CN112390886A - 一种分离的抗原结合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的至少一个CDR；且其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的至少一个CDR。本申请还涉及编码所述分离的抗原结合蛋白的核酸、包含所述分离的抗原结合蛋白的载体、包含所述核酸或所述载体的细胞、制备所述分离的抗原结合蛋白的方法以及所述分离的抗原结合蛋白的用途。

Description

一种分离的抗原结合蛋白及其用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种分离的抗原结合蛋白及其用途。
背景技术
肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，其中肝癌是危害很广泛的一种恶性肿瘤。由乙肝病毒引起的肝癌具有潜伏期长的特点，一旦发现往往已至晚期，而且发病后进展快速、治疗预后差。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，存在于多种肿瘤之中，在肝癌中尤为常见。近年来，随着分子生物学、基因组学及蛋白质组学的进展，陆续问世了一系列的分子靶向药物，用于肝癌的救治。分子靶向治疗是以肿瘤细胞过度表达的某些标志性分子为靶点，选择针对性的阻断剂，进行有效地干预，从而达到抑制肿瘤生长、进展及转移的效果。相对于手术、放疗、化疗三大传统治疗手段，分子靶向治疗能高效并选择性地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤。但是目前利用分子靶向技术进行肿瘤治疗的效果仍不尽人意，有较多需要改进之处。
发明内容
本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的至少一个CDR；且其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的至少一个CDR。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以6×10-9M或更低的KD与GPC3蛋白相结合，其中所述KD值通过Octet测定；
2)在FACS测定中，能够特异性结合HepG2细胞和/或Huh7细胞表面的GPC3蛋白；和，
3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
在某些实施方式中，所述GPC3蛋白包含人GPC3蛋白。
在某些实施方式中，所述人GPC3蛋白包含如SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括GPC3阳性的肿瘤。
在某些实施方式中，所述GPC3阳性的肿瘤包括肝癌。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的HCDR1。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的HCDR2。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的HCDR3。
在某些实施方式中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:4和12中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:5、10和13中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:6、11和14中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的LCDR1。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的LCDR2。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的LCDR3。
在某些实施方式中，所述LCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR1包含SEQ ID NO:1和7中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR2包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR2包含SEQ ID NO:2、8和15中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR3包含SEQ ID NO:3和9中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白的所述VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
在某些实施方式中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:22和30中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR1包含SEQ ID NO:22和30中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:23和31中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR2包含SEQ ID NO:23和31中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:24和32中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR3包含SEQ ID NO:24和32中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:25和33中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR4包含SEQ ID NO:25和33中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白的所述VL包含SEQ ID NO:46-48中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体轻链恒定区包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含抗体轻链LC，且所述LC包含SEQID NO:56-58中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白的所述VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
在某些实施方式中，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:26和34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR1包含SEQ ID NO:26和34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:27和35中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR2包含SEQ ID NO:27和35中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:28和36中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR3包含SEQ ID NO:28和36中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:29和37中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR4包含SEQ ID NO:29和37中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白的所述VH包含SEQ ID NO:50-52中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区源自人IgG重链恒定区。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区源自人IgG1重链恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含抗体重链HC，且所述HC包含SEQID NO:59-61中任一项所示的氨基酸序列。
本申请还提供分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
本申请还提供一种载体，其包含本申请所述的核酸分子。
本申请还提供一种细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。
本申请还提供制备本申请所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养本申请所述的细胞。
本申请还提供一种药物组合物，其包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
本申请还提供本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
本申请还提供本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物，其用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
本申请还提供预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物。
本申请还提供检测样品中GPC3的方法，所述方法包括施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示将野生型人GPC3蛋白及其突变后的突变体1-11的C-末端序列，其中下划线的位点表示该位点突变为鼠GPC3蛋白对应的氨基酸。
图2A显示分别是用野生型人GPC3蛋白或突变体1-5用于检测L1H2、L2H6和L1H6完整抗体以及GC33对照抗体的表位分析结果；图2B显示分别是用突变体6-11用于检测L1H2、L2H6和L1H6完整抗体以及GC33对照抗体的表位分析结果。
图3显示L1H2、L2H6和L1H6完整抗体的ADCC活性检测结果。
图4显示L1H2完整抗体的肿瘤生长抑制效果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常指从天然状态下经人工手段获得的具有抗原结合能力的蛋白。该“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的支架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白支架或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白支架或人工支架。此类支架包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的支架以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的支架。参见例如Korndorfer等,2003,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque等,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此外，肽抗体模拟物("PAMs")以及利用纤连蛋白组分基于抗体模拟物的支架可以用作支架。
在本申请中，术语“KD”(同样地，“KD”或“KD”)通常指“亲和常数”或“平衡解离常数”，并指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数(kd)除以结合速率常数(ka)所获得的值。使用结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)表示结合蛋白(例如本申请所述的分离的抗原结合蛋白)对抗原(例如GPC3蛋白)的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。例如，可以通过Octet测定所述KD值，也可以使用其他实验途径和仪器例如BIAcore(生物分子相互作用分析)测定(例如，可以从BIAcoreInternationa lAB，aGEHealthcarecompany，Uppsala，瑞典获得的仪器)。另外，也可以使用可以从Sapid yneInstruments(Boise，Idaho)获得的KinExA(动态排阻测定(KineticExclusionAssay))测定所述KD值。
在本申请中，术语“GPC3蛋白”通常指磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3,GPC3)，是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，存在于多种肿瘤之中，在肝癌中尤为常见。GPC3蛋白在胎儿时期的肝脏高表达。出生后GPC3蛋白异常表达与肿瘤发生发展关系密切，GPC3蛋白在原发性肝癌(PHC)中呈高表达，而在其他肿瘤或良性肝病中呈低表达或中表达。例如，本申请所述的GPC3蛋白可以包含人GPC3蛋白。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常指可测量的和可再现的相互作用，比如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况可决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标的抗体。在一个实施方案中，抗体结合无关靶标的程度小于抗体对靶标的结合的约10％，如例如通过放射免疫分析(RIA)测量的。例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够以<6x10-9M或更低的解离常数(KD)与GPC3蛋白相结合。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。
在本申请中，术语“抑制”通常指降低细胞的生长速率或者细胞的数量。例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白，其能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
在本申请中，术语“肿瘤”通常指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。在本申请中，肿瘤可以是实体瘤或血液瘤。例如，在本申请中，肿瘤可以是GPC3阳性的肿瘤，其中所述GPC3阳性的肿瘤可以包括肝癌。
在本申请中，术语“可变结构域”通常指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且包含抗原结合位点。
在本申请中，术语“可变”通常指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上存在很大差异的事实。V结构域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在整个可变结构域范围内均匀分布。相反，它集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大多数采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环形连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但显示出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合GPC3)的其它抗体片段。通常，这样的片段应当包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端具有可变结构域(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对应，且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)相对应。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic and ClinicalImmunology,8th Edition,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种，称为κ和λ。取决于其重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能方面的相对小的差异，将γ和α类进一步分成亚类，例如，人表达下述亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgK1。
在本申请中，术语“CDR”通常指抗体可变结构域的区域，其序列是高度可变的和/或形成结构定义环。通常，抗体包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在天然抗体中，HCDR3和LCDR3显示所述六个CDR的大多数多样性，并且特别地HCDR3被认为在赋予抗体的精细特异性方面起独特作用。参见，例如Xu etal,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson and Wu,in Methods in Molecular Biology248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况功能正常且稳定。参见，例如,Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
在本申请中，术语“FR”通常指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。通常，天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4)。例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的VL可以包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。本申请所述的分离的抗原结合蛋白的VH可以包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常指具有抗原结合活性的片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，术语“竞争结合”通常指抗体或其片段通过对另一种抗体(例如，参比抗体)进行变构调节，干扰另一种抗体直接地或间接地结合靶标/抗原(例如，GPC3)的能力。例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以与参比抗体竞争结合GPC3蛋白。此外，抗体或其片段能够干扰另一个抗体或其片段结合靶标的程度，且因此无论其是否可以被认为是根据本发明的阻断或竞争，都可以使用竞争性结合试验来确定。一种特别合适的定量竞争试验使用基于FACS或基于AlphaScreen方法测量标记的(例如，His标记的、生物素化的或放射性标记的)抗体或其片段和另一抗体或其片段之间在结合靶标方面的竞争。通常，竞争抗体或其片段为例如一种下述的：在竞争试验中结合靶标，使得在试验期间和在第二抗体或其片段的存在下，本发明的分离的抗原结合蛋白的所记录的取代达到由以给定量存在的所检测的潜在阻断抗体或其片段得到的最大理论取代(例如，由需要被阻断的冷(例如，未标记的)抗体或其片段取代)的至多100％(例如，在基于FACS的竞争试验中)。优选地，竞争抗体或其片段具有在10％至100％之间，比如在50％至100％之间的所记录的取代。
