RS57008B1 - Anti-kadherin antitelo obeleženo radioaktivnim metalom - Google Patents

Description

OPIS

OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na radioaktivno anti-P-kadherinsko antitelo obeleženo radioaktivnim metalom, koje se posebno specifično akumulira u ćelijama karcinoma, i na terapeutski agens protiv kancera i agens za dijagnozu kancera, od kojih svaki sadrži antitelo.

STANJE TEHNIKE

[0002] Postoji velika potreba za novom terapijom za lečenje karcinoma, što je sada glavni uzrok smrti. Trenutno su primenjene terapije protiv karcinoma, kao što su hirurška terapija, radioterapija i hemoterapija pomoću sredstava protiv karcinoma). Čak i posle operacije, sredstvo protiv karcinoma se koristi u postoperativnoj terapiji.

[0003] Trenutno korišćeni anti-karcinom agensi uključuju sredstvo za alkilovanje, antimetabolit, alkaloidno sredstvo protiv karcinoma, antibiotsko sredstvo protiv karcinoma i platina agens. Efekti tretmana ovim sredstvima nisu u potpunosti zadovoljavajući. Neki agensi nisu specifični za karcinom i često uzrokuju negativne i neželjene efekte, što je problematično. U takvim okolnostima postoji potreba za razvojem efikasnijih agenasa protiv karcinoma.

[0004] U meĎuvremenu, kadherin je Ca<2+>-zavisan adhezijski molekul koji je izražen na površini ćelije. Primeri poznatih vrsta kaderina uključuju klasične kaderine kao što su E kadherin, N kadherin i P kadherin (CDH3); kao i protokadherin i desmosomalni kadherin. Poznato je da se ovi kadherini vezuju homofilno, kako bi se formirao adherentni spoj i povezao se sa citoskeletnim sistemom (aktinskim filamentima) putem intracelularnog katenina i smatra se da kontrolišu adheziju ćelija takvim mehanizmom.

[0005] Osim adhezije ćelija, kaderin se smatra da se odnosi na embriogenezu, morfogenezu, sinaptogenezu, sinaptičku plastičnost i infiltraciju i metastazu kancera. Prema tome, objavljeno je da je anti-kadherin antitelo korisno za terapiju karcinoma (Patentni dokumenti 1 do 3).

DOKUMENTI PRETHODNE PRAKSE

PATENTNI DOKUMENTI

[0006]

Patentni dokument 1: Japanese Kohyo (PCT) Patent Publication No.2005-522982

Patentni dokument 2: Japanese Kohyo (PCT) Patent Publication No.2008-538909

Patentni dokument 3: Japanese Kohyo (PCT) Patent Publication No.2009-528257

[0007] WO 2010001585 A1 opisuje anti-CDH3 antitela, koja se mogu označiti radioizotopom.

Rezime pronalaska

Problemi koje rešava ovaj pronalazak

[0008] MeĎutim, anti-karcinom efekat anti-kadherin antitela nije zadovoljavajući, a potreba za razvojem potentnijeg terapijskog agensa za karcinom je postojala.

[0009] Prema tome, cilj ovog pronalaska je da obezbedi anti-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom, koje se može u visokom stepenu akumulirati u tkivu kancera. Drugi cilj je da obezbedi terapijski agens za kancer koji sadrži antitelo kao aktivni sastojak i koji pokazuje visok anti-kancer efekat. Još jedan cilj je da obezbedi dijagnostički agens za kancer koji može predvideti efikasnost terapijskog agensa za kancer i potvrditi njegov terapeutski efekat.

NAČINI REŠAVANJA PROBLEMA

[0010] Ovi pronalazači su sproveli opsežne studije za postizanje pomenutih ciljeva i utvrdili da je radioaktivnim metalom označeno anti-P-kadherinsko antitelo u kojem je radioaktivni metalni element vezan za anti-P-kadherin antitelo preko metalnog helatirajućeg reagensa se akumulira specifično u tkivu kancera životinje koja ima kancer i da je njegov antikancer efekat izuzetno poboljšan u poreĎenju sa primenom neobeleženog anti-P-kadherin antitela. Ovaj pronalazak je ostvaren na osnovu ovih nalaza.

[0011] U skladu s tim, ovaj pronalazak obezbedjuje antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom koje se dobija vezivanjem radioaktivnog metalnog elementa za anti-P-kadherin antitelo preko reagensa za helatiranje metala, pri čemu anti-P-kadherin antitelo je monoklonsko antitelo ili rekombinantno antitelo koje proizvodi ćelija za proizvodnju antitela predstavljena pristupnim brojem NITE BP-897, NITE BP-899, NITE BP-1048, NITE BP-1049 ili NITE BP-1050, ili vezujući P-kadherin fragment bilo kog od ovih antitela i terapijskog agens protiv kancera i agensa za dijagnostiku kancera koje svako sadrži kao aktivni sastojak anti-P-kadherin antitelo označeno radioaktivnim metalom.

[0012] Ovaj pronalazak takoĎe obezbeĎuje anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom za upotrebu u lečenju ili dijagnozi kancera.

[0013] Ovaj pronalazak takoĎe obezbeĎuje upotrebu anti-P-kadherin antitela obeleženog sa radioaktivnim metalom radi dobijanja terapeutskog agensa protiv kancera ili agensa za dijagnostiku kancera.

EFEKTI PRONALASKA

[0014] Terapijski agens protiv kancera iz ovog pronalaska, koji sadrži kao aktivni sastojak, anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom, visoko se akumulira u tkivu karcinoma i pokazuje visok uticaj na smanjenje kanceroznog tkiva. Prema tome, pomoću terapijskog agensa protiv kancera, terapija kancera može se efikasno izvoditi bez negativnih neželjenih efekata. TakoĎe, pomoću dijagnostičkog agensa ovog pronalaska, može se predvideti efikasnost terapijskog agensa protiv cancera prema ovom pronalasku i njegov terapeutski efekat se može potvrditi.

Kratak opis crteţa

[0015]

[Sl. 1] Grafikoni koji pokazuju rezultat afiniteta antitela procenjenih protočnom citometrijom.

[Sl. 2] Bio-distribucija<67>Ga-DOTA-PPMKS2016 antitela (odnos dodavanja 1:10) 96 časova nakon primene.

[Sl. 3] Bio-distribucija<67>Ga-DOTA-PPMKS2016 antitela (odnos dodavanja 1:3) 96 časova nakon primene.

[Sl. 4] Bio-distribucija<67>Ga-DOTA-PPMKS2029 antitela (odnos dodavanja 1:10) 96 časova nakon primene.

[Sl. 5] Bio-distribucija<67>Ga-DOTA-PPMKS2029 antitela (odnos dodavanja 1:3) 96 časova nakon primene.

[Sl. 6] Bio-distribucija<67>Ga-DOTA-PPMKS2025 antitela (odnos dodavanja 1:10) 96 časova nakon primene.

[Sl. 7] Bio-distribucija<67>Ga-DOTA-PPMKS2025 antitela (odnos dodavanja 1:3) 96 časova nakon primene.

[Sl. 8] Bio-distribucija antitela<67>Ga-DOTA-PPMKS2025 u slučaju dodatnog antitelo-DOTA odnosa 1:1, 1:3 i 1:1096 časova nakon primene.

[Sl. 9] Bio-distribucija<111>In-DOTA-PPAT-052-27c antitela (odnos dodavanja 1:3) 96 časova nakon primene.

[ŠSl. 10] Bio-distribucija<111>In-DOTA-PPAT-052-27c antitela (odnos dodavanja 1:3) 48 sati nakon primene.

[Sl. 11] Bio-distribucija<111>In-DOTA-PPAT-052-28c antitela (odnos dodavanja 1:3) 48 sati i 96 sati nakon primene.

[Sl. 12] Antitumorski efekat antitela<90>Y-DOTA-PPMKS2029 (odnos dodavanja 1:3) u ksenograft modelu.

[Sl. 13] Antitumorski efekat<90>Y-DOTA-PPAT-052-27c antitela (odnos dodavanja 1:3) u ksenograft modelu.

[Sl. 14] Fotoimimidži koji pokazuju rezultate imunohistohemijskog bojenja za potvrĎivanje ekspresije CDH3 proteina.

Načini izvoĎenja pronalaska

[0016] Anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom ovog pronalaska, je obeleženo anti-P-kadherin antitelo za koje se radioaktivni metalni element vezuje preko reagensa za helatiranje metala. Terapeutski agens protiv kancera ili dijagnostički agens za kancer sadrži anti-P-kadherin antitelo obeleženo radioaktivnim metalom.

[0017] Anti- P-kadherin antitelo se specifično vezuje za P kadherin.

[0018] Anti- P-kadherin antitelo je monoklonsko antitelo ili poliklonsko antitelo.

[0019] Prema ovom opisu tip anti-P-kadherin antitela nije posebno ograničen, i mogu biti na odgovarajući način upotrebljena antitela kao što su antitelo miša, ljudsko antitelo, antitelo pacova, antitelo zeca, antitelo ovaca, antitelo kamile i antitelo pilića; i genom rekombinantna antitela koja su namerno modifikovana kako bi se smanjila hetero-antigenost prema čoveku, kao što je himerno antitelo i humanizovano antitelo. Rekombinantno antitelo može se proizvoditi poznatom metodom. Himerno antitelo je antitelo formirano od varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca antitela sisara, osim humanog antitela, na primer antitela miša i konstantnih regiona teškog lanca i lakog lanca humanog antitela i može biti proizvedeno povezujući DN fragment koji kodira varijabilni region antitela miša sa DN fragmentom koji kodira konstantni region humanog antitela, inkorporirajući rezultujući fragment u ekspresioni vektor i inkorporirajući vektor u ćelije domaćina vidi, na primer, Cabilli S Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1984, 81 (21), 6851-5, et al., Proc. i otvorena evropska patentna prijava br. 171496). Humanizovano antitelo, koje se naziva i preoblikovano antitelo, je antitelo proizvedeno transplantacijom regiona za odreĎivanje komplementarnosti (CDR) antitela sisara, različitog od humanog antitela, npr. antitela miša u CDR humanog antitela i tehnike rekombinacije gena su opšte poznate. Konkretno, sekvenca DNK koja uključuje CDR antitela miša povezanog sa okvirnim regionom (FR) humanog antitela se sintetiše putem PCR koristeći nekoliko oligonukleotida koji se proizvede da imaju prekriveni deo na kraju istog. Tako dobijeni DNK fragment je povezan sa DNA fragmentom koji kodira konstantni region ljudskog antitela, zatim se rezultujući fragment inkorporira u ekspresioni vektor i vektor se inkorporira u ćelije domaćina kako bi se time proizvelo humanizovano antitelo (vidi EP239400 A i WO 96/02576 A). FR humanog antitela povezan preko CDR je izabran iz FR-ova koji imaju CDR koji formira pogodno mesto za vezivanje antigena. Ako je potrebno, aminokiselina u FR varijabilnog regiona antitela može biti supstituisana tako da CDR humanizovanog antitela formira adekvatno mesto za vezivanje antigena (Sato, K. et al., Cancer Res., 1993, 53 , 851-856).

