JP6831783B2 - 抗体薬物コンジュゲート - Google Patents

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Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ方式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表を含有する。２０１５年１１月１２日に作られた上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５６５０６−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが１４６，９６６バイトである。
本発明は、一般に、抗Ｐ−カドヘリン抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、ならびにがんの処置のためのそれらの使用に関する。
Ｐ−カドヘリン
古典的なカドヘリンは、カルシウム依存性細胞間接触を媒介する接着型結合（adherens-type junctions）で発現される細胞接着分子のファミリーを表す。胎盤カドヘリン（Ｐ−カドヘリン、カドヘリン３、１型または「ＣＤＨ３」としても公知）は、正常組織では発現が制限されているが、皮膚、食道、肺および口腔の基底上皮細胞を含む幾つかの組織の未分化または分化下の細胞型で発現されることが知られている（例えば、Albergaria et al., Int. J. Dev. Biol. 55:811-822 (2011)を参照）。
Ｐ−カドヘリンの構造は、３つの別個のドメイン：タンデムで５つのカドヘリン反復を含有する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、膜貫通ドメイン、およびカテニン結合性ドメインを含有する細胞内テイルで構成される。ＥＣＤは、多重Ｐ−カドヘリン分子間のシスおよびトランス相互作用の両方を媒介する一方で、カテニン結合性ドメインは、Ｐ１２０カテニンなどのタンパク質、したがって細胞骨格エレメントにＰ−カドヘリンを連結される（例えば、Wu et al., PNAS 107:17592-7 (2010)を参照）。
Ｐ−カドヘリンおよびがん
Ｐ−カドヘリン（「Ｐｃａｄ」、「ＰＣａｄ」、「Ｐ−Ｃａｄ」、またはＣＤＨ３とも称される）はまた、とりわけ、乳がん、胃がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、および結腸直腸がんを含む多数の悪性腫瘍において過剰発現されることが知られている。幾つかの乳腺腫瘍、子宮内膜腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍および膀胱腫瘍におけるＰ−カドヘリンの過剰発現はまた、Ｐ−カドヘリン発現レベルが低いか、または存在しない場合と比較して、より悪い予後と相関している。乳がんでは、Ｐ−カドヘリンは、高悪性度浸潤癌において高頻度で過剰発現され、基底様腫瘍の信頼性高いマーカーである（例えば、Paredes et al., Br. Can. Res. 9:214-226 (2007)、Sanders et al., Int. J. Can. 79:573-579 (1998)、Albergaria et al., Int. J. Dev. Biol. 55:811-822 (2011)、Sousa et al., Histol. Histopathol. 25:963-975 (2010)を参照）。
乳がんおよび卵巣がんなどのある特定の細胞型では、Ｐ−カドヘリンは、腫瘍細胞運動性、侵襲性および転移を促進することが知られている（例えば、Cheung et al., Oncogene 30:2964-74 (2011)、Ribeiro et al, Oncogene 29 :392-402 (2010)を参照）。
多数のがん関連プロセスは、Ｐ−カドヘリンｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を促進することが知られている。発現の突然変異または損失のいずれかを介した腫瘍抑制因子ＢＲＣＡ１の不活性化は、乳がん細胞系および患者の検体の両方においてＰ−カドヘリン発現の増加と関連付けられている。転写因子Ｃ−ＥＢＰβおよび抗エストロゲンＩＣＩ１８２７８０（フルベストラント）は、他のプロセスを介したＣＤＨ３プロモーターの低メチル化のように、Ｐ−カドヘリン発現を調節不全にして、腫瘍細胞におけるそのアップレギュレーションを誘導することが知られている。胞巣状横紋筋肉腫では、キメラ発がん性転写因子ＰＡＸ３−ＦＯＸＯＡ１およびＰＡＸ−ＦＯＸＯＡ１（転座に起因する）は、Ｐ−カドヘリン発現を直接誘導して、腫瘍攻撃性の増加をもたらす（例えば、Albergaria et al., Int. J. Dev. Biol. 55:811-822 (2011)、Thuault et al., Oncogene 15:1474-86 (2012)、Ames et al., Clin. Can. Res. 11;4003-11 (2005)、Gorski et al., Br. Can . Res. Treat. 122:721-31 (2010)、Paredes et al., Clin. Can. Res. 11:5869-5877 (2005)、Albergaria et al., Human Mol. Gen. 19:2554-2566 (2010)を参照）。
抗体薬物コンジュゲート
抗体薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）は、がんの処置における細胞毒性剤の局所送達のために使用されてきた（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５：５４３〜５４９，２００５を参照されたい）。ＡＤＣにより、最小の毒性で最大の効能を達成することができる薬物部分の標的化された送達が可能になる。ＡＤＣが有望な臨床結果を示すにつれて、がん療法のための新しい治療剤を開発する必要性が増大する。さらに、公知のがん標的に対して治療上有効なＡＤＣを作製しようとする試みは、全てが首尾よくいっているとは限らない。ＡＤＣの治療上の有効性に影響を及ぼし得る要因の例として、親和性、抗体のコンジュゲートする能力、リンカーの切断可能性または安定性、抗体−薬物コンジュゲートの安定性、抗体薬物コンジュゲートの凝集する傾向、および各抗体にコンジュゲートする薬物／ペイロード分子の比（「ＤＡＲ」または「薬物抗体比」）が挙げられる。
凝集および安定性の欠如は、臨床背景で抗体薬物コンジュゲートに対する有害反応の可能性を増加させて、有効性を低減させて、ならびにＡＤＣを作製するコストを増大させ得る。
したがって、治療上有効なＡＤＣ分子が必要とされる。
本出願は、ヒトＰ−カドヘリンタンパク質に結合する抗体、またはその抗原結合性断片を開示する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１２６の１２４、１２５、１５１、１５３、１５４、１５５、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６８、１７０、１７１、および１７２位にあるアミノ酸から選択される１つまたは複数の残基においてＰ−カドヘリンに結合する。別の実施形態では、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号１２６の１２４、１２５、１５１、１５３、１５４、１５５、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６８、１７０、１７１、および１７２位にあるアミノ酸においてヒトＰ−カドヘリンタンパク質に結合する。幾つかの実施形態では、抗体、またはその抗原結合性断片は、配列番号１２６の１２４、１５１、１５３〜１５６、および１７２位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基においてヒトＰ−カドヘリンに結合する重鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１２８の５２、５４、５６、６０、６５、１０５、または１０７位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含むヒトＰ−カドヘリンタンパク質に対する重鎖結合性パラトープを含む。さらに別の実施形態では、抗体は、配列番号１２６の１２４、１２５、１５５、１５６、１５９〜１６３、１６８、１７０、および１７１位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基においてヒトＰ−カドヘリンに結合する軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、ヒトＰ−カドヘリンタンパク質に対する軽鎖可変領域結合性パラトープは、配列番号１２９の１、２、２７、２８、３０、６８、９２、９３、または９４位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。特定実施形態では、抗体、またはその抗原結合性断片は、上記で論述するような重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
他の実施形態では、本出願は、
ａ）配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号１１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号２１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域；および配列番号３１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号３３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号４１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号４３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号５１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号５３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；
ｄ）配列番号６１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号６３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号７１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号７３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；
ｅ）配列番号８１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号８２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号８３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号９１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号９２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号９３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；または
ｆ）配列番号１０１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号１０３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号１１１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１１２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域
を含むヒトＰ−カドヘリンを結合する抗体、またはその抗原結合性断片を開示する。
本出願はまた、
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｃ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｄ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｅ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｆ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含むＰ−カドヘリンを結合する抗体、またはその抗原結合性断片を開示する。
他の実施形態では、本出願は、
ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｄ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｅ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号９９のアミノ酸配列を含む軽鎖；または
ｆ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含むＰ−カドヘリンを結合する抗体、またはその抗原結合性断片を開示する。
本出願はさらに、本明細書中に開示する抗体と同じヒトＰ−カドヘリンのエピトープに結合するか、またはヒトＰ−カドヘリンへの結合について本明細書中に開示する抗体と競合する抗体、またはその抗原結合性断片を開示する。
幾つかの実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体、またはその抗原結合性断片は、ヒトまたはヒト化抗体である。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、モノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。
本出願はまた、式：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、Ａｂは、本明細書中に開示するようなＰ−カドヘリン抗体、またはその抗原結合性断片であり；Ｌは、リンカーであり；Ｄは、薬物部分であり；ｍは、１〜８の整数であり；ｎは、１〜１０の整数である）を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、またはその薬学的に許容される塩を開示する。幾つかの実施形態では、ｍは１である。他の実施形態では、ｎは、３または４である。
幾つかの実施形態では、ＡＤＣの抗体、またはその抗原結合性断片は、
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ領域；または
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む。
さらなる実施形態では、抗体薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合性断片は、
（ａ）配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２のＶＨ ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および（ｄ）配列番号１１のＶＬ ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含み、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定されるか；または
（ａ）配列番号２１のＶＨ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２３のＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および（ｄ）配列番号３１のＶＬ ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＶＬ ＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３３のＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含み、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される。
他の実施形態では、抗体薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合性断片は、
ａ）配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖；または
ｂ）配列番号２９の重鎖および配列番号３９の軽鎖
を含む。
さらなる実施形態では、抗体薬物コンジュゲートのリンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、プロチャージドリンカーおよびジカルボン酸ベースのリンカーからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬に由来する。
幾つかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲートの薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、アウリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される。さらなる実施形態では、細胞毒性剤は、メイタンシノイドである。特定実施形態では、メイタンシノイドは、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である。
特定実施形態では、抗体薬物コンジュゲートは、下記式：

（式中、Ａｂは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性断片であり；ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定され；ｎは、１〜１０である）またはその薬学的に許容される塩を有する。
本出願はまた、本明細書中に開示するようなヒトＰ−カドヘリン抗体、もしくはその抗原結合性断片、またはこれらの抗体を含む抗体薬物コンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を開示する。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥物として調製される。さらなる実施形態では、凍結乾燥物は、抗体、その抗原結合性断片、またはこれらの抗体の抗体薬物コンジュゲート、ヒスチジン、スクロース、およびポリソルベート２０を含む。特定実施形態では、医薬組成物は、約１０ｍｇ／ｍＬの本明細書中に開示する抗体薬物コンジュゲート、２０ｍＭヒスチジン、２４０ｍＭスクロース、および０．０２％ポリソルベート２０を含む。
本発明はまた、それを必要とする患者においてがんを処置する方法であって、前記患者に、本明細書中に開示する抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を投与することを含む方法を開示する。幾つかの実施形態では、上記方法は、１つまたは複数のさらなる治療用化合物と組み合わせて、抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を患者に投与することを含む。
他の実施形態では、本出願は、医薬としての使用のための、本明細書中に開示するようなＰ−カドヘリン抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を開示する。特定実施形態では、抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物は、それを必要とする患者におけるがんの処置における使用のためである。
同様に、それを必要とする患者においてがんを処置するための、またはがんの処置のための医薬の製造における、本明細書中で論述するようなＰ−カドヘリン抗体、もしくはその抗原結合性断片、または抗体薬物コンジュゲートの使用が本明細書中に開示される。
幾つかの実施形態では、がんは、Ｐ−カドヘリンを発現する。さらなる実施形態では、がんは、副腎皮質癌、膀胱がん、骨がん、乳がん、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、胚芽腫、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞がん、カポジ肉腫、肝臓がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、卵巣がん、直腸がん、横紋筋肉腫、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮がん、腹部がん、子宮がん、膣がん、および外陰部がん、副腎皮質癌、膀胱がん、骨がん、乳がん、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、胚芽腫、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞がん、カポジ肉腫、肝臓がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、卵巣がん、直腸がん、横紋筋肉腫、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮がん、腹部がん、子宮がん、膣がん、および外陰部がんからなる群から選択される。特定実施形態では、がんは、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肺がん、および卵巣がんからなる群から選択される。
本出願はまた、本明細書中に開示するようなＰ−カドヘリン抗体または抗原結合性断片をコードする核酸を開示する。特定実施形態では、核酸は、配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１８、３８、５８、７８、９８、１１８、１０、３０、５０、７０、９０、１１０、２０、４０、６０、８０、１００、および１２０のヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、本出願は、本明細書に開示する核酸を含むベクター、ならびに本明細書中に開示するベクターまたは核酸を含む宿主細胞を企図する。さらに、Ｐ−カドヘリン抗体または抗原結合性断片を生成する方法であって、宿主細胞を培養することと、培養物から抗体を回収することとを含む方法が開示される。
さらなる実施形態では、本出願は、抗Ｐ−カドヘリン抗体薬物コンジュゲートを生成する方法であって、
（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結させること、
（ｂ）上記リンカー−薬物を、請求項４７に記載の細胞培養物から回収した抗体にコンジュゲートすること、および
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製すること
を含む、方法を開示する。別の実施形態では、抗Ｐ−カドヘリン抗体薬物コンジュゲートを生成する方法は、
（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結させること、
（ｂ）上記リンカー−薬物を、本明細書中に開示するような抗体にコンジュゲートすること、および
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製すること
を含む。幾つかの実施形態では、これらの方法に従って作製される抗体薬物コンジュゲートは、約３．８のＵＶ分光光度計で測定される平均ＤＡＲを有する。
他の実施形態では、本明細書中に開示する抗体、またはその抗原結合性断片は、診断剤として使用される。診断剤の幾つかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、イメージング剤、または金属イオンで標識される。
図１は、ドメイン間接合部に位置する３つのカルシウム結合部位を有するヒトＰ−カドヘリンの細胞外ドメインの最初の２つのカドヘリン反復ドメインを示すヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２の結晶構造の全体図を表す。 図２は、結晶の非対称ユニットを形成する２つのヒトＰ−カドヘリンタンパク質と複合体形成される２つのＰ−カドヘリン抗体Ｆａｂの結晶構造の全体図を表す。挿入図は、２つのＰ−カドヘリン分子のＥＣ１ドメインを含む接触領域のクローズアップ図を表す。２つの複合体間にほんの数個の結晶接触が存在する。 図３は、Ｐ−カドヘリン抗体ＮＯＶ１６９Ｎ３１ＱのＦａｂの残基と接触するヒトＰ−カドヘリンエピトープ残基（配列番号１３３）を表すグラフである。ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１ドメインのアミノ酸配列は、水平軸上に列挙される。グラフの上部は、非水素原子間の４．０Åのカットオフ距離を使用したプログラムＮＣＯＮＴにより同定されるような、タンパク質抗原と抗体との間の直接的な分子間接触の数を示す。グラフの下部は、プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬにより算出されるような、抗体結合時のＰ−カドヘリン残基が招く溶媒接近可能表面積の低減を示す（Å２で）。ＥＣドメインのβ−バレル構造は、β鎖の番号付けに相当するラベルを伴う一連の矢印として図式的に示される。 図４は、黒い棒状物質（抗体図）で示される抗体（４．０Åカットオフ距離）と相互作用する全てのアミノ酸残基を伴うヒトＰ−カドヘリンのＮ−末端カドヘリン反復（ＥＣ１）ドメイン（灰色の模式図）の結晶構造のクローズアップ図を表す。 図５は、ヒト（配列番号１３３）Ｐ−カドヘリンＥＣ１ドメインおよびカニクイザル（「ｃｙｎｏ」、カニクイザル（Macaca fascicularis））（配列番号１３４）Ｐ−カドヘリンＥＣ１ドメインの配列アラインメントを表す。黒色太字のフォントのアミノ酸残基は、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ抗体との直接的な分子間接触（４．０Å未満）に関与する。灰色太字のフォントで矢印とともに示されるアミノ酸残基は、さらに遠いが、抗体結合時にその溶媒接近可能表面の減少を受ける。両方のカテゴリーエピトープ残基が、カニクイザルＰ−カドヘリンで完全に保存されることに留意されたい。 図６は、ヒトカドヘリンのＥＣ１ドメインの多重配列アラインメントを表す（それぞれ、配列番号１３５〜１４３、出現順で）。Ｐ−カドヘリンは、「カドヘリン−３」とも称されることに留意されたい。四角に囲った残基は、その溶媒接近可能表面の低減により決定されるように、抗原−抗体界面に位置する。ヒトカドヘリン１〜４に見出される挿入は、太線で四角に囲われる。重要なエピトープ残基Ｇｌｕ１５５は、他のヒトカドヘリンでは保存されない。 図７は、Ｐ−カドヘリン媒介性細胞接着に対するＰ−カドヘリン抗体ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑの影響を示す顕微鏡写真を表す。細胞は、スフェロイド形成の誘導前にＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑまたは非特異的ヒトＩｇＧ１抗体で前処理した。スフェロイド形状および密度は、１３２時間のインキュベーション期間後に顕微鏡で評価した。 図８は、Ｐ−カドヘリン陽性（ＨＣＣ７０およびＨＣＣ１９５４）および陰性（ＨＴ２９）細胞系におけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性効力を示すグラフを表す。（Ａ）ＨＣＣ１９５４（Ｐ−カドヘリン＋）、（Ｂ）ＨＣＣ７０（Ｐ−カドヘリン＋）および（Ｃ）ＨＴ２９（Ｐ−カドヘリン−）細胞におけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの用量応答。生存率は、遊離マイタンシン（Ｌ−ＤＭ１−Ｍｅ、黒丸）、アイソタイプ対照ＡＤＣ（ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１、白四角）、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗体構成成分（ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ、白三角）およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１（黒三角）による処置の５日後に測定した。 図９は、ＮＯＶ１６９Ｎ３１ＱおよびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のＡＤＣＣ活性を示すグラフを表す。標的細胞を、固定数の新鮮なヒトＮＫエフェクター細胞（エフェクター対標的細胞比５：１）および増加量のＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ（黒丸）、ＩｇＧ１対照抗体（白丸）、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１（黒四角）またはＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（白四角）とともにインキュベートした。全ての試料を三重反復でランし、細胞生存率は、２４時間後に評価した。 図１０は、ＨＣＣ７０トリプルネガティブ乳がん皮下腫瘍異種移植片モデルにおけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの活性を示す一連のＩＨＣ画像を表す。画像は、単回用量のＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１後の有糸分裂停止（ｐ−ヒストンＨ３）を示す。 図１１Ａは、Ｐ−カドヘリンの発現を示すＨＣＣ７０腫瘍組織上のＰ−カドヘリンに関するＩＨＣの代表的な画像を表す。図１１Ｂは、ＨＣＣ７０乳がん異種移植片モデルにおける各種Ｐ−カドヘリンＡＤＣの有効性を示すグラフを表す。 図１２は、ＨＣＣ７０乳がん異種移植片モデルに対するＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答有効性を示すグラフを表す。 図１３Ａは、Ｐ−カドヘリンの発現を示すＨＣＣ１９５４腫瘍組織上のＰ−カドヘリンに関するＩＨＣの代表的な画像を表す。図１３Ｂは、ＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片モデルにおけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の有効性を示すグラフである。 図１３Ｃは、ＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片モデルにおけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の有効性を示すグラフである。図１３Ｄは、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１を使用した処置に応答したＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片マウスの体重の変化を表すグラフである。 図１４Ａは、Ｐ−カドヘリンの発現を示すＢＩＣＲ６腫瘍組織上のＰ−カドヘリンに関するＩＨＣの代表的な画像を表す。図１４Ｂは、ＢＩＣＲ６頭頸部がん異種移植片モデルにおけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の有効性を示すグラフを表す。 図１５Ａは、Ｐ−カドヘリンの発現を示すｓｃａＢＥＲ腫瘍組織上のＰ−カドヘリンに関するＩＨＣの代表的な画像を表す。図１５Ｂは、ｓｃａＢＥＲ膀胱がん異種移植片モデルにおけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の有効性を示すグラフを表す。 図１６は、ＨｕＰｒｉｍｅＥＤ２２６７食道がん異種移植片モデルにおけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の有効性を示すグラフを表す。 図１７は、ＨＣＣ７０乳がん異種移植片モデルにおける２つの異なるリンカー（ＭＣＣ対ＣＸ１−１）を使用してＤＭ１にコンジュゲートしている抗Ｐ−カドヘリンＮＥＧ００６７の有効性を比較するグラフを表す。 図１８は、ＨＣＣ７０乳がん異種移植片モデルにおけるＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカー−ペイロードを使用してコンジュゲートしている３つのマウスハイブリドーマ由来の抗Ｐ−カドヘリンＡＤＣの有効性を比較するグラフを表す。
定義
別途記述しない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有することが意図される。
用語「アルキル」とは、特定数の炭素原子を有する一価飽和炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜６アルキルとは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキル基は、直鎖状または分枝状であってもよい。代表的な分枝状アルキル基は、１、２、または３個の分枝を有する。アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチル）、ペンチル（ｎ−ペンチル、イソペンチル、およびネオペンチル）、ならびにヘキシルが挙げられる。
本明細書で使用される用語「抗体」とは、非共有的に、可逆的に、および特異的様式で対応する抗原に結合することができる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。例えば、天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）とを含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと省略される）と、重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと省略される）と、軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４に配置される３つのＣＤＲと、４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）などの、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
用語「抗体」は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）を含む。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものであってもよい。
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」は、ＶＬおよびＶＨの超可変領域を互換的に指す。ＣＤＲは、そのような標的タンパク質に対する特異性を担持する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。各ヒトＶＬまたはＶＨ中には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から連続的に番号付けられる）が存在し、可変ドメインの約１５〜２０％を占める。ＣＤＲは標的タンパク質のエピトープと構造的に相補的であり、かくして、結合特異性を直接担う。ＶＬまたはＶＨの残りのストレッチ、いわゆるフレームワーク領域は、アミノ酸配列の変化をあまり示さない（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。
ＣＤＲとフレームワーク領域の位置を、当業界における様々な周知の定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイブウェブ上でwww.imgt.org/にて）およびＡｂＭ（例えば、Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)を参照されたい）を使用して決定することができる。抗原結合部位の定義は、以下にも記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); およびLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); およびRees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
軽鎖と重鎖は両方とも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。用語「定常」および「可変」は機能的に使用される。これに関して、軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインポーションが抗原認識および特異性を決定付けることが理解される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて増大する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である；ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインを実際に含む。
本明細書で使用される用語「抗原結合性断片」とは、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間分布により）能力を保持する抗体の１または複数のポーションを指す。結合断片の例としては、限定されるものではないが、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ科抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または抗体の他のエピトープ結合断片が挙げられる。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、それらを、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子（一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を形成する単一タンパク質鎖として作製することができる合成リンカーにより連結することができる；例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988;およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988を参照されたい。そのような一本鎖抗体も、用語「抗原結合性断片」内に包含されることが意図される。これらの抗原結合性断片は、当業者には公知の従来の技術を使用して得られ、その断片はインタクト抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
抗原結合性断片を、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、単一ドメイン抗体、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照されたい）中に組込むこともできる。抗原結合性断片を、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場中に移植することができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。
抗原結合性断片を、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成する並列Ｆｖセグメント対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組込むことができる（Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝的起源に由来する抗体および抗原結合性断片などのポリペプチドを指す。この用語はまた、単一分子組成の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域はまた、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、またはヒト生殖系列配列の変異型または例えば、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000に記載のような、ヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体に由来する。また、１つまたは複数のＣＤＲが、親和性突然変異のために、または製造／ペイロードコンジュゲーション目的で突然変異されているヒト配列由来の抗体も含まれる。Hybridoma. 1997 Aug;16(4):381-9. Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS. Kilpatrick KE, Wring SA, Walker DH, Macklin MD, Payne JA, Su JL, Champion BR, Caterson B, McIntyre GD. Department of Molecular Sciences, Glaxo Wellcome, Research Triangle Park, NC 27709, USAを参照されたい。
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発により、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異により、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換により導入される突然変異）。
本明細書で使用される用語「認識する」とは、エピトープが直鎖状であろうと、立体構造的であろうと、そのエピトープを見つけて、それと相互作用する（例えば、結合する）抗体または抗原結合性断片を指す。用語「エピトープ」とは、本発明の抗体または抗原結合性断片が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、タンパク質の三次元折畳みにより並置される連続的アミノ酸または非連続的アミノ酸の両方から形成させることができる。連続的アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるが、三次元折畳みにより形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、ユニークな空間的コンフォメーション中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法は、当業界における技術、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい）。
本明細書で使用される用語「親和性」とは、単一の抗原部位での抗体と抗原との相互作用の強度を指す。それぞれの抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有力を介して、いくつかの部位で抗原と相互作用する；相互作用が大きくなるほど、親和性が強くなる。
用語「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。しかしながら、１つの抗原に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原との交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
用語「対応するヒト生殖系列配列」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によりコードされる他の全ての既知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列と最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列はまた、他の全ての評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列またはサブ配列と最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列またはサブ配列を指してもよい。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワーク領域と相補性決定領域、可変セグメント（上記で定義されたもの）、または可変領域を含む配列もしくはサブ配列の他の組合せであってもよい。例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、または当業界で公知の別のアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列を整列させる、本明細書に記載の方法を使用して、配列同一性を決定することができる。対応するヒト生殖系列核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域核酸またはアミノ酸配列との少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有してもよい。相当するヒト生殖系列配列は、例えば、公開されている国際IｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイブウェブ上でwww.imgt.org/にて）およびＶ−ｂａｓｅ（ワールドワイブウェブ上でvbase.mrc-cpe.cam.ac.ukにて）によって決定することができる。
抗原（例えば、タンパク質）と抗体、抗体断片、または抗体由来結合剤との間の相互作用を記述する文脈で使用される場合の語句「特異的に結合する」または「選択的に結合する」は、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中の、例えば、生物試料、例えば、血液、血清、血漿または組織試料中の、抗原の存在を決定する結合反応を指す。かくして、ある特定の指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも２倍、特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。一実施形態では、指定のイムノアッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも１０倍、特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。そのような条件下での抗体または結合剤への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について抗体または薬剤を選択する必要があってもよい。望ましい場合または適切な場合、この選択を、他の種（例えば、マウスもしくはラット）または他のサブタイプに由来する分子と交差反応する抗体を除去することにより達成することができる。あるいは、幾つかの実施形態では、ある特定の所望の分子と交差反応する抗体または抗体断片を選択する。
様々なイムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するためには、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応性を決定するのに使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明については、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい）。典型的には、特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍、より典型的には、バックグラウンドの少なくとも１０〜１００倍のシグナルをもたらす。
