TW201625692A - 抗體藥物結合物 - Google Patents

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史蒂芬 可汗
傑生 達米安諾
克萊蒙斯 杜爾
湯瑪士 哈柏
丹尼爾 密那茲
凱西 米勒
凱瑟琳 倫達爾
珍 米歇 瑞恩 羅狄恩
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Abstract

本申請案揭示抗P-鈣黏蛋白抗體、其抗原結合片段及該等抗體或抗原結合片段之抗體藥物結合物。本發明亦關於使用該等抗體、抗原結合片段及抗體藥物結合物治療癌症之方法。本文亦揭示製備該等抗體、抗原結合片段及抗體藥物結合物之方法，及使用該等抗體及抗原結合片段作為診斷試劑之方法。

Description

抗體藥物結合物
本發明概言之係關於抗P-鈣黏蛋白抗體、抗體片段、抗體藥物結合物及其用於治療癌症之用途。
P-鈣黏蛋白
經典鈣黏蛋白代表表現於調介鈣依賴性細胞至細胞接觸之黏著型連接中之細胞黏附分子家族。胎盤鈣黏蛋白(P-鈣黏蛋白；亦稱為鈣黏蛋白3類型1或「CDH3」)在正常組織中具有受限之表現，但已知表現於若干組織之未分化或分化不足之細胞類型(包含皮膚、食道、肺及口腔之基底上皮細胞)中。(例如參見Albergaria等人，Int.J.Dev.Biol.55：811-822(2011))。
P-鈣黏蛋白之結構由以下3個不同結構域組成：含有5個串聯鈣黏蛋白重複單元之細胞外結構域(ECD)、跨膜結構域及含有連環蛋白結合結構域之細胞內尾部。ECD調介多個P-鈣黏蛋白分子之間之順式-及反式相互作用，而連環蛋白結合結構域使P-鈣黏蛋白連接至諸如p120連環蛋白等蛋白質且因此連接至細胞骨架元件。(例如參見Wu等人，PNAS 107：17592-7(2010))。
P-鈣黏蛋白及癌症
P-鈣黏蛋白(亦稱為「Pcad」、「PCad」、「P-Cad」或「CDH3」)亦已知過度表現於諸多惡性腫瘤(尤其包含乳癌、胃癌、 子宮內膜癌、頭頸癌及結腸直腸癌)中。與P-鈣黏蛋白表現程度較低或不存在之情形相比，P-鈣黏蛋白在一些乳房腫瘤、子宮內膜腫瘤、卵巢腫瘤、結腸直腸腫瘤及膀胱腫瘤中之過度表現亦與較差預後相關。在乳癌中，P-鈣黏蛋白通常過度表現於高級侵襲性癌瘤中且係基底樣腫瘤之可靠標記物。(例如參見Paredes等人，Br.Can.Res.9：214-226(2007)；Sanders等人，Int.J.Can.79：573-579(1998)；Albergaria等人，Int.J.Dev.Biol.55：811-822(2011)；Sousa等人，Histol.Histopathol.25：963-975(2010))
在某些癌症類型(例如乳癌及卵巢癌)中，P-鈣黏蛋白已知會促進腫瘤細胞之運動性、侵襲性及轉移。(例如參見Cheung等人，Oncogene 30：2964-74(2011)；Ribeiro等人，Oncogene 29：392-402(2010))。
諸多癌症相關過程已知會促進P-鈣黏蛋白mRNA及蛋白質之表現。腫瘤阻抑基因BRCA1經由突變或表現損失之鈍化與乳癌細胞系及患者樣品中增加之P-鈣黏蛋白表現有關。轉錄因子C-EBPβ及抗雌激素ICI182780(氟維司群(fulvestrant))亦已知會使P-鈣黏蛋白表現失調且誘導其在腫瘤細胞中之上調，如同CDH3啟動子經由其他過程之低甲基化。在小泡型橫紋肌肉瘤中，嵌合致癌轉錄因子PAX3-FOXOA1及PAX7-FOXOA1(源自異位)直接誘導P-鈣黏蛋白表現，從而使得腫瘤侵襲性有所增加。(例如參見Albergaria等人，Int.J.Dev.Biol.55：811-822(2011)；Thuault等人，Oncogene 15：1474-86(2012)；Ames等人，Clin.Can.Res.11；4003-11(2005)；Gorski等人，Br.Can.Res.Treat.122：721-31(2010)；Paredes等人，Clin.Can.Res.11：5869-5877(2005)；Albergaria等人，Human Mol.Gen.19：2554-2566(2010))。
抗體藥物結合物
抗體藥物結合物(「ADC」)已用於局部遞送細胞毒性劑以治療癌症(例如參見Lambert,Curr.Opinion In Pharmacology 5：543-549,2005)。ADC容許靶向遞送藥物部分，其中可達成具有最小毒性之最大效能。因更多的ADC展示有前景之臨床結果，故對研發用於癌症療法之新治療劑之需要增加。另外，並非所有製備用於已知癌症靶之治療有效ADC之努力皆已成功。可實現ADC之治療有效性之因素實例包含抗體與結合物之親和力、連接體之可裂解性或穩定性、抗體-藥物結合物之穩定性、抗體藥物結合物聚集之趨勢及結合至每一抗體之藥物/酬載分子之比率(「DAR」或「藥物抗體比率」)。
聚集及缺乏穩定性可增加抗體藥物結合物在臨床環境中發生不良反應之可能性，減小效能，以及增加製備ADCS之成本。
因此，需要治療有效之ADC分子。
本申請案揭示結合人類P-鈣黏蛋白抗體或其抗原結合片段。在一實施例中，該等抗體或其抗原結合片段在一或多個選自SEQ ID NO：126之位置124、125、151、153、154、155、156、159、160、161、162、163、168、170、171及172處之胺基酸之殘基處結合P-鈣黏蛋白。在另一實施例中，該等抗體或其抗原結合片段在SEQ ID NO：126之位置124、125、151、153、154、155、156、159、160、161、162、163、168、170、171及172處之胺基酸處結合人類P-鈣黏蛋白。在一些實施例中，該等抗體或其抗原結合片段包括在一或多個選自SEQ ID NO：126之位置124、151、153-156及172之胺基酸殘基處結合人類P-鈣黏蛋白之重鏈可變區。在另一實施例中，重鏈可變區包括用於人類P-鈣黏蛋白之包括一或多個選自SEQ ID NO：128之位置52、54、56、60、65、105或107之胺基酸殘基的重鏈結合互補位。在又一實施例中，該等抗體包括在一或多個選自SEQ ID NO：126之位置 124、125、155、156、159-163、168、170及171之胺基酸殘基處結合人類P-鈣黏蛋白之輕鏈可變區。在另一實施例中，用於人類P-鈣黏蛋白之輕鏈可變區結合互補位包括一或多個選自SEQ ID NO：129之位置1、2、27、28、30、68、92、93或94胺基酸殘基。在一具體實施例中，該等抗體或其抗原結合片段包括如上文所論述之重鏈可變區及輕鏈可變區。
在其他實施例中，本申請案揭示結合人類P-鈣黏蛋白之抗體或其抗原結合片段，其包括：a)包括SEQ ID NO：1之VH CDR1、SEQ ID NO：2之VH CDR2及SEQ ID NO：3之VH CDR3之重鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：11之VL CDR1、SEQ ID NO：12之VL CDR2及SEQ ID NO：13之VL CDR3之輕鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；b)包括SEQ ID NO：21之VH CDR1、SEQ ID NO：22之VH CDR2及SEQ ID NO：23之VH CDR3之重鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：31之VL CDR1、SEQ ID NO：32之VL CDR2及SEQ ID NO：33之VL CDR3之輕鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；c)包括SEQ ID NO：41之VH CDR1、SEQ ID NO：42之VH CDR2及SEQ ID NO：43之VH CDR3之重鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：51之VL CDR1、SEQ ID NO：52之VL CDR2及SEQ ID NO：53之VL CDR3之輕鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；d)包括SEQ ID NO：61之VH CDR1、SEQ ID NO：62之VH CDR2及SEQ ID NO：63之VH CDR3之重鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：71之VL CDR1、SEQ ID NO：72之VL CDR2及SEQ ID NO：73之VL CDR3之輕鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；e)包括SEQ ID NO：81之VH CDR1、SEQ ID NO：82之VH CDR2及SEQ ID NO：83之VH CDR3之重鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：91之VL CDR1、SEQ ID NO：92之VL CDR2及SEQ ID NO：93之VL CDR3之輕鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；或f)包括SEQ ID NO：101之VH CDR1、SEQ ID NO：102之VH CDR2及SEQ ID NO：103之VH CDR3之重鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：111之VL CDR1、SEQ ID NO：112之VL CDR2及SEQ ID NO：113之VL CDR3之輕鏈可變區，其中CDR係根據Kabat定義來定義。
本申請案亦揭示結合P-鈣黏蛋白之抗體或其抗原結合片段，其包括：a)包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；b)包括SEQ ID NO：27之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；c)包括SEQ ID NO：47之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：57之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；d)包括SEQ ID NO：67之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：77之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；e)包括SEQ ID NO：87之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：97之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；或f)包括SEQ ID NO：107之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：117之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
在其他實施例中，本申請案揭示結合P-鈣黏蛋白之抗體或其抗原結合片段，其包括：a)包括SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈；b)包括SEQ ID NO：29之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：39之胺基酸序列之輕鏈；c)包括SEQ ID NO：49之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：59之胺基酸序列之輕鏈；d)包括SEQ ID NO：69之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：79之胺基酸序列之輕鏈；e)包括SEQ ID NO：89之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：99之胺基酸序列之輕鏈；或f)包括SEQ ID NO：109之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：119之胺基酸序列之輕鏈。
本申請案另外揭示與本文所揭示抗體結合人類P-鈣黏蛋白之相同表位或與本文所揭示抗體競爭結合人類P-鈣黏蛋白之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，P-鈣黏蛋白抗體或其抗原結合片段係人類或人類化抗體。在其他實施例中，該等抗體或其抗原結合片段係單株抗體。在其他實施例中，該等抗體或其抗原結合片段係單鏈抗體(scFv)。
本申請案亦揭示包括下式之抗體藥物結合物(ADC)：Ab-(L-(D)m)n
或其醫藥上可接受之鹽；其中：Ab係如本文所揭示之P-鈣黏蛋白抗體或其抗原結合片段；L係連接體；D係藥物部分；m係1至8之整數；且n係1至10之整數。在一些 實施例中，m為1。在其他實施例中，n為3或4。
在一些實施例中，ADC之抗體或其抗原結合片段包括：a)包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之VH區及包括SEQ I NO：17之胺基酸序列之VL區；或b)包括SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VH區及包括SEQ ID NO：37之胺基酸序列之VL區。
在另一實施例中，抗體藥物結合物之抗體或其抗原結合片段，其包括：VH區，其包括(a)SEQ ID NO：1之VH CDR1、(b)SEQ ID NO：2之VH CDR2、(c)SEQ ID NO：3之VH CDR3；及VL區，其包括(d)SEQ ID NO：11之VL CDR1、(e)SEQ ID NO：12之VL CDR2及(f)SEQ ID NO：13之VL CDR3，其中CDR係根據Kabat定義來定義；或VH區，其包括(a)SEQ ID NO：21之VH CDR1、(b)SEQ ID NO：22之VH CDR2、(c)SEQ ID NO：23之VH CDR3；及VL區，其包括(d)SEQ ID NO：31之VL CDR1、(e)SEQ ID NO：32之VL CDR2及(f) SEQ ID NO：33之VL CDR3，其中CDR係根據Kabat定義來定義。
在其他實施例中，抗體藥物結合物之抗體或其抗原結合片段包括：a)SEQ ID NO：9之重鏈及SEQ ID NO：19之輕鏈；或b)SEQ ID NO：29之重鏈及SEQ ID NO：39之輕鏈。
在其他實施例中，抗體藥物結合物之連接體係選自由以下組成之群：可裂解連接體、非可裂解連接體、親水性連接體、預帶電荷連接體及基於二羧酸之連接體。在一些實施例中，連接體係衍生自選自由以下組成之群之交聯試劑：3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDP)、4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPP)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDB)、4-(2-吡啶基二硫基)- 2-磺基-丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(磺基-SPDB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIA)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIAB)、馬來醯亞胺PEG NHS、4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸N-磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)及17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十七烷-1-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(CX1-1)。
在一些實施例中，抗體藥物結合物之藥物部分係選自由以下組成之群：V-ATP酶抑制劑、促細胞凋亡劑、Bcl2抑制劑、MCL1抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定劑、奧裡斯他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、類美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫胺酸胺基肽酶)、蛋白質CRM1之核輸出之抑制劑、DPPIV抑制劑、蛋白酶體抑制劑、線粒體中磷醯基轉移反應之抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損害劑、DNA烷基化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝黏合劑及DHFR抑制劑。在其他實施例中，細胞毒性劑係類美登素。在具體實施例中，類美登素係N(2')-去乙醯基-N(2')-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(maytansine)(DM1)或N(2')-去乙醯基-N2-(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。
在一具體實施例中，抗體藥物結合物具有下式：
其中Ab係抗體或其抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：1之重鏈CDR1、SEQ ID NO：2之重鏈CDR2、SEQ ID NO：3之重鏈CDR3及SEQ ID NO：11之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：12之輕鏈CDR2、SEQ ID NO：13之輕鏈CDR3，其中CDR係根據Kabat定義來定義；且n為1至10；或其醫藥上可接受之鹽。
本申請案亦揭示醫藥組合物，其包括如本文所揭示之人類P-鈣黏蛋白抗體或其抗原結合片段或包括該等抗體之抗體藥物結合物及醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，將醫藥組合物製成凍乾物。在其他實施例中，凍乾物包括抗體、其抗原結合片段或該等抗體之抗體藥物結合物、組胺酸、蔗糖及聚山梨醇酯20。在一具體實施例中，醫藥組合物包括約10mg/mL本文所揭示之抗體藥物結合物、20mM組胺酸、240mM蔗糖及0.02%聚山梨醇酯20。
本申請案亦揭示治療有需要之患者之癌症之方法，其包括向該患者投與本文所揭示之抗體藥物結合物或醫藥組合物。在一些實施例中，該方法包括向該患者投與抗體藥物結合物或醫藥組合物與一或多種其他治療化合物之組合。
在其他實施例中，本申請案揭示如本文所揭示之用作醫藥之P-鈣黏蛋白抗體藥物結合物或醫藥組合物。在具體實施例中，抗體藥物結 合物或醫藥組合物係用於治療有需要之患者之癌症。
本文亦揭示如本文所論述之P-鈣黏蛋白抗體或其抗原結合片段或抗體藥物結合物之用途，其用於治療有需要之患者之癌症或用以製造用於治療癌症之醫藥。
在一些實施例中，癌症表現P-鈣黏蛋白。在其他實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎上腺皮質癌瘤、膀胱癌、骨癌、乳癌、中樞神經系統非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胚胎腫瘤、子宮內膜癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、頭頸癌、肝細胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、肝癌、肺癌(包含小細胞肺癌及非小細胞肺癌)、卵巢癌、直腸癌、橫紋肌肉瘤、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌瘤、鱗狀頸癌、胃癌(stomach cancer)、子宮癌、陰道癌及外陰癌、腎上腺皮質癌瘤、膀胱癌、骨癌、乳癌、中樞神經系統非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胚胎腫瘤、子宮內膜癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、頭頸癌、肝細胞癌、卡波西氏肉瘤、肝癌、肺癌(包含小細胞肺癌及非小細胞肺癌)、卵巢癌、直腸癌、橫紋肌肉瘤、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌瘤、鱗狀頸癌、胃癌、子宮癌、陰道癌及外陰癌。在具體實施例中，癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、肺癌及卵巢癌。
本申請案亦揭示編碼如本文所揭示之P-鈣黏蛋白抗體或抗原結合片段之核酸。在具體實施例中，該等核酸包括SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、18、38、58、78、98、118、10、30、50、70、90、110、20、40、60、80、100及120之核苷酸序列。在另一實施例中，本申請案涵蓋包括本文所揭示核酸之載體以及包括本文所揭示載體或核酸之宿主細胞。本發明另外揭示產生P-鈣黏蛋白抗體或抗原結合片段之製程，其包括培養宿主細胞且自培養物回收抗體。
在其他實施例中，本申請案揭示產生抗P-鈣黏蛋白抗體藥物結合物之製程，其包括：(a)以化學方式使SMCC連接至藥物部分DM-1；(b)使該連接體-藥物結合至自申請專利範圍第47項之細胞培養物回收之抗體；及(c)純化抗體藥物結合物。
在另一實施例中，產生抗P-鈣黏蛋白抗體藥物結合物之製程包括：(a)以化學方式使SMCC連接至藥物部分DM-1；(b)使該連接體-藥物結合至如本文所揭示之抗體；及(c)純化抗體藥物結合物。
在一些實施例中，該等該等製程製得之抗體藥物結合物具有約3.8之平均DAR(使用UV分光光度計量測)。
在其他實施例中，使用本文所揭示之抗體或其抗原結合片段作為診斷試劑。在診斷試劑之一些實施例中，使用放射性標記、螢光團、發色團、成像劑或金屬離子標記抗體或其抗原結合片段。
圖1繪示人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2之晶體結構之總體視圖，其展示人類P-鈣黏蛋白之細胞外結構域之前兩個鈣黏蛋白重複結構域，其中具有三個位於結構域-結構域接面處之鈣結合位點。
圖2繪示與兩個人類P-鈣黏蛋白複合以形成不對稱晶體單元之兩個P-鈣黏蛋白抗體Fab之晶體結構之總體視圖。插圖係涉及兩個P-鈣黏蛋白分子之EC1結構域之接觸區之近視圖。在兩個複合物之間僅存在少量晶體接觸。
圖3係繪示接觸P-鈣黏蛋白抗體NOV169N31Q之Fab之殘基之人類P-鈣黏蛋白表位殘基的圖形。人類P-鈣黏蛋白EC1結構域之胺基酸序 列列示於水平軸上。圖形上部展示蛋白質抗原與抗體之間之直接分子間接觸之編號，如藉由程式NCONT使用非氫原子之間4.0Å之截距所鑑別。圖形下部展示在抗體結合後由P-鈣黏蛋白殘基引起之溶劑可達表面減小(以Å2)，如藉由程式AREAIMOL所計算。EC1結構域之β桶狀結構示意性展示為具有對應於β鏈之編號之標記的箭頭串。
圖4繪示人類P-鈣黏蛋白(灰色草圖)之N-末端鈣黏蛋白重複(EC1)結構域之晶體結構之近視圖，其中所有胺基酸殘基皆與以黑條(抗體視圖)展示之抗體(4.0Å截距)相互作用。
圖5繪示人類及食蟹猴(「cyno」；長尾猴(Macaca fascicularis))P-鈣黏蛋白EC1結構域之序列比對。以加粗黑體表示之胺基酸殘基涉及與NOV169N31Q抗體之直接分子間接觸(<4.0Å)。以加粗灰體表示且使用箭頭指示之胺基酸殘基越來越遠，但其溶劑可達表面在抗體結合後經歷減小。應注意，兩種表位殘基在食蟹猴P-鈣黏蛋白中完全保守。
圖6繪示人類鈣黏蛋白之EC1結構域之多重序列比對。應注意，P-鈣黏蛋白亦稱為「鈣黏蛋白-3」。加框殘基位於抗原-抗體界面處，如藉由其溶劑可達表面之減小所測定。以粗線加框者係發現於人類鈣黏蛋白1至4中之插入。應注意，關鍵表位殘基Glu155在其他人類鈣黏蛋白中並不保守。
圖7繪示圖解說明P-鈣黏蛋白抗體NOV169N31Q對P-鈣黏蛋白調介之細胞黏附之效應之顯微照片。在誘導球體形成之前，使用NOV169N31Q或非特異性人類IgG1抗體預處理細胞。藉由顯微術在132hr培育時段之後評價球體之形狀及密度。
圖8繪示圖解說明NOV169N31Q-MCC-DM1在P-鈣黏蛋白陽性(HCC70及HCC1954)及陰性(HT29)細胞系中之活體外細胞毒性效力之圖形。NOV169N31Q-MCC-DM1在(A)HCC1954(P-鈣黏蛋白+)、(B) HCC70(P-鈣黏蛋白+)及(C)HT29(P-鈣黏蛋白-)細胞中之活體外劑量-反應。在使用游離美登素(L-DM1-Me；填充圓)、同種型對照ADC(IgG1-MCC-DM1；空心正方形)、NOV169N31Q-MCC-DM1之抗體組份(NOV169N31Q；空心三角形)及NOV169N31Q-MCC-DM1(填充三角形)處理5天之後量測存活率。
圖9繪示圖解說明NOV169N31Q及NOV169N31Q-MCC-DM1之ADCC活性之圖形。將靶細胞與固定數量之新鮮人類NK效應細胞(效應細胞對靶細胞之比率為5：1)及增加量之NOV169N31Q(實心圓)、IgG1對照抗體(空心圓)、NOV169N31Q-MCC-DM1(實心正方形)或IgG1-SMCC-DM1(空心正方形)一起培育。一式三份運行所有試樣；在24hr之後評價細胞存活率。
圖10繪示一系列圖解說明NOV169N31Q-MCC-DM1 ADC在HCC70三陰性乳癌皮下腫瘤異種移植物模型中之活性之IHC影像。該等影像圖解說明在單一劑量之NOV169N31Q-MC-DM1之後之有絲分裂停滯(p-組蛋白H3)。
圖11A繪示P-鈣黏蛋白在HCC70腫瘤組織上之IHC之代表性影像，其展示P-鈣黏蛋白之表現。
圖11B繪示圖解說明HCC70乳癌異種移植物模型中之各種P-鈣黏蛋白ADC之效能之圖形。
圖12繪示圖解說明NOV169N31Q-MCC-DM1針對HCC70乳癌異種移植物模型之劑量反應效能之圖形。
圖13A繪示P-鈣黏蛋白在HCC1954腫瘤組織上之IHC之代表性影像，其展示P-鈣黏蛋白之表現。
圖13B係圖解說明NOV169N31Q-MCC-DM1在HCC1954乳癌異種移植物模型中之效能之圖形。
圖13C係圖解說明NOV169N31Q-MCC-DM1在HCC1954乳癌異種 移植物模型中之效能之圖形。
圖13D係繪示HCC1954乳癌異種移植物小鼠因應於使用NOV169N31Q-MCC-DM1治療之體重變化之圖形。
圖14A繪示P-鈣黏蛋白在BICR6腫瘤組織上之IHC之代表性影像，其展示P-鈣黏蛋白之表現。
圖14B繪示圖解說明NOV169N31Q-MCC-DM1在BICR6頭頸癌異種移植物模型中之效能之圖形。
圖15A繪示P-鈣黏蛋白在scaBER腫瘤組織上之IHC之代表性影像，其展示P-鈣黏蛋白之表現。
圖15B繪示圖解說明NOV169N31Q-MCC-DM1在scaBER膀胱癌異種移植物模型中之效能之圖形。
圖16繪示圖解說明NOV169N31Q-MCC-DM1在HuPrime ED2267食道癌異種移植物模型中之效能之圖形。
圖17繪示比較使用兩種不同連接體(MCC對CX1-1)結合至DM1之抗P-鈣黏蛋白NEG0067抗體在HCC70乳癌異種移植物模型中之效能之圖形。
圖18繪示比較使用SPDB-DM4連接體-酬載結合之3種鼠類雜交瘤源抗P-鈣黏蛋白ADC在HCC70乳癌異種移植物模型中之效能之圖形。
定義
除非另外陳述，否則本文所用之下列術語及片語意欲具有下列含義：術語「烷基」係指具有指定碳原子數之單價飽和烴鏈。舉例而言，C1-6烷基係指具有1至6個碳原子之烷基。烷基可為直鏈或具支鏈。代表性具支鏈烷基具有一個、兩個或三個支鏈。烷基之實例包含但不限於甲基、乙基、丙基(正丙基及異丙基)、丁基(正丁基、異丁 基、第二丁基及第三丁基)、戊基(正戊基、異戊基及新戊基)及己基。
本文所用之術語「抗體」係指免疫球蛋白家族中能夠以非共價方式、可逆地且以特定方式結合相應抗原之多肽。舉例而言，天然IgG抗體係包括由二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈之四聚體。每一重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個結構域：CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域(CL)。可將VH及VL區進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及更保守之區(稱為架構區(FR))，二者間雜排列。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，其自胺基末端至羧基末端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恆定區可調介免疫球蛋白與宿主組織或因子(包含免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組份(C1q))的結合。
術語「抗體」包含但不限於單株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體及抗獨特型(抗Id)抗體(包含(例如)抗Id抗體至本發明抗體)。抗體可為任何同種型/種類(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)及亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。
「互補決定結構域」或「互補決定區」(「CDR」)可互換地係指VL及VH之超變區。CDR係抗體鏈中具有用於該靶蛋白之特異性之靶蛋白結合位點。在每一人類VL或VH中存在三個CDR(CDR1-3，自N-末端依次編號)，其構成可變結構域之約15-20%。CDR在結構上與靶蛋白之表位互補且由此直接負責結合特異性。VL或VH之剩餘片段(所謂的架構區)展現較小之胺基酸序列變化(Kuby,Immunology，第4版，第4章，W.H.Freeman & Co.,New York,2000)。
可使用業內之各種熟知定義(例如Kabat、Chothia、國際 ImMunoGeneTics數據庫(IMGT)(在全球資訊網上之www.imgt.org/)及AbM(例如參見Johnson等人，Nucleic Acids Res.,29：205-206(2001)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature,342：877-883(1989)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,227：799-817(1992)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.,273：927-748(1997)))測定CDR及架構區之位置。抗原組合位點之定義亦闡述於下列文獻中：Ruiz等人，Nucleic Acids Res.,28：219-221(2000)；及Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29：207-209(2001)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.,262：732-745(1996)；及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：9268-9272(1989)；Martin等人，Methods Enzymol.,203：121-153(1991)；及Rees等人，In Sternberg M.J.E.(編輯)，Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。
將輕鏈及重鏈分成具有結構及功能同源性之區。術語「恆定」及「可變」根據功能使用。就此而言，應瞭解，輕(VL)鏈及重(VH)鏈部分之可變結構域決定抗原識別及特異性。與之相反，輕鏈(CL)及重鏈(CH1、CH2或CH3)之恆定結構域賦予重要生物性質，例如分泌、經胎盤運動性、Fc受體結合、補體結合及諸如此類。按照慣例，恆定區結構域之編號隨著其變得更加遠離抗體之抗原結合位點或胺基-末端而增加。N-末端係可變區且C-末端係恆定區；CH3及CL結構域實際上分別包括重鏈及輕鏈之羧基-末端結構域。
本文所用之術語「抗原結合片段」係指抗體中保留與(例如藉由結合、空間阻礙、穩定/去穩定、空間分佈)抗原之表位特異性相互作用之能力之一或多個部分。結合片段之實例包含但不限於單鏈Fv(scFv)、駱駝科動物抗體、二硫化物連接之Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段、由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；F(ab)2片段、包括兩個在鉸鏈區處由二硫化物橋連接之Fab片段之二價片段； 由VH及CH1結構域組成之Fd片段；由抗體之單一臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546,1989)，其由VH結構域組成；及分離互補決定區(CDR)或抗體之其他表位結合片段。
另外，儘管Fv片段之兩個結構域(VL及VH)係由單獨基因編碼，但可使用重組方法藉由合成連接體使該兩個結構域結合在一起，該合成連接體使該兩個結構域能夠形成VL及VH區配對形成單價分子的單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(「scFv」)；例如參見Bird等人，1988 Science 242：423-426；及Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語「抗原結合片段」內。該等抗原結合片段係使用彼等熟習此項技術者已知之習用技術來獲得，且該等片段經篩選以與完整抗體相同之方式使用。
抗原結合片段亦可納入單一結構域抗體、最大抗體、微小抗體、單一結構域抗體、內抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、v-NAR及雙scFv中(例如參見Hollinger及Hudson,Nature Biotechnology 23：1126-1136,2005)。抗原結合片段可接枝至基於多肽(例如III型纖連蛋白(Fn3))之支架中(參見美國專利第6,703,199號，其闡述纖連蛋白多肽單抗體)。
抗原結合片段可納入包括一對串聯Fv片段(VH-CH1-VH-CH1，其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區)之單鏈分子中(Zapata等人，Protein Eng.8：1057-1062,1995；及美國專利第5,641,870號)。
本文所用之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指具有實質上相同胺基酸序列或衍生自相同基因來源之多肽(包含抗體及抗原結合片段)。此術語亦包含單一分子組合物之抗體分子之製劑。單株抗體組合物展示針對特定表位之單一結合特異性及親和力。
本文所用之術語「人類抗體」包含具有可變區之抗體，在該等 可變區中架構區及CDR區二者皆衍生自人類來源之序列。另外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦衍生自該等人類序列，例如人類胚原(germline)序列或人類胚原序列之突變形式或含有衍生自人類架構序列分析之共有架構序列的抗體(例如如Knappik等人，J.Mol.Biol.296：57-86,2000中所闡述)。亦包含衍生自一或多個CDR已針對親和力成熟或製造/酬載結合目的發生突變之人類序列之抗體。參見Hybridoma.1997年8月；16(4)：381-9.Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS.Kilpatrick KE,Wring SA,Walker DH,Macklin MD,Payne JA,Su JL,Champion BR,Caterson B,McIntyre GD.Department of Molecular Sciences,Glaxo Wellcome,Research Triangle Park,NC 27709,USA。
本發明之人類抗體可包含並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機誘變或定點誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變或用於促進穩定性或製造之保守取代)。
本文所用之術語「識別」係指發現表位且與其相互作用(例如結合，不論該表位係線性抑或構型)之抗體或其抗原結合片段。術語「表位」係指抗原上與本發明之抗體或抗原結合片段特異性結合之位點。表位可自鄰接胺基酸或由蛋白質之三級摺疊並置之非鄰接胺基酸形成。在暴露於變性溶劑時，通常保留自鄰接胺基酸形成之表位，而在使用變性溶劑處理時通常損失由三級摺疊形成之表位。在獨特空間構型中，表位通常包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。確定表位之空間構型之方法包含業內技術，例如x射線結晶學及2維核磁共振(例如參見Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris編輯，(1996))。
本文所用之術語「親和力」係指單一抗原性位點處抗體與抗原之間之相互作用強度。在每一抗原性位點內，抗體「臂」之可變區經 由弱的非共價力在多個位點處與抗原相互作用；相互作用愈大，則親和力愈強。
