VSM13 o fdCAT2. Para la presentación de Fab, el fago fdCAT2 comprende la secuencia de o bien la cadena L o la cadena H como una fusión con g3p y el fagémido pHEN1 comprende la secuencia para el socio apropiado de la cadena L o la cadena H.

Ejemplo 22 Rescate de fagémido que codifica para una proteína de fusión del gen III con cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo mediante codificación por fago del anticuerpo complementario presentado sobre fago y la utilización de esta técnica para preparar librerías de combinatoria dual

Este ejemplo cubre la utilización de anticuerpos fago que codifican para la cadena ligera o pesada de anticuerpo, para rescatar un fagémido que codifica para una fusión de proteína del gen 3 con la cadena complementaria y el ensayo de fragmentos Fab presentados sobre fago en ELISA. Se discute la utilización de esta técnica en la preparación de una librería combinatoria dual.

Ejemplo 23 Inducción de scFv soluble y de fragmentos Fab que utilizan el fagémido pHEN1

Este ejemplo cubre la generación de scFv soluble y de fragmentos Fab, a partir de fusiones de gen III con secuencias que codifican para estos fragmentos mediante la expresión de clones en pHEN1 en una cepa de E. coli, que no se suprime después de las mutaciones.

Ejemplo 24 Sensibilidad incrementada en ELISA de lisozima, utilizando fdTscFvD1.3 como anticuerpo primario comparado con scFvD1.3 soluble

Este ejemplo cubre la utilización de fdTscFvD1.3 en ELISA, que demuestra que con el anticuerpo de fago fdTscFv
D1.3 pueden ser detectadas cantidades inferiores de lisozima que con scFvD1.3 soluble.

Ejemplo 25 Rescate directo y expresión de anticuerpos monoclonales de ratón como fragmentos Fv de cadena sencilla sobre la superficie de bacteriófago fd

Este ejemplo cubre la presentación sobre fago como fragmentos scFv funcionales de dos clones directamente derivados a partir de células que expresan anticuerpos monoclonales dirigidos frente a oestriol. Ambos clones fueron establecidos como funcionales utilizando ELISA.

Ejemplo 26 Ensamblaje PCR de ADN que codifica para el fragmento Fav de un anticuerpo dirigido frente a oxazolona

Este ejemplo cubre la construcción de un inserto de ADN que codifica para un fragmento Fab por medio de amplificación separada de secuencias de ADN de cadena ligera y cadena pesada, seguido de ensamblado. La construcción fue insertada después en el vector fago fdCAT2 y el vector fagémido pHEN1 y el fragmento Fab presentado sobre la superficie demostró ser funcional.

Ejemplo 27 Construcción de un fago auxiliar deficiente en gen III

Este ejemplo describe la construcción de un fago auxiliar derivado de M13K07, mediante la supresión de secuencias en el gen III. Se describe el rescate de pCAT3-scFvD1.3. El scFvD1.3 es expresado a un elevado nivel como una fusión utilizando fago de supresión, equivalente a la expresión que utiliza fdCAT2-scFvD1.3.

Ejemplo 28 Selección de bacteriófago que expresa fragmentos scFv dirigidos frente a lisozima a partir de mezclas según afinidad, utilizando un procedimiento de reconocimiento y selección

Este ejemplo concierne a la selección de bacteriófago según la afinidad del fragmento scFv dirigido hacia lisozima, que es expresado sobre su superficie. Los fagos de diferentes afinidades fueron unidos a platos Petri revestidos con lisozima y, después de lavado, el fago unido eluido utilizando trietilamina. Se encontraron condiciones en las que el enriquecimiento sustancial pudo ser obtenido para un fago con afinidad 5 veces más elevada que para el fago con el cual fue mezclado.

Ejemplo 29 Generación y selección de mutantes de un anticuerpo ácido anti-4-hidroxi-3-nitrofenilacético (NP) expresado sobre fago utilizando cepas de mutador

Este ejemplo cubre la introducción de mutaciones en un gen para un anticuerpo clonado en fago, mediante crecimiento del fago en cepas que mutan al ADN aleatoriamente debido a defectos en replicación de ADN. Se introducen diversas mutaciones en el fago, las cuales pueden ser después seleccionadas a partir de fago padre.

Ejemplo 30 Técnica basada en PCR para un paso de clonado de genes V humanos como construcciones Fab

Este ejemplo proporciona procedimientos para el ensamblaje de fragmentos Fab a partir de genes para anticuerpos. Se proporcionan ejemplos para genes de anticuerpos dirigidos frente a Rhesus-D en hibridoma humano y una línea celular linfoblástica policlonal.

Ejemplo 31 Selección de fago que presenta un fragmento Fab humano dirigido hacia el antígeno Rhesus-D, a través de unión a células que presentan el antígeno rhesus D sobre su superficie

Este ejemplo está relacionado con la construcción de y la presentación de anticuerpos fago procedentes de un fagémido que codifica para un fragmento Fab humano dirigido contra el antígeno Rhesus D. Los fagos que presentan este antígeno fueron después seleccionados por afinidad a partir de un fondo de fagos que presenta anti-lisozima scFvD1.3, sobre la base de unión a glóbulos rojos de Rhesus-D positivo.

Ejemplo 32 Técnica basada en PCR para el clonado en un solo paso de construcciones scFv humanas

Este ejemplo describe la generación de librerías de fragmentos scFv derivados de humano no inmunizado. Se proporcionan ejemplos de la preparación para la presentación de fago de librerías en fagémidos de fragmentos de scFv derivados de IgG y de secuencias de IgM.

Ejemplo 33 Aislamiento de actividades de unión procedentes de una librería de scFvs de un humano no inmunizado

Este ejemplo describe el aislamiento, desde la librería de fragmentos scFv derivados de genes IgM de humano no inmunizado, de clones para anticuerpos fago dirigidos frente a BSA, lisozima y oxazolona. La selección se efectuó a través de reconocimiento y selección o cromatografía de afinidad y análisis de especificidad de unión a través de ELISA. El secuenciado de los clones mostró que los mismos tenían origen humano.

Ejemplo 34 Rescate de librería de IgM humana utilizando un fago auxiliar que carece del gen 3 (\Deltag3)

Este ejemplo cubre el aislamiento, a partir de la librería de fragmentos scFv de genes IgM de humano no inmunizado, de clones de anticuerpo fago para anticuerpos fago específicos para tiroglobulina y oxazolona. En este ejemplo, el rescata se llevó a cabo con M13K07gIIIN13 (NCTC12478), un auxiliar de fago defectuoso en gen III. Pocas rondas de selección resultaron aparentemente necesarias para rescatar una librería de fagémidos con este fago, en comparación con el rescate llevado a cabo con M13K07.

Ejemplo 35 Alteración de la especificidad fina de scFvD1.3 desplegada sobre fago mediante mutagénesis y selección sobre lisozima de pavo inmovilizada

Este ejemplo cubre la mutagénesis in vitro de pCATscFvD1.3, mediante sustitución, con aminoácidos aleatorios, de restos conocidos por ser importantes en el reconocimiento preferencial de lisozima de huevo de gallina sobre lisozima de huevo de pavo, por medio de scFvD1.3. Después de la selección en búsqueda de anticuerpos fago que reconocen el lisozima de huevo de pavo mediante cromatografía de afinidad, se analizaron los clones en relación con su especificidad a través de ELISA. Se averiguó que existían dos grupos de clones con reconocimiento más igualado de lisozimas de gallina y de pavo, uno con señal ELISA incrementada con el enzima de pavo y otro con señal reducida para el enzima de gallina.

Ejemplo 36 Modificación de la especificidad de un anticuerpo mediante sustitución del dominio VLK por una librería derivada de ratón no inmunizado

Este ejemplo muestra que la sustitución de dominio VL de scFvD1.3 específico para lisozima de clara de huevo de gallina (TEL) por una libraría de dominios VL permite la selección de fragmentos scFv que se unen también a lisozima de clara de huevo de pavo (TEL). Los fragmentos scFv fueron presentados sobre fago y la selección se llevó a cabo mediante reconocimiento y selección sobre tubos revestidos con TEL. El análisis mediante ELISA mostró clones con unión reforzada a TEL, en comparación con HEL. Los que poseían una unión más elevada con HEL fueron secuenciados.

Ejemplo 37 Selección de especificidad de anticuerpo fago a través de unión con un antígeno unido a bolitas magnéticas. Utilización de un reactivo rompible para permitirlo. Elución del fago unido en condiciones moderadas

Estos ejemplos cubren la utilización de un enlace rompible en el procedimiento de selección por afinidad, para permitir la liberación de fago unido en condiciones moderadas. El pAbNQ11 estaba enriquecido aproximadamente 600 veces a partir de una mezcla con pAbD1.3, mediante selección utilizando Ox-BSA biotinilado unido a bolitas magnéticas. La rotura de un enlace entre BSA y la biotina permite la elución del fago.

Ejemplo 38 Utilización de selección celular para proporcionar un grupo enriquecido de genes de anticuerpo específico para antígeno, aplicación a la reducción de la complejidad de repertorios de fragmentos de anticuerpo presentados sobre la superficie de bacteriófago

Este ejemplo cubre la utilización de selección celular para producir un grupo enriquecido de genes que codifican para anticuerpos dirigidos frente a ácido 4-hidroxi-3-nitrofenilacético y describe como esta técnica podría ser utilizada para reducir la complejidad de repertorios de anticuerpo presentados sobre la superficie de bacteriófago.

Ejemplo 1 Diseño de materiales de unión en punto de inserción y construcción de vectores

El vector fd-tet tiene dos puntos de restricción BstEII que flanquean al gen de resistencia a la tetraciclina (Figura 3). Dado que la estrategia para la inserción de los fragmentos VH era la de unir los mismos en un nuevo punto BstEII insertado dentro del gen III, resultaba ventajoso suprimir los puntos BstEII originales del fd-tet. Ello se lograba mediante digestión del fd-tet con el enzima de restricción BstEII, rellenando en el sobrecolgante 5’ y religando para generar el vector fdT\deltaBst. La digestión de fd-tet con el enzima de restricción BstEII (0,5 unidades/\mul) fue llevada a cabo en tampón 1 x KGB (glutamato de potasio 100 mM, Tris acetato 23 mM (pH 7,5), acetato de magnesio 10 mM, sueroalbúmina bovina 50 \mug/ml, ditiotreitol 0,5 mM (Sambrook, J. et al., 1989, supra), con ADN a una concentración de 25 ng/ml. El sobrecolgante 5’ fue rellenado utilizando tampón 2 x KGB, dNTP’s cada uno 250 \muM (Pharmacia Ltd., Pharmacia House, Midsummer Boulevard, Milton Keynes, Bucks, UK) y Klenow Fragment (Amersham Internacional, Lincoln Place, Green End, Aylesbury, Bucks, UK) a razón de 0,04 unidades/\mul. Tras incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se extrajo el ADN con fenol/cloroformo y se precipitó con
etanol.

Las uniones se llevaron a cabo a una concentración de ADN de 50 ng/\mul). Las uniones fueron transformadas en células TG1 competitivas y colocadas sobre placas TY suplementadas con tetraciclina 15 \mug/ml. Esto permite seleccionar vectores en los que el gen de la proteína de resistencia a tetraciclina se ha reinsertado en el vector durante la fase de unión. Se eligieron colonias en 25 mls de medio 2 x TY suplementado con tetraciclina 15 \mug/ml y se cultivó durante el transcurso de una noche a 37ºC.

ADN de doble hebra fue purificado a partir de los clones resultantes utilizando el kit de limpiado de genes II (Bio101 Inc., PO Box 2284, La Jolla, California, 92038-2284, USA) y según el procedimiento de aislamiento rápido de ADN de plásmido a pequeña escala descrito en el mismo. La orientación de 5 de los clones resultantes fue comprobada utilizando el enzima de restricción Clal. Se eligió un clon que proporcionó el mismo patrón de restricción mediante Clal como fd-tet, pero que no tenía puntos BstE II.

La mutagénesis in vitro de fdT\deltaBst se utilizó para generar vectores que tienen puntos de restricción adecuados que facilitan el clonado de fragmentos de anticuerpo aguas abajo del péptido señal del gen III y en la estructura con la secuencias de codificación del gen III. La versión 2 del sistema de mutagénesis dirigida a oligonucleótido (Amersham Internacional) se utilizó con oligo 1 (Figura 4) para cerar fdTPs/Bs (para facilitar el clonado de fragmentos VH). La secuencia offdTPs/Bs (Figura 4) fue confirmada utilizando el kit de la versión 2.0 sequenasa (USB Corp., PO Box 22400, Cleveland, Ohio, 44122, USA) con oligo 3 (Figura 4) como cebador.

Un segundo vector fdTPs/xh (para facilitar el clonado de fragmentos Fv de cadena única) se generó por medio de mutagenización de fdTPs/Bs con oligo 2 según el procedimiento de Venkitaraman, A.R. Nucl. Acid. Res. 17, p.3314. La secuencia de fdTPs/Xh (Figura 4) fue confirmada utilizando el kit versión 2.0 de sequenasa (USB Corp.) con oligo 3 como cebador.

Claramente, construcciones alternativas resultarán evidentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, M13 y/o su bacteria huésped podrían ser modificados de tal forma que su gen III pudiera ser interrumpido sin la ocurrencia de excesiva muerte celular; el fd gen III modificado u otra proteína modificada podría ser incorporada en un plásmido que contuviera un origen de replicación de fago de hebra única, tal como pUC119, dando lugar después la superinfección resultante a la encapsulación del genoma de anticuerpo de fago en un revestimiento parcialmente derivado del fago auxiliar y parcialmente de la construcción del gen III de anticuerpo de fago.

La construcción detallada de un vector tal como fdTPs/Bs es tan solo una vía de lograr la terminación de un anticuerpo de fago. Por ejemplo, para evitar la utilización de digeridos de enzima de restricción y/o los pasos de unión, podrían ser utilizadas técnicas tales como clonado de pie pegajoso/mutagénesis (Claxon, T. and Winter, G., 1989 Nucl. Acids. Res. 19, p10163-10170).

Ejemplo 2 Inserción de dominio Fv de inmunoglobulina en fago

El plásmido scFv D1.3 myc (obsequio de g. Winter y A. Griffiths) contiene secuencias VH y VL procedentes del anticuerpo D1.3, fusionado a través de una secuencias de unión para formar una versión Fvd de cadena única de anticuerpo D1.3. La secuencia de scFv y las secuencias circundantes en scFvD1.3 se muestran en la Figura 5.

El anticuerpo D1.3 es dirigido frente a lisozima de huevo de gallina (Harper, M. et al., 1987, Molec. Immunol. 24, 97-108) y la forma scFv expresada en E. coli tiene la misma especificidad (A. Griffiths and G. Winter personal communication).

La digestión de scFvD1.3 myc con Pst1 y Xhol (estos puntos de restricción son mostrados en la Figura 5), proporciona un fragmento de 693 bp que codifica para el volumen de scFv. La unión de este fragmento a fdTPs/Xh roto con Pstl y Xhol dio lugar a la construcción fdTscFvD1.3, que codifica para el péptido señal de gen III y el primer aminoácido fusionado con el scFvD1.3 completo, seguido de la proteína de gen III madura a partir del aminoácido 2.

El vector fdTPs/Xh fue preparado para unión mediante digestión con el Pst1 y Xhol durante 2 horas, seguido de digestión con fosfatasa alcalina intestinal de ternera (Boehringer Manheim UK Ltd, Bell lane, Lewes, East Sussex, BN7 1LG) a razón de 1 unidad/\mul durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió fosfatasa alcalina intestinal de ternera fresca hasta alcanzar una concentración total final de 2 unidades/\mul y se procedió a incubación durante un período adicional de 30 minutos a 37ºC. La reacción fue extraída tres veces con fenol/cloroformo, precipitada con etanol y disuelta en agua. El inserto procedente de scFvD1.3 myc fue separado con los enzimas de restricción adecuados (Pstl y Xhol) extraído dos veces con fenol/cloroformo, precipitado con etanol y disuelto en agua. Las uniones se llevaron a cabo tal y como se describe en el ejemplo 1, con la excepción de que tanto las muestras de vector como de insertos tenían una concentración final de 5 ng/\mul cada una de ellas. La formación de la construcción correcta fue confirmada mediante secuenciado, tal y como se describe en el ejemplo 1.

Para demostrar que se producían proteínas del tamaño esperado, se concentraron viriones mediante precipitación con PEG, tal y como se ha descrito anteriormente. Las muestras fueron preparadas para electroforesis tal y como se describe en Sambrook et al, 1989 supra. El equivalente a 2 mls de sobrenadante fue cargado sobre un gel de poliacrilamida SDS 18%. Después de la electroforesis, el gel fue sumergido en tampón revelador de gel (tris 50 mM, Glicina 380 mM, SDS 0,1%) con metanol 20%, durante un período de 15 minutos. La transferencia a un filtro de nitrocelulosa fue ejecutada en tampón de revelado 1x fresco/metanol 20%, utilizando TE70 Semi Phor, un aparato para manchas semisecas (Hoeffer, 654 Minnesota Street, Box 77387, San Francisco, California 94107, USA).

Después de la transferencia, el filtro fue bloqueado mediante incubación por espacio de 1 hora en solución al 2% de polvo de leche (Marvel) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La detección de scFv y de las secuencias de proteína VH en las proteínas de fusión de anticuerpo de fago fue efectuada mediante inmersión del filtro durante 1 hora con una dilución 1/1000 (en polvo de leche al 2%) de un antisuero policlonal de conejo obtenido contra afinidad purificada, que expresaba bacterialmente el fragmento scFv (obsequio de G. Winter). Después de lavado con PBS (lavados de 3 x 5 minutos), el anticuerpo unido inicialmente fue detectado utilizando un anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano (Sigma, Fancy Road, Poole, Dorset, BH17 7NH, UK) durante 1 hora. El filtro fue lavado en PBS/tritón X-100 0,1% y revelado con tetrahidrocloruro de 3,3’-diaminobencidina (DAB) 0,5 mg/ml; cloruro de cobalto 0,02%; peróxido de hidrógeno 0,03% en PBS.

Los resultados mostraron que con clones fdTVHD1.3 (procedentes del ejemplo 3 que incorporan las secuencias que codifican para VH) y fdTscFvD1.3 (que incorpora secuencias de codificación para scFv), una proteína de entre 69.000 y 92.000 daltons resulta detectable mediante suero anti-Fv. Este es el tamaño esperado para las proteínas de fusión construidas. Este producto no es observado en sobrenadantes procedentes de fd-tet, fdT\deltaBst o fdTPs/Xh.

Ejemplo 3 Inserción de dominio VH de inmunoglobulina en anticuerpo fago

El fragmento VH procedente de D1.3 fue generado a partir del plásmido pSW1-VHD1.3-TAG1 (Ward, E.S. et al., 1989 supra.). La digestión de este plásmido con Pst1 y BstEII genera el fragmento mostrado entre las posiciones 113 y 432 en la Figura 5. El clonado de este fragmento en los puntos Pst1 y BstEII de fdTPs/Bs dio lugar a la construcción fdVHD1.3 que codifica para una proteína de fusión con un dominio VH completo insertado entre el primer y tercero aminoácido de la proteína del gen III madura (el aminoácido dos ha sido suprimido).

Los procedimientos utilizados fueron exactamente los mismos que en el ejemplo 2, con la excepción de que el vector utilizado era fdTPs/Bs digerido con Pst1 y BstEII.

Ejemplo 4 Análisis de especificidad de unión de anticuerpos fago

La unión de los diversos anticuerpos de fago al antígeno, lisozima, específico fue analizada utilizando técnicas ELISA. Anticuerpos fago (por ejemplo, fdTVHD1.3 y fdTsc/FvD1.3) fueron cultivados en E. coli y partículas de anticuerpo de fago fueron precipitadas con PEG, tal y como se describe en los materiales y procedimientos. Las partículas de anticuerpo de fago unidas fueron detectadas utilizando suero policlonal de oveja obtenido frente el fago M13 estrechamente relacionado.

Se prepararon placas ELISA mediante revestimiento de placas de 96 pocillos (Placa flexible Falcon Microtest III. Falcon: Becton Dickinson Labware, 1950 Williams Drive, Oxnard, California, 93030, USA) con 200 \mul de una solución de lisozima (1 mg/ml, salvo que se indique lo contrario) en 50 mm de NaHCO_{3} durante 16-24 horas. Antes de la utilización, esta solución fue extraída, la placa enjuagada varias veces con PBS e incubada con 200 \mul de polvo de leche al 2%/PBS, durante 1 hora. Después de enjuagar durante varias veces con PBS, se añadieron 100 \mul de las muestras de prueba y se incubaron durante 1 hora. Las placas fueron lavadas (3 enjuagues en Tween 20 0,05%/PBS, seguido de 3 lavados con PBS en solitario). Los anticuerpos de fago unidos fueron detectados mediante la adición de 200 \mul/pocillo de una dilución 1/1000 de antisuero policlonal anti-M13 de oveja (obsequio de G. Winter, si bien puede prepararse un anticuerpo equivalente por parte de un experto en la materia, utilizando metodologías convencionales) en polvo de leche al 2%/PBS e incubando durante 1 hora. Después de lavar tal y como se ha indicado anteriormente, las placas fueron incubadas con anticuerpo anti-oveja biotinilado (Amersham Internacional) durante 30 minutos. Las placas fueron lavadas como anteriormente e incubadas con complejo estreptavidina/peroxidasa de rábano (Amersham Internacional). Después de un lavado final, tal y como se ha indicado anteriormente, se añadieron sustrato ABTS 0,5 mg/ml en tampón citrato (ABTS= ácido 2’2’-azinobis-(3-etilbenzotiazolin sulfónico); tampón citrato= ácido cítrico 50 mM, citrato trisódico 50 mM a una relación de 54:46. Se añadió peróxido de hidrógeno hasta alcanzar una concentración final de 0,003% y las placas incubadas durante 1 hora. La densidad óptica a 405 nm fue leída en un lector de placa multiskan Titerlek.

La Figura 6 muestra el efecto derivado de variar la cantidad de anticuerpo fago. 100 \mul de diversas diluciones de fago precipitado con PEG fueron aplicadas y la cantidad expresada en términos del volumen de cultivo original del cual derivaba. Las señales derivaban tanto del scFv que contenía el anticuerpo fago (fdcsFvD1.3) como del anticuerpo fago que contenía VH (fdTVHD1.3) y la del anticuerpo fago que contenía VH era más elevada que la derivada del vector anticuerpo fago (fdTPs/Xh). La señal más elevada con relación al ruido tenía lugar utilizando el equivalente de 1,3 mls de cultivo.

La Figura 7 muestra el resultado de revestir las placas con concentraciones variantes de lisozima o de sueroalbúmina bovina (BSA). Se utilizó el equivalente a 1 ml de sobrenadante de cultivo de anticuerpo de fago original. Las señales procedentes del sobrenadante derivaban de fdTscFvD1.3 eran de nuevo más elevadas que las derivadas de fdTPs/Xh, cuando se utilizaban pocillos revestidos con lisozima. No existían diferencias significativas entre estos dos tipos de sobrenadante cuando las placas fueron revestidas con BSA. En términos amplios, el nivel de señal sobre las placas es proporcional a la cantidad de lisozima revestida. Estos resultados demuestran que la unión detectada es específica para lisozima como antígeno.

Ejemplo 5 Construcción de fdCAT2

Resultaría de utilidad diseñar vectores que permitieran la utilización de enzimas de restricción que cortasen al ADN de forma infrecuente, evitando de este modo la digestión no querida de los insertos de gen de anticuerpo dentro de sus secuencias de codificación. Los enzimas con una secuencia de reconocimiento de ocho bases resultan particularmente útiles a este respecto, por ejemplo, Notl y Sfil. Chaudhary et al (PNAS 87 p1066-1070, 1990) han identificado un determinado número de puntos de restricción los cuales raramente ocurren en genes variables de anticuerpo. El solicitante ha diseñado y construido un vector que utiliza dos de estos puntos, como un ejemplo de cómo este tipo de enzima puede ser utilizado. Los puntos esenciales para los enzimas ApaL1 y Not1 fueron diseñados por ingeniería en fdTPs/Xh para crear fdCAT2.

El oligonucleótido:

: 5’ACT TTC AAC AGT TTC TGC GGC CGC CCG TTT GAT CTC GAG CTC CTG CAG TTG GAC CTG TGC ACT GTG AGA ATA GAA 3’ fue sintetizado (supra leyenda Figura 4) y utilizado para mutageneizar fdTPs/Xh utilizando un kit de mutagénesis in vitro obtenido en Amersham Internacional, tal y como se describe en el ejemplo 1, para crear fd-CAT2. La secuencia de fd-CAT2 fue comprobada alrededor del punto de manipulación mediante secuenciado de ADN. La secuencia final alrededor del punto de inserción dentro del gen III es mostrada en la Figura 8.

N.B. fdCAT2 es también identificado en el presente documento mediante las terminologías alternativas fd-tet-DOG1 y fdDOG1.

Ejemplo 6 Unión específica de fago-anticuerpo (pAb) a antígeno

La unión de pAb D1.3 (fdTscD1.3 del ejemplo 2) a lisozima fue analizada adicionalmente mediante ELISA.

Procedimientos 1. Crecimiento de fago

Cultivos de bacterias transducidas por fago fueron preparados en 10-100 mls de medio 2 x TY con tetraciclina 15 \mug/ml y cultivados con agitación a 37ºC durante 16-24 horas. El sobrenadante de fago fue preparado mediante centrifugación del cultivo (10 min a 10.000 rpm, rotor 8 x 50 ml, centrifugadora Sorval RC-5B). En este estadio, la valoración del fago era 1-5 x 10_{10}/ml unidades transductoras. El fago fue precipitado mediante la adición de 1/5 de volumen PEG 20% Na Cl 2,5M, dejándole durante 1 hora a 4ºC, y centrifugando (supra). Los pellets de fago fueron resuspendidos en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0 a 1/100 del volumen original y las bacterias residuales y los fagos acumulados extraídos mediante centrifugación durante 2 minutos en una microcentrifugadora bench.

ELISA

Se revistieron placas con antígeno (antígeno 1 mg/ml) y se bloquearon tal y como se describe en el ejemplo 4. 2 x 10_{10} unidades transductoras de fago fueron añadidas a las placas revestidas con antígeno en solución salina tamponada con fosfato (PBS) conteniendo polvo de leche desnatada al 2% (MPBS). Las placas fueron lavadas entre cada uno de los pasos con tres enjuagues de Tween 20 0,5% en PBS, seguido de tres enjuagues de PBS. El fago unido fue revelado mediante incubación con antisueros anti-M13 de oveja y detectado con suero anti-cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma, Poole, Dorset, UK), el cual también detecta inmonuglobulinas de oveja y ABTS (ácido 2’2’-azinobis-3-etilbenzo-tiazolin-sulfónico). Las lecturas fueron tomadas a 405 nm después de transcurrido un período de tiempo adecuado. Los resultados (Figura 9) muestran que el fago que soporta el anticuerpo tenía el mismo patrón de reactividad que el anticuerpo D1.3 original (Harper, M., Lema, F., Boulot, G., y Poljak, F.J. (1987) Molec. Immunol. 24 97-108) y unido a lisozima de clara de huevo de gallina, pero no a lisozima de clara de huevo de pavo, lisozima humana o sueroalbúmina bovina. La especificidad del fago resulta particularmente ilustrada por la falta de unión a lisozima de clara de huevo de pavo, que difiere del lisozima de clara de huevo de gallina por tan solo 7
aminoácidos.

Ejemplo 7 Expresión de Fab D1.3

La finalidad de este ejemplo era la de demostrar que el formato scFv utilizado en el ejemplo 2 era tan solo una vía para presentar fragmentos de anticuerpo en el sistema pAb. Un fragmento de anticuerpo más comúnmente utilizado es el fragmento Fab (Figura 1) y este ejemplo describe la construcción de un pAb que expresa un fragmento similar a Fab sobre su superficie y muestra que se une de forma específica a su antígeno. El solicitante eligió expresar la cadena pesada del fragmento de anticuerpo, que comprende los dominios VH y CHI procedentes de secuencias de codificación dentro del propio pAb, y co-expresar la cadena ligera en la célula huésped bacteriana infectada con el pAb. Las regiones VH y CHI del anticuerpo anti-lisozima D1.3 fueron clonadas en fdCAT2 y la correspondiente cadena ligera clonada en el plásmido pUC19. El trabajo de Skerra y Pluckthun (Science 240, p1038-1040 (1988) y de Better et al., 1988, supra, demostraron que fragmentos de unión a antígeno multímeros de la molécula de anticuerpo podían ser secretados en el periplasma de la célula bacteriana de una forma funcional, utilizando secuencias señal adecuadas. No obstante, en estas publicaciones, se describieron medidas especiales como necesarias para recuperar la proteína de unión a partir de la célula, por ejemplo Skerra y Pluckham necesitaron recuperar el fragmento Fv procedente del periplasma mediante cromatografía de afinidad. Los presentes solicitantes han demostrado que resulta posible dirigir la molécula de unión hacia el exterior de la célula sobre una partícula de fago, un proceso que requiere la ocurrencia de diversos acontecimientos: correcta secreción y doblado de la molécula de unión; asociación de las cadenas de la molécula de unión; ensamblaje correcto de la partícula de fago y exportación de la partícula de fago intacta desde
la célula.

Alternativamente, resulta posible, no obstante, expresar la cadena ligera desde dentro del genoma pAb a través de, por ejemplo, clonar un casette de expresión en un lugar adecuado en el genoma del fago. El citado lugar adecuado estaría situado en le región intergénica que alberga los puntos de multiclonado diseñados mediante ingeniería del fago M13 relacionado (ver, por ejemplo, Yanisch-Perron, C et al., Gene 33, p103-119 (1985)).

El punto de partida para este ejemplo era el clon Fab D1.3 en pUC19, un mapa del cual es mostrado en la Figura 10. Las regiones hibridan con los oligonucleótidos KSJ6 y 7 son mostradas subrayadas en la Figura 10. La secuencia que codifica para la región VH-CHI (definida en los extremos 5’ y 3’ por los oligonucleótidos KSJ6 y 7 indicados más adelante) fue amplificada mediante PCR a partir de FabD1.3 en pUC19, utilizando los oligonucleótidos KSJ6 y 7, los cuales retienen el punto Pst I en el extremo 5’ e introducen un punto Xho I en el extremo 3’, para facilitar el clonado en fd CAT2. Las secuencias para los oligonucleótidos KSJ6 y 7 son mostradas más adelante. La región subrayada de KSJ7 muestra la porción que hibrida con la secuencia para D1.3.

KSJ6: 5’ AGG TGC AGC TGC AGG AGT CAG G 3’

KSJ7: 5’ GGT GAC CTC GAG TGA AGA TTT GGG CTC AAC TTT C 3’

Las condiciones PCR fueron las descritas en el Ejemplo II, con la excepción de que treinta ciclos de amplificación PCR fueron llevados a cabo con desnaturalización a 92ºC durante 45 segundos, anillando a 55ºC durante 1 minuto y extensión a 72ºC durante 1 minuto. La plantilla utilizada era ADN procedente de células TG1 que contenía FabD1.3 en pUC19 resuspendido en agua y hervida. El ADN de plantilla fue preparado a partir de colonias, mediante la elección de algún material de colonia en 100 \mul de H_{2}O destilada e hirviendo durante 10 minutos. 1 \mul de esta mezcla fue utilizado en una PCR de 20 \mul. Este régimen dio lugar a amplificación del fragmento esperado de aproximadamente 600 bp. Este fragmento fue cortado con Pst I y Xho I, purificado a partir de un gel de agarosa y ligado en Pst 1/Xho 1-corte fdCAT2. La mezcla PCR fue extraída con fenol/cloroformo y precipitada con etanol (Sambrook et al., supra) antes de la digestión con Pst1 y Xho1 (New England Biolabs), según las recomendaciones de los fabricantes. El fragmento fue resuelto sobre gel agarosa EDTA Tris-acetat 1% (Sambrook et al., supra) y purificado utilizando Geneclean (BIO 101, Geneclean, La Jolla, San Diego, California, USA), según las recomendaciones de los
fabricantes.

