BR112012020116A2 - anticorpo anti-caderina marcado com metal radiotivo. - Google Patents

Abstract

ANTICORPO ANTI-CADERINA MARCADO COM METAL RADIOATIVO. Um objetivo da presente invenção consiste e proporcionar um anticorpo anti-caderina de metal radioativo que seja altamente acumulado especificamente em tecido cancerígeno. Outro Objetivo consiste em proporcionar um agente terapêutico contra câncer tendo um alto efeito anticancerígeno e segurança e um agente de diagnóstico de câncer. O anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo é obtido ligando-se um elemento metálico radioativo a um anticorpo anti-caderina através de um reagente quelante metálico.

Description

ei EEETTA:X AAA Ó TNT OCOCOCOCECECECECEÉN*ÉÚNENVLVLVLELLLVELL.—————---—n—npnp—p—pnpnmrmrm—p—pmnmmrm—p—p—poeee 1/27 “ANTICORPO ANTI-CADERINA MARCADO COM METAL RADIOATIVO”

CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-caderina marcado com metal ra- dioativo que se acumula de modo altamente específico em células cancerígenas, e a um 7 5 —agenteterapêuticoea um agente de diagnóstico de câncer, cada um contendo o anticorpo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA ] Há uma forte demanda por novas terapias contra câncer para o tratamento de cân- cer, que, no presente, é a causa principal de mortes. Atualmente, empregam-se terapias contra câncer, tais como terapia cirúrgica, radioterapia, e quimioterapia (através do uso de um agente anticancerígeno. Mesmo após cirurgias, emprega-se um agente anticancerígeno na terapia pós-operatória.

Os agentes anticancerígenos atualmente empregados incluem um agente de alqui- lação, um antimetabólito, um agente anticancerígeno alcalóide, um agente anticancerígeno . antibiótico, e um agente de platina. Os efeitos do tratamento desses agentes não são com- ú 15 —pletamente satisfatórios. Alguns agentes não são células cancerígenas específicas e fre- . quentemente causam efeitos colaterais, que é problemático. Sob tais circunstancias, existe ". uma demanda pelo desenvolvimento de agentes anticancerígenos mais eficazes.

Entretanto, a caderina é uma molécula de adesão dependente de Ca2+ que é ex- . pressada na superfície celular. Exemplos de espécies de caderina conhecidas incluem cade- —rinas clássicas, tal como caderina E, caderina N, e caderina P (CDH3); assim como protoca- derina, e caderina desmosomal. Estas caderinas são conhecidas por se aglutinarem de mo- do homofílico, formarem uma junção de aderência, e se ligarem ao sistema citoesqueletal (filamentos de actina) através de catenina intracelular e, considera-se que controlem a ade- são celular através de tal mecanismo.

Além da adesão celular, imagina-se que a caderina se refira à embriogênese, mor- fogênese, sinaptogênese, plasticidade sináptica, e infiltração e metástase de câncer. Portan- to, um anticorpo anti-caderina é reportado como sendo útil para terapia contra câncer (Do- cumentos de Patente 1 a 3).

Documentos da Técnica Anterior Documentos de Patente Documento de Patente 1: Publicação de Patente Japonesa Kohyo (PCT) No. 2005- 522982 Documento de Patente 2: Publicação de Patente Japonesa Kohyo (PCT) No. 2008- 538909 Documento de Patente 3: Publicação de Patente Japonesa Kohyo (PCT) No. 2009- 528257

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problemas a serem solucionados pela invenção No entanto, o efeito anticancerígeno do anticorpo anti-caderina não é satisfatório, e há uma demanda pelo desenvolvimento de um agente terapêutico contra câncer mais poten- Í 5 te i Portanto, um objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um anticorpo : anti-caderina marcado com metal radioativo que possa ser altamente acumulado em tecido cancerígeno. Outro objetivo consiste em proporcionar um agente terapêutico contra câncer que contenha o anticorpo como um ingrediente ativo e que exiba um alto efeito anticanceríi- —geno. Ainda outro objetivo consiste em proporcionar um agente de diagnóstico de câncer que possa prever a eficácia de um agente terapêutico contra câncer e conformar o efeito terapêutico do mesmo.

Meios para solucionar os problemas . Os presentes inventores conduziram estudos extensivos para atingir os objetivos ; 15 —supramencionados, e descobriram que um anticorpo anti-caderina marcado com metal ra- : dioativo no qual um elemento metálico radioativo é ligado a um anticorpo anti-caderina atra- "o. vés de um reagente quelante metálico é especificamente acumulado no tecido cancerígeno de um animal portador de câncer, e que, particularmente, o efeito anticancerígeno deste é * consideravelmente acentuado comparado ao grupo de administração de anticorpo anti- —caderinanão-marcado. A presente invenção foi realizada com base nestas descobertas. Tm. Consequentemente, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo que é obtido ligando-se o elemento metálico radioativo a um anticorpo anti-caderina através de um reagente quelante metálico, e um agente terapêutico contra câncer e um agente de diagnóstico de câncer, cada um contendo, como um ingredi- ente ativo,o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo.

A presente invenção também proporciona o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo para uso no tratamento ou diagnóstico de câncer.

A presente invenção também proporciona o uso do anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo para produzir um agente terapêutico contra câncer ou um agente de diagnósticode câncer.

A presente invenção também proporciona um método para tratamento ou diagnósti- co de câncer, que compreende administrar uma quantidade eficaz do anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo a um indivíduo em necessidade do mesmo.

Efeitos da Invenção O agente terapêutico contra câncer que contém, como um ingrediente ativo, o anti- corpo anti-caderina marcado com metal radioativo da presente invenção é altamente acumu- lado em tecido cancerígeno e exibe um alto efeito de retrocesso do tecido cancerígeno. Por-

tanto, através do uso do agente terapêutico contra câncer, a terapia contra câncer pode ser efetivamente realizada sem causar efeitos colaterais. Da mesma forma, através do uso do agente de diagnóstico de câncer da presente invenção, pode-se prever a eficácia do agente terapêutico contra câncer da presente invenção, e o efeito terapêutico deste pode ser con- : 5 firmado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS : A Figura 1 mostra gráficos que apresentam o resultado da afinidade dos anticorpos avaliados por citometria de fluxo. A Figura 2 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2016 (razão de adiçãode1:10)96 horas após a administração do mesmo.

A Figura 3 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2016 (razão de adição de 1:3) 96 horas após a administração do mesmo.

A Figura 4 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2029 (razão de - adição de 1:10) 96 horas após a administração do mesmo. , 15 A Figura 5 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2029 (razão de : adição de 1:3) 96 horas após a administração do mesmo. a A Figura 6 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2025 (razão de adição de 1:10) 96 horas após a administração do mesmo. . A Figura 7 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2025 (razão de adiçãode1:3)96 horas após a administração do mesmo.

A Figura 8 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2025 no caso razões adicionadas de anticorpo DOTA de 1:1, 1:3, e 1:10, 96 horas após a administração do mesmo.

A Figura 9 mostra à biodistribuição do anticorpo 111In-DOTA-PPAT-052-27c (razão — deadiçãode1:3)96 horas após a administração do mesmo.

A Figura 10 mostra a biodistribuição do anticorpo 111In-DOTA-PPAT-052-27c (razão de adição de 1:3) 48 horas após a administração do mesmo.

A Figura 11 mostra a biodistribuição do anticorpo 111In-DOTA-PPAT-052-28c (razão de adição de 1:3) 48 horas e 96 horas após a administração do mesmo. .

A Figura 12 mostra um efeito antitumor do anticorpo 90Y-DOTA-PPMX2029 (razão de adição de 1:3) em um modelo de xenoenxerto.

A Figura 13 mostra um efeito antitumor do anticorpo 90Y-DOTA-PPAT-052-27c (ra- zão de adição de 1:3) em um modelo de xenoenxerto.

A Figura 14 mostra fotoimagens que apresentam os resultados da coloração imuno- histoquímica para confirmar a expressão da proteína CDH3. | Modos para realizar a invenção Í O anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo da presente invenção é um | o ggeÕõTg"iççióí"miÓn ooasauanaanaA) o cm “A =ssPsA =-aÂÀ a ——SSSEEEESSSSSMSMSMSMSMSSSSSSMMMMMMMMMMMMDDDDDDDC 4/27 anticorpo anti-caderina marcado ao qual um elemento metálico radioativo é ligado através de um reagente quelante metálico. O agente terapêutico contra câncer ou o agente de diag- nóstico de câncer contém o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo.

O anticorpo anti-caderina não é particularmente limitado, desde que o anticorpo se ' 5 ligue especificamente à caderina. Exemplos de caderina incluem, caderina, caderina N, e caderina P. Dentre estas, a caderina P é mais preferencial.

] O anticorpo anti-caderina abrange um anticorpo monoclonal, um anticorpo a poli- clonal, um anticorpo que mantém a capacidade de se ligar especificamente a um grupo de- terminante antigênico e variantes e derivados de um anticorpo, tal como um fragmento re- ceptorde célulaT.

O tipo do anticorpo anti-caderina não é particularmente limitado, e podem existir an- ticorpos apropriadamente empregados, tais como um anticorpo de camundongo, um anti- corpo humano, um anticorpo de rato, um anticorpo de coelho, um anticorpo de carneiro, um . anticorpo de camelo, e um anticorpo de galinha; e anticorpos recombinantes de gene que r 15 —sãointencionalmente modificados a fim de reduzir a hetero-antigenicidade a seres humanos, - tal como um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado. O anticorpo recombinante *. pode ser produzido através de um método conhecido. O anticorpo quimérico é um anticorpo formado por regiões variáveis de cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo de ma- r mífero diferente do anticorpo humano, por exemplo, anticorpo de camundongo e regiões constantes de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano e pode ser e produzido ligando-se um fragmento de "DNA que codifica a região variável do anticorpo de camundongo a um fragmento de DNA que codifica a região constante do anticorpo humano, incorporando o fragmento resultante em um vetor de expressão, e incorporando o vetor em células hospedeiras (vide, por exemplo, Cabilly S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81(11)3273-7; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81(21), 6851-5; e o Pedido de Patente Europeu Aberto à Inspeção Pública No. 171496). O anticorpo humanizado, que também é denominado como anticorpo reformatado, é um anticorpo produzido através do transplante de uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo de mamífero diferente do anticorpo humano, por exemplo, um anticorpo de camundongo em uma CDR de um anticorpo humano, e técnicas de recombinação genética ao mesmo são genericamente conhecidas. De modo específico, uma sequência de DNA que inclui uma CDR de um anticorpo de camundongo ligado a uma região de estrutura (FR) de um anticor- po humano é sintetizada através de PCR utilizando-se vários oligonucleotídeos que são produzidos para que tenham uma parte sobreposta em uma extremidade do mesmo. O fragmento de DNA assim obtido é ligado a um fragmento de DNA que codifica a região cons- tante do anticorpo humano, subsequentemente, o fragmento resultante é incorporado em um vetor de expressão e o vetor é incorporado em células hospedeiras para produzir, desse modo, o anticorpo humanizado (vide, EP239400 A e WO 96/02576 A). A FR do anticorpo humano ligada através da CDR é selecionada a partir de FRs tendo uma CDR que forme um sítio de ligação de antígeno adequado. Caso seja necessário, um aminoácido na FR da re- gião variável do anticorpo pode ser substituído de tal modo que uma CDR do anticorpo re- ? 5 formatado forme um sítio de ligação de antígeno apropriado (Sato, K. et al., Cancer Res., 1993, 53, 851-856).