在本申请中，术语“直接相连”与术语“间接相连”相对，术语“直接相连”通常是指直接连接。例如，所述直接相连可以为物质间没有间隔子而直接相连的情况。所述间隔子可以是连接子。例如，所述连接子可以为肽连接子。术语“间接相连”通常是指物质间不直接相连的情况。例如，所述间接相连可以为通过间隔子而连接的情况。例如，在本申请所述的分离的抗原结合蛋白中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端可以直接或间接相连。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本申请中，术语“细胞”通常指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本发明所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。在某些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞为HEK293细胞。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指涉及适合施用于患者、优选人患者的组合物。例如，本申请所述的药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”通常指与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等，通常安全、无毒，且既不是生物学上也非其它方面不合需要的。
在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
分离的抗原结合蛋白
一方面本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的至少一个CDR；且其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的至少一个CDR。
X1VQLVQSGX2X3X4X5X6PGX7SX8X9X10SCX11ASGX12X13FX14X15YX16MHWVRQAPGX17GLEWX18X1 9X20LX21X22X23X24GX25X26X27YX28X29X30X31X32GRX33TX34X35X36DX37X38X39X40X41X42YX43X44X45X46X47LRX48X49DTX50X51YYCX52X53X54X55X56X57X58X59X60X61X62X63X64WGQGTX65VTVSS(SEQ ID NO:53)，其中X1可以为E或Q，X2可以为G或A，X3可以为G或E，X4可以为L或V，X5可以为V或K，X6可以为Q或K，X7可以为R或A，X8可以为L或V，X9可以为R或K，X10可以为L或V，X11可以为A或K，X12可以为F或Y，X13可以为T或D，X14可以为D或T，X15可以为D或A，X16可以为A或E，X17可以为K或Q，X18可以为V或M，X19可以为S或G，X20可以为G或A，X21可以为S或D，X22可以为W或P，X23可以为N或K，X24可以为S或T，X25可以为S或Q，X26可以为I或T，X27可以为G或A，X28可以为A或S，X29可以为D或Q，X30可以为S或K，X31可以为V或F，X32可以为K或Q，X33可以为F或V，X34可以为I或L，X35可以为S或T，X36可以为R或A，X37可以为N或K，X38可以为A或S，X39可以为K或I，X40可以为N或S，X41可以为S或T，X42可以为L或A，X43可以为L或M，X44可以为Q或E，X45可以为M或L，X46可以为N或S，X47可以为S或R，X48可以为A或S，X49可以为E或D，X50可以为A或V，X51可以为L或V，X52可以为A或空白，X53可以为K或空白，X54可以为D或T，X55可以为H或R，X56可以为T或F，X57可以为I或Y，X58可以为G或S，X59可以为V或Y，X60可以为G或A，X61可以为A、Y或H，X62可以为F或空白，X63可以为D或空白，X64可以为I或空白，X65可以为M或L。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的所述VH可以包含SEQ ID NO:50-52中任一项所示的氨基酸序列。
X1X2VX3TQX4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24SX25VX26X27X28X29YX30X31X32X33WYQQX34PGX35X36PX37LX38IYX39X40SX41RX42SGVX43X44RFSGSX45SGX46X47X48X49LX50ISX5 1X52X53AEDX54X55X56YYCX57X58X59X60X61X62X63X64X65X66FGX67GTKLX68X69X70(SEQ ID NO:49)，其中X1可以为Q或D，X2可以为S或V，X3可以为L或M，X4可以为P或S，X5可以为A或P，X6可以为S或L，X7可以为V或S，X8可以为S或L，X9可以为G或P，X10可以为S或V，X11可以为P或T，X12可以为G或L，X13可以为Q或G，X14可以为S或Q，X15可以为I或P，X16可以为T或A，X17可以为I或S，X18可以为S或I，X19可以为C或S，X20可以为空白或C，X21可以为T或R，X22可以为G或S，X23可以为T或S，X24可以为S或Q，X25可以为D或L，X26可以为G或H，X27可以为G或S，X28可以为Y或N，X29可以为N或G，X30可以为V或T，X31可以为S或Y，X32可以为空白或L，X33可以为空白或H，X34可以为H或R，X35可以为K或Q，X36可以为A或S，X37可以为K或R，X38可以为M或L，X39可以为D或K，X40可以为V或G，X41可以为N、Y或Q，X42可以为P或G，X43可以为S或P，X44可以为N或D，X45可以为K或G，X46可以为N或T，X47可以为T或D，X48可以为A或F，X49可以为S或T，X50可以为T或K，X51可以为G或R，X52可以为L或V，X53可以为Q或E，X54可以为E或V，X55可以为A或G，X56可以为D或V，X57可以为S或G，X58可以为S或Q，X59可以为Y或S，X60可以为A或G，X61可以为S或L，X62可以为G或T，X63可以为S或P，X64可以为T或P，X65可以为L或T，X66可以为V或空白，X67可以为G或S，X68可以为T或E，X69可以为V或I，X70可以为L或K。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的所述VL可以包含SEQ ID NO:46-48中任一项所示的氨基酸序列。
例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的HCDR1。例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的HCDR2。例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的HCDR3。又例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的LCDR1。例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的LCDR2。例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的LCDR3。
所述分离的抗原结合蛋白的性质
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以6×10-9M或更低的KD与GPC3蛋白相结合，其中所述KD值通过Octet测定；
2)在FACS测定中，能够特异性结合HepG2细胞和/或Huh7细胞表面的GPC3蛋白；和，
3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够以6×10-9M或更低的KD与GPC3蛋白相结合，其中所述KD值可以通过Octet测定。例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白结合源自人的GPC3蛋白的KD值可以为≤6x10-9M、≤5x10-9M、≤4x10-9M、≤3x10-9M、≤2x10-9M、≤1x10-9M、≤1x10-10M、≤2x10-10M、≤3x10-10M、≤4x10-10M、≤5x10-10M、≤6x10-10M、≤7x10-10M、≤8x10-10M、≤9x10-10M。又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白结合源自鼠的GPC3蛋白的KD值可以为≤6x10-9M、≤5x10-9M、≤4x10-9M、≤3x10-9M、≤2x10-9M、≤1x10-9M、≤1x10- 10M、≤2x10-10M、≤3x10-10M、≤4x10-10M、≤5x10-10M、≤6x10-10M、≤7x10-10M、≤8x10-10M、≤9x10-10M。又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白结合源自猴的GPC3蛋白的KD值可以为≤6x10-9M、≤5x10-9M、≤4x10-9M、≤3x10-9M、≤2x10-9M、≤1x10-9M、≤1x10-10M、≤2x10-10M、≤3x10-10M、≤4x10-10M、≤5x10-10M、≤6x10-10M、≤7x10-10M、≤8x10-10M、≤9x10-10M。
在本申请中，所述KD值还可以通过ELISA、竞争ELISA或BIACORE或KINEXA进行测定。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够特异性结合HepG2细胞和/或Huh7细胞表面的GPC3蛋白，所述特异性结合可以通过FACS测定。例如，可以通过FACS测定中的半最大效应浓度(EC50)来反映本申请所述分离的抗原结合蛋白特异性结合HepG2细胞和/或Huh7细胞表面的GPC3蛋白的情况，例如，半最大效应浓度(EC50)越低说明特异性结合越好。例如，所述分离的抗原结合蛋白在FACS测定中结合HepG2细胞和/或Huh7细胞表面的GPC3蛋白的EC50值可以为0.01μg/ml～0.20μg/ml、0.01μg/ml～0.02μg/ml、0.01μg/ml～0.03μg/ml、0.01μg/ml～0.04μg/ml、0.01μg/ml～0.05μg/ml、0.01μg/ml～0.06μg/ml、0.01μg/ml～0.07μg/ml、0.01μg/ml～0.08μg/ml、0.01μg/ml～0.09μg/ml、0.01μg/ml～0.10μg/ml、0.01μg/ml～0.11μg/ml、0.01μg/ml～0.12μg/ml、0.01μg/ml～0.13μg/ml、0.01μg/ml～0.14μg/ml、0.01μg/ml～0.15μg/ml、0.01μg/ml～0.16μg/ml、0.01μg/ml～0.17μg/ml、0.01μg/ml～0.18μg/ml、0.01μg/ml～0.19μg/ml或0.01μg/ml～0.20μg/ml。
在本申请中，本申请所述的分离的抗原结合蛋白能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖，例如，能够使肿瘤体积减小至少约10％，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约99％或100％。又例如，能够使肿瘤细胞数量减少至少约10％，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约99％或100％。
在本申请中，所述GPC3蛋白可以包含人GPC3蛋白，所述人GPC3蛋白可以包含如SEQID NO:74所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述肿瘤可以包括GPC3阳性的肿瘤，所述GPC3阳性的肿瘤可以包括肝癌。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够通过诱导产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)抑制肿瘤细胞的生长。例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白能够将细胞毒性的浸润T淋巴细胞带入肿瘤组织，进而抑制肿瘤细胞的生长。又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白还可以通过巨噬细胞相关机制间接抑制GPC3阳性细胞的增殖。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白具有一定的内吞活性。所述内吞活性可以通过Confocal方法进行检测。
所述分离的抗原结合蛋白的种类
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体或其抗原结合片段。例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白可以包括但不限于重组抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fv片段、scFv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段和骆驼化单结构域抗体。
在本申请中，所述抗体可以为人源化抗体。换句话说，本申请所述的分离的抗原结合蛋白，其可以为免疫特异性结合至相关抗原(例如人类GPC3)且包含基本上具有人类抗体的氨基酸序列的框架(FR)区及基本上具有非人类抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变异体、衍生物、类似物或片段。此处的“基本上”在CDR的情况下是指CDR的氨基酸序列与非人类抗体CDR的氨基酸序列至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一。所述人源化抗体基本上可以包含所有至少一个且通常两个可变域(Fab、Fab′、F(ab′)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人类免疫球蛋白(即抗体)的CDR区且所有或基本上所有框架区为具有人类免疫球蛋白共有序列的框架区。优选地，人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(例如，Fc)，通常为人类免疫球蛋白的恒定区。在一些实施例中，人源化抗体含有轻链以及重链的至少可变域。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3及CH4区。在一些实施例中，人源化抗体仅含人源化轻链。在一些实施例中，人源化抗体仅含人源化重链。在特定实施例中，人源化抗体仅含轻链和/或人源化重链的人源化可变域。
在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
CDR
在本申请中，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
X1X2X3X4SX5VX6X7X8X9YX10X11X12X13(SEQ ID NO:16)，其中X1可以为T或R，X2可以为G或S，X3可以为T或S，X4可以为S或Q，X5可以为D或L，X6可以为G或H，X7可以为G或S，X8可以为Y或N，X9可以为N或G，X10可以为V或T，X11可以为S或Y，X12可以为空白或L，X13可以为空白或H。
在本申请中，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:1和7中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
X1X2SX3RX4S(SEQ ID NO:17)，其中X1可以为D或K，X2可以为V或G，X3可以为N、Y或Q，X4可以为P或G。
在本申请中，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:2、8和15中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO:18)，其中X1可以为S或G，X2可以为S或Q，X3可以为Y或S，X4可以为A或G，X5可以为S或L，X6可以为G或T，X7可以为S或P，X8可以为T或P，X9可以为L或T，X10可以为V或空白。
在本申请中，所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:3和9中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
X1YX2MH(SEQ ID NO:19)，其中X1可以为D或A，X2可以为A或E。
在本申请中，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:4和12中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
X1LX2X3X4X5GX6X7X8YX9X10X11X12X13G(SEQ ID NO:20)，其中X1可以为G或A，X2可以为S或D，X3可以为W或P，X4可以为N或K，X5可以为S或T，X6可以为S或Q，X7可以为I或T，X8可以为G或A，X9可以为A或S，X10可以为D或Q，X11可以为S或K，X12可以为V或F，X13可以为K或Q。
在本申请中，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:5、10和13中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:21)，其中X1可以为D或T，X2可以为H或R，X3可以为T或F，X4可以为I或Y，X5可以为G或S，X6可以为V或Y，X7可以为G或A，X8可以为A、Y或H，X9可以为F或空白，X10可以为D或空白，X11可以为I或空白。
在本申请中，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:6、11和14中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且HCDR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且HCDR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且HCDR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
FR
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的VL可以包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
在本申请中，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