El ADN vector fd-CAT2 fue digerido con Pst1 y Xho 1 (New England BioLabs), según las recomendaciones de los fabricantes, extraído con fenol/cloroformo y precipitado con etanol (Sambrook et al., supra).

75 ng del vector ADN digerido por Pst1/Xho 1 fueron ligados a 40 ng de fragmento hEGR-R digerido con Pstl/Xho-1 y amplificado con PCR, en 12 \mul de tampón de unión (TrisHCl 66 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 5 mM, ditiotreitol 5 mM, (sueroalbúmina bovina 100 \mug/ml, ATP 0,5 mM, espermidina 0,5 mM) y 40C unidades de T4 ADN ligasa (New England BioLabs), durante 16 horas a 16ºC.

Dos \mul de la mezcla de unión fueron transformados en 200 \mul de células E. coli MC1061 competitivas, colocadas en placas sobre agar 2TY conteniendo tetraciclina 15 \mug/ml e incubadas a 30ºC durante 20 horas. Una parte de la mezcla de reacción de unión fue transformada en E. coli MC1061 (Disponible en, por ejemplo, Clontech Laboratorios Inc. Palo Alto, California) y las colonias se identificaron mediante hibridación con el oligonucleótido D1.3CDR3A, tal y como se describe en el ejemplo 10. La presencia del fragmento del gen VHCH1 fue identificada de forma similar mediante PCR, utilizando oligonucleótidos KSJ6 y 7. Un clon representativo fue denominado fdCAT2VHCH1D1.3. La cadena pesada fue suprimida del FabD1.3 en pUC19 mediante rotura Sph I del ADN plásmido FabD1.3. El fragmento pUC 19 2,7Kb que contiene el gen de cadena ligera fue purificado a partir del gel agarosa y 10 ng de este ADN autoligado y transformado en E. coli TG1 competitivo. Las células fueron colocadas en placas sobre agar 2TY conteniendo ampicilina (100 \mug/ml) e incubadas a 30ºC durante el transcurso de una noche. Las colonias resultantes fueron utilizadas para elaborar ADN miniprep (Sambrook et al., supra) y la ausencia del gen de cadena pesada fue confirmada a través de digestión con Sph I y Hind III. Un clon representativo fue denominado LCD1.3DHC.

Un cultivo a lo largo de toda una noche de células fd CAT2VHCH1 D1.3 fue microcentrifugado a 13.000 Xg durante 10 minutos y se añadieron 50 \mul del sobrenadante que contenía partículas de fago a 50 \mul de un cultivo de una noche de células LCD1.3DHC. Las células fueron incubadas a 37ºC durante 10 minutos y colocadas en placas sobre agar 2TY conteniendo ampicilina (100 \mug/ml) y tetraciclina 15 \mug/ml. Los fagos se prepararon a partir de algunas de las colonias resultantes y se sometieron a ensayo para determinar su capacidad de unión a lisozima, tal y como se ha descrito en el ejemplo 6.

Los resultados (Figura 11) demostraron que cuando los derivados Fab de cadena ligera y pesada procedentes del anticuerpo original D1.3 se encontraban presentes, el pAb se unía a lisozima. El pAb que expresa el fragmento fd VHCH1 no se unía a lisozima salvo que se cultivara en células que también expresasen la cadena ligera. Esto demuestra que se producía un fragmento Fab funcional, mediante una asociación de la cadena ligera libre con el fragmento VHCHI fusionado al gen III y expresado sobre la superficie del pAb.

Ejemplo 8 Aislamiento de fago específico, deseado, a partir de una mezcla de fago vector

El solicitante purificó pAb (D1.3) (denominado originalmente fdTscFvD1.3 en el ejemplo 2) a partir de mezclas que utilizan columnas de afinidad de antígeno. El pAb (D1.3) fue mezclado con el vector fd fago (ver tabla 1) y se hicieron pasar aproximadamente 10^{12} fagos a lo largo de una columna de lisozima-Sepharose (preparada a partir de sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia, Milton Keynes, Bucks, UK), según las instrucciones del fabricante. Células TG1 fueron infectadas con diluciones adecuadas de los eluídos y las colonias derivadas analizadas mediante sondaje con un oligonucleótido que detecta tan solo el pAb (D1.3), ver Tabla 1 y la Figura 12. Se observó un enriquecimiento de de pAb(D1.3) del orden de 1 000 veces, mediante un único paso por columna. Cultivando el fago enriquecido y haciéndolo pasar de nuevo por la columna se observaron enriquecimientos de hasta un millón de
veces.

Se demostró también el enriquecimiento utilizando criterios puramente inmunológicos. Por ejemplo, 10^{12} fagos (a una relación de 1 pAb (D1.3) a 4 x 10^{6} fdTPs/Bs) fueron sometidos a dos rondas de selección por afinidad y después se eligieron 26 colonias y se cultivaron durante el transcurso de una noche. Los fagos fueron después sometidos a ensayo para determinar la unión a lisozima, a través de ELISA (como en el ejemplo 6). Cinco colonias dieron lugar a fagos con actividades de unión a lisozima, ver la tabla 1, y se demostró que las mismas codificaban para scFv (D1.3) mediante cribado PCR (Ejemplo 13, utilizando 30 ciclos de 1 minuto a 92ºC, 1 minuto a 60ºC, 1 minuto a 72ºC, utilizando CDR3PCR1 y oligo 3 (Figura 4) como cebadores.

Así pues, pAbs muy raros pueden ser detectados a partir de grandes poblaciones utilizando antígeno para seleccionar y después cribar el fago.

En este ejemplo, se llevó a cabo la cromatografía por afinidad de pAbs y el sondaje de los oligonucleótidos tal y como se describe más adelante.

Aproximadamente 10^{12} partículas fago en 1 ml de MPBS fueron depositadas en una columna de afinidad de 1 ml de lisozima-Sepharose, la cual había sido prelavada con MPBS. La columna fue lavada a su vez con 10 ml de PBS; después con 10 ml de Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM pH 7,5; después con 10 ml de Tris-HCl 50 mM NaCl pH 8,5; seguido de 5 mls de Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM pH 9,5 (ajustado con trietilamina) y seguidamente eluida con 5 ml de trietilamina 100 mM. El eluido fue neutralizado con tampón fosfato sódico 0,5 M pH 6,8 y el fago colocado en placas para análisis. Para una segunda ronda de cromatografía por afinidad, el eluido de la primera columna fue colocado en placas, a razón de aproximadamente 30.000 colonias por plato de petri. Después de crecimiento durante el transcurso de una noche, las colonias fueron después colocadas por rascado en 5 ml de medio 2 x TY y una alícuota de 20 \mul fue diluida en 10 ml de medio fresco, cultivándose durante el transcurso de una noche. El fago fue precipitado con PEG, tal y como se ha descrito anteriormente, resuspendido en 1 ml de MPBS y depositado sobre la columna, lavado y eluido tal y como se ha indicado anteriormente. Los oligonucleótidos sintetizados eran:

: CDR3PCR1 5’TGA GGA C(A O T)C(A O T) GC CGT CTA CTA CTG TGC 3’

40 pmoles de oligonucleótido VH1FOR (Ward, E.S. et al., (1989) Nature 341, 544-546), específico para pAb (D1.3) fueron fosforilados con 100 \muCi\alpha-32P ATP, hibridados (1 pmol/ml) a filtros de nitrocelulosa a 67ºC en tampón 6 x citrato sódico salino (SSC) Sambrook et al, supra, durante 30 minutos y se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 30 minutos, lavándose con 3 x 1 min a 60ºC en 0,1 x SSC.

Ejemplo 9 Construcción de pAb que expresa actividad anti-hapteno

La oxazolona es un hapteno que es comúnmente utilizado para estudiar los detalles de la respuesta inmune. El anticuerpo anti-oxazolona, NQ11, ha sido descrito previamente (E. Gherardi, R. Pannell, C. Milstein, J. Immunol. Method 126 61-68). Un plásmido que contiene el gen VH y VL de NQ11 fue convertido en una forma scFv mediante la inserción del fragmento BstEII/Sacl de scFvD1.3 myc (nucleótidos 432-499 de la Figura 5) entre los genes VH y VL, para generar pscFvNQ11, la secuencia del cual es mostrada en la Figura 13. Este scFv fue clonado en el punto Pstl/Xhol de FdTPs/Xh (tal y como se ha descrito anteriormente) para generar pAbNQ11 que tiene un punto interno Pst1, por lo que resultó necesario llevar a cabo una digestión completa del pscFvNQ11 con Xhol, seguida de una digestión parcial con Pst1).

La unión específica de pAbNQ11 fue confirmada utilizando ELISA. Placas ELISA fueron revestidas a 37ºC en NaHCO_{3} 50 mM, a una concentración de proteína de 200 \mug/ml. Las placas fueron revestidas o bien con lisozima de huevo de gallina (HEL). sueroalbúmina (BSA) 50 mM o BSA conjugada con oxazolona (OX-BSA) (procedimiento de conjugación en Makela O., Kartinen M., Pelkonen J.L.T., Karjalainen K. (1978) J. Exp. Med. 148 1644). La preparación del fago, la unión a placas ELISA, el lavado y la detección se llevaron a cabo tal y como se describe en el Ejemplo 6. Las muestras fueron ensayadas por duplicado y la absorbancia después de transcurridos 10 minutos presentada en la Figura 14.

Este resultado demuestra que el pAb NQ11 se une al antígeno correcto. La Figura 14 muestra también que el pAbD1.3 y el pAb NQ11 se une únicamente al antígeno frente al cual los anticuerpos originales fueron creados.

Ejemplo 10 Enriquecimiento de pAb D1.3 procedente de mezclas de otros pAb, mediante purificación por afinidad

3 x 10^{10} fagos en 10 ls. de PBSM, a las relaciones de pAb D1.3 a pAb NQ11 mostradas en la tabla 2, fueron hechos pasar sobre una columna de 1 ml de lisozima Sepharose. El lavado, la elución y otros procedimientos fueron llevados a cabo tal y como se describe en el Ejemplo 8, salvo que se indique lo contrario. Los eluidos procedentes de las columnas fueron utilizados para infectar células TG1, las cuales fueron después colocadas en placas. Las colonias fueron sondadas con una sonda que distingue pAbD1.3 de pAbNQ11. La secuencia de este oligonucleótido (D1.3CDR3A) es:

: 5’GTA GTC AAG CCT ATA ATC TCT CTC 3’

La tabla 2 presenta los datos procedentes de este experimento. Se alcanzó en enriquecimiento del orden de casi 1.000 veces en una ronda y un enriquecimiento superior a un millón tras dos rondas de purificación. Este resultado está en consonancia con el descrito en el Ejemplo 8.

Ejemplo 11 Inserción de moléculas de unión en puntos alternativos en el fago

La disponibilidad de un punto alternativo en el fago para la inserción de moléculas de unión abriría la posibilidad de expresar con mayor facilidad más de una molécula de unión, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, en un único pAb. Esto puede ser utilizado para generar especificidades de unión sencillas o múltiples. La presencia de dos actividades de unión diferentes sobre una única molécula incrementará en gran manera la utilidad y la especificidad de la misma. Ello puede resultar de utilidad en la unión de virus con una elevada velocidad mutacional, tales como el virus de inmunodeficiencia humano. Además, puede ser utilizado para ubicar antígenos en estrecha proximidad (por ejemplo, dirección de fármacos o fusión celular) o puede actuar como una "grapa molecular" en procesos enzimáticos, inmunológicos o químicos.

El vector fd-tet y los derivados descritos en el presente documento presentan un único punto BamH1 en el gen 3. Ello ha sido utilizado previamente para la expresión de fragmentos de péptido sobre la superficie de bacteriófago filamentoso (Smith GP, (1985), Science 228 p1315-1317 y De la Cruz et al., (1988) J. Biol. Chem. 263 p4318-4322). Ello proporciona un punto alternativo potencial para la inserción de fragmentos de anticuerpo.

Fragmentos de ADN que codifican para scFv’s procedentes de D1.3 o NQ11 fueron generados mediante PCR, utilizando los cebadores mostrados más adelante. Estos cebadores fueron diseñados para generar un fragmento con puntos BamH1 cerca de ambas terminaciones, para permitir el clonado en el punto BamH1 del gen 3 (ver la Figura 16(1)). Los oligonucleótidos utilizados aseguran también el que el producto PCR resultante carezca de los puntos de restricción Pstl y Xhol, utilizados normalmente para la manipulación de scFv’s(ver la Figura 16(1)). Esto facilitará la subsiguiente manipulación de un segundo fragmento de anticuerpo de la forma habitual en el N terminal del gen 3. Los oligonucleótidos utilizados eran:

: G3Baml 5’TTT AAT GAG GAT CCA CAG GTG CAG CTG CAA GAG 3’

: G3Bam2 5’AAC GAA TGG ATC CCG TTT GAT CTC AAG CTT 3’

Preparación de vector e inserto de PCR

La reacción de PCR fue llevada a cabo en una reacción de 80 \mul, tal y como se ha descrito en el ejemplo 11, utilizando 1 ng/\mul de plantilla y 0,25 U/pl de polimerasa Taq y un régimen de ciclo de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 70ºC durante 2 minutos, a lo largo de 30 ciclos. La plantilla era o bien pscFvNQ11 (Ejemplo 9) o scFvD1.3 (ejemplo 2). Los productos de reacción fueron extraídos con fenol/cloroformo, precipitados, disueltos en agua y digeridos con BamH1, según las instrucciones de los fabricantes. El digerido fue re-extraído con fenol/cloroformo, precipitado y disuelto en agua.

El vector fdTPs/Xh fue roto con BamHI y tratado con fosfatasa intestinal de ternera y purificado tal y como se describe en el ejemplo 2. Las uniones fueron establecidas a una concentración de vector de aproximadamente 6 ng/\mul y a una concentración de inserto de PCR de aproximadamente 3 ng/\mul. Se efectuó el ligado durante 2,5 horas, a temperatura ambiente, antes de la transformación en células TG1 competitivas y ubicadas en placas TY tet. Las colonias resultantes fueron sondadas tal y como se describe en el ejemplo 8. Se preparó ADN a partir de un determinado número de colonias y la correcta orientación y el tamaño del inserto fue confirmado mediante digestión por restricción con Hind III, en solitario o en combinación con BamH1. (Un punto Hind III es contribuido por uno de los cebadores y el otro por el vector).

Dos clones que contenían un inserto D1.3 (fdTBaml y fdTBam2 y uno que contenía un inserto NQ11 (NQ11 Baml) fueron cultivados y se preparó un fago, de acuerdo con lo que se ha descrito anteriormente. Se llevaron a cabo ELISAs, tal y como se describe en el Ejemplo 6. No se detectó ninguna señal específica para ninguno de estos clones, sugiriendo que el punto BamH1 de origen natural no resulta un punto adecuado para la inserción de un anticuerpo funcional (resultados no mostrados).

Puede resultar posible clonar, en puntos alternativos, para retener actividad de unión. Las repeticiones de péptido presentes en el gen III pueden proporcionar el citado punto (Figura 16 bloques A y B). Esto puede ser efectuado mediante la inserción de un punto BamHI y la utilización del producto PCR descrito anteriormente. Para facilitar esto, el punto BamHI fue eliminado mediante mutagénesis con el oligonucleótido G3mut\deltaBam mostrado más adelante (utilizando un kit de mutagénesis in vitro (Amersham Internacional)):

: G3mut\deltaBam 5’ CA AAC GAA TGG GTC CTC CTC ATT A 3’

El resto subrayado sustituye a un resto A, eliminando con ello el punto BamH1. Se preparó ADN a partir de un determinado número de clones y de varios mutantes que carecen de puntos BamH1, identificados mediante digestión por restricción.

El oligonucleótido G3 Bamlink fue diseñado para introducir un punto BamH1 en un determinado número de posibles emplazamientos dentro de los puntos A y B de componente de unión a péptido, ver la Figura 16(2). La secuencia del material de unión es:

: Bamlink 5’CC (G o A) CC ACC CTC GGA TCC (G o A) CC ACC CTC 3’

Su relación con las repeticiones de péptido en el gen III se muestra en la Figura 16.

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Ejemplo 12 Ensamblaje PCR de repertorios VL Kappa (VLK) y VH de ratón para presentación de fago

El principio es ilustrado en la Figura 17. En las secciones A a F, mostradas más adelante, se proporcionan detalles, pero primeramente se discute el planteamiento amplio.

1.: Se prepara cADN a partir de ARN de bazo procedente de un ratón adecuado y los repertorios VH y VLK amplificados individualmente. Separadamente, cebadores inversos y complementarios a VK1FOR-2 (dominio 1) y VLK2BACK (dominio 2) se utilizan para amplificar un ADN existente que contiene scFv, mediante PCR. (El término FOR se refiere a, por ejemplo, un cebador para amplificación de secuencias en la hebra sentido que da lugar a secuencias de codificación antisentido. El término BACK se refiere a, por ejemplo, un cebador para amplificación de secuencias sobre la hebra antisentido que da lugar a secuencias de codificación sentido). Esto genera una molécula "de unión" que codifica para el componente de unión con la secuencia de aminoácido (código de letra 1) (GGGS)_{3}, que se solapa con los dos productos PCR (VH y VLK) primarios.

2.: VL y VLK, amplificados por separado, y las secuencias de componente de unión han sido ahora ensambladas en una molécula de ADN continua, mediante la utilización de un PCR de "ensamblaje". En el "ensamblaje" secundario, PCR, VH, VLK y las bandas de componente de unión son combinados y ensamblados en virtud de los solapamientos mencionados anteriormente. Esto genera un fragmento de ADN ensamblado que dirigirá la expresión de VH y un dominio VLK. La combinación específica VH/VLK es derivada al azar a partir de los repertorios separados VH y VLK mencionados anteriormente.

El ensamblaje PCR se lleva a cabo en dos etapas. Primeramente, 7 rondas de ciclado con tan solo las tres bandas presentes en la PCR, seguido de 20 rondas adicionales en presencia de los cebadores flanqueantes VH1BACK (que hacen referencia al dominio 1 de VH) y VLKFOR). Las secuencias de oligonucleótidos para estos cebadores oligonucleótido se proporcionan bajo la sección titulada "secuencias de cebador", indicada más adelante. Este proceso en dos etapas evita el potencial problema de la amplificación preferencial de las primeras combinaciones que tienen que ser ensambladas.

Para el clonado en el sistema fago, los repertorios ensamblados tienen que ser "etiquetados" con los puntos de estricción apropiados. En el ejemplo proporcionado más adelante, esto se ilustra proporcionando un punto de restricción ApaL1 en el extremo VL de la molécula de ADN continua y un punto Not1 en el extremo VLK de la molécula. Esto se lleva a cabo a través de una tercera etapa PCR, usando cebadores etiquetados. Las secuencias de nucleótido para estos cebadores oligonucleótido se proporcionan también bajo la sección titulada "secuencias de cebador", indicada más adelante. Existen, no obstante, 4 posibles secuencias de cadena ligera kappa (si bien tan solo puede utilizarse una secuencia de cadena pesada consensuada). Por consiguiente, 4 secuencias de cebador oligonucleótido son proporcionadas por VLK.

\newpage

Para la primera etapa de PCR, se han utilizado grupos de cebadores que crean el nuevo punto de restricción y que tienen 10 nucleótidos adicionales en el lado 5’ del punto de restricción. No obstante, etiquetas largas pueden proporcionar un mejor corte, en cuyo caso podrían utilizarse sobrecolgantes de entre 15 y 20 nucleótidos.

Para evitar contaminación durante la PCR, procedimientos escrupulosamente limpios tiene que utilizarse en cualquier momento. Para monitorizar la contaminación, deben incluirse siempre controles negativos que no contengan ADN. Las cajas de gel deben ser despurinadas. Para extraer el ADN de un gel de agarosa puede utilizarse un kit dedicado de Geneclean (B10 101, Geneclean, La Jolla, San Diego, California, USA), según las instrucciones del fabricante. Las bolitas, Nal y el lavado NEW deben ser alicuotados.

La totalidad de los enzimas fueron obtenidos en CP Laboratorios., P.O. Box 22, Bishop’s Stortford, Herts CM20 3DH, y los tampones recomendados y proporcionados por los fabricantes fueron utilizados, salvo indicación en

\hbox{contrario.}

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A. Preparación de ARN

El ARN puede ser preparado utilizando procedimientos que son bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Como ejemplo, el siguiente protocolo (lisis Triton X-100, inactivación fenol/SDS ARNsa) proporciona excelentes resultados con células de bazo e hibridoma (la adición de VRC (complejo ribosil-veronal) como inhibidor de ARNsa resulta necesaria para las células de bazo). Los procedimientos con isotiocianato de guanidinio/CsCl (proporcionando el ARN celular total) proporcionaron también buenos resultados, pero requieren más tiempo.

1.: Se recogen de 1 a 5 x 10^{7} células mediante centrifugación en una centrifugadora bench tope a 800xg durante 10 minutos a 4ºC. Se resuspende suavemente en 50 ml de tampón PBS frío. Se efectúa un nuevo centrifugado de las células a 800xg, durante 10 minutos a 4ºC y se descarga el sobrenadante.

2.: Sobre hielo, se le añade al pellet 1 ml de tampón de lisis enfriado con hielo y se resuspende el mismo con una pipeta de Gibson de 1 ml, pipeteando suavemente arriba y abajo. Se deja en hielo durante 5 mi- nutos.

3.: Después de la lisis, se extrae el residuo mediante centrifugación a 1300 rpm durante 5 minutos en microfuga a 4ºC, en tubos pre-enfriados.

4.: Se transfieren 0,5 ml del sobrenadante a cada uno de dos eppendorfs que contienen 60 \mul de SDS (peso/volumen) 10% y 250 \mul de fenol (previamente equilibrado con Tris-HCl 100 mM, pH 8,0). Se aplica vortex duro durante 2 minutos, seguido de microfuga (13.000 rpm) durante cinco minutos a temperatura ambiente. Se transfiere la fase superior acuosa al nuevo tubo.

5.: Se re-extrae la fase acuosa superior cinco veces con 0,5 ml de fenol.

6.: Se precipita con 1/10 de volumen de acetato sódico 3M y 2,5 volúmenes de etanol a 20ºC, durante el transcurso de una noche o con isopropanol enfriado con hielo durante 30 minutos.

7.: Se lava el pellet de ARN y se resuspende en 50 \mul para comprobar la concentración mediante OD260 y se comprueban 2 \mug sobre gel de agarosa al 1%. Se obtienen 40 \mug de ARN a partir de células de bazo derivadas de ratón.

El tampón de lisis es [Tris-HCl 10 mM, pH 7,4; MgCl_{2} 1 mM; NaCl 150 mM; VRC 10 mM (New England Biolabs); Triton X-100 0,5% (peso/volumen)], recién preparado.

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B. Preparación de cADN

Se puede preparar cADN utilizando muchos procedimientos que resultan bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Como ejemplo, puede utilizarse el siguiente protocolo:

1. Se prepara la siguiente mezcla de transcripción inversa:

\newpage

	\mul
H_{2}O (tratada con DEPC)	20
dNTP 5 mM	10
10 x primer tampón de hebra	10
DTT 0,1M	10
Cebador(es) FOR (10 pmol/\mul)	2 (cada uno)(ver abajo)
ARNsina (Promega; 40 U/\mul)	4

NB

i): DEPC es dietilpirocarbonato, cuya función es la de inactivar cualquier enzima que pudiera degradar al ADN o ARN.

ii): dNTP es desoxinucleótido trifosfato

iii): DTT es ditiotreitol, cuya función es la de antioxidante, para crear el entorno de reducción necesario para el funcionamiento del enzima.

iv): ARNsina es un inhibidor de ribonucleasa obtenido en Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin, USA

\vskip1.000000\baselineskip

2. Se diluyen 10 \mug de ARN hasta alcanzar un volumen final de 40 \mul con agua tratada con DEPC. Se calienta a 65ºC durante 3 minutos y se mantiene sobre hielo durante un minuto (para eliminar la estructura secundaria).

3. Se añade al ARN la mezcla de transcripción inversa (58 \mul) y 4 \mul de la transcriptasa inversa clonada "Super RT" (Anglian Biotech Ltd., White Hall Road, Colchester, Essex) y se incuba a 42ºC durante una hora.

4. Se hierve la mezcla de reacción durante tres minutos, se enfría sobre hielo durante un minutos y se hace girar después en una microfuga para paletizar el residuo. Se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo.

El tampón 10x primera hebra es [KCl 1,4M; Tris-HCl 0,5M, pH 8,1 a 42ºC; MgCl_{2} 80 mM].

Los cebadores se anillan en el extremo 3’. Constituyen ejemplos de cebadores de cadena ligera kappa MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX y MJK5FONX (proporcionados bajo "secuencias de cebador", más adelante) y constituyen ejemplos de cebadores de cadena pesada MIGG1, 2 (CTG GAC AGG GAT CCA GAG TTC CA) Y MIGG3 (CTG GAC AGG GCT CCA TAG TTC CA), los cuales se anillan a CH1.

Alternativamente, puede utilizarse cualquier cebador que se una al extremo 3’ de las regiones variables VH, VLK, VL o a las regiones constantes CHI, CK o CL.

C. PCRs primarias

Para cada una de las PCR y controles negativos, se establecen las siguientes reacciones (por ejemplo, una reacción para cada uno de los cuatro VLKs y cuatro VH PCRs). Se utilizó Vent ADN polimerasa vendida por (C.P. Laboratories Ltd (New England Biolabs), cuya dirección ha sido ya proporcionada anteriormente). Los tampones son los proporcionados por C.P. Laboratories.

	\mul
H_{2}O	32,5
10 x tampón Vent	5
20 x BSA Vent	2,5
dNTPs 5 mM	1,5
Cebador FOR 10 pmol/\mul	2,5
Cebador BACK 10 pol/\mul	2,5

\vskip1.000000\baselineskip

Los cebadores FOR y BACK son proporcionados en la sección indicada más adelante titulada "secuencias de cebador". Para VH, el cebador FOR es VH1FOR-2 y el cebador BACK es VH1BACK. Para VLK, los cebadores FOR son MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX y MJK5FONX (para las respectivas cuatro cadenas ligeras kappa) y el cebador BACK es VK2BACK. Tan solo resulta necesario un cebador BACK de cadena ligera Kappa, debido a que la unión tiene lugar con una secuencia de nucleótido común a las cuatro cadenas ligeras kappa.

Se somete la mezcla a UV durante 5 minutos. Se añaden 2,5 \mul de preparación de cADN (procedente de B anterior), 2 gotas de aceite de parafina (Sigma Chemicals, Poole, Dorset, UK). Se ubica en un bloque de calentamiento cíclico, por ejemplo, PHC-2 fabricado por Techne Ltd. Duxford UK, preestablecido a 94ºC. Se añade 1 \mul de ADN Vent polimerasa bajo la parafina. Se amplifica utilizando 25 ciclos de 94ºC, 1 min.; 72ºC 2 min. Se efectúa un tratamiento posterior a 60ºC, durante 5 minutos.

Se purifica sobre Imp al 2% (agarosa de bajo punto de fusión/gel TAE (Tris-acetato EDTA) y se extrae el ADN a 20 \mul H_{2}O por PCR original, utilizando un kit Geneclean (ver anteriormente), según las instrucciones del fabri-
cante.

D. Preparación de componente de unión

Preparación en volumen (por ejemplo, 10 veces)

	\mul
H_{2}O	34,3
10 x tampón Vent	5
20 x BSA Vent	2,5
dNTPs 5 mM	2
Cebador LINKFOR 10 pmol/\mul	2,5
Cebador LINKBACK 10 pmol/\mul	2,5
ADN procedente de scFvD1.3 (ejemplo 2)	1
Enzima Vent	0,2

\vskip1.000000\baselineskip

Los cebadores para FOR y BACK se proporciona en la sección indicada más adelante bajo el título "secuencias de cebador". El cebador para FOR es LINKFOR y el cebador para BACK es LINKBACK. Se cubre con parafina y se ubica sobre el bloque de calentamiento cíclico (ver anteriormente) a 94ºC. Se amplifica utilizando 25 ciclos de 94ºC 1 min.; 65ºC 1 min.; 72ºC 2 min. Se efectúa un post-tratamiento a 60ºC durante 5 minutos.

Se purifica sobre gel Imp 2%/TAE (utilizando una carga de colorante sin azul de bromofenol como fragmentos 93 bp, si se desea) y se eluye con una columna SPIN-X (Costar Limited 205 Broadway, Cambridge, Ma. USA) y precipita. Se recoge en 5 \mul de H_{2}O para reacción PCR.

E. Ensamblaje PCRs

Se utiliza una cuarta parte de cada uno de los productos de reacción PCR (5 \mul) para cada ensamblaje. El volumen total es de 25 \mul.

Para cada uno de los cuatro cebadores de VLK, se utiliza la siguiente preparación:

H_{2}O	4,95
10 x tampón Vent	2,5
20 x ESA Vent	1,25
dNTPs 5 mM	0,8

\vskip1.000000\baselineskip

Se irradia esta mezcla con UV durante 5 minutos. Se añaden 5 \mul de la banda VH y VK procedentes de PCRs primarias y 1,5 \mul de material de unión, aislado a partir de los geles precipitados y extraído utilizando el kit Geneclean, tal y como se describe en C y D anteriormente. Se cubre con parafina. Se ubica sobre un bloque de calentamiento cíclico prefijado a 94ºC. Se añade lul Vent bajo la parafina. Se amplifica utilizando 7 ciclos de 94ºC 3 min; 72ºC 4 min. Se regresa después a la temperatura de 94ºC.

Se añaden 1,5 \mul de cada uno de los VH1BACK y los cebadores VKFOR MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX o MJK5FONX (10 pmol/\mul) a 94ºC. Los cebadores deben haber sido tratados con UV, tal y como se ha indicado anteriormente. Se amplifica utilizando 20 ciclos de 94ºC 1,5 min; 72ºC 2,5 min. Se efectúa un tratamiento posterior a 60ºC durante 5 minutos. Se purifica sobre gel Imp 2%/TAE y se extrae el ADN a 20 \mul H_{2}O por ensamblaje PCR, utilizando un kit Geneclean (ver anteriormente) según las instrucciones de los fabricantes).

F. Adición de puntos de restricción

Para cada uno de los ensamblajes y control se preparan:

	\mul
H_{2}O	36,5
10 x tampón Taq	5
dNTPs 5 mM	2
Cebador FOR (10 pmol/\mul)	2,5
Cebador BACK (10 pmol/\mul)	2,5
Producto de ensamblaje	1

Los cebadores FOR y BACK se proporcionan en la sección indicada más adelante, bajo el título "Secuencias de cebador". El cebador para FOR es cualquiera de JK1NOT10, JK2NOT10, JK4NOT10 o JK5NOT10 (para las cuatro cadenas ligeras kappa respectivas), para la colocación de un punto de restricción en el extremo VLK. El cebador para BACK es HBKAPA10 para la colocación de un punto de restricción ApaLI en el extremo VH.

Se cubre con parafina y se ubica sobre un bloque de calentamiento cíclico prefijado a 94ºC. Se añaden 0,5 \mul de Cetus Taq ADN polimerasa (Cetus/Perkin-Elmer, Beaconsfield, Bucks, UK) bajo la parafina. La amplificación se lleva a cabo utilizando entre 11 y 15 rondas de ciclado (en función de la eficacia) a 94ºC 1 min; 55ºC 1 min.; 72ºC 2 min. Se efectúa un post-tratamiento a 60ºC durante 5 min.

