CN107531755B

CN107531755B - 磷脂酰肌醇蛋白聚糖表位及其用途

Info

Publication number: CN107531755B
Application number: CN201580076839.6A
Authority: CN
Inventors: D·坎贝尔; I·胡斯蒂尼亚诺·富恩马约尔; A·诺康; J·苏恩; Q·张; B·沃尔什; S·维斯米勒
Original assignee: Minomic International Ltd
Current assignee: Minomic International Ltd
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2035-01-16
Also published as: EP3245219A1; EP3245219B1; US20180002391A1; DK3245219T3; JP6735005B2; WO2016112423A1; ES2805085T3; KR102435383B1; CA2973771A1; AU2015376851A1; SG11201705808XA; JP2018504903A; CN107531755A; AU2015376851B2; EP3245219A4; KR20170109584A; US20210107958A1

Abstract

本发明涉及磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑1(GPC‑1)的表位及其用途。

Description

磷脂酰肌醇蛋白聚糖表位及其用途

技术领域

本发明总体上涉及免疫学和医学领域。更具体地说，本发明涉及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)的表位及其用途。

发明背景

前列腺癌是所有种族男性中最常发生的癌症，并且在白人、黑人、美洲印第安人/阿拉斯加本地人和西班牙裔男性中在死亡率上仅次于肺癌。在2011年，在美国209,292的男性被诊断患有前列腺癌并且他们中27,970由此疾病死亡(U.S.Cancer StatisticsWorking Group,“United States Cancer Statistics:1999-2011Incidence andMortality Web-based Report”,Atlanta(GA):Department of Health and HumanServices,Centers for Disease Control and Prevention,and National CancerInstitute；2014[美国癌症统计工作组“美国癌症统计：1999-2011年，基于发病率和死亡率网的报道”，亚特兰大(GA)：健康与人类服务部门，疾病控制和预防中心，和国家癌症学会2014])。

如果早期症断出前列腺癌，则在很多患者中用手术和/或放射性疗法治疗是成功的。然而，许多患有晚期疾病的患者和所有前列腺癌患者的相当大的比例在局部治疗后最终发展为转移性疾病。

因此，对于用于诊断前列腺癌的方便、可靠和精确的检测，存在需要，尤其是在疾病的早期阶段。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)是具有核心蛋白的细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖，该核心蛋白经由糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞质膜上。它是磷脂酰肌醇蛋白聚糖的更大家族的成员。据报道，GPC-1在一些形式的癌症(例如胰腺癌、乳腺癌)中过度表达，但是表达在其他癌症中并没有显著不同。诸位发明人最近已经确定了GPC-1由前列腺癌细胞过度表达，并可以作为诊断疾病的手段使用(美国临时专利申请号61/928/776，标题为“CellSurface Prostate Cancer Antigen for Diagnosis”[“用于诊断的细胞表面前列腺癌抗原”]，Walsh等人-未公开；PCT申请号PCT/AU 2014/000999“Monoclonal ANTI-GPC-1antibodies and uses thereof”[“单克隆抗-GPC-1抗体及其用途”]，Walsh等人-未公开)。

鉴于由本发明的诸位发明人确定的GPC-1水平与前列腺癌之间的关联，对于鉴定在GPC-1内的表位，存在需要，这些表位有利于在经受诊断和/或预后测试的人中检测和定量GPC-1水平。

发明内容

诸位发明人已经确定了在GPC-1蛋白内的一系列表位优选地通过结合实体(包括但不限于抗体)被靶向。

因此，本发明涉及至少以下实施例：

实施例1：一种用于抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC-1)抗体的表位，位于由氨基酸序列KVNPQGPGPEEK(SEQ ID NO:1)定义的一部分GPC-1柔性环内。

实施例2：根据实施例1所述的表位，其中该表位包含第一区段，该第一区段包含选自以下项的氨基酸序列：

(i)VNPQGPGPEEK(SEQ ID NO:2)；或

(ii)VNPQGPGPEEK(SEQ ID NO:2)的变体，其中该变体包含仅在以下位置处的取代的氨基酸残基：

位置2、3、7、8、9、10和/或11中的任一个或多个；或者

位置1、2、3、4、6、8、10和/或11中的任一个或多个；或者

位置1、2、3、4、5、8、10和/或11中的任一个或多个。

实施例3：根据实施例1所述的表位，其中该表位包含第一区段，该第一区段包含选自以下项的氨基酸序列：

(i)KVNPQGPGP(SEQ ID NO:6)；或

(ii)KVNPQGPGP(SEQ ID NO:6)的变体，该变体包含仅在SEQ ID NO:6的位置1、3、4、8和9中的任一个或多个处的取代的氨基酸残基。

实施例4：根据实施例3所述的变体，该变体包含仅在SEQ ID NO:6的位置8和9中的任一个或多个处的取代的氨基酸残基。

实施例5：根据实施例1所述的表位，其中该表位包含第一区段，该第一区段包含选自以下项的氨基酸序列：

(i)KVNPQGPGPE(SEQ ID NO:5)；或

(ii)KVNPQGPGPE(SEQ ID NO:5)的变体，该变体包含仅在SEQ ID NO:5的位置1、3、4、8、9和10中的任一个或多个处的取代的氨基酸残基。

实施例6：根据实施例5所述的变体，该变体包含仅在SEQ ID NO:6的位置8、9和10中的任一个或多个处的取代的氨基酸残基。

实施例7：根据实施例5或实施例6所述的变体，其中在位置10的E(glu)被任何其他氨基酸取代。

实施例8：根据实施例3至7中任一项所述的变体，其中该变体包含仅在以下位置中的任一个或多个处的取代：

位置1，其中K(lys)被W(trp)、R(arg)、L(lys)、Y(tyr)或F(phe)中的任一个取代；

位置3，其中N(asn)被H(his)、P(pro)或D(asp)中的任一个取代；

位置4，其中P(pro)被R(arg)、K(lys)、W(trp)、S(ser)、H(his)或N(asn)中的任一个取代；

位置8，其中G(gly)被D(asp)、E(glu)、N(asn)、Q(gln)、K(lys)、R(arg)或A(ala)中的任一个取代；

位置9，其中P(pro)被M(met)、A(ala)、I(ile)、K(lys)、R(arg)、Q(gln)、S(ser)、T(thr)或Y(tyr)中的任一个取代。

实施例9：根据实施例1至8中任一项所述的表位，该表位包含第二区段，该第二区段包含氨基酸序列TQNARA(SEQ ID NO:8)。

实施例10：根据实施例1至8中任一项所述的表位，该表位包含第二区段，该第二区段包含氨基酸序列TQNARAFRD(SEQ ID NO:7)。

实施例11：根据实施例1或实施例2所述的表位，其中该表位包含第一区段，该第一区段包含选自以下项的氨基酸序列：

(i)NPQGPGPEE(SEQ ID NO:4)；或

(ii)NPQGPGPEE(SEQ ID NO:4)的变体，其中该变体包含仅在SEQ ID NO:4的位置1、2、3、5、7和9中的任一个或多个处的取代的氨基酸残基。

实施例12：根据实施例11所述的变体，该变体包含仅在SEQ ID NO:4的位置2、7和9中的任一个或多个处的取代的氨基酸残基。

实施例13：根据实施例11或实施例12所述的变体，其中该变体包含在以下位置中的任一个或多个处的取代：

位置1，其中N(asn)被H(his)取代；

位置2，其中P(pro)被任何其他氨基酸取代；

位置3，其中Q(gln)被N(asn)、M(met)、T(thr)、S(ser)或R(arg)中的任一个取代；

位置5，其中P(pro)被A(ala)取代；

位置7，其中P(pro)被A(ala)、D(asp)、C(cys)、E(glu)、Z(glx)、G(gly)、H(his)、K(lys)、M(met)、F(phe)、P(pro)、S(ser)、T(thr)、W(trp)或Y(tyr)中的任一个取代；

位置9，其中E(glu)被任何其他氨基酸取代。

实施例14：根据实施例11至13中任一项所述的表位，其中该表位包含第二区段，该第二区段包含氨基酸序列ALSTASDDR(SEQ ID NO:9)。

实施例15：根据实施例1或实施例2所述的表位，其中该表位包含第一区段，该第一区段包含选自以下项的氨基酸序列：

(i)VNPQGPGPEE(SEQ ID NO:3)；或

(ii)VNPQGPGPEE(SEQ ID NO:3)的变体，其中该变体包含仅在SEQ ID NO:3的位置1、2、3、4、5、8和10中的任一个或多个处的取代的氨基酸残基。

实施例16：根据实施例15所述的变体，该变体包含仅在SEQ ID NO:3的位置1、2、3和8中的任一个或多个处的取代的氨基酸残基。

实施例17：根据实施例15或实施例16所述的变体，其中该变体包含在以下位置中的任一个或多个处的取代：

位置1，其中V(val)被任何其他氨基酸取代；

位置2，其中N(asn)被任何其他氨基酸取代；

位置3，其中P(pro)被任何其他氨基酸取代；

位置4，其中Q(gln)被Y(tyr)、A(ala)、E(glu)、V(val)、M(met)、F(phe)、L(leu)、I(ile)、T(thr)或R(arg)中的任一个取代；

位置5，其中G(gly)被A(ala)、S(ser)、T(thr)、H(his)、W(trp)、Y(tyr)、F(phe)或M(met)取代；

位置8，其中P(pro)被任何其他氨基酸取代；

位置10，其中E(glu)被Q(gln)、D(asp)、F(phe)、H(his)或M(met)取代。

实施例18：根据实施例15至17中任一项所述的表位，其中该表位包含第二区段，该第二区段包含：

氨基酸序列PRERPP(SEQ ID NO:10)或

氨基酸序列QDASDDGSGS(SEQ ID NO:11)。

实施例19：根据实施例15至17中任一项所述的表位，其中该表位包含第二区段(该第二区段包含氨基酸序列PRERPP(SEQ ID NO:10))和第三区段(该第三区段包含氨基酸序列QDASDDGSGS(SEQ ID NO:11))。

实施例20：根据实施例1至10中任一项所述的表位，该表位包含氨基酸序列CGELYTQNARAFRDLCGNPKVNPQGPGPEEKRRRGC(SEQ ID NO:12)。

实施例21：根据实施例1至20中任一项所述的表位，其中是线性表位。

实施例22：根据实施例19所述的表位，其中该表位的第二区段和第三区段是不连续的。

实施例23：根据实施例9、10、14、18或22中任一项所述的表位，其中该表位的第一区段和第二区段是不连续的。

实施例24：用于抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC-1)抗体的表位，该表位包含选自以下项中的任一个或多个的氨基酸序列：TQNARA(SEQ ID NO:8)、ALSTASDDR(SEQ ID NO:9)、PRERPP(SEQ ID NO:10)、QDASDDGSGS(SEQ ID NO:11)、LGPECSRAVMK(SEQ ID NO:13)和TQNARAFRD(SEQ ID NO:7)。

实施例25：根据实施例1至24中任一项所述的表位，其中该表位是分离的多肽或合成的多肽。

实施例26：包含两个或更多个不同表位的组合的表位的排列，其中

每个所述不同表位是根据实施例1至25中任一项所述的表位；

每个所述表位是根据表1所述的表位；或者

表位的组合是在表3中所列组合中的任一个或多个。

实施例27：一种表位的排列，该排列包含两个或更多个不同表位的组合，其中该排列包含

根据实施例1至10中任一项所述的第一表位，以及

根据实施例11至14中任一项所述的第二表位。

实施例28：一种表位的排列，该排列包含两个或更多个不同表位的组合，其中该排列包含

根据实施例1至10中任一项所述的第一表位，以及

根据实施例15至19中任一项所述的第二表位。

实施例29：一种组合物，该组合物包括根据实施例1至25中任一项所述的表位、或者实施例26至28中任一项所述的表位的排列、以及药学上可接收的运载体或赋形剂。

实施例30：一种组件，该组件包含根据实施例1至25中任一项所述的表位、或者根据实施例26至28中任一项所述的表位的排列，该组件结合至一个或多个可溶的或不可溶的支持物上。