X1X2VX3TQX4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20(SEQ ID NO:38)，其中X1可以为Q或D，X2可以为S或V，X3可以为L或M，X4可以为P或S，X5可以为A或P，X6可以为S或L，X7可以为V或S，X8可以为S或L，X9可以为G或P，X10可以为S或V，X11可以为P或T，X12可以为G或L，X13可以为Q或G，X14可以为S或Q，X15可以为I或P，X16可以为T或A，X17可以为I或S，X18可以为S或I，X19可以为C或S，X20可以为空白或C。
例如，所述L-FR1的C末端可以与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:22和30中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1可以包含SEQ ID NO:22和30中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
WYQQX1PGX2X3PX4LX5IY(SEQ ID NO:39)，其中X1可以为H或R，X2可以为K或Q，X3可以为A或S，X4可以为K或R，X5可以为M或L。
例如，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2可以包含SEQ IDNO:23和31中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:23和31中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
GVX1X2RFSGSX3SGX4X5X6X7LX8ISX9X10X11AEDX12X13X14YYC(SEQ ID NO:40)，其中X1可以为S或P，X2可以为N或D，X3可以为K或G，X4可以为N或T，X5可以为T或D，X6可以为A或F，X7可以为S或T，X8可以为T或K，X9可以为G或R，X10可以为L或V，X11可以为Q或E，X12可以为E或V，X13可以为A或G，X14可以为D或V。
例如，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3可以包含SEQ IDNO:24和32中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:24和32中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
FGX1GTKLX2X3X4(SEQ ID NO:41)，其中X1可以为G或S，X2可以为T或E，X3可以为V或I，X4可以为L或K。
例如，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4可以包含SEQ IDNO:25和33中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述L-FR4可以包含SEQ ID NO:25和33中任一项所示的氨基酸序列。
又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述VH可以包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
在本申请中，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
X1VQLVQSGX2X3X4X5X6PGX7SX8X9X10SCX11ASGX12X13FX14(SEQ ID NO:42)，其中X1可以为E或Q，X2可以为G或A，X3可以为G或E，X4可以为L或V，X5可以为V或K，X6可以为Q或K，X7可以为R或A，X8可以为L或V，X9可以为R或K，X10可以为L或V，X11可以为A或K，X12可以为F或Y，X13可以为T或D，X14可以为D或T。
在本申请中，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:26和34中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:26和34中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
WVRQAPGX1GLEWX2X3(SEQ ID NO:43)，其中X1可以为K或Q，X2可以为V或M，X3可以为S或G。
在本申请中，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:27和35中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:27和35中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
RX1TX2X3X4DX5X6X7X8X9X10YX11X12X13X14X15LRX16X17DTX18X19YYCX20X21(SEQ ID NO:44)，其中X1可以为F或V，X2可以为I或L，X3可以为S或T，X4可以为R或A，X5可以为N或K，X6可以为A或S，X7可以为K或I，X8可以为N或S，X9可以为S或T，X10可以为L或A，X11可以为L或M，X12可以为Q或E，X13可以为M或L，X14可以为N或S，X15可以为S或R，X16可以为A或S，X17可以为E或D，X18可以为A或V，X19可以为L或V，X20可以为A或空白，X21可以为K或空白。
在本申请中，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:28和36中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:28和36中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
WGQGTX1VTVSS(SEQ ID NO:45)，其中X1可以为M或L。
在本申请中，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:29和37中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:29和37中任一项所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，H-FR4可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，H-FR4可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，且H-FR1可包含SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQID NO:28所示的氨基酸序列，H-FR4可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
又例如，本申请所述的分离的抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且H-FR1可包含SEQ IDNO:34所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQID NO:36所示的氨基酸序列，H-FR4可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
VL和VH
本申请所述的分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH。例如，所述VL可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。又例如，所述分离的抗原结合蛋白的VL可以包含SEQ ID NO:46-48中任一项所示的氨基酸序列。所述分离的抗原结合蛋白的所述VH可以包含SEQ ID NO:50-52中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
轻链和重链
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区可以包括人Igκ恒定区。例如，所述抗体轻链恒定区可以包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区可以源自人IgG重链恒定区。在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区可以源自人IgG1重链恒定区。例如，所述抗体重链恒定区可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体轻链LC，且所述LC可以包含SEQ ID NO:56-58中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体重链HC，且所述HC可以包含SEQ ID NO:59-61中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白可以包含抗体轻链和抗体重链。
例如，所述轻链可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述重链可包含SEQ IDNO:59所示的氨基酸序列。
例如，所述轻链可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，所述重链可包含SEQ IDNO:60所示的氨基酸序列。
例如，所述轻链可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，所述重链可包含SEQ IDNO:61所示的氨基酸序列。
例如，所述轻链可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，所述重链可包含SEQ IDNO:61所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的轻链可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且重链可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。其中，所述分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。其中，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，且H-FR1可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，H-FR4可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。所述VL可包含SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以为204A。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的轻链可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，且重链可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。其中，所述分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且HCDR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。其中，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且H-FR1可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，H-FR4可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。所述VL可包含SEQ IDNO:47所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以为L1H2。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的轻链可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，且重链可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。其中，所述分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且HCDR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。其中，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且H-FR1可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，H-FR4可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。所述VL可包含SEQ IDNO:47所示的氨基酸序列，且所述VH可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以为L1H6。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的轻链可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，且重链可包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。其中，所述分离的抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，LCDR2可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，LCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且HCDR1可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR2可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，HCDR3可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。其中，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，L-FR2可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，L-FR3可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，L-FR4可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且H-FR1可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，H-FR2可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，H-FR3可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，H-FR4可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。所述VL可包含SEQ IDNO:48所示的氨基酸序列，所述VH可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以为L2H6。
核酸分子、载体、细胞、制备方法和药物组合物
另一方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，其可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。本申请所述的分离的一种或多种核酸分子可以为任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物，但可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请还提供了载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。例如，载体可以包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。又例如，所述载体可以含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，所述载体还可以含有复制起始位点。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
另一方面，本申请还提供了细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。所述细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。在某些实施方式中，所述细胞还可以包括用本发明所述的载体在体外转染的细胞。在某些实施方式中，所述细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。在某些实施方案中，所述细胞可以为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞可以为HEK293细胞。
另一方面，本申请还提供了制备本申请所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法可以包括在使得本申请所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养本申请所述的细胞。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的佐剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒，且既不是生物学上也非其它方面不合需要的。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。
用途和应用
另一方面，本申请还提供了本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物可以用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
另一方面，本申请还提供了预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法可以包括向有需要的受试者施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白。在本申请中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
另一方面，本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物，其可以用于预防、缓解或治疗肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以是实体瘤或血液瘤。例如，所述肿瘤可以包括GPC3阳性的肿瘤，所述GPC3阳性的肿瘤可以包括肝癌。