El tampón 10 x Taq es [Tris-HCl 0,1M pH 8,3 a 25ºC; KCl 0,5M; MgCl 15 mM; gelatina 1 mg/ml].

G. Desarrollo

Se purifica una vez con CHCl_{3}/IAA (alcohol isoamílico), una vez con fenol, una vez con CHCl_{3}/IAA y se extrae de nuevo cada componente para asegurar la mínima pérdida posible. Se precipita y lava dos veces con EtOH al 70%. Se disuelve en 70 \mul de H_{2}O.

Se digiere durante el transcurso de una noche a 37ºC con Notl:

	\mul
ADN (Sec. Añadida)	70
Tampón NEB Notl x 10	10
BSA NEB x 10	10
Not1 (10 U/\mul)	10

El ADN (secuencia añadida) mencionado anteriormente se refiere a la secuencia de ADN ensamblada que comprende, en la dirección 5’ a 3’:

: Punto de restricción ApaL1

: Secuencia VH

: Secuencia de componente de unión

: Secuencia VLK

: Punto de restricción Not 1.

La secuencia VLK puede ser cualquiera de las cuatro posibles secuencias de cadena kappa.

Los enzimas Not 1 mencionados anteriormente, ApaLI más adelante y los tampones NEB Not 1, NEB BSA anteriores y el tampón NEB 4 (más adelante) se pueden obtener en CP Laboratories, New England Biolabs, mencionados anteriormente.

Se precipita de nuevo, se recoge en 80 \mul de H_{2}O. Se le añaden 10 \mul de tampón NEB 4 y 10 \mul de Apal 1.

Se añade el enzima ApaLI en alícuotas a lo largo del día, dado que tiene una semi-vida corta a 37ºC.

Se purifica sobre gel Imp 2%/TAE y extrae el ADN utilizando un kit Geneclean, según las instrucciones del fabricante. En caso necesario, se digiere de nuevo.

H. Producto ADN final

El producto ADN final es un fragmento de aproximadamente 700 bl con terminaciones compatibles Apa L1 y Notl que comprenden; asociadas aleatoriamente, secuencias de cadena ligera y de cadena pesada unidas mediante un componente de unión. Una molécula típica de este tipo es la molécula scFvD1.3 incorporada en fdscFvD1.3, tal y como se ha descrito en el ejemplo 3. Estas moléculas pueden ser después unidas en vectores derivados de fd, por ejemplo, fdCAT2 (ejemplo 5), utilizando técnicas habituales.

Secuencias de cebador

Oligos de PCR primarios (puntos de restricción subrayados):

1

Códigos de ambigüedad M=A o C; R=A o G; S=G o C; W=A o T

Oligos PCR para preparar el material de unión:

100

Puntos de restricción para adición:

2

Ejemplo 13 Construcción de fagémido que contiene el gen III fusionado con la secuencia de codificación para una molécula de unión

Resultaría de utilidad mejorar la eficacia de la transfección del sistema de molécula de unión a fago y también tener la posibilidad de presentar diferentes números y especificidades de moléculas de unión sobre la superficie del mismo bacteriófago. Los solicitantes han diseñado un procedimiento que alcanza ambos objetivos.

El planteamiento deriva del sistema de fagémido basado en pUC119 [Vieira, J y Messing, J (1987) Methods Enzymol. 153.3]. En breve, el gen III procedente de fd-CAT-2-(Ejemplo 5) y la fusión gen III csFv, procedente de fd-CAT2scFvD1.3 (ejemplo 2) fueron clonados aguas abajo del favorecedor lac, en muestras separadas de pUC119, con vistas a que el gen III insertado y la fusión del gen III pudieran ser "rescatados" por el fago auxiliar M13M07 [Vieira, J y Messing, J et supra], preparado según se indica en Sambrook et al, 1989 supra. Cabía esperar que la mayor parte de los fagos rescatados contuvieran un genoma derivado del plásmido pUC119 que contiene la fusión molécula de unión-gen III y que debería expresar números variables de la molécula de unión sobre la superficie hasta un máximo de entre 3 y 5 moléculas de gen III de la superficie del fago de tipo natural. El sistema ha sido ejemplificado más adelante, utilizando un anticuerpo como molécula de unión.

Se formó un fdCAT2 que contiene la forma Fv de cadena única del anticuerpo anti-isolisozima D1.3, mediante la digestión de fdTscFvD1.3 (ejemplo 2) con Pstl y Xhol, purificando el fragmento que contiene el fragmento scFv y uniendo este a fdCAT2 digerido por Pstl y fdCAt2. El clon adecuado, denominado fdCAT2scFvD1.3 fue seleccionado después de ser ubicado en placas sobre tetraciclina 2xTY (15 \mug/ml) y confirmado mediante enzima de restricción y análisis de secuencia.

El gen III procedente de fd-CAT2 (ejemplo 5) y la fusión gen III scFv procedente de fd-CAT2scFvD1.3 fueron amplificados mediante PCR, utilizando los cebadores A y B mostrados seguidamente:

Cebador A:: TGC GAA GCT TTG GAG CCT TTT TTT TTG GAG ATT TTC AAC G

Cebador B:: CAG TGA ATT CCT ATT AAG ACT CCT TAT TAC GCA GTA TGT TAG C

El cebador A que se anilla al extremo 5’ del gen III incluyendo el punto de unión a ribosoma es localizado e incorpora un punto Hind III. El cebador B se anilla al extremo 3’ del gen III en el C Terminal e incorpora dos codones de terminación UAA y un punto EcoR1. 100 ng de fd-CAT2 y fd-CAT2scFvD1.3 ADN se utilizaron como plantilla para amplificación PCR, con un volumen de reacción total de 50 \mul, tal y como se ha descrito en el ejemplo 7, con la excepción de que se efectuaron 20 ciclos de amplificación: 94ºC 1 minuto; 50ºC 1 minuto; 72ºC 3 minutos. Esto resultó en la amplificación del esperado fragmento de 1,2Kb a partir de fd-CAT2 y un fragmento de 1,8 kb procedente de fd-CAT2scFvD1.3.

Los fragmentos de PCR fueron digeridos con EcoR1 y Hind III, fueron purificados con gel y unidos a Eco-R1- y Hind III- cortados y a pUC119ADN desfosforilado y transformados en E. coli TG1, utilizando técnicas habituales (Sambrook et al, supra). Las células transformadas fueron ubicadas en placas sobre agar SOB (Sambrook et al, 1989, supra) conteniendo ampicilina 100 \mug/ml y glucosa 2%. Los clones resultantes fueron denominados PCAT-3 (derivado de fd-CAT2) y pCAT-3scFvD1.3 (derivado de fd-CAT2scFvD1.3).

Ejemplo 14 Rescate de especificidad de anticuerpo anti-lisozima a partir de pCAT-3scFvD1.3, mediante M13K07

Colonias únicas de pCAT-3 y pCAT-3scFvD1.3 fueron seleccionadas en 1,5 ml de 2TY conteniendo ampicilina 100 \mug/ml y glucosa 2%, y cultivadas durante 6 horas a 30ºC. 30 \mul de estas células estacionarias fueron añadidas a 6 mls de 2YT, conteniendo ampicilina 100 \mug/ml y glucosa 2% en tubos de polipropileno de 50 mls (Falcon, Becton Dickinson Labware, 1950 Williams Drive, Oxnard, CA, USA) y cultivadas durante 1,5 horas a 30ºC a 380 rpm, en un New Brunswick Orbital Shaker (New Brunswick Scientific Ltd., Edison House 163 Dixons Hill Road, North Mimms, Hatfield, UK). Las células fueron pelletizadas mediante centrifugación a 5.000 g durante 25 minutos y los tubos secados sobre papel tejido. Los pellets celulares fueron después suspendidos en 6 mls de 2TY conteniendo 1,25x10^{9} p.f.u. ml^{-1} de bacteriófago M13K07 añadido. La mezcla fue dejada sobre hielo, seguido de crecimiento a 35ºC durante 45 minutos a 450 rpm. Se añadió después un cocktail conteniendo 4 \mul de ampicilina 100 \mug/ml, 0,5 \mul de IPTG 0,1M y 50 \mul de kanamicina 10 mg/ml y los cultivos se dejaron a 35º y 450 rpm durante toda una
noche.

Al día siguiente, los cultivos fueron centrifugados y las partículas de fago precipitadas con PEG, tal y como se describe en el ejemplo 6. Los pellets de fago fueron resuspendidos en 100 \mul de TE (tris-EDTA, ver ejemplo 6) y el fago valorado sobre E. coli TG1. Alícuotas de las células infectadas fueron ubicadas en placas sobre 2TY conteniendo o bien ampicilina 100 \mug/ml para seleccionar partículas de fago pUC119 o kanamicina 50 \mug/ml para seleccionar el fago auxiliar M13K07. Las placas fueron incubadas durante el transcurso de una noche a 37ºC y se contabilizaron las colonias resistentes a antibiótico:

ADN	Amp^{R}	Kan^{R}
pCAT-3	1,8x10^{11} colonias	1,2x10^{9} colonias
pCAT-3scFvD1.3	2,4x10^{11} colonias	2,0x10^{9} colonias

Esto demuestra que las partículas de fagémido amp^{R} son infecciosas y se encuentran presentes en la población de fago rescatada, en un exceso de 100 veces el del fago auxiliar Kan^{R} M13K07.

Los fagos fueron ensayados para determinar su actividad anti-lisozima mediante ELISA, tal y como se describe en el ejemplo 6, con las siguientes modificaciones:

1) placas ELISA fueron bloqueadas durante 3 horas con Marvel/PBS al 2%

2) 50 \mul de fago, 400 \mul de 1xPBS y 50 \mul de Marvel 20% fueron mezclados una y otra vez durante 20 minutos a temperatura ambiente, antes de añadir 150 \mul por pocillo.

3) Se dejó que los fagos se unieran durante 2 horas a temperatura ambiente.

4) Todos los lavados posteriores a la unión del fago fueron:

: 2 enjuagues rápidos de PBS/Tween 20 0,5%

: 3x2 minutos lavados PBS/Tween 20 0,5%

: 2 enjuagues rápidos con PBS no detergente

: 3x2 minutos lavados con PBS no detergente.

El resultado de este ELISA se muestra en la figura 19, la cual muestra que la especificidad del anticuerpo puede ciertamente ser rescatada de forma eficaz.

Se considera un tópico en el campo de la genética bacteriana que cuando proteínas mutantes y de origen natural son co-expresadas en la misma célula, la proteína de origen natural se utiliza preferencialmente. Esto es análogo a la situación anterior en la que las proteínas mutantes (a saber, fusión de anticuerpo) y las de gen III de origen natural (procedente de M13K07) compiten para ensamblaje como parte de la partícula de fagémido pUC119. Se anticipa, por tanto, que la mayoría de las partículas del fago pUC119 resultante tendrán menos moléculas de fusión gen III-anticuerpo sobre su superficie que en el caso del sistema de fago descrito, por ejemplo, en el ejemplo 2. Los citados anticuerpos fagémidos tienen probabilidades de unirse a antígenos con una avidez inferior que la de los anticuerpos de fago fd con tres o más copias de la fusión de anticuerpo sobre sus superficies (no existe gen III de tipo natural en el sistema descrito, por ejemplo, en el ejemplo 2) y de proporcionar una ruta para la producción de partículas de fago con diferentes números de la misma molécula de unión (y por tanto diferentes acideces para el ligando/antígeno) o múltiples diferentes especificidades de unión sobre sus superficies mediante la utilización de fago auxiliar tal como M13K07, para rescatar células que expresan dos o más fusiones gen III-anticuerpo.

Resulta también posible derivar un fago auxiliar que no codifique para un gen III funcional en sus genomas (mediante, por ejemplo, la supresión de la secuencia del gen III o una parte de la misma o a través de la incorporación de una mutación ámbar en su gen). Estos fagos defectuosos tan solo crecerán en células apropiadas (por ejemplo, las que proporcionen el gen III funcional en trans o contengan un gen supresor ámbar), pero cuando se utilizan para rescatar anticuerpos fago, tan solo incorporarán la fusión de anticuerpo gen III codificada por el fagémido en la partícula de fago liberada.

Ejemplo 15 Eficacia de transformación de fagémidos pCAT-3 y pCAT-3scFvD1.3

Se prepararon los ADNs de plásmido pUG 19, pCAT-3 y pCAT-3scFvD1.3 y el ADN de fago fdCAT-2 y se utilizaron para transformar E. coli TG1, pCAT-3scFvD1.3. Las transformaciones fueron ubicadas en placas sobre agar SOB que contenía ampicilina 100 \mug/ml y glucosa 2%, y se procedió a incubación a 30ºC, durante el transcurso de una noche. Las transformaciones fdCAT-2 fueron ubicadas en placas sobre agar TY que contenía tetraciclina 15 \mug/ml y se incubaron a 37ºC durante el transcurso de una noche. La eficacia de las transformaciones es expresada como colonias por \mug de ADN input:

ADN	Eficacia de transformación
pUC19	1.10^{9}
pCAT-3	1.10^{8}
pCAT-3scFvD1.3	1.10^{8}
fdCAT-2	8.10^{5}

De acuerdo con lo esperado, la transformación del vector fagémido es aproximadamente 100 veces más eficaz que la del vector parental fdCAT-2. Además, la presencia de un fragmento de anticuerpo scFv no compromete la eficacia. Esta mejora en la eficacia de la transformación resulta útil en la práctica en la generación de librerías de anticuerpos fago que tienen grandes repertorios de diferentes especificidades de unión.

Para demostrar la utilidad del fago para la selección de anticuerpos procedentes de repertorios, el primer requisito es que sean capaces de preparar una librería representativa, diversa, del repertorio de anticuerpos de un animal y de presentar este repertorio sobre la superficie de un bacteriófago fd.

Se aisló ARN citoplásmico, según lo indicado en el ejemplo 12, a partir de los bazos agrupados de cinco ratones Balb/c macho, estimulados 8 semanas después de la inmunización primaria con 2-fenil-5-oxazolona (ph OX), acoplada a sueroalbúmina de pollo. La preparación de cADN y el ensamblaje PCR de los repertorios kappa VL y VH del ratón para la presentación del fago se efectuó tal y como se describe en el ejemplo 12. Las moléculas así obtenidas fueron ligadas a fdCAT2.

El vector fdCAT2 fue digerido extensivamente con Notl y Apal1, purificado mediante electroelución (Sambrook et al, 1989, supra) y 1 \mug ligado a 0,5 \mug (5 \mug para las librerías jerárquicas: ver ejemplo 18) de los genes scFv ensamblados en 1 ml con 8.000 unidades de T4ADN ligasa (New England Biolabs). La unión fue llevada a cabo durante el transcurso de una noche a 16ºC. La mezcla de unión purificada fue sometida a electroporesis en seis alícuotas en células MC1061 (W.J. Dower; J. F. Millar & C.W.Ragsdale Nucleic Acids Res. 16 6127-6145 1988) y ubicada en placas sobre medio NZY (Sambrook et al, 1989, supra) con tetraciclina 15 \mug/ml, en placas de 243x243 mm (Nunc): entre el 90 y el 95% de los clones contenía genes scFv mediante cribado PCR.

Las colonias recombinantes fueron cribadas mediante PCR (en las mismas condiciones que las indicadas en el ejemplo 7, utilizando cebadores VH1BACK y MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX y MJK5FONX (ver ejemplo 12), seguido de digestión con el enzima de corte frecuente BstN1 (New England Biolabs, utilizado según las instrucciones del fabricante). La librería de 2 x 10^{5} clones parecía diversa, a tenor de la diversidad de patrones de digestión observados en la Figura 20 y el secuenciado reveló la presencia de mayoría de grupos VH (R. Dildrop, Immunol. Today 5 85-86 1984) y de subgrupos VK (Kabat E.A. et al., 1987, supra) (datos no mostrados). Ninguno de los clones 568 comprobados estaba unido a pHOx, tal y como se detectó mediante ELISA, como en el ejemplo 9.

Por tanto, la capacidad de seleccionar anticuerpos proporcionada por la utilización de anticuerpos fago (como en el ejemplo 17) resulta esencial para aislar, de forma rápida, anticuerpos con actividad de unión a antígeno, a partir de dominios VH y VL combinados aleatoriamente. Para aislar fragmentos de unión a antígeno haría falta un cribado muy amplio, si se utilizara el planteamiento combinatorio aleatorio de Huse et al., 1989 (supra).

Ejemplo 17 Selección de anticuerpos específicos para 2-fenil-5-oxazolonas procedentes de un repertorio derivado de un ratón inmunizado

La librería preparada en el ejemplo 16 fue utilizada para demostrar esta capacidad del sistema de fago para seleccionar anticuerpos, en base a su especificidad de anticuerpo.

Ninguno de los 568 clones comprobado, procedentes de la librería no seleccionada, estaba unido a phOx, según detección llevada a cabo con ELISA.

El cribado para determinar la unión del fago a hapteno fue llevado a cabo mediante ELISA: placas de 96 pocillos fueron revestidas con phOx-BSA 10 \mug/ml o BSA 10 \mug/ml, en solución salina tamponada con fosfato (PBS), durante el transcurso de una noche a temperatura ambiente. Colonias de bacterias transducidas por fago fueron inoculadas en 200 \mul de 2xTY con tetraciclina 12,5 \mug/ml en placas de 96 pocillos ("pocillos celulares", Nuclon) y cultivadas con agitación (300 rpm) durante 24 horas a 37ºC. En esta etapa, los cultivos fueron saturados y los fagos valorados eran reproducibles (10^{10} TU/ml). 50 \mul de sobrenadante de fago, mezclados con 50 \mul de PBS que contenía polvo de leche desnatada al 4%, fueron añadidos posteriormente a las placas revestidas. En el ejemplo 9 pueden encontrarse detalles adicionales.

La librería de fagos se hizo descender por una columna de afinidad phOx (Tabla 3A) y se eluyó con hapteno. Las colonias procedentes de la librería preparada en el ejemplo 18 fueron colocadas mediante rascado en 50 ml de medio 2xTY y agitadas a 37ºC durante 30 minutos. Los fagos liberados fueron precipitados dos veces con polietilenglicol y resuspendidos en 10^{12} TU (unidades de transducción)/ml en agua (valorado como en el ejemplo 8). Para determinar la selección de afinidad, una columna de 1 ml de phOx-BSA-Sepharose (O. Makela; M. Kaartinen; J.L.T. Pelones y K. Karjalainen; J. Exp. Med. 148 1644-1660, 1978) fue lavada con 300 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 20 ml de PBS que contenía polvo de leche desnatada 2%. 10^{12} TU fagos fueron depositados en 10 ml MPBS, lavados con 10 ml MPBS y finalmente con 200 mls de PBS. Los fagos unidos fueron eluidos con 5 ml de ácido 4-\epsilon-aminocaproico-metilen-2-fenil-oxazol-5-ona 1 mM (phOx-CAP; O. Makel et al., 1978, supra). Aproximadamente 10^{6} Tu de fago eluido fueron amplificadas mediante infección de 1 ml fase log de E. coli TG1 y ubicación en placa, como se ha indicado anteriormente. Para una nueva ronda de selección, las colonias fueron colocadas mediante rascado en 10 ml de medio 2xTY y después procesadas tal y como se ha indicado anteriormente. De los clones eluidos, se averiguó que un
13% estaban unidos a phOx después de la primera ronda de selección y oscilaban entre unión pobre y fuerte en ELISA.

Para secuenciar clones, se preparó una plantilla de ADN a partir de los sobrenadantes de 10 ml de cultivos cultivados durante 24 horas, y secuenciados utilizando el procedimiento didesoxi y un kit de Sequenasa (USB), con el cebador LINKFOR (ver ejemplo 12) para los genes VH y el cebador fdSEQ1 (5’-GAA TTT TCT GTA TGA GG) para los genes Vk. Veintitrés de estos clones que se unen a haptenos fueron secuenciados y ocho diferentes genes VH (A a H) fueron encontrados en una diversidad de pares con siete diferentes genes Vk (de a a g)(Figura 21). La mayoría de los dominios, tales como VH-B y Vk eran "promiscuos", capaces de unirse a hapteno con cualquiera de los diversos socios.

Las secuencias de los genes V estaban relacionadas con las observadas en la respuesta secundaria a phOx, pero con diferencias (Figura 21). Así pues, los hibridomas phOx procedentes de la respuesta secundaria utilizan derivados mutados somáticamente de tres tipos de genes Vk-Vkoxl, genes "de tipo Vkox" y Vk45.1 (C. Berek; G.M.Griffiths &
C. Milstein Nature 316 412-418 (1985). Estos pueden formar parejas con genes VH de diversos grupos, el Vkoxl forma habitualmente pares con el gen VHoxl (Grupo 2 de VH. R. Dildrop supra). Los genes Vkoxl son siempre, y los genes de tipo Vkox habitualmente, encontrados en asociación con cadenas pesadas (incluyendo VHoxl) y contienen un CDR3 de cinco restos cortos, con la secuencia motif Asp-X-Gly-X-X, en la que la glicina central resulta necesaria para crear una cavidad para phOx. No obstante, en la librería combinatoria aleatoria, aproximadamente la totalidad de los genes VH pertenecían al grupo 1 y la mayoría de los genes Vk eran el tipo ox y estaban asociados con dominios VH con un CDR3 de cinco restos, motif Asp/Asn-X-Gly-X-X (Figura 21). Vkoxl y VHoxl fueron encontrados solo una vez (Vk-f y VH-E) y no en combinación con ningún otro. Ciertamente, Vk-f carece de Trp91 involucrado en la unión a phOx y estaba emparejado con yn VH(VH-C) con un CDR3 de seis restos.

Una combinación matricial de genes VH y VK fue identificada en los clones de unión a phOx seleccionados a partir de esta librería combinatoria aleatoria. El número de clones encontrado con cada una de las combinaciones se muestra en la Figura 22. La unión a phOx-BSA, a tenor de la señal ELISA, parecía variar (marcado en sombreado en la Figura 22). No se observó unión a BSA en solitario.

Una segunda ronda de selección, de la librería combinatoria aleatoria original, procedente de ratones inmunes dio lugar a que 93% de los clones eluidos se uniera a phOx (tabla 3). La mayoría de estos clones eran combinaciones Vk-d, y se unían fuertemente a phOx en ELISA (datos no mostrados). Se observaron pocos componentes de unión débiles. Esto sugería que la afinidad cromatográfica no tan solo había originado un enriquecimiento de componentes de unión, sino también de los mejores.

Las valoraciones de apagado de fluorescencia determinaron la Kd de VH-B/Vk-d para phOx-GABA como 10^{-8} M (ejemplo 19), indicando que los anticuerpos con afinidades representativas de la respuesta secundaria pueden ser seleccionados a partir de respuesta secundaria, tan solo dos (de entre once caracterizados) secretan anticuerpos de una afinidad más levada que la de VH-B/Vk-d (C. Berek et al, 1985, supra). La Kd de CH-B/Vk-b para phOx-GABA fue determinada como 10^{-5} M (ejemplo 19). Así pues, los fagos que soportan fragmentos scFv con afinidades débiles pueden ser seleccionados con antígeno, probablemente debido a la avidez de las múltiples cabezas de anticuerpo sobre el fago.

Este ejemplo muestra que especificidades de antígeno pueden ser aisladas a partir de librerías derivadas de ratones inmunizados. A menudo se deseará expresar estos anticuerpos, en una forma soluble, para estudio adicional y para utilización aplicaciones terapéuticas y de diagnosis. El ejemplo 19 demuestra la determinación de la afinidad de los fragmentos scFv solubles seleccionados utilizando anticuerpos fago. El ejemplo 23 demuestra que los fragmentos solubles presentan propiedades similares a los presentados sobre fago. Para muchos propósitos, se preferirá construir y expresar una molécula anticuerpo que contenga porciones Fc de la cadena pesada, y quizás variar el isotipo de inmunoglobulina. Para lograr esto, resulta necesario subclonar los puntos de unión a antígeno utilizando el sistema de selección de fago en un vector para expresión en células de mamífero, utilizando una metodología similar a la descrita por Orlandi, R. et al., (1989, supra). Por ejemplo, los genes VH y VL podían ser amplificados separadamente por medio de PCR con cebadores que contienen puntos de restricción adecuados e insertados en vectores tales como pSV-gpt HulG1 (L. Riechmann et al., Nature 332 323-327), 1988), los cuales permiten la expresión del dominio VL como parte de un isotipo IgGG1 de cadena pesada y pSV-hyg HuCK que permite la expresión del dominio VL unido a la región constante de la cadena ligera K. Además, pueden efectuarse fusiones de los dominios VH y VL con genes que codifican para proteína no inmunoglobulina, por ejemplo, enzimas.

Ejemplo 18 Generación de nuevas especificidades de anticuerpo por medio de ensamblaje de librerías jerárquicas

Nuevas especificidades para anticuerpo fueron derivadas de la librería preparada y cribada en los ejemplos 16 y 17, utilizando un planteamiento jerárquico.

La promiscuidad de los dominios VH-B y Vk-d indujo a los solicitantes a forzar nuevos emparejamientos, por medio de ensamblaje de estos genes con repertorios completos, si cualquiera de los genes Vk o VH procede de los mismos ratones inmunizados. Las librerías "jerárquicas" resultantes, (VH-B x Vk-rep x Vk-d), cada una de ellas con
4 x 10^{7} componentes, fueron sometidas a una ronda de selección y se aislaron los clones de unión a hapteno (Tabla 3). Tal y como se demuestra a través de ELISA, la mayor parte eran componentes de unión fuertes. Mediante el secuenciado de veinticuatro clones procedentes de cada una de las librerías, los solicitantes identificaron catorce nuevos socios para VH-B y trece para Vk-d (Figura 21). Aparte de VH-B y Vk-c, ninguno de los socios previos (o ciertamente otros clones) procedentes de la librería combinatoria aleatoria fue aislado de nuevo. De nuevo, los genes Vk eran principalmente del tipo ox y los genes VH principalmente del grupo 1 (tal y como se define en Dildrop, R. 1984, supra), pero los únicos ejemplos de Vkoxl (Vk-h, -p, -q, y –r) presentan Trp91 y el motivo VH-CDR3 Asp-X-Gly-X-X predomina ahora. Así pues, algunas características de los hibridomas phOx parecen emerger más fuertemente en la librería jerárquica. Los nuevos socios difieren los unos de los otros por pequeñas alteraciones en los CDRs, indicando que la mayor parte del espectro sutil había permanecido sin explotar por el planteamiento combinatorio aleatorio. Más generalmente, se ha demostrado que puede obtenerse un espectro de anticuerpos relacionados mediante el mantenimiento de uno los socios fijo y variando el otro, y esto puede resultar no valorable para la sintonización fina de afinidad y especificad de anticuerpo.

Por consiguiente, de nuevo, los anticuerpos fago permiten una banda más amplia de moléculas de anticuerpo que tienen que ser analizadas, en búsqueda de las propiedades deseadas.

Este ejemplo, y el ejemplo 17, demuestran el aislamiento de especificidades de anticuerpos individuales a través de la presentación sobre la superficie del fago. No obstante, para algunos propósitos, puede resultar más deseable disponer de una mezcla de anticuerpos, equivalente a un antisuero policlonal (por ejemplo, por inmunoprecipitación). Para preparar una mezcla de anticuerpos, se podían mezclar clones y expresar anticuerpos solubles o fragmentos de anticuerpos o, alternativamente, seleccionar clones procedentes de una librería para proporcionar un grupo de genes altamente enriquecido que codifica para anticuerpos o fragmentos de anticuerpo dirigidos contra un ligando de interés y expresar anticuerpos a partir de estos clones.

Ejemplo 19 Selección de anticuerpos desplegados sobre bacteriófago con diferentes afinidades para 2-fenil-5-oxazolona, utilizando cromatografía de afinidad

Los datos ELISA mostrados en el ejemplo 17 sugirieron que la cromatografía por afinidad había no tan solo enriquecido a los elementos de unión sino también a los mejores. Para confirmar esto, se determinaron las afinidades de unión de un fago con unión fuerte y de un fago con unión débil y se demostró después que las mismas podían ser separadas las unas de las otras, utilizando cromatografía de afinidad.

Los clones VH-B/Vk-b y VH-B/Vk-d fueron re-amplificados con MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX y MJK5FONX (ver ejemplo 12) y VH1BACK-Sfil (5’-TCG CGG CCC AGC CGG CCA TGG CC(G/C) AGG T(C/G)(A/C) A(A/G)C TGC AG(C/G) AGT C(A/T)G G), un cebador que introduce un punto Sfil (subrayado) en el extremo 5’ del gen VH. El VH-B/Vk-d fue clonado en un fagémido, por ejemplo, pJM1 (un obsequio procedente de A. Griffiths y J. Marks) como un casette Sfil-Notl, aguas debajo del líder pelB para secreción periplásmica (M. Better et al., supra), con una etiqueta péptido C-terminal para detección (ver ejemplo 20 y figura), y bajo control th de un favorecedor P_{L} (H. Shimatake & M. Rosenberg Nature 292 128-132 1981). El fagémido debería tener las siguientes características: a) puntos de restricción Sfil y Notl únicos aguas debajo de un líder pelB, b) una secuencia que codifica para una etiqueta de péptido C-terminal para detección, y c) un favorecedor P_{L} \lambda que controla la expresión. 10 litros de cultivos de E. coli N4830-1 (M. E. Gottesman, S. Adhya & A. Das J. Mol. Biol. 140 57-75 1980), albergando cada uno de los fagémidos fueron introducidos, al igual que en K. Nagai & H.C. Thogerson (Methods Enzymol 153 461-481 1987), y los sobrenadantes precipitaron con sulfato amónico 50%. El precipitado re-suspendido fue dializado en PBS + EDTA 0,2 mM(PBSE), cargado en una columna de 1,5 ml de phOx:Sepharose y la columna lavada de forma secuencial con 100 ml de PBS: 100 ml de Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,0: 10 ml de citrato 50 mM, pH 5,0: 10 ml de citrato 50 mM, pH 4,0 y 20 ml de glicina 50 mM, pH 3,0. Fragmentos scFv fueron eluidos con glicina 50 mM, pH 2,0, neutralizada con base Tris y dializados frente a PBSE. El VH-B/Vk-b fue clonado en un vector fagémido basado en pUC119 que codifica para una señal idéntica y secuencias etiqueta para pJM1 y la expresión inducida a 30ºC en un cultivo de 10 litros de E. coli TGL que alberga el fagémido, como en D. de Bellis & I. Schwartz (1980 Nucleic Acids Res 18 1311). La baja afinidad del clon VH-B/Vk-b hizo imposible su purificación sobre phOx-Sepharose. Por consiguiente, después de concentración mediante centrifugación (Filtron, Flowgen), el sobrenadante (100 ml de 600 ml) fue cargado en una columna de 1 ml de proteína A-Sepharose acoplada (E. Harlow & D. Lane 1988 supra) al anticuerpo monoclonal 9E10 (Evan, G.I. et al. Mol. Cell. Biol. 5 3610-3616 1985) que reconoce al péptido etiqueta. La columna fue lavada con 200 ml de PBS y 50 ml de PBS preparado en NaCl 0,5M. Los fragmentos scFv fueron eluidos con 100 ml de glicina 0,2M, pH 3,0, con neutralización y diálisis, al igual que
anteriormente.

