CN113354737A

CN113354737A - 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体及其应用

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Publication number: CN113354737A
Application number: CN202110817631.2A
Authority: CN
Inventors: 张文军; 刘敏; 田文武; 李峰; 覃陆英
Original assignee: Guangzhou Aisimai Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Aisimai Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113354737B; WO2023001155A1

Abstract

本发明涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体及其应用。所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链互补决定区包括SEQ ID No.6‑8所示的氨基酸序列，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链互补决定区包括SEQ ID No.14‑16所示的氨基酸序列。所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体能够以高亲和力与磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑3特异性结合，能够激活T淋巴细胞，在提高免疫细胞活性和增强免疫应答、预防治疗肿瘤和感染性疾病等方面具有重要的应用前景。

Description

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学技术领域，涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体及其应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原发性肝癌的70％～90％，目前治疗肝癌晚期的靶向治疗药物仅有索拉菲尼，因而研究与开发肝癌特异性靶点药物具有重要的意义。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是近年发现的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)细胞表面特异性膜蛋白，是HCC靶向治疗的良好靶点。GPC3是一种结合在细胞膜表面的硫酸乙酰肝素(HS)糖蛋白，其基本结构由核心蛋白、硫酸乙酰肝素链和糖基化磷脂酰肌醇3部分组成，大小约66kD，GPC3的羧基末端与糖基化磷脂酰肌醇(GPI)共价结合连接在细胞膜上，氨基末端则游离在细胞外，其内部有多个二硫键连接，使其具有球形立体结构，GPC3蛋白结构可在第358位精氨酸和第359位精氨酸处被弗林(Furin)蛋白酶切割分成两个亚基，形成1个30kD的C端亚单位和1个40kD的游离N端亚单位，其中C端亚单位可与2条硫酸乙酰肝素链(HS链)结合，残留于肿瘤细胞的膜和胞质区；N端亚单位进入循环系统后成为可溶性GPC3分子分泌入血。

GPC3的HS基可与生长因子及其受体、细胞外基质蛋白和黏附分子等相互作用，参与调节细胞增殖、分化、黏附和迁移等，GPC3主要通过Wnts信号途径发挥作用，通过自分泌和旁分泌的方式来激活经典Wnt信号途径使Wnt基因高表达，而Wnt基因的表达产物能够促进多种肿瘤组织生长。

GPC3表达特点是在肝癌组织中过表达，而在正常的人体组织中不表达或低表达，基于GPC3特有的结构和功能特点，将其作为肝癌的治疗靶点，有可能成为治疗肝癌的一把利剑。

综上所述，提供一种高亲和力的GPC3抗体，对于肝癌药物开发领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体及其应用，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体能够以高亲和力与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3特异性结合，能够激活T淋巴细胞，在提高免疫细胞活性和增强免疫应答、预防治疗肿瘤和感染性疾病等方面具有重要的应用前景。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链互补决定区(VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3)包括SEQ ID No.6-8所示的氨基酸序列，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链互补决定区(VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3)包括SEQ ID No.14-16所示的氨基酸序列。

根据本发明，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体能够以高亲和力与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3特异性结合，能够激活T淋巴细胞，在提高免疫细胞活性和增强免疫应答、预防治疗肿瘤和感染性疾病等方面具有重要的应用前景。

根据本发明，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体具有以下性质：

a.特异性结合人GPC3全长抗原、人GPC3近膜端抗原；

b.特异性结合过表达人GPC3全长抗原、人GPC3近膜端抗原的细胞。

根据本发明，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链可变区包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链可变区包括SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。

根据本发明，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链框架区包括如SEQ ID No.2-5所示的氨基酸序列，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链框架区包括SEQ ID No.10-13所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.1：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPGKGLKWIGALDPKTGDTAYAQKFQGRATLTADTSTDTAYMELSSLRSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS。

SEQ ID No.2：QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKAS。

SEQ ID No.3：MHWVKQTPGKGLKWIGA。

SEQ ID No.4：AYAQKFQGRATLTADTSTDTAYMELSSLRSEDSAVYYC。

SEQ ID No.5：WGQGTLVTVSS。

SEQ ID No.6(VH-CDR1)：GYTFTDYE。

SEQ ID No.7(VH-CDR2)：LDPKTGDT。

SEQ ID No.8(VH-CDR3)：TRFYSYTY。

SEQ ID No.9：

DIVLTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSESLVHSNGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCTQATQFPYTFGQGTKVEIK。

SEQ ID No.10：DIVLTQSPLSLTVTPGEPASISCRSS。

SEQ ID No.11：LSWLQQRPGQPPRLLIY。

SEQ ID No.12：NRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC。

SEQ ID No.13：FGQGTKVEIK。

SEQ ID No.14(VL-CDR1)：ESLVHSNGNTY。

SEQ ID No.15(VL-CDR2)：KIS。

SEQ ID No.16(VL-CDR3)：TQATQFPYT。

第二方面，本发明提供编码如第一方面所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的DNA片段。

根据本发明，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链具有SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链具有SEQ ID NO.42的核苷酸序列。

SEQ ID NO.41：

gatattgtgctgacgcagtctccactctcactgaccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtgaaagcctcgtacacagtaatggaaacacctacttgagttggcttcagcagaggccaggccagcctccaagactcctaatttataagatttctaaccggttctctggggtcccagacagattcagtggcagtggggcagggacagatttcacactgaaaatcagcagggtggaagctgaggatgtcggggtttattactgcacacaagctacacaatttccgtacacttttggccaggggaccaaggtggagatcaaa。