' A sequência de aminoácido do anticorpo quimérico ou do anticorpo humanizado tem, de preferência, uma identidade de 100% à sequência da região de Vh ou VI de cDNA que expressa um hibridoma depositado. Devido à modificação genética, um anticorpo tendo uma identidade em sequência de aminoácido de 90%, ou maior, também é preferencial. No processo de humanização ou quimerização; realizou-se convencionalmente tal substituição de resíduo controlada para aperfeiçoar a ligação a um antígeno. Esse anticorpo tendo uma sequência parcialmente modificada é essencialmente considerado como sendo um anticor- . po que se origina a partir do hibridoma original.

; 15 Os métodos para produção de um anticorpo quimérico e de um anticorpo humani- SJ zado com base em uma técnica de engenharia genérica já são conhecidos. De modo espe- " cífico, as sequências de Vh e VL de um anticorpo monoclonal que serve como um grupo confirmado são geneticamente modificadas, e, então, realiza-se uma quimerização ou hu- ". manização através de uma técnica de rotina.

O método para recuperar um anticorpo humano também é conhecido. Em um pro- cedimento, os linfócitos humanos são sintetizados in"vitro por um antígeno de interesse ou por células que expressem o antígeno, e os linfócitos assim sintetizados são fundidos a cé- lulas de mieloma humano, por exemplo, U266, para, desse modo, produzir um anticorpo humano de interesse tendo uma atividade de ligação ao antígeno (vide JP-B-1989-59878).

—Alternativamente, um anticorpo humano de interesse pode ser recuperado através de imuni- zação, por um antígeno de interesse, de um animal transgênico tendo um repertório comple- to do gene de anticorpo humano (vide WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO96/34096, e WO96/33735). Conhece-se, também, uma técnica para recuperar um anticorpo humano através de separação imunomagnética pelo uso de uma biblioteca de anticorpo humano. Em um procedimento, uma região variável de um anticorpo humano é expressada como um anticorpo de cadeia única (scFv) na superfície de fago através do mé- todo de exibição de fago, e um fago que se liga ao antígeno pode ser selecionado. Através de análise genética do fago assim selecionado, uma sequência de DNA que codifica a regi- ão variável do anticorpo humano que se liga ao antígeno pode ser determinada. Quando a — sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno for elucidada, um vetor de expressão apropriado pode ser produzido a partir da sequência, desse modo, um anticorpo humano de interesse pode ser recuperado. Estes métodos são amplamente conhecidos (vide WO |

O SAO cc" DBÉ6> a C———EEEESSSSSSSSSDMDMDMMMMMMMhSheheherrr 6/27 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, e WO 95/15388). Estes anticorpos anti-caderina podem ser um anticorpo de baixo peso molecular tal como um fragmento de anticorpo, um anticorpo modificado, ou similares, desde que a capa- ' 5 cidade de reconhecer toda ou uma parte da proteína codificada pelo gene caderina seja mantida. Exemplos do fragmento de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, e Diabody. Tal ' fragmento de anticorpo pode ser produzido construindo-se um gene que codifica o fragmen- to de anticorpo, incorporando-se o gene em um vetor de expressão, e expressando-se o vetor em células hospedeiras apropriadas (vide, por exemplo, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476- 496; Pluckthun, A. and Skerra; A., Methods Enzymol: (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E, Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; e Bird, R.E. and Walker, B.W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). . Como um anticorpo modificado, pode-se usar um anticorpo que seja ligado a qual- ; 15 — quer entre várias moléculas, tal como polietileno glicol (PEG). Esse anticorpo modificado " pode ser produzido através de modificação química do anticorpo obtido. A técnica de modifi- * cação de anticorpo já foi estabelecida na técnica. Na presente invenção, pode-se empregar, também, um anticorpo modificado de ca- , deia de açúcar para potencializar a atividade citotóxica. As técnicas de modificação da ca- deia de açúcar em um anticorpo já são conhecidas (por exemplo, WO 00/61739 e WO 7 ' 02/31140). - 7 TO ias O anticorpo anti-caderina da presente invenção também abrange um anticorpo mul- ti-específico tendo especificidade a dois ou mais antígenos diferentes. Um exemplo típico de tal molécula pode ser aquele que pode ligar dois antígenos (isto é, um anticorpo bi- específico). O “anticorpo multi-específico” da presente invenção inclui um anticorpo tendo uma especificidade a dois ou mais (por exemplo, três) antígenos. O anticorpo multi- específico pode ser um anticorpo de comprimento inteiro ou um fragmento de tal anticorpo (por exemplo, o anticorpo bi-específico F(ab')2).

O anticorpo anti-caderina da presente invenção e o fragmento de anticorpo deste — podem ser produzidos através de qualquer método adequado, tal como in vivo, células cultu- radas, reação de translação in vitro, e sistema de expressão de DNA recombinante.

As técnicas para produção de anticorpos monocionais e células produtoras de anti- corpo (hibridomas) são genericamente conhecidas na técnica (Campbell, “Monoclonal Anti- body Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,” Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holanda, 1984; e St. Groth et al., J. Inmunol. Methods 35: 1-21, 1980). Em um procedimento específico, uma proteina ou um fragmento desta codifica- do por um gene de caderina que serve como um imunogênio é subcutânea ou intraperítone-

o - 5ô A nl ls É AAAI.oAaAÕAAÔÔMAMAíATI TE OIIOIITIIITI!TEICÕEÓEIEEOOOOO OOUONNOOOOOUOUONLUULPPPPPPPPPPPPPP—eoeoeoee—=—-=-=---————s -addg a sm—m—u-— E€ SS 7/27 almente injetada para imunização a qualquer animal (por exemplo, camundongo ou coelho) que seja conhecido por produzir um anticorpo. Em imunização, pode-se empregar um adju- vante, e tal adjuvante é bem conhecido na técnica. O anticorpo policlonal pode ser produzido isolando-se um anti-soro contendo anti- : S corpos de um animal imunizado e triando-se para determinação da presença de um anticor- po tendo uma especificidade alvo através de uma técnica bem conhecida na técnica (por : exemplo, ELISA, Western blotting, ou radioimunoensaio). O anticorpo monoclonal pode ser produzido removendo-se as células do baço de um animal imunizado e fundindo-se as células com células de mieloma, para, desse modo, produzir hibridomas que possam produzir anticorpos monoclonais. As células de hibridoma que produzem um anticorpo que pode reconhecer uma proteína de interesse ou um frag- mento desta podem ser selecionadas com base em uma técnica bem conhecida na técnica (por exemplo, ELISA, Western blotting, ou radioimunoensaio). Então, o hibridoma que secre- . ta um anticorpo de interesse é clonado, e as células obtidas são culturadas sob condições ; 15 apropriadas. O anticorpo assim secretado é recuperado e purificado através de um método " bem conhecido na técnica (por exemplo, cromatografia em coluna de troca iônica ou croma- *. tografia de afinidade). Em um procedimento alternativo, um anticorpo monoclonal humano pode ser produzido através do uso de uma cepa de Xenomouse (vide Green, J. Immunol.

“ Methods 231: 11-23, 1999; e Wells, Eek, Chem. Biol. 2000 Aug; 7(8): R185-6). Atualmente, realiza-se a produção de anticorpo monoclonal com base na exibição de fago que não en- volve imunização. O anticorpo monocional da presente invenção é um anticorpo de espécie molecular única produzido por uma espécie única de células produtoras de anticorpo ou um fragmento de DNA obtido a partir destas e que codifica o anticorpo. O anticorpo monoclonal pode ser produzido através de qualquer um dos métodos supramencionados.

O fragmento de DNA que codifica um anticorpo monoclonal pode ser prontamente isolado e sequenciado através de um método de rotina (por exemplo, através do uso de uma sonda de oligonucleotídeo que pode se ligar especificamente a genes que codificam a ca- deia pesada e a cadeia leve do anticorpo monocional). Uma célula de hibridoma é um mate- rial de partida preferencial para produzir tal fragmento de DNA. Após o isolamento, tal frag- —mentode DNA é inserido em um vetor de expressão, e o vetor é recombinado a células hospedeiras, tais como células E. coli, células de macaco COS, células de ovário de hams- ter chinês (CHO) ou células de mieloma nas quais não se produz imunoglobulina a não ser que as células sejam transformadas. O anticorpo monoclonal de interesse é produzido pelas células hospedeiras recombinantes. Em um modo alternativo, um anticorpo ou um fragmen- —tode anticorpo pode ser isolado de uma biblioteca de fago de anticorpo produzida através de uma técnica de McCafferty et al. (Nature 348: 552-554 (1990)).

A célula hospedeira empregada para expressão de anticorpo monocional é, de pre-

ferência, uma célula hospedeira de origem mamiífera.

Pode-se utilizar uma célula hospedeira mais adequada a um anticorpo monocional a ser expressado.

A célula hospedeira não é limitada, e exemplos típicos desta incluem uma linhagem celular originária de CHO (célula de ovário de hamster chinês), CV1 (rim de macaco), COS (antígeno SV40T de expressão ' 5 derivado de CV1), SP2/0 (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camun- dongo), 293 (rim humano), e 293T (antígeno SV40T de expressão derivado de 293). A célula ' hospedeira system pode ser obtida a partir de um estabelecimento comercial, a American Tissue Culture Collection (ATCC), ou de uma organização que publicou um documento rele- vante.

De preferência, a célula hospedeira é uma linhagem celular originária de CHO des- provida de expressão gênica de dhfr (deleção em expressão gênica de dhfr) ou SP2/0 (vide Urland, G. et al., Effect of gamma rays at the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions; Somat.

Cell.

Mol.

Genet.

Vol. 12, 1986, p. 5555-566; and Schulman, M. et al, À . better cell line for making hybridomas secreting specífic antibodies, Nature Vol. 276, 1978, p. 269-270). Com mais preferência, a célula hospedeira é uma CHO com DHFR deletado.

À J transfecção de um plasmídeo nas células hospedeiras pode ser realizada através de qual- . quer técnica.

A técnica de transfecção não é limitada e exemplos específicos desta incluem transfecção (incluindo método de fosfato de cálcio, método de DEAE, lipofecção, e eletropo- s ração), incorporação de DNA através do uso de um envelope (por exemplo, vírus Sendai), micro-injeção, e infecção através do uso de um vetor viral (por exemplo, retrovírus ou ade- novírus) (vide Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 9 Introduction of DNA into Mammalian Cells, John Wiley and Sons, Inc.). Dentre estes, a incorporação de plasmídeo em células hospedeiras através de eletroporação é particularmente preferencial.