[0020] minokiselinska sekvenca himernog antitela ili humanizovanog antitela poželjno ima identitet od 100% u odnosu na region VH ili VL cDNK koji eksprimira deponovan hibridom. Zbog genetske modifikacije, takoĎe je poželjno antitelo koje ima identitet u amino kiselinskoj sekvenci od 90% ili više. U procesu humanizacije ili himerizacije, konvencionalno je izvršena takva kontrolisana supstitucija ostataka radi poboljšanja vezivanja za antigen. Takvo antitelo koje ima delimično modifikovanu sekvencu u suštini se smatra antitelo koje potiče iz originalnog hibridoma.

[0021] Metode za proizvodnju himernog antitela i humanizovanog antitela na bazi tehnike genetskog inženjeringa su već poznate. Konkretno, VH i VL sekvence monoklonskog antitela koje služe kao potvrdjena grupa su genetski modifikovane, a potom himerizacija ili humanizacija vrši se putem rutinske tehnike.

[0022] TakoĎe je poznat postupak za oporavak humanog antitela. U jednoj proceduri, ljudski limfociti su senzitovani in vitro sa antigenom koji je interesantan ili sa ćelijama koje eksprimiraju antigen, a tako senzibilizovani limfociti su spojeni sa ćelijama mieloma ćelije, npr. U266, kako bi se proizvelo ljudsko antitelo od interesa koje ima aktivnost vezivanja antigena (vidi JP-B-1989-59878). lternativno, humano antitelo od interesa može se dobiti putem imunizacije transgenske životinje sa antigenom od interesa koji ima potpuni repertoar gena ljudskog antitela (videti WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO96/34096 i WO96/33735). TakoĎe je poznata tehnika za oporavak humanog antitela kroz paniranje pomoću biblioteke ljudskih antitela. U jednoj proceduri, varijabilni region humanog antitela izražava se kao antitelo sa jednim lancem scFv) na površini faga kroz metod fagnog prikaza, a fag koji vezuje antigen može biti odabran. Kroz gensku analizu tako odabranog faga, može se odrediti DNK sekvenca koja kodira varijabilni region humanog antitela koji se vezuje za antigen. Kada je DNK sekvenca scFv koja se vezuje za antigen razjašnjena, može se proizvesti odgovarajući ekspresioni vektor iz sekvence, pri čemu se može oporaviti humano antitelo od interesa. Ove metode su široko poznate videti WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 i WO 95/15388).

[0023] Ova anti-P-kadherinska antitela mogu biti antitela sa niskim molekulom, kao što je fragment antitela, modifikovano antitelo ili slično, sve dok se prepoznaje čitav ili deo proteina kodiranog kadherin genom održavana. Primeri fragmenta antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2, Fv i Diabodi. Takav fragment antitela može biti proizveden konstrukcijom gena koji kodira fragment antitela, inkorporirajući gen u ekspresioni vektor i ekspresiju vektora u odgovarajućim ćelijama domaćina videti, na primer, Co, MS i sar., J. Immunol.

1994) 152, 2968-2976 Better, M., Horvitz, AH, Methods Enzimol., 1989, 178, 476-496; Pluckthun A., Skerra A., Methods Enzimol., 1989, 178, 497-515 Methods Enzimol (1986) 121, 663-669, and Bird, RE and Valker, BV, Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

[0024] Kao modifikovano antitelo može se koristiti antitelo koje je vezano za bilo koji od različitih molekula kao što je polietilen glikol PEG). Takvo modifikovano antitelo može biti proizvedeno hemijskom modifikacijom dobijenog antitela. Tehnika modifikacije antitela je već poznata u struci.

[0025] U ovom pronalasku, može se takoĎe koristiti antitelo sa modifikovanim šećernim lancem za pojačanje citotoksične aktivnosti. Tehnike modifikacije šećernog lanca u antitelu već su poznate npr., WO 0061739 i WO 02/31140).

[0026] Anti-P-kadherin antitelo ovog opisa takoĎe obuhvata multi-specifično antitelo koje ima specifičnost za dva ili više različitih antigena. Tipičan primer takvog molekula može biti jedan koji može vezati dva antigena (tj. bi-specifično antitelo). "Multispecifično antitelo" iz ovog pronalaska obuhvata antitelo koje ima specifičnost dva ili više na pr. tri) antigena. Multispecifično antitelo može biti antitelo u punoj dužini ili fragment takvog antitela (npr., F (ab') 2 bi-specifičnog antitela).

[0027] Anti-P-kadherin antitelo prema ovom pronalasku i P-kadherin antitela vezivni fragment može se proizvesti putem bilo koje pogodne metode kao što su in vivo, kultivisane ćelije, in vitro reakcija prevoĎenja i sistem za ekspresiju rekombinantne DNK.

[0028] Tehnike proizvodnje monoklonskih antitela i ćelija za proizvodnju antitela hibridomi) su generalno poznate u tehnici (Campbell, " Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holandija, 1984. i St. Groth et al., J. Immunol, Metode 35: 1-21, 1980). U jednoj specifičnoj proceduri, protein ili njegov fragment koji je kodiran pomoću kadherin gena koji služi kao imunogen je subkutano ili intraperitonealno injektiran za imunizaciju na bilo koju životinju npr. miš ili zec) za koju je poznato da proizvodi antitelo. Kod imunizacije može se koristiti adjuvans, a takav adjuvant je dobro poznat u stanju tehnike.

[0029] Poliklonsko antitelo može biti proizvedeno izolovanjem antitela koja sadrže antiserum od imunizirane životinje i skrininga za prisustvo antitela imajući za cilj specifičnost putem tehnike koja je dobro poznata u struci (npr. ELISA, Western blotting ili radioimunoassai).

[0030] Monoklonsko antitelo može se proizvesti uklanjanjem ćelija slezine imunizirane životinje i spojem ćelija sa ćelijama mieloma, čime se dobijaju hibridomi koji mogu proizvesti monoklonska antitela. Hibridomske ćelije koje proizvode antitelo koje može prepoznati protein od interesa ili njegov fragment može se odabrati na bazi tehnika koje su dobro poznate u struci (npr. ELISA, Western blotting ili radioimunoassai). Zatim, hibridom koji sekretira antitelo od interesa se klonira, a dobijene ćelije se kultivišu pod odgovarajućim uslovima. Tako sekretirano antitelo se dobija i prečišćava putem postupka koji je dobro poznat u struci (npr., hromatografija na jon izmenjivačkoj koloni ili afinitetna hromatografija). U alternativnoj proceduri, humano monoklonsko antitelo može biti proizvedeno korišćenjem soja ksenomusa (videti Green, J. Immunol, Methods 231: 11-23, 1999, i Wells, Eek, Chem Biol, 2000 Aug, 7 (8 ): R185-6). Trenutno se vrši proizvodnja monoklonskih antitela zasnovanih na fagnom displeju koji ne uključuje imunizaciju. Monoklonsko antitelo ovog pronalaska je antitelo monomolekularnog tipa proizvedeno od strane jednih vrsta ćelija za proizvodnju antitela ili dobijenog od njega fragmenta DNK i kodiranje antitela. Monoklonsko antitelo može biti proizvedeno putem bilo koje od gore pomenutih metoda.

[0031] DNK fragment koji kodira monoklonsko antitelo može se lako izolovati i sekvencirati kroz rutinsku metodu (npr. pomoću oligonukleotidne sonde koja se može specifično vezati za gene koji kodiraju teški lanac i laki lanac monoklonskih antitela). elija hibridoma je poželjni početni materijal za proizvodnju takvog fragmenta DNK. Posle izolacije, takav fragment DNK se ubacuje u ekspresioni vektor, a vektor je rekombinovan u ćelije domaćine kao što su ćelije E. coli, COS ćelije majmuna, ćelije jajnika kineskog hrčka CHO) ili ćelije mieloma u kojima se ne proizvodi imunoglobulin, osim ako su ćelije transformisane. Monoklonsko antitelo od interesa proizvode rekombinantne ćelije domaćina. U alternativnom režimu, antitelo ili fragment antitela može se izolovati iz biblioteke faga antitela proizvedene tehnikom McCafferti et al. (Nature 348: 552-554 (1990)).

[0032] elija domaćin koja se koristi za ekspresiju monoklonskih antitela poželjno je ćelija domaćina sisara. Bira se ćelija domaćin koja je najpogodnija za ekspresiju monoklonskog antitela. elija domaćin nije ograničena, tipični primeri obuhvataju ćelijsku liniju sa CHO poreklom ćelija jajnika kineskog hrčka), CV1 bubreg majmuna), COS CV1 derivat koji izražava SV40T antigen), SP2 0 mišićni mielom), P3 63-Ag3.653 mišićni mielom), 293 (ljudski bubreg) i 293T (293 derivat koji eksprimira SV40T antigen). Sistem ćelija domaćina može se dobiti komercijalno iz zbirke američke kulture tkiva TCC) ili organizacije koja je objavila relevantni dokument.

[0033] elija domaćina je poželjno ćelijska linija sa poreklom iz CHO-iz kojeg dolazi dhfr gen (brisanje ekspresije dhfr gena) ili SP2 / 0 (videti Urland, G. et al., Effect of gamma rays at the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions; Somat. Cell. Mol. Genet. Vol.

12, 1986, p. 5555-566; and Schulman, M. et al., A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies, Nature Vol. 276, 1978, p. 269-270). elija domaćin je poželjnije DHFR-izbrisani CHO. Transfekcija plazmida u ćelije domaćina može se obaviti bilo kojom tehnikom. Tehnika transfekcije nije ograničena, a specifični primeri uključuju transfekciju uključujući metod kalcijum fosfata, DE E metod, lipofekcija i elektroporacija), inkorporiranje DNK pomoću envelope (npr. Virus Sendai), mikro-injekcije i infekcije pomoću vektor virusa (npr. retrovirusni ili adenovirusni) vektor (videti Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9 Introduction of DNA into Mammalian Cells, John Wiley and Sons, Inc.). MeĎu njima je naročito poželjno uvoĎenje plazmida u ćelije domaćina putem elektroporacije.

