ES2656168T3 - Anticuerpo anti cadherina marcado con un metal radioactivo - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo anti cadherina-P marcado con un metal radioactivo, el cual se obtiene uniendo un elemento metálico radioactivo a un anticuerpo anti cadherina-P a través de un reactivo quelante de metales, donde el anticuerpo anti cadherina-P es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo recombinante producido por una célula productora de anticuerpos representada por el número de referencia NITE BP-897, NITE BP-899, NITE BP-1048, NITE BP-1049 o NITE BP-1050, o un fragmento de unión a cadherina-P de cualquiera de estos anticuerpos.
Description
Entre estos reactivos quelantes de metales, son preferentes isotiocianobencil DOTA, metilisotiocianobencil DTPA, ciclohexilisotiocianobencil DTPA, desde el punto de vista de la facilidad de la reacción de incorporación del quelato de metales al anticuerpo, el porcentaje de marcaje, la estabilidad del complejo, etc.
5 El elemento metálico radioactivo puede estar enlazado al anticuerpo anti cadherina P a través de un método de rutina. En un procedimiento, se hace reaccionar un reactivo quelante de metales con un anticuerpo anti cadherina P, para de este modo preparar un precursor de marcador y el precursor se hace reaccionar con un elemento metálico radioactivo.
En el agente terapéutico contra el cáncer y el agente diagnóstico para el cáncer de la presente invención, la proporción en moles de anticuerpo anti cadherina P con respecto al reactivo quelante de metales es importante para la acumulación en las células cancerosas y el efecto antineoplásico. La proporción en moles (anticuerpo anti cadherina P : reactivo quelante) es preferentemente de 1 : 0,1 a 1 : 4,5, más preferentemente de 1 : 0,5 a 1 : 3. Para conseguir tales proporciones en moles, el anticuerpo anti cadherina P y el reactivo quelante se añaden 15 preferentemente para reaccionar a una proporción de 1 : 0,1 a 1 : menos de 5, en particular preferentemente 1 : 1 a
1 : 3. La cantidad de molécula (o moléculas) quelante por anticuerpo anti cadherina P puede calcularse midiendo el peso molecular a través de análisis de masas MALDI-TOF o una técnica similar, y comparando el peso molecular de un anticuerpo no modificado con el de un anticuerpo modificado (Publicación de Patente de Estados Unidos N.º 7514078, Lu et al., J. Pharm. Sci. 94(4), 2005, pág. 788-79 y Tedesco et al., J. Clin. Onco. 23 (16S), 2005, 4765). Como alternativa, la cantidad de molécula (o moléculas) quelante por anticuerpo anti cadherina P puede determinarse a través de una titulación quelatométrica. Un método conocido emplea un reactivo colorimétrico de metal alcalinotérreo (arsenazo III) (Bradyr et al., Nucl. Med. Biol. 31, 795-802, 2004 y Dadachova et al., Nucl. Med. Biol. 26, 977-982, 1999).
25 El agente terapéutico contra el cáncer o el agente de diagnóstico para el cáncer de la presente invención puede proporcionarse como una formulación marcada o una formulación en kit que contiene un precursor de marcador. En la presente invención puede emplearse cualquiera de las dos formulaciones. En el caso de la formulación marcada, puede administrarse un agente terapéutico contra el cáncer o un agente diagnóstico para el cáncer que contiene un anticuerpo anti cadherina P marcado tal cual es. En el caso de una formulación en kit, el agente puede administrarse tras el marcaje con un elemento metálico radioactivo de interés.
El anticuerpo anti cadherina P que contiene un elemento metálico radioactivo enlazado al mismo se acumula de forma elevada en el tejido canceroso y presenta una elevada actividad tóxica para las células cancerosas. Por lo tanto, el anticuerpo es un agente terapéutico contra el cáncer útil que daña menos los tejidos que no son tejidos
35 cancerosos y que tiene una alta seguridad. Además, el anticuerpo anti cadherina P que contiene un elemento metálico radioactivo enlazado al mismo tiene una actividad antineoplásica notoriamente mayor que la del correspondiente anticuerpo anti cadherina P. La actividad antineoplásica es notoriamente elevada en particular cuando la proporción en moles del anticuerpo con respecto al agente quelante es de 1 : 0,1 a 1 : 4,5.
El agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención puede utilizarse en combinación con otro agente antineoplásico. Los ejemplos de tal agente antineoplásico incluye un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor de microtúbulos, un agente antineoplásico antibiótico, un inhibidor de la topoisomerasa, un agente de platino, un fármaco para diana molecular, un agente hormonal y productos biológicos. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen agentes antineoplásicos de mostaza nitrogenada (por ejemplo, ciclofosfamida), agentes
45 antineoplásicos de nitrosourea (por ejemplo, ranimustina) y dacarbacina. Los ejemplos de antimetabolito incluyen 5-FU, UFT, carmofur, capecitabina, tegafur, TS-1, gemcitabina y citarabina. Los ejemplos de inhibidor de los microtúbulos incluyen agentes antineoplásicos alcaloides (por ejemplo, vincristina) y agentes antineoplásicos de taxano (por ejemplo, docetaxel y paclitaxel). Los ejemplos del agente neoplásico antibiótico incluyen mitomicina C, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina y bleomicina. Los ejemplos de inhibidor de la topoisomerasa incluyen irinotecan y nogitecan, que tienen actividad inhibidora de la topoisomerasa I, y etopósido que tiene actividad inhibidora de la topoisomerasa II. Los ejemplos del agente de platino incluyen cisplatino, paraplatino, nedaplatino y oxaliplatino. Los ejemplos del fármaco para diana molecular incluyen trastuzumab, rituximab, imatinib, gefitinib, erlotinib, bevacizumab, bortezomib, sunitinib y sorafenib. Los ejemplos del agente hormonal incluyen dexametasona, finasteride y tamoxifeno. Los ejemplos de productos biológicos incluyen los interferones α, β y γ, e interleucina 2.
55 El agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención puede utilizarse en combinación con una terapia contra el cáncer. Los ejemplos de terapia contra el cáncer incluyen cirugía, radioterapia (incluyendo terapia con bisturí de rayos gamma, terapia con ciberbisturí, terapia con captura de neutrones de boro y radioterapia de iones pesados/de haz de protones), cirugía por ultrasonidos enfocados guiada por RM, crioterapia, ablación por radiofrecuencia, terapia de inyección percutánea de etanol y emboloterapia.
El agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención es eficaz en diversos cánceres de un mamífero (incluyendo un ser humano). Los ejemplos del cáncer diana incluyen carcinomas tales como cáncer faríngeo, cáncer laríngeo, cáncer de lengua, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer 65 colorrectal, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de vesícula biliar, cáncer de riñón, cáncer prostático, melanoma maligno y cáncer de tiroides; y sarcomas tales como osteosarcoma,
7
condrosarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, liposarcoma, angiosarcoma, fibrosarcoma, leucemia, linfoma maligno y mieloma.
El agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención puede disolverse en una solución acuosa,
5 preferentemente un tampón fisiológicamente adaptable tal como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica tamponada. Además, el agente terapéutico puede tener la forma de una suspensión, solución, emulsión o similar, en un vehículo oleoso o acuoso.
La dosificación del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención, que varía en conformidad con los síntomas, la vía de administración, el peso corporal, la edad, etc. de un paciente que lo necesite, es preferentemente, por ejemplo, de 37 a 3.700 Mbq para el tratamiento de un adulto.
El agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención en general se administra por vía parenteral. Por ejemplo, el agente terapéutico contra el cáncer se inyecta (por ejemplo, por vía subcutánea, intravenosa,
15 intramuscular, vía intraperitoneal) o se administra por vía transdérmica, vía transmucosal, vía transnasal, vía transpulmonar, etc.
El agente de diagnóstico para el cáncer de la presente invención puede utilizarse en la formación de imágenes de tumores. En el caso en donde un paciente tiene un tumor en el cual se expresa la proteína CDH3, el agente de diagnóstico para el cáncer de la presente invención se acumula en el tumor. Por lo tanto, pueden formarse imágenes del tumor detectando la radiación mediante un aparato tal como un tomógrafo computarizado de emisión monofotónica (SPECT, forma siglada de single photon emission computed tomograph), un tomógrafo por emisión de positrones (PET, forma siglada de positron emission tomograph) o una cámara de centelleo. Por ejemplo, mediante el uso de un agente de diagnóstico para el cáncer de la presente invención, el efecto terapéutico del agente
25 terapéutico contra el cáncer de la presente invención puede predecirse antes de la administración del agente terapéutico. El agente de diagnóstico se administra al paciente antes del tratamiento y se forman imágenes del tumor. Cuando se observa una alta acumulación, el efecto superior del agente terapéutico puede predecirse como potente. El agente de diagnóstico puede utilizarse para determinar el efecto terapéutico. El agente de diagnóstico de la presente invención se administra a un paciente que ha recibido el tratamiento con el agente terapéutico de la presente invención o cualquier otro tratamiento, para formar imágenes del tumor. A través del control de la variación dependiente del tiempo de la acumulación del agente de diagnóstico puede observarse la expansión o contracción del tumor a lo largo del tiempo.