O sítio de reconhecimento em caderina do anticorpo anti-caderina da presente in- | vençãoé,de preferência, uma região de 1 a 655 de SEQ ID NO: 2. | O anticorpo anti-caderina da presente invenção é preferencialmente produzido a | partir de um hibridoma PPMX2016, PPMX2025, PPMX2029, PPAT-052-02, PPAT-052-03, | PPAT-052-09, PPAT-052-24, PPAT-052-25, PPAT-052-26, ou PPAT-052-28, ou uma linhagem | celular de CHO transgênica PPAT-052-27c, PPAT-052-02c, PPAT-052-03c, PPAT-052-09c, ; —PPAT-O052-21c, PPAT-O52-24c, PPAT-052-25c, PPAT-052-26c, PPAT-052-28c, ou PPAT-052- 29c.

No presente relatório descritivo, os números anexados a PPMX ou PPAT são dados em células produtoras de anticorpo correspondentes ou anticorpos produzidos pelas células produtoras de anticorpo.

Um metal radioativo que é ligado ao anticorpo anti-caderina é, de preferência, um metal radioativo citotóxico quando o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo for usado como um agente terapêutico contra câncer, e um metal radioativo não-citotóxico quando o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo for usado como um agente de diagnóstico de câncer. Exemplos dos metais radioativos citotóxicos incluem ítrio-90 (90Y), rênio-186 (186Re), rênio-188 (188Re), cobre-67 (67Cu), ferro-59 (59Fe), estrôncio-89 (89Sr), ouro-198 (198Au), mercúrio-203 (203Hg), chumbo-212 (212Pb), disprósio-165 (165Dy), rutênio-103 : 5 (103RU), bismuto-212 (212Bi), bismuto-213 (213Bi), hólmio-166 (166Ho0), samário- 153(153Sm), e lutêtio-177 (177LU).

' Dentre estes metais radioativos, 90Y, 153Sm, e 177Lu são preferenciais, a partir dos pontos de vista de meia-vida, energia de radiação, facilidade da reação de marcação, percentual de marcação, estabilidade complexa, etc.

Um metal radioativo não-citotóxico empregado de modo adequado em um agente de diagnóstico de câncer não é limitado e exemplos deste incluem tecnécio-99m (99mTc), índio-111 (111In), índio-113m (113min), gálio-67 (67Ga), gálio-68 (68Ga), tálio-201 (201TI), cromo-51 (51Cr), cobalto-57 (57Co), cobalto-58 (58Co), cobalto-60 (60Co), estrôncio-85 . (85Sr), mercúrio-197 (197Hg), e cobre-64 (64Cu).

Para ligação de um elemento metálico radioativo ao anticorpo anti-caderina, em um o modo preferencial, um reagente quelante metálico é reagido com o anticorpo anti-caderina, . e o produto é adicionalmente reagido com um elemento metálico radioativo, para, desse modo, formar um complexo. No anticorpo modificado assim produzido, o elemento metálico * radioativo é ligado ao anticorpo anti-caderina através do reagente quelante metálico.

Exemplos do reagente quelante metálico para formar tal complexo incluem (1) deri- vados de quinolina, tal como 8-hidróxi quinolina, 8-acetóxi quinolina, 8-hidróxi quinaldina, suldato de oxiquinolina, O-acetiloxina, O-benzoiloxina, O-p-nitrobenzoiloxina, e compostos de quinolona tendo um esqueleto de quinolina (por exemplo, norfloxacina, ofloxacina, eno- xacina, ciprofloxacina, lomefloxacina, tosfloxacina, fleroxacina, e esparfloxacina); (2) com- postos, como ácido cloranílico, aluminon, tiourea, pirogalol, cupferron, Bismutiol (II), ácido gálico galoil, tiolida, 2-mercaptobenzotiazola, e cloreto de tetrafenilarsonio; (3) ácido etileno- diamina tetraacético (EDTA), ácido dietilenotriamina pentaacético (DTPA), e compostos ten- do um esqueleto similar (diidróxi etilglicina, ácido diaminopropano traacético, ácido etilenodi- amina diacético, cloridrato de ácido etilenodiamina dipropiónico, ácido hidróxi etil etilenodia- mina triacético, ácido etilenodiamina tetrakis(metilenosulfônico), ácido diamina tetraacético, ácido hexametileno diamina tetraacético, ácido hidróxi etilimino diacético, ácido iminodiacéti- co, ácido diaminopropano tetraacético, ácido nitrilo triacético, ácido nitrito tripropiônico, sal trissódico do ácido nitrilotris(metilenosulfônico), ácido trietileno tetramina hexaacético, metil DTPA, cicloexil DTPA, aminobenzil EDTA, isotiocianobenzil EDTA, isotiocianobenzil DTPA, — metilisotio cianobenzil DTPA, cicloexilisotio cianobenzil DTPA, maleimidopropil amidobenzil EDTA, maleimidopentil amidobenzil EDTA, maleimidodecil amidobenzil EDTA, maleimido- pentil amidobenzil DTPA, e maleimidodecil amidobenzil DTPA); e ácido (4)1,4,7,10-

O ºººOOOCEEEEE—-——-pueWes.ssseNeNPeAWÓNÔ...s err 10/27 tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7- triacético (NOTA), ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético (TETA), 1,4,7,10-tetraazaciclododecano (Cyclen), 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (Cyclam), isotio- cianobenzil DOTA, e isotiocianobenzil NOTA. ' 5 Dentre estes reagentes quelantes metálicos, isotiocianobenzil DOTA, metilisotio ci- anobenzil DTPA, cicloexilisotio cianobenzil DTPA são preferenciais, a partir dos pontos de ' vista de facilidade de incorporação da reação de metal-quelato ao anticorpo, porcentagem de marcação, estabilidade complexa, etc.

O elemento metálico radioativo pode ser ligado ao anticorpo anti-caderina através de um método de rotina.

Em um procedimento, um reagente quelante metálico é reagido com um anticorpo anti-caderina, para; desse modo, preparar um precursor de marcação, e o precursor é reagido com um elemento metálico radioativo.

No agente terapêutico contra câncer e no agente de diagnóstico de câncer da pre- . sente invenção, a razão molar entre o anticorpo anti-caderina e o reagente quelante metáli- coé importante para o acúmulo em células cancerígenas e para o efeito anticancerígeno.

À - razão molar (anticorpo anti-caderina:reagente quelante) é, de preferência, 1:0,1 a 1:4,5, com ". mais preferência, 1:0,5 a 1:3. Com a finalidade de alcançar tais razões molares, o anticorpo anti-caderina e o reagente quelante são preferencialmente adicionados para reagirem em * uma razão de 1:0,1 a 1:menor que 5, com preferência particular, 1:1 a 1:3. O número de — moléculas quelantes por anticorpo anti-caderina pode ser calculado medindo-se o peso mo- mos lecular através da análise de massa MALDI-TOF ou de uma técnica similar, e comparando- se o peso molecular de um anticorpo não-modificado àquele de um anticorpo modificado (Publicação de Patente US No. 7514078, Lu et al., J.

Pharm.

Sci. 94(4), 2005, p. 788-797, e Tedesco et al., J.

Clin.

Onco. 23 (168), 2005, 4765). Alternativamente, o número de molécu- las quelantes por anticorpo anti-caderina pode ser determinado através de uma titulação quelatométrica.

Um método conhecido emprega um reagente colorimétrico de metal alcalino terroso (arsenazo Ill) (Bradyr et al., Nucl.

Med.

Biol. 31, 795-802, 2004, e Dadachova et al., Nucl.

Med.

Biol. 26, 977-982, 1999). | O agente terapêutico contra câncer ou o agente de diagnóstico de câncer da pre- Í sente invenção podem ser proporcionados como uma formulação marcada ou como uma | formulação de kit contendo um precursor de marcação.

Qualquer formulação pode ser em- | pregada na presente invenção.

No caso de uma formulação marcada, um agente terapêuti- | co contra câncer ou um agente de diagnóstico de câncer contendo um anticorpo anti- caderina marcado pode ser administrado como é.

No caso de uma formulação de kit, o a- gente pode ser administrado após a marcação com um elemento metálico radioativo de inte- resse.

O anticorpo anti-caderina contendo um elemento metálico radioativo ligado a ele se

——————————MMMNMNMNMNMNN—n-—--—-—-—-—--------ss-.-sssssssssseeeeoeÓrrrrrÓÓvvzvzvzvzvvzvzzs 11/27 acumula altamente em tecido cancerígeno e exibe uma alta atividade tóxica sobre células cancerígenas. Portanto, o anticorpo é um agente terapêutico contra câncer útil que menos danifica tecidos além dos tecidos cancerígenos e que apresenta alta segurança. Da mesma forma, o anticorpo anti-caderina contendo um elemento metálico radioativo ligado a ele tem 7 5 uma atividade anticancerígeno consideravelmente maior que aquela de um anticorpo anti- caderina correspondente. A atividade anticancerígena é consideravelmente alta, particular- ' mente quando a razão molar entre anticorpo e agente quelante for 1:0,1 a 1:4,5.

O agente terapêutico contra câncer da presente invenção pode ser usado em com- binação com outro agente anticancerígeno. Exemplos de tal agente anticancerígeno incluem um agente de alquilação, um antimetabólito, um inibidor de microtúbulo, um agente antican- cerígeno antibiótico, um inibidor de topoisomerase, um agente de platina, um fármaco de alvo molecular, um agente hormonal, e um produto biológico. Exemplos do agente de alqui- lação incluem agentes anticancerígeno de mostarda de nitrogênio (por exemplo, ciclofosfa- . mida), agentes anticancerígenos de nitrosourea (por exemplo, ranimustina), e dacarbazina. Exemplos do antimetabólito incluem 5-FU, UFT, carmofur, capecítabina, tegafur, TS-1, gem- J citabina, e citarabina. Exemplos do inibidor de microtúbulo incluem agentes anticancerígeno ". alcalóides (por exemplo, vincristina) e agentes anticancerígenos de taxano (por exemplo, docetaxel e paclitaxel). Exemplos do agente anticancerígeno antibiótico incluem mitomicina . C, doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, e bleomicina. Exemplos do inibidor de topoiso- —merase incluem irinotecano e nogitecano tendo uma atividade inibitória de topoisomerase | e etoposido tendo uma atividade inibitória de topoisomerase Il. Exemplos do agente de platina incluem cisplatina, paraplatina, nedaplatina, e oxaliplatina. Exemplos do fármaco de alvo molecular incluem trastuzumab, rituximab, imatinib, gefitinib, erlotinib, bevacizumab, borte- zomib, sunitinib, e sorafenib. Exemplos do agente hormonal incluem dexametasona, finaste- rida,etamoxifeno. Exemplos do produto biológico incluem interferons a, B, e y e interleucina

2.

