CN107108734A

CN107108734A - 单克隆抗gpc‑1抗体和其用途

Info

Publication number: CN107108734A
Application number: CN201480083863.8A
Authority: CN
Inventors: D·坎贝尔; I·胡斯蒂尼亚诺·富恩马约尔; A·诺康; J·苏恩; Q·张; B·沃尔什; S·维斯米勒
Original assignee: Minomic International Ltd
Current assignee: Minomic International Ltd
Priority date: 2014-10-23
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2034-10-23
Also published as: KR20170085051A; US10577418B2; CN107108734B; AU2014409558A1; AU2014409558B2; JP2017531442A; EP3209686A1; US20180072803A1; WO2016061608A8; SG11201703006QA; JP6749901B2; EP3209686A4; DK3209686T3; ES2778100T3; WO2016061608A1; AU2014409558A8; CA2964179A1; EP3209686B1; CA2964179C; KR102249981B1

Abstract

本申请涉及基于如下发现的发明：BLCA‑38抗体实际上是包括两种有区别的单克隆抗体的抗体群体。权利要求书限定了分离的抗体群体，其包括由特定的重链和轻链可变区限定的第一抗体和/或其抗原结合片段，并且其中抗体群体不包含由特定的轻链可变区限定的第二抗体。权利要求书还限定了杂交瘤细胞、能够产生这样的抗体群体的培养物、包括这样的抗体群体的组合物、编码这样的抗体的核酸分子、载体、其宿主细胞和生产本发明的抗体群体的方法。

Description

单克隆抗GPC-1抗体和其用途

技术领域

本发明一般涉及免疫学和医学领域。更具体地，本发明涉及单克隆抗体和其用途。

背景技术

在全世界，癌症是死亡的重要原因，其中肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌和前列腺癌引起大多数的死亡。前列腺癌是男性中最通常发生的肿瘤并且在死亡率方面仅次于肺癌。如果前列腺癌在早期被诊断，则利用外科手术和/或放射疗法进行治疗在许多患者中是成功的。但是，许多患有重病的患者和所有前列腺癌患者的相当大比例在局部疗法之后最终发展为转移性疾病。

抗体(Abs)在靶向疗法和诊断的领域中是主要工具，这是由于在与其同族抗原相互作用之后它们的结合特异性/亲和性以及潜在的效应器性能。越来越多的Abs已经被批准用于医疗用途并且许多正处于临床评价中。抗体对于鉴定个体中疾病比如前列腺癌的诱因和/或从而诊断这样的疾病可以是有效的诊断工具(diagnostics)。另外，一些抗体的治疗用途已经被显示为降低肿瘤大小并且延长受折磨患者的存活。

Walker等人的美国专利号5,622,836公开了命名为BLCA-38(BLCA-“膀胱癌”)的抗体。该文件教导了BLCA-38是对于由膀胱癌细胞表达的未知抗原特异的单克隆抗体。BLCA-38也被教导为对人卵巢和结肠癌细胞系，以及一些黑素瘤细胞系显示特异性，但不对淋巴(T淋巴或B淋巴)和白血病细胞系显示特异性。

随后，Russell等人(2004)(Russell等,“Cytotoxic properties ofimmunoconjugates containing melittin-like peptide 101against prostate cancer:in vitro&in vivo studies”.Cancer Immunol Immunother 2004:53(5):411-421)公布了一项研究，在该研究中BLCA-38被用于靶向细胞毒性肽至前列腺癌细胞。作者指出BLCA-38是针对人膀胱癌细胞系UCRU-BL-17CL提出的鼠科单克隆抗体。

Russell等人在2004年的进一步公布(Russell等,“Immunohistochemicalcharacterization of the monoclonal antibody,BLCA38,for the detection ofprostate cancer”.Cancer Immunol Immunother 2004:53:995-1004)也教导了BLCA-38是针对人膀胱细胞系提出的鼠科单克隆抗体，其能够结合至膀胱癌细胞、前列腺癌细胞和女阴表皮样细胞，但是不结合至乳腺癌细胞。文章指出BLCA-38对于难以表征或鉴定的大小为大约30kDa的抗原是特异性的。

Carter等人(2004)(Carter等,“Biodistributions of intact monoclonalantibodies and fragments of BLCA38,a new prostate cancer directed antibody”.Cancer Immunol Immunother 2004:53:533-542)分析了使用BLCA-38将治疗剂靶向至前列腺癌细胞的定时(timing)和剂量，还指出其是在细胞表面上和细胞质中表达的大约30kDa的抗原的鼠科单克隆抗体。作者陈述，抗原的性质是难以捉摸的，并且指出其在膀胱和前列腺癌细胞上表达。

Khatri等人在2010年公布的文章(Khatri等,“Promise of BLCA38as aTargeting Antibody for Tissue-Specific Gene Delivery to Prostate Cancer”.Austral-Asian J.Cancer 2010:9(3):195-203)重申了BLCA-38是对前列腺癌细胞特异的鼠科单克隆抗体。作者揭示，虽然BLCA-38在结合至其抗原之后不被内化，但是与病毒的缀合促进了抗体的内化，导致报告基因的表达增加。

尽管抗体作为诊断和治疗剂提供了希望，但是对于诊断和/或治疗各种形式的癌症包括前列腺癌的更有效的药剂的需要继续存在。

发明内容

本发明人已经出人意料地鉴定，在前述现有技术中提及和使用的BLCA-38抗体不是如所示的离散型(discrete)单克隆抗体，而是混合群体(population)中两种不同的单克隆抗体的组合。本发明人已经确定，用于生成BLCA-38抗体的杂交瘤——在美国组织型培养物保藏所(American Tissue Type Culture Collection)中在登录号HB11785下保藏的代表性样本——是杂交瘤细胞的混合群体，其产生至少两种离散型抗体种类。这些抗体种类中仅一种能够结合至在一些形式的癌细胞上存在的相关靶抗原，而第二种类不能。

该意料之外的确定——在现有技术中被提及的BLCA-38代表混合的杂交瘤/抗体群体——促进了能够产生单一群体的单克隆抗体的单克隆杂交瘤的生成，该单克隆抗体对于各种形式的癌细胞上的靶抗原具有结合特异性。除了规避无效抗体的不必要的产生和应用，在本说明书的实施例中提供的数据表明，当应用相等量的抗体时，与现有技术的混合群体相比，根据本发明的单克隆杂交瘤/单克隆抗体的使用可以允许生成更强的信号。

在第一实施方式中，本发明提供了包括重链可变区和轻链可变区的分离的抗体或其抗原结合片段，其中：(a)重链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:3的50-54位限定的氨基酸序列或由其组成；互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQ ID NO:3的69-85位限定的氨基酸序列或由其组成；互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:3的118-126位限定的氨基酸序列或由其组成；和(b)轻链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:4的44-54位限定的氨基酸序列或由其组成；互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQID NO:4的70-76位限定的氨基酸序列或由其组成；互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ IDNO:4的109-117位限定的氨基酸序列或由其组成。

分离的抗体或其抗原结合片段可以进一步包括：(a)由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个重链可变区FR(构架区)：SEQ ID NO:3的残基20-49、SEQ IDNO:3的残基55-68、SEQ ID NO:3的残基86-117和/或SEQ ID NO:3的残基127-137；和/或(b)由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个轻链可变区FR(构架区)：SEQ IDNO:4的残基21-43、SEQ ID NO:4的残基55-69、SEQ ID NO:4的残基77-108和/或SEQ ID NO:4的残基118-127。

分离的抗体或其抗原结合片段可以进一步包括下列的任何一个或多个：(a)由SEQID NO:3的138-461位限定的重链恒定结构域序列；(b)由SEQ ID NO:4的128-234位限定的轻链恒定结构域序列；(c)铰链区。

分离的抗体或其抗原结合片段对磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位可以具有结合特异性。

抗体可以是IgG同种型抗体。抗体可以是IgG1同种型抗体。抗体或抗原结合片段可以包括可检测的标记。

可检测的标记可以是荧光标记、放射性标记、生物素或抗生物素蛋白中的任何一种或多种。

抗体可以是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多聚体抗体(multimericantibody)和/或合成抗体中的任何一种或多种。

抗体可以是双特异性抗体、avibody、双抗体、三抗体(tribody)、四抗体(tetrabody)、纳米抗体、单结构域抗体、VHH结构域、人抗体、完全人源化抗体、部分人源化抗体、anticalin、adnectin或affibody。

抗体可以是包括重链可变区和轻链可变区的嵌合抗体，其中：(a)重链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:9的50-54位限定的氨基酸序列或由其组成；互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQ ID NO:9的69-85位限定的氨基酸序列或由其组成；互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:9的118-126位限定的氨基酸序列或由其组成；和(b)轻链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:10的44-54位限定的氨基酸序列或由其组成；互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQ ID NO:10的70-76位限定的氨基酸序列或由其组成；互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:10的109-117位限定的氨基酸序列或由其组成。

抗体可以是包括重链可变区和轻链可变区的嵌合抗体，其中：(a)重链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与由SEQ ID NO:9的50-54位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；互补决定区2(CDR2)，其包括与由SEQ ID NO:9的69-85位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；互补决定区3(CDR3)，其包括与由SEQ ID NO:9的118-126位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；和(b)轻链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与由SEQ ID NO:10的44-54位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；互补决定区2(CDR2)，其包括与由SEQ IDNO:10的70-76位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；互补决定区3(CDR3)，其包括与由SEQ ID NO:10的109-117位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成。

抗体可以是嵌合抗体，其包括：(a)重链，其包括在SEQ ID NO:9的残基20-467中限定的氨基酸序列或由其组成；和(b)轻链，其包括在SEQ ID NO:10的残基21-234中限定的氨基酸序列或由其组成。

抗体可以是嵌合抗体，其包括：(a)重链，其包括与在SEQ ID NO:9的残基20-467中限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；和(b)轻链，其包括与在SEQ ID NO:10的残基21-234中限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成。

嵌合抗体可以包括可检测的标记。可检测的标记可以是荧光标记、放射性标记、生物素或抗生物素蛋白中的任何一种或多种。

抗原结合片段可以是下列的任何一种或多种：单链可变片段(scFv)、可变结构域(Fv)片段、片段抗原结合(Fab)片段、F(ab)2片段、肽、或包含表位结合区的蛋白水解片段。

抗体可以包括由SEQ ID NO:3的20-461位限定的重链序列和由SEQ ID NO:4的21-234位限定的轻链序列或由二者组成。

在第二实施方式中，本发明提供了在第一实施方式中限定的抗体的分离的抗原结合变体或衍生物，其中变体或衍生物和在第一实施方式中限定的抗体能够特异性地结合至相同抗原。

变体或衍生物的任何一个或多个重链CDR1、CDR2和/或CDR3氨基酸序列，和/或变体或衍生物的任何一个或多个轻链CDR1、CDR2和/或CDR3氨基酸序列与在第一实施方式中限定的抗体中存在的氨基酸的在其它方面对应的CDR序列相比，可以包括一个、两个、三个、四个或五个氨基酸缺失、插入和/或置换。

分离的变体或衍生物可以包括重链可变区和轻链可变区，其中：(a)重链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与由SEQ ID NO:3的50-54位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；互补决定区2(CDR2)，其包括与由SEQ ID NO:3的69-85位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；互补决定区3(CDR3)，其包括与由SEQ ID NO:3的118-126位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；和(b)轻链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与由SEQ ID NO:4的44-54位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；互补决定区2(CDR2)，其包括与由SEQ IDNO:4的70-76位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成；互补决定区3(CDR3)，其包括与由SEQ ID NO:4的109-117位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性的氨基酸序列或由其组成。

变体或衍生物可以包括：(a)至少一个重链可变区FR(构架区)，其选自包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的重链可变区FR：其与SEQ ID NO:3的残基20-49具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性，与SEQ ID NO:3的残基55-68具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性，与SEQ ID NO:3的残基86-117具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性，与SEQ ID NO:3的残基127-137具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性；和/或(b)至少一个轻链可变区FR(构架区)，其选自包括如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的轻链可变区FR：其与SEQ IDNO:4的残基21-43具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性，与SEQ IDNO:4的残基55-69具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性，与SEQ IDNO:4的残基77-108具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性，和/或与SEQID NO:4的残基118-127具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同源性。

变体或衍生物可以包括下列的任何一种或多种：(a)重链恒定结构域序列，其包括与SEQ ID NO:3的138-461位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源性的氨基酸序列或由其组成；(b)轻链恒定结构域序列，其包括与SEQ ID NO:4的128-234位限定的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同源性的氨基酸序列或由其组成；(c)铰链区。

变体或衍生物对磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位可以具有结合特异性。

变体或衍生物可以是同种型抗体。分离的抗体变体或衍生物可以是IgG1同种型抗体。

变体或衍生物可以包括可检测的标记。

变体或衍生物可以是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多聚体抗体和/或合成抗体中的任何一种或多种。

在第三实施方式中，本发明提供了杂交瘤细胞，其能够产生在第一实施方式中限定的抗体或其抗原结合片段，或在第二实施方式中限定的抗原结合变体或衍生物。

杂交瘤细胞可以是在2014年8月22日在Cellbank Australia保藏并分配登录号CBA20140026的那些。

在第四实施方式中，本发明提供了包括单一种类的杂交瘤细胞的细胞培养物(cell culture)，该杂交瘤细胞能够产生在第一实施方式中限定的单一种类的抗体或其抗原结合片段，或在第二实施方式中限定的单一种类的抗原结合变体或衍生物。

杂交瘤细胞可以在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下保藏。

在第五实施方式中，本发明提供了包括多个种类的杂交瘤细胞的细胞培养物，其中：(a)该细胞培养物包括在第三实施方式中限定的杂交瘤细胞；和(b)该细胞培养物不包括产生包括下述轻链可变区的抗体的杂交瘤细胞，该轻链可变区包括下列的任何一种或多种：

互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:6的48-58位限定的氨基酸或由其组成；

互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQ ID NO:6的74-80位限定的氨基酸或由其组成；

互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:6的113-121位限定的氨基酸或由其组成。

细胞培养物可以不包括产生下述抗体的杂交瘤细胞，该抗体包括由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个轻链可变区FR(构架区)：SEQ ID NO:6的残基25-47、SEQ ID NO:6的残基59-73、SEQ ID NO:6的残基81-112、SEQ ID NO:6的残基122-131。