La Kd (1,0 \pm 0,2 c 10^{-8} M) para el clon VH-B/Vk-d fue determinada mediante valoración de apagado de fluorescencia con ácido 4-E-aminobutírico-metilen-2-fenil-oxazol-5-ona (phOx-GABA Co. Makela et al, 1978 supra). La excitación se producía a 280 nm, la emisión fue monitorizada a 340 nm y se calculó la K_{d}. La K_{d} del clon de baja afinidad VH-B/Vk-b fue determinada como 1,8 \pm 0,3 x 10^{-5} M (no mostrada). Para minimizar la adsorción de luz a través de las concentraciones más elevadas del phOx-GABA requeridas, la excitación era de 260 nm y la emisión fue monitorizada a 304 nm. Además, los valores de fluorescencia fueron divididos por los procedentes de una valoración paralela de Fv fragmento D1.3 que se une a lisozima. El valor fue calculado como en H. N. Eisen Meth. Med. Res. 10 115-121 1964. Una mezcla de los clones VH-B/Vk-b y VH-B/Vk-d; 7 x 10^{10} TU fagos en la relación 20 VH-B/1 VH-B/Vk-d fue depositada en una columna pOx-BSA-Sepharose en 10 ml de MPBS y se eluyó tal como se ha indicado anteriormente. Los eluidos fueron depositados en una segunda columna de afinidad y se repitió el proceso para proporcionar un total de tres pases de columna. Las diluciones de fago eluido en cada una de las etapas fueron ubicadas en placas en duplicado y sondadas separadamente con oligonucleótidos específicos para Vk-b (5’ GAG CGC GTA ACC ACT GTA CT) O Vk-d (5’ GAA TGG TAT AGT ACT ACC CT). Después de estas dos rondas, esencialmente la totalidad de los fagos eluidos eran VH-B/Vk-d (Tabla 3). Por consiguiente los anticuerpos fago pueden ser seleccionados sobre la base de la afinidad a antígeno del anticuerpo presentado.

El fagémido pHEN1 (Figura 23) es un derivado de pUC119 (Vieira, J & Messing, J. Methods Enzymol 153 pp 3-11, 1987). La región de codificación de g3p a partir de fdCAT2, incluyendo el péptido señal y los puntos de clonación, fue amplificada mediante PCR, utilizando cebadores G3FUFO y G3FUBA (proporcionados más adelante) (los cuales contienen puntos EcoRI y HindIII, respectivamente), y clonada como un fragmento HindIIIII-EcoRI en pUC119. El fragmento HindIII-Notl, que codifica para la secuencia señal g3p, era el sustituido por un péptido señal pelB (Better, M. et al., Science 240 1041-1043, 1988) con un punto Sfil interno, permitiendo que los genes de anticuerpo sean clonados como fragmentos fil-Notl. Una etiqueta de péptido, c-myc, (Munro, S. & Pelma, H. Cell 46 291-300, 1986) fue introducida directamente después del punto Notl mediante clonación de un casette de oligonucleótido y seguido de un codón ámbar introducido por medio de mutagénesis dirigida a un punto, utilizando un kit de mutagénesis in vitro (Amersham Internacional) (Figura 23b).

G3FUFO, 5’-CAG TGA ATT CTT ATT AAG ACT CCT TAT TAC GCA GTA TGT TAG C;

G3FUBA, 5’-TGC GAA GCT TTG GAG CCT TTT TTT TTG GAG ATT TTC AAC G.

Ejemplo 21 Presentación de fragmentos Fab y Fv de cadena única, derivados del anticuerpo anti-oxazolona NQ10.12.5 sobre bacteriófago fd, utilizando pHEN1 y fdCAT2

Se preparó una banda de construcciones (ver Figura 24) a partir de un clon (esencialmente la construcción II en pUC19) diseñada para expresión en bacterias de un fragmento Fab soluble (Better et al., 1988, ver anteriormente) procedente del anticuerpo anti-phOx (2-fenil-5-oxazolona) de ratón NQ10.12.5 (Griffiths, G.M. et al., Nature 312, 271-275, 1984). En la construcción II, las regiones V son derivadas de NQ10.12.5 y están unidas a los dominios constantes Ck y CHI (isótopo \gamma1) humanos. Los restos cisteina C terminales, los cuales forman normalmente un enlace covalente entre cadenas de anticuerpo pesadas y ligeras, han sido suprimidos en ambos dominios constantes. Para clonar genes de cadena ligera y pesada conjuntamente como fragmentos Fab (construcción II) o como cadenas (construcciones III y IV) para presentación de fagos, l se amplificó ADN procedente de la construcción II mediante PCR, para introducir un punto de restricción en el extremo 3’, y en el extremo 5’ o bien en un punto ApaLI (para clonado en fd-CAT2) o un punto Sfil (para clonado en pHEN1). Los cebadores FABNOTFOK con VH1BACKAPA (o VH1BACKSFI15) se utilizaron para amplificación PCR de los genes que codifican para fragmentos Fab (construcción II), los cebadores FABNOTFOH con VH1BACKAPA (o VH1BACKSFI15) para cadenas pesadas (construcción III) y los cebadores FABNOTOK y MVKBAAPA (o MVKBASFI) para cadenas ligeras
(Construcción IV).

La versión Fv de cadena única de NQ10.12.5 (construcción I) tiene los dominios variables de cadena ligera (Vk) y de cadena pesada (VH) unidas a través de un componente de unión flexible (Gly_{4}Ser)_{3} (Huston, J.S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-5883, 1988) y fue construida a partir de la construcción II a través de "unión mediante extensión de superposición", como en el ejemplo 12. Los genes ensamblados fueron re-amplificados con cebadores VK3F2NOT y VH1BACKKAPA (o VH1BACKSFI15) para colgar puntos de restricción para clonado en fd-CAT2 (ApaLI-Notl) o pHEN1 (Sfil-Notl).

3

Los puntos de restricción están subrayados

Rescate de fagos y de partículas de fagémido.

Las construcciones I-IV (Figura 24) fueron introducidas tanto en fd-CAT2 como en pHEN1. El fago fd-CAT2 (y fd-CAT2-I, II, III o IV) fue tomado del sobrenadante de E. coli TG1 infectada después de ser agitado a 37ºC durante el transcurso de una noche a 37ºC en medio 2xTY, con tetraciclina 12,5 \mug/ml y utilizado directamente en ELISA. El fagémido pHEN1 (y pHEN1-I y II) en E. coliTG1 (supE) fue cultivado durante el transcurso de una noche en 2 ml de medio 2xTY, ampicilina 100 \mug/ml y glucosa 1% (sin glucosa, la expresión de g3p evita la superinfección tardía mediante fago auxiliar). 10 \mul del cultivo de una noche fueron utilizados para inocular 2 ml de medio 2xTY, ampicilina 100 \mug/ml, glucosa 1% y agitados a 37ºC durante 1 hora. Las células fueron lavadas y re-suspendidas en 2xTY, ampicilina 100 \mug/ml y las partículas de fagémido rescatadas mediante la adición de 2 \mul (10^{8}pfu) de fago auxiliar VCSM13 (Stratagene). Después de crecimiento durante 1 hora, se añadieron 4 \mul de kanamicina (25 mg/ml) y el cultivo cultivado durante el transcurso de una noche. Las partículas de fagémido fueron concentradas 10 veces para ELISA, mediante precipitación con polietilenglicol. ELISA

La detección de fago unido a 2-fenil-5-oxazolona (phOx) fue llevada a cabo tal como en el ejemplo 9. Placas de 96 pocillos fueron revestidas con phOx-BSA 10 \mug/ml o BSA 10 \mug/ml en PBS, a temperatura ambiente y bloqueadas con PBSS conteniendo polvo de leche desnatada al 2%. El sobrenadante fago (fagémido) (50 \mul) mezclado con 50 \mul de PBS conteniendo polvo de leche desnatada al 4% fue añadido a los pocillos y sometido a ensayo. Para detectar la unión de fragmentos scFv o Fab solubles secretados a partir de pHEN1, la etiqueta de péptido c-myc descrita por Munro and Pelham 1986 supra, fue detectada utilizando 9E10 monoclonal anti-myc (Evan, G.I. et al., Mol. Cell Biol 5 3610-3616, 1985) seguido de detección con inmunoglobulina anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa. En el ejemplo 9 se describen otros detalles.

Las construcciones en fdCAT2 y pHEN1 presentan fragmentos de anticuerpo de la superficie de fago filamentoso. El vector fago, f-CAT2 (figura 8) está basado en el vector fd-tet (Zacher, A.N. et al., Gene 9 127-140, 1980) y tiene puntos de restricción (ApaLI y Notl) para clonar genes de anticuerpo (u otras proteínas), genes para expresión como fusiones con el N terminal de la proteína g3p de revestimiento de fago. La transcripción de las fusiones anticuerpo-g3p en fd-CAT2 es conducida desde el favorecedor del gen III y la proteína de fusión dirigida hacia el periplasmo por medio del líder g3p. Se demostró que los fragmentos Fab y scFv de NQ10.12.5 clonados en fd-CAT2 para presentación se unían a phOx-BSA (pero no a BSA) mediante ELISA (tabla 4). Se consideró que los fagos tenían capacidad de unión si A_{405} de la muestra era al menos 10 veces más grande que el fondo en ELISA.

El vector fagémido pHEN1 (Figura 23) está basado en pUC119 y contiene puntos de restricción (Sfil y Notl) para clonar las proteínas de fusión. Aquí, la transcripción de fusiones anticuerpo-g3p es conducida desde el favorecedor inducible lacZ y la proteína de fusión dirigida hacia el periplasma por medio del líder pelB. El fagémido fue rescatado con el fago auxiliar VCSM13 en medio 2xTY que no contiene glucosa o IPTG: en estas condiciones se genera la suficiente expresión de anticuerpo-g3p. Se demostró que los fragmentos Fab y scFv de NQ10.12.5 clonados en pHEN1 para presentación se unen a phOx-BSA (pero no a BSA) por medio de ELISA (Tabla 4), utilizando el mismo criterio que el indicado anteriormente.

Una metodología alternativa para la preparación de librerías de fragmentos de fago expresadas sobre la superficie de fago sería la siguiente:

1.: Preparar una librería de fagos que expresan genes de cadena pesada (VHCH) procedentes de insertos en el genoma del fago.

2.: Preparar una librería de genes de cadena ligera en un vector de expresión plásmido en E. coli, preferiblemente un fagémido, y aislar las cadenas ligeras de proteína soluble expresadas a partir de esta librería.

3.: Unir las cadenas ligeras de proteína soluble procedentes de la librería con la librería de cadena pesada presentada sobre el fago.

4.: Seleccionar el fago con las propiedades deseadas de afinidad y especificidad.

: Estas codificarán para los genes de cadena pesada (VHCH)

5.: Aislar los genes de cadena ligera que codifican para cadenas ligeras, que forman puntos de unión a antígeno adecuados en combinación con las cadenas pesadas seleccionadas, preferiblemente mediante la utilización de superinfección por bacterias, conteniendo fagémidos que expresan la cadena ligera, con fago que expresa la cadena pesada seleccionada (tal y como se escribe en el ejemplo 20) y después someter a ensayo para determinar la unión a antígeno.

Ejemplo 22 Rescate de fagémido que codifica para una fusión de proteína de gen III con cadenas ligeras o pesadas de anticuerpo por medio de codificación con fago de la cadena complementaria de anticuerpo presentada sobre fago y la utilización de esta técnica para preparar librerías combinatorias duales

Con librerías combinatorias aleatorias existe una limitación sobre la potencial diversidad de los fragmentos Fab presentados debido a la eficacia de la transformación de células bacterianas. Se describe aquí una estrategia (librerías de combinación duales) para superar este problema, incrementando potencialmente el número de fagos reconocidos por un factor de 10^{7}.

Para el ensamblaje de cadenas ligeras y pesadas expresadas a partir de diferentes vectores, el fagémido (pHEN1-III o IV) fue cultivado en E. coli HB2151 (una cepa no supresora), para permitir la producción de cadenas solubles, y rescatadas tal y como se ha indicado anteriormente (ejemplo 23), con la excepción de que fueron utilizados fagos auxiliares que expresaban cadenas socio como fusiones con g3p (10^{9} TUfd-CAT-IV o III, respectivamente), y 2 \mul de tetraciclina (12,5 mg/ml) en vez de kanamicina.

Vectores separados para codificar cadenas ligeras y pesadas Fab.

Las cadenas ligeras y pesadas de fragmentos Fab pueden ser codificadas conjuntamente en el mismo vector (ejemplo 21) o en vectores diferentes. Para demostrar esto, la cadena pesada (construcción III) fue clonada en pHEN1 (para proporcionar fragmentos solubles) y la cadena ligera (construcción IV) en fd-CAT2 (para llevar a cabo la fusión con g3p). El fagémido pHEN1-III, cultivado en E. coli HB2151 (no supresor) fue rescatado con fago fd-CAT2-IV y se demostró que el fago(fagémido) se unía a phOx:BSA pero no a BSA (Tabla 4). Esto demuestra que la cadena soluble ligera está correctamente asociada con la cadena pesada anclada en g3p, dado que ni la cadena pesada ni la cadena ligera en solitario se unen a antígeno (tabla 4).

En el experimento inverso (con fagémido pHEN-1-IV y fago fd-CAT2-III) se obtuvieron resultados similares, produciéndose la cadena inversa como una molécula soluble y la cadena ligera fue anclada a g3p (Tabla 4). Por lo tanto, un fragmento Fab es ensamblado sobre la superficie del fago mediante fusión de, o bien cadena ligera o cadena pesada con g3p, en el bien entendido de que la otra cadena sea secretada utilizando el mismo vector o uno diferente (Figura 25).

La población de fago resultante es una mezcla de fagémidos rescatados con fago abd. La relación de los dos tipos de partículas fue valorada mediante infección con E. coli fase log y ubicación sobre placas TYE con, o bien tetraciclina 15 \mug/ml (para seleccionar fd-CAT2) o ampicilina 100 \mug/ml (para seleccionar pHEN1). La valoración del fago fd-CAT2 era de 5 x 10^{11} TU/ml y la valoración de pHEN1 2 x 10^{10} TU/ml, indicando una relación de envasado de 25 fagos por fagémido.

Se demuestra aquí la existencia de una estrategia alternativa que conlleva la presentación de los fragmentos Fab de anticuerpo heterodímeros sobre la superficie del fago. Una de las cadenas se fusiona con g3p y la otra es secretada en forma soluble es el espacio periplásmico de E. coli, donde se asocia, de forma no covalente, con la fusión g3p y se une específicamente a antígeno. Tanto la cadena ligera como la pesada pueden ser fusionadas con el g3p: las mismas son presentadas sobre el fago como fragmentos Fab y se unen al antígeno (Figura 25). Se describen tanto el fago como los vectores fagémidos para presentación superficial. Los fagémidos resultan probablemente superiores a los vectores fago para la creación de grandes librerías de presentación de fagos. Debido particularmente a su elevada eficacia de transfección (entre dos u tres órdenes de magnitud superiores), permitiendo la construcción de librerías más grandes. El vector fagémido pHEN1 permite también la expresión de fragmentos Fab solubles en E. coli no supresora.

Se demuestra también aquí que las cadenas ligeras y pesadas codificadas sobre el mismo vector (construcción II) o sobre vectores diferentes (construcciones III y IV) pueden ser presentadas como fragmentos Fab. Esto ofrece dos vías distintas para preparar librerías combinatorias aleatorias para presentación. Las librería de genes de cadena ligera y las de cadena pesada, amplificadas mediante PCR, podían ser unidas de forma aleatoria a través de un proceso de "ensamblaje PCR" (ejemplo 12) basado en "empalmado mediante extensión superpuesta", clonadas en vectores de presentación fago (fagémido) y expresadas a partir del mismo favorecedor como parte de la misma transcripción (construcción II), como se ha indicado anteriormente, o ciertamente a partir de diferentes favorecedores como transcripciones separadas. Aquí, el vector fago (fagémido) codifica y presenta para ambas cadenas. Para una librería combinatoria de 10^{7} cadenas pesadas y 10^{7} cadenas ligeras, la potencial diversidad de fragmentos Fab desplegados (10^{14}) se ve limitada por la eficacia de la transfección de células bacterianas por parte del vector (aproximadamente 10^{9} clones por \mug de corte y plásmido ligado en el mejor de los casos) (W. J. Dower et al, Nucleic. Acids Res. 16 6127-6145, 1988). Las librerías preparadas de este modo son análogas al procedimiento de librería combinatoria aleatoria descrito por Huse, W.D. et al., Science 246 1275-1281 (1989), pero presentan la importante característica adicional de que la presentación sobre la superficie del fago proporciona un poderoso procedimiento para la selección de especificidades de anticuerpo a partir de un gran número de clones generados.

Alternativamente, librerías de cadenas ligeras y pesadas podían ser clonadas en diferentes vectores para expresión en la misma célula, con un vector fago que codifica para la fusión g3p y un fagémido que codifica para la cadena soluble. El fago actúa como un auxiliar, y las bacterias enriquecidas producían tanto fago envasado como fagémido. Cada uno de los fagos o fagémidos presenta ambas cadenas pero codifica solo para una y, por lo tanto, tan solo para la información genética de la mitad del punto de unión a antígeno. No obstante, los genes para ambas cadenas de anticuerpo pueden ser recuperados de forma separada mediante ubicación en placa sobre el medio selectivo, sugiriendo un medio en virtud del cual pares mutuamente complementarios de antígeno que se unen a combinaciones de cadenas pesadas y ligeras podían ser seleccionados a partir de librerías combinatorias aleatorias. Por ejemplo, un repertorio de cadena ligera sobre fago fd podía ser utilizado para infectar células que albergan una librería de cadenas pesadas solubles sobre el fagémido. La librería de fagémido purificada por afinidad podría ser entonces utilizada para infectar E. coli, rescatada con la librería de fago purificada por afinidad y la nueva librería combinatoria ser sometida a una nueva ronda de selección. Por lo tanto, los genes de cadena ligera y de cadena pesada de anticuerpo son redistribuidos después de cada una de las rondas de purificación. Finalmente, después de varias rondas, las bacterias infectadas pudieron ser colocadas en placas y cribadas individualmente para fago de unión a antígeno. Las citadas librerías combinatorias duales son potencialmente más diversas que las codificadas en un vector único. Mediante la combinación de librerías separadas de 10^{7} fagos (fagémidos) de cadena ligera, la diversidad de los fragmentos Fab (potencialmente 10^{14}) está tan solo limitada por el número de bacterias (10^{12} por litro). De forma más simple, la utilización de dos vectores debería también facilitar la construcción de "librerías jerárquicas" en las que una cadena ligera o pesada fija es emparejada con una librería o socios (ejemplo 18), que ofrecen un medio de "afinar" la afinidad y especificidad para
anticuerpo.

Ejemplo 23 Inducción de fragmentos Fab y scFv solubles utilizando fagémido pHEN1

Nuevos estudios de anticuerpos que son expresados sobre la superficie de fago se verían facilitados en gran manera si resultara simple variar a expresión en solución.

E. coli HB2151 fue infectada con fagémido pHEN (pHEN1-I o II) y colocada en placas sobre YTE, placas con ampicilina 100 \mug/ml. Las colonias fueron agitadas a 37ºC en medio 2xTY, ampicilina 100 \mug/ml, glucosa 1% a OD_{550}= 0,5 a 1,0. Las células fueron pelletizadas, lavadas una vez en medio 2xTY, resuspendidas en medio con ampicilina 100 \mug/ml, isopropil-\beta-D-tiogalactosido (IPTG) 1 mM, y cultivadas durante un período adicional de 16 horas. Las células fueron pelletizadas y el sobrenadante, que contenía las cadenas secretadas, utilizado directamente en ELISA.

El fagémido pHEN1 presenta la ventaja sobre el fago fd-CAT2, de que el anticuerpo puede ser producido o bien mediante presentación de fago (mediante crecimiento en cepas supE de E. coli) o como un fragmento soluble etiquetado (mediante crecimiento en cepas no supresoras), como un péptido etiqueta (ejemplo 20) y se introdujo codón ámbar entre el anticuerpo y g3p. Se demostró la secreción de fragmentos Fab solubles a partir de pHEN1 o de fragmentos scFv a partir de pHEN1, después de crecimiento en E. coli HB2151 y de inducción con IPTG, utilizando análisis Western (Figura 26). Para la detección de proteínas secretadas, 10 \mul de sobrenadante de cultivos inducidos fueron sometidos a SDS-PAGE y las proteínas transferidas mediante electroblotting a Immobilon-P (Millipore). Cadenas solubles y pesadas solubles fueron detectadas con antisuero Fab anti-humano policlonal de cabra (Sigma) e inmunoglobulina anti-cabra de conejo conjugada con peroxidasa (Sigma), cada una de ellas a una dilución de 1:1000. El dominio VK etiquetado fue detectado con anticuerpo 9E10 (1:1000) e inmunoglobulina anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa (Fc específico) (1:1000) (Sigma) o con un antisuero CK (Dako) anti-humano marcado con peroxidasa. Como sustrato para peroxidasa se utilizó 3,3’-diaminobencidina (DAB, Sigma) (Harlow E., et al., 1988 Supra). Con el scFV, los fragmentos fueron detectados utilizando el anticuerpo etiqueta anti-myc 9E10 (datos no mostrados). Con el Fab, tan solo la cadena ligera fue detectada mediante anticuerpo 9E10 (o CK antihumano), tal como cabía esperar, muestra que el antisuero FAb anti-humano detectaba tanto cadenas pesadas como cadenas ligeras. La unión de los fragmentos Fab y scFv solubles a phOx-BSA (peo no a BSA) quedó también demostrada mediante ELISA (tabla 4B). Por lo tanto, los fragmentos scFv y Fab pueden ser presentados sobre fago o secretados en forma de fragmentos solubles procedentes del vector fagémido.

Ejemplo 24 Sensibilidad incrementada del ensayo ELISA de lisozima utilizando FDTscFv como anticuerpo primario comparado con scFvD1.3 soluble

En principio, la utilización de anticuerpos fago debería permitir la realización de inmunoensayos más sensibles que con anticuerpos solubles. Los anticuerpos de fago combinan la capacidad de unión a un antígeno específico con el potencial para amplificación a través de la presencia de múltiples copias (ca. 2800) de la proteína de revestimiento más específica (g8p) sobre cada uno de los viriones. Esto permitiría la unión de diversas moléculas de anticuerpo dirigidas frente a M13 a cada uno de los viriones, seguido de la unión de diversas moléculas de anticuerpo anti-especie conjugado con peroxidasa (anti-oveja) IgG en el caso anterior). Así pues, para cada uno de los anticuerpos fago unidos a antígeno existe potencial de unión con diversas moléculas de peroxidasa, mientras que cuando se utiliza un anticuerpo soluble como anticuerpo primario, esta amplificación no tendrá lugar.

Las placas ELISA fueron revestidas durante el transcurso de una noche a temperatura ambiente utilizando 200 \mul de diluciones multiplicadas por 10 (1000, 100, 10, 1, 0,1 y 0,01) en NaHCO_{3} 50 mM. pH 9,6. Se llevó a cabo un ELISA tal y como se describe en el ejemplo 4, con la excepción de que (i) la incubación con anticuerpo anti-lisozima fue con, o bien FDTscFvD1.3 (pAb; 10^{11} fagos por pocillo; 1,6 mol) o con scFvD1.3 purificado por afinidad soluble (18 \mug por pocillo; 0,7 nmol) (ii) la incubación con un segundo anticuerpo fue con una dilución 1/100 de suero de oveja anti-M13 para muestras FDTscFvD1.3 o con una dilución 1/100 de suero anti-scFvD1.3 de conejo (procedente de S. Ward) para muestras de scFvD1.3 solubles (iii) inmunoglobulina anti-cabra de conejo conjugada con peroxidasa (Sigma; 1/5000) fue utilizada para muestras de FDTscFvD1.3 e inmunoglobulina anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa (Sigma, 1/5000) fue utilizada para muestras scFvD1.3 solubles. La absorbancia a 405 nm fue medida después e 15 horas. Los resultados se muestran en las Figuras 30 y 31. En estas figuras se muestran las concentraciones de lisozima para revestimiento en una escala log de diluciones relativas a 1 \mug/ml (a saber, log=-3=1 mg/ml; log=2=0,01 \mug/ml).

Con FDTscFvD1.3, con todas las concentraciones de lisozima, se obtuvieron señales más elevadas (Figura 28), pero la diferencia resultó muy marcada en las diluciones más grandes, en las que las cantidades de antígeno eran más limitativas (Figuras 27 y 28). Esto sugiere que los anticuerpos fago pueden resultar particularmente valiosos para ensayos de tipo sándwich, en los que la captura de pequeñas cantidades de antígeno por parte del anticuerpo primario generará una señal amplificada cuando los anticuerpos fago dirigidos contra un epítope diferente se utilizan como segundo anticuerpo de unión a antígeno.

Ejemplo 25 Rescate directo y expresión de anticuerpos monoclonales de ratón como fragmentos de cadena sencilla sobre la superficie de bacteriófago fd

El principio resulta muy similar al descrito en el ejemplo 12. Consiste en el ensamblaje de PCR de anticuerpos de cadena sencilla procedentes de cADN preparado a partir de monoclonales de ratón. Como ejemplo, se describe el rescate y la expresión de dos de los citados anticuerpos a partir de anticuerpos que expresan monoclonales frente a la hormona esteroide oestriol.

A. Preparación de ARN

El ARN puede ser preparado utilizando muchos procedimientos bien conocidos por parte de los expertos en la materia. En este ejemplo, la utilización de lisis de Triton X-100, inactivación con fenol/SDS ARNsa proporcionó excelentes resultados.

1.: Las células monoclonales de ratón que fueron utilizadas habían sido recogidas mediante centrifugación y resuspendidas en medio exento de suero. Las mismas fueron después centrifugadas y resuspendidas en solución salina y, después de un paso de centrifugación final, resuspendidas en agua esterilizada a razón de 1 x 10^{7} células por ml. (normalmente las células serían lavadas en tampón PBS y finalmente resuspendidas en tampón PBS. Pero estas células en particular nos fueron suministradas tal y como se describe, congeladas en agua.)

2.: A 750 \mul de células se les añadieron 250 \mul de tampón de lisis 4x, enfriado con hielo (Tris-HCl 40 mM; pH 7,4/MgCl_{2} 4 mM/NaCl 600 mM/VRC (complejo veronilo ribosilo) 40 mM/TritonX-100 2%). La suspensión fue mezclada adecuadamente y se dejó sobre hielo durante 5 minutos.

3.: La centrifugación se llevó a cabo a 4ºC en una microfuga a 13.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante fue entonces extraído con fenol tres veces, extraído tres veces con fenol/cloroformo y, finalmente, precipitado con etanol, tal y como se describe en los materiales y los procedimientos. El precipitado fue resuspendido en 50 \mul de agua.

4.: Se midió la densidad óptica del ARN a 260 nm con una muestra de 2,5 \mul en 1 ml de agua. El ARN fue comprobado mediante electroforesis de una muestra de 2 \mug sobre gel de agarosa al 1%. El ARN, en la banda comprendida entre 32 y 42 \mug, fue obtenido mediante este procedimiento.

B. Preparación de cADN

El procedimiento utilizado es el mismo que el del ejemplo 12. Se llevaron a cabo dos preparaciones de cADN. Estas procedían de ARN extraído a partir de monoclonales conocidas como líneas celulares 013 y 014, las cuales expresan ambas anticuerpos frente a la hormona esteroide eh, oestriol.

C. PCRs primarias

El procedimiento utilizado es esencialmente el mismo que el del ejemplo 14. La región VH fue amplificada con los cebadores VH1BACK y VH1FOR-2. Para la región Vkappa, se llevaron a cabo cuatro reacciones separadas utilizando el cebador VK2BACK y con MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX o MJK5FONX. Muestras (5 \mul) fueron comprobadas sobre un gel de agarosa al 1,5%. A partir de esto, se observó que para el cADN preparado a partir de los dos monoclonales de oestriol, los cebadores VK2BACK y MJK1FONX proporcionaron la mejor amplificación de la región Vkappa. Las bandas VH y las bandas kappa amplificadas con VK2BACK/MJK1FONX fueron purificadas sobre geles de agarosa al 2% de bajo punto de fusión, para cada uno de los monoclonales. Las bandas de ADN fueron retiradas del gel y purificadas utilizando un kit Geneclean dedicado, tal y como se describe en el
ejemplo 12.

D. Preparación de componente de unión

El procedimiento utilizado es esencialmente el mismo que el descrito en el ejemplo 12. En este caso, el componente de unión amplificado ADN fue purificado sobre un gel de agarosa al 2% y recuperado a partir del gel con un kit "Mermaid" (BIO 101, Geneclean, La Jolla, San Diego, California, USA) dedicado, utilizando las instrucciones de los fabricantes.

E. Ensamblaje de PCRs

El procedimiento utilizado es esencialmente el mismo que el descrito en el ejemplo 12. En este caso, el producto PCR ensamblado fue purificado sobre gel de agarosa al 2% y recuperado a partir del gel con un kit "Mermaid" dedicado.

F. Adición de puntos de restricción y operatividad

El producto ensamblado fue "etiquetado" con puntos de restricción Apa LI y Not I. El ADN fue después digerido con Apa LI y Not I, para proporcionar los extremos pegajosos apropiados para clonado y después purificado sobre un gel de agarosa al 2% de punto de fusión bajo y extraído utilizando un kit Geneclean. El procedimiento utilizado es el mismo que el descrito en el ejemplo 12.

G. Clonado en vector fd-CAT2

Un total de 15 \mug de fd-CAT2 ADN purificado con CsCl fueron digeridos con 100 unidades del enzima de restricción Not I (New England Biolabs), en un volumen total de 200 \mul de tampón 1x NEB Not I con 1xBSA acetilado con NEB, por un total de 3 horas a 37ºC. El vector ADN fue el tratado dos veces con 15 \mul de Strataclean (una resina disponible comercialmente para la eliminación de proteína), siguiendo las instrucciones del fabricante (Stratagene, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, California, USA). El ADN fue entonces precipitado con etanol y redisuelto en tampón TE (Sambrook et al, 1989, supra). El ADN fue después digerido con 100 unidades del enzima de restricción Apa LI (New England Biolabs) en un volumen total de 200 \mul tampón 4 1x NEB, a 37ºC. El vector fue después purificado en una columna Chroma Spin 1.000, siguiendo las instrucciones del fabricante (Clontech Laboratories Inc, 4030 Fabian way, Palo Alto, California, USA). Este paso elimina el fragmento ApaLI/Not I para proporcionar en vector de corte de ADN para máxima eficacia de unión.

Las reacciones de unión fueron llevadas a cabo con 2,5-10 ng del inserto de ADN y 10 ng de vector en un volumen total de 10 \mul de tampón 1x NEB ligasa con 1 \mul de NEB ligasa (New England Biolabs) a 16ºC, durante el transcurso de una noche (aproximadamente 16 horas).

H. Transformación y crecimiento

La cepa TG1 d E. coli fue convertida en competitiva y transformada con el fdCAT2 recombinante, tal y como se describe en Sambrook et al, 1989, supra. Las células fueron ubicadas en placas sobre placas LBtet (10 g triptona, 5 g
de extracto de levadura, 10 g de NACl, 15 g de bacto-agar por litro, con tetraciclina 15 \mug/\mul que fueron añadidos justo antes de ser derramada en las placas) y cultivada durante el transcurso de una noche.

Colonias únicas bien aisladas fueron después inoculadas en 10 ml de caldo LBtet (medio LB con tetraciclina 15 \mug/\mul) en tubos de 50 ml. Después se mantuvieron en crecimiento durante el transcurso de una noche a 35ºC/350 rpm en una centrifugadora de banco superior. Los sobrenadantes fueron transferidos a tubos de centrifugación de 15 ml y se añadieron, a cada uno de ellos, 2 ml de PEG 8000 al 20%/NaCl 2,5 M. Después de incubación a temperatura ambiente durante un período de 20-30 minutos, el fago sobrenadante fue pelletizado mediante centrifugación a 9000 rpm en un rotor Sorval SM24, durante 30 minutos. El sobrenadante PEG fue descartado. Cualquier resto de PEG fue eliminado con una pipeta Pasteur, después de un breve paso de centrifugación (2 minutos). Este último paso fue repetido para tener la seguridad de que se había eliminado el PEG. El pellet de fago fue después resumergido en 500 \mul de tampón PBS. Se transfirió a un tubo de microcentrifugación y se hizo girar a 13000 rpm para eliminar cualquier resto de células. El fago sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo.