O agente terapêutico contra câncer da presente invenção pode ser usado em com- binação com uma terapia contra câncer. Exemplos de terapia contra câncer incluem cirurgia, terapias de radiação (incluem terapia de faca gama, terapia de faca Cyber, terapia de captu- —rade nêutrons por boro, e terapia de feixes de próton/feixes de íons pesados), cirurgia ultra- sônica focalizada guiada por MR, crioterapia, ablação por radiofrequência, terapia de injeção de etanol percutânea, e emboloterapia.

O agente terapêutico contra câncer da presente invenção é eficaz em vários tipos de câncer de um mamífero (incluindo seres humanos). Exemplos do câncer alvo incluem — carcinomas, tal como câncer faringeal, câncer laringeal, câncer de língua, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer esofageal, câncer de estomago, câncer colorretal, câncer uterino, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de vesícula biliar, câncer de

TOP O!]!Ô!ÔÉÔôÔ!ôÔ!Ô!Ô]Ô]Ô!]Ô]ÔÔÉÔÉ——sssss-=————----------------------———————————— 12/27 rim, câncer prostático, melanoma maligno, e cancer de tireóide; e sarcomas, tais como oste- osarcoma, condrosarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, liposarcoma, angiosarcoma, fibrosarcoma, leucemia, linfoma maligno, e mieloma.

O agente terapêutico contra câncer da presente invenção pode ser dissolvido em ' 5 uma solução aquosa, de preferência, um tampão fisiologicamente adaptável, tal como solu- ção de Hanks, solução de Ringer, ou uma solução salina fisiológica tamponada.

Da mesma ' forma, ao agente terapêutico pode ter a forma de suspensão, solução, emulsão, ou simila- res, em um veículo oleoso ou aquoso.

A dosagem do agente terapêutico contra câncer da presente invenção, que varia de — acordo com os sintomas, rota de administração, peso corporal, idade, etc, de um paciente em necessidade deste, é, de preferência, por exemplo, igual a 37 a 3.700 MBq para um tra- tamento em um adulto.

Em geral, o agente terapêutico contra câncer da presente invenção é administrado . parenteralmente.

Por exemplo, o agente terapêutico contra câncer é injetado (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitonealmente) ou administrado transdérmica, " transmucosa, transnasal, transpulmonarmente, etc. ". O agente de diagnóstico de câncer da presente invenção pode ser usado na forma- ção de imagem do tumor.

No caso onde um paciente tem um tumor no qual a proteína CDH3 ” é expressada, o agente de diagnóstico de câncer da presente invenção se acumula no tu- mor Portanto, o tumor pode ser capturado em imagens detectando-se a radiação por meio de um aparelho, tal como um tomógrafo computadorizado por emissão de fóton único (SPECT), um tomógrafo por emissão de pósitron (PET), ou uma câmera de cintilação.

Por exemplo, através do uso do agente de diagnóstico de câncer da presente invenção, o efeito terapêutico do agente terapêutico contra câncer da presente invenção pode ser previsto an- tesda administração do agente terapêutico.

O agente de diagnóstico é administrado a um paciente antes do tratamento, e o tumor é capturado em imagens.

Quando um alto acúmulo for observado, o efeito superior do agente terapêutico pode ser previsto como potente.

O agente de diagnóstico pode ser usado para determinar o efeito terapêutico.

O agente de diagnóstico da presente invenção é administrado a um paciente que recebeu o tratamento como agente terapêutico da presente invenção ou qualquer outro tratamento com a finali- dade de formar imagens do tumor.

Através do monitoramento da variação dependente do tempo no acúmulo do agente de diagnóstico, pode-se observar a expansão ou encolhimento do tumor com o passar do tempo.

O anticorpo para uso como um agente de diagnóstico reconhece, de preferência, um epítopo competitivo a um agente terapêutico.

Com mais preferência, o anticorpo reco- nhece o mesmo epítopo reconhecido pelo agente terapêutico.

Com a máxima preferência, o agente terapêutico e o agente de diagnóstico são o mesmo anticorpo.

co SS /? XY ÔÔ1Ô)á—24GrRRa a cm“ OO OOOOOYOUOOOOUOUOO O OOONO——LºÉºÉLÉELÉLÉLLLEEELEEE.A.————-—-—-——------—paA 13/27 Em geral, o agente de diagnóstico de câncer da presente invenção é administrado a um indivíduo intravenosamente.

No entanto, o agente de diagnóstico de câncer também pode ser administrado arterialmente.

A dosagem deste, que varia de acordo com os sinto- mas, rota de administração, peso corporal, idade, etc. de um paciente em necessidade des- . 5 te, é,de preferência, por exemplo, igual a 37 a 1.120 MBq para um tratamento em um adul- to. " Exemplos A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes por meio de exemplos, que não devem ser construídos como limitantes à invenção.

Exemplo 1: Produção do antígeno CDH3 solúvel A proteina CDH3 (sSCDH3) solúvel-na qual se removeu a região transmembranar C- terminal foi produzida para servir como um imunógeno para produção de um anticorpo anti- CDH3. . (1) Produção de vetor de expressão de antígeno CDH3 solúvel Realizou-se um PCR através do uso de um cDNA de CDH3 de comprimento inteiro " como um modelo e um iniciador na direção (SEQ ID NO: 3: CGCGGTAC- "a.

CATGGGGCTCCCTCGT, (hCDH3FUIIFW)) e um iniciador inverso (SEQ ID NO: 4: CCGTC- TAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC, (hCDH3SoIbRV)), que foi projetado para amplificar um : segmento correspondente à região extracelular CDH3 (1-654 em SEQ ID NO: 2, nas partes quese seguem do presente documento referido como SCDH3cDNA). A reação foi realizada . através do uso de KOD-Plus (um produto da Toyobo) e sob as condições a seguir: 94ºC-15 seg, 55ºC-30 seg, e 68ºC-90 seg (30 ciclos)). Após o término da reação de PCR, a mistura de reação foi submetida à eletroforese em gel de agarose, e um pedaço de gel contendo uma banda de um tamanho alvo (cerca de 2,0kbp)foicortado.

O SCDH3cDNA alvo foi recuperado do pedaço de gel pelo uso de um kit de extração rápida de gel QIA (um produto da Quiagen). Com a finalidade de inserir SCDH3cDNA em um vetor de expressão PEF4/myc- HisB, sSCDH3cDNA foi tratado com duas enzimas de restrição Kpnl e Xbal.

O fragmento as- sim obtido foi inserido em pEF4/myc-HisB que foi tratado com as mesmas enzimas de restri- —çãoKpnle Xbal, pelo uso de T4 DNA ligase através de uma técnica de rotina, por meio da qual um vetor de expressão pEF4-sCDH3-myc-His foi produzido. (2) Expressão de proteina CDH3 solúvel De acordo com um protocolo de um reagente de transfecção FUGENES6, 8 x 105 cé- lulas de CHO foram inoculadas em uma placa de 10 cm de diâmetro no dia anterior à trans- fecção,eascélulasforam culturadas de um dia para o outro.

Posteriormente, um vetor de expressão pEF4-sCDH3-myc-His (8 ug) e um reagente FUGENES6 (16 uL) foram misturados com um meio RPMI 1640 livre de soro (400 uL), e a mistura foi deixada descansar em tem-

peratura ambiente durante 15 minutos.

A mistura resultante foi adicionada ao líquido de cul- tura celular para transfecção.

Dois dias após a transfecção, realizou-se uma clonagem limi- tando-se a diluição através do uso de um reagente de seleção (Zeocin). As células de CHO de expressão de CDH3 solúveis foram selecionadas através de ' 5 Western blotting pelo uso de um anticorpo monoclonal anti-c-Myc (um produto da SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). As linhagens celulares exibiram um alto nível de secreção no ' sobrenadante de cultura e alta proliferação foram selecionadas para obter uma linhagem celular de CHO de expressão de CDH3 solúvel (EXZ1702). As células de CHO de expres- são de CDH3 solúveis assim selecionadas (EXZ1702) foram culturadas durante 72 horas emtrês garrafas rotatórias (cada área de cultura: 1,500 em2) com um meio CHO-S-SFM-II livre de soro (333 mL/garrafa) (um produto de- Invitrogen), e os sobrenadantes de cultura foram recuperados, O sobrenadante de cultura assim obtido foi submetido à cromatografia de afinidade por meio de uma coluna HP HisTrap (marca registrada) (produto de GE Health- . care Bio-science) e cromatografia de filtração em gel por meio de uma coluna 200 pg Su- —perdex (marca registrada) (produto de GE Healthcare Bio-science), para, desse modo, ad- Í quirir uma proteína CDH3 solúvel. " Exempló 2: Estabelecimento da linhagem celular de CHO de expressão de CDH3 Com o intuito de obter uma linhagem celular para triagem de anticorpo anti-CDH3, be estabeleceu-se uma linhagem celular de CHO que expressa CDH3 de comprimento inteiro. (1) Produção do vetor de expressão gênica de CDH3 Com a finalidade de inserir um DNA de CDH3 humano de comprimento inteiro re- presentado por SEQ ID NO: 1 em um vetor de expressão de mamíferos PEF4/myc-HisB (produto de Invitrogen), o DNA de CDH3 humano de comprimento inteiro foi tratado com duas enzimas de restrição Kpnl (produto de Takara Bio Inc.) e Xbal (produto de Takara Bio Inc)em37ºC durante uma hora.

O fragmento assim obtido foi inserido em PEF4/myc-HisB que foi tratado com as mesmas enzimas de restrição Kpnl e Xbal, pelo uso de T4 DNA liga- se (produto de Promega) através de uma técnica de rotina, por meio da qual um vetor de expressão pEF4-CDH3-myc-His foi produzido. (2) Aquisição de linhagem de expressão de CDH3 estável | De acordo com um protocolo de um reagente de transfecção (produto de Roche Di- agnostics K.K.) FUGENE 6 (marca registrada), 8 x 105 células de CHO foram inoculadas em uma placa de 10 cm de diâmetro no dia anterior à transfecção, e as células foram culturadas de um dia para o outro.

Posteriormente, um vetor de expressão PEF4-sCDH3-myc-His (8 ug) e um reagente FUGENES (16 uL) foram misturados com um meio RPMI 1640 livre de soro — (produto de SIGMA-ALDRICH) (400 uL), e a mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente durante 15 minutos.

A mistura resultante foi adicionada ao líquido de cultura celu- lar para transfecção.

Dois dias após a transfecção, realizou-se uma clonagem limitando-se a ii SHÀ o tan AO 15/27 diluição através do uso de um reagente de seleção (Zeocin). Os clones de CHO de expressão de CDH3 de comprimento inteiro foram seleciona- dos através de Western blotting pelo uso de um anticorpo monoclonal anti-c-Myc (produto de SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). Como resultado, a linhagem celular de CHO de expres- * 5 sãodeCDH3 de comprimento inteiro (EXZ1501) foi selecionada como uma linhagem celular que exibia um alto nível de expressão e alta proliferação.