用語「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」とは、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で除算したものを指す。当業界における任意の公知の方法を使用して、平衡解離定数を測定することができる。本発明の抗体は一般に、約１０−７または１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、幾つかの実施形態では、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有する。
用語「バイオアベイラビリティ」とは、患者に投与される所与の量の薬物の全身利用能（すなわち、血液／血漿レベル）を指す。バイオアベイラビリティは、投与される剤形から全身循環に達する薬物の時間（速度）と総量（程度）の両方の尺度を示す絶対項である。
本明細書で使用される語句「から本質的になる」とは、方法または組成物中に含まれる活性薬剤の属または種、ならびに方法または組成物の意図される目的にとって不活性な任意の賦形剤を指す。幾つかの実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗体薬物コンジュゲート以外の１または複数のさらなる活性剤の含有を明確に排除する。幾つかの実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗体薬物コンジュゲート以外の１または複数のさらなる活性剤と、第２の同時投与される薬剤との含有を明確に排除する。
用語「アミノ酸」とは、天然の、合成の、および非天然のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に改変されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したα−炭素を指す。そのような類似体は改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似する様式で機能する化合物を指す。
用語「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一の、もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重性のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。かくして、アラニンがあるコドンによって特定される全ての位置で、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく記載される対応するコドンのいずれかに変化させてもよい。そのような核酸変化は「サイレント変異」であり、保存的に改変されたバリアントの１種である。ポリペプチドをコードする全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を記述する。当業者であれば、核酸中のそれぞれのコドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧと、通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識できる。従って、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれ記載される配列中で暗黙的である。
ポリペプチド配列について、「保存的に改変されたバリアント」は、あるアミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらすポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業界で周知である。そのような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間相同体、および対立遺伝子だけでなく、それを排除しない。以下の８群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。幾つかの実施形態では、用語「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響しないか、またはそれを変化させないアミノ酸改変を指すように使用される。
本明細書で使用される用語「最適化された」とは、生成細胞または生物、一般には、真核細胞、例えば、酵母細胞、ピチア（Pichia）細胞、真菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変化させたヌクレオチド配列を指す。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られる、出発ヌクレオチド配列により元々コードされるアミノ酸配列を完全に、またはできるだけ多く保持するように操作される。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一であるパーセント」または「同一性パーセント」とは、２つ以上の配列またはサブ配列が同じである程度を指す。２つの配列は、それらが比較される領域にわたってアミノ酸またはヌクレオチドの同じ配列を有する場合、「同一」である。２つの配列が、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、もしくは手動によるアラインメントおよび視覚的検査により測定される比較ウィンドウ、または指定の領域にわたって最大の一致のために比較および整列された場合、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特定の領域にわたって、または特定されない場合、配列全体にわたって６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）を有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、長さ少なくとも約３０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、またはより好ましくは、長さ１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列とをコンピュータに入力し、サブ配列座標を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用するか、または代替パラメーターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列に関する配列同一性パーセントを算出する。
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較することができる、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置数の任意の１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当業界で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970)の部分相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または手動によるアラインメントおよび視覚的検査（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003を参照されたい）により行うことができる。
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに好適であるアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公共的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満足する、クエリー配列中の短いワード長Ｗを同定することにより高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、supra）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するための種子として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させることができる限りそれぞれの配列に沿った両方の方向に伸長される。累積スコアを、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致する残基の対に関するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（不一致の残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ減少する場合、停止される；１または複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のため、累積スコアはゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照されたい）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指示を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、および最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似すると考えられる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＰＡＭ１２０ウェイト残テーブル（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, 1988のアルゴリズムを使用して決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれたNeedleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970のアルゴリズムを使用して決定することができる。
上記の配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指示は、以下に記載のように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することである。かくして、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指示は、以下に記載のように、２つの分子またはその相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指示は、同じプライマーを使用してその配列を増幅することができることである。
用語「核酸」は、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用され、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。この用語は、合成である、天然である、および非天然である、参照核酸と類似する結合特性を有する、ならびに参照ヌクレオチドと類似する様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基もしくは結合を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホルアミデート（phosphoroamidate）、メチルホスホン酸、キラル−メチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
別途指摘しない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示される配列も暗示的に包含する。特に、以下に詳述されるように、１または複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより、縮重コドン置換を達成することができる（Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; およびRossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。
核酸の文脈における用語「作動可能に連結された」とは、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列が適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激またはモジュレートする場合、それはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列に対して物理的に連続している、すなわち、それらはｃｉｓ作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列に対して物理的に連続しているか、またはそれに近接して位置する必要はない。
用語「ポリペプチド」と「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書では互換的に使用される。この用語は、１または複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。別途指摘しない限り、特定のポリペプチド配列は、保存的に改変されたそのバリアントも暗示的に包含する。
本明細書で使用される用語「抗体薬物コンジュゲート」または「イムノコンジュゲート」は、抗体またはその抗原結合性断片と、化学療法剤、毒素、免疫治療剤、イメージングプローブなどの別の薬剤との連結を指す。連結は、共有結合、または静電力などを介する非共有相互作用であってもよい。当業界で公知の様々なリンカーを使用して、抗体薬物コンジュゲートを形成させることができる。さらに、抗体薬物コンジュゲートを、イムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドから発現させることができる融合タンパク質の形態で提供することができる。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」とは、別々のタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）を元々コードしていた２つ以上の遺伝子または遺伝子断片の連結により作出されるタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能特性を有する単一のタンパク質をもたらす。
用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む。注記しない限り、用語「患者」または「対象」は、互換的に本明細書に使用される。
本明細書で使用される用語「細胞毒素」または「細胞毒性剤」は、細胞の成長および増殖にとって有害であり、細胞または悪性腫瘍を減少させる、阻害する、または破壊するように作用することができる任意の薬剤を指す。
本明細書で使用される用語「抗がん剤」とは、限定されるものではないが、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗がん剤、ならびに免疫治療剤などの、がんなどの細胞増殖障害を処置するために使用することができる任意の薬剤を指す。
本明細書で使用される用語「薬物部分」または「ペイロード」とは、本発明の抗体または抗原結合性断片にコンジュゲートされ、任意の治療剤または診断剤、例えば、抗がん剤、抗炎症剤、抗感染剤（例えば、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤）、または麻酔剤を含んでもよい化学部分を指す。例えば、薬物部分は、細胞毒のような抗がん剤であり得る。特定の実施形態では、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、アウリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、プロテアソーム阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤から選択される。これらの各々を、抗体と適合するリンカーに結合させるための方法および本発明の方法は、当業界で公知である。例えば、Singh et al., (2009) Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457を参照されたい。さらに、ペイロードは、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外線プローブ、親和性プローブ、キレート剤、分光プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体断片、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、サッカリドまたはポリサッカリドであってもよい。
用語「メイタンシノイド薬物部分」は、メイタンシノイド化合物の構造を有する抗体薬物コンジュゲートの下部構造を意味する。メイタンシノイドは、東アフリカの低木メイテナス・セラタ（Maytenus serrata）から初めて単離された（米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。その後、ある特定の微生物も、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを生成することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。合成メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が報告されている。米国特許第４，１３７，２３０号明細書；第４，２４８，８７０号明細書；第４，２５６，７４６号明細書；第４，２６０，６０８号明細書；第４，２６５，８１４号明細書；第４，２９４，７５７号明細書；第４，３０７，０１６号明細書；第４，３０８，２６８号明細書；第４，３０８，２６９号明細書；第４，３０９，４２８号明細書；第４，３１３，９４６号明細書；第４，３１５，９２９号明細書；第４，３１７，８２１号明細書；第４，３２２，３４８号明細書；第４，３３１，５９８号明細書；第４，３６１，６５０号明細書；第４，３６４，８６６号明細書；第４，４２４，２１９号明細書；第４，４５０，２５４号明細書；第４，３６２，６６３号明細書；および第４，３７１，５３３号明細書、ならびにKawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451（それぞれ参照により明示的に組み込まれる）を参照されたい。コンジュゲーションにとって有用な特定のメイタンシノイドの例としては、ＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４が挙げられる。
「腫瘍」とは、悪性であっても、または良性であっても、新生物性細胞成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。
用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖、生存能力、または転移活性の速度の低下を意味する。例えば、抗腫瘍活性は、治療法中に生じる異常細胞の成長速度の低下または腫瘍サイズの安定性もしくは低減、または治療法を用いない対照と比較した場合の治療法に起因したより長い生存により示され得る。そのような活性を、限定されるものではないが、異種移植片モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデル、および抗腫瘍活性を調査するための当業界で公知の他のモデルなどのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおいて受け入れられるものを使用して評価することができる。
用語「悪性腫瘍」とは、非良性腫瘍またはがんを指す。本明細書で使用される用語「がん」は、脱調節された、または制御されない細胞成長を特徴とする悪性腫瘍を含む。例示的ながんとしては、がん腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。
用語「がん」は、原発性悪性腫瘍（例えば、細胞が元の腫瘍部位以外の対象の身体部位に移動していないもの）および二次悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍部位とは異なる第２の部位への腫瘍細胞の移動である転移から生じるもの）を含む。
「Ｐ−カドヘリン」（Ｐｃａｄ、ＰＣａｄ、またはＣＤＨ３としても公知）という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７８４、ＮＰ＿００１７８４．２（アミノ酸配列）、およびＮＭ＿００１７９３．４、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１４４６２、ＮＧ＿００９０９６、およびＮＧ＿００９０９６．１（ヌクレオチド配列）で公開されているＰ−カドヘリンの核酸およびアミノ酸配列を指す。ヒトＰ−カドヘリンドメイン１〜５に関する配列情報は、細胞外であり、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７９３．４およびＮＰ＿００１７８４で公開されている。
「Ｐ−カドヘリン」はまた、その完全長にわたって、上記ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７８４、ＮＰ＿００１７８４．２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有するタンパク質およびアミノ酸配列を指す。
構造的に、Ｐ−カドヘリン核酸配列は、その細胞外ドメインにわたって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７９３．４、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１４４６２、ＮＧ＿００９０９６、およびＮＧ＿００９０９６．１の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有する。
本明細書で使用される場合、任意の疾患または障害の用語「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、一実施形態では、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患または少なくとも１つのその臨床症状の発生を減速させるか、または停止させるか、または軽減すること）を指す。別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、患者によって認識できないものを含む少なくとも１つの物理的パラメーターを軽減または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、疾患または障害を、物理的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）、またはその両方で調節することを指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、疾患または障害の開始または発生または進行を防止する、または遅延させることを指す。
用語「治療的に許容される量」または「治療有効用量」は、所望の結果（すなわち、腫瘍サイズの低下、腫瘍成長の阻害、転移の防止、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫感染の阻害または防止）を得るのに十分な量を互換的に指す。幾つかの実施形態では、治療的に許容される量は、望ましくない副作用を誘導しない、または引き起こさない。幾つかの実施形態では、治療上許容される量は、副作用（但し、患者の状態を考慮して、医療機関により許容されるもののみ）を誘導するか、またそれを引き起こす。治療的に許容される量を、最初は低用量を投与し、次いで、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加させることにより決定することができる。「予防有効用量」および「治療有効用量」の本発明の分子は、がんと関連する症状などの疾患症状の、それぞれ、開始を防止するか、またはその重症度の低下をもたらし得る。
用語「同時投与する」とは、個体の血液中の２つの活性薬剤の存在を指す。同時投与される活性薬剤を、同時に、または連続的に送達することができる。
本発明は、Ｐ−カドヘリンに結合する抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、およびそれらの薬物コンジュゲート、すなわち抗体薬物コンジュゲートまたはＡＤＣを提供する。特に、本発明は、Ｐ−カドヘリンに結合し、そのような結合の際に内在化する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。本発明の抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を、抗体薬物コンジュゲートを生成するために使用することができる。さらに、本発明は、望ましい薬物動態特性および他の望ましい属性を有し、したがって、Ｐ−カドヘリンを発現するがんを処置するのに使用され得る抗体薬物コンジュゲートを提供する。本発明はさらに、本発明の抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびにがんの処置のためにそのような医薬組成物を作製し、使用する方法を提供する。
抗体薬物コンジュゲート
本発明は、イムノコンジュゲートとも称される抗体薬物コンジュゲートを提供し、ここで、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体、抗原結合性断片またはその機能的等価物は、薬物部分に連結される。一態様では、本発明の抗体、抗原結合性断片またはその機能的等価物は、リンカーによる共有結合を介して、抗がん剤である薬物部分に連結される。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、有効用量の抗がん剤（例えば、細胞毒性剤）を、Ｐ−カドヘリンを発現する腫瘍組織に選択的に送達し、それによって、より高い選択性（およびより低い有効用量）を達成することができる。
一態様では、本発明は、式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、Ａｂは、本明細書に記載のＰ−カドヘリン結合抗体を表し；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは薬物部分であり；
ｍは１〜８の整数であり；および
ｎは１〜２０の整数である）
のイムノコンジュゲートを提供する。一実施形態では、ｎは１〜１０、２〜８、または２〜５の整数である。特定の実施形態では、ｎは２、３または４である。幾つかの実施形態では、ｍは１である。他の実施形態では、ｍは２、３または４である。
薬物と抗体の比率は特定のコンジュゲート分子については正確な値を有するが（例えば、式（Ｉ）中でｍを掛けたｎ）、その値は、典型的には、コンジュゲーションステップと関連する、ある程度の不均等性のため、多くの分子を含有する試料を記述するために使用される場合には平均値であることが多いことを理解されたい。イムノコンジュゲートの試料に関する平均充填量を、本明細書では薬物と抗体の比率、または「ＤＡＲ」と呼ぶ。幾つかの実施形態では、薬物がメイタンシノイドである場合、それは、「ＭＡＲ」と称される。幾つかの実施形態では、ＤＡＲは約２〜約６であり、典型的には、約３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７．０、７．５、８．０である。幾つかの実施形態では、試料の少なくとも５０重量％は、平均ＤＡＲ±２を有する化合物であり、好ましくは、試料の少なくとも５０％は、平均ＤＡＲ±１を含有するコンジュゲートである。実施形態は、ＤＡＲが約３．５、３．６、３．７、３．８または３．９であるイムノコンジュゲートを含む。幾つかの実施形態では、「約ｎ」のＤＡＲは、ＤＡＲの測定値がｎの２０％以内にあることを意味する。
本発明はまた、薬物部分に連結またはコンジュゲートされた、本明細書に開示される抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）およびその機能的等価物を含むイムノコンジュゲートに関する。一実施形態では、薬物部分Ｄは、構造：

（式中、波線は抗体薬物コンジュゲートのリンカーへのメイタンシノイドの硫黄原子の共有結合を示す）
を有するものなどの、メイタンシノイド薬物部分である。Ｒは、出現する毎に、独立にＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。アミド基を硫黄原子に結合させるアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、またはプロピルであってよい、すなわち、ｍは１、２または３である（米国特許第６３３，４１０号明細書、米国特許第５，２０８，０２０号明細書、Chari et al. (1992) Cancer Res. 52; 127-131、Lui et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-8623）。
メイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体、すなわち、メイタンシノイドのキラル炭素でのＲおよびＳ配置の任意の組合せが、本発明のイムノコンジュゲートについて企図される。一実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、以下の立体化学を有する。
一実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１としても知られる）である。ＤＭ１は、以下の構造式により表される。
別の実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３としても知られる）である。ＤＭ３は、以下の構造式により表される。
別の実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４としても知られる）である。ＤＭ４は、以下の構造式により表される。
薬物部分Ｄは、リンカーＬによって抗体Ａｂに連結され得る。Ｌは、共有結合によって薬物部分を抗体に連結することが可能な任意の化学部分である。架橋試薬は、薬物部分および抗体を連結して、抗体薬物コンジュゲートを形成するのに使用され得る二官能性または多官能性試薬である。抗体薬物コンジュゲートは、薬物部分および抗体への結合を可能にする反応官能性を有する架橋試薬を使用して調製することができる。例えば、システイン、チオールまたはアミン、例えばＮ末端またはアミノ酸鎖側鎖（抗体のリシンのような）は、架橋試薬の官能基と結合を形成することができる。
一実施形態では、Ｌは切断性リンカーである。別の実施形態では、Ｌは非切断性リンカーである。幾つかの実施形態では、Ｌは酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ジスルフィド結合切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである。
薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で非切断性リンカーを形成する好適な架橋試薬は当業界で周知であり、硫黄原子（ＳＭＣＣなど）を含む非切断性リンカーまたは硫黄原子を含まないものを形成することができる。薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で非切断性リンカーを形成する好ましい架橋試薬は、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分を含む。本発明によれば、そのような非切断性リンカーは、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分に由来すると言われる。
マレイミドに基づく部分を含む架橋試薬としては、限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＳＡ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（−ｐ−マレオミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＩＰ）およびＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳなどのポリエチレングリコールスペーサを含有するマレイミドに基づく架橋試薬が挙げられる。これらの架橋試薬は、マレイミドに基づく部分に由来する非切断性リンカーを形成する。マレイミドに基づく架橋試薬の代表的な構造は、以下に示される。
別の実施形態では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）またはＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳに由来する。
ハロアセチルに基づく部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。これらの架橋試薬は、ハロアセチルに基づく部分に由来する非切断性リンカーを形成する。ハロアセチルに基づく架橋試薬の代表的な構造は、以下に示される。
一実施形態では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）またはＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）に由来する。
薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で切断性リンカーを形成する好適な架橋試薬は、当業界で周知である。ジスルフィド含有リンカーは、生理的条件下で起こり得るジスルフィド交換を介して切断可能であるリンカーである。本発明によれば、そのような切断性リンカーは、ジスルフィドに基づく部分に由来すると言われる。好適なジスルフィド架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）が挙げられ、その構造は以下に示される。これらのジスルフィド架橋試薬は、ジスルフィドに基づく部分に由来する切断性リンカーを形成する。

Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、

Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、

Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）および

Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）。
一実施形態では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）に由来する。
薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で荷電リンカーを形成する好適な架橋試薬は、プロチャージ架橋試薬として知られる。一実施形態では、リンカーＬは、プロチャージ架橋試薬ＣＸ１−１に由来する。ＣＸ１−１の構造は、以下の通りである。

２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）。
上記で表される架橋試薬はそれぞれ、架橋試薬の一方の末端に、抗体の第一級アミンと反応して、アミド結合を形成するＮＨＳ−エステル、および他方の末端に、メイタンシノイド薬物部分のスルフィドリルと反応して、チオエーテルまたはジスルフィド結合を形成するマレイミド基またはピリジニルジスルフィド基を含有する。
１つの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、下記構造式のいずれか１つにより表される。

式中、
ＡｂはＰ−カドヘリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；
アミド結合とＡｂの第１級アミンとの形成を介してＡｂに結合したＤ−Ｌ基の数を示すｎは、１〜２０の整数である。一実施形態において、ｎは１〜１０、２〜８または２〜５の整数である。特定の実施形態において、ｎは３または４である。
一実施形態では、コンジュゲート中の薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と抗体との平均モル比（すなわち、メイタンシノイド抗体比（ＭＡＲ）としても知られる、平均ｎ値）は、約１〜約１０、約２〜約８（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０または８．１）、約２．５〜約７、約３〜約５、約２．５〜約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５）、約３．０〜約４．０、約３．２〜約４．２、または約４．５〜５．５（例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４または約５．５）である。
本発明の態様では、本発明のコンジュゲートは、実質的に高い純度を有し、下記特色の１つまたは複数を有する：（ａ）約９０％を上回る（例えば、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を上回るか、またはそれに等しい）、好ましくは約９５％を上回るコンジュゲート種が単量体であること、（ｂ）コンジュゲート調製物中のコンジュゲートされていないリンカーレベルが、約１０％未満であること（例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％未満であるか、それに等しい）（総リンカーに対して）、（ｃ）１０％未満のコンジュゲート種が架橋されること（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０％未満であるか、またはそれに等しい）、（ｄ）コンジュゲート調製物における遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）レベルが、約２％未満であること（例えば、約１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％または０％未満であるか、またはそれに等しい）（総細胞障害性作用物質に対するｍｏｌ／ｍｏｌ）、および／または（ｅ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）のレベルにおける実質的な増加が、貯蔵時に起こらないこと（例えば、約１週、約２週、約３週、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約１年、約２年、約３年、約４年または約５年後）。遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）のレベルにおける「実質的な増加」は、ある特定の貯蔵時間（例えば、約１週、約２週、約３週、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約１年、約２年、約３年、約４年または約５年）後に、遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）のレベルの増加が、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．２％、約２．５％、約２．７％、約３．０％、約３．２％、約３．５％、約３．７％、または約４．０％未満であることを意味する。
本明細書で使用される用語「非コンジュゲート化リンカー」とは、抗体がリンカーを介して薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）に共有的にカップリングしていない、架橋試薬（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）に由来するリンカーと共有的に連結された抗体を指す（すなわち、「非コンジュゲート化リンカー」はＡｂ−ＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢ、またはＡｂ−ＣＸ１−１で表すことができる）。
１．薬物部分
本発明は、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合するイムノコンジュゲートを提供する。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、薬物部分、例えば、抗がん剤、自己免疫処置剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、または麻酔剤にコンジュゲートされた抗Ｐ−カドヘリン抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を含む。本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、当業界で公知の任意の方法を使用して、いくつかの同一の、または異なる薬物部分にコンジュゲートすることができる。
ある特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートの薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、アウリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、Ｅｇ５阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される。
一実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートの薬物部分は、限定されるものではないが、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４などのメイタンシノイド薬物部分である。
さらに、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、所与の生物学的応答を改変する薬物部分にコンジュゲートすることができる。薬物部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、アポトーシス剤、抗血管新生剤などのタンパク質、または例えば、リンホカインなどの生物応答改変剤を含んでもよい。
一実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物は、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素などの薬物部分にコンジュゲートされる。細胞毒素の例としては、限定されるものではないが、タキサン（例えば、国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ０１／３８３１８およびＰＣＴ／ＵＳ０３／０２６７５を参照されたい）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサイクリン、ツブリシン（tubulysin）類似体、デュオカルマイシン類似体、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、メイタンシノイド、ならびに反応性ポリエチレングリコール部分（例えば、Sasse et al., J. Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000)、Suzawa et al., Bioorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000)、Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 44, 1045-53 (1991)、Francisco et al., Blood (2003)（印刷出版物に先立って、電子出版物）、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、第６，３４０，７０１号明細書、第６，３７２，７３８号明細書、および第６，４３６，９３１号明細書、米国特許出願公開第２００１／００３６９２３Ａ１号明細書、係属中米国特許出願第１０／０２４，２９０号明細書および第１０／１１６，０５３号明細書、ならびに国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ０１／４９６９８を参照されたい）を含む細胞毒性剤、タキソン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が挙げられる。また、治療剤としては、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、削摩剤（ablating agent）（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メイファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げられる（例えば、Seattle Geneticsの米国特許出願公開第２００９０３０４７２１号明細書を参照されたい）。
本発明の抗体、抗体断片（抗原結合性断片）または機能的等価物にコンジュゲートすることができる細胞毒素の他の例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびアウリスタチン、ならびにその誘導体が挙げられる。
治療剤を抗体にコンジュゲートするための様々な型の細胞毒素、リンカーおよび方法は、当業界で公知であり、例えば、Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264を参照されたい。
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、放射性アイソトープにコンジュゲートして、放射性イムノコンジュゲートと呼ばれる、細胞毒性放射性薬剤を作成することもできる。診断的または治療的に使用するために抗体にコンジュゲートすることができる放射性アイソトープの例としては、限定されるものではないが、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、イットリウム−９０、およびルテチウム−１７７が挙げられる。放射性イムノコンジュゲートを調製するための方法は、当業界で確立されている。放射性イムノコンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）など、商業的に入手可能であり、同様の方法を使用して、本発明の抗体を使用して放射性イムノコンジュゲートを調製することができる。ある特定の実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合させることができる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当業界で一般に公知であり、それぞれ全体が参照により組み込まれる、Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; およびZimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている。
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、異種タンパク質またはポリペプチド（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチド）にコンジュゲートして、融合タンパク質を作成することもできる。特に、本発明は、本明細書に記載の抗体断片（例えば、抗原結合性断片）（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。