術語「分離抗體」係指實質上不含其他具有不同抗原性特異性之抗體之抗體。然而，特異性結合一種抗原之分離抗體可與其他抗原具有交叉反應性。另外，分離抗體實質上可不含其他細胞材料及/或化學品。
術語「相應人類胚原(germline)序列」係指與所有其他由人類胚原免疫球蛋白可變區序列編碼之已知可變區胺基酸序列相比，核酸序列編碼與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高測定胺基酸序列一致性之人類可變區胺基酸序列或子序列。相應人類胚原序列亦可係指與所有其他所評估可變區胺基酸序列相比與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列一致性之人類可變區胺基酸序列或子序列。相應人類胚原序列可為僅架構區、僅互補決定區、架構及互補決定區、可變區段(如上文所定義)或包括可變區之序列或子序列之其他組合。可使用本文所闡述之方法(例如使用BLAST、ALIGN比對兩個序列或業內已知之另一比對算法)來測定序列一致性。相應人類胚原核酸或胺基酸序列可與參考可變區核酸或胺基酸序列具有約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性。可(例如)經由公開可用之國際ImMunoGeneTics數據庫(IMGT)(在全球資訊網上之www.imgt.org/)及V-base(在全球資訊網上之vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)來測定相應人類胚原序列。
在用於闡述抗原(例如蛋白質)與抗體、抗體片段或抗體源結合劑之間之相互作用之背景中時，片語「特異性結合」或「選擇性結合」係指決定抗原在蛋白質異質群體及其他生物產品中(例如在生物試樣(例如血液、血清、血漿或組織試樣)中)之存在之結合反應。因此，在某些指定免疫分析條件下，具有特定結合特異性之抗體或結合劑至少 兩倍於背景結合特定抗原且並不實質上以顯著量結合存在於試樣中之其他抗原。在一實施例中，在指定免疫分析條件下，具有特定結合特異性之抗體或結合劑至少十(10)倍於背景結合特定抗原且並不實質上以顯著量結合存在於試樣中之其他抗原。在該等條件下特異性結合抗體或結合劑可需要經選擇具有用於特定蛋白質之特異性之抗體或藥劑。如期望或適當，則可藉由剔除與來自其他物種(例如小鼠或大鼠)或其他亞型之分子交叉反應之抗體來達成此選擇。另一選擇為，在一些實施例中，選擇與某些期望分子交叉反應之抗體或抗體片段。
可使用多種免疫分析格式選擇與特定蛋白特異性免疫反應之抗體。舉例而言，固相ELISA免疫分析通常用於選擇與蛋白質特異性免疫反應之抗體(例如參見Harlow及Lane，Using Antibodies，A Laboratory Manual(1998)，其闡述可用於測定特異性免疫反應之免疫分析格式及條件)。通常，特異性或選擇性結合反應將產生至少兩倍於背景信號及更通常至少10至100倍於背景之信號。
術語「平衡解離常數(KD,M)」係指解離速率常數(kd，時間-1)除以締合速率常數(ka，時間-1，M-1)。可使用業內已知之任一方法量測平衡解離常數。本發明抗體通常具有小於約10-7或10-8M、例如小於約10-9M或10-10M、在一些實施例中小於約10-11M、10-12M或10-13M之平衡解離常數。
術語「生物可用性」係指給定量之投與患者之藥物之全身性可用性(亦即血液/血漿濃度)。生物可用性係指示自投與劑型達成一般循環之藥物之時間(速率)及總量(程度)之量度的絕對術語。
如本文中所使用，片語「基本上由......組成」係指方法或組合物中所包含活性醫藥藥劑之類或種以及任一對於方法或組合物之預期目的為惰性之賦形劑。在一些實施例中，片語「基本上由......組成」明確排除包含一或多種除本發明之抗體藥物結合物外之其他活性劑。在 一些實施例中，片語「基本上由......組成」明確排除包含一或多種除本發明之抗體藥物結合物外之其他活性劑及第二共投與藥劑。
術語「胺基酸」係指天然、合成及非天然胺基酸以及以類似於天然胺基酸之方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸係彼等藉由基因代碼編碼者以及彼等經稍後修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然胺基酸具有相同基本化學結構(亦即與氫、羧基、胺基及R基團結合之α-碳)之化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有不同於胺基酸通常化學結構之結構但以類似於天然胺基酸之方式起作用的化學化合物。
術語「保守修飾變體」適用於胺基酸序列及核酸序列二者。就特定核酸序列而言，經保守修飾之變體係指彼等編碼一致或基本上一致之胺基酸序列之核酸，或在該核酸不編碼胺基酸序列之情況下係指基本上一致之序列。由於基因代碼之簡並性，大量功能相同之核酸編碼任一給定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸由密碼子指定之每一情形下，可在不改變所編碼多肽下將該密碼子改變成所述之任一相應密碼子。該核酸變化為「沉默變化」，其係保守修飾變化之一種。本文中編碼多肽之每一個核酸序列亦闡述該核酸之每一可能的沉默變化。熟習此項技術者將認識到，核酸中之每一密碼子(AUG(其通常為甲硫胺酸之唯一密碼子)及TGG(其通常為色胺酸之唯一密碼子)除外)可經修飾以產生功能相同之分子。因此，編碼多肽之核酸之每一沉默變化暗含於每一所闡述序列中。
對於多肽序列而言，「保守修飾變體」包含多肽序列之個別取 代、缺失或添加，其使得經胺基酸化學類似之胺基酸取代。提供功能類似胺基酸之保守取代已為熟習此項技術者所熟知。該等保守修飾變體亦包括且不排除多態變體、種間同系物及本發明等位基因。下列8個群含有之胺基酸互為保守取代：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天門冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(例如參見Creighton,Proteins(1984))。在一些實施例中，術語「保守序列修飾」用於係指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體之結合特性之胺基酸修飾。
本文所用之術語「最佳化」係指經改變以使用在生產細胞或有機體、通常真核細胞(例如酵母細胞、畢赤酵母屬(Pichia)細胞、真菌細胞、木黴屬(Trichoderma)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中較佳之密碼子編碼胺基酸序列之核苷酸序列。最佳化核苷酸序列經改造以完全或儘可能多地保留最初由起始核苷酸序列編碼之胺基酸序列，亦稱為「親代」序列。
在兩種或更多個核酸或多肽序列之背景中，術語「一致百分比」或「一致性百分比」係指兩種或更多個序列或子序列相同之程度。若兩個序列在所比較區上具有相同胺基酸或核苷酸序列，則其「一致」。若在針對最大對應性在對比窗或指定區中進行比較及比對(如使用下列序列對比算法中之一者或藉由人工比對及目測檢查所量測)時兩個序列具有胺基酸殘基或核苷酸之指定相同百分比(亦即在指定區中或在未指定時在整個序列中具有60%一致性、視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%之一致性)，則兩個序列「實質上相同」。視情況，一致性存在於長度至少為約30個核苷酸(或10個胺基酸)之區中，或更佳地存在於長度為100至500或1000或更 多個核苷酸(或20、50、200或更多個胺基酸)之區中。
就序列對比而言，一個序列通常將作為參考序列與測試序列進行比較。在採用序列對比算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指示子序列坐標，並指定序列算法程式參數。可使用缺省程式參數，或可指定替代參數。然後，序列對比算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
本文所用之「對比窗口」包含對選自由20至600、通常約50至約200、更通常為約100至約150個位置組成之群之多個鄰接位置中任一者的一個區段之參考，在該對比窗口中，序列與具有相同數量鄰接位置之參考序列在兩個序列經過最佳比對後可進行比較。比對對比序列之方法已眾所周知。可(例如)藉由以下方式實施對比序列之最佳比對：Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.2：482c(1970)之局部同源性算法；Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之同源性比對算法；Pearson及Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)之類似性方法探索；電腦化實施該等算法(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)；或人工比對及目測檢查(例如參見Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology,2003)。
適於測定序列一致性及序列類似性百分比之算法之兩個實例係BLAST及BLAST 2.0算法，其分別闡述於Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402,1977；及Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410,1990中。用於實施BLAST分析之軟體可經由National Center for Biotechnology資訊公開獲得。該算法首先涉及藉由鑑別詢問序列中之代碼長度縮寫W來鑑別高評分序列對(HSP)，在代碼與一個資料庫序列中具有相同長度之代碼進行比對時，其將與某一正臨限評分T相匹配或滿足其條件。T稱為相鄰代碼評分臨限值(Altschul等人，見上 文)。該等初始相鄰重複代碼將作為引子以啟動發現含有其之更長HSP的搜索。將重複代碼沿每一序列之兩個方向延伸，儘量能夠使累積比對評分增加。對於核苷酸序列而言，累積評分係使用參數M(匹配殘基對之獎勵評分；始終大於0)及N(不匹配殘基之懲罰評分；始終<0)來計算。對於胺基酸序列而言，使用評分矩陣來計算累積評分。重複代碼在每一方向上之延伸在以下時候將停止：累積比對評分自其所達成之最大值降低了X數量；由於一或多個負評分殘基比對累加而使累積評分變為零或負值；或達到任一序列之端點。BLAST算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列而言)使用之缺省值有代碼長度(W)11、預期值(E)10、M=5、N=-4及兩條鏈之對比值。對於胺基酸序列而言，該BLASTN程式使用之缺省值有代碼長度3及預期值(E)10及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比對(B)50、預期值(E)10、M=5、N=-4及兩條鏈之對比值。
BLAST算法亦對兩個序列之間之類似性實施統計學分析(例如參見Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787,1993)。由BLAST算法提供之一種類似性量度係最小和概率(P(N))，其指示兩個核苷酸或胺基酸序列之間藉由偶爾匹配之概率。舉例而言，若在對比測試核酸與參考核酸時最小和概率小於約0.2、更佳地小於約0.01及最佳地小於約0.001，則該核酸可視為類似於參考序列。
兩個胺基酸序列之間之一致性百分比亦可使用已併入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller之算法(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,1988)、使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來測定。此外，兩個胺基酸序列之間之一致性百分比可使用已納入GCG軟體包(在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453,1970)算法、使用Blossom 62矩陣或 PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。
除上述序列一致性百分比外，兩個核酸序列或多肽實質上相同之另一指示為由第一核酸編碼之多肽與針對由第二核酸編碼之多肽產生之抗體在免疫學上交叉反應，如下文所闡述。因此，該多肽通常與第二多肽實質上相同，舉例而言，其中兩種肽之區別僅在於保守取代。兩個核酸序列實質上相同之另一指示為兩個分子或其補體在嚴格條件下相互雜交，如下文所闡述。兩個核酸序列實質上相同之又一指示為可使用相同引物擴增序列。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用且係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾骨架殘基或鍵之核酸，其係合成的、天然的及非天然的，其具有與參考核酸類似之鍵結性質，且其以係與參考核苷酸類似之方式代謝。該等類似物之實例包含但不限於硫代磷酸酯、磷醯胺化物、磷酸甲酯、對掌性-磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如簡並密碼子取代)、互補序列以及明確指示之序列。具體而言，如下文所詳述，藉由產生一或多個所選(或全部)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧次黃嘌呤核苷殘基取代之序列可達成簡並密碼子取代(Batzer等人，(1991)Nucleic Acid Res.19：5081；Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；及Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes 8：91-98)。
核酸背景中之術語「可操作地連接」係指兩個或更多個多核苷酸(例如DNA)片段之間之功能關係。通常，其係指轉錄調控序列與轉錄序列之功能關係。舉例而言，若啟動子或增強子序列刺激或調節編 碼序列在適當宿主細胞或其他表現系統中之轉錄，則其可操作地連接至編碼序列。通常，可操作地連接至轉錄序列之啟動子轉錄調控序列在物理上與轉錄序列鄰接，亦即其為順式作用。然而，一些轉錄調控序列(例如增強子)無需與其增強轉錄之編碼序列在物理上鄰接或緊鄰。
術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，其係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基係對應天然胺基酸之人造化學模擬物之胺基酸聚合物以及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。除非另外指示，否則特定多肽序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體。
本文所用之術語「抗體藥物結合物」或「免疫結合物」係指抗體或其抗原結合片段與另一藥劑(例如化學治療劑、毒素、免疫治療劑、成像探針及諸如此類)之鏈接。鏈接可為共價鍵或非共價相互作用(例如經由靜電力)。可採用業內已知之各種連接體以形成抗體藥物結合物。另外，抗體藥物結合物可以可自編碼免疫結合物之多核苷酸表現之融合蛋白形式提供。如本文中所使用，「融合蛋白」係指經由連接兩個或更多個最初編碼單獨蛋白質(包含肽及多肽)之基因或基因片段來產生之蛋白質。轉譯融合基因會得到具有源自每一原始蛋白質之功能性質之單一蛋白質。
術語「個體」包含人類及非人類動物。非人類動物包含所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，例如非人類靈長類、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除非在加以指出時，否則術語「患者」或「個體」在本文中可互換使用。
本文所用之術語「細胞毒素」或「細胞毒性劑」係指任一有害於細胞之生長及增殖且可用於減少、抑制或破壞細胞或惡性腫瘤之藥劑。
本文所用之術語「抗癌劑」係指任一可用於治療細胞增殖性病症(例如癌症)之藥劑，包含但不限於細胞毒性劑、化學治療劑、放射療法及放射治療劑、靶定抗癌劑及免疫治療劑。
本文所用之術語「藥物部分」或「酬載」係指結合至本發明之抗體或抗原結合片段之化學部分，且可包含任一治療劑或診斷劑(例如抗癌劑、抗發炎劑、抗感染劑(例如抗真菌劑、抗細菌劑、抗寄生蟲劑、抗病毒劑)或麻醉劑)。舉例而言，藥物部分可為抗癌劑，例如細胞毒素。在某些實施例中，藥物部分係選自V-ATP酶抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定劑、奧裡斯他汀、尾海兔素、類美登素、MetAP(甲硫胺酸胺基肽酶)、蛋白質CRM1之核輸出之抑制劑、DPPIV抑制劑、線粒體中磷醯基轉移反應之抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、蛋白酶體抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損害劑、DNA烷基化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝黏合劑及DHFR抑制劑。業內已知將該等部分中之每一者連接至與本發明之抗體及方法相容之連接體之方法。例如參見Singh等人(2009)Therapeutic Antibodies：Methods and Protocols，第525卷，445-457。此外，酬載可為生物物理探針、螢光團、自旋標記、紅外探針、親和力探針、螯合劑、光譜探針、放射性探針、脂質分子、聚乙二醇、聚合物、自旋標記、DNA、RNA、蛋白質、肽、表面、抗體、抗體片段、奈米顆粒、量子點、脂質體、PLGA顆粒、糖或多糖。
術語「類美登素藥物部分」意指具有類美登素化合物之結構之抗體-藥物結合物之亞結構。美登素首先係自東非灌木齒葉美登木(shrub Maytenus serrata)分離(美國專利第3,896,111號)。隨後發現，某些微生物亦產生類美登素，例如美登醇(maytansinol)及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。已報導合成美登醇及美登醇類似物。參見 美國專利第4,137,230號、第4,248,870號、第4,256,746號、第4,260,608號、第4,265,814號、第4,294,757號、第4,307,016號、第4,308,268號、第4,308,269號、第4,309,428號、第4,313,946號、第4,315,929號、第4,317,821號、第4,322,348號、第4,331,598號、第4,361,650號、第4,364,866號、第4,424,219號、第4,450,254號、第4,362,663號及第4,371,533號及Kawai等人(1984)Chem.Pharm.Bull.3441-3451)，其各自以引用方式明確併入本文中。可用於結合之具體類美登素之實例包含DM1、DM3及DM4。
「腫瘤」係指贅瘤性細胞生長及增殖(無論惡性抑或良性)以及所有癌前期及癌性細胞及組織。
術語「抗腫瘤活性」意指減小腫瘤細胞增殖速率、存活率或轉移活性。舉例而言，抗腫瘤活性可展示為在治療期間所產生異常細胞之生長速率降低或腫瘤大小之穩定性或減小或因療法而與無療法對照相比具有較長存活。可使用活體外或活體內腫瘤模型(包含但不限於異種移植物模型、同種移植物模型、MMTV模型及業內已知用於探究抗腫瘤活性之其他已知模型)來評價該活性。
術語「惡性腫瘤」係指非良性腫瘤或癌症。如本文中所使用，術語「癌症」包含特徵在於失調或不受控細胞生長之惡性腫瘤。實例性癌症包含：癌瘤、肉瘤、白血病及淋巴瘤。
術語「癌症」包含原發性惡性腫瘤(例如彼等細胞並未遷移至個體身體中除原始腫瘤位點外之位點)及繼發性惡性腫瘤(例如彼等源自轉移(腫瘤細胞遷移至不同於原始腫瘤位點之二級位點)者)。
術語「P-鈣黏蛋白」(亦稱為Pcad、PCad或CDH3)係指P-鈣黏蛋白之核酸及胺基酸序列，其已公開於基因庫登記編號：NP_001784、NP_001784.2(胺基酸序列)及NM_001793.4、基因庫登記編號：AA14462、NG_009096及NG_009096.1(核苷酸序列)中。用於人類P- 鈣黏蛋白結構域1-5之序列資訊為細胞外且公開於基因庫登記編號：NM_001793.4及NP_001784中。
「P-鈣黏蛋白」亦係指在全長中與上述基因庫登記編號：NP_001784、NP_001784.2之胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之蛋白質及胺基酸序列。
在結構上，P-鈣黏蛋白核酸序列在其細胞外結構域上與基因庫登記編號：NM_001793.4、基因庫登記編號：AA14462、NG_009096及NG_009096.1之核酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性。
在一實施例中，如本文中所使用，術語「治療」(treat、treating或treatment)任一疾病或病症係指改善該疾病或病症(亦即減緩或阻止或降低該疾病或其至少一種臨床症狀之發展)在另一實施例中，「治療」(treat、treating或treatment)係指緩解或改善至少一種物理參數(包含彼等不能由患者感受者)。在又一實施例中，「治療」(treat、treating或treatment)係指在物理方面調節疾病或病症(例如穩定可感受到之症狀)、在生理學方面調節疾病或病症(例如穩定物理參數)或二者皆有。在又一實施例中，「治療」(treat、treating或treatment)係指預防或延遲疾病或病症之發作或發展或進展。
術語「治療可接受量」或「治療有效劑量」可互換地係指足以實現期望結果(亦即減小腫瘤大小、抑制腫瘤生長、預防轉移、抑制或預防病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染)之量。在一些實施例中，治療可接受量並不誘導或引起不期望副效應。在一些實施例中，治療可接受量誘導或引起副效應，但僅引起彼等在患者病狀方面可由健康護理提供者所接受者。可藉由以下方式來測定治療可接受量：首先投與低劑量，且然後以遞增方式增加該劑量直至達成期望效應為止。本發 明分子之「預防有效劑量」及「治療有效劑量」可分別預防疾病症狀(包含與癌症有關症狀)之發作或降低其嚴重程度。
術語「共投與」係指在個體血液中存在兩種活性劑。可同時或依序遞送共投與之活性劑。
本發明提供結合P-鈣黏蛋白之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)及其藥物結合物(亦即抗體藥物結合物或ADC)。特定而言，本發明提供結合P-鈣黏蛋白且在該結合後內在化之抗體及抗體片段(例如抗原結合片段)。本發明之抗體及抗體片段(例如抗原結合片段)可用於產生抗體藥物結合物。另外，本發明提供具有期望藥物動力學特性及其他期望屬性且由此可用於治療表現P-鈣黏蛋白之癌症之抗體藥物結合物。本發明另外提供包括本發明之抗體藥物結合物之醫藥組合物及製備該等醫藥組合物與使用其治療癌症之方法。
抗體藥物結合物
本發明提供抗體藥物結合物(亦稱為免疫結合物)，其中特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體、抗原結合片段或其功能等效物連接至藥物部分。在一態樣中，本發明之抗體、抗原結合片段或其功能等效物經由共價連接藉由連接體連接至作為抗癌劑之藥物部分。本發明之抗體藥物結合物可選擇性將有效劑量之抗癌劑(例如細胞毒性劑)遞送至表現P-鈣黏蛋白之腫瘤組織，藉此可達成較大選擇性(及較低有效劑量)。
在一態樣中，本發明提供式(I)之免疫結合物：Ab-(L-(D)m)n
其中Ab代表本文所闡述之P-鈣黏蛋白結合抗體；L係連接體；D係藥物部分；m係1至8之整數；且n為1-20之整數。在一實施例中，n為1至10、2至8或2至5之整 數。在一具體實施例中，n為2、3或4。在一些實施例中，m為1；在其他實施例中，m為2、3或4。
儘管對於特定結合物分子而言藥物對抗體比率具有確切值(例如在式(I)中為n乘以m)，但應理解，在用於闡述含有許多分子之試樣時，因一定程度之不均勻性(通常與結合步驟有關)，該值通常為平均值。免疫結合物試樣之平均載量在本文中稱為藥物對抗體比率或「DAR」。在一些實施例中，在藥物係類美登素時，其稱為「MAR」。在一些實施例中，DAR介於約2與約6之間，且通常約為3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0、7.5、8.0。在一些實施例中，至少50重量%之試樣係具有平均DAR±2之化合物，且較佳地至少50%之試樣係含有平均DAR±1之結合物。實施例包含DAR約為3.5、3.6、3.7、3.8或3.9之免疫結合物。在一些實施例中，「約n」之DAR意指DAR之量測值為20% n內。
本發明亦係關於免疫結合物，其包括如本文所揭示連接或結合至藥物部分之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)及其功能等效物。在一實施例中，藥物部分D係類美登素藥物部分，包含彼等具有以下結構者：
其中波浪線指示類美登素之硫原子至抗體藥物結合物之連接體之共價連接。R在每次出現時獨立地係H或C1-C6烷基。將醯胺基團連 接至硫原子之伸烷基鏈可為甲烷基、乙烷基或丙基，亦即m為1、2或3。(美國專利第633,410號、美國專利第5,208,020號，Chari等人(1992)Cancer Res.52；127-131；Lui等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：8618-8623)。
類美登素藥物部分之所有立體異構體皆涵蓋用於本發明免疫結合物，亦即在類美登素之對掌性碳處之R及S構形之任一組合。在一實施例中，類美登素藥物部分具有下列立體化學。
在一實施例中，類美登素藥物部分係N2’-去乙醯基-N 2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(亦稱為DM1)。DM1係由下列結構式代表。
在另一實施例中，類美登素藥物部分係N2’-去乙醯基-N 2'-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(亦稱為DM3)。DM3係由下列結構式代表。
在另一實施例中，類美登素藥物部分係N2’-去乙醯基-N 2'-(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(亦稱為DM4)。DM4係由下列結構式代表。
藥物部分D可經由連接體L連接至抗體Ab。L係能夠使藥物部分與抗體經由共價鍵連接之任一化學部分。交聯試劑係可用於連接藥物部分及抗體以形成抗體藥物結合物之雙功能或多功能試劑。可使用具有能夠結合藥物部分及抗體之反應性官能基之交聯試劑來製備抗體藥物結合物。舉例而言，半胱胺酸、硫醇或胺(例如N-末端或胺基酸側鏈，例如抗體之離胺酸)可與交聯試劑之官能基形成鍵。
在一實施例中，L係可裂解連接體。在另一實施例中，L係非可 裂解連接體。在一些實施例中，L係酸不穩定連接體、光不穩定連接體、肽酶可裂解連接體、酯酶可裂解連接體、二硫鍵可裂解連接體、親水性連接體、預帶電荷連接體或基於二羧酸之連接體。
在藥物部分(例如類美登素)與抗體之間形成非可裂解連接體之適宜交聯試劑在業內已眾所周知，且可形成包括硫原子之非可裂解連接體(例如SMCC)或彼等不含硫原子者。在藥物部分(例如類美登素)與抗體之間形成非可裂解連接體之較佳交聯試劑包括基於馬來醯亞胺基或鹵乙醯基之部分。根據本發明，該等非可裂解連接體可視為衍生自基於馬來醯亞胺基或鹵乙醯基之部分。
包括基於馬來醯亞胺基之部分之交聯試劑包含但不限於N-琥珀醯亞胺基-4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸酯(SMCC)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)、N-琥珀醯亞胺基-4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸酯)(其係SMCC之「長鏈」類似物(LC-SMCC))、κ-馬來醯亞胺基十一烷酸N-琥珀醯亞胺基酯(KMUA)、γ-馬來醯亞胺基丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(GMBS)、ε-馬來醯亞胺基己酸N-琥珀醯亞胺基酯(EMCS)、間-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、N-(-馬來醯亞胺基乙醯氧基)-琥珀醯亞胺酯(AMSA)、琥珀醯亞胺基-6-(β-馬來醯亞胺基丙醯胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀醯亞胺基-4-(對-馬來醯亞胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)、N-(-對-馬來醯亞胺基苯基)異氰酸酯(PMIP)及含有聚乙二醇間隔劑之基於馬來醯亞胺基之交聯試劑(例如MAL-PEG-NHS)。該等交聯試劑形成衍生自基於馬來醯亞胺基之部分在非可裂解連接體。基於馬來醯亞胺基之交聯試劑之代表性結構展示於下文中。
在另一實施例中，連接體L係衍生自N-琥珀醯亞胺基-4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸酯(SMCC)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)或MAL-PEG-NHS。
包括基於鹵乙醯基之部分之交聯試劑包含碘乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIA)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIAB)、溴乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SBA)及3-(溴乙醯胺基)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SBAP)。該等交聯試劑形成衍生自基於鹵乙醯基之部分之非可裂解連接體。基於鹵乙醯基之交聯試劑之代表性結構展示於下文中。
在一實施例中，連接體L係衍生自碘乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIA)或(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIAB)。
在藥物部分(例如類美登素)與抗體之間形成可裂解連接體之適宜交聯試劑在業內已眾所周知。含有二硫化物之連接體係可經由二硫化物交換裂解(可在生理學條件下發生)之連接體。根據本發明，該等可裂解連接體可視為衍生自基於二硫化物之部分。適宜二硫化物交聯試 劑包含N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)及N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)，其結構展示於下文中。該等二硫化物交聯試劑形成衍生自基於二硫化物之部分之可裂解連接體。
N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)，
N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)，
N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)及
N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)。
在一實施例中，連接體L係衍生自N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)。
在藥物部分(例如類美登素)與抗體之間形成帶電連接體之適宜交聯試劑稱為預帶電荷交聯試劑。在一實施例中，連接體L係衍生自預帶電荷交聯試劑CX1-1。CX1-1之結構如下。
17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十七烷-1-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(CX1-1)上文所繪示之每一交聯試劑在交聯試劑之一端含有與抗體之一級胺反應形成醯胺鍵之NHS酯，且在另一端含有與類美登素藥物部分之巰基反應形成硫醚或二硫鍵之馬來醯亞胺基團或吡啶基二硫化物基團。
在一實施例中，本發明結合物係由下列結構式中之任一者代表：
其中：Ab係特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或其抗原結合片段；n(其指示經由與Ab之一級胺形成醯胺鍵來連接Ab之D-L基團之數量)係1至20之整數。在一實施例中，n係1至10、2至8或2至5之整數。在一具體實施例中，n為3或4。
在一實施例中，結合物中藥物(例如DM1或DM4)對抗體之平均莫耳比率(亦即平均n值，亦稱為類美登素抗體比率(MAR))為約1至約10、約2至約8(例如1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、 6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或8.1)、約2.5至約7、約3至約5、約2.5至約4.5(例如約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5)、約3.0至約4.0、約3.2至約4.2或約4.5至5.5(例如約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4或約5.5)。
在本發明之一態樣中，本發明結合物具有實質上較高純度且具有下列特徵中之一或多者：(a)大於約90%(例如大於或等於約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)、較佳地大於約95%之結合物物質係單體，(b)結合物製劑中之未結合連接體含量小於約10%(例如小於或等於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%)(相對於總連接體)，(c)小於10%之結合物物質發生交聯(例如小於或等於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%)，(d)結合物製劑中之游離藥物(例如DM1或DM4)含量小於約2%(例如小於或等於約1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或0%)(相對於總細胞毒性劑之mol/mol)，及/或(e)在儲存後(例如在約1週、約2週、約3週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約1年、約2年、約3年、約4年或約5年之後)，游離藥物(例如DM1或DM4)含量並不發生實質性增加。游離藥物(例如DM1或DM4)含量之「實質性增加」意指在某一儲存時間(例如約1週、約2週、約3週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約1年、約2年、約3年、約4年或約5年)之後，游離藥物(例如DM1或DM4)含量之增加小於約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約 2.0%、約2.2%、約2.5%、約2.7%、約3.0%、約3.2%、約3.5%、約3.7%或約4.0%。
如本文中所使用，術語「未結合連接體」係指以共價方式與衍生自交聯試劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)之連接體連接之抗體，其中該抗體並不經由連接體以共價方式偶合至藥物(例如DM1或DM4)(亦即，「未結合連體」可由Ab-MCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1代表)。
1. 藥物部分
本發明提供特異性結合P-鈣黏蛋白之免疫結合物。本發明之抗體藥物結合物包括結合藥物部分(例如抗癌劑、自體免疫治療劑、抗發炎劑、抗真菌劑、抗細菌劑、抗寄生蟲劑、抗病毒劑或麻醉劑)之抗P-鈣黏蛋白抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效物。可使用業內已知之任一方法使本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效物結合至若干相同或不同藥物部分。
在某些實施例中，本發明免疫結合物之藥物部分係選自由以下組成之群：V-ATP酶抑制劑、促細胞凋亡劑、Bcl2抑制劑、MCL1抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定劑、奧裡斯他汀、尾海兔素、類美登素、MetAP(甲硫胺酸胺基肽酶)、蛋白質CRM1之核輸出之抑制劑、DPPIV抑制劑、Eg5抑制劑、蛋白酶體抑制劑、線粒體中磷醯基轉移反應之抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損害劑、DNA烷基化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝黏合劑及DHFR抑制劑。
在一實施例中，本發明免疫結合物之藥物部分係類美登素藥物部分，例如但不限於DM1、DM3或DM4。