SEQ ID NO.42：

caagtgcaactcgttcaatcaggagctgaggtgaagaaacctggagcatctgtcaagctctcctgtaaggcctccggatacacctttaccgattacgagatgcactgggtgaagcagactcctggaaagggtctgaagtggatcggcgccctggaccctaagaccggagacaccgcttatgcccagaagtttcagggaagagccactctgaccgctgacacatcaaccgataccgcttacatggagctcagctccctgcgcagtgaggattctgctgtgtactattgtacacgcttttatagctacacctactggggacagggcactctcgtgaccgtctcctcc。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。

第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明提供一种亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体由第一方面所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体经过突变处理制备得到。

根据本发明，所述突变处理包括对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链可变区和/或重链可变区进行随机突变，突变处理进一步提高了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的亲和力。

优选地，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链互补决定区包括SEQID No.6-8所示的氨基酸序列。

优选地，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链互补决定区CDR1包括SEQ ID No.14所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR2包括SEQ ID No.15所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR3包括SEQ ID No.20-40中任意一种所示的氨基酸序列。

优选地，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链互补决定区CDR1包括SEQ ID No.17-19中任意一种所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR2包括SEQ ID No.15所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR3包括SEQ ID No.16所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.17：HPLLHSNGNTY。

SEQ ID No.18：ESLVHINGNTY。

SEQ ID No.19：QSLLSSNGNTY。

SEQ ID No.20：TQSAFAPYT。

SEQ ID No.21：VQVSFFPYT。

SEQ ID No.22：TQLTRVPYT。

SEQ ID No.23：FQNGRFPYT。

SEQ ID No.24：TQATRPPYS。

SEQ ID No.25：VQVSSFPYT。

SEQ ID No.26：TQATHLYYS。

SEQ ID No.27：TQATRPPYL。

SEQ ID No.28：VQVSAFPYT。

SEQ ID No.29：LQVSIFPYT。

SEQ ID No.30：VQVSRFPYT。

SEQ ID No.31：VQTATFPYT。

SEQ ID No.32：VQVARFPYT。

SEQ ID No.33：TQGSHPPYT。

SEQ ID No.34：TQATRAPYS。

SEQ ID No.35：FQVALFPYT。

SEQ ID No.36：TQASRPMYT。

SEQ ID No.37：VQVSLFPYT。

SEQ ID No.38：VQLSRFPYT。

SEQ ID No.39：VQVSMFPYT。

SEQ ID No.40：FQSSHFPYT。

优选地，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链框架区包括如SEQ IDNo.2-5所示的氨基酸序列，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链框架区包括SEQ ID No.10-13所示的氨基酸序列。

第六方面，本发明提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括第五方面所述的亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。

根据本发明，所述双特异性抗体具有以下性质：

a.在GPC3阳性的靶细胞存在时，对T细胞有激活作用；

b.介导T细胞杀伤GPC3阳性的肿瘤细胞；

c.体内抑制GPC3阳性肿瘤的生长。

第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体、第五方面所述的亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体或第六方面所述的双特异性抗体中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供第一方面所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体、第五方面所述的亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体、第六方面所述的双特异性抗体或第七方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述肿瘤包括肝癌。

针对现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体能够以高亲和力与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异性结合，在治疗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3相关的病症领域具有重要应用价值；

(2)本发明通过对所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体进行突变构建亲和力成熟文库，进一步提高了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的亲和力；

(3)本发明的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体能够高效地与过表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的细胞结合，能够激活T淋巴细胞，抑制肿瘤生长并促进其消退。