在本申请中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述受试者可以包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
另一方面，本申请还提供了检测样品中GPC3的方法，所述方法包括施用本申请所述的分离的抗原结合蛋白。在本申请中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的蛋白质分子、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring HarborLaboratory Press。
实施方案
1分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的至少一个CDR；且其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的至少一个CDR。
2根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以6×10-9M或更低的KD与GPC3蛋白相结合，其中所述KD值通过Octet测定；
2)在FACS测定中，能够特异性结合HepG2细胞和/或Huh7细胞表面的GPC3蛋白；
3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
3根据实施方案2所述的分离的抗原结合蛋白，所述GPC3蛋白包含人GPC3蛋白。
4根据实施方案2-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述人GPC3蛋白包含如SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列。
5根据实施方案2-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述肿瘤包括GPC3阳性的肿瘤。
6根据实施方案5所述的分离的抗原结合蛋白，所述GPC3阳性的肿瘤包括肝癌。
7根据实施方案1-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的HCDR1。
8根据实施方案1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的HCDR2。
9根据实施方案1-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的HCDR3。
10根据实施方案7所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
11根据实施方案10所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:4和12中任一项所示的氨基酸序列。
12根据实施方案8所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
13根据实施方案12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:5、10和13中任一项所示的氨基酸序列。
14根据实施方案9所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
15根据实施方案14所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:6、11和14中任一项所示的氨基酸序列。
16根据实施方案1-15中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的LCDR1。
17根据实施方案1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的LCDR2。
18根据实施方案1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的LCDR3。
19根据实施方案16所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
20根据实施方案19所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:1和7中任一项所示的氨基酸序列。
21根据实施方案17所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR2包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
22根据实施方案21所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR2包含SEQ ID NO:2、8和15中任一项所示的氨基酸序列。
23根据实施方案18所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
24根据实施方案23所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:3和9中任一项所示的氨基酸序列。
25根据实施方案1-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
26根据实施方案25所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
27根据实施方案1-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
28根据实施方案27所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:22和30中任一项所示的氨基酸序列。
29根据实施方案27-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NO:22和30中任一项所示的氨基酸序列。
30根据实施方案27所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:23和31中任一项所示的氨基酸序列。
31根据实施方案27和30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2包含SEQ ID NO:23和31中任一项所示的氨基酸序列。
32根据实施方案27所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:24和32中任一项所示的氨基酸序列。
33根据实施方案27和32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3包含SEQ ID NO:24和32中任一项所示的氨基酸序列。
34根据实施方案27所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:25和33中任一项所示的氨基酸序列。
35根据实施方案27和34中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR4包含SEQ ID NO:25和33中任一项所示的氨基酸序列。
36根据实施方案1-35中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQID NO:46-48中任一项所示的氨基酸序列。
37根据实施方案1-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区。
38根据实施方案37所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体轻链恒定区包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
39根据实施方案1-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体轻链LC，且所述LC包含SEQ ID NO:56-58中任一项所示的氨基酸序列。
40根据实施方案1-39中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
41根据实施方案40所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:26和34中任一项所示的氨基酸序列。
42根据实施方案40-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1包含SEQ ID NO:26和34中任一项所示的氨基酸序列。
43根据实施方案40所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:27和35中任一项所示的氨基酸序列。
44根据实施方案40和43中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR2包含SEQ ID NO:27和35中任一项所示的氨基酸序列。
45根据实施方案40所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:28和36中任一项所示的氨基酸序列。
46根据实施方案40和45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3包含SEQ ID NO:28和36中任一项所示的氨基酸序列。
47根据实施方案40所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:29和37中任一项所示的氨基酸序列。
48根据实施方案40和47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR4包含SEQ ID NO:29和37中任一项所示的氨基酸序列。
49根据实施方案1-48中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含SEQID NO:50-52中任一项所示的氨基酸序列。
50根据实施方案1-49中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区源自人IgG重链恒定区。
51根据实施方案1-50中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区源自人IgG1重链恒定区。
52根据实施方案1-51中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
53根据实施方案1-52中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链HC，且所述HC包含SEQ ID NO:59-61中任一项所示的氨基酸序列。
54分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方案1-53中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
55载体，其包含根据实施方案54所述的核酸分子。
56细胞，其包含根据实施方案54所述的核酸分子或根据实施方案55所述的载体。
57制备实施方案1-53中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得实施方案1-53中任一项所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养根据实施方案56所述的细胞。
58药物组合物，其包含实施方案1-53中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案54所述的核酸分子、实施方案55所述的载体和/或实施方案56所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
59实施方案1-53中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案54所述的核酸分子、实施方案55所述的载体、实施方案56所述的细胞和/或实施方案58所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
60预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用实施方案1-53中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
61检测样品中GPC3的方法，所述方法包括施用实施方案1-53中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
实施例
实施例1.利用噬菌体抗体文库筛选抗GPC3抗体
以重组人GPC3蛋白(上海原能细胞医学技术有限公司，氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示)为抗原，进行噬菌体天然人源性抗体文库(上海原能细胞医学技术有限公司)分选，共进行四轮分选。酶联免疫管中使用CBS缓冲液包被抗原GPC3蛋白1ml，GPC3浓度为20μg/ml(第一、二轮)或10μg/ml(第三、四轮)，4℃过夜；次日用含10％的脱脂奶粉的PBS缓冲液2ml封闭免疫管；将1ml的封闭过的噬菌体(phage)加入到免疫管中，室温孵育1h；PBST洗涤10次(第一、二轮)或15次(第三、四轮)；加入pH2.2的Gly-HCl缓冲液800μl洗脱，立即加400μl的pH8.0的Tris-HCl缓冲液中和；加入到20ml对数生长期(光密度值OD约0.8)的大肠杆菌菌株E.coli SS320中，混匀37℃静置1h；取出500μl用来测定噬菌体滴度并用甘油保菌；剩余菌液涂平板，培养箱中37℃过夜培养；第二天刮下平板的菌，按一定比例接入80ml的2YT-Amp培养基中，使OD等于0.2，培养数小时以OD达到0.8时，加入160μl的辅助噬菌体(helperphage)，然后混匀37℃静置1h；加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、Kan抗生素，250rpm，30℃，振荡培养过夜；收集上清，用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，将沉淀的噬菌体重悬于1.5ml的PBS缓冲液中；重悬的噬菌体用于下一轮的富集筛选，4轮淘洗之后，观察到显著的富集。利用ELISA对淘选得到的噬菌体抗体克隆进行鉴定，具体方法为：在96孔ELISA板上包被人GPC3蛋白(上海原能细胞医学技术有限公司)，浓度1μg/ml，4℃过夜。然后用10％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，充分洗涤后，取单克隆的噬菌体上清加入96孔板，37℃孵育2小时。充分洗涤后，加入Anti-M13-HPR(GE healtcare，27-9421-01)，37℃作用45min，充分洗涤后加入TMB显色，室温下作用5-10min后，最后用硫酸终止反应，于450nm处测定各孔OD值。
通过ELISA鉴定获得了4株能特异性结合人GPC3的噬菌体抗体克隆(也就是本申请所述的分离的抗原结合蛋白)，测序后获得VH和VL基因序列，将这4株噬菌体抗体克隆分别命名为204A、L1H2、L1H6、L2H6。SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:46分别显示了噬菌体抗体克隆204A的轻链可变区VL的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:50分别显示了噬菌体抗体克隆204A重链可变区VH的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:47分别显示了噬菌体抗体克隆L1H2的轻链可变区VL的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:51分别显示了噬菌体抗体克隆L1H2重链可变区VH的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:47分别显示了噬菌体抗体克隆L1H6的轻链可变区VL的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:52分别显示了噬菌体抗体克隆L1H6重链可变区VH的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:48分别显示了噬菌体抗体克隆L2H6的轻链可变区VL的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:52分别显示了噬菌体抗体克隆L2H6重链可变区VH的核酸序列和氨基酸序列。
实施例2.抗GPC3完整抗体的表达和纯化
将噬菌体抗体克隆204A、L1H2、L1H6、L2H6重新设计成完整IgG1,κ抗体(也就是本申请所述的分离的抗原结合蛋白)，具体方法为：设计引物对噬菌体抗体克隆的VH进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和SalI双酶切的pCMV-IgG1NDL载体；设计引物对噬菌体抗体克隆的VL进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV-κ载体。测序正确后将重、轻链表达载体共转染293F细胞进行瞬时表达，并通过ProteinA柱纯化，获得204A、L1H2、L1H6、L2H6完整IgG1,κ抗体。SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:56显示了204A完整抗体轻链的核酸序列和氨基酸序列，SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:59显示了204A完整抗体重链的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:57显示了L1H2完整抗体轻链的核酸序列和氨基酸序列，SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:60显示了L1H2完整抗体重链的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:57显示了L1H6完整抗体轻链的核酸序列和氨基酸序列，SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:61显示了L1H6完整抗体重链的核酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:58显示了L2H6完整抗体轻链的核酸序列和氨基酸序列，SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:61显示了L2H6完整抗体重链的核酸序列和氨基酸序列。
实施例3.抗GPC3完整抗体的结合亲和力检测