I. Ensayo para expresión de anticuerpo

Bacteriófagos fd recombinantes fueron cribados para expresión de anticuerpo frente a oestriol, mediante ELISA. Este procedimiento se describe en el ejemplo 6. En este caso, las siguientes alteraciones resultan relevantes.

1.: Placas de microvaloración fueron revestidas durante una noche con 40 \mug/ml de oestriol-6-carboximetiloxima-BSA (Steraloids, 31 Radcliffe Road, Croydon, CRO 5GJ, England).

2.: El primer anticuerpo era el fago putativo anticuerpo anti oestriol. 50 \mul de fago en un volumen final de 200 \mul de PBS esterilizada combinando con gelatina 0,25% fueron añadidos a cada uno de los pocillos.

3.: El segundo anticuerpo era anti M13 de oveja, a una dilución 1:1000.

4.: El tercer anticuerpo era inmunoglobulina anticabra de conejo conjugada con peroxidasa.

Los recombinantes que expresan anticuerpos funcionales fueron detectados mediante incubación con el sustrato cromógeno ácido 2’2’zinobis-(3-etil-benzotiazolin-sulfónico). Los resultados se muestran en las Figuras 29 y 30.

Ejemplo 26 Ensamblaje PCR de ADN que codifica para fragmentos Fab de un anticuerpo dirigido contra oxazolona

El ejemplo 21 demostró que los genes que codifican para fragmentos Fab podían ser subclonados en vectores fdCAT2 y pHEN1 y los dominios de proteína presentados sobre la superficie de fago con retención de la función de unión. Este ejemplo demuestra que los dominios VHCH y VKCK pueden ser amplificados separadamente y después unidos a través de un componente de unión que permite la expresión de la cadena ligera como una fusión de proteína de gen III y el fragmento VHCH como una molécula soluble. Un fragmento Fab funcional es después presentado sobre fago mediante asociación de estos dominios. El proceso de ensamblaje, descrito en este ejemplo, resulta necesario para la presentación de fragmentos Fab derivados del repertorio inmune, si tanto los dominios de cadena ligera como de cadena pesada tienen que ser codificados dentro de un vector único.

Los dominios VHCH1 y VKCK de una construcción (ejemplo 21, construcción II en pUC19) derivada de anticuerpo NQ10.12.5 dirigido contra 2-fenil-5-oxazolona fueron amplificados utilizando PCR. Para clonado en el vector fdCAT2, los oligonucleótidos VH1BACKAPA (ejemplo 21) y HulgG1-4CH1FOR (ejemplo 30) fueron utilizados para amplificar los dominios VHCH1. Para clonado en PHEN1, el VH1BACKSFH5 (ejemplo 21) sustituyó a VH1BACKAPA para esta amplificación. Para clonado en ambos vectores, los dominios VKCK fueron amplificados utilizando VK2BACK (Ejemplo 21) y CKNOTFOR (ejemplo 30). Se preparó un fragmento de oligonucleótido de unión que contiene la terminación 8 del gen fd de bacteriófago y el gen 3 fd, mediante amplificación de la región que los contiene a partir el vector fdCAT2 mediante PCR, utilizando los oligonucleótidos:

VK-TERM-FOR

: 5’-TGG AGA CTG GGT GAG CTC AAT GTC GGA GTG AGA ATA GAA AGG 3’ (se superpone con VK2BACK [ejemplo 12]) y 12

CH1-TERM-BACK

: 5’AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT AGC TGA TAA ACC GAT ACA ATT AAA GGC 3’ (se superpone con HulgG1-4-CH1-FOR).

El ensamblaje del fragmento Fab procedente de los dominios VHCH1 y VKCK y el elemento de unión preparado tal y como se ha indicado anteriormente fue tal como se describe en el ejemplo 12E, con la excepción de que los cebadores VH1BACKAPA (cuando son clonados a fdCAT2) o VH1BACKSFH5 cuando es clonado a pHEN1) y CKNOTFOR fueron utilizados para la reamplificación final, introduciendo con ello puntos de restricción para clonado a fdCAT2 (Apa1I-Notl) o pHEN1 (Sfil-Notl) el fragmento Fab ensamblado, tal como se muestra en la Figura 31. En ausencia de elemento de unión no se observó la presencia de producto ensamblado. Un scFv ensamblado, preparado según el ejemplo 12, se muestra a efectos comparativos.

Los anticuerpos fago fueron preparados como en el ejemplo 21 y se llevó a cabo un ELISA con oxazolona como antígeno, según el ejemplo 6. Los resultados fueron los esperados para los fragmentos FAb clonados, tanto en muestras fdCAT2 como en muestras pHEN1, las partículas de fago se unían a oxazolona, tal como se detectaba a través de una señal ELISA positiva.

Ejemplo 27 Construcción de un fago auxiliar deficiente en gen III

Para comprender totalmente el potencial del sistema de clonado de fagémido resulta deseable un fago auxiliar que carezca del gen III. El rescate de las fusiones de gen III con el referido fago auxiliar daría lugar a que la totalidad de progenie de fagémidos tuviera una fusión de gen III sobre sus cápsidos, dado que no existiría competencia con la molécula de tipo natural.

El control sobre el número de moléculas de fusión contenidas en cada uno de los fagos resultará particularmente útil. Por ejemplo, para rescatar anticuerpos de baja afinidad puede utilizarse un fago auxiliar deficiente en gen III procedente de un repertorio sencillo, en el cual resultará necesaria una elevada avidez para aislar a los fagos que soportan la correcta especificidad de anticuerpo. El fago auxiliar no mutado puede ser después utilizado cuando se construyan versiones de afinidad más elevada, reduciendo con ello el componente avidez y permitiendo que la selección tenga lugar puramente en base a la afinidad. Esto resultará ser una estrategia sorprendentemente exitosa para el aislamiento y la maduración por afinidad de anticuerpos procedentes de librerías sencillas.

La estrategia elegida para construir el fago auxiliar era la de suprimir parcialmente el gen III de M13K07, utilizando exonucleasa Bal31. No obstante, las proteínas de gen III carentes de fago no resultan infecciosas, por lo que se construyó una cepa de E. coli que expresaba el gen III. El gen III M13 de tipo natural fue amplificado mediante PCR con cebadores gIIIFUFO y gIIIFUBA, exactamente como se describe en el ejemplo 20. El producto de PCR fue digerido con Eco RI y Hind III e insertado en Eco RI y pUC19 cortado por Hind III (no un fagémido, dado que carece del origen de fago filamentoso de replicación ADN SS, bajo control del favorecedor lac. El plásmido fue transformado en E. coli TG1 y la cepa resultante denominada TGI/pUC19gIII. Esta cepa proporciona proteína gIII en trans para el fago auxiliar.

Existe un único punto BAm HI sencillo en M13K07, el cual está situado aproximadamente en el centro de gIII. Se preparó ADN M13K07 de doble hebra mediante lisis alcalina y centrifugación con cloruro de cesio (Sambrook et al, supra, 1989); veinte \mug de ADN fueron cortados con Bam H1, extraídos con fenol y precipitados con etanol, después resuspendidos en 50 \mul de tampón Bal 31 (NaCl 600 mM; Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; CaCl_{2} 12 mM y EDTA 1 mM) y fueron digeridos durante 4 minutos con 1 unidad de Bal 31 (New England BioLAbs). Este tratamiento eliminó aproximadamente 1 kb de ADN. Se añadió EGTA a 20 mM y se extrajo con fenol y precipitó con etanol, con anterioridad a la purificación del genoma truncado sobre un gel de agarosa. El ADN fue reparado con enzima klenow y autoligado con T4 ADN ligasa (New England BioLabs).

Alícuotas de la reacción de ligado fueron transformadas en TG1/pUC19gIII competitivo y ubicadas en placas sobre medio SOB que contenía ampicilina a 100 \mug/ml y kanamicina a 50 \mug/ml. Las colonias fueron cribadas en búsqueda de presencia de una supresión mediante PCR con cebadores gIIIFUBA y KSJ12 (CGGAATACCCAAAAGAACTGG).

El KSJ 12 se anilla al gen VI que está situado inmediatamente aguas abajo del gen III en el genoma fago, distinguiendo de este modo al gIII sobre el fago auxiliar del que reside sobre el plásmido. Tres clones proporcionaron productos PCR truncados, correspondientes a supresiones de ca. 200, 400 y 800 bp. Estos clones fueron denominados M13K07 gIII \Delta Nos 1,2 y 3, respectivamente. No se aislaron clones a partir de los puntos temporales Bal 31 tempranos, sugiriendo que estos resultan, de alguna forma, letales para la célula huésped. Diversos clones fueron aislados a partir de puntos temporales tardíos, pero ninguno de ellos proporcionó un producto PCT, indicando que la reacción de supresión había ido demasiado lejos.

Los M13K07 gIII \Delta Nos 1, 2 y 3 fueron cultivados y el fago auxiliar resultante comprobado en lo concerniente a su capacidad para rescatar una fusión gIII de anticuerpo (scFv 1.3) por medio de ELISA, exactamente como se ha descrito en el ejemplo 14. Tal y como se muestra en la Figura 32, se averiguó que tan solo un clon, M13FC07.gIII\DeltaNo3, rescataba correctamente al anticuerpo; de hecho, la señal que utiliza este auxiliar era más grande que la observada con el progenitor M13K07. Los fagémidos rescatados con M13KO7 gIII\DeltaNo3 deben tener una densidad mucho más elevada de fusiones de anticuerpo sobre sus superficies. Que este era efectivamente el caso fue demostrado cuando el fago utilizado en este ELISA fue analizado por medio de ensayo Western con antisuero de proteína gIII (Figura 33). Este análisis permite la estimación de la cantidad de proteína de fusión gIII frente a la proteína gIII libre sobre las partículas de fago (fagémido).

Tan solo una mínima fracción de la proteína gen III sobre el material rescatado por M13KO7 se encuentra presente como una fusión intacta (Figura 33). La banda de proteína de fusión es inducida por IPTG, por lo que resulta incuestionable que es sintetizada por el fagémido. Según lo esperado, incluso cuando el favorecedor lac que conduce la síntesis de proteína de fusión gIII está totalmente inducido (IPTG 100 \muM), predomina la proteína de tipo gIII, con un número de copias más bajo y dirigida a partir de un favorecedor mucho más débil. Esto está en contraste con el patrón generado por el mismo clon rescatado con M13KO7 gIII\DeltaNo3, y con el patrón generado por medio de fd CAT2-scFv D1.3. En ambos últimos casos, no existe competencia con el gIII de tipo natural y la banda de proteína de fusión es, en consonancia, más fuerte.

Resulta destacable hacer notar que la construcción de M13KO7 gIII\DeltaNo3 resultó inmensamente ineficaz: un clon a partir de 20 \mug de ADN de partida. Además, el rendimiento de fago auxiliar gIII a partir de cultivos dejados a lo largo de una noche es extremadamente bajo, ca. 10^{6} cfu/ml, en comparación con la ca. de 10^{11} cfu/ml para el fago parental. A pesar de esto, el M13KO7 gIII\Deltao3 rescata al fagémido al igual que el fago parental, según pueden comprobarse a través del número de partículas de fagémido producidas después del crecimiento durante la noche. Esto indica que la replicación trans y las funciones de envasado del auxiliar permanecen intactas y sugiere que su propia replicación resulta defectuosa. Por consiguiente, puede resultar que la inactivación de gIII resulte normalmente tóxica para la célula huésped y que el M13KO7/gIII\DeltaNo3 fuera aislado debido a una mutación compensatoria que afecte, por ejemplo, a la replicación. El fago fd-tet resulta inusual dado que el mismo tolera mutaciones en genes estructurales que resultan normalmente letales para la célula huésped, dado que la misma tiene un defecto de replicación que reduce la acumulación de productos fago tóxicos; el M13KO7 gIII\DeltaNo3 puede también presentar este defecto.

El M13KO7 gIII\DeltaNo 3 ha sido depositado en la National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London, NW9 6HT, UK (accesión No. NCTC 12478). El 28 de Junio de 1991, según el reglamento del tratado de Budapest. El mismo contiene un supresión del genoma M13 a partir de las bases 1979 a 2768 inclusive (ver Van Wezenbeek, P.G.M.F. et al, Gene II p 129-148, 1980, para la secuencia de ADN del genoma de M13).

Ejemplo 28 Selección de bacteriófago que expresa fragmentos scFv dirigido frente a lisozima a partir de mezclas según la afinidad, utilizando un procedimiento de reconocimiento y selección

Para el aislamiento de un anticuerpo con una afinidad elevada deseada, resulta necesario ser capaz de seleccionar un anticuerpo con tan solo una afinidad unas pocas veces más elevada que la del resto de la población. Esto resultará particularmente importante cuando se ha aislado un anticuerpo con insuficiente afinidad, por ejemplo, procedente de un repertorio que deriva de un animal inmunizado, y se utiliza mutagénesis aleatoria para preparar derivados con afinidad potencialmente incrementada. En este ejemplo, mezclas de fagos que expresan anticuerpos de diferentes afinidades dirigidos contra lisozima de huevo de gallina fueron sometidos a un procedimiento de reconocimiento y selección. Se demostró que los anticuerpos de fago proporcionaban la capacidad de seleccionar un anticuerpo con una K_{d} de 2 nM, frente a uno con una K_{d} de 13 nM.

Los oligonucleótidos utilizados en este ejemplo se muestra en la lista que sigue a continuación

Oligonucleótidos

4

5

Los fragmentos scFv que presentan los fagos dirigidos contra lisozima fueron derivados de fragmentos Fab clonados en plásmidos.

Regiones variables de cadena ligera y pesada fueron amplificadas por medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR) a partir de plásmidos humanizados que contienen insertos VH-CHI o VK-CK adecuados para la producción de fragmentos Fab (obsequio de J. Foote). La constante de disociación Kd para diferentes combinaciones de los dos plásmidos combinados como Fabs se muestra seguidamente:

Plásmido de cadena pesada	Plásmido de cadena ligera	Kd
HuH-1	HuK-3	52 nM
HuH-1	HuK-4	180 nM
HuH-2	HuK-3	13 nM
HuH-2	HuK-4	(no determinada)

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PCR primaria

La PCR primaria de las regiones variables fue llevada a cabo combinando lo siguiente:

: 36,5 \mul de agua

: 5 \mul de tampón PCR (10x)

: 2 \mul de dNTP (5 mM)

: 2,5 \mul de oligo Back (10 pmoles/ \mul)(VHBHD13APA o VKBHD13)

: 2,5 \mul de oligo Forward (10 pmoles/ \mul)(VHFHD13 o VKFHD13NOT).

La reacción es descontaminada mediante irradiación UV para destruir ADN extraño durante 5 minutos, y se añade 1 \mul de ADN plásmido (0,1 \mug/ \mul). La mezcla PCR fue cubierta con dos gotas de aceite de parafina y colocada sobre un bloque PCR a 94ºC durante 5 minutos, con anterioridad a la adición de 0,5 \mul de Taq ADN polimerasa bajo la parafina. Las condiciones de ciclado eran 94ºC 1 min., 40ºC 1 min., 72ºC 1,5 min., 17 ciclos.

El componente de unión (Gly_{4}-Ser)_{3} fue amplificado a partir del clon anti-phOx (2-feniloxazol-5-ona) fd-CAT2-scFv NQ11, utilizando los oligos HD 13BLIN y HD13FLIN3, con 0,1 \mug de ADN plásmido. El ciclado de PCR utilizado fue de 94ºC 1 min., 25ºC 1,5 min., durante 17 ciclos.

El ADN amplificado fue purificado trabajando las muestras sobre gel de agarosa de bajo punto de fusión al 2% a 90 mA, separando las bandas adecuadas y extrayendo el ADN utilizando el kit Geneclean II (BIO 101 Inc) para VH y VK, o utilizando unidades de filtro Spin-X (Costar) para el componente de unión. Para resuspender el ADN extraído se utilizó un volumen final de 10 \mul.

Ensamblaje PCR

El ensamblado de las cuatro construcciones Fv humanizado D1.3 (scFv HuD1.3) de cadena única se efectuó a través del procedimiento de ensamblaje mediante extensión por superposición del ejemplo 12. Se combinaron los siguientes componentes:

: 34,5 \mul de agua

: 5 \mul de tampón PCR (10x)

: 2 \mul de dNTP (5 mM)

: 2,5 \mul de oligo Back (10 pmoles/ \mul)(VHBHD13APA)

: 2,5 \mul de oligo Forward (10 pmoles/\mul)(VKFHD13NOT).

Una vez más, la reacción es descontaminada mediante tratamiento UV durante 5 minutos, antes de proceder a efectuar la adición de 1 \mul de los productos PCR primarios; VH-1 o VH-2, VK-3 o VK-4, además del ADN de unión. La reacción fue cubierta con 2 gotas de parafina y calentada a 94ºC durante 5 minutos antes de proceder a la adición de 0,5 \mul de la Tag polimerasa. Las condiciones de clicado PCR utilizadas fueron 94ºC 1 min., 60ºC 1,5 min., 72ºC 2,5 min., durante 20 ciclos.

La capa acuosa bajo la parafina fue extraída una vez con fenol, una vez con fenol:cloroformo, una vez con éter, precipitada con etanol y re-suspendida en 36 \mul de agua. Se añadieron 5 \mul de tampón 10x para Notl, 5 \mul de BSA a
1 mg/ml, y 4 \mul (40 U) de Notl (New England Biolabs). La restricción fue incubada a 37ºC durante el transcurso de una noche.

El ADN fue precipitado con etanol y re-suspendido en 36 \mul de agua y 5 \mul de tampón NEB 10x, 4,5 \mul de BSA 1 mg/ml y 2 \mul (40 U) de AlaLI (New England BioLabs). Se incubó a 37ºC durante 5 minutos; se añadieron 2 \mul adicionales de ApaLI y se procedió a incubar la reacción a 37ºC durante el transcurso de una noche.

El ADN cortado fue extraído mediante purificación con gel sobre gel de agarosa al 1,3%, de bajo punto de fusión, seguido de tratamiento con Geneclean, para generar el inserto de ADN para clonado.

El vector fd CAT2 (preparado y digerido con ApaLI y Notl, como en el ejemplo 16) y el scFv ADN fueron ligados como en el ejemplo 16.

Análisis de clones

Las colonias procedentes de las uniones fueron primeramente cribadas en búsqueda de insertos mediante cribado con PCR. La mezcla para PCR fue preparada en masa mediante la combinación de 14,8 \mul de tampón PCR 1x; 1 \mul de dNTP (5 mM); 1 \mul de oligo Back (FDPCRBAK); 1 \mul de oligo Forward (FDPCRFOR) y 0,2 \mul de Taq polimerasa por colonia cribada. 20 \mul de esta mezcla PCR se aplicaron como alícuota a una placa Techne. La parte superior de una colonia fue tocada con un palillo de dientes y girada rápidamente en la mezcla de PCR y la colonia rescatada mediante la colocación del palillo de dientes en una placa Cellwell (Nunc) que contenía 250 \mul de medio 2xTY. La mezcla PCR es cubierta con 1 gota de parafina y la placa es ubicada sobre el bloque a 94ºC durante 10 minutos, antes de ser ciclada a 94ºC 1 minuto, 60ºC 1 minuto, 72ºC, 2,5 minutos.

Los clones derivados de este modo fueron denominados como se indica más adelante. La afinidad de los fragmentos scFv derivados de los fragmentos Fab no fue determinada pero los resultados previos sugieren que los mismos están estrechamente relacionados, a pesar de no ser necesariamente idénticos (R.E. Bird & B.W. Walker TIBTECH 9 132-137, 1991).

Nombre de la construcción	Composición	Afinidad de Fab (Kd)
TPB1	VH-HuH2-(Gly_{4}-Ser)_{3}-VK-HuK3	13 nM
TPB2	VH-HuH1-(Gly_{4}-Ser)_{3}-VK-HuK4	180 nM
TPB3	VH-HuH2-(Gly_{4}-Ser)_{3}-VK-HuK4	(Desconocida)
TPB4	VH-HuH1-(Gly_{4}-Ser)_{3}-VK-HuK3	52 nM

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La preparación de fago y de ELISA fue tal y como se describe en el Ejemplo 6. Se demostró que los clones generados en fd CAT2 se unían a lisozima, según lo esperado.

Selección por afinidad Selección del fago de afinidad más elevada

Se llevaron a cabo experimentos de mezclado, en los cuales el fago fd-CAT2 scFvD1.3 (ejemplo 15) fue mezclado o bien con fd-CAT2 TPB1, fd CAT2 TPB2 o fd-CAT2TKPB4, y se utilizó en una ronda de reconocimiento y selección.

El procedimiento general utilizado para selección por afinidad a través de reconocimiento y selección es el detallado más adelante. Cualquier desviación de este protocolo se describe en el punto relevante. Las placas de reconocimiento y selección fueron ubicadas sobre una plataforma oscilante entre las manipulaciones.

Platos de cultivo celular Falcon de 35 mm fueron revestidos durante el transcurso de una noche con 1 ml de lisozima (diversas concentraciones) disuelta en bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,6, y bloqueada con 2 ml de MPBS 2% a temperatura ambiente durante 2 horas. Los fagos se prepararon en 1 ml de MPBS al 2% y oscilados a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas fueron lavadas durante 5 minutos, con 2 ml de las siguientes soluciones; 5 veces con PBS, PBS-Tween, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; cloruro sódico 500 mM; Tris-HCl 50 mM, pH 8,5; cloruro sódico 500 mM; Tris-HCl 50 mM, pH 9,5; cloruro sódico 500 mM, bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,6; cloruro sódico 500 mM. Los fagos fueron después eluidos mediante la adición de 1 ml de trietilamina 100 mM y sometidos a oscilación durante 5 minutos, antes de proceder a la eliminación del eluido, el cual fue neutralizado con 100 \mul de Tris-HCl
1,0 M, pH 7,4.

Las placas fueron revestidas durante el transcurso de una noche con lisozima a las concentraciones indicadas más adelante.

Colonias procedentes de la ronda única de reconocimiento y selección fueron sondadas con o bien MURDSEQ (para fdCAT2 scFvD1.3) o HUMD13SEQ (para construcciones fdCAT2 TPB)

Círculos de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, BA 85, 0,45 \mum) fueron marcados con lápiz y hechos descender suavemente en las colonias derivadas procedentes de los experimentos de reconocimiento y selección y dejados durante un minuto. Los filtros fueron después retirados rápidamente desde un extremo y colocados con la colonia mirando hacia arriba sobre un papel 3MM (Whatman) sumergido en solución desnaturalizante (hidróxido sódico 500 mM; cloruro sódico 1,5M) durante 5 minutos. Fueron transferidas a 3MM sumergido en solución neutralizante (cloruro sódico 3.0 M; Tris-HCl 500 mM, pH 7,5) durante 1 minuto y después sumergidas en 3MM en 5xSSC; acetato amónico 250 mM durante 1 minuto. Los filtros fueron después secados al aire, antes de ser horneados en horno de vacío a 80ºC durante 30 minutos.

la sonda de oligonucleótidos fue preparada mediante la combinación de los siguientes componentes:

: 2 \mul de oligonucleótido (1 pmol/\mul)

: 2 \mul de \delta-32P ATP (3000 Ci/mmol) (Amersham International plc)

: 2 \mul de tampón 10x kinasa (Tris-HCl 0,5 M; pH 7,5; cloruro de magnesio 100 mM; DTT 10 mM)

: 12 \mul de agua

: 2 \mul de polinucleótido kinasa (20 unidades).

La combinación fue incubada a 37ºC durante 1 hora.

La hibridación fue llevada a cabo en el hibridizador Techne HB-1. Los filtros cocidos fueron pre-hibridados a 37ºC en 40 ml de tampón de hibridación (10 ml de pirofosfato sódico 100 mM; 180 ml de cloruro sódico 5,0 M; 20 ml de solución de Denhats 50x; 90 ml de Tris-HCl 1,0 M, pH 7,5; 24 ml de EDTA 250 mM; 50 ml de NP40 10%; completada hasta alcanzar 1 litro con agua; 60,3 mg de rATP; 200 mg de ARN de levadura (Sigma)), durante 15 minutos, antes de la adición de los 20 \mul de la oligoquinasa. Los filtros fueron incubados a 37ºC durante al menos una hora y después lavados 3 veces con 50 ml de 6xSSC a 37ºC, durante 10 minutos (lavado de baja estringencia). Los filtros fueron secados al aire, cubiertos con una envoltura Saran y presentados durante el transcurso de una noche a una película Kodak X-AR. Selección de fd-CAT2 scFvD1.3 a partir de fd-CAT2 TPB4.

La Figura 34 sintetiza los resultados a partir de experimentos de reconocimiento y selección, utilizando una mezcla de fago fd-CAT2 scFv D1.3 de elevada afinidad (Kd-2 nM) y la construcción fd-CAT2 TPB4 (Kd-52 nM).

A una concentración de revestimiento de 3000 \mug/ml de lisozima, el enriquecimiento obtenido fue nulo o escaso. No obstante, resultó posible conseguir enriquecimiento para el fago scFv D1.3 cuando se utilizó una concentración más baja de lisozima para revestir las placas. El mejor valor de enriquecimiento obtenido oscilaba entre 1,5% fd-CAT2 scFvD1.3 en la mezcla de partida y el 33% de fd-CAT2 scFvD1.3 en la fracción eluida, sobre una placa revestida durante el transcurso de una noche con 30 \mug/ml de lisozima. Selección de fd-CAT2 scFvD1.3 a partir de fd-CAT2TPB1.

El enriquecimiento para el fago de elevada afinidad scFvD1.3 sobre el fago fd-CAT2 TPB1 (Kd-12 nM) solo pudo ser demostrado a partir de experimentos en los que las placas habían sido revestidas durante el transcurso de una noche con concentraciones bajas de lisozima, tal y como se muestra en la Figura 35.

En resumen, se han construido versiones Fv de cadena única de una serie de anticuerpos D1.3 humanizados en fago fd-CAT2. Mediante selección por afinidad de mezclas de fago fd-CAT2, reconocido y seleccionado en platos petri pequeños, se demostró que la elevada afinidad del fago scFvD1.3 podía ser seleccionada preferentemente frente a un fondo de fago scFv HuD1.3 de afinidad más baja.

Ejemplo 29 Generación y selección de mutantes de un anticuerpo ácido anti-4-hidroxi-3-nitrofenilacético (NP), expresado sobre fago utilizando cepas mutadoras

A veces resultará deseable incrementar la diversidad de un grupo de genes clonados en fago, por ejemplo un grupo de genes de anticuerpo o para producir un gran número de variantes de un gen clonado único. Existen muchos procedimientos de mutagénesis adecuados in vitro. No obstante, un procedimiento particularmente atractivo para preparar una población más diversa de una librería de genes de anticuerpo, se basa en utilizar cepas mutadoras. Esto presenta la ventaja de generar números muy elevados de mutantes, esencialmente limitados tan solo por el número de fagos que pueden ser manipulados. El sistema de presentación de fago permite sacar pleno partido de este número para aislar clones alterados o mejorados.

Las secuencias de nucleótido que codifican para un fragmento de anticuerpo scFv dirigido contra ácido 4-hidroxi-3-nitrofenilacético (NP), scFv18, derivado como en el ejemplo 12 de un anticuerpo monoclonal contra NP, fueron clonadas en fdCAT2 utilizando puntos de restricción ApaLI y Notl como en el ejemplo 11, para crear fdCAt2scFvB18 o en fdDOGKan (fdCAT2 con su gen de resistencia a tetraciclina eliminado por un gen de resistencia a kanamicina) utilizando puntos de restricción Pstl y Notl para crear fdDOGKanscFv18 o en el vector fagémido pHEN1, utilizando los puntos de restricción Sfil y Notl como una proteína de fusión con el gen III para crear pRENIscFvB18.

Se utilizaron las siguientes cepas mutadoras (R.M.Schaaper & R.L.Dunn, J. Mol. Biol. 262 1627-16270, 1987; R.M. Schapper Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 8126-8130 1988):

NR9232: ara, thi, mutD5-zaf13::Tn10, prolac, F’prolac

NR9670: ara, thi, azi, mutT1, leu::Tn10, prolac

NR9292: ara, thi, mutH101, prolac, F’prolac

NR9084: ara, thi, mutT1, azi, prolac, F’prolaclZ\DeltaM15M15

NR9046: ara, thi, supE, rif, naIA, metB, argE(am), prolac, F’prolac fueron obsequios gentileza de Dr. R.M. Schaaper (Department of Health & Human Services, NIH, PO Box 12233; Research Triangle Park, N.C. 27709).

NR9046mutD5: NR9046 mutD5:: Tn10

NR9046mutT1: NR9046 mutT1: Tn10.

Fueron construidas mediante transducción P1, según procedimientos habituales. Las cepas mutadoras fueron transfectadas con fdCAT2scFvB18 de fdDOGKanscFvB18 y los transfectantes seleccionados por su resistencia a antibióticos. Los transfectantes fueron cultivados durante un período de 24 horas a 37ºC, antes de que el fago mutante fuera revestido mediante precipitación con PEG. Los fagos mutantes fueron recogidos sobre una columna de afinidad NIP (ácido 4-hidroxi-3-yodo-5-nitrofenilacético)-BSA-Sepharose de 1 ml, preparada según las instrucciones del fabricante, prelavada con 200 ml de PBS y bloqueada con 20 ml de MPBS. Los fagos fueron depositados sobre la columna en 10 ml de MPBS y el material no unido fue aplicado de nuevo para asegurar la unión completa. La columna fue lavada, subsiguientemente, con 10 ml de MPBS y 500 mls de PBS. El fago unido a la matriz de afinidad fue eluido con cinco volúmenes de Nip-Cap 0,33 mM (Ejemplo 38).

El eluido de fago fue incubado entre 30 min. y 1 hora con cepas mutadoras de E. coli en fase log (2 x 10^{8} células/ml), sin selección de antibiótico. Las células infectadas fueron después diluidas 1:100 en 2xTY y cultivadas durante 24 horas con selección de antibiótico (tetraciclina 15 \mug/ml o kanamicina 30 \mug/ml para fdCAT2scFvB18 o fdDOGKansc FvB18, respectivamente). El fago procedente de este medio de cultivo fue utilizado para otra ronda de selección y mutación por afinidad.

La unión de anticuerpos fago fue sometida a ensayo mediante ELISA, como en el ejemplo 9, con la excepción de que las placas ELISA fueron revestidas con NIP-BSA (4-hidroxi-3-yodo-5-nitrofenilacetilo-BSA; 0,4 mg/ml). Los sobrenadantes de cultivo se prepararon siguiente el crecimiento en Cellwek, tal y como se describe en el Ejemplo 17 y 20 \mul de cultivo sobrenadante fueron añadidos a cada uno de los pocillos diluidos hasta 200 \mul con MPBS.

Las muestras de fago que daban señales en ELISA de más del doble del fondo fueron objeto de comprobación mediante ELISA, tal y como se ha indicado anteriormente, para determinar la unión no específica frente a lisozima, BSA o Ox-BSA (ejemplo 9). La especificidad para NIP fue confirmada adicionalmente a través de un ELISA, en el que diluciones en serie de NIP-CAAP fueron añadidas conjuntamente con anticuerpos fago. La adición de concentraciones crecientes de NIP-CAP reducía la señal ELISA a nivel a de la del fondo.

Los fagos que dieron señales positivas en ELISA fueron secuenciados y se subclonaron 2 diferentes mutantes en fagémido pHEN1, transformándose en HB2151 para expresión soluble y TG1 para presentación de fago (ejemplo 23).

