CN102180969A - 抗肝癌活性单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肝癌活性单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体，是可以与GPC3抗原表位特异性结合的单克隆抗体；所述GPC3抗原表位的氨基酸序列为自GenBank accession Number为AAA98132.1的氨基端端第359-580位氨基酸残基。本发明制备了高效价、高特异、且具有免疫活性、并且对肿瘤细胞具有毒杀活性的鼠抗人GPC3-C单克隆抗体，为研究GPC3在组织和细胞中的表达和分布情况，深入研究GPC3蛋白的生物学功能以及肝癌的临床早期检测奠定了实验基础，并为治疗肝癌提供一种无毒性的辅助药物。

Description

抗肝癌活性单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗肝癌活性单克隆抗体及其应用。

背景技术

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，目前在全球范围内其发病率呈上升趋势。我国是世界上肝癌发病集中的国家。肝细胞癌(HCC)预后极差，延长患者生存期的关键是早期诊断和早期治疗。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)在肝癌细胞中异常表达，而在正常肝细胞和其他非肿瘤肝病细胞表面未见表达。且在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、间皮瘤、肾癌等肿瘤中表达缺失，是潜在的肝癌特异性标志物。GPC3是一种细胞膜蛋白，分子量60～70kD。是硫酸类肝素蛋白聚糖家族中的一员，通过糖基磷脂酰肌醇结合于细胞表面。

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3，GPC3)是硫酸类肝素蛋白聚糖家族中的一员，通过糖基磷脂酰肌醇结合于细胞表面。属膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在胚胎及胎儿期负性调控组织器官的发育，出生后异常表达与肿瘤的发生发展关系密切。

GPC3基因首先由Lage等人于1996年胃癌细胞系EPG85-257RNOV构建的λcDNA表达文库中分离克隆得到的。1997年Pila等在研究SGBS综合症时，发现这些病人的一个共同特点是出现X染色体与常染色体之间的转位。提示该区段含有重要的功能基因。Pila等分离克隆了该基因，命名为GPC3基因。GPC3蛋白相对分子质量约66kDa，其基本结构包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素链和糖基化磷脂酰肌醇。GPC3在核心蛋白下游富含半胱氨酸结构区的下端，即第358位精氨酸和359位丝氨酸处可以被酶切割而分成2段，使N-端约含40kDa的GPC3蛋白成为可溶性蛋白片段而分泌入血。

在胚胎和胎儿期，GPC3的表达有明显的器官组织特异性和分化时相特异性。肝实质细胞在整个胎儿期均有明显表达，而出生后到成人阶段，除在胎盘、乳腺、间皮、卵巢、肺及肾组织有弱表达外，其他正常组织无明显表达。成人GPC3异常表达与多种肿瘤的发生发展关系密切，在乳腺癌和卵巢癌中为表达缺失，在肾癌、肺鳞癌、甲状腺癌、梅克尔细胞癌、胃癌、大肠癌等呈过表达.在肝细胞癌早期，GPC3即呈高表达，并认为对HCC具有早期诊断价值(罗飞兵，张焜和.Glypican-3与原发性肝癌关系研究进展.世界华人消化杂志，2010，18(2)：155-159)。

GPC3在肝癌组织与良性肝病组织的表达差异明显。Wang等(Wang XY，Degos F，Dubois S，Tessiore S，AllegrettaM，Guttmann RD，Jothy S，Belghiti J，BedossaP，Paradis V.Glypican-3expression in hepatocellular tumors：diagnostic valuefor preneoplastic lesions and hepatocellular carcinomas.Hum Pathol 2006；37：1435-1441)用基于组织芯片的免疫组织化学染色检测肝癌组织GPC3，发现有肝硬化背景的肝癌组织阳性率达90％，而正常肝脏背景下的肝癌组织阳性率为64％，肝脏腺瘤和早期肝癌组织阳性率为48％，良性结节或低级别腺瘤组织阳性率仅3％，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，其他研究组不同的数据都表明，GPC3的表达与肝癌发生发展密切相关。GPC3抗体免疫组织化学和血清方法诊断肝癌在早期肝癌和AFP阴性的肝癌诊断中有一定的意义。然而多项研究表明GPC3在诊断肝癌中还存在诸多问题如：血清GPC3检测敏感性远不及组织学检测高；血清GPC3检测不能监测酒精性和非酒精性脂肪肝患者是否发展为肝癌患者等等。