El anticuerpo para su uso como un agente de diagnóstico reconoce preferentemente un epítopo competitivo con el
35 agente terapéutico. Más preferentemente, el anticuerpo reconoce el mismo epítopo que el reconocido por el agente terapéutico. Muy preferentemente, el agente terapéutico y el agente de diagnóstico son el mismo anticuerpo.
El agente de diagnóstico para el cáncer de la presente invención se administra en general a un sujeto por vía intravenosa. Sin embargo, el agente de diagnóstico para el cáncer también puede administrarse por vía arterial. La dosificación del mismo, que varía en conformidad con los síntomas, la vía de administración, el peso corporal, la edad, etc., de un paciente que lo necesite, es preferentemente, por ejemplo, de 37 a 1.120 MBq para un tratamiento de adulto.
Ejemplos
45 La presente invención se describirá a continuación en detalle por medio de ejemplos, que no deben considerarse como limitantes de la invención. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1: Producción de un antígeno CDH3 soluble
La proteína CDH3 soluble (sCDH3) en la cual la región transmembrana C terminal se había delecionado se produjo para servir como un inmunógeno para producir un anticuerpo anti CDH3.
(1) Producción de un vector de expresión de antígeno CDH3 soluble
55 Se realizó PCR mediante el uso de un ADNc CDH3 de longitud completa como molde y de un cebador directo (SEQ ID NO: 3: CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT, (hCDH3FullFW)) y un cebador inverso (SEQ ID NO: 4: CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC, (hCDH3SolbRV)), que se habían diseñado para amplificar un segmento correspondiente con la región extracelular de CDH3 (1-654 en la SEQ ID NO: 2, en lo sucesivo denominado en el presente documento sCDH3ADNc). La reacción se realizó mediante el uso de KOD-Plus (producto de Toyobo) y en las siguientes condiciones: 94 ºC-15 s, 55 ºC-30 s y 68 ºC-90 s (30 ciclos)).
Tras la finalización de la reacción de PCR, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se cortó un trozo de gel que contenía la banda del tamaño buscado (aproximadamente 2,0 kpb). El sCDH3ADNc diana
65 se recuperó del trozo de gel mediante el uso del kit de extracción en gel QIA quick (producto de Qiagen).
8
(i) 4 conjuntos de cebadores sentido para la clonación de la región variable de la cadena L de ratón
Hokkaido System Science Co., Ltd sintetizó 17 cebadores sentido y 3 cebadores inversos, de acuerdo con "Phage Display -A Laboratory Manual”, Barbas Burton Scott Silverman," PROTOCOLO 9.5. 5 VK sentido (parte de FR1)
Como cebador de VK sentido se empleó una mezcla de los siguientes 17 cebadores.
5’-GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC-3’ (degeneración 2): SEQ ID NO: 5 5’-GAY ATT GTT CTC WCC CAG TC-3’ (degeneración 4): SEQ ID NO: 6 5’-GAY ATT GTG MTM ACT CAG TC-3’ (degeneración 8): SEQ ID NO: 7 5’ GAY ATT GTG YTR ACA CAG TC-3’ (degeneración 8): SEQ ID NO: 8 5’ GAY ATT GTR ATG ACM CAG TC-3’ (degeneración 8): SEQ ID NO: 9
15 5’ GAY ATT MAG ATR AMC CAG TC-3’ (degeneración 16): SEQ ID NO: 10 5’ GAY ATT CAG ATG AYD CAG TC-3’ (degeneración 12): SEQ ID NO: 11 5’ GAY ATY CAG ATG ACA CAG AC-3’ (degeneración 4): SEQ ID NO: 12 5’ GAY ATT GTT CTC AWC CAG TC-3’ (degeneración 4): SEQ ID NO: 13 5’ GAY ATT GWG CTS ACC CAA TC-3’ (degeneración 8): SEQ ID NO: 14 5’ GAY ATT STR ATG ACC CAR TC-3’ (degeneración 16): SEQ ID NO: 15 5’ GAY RTT KTG ATG ACC CAR AC-3’ (degeneración 16): SEQ ID NO: 16 5’ GAY ATT GTG ATG ACB CAG KC-3’ (degeneración 12): SEQ ID NO: 17 5’ GAY ATT GTG ATA ACY CAG GA-3’ (degeneración 4): SEQ ID NO: 18 5’ GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT-3’ (degeneración 4): SEQ ID NO: 19
antisentido de J (4 conjuntos de cebadores)
cebador antisentido de J1/J2 (1)
5’-GGS ACC AAR CTG GAA ATM AAA-3’ (degeneración 8): SEQ ID NO: 22
cebador antisentido de J4 (2)
cebador antisentido de J5 (3)
5’-GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA-3’: SEQ ID NO: 24
mezcla de cebadores antisentido de J1/J2, J4, J5 (4)