附图说明

图1A为10C7抗体与GPC3胞外区抗原的结合活性图；

图1B为10C7抗体与GPC3近膜端抗原的结合活性图；

图2A为10C7抗体与293F/GPC3全长细胞结合活性图；

图2B为10C7抗体与293F/GPC3近膜端细胞结合活性图；

图3A为亲和力成熟变体(5D1、8G2、5H9和8H5)与GPC3近膜端抗原的结合活性图；

图3B为亲和力成熟变体(5C1、7F11和5H1)与GPC3近膜端抗原的结合活性图；

图3C为亲和力成熟变体(7H3、11C6、7A2和1A6)与GPC3近膜端抗原的结合活性图；

图3D为亲和力成熟变体(5A5、8F1、5E11和5B6)与GPC3近膜端抗原的结合活性图；

图3E为亲和力成熟变体(5A4、5D8、5B10和5B8)与GPC3近膜端抗原的结合活性图；

图3F为亲和力成熟变体(7C6、8F9、9G4和7F1)与GPC3近膜端抗原的结合活性图；

图3G为亲和力成熟变体7A7与GPC3近膜端抗原的结合活性图；

图4A为FACS检测抗体(hIgG、GC33单抗模拟物、5D1和8G2)与过表达人GPC3近膜端抗原的细胞的结合活性图；

图4B为FACS检测抗体(5H9、8H5、5C1和7F11)与过表达人GPC3近膜端抗原的细胞的结合活性图；

图4C为FACS检测抗体(5H1、7H3、11C6和7A2)与过表达人GPC3近膜端抗原的细胞的结合活性图；

图4D为FACS检测抗体(1A6、5A5、8F1和5E11)与过表达人GPC3近膜端抗原的细胞的结合活性图；

图4E为FACS检测抗体(5B6、5A4、5D8和5B10)与过表达人GPC3近膜端抗原的细胞的结合活性图；

图4F为FACS检测抗体(5B8、7C6、8F9和9G4)与过表达人GPC3近膜端抗原的细胞的结合活性图；

图4G为FACS检测抗体(7F1、7A7)与过表达人GPC3近膜端抗原的细胞的结合活性图；

图5A为FACS检测抗体(hIgG、GC33单抗模拟物、5D1和8G2)与过表达人GPC3全长抗原的细胞的结合活性图；

图5B为FACS检测抗体(5H9、8H5、5C1和7F11)与过表达人GPC3全长抗原的细胞的结合活性图；

图5C为FACS检测抗体(5H1、7H3、11C6和7A2)与过表达人GPC3全长抗原的细胞的结合活性图；

图5D为FACS检测抗体(1A6、5A5、8F1和5E11)与过表达人GPC3全长抗原的细胞的结合活性图；

图5E为FACS检测抗体(5B6、5A4、5D8和5B10)与过表达人GPC3全长抗原的细胞的结合活性图；

图5F为FACS检测抗体(5B8、7C6、8F9和9G4)与过表达人GPC3全长抗原的细胞的结合活性图；

图5G为FACS检测抗体(7F1、7A7)与过表达人GPC3全长抗原的细胞的结合活性图；

图6A为GPC3×CD3双特异性抗体(5H9×CD3、10C7×CD3、5D1×CD3和hIgG)对T细胞激活作用检测结果图；

图6B为GPC3×CD3双特异性抗体(7C6×CD3、7A7×CD3、8F9×CD3、7F11×CD3和7F1×CD3)对T细胞激活作用检测结果图；

图7A为GPC3×CD3双特异性抗体(7C6×CD3、7F11×CD3、7F1×CD3、7A7×CD3、8F9×CD3、5D1×CD3和5H9×CD3)对HepG2细胞的杀伤作用检测结果图；

图7B为GPC3×CD3双特异性抗体(7C6×CD3、7F11×CD3、7F1×CD3、7A7×CD3、8F9×CD3、5D1×CD3和5H9×CD3)对Huh-7细胞的杀伤作用检测结果图；

图8为BALB/c-hCD3E小鼠皮下CT26-hGPC3肿瘤体积变化图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语及其缩略语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。以下列举了本文中使用的部分术语和缩略语。

抗体：antibody，Ab。

免疫球蛋白：immunoglobulin，Ig。

重链：heavy chain，HC。

轻链：light chain，LC。

重链可变区：heavy chain variable domain，VH。

重链恒定区：heavy chain constant domain，CH。

轻链可变区：light chain variable domain，VL。

轻链恒定区：light chain constant domain，CL。

抗原结合区：antigen binding fragment，Fab。

铰链区：hinge region。

Fc片段：fragment crystallizable region，Fc region。

单克隆抗体：monoclonal antibodies，mAbs。

抗体依赖性细胞毒作用：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC。

补体依赖性细胞毒性作用：complement dependent cytotoxicity，CDC。

自然杀伤细胞：natural killing cell，NK细胞。

双特异性抗体：bispecific antibody，BsAb。

T细胞受体：T cell receptor，TCR。

主要组织相容性复合体：major histocompatibility complex，MHC。

互补决定区：complementarity determining region，CDR，是指抗体的抗原互补结合区。

免疫受体酪氨酸活化基序：immunoreceptor tyrosine-based activationmotif，ITAM。

单链可变区抗体片段(又称单链抗体)：single-chain variable fragment，scFv；

过继免疫治疗：adoptive cellular immunotherapy，ACI。

淋巴因子激活的杀伤细胞：lymphokine-activatedkiller cell，LAK细胞。

肿瘤浸润淋巴细胞：Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL细胞。

细胞因子诱导的杀伤细胞：cytokine-induced killer cell，CIK细胞。

本发明所述分子克隆、细胞培养、蛋白纯化、免疫学实验、微生物学、动物模型等试验的操作步骤为该领域内被广泛应用的常规步骤。除非上下文另有说明，否则本发明单数术语包含复数且复数含义包括单数含义。除非另外指明，否则本发明所述核苷酸序列按照5’端至3’端的方向从左至右排列并书写。除非另外指明，否则本发明所述氨基酸序列按照从氨基端(N末端)到羧基端(C末端)的方向从左至右排列并书写。本发明所提及的氨基酸三字母缩写及核苷酸单字母缩写为该技术领域普遍接受的形式，氨基酸单字母缩写为IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的形式。

术语“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸之一或可能存在于特定的限定位置的任何非天然类似物。本发明所述“氨基酸突变”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入、缺失和修饰，以及氨基酸取代、插入、缺失和修饰的任意组合。本文中优选的氨基酸修饰是取代。本发明中“氨基酸取代”或“取代”是指将亲本多肽序列中特定位置的氨基酸替代为另一种氨基酸。例如，取代C220S是指变体多肽，其中多肽的位置220处的氨基半胱氨酸已被氨基酸丝氨酸替代。氨基酸突变可以通过分子克隆或化学的方法实现，分子克隆的方法包括PCR、定点突变、全基因合成等。

术语“蛋白”、“肽链”、“多肽链”是指两个以上的氨基酸通过肽键连接的分子，包含天然蛋白、人工蛋白、蛋白片段、突变蛋白和融合蛋白等。

术语“结构域”是指生物大分子中具有独立功能的特异结构区域，结构域具有独立的三级结构，其功能不依赖于生物大分子中的其余部分，本发明中的结构域特指蛋白中这样的区域，如重链可变区VH结构域、轻链可变区VL结构域，结构域之间相互结合可以构成一个大的结构域。