GPC3表达在肝细胞中的作用和参与的信号通路：正常肝细胞GPC3表达增加时，细胞分裂增殖下降，阻断GPC3表达则促进肝细胞生长.但在肝癌细胞则情况不同，GPC3表达不起负性调控作用。GPC3表达上调后可能通过激活整合素、胰岛素样生长因子和Wnt信号通路等促进肝癌细胞生长，增强细胞的迁移和侵袭能力。

GPC3蛋白结构在第358位精氨酸和359位丝氨酸处可以被切割酶分成两个亚基：氨基末端蛋白(可溶性蛋白片段)和羧基末端蛋白(与包膜结合的蛋白片段)。氨基末端蛋白分泌入血，主要用于肝癌血清学检测；羧基末端蛋白位于细胞膜和胞质区上。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗肝癌活性单克隆抗体以及其应用，

本发明所提供的单克隆抗体，是可以与GPC3抗原表位特异性结合的单克隆抗体；所述GPC3抗原表位的氨基酸序列为自GenBank accession Number为AAA98132.1的氨基端第359-580位氨基酸残基。

所述单克隆抗体的制备中所用免疫抗原是将所述GPC3抗原表位的编码基因插入pET32a的BamH I和Sal I位点之间获得的重组表达载体表达后纯化获得的融合蛋白；所述GPC3抗原表位的编码基因为自GenBank accession Number为L47125.15′端的第1226-1891位核苷酸序列。

所述单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC№.4544的鼠源杂交瘤细胞株GPCC5#分泌的抗体。

上述杂交瘤细胞株GPCC5#，已于2011年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC№.4544。该杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围

上述单克隆抗体在制备检测和/或治疗肝癌的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明首先表达和纯化了GPC3-C端(359-580aa)重组蛋白，所述的重组蛋白是设计引物，经过RT-PCR方法扩增HepG2提取的RNA方法，得到编码GPC3-C端(359-580aa)的基因。经过序列测定正确后，分别依据读码框连接入原核表达载体pET-32a和pGEX-4t-1载体中，构建两个相应的原核表达载体。表达纯化后免疫小鼠，筛选单抗，经过ELISA，WB和细胞免疫荧光鉴定后，最后鉴定获得了7株单克隆抗体。对鉴定的7株抗体进行抗肿瘤的ADCC实验结果发现7株抗体具有不同水平辅助ADCC的效能，特别是上述杂交瘤细胞株GPCC5#分泌的抗体，对肿瘤细胞的毒杀活性明显强于其他的6株抗体。

本发明的抗体为鼠抗人GPC3-C单克隆抗体，具有高效价、高特异、且具有免疫活性、并且对肿瘤细胞具有毒杀活性等优点，可以与细胞GPC3-C端(359-580aa)结合的抗体，抗体结合的特异性高，结合力强，可以通过ADCC作用杀伤肝肿瘤细胞。为研究GPC3在组织和细胞中的表达和分布情况，深入研究GPC3蛋白的生物学功能以及肝癌的临床早期检测奠定了实验基础，并为治疗肝癌提供一种无毒性的辅助药物。

附图说明

图1为pET32A-GPC3-C和pGEX-GPC3-C质粒的酶切鉴定。图中，A为pET32A-GPC3-C质粒的酶切鉴定，M为2kb DNA Marker，1-3均为鉴定的质粒，其中3号质粒正确.B为pGEX-GPC3-C质粒的酶切鉴定，M为2kb DNA Marker，1-3均为鉴定的质粒，1-3号质粒均正确。

图2为TrxA-GPC3-C、GST-GPC3-C蛋白的原核表达。1为pET32a空载体对照，2为pET32a-GPC3上清，3为pET32a-GPC3包涵体，4为pGEX-4T-1空载体对照，5为pGEX-GPC3上清，6为pGEX-GPC3包涵体，M为低分子量蛋白Marker。