(ii) 7 conjuntos de cebadores para la clonación de la región variable de la cadena L, VK sentido (parte del péptido 45 señal)
Los cebadores se obtuvieron a través de modificación de la secuencia de nucleótidos de un conjunto de cebadores de Ig de ratón (Novagen; Merck, n.º de Cat. 69831-3) de forma que se eliminaran los sitios de las enzimas de restricción. Cebador sentido del conjunto A
5’-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3’: SEQ ID NO: 25
Cebador sentido del conjunto B
55 5’-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’: SEQ ID NO: 26
Cebador sentido del conjunto C
5’-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3’: SEQ ID NO: 27
Cebador sentido del conjunto D (mezcla de los siguientes 2 cebadores)
5’-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3’: SEQ ID NO: 28 5’-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3’: SEQ ID NO: 29
65
11
Cebador sentido del conjunto E (mezcla de los siguientes 3 cebadores)
5’-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3’: SEQ ID NO: 30 5’-ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3’: SEQ ID NO: 31 5 5’-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC-3’: SEQ ID NO: 32
Cebador sentido del conjunto F (mezcla de los siguientes 4 cebadores)
5’-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3’: SEQ ID NO: 33 5’-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3’: SEQ ID NO: 34 5’-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3’: SEQ ID NO: 35 5’-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3’: SEQ ID NO: 36
Cebador sentido del conjunto G (mezcla de los siguientes 4 cebadores)
15 5’-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3’: SEQ ID NO: 37 5’-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3’: SEQ ID NO: 38 5’-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3’: SEQ ID NO: 39 5’-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3’: SEQ ID NO: 40
Cebador antisentido de KVL
ACTGGATGGTGGGAAGATGGA: SEQ ID NO: 41
25 B. Cebadores para su uso en la amplificación por PCR de un gen que codifica la región V de la cadena H de ratón
Se emplearon los siguientes dos conjuntos de cebadores, un conjunto de 4 cebadores que tenían, en el extremo 5’, homología con la parte de señal de la cadena H de ratón y un cebador que tenía, en el extremo 3’, homología con la parte IGHC; y un conjunto de 1 cebador que tenía, en el extremo 5’, homología con la parte FR1 y un conjunto de 2 cebadores que tenían, en el extremo 3’, homología con la región constante de la cadena H de ratón (IGHC). Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa mediante el uso de los dos conjuntos de cebadores, mediante lo cual se aisló a partir del ADNc el fragmento de ADN de la región variable de la cadena H de inmunoglobulina de ratón. Las secuencias de los cebadores eran las siguientes.
35 (i) Cebadores para la clonación de la región variable de la cadena H de ratón
VH sentido (parte de señal: conjunto de 4 cebadores)
Estos cebadores se sintetizaron de acuerdo con Current Protocols in Immunology (John Wiley and Sons, Inc.), unidad 2.12 Cloning, Expression, and Modification of Antibody V Regions (tabla 2.12.2).
5’-ATG GRA TGS AGC TGK GTM ATS CTC TT-3’ (degeneración: 32): SEQ ID NO: 42 5’-ATG RAC TTC GGG YTG AGC TKG GTT TT-3’ (degeneración: 8): SEQ ID NO: 43 5’-ATG GCT GTC TTG GGG CTG CTC TTC T-3’: SEQ ID NO: 44
(ii) Cebadores para la clonación de la región variable de la cadena H de ratón
VH sentido (parte de FR1)
Estos cebadores se diseñaron mediante modificación de la secuencia de nucleótidos de los cebadores sentido divulgados en un documento (Tan et al, "Superhumanized" Antibodies: Reduction of Immunoogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169 (2002), págs. 1119-1125).
55 5’-SAG GTS MAR CTK SAG TCW GG-3’(degeneración: 256): SEQ ID NO: 46
VH antisentido (cebador antisentido común con 3 y 4)
El cebador se diseñó a través de degeneración de la secuencia de nucleótidos de forma que el cebador puede aparearse con todas las isoformas de la IgG de ratón.