A reação entre EXZ1501 e um an- ' ticorpo anti-CDH3 comercial (produto de R&D SYSTEMS) foi confirmada através de citome- tria de fluxo.

Ou seja, a expressão da proteina CDH3 na membrana celular de EXZ1501 foi conformada, Exemplo 3: Produção de anticorpo monocional anti-CDH3 11) Produção de anticorpo monocional pelo uso da proteina CDH3 solúvel como um imunógeno A proteína CDH3 solúvel (50 ug) dissolvida em uma solução salina fisiológica foi - misturada com uma quantidade igual de Titer-MAX Gold (marca registrada) (produto de Titer Max)) e a mistura foi injetada intraperitoneal e subcutaneamente em um camundongo - MRL/Ipr (Japan SLC inc.) para imunização inicial.

Realizaram-se procedimentos de imuniza- "o. ção subsequentes injetando-se intraperitoneal e subcutaneamente, ao camundongo, uma mistura de proteina CDH3 solúvel (25 ug) e Titer-MAX Gold preparada da mesma maneira. ' Três dias após a imunização final, prepararam-se células do baço do camundongo sob con- —dições assépticas, e as células foram fundidas com as células de mieloma de camundongo SP2/0-Ag14 ou P3-X63-Ag8.653 através de um método de polietileno glicol genericamente empregado. (2) Seleção de hibridomas produtores de anticorpo anti-CDH3 anticorpo A seleção de anticorpos anti-CDH3 foi realizada através de citometria de fluxo pelo uso de uma linhagem celular de CHO de expressão de CDH3 de comprimento inteiro (EXZ1501). De modo específico, as células de CHO de expressão de CDH3 de comprimento in- teiro (EXZ1501) foram removidas de uma placa de cultura tratando-se com 2mM de EDTA- PBS e suspensas em uma solução de FACS a uma concentração celular de 1 x 106 célu- las/mL.

A suspensão celular foi inoculada em uma placa de 96 poços a uma concentração de 50 uL/poço, e um sobrenadante de cultura de hibridoma foi adicionado à mesma, seguido pela reação em 4ºC durante 60 minutos.

A placa foi lavada duas vezes com uma solução de | FACS (200 ul/poço), e F(ab')2 de cabra anticcamundongo IgG marcado com Alexa Fluor | 488 (produto de Invitrogen) foi adicionado, seguido pela reação em 4ºC durante 30 minutos. — De modo subsequente, a placa foi lavada duas vezes com uma solução de FACS, e reali- zou-se citometria de fluxo, para, desse modo, selecionar hibridomas que produzem um anti- corpo que se liga às células de CHO de expressão de CDH3. Como resultado, obtiveram-se

40 clones de PPMX2016 a PPAT-052-28. Através de citometria de fluxo, confirmou-se que todos os hibridomas reagiram com as células de CHO de expressão de CDH3 (EXZ1501) e NCI-H358, porém, não reagem com as células de CHO. Os anticorpos foram purificados a ' partir do sobrenadante de cultura de hibridoma por meio da coluna de Proteína G e empre- Ú 5 gados nos experimentos subsequentes. Dentre os hibridomas selecionados, PPMX2016 (NITE BP-897), PPMX2025 (NITE BP-898), PPMX2029 (NITE BP-899), PPAT-052-02 (NITE BP-1034), PPAT-052-03 (NITE BP-1035), PPAT-052-09 (NITE BP-1036), PPAT-052-24 (NITE BP-1037), PPAT-052-25 (NITE BP-1038), PPAT-052-26 (NITE BP-1039), e PPAT-052- 28(NITE BP-1040) foram depositados por Incorporated Administrative Agency, the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (2-5-8, Kazusa- kamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japão) em 10 de fevereiro de 2010 e 18 de janeiro de 2011. Exemplo 4: Clonagem de genes de anticorpo (1) Um fragmento de DNA que codifica a região V de um anticorpo monoclonal de + camundongo em: CDH3 humano foi clonado através do procedimento a seguir. O RNA cito- —plásmico foiisolado das células de hibridoma de camundongo através de um método descri- " to em um documento (Gough, “Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from o small numbers of cells,” Analytical Biochemisty, 173, p. 93-95 (1988)), com a condição de que ao invés do tampão de dissolução descrito no documento, empregou-se um tampão de ' TNE (isto é, 25mMM de Tris-HCI, pH: 7,5; 1% de NP-40; 150mM de NaCl; ImM de EDTA, pH:

8.0). Demodo mais específico, 5 x 106 células de hibridoma foram suspensas no tampão de TNE (200 uL), para, desse modo, dissolver as membranas celulares, e os núcleos celulares foram removidos através de centrifugação. Ao sobrenadante de citoplasma assim obtido (cerca de 200 ul), um tampão de extração (10mM de Tris-HCl, pH: 7,5; 0,35M de NaCl; 1%(p/v) de SDS; 10mM de EDTA, pH: 8,0; 7M de ureia) (200 uL) foi adicionado. A mistura foi submetida à extração com fenol e clorofórmio. À solução de RNA assim obtida, adicionou-se glicogênio (produto de Roche, Cat No. 901393) que serve como um carreador. Então, adi- cionou-se etanol para precipitar o produto. O precipitado de RNA foi dissolvido em água des- tilada esterilizada (10 a 50 uL) a uma concentração de RNA citoplásmico de 0,5 a 2 ug/uL. (2) Produção da biblioteca de CDONA do RNA preparado a partir de hibridomas Para sintetizar um cDNA de fita única, preparou-se uma mistura de reação (20 ul) contendo o RNA citoplásmico preparado anteriormente (0,5 a 3 ug), SOMM de Tris-HC! (pH: 8,3, temperatura ambiente), 79SmM de KCl, 3mM de MgCi2, e 10mM de DTT), um iniciador aleatório (100 ng), 0,5SmMM de dNTP, e Superscript Il (transcriptase reversa, produto de Invi- trogen) (200 unidades). A mistura foi incubada em 42ºC durante 50 minutos. A biblioteca de cDNAassim sintetizada foi empregada como um modelo de reação de cadeia de polimerase (PCR) sem realizar um tratamento adicional. (3) Amplificação de um gene que codifica uma região variável de anticorpo anti-

CDH3 através de PCR Todos os iniciadores empregados nos experimentos foram sintetizados por Hokkai- do System Science Co,, Ltd.

A.

Iniciadores para uso na amplificação de PCR de um gene que codifica a região V : 5 decadeiaLem camundongos Os dois conjuntos de iniciadores a seguir foram empregados: (i) um iniciador de ' DNA tendo, na terminação 5', uma homologia à parte FR1 e iniciadores de conjunto 4 tendo, na terminação 3', uma homologia a um gene de cadeia J na cadeia L em camundongos, e (ii) iniciadores de conjunto 7 tendo, na terminação 5', uma homologia à parte de sinal de ca- deiaLe um iniciador de anti-sentido tendo, na terminação 3', uma homologia à parte KO (iniciador de anti-sentido KVL). A reação de cadeia de polimerase foi realizada através do uso dos dois conjuntos de iniciadores, por meio dos quais um fragmento de DNA de região variável de cadeia L de imunoglobulina em camundongos foi obtido a partir de CONA.

As . sequências iniciadoras são as seguintes. (i) Iniciadores de conjunto 4 para clonagem de região variável de cadeia L em ca- "” mundongos .. De acordo com “Phage Display —A Laboratory Manual-, Barbas Burton Scott Silver- man," PROTOCOL 9.5, 17 iniciadores de sentido e 3 iniciadores inversos foram sintetizados ' por Hokkaido System Science Co,, Ltd.

Sentido VK (parte FR1) Empregou-se uma mistura dos 17 iniciadores a seguir como um iniciador de sentido VK. 8'-GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC-3' (degeneração 2): SEQ ID NO: 5 5'-GAY ATT GTT CTC WCC CAG TC-3' (degeneração 4): SEQ ID NO: 6 8'-GAY ATT GTG MTM ACT CAG TC-3' (degeneração 8): SEQ ID NO: 7 5' GAY ATT GTG YTRACA CAG TC-3' (degeneração 8): SEQ ID NO: 8 5' GAY ATT GTR ATG ACM CAG TC-3' (degeneração 8): SEQ ID NO: 9 5' GAY ATT MAG ATR AMC CAG TC-3' (degeneração 16): SEQ ID NO: 10 8' GAY ATT CAG ATG AYD CAG TC-3' (degeneração 12): SEQ ID NO: 11 5' GAY ATY CAG ATG ACA CAG AC-3' (degeneração 4): SEQ ID NO: 12 8' GAY ATT GTT CTC AWC CAG TC-3' (degeneração 4): SEQ ID NO: 13 8' GAY ATT GWG CTS ACC CAA TC-3' (degeneração 8): SEQ ID NO: 14 5' GAY ATT STR ATG ACC CAR TC-3' (degeneração 16): SEQ ID NO: 15 5' GAY RTT KTG ATG ACC CAR AC-3' (degeneração 16): SEQ ID NO: 16 5' GAY ATT GTG ATG ACB CAG KC-3'(degeneração 12): SEQ ID NO: 17 5' GAY ATT GTG ATAACY CAG GA-3' (degeneração 4): SEQ ID NO: 18 5' GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT-3' (degeneração 4): SEQ ID NO: 19

O 2 V"“P*=NT———-—-—-A A ,=======..—=AA=A=-=,."""?. "2" . nÁ—Eac.-e.eePe.e.*Ú . 18/27 85' GAY ATT GTG ATG ACA CAA CC-3' (degeneração 2): SEQ ID NO: 20 &8' GAY ATT TTG CTG ACT CAG TC-3' (degeneração 2): SEQ ID NO: 21 Anti-sentido J (iniciadores de conjunto 4) Iniciador anti-sentido J1/J2 (1) ' 5 5'-GGS ACC AAR CTG GAA ATM AAA-3' (degeneração 8): SEQ ID NO: 22 Iniciador anti-sentido J4 (2) : 5-GGG ACA AAG TTG GAA ATA AAA-3': SEQ ID NO: 23 Iniciador anti-sentido J5 (3) 5'-GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA-3': SEQ ID NO: 24 Mistura de iniciador anti-sentido J1/J2, J4, J5 (4) (ii) Iniciadores de conjunto 7 para clonagem de região variável de cadeia L em ca- mundongos Sentido VK (parte de peptídeo de sinal) . Os iniciadores foram obtidos através de modificação de sequência de nucleotídeo de um conjunto de iniciador de camundongo lg (Novagen; Merck, Cat.