实施例31：实施例30所述的组件，其中该组件是酶联免疫吸附测定(ELISA)的组分。

实施例32：一种核酸，该核酸编码根据实施例1至25中任一项所述的表位。

实施例33：一种载体，该载体包含根据实施例32所述的核酸。

实施例34：一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据实施例33所述的载体。

实施例35：一种分离的结合实体，该分离的结合实体能够特异性结合根据实施例1至25中任一项所述的表位，其中该结合实体不是抗体。

实施例36：一种分离的结合实体，该分离的结合实体能够特异性结合根据实施例1至25中任一项所述的表位，其中该结合实体是抗体并且其条件是该抗体不是：MIL38抗体(CBA20140026)、兔抗GPC-1多克隆抗体(ab137604，艾博抗公司(abcam))、小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖单克隆抗体2600克隆4D1(密理博公司(Millipore))或山羊抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1抗体(AA 24-530)。

实施例37：用于在受试者中检测前列腺癌的方法，该方法包括从该受试者获得生物样品、在该样品中检测根据实施例1至25中任一项所述的表位的存在、以及基于在该样品中检测到的该表位的量，确定该受试者是否患有前列腺癌或具有发展前列腺癌的增加的可能。

该生物样品可以是体液样品。

该生物样品可以是组织样品。

实施例38：根据实施例37所述的方法，其中检测该样品中表位的存在包括将该样品与结合实体接触，该结合实体能够特异性结合根据实施例1至25中任一项所述的表位。

实施例39：根据实施例38所述的方法，其中该结合实体是一群的抗体。

实施例40：根据实施例39所述的方法，其中该群的抗体包括以下项中的任一个或多个：MIL38抗体(CBA20140026)、兔抗GPC-1多克隆抗体(ab137604，艾博抗公司(abcam))、小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖单克隆抗体2600克隆4D1(密理博公司(Millipore))或山羊抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1抗体(AA 24-530)。

实施例41：根据实施例39所述的方法，其中该群的抗体不包含以下项中的任一个：MIL38抗体(CBA20140026)、兔抗GPC-1多克隆抗体(ab137604，艾博抗公司(abcam))、小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖单克隆抗体2600克隆4D1(密理博公司(Millipore))或山羊抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1抗体(AA 24-530)。

实施例42：根据实施例37至41中任一项所述的方法，该方法包括将存在于该生物样品中表位的量与存在于对照样品中表位的量进行比较，其中将体液样品中表位的增加的量的检测与对照样品中的同等测量进行比较，指示该受试者中的前列腺癌或该受试者中发展前列腺癌的增加的可能。

实施例43：根据实施例42所述的方法，其中在该样品中检测到的表位的量比对照样品中检测到的表位的量增加了超过50％。

实施例44：根据实施例37至43中任一项所述的方法，其中检测该表位的存在包括使该样品与保藏在澳大利亚细胞库(Cellbank Australia)中在登录号CBA20140026下的MIL38抗体的群接触。

实施例45：根据实施例37至43中任一项所述的方法，其中检测该表位的存在包括将该样品与一群的抗体接触，该群的抗体不包括包含轻链可变区的抗体，该轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:20的位置48-58定义的氨基酸序列或由其组成的互补决定区1(CDR1)；包含SEQ ID NO:20的位置74-80定义的氨基酸序列或由其组成的互补决定区2(CDR2)；和/或包含SEQ ID NO:20的位置113-121定义的氨基酸序列或由其组成的互补决定区3(CDR3)。

实施例46：根据实施例37至45中任一项所述的方法，该方法进一步包括确定该生物样品中前列腺特异性抗原(PSA)的水平，并将该检测的水平与对照样品中的水平进行比较。

实施例47：根据实施例37至46中任一项所述的方法，其中该生物样品是体液样品。

实施例48：根据实施例37至46中任一项所述的方法，其中该生物样品是组织样品。

实施例49：一种融合蛋白，该融合蛋白包含根据实施例1至25中任一项所述的表位。

实施例50：根据实施例1至25中任一项所述的表位、根据实施例26至28中任一项所述的表位的排列、或者根据实施例48的融合蛋白的用途，作为用于检测GPC-1的方法中的阳性对照元素。

实施例51：根据实施例50的用途，其中该方法是根据实施例37至48中任一项所述的用于检测前列腺癌的方法。

当用于检测方法或检测测定中时，阳性对照元素可以直接或间接提供阳性的/肯定的信号，并且从而至少部分地或完全验证该方法或测定能够正确工作。

附图说明

现在将仅通过实例的方式并参考附图描述本发明的优选的实施例，其中：

图1示出蛋白质数据库标识符(PBD ID)4AD7中存在的链B的透视图(http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/4AD7)；

图2示出MIL38-AM4抗体筛选的原始数据的框图。框的底部和顶部是数据的第25和第75百分位数。框中间附近的带是第50百分位数(中位数)。须线在四分位数范围内为1.5，表明数据集内的统计学离群值(Mcgill等人，The American Statistician,32:12-16,1978[美国统计学家，32:12-16，1978])；

图3示出，当用1μg/ml(顶部痕迹)或10μg/ml的MIL38-AM4(底部痕迹)孵育时，肽数相对于所有五个阵列(组1-5，实例1)获得的记录强度的图；

图4示出来自蛋白质数据库标识符(PBD ID)4AD7的链B(http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/4AD7)与以深阴影球的序列TQNARAFRDLYS(SEQ ID NO:21)，以及以浅阴影球的残基K347、V348、G362和K363的透视图。将V348连接到G362的环没有从X射线衍射中解析出来；

图5示出多克隆和单克隆抗GPC-1和MIL38-AM3抗体筛选的原始数据的框图。框的底部和顶部是数据的第25和第75百分位数。框中间附近的带是第50百分位数(中位数)。须线在四分位数范围内为1.5，表明数据集内的统计学离群值(Mcgill等人，The AmericanStatistician,32:12-16,1978[美国统计学家，32:12-16，1978])；

图6示出肽数相对于在用于映射MIL38-AM4的阵列上测试的针对三种可商购的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1制剂获得的记录强度的图，其示出用于比较；

图7示出来自蛋白质数据库标识符(PBD ID)的链B的透视图(http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/4AD7)。图7A示出链B与以浅阴影球的序列PRERPP(SEQ ID NO:10)，以及以深阴影球的残基K347、V348、G362和K363的透视图。将V348连接到G362的环没有从X射线衍射中解析出来；这些表位通过兔抗GPC-1识别。额外的表位(QDASDDGSGS(SEQ ID NO:11))未在坐标文件中解析。图7B示出链B与以阴影球的序列LGPECSRAVMK(SEQ ID NO:13)的透视图。此表位由小鼠抗GPC-1识别；图8示出抗体筛选的原始数据的框图。框的底部和顶部是数据的第25和第75百分位数。框中间附近的带是第50百分位数(中位数)。须线在四分位数范围内为1.5，表明数据集内的统计学离群值(Mcgill等人，The AmericanStatistician,32:12-16,1978[美国统计学家，32:12-16，1978])；

图9示出在组3的取代分析上探测的兔多克隆Ab 137604的字母图表示。中央/水平条表示针对基本序列记录的平均强度。在对应于突变的位置的列中绘出单个突变，并且在对应于记录强度的高度处绘制符号；

图10示出在组2的取代分析(实例3)上探测的山羊多克隆抗GPC-1的字母图表示；

图11示出在组3的取代分析(实例3)上探测的MIL 38-AM4的字母图表示；

图12示出针对在组1的肽(实例3)上探测的MIL38-AM4获得的数据的热点图表示。信号强度从黑色(基线)到白色(平均)到灰色(最大)；‘X’＝x轴；列X1-X33中描绘的x轴肽序列如下：X-1肽是SEQ ID NO:1的残基344-353；X-2肽是SEQ ID NO:1的残基348-357；X-3肽是SEQ ID NO:1的残基352-361；X-4肽是SEQ ID NO:1的残基356-365；X-5肽是SEQ ID NO:1的残基344-354；X-6肽是SEQ ID NO:1的残基348-358；X-7肽是SEQ ID NO:1的残基352-362；X-8肽是SEQ ID NO:1的残基356-366；X-9肽是SEQ ID NO:1的残基344-355；X-10肽是SEQ ID NO:1的残基348-359；X-11肽是SEQ ID NO:1的残基352-363；X-12肽是SEQ ID NO:1的残基344-356；X-13肽是SEQ ID NO:1的残基348-360；X-14肽是SEQ ID NO:1的残基352-364；X-15肽是SEQ ID NO:1的残基344-357；X-16肽是SEQ ID NO:1的残基348-361；X-17肽是SEQ ID NO:1的残基352-365；X-18肽是SEQ ID NO:1的残基344-358；X-19肽是SEQ IDNO:1的残基348-362；X-20肽是SEQ ID NO:1的残基352-366；X-21肽是SEQ ID NO:1的残基344-359；X-22肽是SEQ ID NO:1的残基348-363；X-23肽是SEQ ID NO:1的残基344-360；X-24肽是SEQ ID NO:1的残基348-364；X-25肽是SEQ ID NO:1的残基344-361；X-26肽是SEQID NO:1的残基348-365；X-27肽是SEQ ID NO:1的残基344-362；X-28肽是SEQ ID NO:1的残基348-366；X-29肽是SEQ ID NO:1的残基344-363；X-30肽是SEQ ID NO:1的残基344-364；X-31肽是SEQ ID NO:1的残基344-365；X-32肽是SEQ ID NO:1的残基344-366；X-33肽是置乱/随机序列；‘Y’＝y轴；列Y1-Y19中描绘的y轴肽序列如下：Y-1肽是SEQ ID NO:1的残基131-140；Y-2肽是SEQ ID NO:1的残基135-144；Y-3肽是SEQ ID NO:1的残基139-148；Y-4肽是SEQ ID NO:1的残基131-141；Y-5肽是SEQ ID NO:1的残基135-145；Y-6肽是SEQ ID NO:1的残基139-149；Y-7肽是SEQ ID NO:1的残基131-142；Y-8肽是SEQ ID NO:1的残基135-146；Y-9肽是SEQ ID NO:1的残基131-143；Y-10肽是SEQ ID NO:1的残基135-147；Y-11肽是SEQ ID NO:1的残基131-144；Y-12肽是SEQ ID NO:1的残基135-148；Y-13肽是SEQ ID NO:1的残基131-145；Y-14肽是SEQ ID NO:1的残基135-149；Y-15肽是SEQ ID NO:1的残基131-146；Y-16肽是SEQ ID NO:1的残基131-147；Y-17肽是SEQ ID NO:1的残基131-148；Y-18肽是SEQ ID NO:1的残基131-149；Y-19肽是置乱/随机序列。

图13是在组1的肽上获得的所有结果的散点图矩阵；

图14示出2D电泳和蛋白质印迹的结果，这些结果证明MIL38和抗GPC-1抗体在2D凝胶蛋白印迹上示出重叠的反应性；

图15示出用MIL38抑或抗-GC-1抗体在DU-145前列腺癌或C3(MIL38阴性)细胞膜蛋白提取物上进行免疫沉淀的蛋白质印迹；并且

图16示出免疫沉淀的蛋白质印迹，该免疫沉淀的蛋白质印迹证明MIL38抗体可以检测前列腺癌患者的血浆中(图16A)和前列腺癌提取物中(图16B)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。图16A泳道是：来自前列腺癌血浆的046IP NT-IP；来自用肝素酶处理的前列腺癌血浆的046IP HepI-IP；来自于标准对照血浆的042IP NT-IP；来自用肝素酶处理的于标准对照血浆042IP HepI-IP；魔法标记-商业的蛋白质标记作为分子量标准。

定义

如本申请中使用，除非上下文另外明确规定，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数称谓。例如，短语“一种抗体”也包括多种抗体。

如在此使用，术语“包含”意指“包括”。词“包含(comprising)”的变体，如“包括(comprise)”和“包括了(comprises)”具有相应变动的含义。因此，例如，“包含”抗体A的样品可以唯一的由抗体A组成或可以包括一种或多种另外的组分(例如抗体B)。

如在此使用的，术语“多种(multiple)”和“多个(多个)”意指多于一个(种)。在某些具体的方面或实施例中，多种或多个可以意指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或更多，以及在其中可推论出的任何整数，以及在其中可推论出的任何范围。