细胞培养物中的多个种类的杂交瘤细胞可以每个能够产生在第一实施方式中限定的单一种类的抗体或其抗原结合片段，或在第二实施方式中限定的单一种类的抗原结合变体或衍生物。

在第六实施方式中，本发明提供了如此组合物：其包括在第一实施方式中限定的单一种类的抗体或其抗原结合片段，或在第二实施方式中限定的单一种类的抗原结合变体或衍生物。

在第七实施方式中，本发明提供了包括不同抗体种类或其抗原结合片段的混合物的组合物，其中：(a)该组合物包括在第一实施方式中限定的单一种类的抗体或其抗原结合片段，或在第二实施方式中限定的单一种类的抗原结合变体或衍生物；和(b)该组合物不包括含有下述轻链可变区的抗体，该轻链可变区包括下列的任何一种或多种：

不同抗体种类或其抗原结合片段的混合物可以每种对磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位具有结合特异性。

在第八实施方式中，本发明提供了核酸分子，其编码在第一实施方式中限定的抗体或其抗原结合片段，或在第二实施方式中限定的抗原结合变体或衍生物。

核酸分子可以包括在SEQ ID NO:1中限定的序列或由其组成。

核酸分子可以包括在SEQ ID NO:2中限定的序列或由其组成。

抗体或其抗原结合片段，或抗原结合变体或衍生物可以每种对磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位具有结合特异性。

在第九实施方式中，本发明提供了包括在第八实施方式中限定的核酸分子的载体。

在第十实施方式中，本发明提供了包括在第九实施方式中限定的载体的宿主细胞。

在第十一实施方式中，本发明提供了用于产生在第一实施方式中限定的抗体或其抗原结合片段，或在第二实施方式中限定的抗原结合变体或衍生物的方法(process)，其中该方法包括在培养基中在适合的条件下培养在第三实施方式中限定的交瘤细胞，或者在第十实施方式中限定的宿主细胞，从而产生抗体或其抗原结合片段，或抗原结合变体或衍生物。

该方法可以进一步包括从培养基中分离抗体或其抗原结合片段，或抗原结合变体或衍生物。

在第十二实施方式中，本发明提供了用于产生在第一实施方式中限定的抗体或其抗原结合片段，或在第二实施方式中限定的抗原结合变体或衍生物的方法，其中该方法包括在适合的条件下培养在第四或第五实施方式中限定的细胞培养物，从而产生抗体或其抗原结合片段，或抗原结合变体或衍生物。

在第十三实施方式中，本发明提供了从在第十一或第十二实施方式中限定的方法获得或可获得的抗体或其抗原结合片段，或抗原结合变体或衍生物。

抗体或其抗原结合片段，或抗原结合变体或衍生物可以包括可检测的标记。

在第十四实施方式中，本发明提供了用于从混合物的杂交瘤群体中获得在第三实施方式中限定的杂交瘤细胞的方法，该方法包括从混合的杂交瘤群体中分离至少一部分杂交瘤细胞。

分离可以包括克隆混合的杂交瘤群体的个别杂交瘤细胞，并确定克隆的后代能够产生在第一实施方式中限定的抗体或其抗原结合片段，或在第二实施方式中限定的抗原结合变体或衍生物。

混合的在杂交瘤群体可以在美国组织型培养物保藏所(ATCC)中在登录号HB11785下保藏。

在第十五实施方式中，本发明提供了包括根据本发明的如下任何一种或多种的试剂盒：抗体或其抗原结合片段、抗原结合变体或衍生物、嵌合抗体或杂交瘤细胞。

试剂盒可以是分离型(fragmented)试剂盒或组合型试剂盒。该试剂盒可以进一步包括选自如下的一种或多种另外的成分：用于细胞培养的试剂、参考样本、缓冲液、标记和使用试剂盒的成分执行分析的书面指示。

在第十六实施方式中，本发明提供了包括根据本发明的如下任何一种或多种的组合物：抗体或其抗原结合片段、抗原结合变体或衍生物、嵌合抗体或杂交瘤细胞。

组合物可以是药物组合物。该药物组合物可以进一步包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或运载体。

在第十七实施方式中，本发明提供了用于检测和/或定量对象中GPC-1的表达的方法，该方法包括(a)从对象中获得细胞、组织样本和/或体液样本；(b)将细胞、组织样本和/或体液样本与根据本发明的抗体、抗体变体、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物或嵌合抗体接触，和(c)确定和/或定量所述抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物或嵌合抗体与对象的细胞、组织样本和/或体液样本的结合。

在从对象获得的细胞、组织和/或体液样本中检测的GPC-1表达的水平可以与对照细胞样本或样本群体参考的GPC-1表达水平进行比较。在一些实施方式中，与对照或参考相比对象中增加的GPC-1表达的确定可以是疾病的诊断，或者在对象中发展疾病的增加的可能性。该疾病可以是前列腺癌。

用于检测的GPC-1可以存在于细胞的表面上和/或在内部表达。体液可以是尿、血液或其成分(例如，血清或血浆)。细胞或组织样本可以是前列腺细胞或前列腺组织。

抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物或嵌合抗体可以通过根据本发明的杂交瘤细胞产生。杂交瘤细胞可以在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下保藏。

在第十八实施方式中，本发明提供了包括单一种类的能够特异性地结合至GPC-1的单克隆抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物或嵌合抗体的溶液，该溶液可以被应用至可以潜在地包含GPC-1的细胞、组织样本或体液样本。单一种类可以通过在CellbankAustralia中在登录号CBA20140026下保藏的杂交瘤细胞产生。

在第十九实施方式中，本发明提供了包括多个种类的抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物或嵌合抗体的溶液，该溶液可以被应用至可以潜在地包含GPC-1的细胞、组织样本或体液样本，其中溶液中多个种类中的至少一个种类能够特异性地结合至GPC-1。能够特异性地结合至GPC-1的种类可以通过在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下保藏的杂交瘤细胞产生。包括多个种类的溶液可以不包括含有下述轻链可变区的抗体，该轻链可变区包括下列的任何一种或多种：

本发明还涉及如下实施方式：

实施方式1：分离的抗体群体，其包括：

第一抗体和/或其抗原结合片段，其中该第一抗体包括：

(a)重链可变区，其包括：

互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:3的50-54位限定的氨基酸序列或由其组成；

互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQ ID NO:3的69-85位限定的氨基酸序列或由其组成；

互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:3的118-126位限定的氨基酸序列或由其组成；和

(b)轻链可变区，其包括：

互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:4的44-54位限定的氨基酸序列或由其组成；

互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQ ID NO:4的70-76位限定的氨基酸序列或由其组成；

互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:4的109-117位限定的氨基酸序列或由其组成；

并且其中抗体群体不包括包含下述轻链可变区的第二抗体，该轻链可变区包括：

互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:6的48-58位限定的氨基酸序列或由其组成；

互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQ ID NO:6的74-80位限定的氨基酸序列或由其组成；

互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:6的113-121位限定的氨基酸序列或由其组成。

实施方式2：根据实施方式1的抗体群体，其中该抗体群体不包含所述第二抗体的抗原结合片段。

实施方式3：根据实施方式1或实施方式2的抗体群体，其中第一抗体和/或其抗原结合片段对磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位具有结合特异性。

实施方式4：根据实施方式1-3中任一个的抗体群体，其中第一抗体和/或其抗原结合片段是IgG1同种型。

实施方式5：根据实施方式1-4中任一个的抗体群体，其中第一抗体和/或其抗原结合片段是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多聚体抗体和/或合成抗体中的任何一种或多种。

实施方式6：根据实施方式1-5中任一个的抗体群体，其中抗原结合片段是下列的任何一种或多种：单链可变片段(scFv)、可变结构域(Fv)片段、片段抗原结合(Fab)片段、F(ab)2片段、肽、或包含表位结合区的蛋白水解片段。

实施方式7：根据实施方式1-6中任一个的抗体群体，其中第一抗体和/或其抗原结合片段进一步包括：

(a)由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个重链可变区FR(构架区)：SEQ ID NO:3的残基20-49、SEQ ID NO:3的残基55-68、SEQ ID NO:3的残基86-117、SEQID NO:3的残基127-137；和/或

(b)由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个轻链可变区FR(构架区)：SEQ ID NO:4的残基21-43、SEQ ID NO:4的残基55-69、SEQ ID NO:4的残基77-108、SEQID NO:4的残基118-127。

实施方式8：根据实施方式1-7中任一个的抗体群体，其中第一抗体和/或其抗原结合片段进一步包括下列的一个或多个：

(a)由SEQ ID NO:3的138-461位限定的重链恒定结构域序列；

(b)由SEQ ID NO:4的128-234位限定的轻链恒定结构域序列；

(c)铰链区。

实施方式9：根据实施方式1-8中任一个的抗体群体，其中第一抗体包括由SEQ IDNO:3的20-461位限定的重链序列和由SEQ ID NO:4的21-234位限定的轻链序列或由其二者组成。

实施方式10：能够产生根据实施方式1-9的任一个的抗体群体的杂交瘤细胞。

实施方式11：一种细胞培养物，其包括单一种类的能够产生根据实施方式1-9的任一个的抗体群体的杂交瘤细胞，其中该抗体群体包含仅一个种类的抗体和/或其抗原结合片段。

实施方式12：根据实施方式9的杂交瘤细胞，或者根据实施方式10的细胞培养物，其中杂交瘤细胞在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下保藏。

实施方式13：一种细胞培养物，其包括多个种类的杂交瘤细胞，其中：

(a)该细胞培养物包括根据实施方式10或实施方式12的杂交瘤细胞；和

(b)该细胞培养物不包括产生包括下述轻链可变区的抗体的杂交瘤细胞，该轻链可变区包括下列的任何一种或多种：

实施方式14：根据实施方式13的细胞培养物，其中该细胞培养物不包括产生下述抗体的杂交瘤细胞，该抗体包括由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个轻链可变区FR(构架区)：SEQ ID NO:6的残基25-47、SEQ ID NO:6的残基59-73、SEQ ID NO:6的残基81-112、SEQ ID NO:6的残基122-131。

实施方式15：一种组合物，其包括根据实施方式1-9的任一个的抗体群体，其中该抗体群体仅包含一个种类的抗体和/或其抗原结合片段。

实施方式16：一种组合物，其包括根据实施方式1-9的任一个的抗体群体，其中该抗体群体包含多个种类的抗体和/或其抗原结合片段。

实施方式17：根据实施方式16的组合物，其中多个种类的抗体和/或其抗原结合片段每个对磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位具有结合特异性。

实施方式18：一种核酸分子，其编码根据实施方式1-9的任一个的第一抗体或其抗原结合片段的至少一个。

实施方式19：根据实施方式18的核酸分子，其中该核酸分子包括在SEQ ID NO:1中限定的序列或由其组成。

实施方式20：根据实施方式18或实施方式19的核酸分子，其中该核酸分子包括在SEQ ID NO:2中限定的序列或由其组成。

实施方式21：一种载体，其包括根据实施方式18-20的任一个的核酸分子。

实施方式22：一种宿主细胞，其包括根据实施方式21的载体。

实施方式23：一种用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，其中该方法包括在培养基中在适合的条件下培养根据实施方式10或实施方式12的交瘤细胞，或者根据实施方式22的宿主细胞，从而产生抗体或其抗原结合片段。

实施方式24：一种用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，其中该方法包括在适合的条件下培养根据实施方式11-14的任一个的细胞培养物，从而产生抗体或其抗原结合片段。

实施方式25：根据实施方式23或实施方式24的方法，进一步包括从培养物中分离抗体或其抗原结合片段。

实施方式26：从根据实施方式23-35的任一个的方法获得或可获得的抗体或其抗原结合片段。

实施方式27：从混合的杂交瘤群体中获得根据实施方式10或实施方式12的杂交瘤细胞的方法，该方法包括从混合的杂交瘤群体中分离杂交瘤细胞的至少一部分。

实施方式28：根据实施方式27的方法，其中分离包括克隆混合的杂交瘤群体的个别杂交瘤细胞，并确定克隆的后代能够产生根据实施方式1-9的任一个的抗体群体。

实施方式29：根据实施方式27或实施方式28的方法，其中混合的杂交瘤群体在美国组织型培养物保藏所(ATCC)中在登录号HB11785下保藏。

实施方式30：根据实施方式5的抗体群体，其中第一抗体和/或其抗原结合片段是嵌合的。

实施方式31：根据实施方式5或实施方式30的抗体群体，其中第一抗体和/或其抗原结合片段是嵌合抗体，其包括：

(a)重链恒定区，其包括在SEQ ID NO:9的残基138-467中限定的氨基酸序列或由其组成；和

(b)轻链恒定区，其包括在SEQ ID NO:10的残基128-234中限定的氨基酸序列或由其组成。

实施方式32：根据实施方式1-9的任一个的抗体群体，其中第一抗体和/或其片段包括可检测的标记。

实施方式33：根据实施方式32的抗体群体，其中可检测的标记是荧光标记、放射性标记、生物素或抗生物素蛋白中的任何一种或多种。

附图说明

现在将参照附图仅通过实例的方式描述本发明的优选实施方式，其中：

图1显示了使用来自不同来源的MIL-38抗体对来自DU-145、C3和CA-HPV-10细胞系的提取物的蛋白质印迹分析的结果。三角形(arrowhead)表示不同抗体制剂与MIL-38抗原的等价反应性。箭头表示三个制品(prep)的每个中重链和轻链的双带。缩写词：37A＝内部MIL-38抗体制剂；“原始的”(1-O)＝来自ATCC杂交瘤细胞(HB11785)的MIL-38抗体制剂；40A＝来自内部杂交瘤细胞的MIL-38抗体制剂； Ruby Protein Gel Stain。泳道：1(MW标记物)；2(DU145 MPEK 16/7/12)；3(C3 MPEK 20/4/12)；4(CA-HPV-10 MPEK28/3/12)；5(-)；6(MW标记物)；7(DU145 MPEK 16/7/12)；8(C3 MPEK 20/4/12)；9(CA-HPV-10 MPEK 28/3/12)；10(MW标记物)；11(DU145 MPEK 16/7/12)；12(C3 MPEK 20/4/12)；13(CA-HPV-10 MPEK 28/3/12)；14(-)；15(MIL-38制品1“原始的”)；16(MIL-38制品40A)；17(MIL-38制品37A)；18(MW标记物)；

图2示出了来源于内部杂交瘤原种(stock)(AusMAb杂交瘤细胞克隆1)或从来自ATCC的原始的HB11785杂交瘤原种(AusMA杂交瘤系3、4和5)再克隆的细胞的MIL-38抗体制剂与内部MIL-38抗体制剂33A的那些的比较。图2A示出了通过SDS-PAGE电泳来分凝(segregation)每种抗体制剂中的重链和轻链成分；泳道：1(Magic标记物)；2(AusMab 1)；3(AusMab 3)；4(AusMab 4)；5(AusMab 5)；6(MIL-38制品33A)；7(See Blue Plus2)；图2B示出了使用来自不同制剂的MIL-38抗体对来自DU-145和C3细胞系的提取物的蛋白质印迹分析的结果；