另外，本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效 物可結合至修飾給定生物反應之藥物部分。藥物部分不應解釋為限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為擁有期望生物活性之蛋白質、肽或多肽。該等蛋白質可包含(例如)毒素(例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、去毒假單胞菌(pseudomonas)外毒素、霍亂毒素或白喉類毒素)、蛋白質(例如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、細胞介素、細胞凋亡劑、抗血管生成劑)或生物反應修飾劑(例如淋巴因子)。
在一實施例中，本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效物結合至藥物部分(例如細胞毒素、藥物(例如免疫阻抑劑)或放射性毒素)。細胞毒素之實例包含但不限於紫杉烷(例如參見國際(PCT)專利申請案第WO 01/38318號及第PCT/US03/02675號)、DNA烷基化劑(例如CC-1065類似物)、蒽環抗生素(anthracycline)、土布司音(tubulysin)類似物、多卡米星(duocarmycin)類似物、奧裡斯他汀E、奧裡斯他汀F、類美登素及包括反應性聚乙二醇部分之細胞毒性劑(例如參見Sasse等人，J.Antibiot.(Tokyo),53,879-85(2000)；Suzawa等人，Bioorg.Med.Chem.,8,2175-84(2000)；Ichimura等人，J.Antibiot.(Tokyo),44,1045-53(1991)；Francisco等人，Blood(2003)(印刷公開案之前之電子公開案)、美國專利第5,475,092號、第6,340,701號、第6,372,738號及第6,436,931號、美國專利申請案公開案第2001/0036923 A1號、待決美國專利申請案第10/024,290號及第10/116,053號及國際(PCT)專利申請案第WO 01/49698號)、塔克松(taxon)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、秋水仙素(t.colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D、1-去氫睪甾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。治療劑亦包含(例如)抗代謝物(例如胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、脫落劑(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替派(thiotepa)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、美法侖(meiphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)(順鉑(cisplatin))、蒽環抗生素(例如柔紅黴素(先前為道諾黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如更生黴素(dactinomycin)(先前為放線菌素)、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素及安麯黴素(anthramycin)(AMC))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春花鹼)。(例如參見Seattle Genetics US20090304721)。
可結合本發明之抗體、抗體片段(抗原結合片段)或功能等效物之細胞毒素之其他實例包含多卡米星、卡奇黴素(calicheamicin)、美登素及奧裡斯他汀及其衍生物。
業內已知各種類型之細胞毒素、連接體及使治療劑結合至抗體之方法，例如參見Saito等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne,(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan及Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter及Springer,(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效物亦可結合至放射性同位素以生成細胞毒性放射醫藥(稱為放射免疫結合物)。可結合抗體以用於診斷或治療之放射性同位素之實例包含但不限於碘-131、銦-111、釔-90及鑥-177。業內已確立製備放射免疫結合物之方法。放射免疫結合物之實例市面有售，包含ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)及BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，且可使用類似方法並使用本發明抗體來製備放射免疫結合物。在某些實施例中，大環螯合劑係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N’,N”,N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接體分子連接至抗體。業內通常已知該等連接體分子且闡述於Denardo等人(1998)Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人(1999)Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；及Zimmerman等人(1999)Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50(其各自之全部內容以引用方式併入本文中)中。
本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效物亦可結合至異源蛋白或多肽(或其片段，較佳地結合至至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個胺基酸之多肽)以生成融合蛋白。特定而言，本發明提供包括本文所闡述抗體片段(例如抗原結合片段)(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH結構域、VH CDR、VL結構域或VL CDR)及異源蛋白、多肽或肽之融合蛋白。
可經由基因改組、基序改組、外顯子改組及/或密碼子改組(通稱為「DNA改組」)技術生成其他融合蛋白。可採用DNA改組來改變本發明抗體或其片段(例如具有較高親和力及較低解離速率之抗體或其片段)之活性。通常參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人(1997)Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama,(1998)Trends Biotechnol. 16(2)：76-82；Hansson等人(1999)J.Mol.Biol.287：265-76；及Lorenzo及Blasco,(1998)Biotechniques 24(2)：308-313(該等專利及公開案中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中)。可藉由在重組之前經受隨機誘變(藉由易錯PCR)、隨機核苷酸插入或其他方法來改變抗體或其片段或編碼抗體或其片段。編碼特異性結合抗原之抗體或其片段之多核苷酸可與一或多種異源分子之一或多種組份、基序、區段、部分、結構域、片段等重組。
另外，本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效物可結合至標記物序列(例如肽)以促進純化。在較佳實施例中，標記物胺基酸序列係六組胺酸肽，例如尤其係提供於pQE載體中之標籤(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)，許多係市面有售。如Gentz等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所闡述，舉例而言，六組胺酸提供融合蛋白之便利純化。可用於純化之其他肽標籤包含但不限於血凝素(「HA」)標籤(其對應於衍生自流感血凝素蛋白之表位(Wilson等人(1984)Cell 37：767))及「FLAG」標籤(A.Einhauer等人，J.Biochem.Biophys.Methods 49：455-465,2001)。根據本發明，抗體或抗原結合片段亦可結合至腫瘤穿透肽以增強其效能。
在其他實施例中，本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效物結合至診斷劑或可檢測劑。該等免疫結合物可用於監測或預測疾病或病症之發作、發展、進展及/或嚴重程度以作為臨床測試程序之一部分，例如測定特定療法之效能。可藉由使抗體偶合至可檢測物質來達成該診斷及檢測，該等可檢測物質包含但不限於各種酶，例如但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，例如但不限於鏈黴抗生物素蛋白/生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光材料，例如但不限於Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光材料，例如但不限於魯米諾(luminol)；生物發光材料，例如但不限於螢光素酶、螢光素及水母螢光素；放射性材料，例如但不限於碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、及111In、)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、64Cu、113Sn、及117Sn；及使用各種金屬斷層掃描之正電子發射金屬及非放射性順磁性金屬離子。
本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效物亦可連接至固體載體，此尤其可用於靶抗原之免疫分析或純化。該等固體載體包含但不限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
2. 連接體
如本文中所使用，「連接體」係能夠連接抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或功能等效物與另一部分(例如藥物部分)之任一化學部分。連接體可易於在化合物或抗體保持活性之條件下發生裂解(可裂解連接體)，例如酸誘導裂解、光誘導裂解、肽酶誘導裂解、酯酶誘導裂解及二硫鍵裂解。另一選擇為，連接體可實質上抵抗裂解(例如穩定連接體或非可裂解連接體)。在一些態樣中，連接體係預帶電荷 連接體、親水性連接體或基於二羧酸之連接體。
在一態樣中，本發明中所使用之連接體係衍生自諸如以下等交聯試劑：N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPP)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDB)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIA)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIAB)、馬來醯亞胺PEG NHS、4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸N-磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)或17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十七烷-1-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(CX1-1)。
非可裂解連接體係任一能夠以穩定、共價方式連接藥物(例如類美登素)與抗體之化學部分且並不屬上文針對可裂解連接體所列示之種類。因此，非可裂解連接體實質上抵抗酸誘導裂解、光誘導裂解、肽酶誘導裂解、酯酶誘導裂解及二硫鍵裂解。另外，非可裂解係指連接體中或與連接體相鄰之化學鍵能夠在藥物(例如類美登素)或抗體並不損失其活性之條件下承受由裂解二硫鍵之酸、光不穩定裂解劑、肽酶、酯酶或化學或生理學化合物誘導的裂解。
酸不穩定連接體係可在酸性pH下裂解之連接體。舉例而言，某些細胞內隔室(例如核內體及溶酶體)具有酸性pH(pH 4-5)，且提供適於裂解酸不穩定連接體之條件。
光不穩定連接體係可用於身體表面處及光可達到之許多體腔中之連接體。另外，紅外光可滲透組織。
一些連接體可由肽酶裂解，亦即肽酶可裂解連接體。僅某些肽易於在細胞內部或外部裂解，例如參見Trout等人，79 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,626-629(1982)及Umemoto等人，43 Int.J.Cancer, 677-684(1989)。另外，肽係由α-胺基酸及肽鍵構成，肽鍵在化學上係一種胺基酸之羧酸酯與第二胺基酸之胺基之間的醯胺鍵。其他醯胺鍵(例如羧酸酯與離胺酸之α-胺基之間之鍵)應理解為並非肽鍵且可視為非可裂解。
一些連接體可由酯酶裂解，亦即酯酶可裂解連接體。同樣，僅某些酯可由存在於細胞內部或外部之酯酶裂解。酯係藉由羧酸及醇之縮合形成。簡單酯係使用簡單醇(例如脂肪族醇及小環以及小芳族醇)產生之酯。
預帶電荷連接體係衍生自在納入抗體藥物結合物中之後保留電荷之帶電交聯試劑。預帶電荷連接體之實例可參見US 2009/0274713。
3. ADC之結合及製備
本發明結合物可藉由業內已知之任一方法(例如彼等闡述於美國專利第7,811,572號、第6,411,163號、第7,368,565號及第8,163,888號及美國申請公開案2011/0003969、2011/0166319、2012/0253021及2012/0259100中者)。該等專利及專利申請公開案之全部教示內容以引用方式併入本文中。
單步驟製程
在一實施例中，本發明結合物可藉由單步驟製程製得。該製程包括在適宜pH下於視情況含有一或多種共溶劑之實質上水性介質中組合抗體、藥物及交聯劑。在一實施例中，該製程包括以下步驟：使本發明抗體與藥物(例如DM1或DM4)接觸以形成包括抗體及藥物之第一混合物，且然後使包括抗體及藥物之第一混合物與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在具有pH為約4至約9之溶液中接觸以提供包括(i)結合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游離藥物(例如DM1或DM4)及(iii) 反應副產物之混合物。
在一實施例中，單步驟製程包括使抗體與藥物(例如DM1或DM4)且然後交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在pH約為6或更大(例如約6至約9、約6至約7、約7至約9、約7至約8.5、約7.5至約8.5、約7.5至約8.0、約8.0至約9.0或約8.5至約9.0)之溶液中接觸。舉例而言，本發明製程包括使細胞結合劑與藥物(DM1或DM4)且然後交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在pH為約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.4、約8.5、約8.6、約8.7、約8.8、約8.9或約9.0之溶液中接觸。在一具體實施例中，本發明製程包括使細胞結合劑與藥物(例如DM1或DM4)且然後交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在pH為約7.8(例如pH為7.6至8.0或pH為7.7至7.9)之溶液中接觸。
單步驟製程(亦即使抗體與藥物(例如DM1或DM4)且然後交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接觸)可業內已知之任一適宜溫度下實施。舉例而言，單步驟製程可發生於約20℃或更低溫度(例如約-10℃(前提係(例如)藉由存在用於溶解細胞毒性劑及雙功能交聯試劑之有機溶劑來防止溶液冷凍)至約20℃、約0℃至約18℃、約4℃至約16℃)、室溫(例如約20℃至約30℃或約20℃至約25℃)或升高溫度(例如約30℃至約37℃)下。在一實施例中，單步驟製程發生於約16℃至約24℃(例如約16℃、約17℃、約18℃、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃或約25℃)之溫度下。在另一實施例中，在約15℃或更低溫度(例如約-10℃至約15℃或約0℃至約15℃)之溫度下實施單步驟製程。舉例而言，該製程包括使抗體與藥物(例如DM1或DM4)且然後交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、 SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在約15℃、約14℃、約13℃、約12℃、約11℃、約10℃、約9℃、約8℃、約7℃、約6℃、約5℃、約4℃、約3℃、約2℃、約1℃、約0℃、約-1℃、約-2℃、約-3℃、約-4℃、約-5℃、約-6℃、約-7℃、約-8℃、約-9℃或約-10℃之溫度下接觸，前提係(例如)藉由存在用於溶解交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、磺基-SPDB SPDB或CX1-1)之有機溶劑來防止溶液冷凍。在一實施例中，該製程包括使抗體與藥物(例如DM1或DM4)且然後交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在約-10℃至約15℃、約0℃至約15℃、約0℃至約10℃、約0℃至約5℃、約5℃至約15℃、約10℃至約15℃或約5℃至約10℃之溫度下接觸。在另一實施例中，該製程包括使抗體與藥物(例如DM1或DM4)且然後交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在約10℃(例如8℃至12℃之溫度或9℃至11℃之溫度)之溫度下接觸。
在一實施例中，藉由以下方式來實現上文所闡述之接觸：提供抗體，然後使抗體與藥物(例如DM1或DM4)接觸以形成包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之第一混合物，且然後使包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之第一混合物與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接觸。舉例而言，在一實施例中，在反應器皿中提供抗體，向反應器皿中添加藥物(例如DM1或DM4)(由此接觸抗體)，且然後向包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物中添加交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)(由此接觸包括抗體及藥物之混合物)。在一實施例中，在反應器皿中提供抗體，且在向器皿中提供抗體後立即向反應器皿中添加藥物(例如DM1或DM4)。在另一實施例中，在反應器皿中提供抗體，且在向器皿中提供抗體後一定時間間隔(例如在向空間中提供細胞結合劑之後約5分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分 鐘、約1小時、約1天或更長時間)之後向反應器皿中添加藥物(例如DM1或DM4)。可迅速(亦即在短時間間隔內，例如約5分鐘、約10分鐘)或緩慢(例如藉由使用幫浦)添加藥物(例如DM1或DM4)。
然後可使包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在使抗體與藥物(例如DM1或DM4)接觸之後立即或在使抗體與藥物(例如DM1或DM4)接觸之後某一稍後時間點(例如約5分鐘至約8小時或更長時間)接觸。舉例而言，在一實施例中，在向包括抗體之反應器皿中添加藥物(例如DM1或DM4)之後立即將交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)添加至包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物中。另一選擇為，可在使抗體與藥物(例如DM1或DM4)接觸之後約5分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時或更長時間使包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接觸。
在使包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接觸之後，使反應進行約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、或更長時間(例如約30小時、約35小時、約40小時、約45小時或約48hr)。
在一個實施例中，一步驟製程進一步包括淬滅步驟以將任何未反應藥物(例如DM1或DM4)及/或未反應交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)淬滅。淬滅步驟通常在純化結合物之前實施。在一個實施例中，藉由使混合物與淬滅試劑接觸來將混 合物淬滅。如本文中所使用，「淬滅試劑」係指與游離藥物(例如DM1或DM4)及/或交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反應之試劑。在一個實施例中，可使用馬來醯亞胺或鹵乙醯胺淬滅試劑(例如4-馬來醯亞胺基丁酸、3-馬來醯亞胺基丙酸、N-乙基馬來醯亞胺、碘乙醯胺或碘乙醯胺基丙酸)以確保藥物(例如DM1或DM4)中之任何未反應基團(例如硫醇)淬滅。淬滅步驟可幫助防止藥物(例如DM1)二聚合。二聚合DM1可能難以去除。在使用極性之帶電硫醇淬滅試劑(例如4-馬來醯亞胺基丁酸或3-馬來醯亞胺基丙酸)淬滅時，過量未反應DM1轉化成極性之帶電水溶性加合物，其可在純化步驟期間容易地自共價連接之結合物分離。亦可使用非極性及中性硫醇淬滅試劑進行淬滅。在一個實施例中，藉由使混合物接觸與未反應交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反應之淬滅試劑來淬滅混合物。舉例而言，可向混合物中添加親核劑以淬滅任何未反應SMCC。親核劑較佳係含胺基之親核劑，例如離胺酸、牛磺酸及羥基胺。
在一較佳實施例中，在使混合物與淬滅試劑接觸之前，使反應(亦即使抗體與藥物(例如DM1或DM4)且然後交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接觸)進行完全。就此而言，在使包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接觸之後約1小時至約48小時(例如約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時或約25小時至約48小時)向混合物中添加淬滅試劑。
另一選擇為，藉由將混合物pH降低至約5.0(例如4.8、4.9、5.0、 5.1或5.2)來淬滅混合物。在另一實施例中，藉由將pH降低至小於6.0、小於5.5、小於5.0、小於4.8、小於4.6、小於4.4、小於4.2、小於4.0來淬滅混合物。另一選擇為，將pH降低至約4.0(例如3.8、3.9、4.0、4.1或4.2)至約6.0(例如5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)、約4.0至約5.0、約4.5(例如4.3、4.4、4.5、4.6或4.7)至約5.0。在一實施例中，藉由將混合物pH降低至4.8來淬滅混合物。在另一實施例中，藉由將混合物pH降低至5.5來淬滅混合物。
在一實施例中，單步驟製程進一步包括自抗體釋放不穩定結合之連接體之保溫步驟。保溫步驟包括在純化結合物之前(例如在反應步驟之後、在反應步驟與淬滅步驟之間或在淬滅步驟之後)將混合物保溫。舉例而言，該製程包括：(a)使抗體與藥物(例如DM1或DM4)接觸以形成包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物；且然後使包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)之混合物在pH為約4至約9之溶液中接觸以提供包括(i)結合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游離藥物(例如DM1或DM4)及(iii)反應副產物之混合物，(b)將在步驟(a)中製得之混合物保溫以自細胞結合劑釋放不穩定結合連接體，及(c)純化混合物以提供純化結合物。
在另一實施例中，該製程包括：(a)使抗體與藥物(例如DM1或DM4)接觸以形成包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物；且然後使包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在pH為約4至約9之溶液中接觸以提供包括(i)結合物、(ii)游離藥物(例如DM1或DM4)及(iii)反應副產物之混合物，(b)將在步驟(a)中製得之混合物淬滅以淬滅任何未反應藥物(例如DM1或DM4)及/或未反應交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)，(c)將在步驟(b)中製得之 混合物保溫以自細胞結合劑釋放不穩定結合之連接體，及(d)純化混合物以提供純化結合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)。
另一選擇為，保溫步驟可在純化結合物之後實施，隨後進行額外純化步驟。
在一較佳實施例中，在保溫步驟之前使反應進行完全。就此而言，在使包括抗體及藥物(例如DM1或DM4)之混合物與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接觸之後，可實施保溫步驟約1小時至約48小時(例如約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時或約24小時至約48小時)。
保溫步驟包括將溶液維持於適宜溫度(例如約0℃至約37℃)下適宜時間段(例如約1小時至約1週、約1小時至約24小時、約1小時至約8小時或約1小時至約4小時)以自抗體釋放不穩定結合之連接體，而並不自抗體實質上釋放穩定結合之連接體。在一實施例中，保溫步驟包括將溶液維持於約20℃或更低溫度(例如約0℃至約18℃、約4℃至約16℃)、室溫(例如約20℃至約30℃或約20℃至約25℃)或升高溫度(例如約30℃至約37℃)下。在一實施例中，保溫步驟包括將溶液維持於約16℃至約24℃(例如約15℃、約16℃、約17℃、約18℃、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃或約25℃)之溫度下。在另一實施例中，保溫步驟包括將溶液維持於約2℃至約8℃(例如約0℃、約1℃、約2℃、約3℃、約4℃、約5℃、約6℃、約7℃、約8℃、約9℃或約10℃)之溫度下。在另一實施例中，保溫步驟包括將溶液維持於約37℃(例如約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39 ℃或約40℃)之溫度下。
保溫步驟之持續時間取決於實施保溫步驟之溫度及pH。舉例而言，可藉由在升高溫度下實施保溫步驟來實質上減小保溫步驟之持續時間，其中最大溫度受限於細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之穩定性。保溫步驟可包括將溶液維持約1小時至約1天(例如約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約22小時或約24小時)、約10小時至約24小時、約12小時至約24小時、約14小時至約24小時、約16小時至約24小時、約18小時至約24小時、約20小時至約24小時、約5小時至約1週、約20小時至約1週、約12小時至約1週(例如約12小時、約16小時、約20小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天)或約1天至約1週。
在一實施例中，保溫步驟包括將溶液在約2℃至約8℃之溫度下維持至少約12小時且至多一週之時段。在另一實施例中，保溫步驟包括將溶液在約2℃至約8℃之溫度下維持過夜(例如約12小時至約24小時、較佳地約20小時)。
用於保溫步驟之pH值較佳為約4至約10。在一實施例中，用於保溫步驟之pH值為約4或更高但小於約6(例如4至5.9)或約5或更高但小於約6(例如5至5.9)。在另一實施例中，用於保溫步驟之pH值介於約6至約10之間(例如約6.5至約9、約6至約8)。舉例而言，用於保溫步驟之pH值可為約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5或約10。
在具體實施例中，保溫步驟可包括將混合物在25℃下於約6-7.5之pH下培育約12小時至約1週，將混合物在4℃下於約4.5-5.9之pH下培育約5小時至約5天，或將混合物在25℃下於約4.5-5.9之pH下培育約 5小時至約1天。
單步驟製程可視情況包含向反應步驟中添加蔗糖以增加結合物之溶解性及回收率。期望地，以約0.1%(w/v)至約20%(w/v)(例如約0.1%(w/v)、1%(w/v)、5%(w/v)、10%(w/v)、15%(w/v)或20%(w/v))之濃度添加蔗糖。較佳地，以約1%(w/v)至約10%(w/v)(例如約0.5%(w/v)、約1%(w/v)、約1.5%(w/v)、約2%(w/v)、約3%(w/v)、約4%(w/v)、約5%(w/v)、約6%(w/v)、約7%(w/v)、約8%(w/v)、約9%(w/v)、約10%(w/v)或約11%(w/v))之濃度添加蔗糖。此外，反應步驟亦可包括添加緩衝劑。可使用業內已知之任一適宜緩衝劑。適宜緩衝劑包含(例如)檸檬酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑及磷酸鹽緩衝劑。在一實施例中，緩衝劑係選自由以下組成之群：HEPPSO(N-(2-羥乙基)六氫吡嗪-N'-(2-羥基丙烷磺酸))、POPSO(去水六氫吡嗪-1,4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸))、HEPES(4-(2-羥乙基)六氫吡嗪-1-乙烷磺酸)、HEPPS(EPPS)(4-(2-羥乙基)六氫吡嗪-1-丙烷磺酸)、TES(N-[叁(羥甲基)甲基]-2-胺基乙烷磺酸)及其組合。
在一實施例中，單步驟製程可進一步包括純化混合物以提供純化結合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)之步驟。可使用業內已知之任一純化方法來純化本發明結合物。在一實施例中，使用切向流過濾(TFF)、非吸附層析、吸附層析、吸附過濾、選擇性沈澱或任一其他適宜純化製程以及其組合來純化本發明結合物。在另一實施例中，在對結合物實施上文所闡述之純化製程之前，首先經由一或多個PVDF膜過濾結合物。另一選擇為，在對結合物實施上文所闡述之純化製程之後，經由一或多個PVDF膜過濾結合物。舉例而言，在一實施例中，經由一或多個PVDF膜過濾結合物且然後使用切向流過濾純化。另一選擇為，使用切向流過濾純化結合物且然後經由一或多個PVDF膜過濾。
可利用任一適宜TFF系統來進行純化，包含Pellicon型系統(Millipore,Billerica,MA)、Sartocon Cassette系統(Sartorius AG,Edgewood,NY)及Centrasette型系統(Pall公司，East Hills,NY)。
可利用任一適宜吸附層析樹脂進行純化。較佳吸附層析樹脂包含羥基磷灰石層析、疏水性電荷誘導層析(HCIC)、疏水性相互作用層析(HIC)、離子交換層析、混合模式離子交換層析、固定化金屬親和層析(IMAC)、染料配體層析、親和層析、反相層析及其組合。適宜羥基磷灰石樹脂之實例包含陶瓷羥基磷灰石(CHT I型及II型，Bio-Rad實驗室，Hercules,CA)、HA Ultrogel羥基磷灰石(Pall公司，East Hills,NY)及陶瓷氟磷灰石(CFT I型及II型，Bio-Rad實驗室，Hercules,CA)。適宜HCIC樹脂之實例係MEP Hypercel樹脂(Pall公司，East Hills,NY)。適宜HIC樹脂之實例包含丁基-瓊脂糖、己基-瓊脂糖、苯基-瓊脂糖及辛基-瓊脂糖樹脂(其皆來自GE Healthcare,Piscataway,NJ)以及Macro-prep甲基及Macro-Prep第三丁基樹脂(Biorad實驗室，Hercules,CA)。適宜離子交換樹脂之實例包含SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖及Q-瓊脂糖樹脂(其皆來自GE Healthcare,Piscataway,NJ)及Unosphere S樹脂(Bio-Rad實驗室，Hercules,CA)。適宜混合模式離子交換劑之實例包含Bakerbond ABx樹脂(JT Baker,Phillipsburg NJ)。適宜IMAC樹脂之實例包含螯合瓊脂糖樹脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)及Profinity IMAC樹脂(Bio-Rad實驗室，Hercules,CA)。適宜染料配體樹脂之實例包含藍色瓊脂糖樹脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)及Affi-gel藍色樹脂(Bio-Rad實驗室，Hercules,CA)。適宜親和力樹脂之實例包含蛋白質A瓊脂糖樹脂(例如MabSelect,GE Healthcare,Piscataway,NJ)及凝集素親和力樹脂(例如扁豆凝集素瓊脂糖樹脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ))，其中抗體擁有適當凝集素結合位點。適宜反相樹脂之實例包含C4、C8及C18樹脂(Grace Vydac,Hesperia, CA)。
可利用適宜非吸附層析樹脂進行純化。適宜非吸附層析樹脂之實例包含但不限於SEPHADEXTM G-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM樹脂(例如S-200及S-300)、SUPERDEXTM樹脂(例如SUPERDEXTM 75及SUPERDEXTM 200)、BIO-GEL®樹脂(例如P-6、P-10、P-30、P-60及P-100)及其他為彼等熟習此項技術者所習知者。
兩步驟製程及一鍋式製程
在一實施例中，可如美國專利7,811,572及美國專利申請案公開案第2006/0182750號中所闡述來製備本發明結合物。該製程包括以下步驟：(a)使本發明抗體與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接觸以以共價方式連接連接體(亦即Ab-SMCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1)與抗體且由此製備包括結合有連接體之抗體之第一混合物；(b)視情況對第一混合物實施純化製程以製備結合有連接體之抗體之經純化第一混合物；(c)藉由使結合有連接體之抗體與藥物(例如DM1或DM4)在pH為約4至約9之溶液中進行反應來使藥物(例如DM1或DM4)與第一混合物中之結合有連接體之抗體結合以製備包括(i)結合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游離藥物(例如DM1或DM4)及(iii)反應副產物之第二混合物；及(d)對第二混合物實施純化製程以自第二混合物之其他組份純化結合物。另一選擇為，可刪除純化步驟(b)。可使用本文所闡述之任一純化方法進行步驟(b)及(d)。在一實施例中，使用TFF進行步驟(b)及(d)。在另一實施例中，使用TFF進行步驟(b)且使用吸收層析(例如CHT)進行步驟(d)。
單步驟試劑及原位製程
在一實施例中，可藉由以下方式來製備本發明結合物：使預形成藥物-連接體化合物(例如SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB- DM4或CX1-1-DM1)與本發明抗體結合，如美國專利6,441,163及美國專利申請案公開案第2011/0003969號及第2008/0145374號中所闡述，隨後進行純化步驟。可使用本文所闡述之任一純化方法。藉由使藥物(例如DM1或DM4)與交聯劑(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)進行反應來製備藥物-連接體化合物。視情況在結合至抗體之前對藥物-連接體化合物(例如SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4或CX1-1-DM1)實施純化。
抗P-鈣黏蛋白抗體
本發明提供特異性結合人類P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)。本發明之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包含但不限於如實例中所闡述進行分離之人類單株抗體或其片段。