使用Octet RED384仪器(Pall ForteBio公司)测量实施例2获得的204A、L1H2、L1H6、L2H6完整抗体针对重组人GPC3蛋白的结合亲和力。首先，用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin,Pierce,21327)标记重组人GPC3蛋白(即抗原)。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用分子相互作用分析仪fortebiooctetRED384(PALL)来进行抗原抗体之间的结合动力学分析(抗原、抗体稀释均使用0.1％BSA及0.02％吐温20的PBS缓冲液)。使用浓度为50nM经过生物素偶联的抗原与SA传感器固定，1500rpm/min，结合10min；然后再与对倍稀释的抗体(即实施例2获得的204A、L1H2、L1H6、L2H6完整抗体)溶液结合10min，1500rpm/min。最后解离10分钟，1500rpm/min。残留的抗体将通过甘氨酸脉冲再生。得到的结果将通过OctetDataAnalysis9.0软件(fortebio)进行数据分析，来计算出抗原与抗体的结合强度，得到KD值，Ka(1/Ms)值和Kd(1/s)值。抗GPC3完整抗体204A、L1H2、L1H6、L2H6均能与重组人GPC3蛋白高亲和力结合(如表1所示)。
表1.抗GPC3完整抗体与人GPC3蛋白的结合亲和力
Figure BDA0002634134690000301
表1中，Ka：结合速率常数；Kd：解离速率常数；KD：亲和常数，等于Kd/Ka。
实施例4.抗GPC3完整抗体的表位分析
测定L1H2、L1H6以及L2H6抗体的表位具体位置，通过PCR定点突变技术(天根，KM101)，把GPC3-His蛋白的序列进行定点突变。抗GPC3抗体与鼠GPC3抗体无交叉反应，将野生型人GPC3蛋白和鼠GPC3蛋白不同的位点分别一一突变为鼠对应的氨基酸，如图1所示，共11个位点。然后分别把这11个突变的GPC3-His突变蛋白以及GPC-His真核表达，获得对应的蛋白。用Anti-6×His-HRP(Abcam，ab1187)把以上12个蛋白的基线调成一致。然后包被等量的12个蛋白各1ug/ml，4℃过夜；第二天用5％脱脂奶粉(生工，A600669)封闭以后，一抗加入L1H2、L1H6、L2H6以及GC33抗体(4ug/ml初始浓度，4倍梯度稀释，共7个孔，最后一个孔用PBS)，反应一小时，二抗用羊抗人IgG HRP(Abcam，ab97225)，1:8000使用。其中GC33表示对照抗体(请参见名称为抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，公告号为CN1842540B的专利文献)。37℃作用45min，充分洗涤后加入TMB显色，室温下作用5-10min后，最后用硫酸终止反应，于450nm处测定各孔OD值。
统计结果如图2A-2B所示。结果显示，当用野生型人GPC3蛋白(人Wildtype humanGPC3)时，L1H2比GC33抗体结合稍微强一些。当把人GPC3的苯丙氨酸突变为丝氨酸时(如突变体7所示)，L1H2和L2H6与GPC-His突变蛋白结合大大减弱，而L1H6和GC33所受影响较小。当把人GPC3的脯氨酸突变为谷氨酰胺时(如突变体5所示)，L2H6与GPC-His突变蛋白结合有所减弱，另外三个抗体所受影响较小。表明L1H2的表位重点位于苯丙氨酸附近，而GC33的表位位于由GPC3 C-末端的KDNEIST的序列内。
实施例5.抗GPC3完整抗体与细胞表面GPC3结合检测
通过流式细胞荧光分选技术(FACS)，使用iQue Screener流式仪(购自IntelliCyt公司)，用含有0.1％BSA的PBS作为缓冲液进行细胞表面靶抗原(GPC3)与抗体(实施例2获得的L1H2、L1H6、L2H6完整抗体)结合亲和力检测，具体过程如下：
1.使用缓冲液配置浓度为1*106cells/ml的靶细胞(即HepG2肝癌细胞、Huh7肝癌细胞或L02肝细胞)，加入96孔尖底板(corning 3894)，每孔30μl；
2.使用缓冲液配置检测抗体浓度为3μg/ml，并按3倍比稀释抗体，形成8个浓度梯度；
3.将配置好的不同浓度的抗体按30μl/孔加入已铺好的靶细胞中混匀；
4. 4℃冰箱孵育1小时；
5.每孔加150μl缓冲液，300g离心5分钟，弃上清后将细胞震松散；
6.重复步骤5；
7.使用缓冲液按1:200配比配置荧光二抗(ab98593)，每孔30μl加入细胞中混匀，4°冰箱孵育30分钟；
8.每孔加150μl缓冲液，300g离心5分钟，弃上清后将细胞震松散；
9.重复步骤8；
10.每孔加35μl缓冲液混匀后用流式仪器检测；
11.用Graphpad软件对数据进行分析。
流式亲和力结合实验的分析结果如表2所示，其中GC33表示对照抗体(请参见名称为抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，公告号为CN1842540B的专利文献)，其表达纯化方法同实施例2。
表2.抗GPC3完整抗体与细胞表面GPC3蛋白的结合结果
Figure BDA0002634134690000311
从表2可以看出，L1H2、L2H6和L1H6完整抗体在高GPC3表达的HepG2肝癌细胞以及中等GPC3表达的Huh7肝癌细胞表面的流式结合能力均高于GC33抗体的细胞表面结合水平。
实施例6.抗GPC3完整抗体的ADCC活性检测
抗GPC3完整抗体(即L1H2、L1H6和L2H6完整抗体)针对GPC3高表达的肝癌细胞系HepG2的ADCC活性通过
Figure BDA0002634134690000312
荧光素酶检测系统(
Figure BDA0002634134690000313
Luciferase Assaysystem)进行检测。
细胞和抗体样本具体处理过程如下：
1.用含10％FBS(GIBICO)的DMEM(GIBICO)完全培养基培养和扩增稳定表达荧光素酶(luciferase)的HepG2细胞(HepG2-luc)，0.25％胰酶(GIBICO)消化细胞后将1.95x106细胞用X-VIVO(Lonza)培养基重悬至13ml，形成1.5x105/ml的细胞悬液待用。
2.将2ml单采血用PBS稀释三倍至6ml，铺于5ml聚蔗糖(ficoll，GE)分离液上层，500g离心30分钟后取白膜层，用10mlPBS洗涤2次，每次500g离心5分钟。取5x107获得的PBMC细胞用X-VIVO(Lonza)培养基重悬至6.9ml，形成7.2x106/ml的细胞悬液待用。
3.将L1H2、L1H6和L2H6完整抗体用X-VIVO(Lonza)培养基稀释到30μg/ml，然后依次10倍稀释，产生3μg/ml、0.3μg/ml、0.03μg/ml抗体溶液待用。
4.按每孔70μl HepG2-luc细胞悬液加每孔70μl PBMC细胞悬液以及每孔70μl各抗体溶液的方式进行铺板(96孔V底板(Thermo))，每组两个副孔，37℃的CO2培养箱中静置孵育5小时。
5.70μl HepG2-luc细胞悬液加70μl PBMC细胞悬液以及70μl X-VIVO培养基的孔和210μl X-VIVO培养基的孔分别作为无杀伤对照孔和本底孔，每组两个副孔，37℃的CO2培养箱中静置孵育5小时。
Figure BDA0002634134690000321
荧光素酶检测系统(
Figure BDA0002634134690000322
Luciferase Assay system)检测具体过程如下：
1.将试剂平衡至室温后用
Figure BDA0002634134690000323
荧光素酶检测缓冲液(
Figure BDA0002634134690000326
Luciferase Assay Buffer)重悬
Figure BDA0002634134690000324
荧光素酶检测底物(
Figure BDA0002634134690000325
LuciferaseAssay Substrate)。
2.将重悬好的检测试剂按100μl/孔铺于96孔平底白板中(thermo)。
3.将实验孔板从37℃的CO2培养箱中取出静置10分钟平衡至室温。
4.用排枪充分吹打重悬每个孔的细胞，使其成为均匀的细胞悬液。
5.用排枪立即取细胞悬液100μl至含有检测试剂的白板中并吹打混匀
6.避光静置10分钟，用TECAN SPARK 10M酶标检测仪的发光(Luminescence)检测程序进行读值。
7.对读值进行分析：
杀伤％＝100X(无杀伤对照孔─抗体实验孔)/无杀伤对照
实验结果如图3显示，可以看出，L1H2、L1H6和L2H6完整抗体均能够有效介导对GPC3高表达的肝癌细胞系HepG2的有效杀伤，即均具有显著的ADCC活性。
实施例7.L1H2抗体对用人肝细胞瘤移植的小鼠模型的抗肿瘤活性
将Huh7细胞以1×107个/0.2mL浓度接种于BALB/c nude小鼠的右侧皮下，共20只，待接瘤第6天进行分组，按肿瘤体积挑选16只随机分2组，每组8只。给药途径为尾静脉注射，分组后Day0、7、14、28给药4次，药效项目数据截至为Day41。L1H2抗体组尾静脉给药L1H210mg/kg，对照组尾静脉注射相同体积的PBS。给药和观察期间每周测量2-3次小鼠体重和肿瘤体积，并记录测量值。实验结束时，动物安乐死，计算肿瘤体积变化。
在本实验中，用肿瘤体积随时间的变化来评价L1H2抗体对用人肝细胞瘤移植的小鼠模型的抗肿瘤效果。通过下列公式计算肿瘤体积。
肿瘤体积＝(长轴)×(短轴)×(短轴)/2
如图4所示，与对照组相比较，在L1H2抗体组(L1H2 10mg/kg IV)中观察对小鼠肿瘤生长抑制率为59.67％。因此，本申请的抗体被显示对用人肝细胞瘤移植的小鼠模型有抗癌作用。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 上海原能细胞医学技术有限公司
<120> 一种分离的抗原结合蛋白及其用途
<130> 0065-PA-026
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A LCDR1
<400> 1
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A LCDR2
<400> 2
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A LCDR3
<400> 3
Ser Ser Tyr Ala Ser Gly Ser Thr Leu Val
1 5 10
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A HCDR1
<400> 4
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A HCDR2
<400> 5
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A HCDR3
<400> 6
Asp His Thr Ile Gly Val Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 LCDR1
<400> 7
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6 LCDR2
<400> 8
Lys Val Ser Tyr Arg Gly Ser
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 LCDR3
<400> 9
Gly Gln Ser Gly Leu Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2 HCDR2
<400> 10
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Gln Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2 HCDR3
<400> 11
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 HCDR1
<400> 12
Ala Tyr Glu Met His
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H6/L2H6 HCDR2
<400> 13
Ala Leu Asp Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H6/L2H6 HCDR3
<400> 14
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala His
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L2H6 LCDR2
<400> 15
Lys Gly Ser Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为T或R
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X可以为G或S
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X3可以为T或S
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X可以为S或Q
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X可以为D或L
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为G或H
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为G或S
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为Y或N
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X可以为N或G
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为V或T
<220>
<221> X
<222> (14)..(14)
<223> X可以为S或Y
<220>
<221> X
<222> (15)..(15)
<223> X可以为空白或L
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X可以为空白或H
<400> 16
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR2通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为D或K
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X可以为V或G
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X可以为N、Y或Q
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X可以为P或G
<400> 17
Xaa Xaa Ser Xaa Arg Xaa Ser
1 5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为S或G
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X可以为S或Q
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X可以为Y或S
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X可以为A或G
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X可以为S或L
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X可以为G或T
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X可以为S或P
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为T或P
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为L或T
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为V或空白
<400> 18
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为D或A
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X可以为A或E
<400> 19
Xaa Tyr Xaa Met His
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为G或A
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X可以为S或D
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X可以为W或P
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X可以为N或K
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X可以为S或T
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为S或Q
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为I或T
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为G或A
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X可以为A或S
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为D或Q
<220>
<221> X
<222> (14)..(14)
<223> X可以为S或K
<220>
<221> X
<222> (15)..(15)
<223> X可以为V或F
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X可以为K或Q
<400> 20
Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR3通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为D或T
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X可以为H或R
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X可以为T或F
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X可以为I或Y
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X可以为G或S
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X可以为V或Y
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X可以为G或A
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为A、Y或H
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为F或空白
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为D或空白
