BR112012020116B1

BR112012020116B1 - Anticorpo anti-p-caderina marcado com metal radioativo, agente terapêutico contra o câncer e agente de diagnóstico de câncer que compreendem o dito anticorpo, hibridoma, bem como usos do mesmo para produzir um agente terapêutico contra o câncer e um agente de diagnóstico de câncer

Info

Publication number: BR112012020116B1
Application number: BR112012020116-6A
Authority: BR
Inventors: Akihiro Hino; Akio Nagano; Masahiko Watanabe; Tadasi Matsuura; Hirokazu Satoh; Fumiko Nomura; Katsuyuki Mitomo
Original assignee: Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd.; Perseus Proteomics Inc.
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2011-02-09
Publication date: 2021-12-14
Also published as: JP2014012731A; EP2535358B1; WO2011099524A1; RU2577125C2; BR112012020116A2; JPWO2011099524A1; EP2535358A1; ES2656168T3; AU2011215267B2; KR20120115995A; EP2535358A9; LT2535358T; CN102892787A; US20140328754A1; HUE037817T2; SI2535358T1; KR101900110B1; EP2535358A4; CY1120012T1; US20130071324A1

Abstract

ANTICORPO ANTI-CADERINA MARCADO COM METAL RADIOATIVO. Um objetivo da presente invenção consiste e proporcionar um anticorpo anti-caderina de metal radioativo que seja altamente acumulado especificamente em tecido cancerígeno. Outro Objetivo consiste em proporcionar um agente terapêutico contra câncer tendo um alto efeito anticancerígeno e segurança e um agente de diagnóstico de câncer. O anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo é obtido ligando-se um elemento metálico radioativo a um anticorpo anti-caderina através de um reagente quelante metálico.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo que se acumula de modo altamente específico em células cancerígenas, e a um agente terapêutico e a um agente de diagnóstico de câncer, cada um contendo o anticorpo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] Há uma forte demanda por novas terapias contra o câncer para o tratamento de câncer, que, no presente, é a causa principal de mortes. Atualmente, empregam-se terapias contra o câncer, tais como terapia cirúrgica, radioterapia, e quimioterapia (através do uso de um agente anticancerígeno. Mesmo após cirurgias, emprega-se um agente anticancerígeno na terapia pós-operatória.

[003] Os agentes anticancerígenos atualmente empregados incluem um agente de alquilação, um antimetabólito, um agente anticancerígeno alcalóide, um agente anticancerígeno antibiótico, e um agente de platina. Os efeitos do tratamento desses agentes não são completamente satisfatórios. Alguns agentes não são células cancerígenas específicas e frequentemente causam efeitos colaterais, que é problemático. Sob tais circunstâncias, existe uma demanda pelo desenvolvimento de agentes anticancerígenos mais eficazes.

[004] Entretanto, a caderina é uma molécula de adesão dependente de Ca2+ que é expressa na superfície celular. Exemplos de espécies de caderina conhecidas incluem caderinas clássicas, tal como caderina E, caderina N, e caderina P (CDH3); assim como protocaderina, e caderina desmosomal. Estas caderinas são conhecidas por se aglutinarem de modo homofílico, formarem uma junção de aderência, e se ligarem ao sistema citoesqueletal (filamentos de actina) através de catenina intracelular e, considera-se que controlem a adesão celular através de tal mecanismo.

[005] Além da adesão celular, imagina-se que a caderina se refira à embriogê- nese, morfogênese, sinaptogênese, plasticidade sináptica, e infiltração e metástase de câncer. Portanto, um anticorpo anti-caderina é reportado como sendo útil para terapia contra o câncer (Documentos de Patente 1 a 3).

Documentos da Técnica Anterior Documentos de Patente

[006] Documento de Patente 1: Publicação de Patente Japonesa Kohyo (PCT) No. 2005-522982

[007] Documento de Patente 2: Publicação de Patente Japonesa Kohyo (PCT) No. 2008-538909

[008] Documento de Patente 3: Publicação de Patente Japonesa Kohyo (PCT) No. 2009-528257

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problemas a serem solucionados pela invenção

[009] No entanto, o efeito anticancerígeno do anticorpo anti-caderina não é satisfatório, e há uma demanda pelo desenvolvimento de um agente terapêutico contra o câncer mais potente.

[0010] Portanto, um objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo que possa ser altamente acumulado em tecido cancerígeno. Outro objetivo consiste em proporcionar um agente terapêutico contra o câncer que contenha o anticorpo como um ingrediente ativo e que exiba um alto efeito anticancerígeno. Ainda outro objetivo consiste em proporcionar um agente de diagnóstico de câncer que possa prever a eficácia de um agente terapêutico contra o câncer e conformar o efeito terapêutico do mesmo.

Meios para solucionar os problemas

[0011] Os presentes inventores conduziram estudos extensivos para atingir os objetivos supramencionados, e descobriram que um anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo no qual um elemento metálico radioativo é ligado a um anticorpo anti-caderina através de um reagente quelante metálico é especificamente acumulado no tecido cancerígeno de um animal portador de câncer, e que, particularmente, o efeito anticancerígeno deste é consideravelmente acentuado comparado ao grupo de administração de anticorpo anti-caderina não-marcado. A presente invenção foi realizada com base nestas descobertas.

[0012] Consequentemente, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo que é obtido ligando-se o elemento metálico radioativo a um anticorpo anti-caderina através de um reagente quelante metálico, e um agente terapêutico contra o câncer e um agente de diagnóstico de câncer, cada um contendo, como um ingrediente ativo, o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo.

[0013] A presente invenção também proporciona o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo para uso no tratamento ou diagnóstico de câncer.

[0014] A presente invenção também proporciona o uso do anticorpo anti-ca- derina marcado com metal radioativo para produzir um agente terapêutico contra o câncer ou um agente de diagnóstico de câncer.

[0015] A presente invenção também proporciona um método para tratamento ou diagnóstico de câncer, que compreende administrar uma quantidade eficaz do anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo a um indivíduo em necessidade do mesmo.

Efeitos da Invenção

[0016] O agente terapêutico contra o câncer que contém, como um ingrediente ativo, o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo da presente invenção é altamente acumulado em tecido cancerígeno e exibe um alto efeito de retrocesso do tecido cancerígeno. Portanto, através do uso do agente terapêutico contra o câncer, a terapia contra o câncer pode ser efetivamente realizada sem causar efeitos colaterais. Da mesma forma, através do uso do agente de diagnóstico de câncer da presente invenção, pode-se prever a eficácia do agente terapêutico contra o câncer da presente invenção, e o efeito terapêutico deste pode ser confirmado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] A Figura 1 mostra gráficos que apresentam o resultado da afinidade dos anticorpos avaliados por citometria de fluxo.

[0018] A Figura 2 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2016 (razão de adição de 1:10) 96 horas após a administração do mesmo.

[0019] A Figura 3 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2016 (razão de adição de 1:3) 96 horas após a administração do mesmo.

[0020] A Figura 4 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2029 (razão de adição de 1:10) 96 horas após a administração do mesmo.

[0021] A Figura 5 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2029 (razão de adição de 1:3) 96 horas após a administração do mesmo.

[0022] A Figura 6 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2025 (razão de adição de 1:10) 96 horas após a administração do mesmo.

[0023] A Figura 7 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2025 (razão de adição de 1:3) 96 horas após a administração do mesmo.

[0024] A Figura 8 mostra a biodistribuição do anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2025 no caso razões adicionadas de anticorpo DOTA de 1:1, 1:3, e 1:10, 96 horas após a administração do mesmo.

[0025] A Figura 9 mostra a biodistribuição do anticorpo 111In-DOTA-PPAT- 052-27c (razão de adição de 1:3) 96 horas após a administração do mesmo.

[0026] A Figura 10 mostra a biodistribuição do anticorpo 111In-DOTA-PPAT- 052-27c (razão de adição de 1:3) 48 horas após a administração do mesmo.

[0027] A Figura 11 mostra a biodistribuição do anticorpo 111In-DOTA-PPAT- 052-28c (razão de adição de 1:3) 48 horas e 96 horas após a administração do mesmo.

[0028] A Figura 12 mostra um efeito antitumor do anticorpo 90Y-DOTA- PPMX2029 (razão de adição de 1:3) em um modelo de xenoenxerto.

[0029] A Figura 13 mostra um efeito antitumor do anticorpo 90Y-DOTA-PPAT- 052-27c (razão de adição de 1:3) em um modelo de xenoenxerto.

[0030] A Figura 14 mostra fotoimagens que apresentam os resultados da coloração imuno-histoquímica para confirmar a expressão da proteína CDH3.

Modos para realizar a invenção

[0031] O anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo da presente invenção é um anticorpo anti-caderina marcado ao qual um elemento metálico radioativo é ligado através de um reagente quelante metálico. O agente terapêutico contra o câncer ou o agente de diagnóstico de câncer contém o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo.

[0032] O anticorpo anti-caderina não é particularmente limitado, desde que o anticorpo se ligue especificamente à caderina. Exemplos de caderina incluem, cade- rina, caderina N, e caderina P. Dentre estas, a caderina P é mais preferencial.

[0033] O anticorpo anti-caderina abrange um anticorpo monoclonal, um anticorpo a policlonal, um anticorpo que mantém a capacidade de se ligar especificamente a um grupo determinante antigênico e variantes e derivados de um anticorpo, tal como um fragmento receptor de célula T.