5’-CAS CCC CAT CDG TCT ATC C-3’(degeneración: 6): SEQ ID NO: 47
65
12
patrón. Se disolvió el anticuerpo de modificación en agua ultrapura, para preparar de este modo una solución de anticuerpo de modificación. La solución de DOTA patrón o la solución de anticuerpo de modificación (10 μl) se combinaron con la solución de arsenazo III (190 μl), y la mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se midió la absorbancia de la mezcla a una longitud de onda 630 nM. A partir de las mediciones de 5 absorbancia de las soluciones de DOTA patrón se extrajo una curva patrón. Mediante la curva patrón, se calculó la cantidad de moléculas de DOTA enlazadas al anticuerpo de modificación (número promedio de modificación DOTA).
La tabla 2 muestra los resultados (la proporción de adición de DOTA y el número promedio real de DOTA de modificación). Como está claro a partir de la Tabla 2, se encontró que la cantidad de moléculas de DOTA enlazadas 10 al anticuerpo está determinada por lo proporción de adición de DOTA.
[Tabla 2]
- Proporción de adición de anticuerpo con respecto a DOTA
- N.º prom. de DOTA de modificación
- PPMX2025 (proporción de adición 1:1)
- 0,9
- PPMX2025 (proporción de adición 1:3)
- 2,0
- PPMX2025 (proporción de adición 1:10)
- 5,3
- PPMX2016 (proporción de adición 1:1)
- 0,7
- PPMX2016 (proporción de adición 1:3)
- 2,1
- PPMX2016 (proporción de adición 1:10)
- 5,2
- PPAT-052-27c (proporción de adición 1:3)
- 1,8
- (Nota) PPAT-052-27c se analizó solo a una proporción de adición de 1:3.
(3) Preparación de anticuerpos marcados con 67Ga-, 111In-o 90Y 15
(i) Marcaje con 67Ga o 111In
Cada uno de los anticuerpos purificados PPMX2016, PPMX2025, PPMX2029 y PPAT-052-27c, y el anticuerpo PPAT-052-28c, se disolvió en un tampón (acetato de amonio-HCl 0,25 M, pH: 5,5) hasta una concentración de 20 6 mg/ml. Se añadió una solución de 67GaCl3 (producto de Fuji Film RI Pharma) o una solución de 111InCl3 (producto de MDS Nordion Inc.) a la solución de anticuerpo y la mezcla se incubó a 45 °C durante una hora.
(ii) Marcaje con 90Y
25 Se disolvió cada uno de los anticuerpos PPMX2029 y PPAT-052-27c purificados en un tampón (acetato de amonio-HCl 0,25 M, pH: 5,5) hasta una concentración de 6 mg/ml. Se añadió una solución de 90YCl3 (producto de Nuclitec) a la solución de anticuerpo y la mezcla se incubó a 45 °C durante una hora.
(iii) Determinación del porcentaje de marcaje
30 Se tomó una muestra de una alícuota de la mezcla de reacción de marcaje y se sometió a cromatografía en capa fina (61885, producto de PALL), para determinar de este modo el porcentaje de marcaje. Se empleó solución salina fisiológica como eluyente y se midió la radioactividad en los extremos de la parte superior e inferior de una tira mediante un contador γ. El porcentaje de marcaje se calculó mediante la siguiente ecuación.
Porcentaje de marcaje = (cuentas del extremo de la parte inferior/(cuentas del extremo de la parte superior + cuentas del extremo de la parte inferior))x100 (%)
40 Cuando el porcentaje de marcaje alcanzó el 90 % o más, el anticuerpo marcado se utilizó en los experimentos posteriores. Los anticuerpos marcados se purificaron en una columna desaladora (PD-10, producto de GE Healthcare, 17-0435-01) con PBS.
45 Ejemplo 11: Investigación de la relación entre el porcentaje de incorporación de quelato y la biodistribución (es decir, distribución en el cuerpo)
Se investigaron PPMX2016, PPMX2025 y PPMX2029 en términos de biodistribución en virtud de la diferencia de los valores del porcentaje de incorporación de quelato (proporción de adición de DOTA de 1:1, 1:3 y 1:10).
50 En primer lugar, se cultivó NCI-H358 en medio RPMI1640 conteniendo SFB al 10 % y las células cultivadas se trasplantaron por vía subcutánea a la región ventral derecha de cada uno de los ratones desnudos (hembras, de 7
15
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