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X可以为I或空白
<400> 21
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A L-FR1
<400> 22
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys
20
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A L-FR2
<400> 23
Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 24
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A L-FR3
<400> 24
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A L-FR4
<400> 25
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A H-FR1
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
20 25 30
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A H-FR2
<400> 27
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A H-FR3
<400> 28
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A H-FR4
<400> 29
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 L-FR1
<400> 30
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 L-FR2
<400> 31
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 32
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 L-FR3
<400> 32
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 L-FR4
<400> 33
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 H-FR1
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr
20 25 30
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 H-FR2
<400> 35
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 H-FR3
<400> 36
Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6/L2H6 H-FR4
<400> 37
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 38
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR1通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为Q或D
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X可以为S或V
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X可以为L或M
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X可以为P或S
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为A或P
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为S或L
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为V或S
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X可以为S或L
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X可以为G或P
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为S或V
<220>
<221> X
<222> (14)..(14)
<223> X可以为P或T
<220>
<221> X
<222> (15)..(15)
<223> X可以为G或L
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X可以为Q或G
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X可以为S或Q
<220>
<221> X
<222> (18)..(18)
<223> X可以为I或P
<220>
<221> X
<222> (19)..(19)
<223> X可以为T或A
<220>
<221> X
<222> (20)..(20)
<223> X可以为I或S
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X可以为S或I
<220>
<221> X
<222> (22)..(22)
<223> X可以为C或S
<220>
<221> X
<222> (23)..(23)
<223> X可以为空白或C
<400> 38
Xaa Xaa Val Xaa Thr Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR2通式
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X可以为H或R
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为K或Q
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为A或S
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X可以为K或R
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为M或L
<400> 39
Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa Pro Xaa Leu Xaa Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 40
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR3通式
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X可以为S或P
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X可以为N或D
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为K或G
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为N或T
<220>
<221> X
<222> (14)..(14)
<223> X可以为T或D
<220>
<221> X
<222> (15)..(15)
<223> X可以为A或F
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X可以为S或T
<220>
<221> X
<222> (18)..(18)
<223> X可以为T或K
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X可以为G或R
<220>
<221> X
<222> (22)..(22)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (23)..(23)
<223> X可以为Q或E
<220>
<221> X
<222> (27)..(27)
<223> X可以为E或V
<220>
<221> X
<222> (28)..(28)
<223> X可以为A或G
<220>
<221> X
<222> (29)..(29)
<223> X可以为D或V
<400> 40
Gly Val Xaa Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Xaa Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Leu Xaa Ile Ser Xaa Xaa Xaa Ala Glu Asp Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L-FR4通式
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X可以为G或S
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为T或E
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为V或I
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为L或K
<400> 41
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR1通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为E或Q
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为G或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为G或E
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X可以为V或K
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为Q或K
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X可以为R或A
<220>
<221> X
<222> (18)..(18)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (19)..(19)
<223> X可以为R或K
<220>
<221> X
<222> (20)..(20)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (23)..(23)
<223> X可以为A或K
<220>
<221> X
<222> (27)..(27)
<223> X可以为F或Y
<220>
<221> X
<222> (28)..(28)
<223> X可以为T或D
<220>
<221> X
<222> (30)..(30)
<223> X可以为D或T
<400> 42
Xaa Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa
1 5 10 15
Ser Xaa Xaa Xaa Ser Cys Xaa Ala Ser Gly Xaa Xaa Phe Xaa
20 25 30
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR2通式
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为K或Q
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为V或M
<220>
<221> X
<222> (14)..(14)
<223> X可以为S或G
<400> 43
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Xaa Gly Leu Glu Trp Xaa Xaa
1 5 10
<210> 44
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR3通式
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X可以为F或V
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X可以为I或L
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X可以为S或T
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X可以为R或A
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为N或K
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为A或S
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为K或I
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X可以为N或S
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X可以为S或T
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为L或A
<220>
<221> X
<222> (15)..(15)
<223> X可以为L或M
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X可以为Q或E
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X可以为M或L
<220>
<221> X
<222> (18)..(18)
<223> X可以为N或S
<220>
<221> X
<222> (19)..(19)
<223> X可以为S或R
<220>
<221> X
<222> (22)..(22)
<223> X可以为A或S
<220>
<221> X
<222> (23)..(23)
<223> X可以为E或D
<220>
<221> X
<222> (26)..(26)
<223> X可以为A或V
<220>
<221> X
<222> (27)..(27)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (31)..(31)
<223> X可以为A或空白
<220>
<221> X
<222> (32)..(32)
<223> X可以为K或空白
<400> 44
Arg Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Leu Arg Xaa Xaa Asp Thr Xaa Xaa Tyr Tyr Cys Xaa Xaa
20 25 30
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H-FR4通式
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X可以为M或L
<400> 45
Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 46
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A VL
<400> 46
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Ser Gly
85 90 95
Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6 VL
<400> 47
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser
85 90 95
Gly Leu Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L2H6 VL
<400> 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser
85 90 95
Gly Leu Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 49
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为Q或D
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X可以为S或V
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X可以为L或M
<220>
<221> X
<222> (7)..(7)
<223> X可以为P或S
<220>
<221> X
<222> (8)..(8)
<223> X可以为A或P
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为S或L
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为V或S
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X可以为S或L
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X可以为G或P
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为S或V
<220>
<221> X
<222> (14)..(14)
<223> X可以为P或T
<220>
<221> X
<222> (15)..(15)
<223> X可以为G或L
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X可以为Q或G
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X可以为S或Q
<220>
<221> X
<222> (18)..(18)
<223> X可以为I或P
<220>
<221> X
<222> (19)..(19)
<223> X可以为T或A
<220>
<221> X
<222> (20)..(20)
<223> X可以为I或S
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X可以为S或I
<220>
<221> X
<222> (22)..(22)
<223> X可以为C或S
<220>
<221> X
<222> (23)..(23)
<223> X可以为空白或C
<220>
<221> X
<222> (24)..(24)