Para la expresión de fragmentos scFv solubles, los transformantes en E. coli HB2151 fueron cultivados a 37ºC en 1 litro de 2xTY, glucosa 2%; ampicilina 0,1 mg/ml hasta un OD600 de 1 se indujo la expresión de fragmentos scFv solubles mediante la adición de IPTG a 1 mM. Los cultivos fueron agitados a 30ºC durante 16 horas.

El scFvB18 soluble fue concentrado a partir de sobrenadante bacteriano crudo, en una unidad de ultrafiltración FLOWGEN, hasta un volumen de 200 ml.

El concentrado se hizo pasar dos vece sobre una columna NIP-BSA-Sepharose de 2 ml, prelavada con 200 ml de PBS. La columna fue lavada con 500 ml de PBS y 200 ml de Tris 0,1M pH7,5; NaCl 0,5M y los anticuerpos de fago fueron eluidos con tampón citrato 50 mM, pH 2,3. El eluido fue inmediatamente neutralizado con Tris 1M pH8. El eluido fue sometido a diálisis contra dos cambios de 1 litro de PBS, EDTA 0,2 mM. La proteína precipitada fue extraída mediante centrifugación a 10.000 g y se determinó el rendimiento en proteína midiendo la absorbancia a 280 nm del sobrenadante.

Después de cuatro rondas de mutación y selección, los clones aislados fueron cribados y en uno o dos ejemplos raros se obtuvieron señales fuertemente positivas ELISA procedentes de los anticuerpos de fago derivados de la mutación de cada uno de fdCAT2FvB18 y fdDOGKanscFvB18 en el ELISA. Las condiciones ELISA fueron tales que el fago progenitor fdCAT2scFvB18 generó tan solo señales débiles. Estos anticuerpos de fago que proporcionan señales ELISA fuertemente positivas fueron enriquecidos en posteriores rondas a través de un factor de aproximadamente 2,5 por ronda. Cuarenta anticuerpos de fago que proporcionaban señales fuertemente positivas fueron secuenciados y cada uno de ellos mostró mutaciones sencillas en seis diferentes posiciones en las secuencias de nucleótido scFvB18, cinco de los cuales residían en la cadena ligera. Más del 70% de las mutaciones tenían lugar en las posiciones 724 y 725 cambiando la primera glicina en el segmento J de la cadena ligera (marco 4) por serina (en 21 casos) o aspartato (en 3 casos). Las mutaciones encontradas se muestran en la tabla 5. La secuencia de scFvB18 se muestra en la Figura 36.

Las secuencias de nucleótido que codifican para los fragmentos scFv de un mutante marco con la glicina indicada anteriormente para mutación serina, al igual que un mutante en el que Tyr en el CDR3 de la cadena ligera había sido mutado a aspartato, fueron amplificadas mediante PCR a partir de los clones de anticuerpo de fago y subclonadas en fagémido pHEN1 (esencialmente como en el ejemplo 21). Esto evita posibles problemas con mutaciones del gen III provocados por las cepas de mutador. El mismo patrón de señales ELISA fue observado cuando los mutantes se presentaron sobre fago después del rescate del fagémido con el fago auxiliar (tal como se describe en el ejemplo 21), como cuando los mutantes fueron sometidos a ensayo cuando se expresaban desde el genoma del fago, como anteriormente.

Los fragmentos scFv procedentes de scFvB18 y los fragmentos scFv que contienen las mutaciones de glicina a serina y de tirosina a aspartato, respectivamente, fueron expresados en solución (después de la transformación en E. coli HB2151, como en el ejemplo 23) a 30ºC. Los mismos no mostraban diferencias en las señales ELISA entre B18 de tipo natural y el mutante marco. La señal obtenida procedente del anticuerpo e fago con la Tyr mutada a aspartato en CDR3 de scFvB18 era aproximadamente 10x más fuerte. Se averiguó que los rendimientos de expresión eran comparables, según el análisis Western, utilizando un antisuero preparado contra g3p (tal como se describe anteriormente). Las mediciones de afinidad fueron llevadas a cabo utilizando apagado de fluorescencia, tal y como se describe en el ejemplo 19. Las mediciones de afinidad de los fragmentos scFv purificados por afinidad mostraban, no obstante, que todos los mutantes scFv618, el scFvB18 (Gly \rightarrow Ser) y los mutantes scFvB18 (Tyr \rightarrow Asp) tenían todos ellos una afinidad de 20 nM para NIP-CAP.

Un análisis Western utilizando un anticuerpo anti-gen III mostró que el mutante marco había sufrido una rotura proteolítica significativamente inferior a la del scFvB18.

Por consiguiente, la utilización de cepas de mutador genera un rango diverso de mutantes en anticuerpos de fago, cuando los mismos se utilizan como huéspedes para fusiones de gen III. En este caso, algunos de los clones muestran señales ELISA más elevadas debido probablemente a la estabilidad incrementada al ataque proteolítico. Las cepas de mutador pueden por tanto ser utilizadas para introducir diversidad en un clon o en una población de clones. La diversidad debería generar clones con características deseables, tales como una afinidad o especificidad más elevadas. Los citados clones pueden ser después seleccionados después del la presentación de las proteínas sobre el
fago.

Ejemplo 30 Una técnica basada en PCR para un paso de clonado de genes V humanos como construcciones Fab

Este ejemplo describe una técnica basada en PCR para "ensamblar" Fabs humanos mediante el empalmado conjunto del ADN de cadena pesada y de cadena ligera con una pieza separada de ADN de "unión". Se utiliza una mezcla de cebadores universales, la cual debería hacer la técnica aplicable a la totalidad de genes V humanos.

La técnica general para ensamblaje de PCR de genes V humanos para crear una construcción Fab está descrita. La eficacia de esta técnica fue valorada mediante "ensamblado", clonado y expresión de un Fab anti-resus (Rh-D) humano, procedente de hibridoma monoclonal IgG-K. También demostramos el potencial para rescatar anticuerpos humanos monoclonales a partir de poblaciones celulares policlonales mediante ensamblaje, expresión y aislamiento de Fab anti-Rh-D monoclonal IgG-lambda procedente de una línea celular linfoblástica policlonal (LCL).

La estrategia global para el ensamblaje mediante PCR se muestra en la Figura 37 y se describe más adelante con mayor detalle. Para el ensamblaje con PCR, las cadenas ligeras VH-CH1 y VK-CK o Vlambda-C son amplificadas a partir de la primera hebra de cADN y purificadas mediante gel. El ADN de las cadenas ligeras y pesadas es entonces combinado conjuntamente con ADN de unión y oligonucleótidos flanqueantes, en una nueva reacción PCR. Esto da como resultado una construcción Fab de longitud completa, dado que el extremo 5’ del ADN de unión es complementario al extremo 3’ del dominio CH1 y el extremo 3’ del elemento de unión es complementario al extremo 5’ del dominio de cadena ligera. El ADN de unión contiene restos terminales del dominio CHI humano, la secuencia líder bacteriana (peIB) para la cadena ligera y los restos iniciales de la cadena ligera VK o V lambda (Figura 2). Finalmente, después de la purificación con gel, la construcción Fab es re-amplificada con oligonucleótidos flanqueantes que contienen puntos de restricción para clonado.

Cebadores oligonucleótido: Con vistas a desarrollar el clonado de genes V humanos, resultó necesario diseñar una nueva banda de cebadores oligonucleótido específicos.

Los cebadores de PCR en el extremo 5’ del exón del gen V lambda, VK y VH (cebadores BACK) se basan en datos de secuencias extraídos de la base de datos Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of Immunological Interest. 4th edition. US Department of Health and Human Services, 1987), la base de datos EMBL, la literatura (Chuchana, P. et al., Eur J. Immunol. 1990, 20:1317) y en datos no publicados. La secuencia de los cebadores VH, VK y V lambda se proporciona en la tabla 1. Además, se designaron también cebadores VH extendidos con puntos Sfil en la terminación 5’ (Tabla 6), para adicionar un punto de restricción después del ensamblado.

La Tabla 6 muestra también los cebadores 3’ (cebadores FORDWARD), diseñados para la PCR basada en clonado de genes V humanos. Existen dos conjuntos de estos cebadores, en función de si tiene que producirse un Fab o un scFv. Para ensambla Fab, el cebador forward está basado en el extremo 3’ del dominio CHI, dominio CK y dominio Clambda. Además, los cebadores CK y C2FORWARD fueron también sintetizados como versiones extendidas con puntos Notl en sus terminaciones 5’.

Para permitir la generación de ADN de unión por medio de amplificación con PCR de una plantilla de plásmido que contiene el elemento de unión Fab (Tabla 6), se sintetizaron cebadores complementarios a los cebadores fordward CH1 y a los cebadores back lambda V y VkK. Para asegurar la amplificación adecuada, los cebadores fueron extendidos en la secuencia de elemento de unión real.

A. Preparación de ARN

Esta es esencialmente la misma que en el ejemplo 12, pero utilizando material de origen humano. En los resultados proporcionados en este ejemplo se utilizaron hibridomas humanos y líneas celulares linfoblásticas policlonales humanas.

B. Preparación de cADN

Aproximadamente 4 \mug de ARN total en 20 \mul de agua fueron calentados a 65ºC durante 3 minutos, apagados sobre hielo y añadidos a una mezcla de reacción de 30 \mul, dando lugar a una mezcla de reacción de 50 \mul que contiene KCl 140 mM; Tris 50 mM; HCl (pH 8,1 @ 42ºC), MgCl_{2} 8 mM, DTT 10 mM; trifosfato de desoxitimidina 500 \muM; trifosfato de desoxicitosina 500 \muM; trifosfato de desoxiadenosina 500 \muM y trifosfato de desoxiguanosina 500 \muM; 80 unidades de inhibidor de ARNsa placental humano y 10 pmoles del cebador Forward adecuado (HulgGI-4CH1FOR, HulgMFOR, HuCKFOR, HuCLFOR). Se añadieron dos \mul (50 unidades) de transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviar (AMV), se incubó la reacción a 42ºC durante 1 hora, se calentó a 100ºC durante 3 minutos. Se apagó sobre hielo y centrifugó durante 5 minutos.

C. PCRs primarias

Para las amplificaciones PCRs primarias, se utilizó una mezcla equimolar de cebadores basados en la familia apropiada de BACK y FORDWARD (ver ejemplos específicos 30a y 30b, proporcionados más adelante en este ejemplo). Se preparó una mezcla de reacción de 50 \mul conteniendo 5 \mul de sobrenadante procedente de la síntesis de cADN, 20 pmol de la concentración total de los cebadores FORWARD, 250 uM dNTPs, KCl 50 mM, Tris-HCl 100 mM.(pH 8,3); MgCl_{2} 1,5 mM; BSA 175 \mug/ml y 1 \mul (5 unidades) de ADN polimerasa Thermus aquaticus/Taq) (Cetus, Emeryville, CA). La mezcla de reacción fue recubierta con aceite de parafina y sometida a 30 ciclos de amplificación, utilizando un ciclador térmico Techne. El ciclo era de 94ºC durante 1 minutos (desnaturalización); 57ºC durante 1 minuto (anillamiento) y 72ºC durante 1 minuto (extensión). El producto fue analizado haciendo circular 5 \mul sobre gel de agarosa al 2%. El resto fue extraído dos veces con éter, dos veces con fenol/cloroformo, precipitado con etanol y re-suspendido en 50 \mul de agua.

D. Preparación del elemento de unión

Para preparar el ADN de unión a Fab, se llevaron a cabo 13 reacciones PCR separadas utilizando HulgG1-4CH1FOR y cada uno de los oligonucleótido VK o V lambda inversos. La plantilla era de aproximadamente 1 ng de pJM-1Fab D1.3 (Figura 38). Los reactivos de reacción de PCR fueron los que se han descrito anteriormente y el ciclo era de 94º:1 min; 45º:1 min.; 72º:1 min. Los elementos de unión fueron analizados sobre un gel de agarosa al 4%, purificados sobre un gel de agarosa al 2%, eluidos a partir del gel sobre una columna Spin-X y precipitados con etanol.

E. PCRs de ensamblaje

Para ensamblaje PCR de un Fab humano, aproximadamente 1 \mug de una cadena pesada primaria de amplificación y 1 \mug de una cadena ligera primaria de amplificación fueron mezcladas con aproximadamente 250 ng del ADN de unión adecuado, en una reacción PCR sin cebadores y cicladas 7 veces (94º:2 min., 72º:2,5 min.) para unir los fragmentos. La mezcla de reacción fue después amplificada para 25 ciclos (94º:1 min., 68-72º:1 min., 72º:2,5 min), después de la adición de 20 pmoles de cebadores BACK y FORWARD flanqueantes apropiados.

F. Adición de puntos de restricción

Los productos ensamblados fueron purificados con gel y re-amplificados para 25 ciclos (94º:1 min., 55º:1 min., 72º:25 min.) con los oligonucleótidos flanqueantes conteniendo los puntos de restricción colgantes. Los tampones PCR y los NTPs eran tal como se ha descrito previamente.

Ejemplos específicos de ensamblaje con PCR de genes de inmunoglobulina humana

a. Ensamblaje PCR de un Fab procedente de un hibridoma humano: Las líneas celulares anti Rh-D monoclonales humanas Fog-1 (IgG-k) derivan de la transformación EBV de las PBLs de un donante de sangre Rh-D negativo inmunizado con sangre Rh-D positivo y han sido previamente descritas (Melamed, M.D. et al., J. Immunological Methods. 1987. 104-245) (Hughes-Jones N.C. et al., Biochem., J. 1990 268:135) (Gorick, B.D. et al., Vox. Sang. 1968. 55:165). El ARN total fue preparado a partir de aproximadamente 10^{7} células de hibridoma. La síntesis de la primera hebra de cADN fue efectuada tal y como se describe anteriormente, utilizando los cebadores HulgGI-4CH1FOR y HuCKFOR. Las PCRs primarias fueron efectuadas para VH-CH1 utilizando una mezcla de los cebadores 6 HuVHBACK y HulgG1-4CG1FOR y para el VK-CK utilizando una mezcla de los cebadores 6 HuVKBACK y HuCKFOR. Una construcción Fab fue ensamblada tal y como se ha descrito anteriormente, restringido con Sfil y Notl, purificado con gel y ligado en pJM-1Fab D1.3 restringido con Sfil y Notl. La mezcla de unión fue utilizada para trasformar células de E. coli E.M.G. competitivas. Noventa y seis clones fueron aplicados con un palillo en el medio en pocillos de placa de microvaloración, cultivados hasta fase mid-log a 30ºC y se indujo después la expresión del Fab mediante calentamiento brusco a 42ºC durante 30 minutos, seguido de cultivo durante 4 horas a 37ºC. Los noventa y seis clones fueron después cribados para determinar la actividad anti-Rh-D, tal y como se describe más adelante.

b. Ensamblaje de Fabs humanos procedentes de uno policlonal (LCL) Un LCL poliglonal "OG" fue derivado de una transformación EBV de aproximadamente 10^{7} linfocitos sanguíneos periféricos (Pals), procedentes de un donante Rh-D negativo inmunizado con glóbulos rojos Rh-D positivos. Las células fueron ubicadas en placas a una concentración de aproximadamente 10^{5} células por pocillo. Los pocillos positivos fueron identificados mediante cribado de las células recogidas y después subclonadas una vez. El tipado del pocillo indicaba que se estaba produciendo un anticuerpo IgG-lambda. En este estadio, se preparó el ARN total a partir de aproximadamente 10^{6} células. La síntesis de la primera hebra de cADN se llevó a cabo tal como se describe anteriormente utilizando los cebadores HulgGI-4CGIFOR-4CGIFOR y HuCLFOR. Las PCRs primarias fueron efectuadas, para el VH-CHI, utilizando una mezcla de los 6 cebadores HuVHBACK2 y HulgGI-4 CGIFOR y para el V lambda-C lambda utilizando una mezcla de los 7 cebadores HuV BACK y HuC FOR. La restricción, el clonado y el cribado se efectuaron según lo descrito. Para determinar la diversidad de los clones, los genes VH y V lambda de 15 clones fueron amplificados por medio de PCR, restringidos con el enzima de restricción de corte frecuente BstN1 y analizados sobre un gel de agarosa al 4% (ver ejemplo 16).

Ensayo para determinar la actividad anti-Rh-D y demostración de especificidad: Una suspensión al 5% (vol/vol) de, o bien eritrocitos Rh-D positivos (OR2R2) o Rh-D negativos (Orr) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,3), fueron incubados con una solución de papaina durante 10 minutos a 37ºC. Los eritrocitos fueron lavados tres veces en PBS y una suspensión al 1% (vol/vol) de eritrocitos se preparó en PBS suplementado con sueroalbúmina bovina (BSA) al 1% (vol/vol). Cincuenta \mul de una suspensión de eritrocitos tratada con papaina y 50 \mul de sobrenadante de fago fueron ubicados en los pocillos de las placas de microvaloración de fondo redondo y las placas fueron colocadas en un agitador de placa Titertek durante 2 minutos. Después de 15 minutos de incubación a 37ºC, 100 \mul de PBS/BSA fueron añadidos a cada uno de los pocillos. Las placas fueron centrifugadas a 200 g durante 1 minutos y se descartó el sobrenadante. Los eritrocitos fueron resuspendidos en el remanente de PBS/BSA y los fragmentos Fab fueron reticulados mediante la adición del anticuerpo monoclonal 9E10 (50 \mul de solución lug/ml en PBS/BSA) dirigido frente a la etiqueta de péptido myc (Ward, E.S. et al., Nature 1989., supra). Las placas fueron colocadas a temperatura ambiente (RT) hasta que la sedimentación se había producido. La aglutinación de eritrocitos provocó un botón difuso de eritrocitos y los resultados fueron evaluados microscópicamente. La especificidad fue confirmada con un panel pre-papainizado habitual (como anteriormente) de 9 suspensiones de eritrocitos en PBS (todas las suspensiones del grupo sanguíneo OD, 4D positivo y 5D negativo), conocidas por tener expresión homozigota de la totalidad de los aloantígenos de grupo sanguíneo eritrocito clínicamente relevantes. El número de copias de antígeno D sobre las células D positivas variaba entre 10.000 y 20.000 por eritrocito, en función del genotipo Rh. Brevemente, 50 \mul de sobrenadante de fago en PBS, suplementado con leche desnatada al 2% (vol/vol) fueron mezclados con 50 \mul de una suspensión de eritrocitos al 2% en PBS, en tubos de vidrio y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC. Después de un lavado con PBS/BSA los eritrocitos fueron pelletizados y resuspendidos en 50 \mul de cadena larga lambda anti-humano de burro (Sigma L9527, diluido 1:40 en PBS/BSA). Los tubos fueron centrifugados durante 1 minuto a 200 g y la aglutinación fue leída microscópicamente, utilizando el procedimiento "tip and roll".

Resultados

a. Ensamblaje PCR de un Fab procedente de hibridoma humano: Una banda única de tamaño correcto fue obtenida después de amplificación. Treinta y ocho de 96 clones (40%) cribaron específicamente Rh-D positivo aglutinado, pero no glóbulos rojos de Rh-D negativo. Los resultados demuestran una elevada frecuencia de empalmado exitoso en el proceso de ensamblaje y el potencial que presenta esta técnica para el clonado de hibridomas humanos en un solo paso.

b. Ensamblaje de Fabs humanos procedentes de una línea celular linfoblástica policlonal (LCL) El análisis de la diversidad de clones indicó que 3 diferentes familias de cadena pesada y 2 diferentes familias de cadena ligera estaban presentes. Cinco clones específicos anti-Rh-D fueron identificados de un total de 96 cribados. Las cadenas VH y V\lambda tenían las mismas secuencias de nucleótido en cada uno de los clones y eran típicas de genes anti-Rh-V (resultados no publicados). Los resultados demuestran el potencial de esta técnica para ensamblar, clonar y aislar fragmentos de anticuerpo humano a partir de poblaciones de células policlonales (ver también la sección acerca del aislamiento de actividades de unión específicas a partir de librería humana "no inmunizada" (ejemplos 32 y 33).

Ejemplo 31 Selección de fago que presenta un fragmento Fab dirigido contra el antígeno Rhesus-D, a través de unión con células que presentan el antígeno Rhesus-D sobre su superficie

Un elevado número de importantes antígenos son componentes integrales de membranas de superficie celular, a saber, ellos son antígenos de la superficie celular. Entre los mismos se incluyen los antígenos específicos tumorales y antígenos de la superficie de los glóbulos blancos y los glóbulos rojos. En muchos casos, sería importante aislar anticuerpos contra estos antígenos. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra el antígeno rhesus-D (Rh-D) sobre glóbulos rojos se utilizan tanto para diagnóstico como para terapéutica. Muchos de estos antígenos resultan difíciles de purificar y algunos, como Rh-D, no son biológicamente activos cuando se han aislado de la membrana. Por lo tanto, resultaría de utilidad el ser capaces de disponer de fragmentos de anticuerpo purificados por afinidad presentados sobre la superficie de bacteriófagos directamente sobre antígenos de la superficie celular. Para comprobar la adecuabilidad de la purificación por afinidad sobre antígenos de la superficie celular, el anticuerpo monoclonal anti-Rh-D humano Fog-B fue presentado como fragmento Fab sobre la superficie del bacteriófago fd. El fragmento Fog-B-Fab presentado se unió al antígeno, tal como se determinó a través del ensayo de aglutinación, y pudo ser purificado por afinidad, en base a su unión sobre la superficie de glóbulos rojos Rh-D positivos, pero no en el caso de glóbulos blancos Rh-D negativos.

Materiales y Procedimientos

La construcción de un clon que codifica para un fragmento Fab anti-Rh-D en fagémido pHENI y la presentación del fragmento Fab sobre la superficie de bacteriófago fd.

El hibridoma humano Fog-B ha sido descrito previamente en (N.C. Hughes-Jones et al. Biochem., J. 268 135 (1990). El mismo produce un anticuerpo IgG-1/lambda que se une al antígeno Rh-D. Se preparó ARN a partir de 10^{7} células de hibridoma, utilizando un procedimiento modificado de Cathala (tal y como se describe en el ejemplo 12) y se sintetizó la primera hebra de cADN utilizando cebadores específicos de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina (HuVH1FOR) [ejemplo 40] y HuC\lambdaFOR (5’-GGA ATT CTT ATG AAG ATT CTG TAG GGG CCA C-3’)), tal y como se describe en el ejemplo 14. El gen VH fue amplificado subsiguientemente a partir de una alícuota de la primera hebra de cADN, utilizando HuVH4aBACK y HuVH1FOR. El gen V\lambda fue amplificado utilizando un cebador V\lambda específico para Fog-B (V\lambdaFog-B, 5’-AAC CAG CCA TGG CC AGT CTG TGT TGA CGC AGC C-3’). Las condiciones PCR eran las que se describen en el ejemplo 40. Los productos PCR fueron analizados utilizando 5 \mul sobre gel de agarosa al 2%. El resto fue extraído dos veces con éter, dos veces con fenol/cloroformo, precipitado con etanol y re-suspendido en 50 \mul de H_{2}O. El ADN VH amplificado fue digerido con Pst1 y BstEII y el ADN V\lambda-C\lambda amplificado con Ncol y EcoR1. Los fragmentos fueron purificados sobre gel de agarosa al 2%, extraídos utilizando Geneclean y ligados secuencialmente en el vector de expresión soluble pJM-1 Fab D1.3 (Figura 38). Los clones que contenían el inserto correcto fueron inicialmente identificados mediante análisis de restricción y verificados mediante ensayo de Fab soluble expresado (ver ejemplo 19 para las condiciones de inducción). El casette Fog-B Fab fue amplificado a partir de pJM-1 mediante PCR, utilizando HuVH4BACK-Sfi y Hu C\lambda-Not, digeridos con los enzimas de restricción adecuados y ligados a pHEN1. Los clones que contenían el inserto correcto fueron inicialmente identificados mediante análisis de restricción y, subsiguientemente, mediante ensayo (ver ejemplo 21 para las condiciones de inducción).

Ensayo para fragmento Fab Fog-B soluble y fragmento Fog-B presentado en fago para determinar la actividad anti-Rh-D y documentación de especificidad.

El ensayo del Fab soluble expresado fue llevado a cabo sobre sobrenadante de E. coli no concentrado. En ensayo del Fog-B presentado sobre la superficie de fago fue llevado a cabo sobre un fago que había concentrado 10 veces mediante precipitación con PEG y después resuspendido en PBS. Los ensayos para determinar la actividad y la especificidad son como se describe el en ejemplo.

Purificación por afinidad en superficie celular de fago que presenta un fragmento Fog-B anti-Rh-D Fab.

Fago Fog-B purificado fue mezclado con fago Fd-Tet CAT-1 purificado que presenta el anti-lisozima scFv D1.3 (pAbD1.3) en una relación de aproximadamente 1 Fog-B:50 scFvD1.3. Eritrocitos prepainizados (OR2R2 [Rhesus positivo] u Orr [Rhesus negativo]), fueron re-suspendidos en PBS suplementado con polvo de leche desnatada al 2% en una concentración de 4 x 107/ml. Un ml de esta suspensión fue mezclado con 10^{11} fagos suspendidos en 2 ml de PBS suplementado con leche desnatada al 2% e incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente, en condiciones de rotación continua. Los eritrocitos fueron lavados tres veces con un exceso de PBS enfriado con hielo (10 ml por lavado) y pelletizados subsiguientemente. Los fagos fueron eluidos de las células mediante re-suspensión en 200 \mul de ácido cítrico 76 mM, pH 2,8 en PBS, durante 1 min. Las células fueron entonces pelletizadas mediante centrifugación durante 1 minuto a 3.000 rpm y el sobrenadante que contenía el fago eluido fue neutralizado mediante la adición de 200 \mul de Tris-base 240 mM, hidrógeno fosfato disódico 22 mM en albúmina 1% peso/volumen. Para infectar las células TG1 se utilizaron diluciones en serie del eluido. Los fagos Fab Fog-B fueron seleccionados sobre placas de ampicilina y el fago scFvD1.3 sobre placas de tatraciclina y se determinó la valoración de cada uno de ellos con anterioridad a la selección, después de la selección sobre células rhesus-D negativas y después de la selección sobre células Rhesus D positivas.

Resultados

El fragmento Fog-B Fab presentado sobre la superficie del fago derivaba del clon fagémido pHEN específicamente aglutinado rhesus-D positivo, pero no de los glóbulos rojos rhesus-D negativos. La purificación por afinidad del fagémido FoG-1-Fab sobre glóbulos rojos Rh-D positivos dio lugar a un enriquecimiento de entre 1:50 y 1500:1 (Fog-B Fab:scFvD1.3), mientras que la purificación sobre glóbulos rojos Rh-D negativos no demostró esencialmente enriquecimiento (10 veces).

	Valoración	Relación
	Fog-B Fab	scFvD1.3	Fog-B Fab/scFvD1.3
Antes de la selección	1,0 x 10^{8}	5,0 x 10^{9}	1:50
Selección sobre células con Rh-D negativo	2,0 x 10^{4}	1,0 x 10^{5}	1:5
Selección sobre células con Rh-D positivo	6,0 x 10^{6}	4,0 x 10^{3}	1500:1

Ejemplo 32 Una técnica basada en PCR para el clonado en un solo paso de construcciones scFv humanas

El ensamblaje de scFv humano es similar al ensamblaje de scFvs de ratón descrito en el ejemplo 12. Para desarrollar el clonado PCR de genes V humanos resultó necesario diseñar una nueva banda de cebadores oligonucleótido humanos específicos (tabla 6). La utilización de estos cebadores para la generación de Fabs humanos se describe en el ejemplo 30. El ensamblaje de scFvs humanos es esencialmente el mismo pero requiere un juego de cebadores FORDWARD complementario a los segmentos J de los genes VH, VK, y V lambda. (Para los cebadores Fabs FORDWARD se utilizan cebadores complementarios a la región constante). Los cebadores específicos del segmento J fueron diseñados en base a las secuencias publicadas JH, JK y J lambda (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interests. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987).

Además, se necesita un elemento de unión diferente para los scFvs y para los Fabs, por lo que para preparar el componente de unión para los scFvs humanos se necesitó un nuevo juego de cebadores. Para permitir la generación de un ADN de unión, se sintetizaron los cebadores complementarios a los cebadores JH fordward y los cebadores VK y V lambda back, mediante amplificación PCR de una plantilla de plásmido que contenía el elemento de unión scFv (tabla 6, Figura 39). Para asegurar la amplificación adecuada, los cebadores fueron extendidos en la secuencia de unión real. Utilizando estos cebadores para preparar el ADN de unión a scFv, se llevaron a cabo 52 reacciones PCR separadas, utilizando cada uno de los cebadores JH inversos en combinación con cada uno de los 13 oligonucleótidos VK y V lambda inversos. La plantilla era de aproximadamente 1 ng de pSW2saD1.3 (Ward, E.S. 1989 supra) conteniendo el péptido corto (Gly4Ser)3)Huston, J.S. et al., Gene 1989, 77:61).

Un ejemplo específico de ensamblaje PCR de una librería de scFv humano

Este ejemplo describe la generación de una librería humana de scFvs obtenidos a partir de humano no inmunizado.

500 ml de sangre, conteniendo aproximadamente 10^{8} células B, fueron obtenidos de un donante de sangre voluntario sano. Los glóbulos blancos fueron separados sobre Ficoll y se preparó el ARN, tal y como se describe en el ejemplo 12.

El veinte por ciento del ARN, conteniendo el material genético procedente de aproximadamente 2 x 10^{7} células B, fue utilizado para la preparación de cADN, tal y como se describe en el ejemplo 30. Las cadenas pesadas procedentes de anticuerpos IgG e IgM fueron mantenidas separadas por medio de síntesis de cADN utilizando cebadores, bien con un cebador específico para igG (HulgG1-4CH1FOR) o con un cebador específico para IgM (HulgMFOR). Para generar cuatro librerías scFv separadas (IgG-K, IgG-lambda, IgM-K e IgM-lambda) se utilizaron alícuotas del cADN, tal y como se escribe en el ejemplo 30. Las librerías resultantes fueron purificadas sobre agarosa 1,5%, electroeluidas y precipitadas con etanol. Para el clonado subsiguiente, las librerías K y lambda fueron combinadas, proporcionando librerías IgG e IgM separadas. Clonado de la librería: Los fragmentos scFv purificados (1-4 \mug) fueron digeridos con los enzimas de restricción Notl y, o bien Sfil o Ncol. Después de la digestión, los fragmentos fueron extraídos con fenol/cloroformo y precipitados con etanol. Los fragmentos digeridos fueron ligados a pHEN1 ADN (6 \mug), purificado mediante electroforesis en gel de agarosa, digerido con o bien Sfil-Notl o Ncol-Notl (ver ejemplo 20), en una mezcla de unión de 100 \mul con 2.000 U de T4 ADN ligasa (New England Biolabs), durante el transcurso de una noche a temperatura ambiente. La mezcla de unión fue purificada mediante extracción con fenol y precipitada con etanol. El ADN precipitado fue re-suspendido en 10 \mul de agua, y muestras de 2,5 \mul fueron sometidas a electroporesis en E. coli TG1 (50 \mul). Las células fueron cultivadas en 1 ml de SOC durante 1 hora y después ubicadas en placas sobre medio 2 x TY, con ampicilina 100 \mug/ml y glucosa (AMP-GLU) al 1%, en platos de 243 x 243 mm (Nunc). Después del crecimiento durante el transcurso de una noche, las colonias fueron rascadas de las placas y depositadas en 10 ml de medio 2 x TY que contenía APM-GLU y glicerol 15%, para almacenamiento a -70ºC, como stock de librería.

El clonado en pHEN1, digerido por Sfil-Notl y Ncol-Notl, proporcionó librerías de 10^{7} y 2x 10^{7} clones, respectivamente, para librerías de IgM y aproximadamente 5 x 10^{7} clones para cada una de las dos librerías de IgG.