术语“抗体”指包含至少一个抗原识别位点并能特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。在此，术语“抗原”是在机体内能诱发免疫应答且与抗体特异性结合的物质，如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、半抗原或上述物质的组合。抗体与抗原的结合依靠二者间形成的相互作用来介导，包括氢键、范德华力、离子键以及疏水键。抗原表面与抗体结合的区域为“抗原决定簇”或“表位”，一般来说，每个抗原有多个决定簇。本发明所提及的术语“抗体”包含单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段、包含至少两个不同表位结合结构域的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、翻译后修饰抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、包含抗体抗原决定簇的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所期望的生物活性。具体来说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即至少含有一个抗原结合位点的分子。

术语“Fab”、“Fab区域”、“Fab片段”或“Fab分子”是抗原结合片段，包含免疫球蛋白重链的VH结构域、CH1结构域以及轻链的VL结构域、CL结构域，重链第一个恒定区结构域CH1与轻链的恒定区结构域CL结合，重链的可变区结构域VH和轻链的可变区结构域VL结合。

术语“Fc”、“Fc区域”、“Fc片段”或“Fc分子”是抗体的效应区，能够引起如CDC、ADCC、ADCP、细胞因子释放等。天然的抗体Fc通常是由两个相同的蛋白片段结合构成，该蛋白片段包含两个或三个免疫球蛋白恒定区结构域。本发明中所述Fc包含天然Fc以及突变的Fc。虽然Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常定义为包含从C226或P230开始到其羧基末端的残基。在实验条件下，免疫球蛋白单体经木瓜蛋白酶酶切生成的片段分别为Fab和Fc。抗体的“铰链”或“铰链区”是指包含抗体的第一和第二恒定结构域(CH1和CH2)之间的氨基酸的柔性多肽。

除非另有说明，否则本发明所述抗体可变区氨基酸编号使用Kabat等人在1991年所阐述的编码方案，即“Kabat索引”或“Kabat编号”(Kabat,E.A.et al.SequencesofProteins ofImmunological Interest,5th ed.,NIH Publication No.91–3242,Bethesda,MD.:1991)。除非另有说明，否则本发明所述抗体恒定区氨基酸编号使用EU索引(Edelman GM,et.al.Proc NatlAcad Sci U SA 1969,63:78-85.)。

术语“抗原结合位点”指抗原结合分子与抗原产生直接相互作用的一个或多个氨基酸残基，抗体的抗原结合位点由抗原互补决定区(CDR)构成，天然免疫球蛋白分子通常包含两个抗原结合位点，Fab分子通常包含一个抗原结合位点。

术语“T细胞激活”指T淋巴细胞尤其是杀伤性T淋巴细胞的一种或多种免疫反应，包括：增值、分化、细胞因子的释放、杀伤性效应分子的分泌、细胞杀伤等。

术语“EC₅₀”即半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指引起50％最大效应所对应的抗体浓度。

本文所用“特异性结合”是指，两种分子间的非随机的结合反应，如抗体及其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方案中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”指特异性结合。

本文所用“KD”是指，特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、或10-10M或更小的平衡解离常(KD)结合抗原。

术语“单链可变区抗体片段”或“scFv”指免疫球蛋白重链可变区VH和轻链可变区VL的融合蛋白，包括N端为VH以及N端为VL的不同组合形式，利用构建重组蛋白的常规分子克隆方法即可制备(Sambrook JF,E.F.et al.Molecular cloning:a laboratorymanual.4th ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork:2012)。

术语“人源化抗体”是指人源免疫球蛋白(受体抗体)的部分或者全部CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或者抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或者反应性的非人源(如小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的架构区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或者被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步改善或者优化抗体的一种或多种特性。

本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体或抗体偶联物，和任选地药学上可接受的载体，表面活性剂和/或稀释剂。在一些实施方案中，除本发明的抗体、双特异性抗体或抗体偶联物外，所述药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括但不限于化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法的试剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂和其它治疗癌症的试剂。

术语“宿主细胞”指导入外源核酸的细胞及其后代，可通过编码多肽的核苷酸转化或转染，从而表达外源多肽。本发明所述的宿主细胞包括但不限于CHO细胞(Chinesehamster ovary cells，中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293细胞(Human embryonic kidney cells293，人胚肾细胞293)、BHK细胞(Baby Hamster Kidney，幼仓鼠肾细胞)、骨髓瘤细胞、酵母、昆虫细胞或原核细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)等。应当指出，本发明所述“宿主细胞”不仅指导入了外源核酸的细胞，同时还包括了该细胞的后代，由于在细胞分裂过程中后代细胞会发生突变，但仍属于本发明所述的术语范围。

本发明还进一步包含编码这些多肽链的核酸序列。在表达抗体的过程中，将核酸序列插入合适的载体中，载体包括但不限于：质粒、噬菌表达载体、柯斯质粒、人工染色体、噬菌体以及动物病毒。表达载体中包含用于调控表达的元件，包括但不限于启动子、转录起始序列、增强子、信号肽序等。启动子包括但不限于T7启动子、T3启动子、SP6启动子、β-actin启动子、EF-1α启动子、CMV启动子以及SV40启动子。将表达载体转入宿主细胞中可使用本领域内已知的合适方法，包括但不限于：磷酸钙沉淀法、聚乙烯亚胺转染法、脂质体转染法、电穿孔法、PEI(聚乙烯亚胺)转染法。