さらなる融合タンパク質を、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に、「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術により作成することができる。ＤＮＡシャッフリングを使用して、本発明の抗体またはその断片の活性（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはその断片）を変化させることができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、第５，８１１，２３８号明細書、第５，８３０，７２１号明細書、第５，８３４，２５２号明細書、および第５，８３７，４５８号明細書; Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; およびLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308-313（これらの特許および刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはその断片、またはコードされた抗体もしくはその断片は、組換え前に変異性ＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法により無作為突然変異誘発にかけることにより変化させることができる。抗原に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを、１または複数の異種分子の、１または複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換えることができる。
さらに、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、ペプチドなどのマーカー配列にコンジュゲートして、精製を容易にすることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）に提供されるタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチド（配列番号１３０）であり、その多くが商業的に入手可能である。Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のように、例えば、ヘキサ−ヒスチジン（配列番号１３０）は、融合タンパク質の好都合の精製を提供する。精製にとって有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（Wilson et al., (1984) Cell 37:767）、および「ＦＬＡＧ」タグ（A. Einhauer et al., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465, 2001）が挙げられる。本発明によれば、抗体または抗原結合性断片を、腫瘍浸透ペプチドにコンジュゲートして、その効能を増強することもできる。
他の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物は、診断剤または検出剤にコンジュゲートされる。そのようなイムノコンジュゲートは、特定の療法の効能の決定などの、臨床試験手順の一部として疾患または障害の開始、発生、進行および／または重症度をモニタリングまたは予後診断するのに有用であり得る。そのような診断および検出を、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンなどの蛍光材料；限定されるものではないが、ルミノールなどの発光材料；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光材料；限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、６４Ｃｕ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｓｎなどの放射性材料；ならびに様々なポジトロン放出断層撮影を使用するポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンなどの、検出可能物質に抗体をカップリングさせることにより達成することができる。
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、標的抗原のイムノアッセイまたは精製にとって特に有用である固相支持体に結合することもできる。そのような固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
２．リンカー
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、薬物部分などの別の部分に、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を連結することができる任意の化学部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性を保持する条件下で、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、およびジスルフィド結合切断などの切断の影響を受けやすいものであってもよい（切断性リンカー）。あるいは、リンカーは、切断に対して実質的に耐性であってもよい（例えば、安定性リンカーまたは非切断性リンカー）。いくつかの態様では、リンカーは、プロチャージリンカー、親水性リンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである。
一態様では、本発明で使用されるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋試薬に由来する。
非切断性リンカーは、安定な、共有的な様式でメイタンシノイドなどの薬物を、抗体に連結することができ、切断性リンカーについて上記に列挙されたカテゴリーの下から外れない任意の化学部分である。かくして、非切断性リンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断およびジスルフィド結合切断に対して実質的に耐性である。さらに、非切断性とは、メイタンシノイドなどの薬物または抗体がその活性を喪失しない条件下で、酸、光不安定性切断剤、ペプチダーゼ、エステラーゼ、またはジスルフィド結合を切断する化学的もしくは生理的化合物により誘導される切断に耐える、リンカー中の、またはリンカーに隣接する化学的結合の能力を指す。
酸不安定リンカーは、酸性ｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソームおよびリソソームなどの特定の細胞内区画は、酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、酸不安定リンカーを切断するのに好適な条件を提供する。
光不安定リンカーは、光に接近可能である体表面で、および多くの体腔において有用であるリンカーである。さらに、赤外線は組織に浸透することができる。
いくつかのリンカーは、ペプチダーゼ、すなわち、ペプチダーゼ切断性リンカーにより切断することができる。特定のペプチドのみが、細胞の内部または外部で容易に切断される。例えば、Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 626-629 (1982)およびUmemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989)を参照されたい。さらに、ペプチドは、α−アミノ酸と、化学的には、あるアミノ酸のカルボキシレート基と、第２のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合であるペプチド結合とから構成される。リシンのカルボキシレート基およびε−アミノ基との間の結合などの他のアミド結合は、ペプチド結合ではないと理解され、非切断性であると考えられる。
いくつかのリンカーは、エステラーゼにより切断することができる、すなわち、エステラーゼ切断性リンカーである。再度、特定のエステルのみを、細胞の内部または外部に存在するエステラーゼにより切断することができる。エステルは、カルボン酸とアルコールとの縮合により形成される。単純エステルは、脂肪族アルコール、ならびに小環状および低分子芳香族アルコールなどの、単純アルコールを使用して生成されるエステルである。
プロチャージリンカーは、抗体薬物コンジュゲートへの組込み後にその電荷を保持する荷電した架橋試薬に由来する。プロチャージリンカーの例を、米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号明細書に見出すことができる。
３．ＡＤＣのコンジュゲーションおよび調製
本発明のコンジュゲートを、米国特許第７，８１１，５７２号明細書、第６，４１１，１６３号明細書、第７，３６８，５６５号明細書、および第８，１６３，８８８号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号明細書、第２０１１／０１６６３１９号明細書、第２０１２／０２５３０２１号明細書および第２０１２／０２５９１００号明細書に記載のものなどの当業界で公知の任意の方法により調製することができる。これらの特許および特許出願公開の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
１ステップ法
一実施形態では、本発明のコンジュゲートを、１ステップ法によって調製することができる。この方法は、実質的に水性の媒体中で抗体、薬物および架橋剤を混合すること、任意選択で、好適なｐＨで１または複数の共溶媒を含有させることを含む。一実施形態では、方法は、本発明の抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物とを含む第１の混合物を形成させるステップ、次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体と薬物とを含む第１の混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップを含む。
一実施形態では、１ステップ法は、約６以上（例えば、約６〜約９、約６〜約７、約７〜約９、約７〜約８．５、約７．５〜約８．５、約７．５〜約８．０、約８．０〜約９．０、または約８．５〜約９．０）のｐＨを有する溶液中で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。例えば、本発明の方法は、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９または約９．０のｐＨを有する溶液中で、細胞結合剤を、薬物（ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、約７．８のｐＨ（例えば、７．６〜８．０のｐＨまたは７．７〜７．９のｐＨ）を有する溶液中で、細胞結合剤を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。
１ステップ法（すなわち、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させること）を、当業界で公知の任意の好適な温度で実行することができる。例えば、１ステップ法は、約２０℃以下（例えば、約−１０℃（例えば、細胞毒性剤および二官能性架橋試薬を溶解するために使用される有機溶媒の存在によって、溶液の凍結が防止されるという条件で）〜約２０℃、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）、または室温（例えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）、または高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）で行ってもよい。一実施形態では、１ステップ法は、約１６℃〜約２４℃（例えば、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で行う。別の実施形態では、１ステップ法は、約１５℃以下（例えば、約−１０℃〜約１５℃、または約０℃〜約１５℃）の温度で実行される。例えば、方法は、例えば、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＰＤＢ、ＳＰＤＢ、またはＣＸ１−１）を溶解するために使用される有機溶媒（複数可）の存在によって、溶液の凍結が防止されるという条件で、約１５℃、約１４℃、約１３℃、約１２℃、約１１℃、約１０℃、約９℃、約８℃、約７℃、約６℃、約５℃、約４℃、約３℃、約２℃、約１℃、約０℃、約−１℃、約−２℃、約−３℃、約−４℃、約−５℃、約−６℃、約−７℃、約−８℃、約−９℃、または約−１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢ、またはＣＸ１−１）と接触させることを含む。一実施形態では、方法は、約−１０℃〜約１５℃、約０℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃、約０℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１０℃〜約１５℃、または約５℃〜約１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。別の実施形態では、方法は、約１０℃の温度（例えば、８℃〜１２℃の温度または９℃〜１１℃の温度）で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。
一実施形態では、上記の接触は、抗体を提供した後、該抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む第１の混合物を形成させ、次いで、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む第１の混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることにより行われる。例えば、一実施形態では、抗体を反応容器中に提供し、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加し（それによって、抗体を接触させる）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）を、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物に添加する（それによって、抗体と薬物とを含む混合物を接触させる）。一実施形態では、抗体を反応容器中に提供し、抗体を容器に提供する直後に、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加する。別の実施形態では、抗体を反応容器中に提供し、抗体を容器に提供した後の時間間隔後（例えば、細胞結合剤を空間に提供した後約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１日以上後）に、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加する。薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を、迅速に（すなわち、約５分、約１０分などの短い時間間隔以内に）またはゆっくりと（ポンプを使用するなど）添加することができる。
次いで、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させた直後に、または抗体を薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させた後のいくらか後の時点で（例えば、約５分〜約８時間以上）、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることができる。例えば、一実施形態では、抗体を含む反応容器への薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）の添加の直後に、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）を、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物に添加する。あるいは、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させた後、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間以上で、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることができる。
抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後、反応を約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間以上（例えば、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、または約４８時間）進行させる。
一実施形態では、１ステップ法は、未反応の薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）および／または未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢもしくはＣＸ１−１）をクエンチするためのクエンチングステップをさらに含む。クエンチングステップは、典型的には、コンジュゲートの精製前に行われる。一実施形態では、混合物をクエンチング試薬と接触させることにより、混合物をクエンチする。本明細書で使用される場合、「クエンチング試薬」とは、遊離薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）および／または架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応する試薬を指す。一実施形態では、４−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、またはヨードアセトアミドプロピオン酸などのマレイミドまたはハロアセトアミドクエンチング試薬を使用して、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）中の任意の未反応の基（チオールなど）がクエンチされたことを確保することができる。クエンチングステップは、薬物（例えば、ＤＭ１）の二量体化を防止するのに役立ち得る。二量体化したＤＭ１は、除去するのが困難であり得る。極性の荷電したチオールクエンチング試薬（４−マレイミド酪酸または３−マレイミドプロピオン酸など）を使用するクエンチングの際に、過剰の未反応のＤＭ１は、精製ステップの間に共有的に連結したコンジュゲートから容易に分離することができる極性の荷電した水溶性付加物に変換される。非極性および中性チオールクエンチング試薬を使用するクエンチングを使用することもできる。一実施形態では、混合物を、未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応するクエンチング試薬と接触させることにより、混合物をクエンチする。例えば、求核試薬を混合物に添加して、任意の未反応のＳＭＣＣをクエンチすることができる。好ましくは、求核試薬は、リシン、タウリンおよびヒドロキシルアミンなどの、アミノ基含有求核試薬である。
好ましい実施形態では、反応（すなわち、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させること）を、混合物をクエンチング試薬と接触させた後、完了まで進行させる。これに関して、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後、クエンチング試薬を約１時間〜約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間または約２５時間〜約４８時間）混合物に添加する。
あるいは、混合物のｐＨを約５．０（例えば、４．８、４．９、５．０、５．１または５．２）に低下させることにより、混合物をクエンチする。別の実施形態では、ｐＨを６．０未満、５．５未満、５．０未満、４．８未満、４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満に低下させることにより、混合物をクエンチする。あるいは、ｐＨを、約４．０（例えば、３．８、３．９、４．０、４．１または４．２）〜約６．０（例えば、５．８、５．９、６．０、６．１または６．２）、約４．０〜約５．０、約４．５（例えば、４．３、４．４、４．５、４．６または４．７）〜約５．０に低下させる。一実施形態では、混合物のｐＨを４．８に低下させることにより、混合物をクエンチする。別の実施形態では、混合物のｐＨを５．５に低下させることにより、混合物をクエンチする。
一実施形態では、１ステップ法は、不安定に結合したリンカーを抗体から遊離させるための保持ステップをさらに含む。保持ステップは、コンジュゲートの精製前（例えば、反応ステップの後、反応ステップとクエンチングステップの間、またはクエンチングステップの後）に混合物を保持することを含む。例えば、方法は、（ａ）抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を形成させるステップ；次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で調製された混合物を保持して、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から遊離させるステップ、ならびに（ｃ）混合物を精製して、精製されたコンジュゲートを提供するステップを含む。
別の実施形態では、方法は、（ａ）抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を形成させるステップ；次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で調製された混合物をクエンチして、任意の未反応の薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）および／または未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）をクエンチするステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）で調製された混合物を保持して、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から遊離させるステップ、ならびに（ｄ）混合物を精製して、精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を提供するステップを含む。
あるいは、保持ステップを、コンジュゲートの精製後に実施した後、さらなる精製ステップを行うことができる。
好ましい実施形態では、保持ステップの前に反応を完了まで進行させる。これに関して、保持ステップを、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後、約１時間〜約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間または約２４時間〜約４８時間）実施することができる。
保持ステップは、好適な期間（例えば、約１時間〜約１週間、約１時間〜約２４時間、約１時間〜約８時間、または約１時間〜約４時間）にわたって好適な温度（例えば、約０℃〜約３７℃）で溶液を維持して、安定に結合したリンカーを抗体から実質的に遊離させないが、不安定に結合したリンカーを抗体から遊離させることを含む。一実施形態では、保持ステップは、約２０℃以下（例えば、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）、室温（例えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）、または高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）で溶液を維持することを含む。一実施形態では、保持ステップは、約１６℃〜約２４℃（例えば、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態では、保持ステップは、約２℃〜約８℃（例えば、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、または約１０℃）の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態では、保持ステップは、約３７℃（例えば、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、または約４０℃）の温度で溶液を維持することを含む。
保持ステップの持続期間は、保持ステップが行われる温度およびｐＨに依存する。例えば、保持ステップの持続期間は、高温で保持ステップを行うことにより実質的に減少させることができ、その最大温度は細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートの安定性によって制限される。保持ステップは、約１時間〜約１日（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、または約２４時間）、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１４時間〜約２４時間、約１６時間〜約２４時間、約１８時間〜約２４時間、約２０時間〜約２４時間、約５時間〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約１２時間〜約１週間（例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約７日）または約１日〜約１週間にわたって溶液を維持することを含んでもよい。
一実施形態では、保持ステップは、少なくとも約１２時間から最大で１週間までの期間にわたって約２℃〜約８℃の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態では、保持ステップは、一晩（例えば、約１２〜約２４時間、好ましくは、約２０時間）、約２℃〜約８℃の温度で溶液を維持することを含む。
保持ステップのためのｐＨ値は、好ましくは、約４〜約１０である。一実施形態では、保持ステップのためのｐＨ値は、約４以上であるが、約６未満である（例えば、４〜５．９）か、または約５以上であるが、約６未満である（例えば、５〜５．９）。別の実施形態では、保持ステップのためのｐＨ値は、約６〜約１０の範囲（例えば、約６．５〜約９、約６〜約８）である。例えば、保持ステップのためのｐＨ値は、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０であってもよい。
特定の実施形態では、保持ステップは、約１２時間〜約１週間にわたって、約６〜７．５のｐＨで２５℃で混合物をインキュベートすること、約５時間〜約５日間にわたって、約４．５〜５．９のｐＨで４℃で混合物をインキュベートすること、または約５時間〜約１日間にわたって、約４．５〜５．９のｐＨで２５℃で混合物をインキュベートすることを含んでもよい。
１ステップ法は、任意選択で、コンジュゲートの可溶性および回収を増加させるための反応ステップへのスクロースの添加を含んでもよい。望ましくは、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、または２０％（ｗ／ｖ））の濃度でスクロースを添加する。好ましくは、約１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）、または約１１％（ｗ／ｖ））の濃度でスクロースを添加する。さらに、反応ステップはまた、緩衝剤の添加をも含んでもよい。当業界で公知の任意の好適な緩衝剤を使用することができる。好適な緩衝剤としては、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびリン酸緩衝液が挙げられる。一実施形態では、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、およびその組合せからなる群から選択される。
一実施形態では、１ステップ法は、混合物を精製して、精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を提供するステップをさらに含んでもよい。当業界で公知の任意の精製方法を使用して、本発明のコンジュゲートを精製することができる。一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、接線流濾過（ＴＦＦ）、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、選択的沈降、または任意の他の好適な精製方法、ならびにその組合せを使用する。別の態様では、コンジュゲートを上記の精製方法にかける前に、１または複数のＰＶＤＦ膜を通してコンジュゲートを最初に濾過する。あるいは、コンジュゲートを上記の精製方法にかけた後に、１または複数のＰＶＤＦ膜を通してコンジュゲートを濾過する。例えば、一実施形態では、コンジュゲートを１または複数のＰＶＤＦ膜を通して濾過した後、接線流濾過を使用して精製する。あるいは、コンジュゲートを接線流濾過を使用して精製した後、１または複数のＰＶＤＦ膜を通して濾過する。
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、ＳａｒｔｏｃｏｎＣａｓｓｅｔｔｅシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ）、およびＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ型システム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）などの、任意の好適なＴＦＦシステムを精製のために使用することができる。
任意の好適な吸着クロマトグラフィー樹脂を、精製のために使用することができる。好ましい吸着クロマトグラフィー樹脂としては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合様式イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、染料リガンドクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびその組合せが挙げられる。好適なヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＨＡ Ｕｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）、およびセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適なＨＣＩＣ樹脂の例は、ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）である。好適なＨＩＣ樹脂の例としては、Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｈｅｘｙｌ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、およびＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（全てＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから）、ならびにＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐメチルおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−ブチル樹脂（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適なイオン交換樹脂の例としては、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（全てＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから）、ならびにＵｎｏｓｐｈｅｒｅＳ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な混合様式イオン交換体の例としては、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢｘ樹脂（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が挙げられる。好適なＩＭＡＣ樹脂の例としては、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な染料リガンド樹脂の例としては、Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＡｆｆｉ−ｇｅｌブルー樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な親和性樹脂の例としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）および抗体が適切なレクチン結合部位を担持する、レクチン親和性樹脂、例えば、Ｌｅｎｔｉｌ Ｌｅｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が挙げられる。好適な逆相樹脂の例としては、Ｃ４、Ｃ８、およびＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）が挙げられる。
任意の好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂を、精製のために使用することができる。好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂の例としては、限定されるものではないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂（例えば、Ｓ−２００およびＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５およびＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０、およびＰ−１００）、ならびに当業者には公知の他のものが挙げられる。
２ステップ法および１ポット法
一実施形態では、本発明のコンジュゲートを、米国特許第７，８１１，５７２号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号明細書に記載のように調製することができる。この方法は、（ａ）本発明の抗体を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、リンカー（すなわち、Ａｂ−ＳＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢまたはＡｂ−ＣＸ１−１）を抗体に共有結合させることによって、リンカーが結合した抗体を含む第１の混合物を調製するステップ；（ｂ）任意選択で、第１の混合物を精製方法にかけて、リンカーが結合した抗体の精製された第１の混合物を調製するステップ；（ｃ）約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、リンカーが結合した抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と反応させることにより、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を、第１の混合物中のリンカーが結合した抗体にコンジュゲートして、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）；および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２の混合物を調製するステップ；ならびに（ｄ）第２の混合物を精製方法にかけて、第２の混合物の他の成分からコンジュゲートを精製するステップを含む。あるいは、精製ステップ（ｂ）を省略してもよい。本明細書に記載の任意の精製方法を、ステップ（ｂ）および（ｄ）のために使用することができる。一実施形態では、ＴＦＦをステップ（ｂ）と（ｄ）の両方のために使用する。別の実施形態では、ＴＦＦをステップ（ｂ）のために使用し、吸着クロマトグラフィー（例えば、ＣＨＴ）をステップ（ｄ）のために使用する。
１ステップ試薬およびｉｎ ｓｉｔｕ法
一実施形態では、米国特許第６，４４１，１６３号明細書および米国特許出願公開第２０１１／０００３９６９号明細書および第２００８／０１４５３７４号明細書に記載のように、予め形成された薬物−リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を、本発明の抗体にコンジュゲートした後、精製ステップを行うことにより、本発明のコンジュゲートを調製することができる。本明細書に記載の任意の精製方法を使用することができる。薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応させることにより、薬物−リンカー化合物を調製する。任意選択で、薬物−リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を精製にかけた後、抗体にコンジュゲートする。
抗Ｐ−カドヘリン抗体
本発明は、ヒトＰ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。本発明の抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）としては、実施例（以下のセクション６を参照）に記載するように単離されるヒトモノクローナル抗体またはそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本発明は、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。ある特定の実施形態では、本発明はまた、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む、前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）も提供する。特定の実施形態では、本発明は、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、４、５以上のＶＨ ＣＤＲを含む（またはあるいは、からなる）前記抗体を提供する。
本発明は、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。本発明はまた、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む、前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）も提供する。特に本発明は、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３以上のＶＬ ＣＤＲを含む（またはあるいは、からなる）前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
本発明の他の抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、変異しているが、表１に記載の配列に記載のＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、抗体は、表１に記載の配列に記載のＣＤＲ領域と比較した場合、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸がＣＤＲ領域中で変異しているアミノ酸配列変異体を含む。
本発明はまた、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖および完全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。かかる核酸配列は、哺乳動物細胞における発現に関して最適化され得る。
本発明の他の抗体としては、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異しているが、表１に記載の配列に対する少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性を有するものが挙げられる。幾つかの実施形態では、表１に記載する配列で表される可変領域と比較した場合、１、２、３、４または５個のアミノ酸が可変領域中で突然変異しているが、表１に列挙する抗体と実質的に同じ治療活性を保持する。
これらの抗体はそれぞれＰ−カドヘリンに結合することができるため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖、および完全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を「混合および一致」させて、本発明の他のＰ−カドヘリン結合抗体を作出することができる。そのような「混合および一致」したＰ−カドヘリン結合抗体を、当業界で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、および実施例のセクションに記載の他のアッセイ）を使用して試験することができる。これらの鎖を混合および一致させる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列と置き換えるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対に由来する完全長重鎖配列を、構造的に類似する完全長重鎖配列と置き換えるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列と置き換えるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対に由来する完全長軽鎖配列を、構造的に類似する完全長軽鎖配列と置き換えるべきである。従って、一態様では、本発明は、抗体がＰ−カドヘリンに特異的に結合する、配列番号７、２７、４７、６７、８７および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号１７、３７、５７、７７、９７および１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号９、２９、４９、６９、８９および１０９からなる群から選択される哺乳動物細胞中での発現のために最適化されたアミノ酸配列を含む完全長重鎖；および配列番号１９、３９、５９、７９、９９および１１９からなる群から選択される哺乳動物発現系の細胞中での発現のために最適化されたアミノ酸配列を含む完全長軽鎖を有する単離されたモノクローナル抗体；または（ｉｉ）その抗原結合ポーションを含む機能的タンパク質を提供する。
別の態様では、本発明は、表１に記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはその組合せを含むＰ−カドヘリン結合抗体を提供する。抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号１、２１、４１、６１、８１および１０１に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号２、２２、４２、６２、８２および１０２に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号３、２３、４３、６３、８３および１０３に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号１１、３１、５１、７１、９１および１１１に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号１２、３２、５２、７２、９２および１１２に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号１３、３３、５３、７３、９３および１１３に示す。
これらの抗体がそれぞれＰ−カドヘリンに結合することができ、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域によって提供されることを考慮して、ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列とを、「混合および一致」させることができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを混合および一致させることができる）。そのような「混合および一致」したＰ−カドヘリン結合抗体を、当業界で公知の結合アッセイおよび実施例に記載のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合および一致させる場合、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）と置き換えるべきである。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合および一致させる場合、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）と置き換えるべきである。新規ＶＨおよびＶＬ配列を、１または複数のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本開示のモノクローナル抗体について本明細書に示されるＣＤＲ配列に由来する構造的に類似する配列と置換することにより、新しいＶＨおよびＶＬ配列を作出することができることが当業者には容易に明らかである。
従って、本発明は、抗体がＰ−カドヘリンに特異的に結合する、配列番号１、２１、４１、６１、８１および１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、２２、４２、６２、８２および１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号３、２３、４３、６３、８３および１０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；配列番号１１、３１、５１、７１、９１および１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１２、３２、５２、７２、９２および１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１３、３３、５３、７３、９３および１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
特定の実施形態では、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
別の特定の実施形態では、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
さらに別の特定の実施形態では、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
さらなる実施形態では、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号６１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号６２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
別の特定の実施形態では、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号８１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号８３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
さらに特定の実施形態では、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、配列番号１０１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態では、Ｐ−カドヘリンに特異的に結合する抗体は、表１に記載される抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）である。
１．エピトープおよび同エピトープに結合する抗体の同定