[0034] Mesto prepoznavanja u kadherinu anti-P-kadherin antitela iz ovog pronalaska je poželjno region od 1 do 655 SEQ ID NO: 2.

[0035] Anti-P-kadherin antitelo prema ovom pronalasku se poželjno proizvodi od hibridoma PPMX2016 ili PPMX2029 ili transgenske CHO ćelijske linije PPAT-052-27c, PPAT-052-28c ili PPAT-052-29c. U sadašnjoj specifikaciji, brojevi vezani za PPMX ili PP T daju se ili odgovarajućim ćelijama koje proizvode ćelije ili antitela proizvedenih od strane ćelija za proizvodnju antitela.

[0036] Radioaktivni metal koji je vezan za anti-P-kadherin antitelo je poželjno citotoksični radioaktivni metal kada se radioaktivnim metalom obeleženo anti-P-kadherin antitelo koristi kao terapijski agens za kancer i ne-citotoksični radioaktivni metal kada se anti-P-kadherinsko antitelo obeleženo radioaktivnim metalom koristi kao sredstvo za dijagnostiku karcinoma.

[0037] Primeri citotoksičnog radioaktivnog metala uključuju itrijum-90 (<90>Y), renijum-186 (<186>Re), renijum-188 (<188>Re), bakar-67 (<67>Cu), gvožĎe-59 (<59>Fe), stroncijum-89 (<89>Sr), zlato-198 (<198>u), živa-203 (<203>Hg), olovo-212 (<212>Pb), disprozijum-165 (<165>Dy), rutenijum-103 (<103>Ru), bizmut-212 (<212>Bi), bizmut-213 (<213>Bi), holmijum-166 (<166>HO), samarijum-153 (<153>Sm), i lutecijum-177 (<177>Lu).

[0038] Od ovih radioaktivnih metala,<90>Y,<153>Sm i<177>Lu su poželjni, sa stanovišta poluživota, energije zračenja, lakoće reakcije obeležavanja, procenta obeležavanja, kompleksne stabilnosti itd.

[0039] Ne-citotoksični radioaktivni metal koji je pogodno korišćen u dijagnostičkom agensu za karcinom nije ograničen i primeri uključuju tehnecijum-99m (<99m>Tc), indijum-111 (<111>Yn), indijum-113m (<113m>In), galijum-67 (<67>Ga) , kobalt-57 (<57>Co), kobalt-58 (<58>Co), kobalt-60 (<60>Co), stronijum-85 (<85>Sr), galijum-68 (<68>Ga) živa-197 (<197>Hg) i bakar-64 (<64>Cu).

[0040] Za vezivanje radioaktivnog metalnog elementa na anti-P-kadherin antitelo, u poželjnom režimu, reagens koji reaguje na metale reaguje sa anti-P-kadherin antitelom, a proizvod dalje reaguje sa radioaktivnim metalnim elementom , čime se formira kompleks. U tako proizvedenom modifikovanom antitelu, radioaktivni metalni element je vezan za anti-P-kadherin antitelo preko reagensa za heliranje metala.

[0041] Primeri reagensa za heliranje metala za formiranje takvog kompleksa uključuju 1) derivate hinolina kao što su 8-hidroksikinolin, 8-acetoksihinolin, 8-hidroksikinalni, oksikinolin sulfat, O-acetiloksin, O-benzoiloksin, O-p-nitrobenzoiloksin i jedinjenja kinolona koji imaju kinolinski skelet (npr. norfloksacin, oflokacin, enoksacin, ciprofloksacin, lomefloksacin, tosfloksacin, flerokacin i sparfloksacin); 2) jedinjenja kao što su kloranilinska kiselina, aluminon, tiourea, pirogalol, kupferon, bizmutiol (II), galoil gallna kiselina, tiolid, 2-merkaptobenzotiazol i tetrafenilarzonijum hlorid; (3) etilendiaminetetraocetne kiseline (EDTA), dietilenetriaminpentaocetne kiseline (DTPA) i sastojci koji imaju sličan skelet (dihidroksietilglicin, diaminopropanolt tracetatna kiselina, etilendiamin diocetna kiselina, hidrohlorid etilendiamindipropionske kiseline, etilendiaminetetrikis (metilensulfonska kiselina), glikol eter diaminetetraocetna kiselina, heksametilendiaminetetraocetna kiselina, hidroksietilindiocetna kiselina, imidodiocetna kiselina, diaminopropanetetraocetna kiselina, nitrilotriocetna kiselina, nitrilotripropionska kiselina, trisodiumova nitrilotis (metilensulfonska kiselina), trietilenetetraminheksaocetna kiselina, metil DTPA, cikloheksil DTPA, aminobenzil EDTA, izotiocijanobenzil EDTA, izotiocijanobenzil DTPA, metilizotiocijanobenzil DTPA, cikloheksilizotiocijanobenzil DTPA, maleimidopropilamidobenzil EDTA, maleimidopentilamidobenzil EDTA, maleimidodecilamodobenzil EDTA, maleimidopentilamidobenzil DTPA i maleimidodecilamidobenzil DTPA); i (4) 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-1,4,7,10-tetra acetatne kiseline (DOTA), 1,4,7-triazaciklononan-1,4,7-triacetne kiseline (NOTA), 1, 4,8,11-tetraazaciklotetradekan-1,4,8,11-tetraocetna kiselina (TETA), 1,4,7,10-tetraazaciklo dodekan (Ciklen), 1,4,8,11-tetraazaciklotetradekan (Ciklam), izotiocijanobenzil DOTA , i izotiocijanobenzil NOTA.

[0042] MeĎu ovim reagensima koji reaguju na metale, izotiocijanobenzil DOT , metilizotiocijanobenzil DTP , preferirani su cikloheksilizotiocianobenzil DTP , sa stanovišta jednostavne reakcije inkorporacije metal-helata u antitelo, procenta obeležavanja, kompleksne stabilnosti itd.

[0043] Radioaktivni metalni element može biti vezan za anti-P-kadherin antitelo putem rutinskog postupka. U jednoj proceduri reagens koji helatira metale reaguje sa anti-P-kadherin antitelom, čime se dobija prethodnik markera, a prethodnik reaguje sa radioaktivnim metalnim elementom.

[0044] U terapijskom agensu protiv kancera i dijagnostičkom agensu za cancer prema ovom pronalasku, odnos prema molu anti-P-kadherin antitela prema reagensu koji helatira metal važan je za akumulaciju u ćelijama karcinoma i efektu protiv karcinoma. Molski odnos (anti-P-cadherin antitelo: helatni reagens) je poželjno 1:0,1 do 1:4.5, poželjnije 1:0.5 do 1:3. Da bi se postigli takvi odnosi molova, anti-P-kadherin antiteli i helatni reagens poželjno je dodati da reaguju u odnosu 1:0.1 do 1:manje od 5, naročito poželjno 1:1 do 1:3. Broj molekula helata prema anti-P-kadherin antitelu može se izračunati merenjem molekulske težine kroz MALDI-TOF masenu analizu ili slične tehnike i uporeĎivanjem molekulske težine nemodifikovanog antitela sa modifikovanim antitelima (US Patent Publication No.

7514078, Lu et al., J. Pharm. Sci., 94 (4), 2005, str.788-797, i Tedesco et al., J. Clin. Onco, 23 (16S), 2005, 4765). Alternativno, broj molekula helata prema anti-P-kadherin antitelu može se odrediti pomoću helatometrijske titracije. Jedna poznata metoda koristi kolorimetrijski reagens alkalno zemnog metala (arsenazo III) (Bradir et al., Nucl. Med. Biol., 31, 795-802, 2004, i Dadachova et al., Nucl. Med. Biol., 26, 977- 982, 1999).

[0045] Terapeutski agens protiv kancera ili dijagnostički agens kancera ovog pronalaska mogu se obezbediti kao obeležena formulacija ili formulacija kompleta koja sadrži oznaku prekursora. U ovom pronalasku se može koristiti bilo koja formulacija. U slučaju obeležene formulacije, terapeutski agens protiv kancera ili dijagnostički agens kancera koji sadrži označeno anti-P-kadherin antitelo može se primenjivati kao što je. U slučaju formulacije kompleta, sredstvo se može primeniti nakon obeležavanja sa radioaktivnim metalnim elementom od interesa.

[0046] Anti-P-kadherin antitelo koje sadrži radioaktivni metalni element koji je vezan za njega visoko se akumulira u kanceroznom tkivu i pokazuje visoku aktivnost toksičnih ćelija kancera. Tako, antitelo je korisno terapijsko sredstvo protiv kancera koje manje šteti tkivo osim tkiva cancera i koje ima visoku sigurnost. TakoĎe, anti-P-kadherin antitelo koje sadrži radioaktivni metalni element koji je vezan za njega ima aktivaciju protiv kancera izuzetno veću od one odgovarajućeg anti-P-kadherin antitela. Aktivnost protiv kancera je izuzetno visoka, naročito kada je molski odnos antitela prema helatnom agensu 1:0.1 do 1:4.5.

[0047] Terapeutski agens protiv kancera prema ovom pronalasku može se koristiti u kombinaciji sa drugim anti-kancer agensom. Primeri takvog sredstva protiv kancera uključuju sredstvo za alkilovanje, antimetabolit, inhibitor mikrotubule, antibiotski anti-kancer agens, inhibitor topoizomeraze, platina agens, lek za molekularni cilj, hormonsko sredstvo i biologike. Primeri alkilacionog sredstva uključuju sredstva protiv kancera tipa azotni mustard (npr., Ciklofosfamid), sredstva protiv kancera tipa nitrosourea (npr., ranimustin) i dakarbazin. Primeri antimetabolita uključuju 5-FU, UFT, karmofur, kapecitabin, tafur, TS-1, gemcitabin i citarabin. Primeri inhibitora mikrotubula uključuju alkaloidne anti-kancer agense (npr., Vinkristin) i taksanske anti-kancer agense (npr. docetaksel i paklitaksel). Primeri antibiotskog anti-kancer agensa uključuju mitomicin C, doksorubicin, epirubicin, daunorubicin i bleomicin. Primeri inhibitora topoizomeraze uključuju irinotekan i nogitecan koji imaju inhibitorsku aktivnost topoizomeraze I i etopozid koji ima inhibitorsku aktivnost topoizomeraze II. Primeri platinskog sredstva uključuju cisplatin, paraplatin, nedaplatin i oksaliplatin. Primeri leka molekularnog cilja uključuju trastuzumab, rituksimab, imatinib, gefitinib, erlotinib, bevacizumab, bortezomib, sunitinib i sorafenib. Primeri hormonskog agensa uključuju deksametazon, finasterid i tamoksifen. Primeri biologika uključuju interferone α, β i γ i interleukin 2.