实施例1

本实施例制备一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(GPC3抗体)。

(1)人GPC3抗原的制备

本发明中采用人GPC3抗原，序列来源于UniProtKB:P51654，GPC3近膜端抗原的序列来源于全长抗原C-端524～563位的氨基酸，本发明在此基础上，设计引物并克隆至真核表达载体pcDNA3.1-TEV-Fc-His，建立hGPC3-TEV-Fc-His重组真核表达质粒，以PEI转染法转染至293F宿主细胞，经5天培养后收集细胞上清液，上清经proteinA亲和纯化得到GPC3-TEV-Fc-His融合蛋白，再利用TEV蛋白酶酶切，镍柱纯化后得到重组人GPC3胞外区抗原及近膜端抗原。

(2)人源抗GPC3抗体的获得

取人外周血，分离单核细胞，提取总RNA，用逆转录试剂盒提取得到cDNA，以该cDNA为模板，参考Lim T.S.等(参见：Lim T S,Mollova S,Rubelt F,et al.An optimisedprocedure for amplification of rearranged human antibody genes ofdifferentisotypes[J].New Biotechnology,2010,27(2):108-117.)设计特异引物进行PCR，PCR扩增其VL片段，获得人源VH和人源VL基因。

将人源VH和人源VL基因，通过重叠延伸PCR，组装成人源scFv基因，利用酶切连接将scFv基因克隆至噬菌粒pITa载体，转化至宿主细胞(TG1 Electrocompetent Cells：Lucigen.)，获得抗人scFv噬菌体文库。

人scFv噬菌体文库经过培养、包装、释放及纯化，针对重组人GPC3胞外区抗原，经三轮淘洗后，富集阳性克隆，测序，最终获得1株人源GPC3抗体，命名为10C7。

本发明呈现的人源GPC3抗体10C7重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列如表1所示，其重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4和SEQ ID No.5；其轻链框架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4分别为SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13；其重链互补决定区HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；轻链互补决定区LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3分别为SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。

表1

实施例2

本发明对实施例1所述人源GPC3抗体10C7进行表达、纯化及验证。

(1)10C7的构建和表达

分别合成编码10C7抗体重链和轻链DNA，并将其克隆至表达载体pcDNA3.1中，感染并扩增，并提取质粒，用PEI转染法，将抗人GPC3抗体10C7的重链和轻链表达质粒转染至293F细胞中，培养6天后，离心收集细胞培养上清，随后用ProteinA亲和层析注(GEhealthcare)纯化上清液中的抗体。

本发明中的阳性对照抗体GC33单抗模拟物，序列来源于人鼠嵌合抗体GC33(专利：US 2015/0259417A1)，采用上述同样方法表达、纯化。

(2)10C7与人GPC3抗原的结合活性

采用ELISA法检测抗人GPC3抗体10C7与人GPC3抗原的结合活性，具体方法如下：

将人GPC3胞外区抗原及近膜端抗原分别用NaHCO₃缓冲液(pH 9.0)稀释后进行包被，封闭，将抗体10C7以及对照样品(GC33单抗模拟物和hIgG)分别进行梯度稀释，加入到抗原包被孔进行孵育，洗涤后加入HRP标记的山羊抗人IgG(H+L)二抗，TMB显色，酶标仪检测波长为450nm，读取吸光度OD值，以样品浓度的对数值为X轴，吸光度OD值为Y轴，绘制剂量反应曲线，计算EC₅₀，以EC₅₀代表抗体与GPC3抗原结合的能力，实验同时设置阴性对照hIgG组和阳性抗体GC33单抗模拟物对照组。

图1A为ELISA检测抗体10C7与人GPC3胞外区抗原的结合活性结果，图1B为ELISA检测抗体10C7与人GPC3近膜端抗原的结合活性结果，抗体10C7与人GPC3抗原的结合活性，以EC₅₀来表示，10C7与人GPC3胞外区抗原结合，EC₅₀为0.08357μg/mL，10C7与人GPC3近膜端抗原结合，EC₅₀为0.02791μg/mL，表明本发明的GPC3抗体10C7能与人GPC3胞外区抗原以及GPC3近膜端抗原结合。

(3)抗体10C7与过表达人GPC3抗原细胞的结合活性

采用流式细胞术(FACS)检测抗体10C7与过表达人GPC3抗原细胞的结合活性，具体方法如下：

以PEI转染法，分别将包含人GPC3全长抗原和人GPC3近膜端抗原的质粒瞬转至293F细胞中，获得过表达人GPC3全长抗原和人GPC3近膜端抗原的293F细胞，命名为293F/GPC3全长细胞和293F/GPC3近膜端细胞，收集293F细胞、293F/GPC3全长细胞和293F/GPC3近膜端细胞，以4℃预冷的2％FBS/PBS(稀释液)洗涤，调整细胞密度分别加入96孔板中，再将稀释后的10C7抗体，加入96孔板中，将96孔板置于4℃孵育1h，4℃离心去上清，洗涤两次，再加入PE标记的二抗PE anti-human IgG Fc(Invitrogen)，4℃避光孵育1h，4℃离心去上清，洗涤两次，最后用稀释液重悬细胞后立即流式细胞仪上机检测。

结果见图2A和图2B，可见抗体10C7与293F细胞不结合，但可特异性结合293F/GPC3全长细胞(图2A)及293F/GPC3近膜端细胞(图2B)，表明本发明的GPC3抗体10C7能与过表达人GPC3抗原细胞的结合。