一実施形態では、本発明は、配列番号１２６の１２４、１２５、１５１、１５３、１５４、１５５、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６８、１７０、１７１、および１７２位にあるアミノ酸から選択される１つまたは複数の残基を含むヒトＰ−カドヘリン上のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号１２６の１２４、１５１、１５３〜１５６、および１７２位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基においてヒトＰ−カドヘリンに結合する重鎖を含む抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。他の実施形態では、本発明は、配列番号１２６の１２４、１２５、１５５、１５６、１５９〜１６３、１６８、１７０、および１７１位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基においてヒトＰ−カドヘリンに結合する軽鎖を含む抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。幾つかの実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号１２８の５２、５４、５６、６０、６５、１０５、または１０７位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含むヒトＰ−カドヘリンタンパク質に対する重鎖結合性パラトープを含む。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号１２９の１、２、２７、２８、３０、６８、９２、９３、または９４位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含むヒトＰ−カドヘリンタンパク質に対する軽鎖結合性パラトープを含む。
本発明はまた、表１に記載する抗Ｐ−カドヘリン抗体と同じエピトープに特異的に結合するか、または表１に記載する抗体と交差競合する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。したがって、さらなる抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、例えばＢＩＡＣＯＲＥを介したＰ−カドヘリン結合アッセイまたは結合を測定するための当業者に公知のアッセイで、本発明の他の抗体と交差競合する（cross-compete）（例えば、統計学的に有意な様式で、その結合を競合的に阻害する）その能力に基づいて同定され得る。Ｐ−カドヘリン（例えば、ヒトＰ−カドヘリン）への本発明の抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＰ−カドヘリンへの結合について抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と競合することができることを示す；そのような抗体は、非限定的理論によれば、それが競合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と、Ｐ−カドヘリンタンパク質上の同じか、または関連する（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近い、または重なっている）エピトープに結合することができる。特定の実施形態では、表１に記載する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と同じＰ−カドヘリン上のエピトープに結合する抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。そのようなヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を、本明細書に記載のように調製および単離することができる。
２．Ｆｃ領域のフレームワークのさらなる変化
本発明のイムノコンジュゲートは、例えば、抗体の特性を改善するための、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対する改変をさらに含む改変された抗体またはその抗原結合性断片を含んでもよい。幾つかの実施形態では、フレームワーク改変を行って、抗体の免疫原性を低下させる。例えば、１つの手法は、１または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることである。より特には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が誘導される生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有してもよい。抗体フレームワーク配列を、抗体が誘導される生殖系列配列と比較することにより、そのような残基を同定することができる。フレームワーク領域配列をその生殖系列構成に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞変異を生殖系列配列に「復帰変異」させることができる。そのような「復帰変異」した抗体もまた、本発明により包含されることが意図される。
別の型のフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、またはさらには、１もしくは複数のＣＤＲ領域内の１または複数の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去することによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。この手法はまた、「脱免疫化」とも呼ばれ、Carr et al.による米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で作製される改変に加えて、またはその代わりに、Ｆｃ領域内に改変を含む、典型的には、血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存的細胞性細胞毒性などの、抗体の１または複数の機能的特性を変化させるように、本発明の抗体を操作することができる。さらに、本発明の抗体を化学的に改変する（例えば、１もしくは複数の化学的部分を抗体に結合することができる）か、または改変してそのグリコシル化を変化させ、再度、抗体の１または複数の機能的特性を変化させることができる。これらの実施形態はそれぞれ、以下にさらに詳細に記載される。
一実施形態では、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化する、例えば、増加するか、または減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域を改変する。この手法は、Bodmer et al.による米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変化させて、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするか、または抗体の安定性を増加もしくは減少させる。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より特には、抗体が天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して弱いスタフィロコッカス（Staphylococcyl）タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、１または複数のアミノ酸変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域中に導入する。この手法は、Ward et al.による米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基と置き換えて、抗体のエフェクター機能を変化させることにより、Ｆｃ領域を変化させる。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対する変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、１または複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。親和性を変化させるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であってもよい。この手法は、例えば、両方ともWinter et al.による米国特許第５，６２４，８２１号明細書および第５，６４８，２６０号明細書に記載されている。
別の実施形態では、抗体が変化したＣ１ｑ結合および／または低下した、もしくは無効化される補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基から選択される１または複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。
別の実施形態では、１または複数のアミノ酸残基を変化させることによって、補体を固定する抗体の能力を変化させる。この手法は、例えば、Bodmer et al.によるＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号パンフレットに記載されている。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の１または複数のアミノ酸を、１または複数のアロタイプアミノ酸残基により、図４に示すようにＩｇＧ１サブクラスおよびカッパアイソタイプに置き換える。アロタイプアミノ酸残基としては、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域、ならびにJefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)により記載されたようなカッパアイソタイプの軽鎖の定常領域も挙げられる。
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域を改変して、抗体依存的細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させる、および／または１もしくは複数のアミノ酸を改変することによりＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる。この手法は、例えば、PrestaによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号パンフレットに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善されたバリアントが記載されている（Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001を参照されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を改変する。例えば、無グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を変化させて、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような炭水化物改変を、例えば、抗体配列内の１または複数のグリコシル化部位を変化させることにより達成することができる。例えば、１または複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１または複数のアミノ酸置換を作製することによって、その部位でのグリコシル化を除去することができる。そのような無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような手法は、例えば、Co et al.による米国特許第５，７１４，３５０号明細書および第６，３５０，８６１号明細書に記載されている。
さらに、またはあるいは、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体またはバイセクテイングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの、変化した型のグリコシル化を有する抗体を作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが証明されている。そのような炭水化物改変を、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は当業界で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させることによって、グリコシル化が変化した抗体を生成する宿主細胞として使用することができる。例えば、Hang et al.によるＥＰ１，１７６，１９５は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞系を記載し、そのような細胞系中で発現された抗体は低グリコシル化を示す。PrestaによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号パンフレットは、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された炭水化物に結合させる能力が低下し、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化をももたらす、バリアントＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞を記載している（Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。Umama et al.によるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４２号パンフレットは、操作された細胞系中で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらすバイセクテイングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載している（Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999も参照されたい）。
別の実施形態では、抗体をその生物学的半減期を増加させるように改変する。様々な手法が可能である。例えば、Wardの米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のような、１または複数の以下の変異を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、Presta et al.による米国特許第５，８６９，０４６号明細書および第６，１２１，０２２号明細書に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で変化させることができる。
３．Ｐ−カドヘリン抗体の生成
限定されるものではないが、組換え発現、化学的合成、および抗体四量体の酵素的消化などの、当業界で公知の任意の手段によって抗Ｐ−カドヘリン抗体およびその抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を生成することができるが、完全長モノクローナル抗体を、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生成によって取得することができる。組換え発現は、当業界で公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来するものであってよい。
本発明は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載のような重鎖もしくは軽鎖可変領域または相補性決定領域を含むセグメントをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。幾つかの実施形態では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８、２８、４８、６８、８８および１０８からなる群から選択されるポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８、３８、５８、７８、９８および１１８からなる群から選択されるポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
幾つかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０、３０、５０、７０、９０または１１０のポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０、４０、６０、８０、１００または１２０のポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
本発明のポリヌクレオチドは、抗Ｐ−カドヘリン抗体の可変領域配列のみをコードしてもよい。それらはまた、抗体の可変領域と定常領域との両方をコードしてもよい。いくつかのポリヌクレオチド配列は、例示的マウス抗Ｐ−カドヘリン抗体の１つの重鎖と軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。いくつかの他のポリヌクレオチドは、マウス抗体の１つの重鎖と軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２つのポリペプチドセグメントをコードする。
ポリヌクレオチド配列を、抗Ｐ−カドヘリン抗体またはその結合断片をコードする存在する配列（例えば、以下の実施例に記載の配列）のｄｅ ｎｏｖｏ固相ＤＮＡ合成によるか、またはＰＣＲ突然変異誘発により生成することができる。Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホロアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固相支持体法などの、当業界で公知の方法により、核酸の直接化学合成を達成することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入を、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載のように実施することができる。
また、上記の抗Ｐ−カドヘリン抗体を生成するための発現ベクターおよび宿主細胞も、本発明において提供される。様々な発現ベクターを使用して、抗Ｐ−カドヘリン抗体鎖または結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスに基づく発現ベクターと非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳動物宿主細胞中で抗体を生成することができる。非ウイルスベクターおよび系としては、典型的には、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを含む、プラスミド、エピソームベクター、およびヒト人工染色体（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞中での抗Ｐ−カドヘリンポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現にとって有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓＡ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための当業界で公知のいくつかの他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させる意図される宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、抗Ｐ−カドヘリン抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有する。幾つかの実施形態では、誘導性プロモーターを使用して、誘導条件下以外では挿入された配列の発現を防止する。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物を、発現生成物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列について集団を偏らせることなく、非誘導条件下で拡張することができる。プロモーターに加えて、他の調節エレメントも、抗Ｐ−カドヘリン抗体鎖または断片の効率的発現にとって必要とされるか、または望まれる。これらのエレメントは、典型的には、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現の効率を、使用において細胞系にとって適切なエンハンサーの含有により増強することができる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞中での発現を増加させることができる。
発現ベクターはまた、挿入される抗Ｐ−カドヘリン抗体配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供することができる。より頻繁には、挿入される抗Ｐ−カドヘリン抗体配列を、ベクター中に含有させる前にシグナル配列に連結する。抗Ｐ−カドヘリン抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するために使用されるベクターは、その定常領域または部分もコードすることがある。そのようなベクターにより、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現が可能になり、それにより、インタクト抗体またはその断片の生成がもたらされる。典型的には、そのような定常領域はヒトである。
抗Ｐ−カドヘリン抗体鎖を担持および発現させるための宿主細胞は、原核または真核であってもよい。大腸菌（E.coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核宿主である。使用にとって好適な他の微生物宿主としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌、ならびにサルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、および様々なシュードモナス（Pseudomonas）種などの他の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主においては、当業者であれば、典型的には宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製することもできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージに由来するプロモーター系などの、任意数の様々な周知のプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的には、任意選択でオペレーター配列と共に発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物を使用して、本発明の抗Ｐ−カドヘリンポリペプチドを発現させることもできる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞を使用することもできる。
いくつかの好ましい実施形態では、哺乳動物宿主細胞を使用して、本発明の抗Ｐ−カドヘリンポリペプチドを発現および生成させる。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例に記載のミエローマハイブリドーマクローン）または外因性発現ベクターを担持する哺乳動物細胞系（例えば、以下に例示されるＳＰ２／０ミエローマ細胞）であってもよい。これらのものは、任意の正常な死滅する、または正常もしくは異常な不死の動物もしくはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、様々なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系、形質転換されたＢ細胞およびハイブリドーマなどの、インタクト免疫グロブリンを分泌することができるいくつかの好適な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための哺乳動物組織細胞培養の使用は、例えば、Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987で一般的に考察されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセッシング情報部位を含んでもよい。これらの発現ベクターは通常、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、構成的である、細胞型特異的である、段階特異的である、および／またはモジュレート可能もしくは調節可能であってもよい。有用なプロモーターとしては、限定されるものではないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト極初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当業界で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せが挙げられる。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の型に応じて変化する。例えば、原核細胞のためには塩化カルシウムトランスフェクションが一般的に使用されるが、他の細胞宿主のためにはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションを使用してもよい（一般的には、Sambrook et al., supraを参照されたい）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強性取込み、およびｅｘ ｖｉｖｏでの形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期的な、高収率の生成のためには、安定な発現が望ましいことが多い。例えば、抗Ｐ−カドヘリン抗体鎖または結合断片を安定に発現する細胞系を、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントと、選択マーカー遺伝子とを含有する本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターの導入後、細胞を富化培地中で１〜２日間成長させた後、選択培地に切替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在により、選択培地中で導入された配列を上手く発現する細胞の成長が可能となる。耐性の安定にトランスフェクトされた細胞を、細胞型にとって適切な組織培養技術を使用して増殖させることができる。
治療的および診断的使用
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートは、限定されるものではないが、固形がんなどのがんの処置などの様々な適用において有用である。ある特定の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートは、腫瘍成長の阻害、分化の誘導、腫瘍体積の減少、および／または腫瘍の発がん性の低下にとって有用である。使用方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの方法であってもよい。
一態様では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートは、生物試料中のＰ−カドヘリンの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される用語「検出すること」は、定量的または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態では、生物試料は細胞または組織を含む。ある特定の実施形態では、そのような組織は、他の組織と比較してより高いレベルでＰ−カドヘリンを発現する正常および／またはがん性組織を含む。
一態様では、本発明は、生物試料中のＰ−カドヘリンの存在を検出する方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、抗体の抗原への結合を可能にする条件下で、生物試料を抗Ｐ−カドヘリン抗体と接触させること、および抗体と抗原との間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。
１つの態様では、本発明は、Ｐ−カドヘリンの増加された発現に関連付けられる障害を診断する方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、試験細胞を抗Ｐ−カドヘリン抗体と接触させること；抗Ｐ−カドヘリン抗体のＰ−カドヘリン抗原への結合を検出することにより試験細胞上でのＰ−カドヘリンの発現レベルを決定すること（定量的または定性的に）；および試験細胞中でのＰ−カドヘリンの発現レベルを、対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞またはそのような正常細胞と同等のレベルでＰ−カドヘリンを発現する細胞）中でのＰ−カドヘリンの発現レベルと比較することを含み、対照細胞と比較して、試験細胞上でのＰ−カドヘリンの発現レベルが高い場合、Ｐ−カドヘリンの発現の増加と関連する障害の存在を示す。ある特定の実施形態では、試験細胞は、Ｐ−カドヘリンの発現の増加と関連する障害を有することが疑われる個体から得られる。ある特定の実施形態では、障害は、がんまたは腫瘍などの細胞増殖性障害である。ある特定の実施形態では、上記方法は、試験細胞においてＰ−カドヘリン遺伝子のコピー数を測定することを含む。ある特定の実施形態では、上記方法は、ＰＡＸ−ＦＯＸＯトランスロケーション突然変異を検出することを含む。遺伝子のコピー数および／またはトランスロケーション突然変異は、当技術分野で公知の標準的な方法、例えばＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ等を使用して検出することができる。
ある特定の実施形態では、上記のものなどの診断または検出の方法は、細胞表面上で、または表面上にＰ−カドヘリンを発現する細胞から得られる膜調製物中で発現されるＰ−カドヘリンへの抗Ｐ−カドヘリン抗体の結合を検出することを含む。細胞表面上に発現されるＰ−カドヘリンへの抗Ｐ−カドヘリン抗体の結合を検出するための例示的アッセイは、「ＦＡＣＳ」アッセイである。
ある特定の他の方法を使用して、Ｐ−カドヘリンへの抗Ｐ−カドヘリン抗体の結合を検出することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、および免疫組織化学（ＩＨＣ）などの、当業界で周知である抗原結合アッセイが挙げられる。
ある特定の実施形態では、抗Ｐ−カドヘリン抗体を標識する。標識としては、限定されるものではないが、直接検出される標識または部分（蛍光、発色、高電子密度、化学発光、および放射性標識など）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出される、酵素またはリガンドなどの部分が挙げられる。
ある特定の実施形態では、抗Ｐ−カドヘリン抗体を、不溶性マトリックス上に固定する。固定は、溶液中で遊離したままである任意のＰ−カドヘリンタンパク質から抗Ｐ−カドヘリン抗体を分離することを必要とする。これは、水に不溶性のマトリックスもしくは表面への吸着（Bennich et al, 米国特許第３，７２０，７６０号明細書）により、もしくは共有カップリング（例えば、グルタルアルデヒド架橋を使用する）により、アッセイ手順の前に抗Ｐ−カドヘリン抗体を不溶化することによって、または例えば、免疫沈降により、抗Ｐ−カドヘリン抗体とＰ−カドヘリンタンパク質との複合体の形成後に抗ｃＫＩＴ抗体を不溶化することによって、都合良く達成される。
診断または検出の上記実施形態のいずれかを、抗Ｐ−カドヘリン抗体の代わりに、またはそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して実行することができる。
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを患者に投与することを含む、疾患を処置、または防止する方法を提供する。本発明はまた、患者において疾患を処置または防止するための、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、患者における疾患の処置または防止における使用のための、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、患者における疾患の処置または防止のための医薬の製造における、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートで処置される疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、がんは、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートが結合するＰ−カドヘリン発現細胞を特徴とする。ある特定の実施形態では、がんは、健常な患者に対して、Ｐ−カドヘリンの発現の増加を特徴とする。幾つかの実施形態では、Ｐ−カドヘリンの発現は、Ｐ−カドヘリンＲＮＡの増加により測定され得る。他の実施形態では、がんは、Ｐ−カドヘリンのＤＮＡコピー数の増加を特徴とする。ｐ−カドヘリン発現のレベルを測定または決定する他の方法は、当業者に公知である。処置および／または防止され得る疾患の例として、副腎皮質癌、膀胱がん、骨がん、乳がん、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、胚芽腫、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞がん、カポジ肉腫、肝臓がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、卵巣がん、直腸がん、横紋筋肉腫、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮がん、腹部がん、子宮がん、膣がん、および外陰部がんが挙げられるが、それらに限定されない。
本発明は、治療有効量の本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、がんは固形がんである。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、がんは、耐性がんおよび／または再発したがんである。ある特定の態様では、例えば、耐性がんは、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含むがこれらに限定されないチロシンキナーゼ阻害剤に耐性である。ある特定の実施形態では、がんは、Ｈｅｒ２耐性がんである。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象に、治療有効量の本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、腫瘍成長を阻害する方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含むがこれらに限定されない他のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性である。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、抗Ｐ−カドヘリン抗体が結合するＰ−カドヘリンを発現する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ヒトＰ−カドヘリンを過剰発現する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、Ｐ−カドヘリン遺伝子のコピー数の増加を有する。
本発明はまた、治療有効量の上記抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートによる処置に関して患者を選択する方法を提供する。ある特定の態様では、上記方法は、チロシンキナーゼ阻害剤耐性がんを有する患者を選択することを含む。ある特定の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤耐性がんが、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤および／またはＭｅｔ阻害剤に耐性であると企画される。ある特定の態様では、耐性がんは、Ｈｅｒ２耐性がんであると企画される。より具体的には、Ｈｅｒ２耐性がんは、トラスツズマブまたはトラスツズマブエムタンシンに応答しないと企画される。ある特定の態様では、がんは、新生耐性がんであると企画され、さらに他の態様では、がんは、再発したがん、例えばＨｅｒ２再発がんであると企画される。本発明のある特定の態様では、上記方法は、新生耐性または再発したがんを有する患者を選択すること、およびＰ−カドヘリンの発現に関して測定することを含む。ある特定の態様では、再発したがんまたは腫瘍が、初期ではＰ−カドヘリン発現性がんまたは腫瘍ではなかったが、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、トラスツズマブまたはトラスツズマブエムタンシン）による処置後に、チロシンキナーゼ耐性の、もしくは再発したがんまたは腫瘍であるＰ−カドヘリン陽性がんとなることが企画される。
疾患の処置のために、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートの適切な用量は、処置しようとする疾患の種類、疾患の重症度および経過、疾患の応答性、以前の療法、患者の病歴などの様々な因子に依存する。抗体または薬剤を１回で、または数日から数カ月継続する一連の処置にわたって、または治癒が行われるか、もしくは疾患状態の縮小（例えば、腫瘍サイズの減少）が達成されるまで投与することができる。最適な投薬スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定値から算出することができ、個々の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートの相対的効力に応じて変化する。処置する医師であれば、体液または組織中での測定された滞留時間および薬物濃度に基づいて、投与のための反復速度を推定することができる。
組合せ療法
ある特定の例では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを、他の抗がん剤、抗アレルギー剤、抗嘔吐剤（または制吐剤）、疼痛緩和剤、細胞保護剤、およびその組合せなどの他の治療剤と組み合わせる。
一実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを、抗がん特性を有する第２の化合物との組合せ療法として組合せ医薬製剤、または用量レジメン中で組み合わせる。組合せ医薬製剤または用量レジメンの第２の化合物は、それらが互いに有害に作用しないような、抗体または組合せのイムノコンジュゲートに対する相補的活性を有してもよい。例えば、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートは、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、Ｐ−カドヘリン下流シグナル伝達経路阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、Ｍｃｌ１阻害剤、および他のＰ−カドヘリン阻害剤と組み合わせて投与され得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「組合せ医薬」とは、１つの単位剤形中の固定的組合せ、または２つ以上の治療剤を同時に独立に、もしくは特に、組合せパートナーが協調的な、例えば、相乗効果を示すことができる時間間隔内で別々に投与することができる非固定的組合せもしくは組み合わせ投与のための部分のキットを指す。
用語「組合せ療法」とは、本開示に記載の治療状態または障害を処置するための２つ以上の治療剤の投与を指す。そのような投与は、固定比の活性成分を有する単一のカプセルなどの、実質的に同時的な様式でのこれらの治療剤の同時投与を包含する。あるいは、そのような投与は、それぞれの活性成分について、複数の、または別々の容器（例えば、カプセル、粉末、および液体）中での同時投与を包含する。粉末および／または液体を、投与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。さらに、そのような投与はまた、ほぼ同時に、または異なる時間に、連続的様式でのそれぞれの種類の治療剤の使用も包含する。いずれかの場合、処置レジメンは、本明細書に記載の状態または障害の処置において組合せ薬物の有益な効果を提供する。
組合せ療法は、「相乗作用」を提供し、「相乗的」であることがわかってもよい、すなわち、活性成分を一緒に使用した場合に達成される効果は、化合物を別々に使用することから得られる効果の合計よりも大きい。活性成分が（１）組み合わせた単位用量製剤中で同時製剤化および投与されるか、もしくは同時に送達される；（２）別々の製剤として交互に、もしくは同時に送達される；または（３）いくつかの他のレジメンによるものである場合、相乗効果を達成することができる。交互療法において送達される場合、化合物が例えば、別々の注射筒中の異なる注射液により連続的に投与または送達される場合、相乗効果を達成することができる。一般に、交互療法中では、有効用量の各活性成分は連続的に、すなわち、順次投与されるが、組合せ療法においては、有効用量の２つ以上の活性成分は一緒に投与される。
組合せ療法における使用のために考えられる一般的な化学療法剤としては、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射液（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射液（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射液（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
一態様では、本発明は、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤、およびＭｅｔ阻害剤などの１または複数のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、塩酸エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能なＡＢＴ８６９としても知られる、Ｎ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾール−４−イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）ウレア）；リンゴ酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６としても知られ、米国特許第６，７８０，９９６号明細書に記載された、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−「３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；ザクチマ（ＺＤ６４７４）；およびイマチニブまたはメシル酸イマチニブ（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））が挙げられる。
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤としては、限定されるものではないが、塩酸エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３’’Ｓ’’）−テトラヒドロ-3-フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド、Ｔｏｖｏｋ（登録商標））；バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標））；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カネルチニブ二塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ４９７８３９−６２−０）；ムブリチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリナミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）；および４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−ｙｌ］−フェノール（ＰＫＩ１６６、ＣＡＳ１８７７２４−６１−４）が挙げられる。
ＥＧＦＲ抗体としては、限定されるものではないが、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））；マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）；トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ニモツズマブ（ｈＲ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈ−Ｒ３；ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ３３９１５１−９６−１）；およびｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６、ＣＡＳ９４６４１４−０９−１）が挙げられる。
ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２受容体）（Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０、またはｐ１８５としても知られる）阻害剤としては、限定されるものではないが、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））；トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２、（２Ｅ）−Ｎ−［４−［［３−クロロ−４−［（ピリジン−２−イル）メトキシ］フェニル］アミノ］−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エンアミド、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０２８４４３号パンフレットに記載）；ラパチニブまたはラパチニブジトシレート（ditosylate）（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；（２Ｅ）−Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（ＢＩＢＷ−２９９２、ＣＡＳ８５０１４０−７２−６）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６、ＣＡＳ７１４９７１−０９−０２）；カネルチニブ二塩酸塩（ＰＤ１８３８０５またはＣＩ−１０３３）；およびＮ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリナミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）が挙げられる。
Ｈｅｒ３阻害剤としては、限定されるものではないが、ＬＪＭ７１６、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８、ＲＧ７１１６、ＲＥＧＮ−１４００、ＡＶ−２０３、ＭＰ−ＲＭ−１、ＭＭ−１１１、およびＭＥＨＤ−７９４５Ａが挙げられる。