[0048] Terapeutski agens protiv kancera prema ovom pronalasku može se koristiti u kombinaciji sa terapijom kancera. Primeri terapije kancera uključuju hirurgiju, terapiju zračenja uključujući terapiju gama nožem, terapiju Cyber nožem, terapiju borom za absorpciju neutrona i protonski zraci terapija teškim jonima), ultrazvučnu hirurgiju voĎenu sa MR, krioterapiju, radiofrekventnu ablaciju, terapiju perkutanog ubrizgavanja etanola i emboloterapiju.

[0049 ]Terapeutski agens protiv kancera prema ovom pronalasku je efikasan na različitim kancerima sisara uključujući i čoveka). Primeri ciljanog kancera uključuju karcinome kao što su faringealni kancer, laringealni kancer, kancer jezika, kancer pluća, kancer dojke, kancer ezofaga, kancer želuca, kolorektalni kancer, kancer materice, kancer jajnika, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer žučne kese, kancer bubrega , kancer prostate, maligni melanom i kancer tiroidne žlezde; i sarkom kao što su osteosarkom, hondrosarkom, rabdomiosarkom, leiomiosarkom, lipozerkom, angiosarkom, fibrosarkom, leukemija, maligni limfom i mijelom.

[0050] Terapijski agens protiv kancera ovog pronalaska može se rastvoriti u vodenom rastvoru, poželjno fiziološki prilagodljivom puferu kao što je Hanksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki rastvor u puferu. TakoĎe, terapeutsko sredstvo može imati oblik suspenzije, rastvora, emulzije ili slično u masnom ili vodenom nosaču.

1

[0051] Doziranje terapijskog agensa protiv kancera prema ovom pronalasku, varira u skladu sa simptomom, načinom primene, telesnom težinom, godinama starosti itd. pacijenta kojem je to potrebno, poželjno je, na primer, 37 do 3700 MBq za jedan tretman odraslih.

[0052] Terapijski agens protiv kancera ovog pronalaska se generalno daje parenteralno. Na primer, terapijski agens protiv kancera se injektira (npr., subkutano, intravenozno, intramuskularno, intraperitonealno) ili se primenjuje transdermalno, transmukosalno, transnasalno, transplumonično, itd.

[0053] Dijagnostički agens kancera ovog pronalaska može se koristiti u snimanju tumora. U slučaju kada pacijent ima tumor u kojem je izražen protein CDH3, dijagnostički agens tumora iz ovog pronalaska se akumulira u tumoru. Tako se tumor može snimiti otkrivanjem zračenja pomoću aparata kao što je kompjuterski tomograf sa singl fotonskom emisijom (SPECT), pozitron emisionim tomografom (PET) ili scintilacionom kamerom. Na primer, upotrebom dijagnostičkog agensa kancera prema ovom pronalasku, terapijski efekat terapijskog agensa protiv kancera ovog pronalaska može se predvideti pre davanja terapijskog agensa. Dijagnostički agens se daje pacijentu pre lečenja i tumor se snima. Kada se observira visoka akumulacija, superiorni efekat terapijskog agensa može se predvideti kao snažan. Dijagnostički agens se može koristiti za odreĎivanje terapijskog efekta. Dijagnostički agens ovog pronalaska se daje pacijentu koji je primio terapiju sa terapijskim agensom ovog pronalaska ili bilo kojim drugim tretmanom kako bi se snimio tumor. Kroz monitoring vremenski zavisne varijacije u akumulaciji dijagnostičkog agensa, može se posmatrati ekspanzija ili skupljanje tumora tokom vremena.

[0054] ntitelo za upotrebu kao dijagnostički agens poželjno prepoznaje epitop konkurentan terapijskom agensu. Još poželjnije, antitelo prepoznaje isti epitop kao onaj koji prepoznaje terapeutski agens. Najpoželjnije, terapeutsko sredstvo i dijagnostički agens su isto antitelo.

[0055] Dijagnostički agens kancera ovog pronalaska se generalno subjektu primenjuje intravenozno. MeĎutim, dijagnostički agens za kancer može takoĎe biti primenjen arterijalno. Doziranje istog, varira u skladu sa simptomom, načinom primene, telesnom težinom, starošću, itd. pacijenta kojem je to potrebno, poželjno je, na primer, 37 do 1120 MBq za jedan tretman odrasle osobe.

Primeri

[0056] Ovaj pronalazak će se detaljnije opisati na primerima, koji se ne smeju tumačiti kao ograničavajući istog. Pronalazak je definisan sa priloženim patentnim zahtevima.

Primer 1: Proizvodnja rastvorljivog CDH3 antigena

[0057] Rastvorljivi CDH3 (sCDH3) protein u kome je C-terminal transmembranski region bio izbrisan je proizveden da služi kao imunogen za proizvodnju anti-CDH3 antitela.

(1) Proizvodnja rastvorljivog CDH3 antigen ekspresionog vektora

[0058] PCR je obavljen korišćenjem CDH3 cele dužine cDN kao šablona i naprednog prajmera (SEQ ID NO: 3: CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT, (hCDH3FullFV)) i obrnutog prajmera (SEQ ID NO: 4: CCGTCTAGATAAC-CTCCCTTCCAGGGTCC, (hCDH3SolbRV)), koji su projektovani tako da pojačavaju segment koji odgovara ekstracelularnom regionu CDH3 (1-654 u SEK ID NO: 2, u daljem tekstu sCDH3cDNA). Reakcija je izvedena korišćenjem KOD-Plus (proizvod Toyobo) i pod sledećim uslovima: 94° C-15 sek, 55 °C-30 sek i 68° C-90 sek (30 ciklusa)).

[0059] Nakon završetka PCR reakcije, reakciona smeša je podvrgnuta elektroforezi agaroznog gela, a gel komad koji sadrži traku cljne dimenzije (oko 2.0 kbp) je isečen. Ciljna sCDH3cDNA je dobijena iz gel komada pomoću kompleta za QIA brzu ekstrakciju gela (proizvod Quiagen).

[0060] Da bi se sCDH3cDNA ubacila u ekspresioni vektor pEF4/ myc-HisB, sCDH3cDNA je tretiran sa dva restrikciona enzima KpnI i Ksbal. Tako dobijeni fragment je ubačen u pEF4/ myc-HisB koji je tretiran sa istim restrikcionim enzimima KpnI i Ksbal, korišćenjem T4 DNK ligaze kroz rutinsku tehniku, pri čemu se dobija ekspresioni vektor pEF4-sCDH3-myc-His .

(2) Ekspresija rastvorljivog CDH3 proteina

[0061] Prema protokolu reagensa za transfekciju FuGENE6, 8 X 10<5>CHO ćelija je inokulisano u posudi prečnika 10 cm na dan pre transfekcije, a ćelije su kultivisane preko noći. Nakon toga, ekspresioni vektor pEF4-sCDH3-myc-His (8 µg) i FuGENE6 regent (16 µL) pomešani su sa sredstvom RPMI 1640 bez seruma (400 µL) i smeša je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 15 minuta. Dobijena smeša je dodata u tečnost ćelijske kulture za transfekciju. Dva dana nakon transfekcije, kloniranje se vršilo ograničavajućim razblaženjem pomoću selektivnog reagensa (Zeocin).

[0062] Rastvorljive CHO-ćelije koje eksprimiraju CDH3 su odabrane putem Western blotovanja pomoću anti-c-Myc monoklonalnog antitela (proizvod SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). elijske linije koje su pokazale visok nivo sekrecije u supernatantu i visoku proliferaciju kulture, odabrane su da bi se dobila rastvorljiva CDH3-ekspresirajuća CHO ćelijska linija EXZ1702). Tako odabrane rastvorljive CDH3-ekspresujuće CHO ćelije (EXZ1702) su kultivisane 72 sata u tri valjkaste bočice (svaka oblast kulture: 1500 cm<2>) sa sredstvom za čišćenje CHO-S-SFM-II (333 ml/bočica) bez seruma (proizvod Invitrogen), a supernatanti kulture su oporavljeni. Tako dobijeni supernatant kulture podvrgnut je afinitetnoj hromatografiji pomoću HisTrap registrovana robna marka) HP kolone (proizvod GE Healthcare Bio-science) i gelske filtracione hromatografije pomoću Superde (registrovana robna marka) 200 pg kolone (proizvod kompanije GE Healthcare Bioscience), čime se dobija rastvorljivi CDH3 protein.

Primer 2: Uspostavljanje CHO ćelijske linije ekspresije CDH3

[0063] Za dobijanje ćelijske linije za skrining anti-CDH3 antitela, utvrĎena je CHO ćelijska linija koja ekspresira CDH3 pune dužine.

(1) Izrada vektora ekspresije CDH3 gena

[0064] Za unošenje humanog CDH3 DNK pune dužine predstavljene sa SEQ ID NO: 1 u ekspresioni vektor sisara pEF4/myc-HisB (proizvod Invitrogen), ljudska CDH3 DNK pune dužine tretirana je sa dva restrikciona enzima KpnI (proizvod Takara Bio Inc.) i Xbal (proizvod kompanije Takara Bio Inc.) na 37 ° C tokom jednog sata. Tako dobijeni fragment je ubačen u pEF4 myc-HisB koji je tretiran sa istim restrikcionim enzimima KpnI i Xbal, koristeći T4 DNK ligazu proizvod Promega) putem rutinske tehnike, pri čemu ekspresioni vektor pEF4-CDH3-myc-His je proizveden.