No. 69831-3) de tal Lo modo que os sítios de enzima de restrição tenham sido removidos. ",. Iniciador de sentido de conjunto A 5-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3': SEQ ID NO: 25 , Iniciador de sentido de conjunto B 5-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3': SEQ ID NO: 26 . Iniciador de sentido de conjunto C S8-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3": SEQ ID NO: 27 Iniciador de sentido de conjunto D (mistura dos 2 iniciadores a seguir) 8-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3': SEQ ID NO: 28 8-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3": SEQ ID NO: 29 Iniciador de sentido de conjunto E (mistura dos 3 iniciadores a seguir) 8-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3': SEQ ID NO: 30 8-ATGTGGGGAY CGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3': SEQ ID NO: 31 5-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCOTCTTCCO-3'": SEQ ID NO: 32 Iniciador de sentido de conjunto F (mistura dos 4 iniciadores a seguir) S5-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3": SEQ ID NO: 33 5-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3': SEQ ID NO: 34 8-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3": SEQ ID NO: 35 5-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3'": SEQ ID NO: 36 Iniciador de sentido de conjunto G (mistura dos 4 iniciadores a seguir) S-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3': SEQ ID NO: 37 8-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3": SEQ ID NO: 38

— P- Rx]RegeúNÃAAA AAA O A Iii NO seo osooso o ooo oo Rss» eos ssssssssssssedssd0ELSHHEEEEEEEEEEEEZZZZHEEEEEEEELLLLEEEEEEER 19/27 58"-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3': SEQ ID NO: 39 5-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3': SEQ ID NO: 40 Iniciador anti-sentido KVL ACTGGATGGTGGGAAGATGGA: SEQ ID NO: 41 ' 5 B.

Iniciadores para uso na amplificação de PCR de um gene que codifica uma regi- ão V de cadeia H em camundongos ' Os dois conjuntos de iniciadores a seguir foram empregados em iniciadores de con- junto 4 tendo, na terminação 5', uma homologia à parte de sinal de cadeia H em camundon- gos e um iniciador tendo, na terminação 3', uma homologia à parte KC; e iniciadores de con- junto 1 tendo, na terminação 5', uma homologia à parte FR1 e iniciadores de conjunto 2 ten- do, na terminação 3', uma homologia' à região constante de cadeia H em camundongos (IGHC). A reação de cadeia de polimerase foi realizada através do uso de dois conjuntos de iniciadores, por meio dos quais um fragmento de DNA de região variável de cadeia H de . imunoglobulina em camundongos foi isolado do cDNA.

As sequências iniciadoras são as seguintes.

SJ (1) Iniciadores para clonagem de região variável de cadeia H em camundongos t.

Sentido VH (parte de sinal: iniciadores de conjunto 4) Estes iniciadores foram sintetizados de acordo com Current Protocols in Immuno- ' logy (John Wiley and Sons, Inc:), Unit 2.12 Cloning, Expression, e Modification of Antibody V Regions (Tabela2.12.2). 5-ATG GRA TGS AGC TGK GTM.

ATS CTC TT-3' (degeneração: 32): SEQ ID NO: 42 5'-ATG RAC TTC GGG YTG AGC TKG GTT TT-3' (degeneração: 8): SEQ ID NO: 43 58'-ATG GCT GTC TTG GGG CTG CTC TTC T-3': SEQ ID NO: 44 5-ATG GRC AGR CTT ACW TYY-3' (degeneração: 32): SEQ ID NO: 45 (ii) Iniciadores para clonagem de região variável de cadeia H em camundongos Sentido VH (parte FR1) Estes iniciadores foram projetados por modificação de sequência de nucleotídeo de iniciadores de sentido descritos em um documento (Tan et al, “Superhumanized” Antibodies: — Reduction of Immunoogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169 (2002), p. 1119-1125). 5-SAG GTS MAR CTK SAG SAG TCW GG-3'(degeneração: 256): SEQ ID NO: 46 Anti-sentido VH (iniciador de anti-sentido comum a 3 e 4) O iniciador foi projetado através da degeneração da sequência de nucleotídeo de tal modo que o iniciador pudesse ser temperado com todas as isoformas de camundongo 1gG.

e O SP) IS”ÁÁa Hu ""IIPnADAo ca a —>2/ e —>—>—>—FTTETEESSSSMSSSMSMSMMMMEEEMMMMMMMMMMMAAAAAAA 20/27 8'-CAS CCC CAT CDG TCT ATC C-3'(degeneração: 6): SEQ ID NO: 47 Exemplo 5 Produção de vetor de expressão de imunoglobulina anti-CDH3 quimérico Produção do plasmídeo de expressão ' s Através de PCR que emprega o Mecanismo de DNA (Peltier Thermal Cycler, MJ Research, Bio-Rad), cada região variável da cadeia L e da cadeia H de um anticorpo mono- ' clonal de camundongo anti-CDH3 foi amplificada pelo suo dos iniciadores descritos no E- xemplo 4. Cada um dos fragmentos de DNA assim amplificados foi incorporado em um vetor de subclonagem pGEM (produto de Promega). A sequência de nucleotídeo do fragmento de —DNAfoideterminada pelo uso de um iniciador universal que se liga ao promotor T7 e SP6 do vetor.

As sequências de nucleotídeo assim obtidas das regiões variáveis de cadeia L e de cadeia H do anticorpo anti-CDH3 foram buscadas pela página de Busca IMGT/V-QUEST (http://imgt.cines.fr/IMGT vquest/vquest?livret=0&Option=mouselg), desse modo, confirmou- . se o término da clonagem dos genes de anticorpo.

A seguir, um gene que codifica a região Cx humana foi ligado ao gene clonado que O codifica a região V da cadeia L do anticorpo anti-CDH3, e um gene que codifica a região Ck1 *. humana foi ligado ao gene que codifica a região V da cadeia H.

Os genes de anticorpo qui- mérico de cadeia L e de cadeia H assim projetados foram sintetizados em comprimento in- ' teiro por GenScript.

No momento, a frequência de utilização de códon foi otimizada com a finalidade de obter uma expressão de gene eficiente em produzir células (de acordo com um método descrito em Kim et al., Codon optimization for high-level expression of human eryt- hropoietin (EPO) in mammalian cells, Gene, 199, 1997, p. 293-301). De modo específico, no caso de cadeia L, para o propósito de uma translação eficaz, uma sequência de DNA es- sencial (Kozak, M., J., At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.

J.

Mol.

Biol. 196, p. 947-950, 1987), peptídeo de sinal de camundongo IGKV, a região V da cadeia L do anticorpo anti-CDH3, e a região Cx humana foram justapostas nesta ordem, e os sítios de enzima de restrição foram adicionados a am- bas as extremidades (Nhel no lado 5' e EcoRI mo lado 3'). A cadeia H quimérica foi prepara- da da mesma maneira.

Cada um dos genes sintetizados foi cortado com Nhel e EcoRI, e o fragmento cortado foi incorporado em um vetor de expressão pCAGGS entre o sítio Nhel e o sítio EcoRI, para, desse modo, produzir um vetor de expressão de cadeia L de anticorpo quimérico anti-CDH3 pcAGGS-IGK e o vetor de expressão de cadeia H pcAGGS-IGH.

Exemplo 6: produção de vetor de expressão estável de imunoglobulina anti-CDH3 Qquimérico Para realizar uma expressão de nível alto de um gene anticorpo geneticamente modificado em células de CHO, produziu-se um vetor de expressão no qual se incorporou um gene de diidrofolato reductase (dhfr) ligado a uma sequência promotora CMV e tendo um |

1 TT EELEEE—=Z?A A ss a ooo ossos os oRRRRR———JP.5»»»—q—«s so oasss esse sttttEEEEEEEEEEEREEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE 2127 sinal poli A.

Com o intuito de produzir uma linhagem celular para expressar/produzir estavel- mente um anticorpo quimérico, produziu-se um vetor de expressão pcAGGS no qual um gene dhfr foi incorporado. De modo específico, em pcCAGGS-IGH e pCAGGS-IGK, que são : 5 vetoresde expressão transientes, incorporou-se um gene dhfr tendo um promotor CMV e um sinal poli A. Cada gene dhfr de camundongo tendo um promotor CMV e uma sequência ] Kozak e um sinal SVA40 poli A foi amplificado através de PCR. Estes genes sob a forma de mistura foram ligados entre si através de PCR, e um sítio Hindlll foi adicionado a ambas as extremidades do produto ligado, para, desse modo, adquirir um fragmento de gene de Hindl- I-CMV promotor-Kozak-dhfr-poli A-Hindlll. O fragmento foi inserido em pcCAGGS-IGH ou PCAGGS-IGK nos sítios de: Hindlll, para, desse modo, obter pCAGGS-IGH-CMVp-dhfr-A e PCAGGS-IGK-CMVp-dhfr-A. Estes vetores de expressão permitem a expressão de anticor- po quimérico com um promotor CAG, e a expressão de um gene dhfr com um promotor . CMV, desse modo, um anticorpo quimérico pode ser efetivamente produzido através de am- plificaçãode gene. SO Exemplo 7: Estabelecer uma linhagem celular de CHO produtora de anti-CDH3 . Qquimérico As células de CHO dhfr (G. Urlaub et al., Isolation of Chinese hamster cell mutants * deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p. 4216-4220, 1980) foram simultaneamente transformadas pelo uso de dois plasmídeos (plasmídeos line- ares obtidos cortando-se plasmídeos circulares com Pvul em um gene resistente à ampicílli- na); isto é, um vetor pcCAGGS-IGK-CMV-dhfr-A para expressão de cadeia L anti-CDH3 qui- mérico e um vetor pCAGGS-IGH-CMV-dhfr-A para expressão de cadeia H anti-CDH3 quimé- rico. Realizou-se uma eletroporação por meio de Amaxa (produto de Lonza). O fragmento de —DNA(2 ug/amostra; no caso de plasmídeo de cadeia L ou plasmídeo de cadeia H) foi adi- cionado a O,1mL de tampão de CHO de eletroporação por Amaxa contendo 3 x 103 células e um pulso foi aplicado.