图3为TrxA-GPC3-C和GST-GPC3-C蛋白的纯化。M为Protein Ruler II，1、2均为pGEX-GPC3-C切胶纯化蛋白，3为pET32a-GPC3-C切胶纯化蛋白。

图4.TrxA-GPC3-C免疫小鼠血清抗体效价测定

图5.GPC3-C腹水单抗效价测定

图6.原核及细胞中GPC3表达情况的Western blot检测。图6中，A为原核表达检测，1为TrxA，2为TrxA-GPC3-C，3为GST，4为GST-GPC3-C，B为细胞表达检测，B图中1为HepG2，2为pcDNA3.1空载体转染Cos7，3为pcDNA3.1-GPC3全长转染Cos7。

图7.GPC3-C McAbs检测HepG2细胞的免疫荧光图(×100)。图7中，A为阴性对照，B-H分别为GPC3-C McAb1-7。

图8.不同抗体的ADCC的杀伤肿瘤细胞的活性检测

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、抗肝癌活性单克隆抗体的制备

一、主要实验材料

主要细胞系：小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0，购自南京凯基生物科技发展有限公司，肝癌细胞系HepG2购自和医科大学基础医学细胞中心、COS7、购自北京弘博康医药科技有限公司；6-8周龄BALB/c雌性小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号：scxk-(军)-2007-004)。

主要试剂：克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司，原核表达载体pET32a、pGEX-4T-1分别购自Novagen和Amersham公司，pcDNA3.1(+)为invitrogen的产品。大肠杆菌感受态DH5α、BL21(DE3)、小量质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自北京博迈德生物科技公司，限制性内切酶、T4DNA连接酶、RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司，IPTG购自Promega公司，弗氏佐剂、羊抗小鼠IgG亚类抗体-HRP均购自Sigma公司；PEG-1500购自Roche公司；Protein A Sepharose 4Fast Flow亲和柱购自美国GE公司；Wester blot显色试剂盒购自北京全式金公司；HRP-羊抗小鼠IgG、FITC-羊抗小鼠IgG购自北京中杉公司；DMEM培养基、RPMI-1640培养基均购自北京钮因华信科技发展有限公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。重组人IL-2为北京双鹭药业的产品。

二、抗GPC3单克隆抗体的制备

1、GPC3-C末端基因克隆

根据GenBank中GPC3已知序列(GenBank accession：L47125.1)设计引物，由上海生工生物技术服务有限公司合成，上游引物为P1：5′-GGATCCTCTGCTTATTATCCTGAAG-3′(序列表中序列1)，下游引物为P2：5′-GTCGACGATCTCGCTCCTGGAAGATGG-3′(序列表中序列2)，下划线为BamH I及Sal I酶切位点。按照TaKaRa公司RNA提取试剂盒说明书，提取人肝癌细胞系HepG2总RNA，使用上述引物RT-PCR扩增出GPC3-C端，PCR循环条件为95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸7min。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，对合适大小的PCR条带进行切胶回收。PCR产物连接pMD18-T载体，转化感受态细胞DH5α，涂板，挑取单菌落增菌，提取质粒，经PCR及EcoR I和Hind III双酶切鉴定正确后，送测序分析。测序表明PCR扩增获得的片段即GPC3-C端基因片段，具有自GenBank accession Number为L47125.1的5′端第1226-1891位核苷酸序列，编码具有自GenBank accession Number为AAA98132.1的氨基端第359-580位氨基酸残基，即GPC3-C端蛋白序列，与理论序列完全一致。