如在此使用的术语“表位”是指抗原的一个或多个特异性部分，这些部分与一个或多个结合实体(如例如蛋白质、配体、抗体、抗体片段或抗体衍生物)互相作用(例如结合)。

如在此使用的，术语“抗体(antibody)”和“多个抗体(antibodies)”包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgM和IgY、完整抗体(包括单链完整抗体及其抗原结合片段)。抗原结合抗体片段包括但不限于Fv、Fab、Fab’和F(ab')2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、以及包含VL或VH结构域之一的片段。这些抗体可以来自任何动物来源或适当的生产宿主。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以单独包含一个或多个可变区或者与以下项的整个或部分结合：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。同样包括的是一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。抗体可以是特异性结合生物分子的单克隆的、多克隆的、嵌合型的、多特异性的、人源化的、以及人类单克隆的和多克隆的抗体。该抗体可以是双特异性抗体、avibody、双特异抗体、三抗(tribody)、四抗(tetrabody)、纳米抗体(nanobody)、单结构域抗体、VHH结构域、人类抗体、全人源化抗体，部分人源化抗体、anticalin、adnectin或亲和体。

如在此使用的，术语“单克隆抗体”是指可以识别单抗原表位的抗体，并且是从与相同抗原表位特异性结合的基本上均质的抗体的群获得的，并且与天然存在的一个或多个突变(其可以以极少的量存在)的潜在例外相同。

如在此使用的，术语“人源化的抗体”是指形成包含来自人类抗体连同非人类抗体(例如鼠科抗体)的序列的抗体。例如，人源化的抗体基本上可以包含基本上所有至少一个和典型地两个可变结构域，其中所有/基本上所有的高变环对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且所有/基本上所有的FR区都来自人类免疫球蛋白序列。人源化的抗体可以任选的也包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，该部分Fc可以典型地是人类免疫球蛋白。

如在此使用的，术语“嵌合抗体”是指表现出希望的生物活性的抗体，并且其中一部分轻链和/或重链与衍生自给定/特定物种的抗体中的相应序列相同或同源，而其余一条或多条链与衍生自另外的不同的物种的抗体中的相应序列相同或同源。例如，嵌合抗体可以包含衍生自第一物种的可变区，并且包含衍生自第二物种的恒定区。嵌合抗体例如可以通过基因工程从属于不同物种的免疫球蛋白基因片断来构建。

如在此使用的，术语“杂交瘤”是指通过将永生细胞(例如多发性骨髓瘤细胞)和抗体产生细胞(例如B淋巴细胞)融合产生的细胞，抗体产生细胞能够产生单一结合特异性的单克隆抗体。

如在此使用的，关于抗体、抗体变体、抗体衍生物、抗原结合片段等的术语“特异性结合(binding specifically和specifically binding)”是指其超过其他非靶分子优先地结合给定靶分子的能力。例如，如果抗体、抗体变体、抗体衍生物或抗原结合片段(“分子A”)能够“特异性结合(binding specifically或specifically binding)”给定的靶分子(“分子B”)，则分子A具有在分子B和任何其他许多个潜在的可替代的结合配偶体之间进行区别的能力。因此，当暴露于多个不同但作为潜在的结合配偶体同样可接近的分子时，分子A将选择性地结合分子B，并且其他可替代的潜在结合配偶体将保持基本上未被分子A结合。通常，分子A将与其他潜在结合配偶体相比至少10倍、优选50倍、更优选100倍、并最优选大于100倍更频繁地优先结合分子B。分子A可以能够以弱的但是可检测的水平结合不是分子B的分子。这通常被称为背景结合，并从分子B特异性结合中容易地可辨别出，例如通过使用适当的对照。

如在此使用的，术语“受试者”包括具有经济的、社会的或研究的重要性的任何动物，包括牛、马、羊、灵长类动物、禽类和啮齿类物种。因此，“受试者”可以是动物，例如像人类或非人类动物。

如在此使用的，关于生物分子(例如抗体)的术语“分离的”是从与其自然存在的至少一些组分游离的生物分子。

如在此使用的，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”各自是指由肽键连接在一起的氨基酸组成的聚合物，并且可互换使用。出于本发明的目的，“多肽”可以构建全长蛋白质或全长蛋白质的一部分，并且“肽”和“多肽”的含义没有任何意图的区别。

如在此使用的，“保守”氨基酸取代是指用具有相似大小和/或相似化学特性的另一个不同氨基酸残基替换氨基酸的序列中的给定氨基酸残基。保守氨基酸取代的非限制性实例包括：A(ala)被S(ser)取代；R(arg)被K(lys)取代；N(asn)被Q(gln)或H(his)取代；D(asp)被E(glu)取代；Q(gln)被N(asn)取代；C(cys)被S(ser)取代；E(glu)被D(asp)取代；G(gly)被P(pro)取代。

如在此使用的，术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸碱基、核糖核苷酸碱基、已知的类似物或天然核苷酸的单链或双链聚合物，或其混合物。

如在此使用的术语“结合实体”涵盖能够特异性结合如在此描述的GPC-1表位或其模拟物的任何分子。结合实体的非限制性实例包括多肽，例如像抗体。

如在此使用的，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。此类递送系统包括允许反应试剂(例如在适当的容器中的标记、参考样品、支持材料等)和/或支持材料(例如，缓冲液、用于进行测定等的书面说明书等)从一个场所至另一个场所的储存、转运或递送的系统。例如，试剂盒可以包括一个或多个外壳，如包含相关反应试剂和/或支持材料的盒子。

如在此使用的，在检测方法和检测测定的上下文中的术语“阳性对照元素”是指当用于方法或测定中时，直接或间接提供阳性的/肯定的信号的元素，并且从而至少部分地或完全验证该方法或测定能够正确工作。

应当理解的是，当涉及数值范围时，使用的术语“在……之间”涵盖范围的每个端点处的数值。例如，长度为10个残基和20个残基之间的多肽包括长度为10个残基的多肽和长度为20个残基的多肽。

在此对现有技术文献的任何描述、或在此由这些文件导出或基于这些文件的陈述，不是承认文件或衍生陈述是相关领域的知常识的一部分。出于描述目的，除非另外声明，否则在此参考的全部文件特此通过引用以其全文结合在此。

详细描述

诸位发明人已经鉴定了当使用结合实体(如抗体)时，有利于检测和量化GPC-1水平的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)内的特异性表位。虽然对许多目的有用，但是这些表位及其组合可以靶向寻求量化GPC-1水平的用于前列腺癌的诊断测定中。

因此，本发明涉及GPC-1表位及其组分；所述表位和/或表位组分的组合物；能够特异度靶向表位、组分和/或组合物的结合实体；组合物、试剂盒和包含表位、组分和/或组合物的其他实体；用于产生能够特异度靶向表位、组分和/或组合物的结合实体所述的方法；以及需要检测表位、组分和/或组合物的用于前列腺癌的诊断方法。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)

本发明由在磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白多糖(GPC-1)中的一系列表位引起，这些表位由特异性结合实体(例如抗体)靶向。

这些表位可以存在于哺乳动物GPC-1蛋白质中(例如像牛、马、羊、灵长类或啮齿类物种)。因此，这些表位可以存在于哺乳动物GPC-1蛋白质中，例如像人类或非人类哺乳动物(例如狗GPC-1蛋白质)。

此外或可替代地，这些表位可以存在于非哺乳动物GPC-1蛋白质中，例如像禽类GPC-1蛋白质。

这些表位可以存在于人类GPC-1蛋白质中(例如，如由以下项中的任一个所述的序列所定义的：NCBI参照序列登录号NP_002072.2、基因库登录号AAH51279.1、基因库登录号AAA98132.1、基因库登录号EAW71184.1、UniProtKB/Swiss-Prot登录号P35052.2，和/或SEQID NO:14)。

应当理解的是，这些表位可以存在于GPC-1变体(例如GPC-1同工型、剪接变体或同种型)中。这些表位可以按GPC-1的细胞表面结合的和/或分泌的形式存在。

表位

-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位

本发明提供GPC-1表位及其组分，并还包括所述表位和/或表位组分的组合。

在一些实施例中，根据本发明所述的GPC-1表位可以包含列于下表1中的表位中的任何一个或多个或由其组成。

表1：根据本发明所述的GPC-1表位的非限制性实例

在某些实施例中，本发明的表位包含或由多个区段或由其组成。这些表位可以是线性的或不连续的。包含多个区段的表位的非限制性实例列于下表2中。

表2：根据本发明所述的GPC-1表位的另外的非限制性实例

在其他实施例中，本发明提供包含多个离散的表位或由其组成的不同表位的组合。这些离散的表位可以是线性的或不连续的。包含多个不同表位的表位组合的非限制性实例列于下表3中。

表3：根据本发明所述的GPC-1表位组合物的非限制性实例

根据本发明所述的表位的组合可以包含前列腺特异性抗原(PSA)，也称为γ-精浆蛋白或激肽释放酶-3(KLK3)。因此，根据本发明所述的表位的组合可以包含列于表1或表2中的表位中的任一个与PSA组合、或者列于表3中的表位组合中的任一个进一步与PSA组合。

-变体

本发明提供在此描述的GPC-1表位的变体。

如本领域普通技术人员已知的，该变体可以包含一个或多个保守的或非保守的取代。

在一些实施例中，本发明的表位的变体可以具有氨基酸残基的规定的百分比，该规定的百分比与指定区域相同(“序列一致性”的百分比)，或者当不指定时与整个序列相同。因此，在此披露的GPC-1表位的“变体”可以与在此描述的GPC-1表位的序列共享至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。

与该变体出现的该GPC-1表位序列相比，该变体可以保持相同的、基本上相同的或改变的生物活性。

该变体可以是来自不同家族、属或种的同系物GPC-1表位，与该变体出现的(例如衍生自哺乳动物的其他物种的那些)该GPC-1表位序列具有相同的或基本上相同的生物功能或活性。

序列一致性的不同可以从氨基酸取代(例如保守的和/或非保守的取代)、插入和/或缺失出现。保守氨基酸取代是指如本领域普通技术人员所熟知的，在多肽链内将一个氨基酸取代或置换为具有相似特性的另一个氨基酸。例如，带电荷氨基酸谷氨酸(Glu)对于类似带电荷氨基酸天冬氨酸(Asp)的取代将是保守氨基酸取代。

可以没有困难地使用本领域普通技术人员已知的方法，确定在两个序列之间的序列一致性的百分比。例如，可以通过将比较窗口上的两个最佳比对的序列，来确定在两个序列之间的序列一致性的百分比。与不包含缺失或添加的参考序列(例如，如在此描述的GPC-1表位序列)相比，该在比较窗口中的序列的一部分可以例如包含缺失或添加(即空位)，以便最佳地比对两个序列。然后可以通过确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量来计算序列一致性的百分比，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以产生序列一致性的百分比。

可以使用序列分析软件(例如序列分析软件Package，Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Ave.,Madison,Wis.53705[遗传学计算机组，威斯康辛大学生物技术中心，1710大学大道，麦迪逊，威斯康辛州53705])测量序列一致性的水平。此软件通过对不同的取代、缺失、及其他修饰的同源性的程度进行赋值而将相似的序列进行匹配。用于测量在两个或更多个序列之间的序列一致性的程度的其他适合的实例计算机软件，包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(从Intelligenetics公司，山景城(Mountain View)，加利福尼亚州可获得)；ALIGN程序(版本2.0)以及GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、以及TFASTA(从Accelrys Inc.公司，9685车站路(Scranton Road)，圣迭哥，加利福尼亚州，美国可获得)。

关于以上实施例(包括列于上表1-3、下表4中的那些)提供了所提及所述的变体的适合的和非限制性的实例。

因此，KVNPQGPGPEEK(SEQ ID NO:1)的变体可以包含在位置2的V(val)、在位置5的Q(gln)、在位置6的G(gly)以及在位置7的P(pro)。该变体可以进一步包含在位置1的K(lys)、和/或在位置3的N(asn)、和/或在位置4的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以进一步包含在位置8的G(gly)、和/或在位置9的P(pro)、和/或在位置10的E(glu)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:1的位置1、3、4、8、9、10、11和/或12中的任一个或多个处。

可替代地，KVNPQGPGPEEK(SEQ ID NO:1)的变体可以包含在位置6的G(gly)、在位置8的G(gly)以及在位置10的E(glu)。该变体进一步包含在位置3的N(asn)、和/或在位置5的Q(gln)、和/或在位置7的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQID NO:1的位置1、2、3、4、5、7、9、11和/或12中的任一个或多个处。

可替代地，KVNPQGPGPEEK(SEQ ID NO:1)的变体可以包含在位置7的P(pro)、在位置8的G(gly)以及在位置10的E(glu)。该变体可以进一步包含在位置5的Q(gln)、和/或在位置6的G(gly)、和/或在位置11的E(glu)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:1的位置1、2、3、4、5、6、9、11和/或12中的任一个或多个处。