ＭＥＴ阻害剤としては、限定されるものではないが、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＣＡＳ８４９２１７−６８−１）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、以前はＸＬ８８０、ＣＡＳ８４９２１７−６４−７）；チバンチニブ（ＡＲＱ１９７、ＣＡＳ１０００８７３−９８−２）；１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（５−（７−メトキシキノリン−４−イルオキシ)ピリジン−２−イル）−５−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＡＭＧ４５８）；クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）、ＰＦ−０２３４１０６６）；（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＳＵ１１２７１）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−ｙｌ）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１２７４）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルホリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１６０６）；６−［ジフルオロ［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］メチル］−キノリン（ＪＮＪ３８８７７６０５、ＣＡＳ９４３５４０−７５−８）；２−［４−［１−（キノリン−６−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピラジン−６−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノール（ＰＦ０４２１７９０３、ＣＡＳ９５６９０５−２７−４）；Ｎ−（（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド（ＭＫ２４６１、ＣＡＳ９１７８７９−３９−１）；６−［［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］チオ］−キノリン（ＳＧＸ５２３、ＣＡＳ１０２２１５０−５７−７）；および（３Ｚ）−５−［［（２，６−ジクロロフェニル）メチル］スルホニル］−３−［［３，５−ジメチル−４−［［（２Ｒ）−２−（１−ピロリジニルメチル）−１−ピロリジニル］カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＰＨＡ６６５７５２、ＣＡＳ４７７５７５−５６−７）が挙げられる。
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＢＭＳ−７５４８０７、ＸＬ−２２８、ＯＳＩ−９０６、ＧＳＫ０９０４５２９Ａ、Ａ−９２８６０５、ＡＸＬ１７１７、ＫＷ−２４５０、ＭＫ０６４６、ＡＭＧ４７９、ＩＭＣＡ１２、ＭＥＤＩ−５７３、およびＢＩ８３６８４５が挙げられる。概説については、例えば、Yee, JNCI, 104; 975 (2012)を参照されたい。
別の態様では、本発明は、限定されるものではないが、ＭＥＫ阻害剤、Ｂｒａｆ阻害剤、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤、ＳＨＰ２阻害剤、およびまたｍＴｏｒなどの、１または複数のＰ−カドヘリン下流シグナリング経路阻害剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。
例えば、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤としては、限定されるものではないが、ＸＬ−５１８（ＡＣＣ Ｃｏｒｐ．から入手可能な、ＧＤＣ−０９７３、Ｃａｓ Ｎｏ．１０２９８７２−２９−４としても知られる）；２−［（２−クロロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロ−ベンザミド（ＣＩ−１０４０またはＰＤ１８４３５２としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００００３５４３６号パンフレットに記載されている）；Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンザミド（ＰＤ０３２５９０１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００２００６２１３号パンフレットに記載されている）；２，３−ビス［アミノ［（２−アミノフェニル）チオ］メチレン］−ブタンジニトリル（Ｕ０１２６としても知られ、米国特許第２，７７９，７８０号明細書に記載されている）；Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６−メトキシフェニル］−１−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロピル］−シクロプロパンスルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９またはＢＡＹ８６９７６６としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７０１４０１１号パンフレットに記載されている）；（３Ｓ，４Ｒ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）−１４−（エチルアミノ）−８，９，１６−トリヒドロキシ−３，４−ジメチル−３，４，９，１９−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾオキサシクロテトラデシン−１，７（８Ｈ）−ジオン］（Ｅ６２０１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００３０７６４２４号パンフレットに記載されている）；２’−アミノ−３’−メトキシフラボン（Ｂｉａｆｆｉｎ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．，ＫＧ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能なＰＤ９８０５９としても知られる）；ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２、ＣＡＳ９１８５０４−６５−１）；（Ｒ）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４，７（３Ｈ，８Ｈ）−ジオン（ＴＡＫ−７３３、ＣＡＳ１０３５５５５−６３−５）；ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６、ＣＡＳ１２０４５３１−２６−９）；およびトラメチニブジメチルスルホキシド（ＧＳＫ−１１２０２１２、ＣＡＳ１２０４５３１−２５−８０）が挙げられる。
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤としては、限定されるものではないが、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（ＧＤＣ０９４１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／０３６０８２号パンフレットおよび第ＷＯ０９／０５５７３０号パンフレットに記載されている）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ２３５としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０６／１２２８０６号パンフレットに記載されている）；４−（トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−２−アミン（ＢＫＭ１２０またはＮＶＰ−ＢＫＭ１２０としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０８４７８６号パンフレットに記載されている）；トザセルチブ（ＶＸ６８０またはＭＫ−０４５７、ＣＡＳ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＳ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６，ＣＡＳ５０２６３２−６６−８）；および８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２、ＣＡＳ１５４４４７−３６−６）が挙げられる。
ｍＴｏｒとしては、限定されるものではないが、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））；リダホロリムス（以前はデフェロリムス、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネートとして知られ、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０６４３８３号パンフレットに記載されている）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））；シマピモッド（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｔｒａｎｓ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；およびＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−（配列番号１３１）、内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）が挙げられる。
さらに別の態様において、本発明は、限定されるものではないが、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣｌ１阻害剤、Ｔｒａｉｌ剤、Ｃｈｋ阻害剤などの１または複数のプロアポトーシス剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することによりがんを処置する方法を提供する。
例えば、ＩＡＰ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＬＣＬ１６１、ＧＤＣ−０９１７、ＡＥＧ−３５１５６、ＡＴ４０６、およびＴＬ３２７１１が挙げられる。ＩＡＰ阻害剤の他の例としては、限定されるものではないが、国際公開第０４／００５２８４号パンフレット、国際公開第０４／００７５２９号パンフレット、国際公開第０５／０９７７９１号パンフレット、国際公開第０５／０６９８９４号パンフレット、国際公開第０５／０６９８８８号パンフレット、国際公開第０５／０９４８１８号パンフレット、米国特許出願公開第２００６／００１４７００号明細書、米国特許出願公開第２００６／００２５３４７号明細書、国際公開第０６／０６９０６３号パンフレット、国際公開第０６／０１０１１８号パンフレット、国際公開第０６／０１７２９５号パンフレット、および国際公開第０８／１３４６７９号パンフレット（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたものが挙げられる。
ＢＣＬ−２阻害剤としては、限定されるものではないが、４−［４−［［２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン−１−イル］メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（４−モルホリニル）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］フェニル］スルホニル］ベンザミド（ＡＢＴ−２６３としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／１５５３８６号パンフレットに記載されている）；テトロカルシンＡ；アンチマイシン；ゴシポール（（−）ＢＬ−１９３）；オバトクラックス；エチル−２−アミノ−６−シクロペンチル−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈクロモン−３−カルボキシレート（ＨＡ１４−１）；オブリメルセン（Ｇ３１３９、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））；Ｂａｋ ＢＨ３ペプチド；（−）−ゴシポール酢酸（ＡＴ−１０１）；４−［４−［（４’−クロロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−ニトロフェニル］スルホニル］−ベンザミド（ＡＢＴ−７３７、ＣＡＳ８５２８０８−０４−９）；およびナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３、ＣＡＳ９２３５６４−５１−６）が挙げられる。
ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）などのプロアポトーシス受容体アゴニスト（ＰＡＲＡ）としては、限定されるものではないが、デュラネルミン（ＡＭＧ−９５１、ＲｈＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）；マパツムマブ（ＨＲＳ−ＥＴＲ１、ＣＡＳ ６５８０５２−０９−６）；レキサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＡＳ８４５８１６−０２−６）；アポマブ（Ａｐｏｍａｂ（登録商標））；コナツムマブ（ＡＭＧ６５５、ＣＡＳ８９６７３１−８２−１）；およびチガツズマブ（ＣＳ１００８、ＣＡＳ９４６４１５−３４−５、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏから入手可能）が挙げられる。チェックポイントキナーゼ（ＣＨＫ）阻害剤としては、限定されるものではないが、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１）；６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピペリジニル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（ＳＣＨ９００７７６、ＣＡＳ８９１４９４−６３−６）；５−（３−フルオロフェニル）−３−ウレイドチオフェン−２−カルボン酸Ｎ−［（Ｓ）−ピペリジン−３−イル］アミド（ＡＺＤ７７６２、ＣＡＳ８６０３５２−０１−８）；４−［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタ−３−イル）アミノ］−３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン（ＣＨＩＲ１２４、ＣＡＳ４０５１６８−５８−３）；７−アミノダクチノマイシン（７−ＡＡＤ）、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン；Ｎ−［５−ブロモ−４−メチル−２−［（２Ｓ）−２−モルホリニルメトキシ］−フェニル］−Ｎ’−（５−メチル−２−ピラジニル）ウレア（ＬＹ２６０３６１８、ＣＡＳ９１１２２２−４５−２）；スルホラファン（ＣＡＳ４４７８−９３−７、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート）；９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＳＢ−２１８０７８、ＣＡＳ１３５８９７−０６−２）；およびＴＡＴ−Ｓ２１６Ａ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＬＹＲＳＰＡＭＰＥＮＬ（配列番号１３２））、およびＣＢＰ５０１（（ｄ−Ｂｐａ）ｓｗｓ（ｄ−Ｐｈｅ−Ｆ５）（ｄ−Ｃｈａ）ｒｒｒｑｒｒ）が挙げられる。
さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、１つまたは複数の免疫調節薬（例えば、共刺激分子の活性化因子または免疫チェックポイント分子の阻害剤のうちの１つまたは複数）と組み合わせて、本発明の抗体薬物コンジュゲートを投与することにより、がんを処置する方法を提供する。
ある特定の実施形態では、免疫調節薬は、共刺激分子の活性化因子である。一実施形態では、共刺激分子のアゴニストは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３またはＣＤ８３リガンドのアゴニスト（例えば、アゴニスト抗体もしくはその抗原結合性断片、または可溶性融合物）から選択される。
ある特定の実施形態では、免疫調節薬は、免疫チェックポイント分子の阻害剤である。一実施形態では、免疫調節薬は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４および／またはＴＧＦＲベータの阻害剤である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３もしくはＣＴＬＡ４、またはそれらの任意の組合せを阻害する。「阻害」または「阻害剤」という用語は、所与の分子、例えば免疫チェックポイント阻害剤のある特定のパラメーター、例えば活性の低減を含む。例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の活性、例えばＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１活性の阻害は、この用語に含まれる。したがって、阻害は、１００％である必要はない。
阻害分子の阻害は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで実施され得る。幾つかの実施形態では、阻害核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を使用して、阻害分子の発現を阻害することができる。他の実施形態では、阻害シグナルを有する阻害剤は、ポリペプチド、例えば可溶性リガンド（例えば、ＰＤ−１−ＩｇまたはＣＴＬＡ−４ Ｉｇ）、または阻害分子に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４および／またはＴＧＦＲベータ、またはそれらの組合せに結合する抗体またはその断片（本明細書中では「抗体分子」とも称される）である。
一実施形態では、抗体分子は、完全抗体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ））である。さらに他の実施形態では、抗体分子は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域（Ｆｃ）、特に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域（Ｆｃ）、さらに特に、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４）の重鎖定常領域を有する。一実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４である。一実施形態では、定常領域は、変更されて、例えば突然変異されて、抗体分子の特性を改変する（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、もしくは補体機能のうちの１つまたは複数を増加または減少させる）。
ある特定の実施形態では、抗体分子は、二重特異性または多重特異性抗体分子の形態で存在する。一実施形態では、二重特異性抗体分子は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する第１の結合特異性および第２の結合特異性、例えばＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、またはＰＤ−Ｌ２に対する第２の結合特異性を有する。一実施形態では、二重特異性抗体分子は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１およびＴＩＭ−３に結合する。別の実施形態では、二重特異性分子は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１およびＬＡＧ−３に結合する。別の実施形態では、二重特異性分子は、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１に結合する。さらに別の実施形態では、二重特異性抗体分子は、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ２に結合する。別の実施形態では、二重特異性抗体分子は、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３に結合する。上述の分子の任意の組合せは、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する第１の結合特異性、ならびにＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、またはＰＤ−Ｌ２のうちの２つまたはそれ以上に対する第２および第３の結合特異性を含む多重特異性抗体分子、例えば三重特異性抗体で成され得る。
ある特定の実施形態では、免疫調節薬は、ＰＤ−１、例えばヒトＰＤ−１の阻害剤である。別の実施形態では、免疫調節薬は、ＰＤ−Ｌ１、例えばヒトＰＤ−Ｌ１の阻害剤である。一実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体分子である。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、単独で、または他の免疫調節薬と組み合わせて、例えばＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３またはＣＴＬＡ４の阻害剤と組み合わせて投与することができる。例示的な実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、例えば抗ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体分子は、ＬＡＧ−３阻害剤、例えば抗ＬＡＧ−３抗体分子と組み合わせて投与される。別の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、例えば抗ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体分子は、ＴＩＭ−３阻害剤、例えば抗ＴＩＭ−３抗体分子と組み合わせて投与される。さらに他の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、例えば抗ＰＤ−１抗体分子は、ＬＡＧ−３阻害剤、例えば抗ＬＡＧ−３抗体分子、およびＴＩＭ−３阻害剤、例えば抗ＴＩＭ−３抗体分子と組み合わせて投与される。ＰＤ−１阻害剤との免疫調節薬の他の組合せ（例えば、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４および／またはＴＧＦＲ）もまた、本発明内である。当該技術分野で公知の、または本明細書中に開示する抗体分子はいずれも、チェックポイント分子の阻害剤の上述の組合せで使用することができる。
一実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピディリズマブから選択される抗ＰＤ−１抗体である。幾つかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブである。ニボルマブに関する代替名称として、ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、またはＢＭＳ−９３６５５８が挙げられる。幾つかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４−９４−４）である。ニボルマブは、ＰＤ１を特異的にブロックする完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）およびＰＤ−１に特異的に結合する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号明細書およびＰＣＴ国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに開示されている。
他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブである。ペムブロリズマブ（商品名ＫＥＹＴＲＵＤＡ、以前はランブロリズマブ、Ｍｅｒｃｋ ３７４５、ＭＫ−３４７５またはＳＣＨ−９００４７５としても公知）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペムブロリズマブは、例えばHamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44、ＰＣＴ国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレット、および米国特許第８，３５４，５０９号明細書に開示されている。
幾つかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ピディリズマブである。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＰＣＴ国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに開示されている。他の抗ＰＤ１抗体は、米国特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号明細書、および／または米国特許出願公開第２０１２０１１４６４９号明細書に開示されている。他の抗ＰＤ１抗体として、ＡＭＰ ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）が挙げられる。
幾つかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２の細胞外またはＰＤ−１結合性部分を含むイムノアドヘシン）である。幾つかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ＡＭＰ−２２４である。
幾つかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。幾つかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、例えば国際公開第２０１３／０１７９１７４号パンフレットに開示され、本明細書中に開示する配列（またはそれに対して実質的に同一または類似の配列、例えば、指定配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一の配列）を有するＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、またはＭＤＸ−１１０５ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（Ａ０９−２４６−２とも称される）から選択される。
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＭＤＸ−１１０５である。ＢＭＳ−９３６５５９としても公知であるＭＤＸ−１１０５は、ＰＣＴ国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０抗体は、ＰＣＴ国際出願第２０１０／０７７６３４号パンフレットに記載される抗ＰＤ−Ｌ１（それぞれ、配列番号２０および２１に示される重鎖および軽鎖可変領域配列）である。
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）である。ＭＤＰＬ３２８０Ａは、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０ＡおよびＰＤ−Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号明細書および米国特許出願公開第２０１２００３９９０６号明細書に開示されている。
他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２阻害剤は、ＡＭＰ−２２４である。ＡＭＰ−２２４は、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体（Ｂ７−ＤＣＩｇ、Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ、例えばＰＣＴ国際公開第２０１０／０２７８２７号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０６６３４２号パンフレットに開示されている）である。
一実施形態では、ＬＡＧ−３阻害剤は、抗ＬＡＧ−３抗体分子である。一実施形態では、ＬＡＧ−３阻害剤は、ＢＭＳ−９８６０１６である。
医薬組成物
イムノコンジュゲートを含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、本発明のイムノコンジュゲートを、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。組成物は、がん（膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、バレット食道がん、胃がん、頭頸部がん、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、肝臓がん、膵がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、シュワン腫、神経膠芽細胞腫、軟部組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎がん、黒色腫、前立腺がん、良性全室線肥大症（ＢＰＨ）、女性化乳房（gynacomastica）、および横紋筋肉腫を含むが、それらに限定されない）がんを処置または防止するのに適している１つまたは複数の他の治療剤をさらに含有することができる。
治療剤および診断剤の製剤を、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローション、または懸濁液の形態で生理的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することにより調製することができる（例えば、Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の抗体薬物コンジュゲートの臨床サービス形態（ＣＳＦ）は、ＡＤＣ、ヒスチジン、スクロースおよびポリソルベ−ト２０を含有するバイアル中の凍結乾燥物である。凍結乾燥物を注射用水で再構成させることができ、その溶液はＡＤＣ、ヒスチジン、スクロース、およびポリソルベート２０、ｐＨ約５．０を含む。１つの特定実施形態では、凍結乾燥物は、ｐＨ５．３で、１０ｍｇ／ｍｌのＡＤＣ、２０ｍＭヒスチジン、２４０ｍＭスクロース、および０．０２％ポリソルベート２０を含む。
治療剤のための投与レジメンの選択は、実体の血清または組織代謝回転率、症状のレベル、実体の免疫原性および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性などのいくつかの因子に依存する。ある特定の実施形態において、投与レジメンは、許容される副作用レベルと一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。従って、送達される生物製剤の量は、特定の実体および処置される状態の重症度に一部依存する。適切な用量の抗体、サイトカイン、および小分子を選択する際の指針が利用可能である（例えば、Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000を参照されたい）。
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響するか、または処置に影響すると予測されることが当業界で公知の、または疑われるパラメーターまたは因子を使用して、医師によって行われる。一般に、用量は最適用量よりもいくらか低い量から開始し、その後、任意の負の副作用と比較して所望の、または最適な効果が達成されるまで少しずつ増加させる。重要な診断尺度は、例えば、生成される炎症性サイトカインの炎症またはレベルの症状のものを含む。
本発明の医薬組成物中の活性成分の急性用量レベルを、患者にとって毒性とならないように、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変化させることができる。選択される用量レベルは、使用される本開発の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、使用される特定の組成物と共に使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および以前の病歴、ならびに医学界で公知の同様の因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
本発明の抗体またはそれらの断片を含む組成物は、連続注入により、または例えば１日、１週または１週につき１〜７回、隔週に１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週ごとに１回、６週ごとに１回、７週ごとに１回、または８週ごとに１回の間隔での投与により供給され得る。用量を、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、大脳内で、または吸入により提供することができる。特定の用量プロトコールは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または用量頻度を含むものである。
本発明のイムノコンジュゲートに関して、患者に投与される用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重であってもよい。用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重であってもよい。本発明の抗体またはその断片の用量を、キログラム患者体重（ｋｇ）に、ｍｇ／ｋｇで投与される用量を掛けたものを使用して算出することができる。
本発明のイムノコンジュゲートの用量を反復し、投与を一日未満、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月、４カ月、５カ月または少なくとも６カ月空けてもよい。幾つかの実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、週に２回、週に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、またはより低頻度で投与され得る。特定の実施形態においては、本発明のイムノコンジュゲートの用量を、２週間毎に反復する。
特定の患者のための有効量は、処置される状態、患者の全体的な健康、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化してもよい（例えば、Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001を参照されたい）。
投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚適用、皮下、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病変内投与による注射もしくは輸注、または持続放出系もしくは埋込み体によるものであってもよい（例えば、Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; 米国特許第６，３５０，４６６号明細書および第６，３１６，０２４号明細書を参照されたい）。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤または注射部位での疼痛を軽減するためのリドカインなどの局所麻酔剤、またはその両方を含んでもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアゾール化剤を含む製剤の使用により、肺投与を使用することもできる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号明細書、第５，９８５，３２０号明細書、第５，９８５，３０９号明細書、第５，９３４，２７２号明細書、第５，８７４，０６４号明細書、第５，８５５，９１３号明細書、第５，２９０，５４０号明細書、および第４，８８０，０７８号明細書；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２４４号パンフレット、第ＷＯ９７／３２５７２号パンフレット、第ＷＯ９７／４４０１３号パンフレット、第ＷＯ９８／３１３４６号パンフレット、および第ＷＯ９９／６６９０３号パンフレット（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明の組成物を、１または複数の当業界で公知の様々な方法を使用して、１または複数の投与経路により投与することもできる。当業者であれば理解できるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変化する。本発明のイムノコンジュゲートのために選択される投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは輸注による他の非経口投与経路が挙げられる。非経口投与は、通常は注射による、腸内投与および局所投与以外の投与様式であってよく、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および輸注が挙げられる。あるいは、本発明の組成物を、局所、表皮または粘膜投与経路などの非経口経路により、例えば、鼻内的、経口的、経膣的、直腸的、舌下的または局所的に投与することができる。一実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは、輸注により投与される。別の実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは皮下投与される。
本発明のイムノコンジュゲートを制御放出系または持続放出系において投与する場合、ポンプを使用して制御放出または持続放出を達成することができる（Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989を参照されたい）。ポリマー材料を使用して、本発明の療法の制御放出または持続放出を達成することができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983を参照されたい；また、Levy et al., Science 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989; 米国特許第５，６７９，３７７号明細書；米国特許第５，９１６，５９７号明細書；米国特許第５，９１２，０１５号明細書；米国特許第５，９８９，４６３号明細書；米国特許第５，１２８，３２６号明細書；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号パンフレット；およびＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０２５３号パンフレットも参照されたい）。持続放出製剤において使用されるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態において、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌であり、および生分解性である。制御放出系または持続放出系を、予防または治療標的の近くに置き、かくして、全身用量のほんの一部のみを要するようにすることができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984を参照されたい）。
制御放出系は、Langer, Science 249:1527-1533, 1990による概説で考察されている。当業者には公知の任意の技術を使用して、本発明の１または複数のイムノコンジュゲートを含む持続放出製剤を生成することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号明細書、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号パンフレット、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／２０６９８号パンフレット、Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996；Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995；Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997；およびLam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明のイムノコンジュゲートを局所投与する場合、それらを軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、スプレー、エアゾール、溶液、乳濁液の形態、または当業者には周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照されたい。非スプレー可能局所剤形については、局所適用と適合する担体または１もしくは複数の賦形剤を含み、いくつかの場合、水よりも高い動的粘度を有する粘性から半固体または固体の形態が典型的に使用される。好適な製剤としては、限定されるものではないが、必要に応じて、滅菌されるか、または例えば、浸透圧などの様々な特性に影響を及ぼすための補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液、もしくは塩）と混合される、溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リミネント剤、蝋膏剤などが挙げられる。他の好適な局所剤形としては、いくつかの場合、固体または液体の不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどの気体噴射剤）との混合物中、またはスクイーズボトル中に充填される、スプレー可能なエアゾール調製物が挙げられる。必要に応じて、モイスチャライザーまたは保湿剤を医薬組成物および剤形に添加することもできる。そのような追加の成分の例は、当業界で周知である。
イムノコンジュゲートを含む組成物を鼻内投与する場合、それをエアゾール形態、スプレー、ミストまたは液滴の形態で製剤化することができる。特に、本発明による使用のための予防剤または治療剤を、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体）の使用と共に、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提示物の形態で都合良く送達することができる。加圧エアゾールの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することにより、用量単位を決定することができる。化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入器または散布器における使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される）を製剤化することができる。
第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射線療法との同時投与または処置のための方法は、当業界で公知である（例えば、Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照されたい）。治療剤の有効量は、症状を少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０％；少なくとも４０％、または少なくとも５０％減少させることができる。
本発明のイムノコンジュゲートと共に投与することができるさらなる療法（例えば、予防剤または治療剤）を、本発明のイムノコンジュゲートから５分未満空けて、３０分未満空けて、１時間空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて、約１２時間〜約１８時間空けて、１８時間〜２４時間空けて、２４時間〜３６時間空けて、３６時間〜４８時間空けて、４８時間〜５２時間空けて、５２時間〜６０時間空けて、６０時間〜７２時間空けて、７２時間〜８４時間空けて、８４時間〜９６時間空けて、または９６時間〜１２０時間空けて投与することができる。２つ以上の療法を、１回の同じ患者訪問のうちに投与してもよい。
ある特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートを、ｉｎ ｖｉｖｏでの適切な分布を確保するように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを通過することを確保するために（必要に応じて）、それらを、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書；第５，３７４，５４８号明細書；および第５，３９９，３３１号明細書を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送される１または複数の部分を含み、かくして、標的化薬物送達を増強してもよい（例えば、Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。標的化部分の例としては、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照されたい）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性プロテインＡ受容体（Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられ、K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
本発明は、単独で、または他の療法と組み合わせた本発明のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するためのプロトコールを提供する。本発明の併用療法の治療法（例えば、予防剤または治療剤）は、対象へ同時にまたは順次投与され得る。本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、周期的に投与することもできる。周期的療法は、療法（例えば、薬剤）の１つに対する耐性の発生を軽減するため、療法（例えば、薬剤）の１つの副作用を回避もしくは軽減する、および／または療法の効能を改善するための、一定期間、第１の療法（例えば、第１の予防剤または治療剤）の投与、次いで、一定期間、第２の療法（例えば、第２の予防剤または治療剤）の投与、およびこの連続的投与の反復、すなわち、周期を含む。
本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、対象に同時に投与することができる。
用語「同時に」は、正確に同時の療法（例えば、予防剤または治療剤）の投与に限定されないが、むしろ、本発明の抗体またはその断片を含む医薬組成物が対象に連続して、および本発明の抗体薬物コンジュゲートが他の療法（複数可）と一緒に作用して、それらを別途投与した場合よりも増大した利益を提供し得るような時間間隔で投与されることを意味する。例えば、それぞれの療法を同時に、または異なる時点で任意の順序で連続的に投与することができる；しかしながら、同時に投与しない場合、それらを十分に近い時間で投与して、所望の治療または予防効果を提供するべきである。それぞれの療法を、任意の適切な形態で、および任意の好適な経路により、別々に対象に投与することができる。様々な実施形態において、療法（例えば、予防剤または治療剤）を、５分未満空けて、１５分未満空けて、３０分未満空けて、１時間未満空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて、２４時間空けて、４８時間空けて、７２時間空けて、または１週間空けて対象に投与する。他の実施形態において、２以上の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、同じ患者訪問のうちに投与する。