实施例3

本实施例制备GPC3抗体10C7亲和力成熟文库。

由图1A可知，本发明制备的GPC3抗体10C7与GPC3全长抗原的结合活性稍弱于人鼠嵌合抗体GC33单抗模拟物，为进一步获得与GPC3抗原有高亲和力的抗体，本实施例对抗体10C7轻链的可变区CDR1、CDR2以及CDR3分别进行随机突变来提升亲和力。

(1)亲和力成熟文库的生成

为了生成10C7的互补决定区CDR 1、CDR 2、CDR3中随机化的亲和力成熟文库，将编码CDR 1、CDR 2、CDR3中的氨基酸三联密码子随机化，根据Kontermann R等(参见：Kontermann R,S Dübel.Antibody Engineering||Synthetic Antibody Libraries[J].2010,10.1007/978-3-642-01144-3(Chapter 6):85-97.)方法分别合成CDR 1、CDR 2、CDR3的三联密码子上下游随机引物，使用10C7的单链可变区抗体形式(VH-linker-VL)作为模板，使用抗体上游引物及下游随机引物扩增第一片段(片段1)，使用相同模板，使用抗体下游引物及上游随机引物扩增第二片段(片段2)，片段1的3'端与片段2的5'端具有交叠区，交叠延伸PCR生成具有随机化CDR的第三片段(片段3)，然后，将所得的片段3克隆至噬菌粒载体经电转化大肠杆菌感受态细胞(TG1 Electrocompetent Cells：Lucigen.)，并均匀涂布平板，37℃过夜培养后收集菌体，所得菌体为人源化抗体的亲和力成熟文库。

(2)亲和力成熟文库的筛选

利用噬菌体展示技术实施亲和力成熟的人源化抗体的生成，如前述实施例方法，亲和力成熟文库噬菌体文库经包装、展示、三轮淘洗后，富集阳性克隆并测序，得到24个亲和力成熟变体，其中，24个亲和力成熟变体中重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；轻链框架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4分别为SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13；重链互补决定区HC-CDR 1、HC-CDR 2、HC-CDR 3分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8，各个变体的轻链互补决定区LC-CDR 1、LC-CDR 2和LC-CDR 3区序列如表2所示。

表2

实施例4

本实施例表达并纯化实施例3所述亲和力成熟变体。

按实施例2所述方法，分别合成编码亲和力成熟各变体的重链和轻链DNA，且将其克隆至表达载体pcDNA3.1中，感染并扩增，提取质粒，用PEI转染法，将亲和力成熟各变体的重链和轻链表达质粒转染至293F细胞中，培养6天后，离心收集细胞培养上清，随后用ProteinA亲和层析柱(GE healthcare)纯化上清液中的抗体，共获得24株亲和力成熟变体。

实施例5

本实施例对实施例4制备的亲和力成熟各变体进行功能验证。

(1)亲和力成熟变体与人GPC3抗原的结合活性

如前实施例所述，采用ELISA方法检测亲和力成熟变体与人GPC3近膜端抗原的结合活性，以样品浓度的对数值为X轴，吸光度OD值(450nm处吸光度)为Y轴，绘制剂量反应曲线，计算EC₅₀，以EC₅₀代表样品与人GPC3抗原结合的能力，实验设置阳性对照组GC33单抗模拟物组以及阴性对照组hIgG。

结果如图3A-图3G所示，24个亲和力成熟变体均可以与人GPC3近膜端抗原结合，其结合活性如表3所示，可知基于抗体10C7突变得到的24个亲和力成熟变体均具备与GPC3近膜端抗原的高亲和力。

表3

抗体名称	EC<sub>50</sub>(μg/mL)	抗体名称	EC<sub>50</sub>(μg/mL)
				GC33单抗模拟物	0.06296	5A5	0.09507
10C7	0.1414	8F1	0.4317
				5D1	0.03233	5E11	0.1199
8G2	0.08799	5B6	0.09115
				5H9	0.02253	5A4	0.1467
8H5	0.05705	5D8	0.04277
				5C1	0.07600	5B10	0.05373
7F11	0.02830	5B8	0.5119
				5H1	0.08515	7C6	0.04278
7H3	0.1960	8F9	0.04495
				11C6	0.08966	9G4	0.06709
7A2	0.06700	7F1	0.03629
				1A6	0.1807	7A7	0.1013

(2)亲和力成熟变体与过表达人GPC3抗原细胞的结合

如前实施例所述，采用FACS法检测所述24个亲和力成熟变体与过表达人GPC3全长抗原和近膜端抗原细胞的结合，以10C7、GC33单抗模拟物及hIgG作为对照，结果如图4A-图4G所示，所述24个亲和力成熟变体均可特异性结合293F/GPC3近膜端细胞(图4A-图4G右侧实线)，结果如图5A-图5G所示，所述24个亲和力成熟变体均可特异性结合293F/GPC3全长细胞(图5A-图5G右侧实线)。

综上所述，基于10C7抗体进行突变亲和力成熟后的变体均能以高亲和力特异性结合人GPC3全长抗原和人GPC3近膜端抗原。

实施例6

本实施例构建靶向CD3和GPC3的双特异性抗体。

根据前述实施例5的结果，选取与人GPC3近膜端抗原结合活性较强的7株亲和力成熟变体(7A7、5D1、5H9、8F9、7C6、7F11和7F1)，构建靶向CD3和GPC3的双特异性抗体。