在某些實施例中，本發明提供特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)，該等抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括具有SEQ ID NO：7、27、47、67、87或107之胺基酸序列之VH結構域。在某些實施例中，本發明亦提供特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)，該等抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括具有表1(見下文)中所列示VH CDR中之任一者之胺基酸序列之VH CDR。在特定實施例中，本發明提供特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)，該等抗體包括一個、兩個、三個、四個、五個或更多個具有表1(見下文)中所列示VH CDR中之任一者之胺基酸序列之VH CDR(或另一選擇為由其組成)。
本發明提供特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)，該等抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括具有SEQ ID NO：17、37、57、77、97或117之胺基酸序列之VL結構域。本發明亦提供特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)，該等抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括具有表1(見下文) 中所列示VL CDR中之任一者之胺基酸序列之VL CDR。特定而言，本發明提供特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)，該等抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括一個、兩個、三個或更多個具有表1(見下文)中所列示VL CDR中之任一者之胺基酸序列之VL CDR(或另一選擇為由其組成)。
本發明之其他抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包含已發生突變但在CDR區中與表1中所闡述序列中所繪示之CDR區具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性之胺基酸。在一些實施例中，該等抗體包括突變體胺基酸序列，其中在CDR區中不超過1、2、3、4或5胺基酸與表1中所闡述序列中所繪示之CDR區相比發生突變。
本發明亦提供編碼特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體之VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈之核酸序列。可最佳化該等核酸序列以表現於乳動物細胞中。
本發明之其他抗體包含彼等胺基酸或編碼胺基酸之核酸已發生突變但與表1中所闡述之序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性者。在一些實施例中，1、2、3、4或5個胺基酸在可變區中與表1中所闡述序列中所繪示之可變區相比發生突變，而保留與表1中所列示之抗體實質上相同之治療活性。
因該等抗體中之每一者可結合至P-鈣黏蛋白，故可「混合並匹配」VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼胺基酸序列之核苷酸序列)以產生本發明之其他P-鈣黏蛋白結合抗體。可使用業內已知之結合分析(例如ELISA及實例部分中所闡述之其他分析)測試該等「混合並匹配」之P-鈣黏蛋白結合抗體。在混合並匹配該等鏈時，來自特定VH/VL配對之VH序列應代替為結構類似之VH序列。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長重鏈序列應代替為結構類似之全長重鏈序列。同樣，來自特定VH/VL配對之VL序列應代替為結構類似之VL序列。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長輕鏈序列應代替為結構類似之全長輕鏈序列。因此，在一態樣中，本發明提供具有以下部分之分離單株抗體或其抗原結合區：包括選自 由SEQ ID NO：7、27、47、67、87及107組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區：及包括選自由SEQ ID NO：17、37、57、77、97及117組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區；其中該抗體特異性結合P-鈣黏蛋白。
在另一態樣中，本發明提供(i)具有以下部分之分離單株抗體：全長重鏈，其包括經最佳化用於表現於哺乳動物表現系統之細胞中且選自由SEQ ID NO：9、29、49、69、89及109組成之群之胺基酸序列；及全長輕鏈，其包括經最佳化以用於表現於哺乳動物之細胞中且選自由SEQ ID NO：19、39、59、79、99及119組成之群之胺基酸序列；或(ii)包括其抗原結合部分之功能蛋白。
在另一態樣中，本發明提供包括如表1中所闡述之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或其組合之P-鈣黏蛋白結合抗體。抗體之VH CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：1、21、41、61、81及101中。抗體之VH CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：2、22、42、62、82及102中。抗體之VH CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：3、23、43、63、83及103中。抗體之VL CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：11、31、51、71、91及111中。抗體之VL CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO 12、32、52、72、92及112中。抗體之VL CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：13、33、53、73、93及113中。
考慮到該等抗體中之每一者可結合至P-鈣黏蛋白且抗原結合特異性主要由CDR1、2及3區提供，故可「混合並匹配」VH CDR1、CDR2及CDR3序列及VL CDR1、CDR2及CDR3序列(亦即，可混合並匹配來自不同抗體之CDR)。可使用業內已知之結合分析及彼等闡述於實例中者(例如ELISA)測試該等「混合並匹配」之P-鈣黏蛋白結合抗體。在混合並匹配VH CDR序列時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應代替為結構類似之CDR序列。同樣，在混合 並匹配VL CDR序列時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應代替為結構類似之CDR序列。熟習此項技術者將易於明瞭，可藉由使用來自本文針對本發明單株抗體展示之CDR序列之結構類似之序列取代一或多個VH及/或VL CDR區序列來產生新穎VH及VL序列。
因此，本發明提供分離單株抗體或抗原結合區，其包括：重鏈CDR1，其包括選自由SEQ ID NO：1、21、41、61、81及101組成之群之胺基酸序列；重鏈CDR2，其包括選自由SEQ ID NO：2、22、42、62、82及102組成之群之胺基酸序列；重鏈CDR3，其包括選自由SEQ ID NO：3、23、43、63、83及103組成之群之胺基酸序列；輕鏈CDR1，其包括選自由SEQ ID NO：11、31、51、71、91及111組成之群之胺基酸序列；輕鏈CDR2，其包括選自由SEQ ID NO：12、32、52、72、92及112組成之群之胺基酸序列；及輕鏈CDR3，其包括選自由SEQ ID NO：13、33、53、73、93及113組成之群之胺基酸序列；其中該抗體特異性結合P-鈣黏蛋白。
在一具體實施例中，特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括SEQ ID NO：1之重鏈CDR1；SEQ ID NO：2之重鏈CDR2；SEQ ID NO：3之重鏈CDR3；SEQ ID NO：11之輕鏈CDR1；SEQ ID NO：12之輕鏈CDR2；及SEQ ID NO：13之輕鏈CDR3。
在另一具體實施例中，特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括SEQ ID NO：21之重鏈CDR1；SEQ ID NO：22之重鏈CDR2；SEQ ID NO：23之重鏈CDR3；SEQ ID NO：31之輕鏈CDR1；SEQ ID NO：32之輕鏈CDR2；及SEQ ID NO：33之輕鏈CDR3。
在又一實施例中，特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括SEQ ID NO：41之重鏈CDR1；SEQ ID NO：42之 重鏈CDR2；SEQ ID NO：43之重鏈CDR3；SEQ ID NO：51之輕鏈CDR1；SEQ ID NO：52之輕鏈CDR2；及SEQ ID NO：53之輕鏈CDR3。
在另一實施例中，特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括SEQ ID NO：61之重鏈CDR1；SEQ ID NO：62之重鏈CDR2；SEQ ID NO：63之重鏈CDR3；SEQ ID NO：71之輕鏈CDR1；SEQ ID NO：72之輕鏈CDR2；及SEQ ID NO：73之輕鏈CDR3。
在另一具體實施例中，特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括SEQ ID NO：81之重鏈CDR1；SEQ ID NO：82之重鏈CDR2；SEQ ID NO：83之重鏈CDR3；SEQ ID NO：91之輕鏈CDR1；SEQ ID NO：92之輕鏈CDR2；及SEQ ID NO：93之輕鏈CDR3。
在另一具體實施例中，特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括SEQ ID NO：101之重鏈CDR1；SEQ ID NO：102之重鏈CDR2；SEQ ID NO：103之重鏈CDR3；SEQ ID NO：111之輕鏈CDR1；SEQ ID NO：112之輕鏈CDR2；及SEQ ID NO：113之輕鏈CDR3。
在某些實施例中，特異性結合P-鈣黏蛋白之抗體係表1中所闡述之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)。
1. 表位及結合相同表位之抗體之鑑別
在一實施例中，本發明提供特異性結合人類P-鈣黏蛋白上之表位之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)，其包括一或多個選自SEQ ID NO：126之位置124、125、151、153、154、155、156、159、160、161、162、163、168、170、171及172處之胺基酸之殘基。在一些實施例中，本發明提供包括在一或多個選自SEQ ID NO：126之位置 124、151、153-156及172之胺基酸殘基處結合人類P-鈣黏蛋白之重鏈的抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)。在其他實施例中，本發明提供包括在一或多個選自SEQ ID NO：126之位置124、125、155、156、159-163、168、170及171之胺基酸殘基處結合人類P-鈣黏蛋白之輕鏈的抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)。在一些實施例中，該等抗體或抗體片段包括用於人類P-鈣黏蛋白之包括一或多個選自SEQ ID NO：128之位置52、54、56、60、65、105或107之胺基酸殘基的重鏈結合互補位。在其他實施例中，該等抗體或抗體片段包括用於人類P-鈣黏蛋白之包括一或多個選自SEQ ID NO：129之位置1、2、27、28、30、68、92、93或94之胺基酸殘基的輕鏈結合互補位。
本發明亦提供與表1中所闡述之抗P-鈣黏蛋白抗體特異性結合相同表位或與表1中所闡述之抗體交叉競爭之抗體及抗體片段(例如抗原結合片段)。可由此基於在P-鈣黏蛋白結合分析中(例如經由BIACORE或熟習此項技術者已知用於量測結合之分析)與本發明其他抗體交叉競爭(例如以統計學顯著方式競爭性抑制結合)之能力來鑑別其他抗體及抗體片段(例如抗原結合片段)。測試抗體抑制本發明之抗體及抗體片段(例如抗原結合片段)與P-鈣黏蛋白(例如人類P-鈣黏蛋白)之結合之能力顯示，測試抗體可與抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)競爭結合P-鈣黏蛋白；根據非限制性理論，此一抗體可與其所競爭之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)結合P-鈣黏蛋白上之相同或相關(例如結構類似或空間相鄰或重疊)表位。在某些實施例中，與表1中所闡述之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)結合P-鈣黏蛋白上之相同表位之抗體係人類或人類化單株抗體。可如本文所闡述來製備及分離該等人類或人類化單株抗體。
2. Fc區之架構之其他改變
本發明免疫結合物可包括修飾抗體或其抗原結合片段，其進一 步包括對VH及/或VL內之架構殘基之修飾，例如以改良抗體性質。在一些實施例中，進行架構修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方式係將一或多個架構殘基「回復突變(back-mutate)」成相應之胚原序列。更具體而言，已經體細胞突變之抗體可能含有與衍生該抗體之胚原序列不同之架構殘基。該等殘基可藉由比較該抗體架構序列與衍生該抗體之胚原序列來鑑別。為使架構區序列返回至其胚原構形，可藉由例如定點誘變將體細胞突變「回復突變」成胚原序列。該等「回復突變」抗體亦意欲由本發明所涵蓋。
另一類型之架構修飾涉及突變架構區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基以去除T細胞表位，由此降低抗體之潛在免疫原性。此方式亦稱為「去免疫化」且進一步詳細闡述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
除在架構或CDR區內進行之修飾外或另一選擇，本發明抗體可經改造以包含在Fc區內之修飾，通常以改變抗體之一或多種功能性質，例如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。另外，本發明抗體可經化學修飾(舉例而言，可將一或多個化學部分連接至該抗體)或經修飾以改變其糖基化，亦以改變抗體之一或多種功能性質。該等實施例各進一步詳細闡述於下文中。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以改變(例如增加或減少)鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數。此方式進一步闡述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。改變CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數以例如促進輕鏈及重鏈組裝或以增加或降低抗體之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短抗體之生物半衰期。更特定地，將一或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區中，從而相對於天然Fc-鉸鏈域SpA結合，該抗體具有受損之葡萄球菌蛋白A(SpA)結合。此方式進一步詳細闡述於Ward等人 之美國專利第6,165,745號中。
在其他實施例中，藉由使用不同胺基酸殘基代替至少一個胺基酸殘基來改變Fc區以改變抗體之效應物功能。舉例而言，可使用不同胺基酸殘基來代替一或多個胺基酸，從而抗體具有對效應物配體經改變之親和力但保留親代抗體之抗原結合能力。對其親和力改變之效應物配體可係(例如)Fc受體或補體之C1組份。此方式闡述於(例如)Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實施例中，選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基代替，從而抗體具有經改變之C1q結合及/或降低或消除補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方式闡述於(例如)Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，改變一或多個胺基酸殘基以由此改變抗體固定補體之能力。此方式闡述於(例如)Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。在一具體實施例中，藉由一或多個同種異型胺基酸殘基(例如彼等在圖4中展示用於IgG1子類及κ同種型者)代替本發明之抗體或其抗原結合片段之一或多個胺基酸。同種異型胺基酸殘基亦包含但不限於IgG1、IgG2及IgG3子類之重鏈之恆定區以及κ同種型之輕鏈之恆定區，如由Jefferis等人，MAbs.1：332-338(2009)所闡述。
在又一實施例中，藉由修飾一或多個胺基酸對Fc區進行修飾以增加抗體調介抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加抗體對Fcγ受體之親和力。此方式闡述於(例如)Presta之PCT公開案WO 00/42072中。另外，已定位人類IgG1上針對FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點，且已闡述具有經改良結合之變體(參見Shields等人，J.Biol.Chem.276：6591-6604,2001)。
在再一實施例中，修飾抗體之糖基化。舉例而言，可製備無糖基化之抗體(亦即，抗體缺乏糖基化)。可改變糖基化以(例如)增加抗 體對「抗原」之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來達成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代以消除一或多個可變區架構糖基化位點，由此消除該位點處之糖基化。該無糖基化可增加抗體對抗原之親和力。此一方式闡述於(例如)Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
另外或另一選擇為，可製備具有經改變糖基化類型之抗體，例如具有降低量之岩藻糖基殘基之低岩藻糖基化抗體或具有增加之二等分GlcNac結構的抗體。已證實，該等經改變糖基化模式增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)在具有經改變之糖基化機構之宿主細胞中表現抗體來達成。業內已闡述具有經改變糖基化機構之細胞且其可用作宿主細胞，該等宿主細胞經用以表現本發明重組抗體，由此產生具有經改變糖基化之抗體。舉例而言，Hang等人之EP 1,176,195闡述具有編碼岩藻糖基轉移酶之功能被破壞之FUT8基因之細胞系，從而在此一細胞系中表現之抗體展現低岩藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835闡述將岩藻糖連接至Asn(297)連接碳水化合物之能力有所降低的變體CHO細胞系Lecl3細胞，亦導致在該宿主細胞中表現之抗體的低岩藻糖基化(亦參見Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。烏馬納等人之PCT公開案WO 99/54342闡述經改造以表現修飾糖蛋白之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))之細胞系，從而在該等經改造細胞系中表現之抗體展現增加之二等分GlcNac結構，從而增加該等抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人，Nat.Biotech.17：176-180,1999)。
在另一實施例中，抗體經修飾以增加其生物半衰期。多種方式係可行的。舉例而言，可引入下列突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如Ward等人之美國專利第6,277,375號中所闡述。另一選擇為，為增加生物半衰期，可在CH1或CL區內改變抗體以含有自 IgG之Fc區中CH2結構域之兩個環所獲取之補救受體結合表位，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所闡述。
3. P-鈣黏蛋白抗體之產生
可藉由業內已知之任一方式(包含但不限於重組表現、化學合成、及酶消化抗體四聚體)來產生抗P-鈣黏蛋白抗體及其抗體片段(例如抗原結合片段)，而可藉由(例如)雜交瘤或重組產生來獲得全長單株抗體。重組表現可來自業內已知之任一適當宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本發明另外提供編碼本文所闡述抗體之多核苷酸，例如編碼包括如本文所闡述互補決定區之重鏈或輕鏈可變區或片段之多核苷酸。在一些實施例中，編碼重鏈可變區之多核苷酸與選自由SEQ ID NO：8、28、48、68、88及108組成之群之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈可變區之多核苷酸與選自由SEQ ID NO：18、38、58、78、98及118組成之群之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列一致性。
在一些實施例中，編碼重鏈之多核苷酸與SEQ ID NO：10、30、50、70、90或110之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之多核苷酸與SEQ ID NO：20、40、60、80、100或120之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之核酸序列一致性。
本發明多核苷酸可僅編碼抗P-鈣黏蛋白抗體之可變區序列。其亦可編碼抗體之可變區及恆定區。一些多核苷酸序列編碼包括一種所列 示小鼠抗P-鈣黏蛋白抗體之重鏈及輕鏈之可變區之多肽。一些其他多核苷酸編碼兩個分別實質上與一種小鼠抗體之重鏈及輕鏈之可變區相同之多肽區段。
可藉由新生固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼抗P-鈣黏蛋白抗體或其結合片段之現有序列(例如如下文實例中所闡述之序列)來產生多核苷酸序列。可藉由業內已知之方法達成核酸之直接化學合成，例如Narang等人，Meth.Enzymol.68：90,1979之磷酸三酯方法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯方法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之二乙基亞磷醯胺方法；及美國專利第4,458,066號之固體載體方法。可如以下文獻中所闡述實施藉由PCR將突變引入多核苷酸序列中，例如PCR技術：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編輯)，Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編輯)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。
本發明亦提供用於產生上文所闡述之抗P-鈣黏蛋白抗體之表現載體及宿主細胞。可採用各種表現載體來表現編碼抗P-鈣黏蛋白抗體鏈或結合片段之多核苷酸。可使用基於病毒及非病毒之表現載體在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包含質粒、附加型載體(通常具有用於表現蛋白質或RNA之表現序列盒)及人類人工染色體(例如參見Harrington等人，Nat Genet 15：345,1997)。舉例而言，可用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現抗P-鈣黏蛋白多核苷酸及多肽之非病毒載體包含pThioHis A、B及C、pcDNATM3.1/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及業內已知用於表現其他蛋白質之諸多其他載體。有用病毒載體包含基於逆轉錄病毒、腺病 毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體、基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein Barr virus)之載體、牛痘病毒載體及西門利克森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)載體。參見Brent等人，見上文；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇取決於擬表現載體之預期宿主細胞。通常，表現載體含有啟動子及其他可操作地連接至編碼抗P-鈣黏蛋白抗體鏈或片段之多核苷酸之調控序列(例如增強子)。在一些實施例中，採用可誘導型啟動子來預防除在誘導條件下插入序列之表現。可誘導型啟動子包含(例如)阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可在非誘導條件下擴增經轉變有機體之培養物，而不偏離表現產物更好地由宿主細胞耐受之編碼序列群體。除啟動子外，亦可需要或期望其他調控元件以用於有效表現抗P-鈣黏蛋白抗體鏈或片段。該等元件通常包含ATG起始密碼子及毗鄰核糖體結合位點或其他序列。此外，可藉由包含適於所用細胞系統之增強子來增強表現效率(例如參見Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。舉例而言，可使用SV40增強子或CMV增強子來增加哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信號序列位置以與由插入抗P-鈣黏蛋白抗體序列編碼之多肽形成融合蛋白。更通常而言，使插入抗P-鈣黏蛋白抗體序列在包含於載體中之前連接至信號序列。擬用於接收編碼抗P-鈣黏蛋白抗體輕及重鏈可變結構域之序列之載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體容許以具有恆定區之融合蛋白形式表現可變區，由此使得產生完整抗體或其片段。通常，該等恆定區係人類。
用於具有及表現抗P-鈣黏蛋白抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核。大腸桿菌(E.coli)係一種可用於選殖及表現本發明多核苷酸之原 核宿主。其他適用微生物宿主包含桿菌(bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))及其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)(例如沙門氏菌(Salmonella)、黏質沙雷氏菌(Serratia)及各種假單胞菌(Pseudomonas)屬)。在該等原核宿主中，亦可製備通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)之表現載體。此外，存在任一數量之各種熟知啟動子，例如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子通常視情況使用操縱因子序列控制表現，且具有用於引發及完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及諸如此類。亦可採用其他微生物(例如酵母)來表現本發明之抗P-鈣黏蛋白多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。
在一些較佳實施例中，使用哺乳動物宿主細胞來表現及產生本發明之抗P-鈣黏蛋白多肽。舉例而言，其可為表現內源性免疫球蛋白基因之雜交瘤細胞系(例如如實例中所闡述之骨髓瘤雜交瘤純系)或具有外源性表現載體之哺乳動物細胞系(例如下文所例示之SP2/0骨髓瘤細胞)。該等細胞包含任一正常短命或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已研發許多能夠分泌完整免疫球蛋白之適宜宿主細胞系，包含CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、經轉變B細胞及雜交瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽通常論述於(例如)Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。用於哺乳動物宿主細胞之表現載體可包含表現控制序列，例如複製起點、啟動子及增強子(例如參見Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68,1986)及必需處理資訊位點(例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點)及轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或哺乳動物病毒之啟動子。適宜啟動子可為組成型、細胞類型特異性、時期特異性及/或可調節或可 調控。有用啟動子包含但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松(dexamethasone)可誘導MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素(tetracycline)可誘導CMV啟動子(例如人類即刻早期CMV啟動子)、組成型CMV啟動子及業內已知之啟動子-增強子組合。
引入含有所關注多核苷酸序列之表現載體之方法端視細胞宿主之類型而有所變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主(通常參見Sambrook等人，見上文)。其他方法包含(例如)電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體調介之轉變、注射及微注射、彈道方法、病毒體、免疫脂質體、多價陽離子：核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子、融合至皰疹病毒結構蛋白VP22(Elliot及O'Hare,Cell 88：223,1997)、DNA之藥劑增強之吸收及離體轉導。對於重組蛋白之長期、高產率生產而言，通常期望穩定表現。舉例而言，可使用本發明之表現載體(其含有複製之病毒源或內源性表現元件及可選擇標記物基因)來製備穩定表現抗P-鈣黏蛋白抗體鏈或結合片段之細胞系。在引入載體後，可在切換至選擇性培養基中之前使細胞在富集培養基中生長1-2天。可選擇標記物之目的在於賦予選擇抗性，且其存在容許生長在選擇性培養基中成功表現引入序列之細胞。可使用適用於細胞類型之組織培養技術增殖抗性穩定轉染細胞。
治療及診斷應用
本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)及抗體藥物結合物可用於各種應用中，包含但不限於用於治療癌症(例如實體癌症)。在某些實施例中，本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)及抗體藥物結合物可用於抑制腫瘤生長、誘導分化、減小腫瘤體積及/或減小腫瘤之致腫瘤性。使用方法可為活體外、離體或活體內方法。
在一態樣中，本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)及抗體藥物結合物可用於檢測生物試樣中之P-鈣黏蛋白之存在。本文所用之術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物學試樣包括細胞或組織。在某些實施例中，該等組織包含相對於其他組織以較高程度表現P-鈣黏蛋白之正常及/或癌性組織。
在一態樣中，本發明提供檢測生物試樣中之P-鈣黏蛋白之存在之方法。在某些實施例中，該方法包括使生物學試樣與抗P-鈣黏蛋白抗體在允許抗體與抗原結合之條件下接觸，並檢測在該抗體與該抗原之間是否形成複合物。
在一態樣中，本發明提供診斷與增加之P-鈣黏蛋白表現有關之病症之方法。在某些實施例中，該方法包括：使測試細胞與抗P-鈣黏蛋白抗體接觸；藉由檢測抗P-鈣黏蛋白抗體與P-鈣黏蛋白抗原之結合來測定P-鈣黏蛋白在測試細胞上之表現程度(定量或定性)；及比較P-鈣黏蛋白在測試細胞中之表現程度與P-鈣黏蛋白在對照細胞(例如與測試細胞具有相同組織來源之正常細胞或以與此一正常細胞相當之程度表現P-鈣黏蛋白之細胞)之表現程度，其中與對照細胞相比P-鈣黏蛋白在測試細胞上之較高表現程度指示存在與增加之P-鈣黏蛋白表現有關之病症。在某些實施例中，測試細胞係自懷疑患有與增加之P-鈣黏蛋白表現有關之病症之個體獲得。在某些實施例中，該病症係細胞增殖性病症，例如癌症或腫瘤。在某些實施例中，該方法包括量測P-鈣黏蛋白基因在測試細胞中之拷貝數。在某些實施例中，該方法包括檢測PAX-FOXO異位突變。可使用業內已知之標準方法(例如PCR、RTPCR等)檢測基因拷貝數及/或異位突變。
在某些實施例中，診斷或檢測方法(例如上文所闡述之彼等方法)包括檢測抗P-鈣黏蛋白抗體與細胞表面上或從在其表面上表現P-鈣黏蛋白之細胞獲得之膜製劑中表現的P-鈣黏蛋白的結合。用於檢測抗P- 鈣黏蛋白抗體與細胞表面上表現之P-鈣黏蛋白之結合之實例性分析為「FACS」分析。
可使用某些其他方法來檢測抗P-鈣黏蛋白抗體與P-鈣黏蛋白之結合。該等方法包含但不限於業內已熟知之抗原結合分析，例如西方印跡(western blot)、放射免疫分析、ELISA(酶聯免疫吸附分析)、「夾心式(sandwich)」免疫分析、免疫沈澱分析、螢光免疫分析、蛋白質A免疫分析及免疫組織化學(IHC)。
在某些實施例中，抗P-鈣黏蛋白抗體經標記。標記包含但不限於直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。
在某些實施例中，將抗P-鈣黏蛋白抗體固定於不溶性基質上。固定使得可分離抗P-鈣黏蛋白抗體與任一保持游離於溶液中之P-鈣黏蛋白。此通常係藉由以下方式來達成：在分析程序之前使抗P-鈣黏蛋白抗體不溶(如藉由吸附至水不溶性基質或表面(Bennich等人，美國專利第3,720,760號))，或共價偶合(例如使用戊二醛交聯)，或在抗P-鈣黏蛋白抗體與P-鈣黏蛋白之間形成複合物之後使抗P-鈣黏蛋白抗體不溶(例如藉由免疫沈澱)。
可使用本發明免疫結合物代替抗P-鈣黏蛋白抗體或與其一起實施診斷或檢測之任一上述實施例。
在一實施例中，本發明提供治療或預防疾病之方法，其包括向患者投與本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物。本發明亦提供本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物之用途，其用於治療或預防患者之疾病。在一些實施例中，本發明提供用於治療或預防患者之疾病之本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物。在其他實施例中，本發 明提供本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物之用途，其用以製造用於治療或預防患者之疾病之醫藥。
在某些實施例中，使用本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)及抗體藥物結合物治療之疾病係癌症。在某些實施例中，癌症之特徵在於本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)及抗體藥物結合物所結合之P-鈣黏蛋白表現細胞。在某些實施例中，癌症之特徵在於相對於健康患者P-鈣黏蛋白表現有所增加。在一些實施例中，可藉由增加P-鈣黏蛋白RNA來量測P-鈣黏蛋白之表現。在其他實施例中，癌症之特徵在於P-鈣黏蛋白之DNA拷貝數有所增加。熟習此項技術者已知量測或測定p-鈣黏蛋白表現之程度之其他方法。可治療及/或預防之疾病之實例包含但不限於腎上腺皮質癌瘤、膀胱癌、骨癌、乳癌、中樞神經系統非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胚胎腫瘤、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、肝細胞癌、卡波西氏肉瘤、肝癌、肺癌(包含小細胞肺癌及非小細胞肺癌)、卵巢癌、直腸癌、橫紋肌肉瘤、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌瘤、鱗狀頸癌、胃癌、子宮癌、陰道癌及外陰癌。
本發明提供治療癌症之方法，其包括投與治療有效量之本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物。在某些實施例中，癌症係實體癌。在某些實施例中，該個體係人類。在某些實施例中，癌症係抗性癌症及/或復發性癌症。在某些態樣中，舉例而言，抗性癌症抵抗酪胺酸激酶抑制劑，包含但不限於EGFR抑制劑、Her2抑制劑、Her3抑制劑、IGFR抑制劑及Met抑制劑。在某些實施例中，癌症係Her2抗性癌症。
在某些實施例中，本發明提供抑制腫瘤生長之方法，其包括向個體投與治療有效量之本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物。在某些實施例中，該個體係人類。在某些實施例 中，個體患有腫瘤或已去除腫瘤。在某些實施例中，腫瘤抵抗其他酪胺酸激酶抑制劑，包含但不限於EGFR抑制劑、Her2抑制劑、Her3抑制劑、IGFR抑制劑及Met抑制劑。