2、GPC3-C端原核表达载体的构建及鉴定

利用BamH I和Sal I将步骤1获得的测序分析正确的菌株质粒及原核表达载体pET32a分别进行酶切，纯化回收酶切产物GPC3-C端基因片段和pET32a载体；pGEX-4T-1载体用BamH I和Xho I酶切并纯化回收。使用T4连接酶将GPC3-C基因端片段分别和pET32a、pGEX-4T-1两种原核表达载体连接，16℃12h，连接产物转化感受态细胞，挑取单菌落，分别用BamH I和Sal I、BamH I和Hind III酶切鉴定，将鉴定正确插入了GPC3-C端基因片段的pET32a载体形成的重组质粒命名为pET32a-GPC3-C；将鉴定正确插入了GPC3-C端基因片段的pGEX-4T-1载体形成的重组质粒命名为pGEX-GPC3-C。pET32A-GPC3-C和pGEX-GPC3-C质粒的酶切鉴定图如图1所示，质粒的转化，提取，酶切，连接及PCR鉴定均严格按照试剂盒说明书操作。

3、TrxA-GPC3-C和GST-GPC3-C重组蛋白的表达及纯化

构建好的pET32a-GPC3-C和pGEX-GPC3-C质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，过夜培养后挑取单菌落克隆接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床培养过夜。新鲜菌液按1∶100转接，37℃培养至OD₂₆₀＝0.5时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达4h，离心收菌，经SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况，pET32a-GPC3-C表达TrxA与GPC3-C的融合蛋白，命名为TrxA-GPC3-C，pGEX-GPC3-C表达GST和GPC3-C的融合蛋白，命名为GST-GPC3-C，SDS-PAGE电泳结果如图2所示，分别表达出TrxA-GPC3-C和GST-GPC3-C，表达形式分析结果表明两种蛋白均以包涵体形式表达。筛选出的高表达菌株扩大培养并诱导表达，收集菌液，以8000rpm离心10min，弃上清，每克湿菌加10ml超声缓冲液(pH7.8、20mmol/L磷酸钠、500mmol/L NaCl)重悬细菌沉淀，经超声破碎细菌后，12000rpm离心15min，弃上清，包涵体洗涤液(50mmol/L Tris-Hcl，100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，0.5％Triton-X100)洗涤，离心后沉淀用含8mol/L尿素的包涵体溶解液溶解。取上清进行SDS-PAGE电泳，分别割取50kD、55kDTrxA-GPC3-C和GST-GPC3-C蛋白条带，加入蛋白浸提液(pH7.9，50mmol/L Tris-Hcl，150mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，0.1％SDS)，4℃过夜浸提，离心收集上清，SDS-PAGE分析纯化效果，结果如图3所示。蛋白标准法测定上清中GPC3-C端重组蛋白含量。

4、单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

取纯化的TrxA-GPC3-C端重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合，制成乳化剂，免疫6～8周龄BALB/c雌性小鼠，10μg/只/次，皮下多点注射，免疫3次，每次间隔2周，首次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，第三次免疫2周后尾静脉取血测定抗体效价，效价达1∶10万以上时供融合使用，融合前3d无佐剂纯化蛋白加强免疫1次。上述实验中，5只小鼠免疫3次后，第10天采血，经间接ELISA检测小鼠血清中抗体效价，显示除2号小鼠外抗体滴度都达到1∶10万以上(图4)，4号小鼠抗体滴度最高。

(2)杂交瘤细胞融合及筛选

选择血清效价最高的4号免疫小鼠，无菌取该免疫小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，使用PEG-1500，按常规方法与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，使用含HAT(含次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质的RPMI-1640选择培养基，其中HAT购自sigma公司)的RPMI-1640选择培养基，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，融合第4天换用含HT的RPMI-1640选择培养基(含次黄嘌呤(hypoxantin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)两种物质的RPMI-1640选择培养基，其中HT购自sigma公司)，7-10天后收集细胞培养上清，用TrxA-GPC3-C蛋白包被96孔板，包被浓度5μg/ml，细胞培养上清为一抗，HRP-羊抗小鼠IgG为二抗，间接酶联免疫吸附试验进行结合试验。为了排除分泌与TrxA-GPC3-C融合蛋白结合的抗体的细胞克隆，同样方法用表达纯化的GST-GPC3-C蛋白包被，排除非特异性反应，筛选阳性克隆，挑选抗体滴度高的的杂交瘤细胞共21株，采用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆化，亚克隆时使用含HT的RPMI-1640培养基，连续亚克隆3次，筛选出稳定高表达特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。最后得到7株高特异分泌抗-GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为GPC3-C mAb-1、GPC3-C mAb-2、GPC3-C mAb-3、GPC3-C mAb-4、GPC3-C mAb-5(GPCC5#)、GPC3-C mAb-6、GPC3-C mAb-7。

