CN107847593A - 治疗抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗癌症，更具体地说，用于治疗前列腺、膀胱和/或胰腺癌的治疗抗体。本发明的一个实施方案是抗‑磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)‑1(GPC1)抗体，其可以缀合于对前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。

Description

治疗抗体及其用途
通过交叉引用的并入
本申请要求2015年4月20日提交的澳大利亚临时专利申请号2015901423的优先权，其全部内容以交叉引用的方式并入本文。
技术领域
本发明一般涉及前列腺癌、胰腺癌和/或膀胱癌领域。更具体地说，本发明涉及使用抗体治疗前列腺癌、胰腺癌和/或膀胱癌。
背景技术
前列腺癌是男性最常发生的肿瘤并且在死亡率方面仅次于肺癌。如果前列腺癌被早期诊断出来的话，那么使用外科手术和/或放疗的治疗在许多患者中是成功的。然而，患有晚期疾病的许多患者以及所有前列腺癌患者中相当大的比例最终在局部治疗后发展出转移性疾病。
据估计膀胱癌每年在美国影响大约77,000名成人，估计引起16,000人死亡。据预测2016年在美国有相当数量的人被诊断出胰腺癌(53,000例)，同时死亡率非常高(41,000例)。用于这些癌症的常规治疗包括外科切除、放射治疗和/或化疗。
虽然治疗抗体作为癌症治疗中的有效药剂很有前景，但是并没有治疗抗体经过监管批准被用于治疗前列腺癌、胰腺癌或膀胱癌。授予Walker等人的美国专利号5,622,836公开了一种名为BLCA-38(BLCA-“膀胱癌”)的抗体。该文件教导BLCA-38是一种对由膀胱癌细胞表达的未知抗原具有特异性的单克隆抗体。还教导了BLCA-38对于人卵巢癌和结肠癌细胞系以及一些黑素瘤细胞系显示特异性，但是对淋巴(T淋巴或B淋巴)和白血病细胞系不显示特异性。
随后，Russell等人(2004)(Russell等人,“含有针对前列腺癌的蜂毒素样肽101的免疫缀合物的细胞毒性：体外和体内研究(Cytotoxic properties of immunoconjugatescontaining melittin-like peptide 101against prostate cancer:in vitro&in vivostudies)”.Cancer Immunol Immunother 2004:53(5):411-421)公开了一项研究，其中使用BLCA-38将细胞毒性肽靶向于前列腺癌细胞。作者指出BLCA-38是针对人膀胱癌细胞系UCRU-BL-17CL产生的鼠单克隆抗体。
Russell等人在2004年的另一项公开(Russell等人,“单克隆抗体BLCA38的免疫组织化学表征以用于检测前列腺癌(Immunohistochemical characterization of themonoclonal antibody,BLCA38,for the detection of prostate cancer)”.CancerImmunol Immunother 2004:53(11)995-1004)也教导了BLCA-38是针对人膀胱细胞系产生的鼠单克隆抗体，其能够结合于膀胱癌细胞、前列腺癌细胞和外阴表皮样细胞，但不结合于乳腺癌细胞。该文章指出BLCA-38对难以表征或鉴别的大约30kDa大小的抗原具有特异性。
Carter等人(2004)(Carter等人,“BLCA38，一种针对前列腺癌的抗体的完整单克隆抗体和片段的生物分布(Biodistributions of intact monoclonal antibodies andfragments of BLCA38,a new prostate cancer directed antibody)”.Cancer ImmunolImmunother 2004:53(6)533-542)分析了使用BLCA-38将治疗剂靶向于前列腺癌细胞的时点和剂量，也表明其是靶向在细胞表面上和细胞质中表达的约30kDa的抗原的鼠单克隆抗体。作者声明抗原的性质是难捉摸的，并且指出其在膀胱和前列腺癌细胞上被表达。
Khatri等人在2010年发表的文章(Khatri等人“BLCA38作为用于前列腺癌的组织特异性基因递送的靶向抗体的前景(Promise of BLCA38as a Targeting Antibody forTissue-Specific Gene Delivery to Prostate Cancer)”.Austral-Asian J.Cancer2010:9(3):195-203)重申了BLCA-38是对前列腺癌细胞具有特异性的鼠单克隆抗体。这些作者揭示了虽然BLCA-38在结合到其抗原时没有被内化，但是与病毒缀合促进了所述抗体的内化，从而导致报告基因的增加的表达。
不同于会破坏癌细胞同时也破坏健康细胞的许多癌症治疗，靶向癌症治疗被设计成选择性地攻击肿瘤细胞，同时避开接受治疗的患者体内的健康细胞和组织。举例来说，靶向抗体药物缀合物(ADC)借助于特异性结合到由癌细胞特异性地产生的标记物上而将细胞毒性剂选择性地递送到癌细胞。这些药剂将其毒性载荷递送到癌细胞并避免破坏健康组织的能力显然是重要的。另外，在特异性结合到癌细胞时的ADC的内化与未内化的ADC相比可以增强其细胞毒性效应。内化可以允许ADC的设计，从而在被摄入细胞囊泡(例如内体和溶酶体)时增强ADC的效应。同样值得注意的是，ADC的内化并不一定诱导有效的细胞杀死，这是一种可能部分起源于不同类型的癌细胞中的差别内体/溶酶体加工路径的观察结果。
治疗抗体可能需要历经多个剂量的大量产品以便在临床上有效(例如每剂200–350mg/m2)。ADC的治疗剂量通常可以略微小于裸露的治疗单克隆抗体(TMA)的治疗剂量(例如每剂160mg)。然而，ADC构建涉及另外的技术，例如使生产流程变复杂并且可能显著增加制造成本的化学缀合步骤。因此尽可能以更低成本提供治疗剂量ADC是值得期望的。
虽然抗体作为治疗剂具有前景，但是对于治疗前列腺、膀胱和/或胰腺癌的有效治疗抗体的需求持续存在。
发明内容
本申请的发明人已经意外地确认了前述现有技术中提到和使用的BLCA-38抗体是采取混合群体形式的两种不同的单克隆抗体的组合。已经确定了这些抗体物种中只有一种能够强烈结合到前列腺癌细胞上存在的相关靶抗原上，而另一种物种则不能。此外，已经意外地发现能够结合到前列腺癌细胞上存在的相关靶抗原上的抗体物种在结合时被内化，虽然前述现有技术指示相反的情况。此外，本申请的发明人已经证实了前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌细胞中的有效内化，这提供一种靶向和杀死这些癌细胞类型的方法。
因此，本发明的第一方面提供一种用于治疗受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段的医药制剂，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
在第二方面，本发明提供一种用于杀死受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段的医药制剂，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
在第三方面，本发明提供一种用于治疗受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌肿瘤的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段的医药制剂，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述肿瘤的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
在第四方面，本发明提供抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段在制备用于治疗受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌的药物中的用途，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
在第五方面，本发明提供抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段在制备用于杀死受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞的药物中的用途，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
在第六方面，本发明提供抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段在制备用于治疗受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌肿瘤的药物中的用途，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
在第七方面，本发明提供一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段，用于治疗受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
在第八方面，本发明提供一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段，用于杀死受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
在第九方面，本发明提供一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段，用于治疗受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌肿瘤，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
在第十方面，本发明提供一种放射显像受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺的方法，所述方法包括：
对所述受试对象施用包含抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段的医药制剂，其中所述抗体和/或片段缀合于至少一种放射显像剂，
检测所述放射显影剂发出的辐射，和
使用检测到的辐射形成所述前列腺、膀胱和/或胰腺的放射图像。
在第十方面的一个实施方案中，受试对象的前列腺的特征为存在良性前列腺增生(BPH)。
在第十方面的一个实施方案中，受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺是癌性的。在第十方面的一个实施方案中，受试对象罹患前列腺、膀胱和/或胰腺癌。
在第十方面的一个实施方案中，放射显像剂选自由以下组成的组：18F、67Ga、68Ga、81mKr、82Rb、13N、99mTc、111In、123I、124I、133Xe、201Tl、177Lu、89Zr、64Cu、67Cu、32P及其任何组合。
在第十方面的一个实施方案中，放射显像是单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，并且放射显像剂选自由以下组成的组：99mTc、111In、67Ga、123I及其任何组合。
在第十方面的一个实施方案中，放射显像是正电子发射断层扫描(PET)，并且放射显像剂选自由以下组成的组：18F、68Ga、64Cu、86Y、124I、89Zr及其任何组合。
在以上方面的一个实施方案中，医药制剂不包含具有轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:11的位置48-58所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置48-58所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:11的位置74-80所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置74-80所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:11的位置113-121所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置113-121所定义的氨基酸序列组成。
在以上方面的另一个实施方案中，细胞毒性剂是被设计成在摄取入所述前列腺癌细胞、膀胱癌细胞和/或胰腺癌细胞的内体或溶酶体中时被激活的前药。
在以上方面的另一个实施方案中，前药通过以下连接子缀合于所述抗体和/或其抗原结合片段：
在小于pH 7.2、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0、pH 4.5或pH 4的pH下容易裂解的酸敏感连接子，
酶裂解型连接子，其中能够裂解所述连接子的酶存在于所述内体或溶酶体内。
在以上方面的另一个实施方案中，细胞毒性剂通过结合到缀合于所述抗体和/或其抗原结合片段的螯合剂上而连接于所述抗体和/或其抗原结合片段。
在以上方面的另外一个实施方案中，抗体包含：
(a)重链可变区，包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:3的位置50-54所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:3的位置50-54所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:3的位置69-85所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:3的位置69-85所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:3的位置118-126所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的位置118-126所定义的氨基酸序列组成；和
(b)轻链可变区，包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:4的位置44-54所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:4的位置44-54所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:4的位置70-76所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:4的位置70-76所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:4的位置109-117所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4的位置109-117所定义的氨基酸序列组成。
在以上方面的一个实施方案中，抗体通过以保藏号CBA20140026保藏在澳大利亚细胞银行(Cellbank Australia)的杂交瘤细胞或其子代产生。
在以上方面的另一个实施方案中，抗体是：
(i)人源化抗-GPC1抗体，
(ii)嵌合抗-GPC1抗体，
(iii)人抗-GPC1抗体，
(iv)单克隆抗-GPC1抗体，
(v)多聚体抗-GPC1抗体，或
(vi)合成抗-GPC1抗体。
在以上方面的一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，所述嵌合抗体包含：
(a)重链恒定区，包含如SEQ ID NO:7的残基138-467中所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:7的残基138-467中所定义的氨基酸序列组成；和
(b)轻链恒定区，包含如SEQ ID NO:8的残基128-234中所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:8的残基128-234中所定义的氨基酸序列组成。
在以上方面的另一个实施方案中，其抗原结合片段是：单链可变片段(scFv)、可变结构域(Fv)片段、片段抗原结合(Fab)片段、F(ab)2片段、肽、或含有表位结合区的蛋白水解片段。
在以上方面的另外一个实施方案中，其抗原结合片段是：包含如SEQ ID NO:9中所定义的序列的单链可变片段(scFv)。
在以上方面的另外一个实施方案中，细胞毒性剂选自由以下组成的组：肾上腺皮质抑制剂、烷化剂、烷基磺酸盐、蒽环类药物、抗血管生成剂、抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、澳瑞他汀(auristatin)、卡奇霉素(calicheamycin)、喜树碱、COX-2抑制剂、酶抑制剂、表鬼臼毒素、乙烯亚胺衍生物、叶酸类似物、HDAC抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、激素拮抗剂、美登素(maytansinoid)、甲基肼衍生物、mTOR抑制剂、氮芥、亚硝基脲、铂配位络合物、促凋亡剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、放射性同位素、取代脲、紫杉烷、三氮烯、微管蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和长春花生物碱。
在以上方面的另外一个实施方案中，细胞毒性剂选自由以下组成的组：阿法替尼(afatinib)、阿普立定(aplidin)、阿那曲唑(anastrozole)、蒽环类药物、AVL-101、AVL-291、阿西替尼(axitinib)、阿扎立平(azaribine)、苯达莫司汀(bendamustine)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、博舒替尼(bosutinib)、苔藓抑素(bryostatin)-1、白消安(busulfan)、camptothecans、卡铂(carboplatin)、卡奇霉素、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、塞来昔布(celecoxib)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatinum)、克拉屈滨(cladribine)、COX-2抑制剂、克唑替尼(crizotinib)、氰基吗啉代阿霉素(cyano-morpholino doxorubicin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素D(dactinomycin)、达沙替尼(dasatinib)、柔红霉素(daunorubicin)、dinaciclib、3’,5’-0-二油酰基-FudR(FUdR-d0)、DM1、DM3、DM4、多西他赛(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、葡萄糖醛酸阿霉素(doxorubicin glucuronide)、倍癌霉素(duocarmycin)、内皮抑素(endostatin)、恩替诺特(entinostat)、表鬼臼毒素、葡萄糖醛酸表柔比星(epirubicin glucuronide)、埃罗替尼(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、雌激素受体结合剂、葡萄糖醛酸依托泊苷(etoposide glucuronide)、磷酸依托泊苷、依托泊苷(etoposide)(VP16)、依西美坦(exemestane)、法尼基-蛋白转移酶抑制剂(farnesyl-protein transferaseinhibitors)、芬戈莫德(fingolimod)、夫拉平度(flavopiridol)、氟尿苷(floxuridine)(FUdR)、氟达拉滨(fludarabine)、5-氟尿嘧啶、氟他胺(flutamide)、fostamatinib、ganetespib、GDC-0834、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、GS-1101、10-羟基喜树碱、羟基脲、依鲁替尼(ibrutinib)、去甲氧基柔红霉素(idarubicin)、艾代拉里斯(idelalisib)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、拉帕替尼(lapatinib)、来那度胺(lenolidamide)、醛氢叶酸(leucovorin)、LFM-A13、洛莫司汀(lomustine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、单甲基澳瑞他汀D(monomethylauristatin D)(MMAD)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、诺维本(navelbine)、来那替尼(neratinib)、尼洛替尼(nilotinib)、亚硝基脲、奥拉帕尼(olaparib)、紫杉醇(paclitaxel)、PCI-32765、喷司他丁(pentostatin)、林可霉素(plicomycin)、2-PDox前药(pro-2-PDox)、甲基苄肼(procarbazine)、PSI-341、2-吡咯啉代阿霉素(2-PDox)、雷洛昔芬(raloxifene)、司莫司汀(semustine)、SN-38、索拉非尼(sorafenib)、链佐星(streptozocin)、SU1 1248、舒尼替尼(sunitinib)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temazolomide)、替尼泊苷(teniposide)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤、噻替派(thiotepa)、拓扑替康(topotecan)、反式铂(transplatinum)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、瓦他拉尼(vatalanib)、长春花碱(vinblastine)、长春花生物碱(vinca alkaloids)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)和ZD 1839。
在以上方面的另外一个实施方案中，细胞毒性剂是选自由以下组成的组的放射性同位素：90Y、188Re、166Ho、165Dy、109Pd、111Ag、186Re、198Au、153Sm、64Cu、177Lu、131I、125I、67Cu、175Yb、166Dy、169Er、212Bi、213Bi、225Ac、212Pb、66Ga、67Ga、68Ga、86Y、94mTc和89Zr。
在以上方面的另外一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的螯合剂缀合：DOTA、DTPA、NOTA、NODAGA、MeCOSAR、TETA、TRAP、TE2A、CBTE2A。
在以上方面的另外一个实施方案中，细胞毒性剂和抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的螯合剂缀合：DOTA、DTPA、NOTA、NODAGA、MeCOSAR、TETA、TRAP、TE2A、CBTE2A。
在以上方面的另外一个实施方案中，受试对象是哺乳动物受试对象或人受试对象。
在第十一方面，本发明提供一种分离的抗体群体，包含：
第一抗体和/或其抗原结合片段，缀合于对前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂，其中所述第一抗体包含：
(a)重链可变区，包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:3的位置50-54所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:3的位置50-54所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:3的位置69-85所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:3的位置69-85所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:3的位置118-126所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的位置118-126所定义的氨基酸序列组成；和
(b)轻链可变区，包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:4的位置44-54所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:4的位置44-54所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:4的位置70-76所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:4的位置70-76所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:4的位置109-117所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4的位置109-117所定义的氨基酸序列组成；
并且其中所述抗体群体不含包含这样的轻链可变区的第二抗体，所述轻链可变区包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:11的位置48-58所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置48-58所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:11的位置74-80所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置74-80所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:11的位置113-121所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置113-121所定义的氨基酸序列组成。
在第十一方面的一个实施方案中，第一抗体和/或其抗原结合片段是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多聚体抗体和/或合成抗体中的任何一种或多种。
在第十一方面的另一个实施方案中，抗原结合片段是单链可变片段(scFv)、可变结构域(Fv)片段、片段抗原结合(Fab)片段、F(ab)2片段、肽、或含有表位结合区的蛋白水解片段中的任何一种或多种。
在第十一方面的另外一个实施方案中，第一抗体包含SEQ ID NO:3的位置20-461所定义的重链序列和SEQ ID NO:4的位置21-234所定义的轻链序列或由SEQ ID NO:3的位置20-461所定义的重链序列和SEQ ID NO:4的位置21-234所定义的轻链序列组成。
在第十一方面的另外一个实施方案中，第一抗体和/或其抗原结合片段是嵌合的。
在第十一方面的另外一个实施方案中，第一抗体和/或其抗原结合片段是嵌合抗体，包含：
(a)重链恒定区，包含如SEQ ID NO:7的残基138-467中所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:7的残基138-467中所定义的氨基酸序列组成；和
(b)轻链恒定区，包含如SEQ ID NO:8的残基128-234中所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:8的残基128-234中所定义的氨基酸序列组成。
在第十一方面的另一个实施方案中，抗原结合片段是包含如SEQ ID NO:9中所定义的序列的单链可变片段(scFv)。
在第十一方面的另外一个实施方案中，细胞毒性剂选自由以下组成的组：肾上腺皮质抑制剂、烷化剂、烷基磺酸盐、蒽环类药物、抗血管生成剂、抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、澳瑞他汀、卡奇霉素、喜树碱、COX-2抑制剂、酶抑制剂、表鬼臼毒素、乙烯亚胺衍生物、叶酸类似物、HDAC抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、激素拮抗剂、美登素、甲基肼衍生物、mTOR抑制剂、氮芥、亚硝基脲、铂配位络合物、促凋亡剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、放射性同位素、取代脲、紫杉烷、三氮烯、微管蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和长春花生物碱。
在第十一方面的另一个实施方案中，细胞毒性剂选自由以下组成的组：阿法替尼、阿普立定、阿那曲唑、蒽环类药物、AVL-101、AVL-291、阿西替尼、阿扎立平、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、camptothecans、卡铂、卡奇霉素、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、COX-2抑制剂、克唑替尼、氰基吗啉代阿霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、达沙替尼、柔红霉素、dinaciclib、3’,5’-0-二油酰基-FudR(FUdR-d0)、DM1、DM3、DM4、多西他赛、阿霉素、葡萄糖醛酸阿霉素、倍癌霉素、内皮抑素、恩替诺特、表鬼臼毒素、葡萄糖醛酸表柔比星、埃罗替尼、雌莫司汀、雌激素受体结合剂、葡萄糖醛酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷(VP16)、依西美坦、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、芬戈莫德、夫拉平度、氟尿苷(FUdR)、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟他胺、fostamatinib、ganetespib、GDC-0834、吉非替尼、吉西他滨、GS-1101、10-羟基喜树碱、羟基脲、依鲁替尼、去甲氧基柔红霉素、艾代拉里斯、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康(CPT-11)、拉帕替尼、来那度胺、醛氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、林可霉素、2-PDox前药(pro-2-PDox)、甲基苄肼、PSI-341、2-吡咯啉代阿霉素(2-PDox)、雷洛昔芬、司莫司汀、SN-38、索拉非尼、链佐星、SU1 1248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康、反式铂、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼、长春花碱、长春花生物碱、长春新碱、长春瑞滨和ZD1839。
在第十一方面的另外一个实施方案中，细胞毒性剂是被设计成在摄取入所述前列腺癌细胞、膀胱癌细胞和/或胰腺癌细胞的内体或溶酶体中时被激活的前药。
在第十一方面的一个实施方案中，前药通过以下连接子缀合于所述抗体和/或其抗原结合片段：
在小于pH 7.2、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0、pH 4.5或pH 4的pH下容易裂解的酸敏感连接子；或
酶裂解型连接子，其中能够裂解所述连接子的酶存在于所述内体或溶酶体内。
在第十一方面的一个实施方案中，细胞毒性剂通过结合到缀合于所述抗体和/或其抗原结合片段的螯合剂上而连接于所述抗体和/或其抗原结合片段。
在第十一方面的另外一个实施方案中，细胞毒性剂和抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的螯合剂缀合：DOTA、DTPA、NOTA、NODAGA、MeCOSAR、TETA、TRAP、TE2A、CBTE2A。
在第十一方面的另外一个实施方案中，细胞毒性剂是选自由以下组成的组的放射性同位素：90Y、188Re、166Ho、165Dy、109Pd、111Ag、186Re、198Au、153Sm、64Cu、177Lu、131I、125I、67Cu、175Yb、166Dy、169Er、212Bi、213Bi、225Ac、212Pb、66Ga、67Ga、68Ga、86Y、94mTc和89Zr。
在第十一方面的另外一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的螯合剂缀合：DOTA、DTPA、NOTA、NODAGA、MeCOSAR、TETA、TRAP、TE2A和CBTE2A。
附图说明
现在将参考附图，仅通过举例来描述本发明的优选实施方案，其中：
图1显示在DU-145细胞上使用嵌合MIL-38抗体和对照的免疫荧光分析的图像。图1A-D显示染色细胞的组合明视场和DAPI图像。图1E-H显示MIL-38prep 33A(1E，阳性对照)、嵌合MIL-38(1F)、西妥昔单抗(1G，人IgG1k的阳性对照)和阴性对照(1H，无1°抗体)与DU-145细胞的结合。
图2显示嵌合MIL-38抗体的蛋白质印迹分析。图2A显示鼠MIL-38与DU-145MPEK提取物、C3MPEK提取物和NS0产生的重组GPC-1抗原的反应性。图2B显示嵌合MIL-38与DU-145MPEK提取物、C3MPEK提取物和NS0产生的重组GPC-1抗原的反应性。图2C显示在与图2B等同的条件下，鼠MIL-38与DU-145MPEK提取物、C3MPEK提取物和NS0产生的重组GPC-1抗原的反应性。
图3显示荧光标记的MIL-38和scFv MIL-38抗体与DU-145细胞的结合的流式细胞术。图3A显示阴性对照(单独细胞和阴性对照抗体)。图3B显示当细胞与未被标记的MIL-38抗体一起预先孵育时，鼠MIL-38与DU-145细胞的反应性以及流式细胞术信号的减少。图3C显示被标记的MIL-38和被标记的MIL-38scFv与DU-145细胞的结合对比。MIL-38scFv在略微低于鼠MIL-38的水平保持与DU-145细胞的结合。
图4显示MIL-38抗体与MDA-MB-231乳腺癌细胞、T-24膀胱癌细胞、PANC-1胰腺癌细胞和DU-145前列腺癌细胞的结合。图4A显示鼠MIL-38抗体与MDA-MB-231细胞的结合。MIL-38的结合显著高于同型或仅二级抗体对照，指示MDA-MB-231细胞对于MIL-38抗原GPC-1是阳性的。图4B显示MIL-38与MDA-MB-231、T-24或DU-145细胞的结合的叠加流式细胞术直方图。MDA-MB-231细胞显示最低结合，而对于DU-145细胞观察到最高结合。图4C显示MIL-38、抗-CD9和抗-CD81抗体与PANC-1细胞的结合的叠加流式细胞术直方图。
图5显示通过MDA-MB-231、T-24和DU-145细胞的MIL-38抗体内化。图5A显示结合于DU-145细胞30分钟后1F5鼠MIL-38亲代抗体的内化。图5B显示结合于DU-145细胞30分钟后嵌合MIL-38抗体的内化。图5C显示在暴露于MDA-MB-231细胞30分钟后，嵌合MIL-38抗体没有可检测到的抗体结合或内化。图5D显示结合于T-24细胞后立即的嵌合MIL-38抗体的内化；图5E显示在60分钟时间过程的15分钟之后，PANC-1细胞中的嵌合MIL-38抗体的局部化(绿色)。图5F显示在60分钟时间过程完成后，用Alexa-Fluor 488标记的抗人抗体在PANC-1细胞中的内化。
图6显示被CY5标记的1F5鼠MIL-38或被CY5标记的嵌合MIL-38对皮下DU-145异种移植物肿瘤的靶向作用。图6A显示1F5鼠MIL-38的靶向作用，而图6B显示嵌合MIL-38的靶向作用。肿瘤位于小鼠背部并且用箭头指示。在耳朵穿刺部位也有局部化(用菱形指示)。
图7显示在DU-145和MDA-MB-231乳腺癌细胞系中使用各种靶向抗体的细胞生长抑制分析。简言之，使细胞在嵌合MIL-38和用细胞毒性剂DM1、MMAE、MMAF和倍癌霉素预先标记的蛋白G的存在下生长3天，随后评估细胞活力。测定EC50并展示在对应图的右边。所用的抗体是嵌合MIL-38(图7A)、BLCA-38(含有AM3和AM4群体的双克隆群体，图7B)、AM3(衍生自具有极小GPC-1结合的BLCA-38群体的单克隆，图7C)、1F5MIL-38(衍生自具有高GPC-1结合的BLCA-38群体的AM4样单克隆，图7D)和爱必妥(一般名称西妥昔单抗，一种用作阳性对照的嵌合抗-EGFR单克隆，图7E)。图7F显示DU-145细胞中的蛋白G-倍癌霉素的滴定(上方的图)，和在DU-145细胞中使用最佳化的蛋白G-倍癌霉素浓度的细胞生长抑制分析。
图8显示来自使用稳定细胞池的中试批次生产的细胞生长和嵌合抗体表达特征。显示活细胞密度(图8A)、细胞活力(图8B)和抗体产量(图8C)，证实了使用适合于大规模GMP生产的方法的可缩放嵌合抗体表达。
图9显示MIL-38的DOTA缀合和使用177Lu的标记。图9A显示在HPLC上跑样的凝胶过滤标准标记物。图9B显示在HPLC上跑样的未缀合MIL-38。图9C显示在PD-10柱纯化后，在HPLC上跑样的缀合MIL-38。图9D显示在HPLC上跑样的被177Lu标记的MIL-38的放射性。图9E显示在HPLC上跑样的被标记MIL-38的对应A280曲线。
图10显示嵌合MIL-38、MIL-38DOTA和被模拟放射标记的MIL-38DOTA与DU-145细胞的结合的流式细胞术。获得基本等同的结合曲线，指示DOTA缀合并不引起MIL-38与DU-145细胞的结合的减少。类似地，已经经历模拟放射标记过程的MIL-38DOTA具有与未标记的缀合物相等的细胞结合，表明细胞结合活性得到保持。
图11显示用67Ga对DOTA缀合MIL-38的标记。图11A显示用67Ga标记的MIL-38的放射性的尺寸排阻色谱法HPLC色谱图。星号指示反应混合物中残留的游离67Ga。图11B显示被67Ga标记的MIL-38DOTA的稳定性研究。用67Ga标记的MIL-38的放射性的尺寸排阻色谱法HPLC色谱图和对应的UV曲线一起展示。移除67Ga-MIL-38制剂中的游离67Ga，然后将其在室温下保持两周，然后经历SEC HPLC色谱法。
图12显示流式细胞术中的嵌合MIL-38、使用三种不同的DOTA缀合物比率制备的MIL-38DOTA和模拟放射性标记的MIL-38DOTA与DU-145和T-24细胞的结合，以及直接抗原结合ELISA中的结合。图12A显示未被标记的嵌合MIL-38或已经使用5、10或20倍摩尔过量的DOTA缀合到DOTA上的嵌合MIL-38的结合。获得基本等同的结合曲线，指示DOTA缀合并不引起MIL-38与DU-145细胞的结合的减少。图12B显示各自已经经历模拟标记反应的chMIL-38DOTA(20倍过量)的三个独立批次与T-24细胞的流式细胞术结合。观察到基本一致的结合曲线，指示良好的批次间再现性。图12C显示chMIL-38DOTA(20倍过量)的三个独立流式反应物的与T-24细胞的流式细胞术结合，chMIL-38DOTA都是从已经经历模拟标记反应的一个批次制备而来的。观察到基本一致的结合曲线，指示良好的批次内再现性。图12D显示单独二级抗体(红色曲线)、chMIL-38DOTA(绿色曲线)、来自批次间再现性的一个样品(批次1，蓝色曲线)和来自批次内再现性的一个样品(Intra 1，橙色曲线)的T-24细胞结合的叠加流式细胞术图谱。观察到基本一致的结合曲线，指示与chMIL-38DOTA对照相比，模拟标记过程并不影响与细胞的结合。图12E显示直接结合ELISA中chMIL-38和已经使用5、10或20倍摩尔过量的DOTA而被缀合于DOTA的chMIL-38与重组GPC-1的结合。图12F显示chMIL-38DOTA、针对批次间比较而制备的模拟标记的chMIL-38DOTA的3个不同制剂和来自批次内制备的3个不同反应物与重组GPC-1的直接结合。
图13显示(A)在嵌合MIL-38抗体注射后，从具有DU-145异种移植物肿瘤的Balb/c裸小鼠的背部观察到的荧光图像；和(B)144小时后来自(A)的代表性小鼠的多模态动物旋转系统(MARS)图像。
图14显示当施用于正常大鼠时，177Lu标记的MIL-38DOTA的生物分布的时间过程。图表显示血、胃、小肠、大肠、睾丸、肌肉、骨头、甲状腺、心脏、肺、肝、肾和膀胱的每克注射剂量％。显示施用后6小时、1天、2天、1周和2周的时间点。
图15显示当施用于正常大鼠时，177Lu标记的MIL-38DOTA的生物分布的时间过程。图表显示血、肝和肾的每克注射剂量％。显示施用后6小时、1天、2天、1周和2周的时间点。
图16是在具有异种移植物肿瘤的Balb/c裸小鼠中注射后48小时时获得的64Cu标记的MIL-38NOTA的PET-CT图像。箭头指示DU-145异种移植物肿瘤的部位。
图17是表示具有异种移植物肿瘤的Balb/c裸小鼠中被DOTA标记和被NOTA标记的MIL-38抗体的离体生物分布的图表。
图18显示(A)从背部观察到的山羊抗-GPC-1抗体的荧光图像；(B)在注射后120小时对于山羊抗-GPC-1观察到的器官的离体荧光图像。肿瘤用红色箭头指示；和(C)120小时下的MARS图像。
图19显示使用不同的MIL-38抗体制剂作为捕获抗体进行的比较夹心ELISA。图19A显示使用AM3和AM4作为捕获抗体的比较夹心ELISA。图19B显示使用混合群体(34A)或克隆群体(AM4 1F5)作为捕获抗体的比较夹心ELISA。
定义
如本申请中所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一”和“所述”包括复数个引用对象。举例来说，措辞“一抗体”也包括多个抗体。
如本文所用，术语“包含”意思是“包括”。措辞“包含(comprising)”的变体，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，具有相应变化的意思。因此，举例来说，“包含”抗体A的样品可以只由抗体A组成或者可以包括一种或多种其它组分(例如抗体B)。
如本文所用，术语“多个”意思是超过一个。在某些特定方面或实施方案中，多个可以意味2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或更多个，以及其中可推导出的任何整数，及其中可推导出的任何范围。
如本文所用，术语“抗体”包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgM和IgY、全抗体(包括单链全抗体)，及其抗原结合片段。抗原结合抗体片段包括但不限于Fv、Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗体可以来自任何动物来源或适当的生产宿主。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以只包含可变区，或者可以包含可变区与以下全部或部分的组合：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。还包括可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。抗体可以是特异性结合生物分子的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、人源化抗体以及人单克隆和多克隆抗体。抗体可以是双特异性抗体、avibody、双价抗体(diabody)、三价抗体(tribody)、四价抗体(tetrabody)、纳米抗体、单结构域抗体、VHH结构域、人抗体、完全人源化抗体、部分人源化抗体、anticalin、adnectin或亲合体(affibody)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指识别单一抗原表位并且从基本上同类的抗体的群体获得的抗体，所述基本上同类的抗体特异性地结合于相同抗原表位并且除了可能少量存在的天然产生的突变的潜在例外是相同的。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指含有来自人抗体以及非人抗体(例如鼠抗体)的序列的抗体的形式。举例来说，人源化抗体可以包含基本上所有的至少一个并且典型地两个可变结构域，其中所有/基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有/基本上所有的FR区是来自人免疫球蛋白序列。人源化抗体也可以任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，其可以典型地是人免疫球蛋白。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指展现期望生物活性的抗体，其中轻链和/或重链的一部分与衍生自指定/特定物种的抗体中的对应序列相同或同源，而剩下的链与衍生自另一种不同物种的抗体中的对应序列相同或同源。举例来说，嵌合抗体可以包含衍生自第一物种的可变区并且包含衍生自第二物种的恒定区。嵌合抗体可以例如通过从属于不同物种的免疫球蛋白基因区段进行基因工程来构建。
如本文所用，术语“杂交瘤”是指通过融合永生细胞(例如多发性骨髓瘤)与抗体生产细胞(例如B淋巴细胞)而产生的细胞，其能够产生单一结合特异性的单克隆抗体。
如本文所用，与抗体、抗体变异体、抗体衍生物、抗原结合片段等有关的术语“结合特异性”和“特异性结合”是指其相比其它非靶分子优先结合于指定靶分子的能力。举例来说，如果抗体、抗体变异体、抗体衍生物或抗原结合片段(“分子A”)能够“特异性结合于”或“特异性地结合于”指定靶分子(“分子B”)，那么分子A具有辨别分子B与任何其它数目的潜在替代性结合配偶体的能力。因此，当暴露于作为潜在结合配偶体的多个不同但可同样接近的分子时，分子A将选择性地结合于分子B，并且其它替代性潜在结合配偶体将保持基本上不被分子A结合。一般来说，分子A相比其它潜在结合配偶体通常将至少10倍、优选地50倍、更优选地100倍并且最优选地大于100倍地优先结合于分子B。分子A能够以微弱但可检测到的水平结合于不是分子B的分子。这通常被称为背景结合并且容易和分子B特异性结合分辨，例如通过使用适当对照。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”涵盖例如通过抑制细胞功能和(包括但不限于)直接和/或间接引起细胞死亡而对细胞有毒性的任何化合物。
如本文所用，在本文所述的“细胞毒性剂”和本文所述的抗体、抗体衍生物或抗体的抗原结合片段的上下文中的术语“缀合”、“缀合的”和“缀合作用”将被理解为意指细胞毒性剂连接到抗体、抗体衍生物或抗原结合片段上。连接可以在细胞毒性剂和抗体之间直接发生，或者细胞毒性剂和抗体之间的连接可以通过一个或多个介入分子(例如蛋白G)间接发生。
如本文所用，术语“受试对象”包括具有经济、社会或研究重要性的任何动物，包括牛、马、羊、灵长类、鸟和啮齿类物种。因此，“受试对象”可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。
本文中对现有技术文档的任何描述或本文中衍生自或基于那些文档的声明都不承认这些文档或衍生声明是相关技术的普通常识的一部分。除非另外说明，否则为了描述目的，本文中提到的所有文档都以全文引用的方式并入本文中。
具体实施方式
对于用于治疗前列腺、膀胱和/或胰腺癌的更有效的方法和药剂的需求持续存在。抗体是癌症的适用诊断剂和治疗剂，从而已经变成一项用于诊断和治疗具有血液恶性肿瘤和实体肿瘤的患者的成功并重要的工具。靶向肿瘤特异性抗原的新颖相关抗体的确认提供了一种改善癌症患者的诊断和/或治疗结果的潜在方式。可以增强这些结果的另一种方式是通过改进现有的基于抗体的诊断剂和/或治疗剂。
诸位发明人已经意外地确认了现有技术中提到和使用的BLCA-38抗体不是所指示的分离的单克隆抗体，而是采取混合群体形式的两种不同的单克隆抗体的组合。诸位发明人已经确定了用于产生BLCA-38抗体的杂交瘤(以保藏号HB11785保藏在美国典型培养物保藏中心(American Tissue Type Culture Collection)的一种代表性样品)是杂交瘤细胞的混合群体，其产生至少两种分离的抗体物种。这些抗体物种中只有一种可以强烈结合到前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞上存在的相关靶抗原上，而另一种物种则不能。
由于意外地确定了现有技术中提到的BLCA-38代表着混合杂交瘤/抗体群体，因此这已经促进了产生单克隆杂交瘤，其能够生产对前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞上的靶抗原具有结合特异性的单克隆抗体的单一群体。这避免了无效治疗抗体的不必要的生产和应用。另外众所周知的是，治疗抗体的生产成本很高，尤其当需要生产后修饰(例如ADC生产或用于放射免疫疗法的螯合剂的缀合)时。避免自不结合目标前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞抗原的抗体制备ADC或螯合单克隆抗体是明显有利的。BLCA-38混合群体中的不结合于前列腺、膀胱和/或胰腺癌抗原的抗体物种的实际靶是未知的，这引起因为与非靶细胞的潜在结合而产生不当副作用的风险。
诸位发明人还意外地发现，与BLCA-38抗体群体在结合于癌细胞时不被内化的现有技术教导相反，诸位发明人已经证实了单克隆抗体物种的抗体在结合于前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞上存在的相关靶抗原时实际上被内化。
因此，本发明的某些实施方案涉及提供衍生自克隆杂交瘤细胞的单克隆抗体群体，所述抗体群体的每个成员都能够特异性地结合于前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞上存在的抗原。本发明还提供保持相同结合特异性的这些抗体的抗原结合片段以及抗体的衍生物和变异体。抗体和片段各自缀合于对受试对象中的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
鉴于提供能够特异性地靶向前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞的抗体缀合物，本发明的其它实施方案涉及用于治疗罹患前列腺、膀胱和/或胰腺癌的受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌的方法，和用于杀死前列腺、膀胱和/或胰腺细胞和肿瘤的方法。
本发明的其它方面涉及包含缀合抗体和/或片段的药物和医药制剂，及其制备方法。
抗体和抗原结合片段
本发明提供抗体、所述抗体的衍生物及其抗原结合片段，其各自缀合于至少一种细胞毒性剂。
在替代实施方案中，提供没有缀合于至少一种细胞毒性剂的抗体、所述抗体的衍生物及其抗原结合片段(即‘裸露的’)。
抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段能够特异性地结合于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的抗原表位。GPC-1蛋白可以是人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白(例如由以下任一种所示的序列定义：NCBI参考序列登录号NP_002072.2、GenBank登录号AAH51279、GenBank登录号AAA98132.1、GenBank登录号EAW71184.1或UniProtKB/Swiss-Prot登录号P35052.2)。在一些实施方案中，GPC-1蛋白可能不包括信号肽和/或前肽。另外或替代性地，单克隆抗体、衍生物和抗原结合片段能够特异性地结合于GPC-1变异体(例如GPC-1同种型、剪接变异体或同种异型(allotype))中存在的抗原表位。
以非限制性实例的方式，抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含重链和/或轻链、其组合或其组分。
合适的抗-GPC1抗体的非限制性实例包括以下表1中列出的那些。
重链或其组分可以包含包括一个、两个或三个互补决定区(CDR1、CDR2和/或CDR3)的重链可变区，在所属领域中也被称为重链高变(HV)区。重链CDR1可以包含如SEQ ID NO:3的残基50-54所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基50-54所定义的氨基酸序列组成。重链CDR2可以包含如SEQ ID NO:3的残基69-85所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基69-85所定义的氨基酸序列组成。重链CDR3可以包含如SEQ ID NO:3的残基118-126所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基118-126所定义的氨基酸序列组成。
另外或替代性地，重链可变区可以包含一个、两个、三个或四个构架区(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。重链FR1可以包含如SEQ ID NO:3的残基20-49所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基20-49所定义的氨基酸序列组成。重链FR2可以包含如SEQ ID NO:3的残基55-68所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基55-68所定义的氨基酸序列组成。重链FR3可以包含如SEQ ID NO:3的残基86-117所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基86-117所定义的氨基酸序列组成。重链FR4可以包含如SEQ ID NO:3的残基127-137所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基127-137所定义的氨基酸序列组成。
另外或替代性地，重链可变区可以包含前导序列。重链前导序列可以包含如SEQID NO:3的残基1-19所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基1-19所定义的氨基酸序列组成。所属领域技术人员将认识到，前导序列是信号序列，其帮助新合成的重链转运到内质网中，并且一般不存在于单克隆抗体的最终装配形式的重链中。
另外或替代性地，轻链或其组分可以包含包括一个、两个或三个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区，在所属领域中也被称为轻链高变(HV)区。轻链CDR1可以包含如SEQ ID NO:4的残基44-54所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基44-54所定义的氨基酸序列组成。轻链CDR2可以包含如SEQ ID NO:4的残基70-76所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基70-76所定义的氨基酸序列组成。轻链CDR3可以包含如SEQ IDNO:4的残基109-117所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基109-117所定义的氨基酸序列组成。
另外或替代性地，轻链可变区可以包含一个、两个、三个或四个构架区(FR1、FR2、FR3、FR4)。轻链FR1可以包含如SEQ ID NO:4的残基21-43所定义的氨基酸序列或由如SEQID NO:4的残基21-43所定义的氨基酸序列组成。轻链FR2可以包含如SEQ ID NO:4的残基55-69所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基55-69所定义的氨基酸序列组成。轻链FR3可以包含如SEQ ID NO:4的残基77-108所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基77-108所定义的氨基酸序列组成。轻链FR4可以包含如SEQ ID NO:4的残基118-127所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基118-127所定义的氨基酸序列组成。
另外或替代性地，轻链可变区可以包含前导序列。轻链前导序列可以包含如SEQID NO:4的残基1-20所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基1-20所定义的氨基酸序列组成。所属领域技术人员将认识到，前导序列是信号序列，其帮助新合成的轻链转运到内质网中，并且一般不存在于单克隆抗体的最终装配形式的轻链中。
另外或替代性地，重链可以包含一个、两个或三个重链恒定区。重链恒定区可以包含如SEQ ID NO:3的残基138-461所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基138-461所定义的氨基酸序列组成。
另外或替代性地，轻链可以包含轻链恒定区。轻链恒定区可以包含如SEQ ID NO:4的残基128-234所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基128-234所定义的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，根据本发明的单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:3的残基20-137所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基20-137所定义的氨基酸序列组成。单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含一个或两个重链可变区。
在一些实施方案中，根据本发明的单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4的残基21-127所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基21-127所定义的氨基酸序列组成。单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含一个或两个轻链可变区。
在一些实施方案中，根据本发明的单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:3的残基20-137或由SEQID NO:3的残基20-137组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4的残基21-127或由SEQ IDNO:4的残基21-127组成。单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含两个重链可变区和两个轻链可变区的组合。
在一些实施方案中，根据本发明的单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含重链，所述重链包含如SEQ ID NO:3的残基20-461所定义的氨基酸序列或由如SEQID NO:3的残基20-461所定义的氨基酸序列组成。单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含一个或两个重链。
在一些实施方案中，根据本发明的单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含轻链，所述轻链包含如SEQ ID NO:4的残基21-234所定义的氨基酸序列或由如SEQID NO:4的残基21-234所定义的氨基酸序列组成。单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含一个或两个轻链。
在一些实施方案中，根据本发明的单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO:3的残基20-461所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:3的残基20-461所定义的氨基酸序列组成，所述轻链包含如SEQ ID NO:4的残基21-234所定义的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:4的残基21-234所定义的氨基酸序列组成。单克隆抗体、变异体、衍生物和抗原结合片段可以包含两个重链和两个轻链的组合或由两个重链和两个轻链的组合组成。
根据本发明的单克隆抗体、所述抗体的变异体和衍生物以及其抗原结合片段不限于任何特定同型，并且因此可以是IgA(IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或IgM同型。在一些实施方案中，它们是IgG1同型。
在本发明的范围内包括由按照布达佩斯条约的条款在2014年8月22日以保藏号CBA20140026提交于214Hawkesbury Road,Westmead NSW 2145,Australia的澳大利亚细胞银行的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。杂交瘤是产生对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位具有特异性结合的单一抗体物种的克隆群体。
在本发明的范围内包括本文所述的抗体的“片段”。一般来说，片段是具有下述意义上的“抗原结合片段”：在其能够特异性地结合与其所来源或所基于的亲代抗体所结合的相同的抗原/表位(例如GPC-1)。典型地，抗原结合片段保留亲代抗体的抗原/表位结合能力的至少10％，或亲代抗体的抗原/表位结合能力的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更高)。还可以预期的是，本文所述的抗体的抗原结合片段可以包含不会实质上改变其抗原/表位结合特异性/能力的保守氨基酸取代(例如其抗原/表位结合特异性/能力的至少70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更高)可以被保留)。
抗原结合片段的非限制性实例包括全长抗体、其肽和衍生物的部分，包括例如Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab′)2、F(ab)3、Fv、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段、dAB片段Fse、VH、VL、VhH和V-NAR结构域、补位(paratope)、CDR区、单链抗体分子(例如sc-Fv)、微抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体、κ抗体(kappa bodies)、线性抗体、多特异性抗体、从抗体片段形成的结构域抗体、从抗体片段形成的多特异性抗体片段，和能够特异性地结合于相关抗原/表位(例如GPC-1)的抗体的任何部分或肽序列。
在本发明的范围内还包括本文所述的抗体的“衍生物”。本发明的抗体的“衍生物”是指本文所述的这样的抗体，其经过修饰以掺入额外组分或导致现有组分被改变，但是仍然能够特异性地结合到与衍生其的亲代抗体特异性结合的相同的抗原/表位(例如GPC-1)上。典型地，本文所设想的抗体衍生物保留亲代抗体的抗原/表位结合能力的至少10％，或亲代抗体的抗原/表位结合能力的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更高)。
适合形成抗体衍生物的修饰的非限制性实例包括酰胺化、糖基化、磷酸化、聚乙二醇化、连接到细胞配体或其它蛋白质上、通过已知的保护/封闭基团的衍生作用、乙酰化等。另外或替代性地，衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。修饰还可以包括与螯合剂如DOTA、DTPA、NOTA、NODAGA、MeCOSAR、TETA、TRAP、TE2A和CBTE2A缀合。
抗体衍生物可以包括被标记的抗体，例如用放射性碘、铟、硫、碳、氚等标记的单克隆抗体；与抗生物素蛋白或生物素缀合的单克隆抗体，与酶(例如辣根、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡糖淀粉酶、乙酰胆碱酯酶、羧酸脱水酶、苹果酸脱氢酶、溶菌酶或过氧化物酶)缀合的单克隆抗体，以及与化学发光剂(例如吖啶酯)、生物发光剂(例如荧光素酶)或荧光剂(例如藻胆蛋白)缀合的单克隆抗体。抗体衍生物的其它实例包括双功能抗体，例如通过将识别两种不同抗原基团的两种独立抗体的部分(例如通过重组技术或交联)相组合而产生的双特异性抗体。
抗体衍生物可以由本文所述的抗体的共价修饰形成，例如通过将抗体的被靶向氨基酸残基与能够和选定侧链或末端残基反应的药剂反应。举例来说，利用双功能药剂的衍生作用是用于将抗体或其片段交联到大分子载体例如非水溶性支持基质上的适用方式。本文所设想的抗体衍生物可以具有连接到基础抗体或其片段上的能够增加其体内半衰期(例如延长从血流中清除之前的时间长度)的药剂。此类技术的非限制性实例包括添加PEG部分。
在某些实施方案中，抗体衍生物可以是包含一个或多个单体的多聚体，例如二聚体，其中每个单体都包含(i)本文所述的抗-GPC-1抗体的抗原结合区，或自其衍生的多肽区(例如通过一个或多个氨基酸的保守取代)，和(ii)多聚化(例如二聚)多肽区，使得抗体衍生物形成特异性地结合于GPC-1的多聚体(例如同型二聚体)。举例来说，本文所述的抗-GPC-1抗体的抗原结合区或自其衍生的多肽区可以和异源蛋白以重组方式或化学方式融合，其中异源蛋白包含二聚或多聚结构域。衍生物可以经历允许形成同型二聚体或异型二聚体的条件。异型二聚体可以包含相同的二聚结构域但不同的抗-GPC-1抗原结合区，相同的抗-GPC-1抗原结合区但不同的二聚结构域，或不同的抗-GPC-1抗原结合区和不同的二聚结构域。合适的二聚结构域包括来源于转录因子(例如碱性区亮氨酸拉链)、碱性区螺旋-环-螺旋蛋白和免疫球蛋白恒定区(例如重链恒定区或其结构域，例如CH1结构域、CH2结构域或CH3结构域)的那些。
在其它实施方案中，抗体衍生物可以是缀合于第二抗体的本文所述的抗-GPC1抗体(“抗体异型缀合物”)。
本文还设想了本文所述的抗体的人源化衍生物。本文所设想的“人源化”抗体是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的人/非人嵌合抗体。举例来说，人源化抗体可以是人免疫球蛋白(受体蛋白)，其中来自受体的CDR区的残基被来自非人物种(供体抗体)(例如对GPC-1抗原/表位具有期望特异性和亲和力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的CDR区的残基取代。人免疫球蛋白的构架区(FR)残基也可以(任选地)被对应的非人残基取代，并且在一些情况下，人源化抗体可以包含受体抗体中或供体抗体中不存在的残基以增强抗体性能。
本文还设想了“嵌合”抗体衍生物，其中重链和/或轻链的一部分和衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的本文所述的抗体的对应序列是相同的或同源的，而重链和/或轻链的剩余部分和衍生自另一不同物种或属于另一不同抗体类别或子类的抗体的对应序列是相同的或同源的。举例来说，本文设想的嵌合抗体可以包含衍生自本文所述的抗-GPC-1单克隆抗体的可变区，和衍生自第二物种的恒定区。嵌合抗体可以例如通过属于不同物种的免疫球蛋白基因区段的基因工程来产生。嵌合抗体及其抗原结合片段可以和本文所述的细胞毒性剂缀合或者可以不和本文所述的细胞毒性剂缀合。
仅以非限制性实例的方式，根据本发明的嵌合抗体可以包含嵌合小鼠人CH1-CH3链序列小鼠VH-人CH1-CH3链(重链)和/或小鼠人κ链序列小鼠VK-人CK序列MIL-38小鼠VK(轻链)。嵌合抗体的重链可以包含如SEQ ID NO:7的残基20-467所示的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:7的残基20-467所示的氨基酸序列组成。嵌合抗体的轻链可以包含如SEQ IDNO:8的残基21-234所示的氨基酸序列或由如SEQ ID NO:8的残基21-234所示的氨基酸序列组成。重链可变区可以包含：互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:7的位置50-54所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:7的位置50-54所定义的氨基酸序列组成；和/或互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:7的位置69-85所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:7的位置69-85所定义的氨基酸序列组成；和/或互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:7的位置118-126所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:7的位置118-126所定义的氨基酸序列组成。另外或替代性地，轻链可变区可以包含：互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:8的位置44-54所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的位置44-54所定义的氨基酸序列组成；和/或互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:8的位置70-76所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的位置70-76所定义的氨基酸序列组成；和/或互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:8的位置109-117所定义的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的位置109-117所定义的氨基酸序列组成。根据本发明的嵌合抗体可以是所述嵌合抗体的“变异体”。
在本发明的范围内包括本文所述的抗体的“变异体”。“变异体”抗体是指由于亲代抗体序列中的一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代，氨基酸序列不同于“亲代”抗-GPC-1抗体氨基酸序列的抗体。举例来说，变异体抗体可以在亲代抗体的一个或多个CDR和/或构架区中包含一个或多个氨基酸取代(例如在亲代抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR和/或构架区中的1到10个、2到5个、或者1、2、3、4或5个取代)。抗体变异体可以包含和亲代抗体的对应可变结构域具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸序列同源性(即序列同一性)的重链可变结构域序列和/或轻链可变结构域序列氨基酸序列。
两个序列之间的序列同源性或同一性在本文中被定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中的和亲代抗体残基相同的氨基酸残基的百分率。如果将会彼此比较的两个序列在长度上不同，那么序列同一性涉及和较长序列的氨基酸残基相同的较短序列的氨基酸残基的百分率。序列同一性可以常规地通过使用计算机程序例如Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包(Wisconsin SequenceAnalysis Package),用于Unix的第8版,Genetics Computer Group,University ResearchPark,575Science Drive Madison,Wis.53711)和/或程序“fasta20u66”(第2.0u66版,1998年9月，由William R.Pearson和弗吉尼亚大学发布；也参见W.R.Pearson(1990),酶学方法(Methods in Enzymology)183,63-98)来确定。
在一些实施方案中，本文所述的变异体抗体可以通过可变抗体的序列中的保守氨基酸变化而和亲代抗体不同。“保守变化”是指这样一种改变，与亲代抗体相比，该改变基本上是抗原中性或构象中性的，从而使变异体抗体的三级结构产生最小变化或者使变异体抗体的抗原决定基产生最小变化，并且不会导致衍生物不能结合于与亲代抗体相同的在GPC-1中的表位。保守氨基酸变化的非限制性实例包括疏水性氨基酸的取代和生理化学上类似的氨基酸的取代。所属领域技术人员可以常规地并且毫无困难地评估是否可以在保持构象中性和抗原中性的同时进行指定氨基酸取代(参见例如Berzofsky,(1985)科学(Science)229:932-940；Bowie等人(1990)科学(Science)247:1306-1310)。蛋白构象的改变可以使用众所周知的分析实现，所述分析包括但不限于微量补体结合(microcomplement fixation)方法(参见Wasserman等人(1961)免疫学杂志(J.Immunol.)87:290-295；Levine等人(1967)酶学方法(Meth.Enzymol.)11:928-936)和使用构象依赖性单克隆抗体的结合研究(参见Lewis等人(1983)生物化学(Biochem.)22:948-954)。保守氨基酸变化可以在亲代抗体的一个或多个CDR和/或构架区中发生(例如在亲代抗体的一个或多个CDR和/或构架区中的1到10个、2到5个、或者1、2、3、4或5个保守取代)。
一般来说，本文中所设想的人源化抗体、嵌合抗体、衍生物、片段和变异体抗体仍然能够特异性地结合于与亲代抗体相同的抗原/表位(例如GPC-1)，其中所述人源化抗体、嵌合抗体、衍生物、片段和变异体抗体衍生自所述亲代抗体或含有所述亲代抗体的组分。典型地，其可以保留亲代抗体的抗原/表位结合能力的至少10％，或亲代抗体的抗原/表位结合能力的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更高)。举例来说，其与亲代抗体相比可以具有更强的结合亲和力和/或结合特异性。
抗体片段、衍生物或变异体特异性地结合于由亲代抗体靶向的抗原/表位(即GPC-1抗原/表位)的能力可以使用所属领域中已知的方法测试，所述方法包括例如使用例如蛋白质印迹法、放射免疫分析、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫沉淀分析、“夹心”免疫分析、免疫扩散分析、沉淀素反应、蛋白A免疫分析、荧光免疫分析、凝胶扩散沉淀素反应、补体结合分析、免疫放射测定法、凝集分析等技术的竞争性和非竞争性分析系统(参见例如Ausubel等人编,分子生物学中的简短方案(Short Protocols in Molecular Biology)(John Wiley&Sons,Inc.,New York,第4版1999)；Harlow&Lane,使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999))。
本发明的范围内特别包括本文所述的任何抗体或其抗原结合片段的变异体，所述任何抗体或其抗原结合片段包括但不限于由本文中的特异性序列定义的抗体(包括嵌合抗体)和抗原结合片段，和由本文所述的杂交瘤产生的抗体，所述杂交瘤包括按照布达佩斯条约的条款在2014年8月22日以保藏号CBA20140026提交于214Hawkesbury Road,WestmeadNSW 2145,Australia的澳大利亚细胞银行的杂交瘤。
细胞毒性剂
根据本发明的抗体及其抗体结合片段可以缀合于至少一种细胞毒性剂。细胞毒性剂可以是例如通过抑制细胞功能和(包括但不限于)直接和/或间接引起细胞死亡而对细胞(例如前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞)有毒性的任何化合物。
细胞毒性剂可以引起对前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞的直接毒性，或者可以诱导细胞凋亡。或者，在放射性标记物的情况下，放射可以引起DNA损伤，从而导致细胞生长停滞、细胞凋亡诱导或细胞死亡。
增加的前列腺、膀胱和/或胰腺癌死亡可能是因为来自已死亡或正在死亡的前列腺、膀胱和/或胰腺癌细胞的蛋白质的免疫识别，从而导致“免疫”效果。
合适的细胞毒性剂的非限制性实例包括：阿法替尼、阿普立定、阿那曲唑、蒽环类药物、AVL-101、AVL-291、阿西替尼、阿扎立平、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、camptothecans、卡铂、卡奇霉素、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、COX-2抑制剂、克唑替尼、氰基吗啉代阿霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、达沙替尼、柔红霉素、dinaciclib、3’,5’-0-二油酰基-FudR(FUdR-d0)、DM1、DM3、DM4、多西他赛、阿霉素、葡萄糖醛酸阿霉素、倍癌霉素、内皮抑素、恩替诺特、表鬼臼毒素、葡萄糖醛酸表柔比星、埃罗替尼、雌莫司汀、雌激素受体结合剂、葡萄糖醛酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷(VP16)、依西美坦、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、芬戈莫德、夫拉平度、氟尿苷(FUdR)、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟他胺、fostamatinib、ganetespib、GDC-0834、吉非替尼、吉西他滨、GS-1101、10-羟基喜树碱、羟基脲、依鲁替尼、去甲氧基柔红霉素、艾代拉里斯、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康(CPT-11)、拉帕替尼、来那度胺、醛氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、林可霉素、2-PDox前药(pro-2-PDox)、甲基苄肼、PSI-341、2-吡咯啉代阿霉素(2-PDox)、雷洛昔芬、司莫司汀、SN-38、索拉非尼、链佐星、SU1 1248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康、反式铂、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼、长春花碱、长春花生物碱、长春新碱、长春瑞滨和ZD 1839。
另外或替代性地，细胞毒性剂可以是放射性同位素。合适的放射性同位素的非限制性实例包括：90Y、188Re、166Ho、165Dy、109Pd、111Ag、186Re、198Au、153Sm、64Cu、177Lu、131I、125I、67Cu、175Yb、166Dy、169Er、212Bi、213Bi、225Ac、212Pb、66Ga、67Ga、68Ga、86Y、94mTc和89Zr。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段直接缀合于一种或多种细胞毒性剂。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段间接缀合于一种或多种细胞毒性剂(例如通过选自由以下组成的组的螯合剂：DOTA、DTPA、NOTA、NODAGA、MeCOSAR、TETA、TRAP、TE2A、CBTE2A)。
缀合抗体生产
用于制备单克隆抗体、其衍生物和变异体及其抗原结合片段的工艺是容易获得的并且能够由所属领域技术人员毫不困难地执行。
除了上文在名为“杂交瘤”的章节中描述的Kohler等人(1975)的杂交瘤方法以外，可以利用的另一种非限制性工艺是重组DNA技术(参见例如美国专利号4816567)。举例来说，单克隆抗体、其衍生物和变异体及其抗原结合片段可以在任何广为人知的表达系统中重组地生产，所述表达系统包括但不限杆状病毒、酵母(例如毕赤酵母属、酿酒酵母属)、大肠杆菌、哺乳动物细胞、植物或转基因动物(参见Breitling和Dubel,1999,重组抗体(Recombinant Antibodies),John Wiley&Sons,Inc.,NY,第119-132页)。
在一些实施方案中，编码根据本发明的单克隆抗体、其衍生物和变异体及其抗原结合片段的核酸序列可以用在基于重组DNA技术的生产工艺中。非限制性实例包括如SEQID NO:1中所定义的重链多聚核苷酸序列或其变异体或片段，和/或如SEQ ID NO:2中所定义的轻链多聚核苷酸序列或其变异体或片段。
“变异体”多聚核苷酸在本文中是指在序列上不同于亲代或参考多聚核苷酸的多聚核苷酸。多聚核苷酸序列分歧可以由一个或多个核苷酸的突变变化如缺失、取代或添加而引起。这些变化中的每一个都可以在指定序列中一次或多次地单独发生或者组合发生。“变异体”多聚核苷酸是指与亲代或参考多聚核苷酸具有基本上类似的序列的多聚核苷酸。一般来说，如果两个序列具有相同的核苷酸的规定百分率(序列“同源性”或序列“同一性”的百分率)，那么这两个序列是“基本上类似的”。两个多聚核苷酸序列之间的序列同源性或同一性在本文中被定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性之后，候选(“变异体”)序列中的和亲代/参考多聚核苷酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分率。如果将会彼此比较的两个序列在长度上不同，那么序列同一性涉及和较长序列的核苷酸相同的较短序列的核苷酸的百分率。序列同一性可以常规地通过使用计算机程序例如Bestfit程序(威斯康星序列分析程序包(Wisconsin Sequence Analysis Package),用于Unix的第8版,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science DriveMadison,Wis.53711)和/或程序“fasta20u66”(第2.0u66版,1998年9月，由WilliamR.Pearson和弗吉尼亚大学发布；也参见W.R.Pearson(1990),酶学方法(Methods inEnzymology)183,63-98)来确定。变异体多聚核苷酸与参考/亲代多聚核苷酸之间的序列同源性/同一性的程度可以例如是至少75％、80％、83％85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％。
多聚核苷酸“片段”是编码大型亲代/参考多聚核苷酸的组分或作为大型亲代/参考多聚核苷酸的组分的多聚核苷酸分子。一般来说，片段将编码本发明的抗体的片段，所述片段能够特异性地结合于GPC-1。
根据本发明生产的单克隆抗体、其衍生物和变异体及其抗原结合片段可以使用适当方法从各种来源分离，所述方法包括但不限于免疫球蛋白结合分子(例如蛋白A、L、G或H)、可操作地连接于抗体或抗体片段的标签(例如His-标签、c-myc标签)、亲和色谱法等。
本文所述的单克隆抗体、其衍生物和变异体及其抗原结合片段可以由杂交瘤和/或包含单一杂交瘤群体或混合杂交瘤群体(包括例如上文在名为“杂交瘤”的章节中描述的那些)的细胞培养物生产，然后使用已知技术分离。在一些实施方案中，单克隆抗体可以通过培养按照布达佩斯条约的条款以保藏号CBA20140026保藏于澳大利亚细胞银行的单一(单克隆)物种的杂交瘤细胞来生产，并从培养物中分离。
用于制备和培育杂交瘤细胞系和分离所生产的抗体的工艺对于所属领域技术人员是众所周知的并且是标准程序。
根据本发明的抗体及其抗体结合片段可以缀合于至少一种细胞毒性剂。用于将细胞毒性剂缀合于抗体及其抗原结合片段的方法对于所属领域技术人员是众所周知的(参见例如Zhang等人PLOS One 2011年12月,第6卷第12期)。
药物和医药制剂
根据本发明的药物和医药制剂包含抗体及其抗体结合片段，其可以缀合于如本文所述的至少一种细胞毒性剂，或替代性地在没有此类药剂的情况下被提供(即裸露的)。药物和医药制剂可以使用所属领域技术人员已知的方法制备。合适方法的非限制性实例描述于Gennaro等人(编),(1990),“雷明顿药学全书(Remington’s PharmaceuticalSciences)”,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,USA。
药物和医药制剂可以包含药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。本文设想的“药学上可接受的”载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂是当施予特定受体例如人或非人动物时不产生副反应的物质。药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和佐剂通常也和药物和医药制剂的其它成分是相容的。合适的赋形剂、稀释剂和载体的非限制性实例可见于“医药赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)”第4版,(2003)Rowe等人(编),The Pharmaceutical Press,London,American Pharmaceutical Association,Washington。
药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的非限制性实例包括去矿质水或蒸馏水；盐水溶液；植物油，例如花生油(peanut oil)、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、麻油、花生油(arachis oil)或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低碳数醇，例如乙醇或异丙醇；低碳数芳烷醇；低碳数聚烷撑二醇或低碳数烷撑二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；卡拉胶；黄蓍胶或阿拉伯树胶、和凡士林。典型地，一种或多种载体将形成10重量％到99.9重量％的组合物。
本发明的药物和医药制剂可以采取适合于通过注射施用的形式，适合于口服的制剂的形式(例如胶囊、片剂、囊片、酏剂)，适合于局部施用的软膏、乳霜或洗液的形式，适合于作为滴眼剂递送的形式，适合于通过吸入(例如通过鼻内吸入或口腔吸入)施用的气雾剂形式，或适合于肠胃外施用(也就是经皮、皮下、肌肉内或静脉内注射)的形式。
用于口服的药物和医药制剂的固体形式可以含有在人和兽医药学实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、涂布剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、海藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青、樱桃、橙子或覆盆子味的油。合适的涂布剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
除以上药剂外，用于口服的药物和医药制剂的液体形式还可以含有液体载体。合适的液体载体包括水，油，例如橄榄油、花生油、麻油、向日葵油、红花油、花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯，或其混合物。
用于口服的悬浮液可以另外包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰基醇。合适的分散剂包括卵磷脂、脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯或二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇单硬脂酸酯或二硬脂酸酯、或聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯或二月桂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯或二油酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单硬脂酸酯或二硬脂酸酯、或聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯或二月桂酸酯等。
为了制备作为可注射溶液或悬浮液的药物和医药制剂，可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或载体，例如林格氏液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2丙二醇。
用于口服的乳液可以另外包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括以上举例说明的分散剂，或天然树胶，例如瓜尔胶、阿拉伯树胶或黄蓍胶。
局部制剂包含活性成分(例如，即本发明的抗体和/或其抗原结合片段)连同一种或多种可接受的载体和任选地任何其它治疗成分。适合于局部施用的制剂包括适合于穿透皮肤到达需要治疗的部位的液体或半液体制剂，例如搽剂、洗液、乳霜、软膏或糊剂，和适合于施用于眼睛、耳朵或鼻子的滴剂。
当配制成滴剂时，药物和医药制剂可以包含无菌的水性或油性溶液或悬浮液。这些可以通过将活性成分溶解在杀细菌剤和/或杀真菌剂和/或任何其它合适防腐剂(并且任选地包含表面活性剂)的水溶液中制备。得到的溶液然后可以通过过滤净化，转移到合适容器中并灭菌。举例来说，灭菌可通过先过滤然后用无菌技术转移到容器中来实现。适合于包含在滴剂中的杀细菌剤和杀真菌剂的实例是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)(0.01％)和醋酸洗必太(chlorhexidine acetate)(0.01％)。用于制备油性溶液的合适溶剂包括甘油、稀醇和丙二醇。
当配制成乳霜、软膏或糊剂时，药物和医药制剂可以是用于外部涂敷的活性成分的半固体制剂。它们通过将细碎或粉末形式的活性成分(单独的，或者采取在水性或非水性流体中的溶液或悬浮液形式)与含脂或不含脂基质混合来制备。基质可以包括烃，例如硬石蜡、软石蜡或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；黏胶；天然来源的油，例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸例如硬脂酸或油酸，以及醇例如丙二醇或聚二乙醇。
药物和医药制剂可以包含任何合适的表面活性剂，例如阴离子性、阳离子性或非离子性表面活性剂，例如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以包含悬浮剂，例如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料如硅石，及其它成分如羊毛脂。
用于治疗前列腺、膀胱和/或胰腺癌的方法
根据本发明，可以是裸露的或缀合于至少一种细胞毒性剂的抗体及其抗体结合片段适合于治疗前列腺、膀胱和/或胰腺癌。抗体和/或其片段可以像本文所述的那样作为医药制剂或药物的组分施用。
患有前列腺、膀胱和/或胰腺癌或处于发生前列腺、膀胱和/或胰腺癌的风险下的受试对象的鉴别对于所属领域技术人员是众所周知的。举例来说，在前列腺癌的情况下，合适的方法包括但不限于直肠指检、基于PSA的分析和前列腺活检。
良性前列腺肿瘤(非癌性)与恶性前列腺肿瘤(癌性)的区别因素之一是癌形式转移的能力。转移是癌细胞扩散(转移)到身体其它部分的能力。根据恶性肿瘤的TNM分类法(TNM)将患者的前列腺癌进一步分类成多个分期，TNM基于原发瘤的大小和程度(T)、癌症对于附近淋巴结的扩散(N)和通过原发瘤转移(M)到身体其它部分而形成的继发瘤的存在(美国癌症协会)来分类癌症。表2显示每个癌症分期的实例定义。
表2.改编自美国癌症协会的TNM系统的癌症分期的定义.
这些方法可以用于治疗受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌。可以用本发明治疗的前列腺癌的非限制性实例包括前列腺上皮内瘤、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。可以用本发明治疗的膀胱癌和/或胰腺癌的非限制性实例包括膀胱癌的T分类、N分类和M分类(如美国癌症联合委员会(AJCC)‘TNM系统’所定义)、肌肉浸润性膀胱癌和非肌肉浸润性膀胱癌。
应理解在本文所述的方法的上下文中的“治疗”是指完全或部分缓解与前列腺、膀胱和/或胰腺癌相关的症状，或减缓、抑制或停止那些症状的进一步发展或恶化，或预防前列腺、膀胱和/或胰腺癌。因此，治疗前列腺、膀胱和/或胰腺癌可以包括例如抑制或预防癌症转移，降低转移的速度和/或数量，降低转移的前列腺、膀胱和/或胰腺癌的肿瘤体积，完全或部分缓解转移的前列腺、膀胱和/或胰腺癌，或其它治疗益处。
受试对象可以是可从抗体和/或其抗体结合片段的施用受益的任何动物。在一些实施方案中，受试对象是哺乳动物，例如人、狗、猫、马、牛、猪、灵长类或啮齿动物(例如大鼠或小鼠)。
所述方法可以包括施用“治疗有效量”的根据本发明的抗体及其抗体结合片段。“治疗有效量”应被理解为是指在存在发生前列腺癌的风险下的受试对象中完全或部分缓解与前列腺、膀胱和/或胰腺癌相关的症状，或减缓、抑制或停止那些症状的进一步发展或恶化，或预防前列腺、膀胱和/或胰腺癌或对前列腺、膀胱和/或胰腺癌提供预防的抗体和/或片段的量。
治疗有效量可以取决于给药途径和剂型而变化。根据本发明的缀合抗体和/或其片段的有效量典型地处于约0.001到100mg/kg/天的范围，例如处于约0.05到10mg/kg/天的范围。典型地，选择抗体和/或片段以提供展现高治疗指数的制剂。治疗指数是毒性作用与治疗作用之间的剂量比，可以表示为LD50与ED50之间的比率。LD50是对50％的群体致命的剂量，而ED50是对50％的群体在治疗上有效的剂量。LD50和ED50通过标准医药程序在动物细胞培养物或实验动物中确定。
通常预期根据本发明的缀合抗体和/或其片段的有效剂量处在每24小时每千克体重约0.0001mg到约1000mg活性成分(即根据本发明的缀合抗体和/或其片段)的范围；典型地，每24小时每千克体重约0.001mg到约750mg；每24小时每千克体重约0.01mg到约500mg；每24小时每千克体重约0.1mg到约500mg；每24小时每千克体重约0.1mg到约250mg；每24小时每千克体重约1.0mg到约250mg的范围。更典型地，预期有效剂量处在每24小时每千克体重约1.0mg到约200mg；每24小时每千克体重约1.0mg到约100mg；每24小时每千克体重约1.0mg到约50mg；每24小时每千克体重约1.0mg到约25mg；每24小时每千克体重约5.0mg到约50mg；每24小时每千克体重约5.0mg到约20mg；每24小时每千克体重约5.0mg到约15mg的范围。
或者，有效剂量可以高达约500mg/m2的活性成分(即根据本发明的缀合抗体和/或其片段)。通常预期有效剂量处在约25到约500mg/m2，优选地约25到约350mg/m2，更优选地约25到约300mg/m2，更优选地约25到约250mg/m2，甚至更优选地约50到约250mg/m2，并且甚至更优选地约75到约150mg/m2的范围。
典型地，在治疗应用中，治疗将是针对受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌的持续时间。另外，对于所属领域技术人员显而易见的是，单独剂量的最佳数量和间隔将由所治疗的前列腺、膀胱和/或胰腺癌的本质和程度、给药的形式、途径和部位、以及所治疗的特定个体的本质决定。另外，此类最佳条件可以通过常规技术确定。
在许多情况下，几次或多次施用根据本发明的缀合抗体和/或其片段将是期望的。举例来说，指定剂量可以施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用可以间隔约1周到约12周，并且在某些实施方案中间隔约1周到约4周。在指定受试对象的前列腺、膀胱和/或胰腺癌的复发的情况或风险下，定期再给药可以是期望的。
对于所属领域技术人员将显而易见的是，最佳治疗过程可以使用治疗确定测试的常规过程确定。
根据本发明的缀合抗体和/或其片段可以被配制成用于各种给药途径，例如口服、肠胃外(例如皮内、静脉内、脊柱内、腹膜内、皮下或肌肉内)、经鼻、经直肠、局部或借助于植入型药盒。全身性或肠胃外给药包括但不限于腹膜内、肌肉内、皮下和静脉内注射。在一个实施方案中，其通过粘膜途径给药。可接受的粘膜给药途径的非限制性实例包括鼻内、眼睛、口腔、生殖道、直肠、气管内、皮肤和胃肠道。
在一些实施方案中，本文所述的抗体和/或其片段的治疗方法可以和其它药剂或疗法组合给予。抗体和/或其片段可以像本文所述的那样作为医药制剂或药物的组分。额外药剂或疗法的非限制性实例包括激素药剂、LHRH激动剂和拮抗剂、CYP17抑制剂、紫杉烷疗法、放射性同位素治疗、免疫调节疗法。实例包括多西他赛、米托蒽醌、醋酸阿比特龙(abiraterone acetate)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、酮康唑(ketoconazole)、皮质类固醇、Sipuleucel-T、卡巴他赛(cabazitaxel)、223镭、吉西他滨和卡介苗(BCG)免疫疗法。另外使用的额外放射疗法包括外部射线放射和近距离治疗。抗体和/或其片段可以和额外药剂或疗法同时施用于受试对象。另外或替代性地，抗体和/或片段可以在施用额外药剂或疗法之前或之后施用于受试对象。
实施例
现在将参考具体实施例描述本发明，所述具体实施例不应被解释为以任何方式构成限制。
实施例1：分析来自MIL-38杂交瘤群体的抗体
1.1材料和方法
-MIL-38抗体制剂
MIL-38抗体杂交瘤制剂从以下来源获得：
(i)使用BLCA-38杂交瘤的内部细胞储备液产生被命名为33A的MIL-38抗体制剂。
(ii)使用来自BLCA-38杂交瘤的原始保藏物(HB11785)的细胞的早期传代(<6)冻结来进行单细胞克隆并提供许多克隆以用于表征。选择MIL-38 1F5克隆并以保藏号CBA20140026保藏在澳大利亚细胞银行。
(iii)如授予Walker等人的美国专利号5,622,8361中所述地那样制备用作以上(i)和(ii)中描述的制剂的基础的杂交瘤储备液，该美国专利的全部内容以交叉引用的方式并入本文中。
为了纯化MIL-38抗体，将冷冻细胞储备液迅速解冻，随后再悬浮于RPMI 1640培养基中并在37℃和5％CO2下生长24小时。以连续过程将细胞繁殖，分离并扩大规模。在每个步骤，细胞都再悬浮于新鲜培养基中并在37℃和5％CO2下孵育。在扩大规模后，将细胞转移到无菌的无血清培养基中并生长，直到死亡期开始。收获上清液以收集MIL-38抗体并过滤灭菌。抗体上清液储存在-80℃直到被需要。使用Pierce蛋白G根据制造商推荐纯化抗体。
-蛋白质印迹法和Sypro凝胶分析
蛋白提取：根据标准组织培养技术培养DU-145(MIL-38抗原阳性)或C3(MIL-38抗原阴性)细胞。使用Merck Millipore ProteoExtract Native Membrane ProteinExtraction Kit(MPEK)根据制造商说明书富集细胞膜蛋白。
-转移
使用Transblot Turbo系统(Biorad)在最大2.5A和25V下将凝胶转移到硝化纤维素膜上持续10分钟。
-蛋白质印迹法
简言之，在转移之后，用PBS-Tween(0.1％)中的5％脱脂奶在室温下将膜封闭2小时。施加一级抗体(1μg/ml，在5％脱脂奶PBS-Tween(0.1％)中)并在4℃孵育过夜。在洗涤(3×10min PBS-Tween(0.1％))后，将膜和二级抗体(1:2000的HRP标记的绵羊-抗-小鼠抗体，在5％脱脂奶-PBS-Tween(0.1％)中)一起孵育。在洗涤(3×10min PBS-Tween(0.1％))后，通过使用ECL检测试剂盒(Biorad)并用LAS4000mini(GE Life Science)成像来检测抗原。
-Sypro凝胶
将凝胶在固定溶液(10％乙醇、7％乙酸)中固定2小时，然后转移到RubyProtein Stain中并在室温下在黑暗中孵育过夜。在成像前，用脱色溶液(10％乙醇、7％乙酸)对凝胶冲洗和洗涤最少2小时。用Pharos X扫描仪进行成像。
-免疫荧光分析(IFA)
IFA：将细胞在盖玻片上生长直到75％融合，并放置在6孔板中。用PBS洗涤细胞，随后用丙酮固定。再次用PBS洗涤细胞，随后与TBS一起孵育，然后用含5％脱脂奶的PBS封闭。细胞然后在黑暗中与MIL-38、嵌合MIL-38或西妥昔单抗(Cetuximab)一起孵育，随后与被FITC或Alexa488标记的山羊抗小鼠抗体或山羊抗人抗体一起孵育。两种抗体都在含1％脱脂奶的PBS中制备。在一次抗体孵育与二次抗体孵育之间用PBS洗涤。在二次孵育后，用含DAPI的PBS洗涤细胞并针对绿色荧光可视化(MIL-38阳性)。
-SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE：将样品与含有非还原性SDS的样品缓冲液混合并加样到4-15％预制聚丙烯酰胺凝胶(Criterion TGX；Biorad)上。将凝胶在Tris-甘氨酸跑胶缓冲液中在80V下跑胶10分钟并在200V下另外跑胶50分钟。
-测序(DNA)
先前结果指示以ATCC保藏号HB11785保藏的BLCA-38细胞含有两个细胞群体。亚克隆被鉴别的两种类型的克隆：AM3/Alfio II型(不结合GPC-1)或AM4/Alfio 1(强烈结合GPC-1)。两个群体和从ATCC获得的低传代储备液(称为“1-0或原始”)一起测序。
对于测序操作224945(1-O)和449295-1(Alfio I)，从冷冻杂交瘤细胞提取总RNA并从RNA合成cDNA。然后进行PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)和恒定区，然后将其分别克隆到标准克隆载体中并测序。遵照Plus RNA Purification System的技术手册从杂交瘤细胞分离总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA。遵照SuperScriptTM IIIFirst-Strand Synthesis System的技术手册，使用同型特异性反义引物或通用引物将总RNA反转录成cDNA。根据GenScript的RACE的标准操作程序扩增VH、VL、CH和CL的抗体片段。使用标准分子克隆程序将扩增过的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。进行菌落PCR筛选以鉴别具有正确大小的插入物的克隆。关于每个抗体片段对具有正确大小的插入物的不少于5个单菌落测序。VH和VL质粒编码抗体的全长可变区以及CH1和CL的一部分。CH质粒编码CH1的一部分和全长CH2和CH3。CL质粒编码CL的一部分。为了得到全长恒定区或重链/轻链，通过PCR分别扩增由VH和VL质粒编码的那部分恒定区和由CH和CL质粒编码的那部分恒定区，然后使用重叠延长PCR获得全长DNA。具有正确的VH、VL、CH和CL插入物大小的5个单菌落被送去进行测序。样品的分离总RNA在1.5％琼脂糖/GelRedTM凝胶上沿着DNA标记物(标记物III-TIANGEN，目录号：MD103)跑胶。4微升的每个样品的PCR产物在1.5％琼脂糖/GelRedTM凝胶上沿着DNA标记物(标记物III)跑胶。将PCR产物纯化并储存在-20℃直到进一步使用。
5个不同克隆的VH、VL、CH和CL基因几乎相同。以下列举的共有序列被确定是单克隆杂交瘤群体(AM-4)所产生的抗体的序列。
MIL-38小鼠IgG1重链DNA共有序列(SEQ ID NO:1)
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATGCCTTCACAGTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAGGTGGATGGGC CGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTTTTTGCAGATCAACAACCTCAGAAATGAAGACACGGCTACATATTTCTGTGCTAGATGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA TGA
由小鼠重链编码的序列的单独区域用交替的阴影/无阴影文字突出显示。位置：1-57＝前导序列；58-147＝构架区(HFR1)；148-162＝互补决定区(HCDR1)；163-204＝HFR2；205-255＝HCDR2；256-351＝HFR3；352-378＝HCDR3；379-411＝HFR4；412-1383＝恒定区(CH1-CH3)；703-741＝铰链区(加下划线)；1384-1386＝终止密码子。
MIL-38小鼠κ轻链DNA共有序列(SEQ ID NO:2)
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGT TGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGGTCTATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAATAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGACTTATTACTGTTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA TAG
由小鼠轻链编码的序列的单独区域用交替的阴影/无阴影文字突出显示。位置：1-60＝前导序列；61-129＝构架区(LFR1)；130-162＝互补决定区(LCDR1)；163-207＝LFR2；208-228＝LCDR2；229-324＝LFR3；325-351＝LCDR3；352-381LFR4；382-702＝恒定区(CK)；703-705＝终止密码子。
以上重链和轻链AM-4MIL-38共有DNA序列翻译成以下重链和轻链氨基酸序列：
AM-4MIL-38小鼠IgG1重链氨基酸共有序列(SEQ ID NO:3)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYAFTWVKQAPGKGLRWMGRFAFSLETSASTAFLQINNLRNEDTATYFCARWGQGTLVTVSA *
小鼠IgG1重链序列的单独区域在以上氨基酸序列中标出。位置1-19＝前导序列；20-49＝构架区(HFR1)；50-54＝互补决定区1(HCDR1)；55-68＝HFR2；69-85＝HCDR2；86-117＝HFR3；118-126＝HCDR3；127-137＝HFR4(也称为接合区或J区)；138-461＝IgG1链恒定区(CH1–CH3)和终止密码子(*)。铰链区在以上序列中被加上下划线。
AM-4共有MIL-38轻链氨基酸共有序列(SEQ ID NO:4)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITC WYQQKQGKSPQLLVYGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGTYYCFGGGTKLEIK *
轻链氨基酸序列的单独区域像标记的那样被标出：位置1-20＝前导序列；21-43＝构架区(LFR1)；44-54＝互补决定区1(LCDR1)；55-69＝LFR2；70-76＝LCDR2；77-108＝LFR3；109-117＝LCDR3；118-127＝LFR4；128-234＝κ恒定区(CK)和终止密码子(*)
实施例2：制备和测试嵌合MIL-38抗体
2.1材料和方法
-制备嵌合抗体
开发两个最佳化的cDNA序列用于克隆目的。这些是基于以上在实施例1中鉴别的AM-4重链和轻链共有序列。
第一个最佳化的cDNA序列用于产生小鼠-人嵌合重链序列：
CHO密码子最佳化的cDNA序列#1–小鼠-人嵌合重链1404 bp(SEQ ID NO:5)
CAGATTCAGCTGGTCCAGAGCGGTCCCGAGCTGAAGAAGCCAGGCGAGACCGTGAAGATCTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCTTTCACA TGGGTGAAGCAGGCCCCAGGCAAGGGCCTGAGGTGGATGGGC CGGTTCGCTTTTTCCCTGGAGACCTCTGCCTCCACAGCTTTTCTGCAGATCAACAATCTGAGAAACGAGGACACCGCCACATACTTCTGCGCTAGGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGC TGA
由小鼠-人嵌合重链编码的序列的单独区域用交替的阴影/无阴影文字突出显示。位置：1-57＝前导序列；58-147＝构架区(FR1)；148-162＝互补决定区(CDR1)；163-204＝FR2；205-255＝CDR2；256-351＝FR3；352-378＝CDR3；379-411＝FR4；412-1401＝人恒定区(CH1-CH3)；706-750＝铰链区(加上下划线)；1402-1405＝终止密码子。
产生的第二个最佳化的cDNA序列用于产生小鼠-人嵌合轻链序列：
CHO密码子最佳化的cDNA序列#2–小鼠-人嵌合轻链705 bp(SEQ ID NO:6)
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTGCCTCTCTGTCCGCCAGCGTGGGCGAGACCGTGACAATCACCTGC TGGTATCAGCAGAAGCAGGGCAAGTCCCCACAGCTGCTGGTGTACGGCGTGCCCAGCAGGTTCTCTGGCTCCGGCAGCGGCACACAGTATAGCCTGAAGATCAACTCTCTGCAGCCTGAGGATTTTGGCACCTACTATTGC TTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG TGA
由小鼠-人嵌合轻链编码的序列的单独区域用交替的阴影/无阴影文字突出显示。位置：1-60＝前导序列；61-129＝构架区(LFR1)；130-162＝互补决定区(LCDR1)；163-207＝LFR2；208-228＝LCDR2；229-324＝LFR3；325-351＝LCDR3；352-381＝LFR4；382-702＝人恒定区(CK)；703-705＝终止密码子。
使用无血清培养基将嵌合MIL-38小鼠人CH1-CH3链在CHO-3E7细胞悬浮液中瞬时表达，随后进行一步纯化。
CHO-3E7细胞在无血清FreeStyleTM CHO表达培养基(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中生长。在轨道摇床(orbital shaker)(VWR Scientific,Chester,PA)上在37℃和5％CO2下将细胞维持在锥形瓶(Erlenmeyer Flask)(Corning Inc.,Acton,MA)中。在转染当天，将DNA和PEI(Polysciences,Eppelheim,Germany)以最佳比率混合，然后添加到具有已准备用于转染的细胞的烧瓶中。在第6天收集的上清液用于进一步纯化。
离心细胞培养物发酵液，随后过滤。将过滤过的上清液以3.0ml/min装载到5mlProtein A CIP柱(GenScript,目录号L00433)上。在用适当缓冲液洗涤和洗脱后，收集级分并用pH 9.0的1M Tris-HCl中和。通过SDS-PAGE、蛋白质印迹法，使用标准方案分析纯化蛋白的分子量、产率和纯度测量值。
-嵌合MIL-38抗体分析(玻片免疫荧光)
MIL-38嵌合抗体用于使用DU-145细胞的免疫荧光分析中。鼠MIL-38prep33A用作GPC-1抗原染色的阳性对照，而西妥昔单抗(一种靶向EGFR的嵌合抗体)用作人IgG恒定区染色的阳性对照。不具有一级抗体的玻片用作阴性对照。染色基本上如章节1.1中所述的那样进行，除了用Alexafluor 488标记二级抗体并且使用抗-人抗体染色嵌合样品和西妥昔单抗样品。
-嵌合MIL-38蛋白质印迹法
通过蛋白质印迹法测试嵌合MIL-38和鼠MIL-38对于DU-145和C3MPEK提取物以及对于NS0产生的重组GPC-1抗原的反应性。用鼠MIL-38或嵌合MIL-38探测蛋白质印迹。先用山羊抗人二级抗体后用绵羊抗山羊HRP抗体检测嵌合MIL-38。作为对照，先用山羊抗小鼠二级抗体后用绵羊抗山羊HRP抗体检测鼠MIL-38。当在等同条件下检测时，对嵌合MIL-38和鼠MIL-38观察到等同的反应性。
2.2结果
-嵌合抗体序列的表达
将编码嵌合MIL-38小鼠人CH1-CH3链的重链和轻链的重组质粒瞬时转染到CHO-3E7细胞培养物悬浮液中。通过Protein A CIP 5ml柱从细胞培养物上清液捕获目标蛋白，随后交换缓冲液。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析纯化蛋白。
-嵌合抗体序列
使用最佳化的cDNA序列#1(SEQ ID NO:5)产生具有以下氨基酸序列的嵌合MIL-38抗体重链：
嵌合MIL-38小鼠人CH1-CH3链序列小鼠VH-人CH1-CH3链(重链)(SEQ ID NO:7)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYAFTWVKQAPGKGLRWMGRFAFSLETSASTAFLQINNLRNEDTATYFCARWGQGTLVTVSSA *
小鼠-人嵌合重链序列的单独区域在以上氨基酸序列中标出。位置1-19＝前导序列；20-49＝构架区(HFR1)；50-54＝互补决定区1(HCDR1)；55-68＝HFR2；69-85＝HCDR2；86-117＝HFR3；118-126＝HCDR3；127-137＝HFR4(也称为接合区或J区)；138-467＝IgG1链恒定区(CH1-CH3)，和终止密码子(*)。铰链序列-人IgG1重链铰链序列在上文被加上下划线。
使用最佳化的cDNA序列#2(SEQ ID NO:6)产生具有以下氨基酸序列的嵌合MIL-38抗体轻链：
嵌合MIL-38小鼠-人κ轻链序列：小鼠VK-人CK序列(SEQ ID NO:8)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITC WYQQKQGKSPQLLVYGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGTYYCFGGGTKLEIK *
小鼠-人嵌合轻链氨基酸序列的单独区域像标记的那样被标出：位置1-20＝前导序列；21-43＝构架区(LFR1)；44-54＝互补决定区1(LCDR1)；55-69＝LFR2；70-76＝LCDR2；77-108＝LFR3；109-117＝LCDR3；118-127＝LFR4；128-234＝κ恒定区(CK)和终止密码子(*)
-嵌合MIL-38抗体分析(玻片免疫荧光)
图1A-D显示细胞的明视场图像。图1E显示33A阳性对照的染色。图1F显示嵌合MIL-38抗体的染色。图1G显示使用商业嵌合(小鼠/人)单克隆抗体(西妥昔单抗)阳性对照的染色，并且图1H显示无一级抗体阴性对照的染色。在图1E、F和G中观察到强烈染色，而在图1H中没有观察到染色。这些结果证明嵌合MIL-38抗体在IFA中成功地结合DU-145细胞，表明亲代鼠MIL-38抗体的结合特异性得到了保持。
-嵌合MIL-38抗体分析(蛋白质印迹法)
图2A显示先用鼠MIL-38后用抗小鼠HRP二级抗体探测的蛋白质印迹。图2A中显示的蛋白质印迹的暴露时间是30秒。图2B显示先用嵌合MIL-38后用山羊抗人二级抗体探测的蛋白质印迹。使用绵羊抗山羊HRP抗体检测复合物。图2B中显示的蛋白质印迹的暴露时间是30分钟。图2C显示先用鼠MIL-38后用山羊抗小鼠抗体探测的蛋白质印迹。使用绵羊抗山羊HRP抗体检测复合物。图2C中显示的蛋白质印迹的暴露时间是30分钟。
鼠MIL-38抗小鼠抗体识别DU-145溶解产物和重组GPC-1NS0中的抗原。在C3溶解产物中没有像预期的那样观察到反应性(图2A)。
需要三抗体检测法来测试嵌合MIL-38与DU-145和C3提取物以及重组NS0GPC-1的反应性(图2B)。另外用鼠MIL-38进行使用三抗体检测法的对照蛋白质印迹法(图2C)。当使用三抗体检测法时，检测远没有使用标准两抗体方法灵敏(针对图2A和C中所示的蛋白质印迹，对于图2A所用的暴露时间是30秒，而对于图2C所用的暴露时间是30分钟)。
如图2B所示，嵌合MIL-38识别重组GPC-1NS0抗原，并且当使用此方法检测时，显示与鼠MIL-38相当的反应性(比较图2B和C)。
2.3讨论
嵌合MIL-38抗体在CHO-3E7细胞悬浮液中被成功表达并纯化。基于SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，检测到具有估计分子量～55kDa(计算分子量～52kDa)和28kDa(计算分子量～26kDa)的目标抗体的H链和L链。
在IFA和蛋白质印迹法中观察到嵌合MIL-38与鼠亲代之间的相同反应性，表明在嵌合抗体的构建中结合特异性得到了保持。
实施例3：制备单链可变片段(scFv)MIL-38抗体
3.1材料和方法
-制备scFv抗体
开发最佳化的cDNA序列用于克隆目的。这是基于以上在实施例1中鉴别的AM-4重链和轻链共有序列。重链可变区位于N端并且使用柔性的丝氨酸/甘氨酸连接子连接于轻链可变区。scFv蛋白中掺入由6个组氨酸(hexa his)组成的C端标签以促进重组蛋白的纯化，并且掺入C端半胱氨酸残基以促进基于Cys的标记。
使用最佳化的cDNA序列产生小鼠-人嵌合重链氨基酸序列：
scFv MIL-38氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYAFT WVKQAPGKGLRWMGRFAFSLETSASTAFLQINNLRNEDTATYFCARWGQGTLVTVSSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCWYQQKQGKSPQLLVY GVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGTYYCFGGGTKLEIKC*
小鼠-人嵌合重链序列的单独区域在以上氨基酸序列中标出。位置1-19＝前导序列；20-49＝构架区(HFR1)；50-54＝互补决定区1(HCDR1)；55-68＝HFR2；69-85＝HCDR2；86-117＝HFR3；118-126＝HCDR3；127-137＝HFR4(也称为接合区或J区)；138-152＝甘氨酸/丝氨酸柔性连接子序列，153-175＝构架区(LFR1)；176-186＝互补决定区1(LCDR1)；187-201＝LFR2；202-208＝LCDR2；209-240＝LFR3；241-249＝LCDR3；250-259＝LFR4；260-265＝6组氨酸标签和终止密码子(*)。连接子序列-甘氨酸/丝氨酸连接子序列在上文被加上下划线。
将ScFv MIL-38在CHO细胞中瞬时表达，随后利用6组氨酸标签和镍亲和柱进行一步纯化。
-流式细胞术：
使用标准方法用CY5荧光团标记鼠1F5MIL-38抗体或scFv MIL-38构建体。这些抗体然后用于染色DU-145前列腺癌细胞。
简言之，使用PBS/2mM EDTA分离DU-145细胞。在离心后，将细胞与抗体或对照溶液在FACS洗液(PBS/5％胎牛血清)中在冰上一起孵育45分钟。用FACS洗液洗涤后，将细胞再悬浮于PBS中，然后使用流式细胞术评估细胞结合。
为了检查结合特异性，在与CY5标记的MIL-38孵育之前，DU-145细胞与未标记的鼠MIL-38抗体预先孵育。
图3A显示单独的DU-145细胞或伴有CY5标记的同型对照的DU-145细胞的流式细胞术直方图。图3B显示以下细胞的流式细胞术直方图：未经处理的DU-145细胞或用CY5标记的MIL-38标记的DU-145细胞，或在与CY5标记的MIL-38孵育之前已经与未经标记的MIL-38预先孵育的细胞。结合特异性通过对于与CY5标记的MIL-38预先孵育的细胞所观察到的较低的荧光强度来指示。图3C显示未经处理的DU-145细胞或用CY5标记的MIL-38或CY5标记的scFv MIL-38标记的DU-145细胞的流式细胞术直方图。
3.3讨论
MIL-38抗体成功转化成scFv格式。与DU-145细胞的结合低于亲代MIL-38鼠抗体。
实施例4：鼠1F5MIL-38和嵌合MIL-38抗体在DU-145前列腺癌细胞中的内化
4.1材料和方法
-MDA-MB-231、T-24、PANC-1或DU-145细胞的流式细胞术
用PBS-EDTA分离细胞，然后将细胞与MIL-38一级抗体在冰上在FACS洗涤缓冲液(PBS+5％FCS)中一起孵育45分钟。细胞在FACS洗涤缓冲液中洗涤三次，然后与AlexaFluor488二级抗体在冰上在黑暗中一起孵育30分钟。用FACS洗涤缓冲液洗涤3次后，将细胞转移到FACS管中并使用流式细胞术分析。
-抗体内化分析
将MDA-MB-231或DU-145细胞接种在8孔腔室玻片(5)中并在含有10％FCS的培养基中生长24小时。将细胞换到无血清培养基中持续36小时。将玻片放置在冰上，移除培养基，并每孔添加200μL的在无血清培养基中的10μg/mL冷抗体溶液。细胞在冰上孵育30分钟，然后用冷的无血清培养基洗涤一次，每孔添加200μL无血清培养基，并将细胞在37℃和5％CO2下孵育0、5、15和30分钟。然后移除培养基，并用PBS中的3％PFA在室温下固定细胞15分钟。固定后，用PBS洗涤细胞一次，并用PBS中的冷0.1％Triton X-100渗透化5分钟。然后用PBS洗涤细胞以移除过量的洗涤剂，然后用Tris缓冲盐水(TBS，pH 7.5)中的5％脱脂奶封闭30分钟。将对应的二级抗体(山羊抗-小鼠-Alexa488和山羊抗-人-Alexa488)在PBS中稀释(分别是4μg/mL和2μg/mL)。每孔添加200μL/孔的二级抗体溶液，并在室温下在黑暗中孵育45分钟。细胞用PBS洗涤一次，然后与每孔200μL的1μg/mL Hoechst(核复染)一起孵育5分钟，然后用PBS洗涤两次。移除腔室，并使用70％甘油水溶液作为封固剂封固玻片。
对于T-24细胞，将细胞接种在8孔腔室玻片中并生长3天，直到其达到约50％融合度。细胞在无血清培养基中孵育72小时。然后像上文对MDA-MB-231和DU-145细胞描述的那样处理玻片。
对于PANC-1时间过程，像上文对DU-145细胞描述的那样处理细胞。制备一式两份的玻片，并在37℃下固定细胞15分钟或60分钟。
4.2结果
图4A显示MDA-MB-231和对照(无一级抗体或只有同型)的流式细胞术直方图，而图4B显示1F5MIL-38鼠抗体对于MDA-MB-231、T-24或DU-145细胞的相对反应性。图4C显示1F5MIL-38鼠抗体对于PANC-1细胞的反应性。
图5A显示在与DU-145细胞一起孵育30分钟后，鼠MIL-38抗体(绿色)的局部化。细胞核被显示成蓝色。图5B显示在与DU-145细胞一起孵育30分钟后，嵌合MIL-38抗体(绿色)的局部化。细胞核被显示成蓝色。图5C显示在与MDA-MB-231细胞一起孵育30分钟后，嵌合MIL-38没有结合或内化。图5D显示在与T-24细胞一起孵育立即后，嵌合MIL-38抗体(绿色)的局部化。细胞核被显示成蓝色。图5E显示在60分钟时间过程期间经过15分钟后，嵌合MIL-38抗体(绿色)在PANC-1细胞中的局部化。图5F显示在60分钟时间过程完成后，用Alexa-Fluor 488标记的抗人抗体在PANC-1细胞中的内化。
4.3讨论
MIL-38抗体结合于GPC-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖抗原(图1和2)。GPC-1在前列腺癌细胞的表面上表达(图1)并且已被报道还在包括卵巢癌和膀胱癌(Walker等人1989,Russell等人2004)和乳腺癌(Matsuda等人2001)的多种其它癌细胞系上表达。还报道了GPC-1通过T-24膀胱癌细胞中的小窝和内体运输而内化和再循环到细胞表面上(Mani等人2006)。
GPC-1因此能够通过这些运输机制将结合的MIL-38抗体输送入细胞中，从而实现毒性部分如药物或放射性核素的递送。BLCA-38抗体的目标最近已被确定为GPC-1(PCT申请号：PCT/AU2015/000018)。然而，已经报道了BLCA-38抗体(1F5鼠MIL-38抗体的亲代细胞系)没有经历内化(Khatri 2010)。最近显示BLCA-38细胞是双克隆性的，仅一种细胞群体识别GPC-1(PCT/AU2014/000999)。1F5鼠MIL-38亚克隆和嵌合MIL-38抗体都识别GPC-1，然而在多种细胞类型中至今都没有研究其内化。
DU-145前列腺癌细胞显示比MDA-MBA-231乳腺癌细胞或T-24膀胱癌细胞更高的抗体结合，并且chMIL-38还能够结合PANC-1细胞(图4)。鼠MIL-38单克隆抗体和嵌合MIL-38抗体能够内化入DU-145细胞中，在30分钟时观察到最强内化作用(图5A和B)。T-24细胞还展现了嵌合MIL-38的内化(图5D)，然而MDA-MB-231细胞在这些条件下不显示MIL-38的可检测到的结合或内化(图5C)，尽管MDA-MB-231细胞表达MIL-38抗原(图4)。PANC-1细胞显示在孵育后15分钟时MIL-38与细胞膜的结合，以及孵育后60分钟时抗体几乎完全内化(图5E和F)。
GPC-1介导的MIL-38抗体内化因此不只依赖于MIL-38抗原的表达并且可能依赖于表达水平或细胞类型。细胞类型的作用由最新报道支持，该报道描述了与正常前列腺相比，在前列腺癌中的内体功能的变化(Johnson等人2014分子癌症研究(Mol Cancer Res.)2014年12月；12(12):1851-62)。
嵌合MIL-38抗体在结合前列腺、膀胱或胰腺癌细胞系的细胞表面上的GPC-1后被内化。chMIL-38的最强内化作用指示其作为抗体药物缀合物(ADC)的适用性。
实施例5：MIL-38抗体靶向到DU-145异种移植物
5.1材料和方法
-异种移植物模型
对裸小鼠左侧皮下注射1×106DU-145细胞。使细胞生长大约4周，然后将100μl的在PBS中的5μM Cy-5标记抗体静脉内注射入尾部静脉。使用Bruker MS-FX Pro扫描仪在注射后24小时获取光学图像。对三只小鼠注射Cy-5标记的1F5鼠MIL-38，并对三只小鼠注射Cy-5标记的嵌合MIL-38。
5.2结果
1F5MIL-38(图6A)和嵌合MIL-38(图6B)在每组测试的三只小鼠中的每一只中都展现对DU-145异种移植物的强烈靶向，同时存在最小的脱靶结合。还注意到在耳朵穿刺标记处的一些细微积累，这可能是由于穿刺伤口引起了炎症(注意没有局部化到未穿刺的耳朵)。
5.3讨论
使用放射性缀合的BLCA-38的先前数据指示了对前列腺癌异种移植物的靶向(Carter等人1994)，然而由于BLCA-38抗体的双克隆性质，不清楚1F5克隆是否显示类似靶向作用或AM3样克隆是否负责观察到的肿瘤局部化。
图6A和6B所示的结果指示MIL-38的1F5和嵌合形式都局部化到DU-145肿瘤异种移植物，暗示从BLCA-38混合群体分离的1F5抗体克隆负责肿瘤靶向并且BLCA-38储备液中存在的第二种抗体形式不是肿瘤局部化所必需的。
1F5和嵌合MIL-38抗体的肿瘤特异性局部化表明它们将是用于递送抗前列腺癌疗法如抗体药物缀合物或放射免疫疗法的良好药剂。
实施例6：细胞生长抑制分析
6.1材料和方法
-细胞生长抑制分析
这个分析被设计成用于筛选可以内化到细胞中并将毒素递送给细胞从而引起细胞生长抑制和/或细胞死亡的抗体。诱导细胞生长抑制的抗体是用于转化成具有所确定的毒素载荷的抗体药物缀合物(ADC)格式的候选物。
该分析首先包括在存在已经连接于适合用在ADC技术中的不同毒素的蛋白G的情况下孵育测试抗体和靶细胞。用固定的最终浓度的蛋白G-毒素创建抗体剂量反应曲线。
选择以下蛋白G组合：
表3：蛋白G组合
分析格式如下进行：
将100μl培养基中的20-30％融合度的细胞接种到96孔中，然后孵育过夜。从图中在19:60比率指示的浓度开始，连续稀释抗体，然后添加到含有细胞的96孔板中。
以上文指示的浓度将预加载的蛋白G-药物缀合物添加到处理孔中。细胞然后孵育3天，然后使用CelltitreGlo测量细胞活力。
测试以下抗体：
a.嵌合MIL-38(人IgG1)
b.鼠1F5MIL-38(鼠IgG1，BLCA-38的高GPC-1结合亚克隆)
c.鼠BLCA-38(鼠IgG1，由1F5型和AM3型抗体组成的混合群体)
d.鼠AM3(鼠IgG，BLCA-38的低GPC-1结合亚克隆)
e.爱必妥(Erbitux)(对照人IgG1嵌合抗EGFR抗体)
6.2结果
选择两种细胞系DU-145和MDA-MB-231以纳入分析中。两者都是GPC-1阳性的，但是展现不同水平的MIL-38反应性和内化作用。所选的抗体展示一系列不同特征：
表4：所用抗体
*BLCA-38没有报道发生内化(Khatri等人2010)。
MDA-MB-231细胞对所有的抗-GPC-1抗体/毒素组合都不敏感(图7A到7D)，而抗-EGFR/毒素复合物能够抑制MDA-MB-231细胞的生长(图7E)。MDA-MB-231细胞的生长抑制需要毒素的内化，如仅使用爱必妥的情况下不存在抑制作用所证实的(图7E)。不清楚MDA-MB-231细胞对于抗-GPC-1抗体的不敏感是因为GPC-1的表达水平、GPC-1/抗-GPC-1/蛋白G毒素复合物内化的能力、还是抗-GPC-1对比抗-EGFR复合物的差别加工。
当被爱必妥靶向时，DU-145细胞对这个分析中使用的所有毒素都是敏感的，但是在仅使用爱必妥的情况下不显示抑制作用(图7E)。嵌合MIL-38能够与在预加载有MMAE和MMAF毒素的PSG在DU-145细胞中诱导生长抑制，但与加载有倍癌霉素或DM1的PSG不抑制，从而证明涉及的特定毒素也具有效果(图7A)。相比之下，1F5MIL-38、BLCA-38和AM3在这些分析中不能诱导细胞生长抑制。
图7A-7E所示的实验中使用的蛋白G-倍癌霉素的浓度被证实即使在不存在抗体的情况下对于DU-145细胞也是有毒性的，因此进行滴定以确定用于DU-145细胞的适当较低浓度(图7F，第1张图)。爱必妥能够在这些条件下以剂量依赖性方式诱导细胞生长抑制，但没有MIL-38抗体能在这些条件下引起生长抑制。
单独抗体的内化并不预示生长抑制：嵌合MIL-38和1F5鼠MIL-38内化到相同水平(图5A和B)。对于嵌合MIL-38观察到生长抑制(图7A)，但对于1F5鼠抗体没有观察到生长抑制(图7D)。
6.3讨论
在这些分析中评估多个关键问题：
1.如果细胞系表达GPC-1抗原(不考虑表达水平)，那么它对于抗-GPC-1抗体是敏感的？
2.如果抗体内化，那么它能够通过GPC-1/抗-GPC-1抗体/蛋白G毒素复合物的内化引起生长抑制？
3.相同水平的抗体内化作用应引起相同的生长抑制。
4.细胞系/抗体/毒素组合的相对敏感度。
与这些分析中的阳性对照(爱必妥)相比，MIL-38衍生的抗体展示不同的活性分布。首先，与所测试毒素组合的嵌合MIL-38对于乳腺癌细胞系MDA-MBA-231不显示活性，虽然在这个细胞系上表达了GPC-1。相比之下，在存在测试的所有毒素的情况下，爱必妥对于MDA-MB-231细胞都是活性的。
其次，嵌合MIL-38在存在MMAE和MMAF毒素的情况下对DU-145细胞显示生长抑制，而鼠1F5、AM3或BLCA-38不显示活性。在已经证实相同内化作用的1F5(图5A和5B)的情况下这是尤其出乎意料的，表明观察到的差别活性是由于嵌合构架。
从这些结果可以明白，单独抗原或抗体的内化并不预示指定抗体/抗原复合物的潜在活性，并且必须获得实验数据以确定指定分子的潜在效用。
观察到虽然GPC-1抗原被表达，但表达最低水平的GPC-1抗原的MDA-MB-231细胞在使用嵌合MIL-38时不显示细胞生长抑制，这表明嵌合MIL-38的ADC版本能够特异性地靶向前列腺癌细胞并且不影响具有低GPC-1抗原表达的其它组织。用嵌合MIL-38而不是1F5鉴别到生长抑制作用启示嵌合格式对于基于ADC的策略的利用提供出乎意料的优势。
实施例7：可缩放的嵌合表达系统的开发
7.1材料和方法
-细胞系开发
用于临床试验且最终用于商业供应的足量嵌合抗体的生产需要能够实现高抗体表达和在纯化后的良好回收的生产系统。使用瞬时表达(一种不适合于大规模GMP生产的技术)生产实施例1中所述的嵌合抗体。因此，开发出具有以下特征的合适表达/纯化系统：
1.使用公认的基因转导技术。
2.使用适合于临床级生产的足够质量和谱系的细胞系。
3.使用适合于最终产品的可缩放GMP生产的细胞培养基、生物反应器和纯化技术。
选择Catalent作为制造商，因为其具有抗体的GMP生产方面的丰富经验以及专利GPEX反转录病毒载体表达技术。
使用被掺入Catalent的GPEX表达反转录病毒载体中的嵌合MIL-38重链和轻链编码序列开发出稳定细胞池。
在筛选后，创建稳定池并将其用于嵌合MIL-38的25L规模化生产。使用适合于可缩放生产的工艺纯化细胞上清液。
7.2结果
创建稳定池并将其用于早期生产阶段。使用稳定细胞池以18天分批补料执行25L生产运行。活细胞密度(图8A)、细胞活力(图8B)和抗体产量(图8C)显示良好表现，在开发的这个早期阶段获得0.8g/L的表达水平。
净化来自分批补料的上清液收获物，然后使用用于抗体纯化、宿主细胞蛋白和病毒减少的可缩放技术纯化(表5)。使用非最佳化的纯化获得大约50％的产率，指示已经开发出可缩放工艺。
表5：在嵌合MIL-38纯化期间的产率和回收率.
7.3结果
使用GPEX技术创建表达嵌合MIL-38的稳定CHO细胞池，并将其用于早期生产阶段。在初期分批补料生产阶段观察到良好表达，并且使用已知适合于GMP生产的标准纯化工艺实现良好回收。
稳定池将形成用于未来细胞系研发、合并克隆分离以及主细胞库和工作细胞库构建的基础。所用的纯化工艺可以被进一步最佳化以增加产率。
广为接受的细胞系、表达载体、细胞生长系统和纯化技术的使用意味着从25L中试批次获得的最终抗体产品应具有与从最终生产工艺生产的抗体产品极其类似的特征。至今获得的产率指示产品可以在与其它市售抗体产品一致的成本下生产。
实施例8：用于成像和放射疗法的嵌合MIL-38DOTA缀合物的开发
8.1材料和方法
-用于177Lu标记的MIL-38与DOTA的缀合
DOTA以10:1比率如下缀合到嵌合MIL-38上。在0.1M PBS(pH 8.5)缓冲液中制备p-SCN-Bn-DOTA，然后将嵌合MIL-38(cMIL-38)添加到混合物中。使混合物在室温下在黑暗中反应20小时。
使用预调节的微型PD-10凝胶柱纯化缀合的mAb。通过HPLC筛选级分的活性。
-用177Lu标记MIL-38
将10μL的0.05N HCl中的0.472.1mCi的177Lu添加到0.2mg DOTA-cMIL-38中，然后将pH调节到pH 7.5。混合物在50℃在黑暗中孵育60分钟，然后冷却到室温并静置20分钟。
使用预处理的微型PD-10凝胶柱纯化被放射性标记的MIL-38DOTA。柱用2mL的1xPBS预处理，并丢弃流出物。这总共重复4次，然后将放射性溶液添加到柱中心。添加0.2mlPBS并在低结合Eppendorf管中收集级分。这另外重复19次，然后使用剂量校准器确定每个级分中的活性。使用放射性HPLC(radio-HPLC)分析放射性mAb的样品用于确认分析。
-MIL-38DOTA的模拟标记和流式细胞术
为了证实在嵌合MIL-38与DOTA缀合之后和放射性标记过程之后嵌合MIL-38与DU-145细胞的结合被保持，对MIL-38DOTA执行“模拟”放射性标记过程，其中将其和在以上描述的放射性标记过程中使用的相同缓冲液一起孵育并暴露于相同温度。省略PD-10柱纯化步骤。
嵌合MIL-38、MIL-38DOTA和模拟标记的MIL-38DOTA然后各自用作一级抗体以用于流式细胞术分析。
-用于规模化制造的chMIL-38与DOTA的缀合和67Ga标记
遵照Forrer等人(名为“177Lu放射性标记的嵌合抗-CD20单克隆抗体的体外表征和初步剂量学研究(in vitro characterization of 177Lu-radiolabelled chimeric anti-CD20monoclonal antibody and a preliminary dosimetry study)”)所概述的方法，进行chMIL-38与p-SCN-Bn-DOTA(DOTA)的缀合。使用三个条件：5、10和20倍过量的DOTA。简言之，组合三小瓶chMIL-38(9.3mg/ml)，并将缓冲液从0.01M PBS换成0.2Na2CO3(pH 9.5)。然后将chMIL-38溶液浓缩到433μl的最终体积，从而得到64.4mg/ml的有效浓度。将物质分成三个144μl的等分试样，然后与DOTA(5、10或20当量)反应。每个反应混合物都在37℃下维持1小时。然后用5ml的Na2CO3缓冲液pH 9.5洗涤样品，然后用0.25M乙酸铵pH 7交换缓冲液。
质谱分析指示连接的DOTA的数目是4.3DOTA:MAb(5倍反应过量)、4.6DOTA:MAb(10倍反应过量)和7.5DOTA:MAb(20倍反应过量)。
-chMIL-38DOTA的67Ga标记
使用从含有7.5DOTA:MAb比率的20倍反应过量产生的产物进行chMIL-38DOTA的67Ga标记。使用以下反应条件：0.02M HCl中的50μl 67GaCl3，100μl 0.1M NaOAc缓冲液pH5.0，chMIL-38DOTA:5到25μl抗体(46-230μg)。混合物在40℃孵育1或16小时。计算放射化学产率和衍生出的比放射性。
-通过流式细胞术和直接结合ELISA针对MIL-抗原结合评估DOTA缀合和标记条件
为了证实使用5、10或20倍过量的DOTA将DOTA与chMIL-38缀合的反应条件并不显著改变chMIL-38DOTA与GPC-1的结合，使用以下两种分析法：流式细胞术和直接结合ELISA。流式细胞术如下执行。使用2mM EDTA(37℃下10分钟)分离DU-145或T-24细胞。使细胞沉淀，然后制备每管2×105个细胞。将细胞与一级抗体(1μg/ml，50μl)一起在冰上孵育45分钟，然后在FACS洗涤缓冲液(1x PBS溶液)中洗涤三次。然后将细胞与50μl二级抗体(1μg/mlAlexaFluor 488山羊抗-人(H+L))一起孵育45分钟。将细胞在FACS洗涤缓冲液中洗涤三次，然后流过使用BD FACSDIVATM软件的BD LSRFortessaTM细胞分析仪。
GPC-1直接结合ELISA如下进行。用pH 9的10mM碳酸盐缓冲液涂布96孔板持续15分钟。移除碳酸盐缓冲液，并在室温下用pH 9的10mM碳酸盐缓冲液中的1.5μg/ml重组人GPC-1(R&D systems)将孔涂布过夜。第二天用pH 9的5mM碳酸盐缓冲液洗涤孔，然后用PBS中的10％酪蛋白封闭1小时。将一级抗体从25ng/mL连续稀释到0.39ng/mL，然后在室温孵育1小时。然后用PBS-Tween 20(0.1％)将板洗涤4次。将二级抗体Thermofisher兔抗-人在PBS-Tween,10％酪蛋白中1:8000稀释，然后在室温孵育1小时。用PBS-Tween将板洗涤4次，并添加100μl TMB。使板显影2分钟并在λ450nm下读取。
8.2结果
图9A显示用于校准HPLC的凝胶过滤标准的A280吸光度曲线。图9B显示未缀合的嵌合MIL-38的A280吸光度曲线。图9C显示在DOTA缀合和PD-10柱提纯之后的嵌合MIL-38的A280吸光度曲线。图9D显示在用177Lu标记MIL-38DOTA和PD-10柱提纯之后的177Lu活性的放射性HPLC曲线。图9E显示对应于图9D的A280吸光度曲线。
使用以上所述的缀合、标记和纯化程序，获得被177Lu放射性标记的嵌合MIL-38DOTA的单峰。
图10显示嵌合MIL-38、嵌合MIL-38DOTA和模拟标记的嵌合MIL-38DOTA的流式细胞术直方图。与未经处理的嵌合MIL-38相比，DOTA缀合略微减少观察到的荧光信号。当和MIL-38DOTA比较时，模拟标记并不影响检测到的荧光。
替代缀合条件用于chMIL-38DOTA的规模化生产和67Ga标记。67Ga具有约3.3天的半衰期，并且因此是比同位素如68Ga(半衰期约68分钟)更好的用于预测chMIL-38、DOTA标记的chMIL-38的体内生物分布的同位素。
图11显示用67Ga对DOTA缀合MIL-38的标记。图11A显示用67Ga标记的MIL-38的放射性的尺寸排阻色谱法HPLC色谱图。星号指示反应混合物中残余的游离67Ga，图11B显示用67Ga标记的MIL-38DOTA的稳定性研究。用67Ga标记的MIL-38的放射性的尺寸排阻色谱法HPLC色谱图和对应的UV曲线一起展示。移除67Ga-MIL-38制剂中的游离67Ga，然后将其在室温下保持两周，然后经历SEC HPLC色谱法。虽然有一些67Ga从chMIL-38DOTA中分离出来(通过约10分钟洗脱时间时的第二峰指示)，但是大部分的抗体和放射性在这些条件下都保持完整，指示良好的稳定性。
为了最大化被67Ga标记的chMIL-38DOTA的比放射性，检查chMIL-38DOTA与67GaCl3的比率和孵育时间(1小时对比16小时)的影响。如表6所示，反应混合物中的抗体的量在决定放射化学产率(RC)和衍生出的比放射性(SA)方面是最重要的变量。
表6.关于使用67Ga的chMIL-38标记，抗体质量和孵育时间对放射化学产率和衍生出的比放射性的影响
*衰变校正值(18小时衰变，×0.853)
由于用于将DOTA与chMIL-38缀合和用于以67Ga标记法标记的条件可能影响结合活性，因此设计一系列实验以检查在以下两个不同分析法中这些程序对chMIL-38与GPC-1抗原的结合的影响：流式细胞术(靶向细胞结合的抗原)和直接结合ELISA(靶向表面结合的重组形式GPC-1)。
通过先前所述的“模拟标记”确定标记条件的影响。另外，评估这些分析法的分析内和分析间再现性。
图12显示流式细胞术中的嵌合MIL-38、使用三种不同的DOTA缀合物比率制备的MIL-38DOTA和模拟放射性标记的MIL-38DOTA与DU-145或T-24细胞的结合，以及直接抗原结合ELISA中的结合。图12A显示未被标记的嵌合MIL-38或已经使用5、10或20倍摩尔过量的DOTA缀合到DOTA上的嵌合MIL-38的结合。获得基本等同的结合曲线，指示DOTA缀合并不引起MIL-38与DU-145细胞的结合的减少。图12B显示各自已经经历模拟标记反应的chMIL-38DOTA(20倍过量)的三个独立批次与T-24细胞的流式细胞术结合。观察到基本一致的结合曲线，指示良好的批次间再现性。图12C显示chMIL-38DOTA(20倍过量)的三个独立流式反应物的与T-24细胞的流式细胞术结合，chMIL-38DOTA都是从已经经历模拟标记反应的一个批次制备而来的。观察到基本一致的结合曲线，指示良好的批次内再现性。图12D显示单独二级抗体(红色曲线)、chMIL-38DOTA(绿色曲线)、来自批次间再现性的一个样品(批次1，蓝色曲线)和来自批次内再现性的一个样品(Intra 1，橙色曲线)的T-24细胞结合的叠加流式细胞术图谱。观察到基本一致的结合曲线，指示与chMIL-38DOTA对照相比，模拟标记过程并不影响与细胞的结合。图12E显示直接结合ELISA中chMIL-38和已经使用5、10或20倍摩尔过量的DOTA而被缀合于DOTA的chMIL-38与重组GPC-1的结合。图12F显示chMIL-38DOTA、针对批次间比较而制备的模拟标记的chMIL-38DOTA的3个不同制剂和来自批次内制备的3个不同反应物与重组GPC-1的直接结合。
与未缀合的chMIL-38相比，DOTA与chMIL-38的缀合减少直接分析中其与GPC-1的结合，虽然这种影响只在较低抗体浓度下被观察到并且并不依赖于实验中使用的DOTA比率或连接的DOTA分子的数目(图12E)。与未进行模拟标记的chMIL-38DOTA相比，测试的模拟放射标记条件并不影响chMIL-38DOTA的结合，并且该分析显示良好的批次间和批次内再现性(图12F)。
8.3讨论
已经成功地研发出用于将嵌合MIL-38与DOTA螯合分子缀合的方法。嵌合MIL-38DOTA抗体可以用例如用于成像的67Ga或用于成像和放射免疫治疗的177Lu等试剂标记。其它试剂如钆或90钇也可以与DOTA螯合剂螯合。
流式细胞术和直接结合数据指示，缀合和标记过程对嵌合MIL-38结合DU-145细胞的能力具有极小的影响。
实施例9：小鼠异种移植物模型中的嵌合MIL-38局部化
9.1材料和方法
-抗体标记和内化
用Cy5荧光团标记嵌合MIL-38以便可视化。使用DU-145细胞通过流式细胞术证实标记后结合活性的保留。ChMIL-38Cy5展示明显内化入DU-145细胞中。
-异种移植物和抗体输注
在三只8周大的雄性Balb/c裸小鼠的每只小鼠的右侧皮下注射100μL无血清培养基(RPMI)中的5×106个DU-145细胞。在第26天所有小鼠都具有可感知到的肿瘤(直径大约4mm)。通过尾部静脉注射抗体溶液(大约150μg/注射)，然后使用Bruker In-Vivo Xtreme光学扫描仪在0小时、4小时、24小时、48小时、72小时和144小时成像。
9.2结果
肿瘤局部化在4小时时在三只小鼠中的两只中被观察到，并且在输注后24小时时在测试的所有三只小鼠中都是非常明显的(图13A)。肿瘤局部化在48小时和72小时时被维持，同时非肿瘤信号降低。在144小时时观察到相对于背景信号的最佳的肿瘤，此时背景信号已被清除。chMIL-38Cy5输注是耐受良好的。图13B显示在144小时后来自图13A的代表性小鼠的多模态动物旋转系统(MARS)图像。
实施例10：177Lu DOTA MIL-38的生物分布研究
10.1材料和方法
-生物分布研究
在T0对15只雄性Wistar大鼠注射，在5个计划放血时间点用于解剖和测量关键器官放射性积累。计划时间点是6小时、24小时、48小时、7天和14天。
由Singapore Radiopharmaceuticals提供的DOTA缀合MIL-38抗体用177Lu进行放射性标记并且通过了台式设备质量保证测试。
10.2结果
不同时间点的每克器官的注射活性％的标准化图表(图14)指示安全的放射治疗图谱，同时没有在所分析的组织和器官中的毒性积累的迹象。值得注意的是，关键排泄器官(肝、肾)不展示毒性放射性积累的迹象(图15)。
对于测试动物没有记录到不良事件。
10.3讨论
177Lu标记的嵌合MIL-38DOTA显示良好的耐受性，同时没有在组织或器官、尤其排泄器官中的毒性积累的迹象。该药剂是耐受良好的，同时没有记录到不良事件。
正常大鼠中的这些结果结合在使用荧光标记嵌合MIL-38时所见到的肿瘤靶向(图6和13)一起表明，MIL-38DOTA缀合物很可能具有对前列腺癌同时进行成像和放射治疗的能力。
实施例11：异种移植物中64Cu chMIL-38DOTA和NOTA的PET成像研究
11.1材料和方法
此项研究的目的是使用PET-CT和离体器官分析来检查被放射标记的chMIL-38对DU-145异种移植物的体内靶向。由于67Ga和177Lu都不能用于PET-CT成像，因此使用64Cu作为放射标记。NOTA是64Cu的优选螯合剂，因此嵌合MIL-38也和NOTA螯合剂缀合，并且64Cu被用作成像同位素。使用Siemens Inveon PET-CT扫描仪进行成像。64Cu chMIL-38NOTA和64CuchMIL-38DOTA两者都用于成像和生物分布目的。
在8周大的雄性Balb/c裸小鼠的每只小鼠的右侧皮下注射100μL无血清培养基(RPMI)中的5×106个DU-145细胞。在给药时没有溃疡的迹象，动物被密切监测并且除了肿瘤以外保持在良好状态。在第38天所有小鼠都具有可感知到的肿瘤(直径大约4mm)。在接种后第54天通过尾部静脉注射抗体溶液，然后使用Siemens Inveon PET-CT仪器成像。对两只小鼠输注64Cu chMIL-38-DOTA，并对三只小鼠输注64Cu chMIL-38-NOTA。每只小鼠接受大约100μg的活性3.1-3.4MBq(chMIL-38DOTA)或4-4.8MBq(chMIL-38NOTA)的chMIL-38。
使用有序子集期望最大化(ordered-subset expectation maximization，OSEM2D)算法重构PET图像，并使用允许CT和PET图像融合和感兴趣区(ROI)定义的InveonResearch Workplace软件(IRW 4.1)(Siemens)进行分析。使用IRW软件(Siemens)比对每只单独动物的CT和PET数据集以确保感兴趣器官的良好重叠。
在24小时和48小时对小鼠成像，然后从小鼠移除主要器官并通过γ-分析测量存在的抗体的量。
11.2结果
体内成像显示在chMIL38NOTA抗体的情况下的良好肿瘤积累和长期局部化(超过2天)，如对于Cy5标记的chMIL-38所观察到的那样(图16)。相比DOTA标记的抗体，在NOTA标记的抗体的情况下存在高得多的结合和肿瘤内积累(图17)。这可能是由于体内螯合剂的不稳定性(针对DOTA的情况)、其它器官中由螯合剂诱导的非特异性摄取、或由较低结合效率引起的DOTA中的64Cu损失。NOTA标记的抗体显示高的肿瘤内积累，大致等于对其它抗体系统观察到的肿瘤内积累。
离体分析显示在使用两种不同方法标记的chMIL38抗体的情况下在48小时的生物分布(图17)。对于chMIL-38NOTA，在肝和肿瘤中存在几乎相等的信号，指示有效靶向。预期达到更长时间点的成像将显示几乎排他的肿瘤描绘。
实施例12：异种移植物中的山羊抗-GPC-1的靶向和耐受性研究
12.1材料和方法
MIL-38不识别小鼠GPC-1，因此存在以下可能性：在其它研究中见到的chMIL-38的肿瘤特异性局部化和良好耐受性可能是由只靶向异种移植物肿瘤上的人GPC-1但不靶向内源鼠或大鼠GPC-1的chMIL-38引起的。
鉴别到山羊抗-GPC-1抗体，其识别蛋白质印迹上的小鼠重组GPC-1并且可以免疫沉淀小鼠重组GPC-1，表明其识别小鼠GPC-1的天然(细胞表面)形式。山羊抗-GPC-1抗体因此用于证实对于chMIL-38所见到的安全性和耐受性结果在识别小鼠GPC-1的抗体的情况下也被见到。
关于探索性研究新药(exploratory Investigational New Drugs)的FDA指导建议蛋白质的最大微剂量是<30纳摩尔。对于全长单克隆抗体，这是大约4.5mg蛋白质。小鼠中约0.3mg的抗体等同于安全系数22的4.5mg抗体或安全系数100的1mg抗体的人体等效剂量(HED)(参见表7)。300μg的山羊抗-GPC-1用作每次输注的最高剂量。
通过尾部静脉对具有DU-145异种移植物的6只BalbC小鼠给予被Cy5标记的山羊抗-GPC-1。对三只小鼠给予150μg剂量的抗体，并对三只小鼠给予300μg剂量的抗体。
表7.用于耐受性研究的山羊抗-GPC-1剂量的计算.
*安全系数的推荐极限值是100–参见关于估计初期临床试验中用于成年健康志愿者的治疗剂的最大安全起始剂量的行业指导(Guidance for Industry on Estimatingthe Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics inAdult Health Volunteers)
**对于人：小鼠参考关于估计初期临床试验中用于成年健康志愿者的治疗剂的最大安全起始剂量的行业指导pg 7
嵌合MIL-38不结合重组小鼠GPC-1
山羊抗-GPC-1结合重组人和小鼠GPC-1两者
山羊抗-GPC-1可以用作小鼠耐受性研究中的替代品
12.2结果
-靶向
体内成像显示关于山羊抗-GPC抗体的肿瘤积累和长期局部化(超过5天)。这在小鼠2.2和2.3图像(图18A和18B)和MARS图像(图18C)中是尤其明显的。
离体分析(图18B)显示山羊抗-GPC抗体在肿瘤中展现强信号。在所有动物的肠中的一些残余信号表明抗体最可能通过胆管系统被清除。
-安全性和耐受性
在研究期间根据外观、临床征象、无端行为和对外部刺激的反应来评估小鼠(表8)。还监测体重。
基于此项研究中使用的评分表，没有小鼠显示由所用抗体引起的任何显著的健康影响。一只小鼠(小鼠2.3)在注射后显示轻微萎靡，但这是归因于注射期间造成的尾巴轻度灼伤。这只小鼠随后在治疗过程期间得到恢复。
在研究的过程期间观察每只小鼠的最小体重变化。
表8.安全性和耐受性的评估.
总分：
0-4–正常，不需要采取行动
5-10–小心监测，有痛苦迹象
10和更高–严重疼痛的明显迹象，对动物实行安乐死
任何标准中的出现一个3分立即实行安乐死。
-讨论
山羊抗-GPC-1显示与图13B中所见的chMIL-38结果几乎一致的靶向，尤其在120小时时间点时。这表明与其它器官存在有限的结合，暗示GPC-1不在细胞表面上表达或以低水平在细胞表面上表达，同时在任何特定器官中都没有高表达。
山羊抗-GPC-1抗体在两种剂量下都是良好耐受的。
实施例13：使用AM4MIL-38抗体检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗原
诸位发明人所进行的实验确定了用于MIL-38抗体的杂交瘤的原始保藏物(ATCC保藏号HB11785：鼠杂交瘤BLCA-38，后被称为“BLCA-38杂交瘤”)是生产两种不同抗体群体(这里被称为“AM3”和“AM4”)的杂交瘤细胞的混合群体。分离负责生产每种不同抗体群体的杂交瘤细胞，并且“AM4”杂交瘤细胞以保藏号CBA20140026在2014年8月22日保藏在澳大利亚细胞银行(CBA)。
用碳酸盐缓冲液pH 9.5中的MIL-38preps AM3或AM4(1μg/孔)涂布96孔板过夜。在37℃用含有5％脱脂奶的PBS-Tween(0.1％)封闭平板并洗涤。通过添加150mM NaCl，在缓冲液II(20mM HEPES pH 7.5，0.5mM EDTA，0.5％Triton X-100)中稀释抗原(GPC-1NS0)，并在37℃孵育过夜。用生物素化AM4抗体进行检测，随后用抗生物素蛋白HRP(1μg/mL)进行检测。添加TMB(Sigma目录号T0440)并用TMB终止液(Sigma S5814)终止反应。在450nm下读取吸光度。结果显示在图19A中。
在第二实验中，在室温下用PBS pH 7.2中的MIL-38preps 34A(AM3和AM4抗体的混合物)或AM4(2.5μg/孔)涂布96孔板1小时。在37℃用PBS-Tween(0.05％)中的BlockerCasein(Thermo)封闭平板1小时。洗涤后，将抗原(GPC-1NS0)在含有50mM Tricine和150mMNaCl的TBS pH 7.2中稀释，并在37℃孵育1小时。用生物素化AM4克隆1F5进行检测，随后用抗生物素蛋白HRP(1μg/mL)进行检测。添加TMB(Sigma目录号T0440)并用TMB终止液(SigmaS5814)终止反应。在450nm下读取吸光度。结果显示在图19B中。
使用MIL-38显影以上描述的第一ELISA以捕获NS0产生的GPC-1(即MIL-38抗原)。这个实验比较单克隆AM3MIL-38和单克隆AM4MIL-38的捕获。AM3并不用作夹心ELISA分析中的捕获剂，而AM4则显示用作捕获剂(图19A)。
以上描述的第二ELISA比较了当比较MIL-38混合群体(AM3和AM4)时获得的ELISA信号与从单克隆AM4 1F5克隆获得的ELISA信号。使用AM4 1F5作为捕获剂提供了比使用混合34A抗体群体更高的ELISA信号(图19B)。
夹心ELISA结果证实只有单克隆MIL-38抗体的AM4样形式作为捕获试剂才在检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗原方面具有效用，并且含有单克隆群体的捕获剂提供比由混合群体组成的捕获剂更好的ELISA信号。
实施例14：AM4和AM3MIL-38抗体群体的序列分析
材料和方法
-重链和轻链测序(DNA)
进行三个独立的测序操作。第一个操作(代码224945)利用来自混合(AM4和AM3)制剂的双克隆杂交瘤细胞，命名为1-O。第二个操作(代码449295-1)利用来自用于产生AM4的Alfio I杂交瘤储备液的细胞。第三个操作(代码449295-5)利用来自用于产生AM3的AlfioII杂交瘤储备液的细胞。
对于测序操作224945(1-O)和449295-1(Alfio I)，从冷冻杂交瘤细胞提取总RNA并从RNA合成cDNA。然后进行RT-PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)和恒定区，然后将其分别克隆到标准克隆载体中并测序。
遵照Plus RNA Purification System的技术手册从杂交瘤细胞分离总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA。遵照SuperScriptTM III First-Strand SynthesisSystem的技术手册，使用同型特异性反义引物或通用引物将总RNA反转录成cDNA。根据GenScript的RACE的标准操作程序扩增VH、VL、CH和CL的抗体片段。
使用标准分子克隆程序将扩增过的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。
进行菌落PCR筛选以鉴别具有正确大小的插入物的克隆。关于每个抗体片段，对不少于5个具有正确大小的插入物的单菌落测序。
VH和VL质粒编码抗体的全长可变区和CH1和CL的一部分。CH质粒编码CH1的一部分和全长CH2和CH3。CL质粒编码CL的一部分。为了得到全长恒定区或重链/轻链，通过PCR分别扩增由VH和VL质粒编码的那部分恒定区和由CH和CL质粒编码的那部分恒定区，然后使用重叠延长PCR以获得全长DNA。具有正确的VH、VL、CH和CL插入物大小的5个单菌落被送去进行测序。
测序操作449295-5(Alfio II)在获得对应于预期IgG1重链序列的序列时遇到困难。进行两次RNA制备。对于第一批细胞，将oligo-dT引物和CDS III引物用于反转录(RT)。使用IgG1和特异性引物通过PCR扩增VH/CH和并扩增部分小鼠β-肌动蛋白基因作为阳性对照。正常轻链条带容易获得，而在凝胶上只能观察到很弱的VH。具有正确的和插入物大小的5个单菌落被送去进行测序。发现5个不同克隆的和基因是几乎一致的。来自Alfio II杂交瘤的共有轻链序列在以下列出。从8个随机测序的VH阳性克隆获得1个非生产性(unproductive)的重链序列，如以下所示。从10个随机测序的CH阳性克隆(1个IgG1CH、1个IgG2aCH和8个IgG2bCH)获得三类重链恒定区序列。为了避免潜在类别转换的影响，使用IgM特异性引物进行CH扩增，但没有获得目标PCR产物。当使用重链FR1简并引物扩增全长重链(VH-CH)时也不存在目标PCR产物。
由于在一些尝试后无法获得生产性的重链，因此尝试从第2瓶Alfio II细胞分离重链序列。对于第2瓶细胞，最初将oligo-dT引物用于反转录。分别使用IgG1、IgG2b、IgM、IgA特异性引物和IgG简并引物扩增VH，并使用特异性引物扩增获得生产性的轻链和非生产性的重链，这和先前结果是一致的。也尝试了使用随机6聚体(Random 6mers)引物的反转录但没有成功。
总而言之，进行了分离轻链和重链序列的许多尝试。在关于两个细胞批次的不同尝试之后，总是获得一个重排轻链序列。然而，只观察到弱VH目标PCR产物，并且测序并不引起任何一致的重链序列。
结果
-测序(DNA)
样品的分离总RNA在1.5％琼脂糖/GelRedTM凝胶上沿着DNA标记物(标记物III-TIANGEN，目录号：MD103)跑胶。
4微升的每个样品的PCR产物在1.5％琼脂糖/GelRedTM凝胶上沿着DNA标记物(标记物III)跑胶。将PCR产物纯化并储存在-20℃直到进一步使用。
5个不同克隆的VH、VL、CH和CL基因几乎相同。共有序列(SEQ ID NO:1–AM4MIL-38小鼠IgG1重链DNA共有序列；SEQ ID NO:2–AM4MIL-38小鼠κ轻链DNA共有序列)被确定是单克隆杂交瘤群体(AM-4)所产生的抗体的序列。
以上重链和轻链AM4MIL-38共有DNA序列翻译成AM4重链氨基序列(SEQ ID NO:3-AM4MIL-38小鼠IgG1重链氨基酸共有序列)和AM4轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:4-AM4共有MIL-38轻链氨基酸共有序列)。
AM3共有序列
从AM3样Alfio II细胞无法获得一致的重链序列。从测序操作449295-5(AlfioII)获得的轻链序列总是被获得，并且与用于另外两个测序操作的序列相比，在构架区和互补决定区两者上都显示明显差异。
AM3 MIL-38κ轻链DNA共有序列(SEQ ID NO:10)
GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAGTTCATGTCCACATCAATAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGC TGGTTTCAGCAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACGGAGTCACTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGT TTCGGTTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA TAG
*由轻链编码的序列的单独区域用交替的阴影/无阴影文字突出显示。位置：1-72＝前导序列；73-141＝构架区(LFR1)；142-174＝互补决定区(LCDR1)；175-219＝LFR2；220-240＝LCDR2；241-336＝LFR3；337-363＝LCDR3；364-393＝LFR4；394-714＝恒定区(CK)；715-717＝终止密码子
AM3 MIL-38轻链氨基酸共有序列(SEQ ID NO:11)
DIVMTQSQKFMSTSIGDRVSVTC WFQQKPGQSPKALIYGVTDRFTGSGSGTDFTLTINNVQSEDLAEYFCFGSGTKLEIK
轻链氨基酸序列的单独区域像标记的那样被标出：位置1-24＝前导序列；25-47＝构架区(LFR1)；48-58＝互补决定区1(LCDR1)；59-73＝LFR2；74-80＝LCDR2；81-112＝LFR3；113-121＝LCDR3；122-131＝LFR4；132-238＝κ恒定区(CK)和终止密码子(*)
除非另外定义，否则本文中的所有技术和科学术语都具有和本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文中所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是本文中描述优选方法和材料。引用的所有出版物、专利和专利公开都以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。
本文中所讨论的出版物被提供仅仅因为它们在本申请的提交日期之前公开。本文中的任何内容都不应被解释为承认：本发明因为现有发明而无权占先于该公开。
虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应理解本发明能够被进一步修改，并且本申请旨在涵盖本发明的任何变化、使用或改编，所述变化、使用或改编通常遵照本发明的原理并且包括与本公开的此类脱离，同时处在本发明所属领域内的已知或常规实践内，可以应用于上文所示的基本特征，并且落在随附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 美侬米克国际有限公司
<120> 治疗抗体及其用途
<130> P142353C
<160> 11
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 1
atggcttggg tgtggacctt gctattcctg atggctgctg cccaaagtat ccaagcacag 60
atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120
tgcaaggctt ctggttatgc cttcacagac tattcaatga actgggtgaa gcaggctcca 180
ggaaagggtt taaggtggat gggctggata aacactgaga ctggtgagcc aacatataca 240
gatgacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctttttg 300
cagatcaaca acctcagaaa tgaagacacg gctacatatt tctgtgctag acactatgat 360
tacggggggt ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agccaaaacg 420
acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480
accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540
ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600
ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660
gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720
tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780
cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840
agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900
gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960
cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020
gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080
caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140
tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200
ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260
tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320
gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380
aaatga 1386
<210> 2
<211> 705
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 2
atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120
atcacatgtc gagcaagtgg gaatgttcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 180
ggaaaatctc ctcaactcct ggtctatact gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 240
aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaatag cctgcagcct 300
gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggagta atccgtggac gttcggtgga 360
ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
<210> 3
<211> 461
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 3
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Arg Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg His Tyr Asp Tyr Gly Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
130 135 140
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
145 150 155 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
210 215 220
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
225 230 235 240
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
275 280 285
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
305 310 315 320
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
325 330 335
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
355 360 365
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
370 375 380
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
405 410 415
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
420 425 430
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
435 440 445
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 4
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn
35 40 45
Val His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Thr Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Ser Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230
<210> 5
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/智人嵌合序列
<400> 5
atggcttggg tgtggacact gctgttcctg atggctgctg cccagagtat tcaggctcag 60
attcagctgg tccagagcgg tcccgagctg aagaagccag gcgagaccgt gaagatctcc 120
tgcaaggcca gcggctacgc tttcacagac tattctatga actgggtgaa gcaggcccca 180
ggcaagggcc tgaggtggat gggctggatc aataccgaga caggcgagcc cacctacaca 240
gacgatttca agggccggtt cgctttttcc ctggagacct ctgcctccac agcttttctg 300
cagatcaaca atctgagaaa cgaggacacc gccacatact tctgcgctag gcactacgat 360
tatggcggct ttccttattg gggccagggc accctggtga cagtgtccag cgcctctacc 420
aagggcccat ccgtgtttcc actggctccc tcttccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480
gctctgggct gtctggtgaa ggattacttc ccagagcccg tgacagtgtc ttggaactcc 540
ggcgccctga cctccggagt gcatacattt cccgctgtgc tgcagagctc tggcctgtac 600
agcctgtcca gcgtggtgac cgtgccttct tccagcctgg gcacccagac atatatctgc 660
aacgtgaatc acaagccatc caatacaaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgt 720
gataagaccc atacatgccc cccttgtcct gctccagagc tgctgggagg acctagcgtg 780
ttcctgtttc cacccaagcc taaggacacc ctgatgatct ctaggacccc cgaggtgaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggat cctgaggtga agttcaactg gtacgtggat 900
ggcgtggagg tgcataatgc taagaccaag cctagggagg agcagtacaa cagcacctat 960
cgggtggtgt ctgtgctgac agtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtataag 1020
tgcaaggtga gcaataaggc cctgcccgct cctatcgaga agaccatctc taaggccaag 1080
ggccagcctc gggagccaca ggtgtacaca ctgcctccaa gcagagacga gctgaccaag 1140
aaccaggtgt ctctgacatg tctggtgaag ggcttctatc cttctgatat cgctgtggag 1200
tgggagtcca atggccagcc agagaacaat tacaagacca caccccctgt gctggacagc 1260
gatggctctt tctttctgta ttccaagctg accgtggata agagcaggtg gcagcagggc 1320
aacgtgttct cctgtagcgt gatgcacgag gcactgcaca accactacac tcagaaatcc 1380
ctgtccctgt cacctggcaa atga 1404
<210> 6
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/智人嵌合序列
<400> 6
atgagcgtgc tgacccaggt gctggccctg ctgctgctgt ggctgaccgg agcccgttgc 60
gacatccaga tgacccagtc ccctgcctct ctgtccgcca gcgtgggcga gaccgtgaca 120
atcacctgca gagcctctgg caacgtgcac aattacctgg cttggtatca gcagaagcag 180
ggcaagtccc cacagctgct ggtgtacaca gccaagaccc tggctgacgg cgtgcccagc 240
aggttctctg gctccggcag cggcacacag tatagcctga agatcaactc tctgcagcct 300
gaggattttg gcacctacta ttgccagcat ttctggtcta atccatggac atttggcggc 360
ggcaccaagc tggagatcaa gaggacagtg gccgctccct ccgtgttcat ctttccccct 420
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cctcgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctc tgcagtctgg caattcccag 540
gagagcgtga cagagcagga ctctaaggat tccacctata gcctgtccag cacactgacc 600
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtatgctt gtgaggtcac tcaccagggg 660
ctgtcaagtc cagtcacaaa gtccttcaat aggggggaat gctga 705
<210> 7
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/智人嵌合序列
<400> 7
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Arg Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg His Tyr Asp Tyr Gly Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 8
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/智人嵌合序列
<400> 8
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn
35 40 45
Val His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Thr Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Ser Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 9
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠/智人嵌合序列
<400> 9
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
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Thr Asp Tyr Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
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Arg Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
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Tyr Phe Cys Ala Arg His Tyr Asp Tyr Gly Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
145 150 155 160
Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg
165 170 175
Ala Ser Gly Asn Val His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln
180 185 190
Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Thr Ala Lys Thr Leu Ala Asp
195 200 205
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser
210 215 220
Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Gln His Phe Trp Ser Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
245 250 255
Glu Ile Lys His His His His His His Cys
260 265
<210> 10
<211> 717
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 10
atgggcatca agatggagtc acagactcag gtctttgtat acatgttgct gtggttgtct 60
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gacagggtca gcgtcacctg caaggccagt cagaatgtgg gttctcatgt agcctggttt 180
cagcagaaac cagggcaatc tcctaaagca ctgatttact cggcatccta ccggtacagc 240
ggagtcactg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcaac 300
aatgtgcagt ctgaagactt ggcagagtat ttctgtcagc aatataacag ttttccattc 360
acgttcggtt cggggacaaa gttggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480
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aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600
agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660
actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
<210> 11
<211> 238
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 11
Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu
1 5 10 15
Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln
20 25 30
Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys
35 40 45
Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser His Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
65 70 75 80
Gly Val Thr Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235

Claims (30)

1.一种用于治疗受试对象的前列腺癌、膀胱癌和/或胰腺癌的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗-GPC1)抗体和/或其抗原结合片段的医药制剂，其中所述抗体和/或片段缀合于对所述受试对象的前列腺癌细胞、膀胱癌细胞和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述医药制剂不包含具有如下轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:11的位置48-58所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:11的位置48-58所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:11的位置74-80所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:11的位置74-80所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:11的位置113-121所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:11的位置113-121所定义的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细胞毒性剂是被设计成在摄取入所述前列腺癌细胞、膀胱癌细胞和/或胰腺癌细胞的内体或溶酶体中时被激活的前药。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述前药通过以下连接子缀合于所述抗体和/或其抗原结合片段：
在小于pH 7.2、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0、pH 4.5或pH 4的pH下容易裂解的酸敏感连接子，
酶裂解型连接子，其中能够裂解所述连接子的酶存在于所述内体或溶酶体内。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：
(a)重链可变区，包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:3的位置50-54所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:3的位置50-54所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:3的位置69-85所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:3的位置69-85所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:3的位置118-126所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:3的位置118-126所定义的氨基酸序列组成；和
(b)轻链可变区，包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:4的位置44-54所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:4的位置44-54所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:4的位置70-76所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:4的位置70-76所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:4的位置109-117所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:4的位置109-117所定义的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体通过以保藏号CBA20140026保藏在澳大利亚细胞银行的杂交瘤细胞或其子代产生。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述抗体是：
(i)人源化抗-GPC1抗体，
(ii)嵌合抗-GPC1抗体，
(v)人抗-GPC1抗体，
(vi)单克隆抗-GPC1抗体，
(vii)多聚体抗-GPC1抗体，或
(viii)合成抗-GPC1抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗体是嵌合抗体，其包含：
(a)重链恒定区，包含如SEQ ID NO:7的残基138-467中所定义的氨基酸序列或由如SEQID NO:7的残基138-467中所定义的氨基酸序列组成；和
(b)轻链恒定区，包含如SEQ ID NO:8的残基128-234中所定义的氨基酸序列或由如SEQID NO:8的残基128-234中所定义的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述其抗原结合片段是：单链可变片段(scFv)、可变结构域(Fv)片段、片段抗原结合(Fab)片段、F(ab)2片段、肽、或含有表位结合区的蛋白水解片段。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述其抗原结合片段是：包含如SEQ ID NO:9中所定义的序列的单链可变片段(scFv)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：肾上腺皮质抑制剂、烷化剂、烷基磺酸盐、蒽环类药物、抗血管生成剂、抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、澳瑞他汀、卡奇霉素、喜树碱、COX-2抑制剂、酶抑制剂、表鬼臼毒素、乙烯亚胺衍生物、叶酸类似物、HDAC抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、激素拮抗剂、美登素、甲基肼衍生物、mTOR抑制剂、氮芥、亚硝基脲、铂配位络合物、促凋亡剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、放射性同位素、取代脲、紫杉烷、三氮烯、微管蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和长春花生物碱。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：阿法替尼、阿普立定、阿那曲唑、蒽环类药物、AVL-101、AVL-291、阿西替尼、阿扎立平、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、camptothecans、卡铂、卡奇霉素、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、COX-2抑制剂、克唑替尼、氰基吗啉代阿霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、达沙替尼、柔红霉素、dinaciclib、3’,5’-0-二油酰基-FudR(FUdR-d0)、DM1、DM3、DM4、多西他赛、阿霉素、葡萄糖醛酸阿霉素、倍癌霉素、内皮抑素、恩替诺特、表鬼臼毒素、葡萄糖醛酸表柔比星、埃罗替尼、雌莫司汀、雌激素受体结合剂、葡萄糖醛酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷(VP16)、依西美坦、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、芬戈莫德、夫拉平度、氟尿苷(FUdR)、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟他胺、fostamatinib、ganetespib、GDC-0834、吉非替尼、吉西他滨、GS-1101、10-羟基喜树碱、羟基脲、依鲁替尼、去甲氧基柔红霉素、艾代拉里斯、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康(CPT-11)、拉帕替尼、来那度胺、醛氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、林可霉素、2-PDox前药(pro-2-PDox)、甲基苄肼、PSI-341、2-吡咯啉代阿霉素(2-PDox)、雷洛昔芬、司莫司汀、SN-38、索拉非尼、链佐星、SU1 1248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康、反式铂、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼、长春花碱、长春花生物碱、长春新碱、长春瑞滨和ZD1839。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是放射性同位素。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述放射性同位素选自由以下组成的组：90Y、188Re、166Ho、165Dy、109Pd、111Ag、186Re、198Au、153Sm、64Cu、177Lu、131I、125I、67Cu、175Yb、166Dy、169Er、212Bi、213Bi、225Ac、212Pb、66Ga、67Ga、68Ga、64Cu、86Y、94mTc和89Zr。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂和所述抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的螯合剂缀合：DOTA、DTPA、NOTA、NODAGA、MeCOSAR、TETA、TRAP、TE2A、CBTE2A。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述受试对象是哺乳动物受试对象或人受试对象。
17.一种分离的抗体群体，包含：
第一抗体和/或其抗原结合片段，缀合于对前列腺癌细胞、膀胱癌细胞和/或胰腺癌细胞有毒性的至少一种细胞毒性剂，其中所述第一抗体包含：
(a)重链可变区，包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:3的位置50-54所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:3的位置50-54所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:3的位置69-85所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:3的位置69-85所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:3的位置118-126所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:3的位置118-126所定义的氨基酸序列组成；和
(b)轻链可变区，包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:4的位置44-54所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:4的位置44-54所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:4的位置70-76所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:4的位置70-76所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:4的位置109-117所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:4的位置109-117所定义的氨基酸序列组成；
并且其中所述抗体群体不含这样的第二抗体，所述第二抗体的轻链可变区包含：
互补决定区1(CDR1)，包含SEQ ID NO:11的位置48-58所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:11的位置48-58所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包含SEQ ID NO:11的位置74-80所定义的氨基酸序列或由SEQ IDNO:11的位置74-80所定义的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包含SEQ ID NO:11的位置113-121所定义的氨基酸序列或由SEQID NO:11的位置113-121所定义的氨基酸序列组成。
18.根据权利要求17所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多聚体抗体和/或合成抗体中的任何一种或多种。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的抗体群体，其中所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)、可变结构域(Fv)片段、片段抗原结合(Fab)片段、F(ab)2片段、肽、或含有表位结合区的蛋白水解片段中的任何一种或多种。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的抗体群体，其中所述第一抗体包含SEQ IDNO:3的位置20-461所定义的重链序列和SEQ ID NO:4的位置21-234所定义的轻链序列或由SEQ ID NO:3的位置20-461所定义的重链序列和SEQ ID NO:4的位置21-234所定义的轻链序列组成。
21.根据权利要求18所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段是嵌合的。
22.根据权利要求18所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段是嵌合抗体，包含：
(a)重链恒定区，包含如SEQ ID NO:7的残基138-467中所定义的氨基酸序列或由如SEQID NO:7的残基138-467中所定义的氨基酸序列组成；和
(b)轻链恒定区，包含如SEQ ID NO:8的残基128-234中所定义的氨基酸序列或由如SEQID NO:8的残基128-234中所定义的氨基酸序列组成。
23.根据权利要求19所述的抗体群体，其中所述抗原结合片段是包含如SEQ ID NO:9中所定义的序列的单链可变片段(scFv)。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的抗体群体，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：肾上腺皮质抑制剂、烷化剂、烷基磺酸盐、蒽环类药物、抗血管生成剂、抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、澳瑞他汀、卡奇霉素、喜树碱、COX-2抑制剂、酶抑制剂、表鬼臼毒素、乙烯亚胺衍生物、叶酸类似物、HDAC抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、激素拮抗剂、美登素、甲基肼衍生物、mTOR抑制剂、氮芥、亚硝基脲、铂配位络合物、促凋亡剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、放射性同位素、取代脲、紫杉烷、三氮烯、微管蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和长春花生物碱。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的抗体群体，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的组：阿法替尼、阿普立定、阿那曲唑、蒽环类药物、AVL-101、AVL-291、阿西替尼、阿扎立平、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、camptothecans、卡铂、卡奇霉素、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、COX-2抑制剂、克唑替尼、氰基吗啉代阿霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、达沙替尼、柔红霉素、dinaciclib、3’,5’-0-二油酰基-FudR(FUdR-d0)、DM1、DM3、DM4、多西他赛、阿霉素、葡萄糖醛酸阿霉素、倍癌霉素、内皮抑素、恩替诺特、表鬼臼毒素、葡萄糖醛酸表柔比星、埃罗替尼、雌莫司汀、雌激素受体结合剂、葡萄糖醛酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、依托泊苷(VP16)、依西美坦、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、芬戈莫德、夫拉平度、氟尿苷(FUdR)、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟他胺、fostamatinib、ganetespib、GDC-0834、吉非替尼、吉西他滨、GS-1101、10-羟基喜树碱、羟基脲、依鲁替尼、去甲氧基柔红霉素、艾代拉里斯、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康(CPT-11)、拉帕替尼、来那度胺、醛氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、林可霉素、2-PDox前药(pro-2-PDox)、甲基苄肼、PSI-341、2-吡咯啉代阿霉素(2-PDox)、雷洛昔芬、司莫司汀、SN-38、索拉非尼、链佐星、SU1 1248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康、反式铂、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼、长春花碱、长春花生物碱、长春新碱、长春瑞滨和ZD 1839。
26.根据权利要求17至25中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是放射性同位素。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述放射性同位素选自由以下组成的组：90Y、188Re、166Ho、165Dy、109Pd、111Ag、186Re、198Au、153Sm、64Cu、177Lu、131I、125I、67Cu、175Yb、166Dy、169Er、212Bi、213Bi、225Ac、212Pb、66Ga、67Ga、68Ga、64Cu、86Y、94mTc和89Zr。
28.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性剂和所述抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的螯合剂缀合：DOTA、DTPA、NOTA、NODAGA、MeCOSAR、TETA、TRAP、TE2A和CBTE2A。
29.根据权利要求17至28中任一项所述的抗体群体，其中所述细胞毒性剂是被设计成在摄取入所述前列腺癌细胞、膀胱癌细胞和/或胰腺癌细胞的内体或溶酶体中时被激活的前药。
30.根据权利要求29所述的抗体群体，其中所述前药通过以下连接子缀合于所述抗体和/或其抗原结合片段：
在小于pH 7.2、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5、pH 5.0、pH 4.5或pH 4的pH下容易裂解的酸敏感连接子；或
酶裂解型连接子，其中能够裂解所述连接子的酶存在于所述内体或溶酶体内。
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