As células que foram submetidas à eletroporação foram adicionadas a um meio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM : livre de HT) contendo 10% de FBS dializado que é ; livredeHT(H: hipoxantina, T: timidina). Três dias após a transfecção, o meio foi carregado em um meio de IMDM livre de 10% de FBS dializado, 2mM de L-glutamina, e HT, e neo+ células transformadas foram selecionadas pelo uso de 1 mg/mL de G418, para, desse mo- do, adquirir clones de uma linhagem celular positiva produtora de anticorpo quimérico. De modo subsequente, realizou-se uma amplificação de gene através do uso dos clones sele- cionados utilizando-se G418. Realizou-se uma amplificação de 2 ciclos em 250nM e

1.000nM de metotrexato (MTX), e estabeleceram-se linhagens celulares que podem produzir um anticorpo CDH3 quimérico (cerca de 50 a 100 mg/sobrenadante de cultura L). As linha-

II LITE OO, —ÚÚÚÔ—Ú————— O ARO qse ossos ssssssssssoeosspessssa O ——— Ass secadasscscecccctt], 22/27 gens celulares de CHO para expressar estavelmente um anticorpo anti-CDH3 quimérico assim estabelecidas foram depositadas por Incorporated Administrative Agency, the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary. Tabela 1 - Exemplo 8: Aquisição de anticorpos purificados Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura pelo uso da proteína A. Exemplo 9: Confirmação de afinidade . 10 Através de um método competitivo, a afinidade do anticorpo anti-CDH3 de camun- dongo foi comparada à afinidade do anticorpo anti-CDH3 quimérico. No método competitivo, o a afinidade do anticorpo anti-CDH3 foi determinada através de citometria de fluxo (BD, x FACS Calibur) pelo uso de células cancerígenas NCI-H358, que são conhecidas como sen- do células de alta expressão de CDH3. | i 15 De modo específico, uma amostra serialmente diluída de anticorpo (400 ug/mL a 24 ng/mL) (50 ul) e um anticorpo marcado com Alexa488 (4 ug/mL) (50 uL) foram adicionados e misturados em uma placa de 96 poços. As células NCI-H358 foram removidas de uma placa de cultura através do tratamento com 2mM de EDTA-PBS, e as células foram suspen- sas em uma solução de FACS (1% de BSA PBS) em uma concentração de 1,5 x 106/mL.

Uma alíquota (100 ul) da suspensão foi adicionada aos poços contendo a mistura de anti- corpo. Após a adição, a reação foi realizada em temperatura ambiente durante 60 minutos, e a placa foi lavada duas vezes com uma solução de FACS (200 ul/poço). De modo subse- quente, a intensidade de fluorescência (valor médio de GEO) de cada poço foi determinada através de citometria de fluxo.

O percentual de inibição de ligação do anticorpo marcado com Alexa488 foi calcu- lado a partir de um valor médio de GEO, comparado ao percentual obtido pela reação ape- nas com o anticorpo marcado com Alexa488 (1 ug/mL). A concentração de anticorpo que mostra uma inibição de 50% foi calculada, e os dados foram comparados.

A Figura 1 mostra a avaliação de afinidade de PPMX2016 (anticorpo de camundon- go)e PPAT-O052-27c (anticorpo quimérico do mesmo). Virtualmente, não foram observadas diferenças em afinidade entre os dois anticorpos.

Exemplo 10: Produção de anticorpos marcados (1) Ligação de DOTA ao anticorpo

—2.úv2 2 SS OA q e gere 23/27 Um anticorpo foi dissolvido em um tampão (50mM de Bicine-NaOH, 150mM de Na- Cl, pH: 8,5) em uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL. Separadamente, isotiociano- benzil DOTA (B-205, produto de Macrocyclics) foi dissolvido em DMSO em uma concentra- ção de 10 mg/mL. As duas soluções foram misturadas juntas com a finalidade de ajustar a ? 5 razão molar entre o anticorpo e DOTA 1:1 (razão de adição 1:1), 1:3 (razão de adição 1:3), ou 1:10 (razão de adição 1:10), e a mistura foi agitada e deixada descansar em 25ºC duran- , te 17 horas. Após o término da reação, a mistura de reação foi purificada por meio de uma coluna de dessalinização (PD-10, produto de GE Healthcare, 17-0435-01) com PBS. Utiliza- ram-se os anticorpos a seguir: PPMX2016, PPMX2025, PPMX2029, PPAT-052-27c, e PPAT- 052-28c.

(2) Determinação do percentual de incorporação de quelato O percentual de quelato incorporado ao anticorpo foi determinado através de titula- ção quelatométrica. A concentração de proteína de anticorpo de modificação foi determinada . antecipadamente através de um método convencional, e o número de moles de anticorpo de — modificação foi calculado a partir do peso molecular de IgG. A 1-mg/mL de solução de cobre SJ padrão (100 ul) cuja concentração foi determinada através de espectometria de absorção “o. atômica, um reagente arsenazo Ill (0,776 mg) e uma solução de 5M de acetato de amônio isenta de metal (produto de Sigma Aldrich) (3 mL) foram adicionados, e água ultra-pura foi ' adicionada à solução para ajustar o volume final para 10 mL. A solução resultante foi arma- zenadaem temperatura ambiente no escuro para preparar a solução de arsenazo Ill. Dissol- veu-se DOTA em água ultra-pura, para, desse modo, preparar uma solução padrão de DO- TA. Um anticorpo de modificação foi dissolvido em água ultra-pura, para, desse modo, pre- parar uma solução de anticorpo de modificação. A solução padrão de DOTA ou a solução de anticorpo de modificação (10 uL) foi misturada com a solução de arsenazo Ill (190 uL), e a —misturafoi incubada em 37ºC durante 30 minutos. De modo subsequente, a absorbância da mistura foi medida em um comprimento de onda de 630 nm. Desenhou-se uma curva pa- drão a partir das medições de absorbância de soluções padrão de DOTA. Através de curva padrão, o número de molécula(s) ligada(s) ao anticorpo de modificação foi calculado (núme- ro médio de modificação de DOTA).

A Tabela 2 mostra os resultados (razão de adição de DOTA e número médio real de DOTA de modificação). Conforme fica claro a partir da Tabela 2, descobriu-se que o número de moléculas de DOTA ligadas ao anticorpo é determinado pela razão de adição de DOTA.

Tabela 2 modificação | PPMX2025 (razão de adição de 1:1) ga"

TOººº=ºººº*º*º*º*º*ºº£º£º£ÉE E EEEEEÉEÉEÉYÉYÉYÉNÉYENYNENs—u—-—u—-—-—-—nr—r—r—r—n—n—n 24/27 L PPAT-052-270 (razão de adição de 1:3) ja go""" (Nota) PPAT-052-27c foi testado apenas em uma razão de adição de 1:3. (3) Preparação de anticorpos marcados com 67Ga-, 111In-, ou 90Y i 5 (i) Marcação com 67Ga ou 111In Cada um dos anticorpos PPMX2016, PPMX2025, PPMX2029, e PPAT-052-27c pu- rificados e o anticorpo PPAT-052-28c foram dissolvidos em um tampão (0,25M de acetato de amônio-HCl, pH: 5,5) em uma concentração de 6 mg/mL. Uma solução de A 67GaCl3 (pro- duto de Fuji Film RI Pharma) ou uma solução de 111InCI3 (produto de MDS Nordion Inc.) foi adicionada à solução de anticorpo, e a mistura foi incubada em 45ºC durante uma hora. (ii) Marcação com 90Y * Cada um dos anticorpos PPMX2029 e PPAT-052-27c purificados foi dissolvido em um tampão (0,25M de acetato de amônio-HCIl, pH: 5,5) em uma concentração de 6 mg/mL. SÍ Uma solução de 90YCI3 (produto de Nuclitec) foi adicionada à solução de anticorpo, e a “- 15 misturafoiincubada em 45ºC durante uma hora. (iii) Determinação do percentual de marcação Ú Uma alíquota da mistura de reação de marcação foi amostrada e submetida à cro- matografia em camada delgada (61885, produto de PALL), para, desse modo, determinar o percentual de marcação. A solução salina fisiológica foi empregada como um eluente, e a radioatividade foi medida nas extremidades superior e inferior de uma faixa por meio de um y-contra. O percentual de marcação foi calculado pela equação a seguir.

[81] Percentual de marcação = (contagem de extremidade inferior /(contagem de extre- midade superior + contagem de extremidade inferior))1x100 (%) Quando o percentual de marcação tiver alcançado 90% ou maior, o anticorpo mar- cado foi usado no experimento subsequente. Os anticorpos marcados foram purificados em uma coluna de dessalinização (PD-10, produto de GE Healthcare, 17-0435-01) com PBS.

Exemplo 11: Investigação da relação entre o percentual de incorporação de quelato e a biodistribuição (isto é, distribuição no corpo) PPMX2016, PPMX2025, e PPMX2029 foram investigados em termos de biodistribu- ição em virtude da diferença de percentual de valores de incorporação de quelato (razão de adição de DOTA 1:1, 1:3, e 1:10). ; Primeiramente, NCI-H358 foi culturado em um meio de RPMII1640 contendo 10% de FBS, e as células culturadas foram subcutaneamente transplantadas à região ventral —direitade cada camundongo pelado (fêmeas, 7 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em

TITI:TITAÔº;Ôºugººº—Ô—ºººº—º—ºººSCCSCCCº=ÉÔÔCºVLVLºLVLºLLVLVLVLLLLVVVV--——— ao -s——uuoe eo—hho- 25/27 uma concentração celular de 1 x 107 células/camundongo. Os camundongos foram criados até que o volume médio do tumor tenha alcançado 100 a 150 mm3. Então, aos camundongos transplantados com NCI-H358, anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2016 (razão de adição de 1:3 e 1:10), anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2025 (razão de , 5 adiçãode1:3e1:10), ou anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2029 (razão de adição de 1:3 e 1:10) foi administrado em uma dose de 370 kBq/camundongo.

' Noventa e seis horas após a administração, os camundongos foram sacrificados em anatomia, e os tecidos e o tumor foram removidos, O peso de cada tecido e o peso do tumor foram medidos, e a radioatividade foi medida por meio de um 7-contra e a %ID/g foi calculada pela equação a seguir. [E2] %ID/g=(quantidade de RI acumulada/quantidade de RI administrada total x 100 (%))/peso (g) . As Figuras 2 a 7 mostram os resultados. Todos os anticorpos testados exibiram um acúmulo aumentado no tumor, em uma razão de adição de DOTA de 1:3, comparada ao : caso em uma razão de 1:10. Esse acúmulo aumentado resulta no aprimoramento do efeito “. terapêutico. Além disso, podem-se evitar efeitos colaterais adversos, que, de outro modo, seriam causados pela retenção de uma substância radioativa em órgãos não-marcados. , A Figura 8 mostra o resultado da administração do anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2025 (razão de uso de 1:1, 1:3, e 1:10) em camundongos pelados não-portadores de câncer (fêmeas, 7 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em 370 kBq/camundongo. O anti- corpo foi altamente acumulado no fígado quando a razão de adição era de 1:10, enquanto o acúmulo no fígado era de 1:3 ou 1:1, indicando que efeitos colaterais adversos, como danos radioativos, são evitados no fígado. Exemplo 12: Investigação do comportamento de anticorpo anti-caldina quimérico no corpo Investigaram-se comportamentos de anticorpos quiméricos PPAT-052-27c e PPAT- 052-28c no corpo. Primeiramente, NCI-H1373 foi culturado em um meio de RPMI1640 contendo 10% deFBS,eas células cultiradas foram subcutaneamente transplantadas à região ventral direita de cada camundongo pelado (fêmeas, 9 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em uma concentração celular de 4 x 106 células/camundongo. Os camundongos foram criados até que o volume médio do tumor tenha alcançado 100 a 150 mm3. Então, aos camundongos transplantados com NCI-H1373, anticorpo 111In-DOTA- —PPAT-052-27c (razão de adição de 1:3) ou 111In-DOTA-PPAT-052-28c (razão de adição de 1:3) foi administrado em uma dose de 370 kBq/camundongo. Quarenta e oito ou a noventa e seis horas após a administração, os camundongos

TOO OOOOLLILLILLLLLLLULLLLLLLLLLLLLLLL—————.. — =0="m—=-..,A=A5ºAA«0«=<=«, Dc"... "-"s"2mm-— 26/27 foram sacrificados em anatomia, e os tecidos e o tumor foram removidos.