(2) Akvizicija stabilne linije ekspresije CDH3

[0065] Prema protokolu FuGENE-a (registrovana robna marka) 6 transfekcioni reagens (proizvod Roche Diagnostics K.K.), 8 X 10<5>CHO ćelija je inokulirano u posudu prečnika 10 cm na dan pre transfekcije, a ćelije su kultivisane preko noći. Nakon toga, vektor ekspresije pEF4-CDH3-myc-His (8 µg) i regener FuGENE6 (16 µL) pomešani su sa sredstvom RPMI 1640 bez seruma (proizvodom SIGMA-ALDRICH) (400 µL) i smeša je puštena da bude na sobnoj temperaturi 15 minuta. Dobijena smeša je dodata u tečnost ćelijske kulture za transfekciju. Dva dana nakon transfekcije, kloniranje se vršilo ograničavajućim razblaženjem pomoću selektivnog reagensa Zeocin).

[0066] Klonovi CDH3 pune dužine koji su ekspresija CHO su izabrani putem Western blotiranja pomoću anti-c-Myc monoklonskog antitela (proizvod SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). Kao rezultat, CDH3 celokupna ekspresivna CHO ćelijska linija (EXZ1501) je izabrana kao ćelijska linija koja je pokazala visok nivo ekspresije i visoku proliferaciju. Reakcija izmeĎu EXZ1501 i komercijalnog anti-CDH3 antitela (proizvod R & D SYSTEMS) potvrĎena je protočnom citometrijom. To jest, potvrĎena je ekspresija CDH3 proteina na ćelijskoj membrani EXZ1501.

Primer 3: Izrada anti-CDH3 monoklonalnog antitela

(1) Proizvodnja monoklonskih antitela upotrebom rastvorljivog CDH3 proteina kao imunogena

[0067] Rastvorljivi CDH3 protein (50 µg) rastvoren u fiziološkom rastvoru pomešan je sa jednakom količinom Titer-MAX Gold (registrovani zaštitni znak) proizvod Titer Ma ), i smeša je intraperitonealno i subkutano injektirana u miševima MRL lpr Japan SLC inc.) za inicijalnu imunizaciju. Kasnije procedure imunizacije vršene su intraperitonalno i subkutano ubrizgavanjem, miševima, mešavine rastvorljivog CDH3 proteina (25 µg) i Titer-MAX Gold pripremljenog na isti način. Tri dana nakon finalne imunizacije, ćelije slezine miševa su pripremljene u aseptičkim uslovima i ćelije su spojene sa ćelijama mieloma miševa SP2 O-Ag14 ili P3-X63-Ag8.653 koristeći opšti postupak polietilen glikola.

(2) Izbor hibridoma koji proizvode anti-CDH3 antitelo

[0068] Selekcija anti-CDH3 antitela je izvršena kroz protočnu citometriju pomoću celokupne linije CDH3-ekspresije CHO ćelijske linije EXZ1501).

[0069] Konkretno, CDH3-ekspresujuće CHO ćelije EXZ1501) pune dužine su uklonjene sa ploče za kulturu tretiranjem sa 2mM EDTA-PBS i suspendovane u F CS rastvoru do koncentracije ćelija od 1 X 10<6>ćelija mL. Suspenzija ćelije je inokulirana na ploči sa 96

1

udubljenja do koncentracije od 50 µL/udubljenju, i dodan je supernatant kulture hibridoma, praćen reakcijom na 4 °C tokom 60 minuta. Ploča je isprana dva puta sa FACS rastvorom (200 µL/udubljenju) i dodan je Alexa Fluor anti-mouse IgG·goat F ab’)2 (proizvod Invitrogen) sa oznakom 488, praćeno reakcijom na 4 °C za 30 minuta. Posle toga, pločica je isprana dva puta sa FACS rastvorom, i izvršena je protočna citometrija, čime bi se odabrali hibridomi koji proizvode antitelo koje se vezuje za CHH ćelije koje eksprimiraju CDH3. Kao rezultat, dobijeno je 40 klonova PPMX2016 do PPAT-052-28. Kroz protočnu citometriju potvrĎeno je da svi hibridomi reaguju sa CDH3-ekspresionim CHO ćelijama (EXZ1501) i NCI-H358, ali ne reaguju sa CHO ćelijama. ntitela su prečišćene od supernatanta kulture hibridoma pomoću kolone proteina G i primenjene u sledećim eksperimentima. PPAT-052-02 (NITE BP-1034), PPAT-052-03 (NITE BP-898), PPMX2029 (NITE BP-898), PPMX2016 (NITE BP-897) 1035), PPAT-052-09 (NITE BP-1036), PPAT-052-24 (NITE BP-1037), PPAT-052-25 (NITE BP-1038), PPAT-052-26 (NITE BP-1039), i PPAT-052-28(NITE BP-1040) su deponovani u saradnji sa Incorporated Administrative Agency, the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japan) u 10.februara, 2010 i 18. januara 2011.

Primer 4: Kloniranje gena antitela

[0070]

(1) DNK fragment koji kodira V-region monoklonskog antitela miša sa humanim CDH3 kloniran je putem sledeće procedure. Citoplazmična RNK je izolovana iz ćelija miševa hibridoma putem postupka opisanog u dokumentu (Gough, "Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells," Analytical Biochemisty, 173, p. 93-95 (1988)), pod uslovom da je umesto pufera za rastvaranje koji je opisan u dokumentu upotrebljen TNE pufer (tj. 25 mM Tris-HCl, pH: 7.5, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH: 8,0). Preciznije, 5 X 10<6>ćelija hibridoma su suspendovane u TPE puferu (200 µL), čime se rastvaraju ćelijske membrane, a ćelijska jezgra su uklonjena centrifugiranjem. U tako dobijen supernatant citoplazme (oko 200 µL), pufer za ekstrakciju (10 mM Tris-HCl, pH: 7.5; 0.35 M NaCI; 1% (w/v) SDS; 10 mM EDTA, pH: 8.0; 7 M urea) 200 µL). Smeša je ekstrahovana sa fenolom i hloroformom. Tako dobijenom RNK rastvoru je dodan glikogen (proizvod Roche, Cat No. 901393) koji služi kao nosač. Zatim je dodat etanol za precipitaciju proizvoda. Precipitat RNK je rastvoren u sterilizovanoj destilovanoj vodi (10 do 50 µL) do koncentracije citoplazme RNK od 0.5 do 2 µg/µL.

(2) Proizvodnja cDNA biblioteke iz RNK pripremljene od hibridoma

[0071] Za sintetizovanje jednostruke cDNK, pripremljena je reakciona smeša 20 µL) koja sadrži gore pripremljenu citoplazmičnu RNK (0.5 do 3 µg), 50 mM Tris-HCl (pH: 8.3, sobna temperatura), 75 mM KCl , 3mM MgCl2i 10mM DTT), slučajni prajmer 100 ng), 0.5mM dNTP i Superscript II (reverzna transkriptaza, proizvod Invitrogen) (200 jedinica). Smeša je inkubirana na 42 °C tokom 50 minuta. Tako-sintetizovana cDN biblioteka je korišćena kao šablon polimerazne lančane reakcije PCR) bez daljeg tretmana.

(3) Amplifikacija gena koja kodira varijabilni region anti-CDH3 antitela putem PCR

[0072] Svi prajmeri koji su korišćeni u eksperimentima su sintetisani od strane Hokkaido System Science Co., Ltd.

A. Prajmeri za primenu u PCR amplifikaciji gena koji kodira L-lanca V-regionmiša [0073] Sledeća dva prajmer skupa su korišćena: i) DNK prajmer koji je na kraju 5' imao homologiju u FR1 delu i 4-set prajmeri koji su na 3' kraju homologiju na J-lanac genu u L-lancu miša i ii) 7-set prajmeri koji imaju na kraju 5' homologiju na L-lanac signalni deo i antisensni prajmer koji ima na kraju 3' homologiju na KC deo (KVL antisensni prajmer). Polimerazna lančana reakcija je izvedena korišćenjem dva prajmera, pri čemu je od cDNA dobijen DNK fragment varijabilnog regiona imunoglobulina L-lanca miša. Prajmer sekvence su sledeće.

(i) 4-set direktni prajmeri za kloniranje varijabilnog regiona L-lanca

[0074] Prema "Phage Display -A Laboratory Manual-, Barbas Burton Scott Silverman," PROTOCOL 9.5, 17 direktnih prajmeria i tri inverzna prajmera sintetizovane su od strane Hokkaido Sistem Science Co., Ltd.

VK direktni (deo FR1)

[0075] Smeša sledećih 17 prajmera je korišćena kao VK direktni prajmer.

5’-GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC-3’ degeneracy 2): SEQ ID NO: 5

5’-GAY ATT GTT CTC WCC CAG TC-3’ degeneracy 4): SEQ ID NO: 6

5’-GAY ATT GTG MTM ACT CAG TC-3’ degeneracy 8): SEQ ID NO: 7


5’ G Y TT GTG YTR ACA CAG TC-3’ degeneracy 8): SEQ ID NO: 8


5’ G Y TT GTR TG CM C G TC-3’ degeneracy 8): SEQ ID NO: 9


5’ G Y TT M G TR MC C G TC-3’ degeneracy 16): SEQ ID NO: 10

5’ G Y TT C G TG YD C G TC-3’ degeneracy 12): SEQ ID NO: 11

5’ G Y TY CAG ATG ACA CAG AC-3’ degeneracy 4): SEQ ID NO: 12

5’ G Y TT GTT CTC WC C G TC-3’ degeneracy 4): SEQ ID NO: 13

5’ G Y TT GWG CTS CC C TC-3’ degeneracy 8): SEQ ID NO: 14

5’ G Y TT STR TG CC C R TC-3’ degeneracy 16): SEQ ID NO: 15

5’ G Y RTT KTG ATG ACC CAR AC-3’ degeneracy 16): SEQ ID NO: 16

5’ G Y TT GTG TG CB C G KC-3’ degeneracy 12): SEQ ID NO: 17

5’ G Y TT GTG T CY C G G -3’ degeneracy 4): SEQ ID NO: 18

5’ G Y TT GTG TG CC C G WT-3’ degeneracy 4): SEQ ID NO: 19

5’ G Y TT GTG ATG ACA CAA CC-3’ degeneracy 2): SEQ ID NO: 20

5’ G Y TT TTG CTG CT C G TC-3’ degeneracy 2): SEQ ID NO: 21

J inverzni (4-set prajmeri)

J1/J2 inverzni prajmer (1)

[0076] 5’-GGS ACC AAR CTG GAA ATM AAA-3’ degeneracy 8): SEQ ID NO: 22

J4 inverzni prajmer (2)

[0077] 5’-GGG ACA AAG TTG GAA ATA AAA-3’: SEQ ID NO: 23


1

J5 inverzni prajmer (3)

[0078] 5’-GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA-3’: SEQ ID NO: 24

J1 J2, J4, J5 smeša inverznih prajmera 4)

[0079] Prajmeri su dobijeni putem modifikacije sekvence nukleotida Ig-prajmer seta miša (Novagen; Merck, Cat. No.69831-3) tako što su uklonjeenja mesta restrikcionog enzima. -set direktni prajmer.