在某些實施例中，腫瘤表現抗P-鈣黏蛋白抗體所結合之P-鈣黏蛋白。在某些實施例中，腫瘤過度表現人類P-鈣黏蛋白。在某些實施例中，腫瘤具有增加之P-鈣黏蛋白基因拷貝數。
本發明亦提供選擇患者用於使用本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物進行治療之方法，其包括投與治療有效量之該等抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物。在某些態樣中，該方法包括選擇患有酪胺酸激酶抑制劑抗性癌症之患者。在某些態樣中，預計酪胺酸激酶抑制劑抗性癌症抵抗EGFR抑制劑、Her2抑制劑、Her3抑制劑、IGFR抑制劑及/或Met抑制劑。在某些態樣中，預計抗性癌症係Her2抗性癌症。更具體而言，預計Her2抗性癌症並不對曲妥珠單抗(trastuzumab)或艾曲妥珠單抗(trastuzumab emtansine)具有反應。在某些態樣中，預計癌症係新生抗性癌症，且在其他態樣中，預計癌症係復發性癌症(例如Her2復發性癌症)。在本發明之某些態樣中，該等方法包括選擇患有新生抗性或復發性癌症之患者且量測P-鈣黏蛋白之表現。預計在某些態樣中，復發性癌症或腫瘤並非最初即為P-鈣黏蛋白表現癌症或腫瘤，但在使用酪胺酸激酶抑制劑(例如曲妥珠單抗或艾曲妥珠單抗)治療之後變為酪胺酸激酶抗性P-鈣黏蛋白陽性癌症或復發性癌症或腫瘤。
對於疾病治療而言，本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物之適當劑量取決於各種因素，例如擬治療疾病類型、疾病之嚴重程度及進程、疾病反應性、先前療法、患者臨床史等等。可一次性投與抗體或藥劑或經一系列持續數天至數月之治療進行投與，或直至實現治癒或達成疾病狀態減輕(例如腫瘤大小減小)為 止。最佳投藥時間表可自患者身體中之藥物累積量測來計算且端視個別抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物之相對效力而有所變化。治療醫師可基於所量測之藥物在體液或組織中之滯留時間及濃度來估計投藥之重複速率。
組合療法
在某些情況下，將本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物與其他治療劑(例如其他抗癌劑、抗過敏劑、抗噁心劑(或抗嘔吐劑)、疼痛緩解劑、細胞保護劑及其組合)進行組合。
在一實施例中，將本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物與具有抗癌性質之第二化合物以組合療法形式組合於醫藥組合調配物或投藥方案中。醫藥組合調配物或投藥方案中之第二化合物可具有與組合之抗體或免疫結合物互補之活性，從而其不會不利地影響彼此。舉例而言，本發明之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)或抗體藥物結合物可與(但不限於)以下藥劑組合投與：化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑、P-鈣黏蛋白下游信號傳導路徑抑制劑、IAP抑制劑、Bcl2抑制劑、Mcl1抑制劑及其他P-鈣黏蛋白抑制劑。
本文所用之術語「醫藥組合」係指呈一種劑量單元形式之固定組合或用於組合投與之非固定組合或部分套組(其中兩種或更多種治療劑可獨立地同時或單獨地在一定時間間隔內投與，尤其其中該等時間間隔使得組合配偶體展示合作(例如協同)效應)。
術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療本揭示內容中所闡述之治療性病狀或病症。該投與涵蓋以實質上同時方式(例如以具有固定比率之活性成份之單一膠囊)共投與該等治療劑。另一選擇為，該投與涵蓋以用於每一活性成份之多個或單獨容器(例如膠囊、粉劑及液體)共投與。可在投與之前將粉劑及/或液體重構或稀釋至期望劑量。此外，該投與亦涵蓋以依序方式在大約相同時間或在 不同時間使用每一類型之治療劑。在任一情形下，治療方案將提供藥物組合在治療本文所闡述之病狀或病症之有益效應。
組合療法可提供「協同作用」且證實具有「協同性」，亦即，在一起使用活性成份時所達成之效應大於分開使用化合物所產生效應之總和。在活性成份處於以下情形時可獲得協同效應：(1)共調配且以組合單位劑量調配物同時投與或遞送；(2)以單獨調配物形式交替或並行遞送；或(3)藉由一些其他方案。在以交替療法遞送時，可在依序投與或遞送(例如藉由單獨注射器中之不同注射)化合物時獲得協同效應。一般而言，在交替療法期間，依序(亦即連續)投與有效劑量之每一活性成份，而在組合療法中，一起投與有效劑量之兩種或更多種活性成份。
考慮用於組合療法中之一般化學治療劑包含阿那曲唑(anastrozole)(Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide)(Casodex®)、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate)(Blenoxane®)、白消安(Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine)(Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(carboplatin)(Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine)(BiCNU®)、氯芥苯丁酸(Leukeran®)、順鉑(cisplatin)(Platinol®)、克拉屈濱(cladribine)(Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside)(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC-Dome®)、更生黴素(放線菌素D，Cosmegan)、柔紅黴素鹽酸鹽(daunorubicin hydrochloride)(Cerubidine®)、檸檬酸柔紅黴素(daunorubicin citrate)脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松、多西紫杉醇(docetaxel)(Taxotere®)、多柔比星鹽酸鹽(doxorubicin hydrochloride)(Adriamycin®、Rubex®)、依託泊甙(etoposide)(Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)(Fludara®)、5-氟尿 嘧啶(5-fluorouracil)(Adrucil®、Efudex®)、氟利坦(flutamide)(Eulexin®)、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(Gemcitabine)(雙氟去氧胞苷)、羥基脲(hydroxyurea)(Hydrea®)、艾達黴素(Idarubicin)(Idamycin®)、異環磷醯胺(ifosfamide)(IFEX®)、伊立替康(irinotecan)(Camptosar®)、L-天門冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲硫四氫葉酸鈣、美法侖(melphalan)(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、胺甲喋呤(methotrexate)(Folex®)、米托蒽醌(mitoxantrone)(Novantrone®)、滅髓瘤(mylotarg)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Taxol®)、菲尼克斯(phoenix)(釔90/MX-DTPA)、噴司他丁(pentostatin)、聚苯丙生20(polifeprosan 20)與卡莫司汀植入物(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)(Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide)(Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine)(Tirazone®)、注射用鹽酸拓撲替康(Hycamptin®)、長春花鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞濱(vinorelbine)(Navelbine®)。
在一態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體藥物結合物與一或多種酪胺酸激酶抑制劑(包含但不限於EGFR抑制劑、Her2抑制劑、Her3抑制劑、IGFR抑制劑及Met抑制劑)之組合來達成。
舉例而言，酪胺酸激酶抑制劑包含但不限於埃羅替尼鹽酸鹽(Erlotinib hydrochloride)(Tarceva®)；裡尼法妮(Linifanib)(N-[4-(3-胺基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲，亦稱為ABT 869，可自Genentech獲得)；蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib malate)(Sutent®)；博舒替尼(Bosutinib)(4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)胺基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基六氫吡嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈，亦稱為SKI-606，且闡述於美國專利第6,780,996號中)；達沙替尼(Dasatinib)(Sprycel®)；帕唑 帕尼(Pazopanib)(Votrient®)；索拉非尼(Sorafenib)(Nexavar®)；紮克替瑪(Zactima)(ZD6474)；及伊馬替尼(Imatinib)或甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)(Gilvec®及Gleevec®)。
表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑包含但不限於埃羅替尼鹽酸鹽(Tarceva®)、吉非替尼(Gefitinib)(Iressa®)；N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-[[(3"S")-四氫-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基胺基)-2-丁烯醯胺，Tovok®)；凡德他尼(Vandetanib)(Caprelsa®)；拉帕替尼(Lapatinib)(Tykerb®)；(3R,4R)-4-胺基-1-((4-((3-甲氧基苯基)胺基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)六氫吡嗪-3-醇(BMS690514)；卡納替尼二鹽酸鹽(Canertinib dihydrochloride)(CI-1033)；6-[4-[(4-乙基-1-六氫吡嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(AEE788,CAS 497839-62-0)；木利替尼(Mubritinib)(TAK165)；培利替尼(Pelitinib)(EKB569)；阿法替尼(Afatinib)(BIBW2992)；奈拉替尼(Neratinib)(HKI-272)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]胺基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-胺基甲酸(3S)-3-嗎啉基甲酯(BMS599626)；N-(3,4-Di氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氫-2-甲基環戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647,CAS 781613-23-8)；及4-[4-[[(1R)-1-苯基乙基]胺基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚(PKI166,CAS 187724-61-4)。
EGFR抗體包含但不限於西妥昔單抗(Cetuximab)(Erbitux®)；帕尼單抗(Panitumumab)(Vectibix®)；馬妥珠單抗(Matuzumab)(EMD-72000)；曲妥珠單抗(Herceptin®)；尼妥珠單抗(Nimotuzumab)(hR3)；紮魯木單抗(Zalutumumab)；TheraCIM h-R3；MDX0447(CAS 339151-96-1)；及ch806(mAb-806,CAS 946414-09-1)。
人類表皮生長因子受體2(Her2受體)(亦稱為Neu、ErbB-2、CD340或p185)抑制劑包含但不限於曲妥珠單抗(Herceptin®)；帕妥珠 單抗(Pertuzumab)(Omnitarg®)；艾曲妥珠單抗(Kadcyla®)；奈拉替尼(Neratinib)(HKI-272,(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]胺基]-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯胺，且闡述於PCT公開案第WO 05/028443號中)；拉帕替尼(Lapatinib)或二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib ditosylate)(Tykerb®)；(3R,4R)-4-胺基-1-((4-((3-甲氧基苯基)胺基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)六氫吡嗪-3-醇(BMS690514)；(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-[[(3S)-四氫-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基胺基)-2-丁烯醯胺(BIBW-2992,CAS 850140-72-6)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]胺基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-胺基甲酸(3S)-3-嗎啉基甲酯(BMS 599626,CAS 714971-09-2)；卡納替尼二鹽酸鹽(PD183805或CI-1033)；及N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氫-2-甲基環戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647,CAS 781613-23-8)。
Her3抑制劑包含但不限於LJM716、MM-121、AMG-888、RG7116、REGN-1400、AV-203、MP-RM-1、MM-111及MEHD-7945A。
MET抑制劑包含但不限於卡博替尼(Cabozantinib)(XL184,CAS 849217-68-1)；福力替尼(Foretinib)(GSK1363089，先前係XL880，CAS 849217-64-7)；體凡替尼(Tivantinib)(ARQ197,CAS 1000873-98-2)；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-N-(5-(7-甲氧基喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基)-5-甲基-3-側氧基-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲醯胺(AMG 458)；克裡唑替尼(Cryzotinib)(Xalkori®,PF-02341066)；(3Z)-5-(2,3-二氫-1H-吲哚-1-基磺醯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基六氫吡嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亞甲基)-1,3-二氫-2H-吲哚-2-酮(SU11271)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基六氫吡嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亞甲基)-N-甲基-2-側氧基二氫吲哚-5-磺醯胺(SU11274)；(3Z)-N-(3-氯苯 基)-3-{[3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-甲基-2-側氧基二氫吲哚-5-磺醯胺(SU11606)；6-[二氟[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]噠嗪-3-基]甲基]-喹啉(JNJ38877605,CAS 943540-75-8)；2-[4-[1-(喹啉-6-基甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡嗪-6-基]-1H-吡唑-1-基]乙醇(PF04217903,CAS 956905-27-4)；N-((2R)-1,4-二噁烷-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-側氧基-5H-苯并[4,5]環戊[1,2-b]吡啶-7-基]磺醯胺(MK2461,CAS 917879-39-1)；6-[[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]噠嗪-3-基]硫代]-喹啉(SGX523,CAS 1022150-57-7)；及(3Z)-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]磺醯基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R)-2-(1-吡咯啶基甲基)-1-吡咯啶基]羰基]-1H-吡咯-2-基]亞甲基]-1,3-二氫-2H-吲哚-2-酮(PHA665752,CAS 477575-56-7)。
IGF1R抑制劑包含但不限於BMS-754807、XL-228、OSI-906、GSK0904529A、A-928605、AXL1717、KW-2450、MK0646、AMG479、IMCA12、MEDI-573及BI836845。例如參見Yee,JNCI,104；975(2012)之綜述。
在另一態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體藥物結合物與之組合一或多種P-鈣黏蛋白下游信號傳導路徑抑制劑(包含但不限於MEK抑制劑、Braf抑制劑、PI3K/Akt抑制劑、SHP2抑制劑亦及mTor)來達成。
舉例而言，促分裂原活化蛋白質激酶(MEK)抑制劑包含但不限於XL-518(亦稱為GDC-0973，Cas編號：1029872-29-4，可自ACC公司獲得)；2-[(2-氯-4-碘苯基)胺基]-N-(環丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯醯胺(亦稱為CI-1040或PD184352且闡述於PCT公開案第WO2000035436號中)；N-[(2R)-2,3-二羥基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)胺基]-苯甲醯胺(亦稱為PD0325901且闡述於PCT公開案第WO2002006213號 中)；2,3-雙[胺基[(2-胺基苯基)硫代]亞甲基]-丁腈(亦稱為U0126且闡述於美國專利第2,779,780號中)；N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)胺基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羥基丙基]-環丙烷磺醯胺(亦稱為RDEA119或BAY869766且闡述於PCT公開案第WO2007014011號中)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基胺基)-8,9,16-三羥基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氫-1H-2-苯并氧雜環十四炔-1,7(8H)-二酮(亦稱為E6201且闡述於PCT公開案第WO2003076424號中)；2’-胺基-3’-甲氧基黃酮(亦稱為PD98059，可自Biaffin GmbH & Co.,KG,Germany獲得)；維拉菲尼(Vemurafenib)(PLX-4032,CAS 918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羥基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基胺基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733,CAS 1035555-63-5)；匹馬提布(Pimasertib)(AS-703026,CAS 1204531-26-9)；及拉美替尼二甲基亞碸(Trametinib dimethyl sulfoxide)(GSK-1120212,CAS 1204531-25-80)。
磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑包含但不限於4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺醯基)六氫吡嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]嗎啉(亦稱為GDC 0941且闡述於PCT公開案第WO 09/036082號及第WO 09/055730號中)；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(亦稱為BEZ 235或NVP-BEZ 235，且闡述於PCT公開案第WO 06/122806號中)；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二嗎啉基嘧啶-4-基)吡啶-2-胺(亦稱為BKM120或NVP-BKM120，且闡述於PCT公開案第WO2007/084786號中)；陶紮色替(Tozasertib)(VX680或MK-0457,CAS 639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亞甲基]-2,4-噻唑啶二酮(GSK1059615,CAS 958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙醯基氧基)-1-[(二-2-丙烯基胺基)亞甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氫-11-羥基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-環 戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866,CAS 502632-66-8)；及8-苯基-2-(嗎啉-4-基)-烯-4-酮(LY294002,CAS 154447-36-6)。
mTor包含但不限於替西羅莫司(Temsirolimus)(Torisel®)；立達羅莫司(Ridaforolimus)(先前稱為德菲羅莫司(deferolimus)，二甲基次膦酸(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]三十六-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基酯，亦稱為AP23573及MK8669，且闡述於PCT公開案第WO 03/064383號中)；依維莫司(Everolimus)(Afinitor®或RAD001)；雷帕黴素(Rapamycin)(AY22989,Sirolimus®)；塞馬莫德(Simapimod)(CAS 164301-51-3)；(5-{2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS 1013101-36-4)；及N 2-[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天門冬胺醯基L-絲胺酸-內鹽(SF1126,CAS 936487-67-1)。
在又一態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體藥物結合物與一或多種促細胞凋亡劑(包含但不限於IAP抑制劑、Bcl2抑制劑、MCl1抑制劑、Trail藥劑、Chk抑制劑)之組合。
舉例而言，IAP抑制劑包含但不限於LCL161、GDC-0917、AEG-35156、AT406及TL32711。IAP抑制劑之其他實例包含但不需要彼等揭示於WO04/005284、WO 04/007529、WO05/097791、WO 05/069894、WO 05/069888、WO 05/094818、US2006/0014700、 US2006/0025347、WO 06/069063、WO 06/010118、WO 06/017295及WO08/134679(其皆以引用方式併入本文中)中者。
BCL-2抑制劑包含但不限於4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-環己烯-1-基]甲基]-1-六氫吡嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-嗎啉基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]胺基]-3-[(三氟甲基)磺醯基]苯基]磺醯基]苯甲醯胺(亦稱為ABT-263且闡述於PCT公開案第WO 09/155386號中)；替曲卡星A(Tetrocarcin A)；抗黴素(Antimycin)；棉酚(Gossypol)((-)BL-193)；奧巴拉克(Obatoclax)；乙基-2-胺基-6-環戊基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-側氧基乙基)-4H酮-3-甲酸酯(HA14-1)；奧利默森(Oblimersen)(G3139,Genasense®)；Bak BH3肽；(-)-棉酚乙酸(AT-101)；4-[4-[(4'-氯[1,1'-聯苯]-2-基)甲基]-1-六氫吡嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(二甲基胺基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]胺基]-3-硝基苯基]磺醯基]-苯甲醯胺(ABT-737,CAS 852808-04-9)；及納威拉克(Navitoclax)(ABT-263,CAS 923564-51-6)。
促細胞凋亡受體激動劑(PARA)包含DR4(TRAILR1)及DR5(TRAILR2)，包含但不限於杜拉樂明(Dulanermin)(AMG-951,RhApo2L/TRAIL)；馬帕木單抗(Mapatumumab)(HRS-ETR1,CAS 658052-09-6)；來沙木單抗(Lexatumumab)(HGS-ETR2,CAS 845816-02-6)；阿波單抗(Apomab)(Apomab®)；可那木單抗(Conatumumab)(AMG655,CAS 896731-82-1)；及替加珠單抗(Tigatuzumab)(CS1008,CAS 946415-34-5，可自Daiichi Sankyo獲得)。
檢查點激酶(CHK)抑制劑包含但不限於7-羥基星形孢菌素(UCN-01)；6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(3R)-3-六氫吡啶基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(SCH900776,CAS 891494-63-6)；5-(3-氟苯基)-3-脲基噻吩-2-甲酸N-[(S)-六氫吡嗪-3-基]醯胺(AZD7762,CAS 860352-01-8)；4-[((3S)-1-氮雜雙環[2.2.2]辛-3-基)胺基]-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-6-氯喹 啉-2(1H)-酮(CHIR 124,CAS 405168-58-3)；7-胺基更生黴素(7-AAD)、伊索拉德(Isogranulatimide)、去溴海美迪因(debromohymenialdisine)；N-[5-溴-4-甲基-2-[(2S)-2-嗎啉基甲氧基]-苯基]-N'-(5-甲基-2-吡嗪基)脲(LY2603618,CAS 911222-45-2)；蘿蔔硫素(Sulforaphane)(CAS 4478-93-7,4-甲基亞磺醯基丁基異硫氰酸酯)；9,10,11,12-四氫-9,12-環氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg：3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮雜環辛間四烯-1,3(2H)-二酮(SB-218078,CAS 135897-06-2)；及TAT-S216A(YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL)及CBP501((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr)。
在另一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體藥物結合物與一或多種免疫調節劑(例如一或多種以下藥劑：共刺激分子活化劑或免疫檢查點分子抑制劑)之組合來達成。
在某些實施例中，免疫調節劑係共刺激分子之活化劑。在一實施例中，共刺激分子之激動劑係選自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配體之激動劑(例如激動抗體或抗原結合其片段或可溶性融合體)。
在某些實施例中，免疫調節劑係免疫檢查點分子之抑制劑。在一實施例中，免疫調節劑係PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及/或TGFRβ之抑制劑。在一實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑抑制PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或CTLA4或其任一組合。術語「抑制」或「抑制劑」包含減小給定分子(例如免疫檢查點抑制劑)之某一參數(例如活性)。舉例而言，此術語包含將活性(例如PD-1或PD-L1活性)抑制至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多。因此，抑制無需為100%。
可在DNA、RNA或蛋白質層面上來抑制抑制分子。在一些實施例中，可使用抑制核酸(例如dsRNA、siRNA或shRNA)抑制抑制分子之表現。在其他實施例中，抑制信號之抑制劑係多肽(例如可溶性配體(例如PD-1-Ig或CTLA-4 Ig))或結合抑制分子之抗體或其抗原結合片段(例如結合PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及/或TGFRβ之抗體或其片段(在本文中亦稱為「抗體分子」))或其組合。
在一實施例中，抗體分子係完整抗體或其片段(例如Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段(scFv))。在其他實施例中，抗體分子具有選自(例如)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE之重鏈恆定區之重鏈恆定區(Fc)；尤其選自(例如)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之重鏈恆定區，更尤其IgG1或IgG4(例如人類IgG1或IgG4)之重鏈恆定區。在一實施例中，重鏈恆定區係人類IgG1或人類IgG4。在一實施例中，改變(例如突變)恆定區以修飾抗體分子之性質(例如增加或降低以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基數量、效應細胞功能或補體功能)。
在某些實施例中，抗體分子係呈雙特異性或多特異性抗體分子之形式。在一實施例中，雙特異性抗體分子具有針對PD-1或PD-L1之第一結合特異性且具有第二結合特異性(例如針對TIM-3、LAG-3或PD-L2之第二結合特異性)。在一實施例中，雙特異性抗體分子結合PD-1或PD-L1及TIM-3。在另一實施例中，雙特異性抗體分子結合PD-1或PD-L1及LAG-3。在另一實施例中，雙特異性抗體分子結合PD-1及PD-L1。在又一實施例中，雙特異性抗體分子結合PD-1及PD-L2。在另一實施例中，雙特異性抗體分子結合TIM-3及LAG-3。上述分子 之任一組合可製成多特異性抗體分子，例如包含針對PD-1或PD-1之第一結合特異性及針對TIM-3、LAG-3或PD-L2中之兩者或更多者之第二及第三結合特異性的三特異性抗體。
在某些實施例中，免疫調節劑係PD-1(例如人類PD-1)之抑制劑。在另一實施例中，免疫調節劑係PD-L1(例如人類PD-L1)之抑制劑。在一實施例中，PD-1或PD-L1之抑制劑係PD-1或PD-L1之抗體分子。PD-1或PD-L1抑制劑可單獨或與其他免疫調節劑組合(例如與LAG-3、TIM-3或CTLA4之抑制劑組合)投與。在一實例性實施例中，將PD-1或PD-L1之抑制劑(例如抗PD-1或PD-L1抗體分子)與LAG-3抑制劑(例如抗LAG-3抗體分子)組合投與。在另一實施例中，將PD-1或PD-L1之抑制劑(例如抗PD-1或PD-L1抗體分子)與TIM-3抑制劑(例如抗TIM-3抗體分子)組合投與。在其他實施例中，將PD-1或PD-L1之抑制劑(例如抗PD-1抗體分子)與LAG-3抑制劑(例如抗LAG-3抗體分子)及TIM-3抑制劑(例如抗TIM-3抗體分子)組合投與。免疫調節劑與PD-1抑制劑(例如PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及/或TGFR中之一或多者)之其他組合亦屬本發明內。業內已知或本文所揭示之任一抗體分子可用於檢查點分子抑制劑之上述組合中。
在一實施例中，PD-1抑制劑係選自尼沃魯單抗(Nivolumab)、皮落株單抗(Pembrolizumab)或皮裡株單抗(Pidilizumab)之抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體係尼沃魯單抗。尼沃魯單抗之替代名稱包含MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些實施例中，抗PD-1抗體係尼沃魯單抗(CAS登記號：946414-94-4)。尼沃魯單抗係特異性阻斷PD1之完全人類IgG4單株抗體。尼沃魯單抗(純系5C4)及特異性結合PD1之其他人類單株抗體揭示於美國專利第8,008,449號及PCT公開案第WO2006/121168號中。
在其他實施例中，抗PD-1抗體係皮落株單抗。皮落株單抗(商品名KEYTRUDA，先前係Lambrolizumab，亦稱為Merck 3745/MK-3475或SCH-900475)係結合PD1之人類化IgG4單株抗體。皮落株單抗揭示於(例如)Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2)：134-44、PCT公開案第WO2009/114335號及美國專利第8,354,509號中。
在一些實施例中，抗PD-1抗體係皮裡株單抗。皮裡株單抗(CT-011；Cure Tech)係結合PD1之人類化IgG1k單株抗體。皮裡株單抗及其他人類化抗PD-1單株抗體揭示於PCT公開案第WO2009/101611號中。其他抗PD1抗體揭示於美國專利第8,609,089號、美國公開案第2010028330號及/或美國公開案第20120114649號中。其他抗PD1抗體包含AMP 514(Amplimmune)。
在一些實施例中，PD-1抑制劑係免疫黏附素(例如包括融合至恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)之PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分之免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1抑制劑係AMP-224。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑係抗PD-L1抗體。在一些實施例中，抗PD-L1抑制劑係選自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736或MDX-1105MSB-0010718C(亦稱為A09-246-2)，其揭示於(例如)WO 2013/0179174中且具有本文所揭示之序列(或與其實質上相同或類似之序列，例如與指定序列至少85%、90%、95%一致或具有更高一致性之序列)。