[0034] O tipo do anticorpo anti-caderina não é particularmente limitado, e podem existir anticorpos apropriadamente empregados, tais como um anticorpo de camundongo, um anticorpo humano, um anticorpo de rato, um anticorpo de coelho, um anticorpo de carneiro, um anticorpo de camelo, e um anticorpo de galinha; e anticorpos recombinantes de gene que são intencionalmente modificados a fim de reduzir a hetero-antigenicidade a seres humanos, tal como um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado. O anticorpo recombinante pode ser produzido através de um método conhecido. O anticorpo quimérico é um anticorpo formado por regiões variáveis de cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo de mamífero diferente do anticorpo humano, por exemplo, anticorpo de camundongo e regiões constantes de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano e pode ser produzido ligando-se um fragmento de DNA que codifica a região variável do anticorpo de camundongo a um fragmento de DNA que codifica a região constante do anticorpo humano, incorporando o fragmento resultante em um vetor de expressão, e incorporando o vetor em células hospedeiras (vide, por exemplo, Cabilly S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81(11) 3273-7; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81(21), 6851-5; e o Pedido de Patente Europeu Aberto à Inspeção Pública No. 171496). O anticorpo humanizado, que também é denominado como anticorpo reformatado,é um anticorpo produzido através do transplante de uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo de mamífero diferente do anticorpo humano, por exemplo, um anticorpo de camundongo em uma CDR de um anticorpo humano, e técnicas de recombinação genética ao mesmo são genericamente conhecidas. De modo específico, uma sequência de DNA que inclui uma CDR de um anticorpo de camundongo ligado a uma região de estrutura (FR) de um anticorpo humano é sintetizada através de PCR utilizando-se vários oligonucleotídeos que são produzidos para que tenham uma parte sobreposta em uma extremidade do mesmo. O fragmento de DNA assim obtido é ligado a um fragmento de DNA que codifica a região constante do anticorpo humano, subsequentemente, o fragmento resultante é incorporado em um vetor de expressão e o vetor é incorporado em células hospe-deiras para produzir, desse modo, o anticorpo humanizado (vide, EP239400 A e WO 96/02576 A). A FR do anticorpo humano ligada através da CDR é selecionada a partir de FRs tendo uma CDR que forme um sítio de ligação de antígeno adequado. Caso seja necessário, um aminoácido na FR da região variável do anticorpo pode ser substituído de tal modo que uma CDR do anticorpo humanizado forme um sítio de ligação de antígeno apropriado (Sato, K. et al., Cancer Res., 1993, 53, 851-856).

[0035] A sequência de aminoácido do anticorpo quimérico ou do anticorpo hu-manizado tem, de preferência, uma identidade de 100% à sequência da região de VH ou VL de cDNA que expressa um hibridoma depositado. Devido à modificação genética, um anticorpo tendo uma identidade em sequência de aminoácido de 90%, ou maior, também é preferencial. No processo de humanização ou quimerização, realizou-se convencionalmente tal substituição de resíduo controlada para aperfeiçoar a ligação a um antígeno. Esse anticorpo tendo uma sequência parcialmente modificada é essencialmente considerado como sendo um anticorpo que se origina a partir do hibridoma original.

[0036] Os métodos para produção de um anticorpo quimérico e de um anticorpo humanizado com base em uma técnica de engenharia genérica já são conhecidos. De modo específico, as sequências de VH e VL de um anticorpo monoclonal que serve como um grupo confirmado são geneticamente modificadas, e, então, realiza- se uma quimerização ou humanização através de uma técnica de rotina.

[0037] O método para recuperar um anticorpo humano também é conhecido. Em um procedimento, os linfócitos humanos são sintetizados in vitro por um antígeno de interesse ou por células que expressem o antígeno, e os linfócitos assim sintetizadossão fundidos a células de mieloma humano, por exemplo, U266, para, desse modo, produzir um anticorpo humano de interesse tendo uma atividade de ligação ao antígeno (vide JP-B-1989-59878). Alternativamente, um anticorpo humano de interesse pode ser recuperado através de imunização, por um antígeno de interesse, de um animal transgênico tendo um repertório completo do gene de anticorpo humano (vide WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO96/34096, e WO96/33735). Conhece-se, também, uma técnica para recuperar um anticorpo humanoatravés de separação imunomagnética pelo uso de uma biblioteca de anticorpo humano. Em um procedimento, uma região variável de um anticorpo humano é expressa como um anticorpo de cadeia única (scFv) na superfície de fago através do método de exibição de fago, e um fago que se liga ao antígeno pode ser selecionado. Através de análise genética do fago assim selecionado, uma sequência de DNA que codifica a região variável do anticorpo humano que se liga ao antígeno pode ser determinada. Quando a sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno for elucidada, um vetor de expressão apropriado pode ser produzido a partir da sequência, desse modo, um anticorpo humano de interesse pode ser recuperado. Estes métodos são amplamente conhecidos (vide WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, e WO 95/15388).

[0038] Estes anticorpos anti-caderina podem ser um anticorpo de baixo peso molecular tal como um fragmento de anticorpo, um anticorpo modificado, ou similares, desde que a capacidade de reconhecer toda ou uma parte da proteína codificada pelo gene caderina seja mantida. Exemplos do fragmento de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, e Diacorpo. Tal fragmento de anticorpo pode ser produzido construindose um gene que codifica o fragmento de anticorpo, incorporando-se o gene em um vetor de expressão, e expressando-se o vetor em células hospedeiras apropriadas (vide, por exemplo, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; e Bird, R.E. and Walker, B.W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

[0039] Como um anticorpo modificado, pode-se usar um anticorpo que seja ligado a qualquer entre várias moléculas, tal como polietileno glicol (PEG). Esse anticorpo modificado pode ser produzido através de modificação química do anticorpo obtido. A técnica de modificação de anticorpo já foi estabelecida na técnica.

[0040] Na presente invenção, pode-se empregar, também, um anticorpo modificado de cadeia de açúcar para potencializar a atividade citotóxica. As técnicas de modificação da cadeia de açúcar em um anticorpo já são conhecidas (por exemplo, WO 00/61739 e WO 02/31140).

[0041] O anticorpo anti-caderina da presente invenção também abrange um anticorpo multi-específico tendo especificidade a dois ou mais antígenos diferentes. Um exemplo típico de tal molécula pode ser aquele que pode ligar dois antígenos (isto é, um anticorpo bi-específico). O “anticorpo multi-específico” da presente invenção inclui um anticorpo tendo uma especificidade a dois ou mais (por exemplo, três) antíge- nos. O anticorpo multi-específico pode ser um anticorpo de comprimento inteiro ou um fragmento de tal anticorpo (por exemplo, o anticorpo bi-específico F(ab')2).

[0042] O anticorpo anti-caderina da presente invenção e o fragmento de anticorpo deste podem ser produzidos através de qualquer método adequado, tal como in vivo, células cultivadas, reação de translação in vitro, e sistema de expressão de DNA recombinante.

[0043] As técnicas para produção de anticorpos monoclonais e células produtoras de anticorpo (hibridomas) são genericamente conhecidas na técnica (Campbell, “Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,” Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holanda, 1984; e St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35: 1-21, 1980). Em um procedimento específico, uma proteína ou um fragmento desta codificado por um gene de caderina que serve como um imunogênico é subcutânea ou intraperitonealmente injetada para imunização a qualquer animal (por exemplo, camundongo ou coelho) que seja conhecido por produzir um anticorpo. Em imunização, pode-se empregar um adjuvante, e tal adjuvante é bem conhecido na técnica.

[0044] O anticorpo policlonal pode ser produzido isolando-se um anti-soro contendo anticorpos de um animal imunizado e triando-se para determinação da pre-sença de um anticorpo tendo uma especificidade alvo através de uma técnica bem conhecida na técnica (por exemplo, ELISA, Western blotting, ou radioimunoensaio).

[0045] O anticorpo monoclonal pode ser produzido removendo-se as células do baço de um animal imunizado e fundindo-se as células com células de mieloma, para, desse modo, produzir hibridomas que possam produzir anticorpos monoclonais. As células de hibridoma que produzem um anticorpo que pode reconhecer uma proteína de interesse ou um fragmento desta podem ser selecionadas com base em uma técnica bem conhecida na técnica (por exemplo, ELISA, Western blotting, ou radioimu- noensaio). Então, o hibridoma que secreta um anticorpo de interesse é clonado, e as células obtidas são cultivadas sob condições apropriadas. O anticorpo assim secre- tado é recuperado e purificado através de um método bem conhecido na técnica (por exemplo, cromatografia em coluna de troca iônica ou cromatografia de afinidade). Em um procedimento alternativo, um anticorpo monoclonal humano pode ser produzido através do uso de uma cepa de Xenocamundongo (vide Green, J. Immunol. Methods 231: 11-23, 1999; e Wells, Eek, Chem. Biol. 2000 Aug; 7(8): R185-6). Atualmente, realiza-se a produção de anticorpo monoclonal com base na exibição de fago que não envolve imunização. O anticorpo monoclonal da presente invenção é um anticorpo de espécie molecular única produzido por uma espécie única de células produtoras de anticorpo ou um fragmento de DNA obtido a partir destas e que codifica o anticorpo. O anticorpo monoclonal pode ser produzido através de qualquer um dos métodos supramencionados.

[0046] O fragmento de DNA que codifica um anticorpo monoclonal pode ser prontamente isolado e sequenciado através de um método de rotina (por exemplo, através do uso de uma sonda de oligonucleotídeo que pode se ligar especificamente a genes que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo monoclonal). Uma célula de hibridoma é um material de partida preferencial para produzir tal fragmento de DNA. Após o isolamento, tal fragmento de DNA é inserido em um vetor de expressão, e o vetor é recombinado a células hospedeiras, tais como células E. coli, células de macaco COS, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma nas quais não se produz imunoglobulina a não ser que as células sejam transformadas. O anticorpo monoclonal de interesse é produzido pelas células hospedeiras recombinantes. Em um modo alternativo, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo pode ser isolado de uma biblioteca de fago de anticorpo produzida através de uma técnica de McCafferty et al. (Nature 348: 552-554 (1990)).

[0047] A célula hospedeira empregada para expressão de anticorpo monoclonal é, de preferência, uma célula hospedeira de origem mamífera. Pode-se utilizar uma célula hospedeira mais adequada a um anticorpo monoclonal a ser expresso. A célula hospedeira não é limitada, e exemplos típicos desta incluem uma linhagem celularoriginária de CHO (célula de ovário de hamster chinês), CV1 (rim de macaco), COS (antígeno SV40T de expressão derivado de CV1), SP2/0 (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), 293 (rim humano), e 293T (antí- geno SV40T de expressão derivado de 293). A célula hospedeira system pode ser obtida a partir de um estabelecimento comercial, a American Tissue Culture Collection (ATCC), ou de uma organização que publicou um documento relevante.