5’-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3’: SEQ ID NO: 25


B-set direktni prajmer

[0080] 5’-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’: SEQ ID NO: 26


C-set direktni prajmer

[0081] 5’-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3’: SEQ ID NO: 27

D-set direktni prajmer smeša sledeća 2 prajmera)

[0082]

5’-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3’: SEQ ID NO: 28

5’-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3’: SEQ ID NO: 29

E-set direktni prajmer smeša sledeća 3 prajmera)

[0083]

5’-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3’: SEQ ID NO: 30

5’-ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3’: SEQ ID NO: 31

5’-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC-3’: SEQ ID NO: 32

F-set direktni prajmer smeša sledeća 4 prajmera)

[0084]

5’-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3’: SEQ ID NO: 33

5’-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3’: SEQ ID NO: 34

5’-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3’: SEQ ID NO: 35

5’-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3’: SEQ ID NO: 36

G-set direktni prajmer smeša sledeća 4 prajmera)

[0085]

5’-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3’: SEQ ID NO: 37

5’-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3’: SEQ ID NO: 38

1

5’-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3’: SEQ ID NO: 39

5’-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3’: SEQ ID NO: 40

KVL inverzni prajmer

[0086] ACTGGATGGTGGGAAGATGGA: SEQ ID NO: 41

B. Prajmeri za korišćenje u PCR amplifikaciji gena koji kodira H-lanac V-region miša [0087] Sledeća dva primera setova su koristila 4-set prajmere koji na kraju 5' kraju imaju homologiju na delu signala H-lanca miša i prajmer koji je na kraju 3' imao homologiju u IGHC delu; i 1-set prajmeri koji imaju, na 5' kraju, homologiju sa FR1 delom i 2-set prajmeri koji imaju, na kraju 3', homologiju ka konstantnom regionu H-lanca miša IGHC) miša. Polimerazna lančana reakcija je izvedena korišćenjem dva prajmera, pri čemu je iz cDNK izolovan DNK fragment H-lanac varijabilnog regiona regiona imunoglobulina miša. Prajmer sekvence su sledeće.

(i) Prajmeri za varijabilni region kloniranja H-lanca miša

VH direktni (signalni deo: 4-set prajmeri)

[0088] Ovi prajmeri su sintetizovani prema Current Protocols in Immunology (John Wiley and Sons, Inc.), Unit 2.12 Cloning, Expression, and Modification of Antibody V Regions (Table 2.12.2).

5'-ATG GRA TGS AGC TGK GTM ATS CTC TT-3 '(degeneracy: 32): SEK ID NO: 42 5'-ATG RAC TTC GGG ITG AGC TKG GTT TT-3' (degeneracy: 8): SEK ID NO : 43

5'-ATG GCT GTC TTG GGG CTG CTC TTC T-3 ': SEK ID NO: 44

5'-ATG GRC AGR CTT ACV TII-3 '(degeneracy: 32): SEK ID NO: 45

[0089] Ovi prajmeri su dizajnirani modifikovanjem nukleotidne sekvence direktnih prajmera koji su opisani u dokumentu (Tan et al, "Superhumanized" Antibodies: Reduction of Immunoogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169 (2002), p.

1119-1125).

5'-SAG GTS MAR CTK SAG SAG TCV GG-3'(degeneracy: 256): SEQ ID NO: 46 VH reverzni (reverzni prajmer zajednički sa 3 i 4)

[0090] Prajmer je dizajniran kroz degeneraciju nukleotidne sekvence, tako da se prajmer može ojačati sa svim izoformima IgG miša.

5'-CAS CCC CAT CDG TCT ATC C-3 '(degeneracija: 6): SEK ID NO: 47

Primer 5

Izrada vektora ekspresije imunoglobulina anti-CDH3 himere

1

Izrada plazmida ekspresije

[0091] Kroz PCR koji koristi DNK Engine (Peltier Thermal Cicler, MJ Research, Bio-Rad), svaka varijabilna oblast L-lanca i H-lanca antitela anti-CDH3 monoklonskim antitela miša se pojačava upotrebom prajmera opisanih u Primeru 4. Svaki od tako pojačanih DNK fragmenata je ugraĎen u subkloning vektor pGEM proizvod Promega). Nukleotidna sekvenca DNK fragmenta odreĎena je upotrebom univerzalnog prajmera koji se vezuje za T7 i SP6 promotor vektora. Tako dobijene nukleotidne sekvence varijabilnih regiona L-lanca i H-lanca anti-CDH3 antitela pretražene su putem IMGT V-KUEST Search stranice(http: // im- gt.cines.fr IMGT_vkuest vkuest? livret = 0 & Option = mous eIg), pri čemu je potvrdjen završetak kloniranja gena antitela.

[0092] Zatim, gen koji kodira humani CK region povezan je sa kloniranim genom koji kodira V region L-lanca anti-CDH3 antitela, a gen koji kodira humani Cg1 region povezan je sa genom koji kodira V region H-lanac. Tako dizajnirani geni L-lanca i H-lanca himernih antitela sintetisani su u celoj dužini od strane GenScript-a. U to vreme, učestalost korišćenja kodona je optimizovana kako bi se postigla efikasna ekspresija gena u proizvodnji ćelija prema postupku koji je otkriven u Kim et al., Codon optimization for highlevel expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells, Gene, 199, 1997, str.

293-301). Konkretno, u slučaju L-lanca, u svrhu efikasnog prevoĎenja, esencijalna sekvenca DNK (Kozak, M., J., At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol 196, str. 947-950, 1987), signalni peptid miša IGKV, V regiona L-lanca anti-CDH3 antitela i humani CK region su poreĎani u ovom redu, i dodata su mesta restrikcionog enzima na oba kraja (NheI na 5' strani i EcoRI na 3' strani). H-lanac himere pripremljen je na isti način. Svaki od sintetizovanih gena je isečen sa NheI i EcoRI, a rezani fragment je inkorporiran u vektor ekspresije pC GGS izmeĎu NheI lokacije i EcoRI lokacije, čime se dobija L-lančani ekspresioni vektor pCAGGS-IGK anti-CDH3 himernog antitela i H-lančani ekspresioni vektor pC GGS-IGH.

Primer 6: Izrada ekspresionog imunoglobulin stabilnog anti-CDH3 vektora

[0093] Za realizaciju ekspresije na visokom nivou genetski modifikovanog gena antitela u CHO ćelijama proizveden je ekspresioni vektor u koji je ugraĎen gen dihidrofolat reduktaze (dhfr) povezan sa CMV promoterskom sekvencom i sa poli A signalom.

[0094] Za proizvodnju himerne ćelijske linije za antibodi stabilnu ekspresiju/produkciju, proizveden je vektor ekspresije pCAGGS u koji je inkorporiran dhfr gen. Konkretno, u pCAGGS-IGH i pCAGGS-IGK, koji su tranzientni ekspresioni vektori, inkorporiran je dhfr gen koji ima CMV promoter i poli signal. Svaki od dhfr gena miša koji ima CMV promoter i Kozak sekvencu i SV40 poli signal se pojačava putem PCR-a. Ovi geni u obliku smeše su povezani zajedno putem PCR, a HindIII lokacija je dodata na oba kraja povezanog proizvoda, čime se dobija fragment gena HindIII-CMV promotera-Kozak-dhfr-poli A-HindIII. Ovaj fragment je ubačen u pC GGS-IGH ili pC GGS-IGK na HindIII lokacijama, čime se dobija pC GGS-IGH-CMVp-dhfr- i pC GGS-IGK-CMVp-dhfr- . Ovi ekspresioni vektori omogućavaju ekspresiju himernog antitela sa C G promotorom i ekspresijom dhfr gena sa CMV promotorom, pri čemu se himersko antitelo može efikasno proizvoditi putem amplifikacije gena.

[0095] CHO dhfr ćelije (G. Urlaub et al., Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient

1

in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p. 4216-4220, 1980) su istovremeno transformisani korišćenjem dva plazmida linearni plazmidi dobijeni rezanjem kružnih plazmida sa PvuI u ampicilin-otpornom genu); t.j., vektor pCAGGS-IGK-CMV-dhfr-A za ekspresiju lanca anti-CDH3 L himere i pCAGGS-IGH-CMV-dhfr-A vektor za ekspresiju himera anti-CDH3 H lanca. Elektroporacija je izvršena pomoću Amaxa (proizvod Lonza). DNK fragment (2 µg/uzorak, u slučaju plazmida L-lanca ili plazmida H-lanca) dodat je u 0,1mL Amaxa elektroporacionog CHO pufera koji sadrži 3 X 10<3>ćelija i primenjen je impuls.

[0096] elije koje su prošle elektroporaciju dodate su u Iscove Modified Dulbecco medijum IMDM: bez HT) koji sadrži 10% dializiran FBS koji nije slobodan od HT H: hipoksantin, T: timidin). Tri dana nakon transfekcije, medijum je promenjen u IMDM medijum bez 10% dijalizovanog FBS, 2mM L-glutamin i HT, a neo transformirane ćelije su izabrane pomoću 1 mg/mL G418, čime se dobijaju klonovi pozitivne ćelijska linije koja proizvodi himerna antitela. Posle toga, amplifikacija gena je izvršena korišćenjem klona odabranih pomoću G418. Dvokružna amplifikacija je izvedena u 250nM i 1000nM metotreksatu MTKS), i utvrĎene su ćelijske linije koje mogu proizvesti antitelo CDH3 himere (supernatant kulture od oko 50 do 100 mg/L). Tako uspostavljeno antitelo himera anti-CDH3-stabilno ekspresirajući CHO ćelijske linije deponovano je kod Incorporated Administrative Agency, the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary.

[Tabela 1]

Primer 8: Prikupljanje prečišćenih antitela

[0097] ntitela su prečišćena iz supernatanta kulture pomoću proteina .

Primer 9: Potvrda afiniteta

[0098] Putem konkurentne metode afinitet anti-CDH3 antitela na mišu uporeĎen je sa antitelom anti-CDH3 antitela himere. U konkurentnoj metodi, afinitet anti-CDH3 antitela odreĎen je protočnom citometrijom BD, F CS Calibur) pomoću ćelija raka NCI-H358, za koje se zna da su CDH3 visoke ekspresijske ćelije.