图3示出了内部生成和储存的不同MIL-38抗体制剂的比较(16A、16B、16C、17B、23A-1、23A-2、24A、25A、25B、26B、30A、31A、31B、31C、31D、32B、32C、33A、33B、33C、33D、34A、34B、35A、35C、35D、40A、40B、AM-3、AM-4)。图3A示出了通过SDS-PAGE电泳来分凝每种抗体制剂中的重链和轻链成分。图3B示出了使用来自每种制剂的MIL-38抗体对DU-145细胞提取物的蛋白质印迹分析的结果；

图4示出了MIL-38抗体群体分析的结果。图4A示出了使用原始的IIA、Alfio I、Alfio II、36A和AusMAb 4(AM-4)MIL-38抗体制剂对来自DU-145和C3细胞的蛋白质印迹的结果。图4B示出了减少Syprogel证明通过SDS-PAGE电泳对MIL-38抗体制剂(原始的IIA、Alfio I、Alfio II、36A和AusMAb 4(AM-4))的重和轻链成分的分凝。原始的IIA＝衍生自ATCC登录号HB11785(鼠科杂交瘤BLCA-38)的原种的内部制剂；Alfio I＝衍生自ATCC登录号HB11785的混合的MIL-38抗体群体；Alfio II＝衍生自ATCC登录号HB11785的混合群体的单一抗体群体。

图5示出了来自使用MIL-38抗体的不同制剂的免疫荧光试验的图像。具体地，图5A示出了来自使用MIL-38抗体的不同制剂对DU-145细胞的免疫荧光试验的图像。部分A、D、G、J和M示出了染色细胞的明视野图像；部分B(AM-4)、E(Alfio I)、H(Alfio II)和K(原始的IIA)示出了MIL-38抗体制剂对DU145细胞的结合；部分N示出了DU-145细胞的二次抗体对照；部分C、F、I、L和O示出了细胞的DAPI染色。图5B示出了来自使用MIL-38抗体的不同制剂对C3细胞的免疫荧光试验的图像。部分A、D、G、J和M示出了染色细胞的明视野图像；部分B(AM-4)、E(Alfio I)、H(Alfio II)和K(原始的IIA)示出了MIL-38抗体制剂与DU145细胞的结合；部分N示出了C3细胞的二次抗体对照；部分C、F、I、L和O示出了细胞的DAPI染色；

图6示出了使用不同抗体制剂作为捕捉抗体执行的比较夹心ELISA的结果。图6A示出了使用AM-3和AM-4作为捕捉抗体的比较夹心ELISA。图6B示出了使用混合的制剂(34A)或克隆群体(AM-4 1F5)作为捕捉抗体的比较夹心ELISA。

图7示出了嵌合的MIL-38抗体的SDS-PAGE(图7A)和蛋白质印迹(图7B)分析。泳道M＝蛋白标记物；泳道1＝还原条件；泳道2＝非还原条件；泳道P＝人IgG1κ(Sigma，目录号15154)作为阳性对照。

图8示出了来自使用嵌合的MIL-38抗体和对照对DU-145细胞的免疫荧光试验的图像。图8A-D示出了染色细胞的组合的明视野和DAPI图像。图8E-H示出了对具有MIL-38制品33A(8E，阳性对照)、嵌合的MIL-38(8F)、西妥昔单抗(Cetuximab)(8G，人IgG1k的阳性对照)和阴性对照(8H，无1°抗体)的DU-145细胞的染色；

图9示出了嵌合的MIL-38抗体的蛋白质印迹分析。图9A示出了鼠科MIL-38与DU-145 MPEK提取物、C3 MPEK提取物和NS0产生的重组体GPC-1抗原的反应性。图9B示出了嵌合的MIL-38与DU-145 MPEK提取物、C3 MPEK提取物和NS0产生的重组体GPC-1抗原的反应性。图9C示出了在与图9B等同的条件下鼠科MIL-38与DU-145 MPEK提取物、C3 MPEK提取物和NS0产生的重组体GPC-1抗原的反应性。

定义

如在本申请中使用的，单数形式“一个(a,an)”和“该(the)”包括复数引用对象，除非上下文明确地指示其它方面。例如，短语“一种抗体”也包括多种抗体。

如本文所使用，术语“包括(comprising)”意思是“包含(including)”。词语“包括(comprising)”的变型比如“包括(comprise,comprises)”具有相应地变化的含义。因此，例如，“包括”抗体A的样本可以唯一地由抗体A组成或者可以包括一种或多种另外的成分(例如，抗体B)。

如本文所使用，术语“多个”意思是多于一个。在某些具体的方面或实施方式中，多个的意思可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或更多，和其中可衍生的任何整数，以及其中可衍生的任何范围。

如本文所使用，术语“抗体(一种或多种)”包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgM、和IgY、全抗体，该全抗体包括单链全抗体和其抗原结合片段。抗原结合抗体片段包括但不限于Fv、Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv(sdFv)和包括VL或VH结构域的片段。抗体可以来自任何动物器官或适合的生产宿主。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以包括单独的可变区(一个或多个)或与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的全部或部分组合。还包括的是可变区(一个或多个)与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。抗体可以是单克隆、多克隆、嵌合、多特异性、人源化和特异性地结合生物分子的人单克隆和多克隆抗体。抗体可以是双特异性抗体、avibody、双抗体、三抗体、四抗体、纳米抗体、单结构域抗体、VHH结构域、人抗体、完全人源化抗体、部分人源化抗体、anticalin、adnectin或affibody。

如本文所使用，术语“单克隆抗体”指的是如此抗体：其识别单一抗原表位，并从基本上均质抗体的群体获得，该均质抗体特异性地结合至相同的抗原表位，并且除了可能以少量存在的天然发生的突变(一种或多种)之外在潜力方面是相同的。

如本文所使用，术语“人源化抗体”指的是包含来自人抗体以及非人抗体(例如鼠科抗体)的序列的抗体形式。例如，人源化抗体可以包括基本上所有的至少一个和通常两个可变结构域，其中所有/基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，和所有/基本上所有的FR区来自人免疫球蛋白序列。人源化抗体也可以任选地包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，该免疫球蛋白恒定区(Fc)可以通常地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)。

如本文所使用，术语“嵌合抗体”指的是展现期望的生物学活性的抗体，并且其中轻链和/或重链的一部分与衍生自给定/特定种类的抗体中的相应序列相同或同源，同时剩余的链(一个或多个)与衍生自另外的不同种类的抗体中的相应序列相同或同源。例如，嵌合抗体可以包括衍生自第一种类的可变区和包括衍生自第二种类的恒定区。嵌合抗体可以例如通过来自属于不同种类的免疫球蛋白基因片段的基因工程构建。

如本文所使用，术语“杂交瘤”指的是通过融合无限增殖细胞(例如，多发性骨髓瘤细胞)和产生抗体的细胞(例如，B淋巴细胞)而产生的细胞，其能够产生单一结合特异性的单克隆抗体。

如本文所使用，当提及抗体、抗体变体、抗体衍生物、抗原结合片段等时，术语“特异性地结合(binding specifically,specifically binding)”指的是相对于其它非靶分子其优先结合至给定靶分子的能力。例如，如果抗体、抗体变体、抗体衍生物、抗原结合片段(“分子A”)能够“特异性地结合至”给定靶分子(“分子B”)，则分子A具有区分分子B与任何其它数目的潜在可选的结合伴侣的能力。因此，当暴露于许多不同的但是同等地可接近的分子作为潜在的结合伴侣时，分子A将选择性地结合至分子B并且其它可选的潜在结合伴侣将保持基本上不被分子A结合。一般而言，与其它潜在结合伴侣相比，分子A将至少10倍、优选地50倍、更优选地100倍和更优选地多于100倍更频繁地优先结合至分子B。分子A可以能够以微弱的、但是可检测的水平结合至不是分子B的分子。这通常已知为背景结合并且例如通过使用适合的对照可以容易地与分子B特异性结合区分。

如本文所使用，术语“对象”包括任何具有经济、社会或研究重要性的动物，包括牛、马、羊、灵长类动物、鸟类和啮齿动物种类。因此，“对象”可以是哺乳动物，比如人或非人哺乳动物。

如本文所使用，当提及生物学分子(例如抗体)时，术语“分离的”是如此生物学分子：其不含该生物学分子天然存在的成分中的至少一些。

如本文所使用，术语“蛋白质”和“多肽”每个指的是由通过肽键连接在一起的氨基酸组成的聚合物并且可互换地使用。出于本发明的目的，“多肽”可以组成全长蛋白质或全长蛋白质的一部分。

如本文所使用，术语“多核苷酸”指的是脱氧核苷酸碱基、核糖核苷酸碱基、已知类似物或天然核苷酸、或其混合物的单链或双链聚合物。

如本文所使用，术语“试剂盒”指的是用于递送材料的任何递送系统。这样的递送系统包括允许从一个位置到另一个位置储存、运输或递送反应试剂(例如，在适合容器中的标记、参考样本、支持材料等)和/或支持材料(例如，缓冲液、用于执行试验的书面指示等)的系统。例如，试剂盒可以包括一个或多个附件，比如盒子，其包含相关反应试剂和/或支持材料。术语“试剂盒”包括分离型和组合型试剂盒二者。“分离型试剂盒”指的是包括两个或多个分开的容器的递送系统，这些分开的容器中的每个包含总试剂盒成分的子部分。容器可以同时或者分开地被递送至预期的接受者。任何包括两个或多个分开的容器——其每个包含总试剂盒成分的子部分——的递送系统都包含在术语“分离型试剂盒”的含义内。“组合型试剂盒”指的是在单一容器中(例如在容纳每种期望的成分的单一盒子中)包含反应试验的所有成分的递送系统。

将理解，当提及数值的范围时，在本文中术语“在……之间”的使用包含在该范围的每个端点处的数值。例如，在长度为10个残基和20个残基之间的多肽包括长度为10个残基的多肽和长度为20个残基的多肽。

在本文中的现有技术文件的任何描述，或者在本文中衍生自或基于这些文件的陈述不是对文件或衍生的陈述是相关领域的一般公知常识的一部分的承认。出于描述的目的，本文中提及的所有文件在此通过引用以其全部被并入，除非另有说明。

具体实施方式

对于诊断和/或治疗各种形式的癌症比如前列腺癌的更有效的方法和药剂的需要继续存在。抗体对于癌症而言是有用的诊断和治疗药剂，其在用于诊断和治疗患有血液恶性肿瘤和实体瘤的患者方面已经成为成功的和重要的工具。靶向肿瘤特异性抗原的新的相关抗体的鉴定提供了一种改善癌症患者的诊断和/或治疗结果的潜在手段。这些结果通过其可以被增强的另一种手段是通过改善现有的基于抗体的诊断和/或疗法。

“BLCA-38抗体”在诊断和/或治疗癌症包括膀胱癌和前列腺癌中已经是先前研究的主题。在现有技术中，“BLCA-38抗体”被持续地提及作为靶向大小大约为30kDa的未知抗原的鼠科单克隆抗体^1-5。本发明人已经出人意料地鉴定，在现有技术中公开和使用的BLCA-38抗体不是先前指出的单一单克隆抗体群体，而是混合群体中两种有区别的单克隆抗体的组合。这来源于本发明人的如下确定：用于生成BLCA-38抗体的杂交瘤——在美国组织型培养物保藏所中在登录号HB11785下保藏的代表性样本——是杂交瘤细胞的双克隆(而不是单克隆)群体，其产生两种离散型抗体种类的混合物。这些抗体种类中仅一种能够结合至在前列腺癌细胞上的相关抗原，而第二种类不能。而且，被该抗体结合的抗原显著地大于在现有技术中指出的30kDa^3-4。

这些出乎意料的发现已经促进了单克隆杂交瘤的生成，其能够产生仅对靶抗原具有结合特异性的抗体的单一群体。除了规避无效抗体(即，在现有技术的混合群体中存在的第二单克隆抗体群体)的不必要的产生和应用，当利用相等量的抗体时，与现有技术的混合群体相比，根据本发明使用单克隆杂交瘤/单一抗体提供了更强的信号。

因此，本发明的某些实施方式涉及提供衍生自克隆杂交瘤细胞的单克隆抗体群体，抗体群体的每个成员能够特异性地结合至某些癌细胞(例如，膀胱和前列腺癌细胞)上存在的抗原。本发明还提供了这些抗体的抗原结合片段，以及保持相同结合特异性的抗体的衍生物和变体。

还提供了能够产生本发明的抗体的杂交瘤。这样的杂交瘤的一个实例根据布达佩斯条约的条款在2014年8月22日被保藏在214Hawkesbury Road，Westmead，NSW 2145，澳大利亚的Cellbank Australia中，登录号为CBA20140026。

进一步提供了用于产生和/或分离本发明的抗体的方法，和利用该抗体进行检测/诊断的方法。

单克隆抗体

本发明提供了单克隆抗体、这样的抗体的衍生物和其抗原结合片段。

单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段能够特异性地结合至在磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的抗原表位。GPC-1蛋白可以是人磷脂酰肌醇聚糖-1蛋白(例如，由下列的任何一种中陈述的序列限定的：NCBI参考序列登录号NP_002072.2、GenBank登录号AAH51279.1、GenBank登录号AAA98132.1、GenBank登录号EAW71184.1或UniProtKB/Swiss-Prot登录号P35052.2)。在一些实施方式中，GPC-1蛋白可以不包括信号肽和/或前肽。另外地或可选地，单克隆抗体、衍生物和抗原结合片段可以能够特异性地结合至在GPC-1变体(例如，GPC-1同种型、剪接变体或同种异型)中存在的抗原表位。

通过非限制性实例的方式，单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括重链和/或轻链、其组合、或其成分(一种或多种)。

重链或其成分(一种或多种)可以包括重链可变区，其包括一个、两个、或三个互补决定区(CDR1、CDR2和/或CDR3)，其在本领域中也已知为重链高变(HV)区。重链CDR1可以包括由SEQ ID NO:3的残基50-54限定的氨基酸序列或由其组成。重链CDR2可以包括由SEQ IDNO:3的残基69-85限定的氨基酸序列或由其组成。重链CDR3可以包括由SEQ ID NO:3的残基118-126限定的氨基酸序列或由其组成。