Ejemplo 33 Aislamiento de actividades de unión procedentes de una librería de scFvs procedentes de humano no inmunizado

La capacidad de seleccionar actividades de unión a partir de librerías de anticuerpos humanos presentadas sobre la superficie de fago ha demostrado ser incluso más importante que el aislamiento de actividades de unión a partir de librerías murinas. Ello es debido a que la vía habitual de generación de anticuerpos, a través de la tecnología de hibridoma, ho ha alcanzado el mismo nivel de éxito con los anticuerpos humanos que con los de ratón. Si bien en algunos casos resultará posible preparar librerías a partir de humanos inmunizados, en muchos casos, no resultará posible la inmunización, debido a toxicidad o a falta de disponibilidad de un inmunógeno adecuado o a consideraciones éticas. Alternativamente, las actividades de unión podían ser aisladas a partir de librerías preparadas a partir de individuos con enfermedades en las cuales los anticuerpos terapéuticos son generados por la respuesta inmune. No obstante, en muchos casos, las células que producen anticuerpos estarán localizadas en el bazo y no estarán disponibles en el grupo circulante de linfocitos sanguíneos periféricos (el material más fácilmente accesible para generar la librería). Además, en enfermedades asociadas con inmunosupresión, puede que no se produzcan anticuerpos terapéuticos.

Un planteamiento alternativo sería el de aislar las actividades de unión a partir de una librería preparada a partir de un individuo inmunizado. Este planteamiento está basado en estimaciones de que un repertorio primario de 10^{7} diferentes anticuerpos es probable que reconozca más del 99% de epítopes con una constante de afinidad de 10^{5} M^{-1} o mejor (Pewrelson, A.S. Immunol. Rev. (1989) 110:5). Si bien esto puede no producir anticuerpos de elevada afinidad, la afinidad podría ser reforzada mediante mutación de los genes V y/o la utilización del dominio VH aislado en un planteamiento jerárquico con una librería de cadenas ligeras (o viceversa). En esta sección, demostramos la viabilidad de este planteamiento mediante el aislamiento de actividades de unión a antígeno específicas frente a tres diferentes antígenos procedentes de una librería de scFvs procedentes de un humano inmunizado.

Materiales y procedimientos

La generación de la librería scFv humana utilizada para el aislamiento de actividades de unión descritas en este ejemplo se detalla en el ejemplo 32.

Estimación de diversidad de librerías originales y seleccionadas: Clones recombinantes fueron cribados antes y después de la selección mediante PCR (ejemplo 16) con cebadores LMB3 (el cual establece el 5’ de la secuencia líder pelB y es idéntico al cebador de secuenciado inverso (-40n) de pUC19) y fd-SEQ1, seguido de digestión con el enzima de corte frecuente BstN1. El análisis de 48 clones procedentes de cada una de las librerías seleccionadas indicaba que el 90% de los clones se había insertado y que las librerías parecían ser extremadamente diversas, a juzgar por el patrón de restricción BstNI.

Rescate de librerías de fagémido para experimentos de enriquecimiento: para rescatar partículas de fagémido de la librería, 100 ml de 2 x TY conteniendo AMP-GLU (ver ejemplo 32) fueron inoculados con 10^{9} bacterias tomadas de la librería (preparadas en el ejemplo 42 (aproximadamente 10 \mul) y se cultivaron durante 1,5 horas, agitando a 37ºC. Las células precipitaron (IEC-centrifugadora. 4K, 15 minutos) y fueron resuspendidas en 100 ml de 2x TY-AMP precalentado (37ºC) (ver ejemplo 31), se añadieron 2 x 10^{10} pfu de VCS-M13 (Stratagene) y se incubó a 37ºC durante 30 minutos, sin agitación. Las células fueron después transferidas a 900 ml de 2 x TY conteniendo ampicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (25 \mug/ml) (AMP-KAN) y se cultivaron durante el transcurso de una noche, manteniendo la agitación a 37ºC. Las partículas de fago fueron purificadas y concentradas, por medio de tres precipitaciones con PEG (ver materiales y procedimientos) y resuspendidas en PBS a 10^{13} TU/ml (clones resistentes a la
ampicilina).

Enriquecimiento para componentes de unión phOx-BSA, mediante selección en tubos: Para enriquecimiento, un Nunc-inmunotubo de 75 x 12 mm (Maxisorp; Cat Nº. 4-44202) fue revestido con 4 ml de phOx:BSA (1 mg/ml; 14 phOx por BSA en tampón NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6), durante el transcurso de una noche a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS, el tubo fue incubado durante 2 horas a 37ºC con PBS que contenía Marvel (MPBS 2%) al 2%, para bloqueo. Después de tres lavados con PBS, se añadieron las partículas de fagémido (10^{13} TU) en 4 ml de MPBS al 2%, se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre una mesa rotatoria y se dejó durante un período adicional de 1,5 horas. Los tubos fueron lavados entonces con 20 lavados de PBS, Tween 20 0,1% y 20 lavados con PBS (cada uno de los pasos de lavado fue llevado a cabo derramando tampón dentro y fuera, inmediatamente). Las partículas unidas de fago fueron eluidas del tubo mediante la adición de 1 ml de trietilamina 100 mM, pH 11,5, aplicando rotación durante 15 minutos. El material eluido fue neutralizado inmediatamente mediante la adición de 0,5 ml de Tris-HCl 1,0 M; pH 7,4 y con movimiento vorticial. El fago fue almacenado a 4ºC.

El fago eluido (en 1,5 ml) fue utilizado para infectar 8 ml de células E. coli TG1 con crecimiento logarítmico en 15 ml de medio 2xTY, y colocado en placas AMP-GLU, como anteriormente, generando un promedio de 10^{7} colonias infectadas por fago.

Para la selección de componentes de unión phOx:BSA, se repitió 4 veces el ciclo enriquecimiento con tubo de rescate-ubicación en placa, después de lo cual los clones de fagémido fueron analizados para determinar la unión mediante ELISA.

Enriquecimiento para componentes de unión a lisozima, mediante reconocimiento y selección y sobre columnas. Un plato de petri (plato de cultivo celular Falcon 3001 de 35 x 10 mm) fue utilizado para enriquecimiento mediante reconocimiento y selección. Durante la totalidad de los pasos, las placas fueron balanceadas sobre una placa de balanceo A600 (Raven Scientific). Las placas fueron revestidas durante el transcurso de una noche con 1 ml de lisozima de yema de huevo (3 mg/ml en bicarbonato sódico 50 mM (pH 9,6), lavadas tres veces con 2 ml de PBS y bloqueadas con 2 ml de MPBS al 2%, a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de tres lavados con PBS, aproximadamente 10^{12} TU de partículas de fago en 1 ml de MPBS al 2% fueron añadidas por placa y se dejaron balancear durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas durante 5 minutos con 2 ml de las siguientes soluciones: 5 veces con PBS, PBS-Tween (Tween 20 0,02%), Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) +
NaCl 500 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) + NaCl 500 mM, Tris-HCl 500 m (pH 9,5) + NaCl 500 mM y finalmente con bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,6). Las partículas de fago fueron después eluidas mediante la adición de 1 ml de trietilamina 100 mM, pH 11,5 y aplicando balanceo durante 5 minutos antes de proceder a la neutralización con Tris-HCl 1 M (pH 7,4) (como anteriormente). Alternativamente, para purificación por afinidad se utilizaron columnas de 1 ml de lisozima de clara de huevo de pavo-Sepharose (McCafferty, J., et al., Nature 1990. 348:552). Las columnas fueron lavadas extensivamente con PBS, bloqueadas con 15 ml de MPBS 2% y se cargaron con fago (10^{12} TU) en 1 ml de MPBS al 2%. Después se lavó con 50 ml de PBS, 10 ml de PBS-Tween (PBS + Tween 20 0,2%), 5 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5)-NaCl 500 mM, Tris-HCl 5 mM (pH 8,5) + NaCl 500 mM, 5 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 9,5) +
NaCl 500 mM y, finalmente, 5 ml de bicarbonato sódico 50 mM pH 9,6. El fago unido fue eluido con 1,5 ml de trietilamina 100 mM y neutralizado con Tris-HCl 1M (pH 7,4).

Para la selección de los componentes de unión a lisozima de clara de huevo de pavo, se repitió 4 veces el ciclo enriquecimiento por rescate en tubo-colocación en placa o rescate en columna-ubicación en placa, después de lo cual los clones de fagémido fueron analizados para determinar su unión mediante ELISA. Rescate de clones de fagémido individuales para ELISA: los clones resultantes de partículas de fago ubicadas en placas y reinfectadas fueron eluidos después de cuatro turnos de enriquecimiento, inoculados en 150 \mul de 2xTY-AMP-GLU en placas de 96 pocillos (pocillos celulares, Nunclon), cultivados con agitación (250 rpm) durante el transcurso de una noche a 37ºC. Un replicador de placa de 96 pocillos ("embolo") fue utilizado para inocular aproximadamente 4 \mul de los cultivos de una noche sobre la placa maestra en 100 \mul de 2xTY-AMP-GLU fresco. Una vez transcurrida 1 hora, 50 \mul 2xTY-AMP-GLU conteniendo 10^{8} pfu de VCS-M13 fueron añadidos a cada uno de los pozos, y la placa fue incubada a 37ºC durante 45 minutos, seguido de agitación de la placa a 37ºC durante 1 hora. La glucosa fue eliminada después mediante precipitación por rotación de las células (4K, 15 min) y aspiración del sobrenadante con una pipeta pasteur de vidrio extractora. Las células fueron resuspendidas en 200 \mul de 2 x TY-AMP-KAN (Kanamicina 50 \mug/ml) y cultivadas durante 20 horas, agitando a 37ºC. El fago conteniendo sobrenadante no concentrado fue tomado para análisis mediante ELISA.

ELISA

El análisis de unión a phOx:HSA, BSA o lisozima fue llevado a cabo mediante ELISA (ver ejemplo 9), con 100 \mug/ml de phOx:BSA o BSA, o lisozima de clara de huevo de pavo 3 mg/ml fue usado como revestimiento. La determinación de la reactividad cruzada para antígenos no relacionados con los clones aislados fue también determinada mediante ELISA, sobre placas revestidas con 100 \mug/ml de un antígeno irrelevante (hemocianina de lapa californiana (KLH), ovoalbúmina, quimiotripsinógeno, citocromo C, tiroglobulina, GAP-DH (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenada) o inhibidor tripsina).

Caracterización de clones positivos ELISA: la totalidad de clones específicos de antígenos fue comprobada para determinar la reactividad cruzada frente a un panel de antígenos irrelevantes, tal y como se describe anteriormente. La diversidad de los clones fue determinada mediante cribado con PCR, tal como se describe anteriormente y al menos dos clones procedentes de cada uno de los patrones de restricción fueron secuenciados por parte del procedimiento de terminación de cadena didesoxi.

Resultados

Aislamiento y caracterización de componentes de unión a phOx:BSA: Después de 4 rondas de selección, los clones ELISA positivos fueron aislados para phOx:BSA. Todos los clones procedían de la librería IgM. De 96 clones analizados, 43 de ellos se unían a phOx:BSA y BSA, oscilando las Ods entre 0,4 y 1,3 (fondo 0,125). Estos clones son designados como componentes de unión a BSA. La unión a BSA parecía resultar específica, dado que ninguno de los 11 clones analizados proporcionó una señal por encima del fondo cuando se utilizó ELISA con KLH, ovoalbúmina, quimotripsinógeno, citocromo C, lisozima, tiroglobulina, GAP-DH o inhibidor tripsina. La totalidad de clones BSA tenía el mismo patrón de restricción BstNI y 14 clones fueron completamente secuenciados. Trece de los catorce clones tenían la misma secuencia, el VH procedía de un gen de la familia VH3 humana y el VL de un gen de la familia V lambda 3 humana (Tabla 1). El otro elemento de unión BSA derivaba de un gen de la familia VH4 humana y de un gen de la familia Vkl humana (datos no mostrados).

Se aisló un clon que se unía tan solo a phOx:BSA (OD 0,3) y el fago unido pudo ser completado totalmente mediante la adición de ácido 4-\epsilon-aminocaproico-metileno-2-feniloxazol-5-ona (phOx-CAP) como competidos. Tampoco pudo ser detectada unión por encima de la de fondo con el panel de proteínas irrelevantes descritas anteriormente. La secuencia reveló un VH derivado de un gen de la familia VH1 humana y un VL derivado de un gen de la familia V lambda 1 humana (Tabla 7).

Aislamiento y caracterización de elementos de unión a lisozima: Después de 4 rondas de selección, se aislaron 50 clones ELISA positivos para lisozima de pavo. La mayoría de los clones, más del 95% de los mismos, procedía de la librería IgM. La unión a lisozima parecía resultar específica, dado que ninguno de los clones analizados proporcionó una señal por enzima de la de fondo cuando se utilizó en un ensayo ELISA con ovoalbúmina, quimotripsinógeno, citocromo C, tiroglobulina, GAP-DH o inhibidor trispsina. Los clones de unión a lisozima proporcionaron tres diferentes patrones de restricción BstNI, y al menos dos clones procedentes de cada uno de los patrones de restricción estaban completamente secuenciados. Las secuencias indicaban la presencia de 4 únicas combinaciones de VH-VL humano (tabla 7).

Conclusión

Los resultados indican que las actividades de unión a antígeno pueden ser aisladas a partir de repertorios de scFvs preparados a partir de IgM cADN procedente de voluntarios humanos que no han sido específicamente inmunizados.

Este ejemplo describe el rescate de fusiones de gen 3 procedentes de una librería humana que utiliza un fago auxiliar con una supresión del gen 3.

100 \mul de stock bacteriano de fagémido IgM, preparada tal y como se describe anteriormente (ejemplo 32), conteniendo 5 x 10^{8} bacterias, fueron utilizados para inocular 100 mls de medio 2xTY conteniendo ampicilina 100 \mug/ml, glucosa (TY/Amp/Glu) al 2%. Se cultivó a 37ºC durante 2,5 horas, 10 mls de este cultivo fueron añadidos a 90 mls de TY/Amp/Glu precalentado y se llevó a cabo la infección mediante la adición de 10 mls de un concentrado 200 veces dgen 3 que carecía del ago auxiliar K07 (M13K07gIII\DeltaNo3) (Ejemplo 27), concentrado 200 veces y se procedió a incubación durante 1 hora a 37ºC, sin agitación. La preparación de M13K07gIIINo.3 se efectuó tal y como se describe en el ejemplo 27. Después de centrifugación a 4.000 r.p.m. durante 10 minutos, las bacterias fueron resuspendidas en 100 mls de medio 2xTY conteniendo ampicilina 100 \mug/ml (sin glucosa). La valoración del cultivo en este punto reveló la existencia de 1,9 x 10^{8} bacterias infectadas, según su capacidad de cultivo sobre placas que contenían tanto ampicilina (100 \mug/ml) como kanamicina (50 \mug/ml). La incubación prosiguió durante 1 hora con agitación antes de la transferencia a 2,5 litros de medio 2xTY conteniendo ampicilina 100 \mug/ml, kanamicina 50 \mug/ml, en cinco matraces de 2,5 litros. Este cultivo fue incubado durante 16 horas y se preparó el sobrenadante mediante centrifugación (10-15 minutos a 10.000 r.p.m. en una centrifugadora Sorvall RC5B, a 4ºC). Las partículas de fago fueron recogidas mediante la adición de una quinta parte del volumen de polietilenglicol 20%, NaCl 2,5M, permaneciendo así durante 30 minutos a 4ºC y centrifugando tal y como se ha indicado anteriormente. El pellet resultante fue resuspendido en 40 mls de Tris 10 mM, EDTA 0,1M pH 7,4 y los residuos bacterianos se extrajeron mediante centrifugación, según lo indicado anteriormente. La preparación de fagémido envasado fue después re-precipitada, recogida como anteriormente t re-suspendida en 10 mls de Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4. El litro de esta preparación tenía 4,1x10^{13} unidades transductoras/ml (resistencia a ampicilina).

Se prepararon tubos revestidos con OX-BSA, tal y como se describe en el ejemplo 35, para reconocimiento y selección de la librería de fagémido del ejemplo 32. La librería rescatada fue también recogida y seleccionada contra tubos revestidos con tiroglobulina bovina (Sigma). Los mismos fueron revestidos a una concentración de tiroglobulina 1 mg/ml en NaHCO_{3} 50 mM, pH 6,9, a 37ºC, durante el transcurso de una noche. Los tubos fueron bloqueados con PBS conteniendo polvo de leche al 2% (PBS/M) e incubados con 1 ml de la librería de fagémido rescatada (el equivalente a 250 mls de sobrenadante de cultivo), mezclado con 3 mls de PBS/M, durante 3 horas. El lavado, la elución, la neutralización y la infección se llevaron a cabo según lo descrito en el ejemplo 35.

Resultados: Reconocimiento y selección frente a oxazolona-BSA

La primera ronda de reconocimiento y selección frente a OX-BSA proporcionó 2,8 x 10^{6} fagos. Una gran placa de bacterias con 1,4 x 10^{6} colonias derivadas de este eluido fue rascada en 10 ml de 2xTY, glicerol 20%, agitada durante 10 minutos, alicuotada y almacenada. La misma fue también utilizada para inocular un nuevo cultivo para rescate con M13K07gIII\DeltaNo3. (Las bacterias y los fagos rescatados derivados de la primera ronda de reconocimiento y selección frente a OX-BSA son denominados OXPN1. Las bacterias o fagos rescatados derivados de la segunda y tercera ronda de reconocimiento y selección son denominados OXPAN2 y OXPAN3, respectivamente). El rescate de fagémidos con M13K07gIII\DeltaNo3, después de cada una de las rondas de reconocimiento y selección, fue esencialmente tal como se ha descrito anteriormente, pero utilizando volúmenes de 5 ml para los cultivos iniciales en TY/Amp/Glu, utilizando 1 ml de fago auxiliar y transfiriendo a 100-500 mls de medio 2 x TY conteniendo ampicilina 100 \mug/ml, kanamicina 50 \mug/ml. La segunda y la tercera ronda de pasos de reconocimiento y selección fueron tal como se ha descrito en la primera ronda, pero utilizando 0,8-1,0 mls de fago concentrado 100 veces (el equivalente de 80-100 mls de sobrenadante de cultivo). El eluido procedente de la segunda ronda de reconocimiento y selección contenía 8 x 10^{8} partículas infecciosas y el eluido procedente de la tercera ronda de reconocimiento y selección contenía 3,3 x 10^{9} partículas infecciosas.

Reconocimiento y selección frente a tiroglobulina

La primera ronda de reconocimiento y selección frente a tiroglobulina proporcionó 2,52 x 10^{5} partículas infecciosas. La mitad del eluido fue utilizada para generar 1,26 x 10^{5} colonias bacterianas, sobre una placa grande. Estas colonias fueron rascadas en 10 ml de 2xTY, glicerol 20%, agitadas durante 10 minutos, alicuotadas y almacenadas. Estas bacterias y los fagos rescatados derivados de las mismas se denominan THYPAN1, y se utilizan para inocular un cultivo fresco para rescate con M13K07gIIINo3, para proporcionar una preparación de fago rescatado policlonal. Los materiales derivados de forma similar de reconocimiento y selección de segunda y tercera ronda se denominan THYPAN2 y THYPAN3, respectivamente. La segunda y tercera rondas de reconocimiento y selección con tiroglobulina se efectuaron tal y como se describe para la segunda y tercera rondas de reconocimiento y selección de OX-BSA. El eluido procedente de la segunda ronda de reconocimiento y selección contenía 8 x 10^{7} unidades transductoras y el eluido procedente de la tercera ronda de reconocimiento y selección contenía 6 x 10^{7} partículas infecciosas.

Cribado ELISA de clones derivados de reconocimiento y selección

40 colonias derivadas de la tercera ronda de reconocimiento y selección contra tiroglobulina (THYPAN3) fueron elegidas en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante el transcurso de una noche a 37ºC en 200 \mul de TY/Amp/Glu. Similarmente, 48 colonias procedentes de dos rondas y 48 colonias procedentes de tres rondas de reconocimiento y selección frente a OX-BSA fueron cultivadas (OX-PAN2 y OX-PAN3). Se prepararon fagos policlonales al mismo tiempo. Al día siguiente, 5 \mul procedentes de cada uno de los cultivos fueron transferidos a 100 \mul de TY/Ap/Glu fresco, precalentado, y se cultivaron durante 1,5 horas, con adición de M13K07gIIINo.3 (2 x 10^{5} fagos infecciosos por pocillo en 100 \mul de TY/Amp/Glu). Se procedió a efectuar una incubación durante 1 hora a 37ºC, sin agitación, centrifugándose a 4.000 r.p.m. durante 10 minutos, re-suspendiéndose en 150 \mul de medio 2xTY conteniendo ampicilina 100 \mug/ml y se incubó durante otra hora con agitación antes de añadir 2 ml de medio conteniendo ampicilina 100 \mug/ml, kanamicina 50 \mug/ml. Después de crecimiento durante una noche, los cultivos fueron centrifugados a 4.000 r.p.m. durante 10 minutos y se recogieron los sobrenadantes. Las placas ELISA utilizadas para cribar los clones THYPAN3 fueron revestidas a 37ºC, durante el transcurso de una noche, con tiroglobulina 200 \mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6. Las placas utilizadas para OXPAN2 y OXPAN3 fueron revestidas con OX-BSA 100 \mug/ml en PBS a 37ºC, durante una noche.

120 \mul de sobrenadante de cultivo fueron mezclados con 30 \mul de 5 x PBS, polvo de leche 10% e incubados a temperatura ambiente durante 2 horas. Los ELISAS fueron llevados a cabo tal y como se describe en el ejemplo 14.

Para tiroglobulina, 18 de entre 40 clones resultaron positivos (0,3-2,0 O.D. después de 30 minutos)(Un control de fago (vector pCAT3) proporcionó una lectura de 0,07 O.D.). Además, se observaron también positivos sobre las preparaciones de fago policlonales THYPAN1 (0,314 O.D.) y THYPAN2 (0,189 O.D.), en comparación con fago derivado de la librería de fagémido no reconocida y seleccionada original (0,069 O.D.) La totalidad de fagos policlonales fueron precipitados con PEG y utilizados a una concentración 10 veces superior.

Las reacciones PCR y las digestiones con BstN1 fueron llevadas a cabo sobre los clones positivos, tal y como se ha descrito anteriormente, y se obtuvieron seis diferentes patrones de fragmentos de ADN, mostrando que al menos seis diferentes clones habían sido aislados.

Para OX-BSA, después de dos rondas de reconocimiento y selección, 30 de 48 clones resultaron positivos en ELISA y, después de tres rondas, 42 de 48 resultaron positivos. En un experimento separado, se obtuvo una señal positiva a partir de preparaciones de fago policlonal OXPAN1 (0,988 OD) y OXPAN2 (1,717 OD), en comparación con el fago derivado de la librería de fagémidos no reconocida y seleccionada original (0,186 O.D.), después de 30 minutos.

Especificidad de clones para tiroglobulina u OX-BSA

Clones seleccionados (11 anti-tiroglobulina, 5 anti-OX-BSA), representando a cada uno de los diferentes patrones de digestión por restricción con BstNI, fueron sometidos a ensayo para determinar la unión ante un panel de antígenos irrelevantes. Las placas ELISA fueron revestidas con antígeno (100 \mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,6), mediante incubación durante el transcurso de una noche a 37ºC. El panel de antígenos comprendía hemocianina de lapa californiana, lisozima de huevo de gallina, sueroalbúmina bovina, ovoalbúmina, citocromo c, quimotripsinógeno, inhibidor de tripsina, GAP-D11 (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa), tiroglobulina bovina y oxazolona-BSA. Muestras duplicadas de sobrenadante de fago (80 \mul + 20 \mul 5 x PBS, polvo de leche 10%) fueron añadidas a cada uno de los antígenos e incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se llevó a cabo el ELISA tal y como se describe en el ejemplo 14.

Cada uno de los clones específicos de tiroglobulina (11 de 11) resultaron positivos para tiroglobulina (OD 0,12-0,76), pero después de 60 minutos no mostraron unión (OD<0,03) con ninguno de los 9 antígenos irrelevantes. De forma similar, a de los 5 clones específicos para 5 OX-BSA, 3 tenían un OD 0,07-0,52, comparado con ODs< 0,02 para los antígenos irrelevantes. Ninguno de los 5 clones presentaba unión alguna con el BSA en solitario.

Por lo tanto, pueden aislarse clones positivos después de tan solo dos rondas de reconocimiento y selección, mediante rescate con M13K07gIIINo3. Además, existe una probabilidad más elevada de que este auxiliar genere partículas de fago con más de una molécula de anticuerpo intacta. Esto incrementará, potencialmente, la avidez de los anticuerpos-fago y puede permitir el aislamiento de clones de afinidad más débil.

Ejemplo 35 Alteración de especificidad fina de scFvD1.3 presentada sobre fago, mediante mutagénesis y selección sobre lisozima de pavo inmovilizada

El anticuerpo D1.3 se une a lisozima de huevo de gallina (HEL) con una constante de afinidad de 4,5 x 10^{7}M, mientras que se une a lisozima de huevo de pavo (TEL) con una afinidad de <1 x 10^{5}M^{-1}. (Harper et al., (1987) Molecular Immunology 24 p97-108, Amit et al., (1986) Science 233 p747-753).

Se ha sugerido que esto es debido a que al resto glutamina presente en la posición 121 de HEL (gin 121) está representado por el resto histidina en la misma posición en TEL. Así pues, la mutagénesis de los restos de anticuerpo D1.3 que interaccionan con gin121 de Hel puede facilitar la unión a TEL.

Según Amit et al., supra, la tirosina en la posición de aminoácido 32, la fenilalanina en la posición 91 y el triptófano en la posición 92 de la cadena ligera interaccionan con gln121 de HEL. Además la tirosina en la posición 101 de la cadena pesada también interacciona. No existe previsión de que ninguno de estos restos esté involucrado en la determinación de la conformación de la cadena principal de las regiones variables de anticuerpo (Chothia and Lesk (1987) Journal of Molecular Biology 196, p 901-917).

Mutagénesis de pCAT3SCFvD1.3

El oligonucleótido mutL91,92 se preparó para aleatorizar la fenilalanina en la posición 91 (L91) y triptófano en la posición 92 (L92) de la cadena ligera. El oligonucleótido mutL32 se preparó para aleatorizar la tirosina en la posición 32 de la cadena ligera (L32) y el oligonucleótido mutH101 se preparó para aleatorizar la tirosina en la posición 101 de la cadena pesada (H101) mutL91,92:

: 5’ CGT CCG AGG AGT ACT NNN NNN ATG TTG ACA GTA ATA 3’ mutl32:

: 5’ CTG ATA CCA TGC TAA NNN ATT GTG ATT ATT CCC 3’ mutH101:

: 5’ CCA GTA GTC AAG CCT NNN ATC TCT CTC TCT GGC 3’

(N representa una inserción aleatoria de cantidades iguales de A, C, G o T). La mutagénesis in vitro del vector fagémido pCAT3scFvD1.3 (ejemplo 13) con el oligonucleótido mutL91, 92 se llevó a cabo utilizando un kit de mutagénesis in vitro (Amersham). El ADN resultante fue transformado por medio de electroporación en células TG1, utilizando un electroportor Bio.Rad. Se obtuvieron 78.000 clones y estos fueron depositados mediante rascado en 15 mls de 2xTY/glicerol 20%. Este grupo fue denominado D1.3L9192. Se preparó ADN de hebra única a través de rescate con M13K07, tal y como se describe en Sambrook et al., 1989, supra, y se secuenció con el cebador FDTSEQ1, utilizando un kit secuenciador Sequenase (United Status Biochemical Corporation).

Esto reveló que el ADN había sido mutagenizado con éxito, a juzgar por la presencia de manos en las cuatro vías de secuenciación en las posiciones del nucleótido que codifican para L91 y L92. Este ADN de cadena única mutagenizado fue sometido a una nueva ronda de mutagénesis como anteriormente, utilizando oligonucleótidos mutL32 o mutH101. La mutagénesis con mutL32 dio lugar a 71.000 clones (grupo denominado D1.3L32), mientras que la mutH101 dio lugar a 102.000 clones (grupo denominado D1.3H101). Estos clones fueron depositados tras rascado en 15 mls de 2xTY/glicerol 20%. El ADN de cadena única procedente de cada uno de los grupos fue secuenciado con los oligonucleótidos D1.3L40 y LINKSEQ1, respectivamente, tal y como se describe anteriormente y se demostró que la aleatorización era correcta.

D1.3L40:

: 5’CAG GAG CTG AGG AGA TTT TCC 3’

LINKSEQ1:

: 5’ TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC 3’

Preparación de fagos rescatados para purificación por afinidad

Entre 10 y 20 \mul de bacterias derivadas de cada uno de los grupos mutagenizados (rascados de la placa) fueron utilizados para inocular, 5 mls de TY/Glu/Amp. Todo el crecimiento de las bacterias tuvo lugar a 37ºC. Después de entre 2 y 3 horas de crecimiento, se diluyó 1 ml en 5 mls de TY/Glu/Amp precalentado e infectado por adición de 0,5 mls de un concentrado 200 veces de la preparación M13K07gIII\DeltaNo3, descrita en el ejemplo 27. Después de 1 hora de infección, los cultivos fueron centrifugados a 4.000 r.p.m. durante 10 minutos, se resuspendieron en 2xTY, ampicilina 100 \mug/ml, se incubó durante un nuevo período de una hora, se transfirieron a 500 mls de medio 2xTY conteniendo ampicilina 100 \mug/ml, kanamicina 50 \mug/ml y se procedió a efectuar un cultivo durante 16 horas. Los pasos restantes de la preparación de fago fueron los descritos en el ejemplo 34. Los fagos fueron finalmente disueltos en Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,4 a 1/100 del volumen de cultivo original.

Purificación por afinidad

100 mls de lisozima de huevo de pavo, a una concentración de 10 mg/ml en NaHCO_{3} 0,1M; NaCl 0,5M pH 8,3, fueron mezclados con un volumen igual de Cyanogen Bromide Activated Sepharose 4B (Pharmacia) hinchado, unido covalentemente y lavado según las instrucciones del fabricante. Antes de utilizar esta matriz (TEL-Sepharose) fue lavada con 100 volúmenes de PBS, seguido de 10 volúmenes de PBSM. La TEL-Sepharose fue resuspendida en un volumen igual de PBSM y se añadió a 1 ml de un concentrado (50 veces) de fago en PBSM y se incubó sobre una plataforma rotatoria durante 30 minutos a temperatura ambiente. El fago real utilizado para este paso fue preparado mezclando volúmenes iguales de las preparaciones independientes de los tres grupos randomizados (D1.3L9192; D1.3H101 y D1.3L32). Después de este paso de unión, las suspensiones fueron cargadas en una columna de polipropileno desechable (columnas Poly-Prep, Bio-Rad) y lavadas con 200 volúmenes de PBS conteniendo Tween 20 0,1%. Los fagos unidos fueron eluidos con 1 ml de trietilamina 100 mM y neutralizados con 0,5 ml de Tris 1M (pH 7,4). Se prepararon una serie de diluciones a partir del eluido y se utilizaron para infectar células TG1y, ubicándose sobre placas TY conteniendo ampicilina 100 \mug/ml, glucosa al 2%. Las placas soportando aproximadamente 10 colonias, fueron rascadas en 3 mls de 2 x TY, glicerol 20%, y almacenadas a -70ºC. 10 \mul del mismo fueron utilizados para iniciar una segunda ronda de cultivo que fue rescatado con M13K07gIII\DeltaNo3, tal y como se describe anteriormente (utilizando un volumen de cultivo final de 100 mls). Las segunda y tercera ronda de pasos de purificación en columna de afinidad fueron llevados a cabo tal y como se ha descrito anteriormente para la primera ronda.