O peso de cada tecido e o peso do tumor foram medidos, e a radioatividade foi medida por meio de um y- contra e a %ID/g foi calculada.

As Figuras 9 a 11 mostram os resultados.

PPAT-052-27c exibiu um acúmulo percen- ] 5 tualnotumortão alto quanto 46% ID/g 48 horas após a administração.

PPAT-052-28c exibiu um acúmulo percentual no tumor tão alto quanto 41% 1D/g 48 horas após a administração e ' 52% 1D/g 96 horas após a administração.

Exemplo 13: Teste de xenoenxerto NCI-H358 foi culturado em um meio de RPMI1640 contendo 10% de FBS, e as cé- lulas culturadas foram subcutaneamente transplantadas à região ventral direita de cada ca- mundongo pelado (fêmeas, 7 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em uma concentração celular de 1 x 107 células/camundongo.

Os camundongos transplantados com NCI-H358 foram divididos em seis grupos - (n=8). O anticorpo 90Y-DOTA-PPMX2029 (razão de adição de 1:3) foi administrado em uma dose de 7,4 MBq/camundongo, 5,6 MBq/camundongo, 3,7 MBq/camundongo, e 1,9 MBq/camundongo.

Como grupos de controle, PPMX2029 não-marcado foi administrado em e uma dose de 80 ug/camundongo, e uma solução salina fisiológica foi administrada em uma dose de 100 uL/camundongo.

Em todos os grupos, a administração foi realizada quando o ] volume médio do tumor tiver alcançado 100 a 150 mm3. Após a administração, o peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas vezes por semana (a cada 3 ou 4 dias). Esta observação foi continuada até o dia 51 após a administração.

A Figura 12 mostra os resultados de teste.

O anticorpo 90Y-DOTA-PPMX2029 (ra- zão de adição de 1:3) exibiu um efeito antitumoral proporcional à radioatividade.

Separadamente, NCI-H1373 foi culturado em um meio de RPMI1640 contendo 10% de FBS, e as células culturadas foram subcutaneamente transplantadas à região ventral direita de cada camundongo pelado (fêmeas, 7 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em uma concentração celular de 5 x 106 células/camundongo.

Os camundongos transplantados com NCI-H1373 foram divididos em quatro grupos (n=8). O anticorpo 90Y-DOTA-PPAT-052-27c (razão de adição de 1:3) foi administrado em uma dose de 5,6 MBq/camundongo e 3,7 MBq/camundongo.

Como grupos de controle, | PPMX2029 não-marcado foi administrado em uma dose de 60 ug/camundongo, e uma solu- Í ção salina fisiológica foi administrada em uma dose de 100 ul/camundongo.

Em todos os ; grupos, a administração foi realizada quando o volume médio do tumor tiver alcançado 100 a150mm3. | Após a administração, o peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas Í Vezes por semana (a cada 3 ou 4 dias). Esta observação foi continuada até o dia 26 após a

EÔ— op rdoogproópsaprAtprtS9«>2ÚC.t O2 S<« gs» oqsceoeosaspseopeappaoO85ÇPRôt —Ç—.—" DD P PÍDAsÍAAAOnSO.=Q—— a õ aê . 27/27 administração. A Figura 13 mostra os resultados de teste. O anticorpo 90Y-DOTA-PPAT-052-27c (razão de adição de 1:3) exibiu um efeito antitumoral proporcional à radioatividade. Exemplo 14: Coloração imuno-histoquímica ' 5 A expressão de proteina CDH3 em uma amostra de câncer clínico foi confirmada colorando-se de modo imuno-histoquímico uma matriz de tecido de amostra de câncer.

: Como as matrizes de tecido de amostra de câncer, empregaram-se câncer pan- creático (adenocarcinoma), câncer de pulmão (adenocarcinoma), câncer de pulmão (carci- noma de células escamosas), e câncer colorretal (adenocarcinoma), que são os produtos de Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd. Cada lâmina de matriz de tecido foi desparafinada e ativada com 10mM Tris ImM EDTA (pH: 9,0) em 95ºC durante 40 minutos. A peroxidase endógena na lâmina de matriz foi desativada por um agente de bloqueio, que está incluído em ENVISION+Kit (produto de Da- . ko). De modo subsequente, a lâmina de matriz de tecido foi reagida com 5 ug/mL de anti- corpo ant-CDH3 610227 (produto de BD BIOSCIENCE) ou com 5 ug/mL de anticorpo anti- 8 HBs Hyb-3423 (controle negativo) em 4ºC de um dia para o outro. O anticorpo solution foi o. removido, e a lâmina de matriz de tecido foi adicionalmente reagida com um reagente de anticorpo secundário de polímero que está incluído em ENVISION+Kit em temperatura am- , biente durante 30 minutos. Então, a lâmina teve sua cor desenvolvida por um reagente de coloração que está incluído em ENVISION+Kit, e a coloração nuclear foi realizada pelo uso de uma solução de hematoxilina/eosina.

A Figura 14 mostra os resultados. As células cancerígenas foram coloridas pelo an- ticorpo anti-CDH3, porém, as células normais não foram coloridas.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo CARACTERIZADO por ser obtido ligando-se um elemento metálico radioativo a um anticorpo anti-caderina através de um reagente quelante metálico.

2. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivindi- cação 1, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo anti-caderina poder se ligar a uma região ' de 1 a 655 de SEQ ID NO: 2.

3. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivindi- i cação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo anti-caderina ser um anticorpo mo- — noclonal.

4. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo anti-caderina ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, e um anticorpo humano.

5. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo anti-caderina ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo recombinante produzido por uma célula pro- dutora de anticorpos representada pelo número de acesso NITE BP-897, NITE BP-898, NITE BP-899, NITE BP-1034, NITE BP-1035, NITE BP-1036, NITE BP-1037, NITE BP-1038, NITE BP-1039, NITE BP-1040, NITE BP-1041, NITE BP-1042, NITE BP-1043, NITE BP- 1044, NITE BP-1045, NITE BP-1046, NITE BP-1047, NITE BP-1048, NITE BP-1049, ou NITE BP-1050, ou um fragmento de qualquer um desses anticorpos.

6. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo anti-caderina serum anticorpo monoclonal ou um anticorpo recombinante produzido por uma célula pro- dutora de anticorpos representada pelo número de acesso NITE BP-897, NITE BP-898, NITE BP-899, NITE BP-1034, NITE BP-1035, NITE BP-1036, NITE BP-1037, NITE BP-1038, NITE BP-1039, ou NITE BP-1040, ou um fragmento de qualquer um desses anticorpos.

7. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo anti-caderina ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um fragmento de qualquer um ' desses anticorpos produzidos modificando-se um anticorpo monoclonal conforme definido na reivindicação 6.

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8. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo anti-caderina ser um anticorpo tendo um domínio VH e/ou um domínio VL formado por uma sequência de aminoácido tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior à sequência de aminoáci-

do do domínio VH e/ou do domínio VL de um anticorpo monoclonal conforme definido na reivindicação 6, ou um fragmento deste.

9. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato do reagente quelante metáli- —coser selecionado a partir do grupo que consiste em isotiocianobenzil DOTA, metilisotiocia- nobenzil DTPA, e ciclohexilisotiocianobenzil DTPA. '

10. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato da razão molar entre o anti- corpo anti-caderina e o reagente quelante metálico ser igual a 1:0,1 a 1:4,5.

11. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato da razão molar entre o anti- corpo anti-caderina e o reagente quelante metálico ser igual a 1:0,5 a 1:3.

12. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato do elemento metálico radio- ativo ser um metal radioativo citotóxico usado na terapia contra câncer.

13. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivin- dicação 12, CARACTERIZADO pelo fato do metal radioativo citotóxico ser selecionado a partir do grupo que consiste em ítrio-90 (**Y), rênio-186 ("*ºRe), rênio-188 (Re), cobre-67 ("Cu), ferro-59 (**Fe), estrôncio-89 (*ºSr), ouro-198 ("*Au), disprósio-165 (*Dy), rutênio- 103 ("ºRu), hólmio-166 (***Ho), samário-153(***Sm), e lutécio-177 (Lu).

14. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivin- dicação 12 ou 13, CARACTERIZADO pelo fato do metal radioativo citotóxico ser ítrio-90 CY).

15. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 13 ou 14, CARACTERIZADO pelo fato da terapia contra câncer ser destinada a um câncer de expressão de caderina.

16. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato do elemento metálico radio- ativo ser um metal radioativo não-citotóxico usado no diagnóstico de câncer.

17. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivin- dicação 16, CARACTERIZADO pelo fato do metal radioativo não-citotóxico ser selecionado | a partir do grupo que consiste em tecnécio-99m (To), índio-111 ("ln), índio-113m (“”ln), gálio-67 (Ga), gálio-68 (Ga), tálio-201 (TI), cobalto-57 (Co), estrôncio-85 (Sr), e co- bre -64 (*Cu).

18. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivin- dicação 16 ou 17, CARACTERIZADO pelo fato do metal radioativo não-citotóxico ser seleci- onado a partir de índio-111 (In) e gálio-67 (Ga).

19. Agente terapêutico contra câncer CARACTERIZADO por contém, como um in- grediente ativo, o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 12 a 15.

20. Agente de diagnóstico de câncer CARACTERIZADO por conter, como um in- grediente ativo, o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 16 a 18. :

21. Célula produtora de anticorpos CARACTERIZADA por ser depositada com um número de acesso NITE BP-897, NITE BP-898, NITE BP-899, NITE BP-1034, NITE BP- i 1035, NITE BP-1036, NITE BP-1037, NITE BP-1038, NITE BP-1039, NITE BP-1040, NITE —BP-1041, NITE BP-1042, NITE BP-1043, NITE BP-1044, NITE BP-1045, NITE BP-1046, NITE BP-1047, NITE BP-1048, NITE BP-1049 ou NITE BP-1050.

22. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 15, CARACTERIZADO por ser para uso na terapia contra câncer.

23. Anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 18, CARACTERIZADO por ser para uso no diagnóstico de câncer.

24. Uso do anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 12 a 15, CARACTERIZADO por ser para produzir um agente terapêutico contra câncer.

25. Uso do anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 16 a 18, CARACTERIZADO por ser para produzir um agente de diagnóstico de câncer.

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