VNPQGPGPEEK(SEQ ID NO:2)的变体可以包含在位置1的V(val)、在位置4的Q(gln)、在位置5的G(gly)、以及在位置6的P(pro)。该变体可以进一步包含在位置2的N(asn)、和/或在位置3的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以进一步包含在位置7的G(gly)、和/或在位置8的P(pro)、和/或在位置9的E(glu)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:2的位置2、3、7、8、9、10和/或11中的任一个或多个处。

可替代地，VNPQGPGPEEK(SEQ ID NO:2)的变体可以包含在位置5的G(gly)、在位置7的G(gly)、以及在位置9的E(glu)。该变体进一步包含在位置2的N(asn)、和/或在位置4的Q(gln)、和/或在位置6的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:2的位置1、2、3、4、6、8、10和/或11中的任一个或多个处。

可替代地，VNPQGPGPEEK(SEQ ID NO:2)的变体可以包含在位置6的P(pro)、在位置7的G(gly)、以及在位置9的E(glu)。该变体可以进一步包含在位置4的Q(gln)、和/或在位置5的G(gly)、和/或在位置10的E(glu)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ IDNO:2的位置1、2、3、4、5、8、10和/或11中的任一个或多个处。

VNPQGPGPEE(SEQ ID NO:3)的变体可以包含在位置1的V(val)、在位置4的Q(gln)、在位置5的G(gly)、以及在位置6的P(pro)。该变体可以包含在位置2的N(asn)、和/或在位置3的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以进一步包含在位置7的G(gly)、和/或在位置8的P(pro)、和/或在位置9的E(glu)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个或六个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:3的位置2、3、7、8、9和/或10中的任一个或多个处。

可替代地，VNPQGPGPEE(SEQ ID NO:3)的变体可以包含在位置5的G(gly)、在位置7的G(gly)、以及在位置9的E(glu)。该变体进一步包含在位置2的N(asn)、和/或在位置4的Q(gln)、和/或在位置6的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:3的位置1、2、3、4、6、8和/或10中的任一个或多个处。

可替代地，VNPQGPGPEE(SEQ ID NO:3)的变体可以包含在位置6的P(pro)、在位置7的G(gly)、以及在位置9的E(glu)。该变体可以进一步包含在位置4的Q(gln)、和/或在位置5的G(gly)、和/或在位置10的E(glu)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:3的位置1、2、3、4、5、8和/或10中的任一个或多个处。

NPQGPGPEE(SEQ ID NO:4)的变体可以包含在位置3的Q(gln)、在位置4的G(gly)、以及在位置5的P(pro)。该变体可以包含在位置1的N(asn)、和/或在位置2的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以进一步包含在位置6的G(gly)、和/或在位置7的P(pro)、和/或在位置8的E(glu)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个或六个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:4的位置1、2、6、7、8和/或9中的任一个或多个处。

可替代地，NPQGPGPEE(SEQ ID NO:4)的变体可以包含在位置4的G(gly)、在位置6的G(gly)、以及在位置8的E(glu)。该变体进一步包含在位置1的N(asn)、和/或在位置3的Q(gln)、和/或在位置5的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个或六个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:4的位置1、2、3、5、7和/或9中的任一个或多个处。

可替代地，NPQGPGPEE(SEQ ID NO:4)的变体可以包含在位置5的P(pro)、在位置6的G(gly)、以及在位置8的E(glu)。该变体可以进一步包含在位置3的Q(gln)、和/或在位置4的G(gly)、和/或在位置9的E(glu)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个或六个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:4的位置1、2、3、4、7和/或9中的任一个或多个处。

KVNPQGPGPE(SEQ ID NO:5)的变体可以包含在位置2的V(val)、在位置5的Q(gln)、在位置6的G(gly)、以及在位置7的P(pro)。该变体可以进一步包含在位置1的K(lys)、和/或在位置3的N(asn)、和/或在位置4的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以进一步包含在位置8的G(gly)、和/或在位置9的P(pro)、和/或在位置10的E(glu)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个或六个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:5的位置1、3、4、8、9和/或10中的任一个或多个处。

可替代地，KVNPQGPGPE(SEQ ID NO:5)的变体可以包含在位置6的G(gly)、在位置8的G(gly)、以及在位置10的(glu)。该变体进一步包含在位置3的N(asn)、和/或在位置5的Q(gln)、和/或在位置7的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:5的位置1、2、3、4、5、7和/或9中的任一个或多个处。

可替代地，KVNPQGPGPE(SEQ ID NO:5)的变体可以包含在位置7的P(pro)、在位置8的G(gly)、以及在位置10的E(glu)。该变体可以进一步包含在位置5的Q(gln)、和/或在位置6的G(gly)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:5的位置1、2、3、4、5、6和/或9中的任一个或多个处。

KVNPQGPGP(SEQ ID NO:6)的变体可以包含在位置2的V(val)、在位置5的Q(gln)、在位置6的G(gly)、以及在位置7的P(pro)。该变体可以进一步包含在位置1的K(lys)、和/或在位置3的N(asn)、和/或在位置4的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以进一步包含在位置8的G(gly)、和/或在位置9的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个或五个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:6的位置1、3、4、8和/或9中的任一个或多个处。

KVNPQGPGP(SEQ ID NO:6)的变体可以包含在位置6的G(gly)、以及在位置8的G(gly)。该变体进一步包含在位置3的N(asn)、和/或在位置5的Q(gln)、和/或在位置7的P(pro)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:6的位置1、2、3、4、5、7和/或9中的任一个或多个处。

KVNPQGPGP(SEQ ID NO:6)的变体可以包含在位置7的P(pro)、以及在位置8的G(gly)。该变体可以进一步包含在位置5的Q(gln)、和/或在位置6的G(gly)。此外或可替代地，该变体可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个取代的残基。该一个或多个取代的氨基酸残基可以在SEQ ID NO:6的位置1、2、3、4、5、6和/或9的任一个或多个处。如SEQID NO:7-13中阐述的本发明的任一个表位的变体可以包含在表位序列的任一个或多个位置处的氨基酸取代。如本领域普通技术人员已知的，该氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。该变体可以仅包含一个或多个保守取代、仅包含一个或多个非保守取代或一个或多个保守取代和一个或多个非保守取代的混合物。

-片段

本发明提供在此描述的GPC-1表位和变体的片段。

在一些实施例中，本发明的表位的片段可以包含4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19或20个氨基酸或由其组成。因此，根据本发明所述的表位的片段可以包含例如在5个和10个之间、在5个和15个之间、在5个和20个之间、在10个和20个之间、在10个和15个之间、在7个和15个之间、在7个和13个之间、在8个和12个之间、在8个和10个之间、在11个和19个之间、在12个和18个之间、或在13个和17个之间的长度的氨基酸或由其组成。通常，在此披露的全GPC-1表位的片段与全GPC-1表位相比，可以拥有相似或在一些情况下改进的免疫学特性。

关于以上实施例(包括列于上表1-4、下表5中的那些)提供了所提及的片段的适合的和非限制性的实例。

-融合多肽

本发明的某些实施例提供以融合多肽形式的GPC-1表位。例如，选自表1的两个或更多个全表位、选自表2的两个或更多个表位区段、选自表3的两个或更多个全表位的组合、或来自表1的全表位的组合以及选自表2的任一个或多个表位区段可以连接在一起以形成融合多肽。

可以使用本领域普通技术人员已知的标准技术(包括例如化学偶联)来制备这些融合多肽。在表达系统中，这些融合多肽也可以表达为重组多肽。例如，编码融合多肽的多肽组分的DNA序列可以分开组装，并连接到适当的表达载体中。具有或不具有肽接头，可以将编码一种多肽组分的DNA序列的3'末端连接至编码第二多肽组分的DNA序列的5'末端，使得序列的阅读框是读框的。这可以允许翻译为保留全部两种多肽组分的生物活性的单一融合多肽。

可以采用接头序列来将融合蛋白的第一和第二多肽组分分开足够的距离，以确保每个多肽组分折叠成适当的二级和/或三级结构。适合的接头的非限制性实例包括如本领域普通技术人员已知的肽/多肽、烷基链或其他方便的间隔子分子。适合的肽接头序列可以根据因素来选择，这些因素包括采用灵活扩展构象的能力、不能采用能与融合多肽的一种或多种多肽组分中的一一个或多个功能性表位相互作用的二级结构的能力、和/或缺乏可以与融合多肽的一种或多种多肽组分中的一个或多个功能性表位发生反应的疏水和/或带电残基。

仅通过非限制性实例的方式，肽接头序列可以包含Gly、Asn和/或Ser残基。此外或可替代地，其他近中性氨基酸(如Thr和Ala)也可以用于肽接头序列。可以有用地用作接头的氨基酸序列的另外的实例包括披露在美国专利号4,935,233；美国专利号4,751,180中的那些；Murphy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262,1986[美国科学院院刊83:8258-8262，1986]；和Maratea等人，Gene 40:39-46,1985[基因40:39-46，1985])。该接头序列的长度可以通常是从1个至约50个氨基酸。因此，该接头序列的长度可以是5、10、15、20、30、40、在10和50之间、在10和40之间、在10和30之间、在20和30之间、在1和5之间、或在5和10个氨基酸之间。如果融合多肽的第一和第二多肽组分具有可用于分开功能域并防止空间干扰的非必需N-末端氨基酸区域，则根据本发明所述的融合多肽可以不需要接头序列。

-多核苷酸、载体和宿主细胞

本发明还提供编码本发明的一个或多个GPC-1表位、GPC-1表位的区段，以及包含GPC-1表位和/或其区段的融合蛋白的多核苷酸。

这些多核苷酸可以被克隆进载体中。例如，该载体可以包含编码GPC-1表位、一个或多个GPC-1表位片段、和/或融合蛋白的DNA、RNA或互补DNA(cDNA)序列。该载体可以是质粒载体、病毒载体或适用于外来序列的插入、将这些序列引入到细胞中以及引入的序列的表达的任何其他适合的载具。典型地，该载体是表达载体并且可以包括表达控制和加工序列，如启动子、增强子、核糖体结合位点、聚腺苷酸化信号以及转录终止序列。

本发明还考虑了由此类载体转化的宿主细胞。例如，本发明的聚核苷酸可以被克隆进载体中，该载体转化进细菌宿主细胞，例如大肠杆菌。

用于构建载体以及将其转化进宿主细胞的方法通常是本领域已知的，并且描述在例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Plainview,New York[分子克隆：实验室手册(第2版，冷泉港实验室出版社，普莱恩维尤，纽约]，和Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in MolecularBiology(2007),John Wiley and Sons,Inc.[Ausubel F.M.等人(编辑)现代分子生物学实验指南(2007)，约翰·威利父子公司]。

-生产

本发明的GPC-1表位、GPC-1表位的区段以及包含GPC-1表位和/或其区段的融合蛋白因此可以根据本领域普通技术人员熟知的标准方法学进行制造。

可以使用各种各样熟知的合成和/或重组技术的任一种制备表位、区段和融合蛋白。例如，可以通过使用本领域普通技术人员熟知的方法学通过合成手段生产多肽。在一个非限制性实例中，可以使用可商购的固相技术(例如Merrifield固相合成方法)，在该方法中将氨基酸顺序地添加至生长的氨基酸链中(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2146,1963[Merrifield，美国化学会志85:2149-2146,1963])。用于自动合成在此披露所述的表位、区段、融合蛋白的设备是可商购的(例如帕金埃尔默公司(Perkin Elmer)/应用生物系统部门(福斯特市，加利福尼亚州)，并可以根据制造商的说明书使用。

此外或可替代地，这些表位、区段、融合蛋白可以通过本领域普通技术人员可用的任何其他方法进行生产。例如，可以使用重组方式，其中使用本领域已知的各种各样的程序中的任一种将编码选择的一个或多个表位、一个或多个区段、和/或一个或多个融合蛋白的核酸插入表达载体(例如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition(Jan.15,2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN:0879695765；Ausubel etal.,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates andWiley Interscience,NY(1989)[Sambrook等人，1989，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州；Sambrook和Russell，分子克隆：实验室手册，第3版(2001年1月15日)冷泉港实验室出版社，ISBN:0879695765；Ausubel等人，现代分子生物学实验指南，格林出版公司和威利出版公司，纽约州(1989)])。采用本领域普通技术人员熟知的标准连接技术构建包含编码选择的一个或多个表位、一个或多个区段和/或一个或多个融合蛋白的核酸的适合的表达载体。