另外地或可选地，重链可变区可以包括一个、两个、三个或四个构架区(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。重链FR1可以包括由SEQ ID NO:3的残基20-49限定的氨基酸序列或由其组成。重链FR2可以包括由SEQ ID NO:3的残基55-68限定的氨基酸序列或由其组成。重链FR3可以包括由SEQ ID NO:3的残基86-117限定的氨基酸序列或由其组成。重链FR4可以包括由SEQ ID NO:3的残基127-137限定的氨基酸序列或由其组成。

另外地或可选地，重链可变区可以包括前导序列。重链前导序列可以包括由SEQID NO:3的残基1-19限定的氨基酸序列或由其组成。本领域技术人员将认识到，前导序列是促进新合成的重链运输进入内质网的信号序列，并且其通常不存在于单克隆抗体的最终装配形式的重链中。

另外地或可选地，轻链或其成分(一种或多种)可以包括轻链可变区，其包括一个、两个、或三个互补决定区(CDR1、CDR2和/或CDR3)，其在本领域中也已知为轻链高变(HV)区。轻链CDR1可以包括由SEQ ID NO:4的残基44-54限定的氨基酸序列或由其组成。轻链CDR2可以包括由SEQ ID NO:4的残基70-76限定的氨基酸序列或由其组成。轻链CDR3可以包括由SEQ ID NO:4的残基109-117限定的氨基酸序列或由其组成。

另外地或可选地，轻链可变区可以包括一个、两个、三个或四个构架区(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。轻链FR1可以包括由SEQ ID NO:4的残基21-43限定的氨基酸序列或由其组成。轻链FR2可以包括由SEQ ID NO:4的残基55-69限定的氨基酸序列或由其组成。轻链FR3可以包括由SEQ ID NO:4的残基77-108限定的氨基酸序列或由其组成。轻链FR4可以包括由SEQ ID NO:4的残基118-127限定的氨基酸序列或由其组成。

另外地或可选地，轻链可变区可以包括前导序列。轻链前导序列可以包括由SEQID NO:4的残基1-20限定的氨基酸序列或由其组成。本领域技术人员将认识到，前导序列是促进新合成的轻链运输进入内质网的信号序列，并且其通常不存在于单克隆抗体的最终装配形式的轻链中。

另外地或可选地，重链可以包括一个、两个或三个重链恒定区。重链恒定区可以包括由SEQ ID NO:3的残基138-461限定的氨基酸序列或由其组成。

另外地或可选地，轻链可以包括轻链恒定区。轻链恒定区可以包括由SEQ ID NO:4的残基128-234限定的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方式中，根据本发明的单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括这样的重链可变区，其包括由SEQ ID NO:3的残基20-137限定的氨基酸序列或由其组成。单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括重链可变区中的一个或两个。

在一些实施方式中，根据本发明的单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括这样的轻链可变区，其包括由SEQ ID NO:4的残基21-127限定的氨基酸序列或由其组成。单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括轻链可变区中的一个或两个。

在一些实施方式中，根据本发明的单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括重链可变区——其包括由SEQ ID NO:3的残基20-137限定的氨基酸序列或由其组成，和轻链可变区——其包括由SEQ ID NO:4的残基21-127限定的氨基酸序列或由其组成。单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括重链可变区中的两个和轻链可变区中的两个的组合。

在一些实施方式中，根据本发明的单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括重链，其包括由SEQ ID NO:3的残基20-461限定的氨基酸序列或由其组成。单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括重链中的一个或两个。

在一些实施方式中，根据本发明的单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括轻链，其包括由SEQ ID NO:4的残基21-234限定的氨基酸序列或由其组成。单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括轻链中的一个或两个。

在一些实施方式中，根据本发明的单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括重链——其包括由SEQ ID NO:3的残基20-461限定的氨基酸序列或由其组成，和轻链——其包括由SEQ ID NO:4的残基21-234限定的氨基酸序列或由其组成。单克隆抗体、变体、衍生物和抗原结合片段可以包括重链中的两个和轻链中的两个的组合。

根据本发明的单克隆抗体、这样的抗体的变体和衍生物、和其抗原结合片段不被限制为任何具体的同种型，并且因而可以是IgA(IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、或IgM同种型。在一些实施方式中，它们是IgG1同种型。

包含在本发明的范围内的是由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，该杂交瘤细胞根据布达佩斯条约的条款在2014年8月22日被提交在214Hawkesbury Road，Westmead NSW2145，澳大利亚的cellbank Australia中，登录号为CBA20140026。杂交瘤是产生单一抗体种类的克隆群体，该单一抗体种类对在磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位具有结合特异性。

抗体片段、衍生物和变体

包含在本发明的范围内的是在本文中描述的抗体的“片段”。一般而言，片段是“抗体结合片段”，在该意义上来说它们能够特异性地结合至与它们衍生自的或者它们基于的亲代抗体相同的抗原/表位(例如GPC-1)。通常地，抗原结合片段保留亲代抗体的至少10％的抗原/表位结合能力，或者亲代抗体的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)的抗原/表位结合能力。也可以考虑，本文描述的抗体的抗原结合片段可以包括保守氨基酸置换，其基本上不改变其抗原/表位结合特异性/能力(例如，其抗原/表位结合特异性/能力的至少70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)可以被保留)。

抗原结合片段的非限制性实例包括全长抗体、肽和其衍生物的部分，包括例如Fab、Fab'、F(ab)₂、F(ab′)₂、F(ab)₃、Fv、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段、dAB片段Fse、VH、VL、VhH和V-NAR结构域、互补位、CDR区、单链抗体分子(例如sc-Fv)、微抗体(minibody)、双抗体、三抗体、四抗体、κ抗体、线性抗体、多特异性抗体、由抗体片段形成的结构域抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体片段、和能够特异性地结合至相关抗原/表位(例如GPC-1)的抗体的任何部分或肽序列。

也包含在本发明的范围内的是本文描述的抗体的“衍生物”。本发明的抗体的“衍生物”指的是如此的本文描述的抗体：其被修饰以参入另外的成分或者使现有成分(一种或多种)改变，但是仍然能够特异性地结合至与其衍生自的亲代抗体相同的抗原/表位(例如GPC-1)。通常地，本文考虑的抗体衍生物保留亲代抗体的至少10％的抗原/表位结合能力，或者亲代抗体的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)的抗原/表位结合能力。

适合于形成抗体衍生物的修饰的非限制性实例包括酰胺化、糖基化、磷酸化、聚乙二醇化、连接至细胞配体或其它蛋白、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、乙酰化等。另外地或可选地，衍生物可以包含一种或多种非典型氨基酸。

抗体衍生物可以包括标记的抗体，比如，例如标记有放射性碘、铟、硫、碳、氚等的单克隆抗体；缀合有抗生物素蛋白或生物素的单克隆抗体；缀合有酶(例如，辣根、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡糖淀粉酶、乙酰胆碱酯酶、羧酸脱水酶、苹果酸脱氢酶、溶菌酶或过氧化物酶)的单克隆抗体；和缀合有化学发光剂(例如吖啶酯)、生物发光剂(例如荧光素酶)或荧光剂(例如藻胆蛋白)的单克隆抗体。抗体衍生物的进一步的实例包括双功能抗体，比如双特异性抗体，其通过将识别两个不同的抗原基团的两个单独的抗体的部分进行组合而生成(例如通过重组技术或交联)。

抗体衍生物可以由本文描述的抗体的共价修饰而形成，例如通过将抗体的靶向的氨基酸残基与能够与选择的侧链或末端残基反应的试剂进行反应。例如，用双功能剂的衍生化对于将抗体或其片段交联至大分子运载体比如水不溶性支持基质是有用的手段。本文考虑的抗体衍生物可以具有附着至能够增加其体内半衰期(例如，在从血流清除之前延长时间长度)的基础抗体(base antibody)或其片段的药剂。这样的技术的非限制性的实例包括增加PEG部分。

在某些实施方式中，抗体衍生物可以是多聚体，比如例如，二聚体，其包括一个或多个单体，其中每个单体包括(i)本文描述的抗GPC-1抗体的抗原结合区，或由其衍生的多肽区(比如，例如通过一个或多个氨基酸的保守置换)，和(ii)多聚(例如二聚)多肽区，使得抗体衍生物形成特异性地结合至GPC-1的多聚体(例如同源二聚体)。例如，本文描述的抗GPC-1抗体的抗原结合区，或由其衍生的多肽区可以重组地或化学地与异源蛋白融合，其中异源蛋白包括二聚或多聚结构域。衍生物可以经历允许同源二聚体或异源二聚体形成的条件。异源二聚体可以包括相同的二聚结构域但是不同的抗GPC-1抗原结合区，相同的抗GPC-1抗原结合区但是不同的二聚结构域，或者不同的抗GPC-1抗原结合区和不同的二聚结构域。适合的二聚结构域包括源于转录因子(例如碱性区亮氨酸拉链)、碱性区螺旋-环-螺旋蛋白和免疫球蛋白恒定区(例如重链恒定区或其结构域，比如CH1结构域、CH2结构域或CH3结构域)的那些。

在其它实施方式中，抗体衍生物可以是本文描述的缀合至第二抗体(“抗体异型缀合物(antibody heteroconjugate)”)的抗GPC1抗体。

本文还考虑的是本文描述的抗体的人源化衍生物。本文考虑的“人源化”抗体是人/非人嵌合抗体，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。例如，人源化抗体可以是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR区(一个或多个)的残基被来自非人种类(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、兔或对于GPC-1抗原/表位具有期望的特异性和亲和性的非人灵长类)的CDR区的残基替换。人免疫球蛋白的构架区(FR)残基也可以(任选地)被相应的非人残基替换，并且在一些情况下，人源化抗体可以包括在受体抗体或者供体抗体中不存在的残基以增强抗体性能。

本文进一步考虑的是“嵌合”抗体衍生物，其中重和/或轻链的一部分与本文描述的衍生自具体种类或者属于具体抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或者同源，同时链(一个或多个)的剩余部分与衍生自另一种不同种类或属于另一种不同抗体种类或亚类的抗体中的相应的序列相同或同源。例如，本文考虑的嵌合抗体可以包括衍生自本文描述的抗GPC-1单克隆抗体的可变区，和衍生自第二种类的恒定区。嵌合抗体可以例如通过属于不同种类的免疫球蛋白基因片段的基因工程来生成。

仅通过非限制性实例的方式，根据本发明的嵌合抗体可以包括嵌合的小鼠人CH1-CH3链序列小鼠VH-人CH1-CH3链(重链)和/或小鼠人κ链序列小鼠VK-人CK序列MIL-38小鼠VK(轻链)。嵌合抗体的重链可以包括在SEQ ID NO:9的残基20-467中列出的氨基酸序列或由其组成。嵌合抗体的轻链可以包括在SEQ ID NO:10的残基21-234中列出的氨基酸序列或由其组成。重链可变区可以包括：互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:9的50-54位限定的氨基酸序列或由其组成；和/或互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQ ID NO:9的69-85位限定的氨基酸序列或由其组成；和/或互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:9的118-126位限定的氨基酸序列或由其组成。另外地或可选地，轻链可变区可以包括：互补决定区1(CDR1)，其包括由SEQ ID NO:10的44-54位限定的氨基酸序列或由其组成；和/或互补决定区2(CDR2)，其包括由SEQ ID NO:10的70-76位限定的氨基酸序列或由其组成；和/或互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:10的109-117位限定的氨基酸序列或由其组成。根据本发明的嵌合抗体可以是该嵌合抗体的“变体”。

包含在本发明的范围内的是本文描述的抗体的“变体”。抗体的“变体”指的是凭借亲代抗体序列中一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或置换使得氨基酸序列与“亲代”抗GPC-1抗体氨基酸序列不同的抗体。例如，变体抗体可以包括亲代抗体的一个或多个CDR和/或构架区中的一个或多个氨基酸置换(例如，亲代抗体的一个或多个重和/或轻链CDR和/或构架区中1到10个之间，2到5个之间，或者1、2、3、4、或5个置换)。抗体变体可以包括重链可变结构域序列和/或轻链可变结构域序列氨基酸序列，其与亲代抗体的相应的可变结构域具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸序列同源性(即序列同一性)。

两个序列之间的序列同源性或同一性在本文中被限定为在对齐序列和引入缺口，如果必要，以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与亲代抗体残基相同的氨基酸残基的百分比。如果相互比较的两个序列在长度上不同，则序列同一性指的是与较长序列的氨基酸残基相同的较短序列的氨基酸残基的百分比。序列同一性可以利用计算机程序比如最佳拟合(Bsetfit)程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix的版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive Madison，Wis.53711)和/或程序“fasta20u66”(版本2.0u66，1998年9月，William R.Pearson和theUniversity of Virginia；还参见W.R.Pearson(1990)，Methods in Enzymology 183,63-98)常规地测定。

在一些实施方式中，本文描述的变体抗体经由可变抗体的序列中保守氨基酸改变(一个或多个)可以与亲代抗体不同。“保守改变”指的是基本上抗原或构象中性的变更，其产生变体抗体的三级结构的最小改变，或者产生抗体变体的抗原决定簇的最小改变——与亲代抗体相比，并且其为不致使衍生物不能够结合至GPC-1中与亲代抗体相同的表位的一种。保守氨基酸改变的非限制性实例包括疏水氨基酸的置换和物理化学上类似氨基酸的置换。本领域普通技术人员可以常规地并毫不费力地评估在维持构象和抗原中性的同时是否可以进行给定氨基酸置换(参见例如，Berzofsky，(1985)Science 229:932-940；Bowie等(1990)Science 247:1306-1310)。蛋白构象的变更可以使用公知试验——其包括但不限于微量补体结合方法(参见Wasserman等(1961)J.Immunol.87:290-295；Levine等(1967)Meth.Enzymol.11:928-936)——和通过结合研究使用构象依赖性单克隆抗体(参见Lewis等(1983)Biochem.22:948-954)实现。保守氨基酸改变(一个或多个)可以发生在亲代抗体的一个或多个CDR和/或构架区(例如，亲代抗体的一个或多个CDR和/或构架区中1到10个之间，2到5个之间，或者1、2、3、4、或5个保守置换)。

一般而言，本文考虑的人源化、嵌合的衍生物、片段和变体抗体仍然能够特异性地结合至与它们衍生自其的或它们包含其成分的亲代抗体相同的抗原/表位(例如GPC-1)。通常地，它们可以保留亲代抗体的至少10％的抗原/表位结合能力，或者亲代抗体的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)的抗原/表位结合能力。例如，与亲代抗体相比，它们可以具有更强的结合亲和力和/或结合特异性。