Análisis por medio de ELISA

40 colonias derivadas de la tercera ronda de columna de purificación sobre TEL-Sepharose fueron colocados en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante el transcurso de una noche a 37ºC en 200 \mul de TY/Amp/Glu. Las partículas de fagémido fueron rescatadas y preparadas para ELISA, tal como se describe en el ejemplo 18. Las placas ELISA fueron revestidas durante el transcurso de una noche a 37º con lisozima de huevo de gallina (HEL) o lisozima de huevo de pavo (TEL), a una concentración de 200 \mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM pH 9,6. Los ELISAs se llevaron a cabo tal como se describe en el ejemplo 14.

Después de 15 minutos de incubación en sustrato, se averiguó que 13 clones eran negativos (OD<0,05 sobre HEL o TEL). En la totalidad de los positivos, se detectó una señal de entre 0,1 y 0,78 sobre HEL, con la excepción de uno en el que la señal sobre HEL era de 0,078, pero la señal sobre TEL (OD 0,169) le incluía en el grupo positivo. La preparación de control fagémido tenía una relación de porcentaje de señal TEL:HEL del 22%. Se consideró que los clones tenía una unión no alterada si la relación de TEL:HEL era inferior al 40%. 9 clones caían en esta categoría. Se identificaron 18 muestras que presentaban unión alterada con la relación de señal sobre TEL:HEL de entre 40 y 200%.

Se preparó una dilución en serie sobre 10 clones que fueron analizados por medio de ELISA. En 6 de los clones, el perfil de unión a HEL era el mismo que en el clon original (pCAT3SCFvD1.3), mientras que la señal con TEL se incrementaba (ver la figura 50, clon B1). En los 4 clones restantes, la señal incrementada con TEL iba acompañada de un descenso en la señal sobre HEL (ver la figura 40, clon A4).

Competencia con antígeno soluble

La totalidad de clones aislados conservaban unión con HEL en diversos grados. Con vistas a determinar si un antígeno soluble podía competir con el antígeno inmovilizado, se llevó a cabo un experimento, como anteriormente, pero con la adición de lisozima de huevo de gallina (1 mg/ml) a TEL-Sepharose, con anterioridad a llevar a cabo la incubación con la preparación de fago. Este experimento fue llevado a cabo a través de 3 rondas de purificación en columna y se eligieron 40 clones. Ninguno de estos clones se unía a HEL o GEL, demostrando con ello que el antígeno soluble había tenido éxito en la competición de unión con el antígeno inmovilizado.

Ejemplo 36

Modificación de la especificidad de un anticuerpo mediante sustitución del dominio VLK por una librería VLK derivada de un ratón no inmunizado

Cuando se aísla una especificad de anticuerpo resultará a menudo deseable alguna de sus propiedades, particularmente su afinidad o especificidad. Este ejemplo demuestra que la especificidad de un anticuerpo puede ser alterada mediante la utilización de un dominio VL diferente, derivado de un repertorio de tales dominios. Este procedimiento que utiliza presentación sobre fago resultaría aplicable a mejoras de anticuerpos monoclonales existentes, al igual que a especificidades de anticuerpo derivadas que utilizan anticuerpos fago. Este ejemplo muestra que la sustitución del dominio VL de scFvD1.3 específico para lisozima de clara de huevo de gallina (HEL) por una librería de dominios VL permite la selección de fragmentos scFv que se unen también a lisozima de clara de huevo de pavo (TEL). Más generalmente, este planteamiento experimental muestra que las especificidades de anticuerpo pueden ser modificadas mediante la sustitución de un dominio variable y proporciona un nuevo ejemplo de planteamiento jerárquico para aislar especificidades de anticuerpo.

La cadena pesada D1.3 fue amplificada a partir de una construcción existente (pSW1-VHD1.3, Ward et al., 1989, supra) mediante PCR utilizando los cebadores VH1BACK y VH1FOR, la librería de cadena ligera fue amplificada a partir de una librería de cADN derivada de bazo de ratón no inmunizado, la cual fue sintetizada utilizando cebadores MJKFONX 1,2,4,5 para la primera hebra, como en el ejemplo 12. La subsiguiente amplificación fue llevada a cabo con los mismos cebadores forward y el cebador VK2BACK. El ensamblado PCR de la cadena pesada D1.3 con la librería de cadena ligera fue mediado por el componente de unión Fv de la cadena señal, tal y como se describe en el ejemplo 12.

El clonado de los productos PCR ensamblados (secuencias scFv) fue efectuado después de un paso PCR adicional (pull-through), utilizando un cebador BACK que proporciona un punto ApaLI y cebadores forward que contienen un punto Not 1, tal y como se describe en el ejemplo 12. Los fragmentos PCR digeridos con ApaL1/Not 1 fueron clonados en el vector fdCAT2, digerido de modo similar. Se obtuvieron 5 x 10^{5} transformaciones, después de electroporación de la reacción de unión en células MC1061.

El cribado de la librería fago para determinación de elementos de unión TEL se llevó a cabo mediante reconocimiento y selección. Tubos Falcon 2058 de poliestireno fueron revestidos (16 horas) con 2 ml de TEL-PBS (3 mg/ml) y bloqueados durante dos horas con 4 ml de MPBS (PBS que contenía polvo de leche desnatada al 2%). Los fagos derivados de la librería (5 x 10^{10} unidades transductoras) en 2 ml de MPBS (2%) fueron incubados en estos tubos durante 2 horas a temperatura ambiente. Los tubos fueron lavados con 3 x PBS, 1 x Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M; 1 x Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, NaCl 0,5M; Tris HCl 50 mM, pH 9,5, NaCl M. Finalmente, los fagos fueron eluidos con trietilamina 100 mM. Los fagos eluidos fueron tomados para infectar células TGI, las células fueron colocadas sobre placas 2 x TY que contenían tetraciclina 15 \mug/ml y cultivadas durante 16 horas. La colonias fueron obtenidas mediante rascado en 25 ml de medio 2xTY y los fagos recuperados mediante precipitación con PEG. Tras una segunda ronda de selección para elementos de unión TEL, se efectuaron ELISAs, tal y como se ha descrito anteriormente (ejemplo 2).

El análisis de 100 clones procedentes de la librería, antes de la selección por afinidad mediante ELISA sobre placas revestidas con TEL no mostró elementos de unión. Por el contrario, después de dos rondas de selección para fagos de unión TEL, aproximadamente el 10% de los clones fago mostraron señales positivas ELISA. La señales ELISA fueron consideradas como positivas con valores de al menos dos veces más elevados de el vector fdCAT2, sin inserto. En la Figura 41 se proporciona un análisis más detallado de las propiedades de unión de los fagos de unión TEL.

Tal y como se muestra en la Figura 41, se encontraron varios clones que se unían a TEL y HEL igualmente, en contraste con el D1.3scFv original, el cual se une casi exclusivamente a HEL. Ninguno de los clones estaba unido a BSA. Estos hallazgos indican que la especificidad de estos scFvs era más amplia en comparación con la de D1.3, dado que ambos lisozimas (HEL y TEL) son reconocidos, pero la especificidad para lisozima se conservaba, dado que otro BSA no era reconocido. Las secuencias de aminoácido deducidas (derivadas mediante secuenciado ADN) de los cadenas ligeras MF1 y M21, que corresponden a clones 3 y 9 en la figura 41, se muestran en la figura 42.

En el caso de anticuerpos aislados el planteamiento experimental, tal y como se describe en este estudio, puede resultar particularmente útil si se desea el reconocimiento de una banda más amplia de diferentes pero estrechamente relacionados antígenos. Por ejemplo, Los anticuerpos monoclonales contra antígenos víricos como el bucle V3 de HIV-1 gp120 resultan, en muchos casos, bastante específicos para un aislado particular de virus, debido a la variabilidad en esta parte del gen HIV-1 env. La modificación de los citados anticuerpos aportaría, por consiguiente, un valor terapéutico o de diagnóstico potencialmente más elevado.

Un planteamiento similar podría ser adoptado, en el cual un dominio de cadena variable de propiedades deseadas es mantenido fijo y combinado con una librería de dominios variables de cadena pesada. Algunas cadenas pesadas, por ejemplo VHD1.3, conservan actividad de unión como dominios únicos. Esto puede permitir una estrategia en la que dominios VH son cribados para determinar actividad de unión cuando son expresados sobre fago y después los dominios de unión son combinados con una librería de dominios VL para selección de socios de cadena ligera adecuados.

Ejemplo 37 Selección de una especificidad anticuerpo de fago mediante la unión de un antígeno unido a bolitas magnéticas. Uso de un reactivo rompible para permitir la elución de fago unido en condiciones moderadas

Cuando una anticuerpo de fago se une a su antígeno con elevada afinidad o avidez, puede no resultar posible eluir el anticuerpo de fago a partir de una matriz de afinidad con una molécula relacionada con el antígeno. Alternativamente, puede no existir ninguna molécula eluyente específica que pueda ser preparada con concentración lo suficientemente elevada. En estos casos, resulta necesario utilizar un procedimiento de elución que no resulte específico para el complejo antígeno-anticuerpo. Desafortunadamente, algunos de los procedimientos de elución no específicos interrumpen la estructura del fago, por ejemplo la viabilidad del fago es reducida con el tiempo a pH 12 (Rossomando, E.F. and Zinder, N.D. J. Mol. Biol. 36 387-389 1968). Se diseñó, por tanto, un procedimiento que permite la elución de anticuerpos unidos a fagos, en condiciones moderadas (reducción de un grupo ditiol con ditiotreitol), lo cual no interrumpe la estructura del fago.

El antígeno objetivo fue biotinilado utilizando un reactivo de biotinilación rompible. BSA conjugado con 2-fenil-5-oxazolona (O. Makela et al, supra) fue modificado utilizando un reactivo de biotinilación con un grupo ditiol rompible (2-(biotinamido)-etil-1,3-ditiopropionato de sulfosuccinimidilo, procedente de Pierce), según las instrucciones del fabricante. Este antígeno biotinilado estaba unido a bolitas magnéticas revestidas con estreptavidina y el complejo se utilizó para unión con el fago. Las bolitas magnéticas revestidas con estreptavidina (Dynal) fueron pre-revestidas con antígeno, mediante el mezclado de 650 \mug de OX-BSA biotinilado en 1 ml de PBS, con 200 \mul de bolitas durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. El antígeno libre fue eliminado mediante lavado con PBS. Una cuarentava parte del complejo (equivalente a 5 \mul de bolitas y a una entrada de 17,5 \mug de OX-BSA) fue añadida a 0,5 ml de fago en PBSM (PBS que contiene polvo de leche desnatada 2%) conteniendo 1,9 x 10^{10} partículas de fago mezcladas en las proporciones de pAbD1.3, dirigido frente a lisozima (Ejemplo 2) a pAbNQ11 dirigido frente a 2-fenil-5-oxazolona mostrada en el la Tabla 8.

Después de 1 hora de incubación con mezclado a temperatura ambiente, las bolitas magnéticas fueron recuperadas utilizando un dispositivo de separación magnético Dynal MPC-E. Las mismas fueron después lavadas en PBS conteniendo Tween 20 0,5%, (3 x 10 minutos, 2 x 1 hora, 2 x 10 minutos) y el fago eluido por medio de 5 minutos de incubación en 50 \mul de PBS conteniendo ditiotreitol 10 mM. El eluido fue utilizado para infectar células TG1 y las colonias resultantes sondadas con el oligo NQ11CDR3

: (5’-AAACCAGGCCCCCGTAATCATAGCC 3’)

derivado de CDR3 del anticuerpo NQ11 (este hibrida a pAbNO11 pero no a pAbD1.3).

pAbNQ11 (tabla 8) enriquecido 670 veces fue obtenido a partir de un fondo de pAbD1.3 en una única ronda de purificación, utilizando el equivalente de 17,5 \mug de OX-BSA biotinilado.

Este procedimiento de elución constituye tan solo un ejemplo de un procedimiento de elución en condiciones moderadas. Un procedimiento particularmente ventajoso consistiría en introducir una secuencia de nucleótido que codifique para aminoácidos que constituyen un punto de reconocimiento para rotura mediante una proteasa altamente específica, entre el gen extraño insertado, en este caso un gen para un fragmento de anticuerpo, y la secuencia del resto del gen III. Constituyen ejemplos de las citadas proteasas altamente específicas el factor X y la trombina. Después de la unión del fago a una matriz de afinidad y la elución para eliminar el fago de unión no específica y el fago de unión débil, el fago fuertemente unido sería eliminado mediante lavado de la columna con proteasas, en condiciones adecuadas para la digestión en el punto de rotura. Esto permitiría romper el fragmento de anticuerpo a partir de la partícula de fago que eluye el fago. Cabría esperar que estos fagos resultasen infecciosos, dado que tan solo el punto proteasa debería ser el único introducido. Los fagos unidos fuertemente podrían ser entonces recuperados mediante la infección de, por ejemplo, células TG1 de E. coli.

Ejemplo 38 Uso de selección celular para proporcionar un grupo enriquecido de genes de anticuerpo específico para antígeno, para reducir la complejidad de repertorios de fragmentos de anticuerpo presentados sobre la superficie de bacteriófago

Existen aproximadamente 10^{14} diferentes combinaciones de cadenas ligeras y pesadas derivadas de bazo de ratón inmunizado. Si el planteamiento combinatorio aleatorio se utiliza para clonar fragmentos de cadena ligera y pesada en un vector único para presentar fragmentos scFv, Fv o Fab, la presentación de la totalidad de las 10^{14} combinaciones no constituye una proposición práctica. Un planteamiento descrito en este ejemplo para reducir la complejidad consiste en clonar genes tan solo procedentes de células seleccionadas de antígeno. (un planteamiento alternativo, que hace frente a la complejidad, es la librería combinatoria dual descrita en el ejemplo 22).

El sistema inmune utiliza la unión de antígeno mediante inmunoglobulina superficial para seleccionar la población de células que responde para producir anticuerpos específicos. Este planteamiento de seleccionar células de unión a antígeno ha sido investigado para reducir el número de posibilidades combinatorias y para incrementar la posibilidad de recuperar la combinación original de cadenas ligeras y pesadas.

La respuesta inmunológica al hapteno ácido 4-hidroxi-3-nitrofenilacético (NP) ha sido estudiada ampliamente. Dado que la primera respuesta inmune a NP utiliza tan solo una única cadena ligera, los solicitantes fueron capaces de examinar la utilización del procedimiento combinatorio utilizando una cadena ligera fija y una librería de cadenas pesadas para examinar los genes de frecuencia que codifican para anticuerpos que se unen a NIP (ácido 4-hidroxi-3-yodo-5-nitrofenilacético). Los solicitantes han, de este modo, utilizado este sistema para investigar los méritos de seleccionar poblaciones de células, con anterioridad a preparar librerías combinatorias para presentación sobre fago.

Procedimientos 2.1 Conjugados hapteno

Gammaglobulina de pollito (CCG, Sigma, Poole, UK) y suroalbúmina bovina (BSA, Boehringer Manheim, Alemania) fueron conjugadas con NP-O-succinimida o con NIP-caproato-O-succinimida (Cambridge Research Biochemicals, Northwich, UK), en base al procedimiento descrito por Brownstone (Brownstone, A., Mitchison, N.A. and Pitt-Rivers, R., Immunology 1966, 10: 465-492). Los compuestos activados fueron disueltos en dimetilformamida y añadidos a proteínas en bicarbonato sódico 0,2M. Los mismos fueron mezclados con agitación constante durante 16 horas a 4ºC y después dializados frente a diversos cambios de bicarbonato sódico 0,2M. Los mismos fueron finalmente dializados en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los conjugados preparados eran NP_{12}CGG, NIP_{10}BSA. El derivado NIP_{10}BSA fue subsiguientemente biotinilado utilizando un kit de biotinilación adquirido en Amersham (Amersham International, Amersham, UK).

2.2 Animales e inmunización

Ratones de la cepa C57BL/6 fueron inmunizados por medio de inyección intraperitoneal de 100 \mug de NP-CGG en adyuvante completo de Freund, a las 10 semanas de edad.

2.3 Preparación del bazo

Siete días después de la inmunización, se prepararon las células tal y como se describe por parte de Galfre y Milstein (Galfre, G y Milstein, C., Methods Enzymol. 1981. 73:3-46). Los glóbulos rojos fueron sometidos a lisis con cloruro amónico (Boyle, W. Transplantation 1968.6:71) y, cuando se llevó a cabo la selección celular, las células muertas fueron eliminadas por el procedimiento descrito por von Boehmer y Shortman (von Boehmer, H. y Shortman, K.J. Immunol. Methods 1973:1:273). Las células fueron suspendidas en solución salina tamponada con fosfato (PBS), sueroalbúmina bovina 1%, azida sódica 0,01; a lo largo de todo el procedimiento de selección celular, las células fueron mantenidas a 4ºC en este medio.

2.4 Solución celular

NIP-BSA biotinilado fue acoplado a bolitas magnéticas acopladas a estreptavidina (Dynabeads M280 Streptavidin, Dynal, Oslo, Norway), mediante incubación de 10^{8} bolitas con 100 \mug de proteína biotinilada durante 1 hora, con agitación ocasional, y posterior lavado cinco veces para eliminar el antígeno no unido. Las bolitas acopladas fueron almacenadas a 4ºC en medio, hasta que resultaran necesarias. Para la selección de células que se unen a antígeno, las células (2-4x10^{7}/ml) fueron primeramente incubadas durante 30 minutos con bolitas no acopladas, a una relación bolita:célula de 1:1, con vistas a examinar el grado de unión no específica. Las células no unidas fueron eliminadas y después incubadas con bolitas magnéticas acopladas a NIP-BSA, a una relación bolita:célula de 0,1:1,1, durante 60 minutos, con agitación ocasional. Las bolitas y las células en forma de rosetón fueron separadas de la forma descrita anteriormente. Las bolitas fueron después re-suspendidas en 1 ml de medio y se repitió la separación; este procedimiento se repitió entre 5 y 7 veces, hasta que no pudieron detectarse células no unidas cuando se procedía al contaje en un hemocitómetro.

Para la reducción de células positivas de inmunoglobulina superficial las células fueron incubadas con 20 \mug de inmunoglobulina polivalente anti-ratón de cabra biotinilada (Sigma, Poole, UK). Las células fueron después lavadas con medio y añadidas a bolitas magnéticas acopladas a estreptavidina, a una relación de bolita a célula de 30:1. Tras 30 minutos de incubación las bolitas y las células en forma de rosetón fueron separadas mediante la aplicación de los dispositivos magnéticos tres veces, tomando el sobrenadante cada vez.

2.4 Preparación de ADN/cADN, amplificación PCR y clonado

Se preparó ADN a través de un procedimiento de digerido con proteinasa-K sencillo, que resultaba particularmente conveniente para números pequeños de células (PCR Protocols: A guide to methods and applications. Ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., and White T. J. Academic Press). La preparación de ARN y la subsiguiente síntesis de cADN fue llevada a cabo tal y como se describe por Gherardi et al (Gherardi E., Pannell R., and Milstein C., J. Immunol. Methods, 1990. 126:61-68). La PCR y el clonado de las librerías de cadena pesada fue llevado a cabo utilizando los cebadores y las condiciones descritas por Ward et al., (Ward, E.S., Güssow, D., Griffits, A.D., Jones, P.T. and Winter, G., Nature, 1989. 341:544-546); se llevaron a cabo 40 ciclos de amplificación PCR. Los vectores de expresión VH y Fv fueron adaptados a partir de los anteriormente descritos por Ward et al. Los mismos fueron subclonados en pUC119 (Veira and Messing, ver más adelante) y el vector de expresión Fv fue modificado para incluir una cadena ligera lambda-1 de línea germinal (obtenida como obsequio por parte de T. Simon (originalmente clonada por Siegfred Weiss, Basel Institute of Immunology)). El vector es mostrado en la Figura 53.

2.5 Expresión y ELISA

Para el cribado se seleccionaron colonias sencillas en pocillos individuales de placas de microvaloración (Bibby) en 200 \mul de 2 x TY/ampicilina 100 \mug/ml/glucosa 1% y se incubaron después a 37ºC durante 5-6 horas con agitación, se añadió después isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG, Sigma, Poole, UK), hasta lograr una concentración final 1 mM y se prosiguió con la incubación durante 16 horas adicionales a 30ºC antes de recoger los sobrenadantes. Los pocillos de placas ELISA Falcon (Becton Dickenson, N.J. USA) fueron revestidos durante el transcurso de una noche a temperatura ambiente con NIP_{10}-BSA (40 \mug/ml en PBS) y después bloqueados con polvo de leche desnatada al 2% en PBS durante 2 horas, a temperatura ambiente. Los sobrenadantes bacterianos fueron añadidos e incubados a temperatura ambiente durante 1 hora y las placas fueron lavadas después tres veces con PBS. Se añadió cadena lambda anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa (Souther Biotechnology, Birminham, USA) y se incubó de nuevo durante 1 hora a temperatura ambiente, antes de proceder a efectuar seis lavados con PBS y después revelado con 2,2’-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (Sigma, Poole, UK), como sustrato peroxidasa. Se midió la densidad óptica a 405 nm utilizando un lector de microplaca Thermomax (Molecular Devices, Menlo Park, USA), después de 30 minutos. El análisis Western utilizando etiqueta myc en C-terminal se describe en el ejemplo 23.

3.1 Comparación de ARN/ADN y células seleccionadas de antígeno

Los resultados de la selección de antígeno se muestran en la Tabla 9. Menos del 1% de las células se unen a bolitas revestidas con NIP-BSA y la unión no específica es muy baja. La valoración de la producción de genes expresados a partir de cada una de las librerías VH utilizando análisis Western mostró que la longitud completa de los dominios VH se expresaba en el 95% de los clones (19/20), cuando se utilizaba ARN como material de partida, pero tan solo en el 60% (12/20) de los clones cuando se utilizaba ADN (ya sea células seleccionadas o procedente del bazo total) como material de partida. Esta diferencia se origina, probablemente, del hecho de que muchos pseudogenes reordenados podían ser amplificados con nuestros cebadores y parece que tiene que existir cierto grado de selección, a nivel de transcripción, para los genes funcionales.

Un número variable de clones procedente de cada tipo de librería fueron cribados para la producción de fragmentos Fv que se unían a NP. Se llevaron a cabo cribados iniciales ELISAs y los positivos se tomaron para incluir aquellos con una densidad óptica de al menos dos veces la de fondo. Los inicialmente positivos fueron re-transformados y la unión comprobada por duplicado; se confirmó que la unión resultaba específica para NIP y no para BSA. La frecuencia de los clones de unión a NIP positivos confirmados para cada uno de los materiales de partida se muestra en la Tabla 10. La utilización de ADN como material de partida para la amplificación PCR, resulta aproximadamente equivalente al muestreo de las células presentes, dado que tan solo existe un gen funcional de cadena pesada re-ordenado y, como máximo, un pseudogen reordenado por célula B. La amplificación a partir de ARN de un animal predispone naturalmente al repertorio hacia las células B reactivas y, en un animal recientemente inmunizado, cabría esperar que ello proporcionase cierta predisposición hacia el inmunogen. Los datos en la tabla 10 muestran claramente el poder de esta selección, siendo el número de genes específicos de antígeno que están siendo enriquecidos de al menos 96 veces, cuando se utiliza como material de partida ADN preparado una semana después de la primera inmunización. Los datos muestran también que la selección para determinar la unión a antígeno proporciona también un poderoso procedimiento alternativo de selección para el material de partida genético requerido.

3.2 Comparación de bazo total/bazo con inmunoglobulina superficial reducida

Para examinar la base celular de la selección lograda mediante la utilización de ARN como material de partida, se redujeron las células positivas de inmunoglobulina superficial en el bazo, utilizando bolitas magnéticas conjugadas con inmunoglobulina anti-polivalente biotinilada y estreptavidina. Análisis FACS anteriores habían demostrado que este procedimiento eliminaba más del 96% de las células positivas de inmunoglobulina superficial. Se preparó ARN a partir de fracciones de bazo con inmunoglobulina superficial reducida y de fracciones de bazo sin reducir la inmunoglobulina superficial y de las librerías preparadas a partir de cada una de ellas. Los resultados ELISA (Tabla 10) muestran que el número de positivos no ha disminuido a través de esta reducción, sugiriendo que la mayor parte del efecto selectivo derivado de utilizar ARN puede proceder de las células G negativas de inmunoglobulina superficial (probablemente células de plasma).

Conclusiones

Los solicitantes han demostrado la importancia de la amplificación de ARN específicos, producidos mediante inmunización, para permitir obtener la actividad de unión con una frecuencia razonable, a partir de una librería combinatoria. Los solicitantes han demostrado también una estrategia alternativa que imita la del propio sistema inmune. Utilizando un simple procedimiento de selección de células que se unen a antígeno, se obtuvo un enriquecimiento comparable, presentando la ventaja de utilizar una banda más amplia de genes. A primera vista, el planteamiento de combinación aleatoria parecería poco probable que pudiera dar lugar a la combinación original de cadena ligera y pesada, debido a la vasta diversidad de los genes de inmunoglobulina. No obstante, los solicitantes muestran aquí que, después de inmunización con un buen antígeno, el 10% de los genes del total de ARN esplénico aislado proceden de células específicas para antígeno, por lo que el tamaño eficaz del repertorio se reduce en gran manera. Esto, conjuntamente con el hecho de la promiscuidad de las cadenas ligeras y pesadas (ejemplos 17 y 18), da lugar a que el sistema combinatorio produzca clones de unión a antígeno con una frecuencia razonable. Los datos sugieren también que la masa de ARN específico para antígeno proceda de células negativas de inmunoglobulina superficial, las cuales son, muy probablemente, células de plasma.

Los datos muestran también que este procedimiento simple de selección de antígeno puede resultar de utilidad para reducir la complejidad de la librería combinatoria. En este caso, se ha logrado un enriquecimiento de genes específicos de antígeno de al menos 56 veces, el cual, en el caso normal en el que las cadenas ligeras y pesadas son desconocidas, daría lugar a una reducción en la complejidad de la librería combinatoria por un factor de más de 3.000. Una nueva ventaja derivada de la utilización de células seleccionadas para antígeno (y amplificación a partir de ADN para producir cualquier predisposición debido al estado de la célula) es que las mismas dan lugar a una banda más amplia de genes de anticuerpo amplificados. Puede ocurrir que una simple selección celular, tal como la que los solicitantes han descrito en el presente documento, en combinación con selección de fago resultaría ideal. A partir de este ejemplo, puede observarse que mediante la combinación de célula y procedimientos de selección de fago, uno podría razonablemente esperar cribar todas las combinaciones de cadena ligera y pesada (aproximadamente 4 x 10^{10}) y sería de esta forma capaz de cribar la totalidad de combinaciones de unión, a pesar de que ello no resultaría actualmente posible a partir de bazo completo (aproximadamente 4 x 10^{14} combinaciones, asumiendo 50% de
células B).

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TABLA 3 Selección por afinidad de fago de unión a hapteno

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TABLA 5 Mutaciones en scFvB18 seleccionado mediante presentación sobre fago después de crecimiento en cepas mutadoras

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TABLA 6 (i) Cebadores oligonucleótido utilizados para PCR de genes de inmunoglobulina humanos

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TABLA 6 (ii)

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TABLA 6 (iii)

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TABLA 6 (iv)

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TABLA 6 (v)

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TABLA 8

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TABLA 9 Resultados de selección celular de antígeno

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	Número de células	% de células totales
Total células de bazo	4 x 10^{7}
Células unidas a bolitas no revestidas	0,8 x 10^{4}	0,02
Células unidas a bolitas revestidas con NIP-BSA	22 x 10^{4}	0,55

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TABLA 10 Resultados de ELISAs de unión a FvNIP a partir de poblaciones de células seleccionadas

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	Positivas	Grado de enriquecimiento^{\text{*}}
Población celular
\hskip0,1cm ADN procedente de bazo total	0/940	-
\hskip0,1cm ARN procedente de bazo total	29/282	>96
\hskip0,1cm ADN procedente de células de unión a antígeno	17/282	>56

Selección de Ig superficial
\hskip0,1cm ARN procedente de fracción negativa de Ig superficial	8/94	-
\hskip0,1cm ARN procedente de bazo total	4/94	-

^{\text{*}} Grado de enriquecimiento comparado con el ADN total.

Claims

1. Procedimiento para producir una partícula de bacteriófago filamentoso que presenta en su superficie una molécula de unión específica para un epítope objetivo particular o un antígeno, comprendiendo dicho procedimiento los pasos de:

: producir una población de partículas de bacteriófago filamentoso que presentan es su superficie una población de moléculas de unión que tienen una banda de especificidades de unión, en donde las moléculas de unión son moléculas de anticuerpo Fab capaces de unirse a un epítope objetivo o a un antígeno, y en donde cada una de las partículas de bacteriófago filamentoso contiene un vector fago que comprende ácido nucleico que codifica para la molécula de unión expresada a partir del ácido nucleico y presentada por la partícula en su superficie, en donde el ácido nucleico que codifica para las moléculas de unión en la población se obtiene mediante la combinación, in vitro, de segmentos V no reordenados con segmentos D y J o derivados por medio de mutagénesis in vitro de una secuencia de codificación de anticuerpo existente, y/o en donde la cadena pesada de cada una de las moléculas de anticuerpo Fab presentada por la partícula en su superficie es expresada como una fusión con una proteína de gen III del bacteriófago filamentoso;

: seleccionar una partícula de bacteriófago filamentoso que presenta una molécula de unión con una especificidad deseada, mediante la puesta en contacto de la población de partículas de bacteriófago filamentoso con un epítope objetivo o un antígeno, a los efectos de que las moléculas de unión individuales presentadas sobre las partículas de bacteriófago filamentoso con la especificidad deseada se unan al citado epítope objetivo o antígeno.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 que comprende, adicionalmente,

: separar las partículas de bacteriófago filamentoso unido del epítope objetivo o antígeno.

3. Procedimiento según la reivindicación 2 que comprende, adicionalmente,

: recuperar las partículas de bacteriófago filamentoso separadas que presentan una molécula de unión con la deseada especificidad.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 que comprende además aislar, de las partículas de bacteriófago filamentoso separadas, el ácido nucleico que codifica para la molécula de unión, someter el ácido nucleico a hipermutación en bucle de unión a antígeno, para obtener un ácido nucleico que codifica para una nueva población de moléculas de unión, las cuales son después sometidas a nuevas rondas de selección y de mutagénesis, que comprenden una nueva aplicación del procedimiento de la reivindicación 1.

5. Procedimiento para producir una molécula de unión específica para un epítope objetivo o antígeno en particular, que comprende:

: llevar a cabo el procedimiento según la reivindicación 3 o la reivindicación 4;

: aislar, de las partículas de bacteriófago filamentoso separadas recuperadas según el procedimiento de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, el ácido nucleico que codifica para la molécula de unión;

: insertar ácido nucleico que codifica para la molécula de unión o uno de sus fragmento o derivados con especificidad de unión para el epítope objetivo o antígeno, en un sistema recombinante; y

: producir la molécula de unión, o uno de sus fragmentos o derivados, con especificidad de unión para el epítope objetivo o antígeno, en el sistema recombinante separado de las partículas de bacteriófago filamentoso.

6. Partícula de bacteriófago filamentoso que presenta sobre su superficie una molécula de unión, que es una molécula de anticuerpo Fab que comprende un dominio de unión capaz de unirse al epítope objetivo o antígeno, conteniendo la partícula un vector fago que comprende ácido nucleico que codifica para la molécula de unión expresada a partir del ácido nucleico y presentada por la partícula en su superficie, en la que la cadena pesada de cada una de las moléculas de anticuerpo Fab presentadas por la partícula en su superficie es expresada como una fusión con una proteína del gen III del bacteriófago filamentoso.

7. Población de partículas de bacteriófago filamentoso según la reivindicación 6, que presenta una población de las citadas moléculas de unión que tiene una banda de especificidades de unión.