[0099] Konkretno, dodaje se serijski razblaženi uzorak 400 µg/mL do 24 ng/mL) (50 mL) i antitelo Alexa488-obeleženo antitelo 4 µg/mL) (50 µL) dodato je i mešano na plpći sa 96-udubljenja. NCI-H358 ćelije su uklonjene sa ploče za kulturu kroz tretman sa 2 mM EDT -PBS, a ćelije su suspendovane u F CS rastvoru 1% BS PBS) do koncentracije 1,5 X 10<6>/mL. Alikvot (100 µL) suspenzije je dodan u udubljenja koji sadrži smešu antitela. Nakon dodavanja, reakcija je izvedena na sobnoj temperaturi tokom 60 minuta, a ploča je dva puta isprana pomoću F CS rastvora 200 µl/udubljenju). Nakon toga, intenzitet fluorescencije

1

(GEO srednja vrednost) svakog udubljenja odreĎen je protočnom citometrijom.

[0100] Procenat vezivne inhibicije antitela označenog sa le a488 izračunato je iz srednje vrednosti GEO u odnosu na onu koja je dobijena reakcijom samo sa antitelom Alexa488-obeleženim (1 µg/mL). Izračunata je koncentracija antitela koja pokazuje 50% inhibiciju i podaci su uporeĎeni.

[0101] Slika 1 prikazuje procenu afiniteta PPMKS2016 antitelo miša) i PP T-052-27c njegova himerna antitela). Praktično nije bilo razlike u afinitetu izmeĎu dva antitela.

Primer 10: Izrada obeleženih antitela

(1) Vezivanje DOTA u antitelo

[0102] Antitelo je rastvoreno u puferu (50mM Bicin-NaOH, 150mM NaCl, pH: 8.5) do koncentracije antitela od 10 mg/mL. Odvojeno, izotiocijanobenzil DOTA (B-205, proizvod Macrocyclics) je rastvoren u DMSO do koncentracije od 10 mg/mL. Dva rastvora su mešana zajedno kako bi se podesio odnos molu antitela prema DOTA 1:1 (odnos dodavanja 1:1), 1:3 (odnos dodavanja 1:3) ili 1:10 (odnos dodavanja 1:10 ) i smeša je mešana i ostavljena da stoji na 25 ° C tokom 17 sati. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je prečišćena pomoću desalting kolone PD-10, proizvod kompanije GE Healthcare, 17-0435-01) sa PBS. Koriste se sledeća antitela: PPMKS2016, PPMKS2025, PPMKS2029, PPAT-052-27c i PPAT-052-28c.

2) OdreĎivanje procenta uključivanja helata

[0103] Procenat helata koji je inkorporiran u antitelo odreĎen je pomoću helatometrijske titracije. Koncentracija proteina modifikujućeg antitela je unapred odreĎena uobičajenom metodom, a broj molova modifikacionog antitela izračunat je iz molekulske težine IgG-a. U standardni bakarni rastvor od 1 mg/mL (100 µL) čija koncentracija je odreĎena atomskom apsorpcionom spektrometrijom, rastvor arsenazo III (0.776 mg) i 5M amonijak acetat (proizvod od Sigma Aldrich) (3 mL) bez metala se dodaje i ultrapurzna voda se dodaje u rastvor da bi se finalni volumen prilagodio na 10 mL. Rezultirajući rastvor se čuva na sobnoj temperaturi u mraku kako bi se pripremio rastvor arsenazo III. DOTA je rastvoren u ultračistoj vodi, čime je pripremljen DOT standardni rastvor. Modifikacijsko antitelo je rastvoreno u ultra čistoj vodi, čime se priprema modifikovani antitelski rastvor. Standardni rastvor DOTA ili modifikovani rastvor antitela (10 µL) pomešan je sa rastvorom arsenazo III (190 µL) i smeša je inkubirana na 37 °C tokom 30 minuta. Posle toga, apsorbcija smeše je merena na talasnoj dužini od 630 nm. Standardna krivulja je izvučena iz merenja apsorpcije DOTA standardnih rešenja. Prema standardnoj krivoj, izračunat je broj molekula DOT koji su vezani za modifikaciono antitelo prosečan broj DOT modifikacija).

[0104] Tabela 2 prikazuje rezultate odnos dodavanja DOT i stvarni prosečan broj modifikovanih DOT ). Kao što je jasno iz Tabele 2, utvrĎeno je da je broj molekula DOT vezan za antitelo odreĎen odnosom dodavanja DOTA.

2

[Tabela 2]

(3) Priprema<67>Ga-,<111>In- ili<90>Y- obeleženih antitela

(i) Obeležavanje sa<67>Ga ili<111>In

[0105] Svaka od pročišćenih PPMKS2016, PPMKS2025, PPMKS2029 i PP T-052-27c antitela i PPAT-052-28c antitelo rastvorena je u puferu (0.25M amonijak acetat-HCl, pH: 5.5) do koncentracije od 6 mg/mL. U rastvor antitela dodat je<67>GaCl3rastvor (proizvod Fuji Film RI Pharma) ili<111>InCl3rastvor (proizvod MDS Nordion Inc.) i smeša je inkubirana na 45 °C tokom jednog sata.

ii) Obeležavanje sa<90>Y

[0106] Svaka od pročišćenih PPMKS2029 i PP T-052-27c antitela je rastvorena u puferu (0.25M amonijak acetat-HCl, pH: 5.5) do koncentracije od 6 mg/mL. Rastvor<90>YCl3(proizvod Nuclitec) dodat je u rastvor antitela i smeša je inkubirana na 45 °C tokom jednog sata.

iii) OdreĎivanje procenta obeležavanja

[0107] likvot reakcione smeše za obeležavanje je uzorkovan i podvrgnut tankoslojnoj hromatografiji (61885, proizvod P LL), čime se odreĎuje procenat obeležavanja Fiziološki rastvor je korišćen kao eluent, a radioaktivnost je merena na gornjem i donjem kraju trake pomoću gama-brojača. Procenat etiketiranja izračunat je sledećom jednačinom.

[E1]

Procenat obeležavanja = (broj na donjem kraju) / (broj na gornjem kraju

broj na donjem kraju) X 100 (%)

[0108] Kada procenat obeležavanja dostigne 90% ili više, obeleženo antitelo je korišćeno u narednom eksperimentu. Obeležena antitela su prečišćena u desalting koloni (PD-10, proizvod GE Healthcare, 17-0435-01) sa PBS.

Primer 11: Ispitivanje odnosa izmeĎu procenta integracije helata i bio-distribucije (tj. distribucije u telu)

[0109] PPMX2016, PPMX2025 i PPMX2029 su ispitani u pogledu bio-distribucije na osnovu razlike procenata vrednosti ugraĎivanja helata odnos dodavanja DOT 1:1, 1:3 i 1:10).

[0110] Prvo, NCI-H358 je kultivisana u 10% FBS-sadržaju RPMI1640 medijuma, i kultivisane ćelije su subkutano transplantirane u desni ventralni region svakog od golih miševa ženka, 7-nedelja stara, CLEA Japan Inc. ) u koncentraciji ćelija od 1 X 10<7>ćelija mišu. Miševi su uzgajani sve dok prosečna zapremina tumora nije dosegla 100 do 150 mm<3>.

[0111] Nakon toga, na NCI-H358 transplantirane miševe,<67>Ga-DOTA-PPMX2016 antitelo (odnos dodavanja 1:3 i 1:10),<67>Ga-DOTA-PPMX2025 antitelo (odnos dodavanja 1:3 i 1: 10) ili 67Ga-DOTA-PPMX2029 antitela (odnos dodavanja 1:3 i 1:10) je primenjena u dozi od 370 kBq /mišu.

[0112] Devedeset i šest sati nakon primene, miševi su žrtvovani anatomiji, a tkiva i tumor su uklonjeni. Izmerena je težina svakog tkiva i težina tumora, radioaktivnost je merena pomoću gama-brojača i % ID g izračunava se prema sledećoj jednačini.

[E2]

%ID/g = (akumulirana RI količina / ukupno primenjena RI količina X

100 (%)) /težini (g)

[0113] Sl. 2 do 7 pokazuju rezultate. Sva ispitana antitela pokazala su povećanu akumulaciju u tumoru, pri dodavanju DOTA odnos dodavanja 1:3, u poreĎenju sa slučajem u odnosa dodavanja 1:10. Takva poboljšana akumulacija rezultira poboljšanjem terapijskog efekta. Pored toga, mogu se izbegavati štetni neželjeni efekti, koji bi inače bili uzrokovani zadržavanjem radioaktivne supstance u organima koji nisu ciljani.

[0114] Sl. 8 pokazuje rezultat antitela 67Ga-DOTA-PPMX2025 antitela odnos korišćenja 1:1, 1:3 i 1:10) kod golih miševa koji nemaju kancer ženski, stari 7 nedelja, CLEA Japan Inc) na 370 kBq/mišu. Antitelo se visoko akumulira u jetri kada je odnos dodavanja bio 1:10, dok je akumulacija u jetri bila niska kada je odnos bio 1:3 ili 1:1, što ukazuje na to da su sprečeni neželjeni efekti kao što je radioaktivno oštećenje na jetri.

Primer 12: Istraživanje ponašanja anti-caldina himernih antitela u organizmu

[0115] Ispitivana su ponašanja antitela himera PP T-052-27c i PPAT-052-28c u telu.

[0116] Prvo, NCI-H1373 je kultivisana u 10% FBS koji sadrži RPMI1640 medijum, a ćelije sa kulturom su subkutano transplantirane u desni ventralni region svakog od golih miševa ženka, starija od 9 nedelja, CLEA Japan Inc. ) pri koncentraciji ćelija od 4 X 10<6>ćelija mišu. Miševi su uzgajani sve dok prosečna zapremina tumora nije dosegla 100 do 150 mm<3>.

[0117] Zatim, kod MSI-H1373-transplaniranih miševa,<111>In-DOTA-PPAT-052-27c (odnos dodavanja 1:3) ili<111>In-DOTA-PPAT-052-28c (odnos dodavanja 1:3) od 370 kBq mišu.

[0118] Četrdeset osam ili devedeset šest časova nakon primene, miševi su žrtvovani anatomiji, a tkiva i tumor su uklonjeni. Izmerena je težina svakog tkiva i težina tumora, radioaktivnost je merena pomoću gama-brojača i izračunat je % ID/g.