併用療法の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物中で対象に投与することができる。あるいは、併用療法の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物中で対象に同時に投与することができる。予防剤または治療剤は、同じか、または異なる投与経路により対象に投与されてもよい。組合せ療法の予防剤または治療剤を、同じ医薬組成物中で対象に投与することができる。あるいは、組合せ療法の予防剤または治療剤を、別々の医薬組成物中、対象に同時に投与することができる。予防剤または治療剤を、同じか、または異なる投与経路により対象に投与してもよい。
抗体の生成
ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＰ−カドヘリンタンパク質に関する発現構築物の生成
ヒト、マウスおよびラットＰ−カドヘリン細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉｐｒｏｔデータベース由来のアミノ酸配列に基づいて遺伝子合成した（以下の表２を参照）。カニクイザルＰ−カドヘリンＥＣＤ ｃＤＮＡ鋳型は、各種カニクイザル組織から単離したｍＲＮＡを使用して生成したアミノ酸配列情報に基づいて遺伝子合成した。合成されたＤＮＡ断片は全て、精製を可能にするために、Ｃ−末端ヘキサ−ヒスチジンタグ（配列番号１３０）を有する適切な発現ベクターへクローニングした。
Ｐ−カドヘリンバキュロウイルス生成
組換えＰ−カドヘリンＥＣＤタンパク質を発現するバキュロウイルスは、製造業者のプロトコールに従って、同時トランスフェクション／プラーク精製方法（O’Reilly et. al., 1992）またはＢａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ発現系法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかにより生成された。トランスフェクトした昆虫細胞から生成されたウイルスを、標準的な低ＭＯＩ感染法を使用して増幅させた。
組換えＰ−カドヘリンタンパク質の発現
無血清培地中で成長中のＴｈ５細胞の懸濁培養物（所有権、インハウスメイドレシピ）を、１．５ｅ６個の細胞／ｍｌの密度で播種して、１０ｐｆｕ／ｍｌのＭＯＩまたは容量３％のいずれかで、組換えＰ−カドヘリンバキュロウイルスで同調的に感染させた。Ｐ−カドヘリンバキュロウイルス培養調製物を、２Ｌのガラス製ＥｒｌｅｎｍｙｒフラスコまたはＷａｖｅバイオリアクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれか中で増殖させた。２Ｌのフラスコ中に発現させたＰ−カドヘリン調製物を無血清培地中で、２７℃で１２０ｒｐｍにて振とうした。Ｗａｖｅバイオリアクター中で発現させた調製物を２８℃で７．５°の角度で２５ｒｐｍにて振とうした。フラスコまたはＷａｖｅバイオリアクターのいずれかから収集した上清を、１８００ｒｐｍで１０分間、４℃で培養物を遠心分離することによって、感染の２日後に収集した。続いて、上清を０．２μＭのフィルターユニットで濾過した。１Ｌを上回る発現に関しては、ＫｖｉｃｋＳｔａｒｔ限外濾過フラットシートカセットとともにＡＫＴＡクロスフロー系（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞培養物上清を２〜１０倍に濃縮した。濃縮材料を０．２μＭのフィルターユニットで濾過した。
ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットｐＣＡＤ ＥＣＤタンパク質の精製
ｐＣＡＤ細胞外ドメインタンパク質でタグ付けされた組換えヘキサ−ヒスチジン（配列番号１３０）（例えば、ヒトｐＣＡＤ−６ｘＨｉｓ（配列番号１３０として開示される「６ｘＨｉｓ」）、カニクイザル１ ｐＣＡＤ−６ｘＨｉｓ（配列番号１３０として開示される「６ｘＨｉｓ」）、カニクイザル２ ｐＣＡＤ−６ｘＨｉｓ（配列番号１３０として開示される「６ｘＨｉｓ」）、マウスｐＣＡＤ−６ｘＨｉｓ（配列番号１３０として開示される「６ｘＨｉｓ」）、ラットｐＣＡＤ−６ｘＨｉｓ（配列番号１３０として開示される「６ｘＨｉｓ」））を細胞培養物上清から精製した。清澄化された上清を、２５ｍＭビストリスプロパン、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．２で平衡化させたニッケルセファロース樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラム上で固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に通過させた。上清を５〜８ｍＬ／分の流速でＩＭＡＣカラムに適用させた。２５ｍＭビストリスプロパン、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．２によるベースライン洗浄後に、５倍カラム容量に関して洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に切替えた。プールしたタンパク質は、必要であれば、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａの１５ｍＬの遠心濃縮器を使用して、１０ｋＤまたは３０ｋＤの公称分子量カットオフで濃縮した。次に、プールタンパク質は、２０ｍＭトリス、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５中で予め平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用したゲル濾過により精製した。関係分画をプールして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ）によりタンパク質濃度を決定した。
マウスの免疫化およびハイブリドーマの生成
精製されたヒトＰ−カドヘリンＥＣＤを、フロイント完全アジュバントで１：１に希釈した後、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇｎ（ｂｃｌ−２）２２ｗｅｈｉ株）を免疫した。Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｉｔｅｓ（ＲＩＭＭＳ）（McIntyre GD. Hybridoma 1997）をコールする手順を使用して、マウスを免疫した。簡潔に述べると、マウスに、末梢リンパ節（ＰＬＮ）に近い８つの特定部位で、抗原１〜３μｇを注射した。この手順を、１２日間にわたって８回反復した。１２日目に、試験血液を収集し、血清抗体力価をＥＬＩＳＡにより分析した。プールしたＰＬＮを、１５日目に高力価マウスから除去した。リンパ球を収集するために、ＰＬＮをプレーンＤＭＥＭで２回洗浄した後、０．２２ミクロンのスクリーン（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５２３５０）を通す濾過により分離させた。得られたリンパ球を、さらに２回洗浄した後、Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地（ＢＴＸｐｒｅｓｓ Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ（登録商標）電気穿孔培地ｃａｔ＃４７００１）中で融合した。Ｆ０ミエローマ細胞を、リンパ球対Ｆ０細胞１の比でリンパ球と混合した。細胞混合物を遠心分離した後、Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ培地７ｍｌ中に懸濁させて、続いて９ｍｌの電気融合チャンバー（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｃｏａｘｉａｌ Ｃｈａｍｂｅｒ ９ＭＬ Ｐａｒｔ ＃４７００２０）に添加した。Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＣＥＥＦ−５０Ｂ Ｈｙｂｒｉｍｕｎｅ／Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ系を使用して、製造業者の指示書に従って、電気融合を実施した。融合細胞をチャンバー中で５分回収させて、ＨＡＴを伴わない融合培地（ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１×ＮＥＡＡ、０．５×ＨＦＣＳ）中で１／１０に希釈して、１時間、３７℃に置いた。４×ＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１×ＮＥＡＡ、４×ＨＡＴ、０．５×ＨＦＣＳ）を添加して、１×溶液を作製して、密度を１．６７×１０４個の細胞／ｍｌに調整した。次いで、細胞を、６０μＬ／ウェルで３８４ウェルプレート中に平板培養した。
Ｐ−カドヘリンに対する抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニング
融合の１０日後に、ハイブリドーマプレートを、Ｐ−カドヘリン特異的抗体の存在についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡスクリーンのため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ＃４６４７１８）を、ヒトＰ−カドヘリン（ＰＢＳ中で１５ｎｇ／ウェルに希釈）５０μＬでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。残存タンパク質を吸引し、ウェルをＰＢＳ中の１％ＢＳＡで遮断した。室温で３０分のインキュベーション後に、ウェルをＰＢＳ＋０．０５％ツイーン（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。ハイブリドーマ上清１５μＬをＥＬＩＳＡプレートに移した。ＰＬＮ除去の時点で取ったマウス血清１５μＬを、ＰＢＳ中で１：１０００に希釈し、陽性対照として添加した。二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１１５−０３５−０７１）、ＰＢＳ中で１：５０００に希釈）５０μＬを、ＥＬＩＳＡプレート上の全ウェルに添加した。室温で１時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで８回洗浄した。ＴＭＢ（ＫＰＬ ＃５０−７６−０５）２５μＬを添加して、室温で３０分のインキュベーション後、プレートを６０５ｎｍの吸光度で読み取った。陽性ウェルからの細胞を、ＨＴ培地（ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１×ＮＥＡＡ、１×ＨＴ、０．５×ＨＦＣＳ）中で２４ウェルプレートで増殖させた。
抗体の精製
抗体を含有する上清を、プロテインＧ（Ｕｐｓｔａｔｅ ＃１６−２６６（ビルリカ、ＭＡ））を使用して精製した。上清を充填する前に、樹脂を１０倍カラム容量のＰＢＳで平衡化させた。試料の結合後、カラムを１０倍カラム容量のＰＢＳで洗浄し、抗体を５倍カラム容量の０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０で溶出させた。カラム分画を、１／１０倍容量のトリスＨＣｌ、ｐＨ９．０ですぐに中和した。分画のＯＤ２８０を測定して、陽性分画をプールし、ＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して一晩透析した。
抗Ｐ−カドヘリン抗体のヒト化および親和性成熟
ハイブリドーマ由来の抗Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨおよびＶＬ配列を、下記の通りにヒト化および親和性成熟させた。
ヒト化配列の作成
ホモ・サピエンス（homo sapiens）のためのコドン最適化を含む、ヒト化ＶＬおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、レーゲンスブルク、ドイツ）に注文した。ＶＬおよびＶＨドメインをコードする配列を、哺乳動物細胞における分泌に適した発現ベクター中にＧｅｎｅＡｒｔ由来ベクターからの切断および貼付によりサブクローニングした。重鎖および軽鎖を個々の発現ベクター中にクローニングして、同時トランスフェクションを可能にした。発現ベクターのエレメントとしては、プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を容易にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソーム複製および原核生物中での複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当該技術分野で公知の他のもの）ならびに選択を可能にするためのエレメント（アンピシリン耐性遺伝子およびゼオシンマーカー）が挙げられる。
ヒト化抗体の発現および精製
ＳＶ４０ラージＴ抗原を構成的に発現するヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３−Ｔ ＡＴＣＣ１１２６８）は、ヒト化および／または最適化されたＩｇＧタンパク質の一過性発現のための好ましい宿主細胞系のうちの１つである。トランスフェクションを、トランスフェクション試薬としてＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ２５，０００線状、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、Ｃａｔ番号２３９６６）を使用して実施する。細胞培養等級の水９００ｍｌにＰＥＩ １ｇを室温（ＲＴ）で注意深く溶解することによりＰＥＩストック溶液を調製する。ＰＥＩの溶解を容易にするために、溶液を、ＨＣｌの添加によりｐＨ３〜５へ酸性化した後、ＮａＯＨを用いて最終ｐＨ７．０５となるように中和した。最終的に、容量を１Ｌに調整し、溶液を０．２２μｍフィルターを通して濾過し、アリコートし、さらなる使用まで−８０℃で凍結した。一度解凍したら、アリコートを−２０℃で３回まで再凍結してもよいが、−２０℃では長期間保管すべきではない。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、細胞のトランフェクションおよび増殖のための無血清培養培地、および生成／供給培地としてのＥｘＣｅｌｌ ＶＰＲＯ無血清培養培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、Ｃａｔ番号２４５６１Ｃ）を使用して培養する。一過的トランスフェクションのために調製された細胞を懸濁培養で培養する。小規模（＜５Ｌ）トランスフェクションのためには、細胞を、５％ＣＯ２で加湿されたインキュベーター中、オービタルシェーカー（１００〜１２０ｒｐｍ）上のＣｏｒｎｉｎｇ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、チュークスベリ、ＭＡ）中で成長させる（種フラスコ）。種培養物中の細胞を、指数増殖期（５×１０５〜３×１０６個／ｍＬの細胞密度）に維持すべきであり、トランスフェクションのためには９０％を超える生存率を示すべきである。この範囲の外側の細胞密度は、希釈後に遅滞期またはトランスフェクション効率の低下をもたらす。小規模（＜５Ｌ）のトランスフェクションのために、細胞のアリコートを種培養物から取り、Ｎｏｖａｒｔｉｓ無血清培養培地を使用して最終容量の３６％中、１．４×１０６の細胞／ｍＬに調整する。最終培養容量の７％中にＤＮＡを１ｍｇ／Ｌ（最終容量）に希釈した後穏やかに混合することにより、ＤＮＡ溶液（溶液１：１Ｌのトランスフェクションのために０．５ｍｇの重鎖および０．５ｍｇの軽鎖発現プラスミド）を調製する。細菌汚染を防止するために、この溶液を０．２２μｍフィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）を使用して濾過する。次いで、３ｍｇ／Ｌ（最終容量）のＰＥＩ溶液も、最終培養容量の７％中に希釈し、穏やかに混合した（溶液２）。両溶液を、室温（ＲＴ）で５〜１０分間インキュベートする。その後、溶液２を、穏やかに混合しながら溶液１に添加し、室温でさらに５〜１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を細胞に添加し、細胞の培養を４〜６時間継続する。最終的に、残りの５０％の全生成容量を、ＥｘＣｅｌｌ（登録商標）ＶＰＲＯ無血清培養培地の添加により達成する。細胞培養を、トランスフェクション後８日間継続する。培養物を４℃で２０分間、４５００ｒｐｍでの遠心分離により収集する（Ｈｅｒａｅｕｓ（登録商標）、Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３ Ｓ−Ｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、ＩＬ）。回収された細胞上清を、ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルター（０．２２μｍ）を通して滅菌濾過し、さらなるプロセッシングまで４℃で保管する。
新鮮に消毒された（０．２５Ｍ ＮａＯＨ）ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅ、５ｍｌカラムを使用して、冷却キャビネット中、４℃で「ＡＫＴＡ １００ ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ａｉｒ」クロマトグラフィーシステム上で精製を実施した。カラムは、５ＣＶのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、ＣＡ）で平衡化した後、滅菌濾過された上清（２Ｌ）を４．０ｍｌ／分で充填した。カラムを８ＣＶのＰＢＳで洗浄して、未結合の試料を溶出させて、５ＣＶのＰＢＳで再度洗浄した。抗体を、５ＣＶの５０ｍＭクエン酸、７０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ３．２で溶出させた。溶出液を３ｍｌ分画で収集して、分画をプールし、１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ１０でｐＨ７に調整した。プールをプールし、滅菌濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、０．２２μｍ）し、ＯＤ２８０ｎｍを、Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ）中で測定し、タンパク質濃度を配列データに基づいて算出した。溶出液を、凝集（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）および純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＬＡＬおよびＭＳ）について試験した。２回目の精製ステップのために、必要に応じて、１回目の精製からのプールを、新鮮に消毒された（０．５Ｍ ＮａＯＨ）ＳＰＸ（Ｈｉ Ｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００グレード１２０ｍＬ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））中に充填した。カラムをＰＢＳで平衡化させて、１ｍｌ／分でＰＢＳ緩衝液を使用してランを行い、溶出液を１．２ｍｌ分画中に収集し、１回目の精製ステップについて記載されたように分析した。
Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージライブラリーパンニング由来の抗体
ヒトＰ−カドヘリンを認識する抗体の選択のために、多重パンニング戦略を利用した。ヒトＰ−カドヘリンタンパク質に対する治療用抗体は、抗体バリアントタンパク質の供給源として、商業的に入手可能なファージディスプレイライブラリー、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリーを使用して、Ｐ−カドヘリンに結合するクローンの選択により作成した。このファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Knappik et al., 2000, J Mol Biol 296: 57-86）に基づくものであり、ファージ表面上にＦａｂを展示するためにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を使用する（国際公開第０１／０５９５０号パンフレット）。
抗Ｐ−カドヘリン抗体の単離に関して、固相、液相、および細胞ベースのパンニング戦略を用いた。
組換えＰ−カドヘリン上での固相パンニング
抗原選択プロセスに先立って、コーティングチェックＥＬＩＳＡを実施して、抗原に関して最適コーティング濃度を決定した。Ｈｉｓタグを有する組換えＰ−カドヘリンタンパク質は、受動的吸着により、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ）上にコーティングすることにより、固相パンニングアプローチで使用された。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ）の適切な数（サブライブラリープールの数に応じる）のウェルを、４℃で一晩、１２５ｎＭの抗原でコーティングした。コーティングされたウェルを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／５％粉乳／５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／１ｍＭ ＣａＣｌ２で遮断した。各パンニングに関して、ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体約５０μＬを、室温（ＲＴ）で２時間溶液中で遮断した。ブロッキング手順後、予めブロックしたファージミックスを、抗原でコーティングしてブロックしたウェルそれぞれに添加して、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）振とう機上で室温で２時間（ｈ）インキュベートした。その後、非特異的な結合ファージを、いくつかの洗浄ステップによりＰＢＳで洗い流した。特異的に結合されるファージの溶出に関して、２５ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を室温で１０分（ｍｉｎ）間添加した。ＤＴＴ溶出液を、Ｅ．コリ（E. coli）（大腸菌（Escherichia coli））ＴＧ−Ｆ＋細胞の感染に使用した。感染後、細菌をＬＢ（溶原性ブロス）／Ｃａｍ（クロラムフェニコール）寒天プレート上で平板培養して、３０℃で一晩インキュベートした。コロニーをプレートからこすり落として、ファージレスキュー、選択クローンのポリクローナル増幅およびファージ生産に使用した。精製ファージを用いて、次のパンニングラウンドを開始した。
２回目および３回目のラウンドの固相パンニングを、よりストリンジェントな洗浄条件以外は１回目のラウンドのプロトコールに従って実施した。
選択Ｆａｂ断片のサブクローニングおよび微量発現（Microexpression）
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を促進するために、選択したＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージのＦａｂコード挿入物を、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０ディスプレイベクターから、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１＿ＦＨへサブクローニングした。
初期スクリーニングおよび特性評価のために、個々のＦａｂを発現する大腸菌（E. coli）クローンの一晩の培養物を、０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．８ｍＭ ＥＤＴＡおよび４Ｕ／μｌのベンゾナーゼを使用して溶解した。Ｆａｂ含有大腸菌（E. coli）溶解物を、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳスクリーニングのために使用した。
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、単一Ｆａｂクローンを、標的抗原への結合に関してパニングアウトプットから同定した。Ｆａｂは、Ｆａｂ含有粗製Ｅ．コリ（E. coli）溶解産物を使用して試験した。
調製された大腸菌（E. coli）溶解物におけるＦａｂ発現の検証のために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中で１：１０００に希釈したＦｄ断片特異的ヒツジ抗ヒトＩｇＧでコーティングした。ＰＢＳ中の５％スキムミルク粉末でプレートを遮断した後、Ｆａｂ含有大腸菌（E.coli）溶解物を添加した。Ｆａｂの結合を、Ａｔｔｏｐｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ＃１１６８１９８２００１）を使用してアルカリホスファターゼにコンジュゲートされたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００希釈）により検出した。５３５ｎｍでの蛍光放出を、４３０ｎｍで励起して記録した。
Ｐ−カドヘリン抗原結合性Ｆａｂ断片の同定のために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中で受動的吸着により２５ｎＭのヒトＰ−カドヘリン抗原でコーティングした。ＰＢＳ中の５％スキムミルク粉末でプレートを遮断した後、Ｆａｂ含有大腸菌（E. coli）溶解物を添加した。Ｆａｂの結合を、Ａｔｔｏｐｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、カタログ＃１１６８１９８２００１）を使用して、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００に希釈）により検出した。５３５ｎｍでの蛍光放出を、４３０ｎｍでの励起とともに記録した。
ＦＡＣＳスクリーニング（蛍光標識細胞分取）
ＦＡＣＳスクリーニングでは、細胞表面発現抗原に対する単一Ｆａｂクローン結合は、パニングアウトプットから同定される。Ｆａｂは、Ｆａｂ含有粗製Ｅ．コリ（E. coli）溶解産物を使用して、細胞結合に関して試験される。
細胞懸濁液５０μｌを、新鮮な９６ウェルプレートへ移して（１×１０５個の細胞／ウェルをもたらす）、Ｆａｂ含有細菌抽出物５０μｌと混合した。
次に、細胞−抗体懸濁液を氷上で１時間振とう機上でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠沈させて、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。各洗浄ステップ後、細胞を遠心分離して、慎重に再懸濁させた。
二次検出抗体（ＰＥとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｄｉａｎｏｖａ）を添加して、試料を氷上でインキュベートして、次に、Ｆａｂインキュベーションに従って洗浄した。蛍光強度は、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）機器で決定した。
ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ断片の発現および精製
Ｆａｂ断片の発現は、Ｅ．コリ（E. coli）ＴＧ１Ｆ−細胞で実施した。培養物を３０℃で１８時間振とうさせた。細胞を収集して、崩壊させた。Ｈｉｓ６でタグ付けしたＦａｂ断片（配列番号１３０として開示される「Ｈｉｓ６」）をＩＭＡＣおよびゲル濾過によって単離して、タンパク質濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ分光光度法により決定した。
Ｆａｂ調製物のアイデンティティーおよび純度は、質量分析（ＭＳ）により自然状態で決定された。
交差反応分析
精製したＦａｂは、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスＰ−カドヘリンＥＣＤタンパク質への結合に関して、ＥＬＩＳＡで試験した。この目的で、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ）３８４ウェルプレートを、１０μｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳ中４℃で一晩、抗原でコーティングした。Ｆａｂの結合を、Ａｔｔｏｐｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、カタログ＃１１６８１９８２００１）を使用して、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００に希釈）により検出した。５３５ｎｍでの蛍光放出を、４３０ｎｍで励起して記録した。
ＩｇＧへの変換およびＩｇＧ発現
ＨＥＫ細胞内の完全長ＩｇＧを発現するために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片を、ヒトＩｇＧ１に関して、Ｆａｂ発現ベクターから適切なｐＭｏｒｐｈ（登録商標）＿ｈＩｇベクターへサブクローニングした。細胞培養物上清を、トランスフェクションの１０日後に収集した。滅菌濾過後、溶液を、液体ハンドリングステーションを使用してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに付した。緩衝液交換は、１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ実施され、試料は滅菌濾過された（孔サイズ０．２μｍ）。タンパク質濃度をＵＶ分光光度法により２８０ｎｍで決定して、ＩｇＧの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、変性還元性条件下で分析した。
バイオアッセイ
上述するパニングプロセス後に得られる抗Ｐ−カドヘリン抗体を、以下で例示されるアッセイで評価した：
ＨＣＣ細胞１９５４細胞内部移行アッセイ
抗Ｐ−カドヘリン抗体の、標的媒介性細胞内部移行を受ける能力を決定するために、顕微鏡ベースの内部移行アッセイを、Ｐ−カドヘリン発現ＨＣＣ１９５４腫瘍細胞系を使用して確立させた。
細胞を完全成長培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ）中に再懸濁して、平底顕微鏡９６ウェルアッセイプレート（ＶｉｅｗＰｌａｔｅ（登録商標）−９６ Ｆ ＴＣ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、＃６００５２２５）へ、１００μｌ中で５×１０３個の細胞／ウェルの細胞密度で播種して、３７℃および５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。
２日後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体（ＩｇＧ）をＰＢＳ中で所望の濃度へ希釈した。抗体溶液１００μｌを播種細胞へ添加して、２時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、１×ＣｅｌｌＦＩＸ試薬（ＣｅｌｌＦＩＸ（商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３４０１８１）で固定して、再びＰＢＳで２回洗浄して、０．１％トリトンＸ−１００で透過性にした。続いて、細胞を１×Ｏｄｙｓｓｅｙ緩衝液（Ｌｉ−ｃｏｒ、Ｎｏ．９２７−４００００）で１時間ブロックした。吸引後、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ビスベンズイミドＨ３３３４２三酸化物、＃Ｂ２２６１、Ｓｉｇｍａ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ−１１０１３）で、細胞を１時間染色した。染色後、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析した。半最大内部局在化濃度（ＩＣ５０値）を評価するために、４倍希釈ステップで、１０ｎＭ〜２．４ｐＭの範囲を網羅するＩｇＧ滴定を実施した。
翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位の除去
上述する内部移行アッセイで同定され、かつＰ−カドヘリン発現腫瘍細胞ＨＣＣ１９５４へ効率的に内部局在化することがわかっている抗体の１つであるＮＯＶ１６９が、ＨＣＤＲ１において単一Ｎ３１Ｓ ＰＴＭ部位を含有することを見出した。脱アミノ化を防止するために、この部位を、単一点Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発によりＮ３１Ｑ部位へ変換して、抗体ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑをもたらした。親ＮＯＶ１６９と比較したＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑによる組換えヒトＰ−カドヘリンへの等価性結合強度は、ｆｏｒｔｅＢＩＯ ＫＤ決定によって確認された。
抗体の概要
表１は、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージライブラリーから単離される抗Ｐ−カドヘリン抗体およびマウスハイブリドーマに由来するヒト化抗Ｐ−カドヘリン抗体に関する関連性ある配列情報について記載する。
ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂとのその複合体のＸ線結晶学的構造
ヒトＰ−カドヘリンの三次元構造は、これまで未知であった。ヒトＰ−カドヘリンＥＣＤ（細胞外ドメイン）断片（最初の２つのＮ−末端カドヘリン反復ドメイン、またはＥＣ１＿ＥＣ２、アミノ酸１０８〜３２４、配列番号２、表１）ならびにＮＯＶ１６９Ｎ３１ＱのＦａｂ断片（表１）とのその複合体の結晶構造を決定した。以下に詳述するように、ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２を発現させて、リフォールディングして、精製して、結晶化させた。さらに、精製ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２を、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂと混合して、複合体を形成させて、それも同様に、続いて精製および結晶化した。次に、タンパク質結晶学を用いて、遊離状態でのヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２およびエピトープを規定するためにＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂに結合したヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２に関する原子分解能データを作成した。
結晶学用のヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂのタンパク質生成
結晶学用に生成したヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂのアミノ酸配列を表３に示す。ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２の構築物は、組換え発現ベクター由来のＮ末端残基（小文字で示される、配列番号１２７）と一緒に、ヒトＰ−カドヘリン（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ２２２２３、配列番号１２６）の残基１０８〜３２４（下線を付した）を含んでいた。ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂに関しては、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、Ｃ末端識別／精製タグ（小文字で示される、それぞれ配列番号１２８および配列番号１２９）と一緒に示す。
Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１３０）、続いてＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断部位を有するヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２を、ｐＥＴ２８ベクターを有する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、クローニングして、発現させた。１８℃でのＩＰＴＧを用いた一晩の誘導後に、細胞（６７ｇ）を収集して、５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＴＣＥＰ、およびＥＤＴＡフリーｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）１４タブレットの７００ｍｌ中でフレンチプレスを用いて溶解させた。遠心分離（ＳＳ３４ローターを用いて、１８，０００ｒｐｍで３５分）後に、上清を滅菌濾過して（０．４５μｍ）、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）で予め平衡化したＣｒｕｄｅ ＦＦ金属キレート化クロマトグラフィーカラム（５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。カラムは、まず平衡化緩衝液で、次に２５ｍＬイミダゾールを含む緩衝液Ａで洗浄して、続いて２５ｍＭ〜５００ｍＭイミダゾール勾配を用いて溶出させた。次に、溶出タンパク質（３６ｍｇ）は、５０ｍＭトリスｐＨ８．０に対する一晩の透析中に、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（１ｍｇｍ当たり１０μｇ）を使用して切断した。濾過（０．２２μｍ）後に、試料を、５０ｍＭトリスｐＨ８．０で予め平衡化したＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填して、０．０Ｍ〜１．０Ｍ ＮａＣｌ勾配を用いて溶出させた。Ｐ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２（２５．６ｍｇ）を含有する主要ピークを収集して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣで分析した。続いて分画プールを、以前と同様に、５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールで予め平衡化したＣｒｕｄｅ ＦＦ金属キレート化クロマトグラフィーカラム（５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に再充填した。Ｐ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２タンパク質は、フロースルー中で回収されて、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳによって分析した。ＬＣ−ＭＳ分析により、予測分子量（２３，８３７Ｄａ）が示された。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂを、大腸菌（E. coli）において１リットル規模で発現させた。まず、Ｆａｂ断片をコードするプラスミドを、化学的にコンピテントなＴＧ１Ｆ大腸菌（E. coli）細胞へ形質転換した。３７℃でのＬＢ／寒天／１％グルコース／３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールプレート上での細菌の一晩の成長後、１つのコロニーを使用して、６ｍｌのプレ培養物（２×ＹＴ／１．０％グルコース／３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）を接種した。２２０ｒｐｍで振とうしながら、培養物を３０℃で一晩インキュベートした。翌日、プレ培養物を、発現培養物（２×ＹＴ／１．０％グルコース／３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）１リットルに移した。ＯＤ６００ｎｍ０．６〜０．８に達するまで、２２０ｒｐｍで振とうしながら、発現培養物を３０℃でインキュベートした。発現は、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭになるように添加することにより誘導させた。発現は、２５℃および２２０ｒｐｍで一晩行った。翌日、細胞をペレット化して、−８０℃で凍結させた。
Ｆａｂ断片を、ＡＥＫＴＡ発現系（ソフトウェア、Ｕｎｉｃｏｍ＿ｖ５．１１）で自動プロトコールを使用して２ステップで精製した。まず、細菌ペレットを、溶解緩衝液（２００ｍＭリン酸Ｎａ ｐＨ７．４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％リゾチーム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤１タブレット／５０ｍｌ）４０ｍｌ中に懸濁させて、振とう下、室温で１時間インキュベートした。細胞片は、１６，０００ｇで３０分間の遠心分離によって除去した。Ｆａｂを含有する上清を、０．２μＭシリンジフィルター（Ｐａｌｌ、＃ＰＮ４５２５）に通して、ランニング緩衝液（２０ｍＭリン酸Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で予め平衡化した系上に充填した。第１の精製ステップは、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にわたって実施した。カラムをランニング緩衝液で洗浄して、Ｈｉｓ６タグ付けＦａｂ断片（配列番号１３０として開示される「Ｈｉｓ６」）を、溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出させた。ピーク分画は、ゲル濾過カラム（ＨｉＬｏａｄ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に自動的に適用させた。精製Ｆａｂ断片をＰＢＳ中で溶出させた。Ｆａｂ断片の濃度は、ＵＶ２８０ｎｍ測定により、およびアミノ酸配列から推定される消衰係数を使用して、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒ方程式を適用することにより決定した。
ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２の結晶化および構造決定
ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＮａＣｌに対して透析して、１５ｍｇ／ｍｌへ濃縮して、２０℃で結晶化に関してスクリーニングした。
結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散により、９６ウェルＳＤ２プレート中で成長させた。詳細には、タンパク質０．２μｌを、リザーバ溶液０．２μｌと混合して、ドロップを、２０℃で同じリザーバ溶液８０μｌに対して平衡化させた。Ｘ線回折分析に適した結晶は、０．０８５ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３．６５５Ｍ ＮａＣｌ、１５％グリセロールで作製されるリザーバ溶液を用いて得られた。
データ収集のために、ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２結晶の１つを、低温ループに載せて、液体窒素中で直接瞬間冷却した。Ｐｉｌａｔｕｓピクセル検出器および０．９９９９９Åの波長のＸ線を用いて、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｐａｕｌ Ｓｃｈｅｒｒｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、スイス）のビームラインＸ１０ＳＡ（ＰＸ−ＩＩ）で、回折データを収集した。結晶から検出器への距離２００ｍｍで、それぞれ０．２５ｄｅｇの振動の総計で７２０枚の画像を記録した。データを加工処理して、ＡＰＲＶ−ＩＮＤＥＸで実行されるように（Kroemer, Dreyer, Wendt (2004) Acta Crystallogr. Sect. D: Biol. Crystallogr. 60:1679-1682）、ＸＤＳを使用して１．４０Åの解像度で縮尺した（Kabsch (1993) J. Appl. Crystallogr. 26:795-800）。結晶は、セル寸法ａ＝１２０．８９Å、ｂ＝７６．５２Å、ｃ＝４６．２１Å、アルファ＝９０°、ベータ＝１０７．７９°、ガンマ＝９０°を有する空間群Ｃ２で存在した。ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２構造は、プログラムＰｈａｓｅｒ（McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674）およびＰＤＢエントリー１Ｌ３Ｗ（アフリカツメガエル（X. Laevis）Ｃ−カドヘリン、３．０８Å、５５％配列同一性）を使用して分子置換により分析した。最終的なモデルは、ＣＯＯＴで構築し（Emsley et al., (2010) Acta Crystallogr. Sect. D: Biol. Crystallogr. 66:486-501）、それぞれ結合長および結合角に関して０．０１０Åおよび１．１３°のｒｍｓｄで、それぞれ１９．８％および２１．３％のＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅｅ値へ、Ｂｒｕｓｔｅｒ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ、ＬＴＤ）を用いて改善させた。
ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２構造
ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２（アミノ酸残基１０８〜３２２）の結晶構造を図１に示す。両方のカドヘリンドメインは、明確に規定された電子密度を有し、予想される全体的なフォールドを示した。３つのカルシウムイオンは、ドメイン界面で観察された。
カドヘリンのＥＣＤドメインは、細胞間接着を制御する接着結合の細胞外構築物において役割を果たすと提唱されている。接合部アッセンブリーは、カドヘリンクラスターの外部ドメイン間のトランスおよびシス同型相互作用の両方を含む（Boggon et al., (2002) Science 296:1308-1313、Harrison et al., (2011) Structure 19:244-256）。トランス同型相互作用は、逆の配向性で２つのカドヘリン分子のＥＣ１ドメイン間にＮ末端Ｔｒｐ交換（「鎖交換二量体」）を含む（２つの異なるセルで提示）。対照的に、シス同型相互作用は、同じ配向性で、ある分子のＮ末端細胞外カドヘリン（ＥＣ１）ドメインおよび別の分子の第２の（ＥＣ２）ドメインを含む。トランス相互作用は、シス相互作用よりもはるかに強力であると考えられる。トランス相互作用が、細胞間接着の分子基盤を形成する一方で、シス相互作用は、分子クラスター形成を介して細胞接着を促進すると考えられる。
ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２断片の結晶構造により、Ｔｒｐ交換を介したトランス同型相互作用に関与するＮ末端セグメントは、結晶中ではかかる相互作用には加担せず、それ自体のドメインに結合されることが示された。さらに、結晶充填の分析により、対称性関連Ｐ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２分子の１つが、他のカドヘリンに関してすでに報告されているものに非常に類似したシス同型相互作用を行っていることが明らかとなり、結晶化は、この場合、シス同型相互作用により駆動されることを示した。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂ複合体の結晶化および構造決定
ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２とＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂとの複合体は、１．５：１．０のモル比（ＨＰＬＣにより測定される濃度）で、精製ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂを混合することと、ＥＤＴＡフリーｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）の２タブレットともに１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィー上で複合体を精製することとにより調製した。ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳで分析した。ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２／ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂ複合体を含有する分画を、約１２ｍｇ／ｍｌに濃縮して、最終濃度５ｍＭになるようにＣａＣｌ２を添加して、試料を２０℃での結晶化に関してスクリーニングした。
結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散により、９６ウェルＳＤ２プレート中で成長させた。詳細には、タンパク質０．２μｌを、リザーバ溶液０．２μｌと混合して、ドロップを、２０℃で同じリザーバ溶液８０μｌに対して平衡化させた。Ｘ線回折分析に適した結晶は、０．２Ｍ酢酸カルシウム、１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ８，０００、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５で作製されるリザーバ溶液を用いて得られた。
データ収集の前に、ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２／ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂ結晶の１つを、２０％ＰＥＧ ８，０００、３０％グリセロールを有するリザーバ溶液の１：１ミックスに手短に移して、液体窒素中で直接瞬間冷却した。
Ｐｉｌａｔｕｓピクセル検出器および０．９９９９９Åの波長のＸ線を用いて、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｐａｕｌ Ｓｃｈｅｒｒｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、スイス）のビームラインＸ１０ＳＡ（ＰＸ−ＩＩ）で、回折データを収集した。結晶から検出器への距離３４０ｍｍで、それぞれ０．２５ｄｅｇの振動の総計で７２０枚の画像を記録した。データを加工処理して、ＡＰＲＶ−ＩＮＤＥＸで実行されるように（Kroemer, Dreyer, Wendt (2004) Acta Crystallogr. Sect. D: Biol. Crystallogr. 60:1679-1682）、ＸＤＳを使用して２．１０Åの解像度で縮尺した（Kabsch (1993) J. Appl. Crystallogr. 26:795-800）。結晶は、セル寸法ａ＝１７２．６９Å、ｂ＝７７．７９Å、ｃ＝１３３．４１Å、アルファ＝９０°、ベータ＝９０．０°、ガンマ＝９０°を有する空間群Ｐ２１２１２で存在した。ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２／ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂ複合体構造は、Ｐｈａｓｅｒ（McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674）を使用した分子置換により分析した。最終的なモデルがＣＯＯＴで構築され（Emsley et al., (2010) Acta Crystallogr. Sect. D: Biol. Crystallogr. 66:486-501）、それぞれ結合長および結合角に関して０．０１０Åおよび１．１８°のｒｍｓｄで、それぞれ１９．２％および２２．１％のＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅｅ値へ、Ｂｒｕｓｔｅｒ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ、ＬＴＤ）を用いて改良した。ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂにおける任意の原子の４．０Å内に原子を含有するヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２の残基は、ＣＣＰ４プログラム一式（Collaborative Computing Project, Number 4 (1994) Acta Crystallogr. Sect. D: Biol. Crystallogr. 50:760-763）のプログラムＮｃｏｎｔにより同定され、表４および表５に列挙した。ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ抗体の結合時に溶媒に接近しにくくなるヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２の残基は、ＣＣＰ４プログラム一式のプログラムＡＲＥＡＩＭＯＬにより同定した。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑに関するＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２エピトープ
Ｐ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２／ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂ複合体の結晶構造を使用して、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑに関するＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２エピトープを同定した。Ｘ線分析により、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑが、ヒトＰ−カドヘリンのＥＣ１ドメイン（Ｎ末端カドヘリン反復ドメイン）に結合することが示される（図２）。結晶の非対称性ユニットにおいてＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂ−ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２複合体の２つのコピーが存在する（非対称性ユニットは、結晶学的対称性オペレーターを適用することにより、結晶全体を再生するのに必要とされる構造情報全てを含有する）。コピーはともに、結晶充填に起因した小さな変動を除いて、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂと接触しているほぼ同一残基を共有する。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ ＦａｂによるヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２上の相互作用表面は、Ｐ−カドヘリンのＥＣ１ドメイン内に完全に含まれ、残基１２３〜残基１２７、および残基１５１〜残基１７７を含む２つの不連続（すなわち、非隣接）配列により形成される（図３）。それらの中でも、残基１２４および残基１２４、ならびに残基１５１〜残基１７２は、表４および表５に詳述するように、また図３に示すように、４．０Åよりも短い直接的な分子間接触（非水素原子間）に寄与している。これらの残基は、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂにより認識される三次元表面を形成する（図４）。
ヒトＰ−カドヘリンの他の細胞外カドヘリン反復ドメインとは対照的に、ＥＣ１ドメインは、任意の公知のＮ連結またはＯ連結されるグリコシル化部位を保有しない。したがって、Ｐ−カドヘリンへのＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ結合は、グリコシル化と無関係である。同様に、ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１ドメインのアミノ酸配列が、カニクイザル（Macaca fascicularis）Ｐ−カドヘリンにおいて完全に保存されることも注目に値する（図５）。したがって、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑにより認識されるＰ−カドヘリンエピトープは、毒物学的研究で使用されるこのサル種で完全に保存される。
ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２のＧｌｕ１５５は、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂと最も接触しているエピトープ残基である（図３を参照）。興味深いことに、Ｇｌｕ１５５は、全てのヒトカドヘリンの多重配列アラインメントにより示されるように、ヒトカドヘリン１〜４のみで見出される非保存挿入内に位置する（図６）。Ｇｌｕ１５５自体が、ヒトカドヘリン１、２および４で保存されないため、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑは、ヒトカドヘリン−３（別名、ヒトＰ−カドヘリン）に対して高い選択性を示すと予想される。
上述するように、カドヘリンは、細胞間接着の分子メカニズムにおいて重要な役割を果たし、それは、カドヘリンクラスターの外部ドメイン間の強力なトランス同型相互作用および弱いシス同型相互作用の両方を含む（Boggon et al., (2002) Science 296:1308-1313、Harrison et al., (2011) Structure 19:244-256）。ヒトＰ−カドヘリンＥＣ１＿ＥＣ２／ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ Ｆａｂ複合体の結晶構造に基づいて、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑに関する結合エピトープは、シス同型相互作用に関与するＥＣ１ドメインの表面領域と部分的に重複するが、トランス（細胞間）同型相互作用に関与するＮ末端領域とは重複しないようである。その結果として、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑは、カドヘリン結合について強力なトランス相互作用とは競合せず、したがって、その結合性エピトープにより容易に接近する可能性が高い。さらに、この抗体の、その標的抗原への結合は、トランス同型相互作用が保存されるため、細胞間接着を完全に崩壊させるとは予想されない。
Ｐ−カドヘリン抗体薬物コンジュゲートの生成および特性評価
１ステップ法によるＤＭ１コンジュゲートの調製
Ｐ−カドヘリンに対する抗体を、コンジュゲーション反応を開始する前に接線流濾過（ＴＦＦ＃１）により反応緩衝液（１５ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）中で透析濾過した。続いて、抗体（５．０ｍｇ／ｍＬ）をＤＭ１（抗体量に対して５．６倍モル過剰）、次いで、ＳＭＣＣ（抗体量に対して４．７倍過剰）と混合した。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％ＤＭＡを含有する１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中、２０℃で約１６時間行った。１Ｍ酢酸を添加してｐＨを５．５０に調整することにより反応をクエンチした。ｐＨ調整後、反応混合物を多層（０．４５／０．２２μｍ）ＰＶＤＦフィルターを通して濾過し、精製し、接線流濾過（ＴＦＦ＃２）を使用して８．２２％スクロースを含有する２０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．６）中で透析濾過した。接線流濾過のための装置パラメーターを、以下の表６に列挙する。
上記の方法から得られたコンジュゲートを、細胞毒性剤ローディング（メイタンシノイドと抗体の比、ＭＡＲ）についてはＵＶ分光法；コンジュゲート単量体の決定についてはＳＥＣ−ＨＰＬＣ；および遊離メイタンシノイドパーセンテージについては逆相ＨＰＬＣまたは疎水性保護相（Ｈｉｓｅｐ）−ＨＰＬＣにより分析した。データは表７に示す。
ｉｎ ｓｉｔｕ法によるＤＭ１コンジュゲートの調製
本発明のコンジュゲートはまた、下記手順に従って、ｉｎ ｓｉｔｕ法により調製することができる。Ｐ−カドヘリン抗体は、スルホサクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（スルホ−ＳＭＣＣ）リンカーを使用してＤＭ１にコンジュゲートされた。ＤＭ１およびスルホ−ＳＭＣＣヘテロ二官能性リンカーのストック溶液を、ＤＭＡ中で調製した。スルホ−ＳＭＣＣとＤＭ１チオールとを一緒に混合して、４０％ｖ／ｖの水性５０ｍＭコハク酸緩衝液、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を含有するＤＭＡ中で、ＤＭ１とリンカーとの比１．３：１モル当量およびＤＭ１の最終濃度１．９５ｍＭで、２５℃で１０分間反応させた。次いで、抗体を反応のアリコートと反応させて、５０ｍＭ ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０および１０％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）中、２．５ｍｇ／ｍＬのＡｂの最終コンジュゲーション条件下で、約６．５：１のＳＭＣＣとＡｂとのモル当量比を得た。２５℃で約１８時間後、コンジュゲーション反応混合物を、１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。
ＳＰＤＢリンカーを使用するＡＤＣの調製
Ｐ−カドヘリン抗体（８ｍｇ／ｍｌ）を、５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＬ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５％ＤＭＡを含有する６０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中、２５℃で１２０分間、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ、４．０〜４．１倍モル過剰）を用いて修飾した。次いで、精製されていない修飾Ａｂを、５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および５％ＤＭＡを含有する６０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中、４ｍｇ／ｍＬの最終修飾抗体濃度で、２５℃で１８時間、ＤＭ４（未結合のリンカーに対して１．５倍モル過剰）にコンジュゲートした。コンジュゲーション反応混合物を、１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５で平衡化および溶出させるＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。
ＣＸ１−１リンカーを使用するＡＤＣの調製
抗体ＮＥＧ００６７（５．０ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭ１（抗体量に対して７．４倍モル過剰）、次いで、ＣＸ１−１（抗体量に対して５．７倍過剰）と混合した。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび５％ＤＭＡを含有する５０ｍＭ ＥＰＰＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸］緩衝液（ｐＨ８．０）中、２５℃で約１６時間行った。次いで、反応混合物を、１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５中で平衡化および溶出させるＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。
Ｐ−カドヘリンに対するＰ−カドヘリン抗体およびＡＤＣの親和性
Ｐ−カドヘリンおよびその種オルソログに対する各種抗体および抗体薬物コンジュゲート（Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１方式で）の親和性を、ＣＭ５センサーチップを使用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピッツバーグ、ＰＡ）またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピッツバーグ、ＰＡ）を使用して、ＳＰＲ技術を使用して決定した。
簡潔に述べると、２％Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ）を補充したＨＢＳ−Ｐ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００装置での実験全てに関するランニング緩衝液として使用した。２％Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液を補充したＨＢＳ−Ｐ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００装置での全ての実験に関してランニング緩衝液として使用した。固定化レベルおよび分析物相互作用は、応答単位（ＲＵ）により測定した。パイロット実験を実施して、プロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピッツバーグ、ＰＡ）の固定化および試験抗体の捕捉の実現可能性を試験ならびに確認した。
動態測定に関して、抗体が、固定化プロテインＡを介してセンサーチップ表面に捕捉された実験を実施して、Ｐ−カドヘリンタンパク質の、遊離溶液中で結合する能力を決定した。簡潔に述べると、２３００〜３３００ＲＵに達するように、ｐＨ４．５で２８μｇ／ｍｌのプロテインＡを、２つのフローセル状に流速１０μｌ／分でアミンカップリングによってＣＭ５センサーチップ上に固定化した。次に、０．０１〜０．２５μｇ／ｍｌの試験抗体を、５μｌ／分で３分間注入した。抗体の捕捉レベルは概して、４００ＲＵ未満に維持された。続いて、６．２５〜１００ｎＭのＰ−カドヘリンＥＣＤを、２倍系列で希釈して、流速４０μｌ／分で２〜４分間、参照および試験フローセルの両方にわたって注入した。試験ＥＣＤの表１１を以下に列挙する。結合の解離を５分間行った。各注入サイクル後に、チップ表面を、１００μｌ／分で４５秒間、ＰＢＳ／６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ７．４で再生させた。実験は全て、２５℃で実施して、応答データは、Ｂｉｏｃｏｒｅ Ｔ１００方程式ソフトウェアバージョン２．０．３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、全体的に簡素な１：１相互作用モデルでフィッティングさせて、Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００装置で速度（ｋａ）、オフ速度（ｋｄ）および親和性（ＫＤ）の推定値を得た。Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）２０００装置で実行した実験は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２（登録商標）ソフトウェアバージョン２．０ｂ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、全体的に簡素な１：１相互作用モデルでフィッティングさせて、速度（ｋａ）、オフ速度（ｋｄ）および親和性（ＫＤ）の推定値を得た。
表１２は、表１に開示する各種Ｐ−カドヘリン抗体のドメイン結合および親和性を列挙する。表に示すように、抗体ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ、ＮＥＧ００１２、ＮＥＧ００１３、ＮＥＧ００１６、ＮＥＧ００６４、およびＮＥＧ００６７は全て、ナノモルレベルでヒトＰ−カドヘリンと反応し、カニクイザルＰ−カドヘリンＥＣＤに対して試験したものに関して類似の親和性を有する。抗体は全て、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑを除いて、ラットと交差反応した。
生化学アッセイにおけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１／ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ選択性
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のオフターゲット交差反応性の可能性を検査するために、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑを、相当するＥＣＤ：Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）またはＮ−カドヘリン（ＣＤＨ２）において最高度のアミノ酸配列同一性を有する２つの密接に関連した古典的なカドヘリンファミリーの成員への結合に関して評価した。
Ｐ−カドヘリン対Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンに対する結合の特異性を評価するために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルプレートを、４℃で一晩、組換えヒトＥ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンＥＣＤとともに置いて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）方式を使用して、Ｆａｂ断片をアッセイした。洗浄後、プレートを、１×ＰＢＳＴ中の５％スキムミルクで２時間、ブロックした。Ｆａｂ含有大腸菌（E. coli）溶解物を添加して、室温（ＲＴ）で１時間結合させた。結合Ｆａｂ断片を検出するために、プレートを５×ＴＢＳＴで洗浄して、ＡＰ−抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２を１／２５００希釈で添加した。室温で１時間後、プレートを５×ＴＢＳＴで洗浄して、製造業者の仕様書に従って、Ａｔｔｏｐｈｏｓ基質を添加した。基質を添加した５分後に、プレートをＥＬＩＳＡ読み取り機で読み取った。
ＥＬＩＳＡ方法論を利用して、ヒトＥ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンへの有意な結合は、抗Ｐ−カドヘリン抗体候補ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑに関して検出されなかった。
生化学アッセイにおけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１／ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ選択性
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のオフターゲット交差反応性の可能性を検査するために、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑを、相当するＥＣＤ：Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）またはＮ−カドヘリン（ＣＤＨ２）において最高度のアミノ酸配列同一性を有する２つの密接に関連した古典的なカドヘリンファミリーの成員への結合に関して評価した。
Ｐ−カドヘリン対Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンに対する結合の特異性を評価するために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルプレートを、４℃で一晩、組換えヒトＥ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンＥＣＤとともに置いて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）方式を使用して、Ｆａｂ断片をアッセイした。洗浄後、プレートを、１×ＰＢＳＴ中の５％スキムミルクで２時間、ブロックした。Ｆａｂ含有大腸菌（E. coli）溶解物を添加して、室温（ＲＴ）で１時間結合させた。結合Ｆａｂ断片を検出するために、プレートを５×ＴＢＳＴで洗浄して、ＡＰ−抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２を１／２５００希釈で添加した。室温で１時間後、プレートを５×ＴＢＳＴで洗浄して、製造業者の仕様書に従って、Ａｔｔｏｐｈｏｓ基質を添加した。基質を添加した５分後に、プレートをＥＬＩＳＡ読み取り機で読み取った。
ＥＬＩＳＡ方法論を利用して、ヒトＥ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンへの有意な結合は、抗Ｐ−カドヘリン抗体候補ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑに関して検出されなかった。
Ｐ−カドヘリン機能に対するＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑの影響の評価
抗Ｐ−カドヘリン抗体ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ（抗体薬物コンジュゲートＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の構成成分）の、細胞アッセイにおいてＰ−カドヘリンに対して機能的効果を発揮する能力を評価するために、研究を実施した。Ｐ−カドヘリンは、がん細胞の細胞表面上に発現される同型細胞接着分子であり、したがって、Ｐ−カドヘリン陽性ＨＣＴ１１６細胞およびＰ−カドヘリン陰性ＨＴ−２９細胞を使用したスフェロイド完全性アッセイを用いて、抗体の潜在的なアンタゴニスト特性を評価した。このアッセイの読出しは、明視野顕微鏡法および細胞ＤＮＡの７−ＡＡＤ蛍光検出により決定される場合の、スフェロイドの形状および堅固さである。
ＨＣＴ１１６細胞（Ｐ−カドヘリン陽性）またはＨＴ２９細胞（Ｐ−カドヘリン陰性）を、９６ウェル丸底超低結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ．＃７００７）において１ウェル当たり６，０００個の細胞の密度で、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照Ａｂ（１０μｇ／ｍＬ）もしくはＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ（１０μｇ／ｍＬ）を伴って、または伴わずに播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２でオービタルシェーカー（６０ｒｐｍ）に置いた。細胞を平板培養して、細胞ＤＮＡを標識した１１６時間後に、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ．＃５５９９２５）を添加した。細胞を平板培養した１３２間後に、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄフィルターを使用したＧＥ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００で、７−ＡＡＤ画像処理を行った。各ウェルの７〜９枚の「ｚ」画像スタックを撮り、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ １．８プログラムを使用して、画像スタックを折り畳んだ（collapsed）。
図７では、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑは、明視野顕微鏡法および７−ＡＡＤ（ＤＮＡベースの）画像処理により決定されるスフェロイド密度分析から明らかであるように、Ｐ−カドヘリン発現ＨＣＴ１１６細胞ではＰ−カドヘリン媒介性細胞接着に対して、小さいが、識別可能な効果を示したが、Ｐ−カドヘリン陰性ＨＴ２９細胞では示さなかった。対照的に、非特異的な対照ヒトＩｇＧ１抗体は、多細胞スフェロイドの完全性に対して影響しなかった。したがって、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで、Ｐ−カドヘリン機能の部分的アゴニストであり得る。
細胞増殖および生存のＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１阻害
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の、細胞増殖および生存を阻害する能力を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）増殖アッセイを使用して評価した。
細胞系は、組織培養インキュベーター中で、５％ＣＯ２、３７℃でその成長に最適である培地中で培養した。増殖アッセイのための播種に先立って、最適な成長密度を保証するためにアッセイの少なくとも２日前に、細胞を分割した。播種の日に、０．２５％トリプシンを使用して、細胞を組織培養フラスコから取り出した。細胞生存率および細胞密度は、細胞カウンター（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して決定した。８５％よりも高い生存率を有する細胞を、黒壁付き透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃａｔ＃３９０４）において、標準成長培地５０μＬ中でウェル１つ当たり２，５００個の細胞の密度で播種した。ウェル容量に対する蒸発の影響を最低限に抑えるために、プレートの縁を縁取るウェルに、ＰＢＳを充填した。プレートを組織培養インキュベーター中で、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、遊離マイタンシン（Ｌ−ＤＭ１−Ｍｅ）、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１および非ターゲティングＡＤＣ対照（ＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）を標準成長培地中で２倍で調製した。次に、調製薬物処理を細胞に加えて、０〜１００ｎＭの範囲の最終濃度および１ウェル当たり１００μＬの最終容量をもたらした。各薬物濃度を三重反復で試験した。プレートを組織培養インキュベーター中で、３７℃で一晩または５日間インキュベートし、その後、細胞を溶解させて、かつ総アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）含有量を測定する試薬であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃Ｇ７５７３）１００μＬの添加によって、細胞生存率を評価した。プレートを、オービタルシェーカーで、細胞溶解を誘導するのに３分間の適正な混合を提供する速度で、暗所で室温でインキュベートした。発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した読取りに先立って、プレートを室温で１０分間インキュベートして、蛍光シグナルを安定化させた。未処理細胞の蛍光カウントを、播種後にその日に（０日目の読み取り）、および薬物曝露の５日後に（５日目の読み取り）取った。アッセイ仕様として、未処理細胞の５日目の読み取りを、０日目の読み取りと比較した。インキュベーション期間中の少なくとも１回の細胞倍加を伴うアッセイは、妥当であるとみなした。薬物処理の効果を評価するために、未処理細胞を含有するウェル由来の発光カウント（生存率１００％）を使用して、処理試料を正規化した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用して、ＩＣ５０値を算出した。各細胞系を少なくとも３回評価して、代表的なＩＣ５０値を示す。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、標的平均３．８個の分子の各抗体に結合しているＤＭ１を有する（薬物対抗体比、またはＤＡＲ３．８）。３つの代表的な細胞系の要領応答曲線を示す（図８）。細胞成長または生存の５０％を阻害するのに必要とされる処理の濃度（ＩＣ５０）を算出して、試験した細胞系の代表的なＩＣ５０値を、表１３に概要した。
コンジュゲートしていない抗体ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑは、細胞毒性であるとも、また増殖性であるとも実証されなかったのに対して、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、Ｐ−カドヘリン発現細胞系において増殖および生存を強力に阻害した。どちらの分子も、Ｐ−カドヘリン陰性細胞系ＨＴ２９において活性ではなかった（図８）。対照的に、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、２つの乳がん細胞系ＨＣＣ１９５４およびＨＣＣ７０の成長を強力に阻害した。表１３は、細胞系のパネルにおけるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の活性を概要する。アイソタイプ適合非ターゲティング対照ＡＤＣ（ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１）と比較して、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１は多くの場合、細胞１つ当たり５０，０００個を上回る細胞表面コピーを発現する細胞系に対して細胞傷害活性を示した。これらの研究により、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の細胞毒性効果が、ＡＤＣの内部移行したマイタンシン構成成分に起因すること、およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１が、Ｐ−カドヘリンを過剰発現する細胞を特異的に標的とすることが示される。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１ＱおよびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１誘導性ＡＤＣＣ活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価
増殖に対するその影響に加えて、ＮＯＶ１６９Ｎ３１ＱおよびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１はまた、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介するその能力に関しても評価した。
エフェクター細胞は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ，ＬＬＣから入手されるそのままの（untouched）ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（カタログ＃ＰＢ０１２：Ｆｒｅｓｈ／Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｎｏｒｍａｌ ＰＢ ＣＤ５６＋ＮＫ細胞）であった。標的細胞は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＮＣＳ）を介してＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した（Ｐ−カドヘリン陽性ＨＣＣ１９５４、Ｐ−カドヘリン陰性ＨＴ−２９）。トリプシンフリー細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏからの「Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ」、Ｃａｔ．＃１３１５１−０１４）を使用して、ＨＣＣ１９５４およびＨＴ−２９標的細胞を組織培養容器から取り出して、ＰＢＳで２〜３回洗浄して、培養培地中に再懸濁させた。細胞を、手動でまたは自動細胞カウンターを使用して計数した。９０％を上回る生存率の細胞を、培養培地中に１×１０５個の細胞／ｍＬで懸濁させた。ヒトＮＫ細胞を洗浄して、標的細胞系と同じ様式で計数した。次に、エフェクター細胞を、細胞培養培地中に１〜２×１０６個の細胞／ｍＬで懸濁させた。
処理は、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ抗体、適合アイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ１対照）、ならびに抗体薬物コンジュゲートＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＩｇＧ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を含んでいた。培地５０μＬ中の標的細胞５０００個を、９６ウェルプレート平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３６０３）において播種した。次に、試験および対照抗体を、培地２５μＬ中で４×最終濃度（最終濃度範囲５０〜０．０００１μｇ／ｍＬ、処理なしの対照に加えて）で、３７℃で２０分間添加した。続いて、エフェクター細胞を、培地２５μＬ中でエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）５：１（例えば、５：１の比に関して、ウェル１つ当たり２５０００個のエフェクター細胞）で添加した。処理および対照（標的細胞のみ、エフェクター細胞のみ、細胞なし）を三重反復でランした。次に、プレートを遠心機で５００ＲＰＭで（制動なしで）回転させて、プレートの底部で細胞を濃縮した。続いて、プレートを、正常な細胞培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）下で２４時間インキュベートした。
インキュベーション期間後、培地をプレートから除去して、ウェルをＰＢＳで２〜３回洗浄して、非接着エフェクター細胞を除去した。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃Ｇ７５７０）１００μＬを各ウェルに添加して、プレートを光から守り、オービタルシェーカー上に２分間置いた。次に、発光カウンター（Ｗａｌｌａｃ ＴｒｉＬｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ １４５０）で、プレートを読み取った。発光カウンターにより検出されるシグナルは、ウェル中に残存するＡＴＰの量または細胞の数に正比例する。ベースラインとして対照ウェルを使用して、各処理に関する生存細胞数を、未処理対照のパーセントとして決定することができる。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑはともに、用量依存性様式でｉｎ ｖｉｔｒｏで、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の存在下でＰ−カドヘリン過剰発現細胞に対してＡＤＣＣ活性を媒介する能力を実証した（図９）。抗体およびＡＤＣの両方のための適合アイソタイプ対照が、有意な細胞死滅を示さなかったため、この活性は、Ｐ−カドヘリン特異的であることがわかった。ＮＯＶ１６９Ｎ３１ＱもＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１も、Ｐ−カドヘリン陰性細胞系ＨＴ−２９に対してＡＤＣＣのいかなる誘導も示さず、同様に抗体および抗体薬物コンジュゲートの特定の効果を示している。したがって、腫瘍細胞への細胞毒性ペイロードの送達に加えて、ＡＤＣＣは、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を死滅させるためのＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１作用の別の潜在的なメカニズムを表す。
抗Ｐ−カドヘリンＡＤＣによるｉｎ ｖｉｖｏでのオンターゲット薬物動態マーカーモジュレート
Ｐ−カドヘリンＡＤＣであるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の、ｉｎ ｖｉｖｏでＧ２／Ｍ停止の薬物動態マーカー［ホスホ−ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）による細胞の蓄積］をモジュレートする能力を評価するために研究を行った。目標は、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１、アイソタイプ対照ＡＤＣまたはビヒクル単独で処置したマウス由来の腫瘍においてＧ２／Ｍ細胞周期停止の度合いおよび持続期間を評価することであった。
免疫組織化学により評価されるように、ｐＨＨ３陽性核の蓄積を測定するために、ヒトヒストンＨ３（ｐＨＨ３）のリン酸化Ｓｅｒ１０周囲の残基に相当する合成ホスホペプチドで動物を免疫化することにより生成されるウサギポリクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンバーズ、ＭＡ、Ｃａｔ＃９７０１）から入手した。簡潔に述べると、ＩＨＣプロトコールは、熱、およびＶｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ＃１抗原回復（antigen retrieval）試薬に対する標準的な曝露を含んでいた。一次抗体を１：５０に希釈して、室温で６０分間インキュベートした。続いて、Ｊａｃｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓヤギ抗ラビット抗体ビオチン化二次抗体（Ｃａｔ＃１１１−０６５−１４４、ウエストグローブ、ＰＡ）とのインキュベーションを３２分間実施した。
皮下腫瘍異種移植片モデルにおいてＨＣＣ７０トリプルネガティブ乳がんモデルにおける抗Ｐ−カドヘリンＡＤＣ誘導性ＰＤマーカー変化を評価するために、雌ＳＣＩＤベージュマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。
懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。腫瘍がいったん、平均しておよそ１３０ｍｍ３（ｎ＝３匹／群）になったら、マウスを無作為に割り当てて、単回静脈内（ＩＶ）用量のＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、非特異的なＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）または空のビヒクル対照（２０ｍＭヒスチジン、８．２２％スクロース、０．０２％ＰＳ−２０、ｐＨ５．６）のいずれかを付与した。投与の２１日後までの時点で、腫瘍を収集した。ＰＤ応答の尺度として、ホスホ−ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）レベルの定性的評価を、以下に記載する免疫組織化学染色により行った。
図１０では、メイタンシノイドペイロードの予測メカニズムと一致して、幾つかのベースラインホスホ−ヒストンＨ３免疫染色をビヒクル処置腫瘍で検出した一方で、これらのレベルは、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１処置後に、特に投与の２〜７日後に上昇した。これらのデータにより、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１が、メイタンシノイドペイロードの作用機序と一致して、腫瘍異種移植片において頑強な細胞ＰＤ応答を誘発することが可能であることが実証される。
マウスにおけるＨＣＣ７０トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）モデルに対する抗Ｐ−カドヘリンＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性（ＡＤＣ有効性スクリーニング）
乳がんでは、Ｐ−カドヘリンは、高頻度で高度に発現され、それは、各細胞の表面上におよそ６６，０００個の受容体を伴うＨＣＣ７０細胞系で例示された。ＨＣＣ７０腫瘍上でのＰ−カドヘリン免疫染色の代表的な写真は、この異種移植片モデルにおける染色パターンを可視化するために示される（図１１Ａ）。ＩＨＣは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ自動染色機を使用して実施した。ホルマリン固定したパラフィン包埋腫瘍の切片を脱パラフィンして、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ＃１（ＣＣＩＳ）抗原回復試薬で処置して、次に、一次抗体［ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂからのマウスモノクローナル抗ヒトＰ−ｃａｄ抗体（Ｃａｔ＃６１０２２８、ロット０９９３４）］中で、１０μｇ／ｍｌの濃度で、室温で６０分間インキュベートした。この後、１：２５０の作業濃度で使用されるビオチン化ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃａｔ＃１１５−０６６−０７２、ロット＃６３６２０）とインキュベーションを行った。検出は、ＤＡＢ Ｍａｐキット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ、ｃａｔ＃７６０−１２４）を使用して行った。非特異的なマウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ＃Ｉ−２０００、ロット＃Ｖ０６１０）を対照として使用して、Ｐ−カドヘリン抗体を用いた場合に観察される染色が特異的であることを保証した。
腫瘍が、およそ２１５ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に従って処置群へ無作為化して（ｎ＝８匹／群）、ビヒクルまたは７ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの単回ＩＶ投与を施した。７ｍｇ／ｋｇ用量レベルは、それが、このモデルにおけるＡＤＣ候補間での差を識別する機会（window）を提供するように選択された。用量は、個々のマウスの体重に調整された。ＩＶ用量容量は８ｍｌ／ｋｇであった。
ＮＥＧ００１２−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１処置群における平均腫瘍体積は、４２日目にアイソタイプ適合ｈｕＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１対照群と有意に異なっていた（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎ法、ｐ≦０．０５）。ＡＤＣ候補で処置した他の群は、対照と比較して、統計学的に異なる腫瘍体積を示さなかった（図１１Ｂ）。これにより、リードＡＤＣ候補として、ＮＥＧ００１２−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１が選び出された。有意な体重損失は、いずれの群でも観察されなかった。
マウスにおけるＨＣＣ７０トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）モデルに対するＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量依存性ｉｎ ｖｉｖｏ有効性