基于本发明人公开专利(CN107106682A)所述的技术，通过基因工程技术手段，构建GPC3×CD3双特异性抗体的重组真核表达质粒，利用293F细胞瞬转表达系统，蛋白A亲和层析柱纯化等过程获得7株GPC3×CD3双特异性抗体，分别为7A7×CD3、5D1×CD3、5H9×CD3、8F9×CD3、7C6×CD3、7F11×CD3和7F1×CD3，抗体10C7、阳性对照抗体GC33单抗模拟物。

采用下述方法对获得的7株GPC3×CD3双特异性抗体进行生物学活性的验证。

(1)检测GPC3×CD3双特异性抗体对T细胞的激活作用

采用Jurkat/NFAT-Luc报告基因细胞系和GPC3阳性的人肝癌细胞HepG2细胞组成的检测系统，来评价GPC3×CD3对T细胞的激活作用，在Jurkat/NFAT-Luc细胞系中，荧光素酶基因受NFAT(Nuclear factor ofactivated T-cells)转录因子调控，作为效应细胞，GPC3阳性的HepG2细胞作为靶细胞，当Jurkat/NFAT-Luc细胞与HepG2细胞共培养时，荧光素酶不表达，而当加入GPC3×CD3时，HepG2细胞上的GPC3可以通过GPC3×CD3激活Jurkat/NFAT-Luc细胞内的CD3信号通路，促使荧光素酶表达，从而可以通过检测细胞中的荧光素酶表达量来判断Jurkat T细胞激活程度的强弱。

实验中，在96孔细胞培养板中依次加入适量HepG2细胞、Jurkat/NFAT-Luc细胞，再将所述7株GPC3×CD3双特异性抗体分别进行梯度稀释，将不同浓度的GPC3×CD3双特异性抗体加入到上述细胞培养板中，37℃静置培养6h后，加入ONE-Glo Luciferase检测试剂，使用多功能酶标仪测定化学发光值，以抗体浓度的对数值为横坐标，平均化学发光值为纵坐标，进行四参数拟合，绘制剂量效应曲线，获得各曲线的EC₅₀值，以EC₅₀代表GPC3×CD3激活T细胞的活性，实验设置同型对照抗体hIgG组。

结果如图6A和图6B所示，当与GPC3阳性肿瘤细胞HepG2、Jurkat/NFAT-Luc细胞共同孵育时，本发明构建的7株GPC3×CD3双特异性抗体(7A7×CD3、5D1×CD3、5H9×CD3、8F9×CD3、7C6×CD3、7F11×CD3和7F1×CD3)对Jurkat T细胞都有较好的激活作用。

(2)检测GPC3×CD3双特异性抗体对GPC3阳性细胞的杀伤作用

所述双特异性抗体GPC3×CD3的CD3结合臂特异性地结合T细胞表面的CD3复合物，另一端GPC3结合臂特异性地结合肿瘤细胞表面GPC3分子，使T细胞与肿瘤细胞之间形成免疫桥联，继而激活T细胞，释放穿孔素(Perforin)和颗粒酶B(Granzyme B)等细胞杀伤蛋白，从而杀伤肿瘤细胞。当肿瘤细胞膜受损后，细胞膜通透性增大，胞浆中的乳酸脱氢酶(LDH)被释放到培养上清中，取一定量的上清，加入乳酸脱氢酶的反应底物乳酸后，乳酸脱氢酶催化脱氢反应，产生红色产物甲臜(Formazan)，可在490nm波长下产生吸收峰，细胞上清的乳酸脱氢酶含量越多，其颜色越深，吸光值越大，故可通过测定吸光值来定量肿瘤细胞释放乳酸脱氢酶的量，并计算GPC3×CD3介导PBMC杀伤肿瘤细胞的杀伤活性，杀伤率的计算公式为：Cytotoxicity％＝(OD_样品-SR)/(MR-SR)×100％，其中，SR＝OD_{自发释放孔(靶细胞+效应细胞)}，MR＝OD_{最大释放孔(靶细胞)}。

本发明采用GPC3高表达的细胞人肝癌细胞HepG2和Huh-7作为靶细胞，人外周血单核细胞PBMC作为效应细胞，检测所述7株GPC3×CD3双特异性抗体介导PBMC杀伤肿瘤细胞的杀伤活性。

取新鲜分离的人外周血单核细胞PBMC及长状态良好的HepG2和Huh-7细胞，分别调整细胞密度。用1×PBS缓冲液(pH 7.4)将样品稀释进行梯度稀释，取96孔细胞培养板，依次加入靶细胞、PBMC和梯度稀释的样品，混匀，使得PBMC与靶细胞的比例为20:1，把培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内孵育，21h后，用乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒(碧云天)检测细胞的杀伤毒性，以抗体浓度的对数值为横坐标，杀伤活性为纵坐标，进行四参数拟合，绘制剂量效应曲线，获得各曲线的EC₅₀值，以EC₅₀代表GPC3×CD3对靶细胞的杀伤活性。

结果如图7A和图7B所示，结果显示，本发明构建的7株双特异性抗体GPC3×CD3对GPC3高表达的HepG2细胞有较好的杀伤效果，结果与T细胞活化结果一致，本发明构建的7株双特异性抗体GPC3×CD3对Huh-7细胞的杀伤效果稍弱于对HepG2的杀伤效果。

(3)检测GPC3×CD3双特异性抗体小鼠体内抗肿瘤作用

根据前述实施例结果，选择对T细胞激活作用及体外抗肿瘤杀伤效果较强的2株GPC3×CD3双特异性抗体7F1×CD3和7F11×CD3，进行小鼠体内抗肿瘤杀伤作用的检测。