<223> X可以为T或R
<220>
<221> X
<222> (25)..(25)
<223> X可以为G或S
<220>
<221> X
<222> (26)..(26)
<223> X可以为T或S
<220>
<221> X
<222> (27)..(27)
<223> X可以为S或Q
<220>
<221> X
<222> (29)..(29)
<223> X可以为D或L
<220>
<221> X
<222> (31)..(31)
<223> X可以为G或H
<220>
<221> X
<222> (32)..(32)
<223> X可以为G或S
<220>
<221> X
<222> (33)..(33)
<223> X可以为Y或N
<220>
<221> X
<222> (34)..(34)
<223> X可以为N或G
<220>
<221> X
<222> (36)..(36)
<223> X可以为V或T
<220>
<221> X
<222> (37)..(37)
<223> X可以为S或Y
<220>
<221> X
<222> (38)..(38)
<223> X可以为空白或L
<220>
<221> X
<222> (39)..(39)
<223> X可以为空白或H
<220>
<221> X
<222> (44)..(44)
<223> X可以为H或R
<220>
<221> X
<222> (47)..(47)
<223> X可以为K或Q
<220>
<221> X
<222> (48)..(48)
<223> X可以为A或S
<220>
<221> X
<222> (50)..(50)
<223> X可以为K或R
<220>
<221> X
<222> (52)..(52)
<223> X可以为M或L
<220>
<221> X
<222> (55)..(55)
<223> X可以为D或K
<220>
<221> X
<222> (56)..(56)
<223> X可以为V或G
<220>
<221> X
<222> (58)..(58)
<223> X可以为N、Y或Q
<220>
<221> X
<222> (60)..(60)
<223> X可以为P或G
<220>
<221> X
<222> (64)..(64)
<223> X可以为S或P
<220>
<221> X
<222> (65)..(65)
<223> X可以为N或D
<220>
<221> X
<222> (71)..(71)
<223> X可以为K或G
<220>
<221> X
<222> (74)..(74)
<223> X可以为N或T
<220>
<221> X
<222> (75)..(75)
<223> X可以为T或D
<220>
<221> X
<222> (76)..(76)
<223> X可以为A或F
<220>
<221> X
<222> (77)..(77)
<223> X可以为S或T
<220>
<221> X
<222> (79)..(79)
<223> X可以为T或K
<220>
<221> X
<222> (82)..(82)
<223> X可以为G或R
<220>
<221> X
<222> (83)..(83)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (84)..(84)
<223> X可以为Q或E
<220>
<221> X
<222> (88)..(88)
<223> X可以为E或V
<220>
<221> X
<222> (89)..(89)
<223> X可以为A或G
<220>
<221> X
<222> (90)..(90)
<223> X可以为D或V
<220>
<221> X
<222> (94)..(94)
<223> X可以为S或G
<220>
<221> X
<222> (95)..(95)
<223> X可以为S或Q
<220>
<221> X
<222> (96)..(96)
<223> X可以为Y或S
<220>
<221> X
<222> (97)..(97)
<223> X可以为A或G
<220>
<221> X
<222> (98)..(98)
<223> X可以为S或L
<220>
<221> X
<222> (99)..(99)
<223> X可以为G或T
<220>
<221> X
<222> (100)..(100)
<223> X可以为S或P
<220>
<221> X
<222> (101)..(101)
<223> X可以为T或P
<220>
<221> X
<222> (102)..(102)
<223> X可以为L或T
<220>
<221> X
<222> (103)..(103)
<223> X可以为V或空白
<220>
<221> X
<222> (106)..(106)
<223> X可以为G或S
<220>
<221> X
<222> (111)..(111)
<223> X可以为T或E
<220>
<221> X
<222> (112)..(112)
<223> X可以为V或I
<220>
<221> X
<222> (113)..(113)
<223> X可以为L或K
<400> 49
Xaa Xaa Val Xaa Thr Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Val Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa
35 40 45
Pro Xaa Leu Xaa Ile Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Arg Xaa Ser Gly Val Xaa
50 55 60
Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Xaa Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Ile
65 70 75 80
Ser Xaa Xaa Xaa Ala Glu Asp Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Xaa Xaa
100 105 110
Xaa
<210> 50
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A VH
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp His Thr Ile Gly Val Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2 VH
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Gln Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H6/L2H6 VH
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH通式
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> X可以为E或Q
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X可以为G或A
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
<223> X可以为G或E
<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X可以为V或K
<220>
<221> X
<222> (13)..(13)
<223> X可以为Q或K
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X可以为R或A
<220>
<221> X
<222> (18)..(18)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (19)..(19)
<223> X可以为R或K
<220>
<221> X
<222> (20)..(20)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (23)..(23)
<223> X可以为A或K
<220>
<221> X
<222> (27)..(27)
<223> X可以为F或Y
<220>
<221> X
<222> (28)..(28)
<223> X可以为T或D
<220>
<221> X
<222> (30)..(30)
<223> X可以为D或T
<220>
<221> X
<222> (31)..(31)
<223> X可以为D或A
<220>
<221> X
<222> (33)..(33)
<223> X可以为A或E
<220>
<221> X
<222> (43)..(43)
<223> X可以为K或Q
<220>
<221> X
<222> (48)..(48)
<223> X可以为V或M
<220>
<221> X
<222> (49)..(49)
<223> X可以为S或G
<220>
<221> X
<222> (50)..(50)
<223> X可以为G或A
<220>
<221> X
<222> (52)..(52)
<223> X可以为S或D
<220>
<221> X
<222> (53)..(53)
<223> X可以为W或P
<220>
<221> X
<222> (54)..(54)
<223> X可以为N或K
<220>
<221> X
<222> (55)..(55)
<223> X可以为S或T
<220>
<221> X
<222> (57)..(57)
<223> X可以为S或Q
<220>
<221> X
<222> (58)..(58)
<223> X可以为I或T
<220>
<221> X
<222> (59)..(59)
<223> X可以为G或A
<220>
<221> X
<222> (61)..(61)
<223> X可以为A或S
<220>
<221> X
<222> (62)..(62)
<223> X可以为D或Q
<220>
<221> X
<222> (63)..(63)
<223> X可以为S或K
<220>
<221> X
<222> (64)..(64)
<223> X可以为V或F
<220>
<221> X
<222> (65)..(65)
<223> X可以为K或Q
<220>
<221> X
<222> (68)..(68)
<223> X可以为F或V
<220>
<221> X
<222> (70)..(70)
<223> X可以为I或L
<220>
<221> X
<222> (71)..(71)
<223> X可以为S或T
<220>
<221> X
<222> (72)..(72)
<223> X可以为R或A
<220>
<221> X
<222> (74)..(74)
<223> X可以为N或K
<220>
<221> X
<222> (75)..(75)
<223> X可以为A或S
<220>
<221> X
<222> (76)..(76)
<223> X可以为K或I
<220>
<221> X
<222> (77)..(77)
<223> X可以为N或S
<220>
<221> X
<222> (78)..(78)
<223> X可以为S或T
<220>
<221> X
<222> (79)..(79)
<223> X可以为L或A
<220>
<221> X
<222> (81)..(81)
<223> X可以为L或M
<220>
<221> X
<222> (82)..(82)
<223> X可以为Q或E
<220>
<221> X
<222> (83)..(83)
<223> X可以为M或L
<220>
<221> X
<222> (84)..(84)
<223> X可以为N或S
<220>
<221> X
<222> (85)..(85)
<223> X可以为S或R
<220>
<221> X
<222> (88)..(88)
<223> X可以为A或S
<220>
<221> X
<222> (89)..(89)
<223> X可以为E或D
<220>
<221> X
<222> (92)..(92)
<223> X可以为A或V
<220>
<221> X
<222> (93)..(93)
<223> X可以为L或V
<220>
<221> X
<222> (97)..(97)
<223> X可以为A或空白
<220>
<221> X
<222> (98)..(98)
<223> X可以为K或空白
<220>
<221> X
<222> (99)..(99)
<223> X可以为D或T
<220>
<221> X
<222> (100)..(100)
<223> X可以为H或R
<220>
<221> X
<222> (101)..(101)
<223> X可以为T或F
<220>
<221> X
<222> (102)..(102)
<223> X可以为I或Y
<220>
<221> X
<222> (103)..(103)
<223> X可以为G或S
<220>
<221> X
<222> (104)..(104)
<223> X可以为V或Y
<220>
<221> X
<222> (105)..(105)
<223> X可以为G或A
<220>
<221> X
<222> (106)..(106)
<223> X可以为A、Y或H
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X可以为F或空白
<220>
<221> X
<222> (108)..(108)
<223> X可以为D或空白
<220>
<221> X
<222> (109)..(109)
<223> X可以为I或空白
<220>
<221> X
<222> (115)..(115)
<223> X可以为M或L
<400> 53
Xaa Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa
1 5 10 15
Ser Xaa Xaa Xaa Ser Cys Xaa Ala Ser Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Tyr
20 25 30
Xaa Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Xaa Gly Leu Glu Trp Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Gly Arg Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Arg Xaa Xaa Asp Thr Xaa Xaa Tyr Tyr Cys
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A/L1H2/L1H6/L2H6 轻链恒定区
<400> 54
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 55
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A/L1H2/L1H6/L2H6 重链恒定区
<400> 55
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 56
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A 轻链
<400> 56
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Ser Gly
85 90 95
Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 57
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2/L1H6 轻链
<400> 57
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser
85 90 95
Gly Leu Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 58
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L2H6 轻链
<400> 58
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser
85 90 95
Gly Leu Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 59
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 204A 重链
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp His Thr Ile Gly Val Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 60
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H2 重链
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Gln Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 61
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> L1H6/L2H6 重链
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 62
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码204A VL
<400> 62
cagtctgtgc tgacgcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatacg cgagcggcag cacactggta 300
ttcggcggag ggaccaagct caccgtccta 330
<210> 63
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码L1H2/L1H6 VL
<400> 63
gacgtggtga tgacccagtc ccctctgtct ttacccgtta cactgggcca gcccgcttcc 60
atcagctgca gaagcagcca gtctttagtg cacagcaacg gctacaccta tttacactgg 120
taccagcaga gacccggcca gagccccaga ctgctgatct acaaggtgtc ataccgtgga 180
tccggcgtgc ccgataggtt tagcggcagc ggtagcggca ccgatttcac tttaaagatc 240
tctcgtgtcg aggccgagga tgtgggcgtt tactactgcg gccagagcgg cctcaccccc 300
cctaccttcg gctccggcac caagctggag atcaaa 336
<210> 64
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码L2H6 VL
<400> 64
gacgtggtga tgacccagtc ccctctgtct ttacccgtta cactgggcca gcccgcttcc 60
atcagctgca gaagcagcca gtctttagtg cacagcaacg gctacaccta tttacactgg 120
taccagcaga gacccggcca gagccccaga ctgctgatct acaaggggtc ccagcgtccc 180
tccggcgtgc ccgataggtt tagcggcagc ggtagcggca ccgatttcac tttaaagatc 240
tctcgtgtcg aggccgagga tgtgggcgtt tactactgcg gccagagcgg cctcaccccc 300
cctaccttcg gctccggcac caagctggag atcaaa 336
<210> 65
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码204A VH
<400> 65
gaggtgcagc tggtacagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatcat 300
acgattgggg ttggggcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac tgtctcttca 360
<210> 66
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码L1H2 VH
<400> 66
caagtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60
agctgtaagg ccagcggcta tgacttcacc gcctacgaga tgcactgggt gagacaagct 120
cccggtcaag gtctcgagtg gatgggcgct ttagatccca agaccgggca gaccgcctac 180
tcccagaagt tccaaggtcg tgtgacttta accgccgaca agagcatctc caccgcctac 240
atggagctgt ctcgtctgag gagcgacgat accgtggtgt actattgcac tcgtttttac 300
tcctacgcct actggggcca aggtacactg gtgaccgtga gctcc 345
<210> 67
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码L1H6/L2H6 VH
<400> 67
caagtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60
agctgtaagg ccagcggcta tgacttcacc gcctacgaga tgcactgggt gagacaagct 120
cccggtcaag gtctcgagtg gatgggcgct ttagatccca agtccggttc taccgcctac 180
tcccagaagt tccaaggtcg tgtgacttta accgccgaca agagcatctc caccgcctac 240
atggagctgt ctcgtctgag gagcgacgat accgtggtgt actattgcac tcgtttctac 300
tcatacgccc actggggcca aggtacactg gtgaccgtga gctcc 345
<210> 68
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码204A 轻链
<400> 68
cagtctgtgc tgacgcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatacg cgagcggcag cacactggta 300
ttcggcggag ggaccaagct caccgtccta cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctacc ccagagaagc caaagtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagagcgga 480
aacagccagg aaagcgtgac agagcaggat tccaaggatt ccacatacag cctgagcagc 540
acactgacac tgtccaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgaca 600
caccagggac tgtcctcccc tgtgacaaag agcttcaaca gaggagaatg c 651
<210> 69
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码L1H2/L1H6 轻链
<400> 69
gacgtggtga tgacccagtc ccctctgtct ttacccgtta cactgggcca gcccgcttcc 60
atcagctgca gaagcagcca gtctttagtg cacagcaacg gctacaccta tttacactgg 120
taccagcaga gacccggcca gagccccaga ctgctgatct acaaggtgtc ataccgtgga 180
tccggcgtgc ccgataggtt tagcggcagc ggtagcggca ccgatttcac tttaaagatc 240
tctcgtgtcg aggccgagga tgtgggcgtt tactactgcg gccagagcgg cctcaccccc 300
cctaccttcg gctccggcac caagctggag atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctaccccag agaagccaaa gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
agcggaaaca gccaggaaag cgtgacagag caggattcca aggattccac atacagcctg 540
agcagcacac tgacactgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600
gtgacacacc agggactgtc ctcccctgtg acaaagagct tcaacagagg agaatgc 657
<210> 70
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码L2H6 轻链
<400> 70
gacgtggtga tgacccagtc ccctctgtct ttacccgtta cactgggcca gcccgcttcc 60
atcagctgca gaagcagcca gtctttagtg cacagcaacg gctacaccta tttacactgg 120
taccagcaga gacccggcca gagccccaga ctgctgatct acaaggggtc ccagcgtccc 180
tccggcgtgc ccgataggtt tagcggcagc ggtagcggca ccgatttcac tttaaagatc 240
tctcgtgtcg aggccgagga tgtgggcgtt tactactgcg gccagagcgg cctcaccccc 300
cctaccttcg gctccggcac caagctggag atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctaccccag agaagccaaa gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
agcggaaaca gccaggaaag cgtgacagag caggattcca aggattccac atacagcctg 540
agcagcacac tgacactgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600
gtgacacacc agggactgtc ctcccctgtg acaaagagct tcaacagagg agaatgc 657
<210> 71
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码204A 重链
<400> 71
gaggtgcagc tggtacagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatcat 300
acgattgggg ttggggcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac tgtctcttca 360
gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 72
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码L1H2 重链
<400> 72
caagtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60
agctgtaagg ccagcggcta tgacttcacc gcctacgaga tgcactgggt gagacaagct 120
cccggtcaag gtctcgagtg gatgggcgct ttagatccca agaccgggca gaccgcctac 180
tcccagaagt tccaaggtcg tgtgacttta accgccgaca agagcatctc caccgcctac 240
atggagctgt ctcgtctgag gagcgacgat accgtggtgt actattgcac tcgtttttac 300
tcctacgcct actggggcca aggtacactg gtgaccgtga gctccgcgtc gaccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa cctgtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtaaa 1335
<210> 73
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码L1H6/L2H6 重链
<400> 73
caagtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60
agctgtaagg ccagcggcta tgacttcacc gcctacgaga tgcactgggt gagacaagct 120
cccggtcaag gtctcgagtg gatgggcgct ttagatccca agtccggttc taccgcctac 180
tcccagaagt tccaaggtcg tgtgacttta accgccgaca agagcatctc caccgcctac 240
atggagctgt ctcgtctgag gagcgacgat accgtggtgt actattgcac tcgtttctac 300
tcatacgccc actggggcca aggtacactg gtgaccgtga gctccgcgtc gaccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa cctgtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtaaa 1335
<210> 74
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人GPC3蛋白
<400> 74
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp
20 25 30
Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly
35 40 45
Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val
50 55 60
Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys
65 70 75 80
Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala
85 90 95
Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln
100 105 110
Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala
115 120 125
Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe
130 135 140
Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro
165 170 175
Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu
180 185 190
Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe
195 200 205
Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln
210 215 220
Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile
225 230 235 240
Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu
245 250 255
Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys
260 265 270
Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly
275 280 285
Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu
290 295 300
Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu
305 310 315 320
Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys
325 330 335
Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Glu Thr Glu Lys Lys Ile Trp His
340 345 350
Phe Lys Tyr Pro Ile Phe Phe Leu Cys Ile Gly Leu Asp Leu Gln Ile
355 360 365
Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr
370 375 380
Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His
385 390 395 400
Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln
405 410 415
Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile
420 425 430
Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly
435 440 445
Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met
450 455 460
Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro
465 470 475 480
Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu
485 490 495
Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp
500 505 510
Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys
515 520 525
Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg
530 535 540
Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly
545 550 555 560
Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His
565 570 575
Asn Leu Gly Asn Val His Ser His His His His His His
580 585

Claims (10)

1.分离的抗原结合蛋白，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的VH中的至少一个CDR；且其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的VL中的至少一个CDR。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以6×10-9M或更低的KD与GPC3蛋白相结合，其中所述KD值通过Octet测定；
2)在FACS测定中，能够特异性结合HepG2细胞和/或Huh7细胞表面的GPC3蛋白；
3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
3.分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
4.载体，其包含根据权利要求3所述的核酸分子。
5.细胞，其包含根据权利要求3所述的核酸分子或根据权利要求4所述的载体。
6.制备权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养根据权利要求5所述的细胞。
7.药物组合物，其包含权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体和/或权利要求5所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
8.权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的细胞和/或权利要求7所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
9.预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的细胞和/或权利要求7所述的药物组合物。
10.检测样品中GPC3的方法，所述方法包括施用权利要求1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
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