(3)单克隆抗体的产生及效价测定

将步骤(2)筛选出的7株阳性杂交瘤细胞(GPC3-C mAb-1、GPC3-C mAb-2、GPC3-C mAb-3、GPC3-C mAb-4、GPC3-C mAb-5(GPCC5#)、GPC3-C mAb-6、GPC3-CmAb-7)扩大培养，收集处于对数生长期的细胞，用生理盐水洗涤3次，配成浓度为1×10⁶个/ml的细胞悬液，接种于已用石蜡油致敏的BALB/c雌性小鼠腹腔，每只0.5ml。10-12d后开始采集腹水并离心分离，置-70℃保存，获得GPC3-C mAb-1、GPC3-CmAb-2、GPC3-C mAb-3、GPC3-C mAb-4、GPC3-C mAb-5(GPCC5#)、GPC3-C mAb-6、GPC3-C mAb-7分泌的腹水抗体。用纯化后的GST-GPC3-C重组蛋白包被，采用间接ELISA法测定腹水中的抗体效价。结果表明，间接ELISA检测腹水中抗体效价，腹水抗体效价在1∶20万以上，其中GPC3-C mAb-3和GPC3-C mAb-1获得的抗体效价最高(图5，图5中单抗1、单抗2、单抗3、单抗4、单抗5、单抗6和单抗7分别是GPC3-C mAb-1、GPC3-C mAb-2、GPC3-C mAb-3、GPC3-C mAb-4、GPC3-C mAb-5(GPCC5#)、GPC3-CmAb-6、GPC3-C mAb-7注射小鼠获得的腹水抗体)。

三、单克隆抗体的免疫学特性鉴定

1)单克隆抗体的亚型鉴定

采用间接ELISA法，用切胶纯化后的GST-GPC3-C端重组蛋白为靶抗原，包被浓度为5ug/mL，封闭液封闭，杂交瘤细胞上清为一抗，使用IgG亚型鉴定试剂盒里的酶标二抗，显色，终止液终止，用酶标仪测定450nm波长的吸光度值。经鉴定，制备的七株单抗均为IgG1亚型，轻链均为κ链。

2)单克隆抗体的特异性鉴定

为了检测制备抗体的特异性以及免疫反应性，Western Blot法检测原核表达GPC3-C蛋白和不同肝细胞系内GPC3-C的表达情况，具体方法为：我们以纯化的TrxA-GPC3-C端融合蛋白和pET-32a空载体表达产物TrxA、GST-GPC3-C蛋白和pGEX-4T-1空载体表达产物GST、肝癌细胞系HepG2，小鼠的肝癌细胞Hepa1-6，以及pcDNA3.1-GPC3(合成引物P 1：GGATCCATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGTG(序列表中序列3)，P2：TCTAGAGTG CACCAGGAAGAAGAAGCACACCAC(序列表中序列4)，提取HepG2的mRNA，RT-PCR方法扩增GPC3全长，测序正确后BamHI+XbaI酶切连接入经同样酶切回收的pcDNA3.1(+)载体中，酶切鉴定正确后命名为pcDNA3.1-GPC3。)和pcDNA3.1空载体对照分别瞬时转染COS7真核细胞的裂解产物。进行SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上，转移后的膜于封闭液中封闭后，先分别与步骤二制备的GPC3-C mAb-1、GPC3-C mAb-2、GPC3-C mAb-3、GPC3-C mAb-4、GPC3-C mAb-5(GPCC5#)、GPC3-C mAb-6或GPC3-C mAb-7分泌的单克隆抗体(原核表达检测1∶1000稀释，细胞检测1∶00稀释)，然后分别与HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶10000稀释)共孵育，洗膜后，加入化学发光剂ECL，在暗室中曝光，显影，定影，在胶片上获得相应的条带，分析结果。