在一實施例中，PD-L1抑制劑係MDX-1105。MDX-1105(亦稱為BMS-936559)係闡述於PCT公開案第WO2007/005874號中之抗PD-L1抗體。
在一實施例中，PD-L1抑制劑係YW243.55.S70。YW243.55.S70抗體係闡述於PCT公開案第WO 2010/077634號中之抗PD-L1(重鏈及輕 鏈可變區序列分別展示於SEQ ID No.20及21中)。
在一實施例中，PD-L1抑制劑係MDPL3280A(Genentech/Roche)。MDPL3280A係結合PD-L1之人類Fc最佳化IgG1單株抗體。MDPL3280A及PD-L1之其他人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。
在其他實施例中，PD-L2抑制劑係AMP-224。AMP-224係阻斷PD1與B7-H1之間之相互作用之PD-L2 Fc融合可溶性受體(B7-DCIg；Amplimmune；例如揭示於PCT公開案第WO2010/027827號及第WO2011/066342號中)。
在一實施例中，LAG-3抑制劑係抗LAG-3抗體分子。在一實施例中，LAG-3抑制劑係BMS-986016。
醫藥組合物
為製備包含免疫結合物之醫藥或無菌組合物，將本發明免疫結合物與醫藥上可接受之載劑或賦形劑混合。該等組合物可另外含有一或多種其他適於治療或預防癌症(包含但不限於膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、巴雷特氏食道癌(Barrett’s esophageal cancer)、胃癌、頭頸癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胰臟癌、急性髓樣白血病、慢性髓樣白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌瘤、周邊神經鞘腫瘤神經鞘瘤、膠質母細胞瘤、軟組織之透明細胞肉瘤、惡性間皮瘤、神經纖維瘤病、腎癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房發育及橫紋肌肉瘤)之治療劑。
可藉由與生理學可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備呈(例如)凍乾粉末、漿液、水溶液、洗劑或懸浮液之形式之治療及診斷劑之調配物(例如參見Hardman等人，Goodman及Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.,2001；Gennaro,Remington：The Science及Practice of Pharmacy, Lippincott,Williams及Wilkins,New York,N.Y.,2000；Avis等人(編輯)，Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY,1993；Lieberman等人(編輯)，Pharmaceutical Dosage Forms：tablets,Marcel Dekker,NY,1990；Lieberman等人(編輯)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY,1990；Weiner及Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker公司，New York,N.Y.,2000)。
在一實施例中，本發明之抗體藥物結合物之臨床服務形式(CSF)係存於小瓶中之凍乾物，其含有ADC、組胺酸、蔗糖及聚山梨醇酯20。可使用注射用水重構凍乾物，溶液包括ADC、組胺酸、蔗糖及聚山梨醇酯20且pH約為5.0。在一具體實施例中，凍乾物包括10mg/ml ADC、20mM組胺酸、240mM蔗糖及0.02%聚山梨醇酯20且pH為5.3。
選擇用於治療劑之投與方案取決於若干因素，包含實體之血清或組織轉換率、症狀之程度、實體之免疫原性及生物基質中靶細胞之易接近性。在某些實施例中，投與方案使與可接受之負效應程度一致之遞送至患者之治療劑的量最大化。因此，所遞送生物製劑之量部分地取決於具體實體及所治療病狀之嚴重程度。可獲得選擇抗體、細胞介素及小分子之適當劑量之導則(例如參見Wawrzynczak,Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.有限公司，Oxfordshire,UK,1996；Kresina(編輯)，Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1991；Bach(編輯)，Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1993；Baert等人，New Engl.J.Med.348：601-608,2003；Milgrom等人，New Engl.J.Med.341：1966-1973,1999；Slamon等人，New Engl.J.Med.344：783-792,2001；Beniaminovitz等人，New Engl.J.Med.342：613-619,2000；Ghosh等人，New Engl.J.Med.348：24-32,2003；Lipsky等人，New Engl.J.Med.343：1594-1602,2000)。
適當劑量之確定係由臨床醫師(例如)使用此項技術中已知或懷疑影響治療或預計影響治療之參數或因素來進行。通常，劑量係以稍微小於最佳劑量之量開始且此後以小的增益增加，直至相對於任何不利負效應達成期望或最佳效應為止。重要之診斷手段包含彼等(例如)發炎之症狀或所產生發炎細胞介素之含量。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量量可變以便獲得可有效達成對特定患者有期望治療反應之量的活性成份、組合物及投與模式，而對患者無毒。所選劑量量將端視多種藥物代謝動力學因素而定，該等參數包含所用本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康情況及先前病史及已為醫學技術中所已知之類似因素。
可藉由連續輸注來提供包括本發明之抗體或其片段之組合物，或藉由(例如)以下間隔之劑量來提供：每天、每週或每週1-7次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次或每八週一次。可經靜脈內、皮下、局部、經口、經鼻、經直腸、經肌內、經大腦內或藉由吸入提供劑量。具體劑量方案係涉及避免不期望負效應之最大劑量或投藥頻率者。
對於本發明免疫結合物而言，投與患者之劑量可為0.0001mg/kg至100mg/kg患者體重。劑量可介於0.0001mg/kg患者體重與30mg/kg患者體重、0.0001mg/kg患者體重與20mg/kg患者體重、0.0001mg/kg患者體重與10mg/kg患者體重、0.0001mg/kg患者體重與5mg/kg患者 體重、0.0001mg/kg患者體重與2mg/kg患者體重、0.0001mg/kg患者體重與1mg/kg患者體重、0.0001mg/kg患者體重與0.75mg/kg患者體重、0.0001mg/kg患者體重與0.5mg/kg患者體重、0.0001mg/kg患者體重至0.25mg/kg患者體重、0.0001mg/kg患者體重至0.15mg/kg患者體重、0.0001mg/kg患者體重至0.10mg/kg患者體重、0.001mg/kg患者體重至0.5mg/kg患者體重、0.01mg/kg患者體重至0.25mg/kg患者體重或0.01mg/kg患者體重至0.10mg/kg患者體重之間。可使用患者重量(以千克(kg)表示)乘以擬投與劑量(以mg/kg表示)來計算本發明之抗體或其片段之劑量。
可重複本發明免疫結合物之劑量且各投與可間隔小於1天、至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月、4個月、5個月或至少6個月。在一些實施例中，可每週兩次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次或以更小頻率給予本發明免疫結合物。在一具體實施例中，每2週重複本發明免疫結合物之劑量。
用於特定患者之有效量可端視諸如以下等因素而有所變化：所治療病狀、患者之整體健康狀況、投與之方法途、徑及劑量及副效應嚴重程度(例如參見Maynard等人，A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.,1996；Dent,Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK,2001)。
投與途徑可為(例如)藉由局部或經皮施加、藉由皮下、靜脈內、腹膜腔內、大腦內、肌內、眼內、動脈內、腦脊髓內、病灶內投與注射或輸注或藉由持續釋放系統或植入體(例如參見Sidman等人，Biopolymers 22：547-556,1983；Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277,1981；Langer,Chem.Tech.12：98-105,1982；Epstein等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692,1985；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4034,1980；美國專利第6,350,466號及第6,316,024號)。若需要，則該組合物亦可包含增溶劑或局部麻醉劑(例如利多卡因(lidocaine))以減輕注射位點處之疼痛，或包含此二者。此外，亦可採用肺投與，例如藉由使用吸入器或噴霧器，及與氣溶膠化劑一起調配。例如參見美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
本發明組合物亦可使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者經由一或多個投與途徑投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式應端視期望結果而有所變化。用於本發明免疫結合物之所選投與途徑包含靜脈內、肌內、真皮內、腹膜腔內、皮下、脊椎或其他非經腸投與途徑(例如藉由注射或輸注)。非經腸投與可代表除經腸及局部投與外之投與模式，通常係藉由注射且包含但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、莢膜內、眶內、心臟內、真皮內、腹膜腔內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。另一選擇為，本發明組合物可經由腸道途徑投與，例如局部、表皮或黏膜投與途徑，例如經鼻內、經口、經陰道、經直腸、經舌下或經局部。在一實施例中，藉由輸注投與本發明免疫結合物。在另一實施例中，經皮下投與本發明免疫結合物。
如以受控釋放或持續釋放系統投與本發明免疫結合物，則可使用幫浦達成受控或持續釋放(參見Langer，見上文；Sefton,CRC Crit.Ref Biomed.Eng.14：20,1987；Buchwald等人，Surgery 88：507,1980；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574,1989)。可使用聚合材 料達成受控或持續釋放本發明治療劑(例如參見Medical Applications of Controlled Release,Langer及Wise(編輯)，CRC Pres.,Boca Raton,Fla.,1974；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen及Ball(編輯)，Wiley,New York,1984；Ranger及Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61,1983；亦參見Levy等人，Science 228：190,1985；During等人，Ann.Neurol.25：351,1989；Howard等人，J.Neurosurg.7 1：105,1989；美國專利第5,679,377號；美國專利第5,916,597號；美國專利第5,912,015號；美國專利第5,989,463號；美國專利第5,128,326號；PCT公開案第WO 99/15154號；及PCT公開案第WO 99/20253號。用於持續釋放調配物中之聚合物之實例包含但不限於聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一實施例中，持續釋放調配物中所用聚合物係惰性的、不含可浸出雜質、在儲存時穩定、無菌且生物可降解。可靠近預防或治療靶放置受控或持續釋放系統，由此僅需要一部分全身劑量(例如參見Goodson,Medical Applications of Controlled Release，見上文，第2卷，第115-138頁，1984)。
受控釋放系統論述於Langer之綜述中(Science 249：1527-1533,1990)。可使用熟習此項技術者已知之任一技術來產生包括本發明一或多種免疫結合物之持續釋放調配物。例如參見美國專利第4,526,938號、PCT公開案WO 91/05548、PCT公開案WO 96/20698、Ning等人，Radiotherapy & Oncology 39：179-189,1996；Song等人，PDA Journal of Pharmaceutical Science &技術50：372-397,1995；Cleek等人，Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854,1997；及Lam等 人，Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760,1997，每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
若經局部投與本發明免疫結合物，則其可調配成軟膏、乳霜、經皮貼劑、洗劑、凝膠、噴霧、氣溶膠、溶液、乳液形式或熟習此項技術者熟知之其他形式。例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。對於不可噴霧局部劑型而言，通常採用包括與局部施加相容之載劑或一或多種賦形劑且具有在一些情況下比水大之動力學黏度之黏稠至半固體或固體形式。適宜調配物包含但不限於溶液、懸浮液、乳液、乳霜、軟膏、粉劑、擦劑、油膏及諸如此類，若期望，則其經滅菌或與輔助劑(例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑、緩衝劑或鹽)混合以影響多種性質(例如滲透壓)。其他適宜局部劑型包含可噴霧氣溶膠製劑，其中活性成份在一些情況下與固體或液體惰性載劑組合包裝成與加壓揮發物(例如氣態推進劑，例如氟利昂)之混合物或包裝於擠壓瓶中。若期望，則亦可向醫藥組合物及劑型中添加潤濕劑或保濕劑。該等額外成份之實例已為業內熟知。
若經鼻內投與包括免疫結合物之組合物，則可將其調配成氣溶膠形式、噴霧、霧或滴劑形式。特定而言，根據本發明使用之預防劑或治療劑可藉助適當推進劑(例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適宜氣體)方便地以氣溶膠噴霧形式由壓力包或霧化器遞送。在加壓氣溶膠之情形下，可藉由提供閥門遞送計量量來確定劑量單位。用於吸入器或吹入器中之膠囊及藥筒(例如由明膠構成)可經調配含有該化合物與適宜粉末基質(例如乳糖或澱粉)之粉末混合物。
業內已知用於使用第二治療劑(例如細胞介素、類固醇、化學治療劑、抗生素或輻射)共同投與或治療之方法，(例如參見Hardman等 人(編輯)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10增補版，McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole及Peterson(編輯)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner and Longo(編輯)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量之治療劑可將症狀降低至少10%、至少20%、至少約30%、至少40%或至少50%。
可與本發明免疫結合物組合投與之其他療法(例如預防劑或治療劑)可與本發明免疫結合物以以下方式投與：間隔小於5分鐘、間隔小於30分鐘、間隔1小時、間隔約1小時、間隔約1小時至約2小時、間隔約2小時至約3小時、間隔約3小時至約4小時、間隔約4小時至約5小時、間隔約5小時至約6小時、間隔約6小時至約7小時、間隔約7小時至約8小時、間隔約8小時至約9小時、間隔約9小時至約10小時、間隔約10小時至約11小時、間隔約11小時至約12小時、間隔約12小時至18小時、間隔18小時至24小時、間隔24小時至36小時、間隔36小時至48小時、間隔48小時至52小時、間隔52小時至60小時、間隔60小時至72小時、間隔72小時至84小時、間隔84小時至96小時或間隔96小時至120小時。可在一個相同患者訪視內投與兩種或更多種療法。
在某些實施例中，本發明免疫結合物可經調配以確保在活體內之合理分佈。舉例而言，血液-腦障壁(BBB)排斥許多高親水性化合物。為確保本發明之治療性化合物穿過BBB(若期望)，則可將其調配成(例如)脂質體形式。對於製造脂質體之方法而言，例如參見美國專利第4,522,811號、第5,374,548號及第5,399,331號。脂質體可包括一或多個選擇性傳輸至特定細胞或器官中之部分，由此增強靶向藥物遞送(例如參見Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。實例性靶向部分包含葉酸鹽或生物素(例如參見Low等人之美國專利第5,416,016 號)；甘露糖苷(Umezawa等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；Owais等人，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性劑蛋白質A受體(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p 120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本發明提供將包括本發明之免疫結合物(單獨或與其他療法組合)之醫藥組合物投與有需要之個體之方案。本發明組合療法之療法(例如預防劑或治療劑)可並行或依序投與個體。本發明組合療法之療法(例如預防劑或治療劑)亦可循環投與。循環療法涉及投與第一療法(例如第一預防劑或治療劑)一定時間段，隨後投與第二療法(例如第二預防劑或治療劑)一定時間段且重複此依序投與(亦即循環)以減少對一種療法(例如藥劑)之抗性產生，從而避免或減少一種療法(例如藥劑)之副效應及/或改良療法效能。
本發明組合療法之療法(例如預防劑或治療劑)可同時投與個體。
術語「同時」並不限於在嚴格相同之時間下投與療法(例如預防劑或治療劑)，而是意指以一定序列且在一定時間間隔內將包括本發明之抗體或其片段之醫藥組合物投與個體，從而本發明之抗體藥物結合物可與其他療法一起發揮作用以較其以其他方式投與時提供增加之益處。舉例而言，每一療法可在相同時間或以任一順序在不同時間點依序投與個體；然而，若不在相同時間投與，則其應在時間上充分靠近投與以提供期望治療或預防效應。每一療法可單獨地、以任一適當形式及藉由任何適宜途徑投與個體。在各種實施例中，將各療法(例如預防劑或治療劑)以以下方式投與個體：間隔小於5分鐘、間隔小於15分鐘、間隔小於30分鐘、間隔小於1小時、間隔約1小時、間隔約1 小時至約2小時、間隔約2小時至約3小時、間隔約3小時至約4小時、間隔約4小時至約5小時、間隔約5小時至約6小時、間隔約6小時至約7小時、間隔約7小時至約8小時、間隔約8小時至約9小時、間隔約9小時至約10小時、間隔約10小時至約11小時、間隔約11小時至約12小時、間隔24小時、間隔48小時、間隔72小時或間隔1週。在其他實施例中，在相同患者訪視內投與兩種或更多種療法(例如預防劑或治療劑)。
可以同一醫藥組合物將組合療法之預防劑或治療劑投與個體。另一選擇為，可以單獨醫藥組合物將組合療法之預防劑或治療劑同時投與個體。可藉由相同或不同投與途徑將預防劑或治療劑投與個體。可以同一醫藥組合物將組合療法之預防劑或治療劑投與個體。另一選擇為，可以單獨醫藥組合物將組合療法之預防劑或治療劑同時投與個體。可藉由相同或不同投與途徑將預防劑或治療劑投與個體。
實例 實例1：抗體生成 用於人類、食蟹猴、小鼠及大鼠P-鈣黏蛋白之表現構築體之生成
基於來自GenBank或Uniprot數據庫之胺基酸序列來基因合成人類、小鼠及大鼠P-鈣黏蛋白細胞外結構域(ECD)(參見下表2)。基於使用自各種食蟹猴組織分離之mRNA生成之胺基酸序列資訊來基因合成食蟹猴P-鈣黏蛋白ECD cDNA模板。將所有合成DNA片段選殖至具有C-末端六組胺酸標籤之適當表現載體中以容許進行純化。
P-鈣黏蛋白桿狀病毒生成
藉由共轉染/噬斑純化方法(O’Reilly等人，1992)或Bac-To-Bac表現系統方法(Invitrogen)遵循製造商方案來生成表現重組P-鈣黏蛋白ECD蛋白之桿狀病毒。使用標準低MOI感染方法擴增自經轉染昆蟲細胞生成之病毒。
重組P-鈣黏蛋白之表現
將在無血清培養基(專用，自製配方)中生長之Tn5細胞之懸浮液培養物以1.5e6細胞/ml之密度接種且使用重組P-鈣黏蛋白桿狀病毒以10pfu/ml MOI或3%體積同步感染。在2L玻璃愛倫美氏燒瓶(Erlenmyer flask)或Wave生物反應器(GE Healthcare Life Sciences)中繁殖P-鈣黏蛋白桿狀病毒培養配劑。將2L燒瓶中所表現之P-鈣黏蛋白配劑在120rpm及27℃下於無血清培養基中振盪。將Wave生物反應器中所表現之配劑在25rpm及28℃下以7.5°之角度振盪。在感染後2天藉由將培養物在4℃及1800rpm下離心10分鐘收穫自燒瓶或Wave生物反應器收穫之上清液。然後使用0.2μM過濾單元過濾上清液。對於大於1L之表現而言，使用AKTAcrossflow系統(GE Healthcare Life Sciences)利用KvickStart超濾平板盒將細胞培養上清液濃縮至2-10x。使用0.2 μM過濾單元過濾濃縮材料。
人類、食蟹猴、小鼠及大鼠pCAD ECD蛋白之純化
自細胞培養上清液純化加六組胺酸標籤之重組pCAD細胞外結構域蛋白(例如人類pCAD-6xHis、食蟹猴1 pCAD-6xHis、食蟹猴2 pCAD-6xHis、小鼠pCAD-6xHis、大鼠pCAD-6xHis)。將經淨化上清液通過鎳瓊脂糖樹脂(GE Healthcare Life Sciences)管柱上之固定金屬親和層析(IMAC)上方，該管柱已使用25mM bisTris丙烷、0.3M NaCl、1mM CaCl2(pH 6.2)予以平衡。將上清液以5-8mL/分鐘之流速施加至IMAC管柱上。在使用25mM bisTris丙烷、0.3M NaCl、1mM CaCl2(pH 6.2)進行基線洗滌之後，切換為5管柱體積之洗滌緩衝液(20mM Tris、0.3M NaCl、1mM CaCl2，pH 7.5)。視需要，使用Amicon Ultra 15mL離心濃縮器利用10kD或30kD標稱截留分子量濃縮所彙集蛋白質。然後藉由凝膠過濾利用在20mM Tris、0.3M NaCl、1mM CaCl2(pH 7.5)中預平衡之Superdex 200 26/60管柱(GE Healthcare Life Sciences)純化所彙集蛋白質。彙集適當部分且藉由SDS-PAGE分析。藉由Bradford蛋白質分析(Thermal Fisher)測定蛋白質濃度。
小鼠免疫及雜交瘤產生
在對Bcl-2轉基因小鼠(C57BL/6-Tgn(bcl-2)22 wehi菌株)實施免疫之前，使用弗羅因德氏完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)以1：1稀釋經純化人類P-鈣黏蛋白ECD。使用需要多位點重複免疫(Repetitive Immunization at Multiple Sites，RIMMS)(McIntyre GD.Hybridoma 1997)之程序對小鼠實施免疫。簡言之，在8個鄰近周邊淋巴節(PLN)之特異性位點處向小鼠注射1-3μg抗原。經12天時段重複此程序8次。在第12天，收集測試血液且藉由ELISA分析血清抗體效價。在第15天自高效價小鼠取出所彙集PLN。為收穫淋巴球，使用普 通DMEM將PLN洗滌兩次且然後藉由通過.22微米篩網(Falcon編號：352350)分離。在融合於Cytofusion培養基(BTXpress Cytofusion® Electroporation培養基，編號：47001)之前將所得淋巴球再洗滌2次。將F0骨髓瘤細胞與淋巴球以4個淋巴球對1個FO細胞之比率混合。將細胞混合物離心，懸浮於7ml Cytofusion培養基中且隨後添加至9ml電融合室(Harvard Apparatus Coaxia室，9ML，部件編號：470020)中。根據製造商說明使用Cyto Pulse Sciences公司CEEF-50B Hybrimune/Hybridoma系統實施電融合。將融合細胞在室中回收5min，以1/10稀釋於不含HAT之融合培養基(DMEM+20% FBS,Pen/Strep/Glu,1x NEAA,0.5x HFCS)中且置於37℃下保持一小時。添加4x HAT培養基(DMEM+20% FBS、Pen/Strep/Glu、1x NEAA、4x HAT、0.5x HFCS)以製備1x溶液且將密度調整至1.67×104個細胞/ml。然後以60μL/孔將細胞平鋪於384孔板中。
將抗體分泌至P-鈣黏蛋白中之雜交瘤
在融合之後10天，針對P-鈣黏蛋白特異性抗體之存在篩選雜交瘤板。對於ELISA篩選而言，使用50μL人類P-鈣黏蛋白(在PBS中稀釋至15ng/孔)塗覆Maxisorp 384孔板(Nunc編號：464718)且在4℃下培育過夜。抽吸剩餘蛋白質且使用存於PBS中之1% BSA阻斷孔。在室溫下培育30min之後，使用PBS+0.05% Tween(PBST)將各孔洗滌4次。將15μL雜交瘤上清液轉移至ELISA板中。在PBS中以1：1000稀釋在PLN取出時獲取之15μL小鼠血清且添加作為陽性對照。PBST。向ELISA板上之所有孔中添加50μL二級抗體(山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson Immuno Research編號：115-035-071)，在PBS中以1：5000稀釋)。在室溫下培育1h之後，使用PBST將各板洗滌8次。添加25μL TMB(KPL編號：50-76-05)且在室溫下培育30min之後；在605nm之吸光度下讀取板。將來自陽性孔之細胞擴展至HT培養基(DMEM+20 % FBS,Pen/Strep/Glu,1x NEAA,1x HT,0.5x HFCS)中之24孔板中。
抗體純化
使用蛋白質G(Upstate編號：16-266(Billerica,MA))純化含有抗體之上清液。在裝載上清液之前，使用10管柱體積之PBS平衡樹脂。在結合試樣後，使用10管柱體積之PBS洗滌管柱，且然後使用5管柱體積之0.1M甘胺酸(pH 2.0)洗脫抗體。立即使用1/10體積之pH 9.0 Tris HCl中和管柱部分。量測該等部分之OD280，且彙集陽性部分並針對pH 7.2 PBS透析過夜。
抗P-鈣黏蛋白抗體之人類化及親和力成熟
如下所述對雜交瘤源抗P-鈣黏蛋白抗體之VH及VL序列實施人類化及親和力成熟。
人類化序列之生成
在GeneArt(Life Technologies公司，Regensburg,Germany)處對編碼人類化VL及VH結構域之DNA序列進行測序，包含用於智人之密碼子最佳化。藉由自GeneArt源載體剪切及黏貼來將編碼VL及VH結構域之序列亞選殖至適於在哺乳動物細胞中分泌之表現載體中。將重鏈及輕鏈選殖至個別表現載體中以進行共轉染。表現載體之元件包含啟動子(巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子)、促進分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(牛生長激素(BGH)基因)、容許游離型複製及在原核生物中複製之元件(例如SV40源及ColE1或業內已知之其他者)及容許選擇之元件(胺苄西林(ampicillin)抗性基因及爭光黴素(zeocin)標記物)。
人類化抗體之表現及純化
組成型表現SV40大T抗原之人類胚胎腎細胞(HEK293-T ATCC11268)係用於瞬時表現人類化及/或最佳化IgG蛋白質之較佳宿主細胞系之一。使用PEI(聚乙烯亞胺，MW 25.000，直鏈， Polysciences,USA目錄編號：23966)作為轉染試劑實施轉染。藉由在室溫(RT)下將1g PEI小心溶於900ml細胞培養等級水中來製備PEI儲備溶液。為促進PEI溶解，藉由添加HCl至pH 3-5來酸化溶液，隨後使用NaOH中和至最終pH為7.05。最後，將體積調整至1L且經由0.22μm過濾器過濾溶液，實施等分且在-80℃下冷凍直至進一步使用為止。在解凍後，可將等分試樣在-20℃下再冷凍至多3次，但不應在-20℃處長期儲存。
使用無血清培養基栽培HEK 293T細胞以用於轉染及繁殖細胞，且使用ExCell VPRO無血清培養基(SAFC Biosciences,USA，目錄編號：24561C)作為生產/進料介質。在懸浮液培養物中栽培經製備用於瞬時轉染之細胞。對於小規模(<5L)轉染而言，在Corning振盪燒瓶(Corning,Tewksbury,MA)中於定軌振盪器(100-120rpm)上在加濕培育器中於5% CO2(接種燒瓶)下生長細胞。接種培養物中之細胞應維持於指數生長期(細胞密度介於5×105及3×106/mL之間)且顯示>90%之存活率以用於轉染。此範圍外之細胞密度在稀釋之後產生延滯期或產生減小之轉染效率。對於小規模(<5L)轉染而言，自接種培養物獲取細胞等分試樣且以36%最終體積使用Novartis無血清培養基調整至1.4×106個細胞/mL。藉由以7%最終培養體積將DNA稀釋至1mg/L(最終體積)、隨後輕柔混合來製備DNA溶液(溶液1：0.5mg重鏈及0.5mg輕鏈表現質粒，用於1L轉染)。為防止細菌污染，使用0.22μm過濾器(例如Millipore Stericup)過濾此溶液。然後亦以7%最終培養體積稀釋3mg/L(最終體積)PEI溶液且輕柔混合(溶液2)。將兩種溶液在室溫(RT)下培育5-10min。然後，將溶液2在輕柔混合下添加至溶液1中且在室溫下再培育5-15分鐘。然後向細胞中添加轉染混合物且繼續栽培細胞4至6小時。最後，藉由添加ExCell® VPRO無血清培養基來達成剩餘50%之總生產體積。在轉染後繼續栽培細胞11天。藉由在4500 rpm及4℃下離心20分鐘來收穫培養物(Heraeus ®,Multifuge 3 S-R,Thermo Scientific,Rockford,IL)。經由stericup過濾器(0.22μm)無菌過濾所回收之細胞上清液且在4℃下儲存直至進一步處理為止。
在「ÄKTA 100 explorer Air」層析系統上於4℃下在冷卻箱內使用新衛生化(0.25M NaOH)HiTrap ProtA MabSelect®SuRe 5ml管柱實施純化。使用5 CV PBS(Gibco,Life Technologies,Carlsbad,CA)平衡管柱，且然後以4.0ml/min裝載無菌過濾上清液(2L)。使用8 CV PBS洗滌管柱以洗脫未結合試樣且使用5 CV PBS再次洗滌。使用5 CV 50mM檸檬酸鹽、70mM NaCl(pH 3.2)洗脫抗體。以3ml部分收集洗脫物；彙集各部分且使用1M pH10 Tris HCl調整至pH 7。彙集彙集物且無菌過濾(Millipore Steriflip,0.22um)，在分光光度計ND-1000(NanoDrop)中量測OD 280nm，且基於序列數據計算蛋白質濃度。測試洗脫物之聚集(SEC-MALS)及純度(SDS-PAGE、LAL及MS)。對於第二純化步驟(若需要)而言，將來自第一純化之彙集物裝載至新鮮衛生化(0.5M NaOH)SPX(Hi Load 16/60 Superdex 200等級，120mL)(GE-Helthcare)中。使用PBS平衡管柱且使用PBS緩衝劑以1ml/min運行，以1.2ml部分收集洗脫物且如針對第一純化步驟所闡述進行分析。
來自Morphosys HuCAL PLATINUM ® 噬菌體文庫淘選之抗體
為選擇識別人類P-鈣黏蛋白之抗體，利用多種淘選策略。藉由使用市售噬菌體顯示文庫Morphosys HuCAL PLATINUM®文庫作為抗體變體蛋白質源選擇結合P-鈣黏蛋白之純系來生成針對人類P-鈣黏蛋白之治療抗體。噬菌粒文庫係基於HuCAL®概念(Knappik等人，2000,J Mol Biol 296：57-86)且採用CysDisplayTM技術來顯示噬菌體表面上之Fab(WO01/05950)。
為分離抗P-鈣黏蛋白抗體，採用基於固相、液相及細胞之淘選策 略
重組P-鈣黏蛋白上之固相淘選
在抗原選擇製程之前，實施塗層檢查ELISA以測定抗原之最佳塗層濃度。將具有His標籤之重組P-鈣黏蛋白用於固相淘選方式中，其中經由被動吸附塗覆於MaxisorpTM板(Nunc)上。使用125nM抗原在4℃下過夜塗覆96孔MaxisorpTM板(Nunc)之適當數量(取決於子文庫集合之數量)之孔。使用PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)/5%奶粉/5% BSA(牛血清白蛋白)/0.1% Tween 20/1mM CaCl2阻斷經塗覆孔。對於每一淘選而言，將約50uL HuCAL PLATINUM®噬菌體抗體在室溫(RT)下於溶液中阻斷2h。在阻斷程序之後，將預阻斷噬菌體混合物添加至每一抗原塗覆及阻斷孔中且在室溫下於微量滴定板(MTP)振盪器上培育2小時(h)。然後，藉由若乾洗滌步驟使用PBS洗滌掉非特異性結合之噬菌體。為洗脫特異性結合之噬菌體，在室溫下經10分鐘(min)添加25mM DTT(二硫蘇糖醇)。使用DTT洗脫物來感染大腸桿菌TG-F+細胞。在感染之後，將細菌平鋪於LB(溶源性培養液)/Cam(氯黴素)瓊脂板上且在30℃下培育過夜。自板刮除純系且用於噬菌體拯救、所選純系之多株擴增及噬菌體產生。使用經純化噬菌體開始下一輪淘選。
根據第一輪之方案來實施第二及第三輪固相淘選，只是使用更嚴格之洗滌條件。
所選Fab片段之亞選殖及微表現
為促進可溶性Fab之快速表現，將所選HuCAL PLATINUM®噬菌體之Fab編碼插入序列自pMORPH®30顯示載體亞選殖至pMORPH®x11表現載體pMORPH®x11_FH中。
對於初始篩選及表徵而言，使用0.5mg/mL溶菌酶、0.8mM EDTA及4U/μl Benzonase裂解個別表現Fab之大腸桿菌純系之過夜培養物。將含有Fab之大腸桿菌裂解物用於ELISA及FACS篩選。
ELISA篩選
使用ELISA篩選，自針對靶抗原結合之淘選輸出鑑別單一Fab純系。使用含有Fab之粗製大腸桿菌裂解物測試Fab。
為驗證所製得大腸桿菌裂解物中之Fab表現，使用以1：1000稀釋於PBS中之Fd片段特異性綿羊抗人類IgG塗覆MaxisorpTM(Nunc)384孔板。在使用存於PBS中之5%脫脂奶粉阻斷板之後，添加含有Fab之大腸桿菌裂解物。藉由結合鹼性磷酸酶之F(ab)2特異性山羊抗人類IgG(以1：5000稀釋)使用Attophos螢光受質(Roche，目錄編號：11681982001)檢測Fab結合。使用430nm下之激發記錄535nm下之螢光發射。
為鑑別結合Fab片段之P-鈣黏蛋白抗原，使用25nM人類P-鈣黏蛋白抗原經由在PBS中進行被動吸附來塗覆MaxisorpTM(Nunc)384孔板。在使用存於PBS中之5%脫脂奶粉阻斷板之後，添加含有Fab之大腸桿菌裂解物。藉由結合鹼性磷酸酶之F(ab)2特異性山羊抗人類IgG(以1：5000稀釋)使用Attophos螢光受質(Roche，目錄編號：11681982001)檢測Fab結合。使用430nm下之激發記錄535nm下之螢光發射。
FACS篩選(螢光活化細胞分選)
在FACS篩選中，自淘選輸出鑑別結合細胞表面表現抗原之單一Fab純系。使用含有Fab之粗製大腸桿菌裂解物測試Fab之細胞結合。
將50μl細胞懸浮液轉移至新鮮96孔板中(得到1×105個細胞/孔)且與50μl含有Fab之細菌提取物混合。
然後將細胞-抗體懸浮液在振盪器中於冰上培育1小時。在培育後，旋轉細胞且使用冰冷FACS緩衝劑洗滌兩次。在每一洗滌步驟之後，離心細胞且小心再懸浮。
添加二級檢測抗體(PE結合山羊抗人類IgG；Dianova)並在冰上培 育試樣，且隨後根據Fab培育洗滌。在FACSCaliburTM儀器中測定螢光強度。
HuCAL ® Fab片段之表現及純化
在大腸桿菌TG1 F-細胞中表現Fab片段。將培養物在30℃下振盪18h。收穫細胞且破裂。經由IMAC及凝膠過濾分離加His6標籤之Fab片段且藉由UV分光光度測定法在280nm下測定蛋白質濃度。
以原始狀態藉由質譜(MS)測定Fab製劑之身份及純度。
交叉反應性分析
在ELISA中測試純化Fab與人類、食蟹猴、大鼠及小鼠P-鈣黏蛋白ECD蛋白之結合。為此，使用抗原以存於PBS中之10ug/mL之濃度在4℃下過夜塗覆MaxisorpTM(Nunc)384孔板。藉由結合鹼性磷酸酶之F(ab)2特異性山羊抗人類IgG(以1：5000稀釋)使用Attophos螢光受質(Roche，目錄編號：11681982001)檢測Fab結合。使用430nm下之激發記錄535nm下之螢光發射。
至IgG之轉化及IgG表現
為在HEK細胞中表現全長IgG，將重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變結構域片段自Fab表現載體亞選殖至用於人類IgG1之適當pMorph®_hIg載體中。在轉染後10天收穫細胞培養上清液。在無菌過濾之後，使用液體處置站對溶液實施蛋白質A親和層析。實施緩衝劑交換至1x Dulbecco's PBS(pH 7.2,Invitrogen)且將試樣無菌過濾(0.2μm孔徑)。藉由UV分光光度測定法在280nm下測定蛋白質濃度且在變性、還原條件下於SDS-PAGE中分析IgG純度。
生物分析
在下文所例示之分析中評估遵循上文所闡述之淘選製程所獲得之抗P-鈣黏蛋白抗體：
HCC1954細胞內在化分析
為測定抗P-鈣黏蛋白抗體發生靶調介細胞內在化之能力，使用表現P-鈣黏蛋白之HCC1954腫瘤細胞系確立基於顯微術之內在化分析。
將細胞再懸浮於完整生長培養基(RPMI-1640+10% FCS)中且在5×103個細胞/孔之細胞密度下以100μl接種至平底顯微96孔分析板(ViewPlate®-96 F TC,Perkin Elmer,6005225號)中並在37℃及5% CO2下培育2天。
在兩天之後，將HuCAL®抗體(IgG)在PBS中稀釋至期望濃度。將100μl抗體溶液添加至接種細胞中且培育2h。然後，使用PBS將細胞洗滌兩次，使用1×CellFIX試劑(CellFIXTM,BD Biosciences,340181號)固定，使用PBS再洗滌兩次且使用0.1% Triton X-100滲透化。然後使用1×Odyssey緩衝液(Li-Cor,927-40000號)將細胞阻斷1h。在抽吸之後，使用Hoechst(bisBenzimide H 33342 trichloride,B2261號，Sigma)及Alexa Fluor® 488山羊抗人類IgG(Invitrogen,A-11013號)將細胞染色1h。在染色之後，使用PBS將細胞洗滌三次且使用Cellomics ArrayScan VTI HCS讀取儀(Thermo Fischer Scientific)分析。為評價半最大內在化濃度(IC50值)，實施IgG滴定，其中在4倍稀釋步驟中涵蓋10nM至2.4pM範圍。
轉譯後修飾(PTM)位點之去除
發現一種抗體NOV169(其係在上文所闡述內在化分析中鑑別且發現有效內在化至表現P-鈣黏蛋白之腫瘤細胞HCC1954中)在HCDR1中含有單一N31S PTM位點。為防止去醯胺化，藉由單點Kunkel誘變將此位點轉化成N31Q位點，從而得到抗體NOV169N31Q。藉由forteBIO KD測定證實NOV169N31Q與親代NOV169相比與重組人類P-鈣黏蛋白具有等效結合強度。
抗體匯總
表1陳述自 Morphosys HuCAL PLATINUM ® 噬菌體文庫 分離之抗 P-鈣黏蛋白抗體及衍生自鼠類雜交瘤之人類化抗P-鈣黏蛋白抗體之相關序列資訊。
實例2：人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2及其與NOV169N31Q Fab之複合物之X射線晶體學結構測定
人類P-鈣黏蛋白之三維結構迄今未知。測定人類P-鈣黏蛋白ECD(細胞外結構域)片段(前兩個N-末端鈣黏蛋白重複結構域或EC1_EC2胺基酸108至324，SEQ ID NO：2，表1)以及其與NOV169N31Q(表1)之Fab片段之複合物之晶體結構。如下文所詳述，表現人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2，再摺疊，純化且結晶。此外，將經純化人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2與NOV169N31Q Fab混合以形成複合物，隨後亦純化該複合物且結晶。然後採用蛋白質結晶學來生成呈游離狀態及結合至NOV169N31Q Fab之狀態之人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2之原子拆分數據以定義表位。
用於結晶學之人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2及NOV169N31Q Fab之蛋白質產生
經產生用於結晶學之人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2及NOV169N31Q Fab之胺基酸序列展示於表3中。人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2之構築體包括人類P-鈣黏蛋白(UniProt標記符P22223，SEQ ID NO：126)之殘基108至324(加以下劃線)以及來自重組表現載體(以小寫字母展示，SEQ ID NO：127)之N-末端殘基。對於NOV169N31Q Fab而言，展示重鏈及輕鏈之胺基酸序列以及C-末端鑑別/純化標籤(以小寫字母展示，分別為SEQ ID NO：128及129)。
選殖具有N-末端六組胺酸標籤(後接有PreScission裂解位點)之人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2且表現於具有pET28載體之大腸桿菌BL21(DE3)Star(Invitrogen)中。在18℃下使用IPTG過夜誘導後，收穫細胞(67g)且使用弗氏細胞壓碎器(French press)在700ml 50mM TRIS(pH 8.0)、500mM NaCl、10%甘油、2mM TCEP及14片無EDTA cOmplete蛋白酶抑制劑混合劑(Roche)中裂解。在離心(35min，在18,000rpm下，使用SS34轉子)之後，無菌過濾(0.45μm)上清液且裝載於使用緩衝劑A(50mM pH 8.0 TRIS、500mM NaCl、10%甘油)預平衡之粗製FF金屬螯合層析管柱(5ml,GE Healthcare)上。首先使用平衡緩衝劑洗滌管柱且然後使用包含25mM咪唑之緩衝劑A洗滌，隨後使用25mM至500mM咪唑梯度洗脫。然後在針對50mM pH 8.0 TRIS過夜透析期間使用PreScission蛋白酶(10μg/mg)裂解所洗脫蛋白質(36mg)。在過濾(0.22μm)之後，將試樣裝載於使用50mM pH 8.0 TRIS預平衡之MonoQ陰離子交換層析管柱(GE Healthcare)上，且使用0.0M至1.0M NaCl梯度洗脫。收集含有P-鈣黏蛋白EC1_EC2(25.6mg)之主峰且藉由SDS-PAGE及HPLC分析。然後將餾分池再裝載於使用前述50mM pH 8.0 TRIS、500mM NaCl、10%甘油預平衡之粗製FF金屬螯合層析管柱(5ml,GE Healthcare)上。在流出物中回收P-鈣黏蛋白EC1_EC2蛋白，且藉由HPLC及LC-MS分析。LC-MS分析展示預期分子量(23,837Da)。
將NOV169N31Q Fab以1公升規模表現於大腸桿菌中。首先，將編碼Fab片段之質粒轉變成化學感受態TG1F-大腸桿菌細胞中。在37℃下於LB/瓊脂/1%葡萄糖/34μg/ml氯黴素板上過夜生長細菌之後，使用一種菌落接種6ml預培養(2xYT/1.0%葡萄糖/34μg/ml氯黴素)。在30℃下將培養物培育過夜且在220rpm下振盪。第二天，將預培養物轉移至1公升表現培養物(2xYT/0.1%葡萄糖/34μg/ml氯黴素)中。在30℃下培育表現培養物，在220rpm下振盪直至達到OD600nm為0.6-0.8為止。藉由添加IPTG至最終濃度為0.5mM來誘導表現。在25℃及220rpm下實施表現過夜。第二天，將細胞丸化且在-80℃下冷凍。
在2個步驟中使用自動化方案在AEKTA表現系統(軟體：Unicorn_v5.11)上純化Fab片段。將細菌糰粒首先再懸浮於40ml裂解緩衝劑(200mM pH 7.4磷酸鈉、0.5M NaCl、0.1%溶菌酶、2mM MgCl2、10U/ml benzonase、1片/50ml cOmplete無EDTA蛋白酶抑制劑)且在室溫及振盪下培育1小時。藉由在16,000g下離心30min來去除細胞碎片。使含有Fab之上清液通過0.2μM注射過濾器(Pall,PN4525號)且裝載於使用運行緩衝劑(20mM磷酸鹽鈉、0.5M NaCl、10mM咪唑，pH 7.4)預平衡之系統上。在1ml HiTrap HP管柱(GE Healthcare)上實施第一純化步驟。使用運行緩衝劑洗滌管柱且使用洗脫緩衝劑(20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、250mM咪唑，pH 7.4)洗脫加His6標籤之Fab片段。將峰部分自動施加於凝膠過濾管柱(HiLoad 16/60 Superdex 75；GE Healthcare)上。在PBS中洗脫經純化Fab片段。藉由UV280nm量測且藉由應用Lambert-Beer方程式的使用自胺基酸序列估計之消光係數來測定Fab片段之濃度。
人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2之結晶及結構測定
針對10mM pH 7.4 Tris-HCl、25mM NaCl透析人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2，濃縮至15mg/ml且篩選以用於在20℃下結晶。
在96孔SD2板中藉由坐式蒸氣擴散法生長晶體。詳細而言，將0.2μl蛋白質與0.2μl儲槽溶液混合，且針對80μl相同儲槽溶液在20℃下平衡液滴。使用由0.085M pH 7.5 HEPES、3,655M NaCl、15%甘油製得之儲槽溶液獲得適用於X射線繞射分析之晶體。
對於數據收集而言，將一種人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2晶體安裝於冷凍環中且直接在液氮中快速冷卻。在瑞士光源(Swiss Light Source)(Paul Scherrer Institute,Switzerland)之光束線X10SA(PX-II)下使用Pilatus像素檢測器及0.99999Å波長X射線收集繞射數據。在200mm之晶體至檢測器距離下記錄每一0.25度振盪下之總共720個影像。處理數據且以1.40Å解析度使用XDS進行評定(Kabsch(1993)J.Appl.Crystallogr.26：795-800)，如在APRV-INDEX中所實施(Kroemer,Dreyer,Wendt(2004)Acta Crystallogr.Sect.D：Biol.Crystallogr.60：1679-1682)。晶體呈空間群C2形式，其中晶胞尺寸為a=120.89Å、b=76.52Å、c=46.21Å、α=90°、β=107.79°、γ=90°。藉由分子置換使用程式Phaser(McCoy等人(2007)J.Appl.Cryst.40：658-674)及PDB條目1L3W(非洲爪蟾(X.Laevis)C-鈣黏蛋白，3.08Å，55%序列一致性)解析人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2結構。在COOT中構建最終模型(Emsley等人(2010)Acta Crystallogr.Sect.D：Biol.Crystallogr.66：486-501)且使用Buster精修(Global Phasing,LTD)至R work及R free值分別為19.8%及21.3%，其中鍵長度及鍵角之rmsd分別為0.010Å及1.13°。
人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2結構
人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2(胺基酸殘基108至322)之晶體結構展示於圖1中。兩種鈣黏蛋白結構域皆具有充分定義之電子密度且展示預期整體摺疊。在結構域界面處觀察到三種鈣離子。
已提出，鈣黏蛋白之ECD結構域在黏著連接(其控制分子間黏附)之細胞外構造中發揮一定作用。連接總成涉及鈣黏蛋白簇之胞外結構域之間之反式及順式同型相互作用(Boggon等人(2002)Science 296：1308-1313；Harrison等人(2011)Structure 19：244-256)。反式同型相互作用涉及呈相反定向之兩個鈣黏蛋白分子(由兩個不同細胞呈遞)之EC1結構域之間的N-末端Trp交換(「鏈交換二聚體」)。與之相反，順式同型相互作用涉及一個分子之N-末端細胞外鈣黏蛋白(EC1)結構域及相同定向之另一分子之第二(EC2)結構域。反式相互作用可視為遠強於順式相互作用。儘管反式相互作用形成分子間黏附之分子基礎，順式相互作用可視為經由分子群聚促進細胞黏附。
人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2片段之晶體結構展示，涉及順式同型相互作用(經由Trp交換)之N-末端區段並不參與晶體中之該等相互作用且結合至其自身結構域。另外，晶體堆積之分析揭示，一種對稱性相關P-鈣黏蛋白EC1_EC2分子具有高度類似於彼等已針對其他鈣黏蛋白所報導相互作用之順式同型相互作用，從而展示結晶在此情形下係由順式同型相互作用驅動。
NOV169N31Q Fab複合物之結晶及結構測定
藉由以下方式來製備人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2與NOV169N31Q Fab之複合物：以1.5：1.0莫耳比率混合經純化人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2及NOV169N31Q Fab(藉由HPLC量測濃度)且在Superdex 200(GE Healthcare)尺寸排除層析(在10mM pH 7.5 Tris-HCl、150mM NaCl中使用2片無EDTA cOmplete蛋白酶抑制劑混合劑(Roche)平衡)上純化 複合物。藉由SDS-PAGE及LCMS分析峰部分。將含有人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2/NOV169N31Q Fab複合物之部分濃縮至約12mg/ml，添加CaCl2直至最終濃度為5mM且篩選試樣以用於在20℃下結晶。
在96孔SD2板中藉由坐式蒸氣擴散法生長晶體。詳細而言，將0.2μl蛋白質與0.2μl儲槽溶液混合，且針對80μl相同儲槽溶液在20℃下平衡液滴。使用由0.2M乙酸鈣、10%(w/v)PEG 8,000、0.1M pH 6.5 MES製得之儲槽溶液獲得適用於X射線繞射分析之晶體。
在數據收集之前，將一種人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2/NOV169N31Q Fab晶體簡單轉移至儲槽溶液與20% PEG 8,000、30%甘油之1：1混合物中，且在液氮中快速冷卻。
在瑞士光源(Paul Scherrer Institute,Switzerland)之光束線X10SA(PX-II)下使用Pilatus像素檢測器及0.99999Å波長X射線收集繞射數據。在340mm之晶體至檢測器距離下記錄每一0.25度振盪下之總共720個影像。處理數據且以2.10Å解析度使用XDS進行評定(Kabsch(1993)J.Appl.Crystallogr.26：795-800)，如在APRV-INDEX中所實施(Kroemer,Dreyer,Wendt(2004)Acta Crystallogr.Sect.D：Biol.Crystallogr.60：1679-1682)。晶體呈空間群P21212形式，其中晶胞尺寸為a=172.64Å、b=77.79Å、c=133.41Å、α=90°、β=90.0°、γ=90°。藉由分子置換使用Phaser解析人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2/NOV169N31Q Fab複合物結構(McCoy等人(2007)J.Appl.Cryst.40：658-674)。在COOT中構建最終模型(Emsley等人(2010)Acta Crystallogr.Sect.D：Biol.Crystallogr.66：486-501)且使用Buster精修(Global Phasing,LTD)至R work及R free值分別為19.2%及22.1%，其中鍵長度及鍵角之rmsd分別為0.010Å及1.18°。藉由CCP4程式套件之程式Ncont鑑別人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2中含有NOV169N31Q Fab中任一原子之4.0Å內之原子的殘基(Collaborative Computing Project，第4期(1994)Acta Crystallogr. Sect.D：Biol.Crystallogr.50：760-763)且列示於表4及5中。藉由CCP4程式套件之程式AREAIMOL鑑別人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2中在結合NOV169N31Q抗體後變得不易於接近溶劑之殘基。
用於NOV169N31Q之P-鈣黏蛋白EC1_EC2表位
使用P-鈣黏蛋白EC1_EC2/NOV169N31Q Fab複合物之晶體結構來鑑別用於NOV169N31Q之P-鈣黏蛋白EC1_EC2表位。X射線分析展示，NOV169N31Q結合至人類P-鈣黏蛋白之EC1結構域(N-末端鈣黏蛋白重複結構域)(圖2)。在晶體之不對稱單元(不對稱單元含有所有藉由應用晶體學對稱性映射來再生整個晶體所需之結構資訊)中存在兩個拷貝之NOV169N31Q Fab-人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2複合物。兩個拷貝共有與NOV169N31Q Fab接觸之幾乎相同殘基，只是因晶體堆積而略有變化。
人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2上關於NOV169N31Q Fab之相互作用表面係由兩個不連續(亦即非鄰接)序列形成，該兩個序列完全包括於P-鈣黏蛋白之EC1結構域內且涵蓋殘基123至127及殘基151至177(圖3)。在彼等殘基中，殘基124及125及殘基151至172有助於短於4.0Å之直接分子間接觸(在非氫原子之間)，如表4及5中所詳述且展示於圖3中。該等殘基形成由NOV169N31Q Fab識別之三維表面(圖4)。
與人類P-鈣黏蛋白之其他細胞外鈣黏蛋白重複結構域相比，EC1結構域並不具有任一已知N-連接或O-連接糖基化位點。結合P-鈣黏蛋白之NOV169N31Q由此並無糖基化。亦應注意，人類P-鈣黏蛋白EC1結構域之胺基酸序列在食蟹猴(長尾猴)P-鈣黏蛋白中完全保守(圖5)。因此，由NOV169N31Q識別之P-鈣黏蛋白表位在用於毒理學研究中之此猴物種中完全保守。
人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2之Glu155係製備關於NOV169N31Q Fab之大部分接觸之表位殘基(參見圖3)。有趣的是，Glu155位於僅發現於人類鈣黏蛋白1至4中之非保守插入內，如藉由所有人類鈣黏蛋白之多重序列比對所展示(圖6)。因Glu155自身在人類鈣黏蛋白1、2及4中並不保守，故預計NOV169N31Q顯示針對人類鈣黏蛋白-3(aka人類P-鈣黏蛋白)之高選擇性。
如上文已提及，鈣黏蛋白在分子間黏附之分子機制中發揮重要作用，該分子間黏附涉及鈣黏蛋白簇之胞外結構域之間之強反式及弱順式同型相互作用。(Boggon等人(2002)Science 296：1308-1313；Harrison等人(2011)Structure 19：244-256)。基於人類P-鈣黏蛋白EC1_EC2/NOV169N31Q Fab複合物之晶體結構，用於NOV169N31Q之結合表位似乎部分地與涉及順式同型相互作用之EC1結構域之表面區重疊，但並不與涉及反式(分子間)同型相互作用之N-末端區重疊。 因此，NOV169N31Q並不與強反式相互作用競爭鈣黏蛋白結合，且由此更易於接近其結合表位。另外，此抗體與其靶抗原之結合預計並不完全破壞分子間黏附，此乃因反式同型相互作用得以保留。
實例3：P-鈣黏蛋白抗體藥物結合物之生成及表徵 藉由單步驟製程製備DM1結合物
在開始結合反應之前，經由切向流過濾(TFF 1號)將P-鈣黏蛋白抗體透析過濾至反應緩衝劑(15mM磷酸鉀、2mM EDTA，pH 7.6)中。隨後，將抗體(5.0mg/mL)與DM1(相對於抗體量5.6倍莫耳過量)混合且然後與SMCC(相對於抗體量4.7倍過量)混合。在20℃下於含有2mM EDTA及10% DMA之15mM磷酸鉀緩衝劑(pH 7.6)中實施反應大約16小時。藉由添加1M乙酸以調整pH至5.50來終止反應。在pH調整之後，經由多層(0.45/0.22μm)PVDF過濾器過濾反應混合物且純化並使用切向流過濾(TFF 2號)透析過濾至含有8.22%蔗糖之20mM組胺酸緩衝劑(pH 5.6)中。用於切向流過濾之儀器參數列示於下表6中。
藉由以下方式分析自上文所闡述製程獲得之聚合物：UV光譜，用於分析細胞毒性劑載量(類美登素對抗體比率，MAR)；SEC-HPLC，用於測定結合物單體；及反相HPLC或疏水性屏蔽相(Hisep)- HPLC，用於分析游離類美登素百分比。數據展示於表7中。
藉由原位製程製備DM1結合物
本發明結合物亦可藉由原位製程根據下列程序製得。使用4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)連接體使P-鈣黏蛋白抗體與DM1結合。在DMA中製備DM1及磺基-SMCC異雙功能連接體之儲備溶。將磺基-SMCC及DM1硫醇在25℃下於含有40% v/v 50mM琥珀酸鹽緩衝劑水溶液、2mM EDTA之DMA(pH 5.0)中以1.3：1莫耳當量之DM1對連接體比率及1.95mM之最終DM1濃度一起混合以反應10分鐘。然後使抗體與反應等分試樣在2.5mg/mL Ab之最終結合條件下於50mM EPPS(pH 8.0)及10% DMA(v/v)中進行反應以得到約6.5：1之SMCC對Ab之莫耳當量比率。在25℃下於大約18小時之後，使用利用10mM琥珀酸鹽、250mM甘胺酸、0.5%蔗糖、0.01% Tween 20(pH 5.5)平衡之SEPHADEXTM G25管柱純化結合反應混合物。
使用SPDB連接體製備ADC
使用4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDB，4.0-4.1倍莫耳過量)在25℃下於含有50mM磷酸鉀、50mM NaCl、2mM EDTA及5% DMA之60mM EPPS緩衝劑(pH 8.5)中將P-鈣黏蛋白抗體(8mg/ml)修飾120分鐘。隨後在25℃下於含有50mM磷酸鉀、50mM NaCl、2mM EDTA及5% DMA之60mM EPPS緩衝劑(pH 8.5)中以4mg/mL之最終修飾抗體濃度經18小時使未經純化之修飾Ab結合至DM4(較未結合連接體1.5倍莫耳過量)。使用利用10mM琥珀酸鹽、250mM甘胺酸、0.5%蔗糖、0.01% Tween 20(pH 5.5)平衡及洗脫之SEPHADEXTM G25管柱純化結合反應混合物。
使用CX1-1連接體製備ADC 將抗體NEG0067(5.0mg/mL)與DM1(相對於抗體量7.4倍莫耳過量)混合且然後與CX1-1(相對於抗體量5.7倍過量)混合。在25℃下於含有2mM EDTA及5% DMA之50mM EPPS[4-(2-羥乙基)-1-六氫吡嗪丙烷磺酸]緩衝劑(pH 8.0)中實施反應大約16小時。然後使用在10mM琥珀酸鹽、250mM甘胺酸、0.5%蔗糖、0.01% Tween 20(pH 5.5)中平衡及洗脫之SEPHADEXTM G25管柱純化反應混合物。
表10. CX1-1/DM1結合之NEG0067之性質
實例4：P-鈣黏蛋白抗體及ADC對P-鈣黏蛋白之親和力
使用SPR技術、使用Biacore® T100儀器(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)或Biacore® 2000儀器(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)且使用CM5感測器晶片測定各種抗體及抗體藥物結合物(呈Ab-MCC-DM1格式)對P-鈣黏蛋白及其物種直系同源物之親和力。
簡言之，使用補充有2% Odyssey®阻斷緩衝劑(Li-Cor Biosciences,Lincoln,NE)之HBS-P+(0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、0.05%表面活性劑P20)作為用於Biacore® T100儀器上之所有實驗之運行緩衝劑。使用補充有2% Odyssey®阻斷緩衝劑之HBS-P(0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、0.005%表面活性劑P20)作為用於Biacore® 2000儀器上之所有實驗之運行緩衝劑。藉由反應單位(RU)量測固定程度及分析物相互作用。實施中試實驗以測試及證實蛋白質A(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)之固定可能性及測試抗體之捕獲。
對於動力學量測而言，實施實驗，其中經由固定蛋白質A將抗體捕獲至感測器晶片表面上且測定P-鈣黏蛋白在游離溶液中結合之能力。簡言之，經由胺偶合以10μl/分鐘之流速在兩個流通池上將28μg/ml pH 4.5蛋白質A固定於CM5感測器晶片上以達到2300-3300RU。然後以5μl/min經3分鐘注射0.01-0.25μg/ml測試抗體。抗體之捕獲量通常保持於低於400RU。隨後，以2倍系列稀釋6.25-100nM P-鈣黏蛋白ECD且以40μl/min之流速經2-4min注射於參考及測試流通池上。所測試ECD列示於下表11中。使結合解離5min。在每一注射循環之後，使用pH 7.4 PBS/6M胍-HCl以100μl/min再生晶片表面45秒。在25℃下實施所有實驗且利用簡單1：1相互作用模型使用Biacore T100評 估軟體2.0.3版(GE Healthcare)整體擬合反應數據以在Biacore® T100儀器上獲得締合速率(ka)、解離速率(kd)及親和力(KD)之估計值。利用簡單1：1相互作用模型使用Scrubber 2 ®軟體2.0b版(BioLogic軟體)整體擬合在Biacore® 2000儀器上運行之實驗以獲得締合速率(ka)、解離速率(kd)及親和力(KD)之估計值。
表12列示表1中所揭示之各種P-鈣黏蛋白抗體之結構域結合及親和力。如表中所展示，抗體NOV169N31Q、NEG0012、NEG0013、NEG0016、NEG0064及NEG0067皆與人類P-鈣黏蛋白在毫微莫耳層面上進行反應，且對於彼等針對食蟹猴P-鈣黏蛋白ECD所測試者具有類似親和力。所有抗體皆與大鼠交叉反應，NOV169N31Q除外。
ND=未測定
實例5：生物化學分析中之NOV169N31Q-MCC-DM1/NOV169N31Q選擇性
為檢驗NOV169N31Q-MCC-DM1之脫靶交叉反應性可能，評估NOV169N31Q與在相應ECD：E-鈣黏蛋白(CDH1)或N-鈣黏蛋白(CDH2)中具有最高胺基酸序列一致性程度之兩個緊密相關之經典鈣黏蛋白家族成員之結合。
為評價結合P-鈣黏蛋白與E-鈣黏蛋白及N-鈣黏蛋白之特異性，將Maxisorp 384孔板在4℃下與重組人類E-鈣黏蛋白或N-鈣黏蛋白ECD一起過夜且使用酶連接免疫吸附分析(ELISA)格式分析Fab片段。在洗滌之後，使用存於1xPBST中之5%脫脂奶粉將板阻斷2h。添加含有Fab之大腸桿菌裂解物且在室溫(RT)下結合1h。為檢測結合之Fab片段，使用TBST將板洗滌5次且以1/2500稀釋度添加AP-抗人類IgG F(ab')2。在室溫下1h之後，使用TBST將板洗滌5次且根據製造商說明添加AttoPhos受質。在添加受質之後，在ELISA讀取儀中讀取板5分鐘。
利用ELISA方法，據檢測，候選抗P-鈣黏蛋白抗體NOV169N31Q對人類E-鈣黏蛋白或N-鈣黏蛋白並無顯著結合。
實例6：生物化學分析中之NOV169N31Q-MCC-DM1/NOV169N31Q選擇性
為檢驗NOV169N31Q-MCC-DM1之脫靶交叉反應性可能，評估 NOV169N31Q與在相應ECD：E-鈣黏蛋白(CDH1)或N-鈣黏蛋白(CDH2)中具有最高胺基酸序列一致性程度之兩個緊密相關之經典鈣黏蛋白家族成員之結合。
為評價結合P-鈣黏蛋白與E-鈣黏蛋白及N-鈣黏蛋白之特異性，將Maxisorp 384孔板在4℃下與重組人類E-鈣黏蛋白或N-鈣黏蛋白ECD一起過夜且使用酶連接免疫吸附分析(ELISA)格式分析Fab片段。在洗滌之後，使用存於1xPBST中之5%脫脂奶粉將板阻斷2h。添加含有Fab之大腸桿菌裂解物且在室溫(RT)下結合1h。為檢測結合之Fab片段，使用TBST將板洗滌5次且以1/2500稀釋度添加AP-抗人類IgG F(ab')2。在室溫下1h之後，使用TBST將板洗滌5次且根據製造商說明添加AttoPhos受質。在添加受質之後，在ELISA讀取儀中讀取板5分鐘。
利用ELISA方法，據檢測，候選抗P-鈣黏蛋白抗體NOV169N31Q對人類E-鈣黏蛋白或N-鈣黏蛋白並無顯著結合。
實例7：NOV169N31Q對P-鈣黏蛋白功能之影響之評價
實施研究以評價抗P-鈣黏蛋白抗體NOV169N31Q(抗體藥物結合物NOV169N31Q-MCC-DM1之組份)在細胞分析中對P-鈣黏蛋白施加功能效應之能力。P-鈣黏蛋白係表現於癌細胞之細胞表面上之同型細胞黏附分子，由此採用使用P-鈣黏蛋白陽性HCT116細胞及P-鈣黏蛋白陰性HT-29細胞之球形體完整性分析評價抗體之潛在拮抗性質。此分析之讀出為球形體之形狀及緊度，如藉由細胞DNA之亮視野顯微術及7-AAD螢光檢測所測定。
以6,000個細胞/孔之密度在96孔圓底超低連接板(Corning，目錄編號：7007)中使用或不使用人類IgG1同種型對照Ab(10μg/mL)或NOV169N31Q(10μg/mL)接種HCT116細胞(P-鈣黏蛋白陽性)或HT29細胞(P-鈣黏蛋白陰性)。將細胞在37℃及5% CO2下置於定軌振盪器(60rpm)上。在平鋪細胞之後116小時添加7-胺基更生黴素D(7- AAD；BD Pharmingen，目錄編號：559925)以標記細胞DNA。在平鋪細胞之後132小時在GE IN細胞分析儀2000上使用Texas Red濾波器實施7-AAD成像。自每一孔獲取7-9「z」影像堆疊且使用IN Cell Developer Toolbox 1.8程式塌陷影像堆疊。
在圖7中，在表現P-鈣黏蛋白之HCT116細胞但非在P-鈣黏蛋白陰性HT29細胞中，NOV169N31Q對P-鈣黏蛋白調介之細胞黏附展示較小但可辨別之效應，如藉由亮視野顯微術及藉由7-AAD(基於DNA)成像測定之球形體密度分析所證實。與之相反，非特異性對照人類IgG1抗體對多細胞球形體之完整性並無影響。因此，NOV169N31Q可為P-鈣黏蛋白功能之活體外及/或活體內部分拮抗劑。
實例8：細胞增殖及存活之NOV169N31Q-MCC-DM1抑制
使用CellTiterGlo®增殖分析評價NOV169N31Q-MCC-DM1抑制細胞增殖及存活之能力。
在最適於在5% CO2及37℃下於組織培育器中生長之培養基中培養細胞系。在接種以用於增殖分析之前，將細胞在分析之前分裂至少2天以確保最佳生長密度。在接種當天，使用0.25%胰蛋白酶將細胞自組織培養燒瓶剝離。使用細胞計數器(Vi-Cell XR細胞存活率分析儀，Beckman Coulter)測定細胞存活率及細胞密度。將存活率高於85%之細胞以2,500個細胞/孔之密度接種於黑壁透明底96孔板(Corning，目錄編號：3904)中之50μL標準生長培養基中。使用PBS填充板邊緣處之孔以最小化孔體積上之蒸發效應。將板在37℃下於組織培育器中培育過夜。第二天，以2X在標準生長培養基中製備游離美登素(L-DM1-Me)、NOV169N31Q-MCC-DM1及非靶向ADC對照(IgG1-SMCC-DM1)。然後將所製得藥物治療劑添加至細胞中以使得最終濃度介於0-100nM之間且最終體積為100μL/孔。每一藥物濃度以一式三份進行測試。將板在37℃下於組織培育器中培育過夜或培育5天，然後經由 添加100μL CellTiter Glo®(Promega，目錄編號：G7573，其係裂解細胞且量測總三磷酸腺苷(ATP)含量之試劑)評價細胞存活率。將板在室溫下於暗處在定軌振盪器上以提供適當混合之速度培育3分鐘以誘導細胞裂解。將板在室溫下培育10分鐘以穩定發光信號，然後使用發光計數器(Wallac 1450 MicroBeta TriLux,Perkin Elmer)進行讀數。在接種後次日(第0天讀數)及在藥物暴露5天之後(第5天讀數)獲取未處理細胞之發光計數。根據分析說明書，將未處理細胞之第5天讀數與第0天讀數進行比較。在培育時段期間使用至少一種細胞倍增之分析可視為有效。為評估藥物處理之效應，使用來自含有未處理細胞(100%存活率)之孔之發光計數來正規化所處理試樣。使用Graph Pad Prism 6軟體計算IC50值。每一細胞系評估至少3次且展示代表性IC50值。
NOV169N31Q-MCC-DM1具有3.8個結合每一抗體之DM1分子之目標平均值(藥物對抗體比率或DAR為3.8)。展示3種代表性細胞系之劑量-反應曲線(圖8)。計算抑制50%之細胞生長或存活所需治療劑之濃度(IC50)，其中所測試細胞系之代表性IC50值匯總於表13中。
未結合抗體NOV169N31Q顯示為並非細胞毒性且並非增殖性，而NOV169N31Q-MCC-DM1強力抑制P-鈣黏蛋白表現細胞系中之增殖及存活。任一分子在P-鈣黏蛋白陰性細胞系HT29中皆非活性(圖8)。與之相比，NOV169N31Q-MCC-DM1強力抑制兩種乳癌細胞系HCC1954及HCC70之生長。表13匯總NOV169N31Q-MCC-DM1在一組細胞系中之活性。與同種型匹配之非靶向對照ADC(IgG1-MCC-DM1)相比，NOV169N31Q-MCC-DM1通常針對表現>50,000個細胞表面拷貝P-鈣黏蛋白/細胞之細胞系展示細胞毒性活性。該等研究指示，NOV169N31Q-MCC-DM1之細胞毒性效應係由ADC之內在化美登素組份所致且NOV169N31Q-MCC-DM1特異性靶向過度表現P-鈣黏蛋白之細胞。
實例9：NOV169N31Q及NOV169N31Q-MCC-DM1誘導之ADCC活性之活體外評價
除對增殖之影響外，亦評估NOV169N31Q及NOV169N31Q-MCC-DM1介導抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)之能力。
效應細胞係自AllCells,LLC獲得之原始人類天然殺傷(NK)細胞(目錄編號：PB012：新鮮/原始正常PB CD56+ NK細胞)。靶細胞係自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(P-鈣黏蛋白陽性HCC1954，P-鈣黏蛋白陰性HT-29)經由Novartis Cell Services(NCS)獲得。使用無胰蛋白酶細胞解離緩衝劑(「細胞解離緩 衝劑」，來自Gibco，目錄編號：13151-014)將HCC1954及HT-29靶細胞自組織培養器皿剝離，使用PBS洗滌2-3次，且再懸浮於培養基中。以人工方式或使用自動化細胞計數器來計數細胞。將存活率>90%之細胞以1×105個細胞/mL懸浮於培養基中。洗滌人類NK細胞且以與靶細胞系相同之方式計數。然後以1-2×106個細胞/mL將效應細胞懸浮於細胞培養基中。
治療劑包含NOV169N31Q抗體、匹配同種型對照抗體(IgG1對照)以及抗體藥物結合物NOV169N31Q-MCC-DM1及IgG1-SMCC-DM1。將5000個存於50μL培養基中之靶細胞接種於96孔平底板(Corning 3603號)中。然後在37℃下於25μL培養基中經20分鐘以4X最終濃度(最終濃度範圍為50-0.0001μg/mL，除無治療對照外)添加測試及對照抗體。然後以5：1之效應物對靶細胞比率(E：T)在25μL培養基中添加效應細胞(例如對於5：1比率而言25000個效應細胞/孔)。一式三份運行治療劑及對照(僅靶細胞、僅效應細胞、無細胞)。然後在500RPM下(不停止)於離心器中旋轉板以將細胞濃縮於板底部。然後將板在正常細胞培養條件(37℃、5% CO2)下培育24hr。
在培育時段之後，自板去除培養基且使用PBS將孔洗滌2-3次以去除非黏著效應細胞。向每一孔中添加100μL Cell Titer Glo(Promega，目錄編號：G7570)，將板避光且置於定軌振盪器上保持2分鐘。然後在發光計數器(Wallac Trilux MicroBeta 1450)上讀取板。藉由發光計數器檢測之信號與孔中剩餘之ATP量或細胞數量成正比。使用對照孔作為基線，每一處理之活細胞數量可測定為未處理對照之百分比。
NOV169N31Q-MCC-DM1及NOV169N31Q皆顯示能夠針對過度表現P-鈣黏蛋白之細胞在人類天然殺傷(NK)細胞存在下於活體外以劑量依賴性方式介導ADCC活性(圖9)。發現此活性為P-鈣黏蛋白特異性， 此乃因抗體及ADC之匹配同種型對照顯示並無顯著細胞殺滅。NOV169N31Q及NOV169N31Q-MCC-DM1皆展示對P-鈣黏蛋白陰性細胞系HT-29並無任何ADCC誘導，此亦指示抗體及抗體藥物結合物之特異性效應。因此，除將細胞毒性酬載遞送至腫瘤細胞外，ADCC代表用於在活體內殺滅腫瘤細胞之NOV169N31Q-MCC-DM1作用之另一潛在機制。
實例10：藉由抗P-鈣黏蛋白ADC達成之活體內擊中藥效動力學標記物調節
實施研究以評價P-鈣黏蛋白ADC NOV169N31Q-MCC-DM1在活體內調節G2/M停滯之藥效動力學標記物[含有磷酸-組蛋白H3(pHH3)之細胞之累積]之能力。其目標在於評估在來自使用NOV169N31Q-MCC-DM1、同種型對照ADC或僅媒劑治療之小鼠之腫瘤中G2/M細胞週期停滯之程度及持續時間。
為量測pHH3陽性細胞核之累積，如藉由免疫組織化學所評價，自Cell Signaling Technology(Danvers,MA，目錄編號：9701)獲得兔多株抗體，其係藉由使用對應於環繞人類組蛋白H3(pHH3)之磷酸化Ser10之殘基之合成磷酸肽對動物實施免疫來產生。簡言之，IHC方案包含熱及標準暴露於Ventana Cell Conditioning 1號抗原修復試劑。將原發性抗體稀釋至1：50且在室溫下培育60分鐘。隨後，使用Jackson ImmunoResearch實驗室山羊抗兔生物素化二級抗體(目錄編號：111-065-144,West Grove,PA)培育32分鐘。
為評價皮下腫瘤異種移植物模型中HCC70三陰性乳癌模型中之抗P-鈣黏蛋白ADC誘導之PD標記物變化，以含有存於漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution)中之50% MatrigelTM(BD Biosciences)之懸浮液形式向雌性SCID灰棕色小鼠經皮下植入10×106個細胞。
懸浮液中含有細胞之總注射體積為200μl。在腫瘤平均為130 mm3(n=3/組)時，隨機分配小鼠以接受單一靜脈內(IV)劑量之NOV169N31Q-MCC-DM1(10mg/kg)、非特異性IgG1-MCC-DM1同種型對照(10mg/kg)或空白媒劑對照(20mM組胺酸、8.22%蔗糖、0.02% PS-20，pH 5.6)。在投藥後長達21天之時間點收集腫瘤。作為PD反應之量度，藉由上文所闡述之免疫組織化學染色實施磷酸-組蛋白H3(pHH3)含量之定性評價。
在圖10中，與類美登素酬載之預期作用機制一致，儘管在媒劑治療腫瘤中檢測到一些基線磷酸-組蛋白H3免疫染色染色，但該等程度在NOV169N31Q-MCC-DM1治療後、尤其在投藥後2-7天之間有所升高。該等數據顯示，NOV169N31Q-MCC-DM1能夠在腫瘤異種移植物中誘發穩定細胞PD反應，此與類美登素酬載之作用機制一致。
實例11：抗P-鈣黏蛋白ADC針對小鼠中之HCC70三陰性乳癌(TNBC)模型之活體內效能(ADC效能篩選)
在乳癌中，P-鈣黏蛋白通常高度表現，此可藉由HCC70細胞系來例示，其中大約66,000個受體位於每一細胞之表面上。展示對HCC70腫瘤之P-鈣黏蛋白免疫染色之代表性照片以觀察此異種移植物模型中之染色模式(圖11A)。使用Ventana Discovery XT自動染色儀實施IHC。將福爾馬林(formalin)固定、石蠟包埋之腫瘤片段去蠟，使用Ventana Cell Conditioning 1號(CCIS)抗原修復試劑處理且然後在室溫下於初級抗體[來自BD Transduction實驗室之小鼠單株抗人類P-cad抗體(目錄編號：610228，批號：09934)]以10ug/ml之濃度培育60分鐘。隨後與以1：250之工作濃度使用之生物素化山羊抗小鼠(Jackson實驗室，目錄編號：115-066-072，批號：63620)一起培育。使用DAB Map套組(Ventana Medical，目錄編號：760-124)實施檢測。使用非特異性小鼠IgG抗體(Vector實驗室，目錄編號：I-2000，批號：V0610)作為對照以確保使用P-鈣黏蛋白抗體觀察之染色為特異性。
在腫瘤達到約215mm3時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分配至治療組中(n=8/組)且投用單一靜脈內投與之媒劑或7mg/kg ADC。選擇7mg/kg劑量值，此乃因其預計會提供辨別此模型最終ADC候選者之差異之窗口。根據個別小鼠體重調整劑量。靜脈內劑量體積為8ml/kg。
在第42天，NEG0012-MCC-DM1及NOV169N31Q-MCC-DM1治療組中之平均腫瘤體積顯著不同於同種型匹配之huIgG1-MCC-DM1對照組(單向方差分析(One way ANOVA)；杜恩法(Dunn’s Method)，p0.05)。使用ADC候選者治療之其他組與對照相比並不展示統計學不同之腫瘤體積(圖11B)。此挑選出NEG0012-MCC-DM1及NOV169N31Q-MCC-DM1作為主要ADC候選者。在任一組中觀察到皆無顯著體重損失。
實例12：NOV169N31Q-MCC-DM1針對小鼠中之HCC70三陰性乳癌(TNBC)模型之劑量依賴性活體內效能
在每一細胞之表面上具有大約66,000個受體之HCC70細胞系展示在活體外對NOV169N31Q-MCC-DM1敏感。為證實NOV169N31Q-MCC-DM1在HCC70模型中之靶定抗腫瘤活性，投與2.5、5、10及15mg/kg或10mg/kg NOV169N31Q-MCC-DM1或非特異性同種型對照IgG1-MCC-DM1之單一靜脈內治療。在雌性SCID小鼠中藉由在每一小鼠之右側腹中經皮下注射10×106個細胞來確立HCC70腫瘤。在腫瘤達到約143mm3時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分配至治療組中(n=9)。以指示之劑量值及時間表投與所有測試劑，且根據個別小鼠體重來調整劑量。靜脈內劑量體積為5ml/kg。
NOV169N31Q-MCC-DM1治療產生與劑量成比例之抗腫瘤效能，其中△T/△C %值為48%(2.5mg/kg)、1%(5mg/kg)，而10mg/kg及15mg/kg之劑量分別得到64%及61%之平均消退。在10mg/kg下達成最大 效能。所測試之5mg/kg、10mg/kg及15mg/kg組在統計學上不同於媒劑治療(P<0.05，秩方差分析(ANOVA on Ranks)/杜恩法，第59天)。10mg/kg及15mg/kg之劑量值在小鼠中誘發在治療後持續長達86天之可持續腫瘤消退，此時終止研究。
所有測試劑在研究中皆耐受且在任一治療組中皆未觀察到毒性之明顯臨床症狀，如針對並不結合小鼠P-鈣黏蛋白之ADC所預期。在所有組中，觀察與隨機化時之平均體重相比具有體重增加，且此類似於媒劑治療小鼠，如針對並不結合小鼠P-鈣黏蛋白之ADC所預期(圖12及表14)。
實例13：NOV169N31Q-MCC-DM1針對小鼠中之HCC1954乳癌模型之活體內效能
為證實在其他乳癌模型中之效能，在SCID灰棕色小鼠中之HCC1954基底樣(Her2+)乳癌異種移植物模型中評估NOV169N31Q-MCC-DM1活性。基於活體外P-鈣黏蛋白表現(84,000個受體/細胞)及NOV169N31Q-MCC-DM1敏感性來選擇HCC1954模型。如先前所闡述來實施免疫組織化學分析以顯示HCC70腫瘤中之腫瘤P-鈣黏蛋白含量(圖13A)。
在腫瘤達到約150mm3時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分配至治療組中(n=9/組)且投用單一靜脈內與之媒劑或10mg/kg IgG1-MCC-DM1或NOV169N31Q-MCC-DM1。根據個別小鼠體重調整劑量。靜脈內劑量體積為5ml/kg。
NOV169N31Q-MCC-DM1治療產生HCC1954腫瘤之56%消退，此可持續至第55天(相對於媒劑或IgG1-MCC-DM1，p<0.05，Kruskal-Wallis單向秩方差分析/杜恩法)。IgG1-MCC-DM1之效能係△T/△C %為75%且並不顯著不同於媒劑(p>0.05)。所有測試劑在研究中皆耐受且在任一治療組中皆並未觀察到毒性之明顯臨床症狀(圖13B及表15A)。
表15A：在第31天HCC1954乳癌異種移植物模型中之NOV169N31Q-MCC-DM1效能。治療對腫瘤體積及體重之效應呈現為平均值±SEM。在治療之第31天評估實驗。相對於媒劑，*p<0.001
在另一實例中，在SCID小鼠中之HCC1954基底樣(Her2+)乳癌異種移植物模型中評估NOV169N31Q-MCC-DM1活性。基於活體外P-鈣黏蛋白表現(84,000個受體/細胞)及NOV169N31Q-MCC-DM1敏感性來選擇HCC1954模型。在腫瘤達到約190mm3時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分配至治療組中(n=5/組)且投用兩個(在第0天及第7天給予)靜脈內投與之媒劑、15mg/kg NOV169N31Q或15mg/kg NOV169N31Q-MCC-DM1。根據個別小鼠體重調整劑量。靜脈內劑量體積為10ml/kg。NOV169N31Q-MCC-DM1治療產生HCC1954腫瘤之100%消退，此可持續至在第56天時研究結束(相對於媒劑，p<0.05，Kruskal-Wallis單向秩方差分析/杜恩法，圖13C)。NOV169N31Q之效能係△T/△C %為121.4%且並不顯著不同於媒劑(p>0.05)。所有測試劑在研究中皆耐受且在任一治療組中皆並未觀察到毒性之明顯臨床症狀(圖13D及表15B)。
表15B：在第56天HCC1954乳癌異種移植物模型中之NOV169N31Q-MCC-DM1效能。治療對腫瘤體積及體重之效應呈現為平均值±SEM。在治療之第56天評估實驗。相對於媒劑，*p<0.05
實例14：NOV169N31Q-MCC-DM1針對小鼠中之BICR6頭頸(下嚥鱗狀細胞癌瘤)癌症模型之活體內效能
基於在活體外70,000個受體/細胞之P-鈣黏蛋白表現及NOV169N31Q-MCC-DM1敏感性，在BICR6細胞系中實施NOV169N31Q-MCC-DM1之效能評估。如先前所闡述來實施免疫組織化學分析以證實BICR6腫瘤中之腫瘤P-鈣黏蛋白含量，其中82%之腫瘤細胞針對P-鈣黏蛋白染色至少2+(圖14A)。
在雌性SCID灰棕色小鼠中藉由向每一小鼠之右側腹經皮下植入5×106個腫瘤細胞來確立BICR6腫瘤。在腫瘤達到約130mm3時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分配至治療組中(n=10/組)且投用靜脈內投與之媒劑或10mg/kg IgG1-MCC-DM1或NOV169N31Q-MCC-DM1(以q7d時間表給予(q7dx2))。根據個別小鼠體重調整劑量。靜脈內劑量體積為5ml/kg。
NOV169N31Q-MCC-DM1治療最大產生37%腫瘤消退(在研究之第26天)。總而言之，使用NOV169N31Q-MCC-DM1使腫瘤停滯反應在投藥後可持續(△T/△C 1%,p<0.05，Kruskal-Wallis單向秩方差分析/圖基測試(Tukey’s Test))長達42天。所有測試劑在研究中皆耐受且在任一治療組中皆並未觀察到毒性之明顯臨床症狀(圖14B及表16)。
實例15：NOV169N31Q-MCC-DM1針對小鼠中之scaBER膀胱癌模型之活體內效能
在scaBER膀胱癌異種移植物模型中評估NOV169N31Q-MCC-DM1之抗腫瘤活性，該模型係基於在活體外63,000個受體/細胞之P-鈣黏蛋白表現及NOV169N31Q-MCC-DM1敏感性來選擇。實施免疫組織化學分析以證實scaBER腫瘤中之腫瘤P-鈣黏蛋白含量，從而展示大約52%之腫瘤細胞染色至少2+。(圖15A)。
在雌性SCID灰棕色小鼠中藉由向每一小鼠之右側腹經皮下植入腫瘤片段來確立scaBER腫瘤。在腫瘤達到約130mm3時，根據腫瘤體 積將小鼠隨機分配至治療組中(n=10/組)且投用靜脈內投與之媒劑或10mg/kg IgG1-MCC-DM1或NOV169N31Q-MCC-DM1(給予兩次，間隔兩週(Q2W×2))。根據個別小鼠體重調整劑量。靜脈內劑量體積為5ml/kg。
NOV169N31Q-MCC-DM1治療產生18%之△T/△C(相對於媒劑或IgG1-MCC-DM1，p<0.05，ANOVA/圖基測試，第35天)。IgG1-MCC-DM1之效能係△T/△C為86%且並不顯著不同於媒劑(p>0.05)。所有測試劑在研究中皆耐受且在任一治療組中皆並未觀察到毒性之明顯臨床症狀(圖15B及表17)。
實例16：NOV169N31Q-MCC-DM1針對小鼠中之HuPrime ® ES2267食道癌模型之活體內效能
在表現P-鈣黏蛋白之ES2267食道癌異種移植物模型中評估NOV169N31Q-MCC-DM1之抗腫瘤活性。向雌性BALB/c裸小鼠經皮 下向每一小鼠之右側腹植入腫瘤片段。在腫瘤達到約154mm3時，將小鼠隨機分配至治療組中(n=5)。在隨機化後第0天及第13天經靜脈內投與以10mg/kg投用之NOV169N31Q-MCC-DM1或人類化非特異性同種型對照3207-MCC-DM1。根據個別小鼠體重調整劑量。靜脈內劑量體積為10ml/kg。
在與媒劑比較時，以10mg/kg使用NOV169N31Q-MCC-DM1進行治療產生抗腫瘤效能且在第21天具有58%之平均消退。另外，在以10mg/kg使用非特異性同種型對照IgG1-MCC-DM1治療之後觀察到並無顯著抗腫瘤效能。在第21天及在研究最後一天(第53天)，所測試之NOV169N31Q-MCC-DM1在統計學上不同於媒劑及同種型對照IgG1-MCC-DM1治療組(P<0.05,ANOVA/Holm-Sidak方法，第21天)。所有測試劑皆充分耐受且在任一治療組中觀察到並無體重損失，如針對並不結合小鼠P-鈣黏蛋白之ADC所預期(圖16及表18)。
實例17：使用兩種連接體(MCC及CX1-1)結合DM1之NEG0067在HCC70乳癌異種移植物模型中之效能對比
使用HCC70乳癌異種移植物模型比較使用MCC與CX-1-1連接體結合DM1之抗P-鈣黏蛋白抗體NEG0067之抗腫瘤效能。在腫瘤達到約215mm3時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分配至治療組中(n=8/組)且投用單一靜脈內投與之媒劑或7mg/kg ADC。根據個別小鼠體重調整劑量。靜脈內劑量體積為8ml/kg。
NEG0067-CX1-1-DM1組中之平均腫瘤體積顯著不同於對照IgG1-CX1-1-DM1組(單向方差分析；杜恩法，p0.05)，而NEG0067-MCC-DM1在統計學上並不不同於IgG1-MCC-DM1。然而，與huIgG1-MCC-DM1治療組相比，IgG1-CX1-1-DM1治療組中之活性往往有所增加(圖17)。
實例18：使用SPDB-DM4連接體-酬載(可裂解連接體)結合之鼠類雜交瘤源抗P-鈣黏蛋白ADC在HCC70乳癌異種移植物模型中之效能評價
使用HCC70乳癌異種移植物模型比較使用SBDB-DM4連接體-酬載之3種鼠類雜交瘤源ADC之抗腫瘤效能。在腫瘤達到約150mm3時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分配至治療組中(n=10/組)且投用單一靜脈內投與之媒劑或5mg/kg ADC。根據個別小鼠體重調整劑量。
單一5mg/kg劑量之所有三種SPDB-DM4連接ADC皆顯著誘導可持續腫瘤消退(p0.05)，其中在2P10-SPDB-DM4治療組中發生一定程度之腫瘤再生長。腫瘤在使用1G12-SPDB-DM4或3D21-SPDB-DM4治療之組中保持完全消退(圖18)。
實例19：ADC調配物
ADC NOV169N31Q-MCC-DM1之臨床服務形式(CSF)係存於小瓶 中之含有50mg NOV169N31Q-MCC-DM1之凍乾物。在使用5mL注射用水重構凍乾物之後，獲得含有10mg/mL NOV169N31Q-MCC-DM1、20mM L-組胺酸/L-組胺酸鹽酸鹽單水合物、240mM蔗糖及0.02%聚山梨醇酯20之pH為5.3之溶液。
為進行後續靜脈內投與，通常將所獲得溶液在載劑溶液中進一步稀釋成即用ADC溶液以用於輸注。
對於CSF而言，選擇10mg/mL之ADC濃度。選擇240mM之蔗糖濃度以產生等滲調配物，從而維持非晶型凍乾物之餅形結構且提供蛋白質穩定化。
用於選擇最穩定調配物之重要穩定性指示分析方法尤其涵蓋尺寸排除層析(用於測定聚集程度)、不用顯微鏡看不見之微粒物質測試、游離毒素測定及效力測試。預篩選研究展示，濃度為0.02%之聚山梨醇酯20提供針對機械應力之充分穩定化。在即時及加速穩定性條件(25℃及40℃)下之液體及凍乾穩定性研究顯示，pH值介於5.0與5.5之間之基於組胺酸之調配物提供整體最佳之儲存穩定性。在此範圍中顯而易見，可滿足所測試所有調配物之游離毒素在聚集與釋放之間之平衡。在25℃及40℃下之兩個月穩定性研究顯示極低聚集程度及極低含量之降解產物。
應理解，本文所闡述實例及實施例僅為闡釋目的，且基於其之各種修改或變化應為熟習此項技術者所瞭解且欲包含在本申請案之精神與範圍內及隨附申請專利範圍之範圍內。
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 117
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 119
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸
<400> 120
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<213> 智人
<400> 121
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<211> 822
<212> PRT
<213> 褐鼠
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<210> 123
<211> 822
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<213> 家鼷鼠
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<213> 智人
<400> 143

Claims (55)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，其在一或多個選自SEQ ID NO：126之位置124、125、151、153、154、155、156、159、160、161、162、163、168、170、171及172之胺基酸之殘基結合人類P-鈣黏蛋白。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體在SEQ ID NO：126之位置124、125、151、153、154、155、156、159、160、161、162、163、168、170、171及172之胺基酸結合人類P-鈣黏蛋白。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體包括在一或多個選自SEQ ID NO：126之位置124、151、153至156及172之胺基酸殘基結合人類P-鈣黏蛋白之重鏈可變區。
  4. 如請求項3之抗體，其中用於人類P-鈣黏蛋白之重鏈可變區結合互補位(paratope)包括一或多個選自SEQ ID NO：128之位置52、54、56、60、65、105或107之胺基酸殘基。
  5. 如請求項1之抗體，其中該抗體包括在一或多個選自SEQ ID NO：126之位置124、125、155、156、159至163、168、170及171之胺基酸殘基結合人類P-鈣黏蛋白之輕鏈可變區。
  6. 如請求項5之抗體，其中用於人類P-鈣黏蛋白之輕鏈可變區結合互補位包括一或多個選自SEQ ID NO：129之位置1、2、27、28、30、68、92、93或94之胺基酸殘基。
  7. 一種抗體或其抗原結合片段，其包括如請求項3之重鏈區及如請求項5之輕鏈可變區。
  8. 一種結合P-鈣黏蛋白之抗體或其抗原結合片段，其包括：a.包括SEQ ID NO：1之VH CDR1、SEQ ID NO：2之VH CDR2及SEQ ID NO：3之VH CDR3之重鏈可變區，其中該CDR係根據 Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：11之VL CDR1、SEQ ID NO：12之VL CDR2及SEQ ID NO：13之VL CDR3之輕鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；b.包括SEQ ID NO：21之VH CDR1、SEQ ID NO：22之VH CDR2及SEQ ID NO：23之VH CDR3之重鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：31之VL CDR1、SEQ ID NO：32之VL CDR2及SEQ ID NO：33之VL CDR3之輕鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；c.包括SEQ ID NO：41之VH CDR1、SEQ ID NO：42之VH CDR2及SEQ ID NO：43之VH CDR3之重鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：51之VL CDR1、SEQ ID NO：52之VL CDR2及SEQ ID NO：53之VL CDR3之輕鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；d.包括SEQ ID NO：61之VH CDR1、SEQ ID NO：62之VH CDR2及SEQ ID NO：63之VH CDR3之重鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：71之VL CDR1、SEQ ID NO：72之VL CDR2及SEQ ID NO：73之VL CDR3之輕鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；e.包括SEQ ID NO：81之VH CDR1、SEQ ID NO：82之VH CDR2及SEQ ID NO：83之VH CDR3之重鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：91之VL CDR1、SEQ ID NO：92之VL CDR2及SEQ ID NO：93之VL CDR3之輕鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；或f.包括SEQ ID NO：101之VH CDR1、SEQ ID NO：102之VH CDR2及SEQ ID NO：103之VH CDR3之重鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；及包括SEQ ID NO：111之VL CDR1、 SEQ ID NO：112之VL CDR2及SEQ ID NO：113之VL CDR3之輕鏈可變區，其中該CDR係根據Kabat定義來定義。
  9. 一種結合P-鈣黏蛋白之抗體或其抗原結合片段，其包括：a.包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；b.包括SEQ ID NO：27之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：37之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；c.包括SEQ ID NO：47之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：57之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；d.包括SEQ ID NO：67之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：77之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；e.包括SEQ ID NO：87之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：97之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)；或f.包括SEQ ID NO：107之胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及包括SEQ ID NO：117之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)。
  10. 一種結合P-鈣黏蛋白之抗體或其抗原結合片段，其包括：a.包括SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈；b.包括SEQ ID NO：29之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：39之胺基酸序列之輕鏈；c.包括SEQ ID NO：49之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：59之胺基酸序列之輕鏈；d.包括SEQ ID NO：69之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：79之胺基酸序列之輕鏈；e.包括SEQ ID NO：89之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：99之胺基酸序列之輕鏈； f.包括SEQ ID NO：109之胺基酸序列之重鏈及包括SEQ ID NO：119之胺基酸序列之輕鏈。
  11. 一種抗體，其與如請求項8至10中任一項之抗體結合人類P-鈣黏蛋白之相同表位(epitope)，或與如請求項8至10中任一項之抗體競爭結合人類P-鈣黏蛋白。
  12. 一種抗體藥物結合物，其包括下式：Ab-(L-(D)m)n或其醫藥上可接受之鹽；其中Ab係如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段；L係連接體；D係藥物部分；m係1至8之整數；及n係1至10之整數。
  13. 如請求項12之抗體藥物結合物，其中該m為1。
  14. 如請求項11或12中任一項之抗體藥物結合物，其中該n為3或4。
  15. 如請求項12至14中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體或抗原結合區包括含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之VH區及含有SEQ ID NO：17之胺基酸序列之VL區。
  16. 如請求項12至14中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體或抗原結合區包括含有SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VH區及含有SEQ ID NO：37之胺基酸序列之VL區。
  17. 如請求項12至14中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包括：VH區，其包括：(a)SEQ ID NO：1之VH CDR1，(b)SEQ ID NO：2之VH CDR2，(c)SEQ ID NO：3之VH CDR3；及VL區，其包括：(d)SEQ ID NO：11之VL CDR1，(e)SEQ ID NO：12之VL CDR2，及(f)SEQ ID NO：13之VL CDR3， 其中該CDR係根據Kabat定義來定義。
  18. 如請求項12至14中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包括：VH區，其包括：(a)SEQ ID NO：21之VH CDR1，(b)SEQ ID NO：22之VH CDR2，(c)SEQ ID NO：23之VH CDR3；及VL區，其包括：(d)SEQ ID NO：31之VL CDR1，(e)SEQ ID NO：32之VL CDR2，及(f)SEQ ID NO：33之VL CDR3，其中該CDR係根據Kabat定義來定義。
  19. 如請求項12至14中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體或其抗原結合片段包括SEQ ID NO：9之重鏈及SEQ ID NO：19之輕鏈。
  20. 如請求項12至14中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體包括SEQ ID NO：29之重鏈及SEQ ID NO：39之輕鏈。
  21. 如請求項12至20中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體係單株抗體。
  22. 如請求項12至21中任一項之抗體藥物結合物，其中該連接體係選自由以下組成之群：可裂解連接體、非可裂解連接體、親水性連接體、預帶電荷(procharged)連接體及基於二羧酸之連接體。
  23. 如請求項22之抗體藥物結合物，其中該連接體係衍生自選自由以下組成之群之交聯試劑：N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPP)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDB)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基(sulfo)-丁酸酯(磺基-SPDB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIA)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIAB)、馬來醯亞胺PEG NHS、4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、4-(馬來醯 亞胺基甲基)環己烷甲酸N-磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)及17-(2,5-二側氧基(oxo)-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十七烷-1-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(CX1-1)。
  24. 如請求項23之抗體藥物結合物，其中該連接體係衍生自選自由以下組成之群之交聯試劑：4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDB)及17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十七烷-1-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(CX1-1)。
  25. 如請求項12至24中任一項之抗體藥物結合物，其中該藥物部分係選自由以下組成之群：V-ATP酶抑制劑、促細胞凋亡劑、Bcl2抑制劑、MCL1抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定劑、奧裡斯他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、類美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫胺酸胺基肽酶)、蛋白質CRM1之核輸出之抑制劑、DPPIV抑制劑、蛋白酶體抑制劑、線粒體中磷醯基轉移反應之抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損害劑、DNA烷基化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝黏合劑及DHFR抑制劑。
  26. 如請求項25之抗體藥物結合物，其中細胞毒性劑係類美登素。
  27. 如請求項26之抗體藥物結合物，其中該類美登素係N(2')-去乙醯基-N(2')-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(maytansine)(DM1)或N(2')-去乙醯基-N2-(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。
  28. 如請求項12之抗體藥物結合物，其具有下式： 其中Ab係抗體或其抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：1之重鏈CDR1、SEQ ID NO：2之重鏈CDR2、SEQ ID NO：3之重鏈CDR3及SEQ ID NO：11之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：12之輕鏈CDR2、SEQ ID NO：13之輕鏈CDR3，其中該CDR係根據Kabat定義來定義；且n為1至10；或其醫藥上可接受之鹽。
  29. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  30. 一種醫藥組合物，其包括如請求項12至28中任一項之抗體藥物結合物及醫藥上可接受之載劑。
  31. 如請求項29或30之醫藥組合物，其中該組合物係製成凍乾物。
  32. 如請求項31之醫藥組合物，其中該凍乾物包括如請求項1至11中任一項之抗體或如請求項12至28中任一項之抗體藥物結合物、組胺酸、蔗糖及聚山梨醇酯20。
  33. 如請求項32之醫藥組合物，其中該組合物包括約10mg/mL如請求項28之抗體藥物結合物、20mM組胺酸、240mM蔗糖及0.02%聚山梨醇酯20。
  34. 一種治療有需要患者之癌症之方法，其包括向該患者投與如請求項12至28中任一項之抗體藥物結合物或如請求項29至33中任 一項之醫藥組合物。
  35. 如請求項34之方法，其中將該抗體藥物結合物或醫藥組合物與一或多種其他治療化合物組合投與該患者。
  36. 如請求項12至28中任一項之抗體藥物結合物或如請求項29至33中任一項之醫藥組合物，其用作醫藥。
  37. 如請求項12至28中任一項之抗體藥物結合物或如請求項29至33中任一項之醫藥組合物，其用於治療有需要之患者之癌症。
  38. 一種如請求項1至11中任一項之抗體、如請求項12至28中任一項之抗體藥物結合物或如請求項29至33中任一項之醫藥組合物之用途，其用於治療有需要之患者之癌症。
  39. 一種如請求項1至11中任一項之抗體或如請求項12至28中任一項之抗體藥物結合物之用途，其用以製造用於治療癌症之醫藥。
  40. 如請求項34或35之方法、如請求項36或37之抗體藥物結合物或如請求項38或39之用途，其中該癌症表現P-鈣黏蛋白。
  41. 如請求項40之方法、抗體藥物結合物或用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：腎上腺皮質癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、中樞神經系統非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胚胎腫瘤、子宮內膜癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、頭頸癌、肝細胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、肝癌、包含小細胞肺癌及非小細胞肺癌之肺癌、卵巢癌、直腸癌、橫紋肌肉瘤、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、鱗狀頸癌、胃癌(stomach cancer)、子宮癌、陰道癌及外陰癌、腎上腺皮質癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、中樞神經系統非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胚胎腫瘤、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、肝細胞癌、卡波西氏肉瘤、肝癌、包含小細胞肺癌及非小細胞肺癌之肺癌、卵巢癌、直腸癌、橫紋肌肉瘤、 小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、鱗狀頸癌、胃癌、子宮癌、陰道癌及外陰癌。
  42. 如請求項38之方法、抗體藥物結合物或用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、肺癌及卵巢癌。
  43. 如請求項1至11中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體係人類或人類化抗體。
  44. 如請求項1至11及43中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體係單株抗體。
  45. 如請求項1至11、43或44中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係單鏈抗體(scFv)。
  46. 一種核酸，其編碼如請求項1至11、43、44或45中任一項之抗體或抗原結合片段。
  47. 如請求項46之核酸，其中該核酸包括SEQ ID NO：8、28、48、68、88、108、18、38、58、78、98、118、10、30、50、70、90、110、20、40、60、80、100及120之核苷酸序列。
  48. 一種載體，其包括如請求項46或47之核酸。
  49. 一種宿主細胞，其包括如請求項48之載體或如請求項46或47之核酸。
  50. 一種產生抗體或抗原結合片段之方法，其包括培養如請求項49之宿主細胞且自培養物回收該抗體。
  51. 一種產生抗P-鈣黏蛋白抗體藥物結合物之方法，其包括：(a)以化學方式使SMCC連接至藥物部分DM-1；(b)使該連接體-藥物結合至自如請求項47之細胞培養物回收之抗體；及(c)純化該抗體藥物結合物。
  52. 一種產生抗P-鈣黏蛋白抗體藥物結合物之方法，其包括：(a)以化學方式使SMCC連接至藥物部分DM-1；(b)使該連接體-藥物結合至如請求項1至11、43或44中任一項之抗體；及(c)純化該抗體藥物結合物。
  53. 一種如請求項51或52製得之抗體藥物結合物，其使用UV分光光度計量測具有約3.8之平均DAR。
  54. 一種診斷試劑，其包括如請求項1至11、43、44或45中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  55. 如請求項54之診斷試劑，其中該抗體或其抗原結合片段係經放射性標記、螢光團、發色團、成像劑或金屬離子標記。
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