可以将连接的核酸序列可操作地连接至适合的转录或翻译调控元件上，这些元件有利于一个或多个表位、一个或多个区段和/或一个或多个融合蛋白的表达。负责蛋白质表达的调控元件可以位于用于多肽的编码区的5’。结束翻译的终止密码子和转录的末端信号可以存在于序列编码一个或多个表位、一个或多个区段和/或一个或多个融合蛋白的核酸序列的3’。在构建编码具有可操作地连接的调控元件的感兴趣的一个或多个多肽的核酸之后，可以将所得表达盒引入宿主细胞并且可以表达编码的一个或多个多肽。

根据本发明，GPC-1表位、GPC-1表位的区段和包含GPC-1表位和/或其区段的融合蛋白可以是“分离的”。“分离的”多肽是从其原始环境中去除的一种多肽。例如，如果与天然系统中的一些或所有共存材料分开，则在此所提及的天然存在的蛋白质或多肽被认为是分离的。在此所提及的分离多肽的也可以是纯化的。例如，该分离的多肽可以是至少约90％纯、至少约95％纯或至少约99％纯。

根据本发明所述的多核苷酸和核酸通常是本领域已知的，并例如描述于AusubelF.M et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley andSons,Inc；Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York；and Maniatis etal.Molecular Cloning(1982),280-281[Ausubel F.M.等人(编辑)现代分子生物学实验指南(2007)，威利父子公司；Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册(第2版，冷泉港实验室出版社，普莱恩维尤，纽约和Maniatis等人，分子克隆(1982)，280-281]。例如可以通过化学合成技术，例如磷酸二酯和磷酸三酯方法(参见例如Narang S.A.等人(1979)Meth.Enzymol.68:90[酶方法学68:90]；Brown,E.L.(1979)等人Meth.Enzymol.68:109[酶方法学68:109]；和美国专利号4356270)、乙基亚磷酰胺方法(参见Beaucage S.L等人(1981)Tetrahedron Letters,22:1859-1862[四面体通讯，22:1859-1862])制备多核苷酸。用于在改性固体支持物上合成寡核苷酸的方法描述在美国专利号4458066中。

-支持物

根据本发明所述的表位和融合多肽可以附接至支持物上。该支持物例如可以是不溶性材料或保留表位并且排除其在大部分反应混合物中自由移动的基质。用于固定或定位表位和融合多肽的适合的载体是本领域普通技术人员所熟知的。该支持物可选自于多种多样的以多种形式存在的基质、聚合物等，这些形式包括可方便地用在微量测定法中的珠粒、具有各自的孔的塑料和玻璃板、连通与该反应条件相容的其他材料。在某些优选实施例中，该支持物可以是一种塑料材料，如塑料的珠或薄片，或在具有其中可进行具体测定(例如ELISA)的孔或管的塑料材料。

结合实体

本发明提供能够特异性结合在此描述的GPC-1表位的结合实体。

该结合实体可以是能够特异性结合如在此描述的GPC-1表位的任何分子。结合实体的非限制性实力包括多肽、抗体、抗体片段、分子印迹、凝集素和捕捉化合物。结合实体可以是可以结合本发明的GPC-1表位或可替代地GPC-1的不同区域的试剂，并还修饰表位与另一个不同结合实体(例如像如在此披露的抗体)之间的结合相互作用。

能够特异性结合本发明的GPC-1表位的结合实体(如抗体)可以比其他非靶分子优先地结合给定的目标表位、表位区段的组合或表位组合。例如，如果该结合实体(“分子A”)能够“特异性结合(binding specifically或specifically binding)”给定的靶标GPC-1表位(“分子B”)，则分子A具有在分子B和任何其他多个潜在的可替代的结合配偶体之间进行区别的能力。因此，当暴露于多个不同但作为潜在的结合配偶体同样可接近的分子时，分子A将选择性地结合分子B，并且其他可替代的潜在结合配偶体将保持基本上未被分子A结合。通常，分子A将与其他潜在结合配偶体相比至少10倍、优选50倍、更优选100倍、并最优选大于100倍更频繁地优先结合分子B。分子A可以能够以弱的但是可检测的水平结合不是分子B的分子。这通常被称为背景结合，并从分子B特异性结合中容易地可辨别出，例如通过使用适当的对照。

在此提供的特异性GPC-1表位的知识中，本领域普通技术人员可以在没有创造性努力的情况下生产结合实体。例如，可以使用已知的技术制备特异性结合本发明的一个或多个GPC-1表位的多克隆的和单克隆的抗体制剂。

通过培养物中传代细胞系提供用于产生抗体分子的任何技术可用于制备定向的指向靶标GPC-1表位的单克隆抗体。普遍的方法学描述在Harlow和Lane(编辑)(1988)“Antibodies-A Laboratory Manual[抗体-实验室手册]”，冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)，纽约中。具体的方法学包括最初由Kohler等人在以下文献中发展的杂交瘤技术：(1975)，“Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity”,Nature,256:495-497[(1975)，“分泌具有预定义特异性的抗体的融合细胞的连续培养”，自然，256:495-497]、连同杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，(1983)，“The Production of Monoclonal Antibodies From HumanLymphocytes”,Immunology Today,4:72-79[Kozbor等人(1983)，“来自人类淋巴细胞的单克隆抗体的产生”，今日免疫学，4:72-79])和EBV-杂交瘤技术以产生人类单克隆抗体(Cole等人，(1985)，in“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”,pp.77-96,AlanR.Liss,Inc.[Cole等人，(1985)，在“单克隆抗体癌症疗法”中，第77-96页，艾伦R.利斯有限公司])。永生的、产生抗体的细胞系可以通过除融合之外的技术产生，如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用艾伯斯坦-巴尔病毒病毒(Epstein-Barr virus)转染(参见例如M.Schreier等人(1980)，“Hybridoma Techniques”,Cold Spring Harbor Laboratory[“杂交瘤技术”，冷泉港实验室]；Hammerling等人，(1981)，“Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas”,Elsevier/North-Holland Biochemical Press,Amsterdam[“单克隆抗体和T细胞杂交瘤”，爱思唯尔/北荷兰生化出版社，阿姆斯特丹]；Kennett等人，(1980)，“Monoclonal Antibodies”,Plenum Press[“单克隆抗体”，普莱南出版公司])。

简言之，产生从其中产生单克隆抗体的杂交瘤的方式，骨髓瘤或其他自身永续细胞系可以与从用其识别因子结合部分、或识别因子、或其起源特异性DNA结合部分超免疫的哺乳动物的脾脏获得的淋巴细胞融合。产生能够特异性结合本发明的GPC-1表位的单克隆抗体的杂交瘤通过其与所呈递的一个或多个表位的免疫反应的能力来鉴定。

在实践本发明中有用的单克隆抗体可以通过起始单克隆杂交瘤培养产生,该单克隆杂交瘤培养包括营养培养基，该营养培养基包含杂交瘤的，所述杂交瘤分泌具有适合抗原特异度的抗体分子。在足以使杂交瘤将抗体分子分泌到培养基中的条件和时段下保持培养物。然后收集包含抗体的培养基。然后可以通过熟知的技术进一步分离这些抗体分子。

相似地，存在可用于产生多克隆抗体的本领域已知的不同程序。为了生产针对GPC-1表位的给定组合的多克隆抗体，可以通过注射表位来免疫不同宿主动物，这些宿主动物包括但不限于兔、鸡、小鼠，大鼠、绵羊、山羊等。此外，靶分子可以与免疫原性运载体(例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔

血蓝蛋白(KLH))偶联。同样，可以使用不同佐剂来增加免疫应答，包括但不限于：弗氏佐剂(Freund's)(完全和不完全)、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂)、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔

血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人类佐剂(如BCG(卡介苗)和小棒状杆菌)。

所希望的抗体的筛选可以通过本领域已知的各种技术来完成。对于抗体的免疫特异性结合的适合测定包括但不限于放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹层免疫测定、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定、补体固定测定、免疫荧光测定、蛋白质A测定、免疫电泳测定等(参见例如，Ausubel等人，(1994)，“Current Protocols in Molecular Biology”,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,New York[“现代分子生物学实验指南”，第1卷，约翰·威利父子公司，纽约])。可以凭借第一抗体上的可检测标记来检测抗体结合。可替代地，可以凭借其与第二抗体或适当标记的试剂的结合来检测抗体。用于检测免疫测定中的结合的各种方法是本领域已知的，并包括在本发明的范围内。

针对感兴趣的一个或多个特异性GPC-1表位产生的抗体(或其片段)具有对该一个或多个表位的结合亲和力。优选地，这些抗体(或其片段)具有大于约10⁵M^-1、更优选大于约10⁶M^-1、仍然更优选大于约10⁷M^-1、以及最优选大于约10⁸M^-1的结合亲和力或亲合力。

就获得适量的根据本发明所述的抗体而言，可以使用无血清培养基进行分批发酵制造该一个或多个抗体。在发酵之后，可以经由并入色谱法和病毒灭活/去除步骤的多步骤程序纯化抗体。例如，可以首先通过蛋白质A亲和层析分离抗体，然后用溶剂/洗涤剂处理以灭活任何脂质包膜的病毒。典型地通过阴离子和阳离子交换色谱的进一步纯化可以用于去除残留的蛋白质、溶剂/洗涤剂和核酸。该纯化的抗体可以使用凝胶过滤柱进一步纯化，并配制成0.9％盐水。然后将配制的散装制剂消毒并进行病毒过滤和处置。

能够结合一个或多个本发明的GPC-1表位的抗体的非限制性实例包括：

(i)如保藏在布达佩斯条约条目下，在澳大利亚细胞库(Cellbank Australia)在214霍克斯路，Westmead，NSW 2145，澳大利亚，在2014年8月22日，在登录号CBA20140026下的MIL38抗体；

(ii)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1/GPC1抗体(ab137604)：从

可商购的对人类GPC-1特异的兔多克隆(IgG)

(参见：http://www.abcam.com/glypican-1-gpc1-antibody-ab137604.html)；

(iii)MAB2600I抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体，对人类和大鼠GPC-1特异的克隆4D1：小鼠单克隆(IgG_k)，并从密理博公司(Millipore)可商购(参见：http://www.emdmillipore.com/AU/en/product/,MM_NF-MAB2600？cid＝BI-XX-BRC-A-BIOC-抗B033-1308)；

(iv)山羊抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1抗体(AA 24-530)：对人类GPC-1特异的山羊多克隆，并从寿命生命科学公司(LifeSpan BioSciences,Inc.)可商购(参见https://www.lsbio.com/antibodies/anti-gpc1-antibody-glypican-antibody-aa24-530-icc-wb-western-flow-ls-c330760/341104)。

组合物和试剂盒

根据本发明所述的组合物和试剂盒可以包括：

-如在此(例如表1)描述的一个或多个GPC-1表位、其一个或多个变体或一个或多个片段；和/或

-如在此(例如表2)描述的一个或多个GPC-1表位区段、其一个或多个变体或一个或多个片段；和/或

-如在此(例如表3)描述的一个或多个GPC-1表位组合；和/或

-包含一个或多个GPC-1表位、一个或多个GPC-1表位的区段、和/或其一个或多个变体或一个或多个片段的一个或多个融合蛋白，如在此描述的(参见上文标题为“融合多肽”的小节)；和/或

-如在此描述的一个或多个结合实体(参见上文标题为“结合实体”的部分)。

该组合物可以另外包含可接受的运载体、佐剂和/或稀释剂。就与组合物的其他成分相容而言，这些运载体、稀释剂和佐剂可以是“可接受的”、和/或“药学上可接受的”，通常对其任何接受者无害。适合的运载体、稀释剂和佐剂对本领域普通技术人员是熟知的(参见例如Gilman等人(编)Goodman and Gilman’s:the pharmacological basis oftherapeutics,8th Ed.,Pergamon Press(1990)；Remington’s PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.:Easton,Pa.,17th Ed.(1985)[古德曼和吉尔曼氏疗法药理基础，第8版，培格曼出版社(1990)；雷明顿氏药物科学，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，第17版(1985)])。在一些实施例中，这些组合物可以被用于诊断或搜索目的。