[0119] Sl. 9 do 11 pokazuju rezultate. PPAT-052-27c je pokazao procentualnu akumulaciju u tumoru čak od 46% ID/g 48 sati nakon primene. PPAT-052-28c je pokazao procenat akumulacije u tumoru čak 41% ID g 48 sati nakon primene i 52% ID/g 96 časova posle primene.

Primer 13: Ksenograft test

[0120] NCI-H358 je kultivisan u 10% FBS koji sadrži RPMI1640 medijum, a ćelije koje su kultivisane su subkutano transplantirane u desni ventralni region svakog od golih miševa ženka, stara 7 nedelja, CLEA Japan Inc. .) u koncentraciji ćelija od 1 X10<7>ćelija mišu.

[0121] MSI-H358-transplanirani miševi su podeljeni u šest grupa n = 8). ntitela<90>Y-DOTA-PPMX2029 (odnos dodavanja 1:3) je primenjena u dozi od 7.4 MBq/mišu, 5.6 MBq/ mišu, 3.7 MBq/mišu i 1.9 MBq/mišu. Kao kontrolne grupe, neobeleženi PPMX2029 je primenjen u dozi

od 80 mg/mišu, a fiziološki rastvor je administriran u dozi od 100 ml/mišu. U svim grupama, administracija je izvršena kada je prosečna zapremina tumora dostigla 100 do 150 mm<3>.

[0122] Nakon primene, telesna težina i zapremina tumora su mereni dva puta nedeljno (na 3 ili 4 dana). Ova opservacija se nastavila 51 dan posle primene.

[0123] Slika 12 prikazuje rezultate ispitivanja. 90I-DOTA-PPMX2029 antitelo (odnos dodavanja 1:3) pokazalo je anti-tumorski efekat proporcionalan radioaktivnosti.

[0124] Odvojeno, NCI-H1373 je kultivisan u 10% FBS koji sadrži RPMI1640 medijum, a ćelije sa kulturom su subkutano transplantirane u desnu ventralnu regiju svakog od golih miševa ženka, stara 7 nedelja, CLEA Japan Inc. .) u koncentraciji ćelija od 5 X 10<6>ćelija mišu.

[0125] NCI-H1373-transplanirani miševi su podeljeni u četiri grupe n = 8).<90>Y-DOTA-PPAT-052-27c antitelo (odnos dodavanja 1:3) je primenjeno u dozi od 5,6 MBq/mišu i 3,7 MBq/mišu. Kao kontrolne grupe, neobeleženi PPMX2029 je primenjen u dozi od 60 mg/ mišu, a fiziološki rastvor je primenjen u dozama od 100 µL/mišu. U svim grupama, primena je obavljena kada je prosečna zapremina tumora dostigla 100 do 150 mm<3>.

[0126] Nakon primene, telesna težina i volumen tumora su mereni dva puta nedeljno na 3 ili 4 dana). Ova opservacija se nastavila 26 dana posle primene.

[0127] Slika 13 prikazuje rezultate ispitivanja.<90>Y-DOTA-PPAT-052-27c (odnos dodavanja 1:3) pokazao je anti-tumorski efekat proporcionalan radioaktivnosti.

Primer 14: Imunohistohemijsko bojenje

[0128] Ekspresija CDH3 proteina u kliničkom ispitivanju kancera potvrĎena je imunohistoemijskim bojenjem tkivnog polja uzorka kancera.

2

[0129] Kao primeri kancera u tkivnim uzorcima korišćeni su tkiva kancera pankreasa adenokarcinom), karcinom pluća adenokarcinom), karcinom pluća karcinom skvamoznih ćelija) i kolorektalni karcinom adenokarcinom), koji su proizvodi kompanije Shanghai Outdo Biotech Co. , Ltd.

[0130] Svaki slajd uzorkatkiva je razvijen i aktiviran sa 10 mM Tris 1 mM EDTA (pH: 9.0) na 95 °C tokom 40 minuta. Endogena peroksidaza u slajdu uzorka je inaktivirana blokatorom koji je uključen u komplet ENVISION Kit (proizvod Dako). Posle toga, slajd tkiva je reagovao sa 5 µg/mL anti-CDH3 antitela 610227 (proizvod BD BIOSCIENCE) ili sa 5 µg/ mL anti-HBs antitela Hib-3423 negativna kontrola) na 4 °C preko noći. Rastvor antitela je ispran i slajd tkiva je dalje reagovao sa reagensom sekundarnog antitela polimera koji je uključen u komplet ENVISION+Kit na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Slajd je tada kolor razvijen pomoću reagensa za bojenje koji je uključen u komplet ENVISION+Kit, a nuklearno bojenje obavljeno je korišćenjem rastvora hematokilin eosin.

[0131] Slika 14 prikazuje rezultate. elije raka bile su obojene anti-CDH3 antitelom, ali normalne ćelije nisu obojene.

LISTING SEKVENCE

[0132]

�

�

�

2

�

�

�

4

4

4

Claims (16)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom, n a z n a č e n o t i m e, što se dobija vezivanjem radioaktivnog metalnog elementa na anti-P-kadherin antitelo koristeći reagens koji helatira metal, pri čemu je anti-P-kadherin antitelo monoklonsko antitelo ili rekombinantno antitelo proizvedeno od ćelija za proizvodnju antitela predstavljenih pristupnim brojevima NITE BP-897, NITE BP-899, NITE BP-1048, NITE BP-1049 ili NITE BP-1050, ili P-kadherin vezujući fragment bilo kog ovih antitela.

2. Anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom, n a z n a č e n o t i m e, što je anti-P-kadherin antitelo himerno antitelo izvedeno iz antitela definisanog u zahtevu 1 ili njegovog vezujućeg fragmenta P-kadherina.

3. Anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom, prema zahtevu 1 ili 2, n a z- n a č e n o t i m e, što je reagens koji helatira metal izabran iz grupe koja se sastoji od izotiocijanobenzil DOTA, metilizotioianobenzil DTPA i cikloheksilizotiocijanobenzil DTPA.

4. Anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom prema bilo kom od zahteva 1 do 3, n a z n a č e n o t i m e, što je molski odnos anti-P-kadherin antitela prema reagensu koji helatira metal 1:0.1 do 1:4.5, poželjno 1:0.5 do 1:3.

5. Anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, n a z n a č e n o t i m e, što je radioaktivni metalni element citotoksični radioaktivni metal koji se koristi u terapiji karcinoma koji se može izabrati iz grupe koja se sastoji od itrijuma-90 (<90>Y), renijuma-186 (<186>Re), renijuma-188 (<188>Re), bakra-67 (<67>Cu), gvožĎa-59 (<59>Fe), stroncijuma-89 (<89>Sr), zlatoa 198 (<198>Au), disprozijuma-165 (<165>Dy), rutenijuma-103 (<103>Ru), holijuma-166 (<166>Ho), samarijuma-153 (<153>Sm) i lutecijuma-177 (<177>Lu), poželjno je to itrijum-90 (<90>Y).

6. Anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom prema zahtevu 5, n a z n a -č e n o t i m e što je antitelo ciljano na kancer koji eksprimira P-kadherin.

7. Anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, n a z n a č e n o t i m e, što je radioaktivni metalni element necitotoksični radioaktivni metal koji se koristi u dijagnozi karcinoma, koji se može izabrati iz grupe koja se sastoji od tehnecjuma-99m (<99m>Tc), indijuma-111 (<111>In), indijuma-113m (<113m>In), galijuma-67 (<67>Ga), galijuma-68 (<68>Ga), talijuma-201 (<201>Tl), kobalta-57 (<57>Co), stroncijuma-85 (<85>Sr) i bakar-64 (<64>Cu), poželjno je ne-citotoksični radioaktivni metal odabran od indijuma-111 (<111>In) i galijuma-67 (<67>Ga).

8. Terapeutsko sredstvo protiv kancera, n a z n a č e n o t i m e, što sadrži kao aktivni sastojak anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom, kao što je opisano u bilo kom od zahteva 5 ili 6.

9. Dijagnostički agens za kancer, n a z n a č e n t i m e, što sadrži kao aktivni sastojak, anti-P-kadherin antitelo obeleženo sa radioaktivnim metalom prema zahtevu 7.

10. elija za proizvodnju antitela, n a z n a č e n a t i m e, što se deponuje kao pristupni broj NITE BP-897, NITE BP-899, NITE BP-1048, NITE BP-1049 ili NITE BP-1050.

11. Upotreba anti-P-kadherin antitela obeleženog radioaktivnim metalom prema jednom od zahteva 5 ili 6, n a z n a č e n a t i m e, što se koristi za proizvodnju terapeutskog agensa protiv kancera ili prema jednom od zahteva 7 za proizvodnju dijagnostičkog agensa za kancer.

12. Anti-P-kadherin antitelo vezano za DOTA, n a z n a č e n o t i m e, što se dobija reakcijom anti-P-kadherin antitela sa izotiocianobenzil DOTA, gde je anti-P-kadherin antitelo monoklonsko antitelo ili rekombinantno antitelo koje proizvod ćelija predstavljena pristupnim brojem NITE BP-897, NITE BP-899, NITE BP-1048, NITE BP-1049 ili NITE BP-1050, ili P-kadherin vezujući fragment bilo kojeg od ovih antitela.

13. DOTA-vezano anti-P-kadherin antitelo, n a z n a č e n o t i m e, što je anti-P-kadherin antitelo himerno antitelo izvedeno iz antitela definisanog u zahtevu 12.

14. DOTA-vezano anti-P-kadherin antitelo, prema zahtevu 12 ili 13, n a z n a č e n o t i m e, što je molski odnos anti-P-kadherin antitela prema DOT 1:0.1 do 1:4.5, poželjno 1:0.5 do 1:3.

15. Anti-P-kadherin antitelo, n a z n a č e n o t i m e, što je monoklonsko antitelo ili rekombinantno antitelo proizvedeno od strane ćelije za proizvodnju antitela predstavljene pristupnim brojem NITE BP-897, NITE BP-899, NITE BP-1048, NITE BP- 1049 ili NITE BP-1050, ili P-kadherin vezujući fragment bilo kog od ovih antitela.

16. Himerno antitelo, n a z n a č e n o t i m e, što je izvedeno iz antitela prema zahtevu 15 ili njegovog vezujućeg fragmenta P-kadherina.

4