各細胞の表面上におよそ６６，０００個の受容体を伴うＨＣＣ７０細胞系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１に対して感受性があることが示された。ＨＣＣ７０モデルにおいてＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１による標的抗腫瘍活性を実証するために、２．５、５、１０および１５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１または非特異的なアイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１の単回ＩＶ処置を投与した。ＨＣＣ７０腫瘍は、各マウスの右脇腹への１０×１０６個の細胞の皮下注射により雌ＳＣＩＤマウスにおいて樹立させた。腫瘍が、およそ１４３ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に従って処置群へ無作為化した（ｎ＝９）。試験作用物質は全て、示した用量レベルおよびスケジュールで投与され、用量は、個々のマウスの体重に調整された。ＩＶ用量容量は５ｍｌ／ｋｇであった。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１処置は、ΔＴ／ΔＣ％値４８％（２．５ｍｇ／ｋｇ）、１％（５ｍｇ／ｋｇ）で、用量に比例した抗腫瘍有効性をもたらした一方で、１０および１５ｍｇ／ｋｇの用量は、それぞれ平均退縮６４％および６１％をもたらした。最大有効性は、１０ｍｇ／ｋｇで達成された。試験した５、１０および１５ｍｇ／ｋｇ群は、ビヒクル処置とは統計学的に異なっていた（Ｐ＜０．０５、順位に基づくＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎ法、５９日目）。１０および１５ｍｇ／ｋｇの用量レベルは、研究を終結させた場合、処置の８６日後まで持続するマウスにおける持続的腫瘍退縮を誘発した。
試験作用物質は全て、研究で許容され、マウスＰ−カドヘリンを結合しないＡＤＣに関して予測されるように、毒性の明白な臨床症状は、処置群のいずれにおいても観察されなかった。全ての群において、マウスＰ−カドヘリンを結合しないＡＤＣに関して予測されるように、体重増加が、無作為化での平均体重と比較して観察され、ビヒクル処置マウスの体重増加に類似していた（図１２および表１４）。
マウスにおけるＨＣＣ１９５４乳がんモデルに対するＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
さらなる乳がんモデルにおける有効性を実証するために、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１活性を、ＳＣＩＤベージュマウスにおけるＨＣＣ１９５４基底様（Ｈｅｒ２＋）乳がん異種移植片モデルにおいて評価した。ＨＣＣ１９５４モデルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰ−カドヘリン発現（８４，０００個の受容体／細胞）およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１に対する感受性に基づいて選択した。これまでに記載するように、免疫組織化学を実施して、ＨＣＣ７０腫瘍における腫瘍Ｐ−カドヘリンタンパク質レベルを確認した（図１３Ａ）。
腫瘍が、およそ１５０ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に従って処置群へ無作為化して（ｎ＝９匹／群）、ビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１もしくはＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のいずれかの単回ＩＶ投与を施した。用量は、個々のマウスの体重に調整された。ＩＶ用量容量は５ｍｌ／ｋｇであった。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１処置は、ＨＣＣ１９５４腫瘍の５６％の退縮をもたらし、それは、５５日目まで持続的であった（ビヒクルまたはＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１に対して、ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの順位に基づく一元配置ＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎ法）。ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１の有効性は、ΔＴ／ΔＣ％ ７５％であり、ビヒクルとは有意に異ならなかった（ｐ＞０．０５）。試験作用物質は全て、研究で許容され、毒性の明白な臨床症状は、処置群のいずれにおいても観察されなかった（図１３Ｂおよび表１５Ａ）。
別の例では、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１活性を、ＳＣＩＤマウスにおけるＨＣＣ１９５４基底様（Ｈｅｒ２＋）乳がん異種移植片モデルにおいて評価した。ＨＣＣ１９５４モデルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰ−カドヘリン発現（８４，０００個の受容体／細胞）およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１に対する感受性に基づいて選択した。腫瘍が、およそ１９０ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に従って処置群へ無作為化して（ｎ＝５匹／群）、ビヒクル、１５ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑまたは１５ｍｇ／ｋｇのＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の２回（０日目および７日目に投与）ＩＶ投与を施した。用量は、個々のマウスの体重に調整された。ＩＶ用量容量は１０ｍｌ／ｋｇであった。ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１処置は、ＨＣＣ１９５４腫瘍の１００％の退縮をもたらし、それは、５６日目の終わりまで持続的であった（ビヒクルに対して、ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの順位に基づく一元配置ＡＮＯＶＡ／Ｄｕｎｎ法、図１３Ｃ）。ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑの有効性は、ΔＴ／ΔＣ％ １２１．４％であり、ビヒクルとは有意に異ならなかった（ｐ＞０．０５）。試験作用物質は全て、研究で許容され、毒性の明白な臨床症状は、処置群のいずれにおいても観察されなかった（図１３Ｄおよび表１５Ｂ）。
マウスにおけるＢＩＣＲ６頭頸部（下咽頭扁平上皮癌）がんモデルに対するＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の有効性評価を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの７０，０００個の受容体／細胞のＰ−カドヘリン発現およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１に対する感受性に基づくＢＩＣＲ６細胞系で行った。これまでに記載するように、免疫組織化学を実施して、ＢＩＣＲ６腫瘍における腫瘍Ｐ−カドヘリンレベルを確認して、ここで腫瘍細胞の８２％が、Ｐ−カドヘリンに関して少なくとも２＋を染色する（図１４Ａ）。
ＢＩＣＲ６腫瘍は、各マウスの右脇腹への５×１０６個の腫瘍細胞の皮下生着により雌ＳＣＩＤベージュマウスにおいて樹立させた。腫瘍が、およそ１３０ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に従って処置群へ無作為化して（ｎ＝１０匹／群）、ビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇのｑ７ｄスケジュール（ｑ２ｄｘ２）にわたって投与されるＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１もしくはＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のいずれかのＩＶ投与を施した。用量は、個々のマウスの体重に調整された。ＩＶ用量容量は５ｍｌ／ｋｇであった。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１処置は、最大３７％の腫瘍退縮をもたらした（研究の２６日目）。全体として、静止の腫瘍応答は、投与の４２日後まで、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１で持続的であった（ΔＴ／ΔＣ １％、ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの順位に基づく一元配置ＡＮＯＶＡ／Ｔｕｒｋｅｙ検定）。試験作用物質は全て、研究で許容され、毒性の明白な臨床症状は、処置群のいずれにおいても観察されなかった（図１４Ｂおよび表１６）。
マウスにおけるｓｃａＢＥＲ膀胱がんモデルに対するＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの６３，０００個の受容体／細胞のＰ−カドヘリン発現およびＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１に対する感受性に基づいて選択されるｓｃａＢＥＲ膀胱がん異種移植片モデルで評価した。免疫組織化学を実施して、ｓｃａＢＥＲ腫瘍における腫瘍Ｐ−カドヘリンレベルを確認して、腫瘍細胞のおよそ５２％が、少なくとも２＋を染色することを示した（図１５Ａ）。
ｓｃａＢＥＲ腫瘍は、各マウスの右脇腹への腫瘍断片の皮下生着により雌ＳＣＩＤベージュマウスにおいて樹立させた。腫瘍が、およそ１３０ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に従って処置群へ無作為化して（ｎ＝１０匹／群）、ビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇの２週空けて２度（Ｑ２Ｗｘ２）投与されるＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１もしくはＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のいずれかのＩＶ投与を施した。用量は、個々のマウスの体重に調整された。ＩＶ用量容量は５ｍｌ／ｋｇであった。
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１処置は、ΔＴ／ΔＣ １８％をもたらした（ビヒクルまたはＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１に対して、ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ／Ｔｕｒｋｅｙ検定、３５日目）。ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１の有効性は、ΔＴ／ΔＣ ８６％であり、ビヒクルとは有意に異ならなかった（ｐ＞０．０５）。試験作用物質は全て、研究で許容され、毒性の明白な臨床症状は、処置群のいずれにおいても観察されなかった（図１５Ｂおよび表１７）。
マウスにおけるＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）ＥＳ２２６７食道がんモデルに対するＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性を、Ｐ−カドヘリン発現ＥＳ２２６７食道がん異種移植片モデルで評価した。雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、各マウスの右脇腹において腫瘍断片を皮下移植した。腫瘍が、およそ１５４ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に従って処置群へ無作為化した（ｎ＝５）。１０ｍｇ／ｋｇで投与されるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１またはヒト化非特異的アイソタイプ対照３２０７−ＭＣＣ−ＤＭ１を、無作為化の０日後および１３日後に投与した。用量は、個々のマウスの体重に調整された。ＩＶ用量容量は１０ｍｌ／ｋｇであった。
１０ｍｇ／ｋｇでのＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置は、２１日目に平均退縮５８％を有するビヒクルと比較した場合に、抗腫瘍有効性をもたらした。さらに、１０ｍｇ／ｋｇでの非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置後に、有意な抗腫瘍有効性は観察されなかった。研究の２１日目に、および最終日（５３日目）に、試験したＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ビヒクルおよびアイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１処置群と統計学的に異なっていた（Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ／Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法、２１日目）。試験作用物質は全て、十分許容され、体重損失は、マウスＰ−カドヘリンを結合しないＡＤＣに関して予想されるように、処置群のいずれにおいても観察されなかった（図１６および表１８）。
ＨＣＣ７０乳がん異種移植片モデルにおける２つのリンカー（ＭＣＣおよびＣＸ１−１）を使用してＤＭ１にコンジュゲートしているＮＥＧ００６７の有効性比較
ＨＣＣ７０乳がん異種移植片モデルを使用して、ＭＣＣ対ＣＸ−１−１リンカーを使用してＤＭ１にコンジュゲートしている抗Ｐ−カドヘリン抗体ＮＥＧ００６７の抗腫瘍有効性を比較した。腫瘍が、およそ２１５ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に従って処置群へ無作為化して（ｎ＝８匹／群）、ビヒクルまたは７ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの単回ＩＶ投与を施した。用量は、個々のマウスの体重に調整された。ＩＶ用量容量は８ｍｌ／ｋｇであった。
ＮＥＧ００６７−ＣＸ１−１−ＤＭ１群における平均腫瘍体積は、対照ＩｇＧ１−ＣＸ１−１−ＤＭ１群と有意に異なった（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎ法、ｐ≦０．０５）のに対して、ＮＥＧ００６７−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１と統計学的に異ならなかった。しかしながら、ｈｕＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１処置群と比較して、ＩｇＧ１−ＣＸ１−１−ＤＭ１において活性の増加の傾向が見られた。
ＨＣＣ７０乳がん異種移植片モデルにおけるＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカーペイロード（切断可能なリンカー）を使用してコンジュゲートしているマウスハイブリドーマ由来の抗Ｐ−カドヘリンＡＤＣの有効性評価
ＨＣＣ７０乳がん異種移植片モデルを使用して、ＳＢＤＢ−ＤＭ４リンカーペイロードを使用した３つのマウスハイブリドーマ由来のＡＤＣの抗腫瘍有効性を比較した。腫瘍が、およそ１５０ｍｍ３に達したら、マウスを、腫瘍体積に従って処置群へ無作為化して（ｎ＝１０匹／群）、ビヒクルまたは５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの単回ＩＶ投与を施した。用量は、個々のマウスの体重に調整された。
２Ｐ１０−ＳＰＤＢ−ＤＭ４処置群における幾つかの腫瘍再成長を伴って、単回５ｍｇ／ｍｌ用量の３つのＳＰＤＢ−ＤＭ４連結ＡＤＣ全てが、持続的な腫瘍退縮を有意に誘導した（ｐ≦０．０５）。１Ｇ１２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４または３Ｄ２１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４で処置した群では、腫瘍は完全に退縮したままであった（図１８）。
ＡＤＣ製剤
ＡＤＣであるＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１の臨床サービス形態（ＣＳＦ）は、ＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ５０ｍｇを含有するバイアル中の凍結乾燥物である。注射用の水５ｍＬによる凍結乾燥物の再構成後に、ｐＨ５．３の１０ｍｇ／ｍＬのＮＯＶ１６９Ｎ３１Ｑ−ＭＣＣ−ＤＭ１、２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、２４０ｍＭスクロースおよび０．０２％ポリソルベート２０を含有する溶液が得られる。
その後の静脈内投与のために、得られた溶液を、通常、担体溶液中にさらに希釈して、輸注用のすぐに使えるＡＤＣ溶液にする。
ＣＳＦについては、１０ｍｇ／ｍＬのＡＤＣ濃度を選択した。等張性製剤を作出し、不定形の凍結乾燥ケーキ構造を維持し、タンパク質安定化を得るために、２４０ｍＭのスクロース濃度を選択した。
最も安定な製剤を選択するための重要な安定性指示分析方法は、特に、凝集レベルを決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー、肉眼では見ることができない粒子状物質の試験、遊離毒素の決定および効力試験を包含していた。予備スクリーニング研究により、０．０２％の濃度のポリソルベート２０が機械的ストレスに対する十分な安定を提供することが示された。実時間および加速安定性条件（２５℃および４０℃）での液体および凍結乾燥安定性研究により、５．０〜５．５のｐＨ値のヒスチジンベースの製剤が、全体的に最良の貯蔵安定性を提供することが実証された。とりわけ、この範囲では、遊離毒素の凝集と放出との間の試験される製剤全てのバランスを満たすことができた。２５℃および４０℃での２カ月安定性研究により、非常に低レベルの凝集および分解産物が示された。
本明細書に記載の実施例および実施形態は例示目的に過ぎず、それに照らして様々な改変または変更が当業者に対して示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲の中に含まれることが理解される。
また、本発明は以下を提供する。
［１］
配列番号１２６の１２４、１２５、１５１、１５３、１５４、１５５、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６８、１７０、１７１、および１７２位にあるアミノ酸から選択される１つまたは複数の残基においてヒトＰ−カドヘリンタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
［２］
配列番号１２６の１２４、１２５、１５１、１５３、１５４、１５５、１５６、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６８、１７０、１７１、および１７２位にあるアミノ酸においてヒトＰ−カドヘリンタンパク質に結合する、［１］に記載の抗体。
［３］
配列番号１２６の１２４、１５１、１５３〜１５６、および１７２位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基においてヒトＰ−カドヘリンに結合する重鎖可変領域を含む、［１］に記載の抗体。
［４］
ヒトＰ−カドヘリンタンパク質に対する前記重鎖可変領域結合性パラトープが、配列番号１２８の５２、５４、５６、６０、６５、１０５、または１０７位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、［３］に記載の抗体。
［５］
配列番号１２６の１２４、１２５、１５５、１５６、１５９〜１６３、１６８、１７０、および１７１位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基においてヒトＰ−カドヘリンに結合する軽鎖可変領域を含む、［１］に記載の抗体。
［６］
ヒトＰ−カドヘリンタンパク質に対する前記軽鎖可変領域結合性パラトープが、配列番号１２９の１、２、２７、２８、３０、６８、９２、９３、または９４位から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、［５］に記載の抗体。
［７］
［３］に記載の重鎖領域および［５］に記載の軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片。
［８］
ａ．配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号１１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；
ｂ．配列番号２１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号３１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号３３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；
ｃ．配列番号４１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号４３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号５１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号５３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；
ｄ．配列番号６１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号６２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号６３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号７１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号７３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；
ｅ．配列番号８１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号８２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号８３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号９１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号９２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号９３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；または
ｆ．配列番号１０１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１０２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号１０３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される重鎖可変領域、および配列番号１１１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１１２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１１３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域
を含む、Ｐ−カドヘリンを結合する抗体またはその抗原結合性断片。
［９］
ａ．配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｂ．配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｃ．配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｄ．配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
ｅ．配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｆ．配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、Ｐ−カドヘリンを結合する抗体またはその抗原結合性断片。
［１０］
ａ．配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｂ．配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｃ．配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｄ．配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｅ．配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号９９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｆ．配列番号１０９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含むＰ−カドヘリンを結合する抗体またはその抗原結合性断片。
［１１］
［８］から［１０］のいずれか一項に記載の抗体と同じヒトＰ−カドヘリンのエピトープに結合するか、またはヒトＰ−カドヘリンへの結合に対し［８］から［１０］のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体。
［１２］
式
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ） ｍ ） ｎ
（式中、
Ａｂは、［１］から［１１］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、薬物部分であり、
ｍは、１〜８の整数であり、
ｎは、１〜１０の整数である）
を含む抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
［１３］
前記ｍが１である、［１２］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１４］
前記ｎが、３または４である、［１１］または［１２］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１５］
前記抗体または抗原結合性領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、［１２］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１６］
前記抗体または抗原結合性領域が、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、［１２］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１７］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、（ａ）配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２のＶＨ ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および（ｄ）配列番号１１のＶＬ ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、［１２］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１８］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、（ａ）配列番号２１のＶＨ ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２２のＶＨ ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２３のＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および（ｄ）配列番号３１のＶＬ ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＶＬ ＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３３のＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、［１２］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１９］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖を含む、［１２］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２０］
前記抗体が、配列番号２９の重鎖および配列番号３９の軽鎖を含む、［１２］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２１］
前記抗体が、モノクローナル抗体である、［１２］から［２０］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２２］
前記リンカーが、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカーおよびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される、［１２］から［２１］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２３］
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬に由来する、［２２］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２４］
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬に由来する、［２３］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２５］
前記薬物部分が、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、アウリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される、［１２］から［２４］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２６］
前記細胞毒性剤がメイタンシノイドである、［２５］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２７］
前記メイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、［２６］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２８］
下記式：

（式中、
Ａｂは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性断片であり、前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って規定され；およびｎは１〜１０である）
を有する、［１２］に記載の抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
［２９］
［１］から［１１］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
［３０］
［１２］から［２８］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［３１］
凍結乾燥物として調製された、［２９］または［３０］に記載の医薬組成物。
［３２］
前記凍結乾燥物が、［１］から［１１］のいずれか一項に記載の抗体または［１２］から［２８］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、ヒスチジン、スクロース、およびポリソルベート２０を含む、［３１］に記載の医薬組成物。
［３３］
約１０ｍｇ／ｍＬの［２８］に記載の抗体薬物コンジュゲート、２０ｍＭヒスチジン、２４０ｍＭスクロース、および０．０２％ポリソルベート２０を含む、［３２］に記載の医薬組成物。
［３４］
それを必要とする患者におけるがんを処置する方法であって、［１２］から［２８］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、または［２９］から［３３］のいずれか一項に記載の医薬組成物を、前記患者に投与することを含む、方法。
［３５］
前記抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物が、１つまたは複数のさらなる治療用化合物と組み合わせて、前記患者に投与される、［３４］に記載の方法。
［３６］
医薬としての使用のための、［１２］から［２８］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートまたは［２９］から［３３］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［３７］
それを必要とする患者におけるがんの処置における使用のための、［１２］から［２８］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートまたは［２９］から［３３］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［３８］
それを必要とする患者においてがんを処置するための、［１］から［１１］のいずれか一項に記載の抗体、［１２］から［２８］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートまたは［２９］から［３３］のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
［３９］
がんの処置ための医薬の製造における、［１］から［１１］のいずれか一項に記載の抗体または［１２］から［２８］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートの使用。
［４０］
前記がんが、P−カドヘリンを発現する、［３４］または［３５］に記載の方法、［３６］または［３７］に記載の抗体薬物コンジュゲートまたは［３８］または［３９］に記載の使用。
［４１］
前記がんが、副腎皮質癌、膀胱がん、骨がん、乳がん、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、胚芽腫、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞がん、カポジ肉腫、肝臓がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、卵巣がん、直腸がん、横紋筋肉腫、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮がん、腹部がん、子宮がん、膣がん、および外陰部がん、副腎皮質癌、膀胱がん、骨がん、乳がん、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、胚芽腫、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞がん、カポジ肉腫、肝臓がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、卵巣がん、直腸がん、横紋筋肉腫、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮がん、腹部がん、子宮がん、膣がん、および外陰部がんからなる群から選択される、［４０］に記載の方法、抗体薬物コンジュゲートまたは使用。
［４２］
前記がんが、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肺がん、および卵巣がんからなる群から選択される、［３８］に記載の方法、抗体薬物コンジュゲートまたは使用。
［４３］
前記抗体が、ヒトまたはヒト化抗体である、［１］から［１１］のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
［４４］
前記抗体が、モノクローナル抗体である、［１］から［１１］および［４３］のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
［４５］
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、［１］から［１１］、［４３］または［４４］のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
［４６］
［１］から［１１］、［４３］、［４４］または［４５］のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片をコードする核酸。
［４７］
配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１８、３８、５８、７８、９８、１１８、１０、３０、５０、７０、９０、１１０、２０、４０、６０、８０、１００、および１２０のヌクレオチド配列を含む、［４６］に記載の核酸。
［４８］
［４６］または［４７］に記載の核酸を含むベクター。
［４９］
［４８］に記載のベクターまたは［４６］または［４７］に記載の核酸を含む宿主細胞。
［５０］
［４９］に記載の宿主細胞を培養すること、および培養物から抗体を回収することを含む、抗体または抗原結合性断片を生成するための方法。
［５１］
（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結すること；
（ｂ）リンカー−薬物を、［４７］に記載の細胞培養物から回収された抗体にコンジュゲートすること；および
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製すること
を含む、抗Ｐ−カドヘリン抗体薬物コンジュゲートを生成するための方法。
［５２］
抗Ｐ−カドヘリン抗体薬物コンジュゲートを生成する方法であって、
（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結させることと
（ｂ）リンカー−薬物を、［１］から［１１］、［４３］または［４４］のいずれか一項に記載の抗体にコンジュゲートすること、および
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製すること
を含む、方法。
［５３］
ＵＶ分光光度計を使用して測定される、約３．８の平均ＤＡＲを有する、［５１］または［５２］に従って作製された抗体薬物コンジュゲート。
［５４］
［１］から［１１］、［４３］、［４４］または［４５］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む診断剤。
［５５］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、放射性標識、フルオロフォア、発色団、イメージング剤、または金属イオンで標識されている、［５４］に記載の診断剤。

Claims (30)

  1. ａ．配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、重鎖可変領域、および配列番号１１のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域であって、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、軽鎖可変領域；
    を含む、Ｐ−カドヘリンを結合する抗体またはその抗原結合性断片。
  2. ａ．配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
    を含む、Ｐ−カドヘリンを結合する抗体またはその抗原結合性断片。
  3. ａ．配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖；
    を含むＰ−カドヘリンを結合する抗体またはその抗原結合性断片。
  4. 前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体または単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
  5. 式
    Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
    （式中、
    Ａｂは、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片であり、
    Ｌは、リンカーであり、
    Ｄは、薬物部分であり、
    ｍは、１〜８の整数であり、
    ｎは、１〜１０の整数である）
    を含む抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  6. 前記ｍが１である、請求項５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  7. 前記ｎが、３または４である、請求項５または６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  8. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項５から７のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  9. 前記リンカーが、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカーおよびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される、請求項５から８のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  10. 前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬に由来する、請求項９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  11. 前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬に由来する、請求項１０に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  12. 前記薬物部分が、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、アウリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される、請求項５から１１のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  13. 前記薬物部分がメイタンシノイドである、請求項１２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  14. 前記メイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項１３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  15. 下記式：
    （式中、
    Ａｂは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性断片であり、前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って規定され；およびｎは１〜１０である）
    を有する、請求項５に記載の抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
  16. ＵＶ分光光度計を使用して測定される、約３．８の平均ＤＡＲを有する、請求項５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  17. 請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  18. 請求項５から１６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  19. 凍結乾燥物として調製された、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記凍結乾燥物が、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項５から１６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、ヒスチジン、スクロース、およびポリソルベート２０を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 約１０ｍｇ／ｍＬの請求項１５に記載の抗体薬物コンジュゲート、２０ｍＭヒスチジン、２４０ｍＭスクロース、および０．０２％ポリソルベート２０を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. それを必要とする患者におけるがんの処置における使用のための、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、請求項５から１６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートまたは請求項１７から２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 前記がんが、副腎皮質癌、膀胱がん、骨がん、乳がん、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、胚芽腫、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞がん、カポジ肉腫、肝臓がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、卵巣がん、直腸がん、横紋筋肉腫、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頸部扁平上皮がん、腹部がん、子宮がん、膣がん、および外陰部がんからなる群から選択される、請求項２２に記載の抗体、その抗原結合性断片、抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物。
  24. 請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片をコードする核酸。
  25. 配列番号８、１８、１０、および／または２０のヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の核酸。
  26. 請求項２４または２５に記載の核酸を含むベクター。
  27. 請求項２６に記載のベクターまたは請求項２４または２５に記載の核酸を含む宿主細胞。
  28. 請求項２７に記載の宿主細胞を培養すること、および培養物から抗体を回収することを含む、抗体または抗原結合性断片を生成するための方法。
  29. 請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む診断剤。
  30. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、放射性標識、フルオロフォア、発色団、イメージング剤、または金属イオンで標識されている、請求項２９に記載の診断剤。
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