细胞培养和瞬时转染的方法为：HepG2、COS7培养于DMEM培养基，培养基中添加10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。瞬时转染用Lipofectamine 2000按说明书进行。

结果如图6所示(图6为GPCC5#分泌的单克隆抗体，结果显示GPC3-C单克隆抗体不仅能识别原核表达的GPC3蛋白，又可识别真核表达的GPC3蛋白(图6)。

3)单克隆抗体的免疫活性鉴定

将培养的HepG2、Hepa1-6细胞制备细胞爬片，95％乙醇固定，1％BSA封闭，先后与按照步骤二的方法收集分离GPC3-C mAb-1、GPC3-C mAb-2、GPC3-C mAb-3、GPC3-C mAb-4、GPC3-C mAb-5(GPCC5#)、GPC3-C mAb-6或GPC3-C mAb-7的腹水(1∶50稀释)和FITC标记的羊抗小鼠IgG(1∶50稀释)进行孵育，用正常小鼠血清代替腹水作为阴性对照，荧光显微镜下观察肝癌细胞系HepG2及Hepa1-6中GPC3的表达情况。结果显示，抗GPC3-C 7株单抗在两种肝癌细胞中均能检测到绿色荧光(Hepa1-6结果未显示)，说明我们制备的抗GPC3-C 7株单抗均能与两种肝癌细胞结合，具有免疫活性(图7)。

四、检测单克隆抗体抗肝细胞癌的活性

参考文献(黄瑾，马忠森，林树青。细胞增殖法检测单核P巨噬细胞ADCC效应方法的建立。中国免疫学杂志1999(15)：177-179.)中的方法，检测ADCC效应。检测到7株杂交瘤细胞系分泌的抗体具有不同程度的抗肿瘤的活性。具体方法如下所述：

效应细胞使用小鼠的脾细胞，靶细胞使用表达GPC3的肝癌细胞HepG2细胞。实验分为ADCC杀伤组和非特异杀伤组。其中ADCC杀伤组体系(总共7个处理，分别用的腹水抗体为GPC3-C mAb-1、GPC3-C mAb-2、GPC3-C mAb-3、GPC3-C mAb-4、GPC3-C mAb-5(GPCC5#)、GPC3-C mAb-6或GPC3-C mAb-7分泌的腹水抗体)中包含效应细胞、靶细胞和腹水抗体。非特异杀伤组体系中包含效应细胞和靶细胞。其中靶细胞数目为8000个每孔。效应细胞/靶细胞的比例为2∶1。另外每组均加入重组人IL2100U/ml。每个抗体对应的ADCC杀伤组和对照组重复3次。上述体系加入96孔细胞培养板中，，37℃CO2箱中培养72h，MTT法检测存活的细胞数目。

依据方法分组分别加入7株抗体，效应细胞和靶细胞。培养72h后，细胞增殖法检测杀伤后的存活细胞。结果如图8(图8中1#抗体-7#抗体分别为GPC3-C mAb-1、GPC3-C mAb-2、GPC3-C mAb-3、GPC3-C mAb-4、GPC3-C mAb-5(GPCC5#)、GPC3-CmAb-6或GPC3-C mAb-7分泌的腹水抗体，图中不加抗体为上述非特异杀伤组体系结果)。结果7株抗体具有不同程度的杀伤作用，其中GPCC5#分泌的腹水抗体的杀伤效果最好。

杂交瘤细胞株GPCC5#已于2011年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC№.4544。

讨论：

本研究首先从人肝癌细胞株HepG2中提取总RNA，RT-PCR扩增出GPC3-C末端序列(编码359-580aa)，利用基因重组技术，构建了其融合表达载体。将GPC3-C端基因进行原核融合表达，由于原核表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，故使用8M脲素溶解包涵体，采用SDS-PAGE电泳后切胶回收，纯化目的蛋自，因而我们得到的是变性蛋白，但这不影响其免疫原性，免疫动物后可产生较高效价的抗体。得到高纯度的抗原后进行小鼠免疫，为了获得较满意的免疫效果，我们从免疫途径、免疫次数和佐剂的使用等因素综合考虑，合理设计免疫程序。通过使用佐剂及多次加强免疫，并采用皮下多点注射的方式，使细胞融合时处于最佳的反应状态，免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞的融合率达到了90％以上，获得了较好的融合效果。