选用7周龄的雌性BALB/c-hCD3E小鼠(购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司)，收集对数生长期的CT26-hGPC3细胞，以2×10⁶/100μL/只接种于小鼠右前肢，接种次日分组，分组当天定义为D0天，并于D0天开始给药，实验共分3组，每组6只小鼠，分别是阴性对照生理盐水组，7F1×CD35 mg/kg组和7F11×CD35 mg/kg组，于D0、D3、D6和D9天尾静脉注射给药(i.v.)，开始给药后，每周2次观测肿瘤大小并称量小鼠体重，瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm³)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径²)，给药结束观察至D20，终止实验，利用肿瘤体积计算肿瘤增殖率(T/C％)和肿瘤抑制率(TGI)，根据肿瘤抑制率(TGI)进行疗效评价，肿瘤体积抑制率(TGI_TV)：TGI_TV(％)＝[1-(T_i-T₀)/(V_i-V₀)]×100％(T_i：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，T₀：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值；V_i：溶剂对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，V₀：溶剂对照组在给药第0天的肿瘤体积均值)。

结果如图8所示，7F1×CD3、7F11×CD3对均可对CT26-hGPC3移植BALB/c-hCD3E小鼠肿瘤模型具有显著抑制肿瘤生长的作用，实验终点7F1×CD3、7F11×CD3组小鼠肿瘤均消退。

综上所述，本发明提供的GPC3单克隆抗体及其亲和力成熟变体，能够以高亲和力特异性结合表达GPC3抗原的细胞，GPC3×CD3双特异抗体能够激活T淋巴细胞，有效抑制肿瘤生长并使肿瘤消退，在提高免疫细胞活性和增强免疫应答、预防治疗肿瘤和感染性疾病等方面具有重要的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州爱思迈生物医药科技有限公司

<120> 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖３抗体及其应用

<130> 20210702

<160> 42

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Ile Gly

1 5 10 15

Ala

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr

1 5 10 15

Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr

1 5

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Glu Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Ala

85 90 95

Thr Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

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<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 12

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Glu Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Lys Ile Ser

1

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

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Thr Gln Ala Thr Gln Phe Pro Tyr Thr

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

His Pro Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Glu Ser Leu Val His Ile Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Gln Ser Leu Leu Ser Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Thr Gln Ser Ala Phe Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Val Gln Val Ser Phe Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Thr Gln Leu Thr Arg Val Pro Tyr Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Phe Gln Asn Gly Arg Phe Pro Tyr Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Thr Gln Ala Thr Arg Pro Pro Tyr Ser

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Val Gln Val Ser Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Thr Gln Ala Thr His Leu Tyr Tyr Ser

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Thr Gln Ala Thr Arg Pro Pro Tyr Leu

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Val Gln Val Ser Ala Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Leu Gln Val Ser Ile Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

Val Gln Val Ser Arg Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 31

Val Gln Thr Ala Thr Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 32

Val Gln Val Ala Arg Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 33

Thr Gln Gly Ser His Pro Pro Tyr Thr

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 34

Thr Gln Ala Thr Arg Ala Pro Tyr Ser

1 5

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 35

Phe Gln Val Ala Leu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 36

Thr Gln Ala Ser Arg Pro Met Tyr Thr

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 37

Val Gln Val Ser Leu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 38

Val Gln Leu Ser Arg Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 39

Val Gln Val Ser Met Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 40

Phe Gln Ser Ser His Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 41

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gatattgtgc tgacgcagtc tccactctca ctgaccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtga aagcctcgta cacagtaatg gaaacaccta cttgagttgg 120

cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180

tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca cacaagctac acaatttccg 300

tacacttttg gccaggggac caaggtggag atcaaa 336

<210> 42

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

caagtgcaac tcgttcaatc aggagctgag gtgaagaaac ctggagcatc tgtcaagctc 60

tcctgtaagg cctccggata cacctttacc gattacgaga tgcactgggt gaagcagact 120

cctggaaagg gtctgaagtg gatcggcgcc ctggacccta agaccggaga caccgcttat 180

gcccagaagt ttcagggaag agccactctg accgctgaca catcaaccga taccgcttac 240

atggagctca gctccctgcg cagtgaggat tctgctgtgt actattgtac acgcttttat 300

agctacacct actggggaca gggcactctc gtgaccgtct cctcc 345

Claims

1.一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，其特征在于，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链互补决定区包括SEQ ID No.6-8所示的氨基酸序列；

所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链互补决定区包括SEQ ID No.14-16所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，其特征在于，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链可变区包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链可变区包括SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。

3.一种亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，其特征在于，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体由权利要求1或2所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体经过突变处理制备得到。

4.根据权利要求3所述的亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，其特征在于，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链互补决定区包括SEQ ID No.6-8所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求3所述的亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，其特征在于，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链互补决定区CDR1包括SEQ ID No.14所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR2包括SEQ ID No.15所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR3包括SEQ ID No.20-40中任意一种所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求3所述的亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，其特征在于，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的轻链互补决定区CDR1包括SEQ ID No.17-19中任意一种所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR2包括SEQ ID No.15所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR3包括SEQ ID No.16所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求3所述的亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，其特征在于，所述亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的重链框架区包括如SEQ ID No.2-5所示的氨基酸序列；所述抗体的轻链框架区包括SEQ ID No.10-13所示的氨基酸序列。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体和/或权利要求3-7任一项所述的亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体。

9.权利要求1或2所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体、权利要求3-7任一项所述的亲和力成熟磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌。