CN111187350A - 一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1结合的抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑1结合的抗原结合蛋白，具体涉及抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑1抗体的组合物及方法技术领域，所述抗体包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明提供了抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑1抗体的核酸，抗体片段及其衍生物和多肽，含有所述多肽的细胞，制备所述抗体、抗体片段及其衍生物和多肽的方法，还提供了所述抗体、抗体片段及其衍生物和多肽的应用，包括检测外泌体，血液和其他体液中磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑1的含量，以及治疗或诊断与磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑1相关的疾病或症状，从而提高了疾病治疗的效率。

Description

一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1结合的抗原结合蛋白
技术领域
本发明涉及抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体的组合物及方法技术领域，更具体地说，本发明涉及一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1结合的抗原结合蛋白。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1是一种膜性糖蛋白，含有一个蛋白核心，并通过糖基磷脂酰基醇(GPI)锚定在细胞膜上。它影响多种生物效应，包括生长因子信号传导和细胞增殖，对组织和器官的发生与发育起着调节作用。它在神经胶质瘤和神经胶质瘤起源的细胞株中表达增加，在胰腺和乳腺癌细胞中也过量产生。它还被视为前列腺癌的潜在生物标记物。鉴于它与几类癌症的密切关系，以其为靶点进行相关癌症的诊断和治疗的研究也在蓬勃的展开，包括对血液中外泌体所含磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的量化检测，以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1为靶点的治疗性抗体开发以及免疫疗法免疫毒素及多肽疫苗等的开发。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1结合的抗原结合蛋白，提供了抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体的核酸，抗体片段及其衍生物和多肽，含有所述多肽的细胞，制备所述抗体、抗体片段及其衍生物和多肽的方法，还提供了所述抗体、抗体片段及其衍生物和多肽的应用，包括检测外泌体，血液和其他体液中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的含量，以及治疗或诊断与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1相关的疾病或症状(包括多种癌症)，从而提高了疾病治疗的效率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位结合的IgG类抗体，所述抗体包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
一种IgG类的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体，所述抗体包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列所示的互补决定区，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列所示的互补决定区。
一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体Fab片段，所述抗体Fab片段包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
一种抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1单链抗体，所述抗体包括由连接肽连接的重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在一个优选地实施方式中，所述SEQ ID NO.1氨基酸序列具体为：
VQLQESGAELVKPGASVKVACKASDYTFTSYNMHWIKQTPGQGLEWIGAIYPGIGDASYNQKFRGKATLTADKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCAREGISLVATPAMDFWGQGTSVTVSSAKTTPKLVYPLAP；
所述SEQ ID NO.2氨基酸序列具体为：
GDIMLTQSPASLAVSLGQRATISCRTSESVDSYGKGIMHWYQQKPGQPPKLLVYRASNLEFGIPARFSGSGSRTDFTLTIDPVETDDFATYYCQQSNEEPYTFGGGTKLEIKRADAAPTGSIF。
在一个优选地实施方式中，所述与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位结合的IgG类抗体、IgG类的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1单链抗体中任一项抗体均在制备中有用于治疗癌症的药物中的用途；制备中有用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1含量的试剂和试剂盒中的用途，包括检测外泌体，血液和其他体液中的含量；制备中有用于诊断癌症的试剂和试剂盒中的用途，包括伴随诊断和辅助诊断。
在一个优选地实施方式中，所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体Fab片段在制备中有用于治疗癌症的药物中的用途；制备中有用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1含量的试剂和试剂盒中的用途，包括检测外泌体，血液和其他体液中的含量；制备中有用于诊断癌症的试剂和试剂盒中的用途，包括伴随诊断和辅助诊断。
在一个优选地实施方式中，所述癌症选自神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、原始神经母细胞性的CNS瘤、单核细胞性白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴癌、T细胞性淋巴癌和肥大细胞性肿瘤。
一种药学组合物，包含与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位结合的IgG类抗体、IgG类的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1单链抗体中任一项所述的抗体或抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体Fab片段抗体和药学可接受的载体。
本发明的技术效果和优点：本发明提供了抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体的核酸，抗体片段及其衍生物和多肽，含有所述多肽的细胞，制备所述抗体、抗体片段及其衍生物和多肽的方法，还提供了所述抗体、抗体片段及其衍生物和多肽的应用，包括检测外泌体，血液和其他体液中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的含量，以及治疗或诊断与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1相关的疾病或症状(包括多种癌症)，从而提高了疾病治疗的效率。
附图说明
图1为本发明的双抗夹心法Elisa检测纯化磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1示意图。
图2为本发明的双抗夹心法Elisa检测外泌体中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位结合的IgG类抗体，所述抗体包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
一种IgG类的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体，所述抗体包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列所示的互补决定区，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列所示的互补决定区。
一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体Fab片段，所述抗体Fab片段包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
一种抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1单链抗体，所述抗体包括由连接肽连接的重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
所述SEQ ID NO.1氨基酸序列具体为：
VQLQESGAELVKPGASVKVACKASDYTFTSYNMHWIKQTPGQGLEWIGAIYPGIGDASYNQKFRGKATLTADKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCAREGISLVATPAMDFWGQGTSVTVSSAKTTPKLVYPLAP；
所述SEQ ID NO.2氨基酸序列具体为：
GDIMLTQSPASLAVSLGQRATISCRTSESVDSYGKGIMHWYQQKPGQPPKLLVYRASNLEFGIPARFSGSGSRTDFTLTIDPVETDDFATYYCQQSNEEPYTFGGGTKLEIKRADAAPTGSIF。
所述与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位结合的IgG类抗体、IgG类的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1单链抗体中任一项抗体均在制备中有用于治疗癌症的药物中的用途；制备中有用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1含量的试剂和试剂盒中的用途，包括检测外泌体，血液和其他体液中的含量；制备中有用于诊断癌症的试剂和试剂盒中的用途，包括伴随诊断和辅助诊断。
所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体Fab片段在制备中有用于治疗癌症的药物中的用途；制备中有用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1含量的试剂和试剂盒中的用途，包括检测外泌体，血液和其他体液中的含量；制备中有用于诊断癌症的试剂和试剂盒中的用途，包括伴随诊断和辅助诊断。
所述癌症选自神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、原始神经母细胞性的CNS瘤、单核细胞性白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴癌、T细胞性淋巴癌和肥大细胞性肿瘤。
一种药学组合物，包含与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位结合的IgG类抗体、IgG类的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1单链抗体中任一项所述的抗体或抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体Fab片段抗体和药学可接受的载体。
实施例2：
使用双抗夹心法Elisa检测纯化磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，具体检测步骤如下：
1、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体按1：1000稀释于TBS中，向酶标板每孔加入50微升，放置37℃孵育1小时。
2、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
3、准备1％BSA溶液，向孔内加入100微升，4℃孵育过夜。
4、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
5、梯度稀释纯化磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，按稀释梯度加入酶标板。向每孔加入50微升，放置37℃培养箱中孵育1小时。
6、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
7、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(Glypican-1)兔多抗按1：1000比例稀释于0.1％BSA溶液中，每孔中加入100微升，放置37℃培养箱中孵育1小时。
8、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
9、HRP-抗兔抗体按1：10000比例稀释于0.1％BSA溶液中，每孔中加入100微升，放置37℃培养箱中孵育1小时。
10、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
11、使用Elisa显色液显色5-纳米30分钟，待颜色显出，加入终止液反应5-10分钟。
12、放置于酶标仪490纳米波长下进行数值测量。
实施例3：
使用双抗夹心法Elisa检测外泌体中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，具体检测步骤如下：
一)外泌体提取步骤：
1、从-80℃冰箱中取血浆样品，冰上解冻。
2、按100：1加入凝血酶，室温静置15分钟，1500rpm离心5分钟，取上清。
3、按4：1加入ExoQuick Exosome precipitation solution，混匀后4℃，放置2小时。
4、4℃离心1500g 45分钟。
5、弃上清。
6、按下步实验需要加入NP40裂解液。
二)Elisa步骤：
1、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体按1：1000稀释于TBS中，向酶标板每孔加入50微升，放置37℃孵育1小时。
2、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
3、准备1％BSA溶液，向孔内加入100微升，4℃孵育过夜。
4、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
5、梯度稀释提取的外泌体，按稀释梯度加入酶标板。向每孔加入80微升，放置37℃培养箱中孵育1小时。
6、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
7、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(Glypican-1)兔多抗按1：1000比例稀释于0.1％BSA溶液中，每孔中加入100微升，放置37℃培养箱中孵育1小时。
8、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
9、HRP-抗兔抗体按1：10000比例稀释于0.1％BSA溶液中，每孔中加入100微升，放置37℃培养箱中孵育1小时。
10、弃液体，每孔加入200微升TBST进行清洗，三次，每次3分钟。
11、使用Elisa显色液显色5-纳米30分钟，待颜色显出，加入终止液反应5-10分钟。
12、放置于酶标仪490纳米波长下进行数值测量。
“抗原结合蛋白”是包括以下部分的蛋白：与抗原结合的部分；以及可选地，允许抗原结合部分采取促进抗原结合蛋白与蛋白的结合的构型的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的例子包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。该抗原结合蛋白可以包括，例如，具有接枝的CDRs或CDRs衍生物的替代蛋白支架或人工支架。所述支架包括但不限于，包含引入了突变(例如用于稳定该抗原结合蛋白的三维结构的突变)的抗体衍生支架，以及包括例如生物可相容聚合物的全合成支架。例如参见：Korndorferetal.，2003，Proteins:Structure，Function，and Bioinformatics，Volume 53，Issue 1:121-129；Roque et al.，2004，Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可以使用多肽抗体模拟物("PAMs")，以及基于以纤维蛋白连接素成分为支架的抗体模拟物的支架。
抗原结合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚物分子。在天然存在的球蛋白中，每个四聚物由2对相同的多肽链组成，每对中有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100-110或以上氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羰基末端部分具有恒定区，主要负责效应子功能。人轻链归类为κ(ka ppa)或λ(lambda)轻链；重链归类为μ(mu)、Δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)，分别令抗体的种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区由约12个或以上氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括一个含约10个或以上氨基酸的“D”区。一般请参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.(1989))(在此为通用目的以引用方式全文引入)。每对轻/重链的可变域组成了抗体结合位点，因此一个完整的免疫球蛋白具有2个结合位点。
天然存在的免疫球蛋白链具有的相同通用结构为相对保守骨架区(FR)连接3个高变区(也称为互补决定区或CDRs)。从N-端到C-端，轻链和重链均包含以下域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个域中的氨基酸分配与Kabat et al.在Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.，US Dept.of Health and HumanServices，PHS，NIH，NIH Publication no.91-3242，1991中所述一致。其他的免疫球蛋白链氨基酸编号系统包括IMGT.RTM.(国际免疫遗传学信息系统(InternationalImMunoGeneTics information system)；Lefranc et al.，Dev.Comp.Immunol.29:185-203；2005)和AHo(Honegger and Pluckthun，J.Mol.Biol.309(3):657-670；2001)。
抗体可以从含多样化抗原特异性免疫球蛋白的血清或血浆等来源制得。如果此类抗体进行亲和纯化，则能够针对特定抗原特异性进行富集强化。所述抗体富集制剂通常由低于约10％的针对特定抗原具有特定结合活性的抗体组成。将这些制剂经过几轮亲和纯化，能够增加针对抗原具有特定结合活性的抗体的比例。以此方式制备的抗体通常称为“单特异性”。单特异性抗体制剂可以由约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％的针对特定抗原具有特定结合活性的抗体组成。
“抗体”指的是完整免疫球蛋白或其能与完整抗体为特异结合而竞争的抗原结合部分，除非另有说明。抗原结合部分可以由重组DNA技术或完整抗体的酶切或化学裂解法制备。抗原结合部分包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗体(dAbs)，以及互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、二聚体、三聚体、四聚体和至少包含足以令特定抗原与多肽结合的免疫球蛋白部分的多肽。
Fab片段是具有VL、VH、CL和CH1域的单价片段；F(ab')2片段是具有2个Fab片段的二价片段，其Fab片段在铰链区处由二硫键连接；Fv片段具有抗体单臂的VL和VH域；dAb片段具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段(Ward et al.，Nature 341:544-546，1989)。
单链抗体(scFv)是一种抗体，其中VL和VH域由连接子(例如，氨基酸残基合成序列)连接以形成连续蛋白链，且该连接子的长度足以允许该蛋白链自身折叠并形成单价抗原结合位点(参见例如Bird et al.，1988，Science 242:423-26and Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。二聚体是含有两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括由连接子连接的VL和VH域，且该连接子长度短，不允许同一条链上的两个域之间配对，由此每个域能够与另一条多肽链上的互补域配对(参见例如Holliger et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48，and Poljak et al.，1994，Structure 2:1121-1123)。若二聚体的2条多肽链相同，则其配对所得的二聚体将具有2个相同的抗原决定位点。具有不同序列的多肽链可用于形成具有2个不同抗原结合位点的二聚体。类似地，三聚体和四聚体分别是含有3个或4个多肽链并分别形成3个或4个抗原结合位点(可以相同或不同)的抗体。
可以使用Ka bat et al.supra；Lefranc et al.，supra和/或Honegger andPluckthun，supra所描述的体系，来识别特定抗体的互补决定区(CDRs)和骨架区(FR)。一个分子中可以共价或非共价地包含一个或多个CDRs，来使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以并入作为较大多肽链的一部分的CDR(s)，可以将该CDR(s)共价连接另一个多肽链，或可以非共价地连接该CDR(s)。所述CDRs允许该抗原结合蛋白与所需的特定抗原进行特异结合。
本领域技术人员根据本说明书的教导并使用本领域熟知的技术，能够容易地制备抗体片段或类似物。片段或类似物的氨基末端和羰基末端优选为靠近功能域的边界。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私人序列数据库，来识别结构域和功能域。可以使用计算机化的比较方法来识别存在于已知结构和/或功能的其他蛋白中的序列基序或预期蛋白构造域。用于识别折叠为已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的，参见Bowieet al.，1991，Science 253:164。
“CDR接枝抗体”是含有来自特定物种或种型抗体的一个或多个CDRs和来自相同或不同物种或种型的另一抗体的骨架的抗体。“抗原结合域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”是指抗原结合蛋白上含有与抗原相互作用的氨基酸残基(或其他化学部分)并有利于该抗原结合蛋白对该抗原的特异性和亲和性的部分。对于与其抗原特异结合的抗体而言，这包括其至少一个CDR域的至少一部分。
“表位”是分子上连接抗原结合蛋白(例如，抗体)的部分。表位可以包括该分子的非邻近部分(例如，在多肽中，在多肽一级序列中并不相邻但在该多肽的三级和四级结构中相互足够靠近以被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。
两个多核苷酸或两个多肽序列的“相同百分比”是用GAP电脑程序(GCG WisconsinPackage，version10.3(Accelrys，San Diego，Calif.)中的一部分)以其默认参数来比较序列而确定的。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在全文中可交换地使用，其包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA基因组(例如mRNA)、以核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物(例如，肽核酸和非天然存在核苷酸类似物)及其杂合体。核酸分子可以是单链或双链的。在
一个实施例中，本发明的核酸分子包括编码抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的连续开放阅读框。
若两条单链多核苷酸的序列能够反向平行对齐，使得一条多核苷酸中的每个核苷酸都与另一条多核苷酸上的互补核苷酸相对，而不存在间隙，且各序列的‘5’端或‘3’端也没有不配对的核苷酸，则称这两条多核苷酸互为“互补链”。若两条多核苷酸可在中等严格条件下相互杂交，则称其“互补”。因此，一条多核苷酸可以在并非对方互补链的情况下与另一条多核苷酸互补。
“宿主细胞”是可用于表达核酸(例如本发明的核酸)的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如E.coli；或真核细胞，例如真核单细胞(如酵母菌或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、小鼠细胞、大鼠细胞或昆虫细胞)或杂种细胞。宿主细胞的例子包括猴肾细胞COS-7系(ATCC CRL 1651)(参见Gluzmanet al.，1981，Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物|(例如Veggie CHO)和在无血清培养基上生长的相关细胞系(参见
Rasmussen et al.，1998，Cytotechnology 28:31)，或CHO的DX-B11品系(缺少DHFR)(参见Urlaub et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL10)细胞系、源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)(参见McMahan et al.，1991，EMBOJ.10:2821)、人胚肾细胞(例如293、293EBNA或MSR 293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化灵长类细胞系、正常二倍体细胞、源于初生组织和初生外植体的体外培养所得的细胞系、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。典型地，宿主细胞是能够以编码多肽且能够在该宿主细胞中表达的核酸转化或转染得到的培养细胞。术语“重组宿主细胞”可用于表示已经用需表达的核酸来转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是指包含该核酸，但在调控序列被引入该宿主细胞并与该核酸可操作连接以前，并不以所需表达水平来表达该核酸的细胞。应当理解，术语“宿主细胞”并不单指特定的对象细胞，而是也指所述细胞的后代或潜在后代。因为由于例如突变或环境影响的存在，后代中可能发生某些修饰，使得这些后代事实上与其亲代细胞并不等同，但其仍应属于本文中的“宿主细胞”术语所涵盖的范围。
本申请的多肽可使用本领域已知的任何标准方法制得.可以以DNA重组的方法，通过将编码该多肽的核酸序列(例如，cDNA)插入重组表达载体，并在促进表达的条件下表达该DNA序列来制得的。
编码本文公开的各种多肽的核酸可以化学合成制得。可以选择密码子使用来提高细胞中的表达。所述密码子使用取决于所选择的细胞类型。E.coli和其他细菌，以及哺乳类细胞、植物细胞、酵母菌细胞和昆虫细胞，都已经发展了专门的密码子使用模式。参见示例：Mayfield et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003100(2):438-42；Sinclair etal.Protein Expr.Purif.2002(1):96-105；Connell ND.Curr.Opin.Biotechnol.200112(5):446-9；Makrides etal.Microbiol.Rev.199660(3):512-38；和Sharpetal.Yeast.19917(7):657-78)。
用于核酸操作的常见技术描述例如可参见：Sambrooketal.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2ed.，1989；或Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology(Green Publishing andWiley-Interscience:New York，1987)及其定期更新，在此以引用方式并入本文。编码该多肽的DNA可操作地连接在源于哺乳类、病毒或昆虫基因的适当转录或翻译调节因子上。所述调节因子包括转录启动子、可选的用于控制转录的操纵子序列、编码适当mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。在宿主中进行复制的能力，通常是借由复制起点赋予的，而且此外还包含了用于帮助识别转化体的选择基因。
重组DNA还可以包括可能对纯化蛋白有用的任何蛋白标记序列种类。蛋白标记的例子包括但不限于组氨酸标记、FLAG标记、myc标记、HA标记或GST标记。适用于细菌、真菌、酵母菌和哺乳类细胞宿主的克隆和表达载体可以参见：Cloning Vectors:ALaboratoryManual，(Elsevier，N.Y.，1985)。
采取适用于宿主细胞的方法将该表达结构引入宿主细胞。本领域已知有各种用于将核酸引入宿主细胞的方法，包括但不限于：电穿孔；以氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)或其他物质进行的转染；微弹轰击法(microprojectile bombardment)；脂质转染；以及，感染(其中载体充当感染原)。适当的宿主细胞包括原核细胞、酵母菌、哺乳类细胞或细菌细胞。
适当的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，E.coli或Bacillus spp。酵母菌，优选为Saccharomyces菌种(例如S.cerevisiae)，也可以用于多肽制备。各种哺乳类或昆虫细胞培养体系也可用于表达重组蛋白。用于在昆虫细胞中制备外源蛋白的Baculovirus体系可参见综述：Luckow and Summers，(Bio/Technology，6:47，1988)。适当的哺乳类宿主细胞系的例子包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293，293T和BHK细胞系。通过培养适当的宿主/载体体系来表达重组蛋白，以制备纯化多肽。
本文所公开的蛋白还可以使用细胞翻译体系来制备。为此，必须对编码该多肽的核酸进行修饰，以允许体外转录以产生mRNA并允许该mRNA在所用的特定无细胞体系(真核(例如哺乳类或酵母菌)无细胞翻译体系或原核(例如细菌)无细胞翻译体系)中进行无细胞翻译。
结合性多肽还可以通过化学合成来制备(例如，按照Solid PhasePeptideSynthesis，2nd ed.，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.中所记载的方法)。也可以通过化学合成来对蛋白进行修饰。
本发明中的所述多肽可以通过蛋白化学领域众所周知的蛋白分离/纯化方法进行纯化。非限制性的例子包括：提取、重结晶、盐析(例如，硫酸铵或硫酸钠)、离心、渗析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳、逆流分布或其任意组合。纯化后，多肽可以交换入不同缓冲液，和/或以本领域所知各种方法中的任一种(包括但不限于过滤和渗析)浓缩。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”均指包括2个或以上相互以肽键连接的氨基酸残基的分子。这些术语涵盖，例如，天然和人工蛋白、蛋白片段、蛋白序列的多肽类似物(例如突变蛋白、变体蛋白或融合蛋白)，以及翻译后修饰蛋白，或共价或非共价修饰蛋白。肽、多肽或蛋白可以是单体或聚合体。
多肽(例如，抗体)的“变体”包括：相对于其他多肽序列而插入、删除和/或取代了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。已公开的变体包括，例如，融合蛋白。
多肽的“衍生物”是经过化学修饰的多肽(例如，抗体)，如通过连接另一个化学部分(例如，聚乙二醇，或白蛋白，如人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。除非另有说明，否则术语“抗体”除了指含有两条全长的重链和两条全长的轻链的抗体之外，还包括其衍生物、变体、片段及突变蛋白，其示例如下所述。
“抗原结合蛋白”是包括以下部分的蛋白：与抗原结合的部分；以及可选地，允许抗原结合部分采取促进抗原结合蛋白与蛋白的结合的构型的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的例子包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。该抗原结合蛋白可以包括，例如，具有接枝的CDRs或CDRs衍生物的替代蛋白支架或人工支架。所述支架包括但不限于，包含引入了突变(例如用于稳定该抗原结合蛋白的三维结构的突变)的抗体衍生支架，以及包括例如生物可相容聚合物的全合成支架。例如参见：Korndorferetal.，2003，Proteins:Structure，Function，and Bioinformatics，Volume 53，Issue 1:121-129；Roque et al.，2004，Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可以使用多肽抗体模拟物("PAMs")，以及基于以纤维蛋白连接素成分为支架的抗体模拟物的支架。
本发明提供的单克隆抗体可以使用本领域已知的任何方法来制备，例如从完成免疫接种程序的转基因动物中收获脾细胞并使其无限增殖化。所述脾细胞可以使用本领域任何技术来达成无限增殖化，例如将其与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。用于制备融合蛋白的杂交瘤技术的骨髓瘤细胞优选为不产生抗体、融合效率高，且缺乏某些酶从而无法在某些仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的选择性培养基中生长的细胞。适用于小鼠融合的细胞系的例子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul；用于大鼠融合的细胞系的例子包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和48210。可用于细胞融合的其他细胞系有U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
抗原结合蛋白可以由多种常规技术中的任一种来制备。例如，可以使用任何本领域已知技术，从天然表达所述蛋白的细胞中纯化而得(例如，从产生一种抗体的杂交瘤中纯化该抗体)，或在重组表达体系中制备。例如，参见：Monoclonal Antibodies，Hybridomas:ANew Dimension in Biological Analyses，Kennet et al.(eds.)，Plenum Press，NewYork(1980)；and Antibodies:A Laboratory Manual，Harlow and Land(eds.)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988)。
本领域已知的任何表达体系均可用于制备本发明的重组多肽。一般来说，以含有编码一种所需多肽的DNA的重组表达载体来转化宿主细胞。可以使用的宿主细胞包括原核细胞、酵母菌或更高等的真核细胞。原核细胞包括革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，例如E.coli或bacilli。更高等的真核生物包括昆虫细胞扩已建立的源于哺乳类的细胞系。使用的哺乳类宿主细胞系的例子包括猴肾细胞(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.，1981，Cell23:175)，L cells，293cells、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)(McMahan et al.，1991，EMBO J.10:2821)。适用于细菌、真菌、酵母菌和哺乳类细胞宿主的克隆和表达载体如Pouwels et al.(Cloning Vectors:A LaboratoryManual，Elsevier，N.Y.，1985)所述。
转化后的细胞可以在促进多肽表达的条件下培养，且以常规蛋白纯化程序来回收多肽。一种所述纯化过程包括使用亲和层析法，例如，通过能与PD-L1的全部或部分(例如胞外域)结合的基质。本申请的思路中使用的多肽包括基本不含内源性污染杂质的基本同质的重组哺乳类抗PD-L1抗体多肽。
可以使用多种已知技术中的任一种来制备抗原结合蛋白并筛选所需性质。某些技术涉及分离编码有感兴趣的抗原结合蛋白(例如，抗PD-L1抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操作该核酸。例如，该核酸可以融合到另一感兴趣的核酸，或通过添加、删除或取代一个或多个氨基酸残基来改变(例如，通过诱变或其他常规技术)。
单链抗体可通过氨基酸桥接(短连接肽)来连接重链和轻链可变域(Fv区)片段，以形成单一多肽链。所述单链Fvs(scFvs)通过在编码两个可变域多肽(VL和VH)的DNAs之间融合编码连接肽的DNA来制备。所得多肽可以自身折叠来形成抗原结合单体，或能够形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)，取决于两个可变域之间的柔性连接子的长度(Korttetal.，1997，Prot.Eng.10:423；Kortt et al.，2001，Biomol.Eng.18:95-108)。通过连接不同的含VL和VH的多肽，可以形成与不同表位结合的多价scFvs(Kriangkum et al.，2001，Biomol.Eng.18:31-40)。为制备单链抗体而开发的技术包括如Bird，1988，Science242:423；Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；Ward et al.，1989，Nature334:544，de Graaf et al.，2002，Methods Mol.Biol.178:379-87所述的技术。
抗原结合蛋白包括抗体的衍生物。该衍生化抗体可以包括能够赋予该抗体所需性质的任何分子或物质，例如在一种特定用途中增加其半排出期。所述衍生化抗体可以包括例如可检测的(或标签)部分(例如：放射性、比色的、抗原性或酶活性分子)、可检测珠(例如磁性或电子致密性的(如金珠))、结合另一分子(例如生物素或链霉亲和素)的分子、治疗性或诊断性部分(例如，放射性、细胞毒性或药学活性部分)或能够增加该抗体对一种特定用途(例如向对象如人类对象给药，或其他体内或体外用途)的适用度的分子。可用于衍生抗体的分子的例子包括白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。连接白蛋白且聚乙二醇化的抗体衍生物可以使用本领域所熟知的技术来制备。在一个实施例中，该抗体与甲状腺素运载蛋白(TTR)或TTR变体缀合或以其他方式结合。该TTR或TTR变体可以用选自以下种类的化学物质进行化学改性：葡聚糖、聚(N-乙烯基吡咯烷)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇及聚乙烯醇。
最后应说明的几点是：首先，在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变，则相对位置关系可能发生改变；
其次：本发明公开实施例附图中，只涉及到与本公开实施例涉及到的结构，其他结构可参考通常设计，在不冲突情况下，本发明同一实施例及不同实施例可以相互组合；
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位结合的IgG类抗体，其特征在于：所述抗体包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.一种IgG类的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体，其特征在于：所述抗体包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列所示的互补决定区，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列所示的互补决定区。
3.一种与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体Fab片段，其特征在于：所述抗体Fab片段包括重链可变域序列和轻链可变域序列，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
4.一种抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1单链抗体，其特征在于：所述抗体包括由连接肽连接的重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链可变域序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的重链可变域和轻链可变域，其特征在于：所述SEQID NO.1氨基酸序列具体为：
VQLQESGAELVKPGASVKVACKASDYTFTSYNMHWIKQTPGQGLEWIGAIYPGIGDASYNQKFRGKATLTADKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCAREGISLVATPAMDFWGQGTSVTVSSAKTTPKLVYPLAP；
所述SEQ ID NO.2氨基酸序列具体为：
GDIMLTQSPASLAVSLGQRATISCRTSESVDSYGKGIMHWYQQKPGQPPKLLVYRASNLEFGIPARFSGSGSRTDFTLTIDPVETDDFATYYCQQSNEEPYTFGGGTKLEIKRADAAPTGSIF。
6.根据权利要求1、2或4任意一项所述的抗体，其特征在于：所述与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位结合的IgG类抗体、IgG类的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1单链抗体中任一项抗体均在制备中有用于治疗癌症的药物中的用途；制备中有用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1含量的试剂和试剂盒中的用途，包括检测外泌体，血液和其他体液中的含量；制备中有用于诊断癌症的试剂和试剂盒中的用途，包括伴随诊断和辅助诊断。
7.根据权利要求3所述的抗体Fab片段，其特征在于：所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体Fab片段在制备中有用于治疗癌症的药物中的用途；制备中有用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1含量的试剂和试剂盒中的用途，包括检测外泌体，血液和其他体液中的含量；制备中有用于诊断癌症的试剂和试剂盒中的用途，包括伴随诊断和辅助诊断。
8.根据权利要求6或7任意一项所述的用途，其特征在于：所述癌症选自神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、原始神经母细胞性的CNS瘤、单核细胞性白血病、B细胞性白血病、T细胞性白血病、B细胞性淋巴癌、T细胞性淋巴癌和肥大细胞性肿瘤。
9.一种药学组合物，其特征在于：包含权利要求1-4中任一项所述的抗体或抗体Fab片段和药学可接受的载体。
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