在变性条件下，通常表达载体上自带的蛋白标签会暴露出来产生相应的抗体。我们选用的pET32a表达载体带有TrxA标签，为了避免制备出针对TrxA标签的抗体，在融合后的杂交瘤细胞的筛选时，采用TrxA-GPC3-C和GST-GPC3-C两种纯化蛋白联合筛选的方法，筛选出21株针对两种蛋白均能产生高滴度抗体的杂交瘤细胞进行亚克隆。杂交瘤细胞染色体数较正常多一倍，处于不稳定状态，在瘤细胞分裂时，染色体的分配不平衡，会造成杂交瘤细胞在繁殖过程中抗体分泌能力的丢失，因此从融合细胞中筛选得到阳性杂交瘤细胞后需要经过多次亚克隆筛选才能获得有稳定基因型和稳定分泌表型的细胞株。我们通过三次有限稀释法筛选阳性克隆，最终得到了7株能稳定分泌高特异性抗GPC3-C端单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对获得的含有单克隆抗体的腹水进行效价鉴定，ELISA检测其效价达到了1∶20万以上；用抗体亚类鉴定试剂盒(包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、λ链、κ链的鉴定)经间接ELISA对制备的7株单克隆抗体进行了抗体亚类鉴定，结果7株单抗均为IgG1型，轻链均为κ链。

采用Western blot和细胞免疫荧光法对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。Westernblot及细胞免疫荧光结果证实了我们制备的单克隆抗体特异性良好，具有免疫学活性，既能识别作为免疫原的变性蛋白，也能识别具有空间构象的人肝癌细胞株HepG2表达的GPC3蛋白以及真核瞬时表达的GPC3蛋白。因小鼠和人的GPC3-C蛋白序列的同源性达88.7％，为了检测制备的抗体是否能识别小鼠的GPC3蛋白，我们使用Western-blot和细胞免疫荧光的方法分别检测小鼠肝癌细胞系Hepa1-6。结果我们制备的抗体可以检测到小鼠肝癌细胞系Hepa1-6的GPC3表达。说明我们制备的抗体识别的鼠和人GPC3的表位同源性高，可以用于检测小鼠的GPC3蛋白。为使用小鼠肝癌模型进行GPC3功能研究打下了基础。我们对制备的单克隆抗体进行了辅助细胞毒杀伤细胞活性检测。结果发现制备的7株抗体均具有不同的辅助细胞毒杀伤细胞活性的活性，其中以5号抗体效果最好。

总之，本研究制备了高效价、高特异、且具有免疫活性、并且对肿瘤细胞具有毒杀活性的鼠抗人GPC3-C单克隆抗体，为研究GPC3在组织和细胞中的表达和分布情况，深入研究GPC3蛋白的生物学功能以及肝癌的临床早期检测奠定了实验基础，并为治疗肝癌提供一种无毒性的辅助药物。

Claims (5)

1.一种单克隆抗体，是可以与GPC3抗原表位特异性结合的单克隆抗体；所述GPC3抗原表位的氨基酸序列为自GenBank accession Number为AAA98132.1的氨基端端第359-580位氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的制备中所用免疫抗原是将所述GPC3抗原表位的编码基因插入pET32a的BamH I和Sal I位点之间获得的重组表达载体表达后纯化获得的融合蛋白；所述GPC3抗原表位的编码基因为自GenBank accession Number为L47125.1的5′端第1226-1891位核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC№.4544的鼠源杂交瘤细胞株GPCC5#分泌的抗体。

4.杂交瘤细胞株GPCC5#，其在中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.4544。

5.权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体在制备检测和/或治疗肝癌的药物中的应用。

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