这些试剂盒可以包括片段的或组合的试剂盒。“片段的试剂盒”是指包括两个或更多个分开的容器的递送系统，这些容器每个包含总试剂盒组分的子部分。包括两个或更多个分开的容器的任何递送系统都包括在术语片段的试剂盒的含义内，每个容器均包含总试剂盒组分的子部分。“组合试剂盒”是指包含单个容器中的所有试剂盒组分的递送系统(例如，在容纳每个所需组分的单个盒中)。在一些实施例中，这些试剂盒可以被用于诊断或搜索目的。

诊断方法

本发明的GPC-1表位、GPC-1表位区段和包含其GPC-1表位和/或其区段的融合蛋白可以用于诊断方法中。具体而言，本发明诸位发明人已经发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1是用于前列腺癌的新的标记(美国临时专利申请号61/928/776，标题为“Cell SurfaceProstate Cancer Antigen for Diagnosis”[“用于诊断的细胞表面前列腺癌抗原”]，Walsh等人-未公布)。

因此，本发明提供了基于如在此描述的一个或多个GPC-1表位、GPC-1表位的区段和/或一个或多个表位区段的变体和片段的检测，用于受试者中发展前列腺癌的诊断、预后或可能的方法。此外或可替代地，可以在诊断方法中检测GPC-1表位和/或GPC-1表位片段的变体和片段。

通常，这些方法包括确定来自待测试受试者的生物样品中的一个或多个GPC-1表位和/或GPC-1表位区段的水平。此外或可替代地，当执行这些方法时，也可以确定在生物样品中GPC-1表位和/或其区段的一个或多个变体和一个或多个片段的水平。GPC-1表位、GPC-1表位区段、和变体和片段的分限制性实例包括在标题为“表位”的部分中提及的那些(参见，具体地表1-3，以及变体和片段的相关描述)。

此外，这些方法可以包括确定在生物样品中前列腺特异性抗原(PSA)(也称为γ-精浆蛋白或激肽释放酶-3(KLK3))的水平，并且任选地比较检测到的PSA水平与对照的水平。

在一些实施例中，可以将在受试者的生物样品中检测到的一个或多个GPC-1表位、GPC-1表位区段、和/或一个或多个表位区段的变体和片段的水平与确定存在于对照样品中的水平进行比较。可以在确定受试者生物样品中存在的水平之前、期间或之后确定对照样品中的水平。作为非限制性实例，存在于对照样品中的水平可以基于存在于来自个体的等同生物样品中的那些或基于来自个体的群体的生物样品中存在的平均水平来确定。一个或多个个体可以已被确定为不患有癌症，和/或确定不患有前列腺癌。通常，可以将检测的受试者生物样品中增加的水平与对照中的那些比较，当做指示受试者患有前列腺癌或发展前列腺癌的增加的可能。例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的增加可以表明该受试者患有前列腺癌或发展前列腺癌的增加的可能。可替代地，可以将检测的受试者生物样品中等同或降低的水平与对照的那些比较，当做指示受试者不患有前列腺癌、或者没有发展前列腺癌的增加的可能。

在一些实施例中，将如在此描述的一个或多个GPC-1表位、GPC-1表位区段、和/或一个或多个表位区段的变体和片段作为本发明的诊断方法的阳性对照使用。例如，他们可以被用于在给定的测定中，以证实进行的该测定能够检测一个或多个GPC-1表位、GPC-1表位区段、和/或变体和片段。

在一些实施例中，本发明的这些诊断方法使用本发明的一个或多个融合蛋白。适合的融合蛋白的非限制性实例提供在标题为“融合蛋白”的小节中。在检测方法中，该一个或多个融合蛋白可以被用作阳性对照。

该生物样品可以是组织样品(例如前列腺组织的活检样本)或体液样品。

该体液样品可以是血液、血清、血浆或尿样。

可以用本发明检测的前列腺癌的非限制性实例包括前列腺上皮内瘤、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。

不限于具体检测方法和仅作为非限制性实例的方式，GPC-1表位、GPC-1表位片段、以及变体和片段的检测可以通过本领域普通技术人员已知的标准测定法进行，包括但不限于蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光激活的细胞分选(FACS)、生物膜测试或亲和环测试(参见例如美国申请2013/016,736)。可以将根据本发明所述的结合实体用于测定。

在一些实施例中，该结合实体是抗体。在另外的实施例中，该结合实体不是抗体。

在一些实施例中，该抗体选自以下项中的任一个或多个：

(ii)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1/GPC1抗体(ab137604)：从

可商购的对人类GPC-1特异的兔多克隆(IgG)

(参见：http://www.abcam.com/glypican-1-gpc1-antibody-ab137604.html)；

(iii)MAB2600抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体，对人类和大鼠GPC-1特异的克隆4D1：小鼠单克隆(IgG_k)，并从密理博公司(Millipore)可商购(参见：http://www.emdmillipore.com/AU/en/product/,MM_NF-MAB2600？cid＝BI-XX-BRC-A-BIOC-抗B033-1308)；

在一些实施例中，该抗体不是选自以下项中的任一个或多个：

(ii)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1/GPC1抗体(ab137604)：从

可商购的对人类GPC-1特异的兔多克隆(IgG)

(参见：http://www.abcam.com/glypican-1-gpc1-antibody-ab137604.html)；

(iii)MAB2600I抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体，对人类和大鼠GPC-1特异的克隆4D1：小鼠单克隆(IgG_k)，并从密理博公司(Millipore)可商购(参见：http://www.emdmillipore.com/AU/en/product/,MM_NF-MAB2600？cid＝BI-XX-BRC-A-BIOC-ANTI-B033-1308)；

在一些实施例中，该结合实体是包含MIL38抗体(CBA20140026)并不包含抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC-1)抗体的抗体群，该抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC-1)抗体能够结合包含选自以下项中的任一个或多个的氨基酸序列的表位：TQNARA((SEQ ID NO:8)、ALSTASDDR(SEQ ID NO:9)、PRERPP(SEQ ID NO:10)、QDASDDGSGS(SEQ ID NO:11)、LGPECSRAVMK(SEQID NO:13)和TQNARAFRD(SEQ ID NO:7)。

本领域普通技术人员将理解，在不偏离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施例中披露的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本发明实施例将在所有的方面被认为是用作说明性的而不是限制性的。

实例

现在将参考具体实例来描述本发明，其不应被解释为以任何方式进行限制。

实例1：由鼠科抗人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(MIL38-AM4)结合的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位的鉴定和表征

1.1材料和方法：

进行跨越具有不同构象约束的参照序列的经验集，并在肽阵列上探测抗体。

-抗体

提供的鼠科抗人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖1单克隆抗体MIL38-AM4如下表6所示。

表6：使用的抗体的描述

*由保藏在澳大利亚细胞库(Cellbank Australia)在登录号CBA20140026下的杂交瘤细胞产生

-肽

使用以下人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)序列作为产生结构化肽的文库的基础。

P35052(GPC1_人类)

1MELRARGWWL LCAAAALVAC ARGDPASKSR SCGEVRQIYG AKGFSLSDVP 50

51QAEISGEHLR ICPQGYTCCT SEMEENLANR SHAELETALR DSSRVLQAML 100

101ATQLRSFDDH FQHLLNDSER TLQATFPGAF GELYTQNARA FRDLYSELRL 150

151YYRGANLHLE ETLAEFWARL LERLFKQLHP QLLLPDDYLD CLGKQAEALR 200

201PFGEAPRELR LRATRAFVAA RSFVQGLGVA SDVVRKVAQV PLGPECSRAV 250

251MKLVYCAHCL GVPGARPCPD YCRNVLKGCL ANQADLDAEW RNLLDSMVLI 300

301TDKFWGTSGV ESVIGSVHTW LAEAINALQD NRDTLTAKVI QGCGNPKVNP 350

351QGPGPEEKRR RGKLAPRERP PSGTLEKLVS EAKAQLRDVQ DFWISLPGTL 400

401CSEKMALSTA SDDRCWNGMA RGRYLPEVMG DGLANQINNP EVEVDITKPD 450

451MTIRQQIMQL KIMTNRLRSA YNGNDVDFQD ASDDGSGSGS GDGCLDDLCS 500

501RKVSRKSSSS RTPLTHALPG LSEQEGQKTS AASCPQPPTF LLPLLLFLAL 550

551TVARPRWR558

(SEQ ID NO:14)

图1示出在蛋白质数据库标识符(PBD ID)4AD7下存在的链B的透视图(http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/4AD7)。

-在支架上化学连接的肽(CLIPS)技术

以下提供了所使用的CLIPS技术的一般原理的描述。

CLIPS技术在结构上将肽固定到定义的三维结构中。这导致即使是最复杂的结合位点的功能模拟。现在常规地使用CLIPS技术将肽文库形成单、双或三环结构连同片状和螺旋状折叠。

该CLIPS反应发生在CLIPS支架的溴基团和半胱氨酸的硫醇侧链之间。该反应在温和条件下快速且特异。使用此化学方法，将天然蛋白质序列转化为具有一系列结构的CLIPS构建体，这些结构包括单个T2环、T3双环、共轭T2+T3环、稳定的β片和稳定的α螺旋(Timmerman等人，J.Mol.Recognit.2007；20:283-29[分子识别杂志2007；20:283-29])。

CLIPS文库筛选开始于使用组合矩阵设计将靶蛋白转化为多达10,000个重叠肽构建体的文库。在固体运载体上，合成线性肽的矩阵，随后将其形成空间上定义的CLIPS构建体。以正确构象表示不连续表位的两个部分的构建体以高亲和力结合抗体，它被检测和定量。呈递不完整表位的构建体以更低的亲和力结合抗体，而不含表位的构建体根本不结合。亲和力信息用于迭代筛选以详细定义表位的序列和构象。

包含不连续构象表位的靶蛋白质被转化为矩阵文库。组合肽在专有迷你卡上合成，并化学转化为空间上定义的CLIPS构建体。定量抗体的结合。

-肽合成

为了重建靶分子的不连续表位，合成了结构化肽的文库。这使用在支架上化学连接的肽(CLIPS)技术来完成。CLIPS技术允许在单环、双环、三环、片状折叠、螺旋样折叠及其组合中产生结构化肽。CLIPS模板与半胱氨酸残基偶联。将在肽中多个半胱氨酸的侧链与一个或两个CLIPS模板偶联。例如，将T2 CLIPS模板1,3-双(溴甲基)苯唑的0.5mM溶液溶解在碳酸氢铵(20mM，pH 7.9)/乙腈(1:1(v/v))中。将此溶液添加到肽阵列上。该CLIPS模板结合存在于肽阵列(具有3μl孔的455孔板)的固相结合肽中的两个半胱氨酸的侧链。在溶液中将这些肽阵列温柔地震荡30至60分钟，同时完全覆盖在溶液中。最后，将这些肽阵列广泛地用过量的H₂O洗涤，并在70℃下，在PBS(pH 7.2)中包含1％SDS/0.1％β-巯基乙醇的断裂缓冲液中超声处理30分钟，随后在H₂O中超声处理另外的45分钟。携带肽的T3 CLIPS以类似的方式制备，但具有三个半胱氨酸。

根据以下设计化学合成线性肽和CLIPS肽：

组1

标记线

模拟类型线性肽

描述长度15个的线性肽具有覆盖参考序列(SEQ ID NO:14)的14个的重叠。

组2

标记环

模拟类型环形的肽

描述长度17个的肽，具有在位置1和17的半胱氨酸残基。位置2-16包含组1的线性15mer，其中半胱氨酸被丙氨酸替换。在合成之后，肽被P2 CLIPS^TM接头约束以约束形状。

组3

标记螺旋_i3

模拟类型螺旋肽

描述长度15个的肽，具有参考序列(SEQ ID NO:14)衍生的14个的重叠。半胱氨酸残基被丙氨酸替换。然后位置3和位置7被半胱氨酸替换，其由P2 CLIPS^TM连接。此i、i+4连接(‘装订’)在易于螺旋折叠的序列中诱导螺旋成核。

组4

标记螺旋_i7

模拟类型螺旋肽

描述长度15个的肽，具有参考序列(SEQ ID NO:14)衍生的14个的重叠。半胱氨酸残基被丙氨酸替换。然后位置3和位置11被半胱氨酸替换，其由P2 CLIPS^TM连接。此i、i+7连接(‘装订’)在易于螺旋折叠的序列中诱导螺旋成核。

组5

标记片

模拟类型片状的肽

描述长度15个的肽，具有参考序列(SEQ ID NO:14)衍生的14个的重叠。半胱氨酸残基被丙氨酸替换。然后位置6和位置9被半胱氨酸替换，其由P2 CLIPS^TM连接。在易于β片折叠的肽中，此形状被稳定化。

-ELISA筛选

在基于PEPSCAN的ELISA中测试抗体与每种合成肽的结合。将肽阵列与第一抗体溶液孵育(在4℃下过夜)。在洗涤之后，在25℃下将肽阵列与抗体过氧化物酶偶联物(SBA，目录号：2010-05)的1/1000稀释液孵育一小时。在洗涤之后，添加过氧化物酶基质2,2’-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸(ABTS)和2μl/ml的3％H₂O₂。在一小时之后，测量彩色显影。彩色显影用电荷耦合装置(CCD)-摄像机和图像处理系统进行量化。

-数据处理

从CCD摄像机获得的数值的范围从0至3000mAU，类似于标准的96孔板ELISA读数器。这些结果进行量化并储存在Peplab数据库中。偶尔地，包含气泡的孔导致假阳性的值。手动地检查这些卡片，并将任何由气泡引起的数值得分为0。

-合成质量控制

为了验证合成的肽的质量，平行合成了一组分开的阳性和阴性对照肽。将这些用抗体57.9(参考Posthumus等人，J.Virology,1990,64:3304-3309[病毒学杂志，1990，64:3304-3309])筛选。

-筛选细节

表7总结了抗体结合条件。对于Pepscan缓冲液和预处理(SQ)，这些数字表明竞争蛋白(马血清和卵清蛋白的组合)的相对量。

表7：筛选条件

1.2结果

-主要实验结果和信噪比确定

由筛选产生的原始ELISA结果的完整数据集的图形概述如示出在图2中。这里的方框图描绘每个数据集并指示每个数据集内的平均ELISA信号、分布和离群值。取决于实验条件(抗体的量、阻断强度等)，获得的ELISA数据的不同分布。该数据使能鉴定表位。

在正常严格条件下，将阵列与MIL38-AM4在1μg/ml和10μg/ml的稀释液中孵育。观察到浓度依赖响应(图3)。在10μg/ml，没有观察到没有观察到饱和，表明没有肽呈现完整的表位。鉴定了在一级结构中不相邻的两组响应。出现了两个常见的核心：₁₃₅TQNARAFRD₁₄₃(SEQ ID NO:7)和₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)，其中后一个延伸相对于前者明显地占优势。

在衍生自蛋白质数据库标识符(PBD ID)4AD7(http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/4AD7)(图4)的三维结构(3D)模型中，延伸₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)不解析，也没有在另一个公开的可获得的pdb坐标文件(4ACR，4BWE)中，这表明它可能是灵活的。延伸₁₃₅TQNARAFRD₁₄₃(SEQ ID NO:7)位于该缺失环的邻近处，从V348和G362的位置可以看出，它们在3D模型中被解析。

通常看到结合不完全模拟物，这些模拟物部分地满足抗体需求，类似于我们观察到的MIL38-AM4与此阵列中的肽的结合。我们假设不连续表位，该不连续表位由来自柔性环₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)的主要贡献和来自螺旋₁₃₅TQNARAFRD₁₄₃(SEQ ID NO:7)的(残基)的次要贡献组成。

1.3总结和讨论

此研究旨在绘制鼠科抗人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(MIL38-AM4)的表位。进行跨越具有不同构象约束的参照序列的经验集，并在肽阵列上探测抗体。显著的结合指示不连续表位，该不连续表位由来自柔性环₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)的主要贡献和来自螺旋₁₃₅TQNARAFRD₁₄₃(SEQ ID NO:7)的(残基)的次要贡献组成。

实例2：由其他抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合的另外的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位的鉴定和表征

2.1材料和方法

下表8提供关于本研究中使用的抗体的信息。列出的前三种抗体是可商购的。

表8：使用的抗体的描述

^从以下项可商购的：抗体在线(antibodies-online)(http://www.antibodies-online.com)；寿命生命科学公司(LifeSpan BioSciences,Inc.)(https://www.lsbio.com)

*从

(http://www.abcam.com)可商购的

从默克密理博公司(Merck Millipore)(http://www.emdmillipore.com)可商购的

^§由美国组织典型培养物保藏中心(ATCC)在登录号HB11785下的混合杂交瘤产生的两种不同抗体群之一

-肽

将由SEQ ID NO:14定义的人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)序列用作产生结构化肽的文库的基础。

-在支架上化学连接的肽(CLIPS)技术

在这些实验中使用的CLIPS技术的一般原理如上述实施例1所示。

-肽合成

使用实例1中提及的方法进行肽合成。根据示出在实例1中的设计(组1-5)合成化学合成的线性肽和CLIPS肽。

-ELISA筛选

在基于PEPSCAN的ELISA中测试抗体与每种合成肽的结合，如列于实例1中。

-数据处理和合成质量控制

如之前的实例1进行数据处理和合成质量控制。

-筛选细节

表9总结了抗体结合条件。对于Pepscan缓冲液和预处理(SQ)，这些数字表明竞争蛋白(马血清和卵清蛋白的组合)的相对量。也使用P/Tw(PBS-吐温)以减少结合的严格性。

表9：筛选条件

2.2结果

-主要实验结果和信噪比确定

由筛选产生的原始ELISA结果的完整数据集的图形概述如示出在图5中。这里的方框图描绘每个数据集并指示每个数据集内的平均ELISA信号、分布和离群值。取决于实验条件(抗体的量、阻断强度等)，获得ELISA数据的不同分布。该数据能够识别用于单克隆和多克隆血清的表位，但不能用于MIL38-AM3。

-MIL38-AM3

甚至当在高浓度(10μg/ml)并在减少的严格性(PBS-吐温)下测试时，MIL38-AM3不能被检测。将该样品还用不同的第二抗体(绵羊抗小鼠IgG HRP；通用电气医疗集团(GEHealthcare)，NXA931)进行尝试，但是再次没有获得结果。

作为证实，我们尝试了直接ELISA，其中将MIL38-AM3涂覆在平板上。使用兔抗小鼠IgG-HRP(南方生物技术(Southern Biotech))，该抗体不能被检测。

-兔抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1/GPC1抗体ab137604

兔抗GPC1产生3种主要信号，如可以在图6中相应的小图中可见。这些信号对应于延伸₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)、₃₆₆PRERPP₃₇₁(SEQ ID NO:10)、和₄₇₈QDASDDGSGS₄₈₇(SEQ ID NO:11)。

-小鼠mAb 2600(密理博公司(Millipore))

在所有肽组中，小鼠抗体2600识别一个清除峰，这些肽共享公共核心₂₄₂LGPECSRAVMK₂₅₂(SEQ ID NO:13)。这可以在图6中的相应小图中可见。

-山羊抗GPC-1(GPC1)

山羊抗GPC-1产生2种主要信号，如可以在图6中相应的小图中可见。这些信号对应于延伸₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)和₄₀₈ALSTASDDR₄₁₄(SEQ ID NO:9)。

2.3总结和讨论

此研究旨在概括三种可商购的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1抗体和在相同阵列上的额外的mAb(MIL38-AM3)。在如列于实例1中的现有肽阵列上探测这些抗体。可以全部使用这些阵列绘制可商购的抗GPC-1抗体。由于表位的不连续性质抑或样品降解，并且没有在任何阵列上产生信号，抗体MIL38-AM3被证明难以绘制。

兔抗GPC-1识别在磷脂酰肌醇蛋白聚糖1中的至少三种延伸，₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)、₃₆₆PRERPP₃₇₁(SEQ ID NO:10)、和₄₇₈QDASDDGSGS₄₈₇(SEQ ID NO:11)。这些延伸中的两个在坐标文件4AD7.pdb中被解析，如图7A所示。由于这是多克隆抗体制剂，因此不能评估表位是线性的还是复合表位的一部分。

小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖mab 2600识别在阵列的所有肽组中延伸₂₄₂LGPECSRAVMK₂₅₂(SEQ ID NO:13)。坐标文件4AD7.pdb中表位的定位如图7B所示。

山羊抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1识别在磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)、和₄₀₈ALSTASDDR₄₁₄(SEQ ID NO:9)中的至少两个延伸。由于这是多克隆抗体制剂，因此不能评估表位是线性的还是复合表位的一部分。在可获得的坐标文件中没有延伸被解析。

兔和山羊多克隆制剂都识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖1中的延伸₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)，其中也形成Mab MIL38-AM4的(类似不连续)结合位点的一部分。两种多克隆制剂也识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖1上的另外表位，但不能评估这些表位是否形成不连续表位，或者是样品的多克隆性质的表现。pAb都不识别延伸₁₃₅TQNARA₁₄₀，该延伸被认为有助于MIL38-AM4结合。

小鼠Mab 2600识别不由之前测试此的任何其他抗GPC-1抗体共享的表位。

实例3：由其他抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合的另外的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位的鉴定和表征

3.1材料和方法

下表10提供关于本研究中使用的抗体的信息。使用三种抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1抗体，每个已经在如以上实例1和/或实例2中描述的更早的实验中使用。

表10：使用的抗体的描述

*从

(http://www.abcam.com)可商购的

由保藏在澳大利亚细胞库(Cellbank Australia)在登录号CBA20140026下的杂交瘤细胞产生

-肽

本研究所基于的人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)序列在SEQ ID NO:14中定义。使用残基的以下序列：

GPC1_残基#344-366GNPKVNPQGPGPEEKRRRGKLAP(SEQ ID NO:15)

GPC1_残基#131-149GELYTQNARAFRDLYSELR(SEQ ID NO:16)

-肽合成

使用实例1中提及的方法进行肽合成。根据以下示出的设计合成化学合成的线性肽和CLIPS肽：

组1

模拟不连续表位模拟

类型

标记 MAT.A，MAT.B

描述不同长度的约束肽模拟物。从两个起始序列(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16)，用4步骤制得所有10mer至22mer、以及10mer至18mer的肽，并将这些配对。在该两个肽末端和中间，半胱氨酸被放入。这些由T3 CLIPS链接。

组2

模拟线性肽

类型

标记 RN.PKVNPQGPGPEEKRR(SEQ ID NO:17)

描述取代分析，从碱基序列PKVNPQGPGPEEKRR(SEQ ID NO:18)开始，所有的个体氨基酸被所有自然存在的氨基酸(除了半胱氨酸)替换。

组3

模拟约束肽。

类型

标记 RN.PKVNPQGPGPEEKRR_LOOP(SEQ ID NO:17)、RN.ELCTQNCRAFRDLYS_heli3(SEQ ID NO:19)RN.ELCTQNCRAFRDLYS_LOOP(SEQ ID NO:19)

描述取代分析，从在标记名称中指示的碱基序列开始，所有的个体氨基酸被所有自然存在的氨基酸(除了半胱氨酸)替换。

-ELISA筛选

-数据处理和合成质量控制

如之前的实例1进行数据处理和合成质量控制。

-热图分析

使用的热图方法学的简要的综述列于以下。

热图是数据的图形表示，其中二维图中的变量所取值被表示为颜色。对于双环CLIPS肽，可以从第一和第二环的独立序列导出这样一个二维图。例如，给定系列的16个CLIPS肽的序列是在环1中的4个独特子序列和环2中的4个独特子序列的有效排列。因此，可以将观察到的ELISA数据绘制在4x4矩阵中，其中每个X坐标对应于第一环的序列，并且每个Y坐标对应于第二环的序列。

为了进一步促进可视化，ELISA值可以用阴影的连续梯度替换。在这种情况下，极低的值是浅着色，极高的值是更深的着色，并且平均值为黑色。当此梯度图应用于数据矩阵中时，获得阴影的热图。

-筛选细节

表11总结了抗体结合条件。对于Pepscan缓冲液和预处理(SQ)，这些数字表明竞争蛋白(马血清和卵清蛋白的组合)的相对量。

表11：筛选条件

3.2结果

-主要实验结果和信噪比确定

由筛选产生的原始ELISA结果的完整数据集的图形概述如示出在图8中。这里的方框图描绘每个数据集并指示每个数据集内的平均ELISA信号、分布和离群值。取决于实验条件(抗体的量、阻断强度等)，获得ELISA数据的不同分布。

-兔多克隆Ab 137604

在实例2中，发现延伸₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)足以结合来自兔多克隆Ab137604的一些IgG。在此研究中，包含₃₄₈VNPQGPGPEE₃₅₇(SEQ ID NO:3)的所有构建体再次以1/2500稀释度与来自此样品的IgG结合。在组1的矩阵中，在特定构建体中没有信号的增大。

从图9的取代分析可以看出，残基P353、G354和E356是必需的。在位置Q351、G352和E357允许有限的取代。

-山羊多克隆抗GPC-1

在实例2中，延伸₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)也足以结合来自山羊多克隆抗GPC-1的一些IgG。此抗体识别与兔多克隆相同(但确实是也具有稍微不同的精细特异性)的环。在图10的字母图中，可以看出，最关键的残基是G352、G354和E356，并且在位置N349、Q351和P353上允许有限的取代。在组1的矩阵中，可以看见信号的增大。尽管残基140-149周围的延伸并不暗示在此抗体的主要映射中，但是包括此延伸的不同构建体是用于与在此多克隆中的一些IgG结合的更好的诱饵。

-抗体MIL38-AM4

在实例1和2中，确定MIL38-AM4在延伸₃₄₈VNPQGPGPEEK₃₅₈(SEQ ID NO:2)上结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖，并且还结合延伸₁₃₅TQNARA₁₄₀(SEQ ID NO:8)，延伸₁₃₅TQNARA₁₄₀被作为不连续表位的指示。

包含主要延伸的环状结构确定了对结合最关键的残基。从图10可以看出，残基V348、Q351、G352和P353不能容忍替换，对K347、N349和P350有着显著的需求并在更小程度上来自G354、P355和E356。

通过将来自范围135-143的残基添加到组1的主环矩阵中，优化用于由MIL38-AM4识别的模拟物。

在这些系列中对V348和周围残基的要求再次显现。在矩阵组中存在另外的结合，结果导致对于T3构建的CGELYTQNARAFRDLCGNPKVNPQGPGPEEKRRRGC(SEQ ID NO:12)(图12)的最佳信号。

-相似性和相异性

如可以在图13的散点图中看出，这些抗体结合或不结合相似的构建体。然而，许多构建体唯一地被制剂(沿着轴的点，或在右下角和左上角)之一可见。

-结论

在实例1和2的后续中，对抗体MIL 38-AM4的构象表位进行了描述。发现多克隆抗体AB137604(兔)和抗GPC-1 24-530(山羊)识别相似的表位。在相同的测定中对比并比较这些。

使用实例1中获得的指向MIL 38-AM4的不连续表位的两个引导物来产生其中环具有不同长度的矩阵阵列。此外，进行了个体引导物序列的完全取代分析。用以上列出的三种抗体探测所有阵列。

为了识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，在本研究中调查的所有抗体都与专一或主要地由在残基347和358之间的柔性环组成的表位结合。然而，它们的精细特异性不同，这可以对其功能特性有影响，这反过来可以影响体内的选择性或鉴别性测试中的适用性。

兔多克隆Ab 137604的表位(一些以IgG种类存在)是线性延伸₃₄₈VNPQGPGPEE₃₅₇(SEQ ID NO:3)。不存在识别构象表位的抗体的存在的指示。

由山羊多克隆抗GPC-1(一些以IgG种类)也可以看到相同的柔性环。对结构化模拟物有一些偏好，尽管这不是很重要。很可能在此制剂中不是所有抗体都以相同的方式看到柔性环。单克隆抗体MIL38-AM4主要在残基347-355之间的环上结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，但是此抗体明显地从将135-143范围内的残基添加至肽中获益。产生的模拟物仍然不是最佳的，这反映在需要1000-倍更高浓度的抗体以获得如与记录为兔Ab 137604相似的信号强度的事实，进一步证明了对结合底物提出的附加要求。

这对于通过定量方法(例如Biacore)确定的对靶蛋白的亲和力没有影响。事实上，精致的选择性标记抗体可以在体内使用而不引起副作用。

表12：在此研究中的抗体的表位

基以上呈现的结果，下表13代表了在所分析的表位序列中耐受的取代的概述。

实例4.MIL38和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗GPC-1)抗体在2D蛋白质印迹上示出重叠反应性。

兔抗GPC-1抗体ab137604示出与分子量大约60kDa(与MIL38检测到的分子量相同)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1核心蛋白的反应性。为了证实MIL38识别出磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，将前列腺癌DU-145MPEK提取物经受2D电泳和蛋白质印迹。

DU-145前列腺癌细胞的膜蛋白提取物(MPEK)在2D凝胶上分离(pI梯度-水平，并且分子质量垂直)。使用MIL38抗体和商业的rGPC-1兔多克隆抗体的蛋白质印迹示出标记60Kd蛋白质的重叠反应性(在图14中的圆圈)。泳道D(图14)是作为对照的DU-145提取物的一维分离。泳道M(图14)是作为对照的分子大小标记的一维分离泳道。

如在图14中示出，MIL38抗体和抗GPC-1抗体示出检测具有60kDa分子量并且等电点范围从5至7的蛋白质的重叠反应性。

实例5.在抗GPC-1免疫沉淀中检测到MIL38，并且反之亦然。

使用MIL38或兔抗GPC-1抗体免疫沉淀来自DU-145或C3(MIL38阴性)MPEK提取物的其各自的抗原。免疫沉淀物(IPs)是用MIL38抑或抗GPC-1抗体蛋白质印迹的(图15)。

在用抗GPC-1印迹的MIL38 IP中检测到60kDa GPC-1反应性条带，而用MIL38印迹的抗GPC-1IP中检测到60kDa MIL38反应性条带。仅与二级对照没有检测到反应性。此外，用MIL38抗体的免疫沉淀反应导致MIL38和抗GPC-1抗原两者的几乎全部耗尽，强烈地提示MIL38抗原是磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。

将MIL38和兔抗GPC-1抗体各自用于免疫沉淀来自DU-145前列腺癌或C3(MIL38阴性)细胞膜蛋白提取物的其抗原。示出用MIL38抑或抗GPC-1抗体检测的免疫沉淀的蛋白质印迹。图15A描绘GPC1检测MIL38免疫沉淀物(左)和MIL38检测GPC1免疫沉淀物(右)。图15B描绘作为对照的MIL38检测MIL38免疫沉淀物。泳道是：魔法标记-商业蛋白质标记作为对照；DU145 MPEK-前列腺癌膜蛋白提取物(没有免疫沉淀的)；DU145 FT-前列腺癌从免疫沉淀中流过；使用抗体的DU145 IP-免疫沉淀；C3 MPEK-(MIL38阴性)对照膜蛋白提取物(没有免疫沉淀的)；C3 FT-从免疫沉淀中流过；使用抗体的C3 IP洗脱-(MIL38阴性)的免疫沉淀。MIL38可以检测来自rGPC1抗体的免疫沉淀物，并且反之亦然。MIL38也可以结合包括DU145MPEK的所有对照，并结合由MIL38进行的IP。

实例6.GPC-1可以由前列腺癌血浆样品以及来自前列腺癌患者的膜提取物中的MIL38检测。

将来自一个正常患者(042)和一个前列腺癌患者(046)的血浆样品用MIL38抗体免疫沉淀，并且将IP样品用MIL38和抗GPC-1抗体蛋白质印迹(图16A)。

在全部两个血浆样本中，两种抗体检测到大约70kDa的特异性条带。与正常患者血浆相比，前列腺癌患者血浆中MIL38和抗GPC-1抗体二者的信号明显更高(更暗的条带)，这提示前列腺癌患者中此可溶性形式的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1可能升高。

为了确定是否可以在来自正常的前列腺和前列腺癌的膜蛋白提取物中检测到MIL38抗原，每个样品均从Novus Bio公司获得。使用MIL38抗体进行蛋白质印迹等量的蛋白质(图16B)。前列腺癌提取物展示比正常前列腺样品远远更高的MIL38抗原的表达。

实例7.在患者尿中检测MIL38抗原。

MIL38可以检测前列腺癌患者尿中的细胞。为了测试此检测方法的灵敏度和特异度，获得了125个年龄匹配的尿样。将细胞从尿液中离心沉淀并通过MIL38间接免疫荧光测定进行分析。分析了总计47个健康对照、37个良性前列腺肥大(BPH)和41个活检证实的前列腺癌。

MIL38免疫荧光测定(IFA)检测展示在组内鉴定前列腺癌方面，71％的灵敏度和73％的特异度。与BPH患者相比，此测试示出在鉴定前列腺癌方面，71％的灵敏度和76％的特异度(表14)。

表14：在患者尿中的前列腺癌检测的灵敏度和特异度的计算。

Claims

1.一种分离的表位肽，该分离的表位肽用于抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（GPC-1）抗体，该分离的表位肽位于由氨基酸序列KVNPQGPGPEEK（SEQ ID NO: 1）定义的一部分GPC-1柔性环内，其中该分离的表位肽的氨基酸序列为：

(i) KVNPQGPGPEEK（SEQ ID NO: 1）；

(ii) KVNPQGPGPEEK（SEQ ID NO: 1）的片段，该片段由以下项组成：VNPQGPGPEEK（SEQID NO: 2）、VNPQGPGPEE（SEQ ID NO: 3）、NPQGPGPEE（SEQ ID NO: 4）、KVNPQGPGPE（SEQ IDNO: 5）或KVNPQGPGP（SEQ ID NO: 6）；

(iii) SEQ ID NO: 3的变体，具有仅在以下位置中的任一处的取代：

位置1，其中V（val）被任何其他氨基酸取代，

位置2，其中N（asn）被任何其他氨基酸取代，

位置3，其中P（pro）被任何其他氨基酸取代，

位置4，其中Q（gln）被Y（tyr）、A（ala）、E（glu）、V（val）、M（met）、F（phe）、L（leu）、I（ile）、T（thr）或R（arg）中的任一个取代，

位置5，其中G（gly）被A（ala）、S（ser）、T（thr）、H（his）、W（trp）、Y（tyr）、F（phe）或M（met）取代，

位置8，其中P（pro）被任何其他氨基酸取代，或者

位置10，其中E（glu）被Q（gln）、D（asp）、F（phe）、H（his）或M（met）取代，

(iv) SEQ ID NO: 4的变体，具有仅在以下位置中的任一处的取代：

位置1，其中N（asn）被H（his）取代，

位置2，其中P（pro）被任何其他氨基酸取代，

位置3，其中Q（gln）被N（asn）、M（met）、T（thr）、S（ser）或R（arg）中的任一个取代，

位置5，其中P（pro）被A（ala）取代，

位置7，其中P（pro）被A（ala）、D（asp）、C（cys）、Z（glx）、G（gly）、H（his）、K（lys）、M（met）、F（phe）、P（pro）、S（ser）、T（thr）、W（trp）或Y（tyr）中的任一个取代，或者

位置9，其中E（glu）被任何其他氨基酸取代；或者

(v) SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6的变体，具有仅在以下位置中的任一处的取代：

位置1，其中K（lys）被W（trp）、R（arg）、L（lys）、Y（tyr）或F（phe）中的任一个取代；

位置3，其中N（asn）被H（his）、P（pro）或D（asp）中的任一个取代；

位置4，其中P（pro）被R（arg）、K（lys）、W（trp）、S（ser）、H（his）或N（asn）中的任一个取代；

位置8，其中G（gly）被D（asp）、E（glu）、N（asn）、Q（gln）、K（lys）、R（arg）或A（ala）中的任一个取代；或者

位置9，其中P（pro）被M（met）、A（ala）、I（ile）、K（lys）、R（arg）、Q（gln）、S（ser）、T（thr）或Y（tyr）中的任一个取代。

2.一种核酸，该核酸编码根据权利要求1所述的表位肽。

3.检测来自受试者中的生物样品中根据权利要求1所述的表位肽的存在的一群抗体在制备用于基于在该样品中检测到的该表位肽的量确定该受试者是否患有前列腺癌或具有发展前列腺癌的增加的可能的诊断剂中的用途，其中该一群抗体能够特异性结合根据权利要求1所述的表位肽，并且其中该一群抗体包括以下项中的任一个或多个：MIL38抗体、兔抗GPC-1多克隆抗体、小鼠抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖单克隆抗体2600克隆4D1或山羊抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖1抗体。

4.根据权利要求3所述的用途，其中检测该样品中表位肽的存在包括将该样品与所述一群抗体接触。

5.一种融合蛋白，该融合蛋白包含根据权利要求1所述的表位肽。

6.根据权利要求1所述的表位肽或者根据权利要求5所述的融合蛋白在制备用于检测GPC-1的非诊断方法中的阳性对照元素的用途。

7.根据权利要求1所述的表位肽或者根据权利要求5所述的融合蛋白在制备用于检测GPC-1的诊断剂中的用途。