抗体片段、衍生物或变体特异性地结合至由亲代抗体(即GPC-1抗原/表位)靶向的抗原/表位的能力可以使用本领域中已知的方法测试，包括例如使用如下技术的竞争性和非竞争性试验系统：比如蛋白质印迹、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀试验、“夹心”免疫试验、免疫扩散试验、沉淀素反应、蛋白A免疫试验、荧光免疫试验、凝胶扩散沉淀素反应、补体结合试验、免疫放射试验、凝集试验等(参见例如，Ausubel等编辑，Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.，纽约，第4版，1999)；Harlow&Lane，Using Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1999))。

具体地包含在本发明的范围内的是本文描述的任何抗体或其抗原结合片段的变体，包括但不限于由本文中特定序列限定的抗体(包括嵌合抗体)和抗原结合片段，和由本文描述的杂交瘤产生的抗体，该杂交瘤包括如此杂交瘤：其根据布达佩斯条约的条款在2014年8月22日被提交在214Hawkesbury Road，Westmead NSW 2145，澳大利亚的cellbankAustralia中，登录号为CBA20140026。

杂交瘤

本发明提供了能够产生单克隆抗体、这样的抗体的衍生物和变体、和其抗原结合片段的杂交瘤细胞。

在一些实施方式中，杂交瘤可以产生在上面的标题为“单克隆抗体”的部分中列出的单克隆抗体和/或其抗原结合片段。

在一些实施方式中，杂交瘤可以产生在上面的标题为“抗体片段、衍生物和变体”的部分中列出的本文描述的单克隆抗体的片段、衍生物和/或变体。

用于产生能够产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的技术在本领域中是公知的。非限制性的实例包括杂交瘤方法(参见Kohler和Milstein，(1975)Nature，256:495-497；Coligan等Methods In Molecular Biology的2.5.1-2.6.7部分(Humana Press 1992)；和Harlowand Lane Antibodies:A Laboratory Manual，726页(Cold Spring Harbor Pub.1988))，用于产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤方法(参见Cole等1985，in Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.，77-96页)，人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等1983，Immunology Today 4:72)，和三源杂交瘤(trioma)技术。

简言之，本发明的单克隆抗体可以例如通过腹膜内注射将感兴趣的免疫原(抗原)(即GPC-1)施用至近交或野生型小鼠(例如BALB/c或C57BL/6小鼠)、兔、大鼠或其它动物种类，或能够产生天然或人抗体的转基因小鼠来制备。为了诱导免疫反应，免疫原例如可以与佐剂混合，单独被施用，通过载体表达，作为DNA被施用，或者作为融合蛋白被施用。动物可以被加强(boost)例如至少两次，并且然后可以从免疫动物收获脾细胞。杂交瘤可以通过将致敏的脾细胞与骨髓瘤细胞系(例如，鼠科SP2/O骨髓瘤细胞，使用例如在Kohler和Milstein和Harlow和Lane中列出的方法)融合而生成。

根据本发明的GPC-1抗原构建体(例如疫苗组合物，其包括药学上可接受形式的GPC-1抗原构建体)可以以重复剂量(例如，1-15次剂量之间、2-10次剂量之间、3-7次剂量之间、4-6次剂量之间)被施用至适合的动物，持续适合的时间间隔(例如，1-10周之间、1-6周之间、1-4周之间、2-3周之间)。动物的免疫反应可以通过在加强之后的适合时间处(例如，加强之后的3-10天之间、加强之后的4-8天之间、加强之后的5-6天之间)采集血清样本，然后使用已知的技术(例如通过ELISA)测定抗原构建体的免疫原性来监测。以这种方式的免疫作用可以导致动物中的免疫反应。具有治疗效价的动物通常是以适合的稀释(例如，在1:4000和1:6000之间、在1:4500和1:5500或1:5000之间)通过ELISA提供阳性结果的那些。具有治疗效价的那些可以被选择用于融合它们的产生抗体的细胞(B淋巴细胞)与连续不断地复制/无限增殖细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)。细胞可以使用适合的药剂比如聚乙二醇被诱导融合。所得到的杂交瘤细胞然后可以以常规的方式克隆(例如，使用有限稀释法)，并且测试生成的克隆体在培养中产生期望的抗GPC-1单克隆抗体的能力。杂交瘤可以通过在包含次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT)的选择培养基中平板培养细胞化学地选择。可以筛选杂交瘤的产生单克隆抗体的能力并且阳性杂交瘤然后可以被克隆、扩展和储存。

在本发明的优选实施方式中，杂交瘤是能够产生单一抗体种类的单克隆细胞群体，该单一抗体种类能够特异性地结合至GPC-1。这样的单克隆抗体的非限制性实例在上面的标题为“单克隆抗体”和“抗体片段、衍生物和变体”的部分中列出。

在一些实施方式中，根据本发明的杂交瘤可以是根据布达佩斯条约的条款在2014年8月22日被提交在214Hawkesbury Road，Westmead NSW 2145，澳大利亚的cellbankAustralia中，登录号为CBA20140026的杂交瘤。培养和繁殖这些杂交瘤细胞以产生根据本发明的单克隆抗体的方法对于本领域的普通技术人员而言是公知的。

在本文中也考虑的是包括本发明的杂交瘤细胞的细胞培养物。

在一些实施方式中，细胞培养物包括单一(单克隆)种类的杂交瘤细胞，其能够产生单一种类的特异性地结合至GPC-1的抗体或其抗原结合片段。这样的单克隆抗体的非限制性的实例在上面的标题为“单克隆抗体”和“抗体片段、衍生物和变体”的部分中列出。单一(单克隆)种类的杂交瘤细胞可以根据布达佩斯条约的条款在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下被保藏。

在一些实施方式中，细胞培养物包括多个种类的杂交瘤细胞(即混合的杂交瘤细胞群体)。该混合的杂交瘤细胞群体可以包括单一(单克隆)种类的杂交瘤细胞，其能够产生特异性地结合至GCP-1的单一种类的抗体。这样的单克隆抗体的非限制性的实例在上面的标题为“单克隆抗体”和“抗体片段、衍生物和变体”的部分中列出。单一(单克隆)种类的杂交瘤细胞可以根据布达佩斯条约的条款在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下被保藏。混合的杂交瘤细胞群体可以不包括在ATCC中在登录号HB11785下保藏的杂交瘤细胞和/或能够产生下述抗体的杂交瘤细胞，该抗体包括：

轻链可变区，其包括下列的任何一种或多种：

互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:6的113-121位限定的氨基酸序列或由其组成；

和/或

由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个轻链可变区FR(构架区)：SEQ ID NO:6的残基25-47、SEQ ID NO:6的残基59-73、SEQ ID NO:6的残基81-112、SEQ IDNO:6的残基122-131。

抗体生产工艺

用于制备单克隆抗体、其衍生物和变体、和其抗原结合片段的工艺是容易获得的，并且能够由本领域普通技术人员容易地执行。

除了Kohler等(1975)的杂交瘤方法和上面在标题为“杂交瘤”的部分中描述的之外，可以被利用的另外的非限制性工艺是重组DNA技术(参见例如，美国专利号4816567)。例如，单克隆抗体、其衍生物和变体、和其抗原结合片段可以在任何完善的表达系统中重组地产生，该表达系统包括但不限于杆状病毒、酵母(例如毕赤酵母属、酵母属)、大肠杆菌、哺乳动物细胞、植物、或转基因动物(参见Breitling和Dubel，1999，Recombinant Antibodies，John Wiley&Sons,Inc.，纽约，119-132页)。

在一些实施方式中，编码根据本发明的单克隆抗体、其衍生物和变体、和其抗原结合片段的核酸序列可以在基于重组DNA技术的生产工艺中使用。非限制性实例包括在SEQID NO:1中限定的重链多核苷酸序列或在SEQ ID NO:2中限定的轻链多核苷酸序列或其变体或片段。

“变体”多核苷酸在本文中指的是在序列方面与亲代或参比多核苷酸不同的多核苷酸。多核苷酸序列趋异可以起因于突变改变，比如一个或多个核苷酸的缺失、置换或添加。这些改变中的每个可以在给定序列中单独或组合，一次或多次发生。“变体”多核苷酸指的是与亲代或参比多核苷酸具有基本上相似序列的多核苷酸。一般而言，如果两个序列具有相同的指定的核苷酸百分比(序列“同源性”或序列“同一性”的百分比)，则两个序列是“基本上相似的”。两个多核苷酸序列之间的序列同源性或同一性在本文中被限定为在对齐序列和引入缺口，如果必要，以实现最大百分比序列同一性之后，候选(“变体”)序列中与亲代/参比多核苷酸序列的那些相同的核苷酸的百分比。如果相互比较的两个序列在长度上不同，则序列同一性指的是与较长序列的核苷酸相同的较短序列的核苷酸的百分比。序列同一性可以利用计算机程序比如最佳拟合程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix的版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science DriveMadison，Wis.53711)和/或程序“fasta20u66”(版本2.0u66，1998年9月，WilliamR.Pearson和the University of Virginia；还参见W.R.Pearson(1990)，Methods inEnzymology 183,63-98)常规地测定。变体多核苷酸与亲代/参比多核苷酸之间的序列同源性/同一性的程度可以例如是至少75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％。

多核苷酸“片段”是编码大的亲代/参比多核苷酸的组成或者是其组成的多核苷酸分子。一般而言，片段将编码本发明的抗体的片段，片段能够特异性地结合至GPC-1。

根据本发明产生的单克隆抗体、其衍生物和变体、和其抗原结合片段可以使用适合的方法与各种来源分离，该适合的方法包括但不限于免疫球蛋白结合分子(例如，蛋白A、L、G或H)、可操作地连接至抗体或抗体片段的标志(例如，His标志、c-myc标志)、亲和色谱法等。

本文描述的单克隆抗体、其衍生物和变体、和其抗原结合片段可以通过杂交瘤和/或细胞培养物——其包括单一或混合的杂交瘤群体，该杂交瘤群体包括例如上面标题为“杂交瘤”的部分中表述的那些——产生，然后使用已知的技术分离。在一些实施方式中，单克隆抗体可以通过培养单一(单克隆)种类的杂交瘤细胞——其根据布达佩斯条约的条款在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下保藏——并从培养物中分离而产生。

用于制备和培养杂交瘤细胞系和分离产生的抗体的工艺对于本领域普通技术人员而言是公知的并且是标准的程序。

组合物和试剂盒

根据本发明的单克隆抗体、其衍生物和变体、和其抗原结合片段——包括上面标题为“单克隆抗体”和“抗体片段、衍生物和变体”的部分中描述的那些——可以作为试剂盒和/或组合物(例如药物组合物)的成分被包括。

通过非限制性实例的方式，本发明的试剂盒可以包括根据本发明的抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物、嵌合抗体、或杂交瘤细胞中的任何一种或多种，或任何组合。杂交瘤细胞可以在登录号CBA20140026下保藏于Cellbank Australia。

试剂盒可以另外地包括任何数目的另外的成分，包括例如，用于细胞培养的试剂、参考样本、缓冲液、标记和使用试剂盒的成分执行检测分析的书面指示。

试剂盒可以是分离型或组合型试剂盒。

本发明还提供了包括根据本发明的抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物、嵌合抗体、或杂交瘤细胞中的任何一种或多种的组合物。

通过非限制性实例的方式，根据本发明的组合物可以包括根据本发明的抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物、嵌合抗体、或杂交瘤细胞中的任何一种或多种，或任何组合。杂交瘤细胞可以在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下保藏。

组合物可以是药物组合物。该药物组合物可以包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或运载体，如本领域普通技术人员已知的。为了制备该药物组合物，包含的成分(一种或多种)可以与药学上可接受的稀释剂、运载体和/或赋形剂(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,MackPublishing Company,Easton,Pa.(1984))混合。治疗和诊断剂的制剂(formulation)可以通过与生理学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂混合而制备，该运载体、赋形剂或稳定剂是例如水溶液或悬浮液、冻干粉末、浆液的形式(参见，Gennaro(2000)Remington:TheScience and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams和Wilkins，纽约，N.Y.；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker,Inc.，纽约，N.Y.；Avis等(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets，Marcel Dekker，NY；Hardman等(2001)Goodman and Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，McGraw-Hill，纽约，N.Y.；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems，Marcel Dekker，NY)。

检测方法

本发明提供了用于检测和/或定量对象(例如对象的细胞)中GPC-1蛋白的表达的方法。该方法包括从对象获得细胞、组织样本和/或体液样本，将细胞、组织和/或体液样本与根据本发明的抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物或嵌合抗体(例如，在上面标题为“单克隆抗体”和“抗体片段、衍生物和变体”的部分中描述的那些)接触，并确定和/或定量所述抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物或嵌合抗体与对象的细胞、组织样本或体液样本的结合。

用于检测的GPC-1可以存在于细胞的表面上和/或内部地表达。体液可以是尿。细胞或组织样本可以是前列腺细胞或前列腺组织。检测和/或定量GPC-1表达可以使用本领域中任何已知的手段进行，包括例如流式细胞术和/或ELISA。

在一些实施方式中，在方法中使用的抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物或嵌合抗体通过根据本发明的杂交瘤(例如在上面标题为“杂交瘤”的部分中描述的杂交瘤)产生。在一些实施方式中，抗体是由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，该杂交瘤细胞在CellbankAustralia中在登录号CBA20140026下保藏。

在一些实施方式中，包括单一种类的抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物或嵌合抗体的溶液——其能够检测GPC-1——被应用至可能潜在地包含GPC-1的细胞、组织和/或体液样本。单一种类可以通过杂交瘤细胞产生，该杂交瘤细胞在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下保藏。

另外地，包括多个种类的抗体、抗体变体、抗体片段、抗体衍生物和/或嵌合抗体的溶液可以被应用至可以包含GPC-1的细胞、组织和/或体液样本，其中溶液中的至少一个种类能够检测GPC-1。能够检测GPC-1的种类可以通过杂交瘤细胞产生，该杂交瘤细胞在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下保藏。在这样的实施方式中，包括多个种类的溶液不包括这样的抗体，其由在美国组织型培养物保藏所(ATCC)中在登录号HB11785下保藏的杂交瘤细胞和/或能够产生包括下述的抗体的杂交瘤细胞产生，

轻链可变区，其包括如下的任何一种或多种：

互补决定区3(CDR3)，其包括由SEQ ID NO:6的113-121位限定的氨基酸序列或由其组成

和/或

在一些实施方式中，在从对象获得的细胞、组织和/或体液样本中检测的GPC-1表达的水平可以与对照细胞样本或者样本群体参比的GPC-1表达水平进行比较。在一些实施方式中，与对照或参比相比在对象中增加的GPC-1表达的确定可以是对象中疾病的诊断，或对象中患疾病的增加的可能性。疾病可以是前列腺癌。

本领域普通技术人员将理解，可以如具体实施方式中公开的对本发明进行许多变化和/或修饰，而不背离宽泛描述的本发明的精神或范围。因此，本发明的实施方式在所有方面被视为是说明性的而不是限制性的。

实施例

现在将参照具体实施例来描述本发明，这些实施例不应当被解释为在任何方面是限制性的。

实施例1：来自MIL-38杂交瘤群体的抗体的分析

1.1材料和方法

-MIL-38抗体制剂

制剂MIL-38抗体杂交瘤从下列来源获得：

(i)BLCA-38杂交瘤的内部细胞原种被用于生成一系列MIL-38抗体制剂，命名为16A、16B、16C、17B、23A-1、23A-2、24A、25A、25B、26B、30A、31A、31B、31C、31D、32B、32C、33A、33B、33C、33D、34A、34B、35A、35C、35D、40A、40B。

(ii)来自内部原种的一批细胞被用于生成MIL-38杂交瘤制剂AusMAb 1和2(AM-1和AM-2)。

(iii)BLCA-38杂交瘤的原始保藏的小瓶从ATCC重新得到(登录号HB11785：鼠科杂交瘤BLCA-38)。其被培养并且内部细胞原种被制备。来自该原始原种的抗体制剂被命名为“原始的”(1-O)和“原始的IIA”；

(iv)“原始的”细胞的小瓶被用于生成抗体制剂AusMAb 3(AM-3)和随后生成抗体制剂AusMAb 4和5(AM-4、AM-5)。细胞被用于生成AusMAb3和被用于生成AusMAb 4和5的细胞在两批中分别地被冷冻。

(v)从这些冷冻的细胞，被称为“Alfio I”的制剂从被用于制备AM-4和AM-5的细胞原种生成，和被称为“Alfio II”的制剂从被用于生成AM-3的细胞原种生成。

(vi)来自BLCA-38杂交瘤(HB11785)的原始保藏的细胞的早期传代(<6)冷冻被用于执行单一细胞克隆并提供许多克隆体以表征。MIL-38 1F5克隆体被选择并且在CellBankAustralia中在登录号CBA20140026下保藏。

被用作生成上面(i)-(vi)中描述的制剂的基础的杂交瘤原种如在Walker等的美国专利号5,622,836¹中描述的制备，该专利的全部内容通过交叉引用被并入本文。

对于MIL-38抗体的纯化，冷冻的细胞原种被快速地解冻，然后在RPMI1640培养基中再悬浮并且使其在37℃下利用5％CO₂生长24h。以顺序过程扩展、分裂并按比例增加细胞。在每个步骤中，将细胞再悬浮在新鲜培养基中并在37℃下利用5％CO₂孵育。在按比例增加之后，将细胞转移至无血清培养基并且生长直到开始死亡期。收获上清液以收集MIL-38抗体并且过滤杀菌。抗体上清液在-80℃下储存直到达到要求。使用Pierce蛋白G根据制造商的推荐纯化抗体。

用于生成AusMab克隆体AM-1-AM-5的细胞如下制备。细胞在DMEM+10％FCS中复活。一旦生长良好，将它们克隆(参见下文)、扩展并冷冻。然后使细胞脱离FCS并转移至GibcoHSFM无血清培养基(通常脱离持续5天)。

在将细胞接种入生物反应器中之前，改变的连续稀释被执行以获得在96孔板中获得单细胞/孔。条件培养基被用于促进单一细胞生长。在平板培养后3天观察个别孔，并且计数每个孔的4-8个细胞克隆体的数目。仅获得单菌落的孔被选择用于扩展。抗体的表达在扩展之前被确认。

在扩展之后，将细胞的一部分转移至Integra两隔室生物反应器，同时剩余的细胞被冷冻。根据制造商的指示在生物反应器中生长细胞。在收获之后，使用标准技术纯化抗体。

-蛋白质印迹和Sypro凝胶分析

蛋白提取物：根据标准组织培养技术培养DU-145(MIL-38抗原阳性)或C3(MIL-38抗原阴性)细胞。使用Merck Millipore ProteoExtract天然膜蛋白提取试剂盒(MembraneProtein Extraction Kit)(MPEK)根据制造商的指示富集细胞膜蛋白。

转移：在2.5A和25V最大值下使用Transblot Turbo系统(Biorad)将凝胶转移至硝酸纤维膜上持续10min。

蛋白质印迹：简言之，在转移之后，在室温下利用在PBS吐温(0.1％)中的5％脱脂牛奶封闭膜持续2h。第一抗体(1μg/ml，在5％脱脂牛奶-PBS吐温(0.1％)中)被应用并且在4℃下孵育过夜。在清洗之后(3x 10min PBS吐温(0.1％))，利用第二抗体(1:2000绵羊-抗-小鼠HRP标记的，在5％脱脂牛奶-PBS吐温(0.1％)中)孵育膜。在清洗之后(3x 10min PBS吐温(0.1％))，通过使用ECL检测试剂盒(Biorad)并利用LAS4000mini(GE Life Science)成像来检测抗原。

Sypro凝胶：将凝胶在固定液(10％乙醇，7％乙酸)中固定2h，然后被转移至 Ruby染色剂中并在黑暗中在室温下孵育过夜。在成像之前，冲洗凝胶并用脱色液(10％乙醇，7％乙酸)洗涤持续最大2h。用Pharos X扫描仪进行成像。

-免疫荧光试验(IFA)

IFA：将细胞在盖玻片上生长直到75％汇合，并放置在6孔板中。用PBS洗涤细胞，然后用丙酮固定。再次用PBS洗涤细胞，然后用TBS孵育，然后用包含5％脱脂牛奶的PBS封闭。细胞然后在黑暗中用MIL-38、嵌合的MIL-38或西妥昔单抗孵育，然后用标记有FITC或Alexa488的山羊抗-小鼠或山羊抗-人抗体孵育。两种抗体在包含1％脱脂牛奶的PBS中制备。在第一抗体和第二抗体孵育之间进行利用PBS的洗涤。在第二孵育之后，用包含DAPI的PBS洗涤细胞，并且可视化用于绿色荧光(MIL-38阳性)。

-SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE：将样本与包含非还原SDS的样本缓冲液混合并加载至4-15％预制聚丙烯酰胺凝胶上(Criterion TGX；Biorad)。在Tris甘氨酸中在80V下运行10min，并在200V下运行另外的50min。

1.2结果

-蛋白质印迹

源自下列来源的MIL-38抗体的制剂一起被比较：

(i)来自ATCC的杂交瘤细胞(制剂1-O，“原始的”)；

(ii)从由申请人公司保持的杂交瘤细胞产生的抗体的两个单独的制剂(制剂37A和40A)；

观察到所有三种制剂的等价蛋白质印迹反应性(图1)。所有三种制剂提供了重链和轻链二者的双带，这表明非克隆群体。

-免疫荧光试验(IFA)

在多种细胞系上使用的不同抗体制剂(“1-原始的”(1-O)、40A和37A)提供了等价IFA反应性(图1)。

表1：各个细胞系上的不同抗体MIL-38制剂的IFA反应性

NB：-来自制品1-O(“1-原始的”)、40A和37A的抗体在一系列细胞系上用于IFA

-观察到所有三种制品的可比较的IFA反应性

-不同MIL-38抗体制剂的分析

源自制剂AM-1-AM-5(由AusMAb Pty Ltd生成)的MIL-38抗体制剂和内部MIL-38抗体制剂33A的大小和反应性通过SDS-PAGE(图2A)和蛋白质印迹(图2B)比较。

抗体的内部MIL-38制剂展示了重链和轻链二者的双带，这表明非克隆群体(参见图2A)。AusMAb MIL-38抗体制剂(AusMab 1、AusMab 3、AusMab 4、AusMab 5)显示了重链和轻链二者的单带。MIL-38抗体制剂33A显示了重链和轻链二者的双带，这表明非克隆群体。显著地，AusMAb 3带与AusMab 1、AusMab 4、AusMab 5和33A相比展示了较高的MW，这表明在来源1-O原种中存在两个不同的克隆群体。

AusMAb 3(AM-3)抗体也不与MIL-38抗原反应，而AusMab 1、AusMab 4、AusMab 5和制剂33A与其反应(图2B)。

-另外的内部MIL-38制剂的分析

SDS-PAGE电泳被用于分析从BLCA-38杂交瘤原种生成的各种其它MIL-38抗体制剂的和储存在内部的重链和轻链MW。重链和轻链的双带在所有制剂中被观察到(图3A)。相反，AusMab 4(AM-4)抗体制剂显示了重链和轻链二者的单带。

各种内部MIL-38抗体制剂与DU-145 MPEK提取物的蛋白质印迹反应性在制剂之间是一致的。AusMab 4(AM-4)与DU-145 MPEK提取物反应，而AusMab 3(AM-3)不与DU-145MPEK提取物反应(图3B)。

1.2讨论

从这些结果，明显的是来自内部和ATCC原种二者的MIL-38杂交瘤原种包含细胞的混合群体。克隆两个可辨认的群体(AusMab群体)给出不同分子量的两种抗体。这两种抗体种类中的一种不与MIL-38抗原反应，而另一种对从混合群体产生的MIL-38显示了等价反应性。

实施例2：另外的MIL-38抗体制剂的分析

2.1材料和方法

-MIL-38抗体的制备

使用源自AusMab 3(AM-3)或AusMab 4(AM-4)和AusMab 5(AM-5)的冷冻的杂交瘤细胞群体的制剂。在AM-3的衍生中使用的细胞被称为“Alfio II”。筛选之后，表明AM-3不与DU-145 MPEK提取物反应，较早的传代原种被研究以鉴定阳性克隆体。这些早期的传代细胞被用于衍生AM-4并被称为“Alfio I”。两个细胞原种被保持储存并且使得MIL-38抗体的内部产生。

对于原始的IIA、Alfio I和Alfio II的MIL-38分批产生，原种被快速解冻，然后在RPMI 1640培养基中再悬浮并且使其在37℃下利用5％CO₂生长24h。以顺序过程扩展、分裂并按比例增加细胞。在每个步骤中，将细胞再悬浮在新鲜培养基中并在37℃下利用5％CO₂孵育。在按比例增加之后，将细胞转移至无血清培养基并且生长直到开始死亡期。收获上清液以收集MIL-38抗体并且过滤杀菌。抗体上清液在-80℃下储存直到达到要求。使用Pierce蛋白G根据制造商的推荐纯化抗体。

-蛋白质印迹和Sypro凝胶

蛋白质印迹和Sypro凝胶的制备基本上根据在上面的实施例1(参见部分1.1)中列出的方法进行。

蛋白质印迹在下面的条件下进行：

4-12％Bis-Tris凝胶

封闭：过夜

蛋白质印迹方案：第一抗体1hr，10μg/膜片，

洗涤3x 10min，

第二抗体1hr，第二抗体1/2000山羊-小鼠HRP

细胞：针对DU-145和C3 MPEK提取物测试的

-免疫荧光试验

免疫荧光试验基本上根据在上面的实施例1(参见部分1.1)中列出的方法进行。

2.2结果

-蛋白质印迹

Alfio I、Alfio II、36A、AusMAb和“原始的IIA”(从ATCC HB11785的杂交瘤细胞制备的MIL-38制剂)对DU-145和C3 MPEK细胞提取物的蛋白质印迹反应性被测试。

Alfio II的蛋白质印迹反应性类似于制剂AM-3的蛋白质印迹反应性(图4A)。原始的IIA和Alfio I类似于制剂36A(内部双克隆)(图4A)。

-Sypro凝胶分析

在单独的重链部分中的双带没有先前观察到的清晰，而在单独的轻链部分中的双带可以清晰地被区分。原始的IIA、Alfio I和36A MIL-38抗体制剂的单独的轻链部分都包含两个带。相比之下，Alfio II的单独的轻链部分包含单一轻链种类，其具有较高的MW(即，类似AM-3 MIL-38抗体制剂)。注意到，与导致轻链种类的较宽带的其它抗体相比，更多的Alfio II抗体被加载至凝胶上。来自AM-4MIL-38抗体的单独的重链和轻链部分与双克隆或AM-3样形式清楚地区分(图4B)。

-免疫荧光试验

与蛋白质印迹结果一致，DU-145细胞的IFA分析显示了AM-4、Alfio I和原始的IIA给出了良好的IFA反应性，而Alfio II(在蛋白质印迹中与AM-3等价)显示了在IFA中无反应性(图5A)。任何制剂的无反应性利用阴性对照细胞系C3观察(图5B)。

2.3讨论

这些分析表明，Alfio I是双克隆MIL-38抗体群体，而Alfio II是AM-3样(单克隆)抗体群体，并进一步确认了MIL-38抗体制剂AM-4是单克隆抗体群体。

因此，明显的是双克隆MIL-38抗体群体比如Alfio I包含有区别的AM-3和AM-4单克隆抗体的混合物。

实施例3：MIL-38抗体群体的ELISA试验的比较

3.1材料和方法

将96孔板涂覆有在碳酸盐缓冲液pH 9.5中的MIL-38制品AM-3或AM-4(1μg/孔)，过夜。用包含5％脱脂牛奶的PBS吐温(0.1％)封闭板并洗涤。抗原(从NS0细胞产生的重组人GPC-1)在添加有150mM NaCl的Buffer II(20mM HEPES pH 7.5，0.5mM EDTA，0.5％TritonX-100)中稀释，并在37℃下孵育过夜。利用生物素化的AM-4进行检测，然后利用抗生物素蛋白HRP(1μg/mL)检测。TMB(Sigma目录号T0440)被加入并且利用停止液(Sigma S5814)停止。读取450nm的吸光度。结果在图6A中示出。

在第二实验中，将96孔板涂覆有在PBS pH 7.2中的MIL-38制品34A或AM-4(2.5μg/孔)，在室温下持续1h。板用在PBS吐温(0.05％)中的封闭剂酪氨酸(Thermo)在37℃下封闭1h。在洗涤之后，抗原(GPC-1NS0)在包含50mM两性离子缓冲剂和150mM NaCl的TBS pH 7.2中稀释，并在37℃下孵育1h。利用生物素化的AM-4克隆体1F5进行检测，然后用抗生物素蛋白HRP(1μg/mL)检测。加入TMB(Sigma目录号T0440)并用TMB停止液(Sigma S5814)停止。读取450nm的吸光度。结果在图6B中示出。

3.2.1结果

上面描述的第一ELISA使用MIL-38进行以捕捉重组NS0产生的GPC-1(即MIL-38抗原)。该实验比较用于捕捉的单克隆AM-3 MIL-38和单克隆AM-4MIL-38。AM-3在夹心ELISA试验中不起捕捉剂的功能(图6A)。

当将MIL-38(34A)的混合群体与从单克隆AM-4-1F5克隆体获得的群体比较时，上比描述的ELISA比较获得的ELISA信号。使用AM-4 1F5作为捕捉剂提供了与使用混合的34A抗体群体相比更高的ELISA信号(图6B)。

3.2.2讨论

夹心ELISA结果表明，仅AM-4样形式的单克隆MIL-38抗体在检测抗原作为捕捉试剂中具有实用性，并且包含单克隆群体的捕捉试剂与由混合群体组成的捕捉试剂相比提供了优越的ELISA信号。

实施例4：MIL-38抗体群体的序列分析

4.1材料和方法

-重和轻链测序(DNA)

进行三个不同的测序实验。第一个实验(编号224945)利用1-O制剂的双克隆杂交瘤细胞。第二个实验(编号449295-1)利用来自用于生成AM-4的Alfio I杂交瘤原种的细胞。第三个实验(编号449295-5)利用自用于生成AM-3的Alfio II杂交瘤原种的细胞。

对于测序实验224945(1-O)和449295-1(Alfio I)，总RNA从冷冻的杂交瘤细胞提取，并且cDNA由RNA合成。然后进行PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)和恒定区，其然后分别被克隆入标准克隆载体并被测序。

按照 Plus RNA Purification System的技术手册，从杂交瘤细胞分离总RNA。总RNA通过琼脂糖凝胶电泳分析。

按照SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA转录入cDNA。V_H、V_L、C_H和C_L的抗体片段根据GenScript的RACE的标准操作程序进行扩增。

使用标准分子克隆程序将扩增的抗体片段分别地克隆入标准克隆载体。

进行菌落PCR筛选以鉴定具有正确大小的插入片段的克隆体。具有正确大小的插入片段的不少于五个单一菌落的每个抗体片段被测序。

V_H和V_L质粒编码抗体的全长可变区与C_H1和C_L的一部分。C_H质粒编码C_H1的一部分与C_H2和C_H3的全长。C_L质粒编码C_L的一部分。为了得到全长恒定区或重/轻链，由VH和VL质粒编码的恒定区的部分和由C_H和C_L编码的恒定区的部分分别地通过PCR扩增，并且然后进行重叠延伸PCR以获得全长DNA。具有正确的V_H、V_L、C_H和C_L插入片段大小的五个单一菌落被发送用于测序。

测序实验449295-5(Alfio II)遭遇获得与预期的IgG1重链序列对应的序列的困难。获得两种RNA制剂。对于第一批细胞，寡脱氧胸苷酸引物和CDS III引物被用于反转录(RT)。使用IgG1和特异性引物通过PCR扩增V_H/C_H和部分小鼠β-肌动蛋白基因被扩增为阳性对照。正常的轻链带被容易地获得，同时在凝胶上仅可以观察的弱的V_H。具有正确的和插入片段大小的五个个别菌落被发送用于筛选。五个不同克隆体的和基因被发现为几乎相同。来自Alfio II杂交瘤的共有轻链序列在下面列举。一个非生产性的重链序列从八个随机测序的V_H阳性克隆体获得，如下面所显示。三种重链恒定区序列从十个随机测序的C_H阳性克隆体(一个IgG₁C_H，一个IgG_2aC_H和八个IgG_2bC_H)获得。为了避免潜在的类别转换的影响，进行使用IgM特异性引物的C_H的扩增，但是没有获得目标PCR产物。当使用重链FR1简并引物扩增全长重链(V_H-C_H)时，也不存在目标PCR产物。

在几次常识之后可以获得没有生产性的重链时，尝试从第二小瓶的Alfio II细胞分离重链序列。对于第二小的瓶细胞，寡脱氧胸苷酸引物被被最初地用于反转录。分别使用IgG1、IgG2b、IgM、IgA特异性引物和IgG简并引物扩增V_H，并且使用特异性引物扩增获得生产性的重链和非生产性的重链，其与前述结果相同。使用随机的6核苷酸引物(Random 6mers primer)的反转录也被尝试，但是没有成功。

总之，已经进行了分离轻链和重链序列的多次尝试。在对两批细胞进行不同的尝试之后，一致地获得一种重排的轻链序列。但是，仅弱的V_H目标PCR产物被观察到并且促需不导致任何一致的重链序列。

结果

-序列总结表

下面的表2提供了研究的抗体的重链和轻链核苷酸序列与蛋白序列的概述，指示各个内部区的位置。

-测序(DNA)

样本的分离的总RNA与DNA标记物(标记物III–TIANGEN，目录号：MD103)一起在1.5％琼脂糖/GelRed^TM凝胶上运行。

每个样本的4微升的PCR产物与DNA标记物(标记物III)一起在1.5％琼脂糖/GelRed^TM凝胶上运行。PCR产物被纯化并在–20℃下储存直到进一步使用。

五个不同克隆体的VH、VL、CH和CL基因几乎相同。下面列出的共有序列被确定是由单克隆杂交瘤群体(AM-4)产生的抗体的序列。

AM-4 MIL-38小鼠IgG₁重链DNA共有序列(SEQ ID NO:1)

小鼠重链编码的序列的个别区用交替的阴影/非阴影文本突出显示。位置：1-57＝前导序列；58-147＝构架区(HFR1)；148-162＝互补决定区(HCDR1)；163-204＝HFR2；205-255＝HCDR2；256-351＝HFR3；352-378＝HCDR3；379-411＝HFR4；412-1383＝恒定区(CH1-CH3)；703-741＝铰链区(下划线的)；1384-1386＝终止密码子。

AM-4 MIL-38小鼠κ轻链DNA共有序列(SEQ ID NO:2)

小鼠轻链编码的序列的个别区用交替的阴影/非阴影文本突出显示。位置：1-60＝前导序列；61-129＝构架区(LFR1)；130-162＝互补决定区(LCDR1)；163-207＝LFR2；208-228＝LCDR2；229-324＝LFR3；325-351＝LCDR3；352-381LFR4；382-702＝恒定区(CK)；703-705＝终止密码子。

上面的重和轻链AM-4MIL-38共有DNA序列翻译为下面的重链和轻链氨基酸序列：

AM-4 MIL-38小鼠IgG1重链氨基酸共有序列(SEQ ID NO:3)

小鼠IgG1重链序列的个别区在上面的氨基酸序列中指出。位置1-19＝前导序列；20-49＝构架区(HFR1)；50-54＝互补决定区1(HCD1)；55-68＝HFR2；69-85＝HCDR2；86-117＝HFR3；118-126＝HCDR3；127-137＝HFR4(也被称为连接区或J区)；138-461＝IgG1链恒定区(CH1–CH3)&终止密码子(*)。在上面的序列中，铰链区被加下划线。

AM-4共有MIL-38轻链氨基酸共有序列(SEQ ID NO:4)

轻链氨基酸序列的个别区如标记的指示：位置1-20＝前导序列；21-43＝构架区(LFR1)；44-54＝互补决定区1(LCDR1)；55-69＝LFR2；70-76＝LCDR2；77-108＝LFR3；109-117＝LCDR3；118-127＝LFR4；128-234＝κ恒定区(CK)&终止密码子(*)

测序实验224945(1-O)和449295-1(Alfio I)之间的共有序列的比较表明轻链和重链的序列是相同的(参见下面序列比对)。由于这些序列在双克隆群体(1-O)和AM-4-样Alfio I群体之间是一致的，它们如上面所述被称为“AM-4共有序列”。

AM-3共有序列

从AM-3样Alfio II细胞不能获得一致的重链序列。从测序实验449295-5(AlfioII)获得的轻链序列被一致地获得，并且与在上面的比对(参见上面的“1.轻链比对”)中显示的其它两个测序实验的序列相比，在构架区和互补决定区二者中显示了明显的区别。

AM-3 MIL-38κ轻链DNA共有序列(SEQ ID NO:5)

*轻链编码的序列的个别区用交替的阴影/非阴影文本突出显示。位置：1-72＝前导序列；73-141＝构架区(LFR1)；142-174＝互补决定区(LCDR1)；175-219＝LFR2；220-240＝LCDR2；241-336＝LFR3；337-363＝LCDR3；364-393＝LFR4；394-714＝恒定区(CK)；715-717＝终止密码子

AM-3 MIL-38轻链氨基酸共有序列(SEQ ID NO:6)

轻链氨基酸序列的个别区如标记的指示：位置1-24＝前导序列；25-47＝构架区(LFR1)；48-58＝互补决定区1(LCDR1)；59-73＝LFR2；74-80＝LCDR2；81-112＝LFR3；113-121＝LCDR3；122-131＝LFR4；132-238＝κ恒定区(CK)&终止密码子(*)

实施例5：嵌合的MIL-38抗体的制备和测试

5.1材料和方法

-嵌合抗体的制备

两个优化的cDNA序列被开发用于克隆目的。这些基于上面在实施例4中鉴定的AM-4重链和轻链共有序列。

第一优化的cDNA序列被用于生成小鼠-人嵌合的重链序列：

CHO密码子优化的cDNA序列#1–小鼠-人嵌合的重链1404bp(SEQ ID NO:7)

小鼠-人嵌合的重链编码的序列的个别区用交替的阴影/非阴影文本突出显示。位置：1-57＝前导序列；58-147＝构架区(FR1)；148-162＝互补决定区(CDR1)；163-204＝FR2；205-255＝CDR2；256-351＝FR3；352-378＝CDR3；379-411＝FR4；412-1401＝人恒定区(CH1-CH3)；706-750＝铰链区(加下划线的)；1402-1405＝中止密码子。

生成的第二优化的cDNA序列被用于生成小鼠-人嵌合抗体轻链序列：

CHO密码子优化的cDNA序列#2–小鼠-人嵌合的轻链705bp(SEQ ID NO:8)

小鼠-人嵌合的轻链编码的序列的个别区用交替的阴影/非阴影文本突出显示。位置：1-60＝前导序列；61-129＝构架区(LFR1)；130-162＝互补决定区(LCDR1)；163-207＝LFR2；208-228＝LCDR2；229-324＝LFR3；325-351＝LCDR3；352-381＝LFR4；382-702＝人恒定区(CK)；703-705＝终止密码子。

嵌合的MIL-38小鼠人CH1-CH3链使用无血清培养基在悬浮液CHO-3E7细胞中瞬时地表达，然后一步纯化。

CHO-3E7细胞在无血清FreeStyle^TM CHO表达培养基(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)中生长。细胞在锥形瓶(Corning Inc.,Acton,MA)中在37℃下利用5％CO₂在定轨摇床(VWR Scientific,Chester,PA)上维持。在转染的那天，DNA和PEI(Polysciences,Eppelheim,Germany)以最佳比率混合，然后被加入至具有准备好转染的细胞的烧瓶中。在第6天时收集到的上清液被用于进一步纯化。

细胞培养肉汤被离心，接着过滤。将过滤的上清液以3.0ml/min加载至5ml蛋白ACIP柱(GenScript，目录号L00433)上。在洗涤并用适合的缓冲液稀释之后，收集馏分并用1MTris-HCl，pH 9.0中和。纯化的蛋白通过SDS-PAGE、蛋白质印迹，通过使用分子量、产量和纯化措施的标准方案进行分析。

-嵌合的MIL-38抗体试验(载玻片免疫荧光)

MIL-38嵌合抗体与DU-145细胞一起被用于免疫荧光试验中。鼠科MIL-38制品33A被用作GPC-1抗原染色的阳性对照，而西妥昔单抗(靶向EGFR的嵌合抗体)被用作人IgG恒定区的染色的阳性对照。具有第一抗体的载玻片被用作阴性对照。除了第二抗体用Alexafluor 488标记和抗人抗体被用于染色嵌合的和西妥昔单抗样本之外，染色基本上如部分1.1中描述的进行。

-嵌合的MIL-38蛋白质印迹

嵌合的MIL-38和鼠科MIL-38针对DU-145和C3 MPEK提取物以及对重组体NS0产生的GPC-1抗原的反应性通过蛋白质印迹测试。蛋白质印迹通过鼠科MIL-38或嵌合的MIL-38探测。嵌合的MIL-38通过山羊抗人第二抗体，接着绵羊-抗-山羊HRP抗体检测。作为对照，鼠科MIL-38通过山羊抗小鼠第二抗体，接着绵羊-抗-山羊HRP抗体检测。当在等价条件下检测时，对于嵌合的MIL-38和鼠科MIL-38观察到等价反应性。图9A示出了用鼠科MIL-38，接着抗小鼠HRP第二抗体探测的蛋白质印迹。图9B示出了用嵌合的MIL-38，接着山羊抗人HRP第二抗体探测的蛋白质印迹。使用绵羊-抗-山羊HRP抗体检测复合物。图9C示出了用鼠科MIL-38，接着山羊抗人小鼠抗体探测的蛋白质印迹。使用绵羊-抗-小鼠HRP抗体检测复合物。

5.2结果

-嵌合抗体序列的表达

编码嵌合的MIL-38小鼠人CH1-CH3链的重链和轻链的重组质粒瞬时地被转染入悬浮液CHO-3E7细胞培养物中。通过蛋白A CIP 5ml柱接着缓冲液交换从细胞培养物上清液捕捉目标蛋白。纯化的蛋白通过在图7A和7B中显示的SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析。将3g样本加载至SDS-PAGE上并且将0.3g总蛋白质加载在蛋白质印迹上。用于蛋白质印迹的第一抗体是山羊抗-人IgG–HRP(GenScript，目录号A00166)。

-嵌合抗体序列

优化的cDNA序列#1(SEQ ID NO:7)被用于生成具有下列氨基酸序列的嵌合的MIL-38抗体重链：

嵌合的MIL-38小鼠人CH1-CH3链序列小鼠VH-人CH1-CH3链(重链)(SEQ ID NO:9)

小鼠-人嵌合的重链序列的个别区域在上面的氨基酸序列中指出：位置1-19＝前导序列；20-49＝构架区(HFR1)；50-54＝互补决定区1(HCD1)；55-68＝HFR2；69-85＝HCDR2；86-117＝HFR3；118-126＝HCDR3；127-137＝HFR4(也被称为连接区或J区)；138-467＝IgG1链恒定区(CH1-CH3)，&终止密码子(*)。铰链序列-人IgG1重链铰链序列在上面加下划线。

优化的cDNA序列#2(SEQ ID NO:8)被用于生成具有下列氨基酸序列的嵌合的MIL-38抗体轻链：

嵌合的MIL-38小鼠-人κ轻链序列：小鼠VK-人CK序列(SEQ ID NO:10)

小鼠-人嵌合的轻链氨基酸序列的个别区如标记的指出：位置1-20＝前导序列；21-43＝构架区(LFR1)；44-54＝互补决定区1(LCDR1)；55-69＝LFR2；70-76＝LCDR2；77-108＝LFR3；109-117＝LCDR3；118-127＝LFR4；128-234＝κ恒定区(CK)&终止密码子(*)

-嵌合的MIL-38抗体试验(载玻片免疫荧光)

图8A-D示出了细胞的明视野图像。图8E示出了33A阳性对照的染色。图8F示出了嵌合的MIL-38抗体的染色。图8G示出了使用商业嵌合的(小鼠/人)单克隆抗体(西妥昔单抗)阳性对照的染色，和图8H示出了无第一抗体阴性对照染色。在图8E、F和G中观察到强染色并且在图8H中没有观察到染色。这些结果证明嵌合的MIL-38抗体在IFA中成功地结合DU-145细胞，这表明亲代鼠科MIL-38抗体的结合特异性已经被维持。

-嵌合的MIL-38抗体试验(蛋白质印迹)

图9A示出了利用鼠科MIL-38，接着抗小鼠HRP第二抗体探测的蛋白质印迹。图9A中示出的蛋白质印迹的曝光时间是30秒。图9B示出了利用嵌合的MIL-38，接着山羊抗人第二抗体探测的蛋白质印迹。使用绵羊-抗-山羊HRP抗体检测复合物。图9B中示出的蛋白质印迹的曝光时间是30秒。图9C示出了利用鼠科MIL-38，接着山羊抗小鼠抗体探测的蛋白质印迹。使用绵羊-抗-山羊HRP抗体检测复合物。图9C中示出的蛋白质印迹的曝光时间是30分钟。

鼠科MIL-38抗小鼠识别DU-145溶菌产物和重组体GPC-1NS0中的抗原。在C3溶菌产物中没有观察到期望的反应性(图9A)。

三抗体检测方法(three-antibody detection method)被要求来测试具有DU-145和C3提取物以及重组体NS0GPC-1的嵌合的MIL-38的反应性(图9B)。使用三抗体检测方法的对照蛋白质印迹也利用鼠科MIL-38进行(图9C)。当使用三抗体检测方法时，与使用标准二抗体方法(standard two antibody method)相比，检测的灵敏度是远远不及的(对于图9A和图9C中示出的蛋白质印迹，用于图9A的曝光时间是30秒，而用于图9C的是30分钟)。

如图9B中所示，当使用该方法检测时，嵌合的MIL-38识别重组体GPC-1NS0抗原，并且显示了与鼠科MIL-38的比得上的反应性(比较图9B和图9C)。

5.3讨论

嵌合的MIL-38抗体在悬浮液CHO-3E7细胞中成功地表达并且纯化。基于SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，目标抗体的H和L链被检测为具有估计的分子量～55kDa(计算分子量～52kDa)和28kDa(计算分子量～26kDa)。

嵌合的MIL-38和鼠科亲代之间的等价反应性在IFA和蛋白质印迹中被观察到，这表明结合特异性已经在嵌合抗体的构建中被维持。

序列表

<110> 美侬米克国际有限公司

<120> 单克隆抗GPC-1抗体和其用途

<130> P107105C

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1386

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 1

atggcttggg tgtggacctt gctattcctg atggctgctg cccaaagtat ccaagcacag 60

atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120

tgcaaggctt ctggttatgc cttcacagac tattcaatga actgggtgaa gcaggctcca 180

ggaaagggtt taaggtggat gggctggata aacactgaga ctggtgagcc aacatataca 240

gatgacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctttttg 300

cagatcaaca acctcagaaa tgaagacacg gctacatatt tctgtgctag acactatgat 360

tacggggggt ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agccaaaacg 420

acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480

accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540

ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600

ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660

gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720

tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780

cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840

agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900

gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960

cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020

gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080

caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140

tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200

ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260

tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320

gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380

aaatga 1386

<210> 2

<211> 705

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 2

atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120

atcacatgtc gagcaagtgg gaatgttcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 180

ggaaaatctc ctcaactcct ggtctatact gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 240

aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaatag cctgcagcct 300

gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggagta atccgtggac gttcggtgga 360

ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600

ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705

<210> 3

<211> 461

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Arg Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg His Tyr Asp Tyr Gly Gly Phe Pro Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

130 135 140

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

145 150 155 160

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305 310 315 320

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

325 330 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

355 360 365

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

370 375 380

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385 390 395 400

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 4

<211> 234

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 4

Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn

35 40 45

Val His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Val Tyr Thr Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp

100 105 110

Ser Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

130 135 140

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

165 170 175

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

195 200 205

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

210 215 220

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 5

atgggcatca agatggagtc acagactcag gtctttgtat acatgttgct gtggttgtct 60

ggtgttgatg gagacattgt gatgacccag tctcaaaagt tcatgtccac atcaatagga 120

gacagggtca gcgtcacctg caaggccagt cagaatgtgg gttctcatgt agcctggttt 180

cagcagaaac cagggcaatc tcctaaagca ctgatttact cggcatccta ccggtacagc 240

ggagtcactg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcaac 300

aatgtgcagt ctgaagactt ggcagagtat ttctgtcagc aatataacag ttttccattc 360

acgttcggtt cggggacaaa gttggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717

<210> 6

<211> 238

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 6

Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu

1 5 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln

20 25 30

Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser His Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

65 70 75 80

Gly Val Thr Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys

100 105 110

Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 7

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体序列

<400> 7

atggcttggg tgtggacact gctgttcctg atggctgctg cccagagtat tcaggctcag 60

attcagctgg tccagagcgg tcccgagctg aagaagccag gcgagaccgt gaagatctcc 120

tgcaaggcca gcggctacgc tttcacagac tattctatga actgggtgaa gcaggcccca 180

ggcaagggcc tgaggtggat gggctggatc aataccgaga caggcgagcc cacctacaca 240

gacgatttca agggccggtt cgctttttcc ctggagacct ctgcctccac agcttttctg 300

cagatcaaca atctgagaaa cgaggacacc gccacatact tctgcgctag gcactacgat 360

tatggcggct ttccttattg gggccagggc accctggtga cagtgtccag cgcctctacc 420

aagggcccat ccgtgtttcc actggctccc tcttccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480

gctctgggct gtctggtgaa ggattacttc ccagagcccg tgacagtgtc ttggaactcc 540

ggcgccctga cctccggagt gcatacattt cccgctgtgc tgcagagctc tggcctgtac 600

agcctgtcca gcgtggtgac cgtgccttct tccagcctgg gcacccagac atatatctgc 660

aacgtgaatc acaagccatc caatacaaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgt 720

gataagaccc atacatgccc cccttgtcct gctccagagc tgctgggagg acctagcgtg 780

ttcctgtttc cacccaagcc taaggacacc ctgatgatct ctaggacccc cgaggtgaca 840

tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggat cctgaggtga agttcaactg gtacgtggat 900

ggcgtggagg tgcataatgc taagaccaag cctagggagg agcagtacaa cagcacctat 960

cgggtggtgt ctgtgctgac agtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtataag 1020

tgcaaggtga gcaataaggc cctgcccgct cctatcgaga agaccatctc taaggccaag 1080

ggccagcctc gggagccaca ggtgtacaca ctgcctccaa gcagagacga gctgaccaag 1140

aaccaggtgt ctctgacatg tctggtgaag ggcttctatc cttctgatat cgctgtggag 1200

tgggagtcca atggccagcc agagaacaat tacaagacca caccccctgt gctggacagc 1260

gatggctctt tctttctgta ttccaagctg accgtggata agagcaggtg gcagcagggc 1320

aacgtgttct cctgtagcgt gatgcacgag gcactgcaca accactacac tcagaaatcc 1380

ctgtccctgt cacctggcaa atga 1404

<210> 8

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体序列

<400> 8

atgagcgtgc tgacccaggt gctggccctg ctgctgctgt ggctgaccgg agcccgttgc 60

gacatccaga tgacccagtc ccctgcctct ctgtccgcca gcgtgggcga gaccgtgaca 120

atcacctgca gagcctctgg caacgtgcac aattacctgg cttggtatca gcagaagcag 180

ggcaagtccc cacagctgct ggtgtacaca gccaagaccc tggctgacgg cgtgcccagc 240

aggttctctg gctccggcag cggcacacag tatagcctga agatcaactc tctgcagcct 300

gaggattttg gcacctacta ttgccagcat ttctggtcta atccatggac atttggcggc 360

ggcaccaagc tggagatcaa gaggacagtg gccgctccct ccgtgttcat ctttccccct 420

agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgct tccgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 480

cctcgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctc tgcagtctgg caattcccag 540

gagagcgtga cagagcagga ctctaaggat tccacctata gcctgtccag cacactgacc 600

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtatgctt gtgaggtcac tcaccagggg 660

ctgtcaagtc cagtcacaaa gtccttcaat aggggggaat gctga 705

<210> 9

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体序列

<400> 9

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Arg Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Phe Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg His Tyr Asp Tyr Gly Gly Phe Pro Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 10

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗体序列

<400> 10

Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn

35 40 45

Val His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Val Tyr Thr Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp

100 105 110

Ser Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

Claims

1.一种分离的抗体群体，其包括：

第一抗体和/或其抗原结合片段，其中所述第一抗体包括：

(a)重链可变区，其包括：

(b)轻链可变区，其包括

并且其中所述抗体群体不包含包括下述轻链可变区的第二抗体，该轻链可变区包括：

2.根据权利要求1所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段对于在磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位具有结合特异性。

3.根据权利要求1或2所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段是同种型IgG1。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多聚体抗体和/或合成抗体中的任何一种或多种。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体群体，其中所述抗原结合片段是下列的任何一种或多种：单链可变片段(scFv)、可变结构域(Fv)片段、片段抗原结合(Fab)片段、F(ab)2片段、肽、或包含表位结合区的蛋白水解片段。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段进一步包括：

(a)由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个重链可变区FR(构架区)：SEQ ID NO:3的残基20-49、SEQ ID NO:3的残基55-68、SEQ ID NO:3的残基86-117、SEQ IDNO:3的残基127-137；和/或

(b)由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个轻链可变区FR(构架区)：SEQ ID NO:4的残基21-43、SEQ ID NO:4的残基55-69、SEQ ID NO:4的残基77-108、SEQ IDNO:4的残基118-127。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段进一步包括下列的一个或多个：

(a)由SEQ ID NO:3的138-461位限定的重链恒定结构域序列；

(b)由SEQ ID NO:4的128-234位限定的轻链恒定结构域序列；

(c)铰链区。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体群体，其中所述第一抗体包括由SEQ ID NO:3的20-461位限定的重链序列和由SEQ ID NO:4的21-234位限定的轻链序列或由二者组成。

9.能够产生根据权利要求1-8中任一项所述的抗体群体的杂交瘤细胞。

10.一种细胞培养物，其包括单一种类的能够产生根据权利要求1-8中任一项所述的抗体群体的杂交瘤细胞，其中所述抗体群体包含仅一个种类的抗体和/或其抗原结合片段。

11.根据权利要求9所述的杂交瘤细胞，或者根据权利要求10所述的细胞培养物，其中所述杂交瘤细胞在Cellbank Australia中在登录号CBA20140026下保藏。

12.一种细胞培养物，其包括多个种类的杂交瘤细胞，其中：

(a)所述细胞培养物包括根据权利要求9或权利要求11所述的杂交瘤细胞；和

(b)所述细胞培养物不包括产生包括下述轻链可变区的抗体的杂交瘤细胞，该轻链可变区包括下列的任何一种或多种：

13.根据权利要求12所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物不包括产生下述抗体的杂交瘤细胞，该抗体包括由选自下列的任何一个或多个的序列限定的一个或多个轻链可变区FR(构架区)：SEQ ID NO:6的残基25-47、SEQ ID NO:6的残基59-73、SEQ ID NO:6的残基81-112、SEQ ID NO:6的残基122-131。

14.一种组合物，其包括根据权利要求1-8中任一项所述的抗体群体，其中所述抗体群体仅包含一个种类的抗体和/或其抗原结合片段。

15.一种组合物，其包括根据权利要求1-8中任一项所述的抗体群体，其中所述抗体群体包含多个种类的抗体和/或其抗原结合片段。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述多个种类的抗体和/或其抗原结合片段每个对磷脂酰肌醇聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)中存在的表位具有结合特异性。

17.一种核酸分子，其编码根据权利要求1-8中任一项所述的第一抗体或其抗原结合片段的至少一个。

18.根据权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括在SEQ ID NO:1中限定的序列或由其组成。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括在SEQ IDNO:2中限定的序列或由其组成。

20.一种载体，其包括根据权利要求17-19中任一项所述的核酸分子。

21.一种宿主细胞，其包括根据权利要求20所述的载体。

22.一种用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述方法包括在培养基中在适合的条件下培养根据权利要求9或权利要求11所述的杂交瘤细胞，或者根据权利要求21所述的宿主细胞，从而产生所述抗体或其抗原结合片段。

23.一种用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述方法包括在适合的条件下培养根据权利要求10-13中任一项所述的细胞培养物，从而产生所述抗体或其抗原结合片段。

24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，进一步包括从所述培养物中分离所述抗体或其抗原结合片段。

25.从根据权利要求22-24中任一项所述的方法获得或可获得的抗体或其抗原结合片段。

26.从混合的杂交瘤群体中获得根据权利要求9或权利要求11所述的杂交瘤细胞的方法，所述方法包括从所述混合的杂交瘤群体中分离所述杂交瘤细胞的至少一部分。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述分离包括克隆所述混合的杂交瘤群体的个别杂交瘤细胞，并确定克隆的后代能够产生根据权利要求1-8中任一项所述的抗体群体。

28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中所述混合的杂交瘤群体在美国组织型培养物保藏所(ATCC)中在登录号HB11785下保藏。

29.根据权利要求4所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段是嵌合的。

30.根据权利要求4或权利要求29所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其抗原结合片段是嵌合抗体，其包括：

31.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体群体，其中所述第一抗体和/或其片段包括可检测的标记。

32.根据权利要求31所述的抗体群体，其中所述可检测的标记是荧光标记、放射性标记、生物素或抗生物素蛋白中的任何一种或多种。