[0048] De preferência, a célula hospedeira é uma linhagem celular originária de CHO desprovida de expressão gênica de dhfr (deleção em expressão gênica de dhfr) ou SP2/0 (vide Urland, G. et al., Effect of gamma rays at the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions; Somat. Cell. Mol. Genet. Vol. 12, 1986, p. 5555566; and Schulman, M. et al., A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies, Nature Vol. 276, 1978, p. 269-270). Com mais preferência, a célula hospedeiraé uma CHO com DHFR deletado. A transfecção de um plasmídeo nas células hospedeiras podem ser realizada através de qualquer técnica. A técnica de transfec- ção não é limitada e exemplos específicos desta incluem transfecção (incluindo método de fosfato de cálcio, método de DEAE, lipofecção, e eletroporação), incorporação de DNA através do uso de um envelope (por exemplo, vírus Sendai), micro- injeção, e infecção através do uso de um vetor viral (por exemplo, retrovírus ou ade- novírus) (vide Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 9 Introduction of DNA into Mammalian Cells, John Wiley and Sons, Inc.). Dentre estes, a incorporação de plasmídeo em células hospedeiras através de eletroporação é particularmente preferencial.

[0049] O sítio de reconhecimento em caderina do anticorpo anti-caderina da presente invenção é, de preferência, uma região de 1 a 655 de SEQ ID NO: 2.

[0050] O anticorpo anti-caderina da presente invenção é preferencialmente produzido a partir de um hibridoma PPMX2016, PPMX2025, PPMX2029, PPAT-052- 02, PPAT-052-03, PPAT-052-09, PPAT-052-24, PPAT-052-25, PPAT-052-26, ou PPAT- 052-28, ou uma linhagem celular de CHO transgênica PPAT-052-27c, PPAT-052-02c, PPAT-052-03c, PPAT-052-09c, PPAT-052-21c, PPAT-052-24c, PPAT-052-25c, PPAT- 052-26c, PPAT-052-28c, ou PPAT-052-29c. No presente relatório descritivo, os números anexados a PPMX ou PPAT são dados em células produtoras de anticorpo correspondentes ou anticorpos produzidos pelas células produtoras de anticorpo.

[0051] Um metal radioativo que é ligado ao anticorpo anti-caderina é, de preferência, um metal radioativo citotóxico quando o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo for usado como um agente terapêutico contra o câncer, e um metal radioativo não-citotóxico quando o anticorpo anti-caderina marcado com metal radioativo for usado como um agente de diagnóstico de câncer.

[0052] Exemplos dos metais radioativos citotóxicos incluem ítrio-90 (90Y), rê- nio-186 (186Re), rênio-188 (188Re), cobre-67 (67Cu), ferro-59 (59Fe), estrôncio-89 (89Sr), ouro-198 (198Au), mercúrio-203 (203Hg), chumbo-212 (212Pb), disprósio-165 (165Dy), rutênio-103 (103Ru), bismuto-212 (212Bi), bismuto-213 (213Bi), hólmio-166 (166Ho), samário-153(153Sm), e lutêtio-177 (177Lu).

[0053] Dentre estes metais radioativos, 90Y, 153Sm, e 177Lu são preferenciais, a partir dos pontos de vista de meia-vida, energia de radiação, facilidade da reação de marcação, percentual de marcação, estabilidade complexa, etc.

[0054] Um metal radioativo não-citotóxico empregado de modo adequado em um agente de diagnóstico de câncer não é limitado e exemplos deste incluem tecné- cio-99m (99mTc), índio-111 (111In), índio-113m (113mIn), gálio-67 (67Ga), gálio-68 (68Ga), tálio-201 (201Tl), cromo-51 (51Cr), cobalto-57 (57Co), cobalto-58 (58Co), co- balto-60 (60Co), estrôncio-85 (85Sr), mercúrio-197 (197Hg), e cobre-64 (64Cu).

[0055] Para ligação de um elemento metálico radioativo ao anticorpo anti-ca- derina, em um modo preferencial, um reagente quelante metálico é reagido com o anticorpo anti-caderina, e o produto é adicionalmente reagido com um elemento metálico radioativo, para, desse modo, formar um complexo. No anticorpo modificado assim produzido, o elemento metálico radioativo é ligado ao anticorpo anti-caderina através do reagente quelante metálico.

[0056] Exemplos do reagente quelante metálico para formar tal complexo incluem (1) derivados de quinolina, tal como 8-hidróxi quinolina, 8-acetóxi quinolina, 8- hidróxi quinaldina, suldato de oxiquinolina, O-acetiloxina, O-benzoiloxina, O-p-nitro- benzoiloxina, e compostos de quinolona tendo um esqueleto de quinolina (por exemplo, norfloxacina, ofloxacina, enoxacina, ciprofloxacina, lomefloxacina, tosfloxacina, fleroxacina, e esparfloxacina); (2) compostos, como ácido cloranílico, aluminon, tiou- rea, pirogalol, cupferron, Bismutiol (II), ácido gálico galoil, tiolida, 2-mercaptobenzoti- azola, e cloreto de tetrafenilarsonio; (3) ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), ácido dietilenotriamina pentaacético (DTPA), e compostos tendo um esqueleto similar (diidróxi etilglicina, ácido diaminopropano traacético, ácido etilenodiamina diacético, cloridrato de ácido etilenodiamina dipropiónico, ácido hidróxi etil etilenodiamina triacé- tico, ácido etilenodiamina tetrakis(metilenosulfônico), ácido diamina tetraacético, ácido hexametileno diamina tetraacético, ácido hidróxi etilimino diacético, ácido iminodiacético, ácido diaminopropano tetraacético, ácido nitrilo triacético, ácido nitrilo tripropiônico, sal trissódico do ácido nitrilotris(metilenosulfônico), ácido trietileno tetramina hexaacético, metil DTPA, cicloexil DTPA, aminobenzil EDTA, isotiocianobenzil EDTA, isotiocianobenzil DTPA, metilisotio cianobenzil DTPA, cicloexilisotio cianobenzil DTPA, maleimidopropil amidobenzil EDTA, maleimidopentil amidobenzil EDTA, malei- midodecil amidobenzil EDTA, maleimidopentil amidobenzil DTPA, e maleimidodecil amidobenzil DTPA); e ácido (4)1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA), ácido 1,4,8,11-tetraa- zaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético (TETA), 1,4,7,10-tetraazaciclododecano (Cyclen), 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (Cyclam), isotiocianobenzil DOTA, e isoti- ocianobenzil NOTA.

[0057] Dentre estes reagentes quelantes metálicos, isotiocianobenzil DOTA, metilisotio cianobenzil DTPA, cicloexilisotio cianobenzil DTPA são preferenciais, a partir dos pontos de vista de facilidade de incorporação da reação de metal-quelato ao anticorpo, porcentagem de marcação, estabilidade complexa, etc.

[0058] O elemento metálico radioativo pode ser ligado ao anticorpo anti-cade- rina através de um método de rotina. Em um procedimento, um reagente quelante metálico é reagido com um anticorpo anti-caderina, para, desse modo, preparar um precursor de marcação, e o precursor é reagido com um elemento metálico radioativo.

[0059] No agente terapêutico contra o câncer e no agente de diagnóstico de câncer da presente invenção, a razão molar entre o anticorpo anti-caderina e o reagente quelante metálico é importante para o acúmulo em células cancerígenas e para o efeito anticancerígeno. A razão molar (anticorpo anti-caderina:reagente quelante) é, de preferência, 1:0,1 a 1:4,5, com mais preferência, 1:0,5 a 1:3. Com a finalidade de alcançar tais razões molares, o anticorpo anti-caderina e o reagente quelante são preferencialmente adicionados para reagirem em uma razão de 1:0,1 a 1:menor que 5, com preferência particular, 1:1 a 1:3. O número de moléculas quelantes por anticorpo anti-caderina pode ser calculado medindo-se o peso molecular através da análise de massa MALDI-TOF ou de uma técnica similar, e comparando-se o peso molecular de um anticorpo não-modificado àquele de um anticorpo modificado (Publicação de Patente US No. 7514078, Lu et al., J. Pharm. Sci. 94(4), 2005, p. 788-797, e Tedesco et al., J. Clin. Onco. 23 (16S), 2005, 4765). Alternativamente, o número de moléculas quelantes por anticorpo anti-caderina pode ser determinado através de uma titulação quelatométrica. Um método conhecido emprega um reagente colorimétrico de metal alcalino terroso (arsenazo III) (Bradyr et al., Nucl. Med. Biol. 31, 795-802, 2004, e Da- dachova et al., Nucl. Med. Biol. 26, 977-982, 1999).

[0060] O agente terapêutico contra o câncer ou o agente de diagnóstico de câncer da presente invenção podem ser proporcionados como uma formulação marcada ou como uma formulação de kit contendo um precursor de marcação. Qualquer formulação pode ser empregada na presente invenção. No caso de uma formulação marcada, um agente terapêutico contra o câncer ou um agente de diagnóstico de câncer contendo um anticorpo anti-caderina marcado pode ser administrado como é. No caso de uma formulação de kit, o agente pode ser administrado após a marcação com um elemento metálico radioativo de interesse.

[0061] O anticorpo anti-caderina contendo um elemento metálico radioativo ligado a ele se acumula altamente em tecido cancerígeno e exibe uma alta atividade tóxica sobre células cancerígenas. Portanto, o anticorpo é um agente terapêutico contra o câncer útil que menos danifica tecidos além dos tecidos cancerígenos e que apresenta alta segurança. Da mesma forma, o anticorpo anti-caderina contendo um elemento metálico radioativo ligado a ele tem uma atividade anticancerígeno consideravelmente maior que aquela de um anticorpo anti-caderina correspondente. A atividadeanticancerígena é consideravelmente alta, particularmente quando a razão molar entre anticorpo e agente quelante for 1:0,1 a 1:4,5.

[0062] O agente terapêutico contra o câncer da presente invenção pode ser usado em combinação com outro agente anticancerígeno. Exemplos de tal agente anticancerígeno incluem um agente de alquilação, um antimetabólito, um inibidor de microtúbulo, um agente anticancerígeno antibiótico, um inibidor de topoisomerase, um agente de platina, um fármaco de alvo molecular, um agente hormonal, e um produto biológico. Exemplos do agente de alquilação incluem agentes anticancerígeno de mostarda de nitrogênio (por exemplo, ciclofosfamida), agentes anticancerígenos de nitrosourea (por exemplo, ranimustina), e dacarbazina. Exemplos do antimetabólito incluem 5-FU, UFT, carmofur, capecitabina, tegafur, TS-1, gemcitabina, e citarabina. Exemplos do inibidor de microtúbulo incluem agentes anticancerígeno alcalóides (por exemplo, vincristina) e agentes anticancerígenos de taxano (por exemplo, docetaxel e paclitaxel). Exemplos do agente anticancerígeno antibiótico incluem mitomicina C, doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, e bleomicina. Exemplos do inibidor de to-poisomerase incluem irinotecano e nogitecano tendo uma atividade inibitória de to-poisomerase I e etoposido tendo uma atividade inibitória de topoisomerase II. Exem-plos do agente de platina incluem cisplatina, paraplatina, nedaplatina, e oxaliplatina. Exemplos do fármaco de alvo molecular incluem trastuzumab, rituximab, imatinib, ge- fitinib, erlotinib, bevacizumab, bortezomib, sunitinib, e sorafenib. Exemplos do agente hormonal incluem dexametasona, finasterida, e tamoxifeno. Exemplos do produto bi-ológico incluem interferons α, β, e Y e interleucina 2.

[0063] O agente terapêutico contra o câncer da presente invenção pode ser usado em combinação com uma terapia contra o câncer. Exemplos de terapia contra o câncer incluem cirurgia, terapias de radiação (incluem terapia de faca gama, terapia de faca Cyber, terapia de captura de nêutrons por boro, e terapia de feixes de pró- ton/feixes de íons pesados), cirurgia ultra-sônica focalizada guiada por MR, criotera- pia, ablação por radiofrequência, terapia de injeção de etanol percutânea, e embolo- terapia.

[0064] O agente terapêutico contra o câncer da presente invenção é eficaz em vários tipos de câncer de um mamífero (incluindo seres humanos). Exemplos do câncer alvo incluem carcinomas, tal como câncer faringeal, câncer laringeal, câncer de língua, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer esofageal, câncer de estomago, câncer colorretal, câncer uterino, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer pancreá- tico, câncer de vesícula biliar, câncer de rim, câncer prostático, melanoma maligno, e câncer de tireóide; e sarcomas, tais como osteosarcoma, condrosarcoma, rabdomi- osarcoma, leiomiosarcoma, liposarcoma, angiosarcoma, fibrosarcoma, leucemia, lin- foma maligno, e mieloma.

[0065] O agente terapêutico contra o câncer da presente invenção pode ser dissolvido em uma solução aquosa, de preferência, um tampão fisiologicamente adaptável, tal como solução de Hanks, solução de Ringer, ou uma solução salina fisiológica tamponada. Da mesma forma, ao agente terapêutico pode ter a forma de suspensão, solução, emulsão, ou similares, em um veículo oleoso ou aquoso.

[0066] A dosagem do agente terapêutico contra o câncer da presente invenção, que varia de acordo com os sintomas, rota de administração, peso corporal, idade, etc. de um paciente em necessidade deste, é, de preferência, por exemplo, igual a 37 a 3.700 MBq para um tratamento em um adulto.

[0067] Em geral, o agente terapêutico contra o câncer da presente invenção é administrado parenteralmente. Por exemplo, o agente terapêutico contra o câncer é injetado (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitonealmente) ou administrado transdérmica, transmucosa, transnasal, transpulmonarmente, etc.

[0068] O agente de diagnóstico de câncer da presente invenção pode ser usado na formação de imagem do tumor. No caso onde um paciente tem um tumor no qual a proteína CDH3 é expressada, o agente de diagnóstico de câncer da presente invenção se acumula no tumor. Portanto, o tumor pode ser capturado em imagens detectando-se a radiação por meio de um aparelho, tal como um tomógrafo computadorizado por emissão de fóton único (SPECT), um tomógrafo por emissão de pósitron (PET), ou uma câmera de cintilação. Por exemplo, através do uso do agente de diagnóstico de câncer da presente invenção, o efeito terapêutico do agente terapêutico contra o câncer da presente invenção pode ser previsto antes da administração do agente terapêutico. O agente de diagnóstico é administrado a um paciente antes do tratamento, e o tumor é capturado em imagens. Quando um alto acúmulo for observado, o efeito superior do agente terapêutico pode ser previsto como potente. O agente de diagnóstico pode ser usado para determinar o efeito terapêutico. O agente de diagnóstico da presente invenção é administrado a um paciente que recebeu o tratamento com o agente terapêutico da presente invenção ou qualquer outro trata-mento com a finalidade de formar imagens do tumor. Através do monitoramento da variação dependente do tempo no acúmulo do agente de diagnóstico, pode-se observar a expansão ou encolhimento do tumor com o passar do tempo.

[0069] O anticorpo para uso como um agente de diagnóstico reconhece, de preferência, um epítopo competitivo a um agente terapêutico. Com mais preferência, o anticorpo reconhece o mesmo epítopo reconhecido pelo agente terapêutico. Com a máxima preferência, o agente terapêutico e o agente de diagnóstico são o mesmo anticorpo.

[0070] Em geral, o agente de diagnóstico de câncer da presente invenção é administrado a um indivíduo intravenosamente. No entanto, o agente de diagnóstico de câncer também pode ser administrado arterialmente. A dosagem deste, que varia de acordo com os sintomas, rota de administração, peso corporal, idade, etc. de um paciente em necessidade deste, é, de preferência, por exemplo, igual a 37 a 1.120 MBq para um tratamento em um adulto.

Exemplos

[0071] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes por meio de exemplos, que não devem ser construídos como limitantes à invenção.

Exemplo 1: Produção do antígeno CDH3 solúvel

[0072] A proteína CDH3 (sCDH3) solúvel na qual se removeu a região trans- membranar C-terminal foi produzida para servir como um imunógeno para produção de um anticorpo anti-CDH3.

(1) Produção de vetor de expressão de antígeno CDH3 solúvel

[0073] Realizou-se um PCR através do uso de um cDNA de CDH3 de comprimento inteiro como um modelo e um iniciador na direção (SEQ ID NO: 3: CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT, (hCDH3FullFW)) e um iniciador inverso (SEQ ID NO: 4: CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC, (hCDH3SolbRV)), que foi projetado para amplificar um segmento correspondente à região extracelular CDH3 (1654 em SEQ ID NO: 2, nas partes que se seguem do presente documento referido como sCDH3cDNA). A reação foi realizada através do uso de KOD-Plus (um produto da Toyobo) e sob as condições a seguir: 94°C-15 seg, 55°C-30 seg, e 68°C-90 seg (30 ciclos)).

[0074] Após o término da reação de PCR, a mistura de reação foi submetida à eletroforese em gel de agarose, e um pedaço de gel contendo uma banda de um tamanho alvo (cerca de 2,0 kbp) foi cortado. O sCDH3cDNA alvo foi recuperado do pedaço de gel pelo uso de um kit de extração rápida de gel QIA (um produto da Quia- gen).

[0075] Com a finalidade de inserir sCDH3cDNA em um vetor de expressão pEF4/myc-HisB, sCDH3cDNA foi tratado com duas enzimas de restrição KpnI e XbaI. O fragmento assim obtido foi inserido em pEF4/myc-HisB que foi tratado com as mesmas enzimas de restrição KpnI e XbaI, pelo uso de T4 DNA ligase através de uma técnica de rotina, por meio da qual um vetor de expressão pEF4-sCDH3-myc-His foi produzido.

(2) Expressão de proteína CDH3 solúvel

[0076] De acordo com um protocolo de um reagente de transfecção Fu- GENE6, 8 x 105 células de CHO foram inoculadas em uma placa de 10 cm de diâmetro no dia anterior à transfecção, e as células foram cultivadas de um dia para o outro. Posteriormente, um vetor de expressão pEF4-sCDH3-myc-His (8 μg) e um reagente FuGENE6 (16 μL) foram misturados com um meio RPMI 1640 livre de soro (400 μL), e a mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente durante 15 minutos. A mistura resultante foi adicionada ao líquido de cultura celular para transfecção. Dois dias após a transfecção, realizou-se uma clonagem limitando-se a diluição através do uso de um reagente de seleção (Zeocin).

[0077] As células de CHO de expressão de CDH3 solúveis foram selecionadas através de Western blotting pelo uso de um anticorpo monoclonal anti-c-Myc (um produto da SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). As linhagens celulares exibiram um alto nível de secreção no sobrenadante de cultura e alta proliferação foram selecionadas para obter uma linhagem celular de CHO de expressão de CDH3 solúvel (EXZ1702). As células de CHO de expressão de CDH3 solúveis assim selecionadas (EXZ1702) foram cultivadas durante 72 horas em três garrafas rotatórias (cada área de cultura: 1.500 cm2) com um meio CHO-S-SFM-II livre de soro (333 mL/garrafa) (um produto de Invitrogen), e os sobrenadantes de cultura foram recuperados. O sobrenadante de cultura assim obtido foi submetido à cromatografia de afinidade por meio de uma coluna HP HisTrap (marca registrada) (produto de GE Healthcare Bio-science) e croma- tografia de filtração em gel por meio de uma coluna 200 pg Superdex (marca registrada) (produto de GE Healthcare Bio-science), para, desse modo, adquirir uma proteína CDH3 solúvel.

Exemplo 2: Estabelecimento da linhagem celular de CHO de expressão de CDH3

[0078] Com o intuito de obter uma linhagem celular para triagem de anticorpo anti-CDH3, estabeleceu-se uma linhagem celular de CHO que expressa CDH3 de comprimento inteiro.

(1) Produção do vetor de expressão gênica de CDH3

[0079] Com a finalidade de inserir um DNA de CDH3 humano de comprimento inteiro representado por SEQ ID NO: 1 em um vetor de expressão de mamíferos pEF4/myc-HisB (produto de Invitrogen), o DNA de CDH3 humano de comprimento inteiro foi tratado com duas enzimas de restrição KpnI (produto de Takara Bio Inc.) e Xbal (produto de Takara Bio Inc.) em 37°C durante uma hora. O fragmento assim obtido foi inserido em pEF4/myc-HisB que foi tratado com as mesmas enzimas de restriçãoKpnI e XbaI, pelo uso de T4 DNA ligase (produto de Promega) através de uma técnica de rotina, por meio da qual um vetor de expressão pEF4-CDH3-myc-His foi produzido.

(2) Aquisição de linhagem de expressão de CDH3 estável

[0080] De acordo com um protocolo de um reagente de transfecção (produto de Roche Diagnostics K.K.) FuGENE 6 (marca registrada), 8 x 105 células de CHO foram inoculadas em uma placa de 10 cm de diâmetro no dia anterior à transfecção, e as células foram cultivadas de um dia para o outro. Posteriormente, um vetor de expressão pEF4-sCDH3-myc-His (8 μg) e um reagente FuGENE6 (16 μL) foram misturados com um meio RPMI 1640 livre de soro (produto de SIGMA-ALDRICH) (400 μL), e a mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente durante 15 minutos. A mistura resultante foi adicionada ao líquido de cultura celular para transfecção. Dois dias após a transfecção, realizou-se uma clonagem limitando-se a diluição através do uso de um reagente de seleção (Zeocin).

[0081] Os clones de CHO de expressão de CDH3 de comprimento inteiro foram selecionados através de Western blotting pelo uso de um anticorpo monoclonal anti-c-Myc (produto de SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). Como resultado, a linhagem celular de CHO de expressão de CDH3 de comprimento inteiro (EXZ1501) foi selecionada como uma linhagem celular que exibia um alto nível de expressão e alta proliferação. A reação entre EXZ1501 e um anticorpo anti-CDH3 comercial (produto de R&D SYSTEMS) foi confirmada através de citometria de fluxo. Ou seja, a expressão da proteína CDH3 na membrana celular de EXZ1501 foi conformada.

Exemplo 3: Produção de anticorpo monoclonal anti-CDH3 (1) Produção de anticorpo monoclonal pelo uso da proteína CDH3 solúvel como um imunógeno

[0082] A proteína CDH3 solúvel (50 μg) dissolvida em uma solução salina fisiológica foi misturada com uma quantidade igual de Titer-MAX Gold (marca registrada) (produto de Titer Max), e a mistura foi injetada intraperitoneal e subcutaneamente em um camundongo MRL/lpr (Japan SLC inc.) para imunização inicial. Realizaram-se procedimentos de imunização subsequentes injetando-se intraperitoneal e subcutanea- mente, ao camundongo, uma mistura de proteína CDH3 solúvel (25 μg) e Titer-MAX Gold preparada da mesma maneira. Três dias após a imunização final, prepararam- se células do baço do camundongo sob condições assépticas, e as células foram fundidas com as células de mieloma de camundongo SP2/O-Ag14 ou P3-X63-Ag8.653 através de um método de polietileno glicol genericamente empregado.

(2) Seleção de hibridomas produtores de anticorpo anti-CDH3 anticorpo

[0083] A seleção de anticorpos anti-CDH3 foi realizada através de citometria de fluxo pelo uso de uma linhagem celular de CHO de expressão de CDH3 de comprimento inteiro (EXZ1501).

[0084] De modo específico, as células de CHO de expressão de CDH3 de comprimento inteiro (EXZ1501) foram removidas de uma placa de cultura tratando-se com 2mM de EDTA-PBS e suspensas em uma solução de FACS a uma concentração celular de 1 x 106 células/mL. A suspensão celular foi inoculada em uma placa de 96 poços a uma concentração de 50 μL/poço, e um sobrenadante de cultura de hibridoma foi adicionado à mesma, seguido pela reação em 4°C durante 60 minutos. A placa foi lavada duas vezes com uma solução de FACS (200 μL/poço), e F(ab')2 de cabra anti- camundongo IgG marcado com Alexa Fluor 488 (produto de Invitrogen) foi adicionado, seguido pela reação em 4°C durante 30 minutos. De modo subsequente, a placa foi lavada duas vezes com uma solução de FACS, e realizou-se citometria de fluxo, para, desse modo, selecionar hibridomas que produzem um anticorpo que se liga às células de CHO de expressão de CDH3. Como resultado, obtiveram-se 40 clones de PPMX2016 a PPAT-052-28. Através de citometria de fluxo, confirmou-se que todos os hibridomas reagiram com as células de CHO de expressão de CDH3 (EXZ1501) e NCI-H358, porém, não reagem com as células de CHO. Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura de hibridoma por meio da coluna de Proteína G e empregados nos experimentos subsequentes. Dentre os hibridomas selecionados, PPMX2016 (NITE BP-897), PPMX2025 (NITE BP-898), PPMX2029 (NITE BP- 899), PPAT-052-02 (NITE BP-1034), PPAT-052-03 (NITE BP-1035), PPAT-052-09 (NITE BP-1036), PPAT-052-24 (NITE BP-1037), PPAT-052-25 (NITE BP-1038), PPAT- 052-26 (NITE BP-1039), e PPAT-052-28(NITE BP-1040) foram depositados por Incorporated Administrative Agency, the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japão) em 10 de fevereiro de 2010 e 18 de janeiro de 2011.

Exemplo 4: Clonagem de genes de anticorpo

[0085] (1) Um fragmento de DNA que codifica a região V de um anticorpo mo-noclonal de camundongo em CDH3 humano foi clonado através do procedimento a seguir. O RNA citoplásmico foi isolado das células de hibridoma de camundongo através de um método descrito em um documento (Gough, “Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells,” Analytical Biochemisty, 173, p. 93-95 (1988)), com a condição de que ao invés do tampão de dissolução descrito no documento, empregou-se um tampão de TNE (isto é, 25mM de Tris-HCl, pH: 7,5; 1% de NP-40; 150mM de NaCl; 1mM de EDTA, pH: 8.0). De modo mais específico, 5 x 106 células de hibridoma foram suspensas no tampão de TNE (200 μL), para, desse modo, dissolver as membranas celulares, e os núcleos celulares foram removidos através de centrifugação. Ao sobrenadante de citoplasma assim obtido (cerca de 200 μL), um tampão de extração (10mM de Tris-HCl, pH: 7,5; 0,35M de NaCl; 1%(p/v) de SDS; 10mM de EDTA, pH: 8,0; 7M de ureia) (200 μL) foi adicionado. A mistura foi submetida à extração com fenol e clorofórmio. À solução de RNA assim obtida, adicionou-se glicogênio (produto de Roche, Cat No. 901393) que serve como um carrea- dor. Então, adicionou-se etanol para precipitar o produto. O precipitado de RNA foi dissolvido em água destilada esterilizada (10 a 50 μL) a uma concentração de RNA citoplásmico de 0,5 a 2 μg/μL.

(2) Produção da biblioteca de cDNA do RNA preparado a partir de hibridomas

[0086] Para sintetizar um cDNA de fita única, preparou-se uma mistura de reação (20 μL) contendo o RNA citoplásmico preparado anteriormente (0,5 a 3 μg), 50mM de Tris-HCl (pH: 8,3, temperatura ambiente), 75mM de KCl, 3mM de MgCl2, e 10mM de DTT), um iniciador aleatório (100 ng), 0,5mM de dNTP, e Superscript II (transcriptase reversa, produto de Invitrogen) (200 unidades). A mistura foi incubada em 42°C durante 50 minutos. A biblioteca de cDNA assim sintetizada foi empregada como um modelo de reação de cadeia de polimerase (PCR) sem realizar um tratamento adicional.

(3) Amplificação de um gene que codifica uma região variável de anticorpo anti-CDH3 através de PCR

[0087] Todos os iniciadores empregados nos experimentos foram sintetizados por Hokkaido System Science Co., Ltd.

A. Iniciadores para uso na amplificação de PCR de um gene que codifica a região V de cadeia L em camundongos

[0088] Os dois conjuntos de iniciadores a seguir foram empregados: (i) um iniciador de DNA tendo, na terminação 5', uma homologia à parte FR1 e iniciadores de conjunto 4 tendo, na terminação 3', uma homologia a um gene de cadeia J na cadeia L em camundongos, e (ii) iniciadores de conjunto 7 tendo, na terminação 5', uma homologia à parte de sinal de cadeia L e um iniciador de anti-sentido tendo, na terminação 3', uma homologia à parte KC (iniciador de anti-sentido KVL). A reação de cadeia de polimerase foi realizada através do uso dos dois conjuntos de iniciadores, por meio dos quais um fragmento de DNA de região variável de cadeia L de imuno- globulina em camundongos foi obtido a partir de cDNA. As sequências iniciadoras são as seguintes.

(i) Iniciadores de conjunto 4 para clonagem de região variável de cadeia L em camundongos

[0089] De acordo com “Phage Display -A Laboratory Manual-, Barbas Burton Scott Silverman,” PROTOCOL 9.5, 17 iniciadores de sentido e 3 iniciadores inversos foram sintetizados por Hokkaido System Science Co., Ltd. Sentido VK (parte FR1)

[0090] Empregou-se uma mistura dos 17 iniciadores a seguir como um iniciador de sentido VK. 5’-GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC-3’ (degeneração 2): SEQ ID NO: 5 5’-GAY ATT GTT CTC WCC CAG TC-3’ (degeneração 4): SEQ ID NO: 6 5’-GAY ATT GTG MTM ACT CAG TC-3’ (degeneração 8): SEQ ID NO: 7 5’ GAY ATT GTG YTR ACA CAG TC-3’ (degeneração 8): SEQ ID NO: 8 5’ GAY ATT GTR ATG ACM CAG TC-3’ (degeneração 8): SEQ ID NO: 9 5’ GAY ATT MAG ATR AMC CAG TC-3’ (degeneração 16): SEQ ID NO: 10 5’ GAY ATT CAG ATG AYD CAG TC-3’ (degeneração 12): SEQ ID NO: 11 5’ GAY ATY CAG ATG ACA CAG AC-3’ (degeneração 4): SEQ ID NO: 12 5’ GAY ATT GTT CTC AWC CAG TC-3’ (degeneração 4): SEQ ID NO: 13 5’ GAY ATT GWG CTS ACC CAA TC-3’ (degeneração 8): SEQ ID NO: 14 5’ GAY ATT STR ATG ACC CAR TC-3’ (degeneração 16): SEQ ID NO: 15 5’ GAY RTT KTG ATG ACC CAR AC-3’ (degeneração 16): SEQ ID NO: 16 5’ GAY ATT GTG ATG ACB CAG KC-3’(degeneração 12): SEQ ID NO: 17 5’ GAY ATT GTG ATA ACY CAG GA-3’ (degeneração 4): SEQ ID NO: 18 5’ GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT-3’ (degeneração 4): SEQ ID NO: 19 5’ GAY ATT GTG ATG ACA CAA CC-3’ (degeneração 2): SEQ ID NO: 20 5’ GAY ATT TTG CTG ACT CAG TC-3’ (degeneração 2): SEQ ID NO: 21 Anti-sentido J (iniciadores de conjunto 4) Iniciador anti-sentido J1/J2 (1) 5’-GGS ACC AAR CTG GAA ATM AAA-3’ (degeneração 8): SEQ ID NO: 22 Iniciador anti-sentido J4 (2) 5’-GGG ACA AAG TTG GAA ATA AAA-3’: SEQ ID NO: 23 Iniciador anti-sentido J5 (3) 5’-GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA-3’: SEQ ID NO: 24 Mistura de iniciador anti-sentido J1/J2, J4, J5 (4)

(ii) Iniciadores de conjunto 7 para clonagem de região variável de cadeia L em camundongos Sentido VK (parte de peptídeo de sinal)

[0091] Os iniciadores foram obtidos através de modificação de sequência de nucleotídeo de um conjunto de iniciador de camundongo Ig (Novagen; Merck, Cat. No. 69831-3) de tal modo que os sítios de enzima de restrição tenham sido removidos. Iniciador de sentido de conjunto A 5’-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3’: SEQ ID NO: 25 Iniciador de sentido de conjunto B 5’-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’: SEQ ID NO: 26 Iniciador de sentido de conjunto C 5’-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3’: SEQ ID NO: 27 Iniciador de sentido de conjunto D (mistura dos 2 iniciadores a seguir) 5’-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3’: SEQ ID NO: 28 5’-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3’: SEQ ID NO: 29 Iniciador de sentido de conjunto E (mistura dos 3 iniciadores a seguir) 5’-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3’: SEQ ID NO: 30 5’-ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3’: SEQ ID NO: 31 5’-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC-3’: SEQ ID NO: 32 Iniciador de sentido de conjunto F (mistura dos 4 iniciadores a seguir) 5’-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3’: SEQ ID NO: 33 5’-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3’: SEQ ID NO: 34 5’-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3’: SEQ ID NO: 35 5’-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3’: SEQ ID NO: 36 Iniciador de sentido de conjunto G (mistura dos 4 iniciadores a seguir) 5’-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3’: SEQ ID NO: 37 5’-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3’: SEQ ID NO: 38 5’-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3’: SEQ ID NO: 39 5’-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3’: SEQ ID NO: 40 Iniciador anti-sentido KVL ACTGGATGGTGGGAAGATGGA: SEQ ID NO: 41

B. Iniciadores para uso na amplificação de PCR de um gene que codifica uma região V de cadeia H em camundongos

[0092] Os dois conjuntos de iniciadores a seguir foram empregados em iniciadores de conjunto 4 tendo, na terminação 5', uma homologia à parte de sinal de cadeia H em camundongos e um iniciador tendo, na terminação 3', uma homologia à parte IGHC; e iniciadores de conjunto 1 tendo, na terminação 5', uma homologia à parte FR1 e iniciadores de conjunto 2 tendo, na terminação 3', uma homologia à região constante de cadeia H em camundongos (IGHC). A reação de cadeia de polimerase foi realizada através do uso de dois conjuntos de iniciadores, por meio dos quais um fragmento de DNA de região variável de cadeia H de imunoglobulina em camundongos foi isolado do cDNA. As sequências iniciadoras são as seguintes.

(i) Iniciadores para clonagem de região variável de cadeia H em camundongos Sentido VH (parte de sinal: iniciadores de conjunto 4)

[0093] Estes iniciadores foram sintetizados de acordo com Current Protocols in Immunology (John Wiley and Sons, Inc.), Unit 2.12 Cloning, Expression, e Modification of Antibody V Regions (Tabela 2.12.2). 5’-ATG GRA TGS AGC TGK GTM ATS CTC TT-3’ (degeneração: 32): SEQ ID NO: 42 5’-ATG RAC TTC GGG YTG AGC TKG GTT TT-3’ (degeneração: 8): SEQ ID NO: 43 5’-ATG GCT GTC TTG GGG CTG CTC TTC T-3’: SEQ ID NO: 44 5’-ATG GRC AGR CTT ACW TYY-3’ (degeneração: 32): SEQ ID NO: 45 (ii) Iniciadores para clonagem de região variável de cadeia H em camundongos Sentido VH (parte FR1)

[0094] Estes iniciadores foram projetados por modificação de sequência de nucleotídeo de iniciadores de sentido descritos em um documento (Tan et al, “Supe-rhumanized” Antibodies: Reduction of Immunoogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti- CD281, Journal of Immunology 169 (2002), p. 1119-1125). 5’-SAG GTS MAR CTK SAG SAG TCW GG-3’(degeneração: 256): SEQ ID NO: 46 Anti-sentido VH (iniciador de anti-sentido comum a 3 e 4)

[0095] O iniciador foi projetado através da degeneração da sequência de nu- cleotídeo de tal modo que o iniciador pudesse ser temperado com todas as isoformas de camundongo IgG. 5’-CAS CCC CAT CDG TCT ATC C-3’(degeneração: 6): SEQ ID NO: 47

Exemplo 5 Produção de vetor de expressão de imunoglobulina anti-CDH3 quimérico Produção do plasmídeo de expressão

[0096] Através de PCR que emprega o Mecanismo de DNA (Peltier Thermal Cycler, MJ Research, Bio-Rad), cada região variável da cadeia L e da cadeia H de um anticorpo monoclonal de camundongo anti-CDH3 foi amplificada pelo suo dos iniciadores descritos no Exemplo 4. Cada um dos fragmentos de DNA assim amplificados foi incorporado em um vetor de subclonagem pGEM (produto de Promega). A sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA foi determinada pelo uso de um iniciador universal que se liga ao promotor T7 e SP6 do vetor. As sequências de nucleotídeo assim obtidas das regiões variáveis de cadeia L e de cadeia H do anticorpo anti-CDH3 foram buscadas pela página de Busca IMGT/V-QUEST (http://imgt.ci- nes.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=mouseIg), desse modo, confirmou-se o término da clonagem dos genes de anticorpo.

[0097] A seguir, um gene que codifica a região CK humana foi ligado ao gene clonado que codifica a região V da cadeia L do anticorpo anti-CDH3, e um gene que codifica a região Cr1 humana foi ligado ao gene que codifica a região V da cadeia H. Os genes de anticorpo quimérico de cadeia L e de cadeia H assim projetados foram sintetizados em comprimento inteiro por GenScript. No momento, a frequência de utilização de códon foi otimizada com a finalidade de obter uma expressão de gene eficiente em produzir células (de acordo com um método descrito em Kim et al., Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells, Gene, 199, 1997, p. 293-301). De modo específico, no caso de cadeia L, para o propósito de uma translação eficaz, uma sequência de DNA essencial (Kozak, M., J., At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, p. 947-950, 1987), peptídeo de sinal de camundongo IGKV, a região V da cadeia L do anticorpo anti-CDH3, e a região Ck humana foram justapostas nesta ordem, e os sítios de enzima de restrição foram adicionados a ambas as extremidades (NheI no lado 5' e EcoRI mo lado 3'). A cadeia H quimérica foi preparada da mesma maneira. Cada um dos genes sintetizados foi cortado com NheI e EcoRI, e o fragmento cortado foi incorporado em um vetor de expressão pCAGGS entre o sítio NheI e o sítio EcoRI, para, desse modo, produzir um vetor de expressão de cadeia L de anticorpo quimérico anti-CDH3 pCAGGS-IGK e o vetor de expressão de cadeia H pCAGGS-IGH.

Exemplo 6: produção de vetor de expressão estável de imunoglobulina anti- CDH3 quimérico

[0098] Para realizar uma expressão de nível alto de um gene anticorpo geneticamente modificado em células de CHO, produziu-se um vetor de expressão no qual se incorporou um gene de diidrofolato reductase (dhfr) ligado a uma sequência promotora CMV e tendo um sinal poli A.

[0099] Com o intuito de produzir uma linhagem celular para expressar/produzir estavelmente um anticorpo quimérico, produziu-se um vetor de expressão pCAGGS no qual um gene dhfr foi incorporado. De modo específico, em pCAGGS-IGH e pCA- GGS-IGK, que são vetores de expressão transientes, incorporou-se um gene dhfr tendo um promotor CMV e um sinal poli A. Cada gene dhfr de camundongo tendo um promotor CMV e uma sequência Kozak e um sinal SV40 poli A foi amplificado através de PCR. Estes genes sob a forma de mistura foram ligados entre si através de PCR, e um sítio HindIII foi adicionado a ambas as extremidades do produto ligado, para, desse modo, adquirir um fragmento de gene de HindIII-CMV promotor-Kozak-dhfr-poli A-HindIII. O fragmento foi inserido em pCAGGS-IGH ou pCAGGS-IGK nos sítios de HindIII, para, desse modo, obter pCAGGS-IGH-CMVp-dhfr-A e pCAGGS-IGK-CMVp- dhfr-A. Estes vetores de expressão permitem a expressão de anticorpo quimérico com um promotor CAG, e a expressão de um gene dhfr com um promotor CMV, desse modo, um anticorpo quimérico pode ser efetivamente produzido através de amplificação de gene.

Exemplo 7: Estabelecer uma linhagem celular de CHO produtora de anti- CDH3 quimérico

[00100] As células de CHO dhfr (G. Urlaub et al., Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p. 4216-4220, 1980) foram simultaneamente transformadas pelo uso de dois plas- mídeos (plasmídeos lineares obtidos cortando-se plasmídeos circulares com PvuI em um gene resistente à ampicillina); isto é, um vetor pCAGGS-IGK-CMV-dhfr-A para expressão de cadeia L anti-CDH3 quimérico e um vetor pCAGGS-IGH-CMV-dhfr-A para expressão de cadeia H anti-CDH3 quimérico. Realizou-se uma eletroporação por meio de Amaxa (produto de Lonza). O fragmento de DNA (2 μg/amostra; no caso de plas- mídeo de cadeia L ou plasmídeo de cadeia H) foi adicionado a 0,1mL de tampão de CHO de eletroporação por Amaxa contendo 3 x 103 células e um pulso foi aplicado.

[00101] As células que foram submetidas à eletroporação foram adicionadas a um meio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM : livre de HT) contendo 10% de FBS dializado que é livre de HT (H: hipoxantina, T: timidina). Três dias após a trans- fecção, o meio foi carregado em um meio de IMDM livre de 10% de FBS dializado, 2mM de L-glutamina, e HT, e neo+ células transformadas foram selecionadas pelo uso de 1 mg/mL de G418, para, desse modo, adquirir clones de uma linhagem celular positiva produtora de anticorpo quimérico. De modo subsequente, realizou-se uma amplificação de gene através do uso dos clones selecionados utilizando-se G418. Realizou-se uma amplificação de 2 ciclos em 250nM e 1.000nM de metotrexato (MTX), e estabeleceram-se linhagens celulares que podem produzir um anticorpo CDH3 quimérico (cerca de 50 a 100 mg/sobrenadante de cultura L). As linhagens celulares de CHO para expressar estavelmente um anticorpo anti-CDH3 quimérico assim estabelecidas foram depositadas por Incorporated Administrative Agency, the National Insti-tute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary. Tabela 1

Exemplo 8: Aquisição de anticorpos purificados

[00102] Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura pelo uso da proteína A.

Exemplo 9: Confirmação de afinidade

[00103] Através de um método competitivo, a afinidade do anticorpo anti- CDH3 de camundongo foi comparada à afinidade do anticorpo anti-CDH3 quimérico. No método competitivo, a afinidade do anticorpo anti-CDH3 foi determinada através de citometria de fluxo (BD, FACS Calibur) pelo uso de células cancerígenas NCI-H358, que são conhecidas como sendo células de alta expressão de CDH3.

[00104] De modo específico, uma amostra serialmente diluída de anticorpo (400 μg/mL a 24 ng/mL) (50 μL) e um anticorpo marcado com Alexa488 (4 μg/mL) (50 μL) foram adicionados e misturados em uma placa de 96 poços. As células NCI-H358 foram removidas de uma placa de cultura através do tratamento com 2mM de EDTA- PBS, e as células foram suspensas em uma solução de FACS (1% de BSA PBS) em uma concentração de 1,5 x 106/mL. Uma alíquota (100 μL) da suspensão foi adicionada aos poços contendo a mistura de anticorpo. Após a adição, a reação foi realizada em temperatura ambiente durante 60 minutos, e a placa foi lavada duas vezes com uma solução de FACS (200 μL/poço). De modo subsequente, a intensidade de fluorescência (valor médio de GEO) de cada poço foi determinada através de citometria de fluxo.

[00105] O percentual de inibição de ligação do anticorpo marcado com Alexa488 foi calculado a partir de um valor médio de GEO, comparado ao percentual obtido pela reação apenas com o anticorpo marcado com Alexa488 (1 μg/mL). A concentração de anticorpo que mostra uma inibição de 50% foi calculada, e os dados foram comparados.

[00106] A Figura 1 mostra a avaliação de afinidade de PPMX2016 (anticorpo de camundongo) e PPAT-052-27c (anticorpo quimérico do mesmo). Virtualmente, não foram observadas diferenças em afinidade entre os dois anticorpos.

Exemplo 10: Produção de anticorpos marcados (1) Ligação de DOTA ao anticorpo

[00107] Um anticorpo foi dissolvido em um tampão (50mM de Bicine-NaOH, 150mM de NaCl, pH: 8,5) em uma concentração de anticorpo de 10 mg/mL. Separadamente, isotiocianobenzil DOTA (B-205, produto de Macrocyclics) foi dissolvido em DMSO em uma concentração de 10 mg/mL. As duas soluções foram misturadas juntas com a finalidade de ajustar a razão molar entre o anticorpo e DOTA 1:1 (razão de adição 1:1), 1:3 (razão de adição 1:3), ou 1:10 (razão de adição 1:10), e a mistura foi agitada e deixada descansar em 25°C durante 17 horas. Após o término da reação, a mistura de reação foi purificada por meio de uma coluna de dessalinização (PD-10, produto de GE Healthcare, 17-0435-01) com PBS. Utilizaram-se os anticorpos a seguir: PPMX2016, PPMX2025, PPMX2029, PPAT-052-27c, e PPAT-052-28c.

(2) Determinação do percentual de incorporação de quelato

[00108] O percentual de quelato incorporado ao anticorpo foi determinado através de titulação quelatométrica. A concentração de proteína de anticorpo de modificação foi determinada antecipadamente através de um método convencional, e o número de moles de anticorpo de modificação foi calculado a partir do peso molecular de IgG. A 1-mg/mL de solução de cobre padrão (100 μL) cuja concentração foi determinada através de espectometria de absorção atômica, um reagente arsenazo III (0,776 mg) e uma solução de 5M de acetato de amônio isenta de metal (produto de Sigma Aldrich) (3 mL) foram adicionados, e água ultra-pura foi adicionada à solução para ajustar o volume final para 10 mL. A solução resultante foi armazenada em temperatura ambiente no escuro para preparar a solução de arsenazo III. Dissolveu-se DOTA em água ultra-pura, para, desse modo, preparar uma solução padrão de DOTA. Um anticorpo de modificação foi dissolvido em água ultra-pura, para, desse modo, preparar uma solução de anticorpo de modificação. A solução padrão de DOTA ou a solução de anticorpo de modificação (10 μL) foi misturada com a solução de arsenazo III (190 μL), e a mistura foi incubada em 37°C durante 30 minutos. De modo subsequente, a absorbância da mistura foi medida em um comprimento de onda de 630 nm. Desenhou-se uma curva padrão a partir das medições de absorbância de soluções padrão de DOTA. Através de curva padrão, o número de molécula(s) ligada(s) ao anticorpo de modificação foi calculado (número médio de modificação de DOTA).

[00109] A Tabela 2 mostra os resultados (razão de adição de DOTA e número médio real de DOTA de modificação). Conforme fica claro a partir da Tabela 2, descobriu-se que o número de moléculas de DOTA ligadas ao anticorpo é determinado pela razão de adição de DOTA. Tabela 2

(Nota) PPAT-052-27c foi testado apenas em uma razão de adição de 1:3.

(3) Preparação de anticorpos marcados com 67Ga-, 111In-, ou 90Y (i) Marcação com 67Ga ou 111In

[00110] Cada um dos anticorpos PPMX2016, PPMX2025, PPMX2029, e PPAT-052-27c purificados e o anticorpo PPAT-052-28c foram dissolvidos em um tampão (0,25M de acetato de amônio-HCl, pH: 5,5) em uma concentração de 6 mg/mL. Uma solução de A 67GaCl3 (produto de Fuji Film RI Pharma) ou uma solução de 111InCl3 (produto de MDS Nordion Inc.) foi adicionada à solução de anticorpo, e a mistura foi incubada em 45°C durante uma hora.

(ii) Marcação com 90Y

[00111] Cada um dos anticorpos PPMX2029 e PPAT-052-27c purificados foi dissolvido em um tampão (0,25M de acetato de amônio-HCl, pH: 5,5) em uma con-centração de 6 mg/mL. Uma solução de 90YCl3 (produto de Nuclitec) foi adicionada à solução de anticorpo, e a mistura foi incubada em 45°C durante uma hora.

(iii) Determinação do percentual de marcação

[00112] Uma alíquota da mistura de reação de marcação foi amostrada e submetida à cromatografia em camada delgada (61885, produto de PALL), para, desse modo, determinar o percentual de marcação. A solução salina fisiológica foi empregada como um eluente, e a radioatividade foi medida nas extremidades superior e inferior de uma faixa por meio de um y-contra. O percentual de marcação foi calculado pela equação a seguir. [E1] Percentual de marcação = (contagem de extremidade inferior /(contagem de extremidade superior + contagem de extremidade inferior))x100 (%)

[00113] Quando o percentual de marcação tiver alcançado 90% ou maior, o anticorpo marcado foi usado no experimento subsequente. Os anticorpos marcados foram purificados em uma coluna de dessalinização (PD-10, produto de GE Healthcare, 17-0435-01) com PBS.

Exemplo 11: Investigação da relação entre o percentual de incorporação de quelato e a biodistribuição (isto é, distribuição no corpo)

[00114] PPMX2016, PPMX2025, e PPMX2029 foram investigados em termos de biodistribuição em virtude da diferença de percentual de valores de incorporação de quelato (razão de adição de DOTA 1:1, 1:3, e 1:10).

[00115] Primeiramente, NCI-H358 foi cultivado em um meio de RPMI1640 contendo 10% de FBS, e as células cultivadas foram subcutaneamente transplantadas à região ventral direita de cada camundongo pelado (fêmeas, 7 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em uma concentração celular de 1 x 107 células/camundongo. Os camundongos foram criados até que o volume médio do tumor tenha alcançado 100 a 150 mm3.

[00116] Então, aos camundongos transplantados com NCI-H358, anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2016 (razão de adição de 1:3 e 1:10), anticorpo 67Ga-DOTA- PPMX2025 (razão de adição de 1:3 e 1:10), ou anticorpo 67Ga-DOTA-PPMX2029 (razão de adição de 1:3 e 1:10) foi administrado em uma dose de 370 kBq/camun- dongo.

[00117] Noventa e seis horas após a administração, os camundongos foram sacrificados em anatomia, e os tecidos e o tumor foram removidos. O peso de cada tecido e o peso do tumor foram medidos, e a radioatividade foi medida por meio de um y-contra e a %ID/g foi calculada pela equação a seguir. [E2] %ID/g=(quantidade de RI acumulada/quantidade de RI administrada total x 100 (%))/peso (g)

[00118] As Figuras 2 a 7 mostram os resultados. Todos os anticorpos testados exibiram um acúmulo aumentado no tumor, em uma razão de adição de DOTA de 1:3, comparada ao caso em uma razão de 1:10. Esse acúmulo aumentado resulta no aprimoramento do efeito terapêutico. Além disso, podem-se evitar efeitos colaterais adversos, que, de outro modo, seriam causados pela retenção de uma substância radioativa em órgãos não-marcados.

[00119] A Figura 8 mostra o resultado da administração do anticorpo 67Ga- DOTA-PPMX2025 (razão de uso de 1:1, 1:3, e 1:10) em camundongos pelados não- portadores de câncer (fêmeas, 7 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em 370 kBq/ca- mundongo. O anticorpo foi altamente acumulado no fígado quando a razão de adição era de 1:10, enquanto o acúmulo no fígado era de 1:3 ou 1:1, indicando que efeitos colaterais adversos, como danos radioativos, são evitados no fígado.

Exemplo 12: Investigação do comportamento de anticorpo anti-caldina quimérico no corpo

[00120] Investigaram-se comportamentos de anticorpos quiméricos PPAT- 052-27c e PPAT-052-28c no corpo.

[00121] Primeiramente, NCI-H1373 foi cultivado em um meio de RPMI1640 contendo 10% de FBS, e as células cultivadas foram subcutaneamente transplantadas à região ventral direita de cada camundongo pelado (fêmeas, 9 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em uma concentração celular de 4 x 106 células/camundongo. Os camundongos foram criados até que o volume médio do tumor tenha alcançado 100 a 150 mm3.

[00122] Então, aos camundongos transplantados com NCI-H1373, anticorpo 111In-DOTA-PPAT-052-27c (razão de adição de 1:3) ou 111In-DOTA-PPAT-052-28c (razão de adição de 1:3) foi administrado em uma dose de 370 kBq/camundongo.

[00123] Quarenta e oito ou a noventa e seis horas após a administração, os camundongos foram sacrificados em anatomia, e os tecidos e o tumor foram removidos. O peso de cada tecido e o peso do tumor foram medidos, e a radioatividade foi medida por meio de um y-contra e a %ID/g foi calculada.

[00124] As Figuras 9 a 11 mostram os resultados. PPAT-052-27c exibiu um acúmulo percentual no tumor tão alto quanto 46% ID/g 48 horas após a administração. PPAT-052-28c exibiu um acúmulo percentual no tumor tão alto quanto 41% ID/g 48 horas após a administração e 52% ID/g 96 horas após a administração.

Exemplo 13: Teste de xenoenxerto

[00125] NCI-H358 foi cultivado em um meio de RPMI1640 contendo 10% de FBS, e as células cultivadas foram subcutaneamente transplantadas à região ventral direita de cada camundongo pelado (fêmeas, 7 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em uma concentração celular de 1 x 107 células/camundongo.

[00126] Os camundongos transplantados com NCI-H358 foram divididos em seis grupos (n=8). O anticorpo 90Y-DOTA-PPMX2029 (razão de adição de 1:3) foi administrado em uma dose de 7,4 MBq/camundongo, 5,6 MBq/camundongo, 3,7 MBq/camundongo, e 1,9 MBq/camundongo. Como grupos de controle, PPMX2029 não-marcado foi administrado em uma dose de 80 μg/camundongo, e uma solução salina fisiológica foi administrada em uma dose de 100 μL/camundongo. Em todos os grupos, a administração foi realizada quando o volume médio do tumor tiver alcançado 100 a 150 mm3.

[00127] Após a administração, o peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas vezes por semana (a cada 3 ou 4 dias). Esta observação foi continuada até o dia 51 após a administração.

[00128] A Figura 12 mostra os resultados de teste. O anticorpo 90Y-DOTA- PPMX2029 (razão de adição de 1:3) exibiu um efeito antitumoral proporcional à radi-oatividade.

[00129] Separadamente, NCI-H1373 foi cultivado em um meio de RPMI1640 contendo 10% de FBS, e as células cultivadas foram subcutaneamente transplantadas à região ventral direita de cada camundongo pelado (fêmeas, 7 semanas de idade, CLEA Japan Inc.) em uma concentração celular de 5 x 106 células/camundongo.

[00130] Os camundongos transplantados com NCI-H1373 foram divididos em quatro grupos (n=8). O anticorpo 90Y-DOTA-PPAT-052-27c (razão de adição de 1:3) foi administrado em uma dose de 5,6 MBq/camundongo e 3,7 MBq/camundongo. Como grupos de controle, PPMX2029 não-marcado foi administrado em uma dose de 60 μg/camundongo, e uma solução salina fisiológica foi administrada em uma dose de 100 μL/camundongo. Em todos os grupos, a administração foi realizada quando o volume médio do tumor tiver alcançado 100 a 150 mm3.

[00131] Após a administração, o peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas vezes por semana (a cada 3 ou 4 dias). Esta observação foi continuada até o dia 26 após a administração.

[00132] A Figura 13 mostra os resultados de teste. O anticorpo 90Y-DOTA- PPAT-052-27c (razão de adição de 1:3) exibiu um efeito antitumoral proporcional à radioatividade.

Exemplo 14: Coloração imuno-histoquímica

[00133] A expressão de proteína CDH3 em uma amostra de câncer clínico foi confirmada colorando-se de modo imuno-histoquímico uma matriz de tecido de amostra de câncer.

[00134] Como as matrizes de tecido de amostra de câncer, empregaram-se câncer pancreático (adenocarcinoma), câncer de pulmão (adenocarcinoma), câncer de pulmão (carcinoma de células escamosas), e câncer colorretal (adenocarcinoma), que são os produtos de Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd.

[00135] Cada lâmina de matriz de tecido foi desparafinada e ativada com 10mM Tris 1mM EDTA (pH: 9,0) em 95°C durante 40 minutos. A peroxidase endógena na lâmina de matriz foi desativada por um agente de bloqueio, que está incluído em ENVISION+Kit (produto de Dako). De modo subsequente, a lâmina de matriz de tecido foi reagida com 5 μg/mL de anticorpo anti-CDH3 610227 (produto de BD BIOSCIENCE) ou com 5 μg/mL de anticorpo anti-HBs Hyb-3423 (controle negativo) em 4°C de um dia para o outro. O anticorpo solution foi removido, e a lâmina de matriz de tecido foi adicionalmente reagida com um reagente de anticorpo secundário de polímero que está incluído em ENVISION+Kit em temperatura ambiente durante 30 minutos. Então, a lâmina teve sua cor desenvolvida por um reagente de coloração que está incluído em ENVISION+Kit, e a coloração nuclear foi realizada pelo uso de uma solução de hematoxilina/eosina.

[00136] A Figura 14 mostra os resultados. As células cancerígenas foram coloridas pelo anticorpo anti-CDH3, porém, as células normais não foram coloridas.

Claims

1. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo CARACTERIZADO pelo fato de que é obtido pela ligação de um elemento metálico radioativo a um anticorpo anti-P-caderina através de um reagente quelante metálico, em que o anticorpo anti-P-caderina é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo re- combinante produzido por uma célula produtora de anticorpos representada por um número de acesso dentre NITE BP-897, NITE BP-899, NITE BP-1048, NITE BP-1049 ou NITE BP-1050, ou um fragmento de ligação P-caderina de qualquer um desses anticorpos.

2. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-P-caderina é um anticorpo quimérico ou um fragmento de ligação P-caderina do mesmo.

3. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente quelante metálico é selecionado a partir do grupo que consiste em isotiocianobenzil DOTA, metiliso- tiocianobenzil DTPA, e ciclohexilisotiocianobenzil DTPA.

4. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão molar entre o anticorpo anti-P-caderina e o reagente quelante metálico é 1:0,1 a 1:4,5.

5. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão molar entre o anticorpo anti-P-caderina e o reagente quelante metálico é 1:0,5 a 1:3.

6. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o elemento metálico radioativo é um metal radioativo citotóxico usado na terapia contra o câncer que pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em ítrio-90 (90Y), rê- nio-186 (186Re), rênio-188 (188Re), cobre-67 (67Cu), ferro-59 (59Fe), estrôncio-89 (89Sr), ouro-198 (198Au), disprósio-165 (165Dy), rutênio-103 (103Ru), hólmio-166 (166Ho), samá- rio-153 (153Sm) e lutécio-177 (177Lu).

7. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o metal radioativo citotóxico é ítrio-90 (90Y).

8. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é direcionado a um câncer que expressa P-caderina.

9. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o ele-mentometálico radioativo é um metal radioativo não-citotóxico usado no diagnóstico de câncer, que pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em tecnécio-99m (99mTc), índio-111 (111In), índio-113m (113mIn), gálio-67 (67Ga), gálio-68 (68Ga), tálio-201 (201Tl), cobalto-57 (57Co), estrôncio-85 (85Sr) e cobre-64 (64Cu).

10. Anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o metal radioativo não-citotó- xico é selecionado a partir de índio-111 (111In) e gálio-67 (67Ga).

11. Agente terapêutico contra o câncer CARACTERIZADO pelo fato de que contém, como um ingrediente ativo, o anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8.

12. Agente de diagnóstico de câncer CARACTERIZADO pelo fato de que con-tém, como um ingrediente ativo, o anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, conforme definido na reivindicação 9 ou 10.

13. Hibridoma CARACTERIZADO pelo fato de que é depositado sob o número de acesso dentre NITE BP-897 e NITE BP-899.

14. Uso do anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que é para produzir um agente terapêutico contra o câncer.

15. Uso do anticorpo anti-P-caderina marcado com metal radioativo, conforme definido na reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que é para produzir um agente de diagnóstico de câncer.