CN114685656A - 抗SIRPα单克隆抗体 - Google Patents

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CN114685656A CN202011625773.0A CN202011625773A CN114685656A CN 114685656 A CN114685656 A CN 114685656A CN 202011625773 A CN202011625773 A CN 202011625773A CN 114685656 A CN114685656 A CN 114685656A
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以高亲和力与人sirpα结合的单克隆抗体或抗原结合片段，本发明还提供了编码本发明抗体或抗原结合片段的氨基酸序列和核苷酸序列；本发明提供的抗体能够阻断sirpα与CD47之间的相互作用而不影响CD47与sirpg之间相互作用。

Description

抗SIRPα单克隆抗体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗SIRPα单克隆抗体、制备方法及其应用。
背景技术
信号调节蛋白α或SIRPα(也称为SIRPα/CD172a或SHPS-1)是一种细胞表面糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，其主要在髓样细胞谱系(包括MΦ，DC，粒细胞等)内表达，且特征在于胞外区含有两个近膜IgC域和一个远端IgV域；在胞内的尾部，具有2个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。一旦受体交联，酪氨酸磷酸化的ITIM位点募集并活化SHP磷酸酶以负调控细胞功能，诸如吞噬作用或炎性细胞因子释放。Axel Ullrich等在US6541615中描述了人类SIRPα的克隆与表达。Sarfati等在WO1999/040940中以及Van den Berg等在WO00/66159中暗示了SIRPα和CD47参与了癌症及其他疾病的病原学，并且Van den Berg等还提出了SIRPα抑制剂的治疗应用。SIRPα和CD47之间的相互作用在调节巨噬细胞对白血病细胞和白血病干细胞(LSC)的吞噬作用中起到十分重要的作用。在University HealthNetwork的WO2013/056352和Eberhard's US6913894以及其它研究机构也提出抗SIRPα抗体可以有效抑制SIRPα和CD47之间的相互作用，发挥抗肿瘤作用。
CD47作为SIRPα的主要配体，且其在大多数细胞类型(包括内皮/上皮细胞，白细胞，和红细胞)中的广泛表达提示其介导“不要吃我”信号以保护健康细胞免受吞噬细胞依赖性清除。为了支持此观点，数项研究显示将来自敲除CD47的小鼠的红细胞或白细胞过继转移至野生型接受者中导致CD47缺陷的细胞的快速清除。相反地，对接受人造血细胞的多个品系的免疫受损小鼠的定位遗传分析将NOD小鼠中的Sirpα等位基因鉴定为异种移植模型中成功植入的起因。随后的研究证明了仅在NOD小鼠中表达的SIRPα的等位基因变体保留了结合在人造血干细胞上表达的人CD47的能力，从而抑制巨噬细胞依赖性移植排斥。
SIRPα和CD47的受调控的表达确立了稳态控制机制以调节吞噬细胞活性。例如，凋亡细胞下调CD47的表达以促进定居巨噬细胞进行的吞噬而活细胞保持不受伤害。同样地，炎性刺激物(诸如LPS)减少MΦ和DC中的SIRPα表达以加强它们在炎症期间的活化。然而，如在癌症中所见，SIRPα和CD47表达的失调促成免疫相关疾病。相对于非癌性细胞，数种肿瘤显著增加CD47的表达，以便逃脱在正常情况下消除恶性细胞的免疫监视机制。临床前研究揭示同基因肿瘤模型(诸如B16F10黑色素瘤)中CD47的基因敲低足以抑制具有免疫能力的小鼠中的肿瘤生长。对移植至免疫受损的小鼠中的敲除CD47的人癌细胞系观察到类似的结果。或者，破坏SIRPα-CD47相互作用的生物药剂(诸如抗CD47抗体)也增强了小鼠模型中的肿瘤清除。当与商业性抗肿瘤抗原抗体(诸如曲妥珠单抗(trastuzumab)或利妥昔单抗(rituximab))组合时，相较于标准单一疗法，抗CD47抗体促进抗肿瘤应答的协同增加。
然而，鉴于CD47的普遍表达，抗CD47抗体引起相关的血液毒性(贫血或者血小板减少症)，这限制了其治疗功效。
此外，CD47也与sirp家族的另一成员sirp-γ(也成为sirpg、sirpγ、CD172g或sirpβ2)结合，sirp-γ存在于人T细胞表面上而不存在于人骨髓细胞上。SIRPg是近3500万年前古代世界灵长类动物中的sirp基因复制的结果，并在人T淋巴细胞上以限制性方式进行表达，与骨髓细胞上的SIRPα表达相反。小鼠中不存在sirpg。已经表明，SIRPα-CD47相互作用介导细胞-细胞黏附，增强超抗原依赖性T细胞介导的增殖，以及共刺激T细胞活化。
由于SIRPα和sirpg之间(特别是在与CD47相互作用的区域)的序列高度相似性，现有已公开的抗SIRPα抗体也结合sirpg并在人体中具有不良作用，例如抑制T细胞增殖和降低免疫应答。因此本领域仍然需要新的高亲和力且能够阻断SIRPα与CD47之间的相互作用而不影响CD47与sirpg之间相互作用的抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于治疗的抗SIRPα单克隆抗体，这种抗体能够阻断SIRPα与CD47之间的相互作用而不影响sirpg与CD47之间的结合；同时还提供了制备本发明抗SIRPα单克隆抗体的制备方法及应用。
本发明的第一个方面，提供了一种能够结合SIRPα的鼠源单克隆抗体。所述抗体是一种与SIRPα具有高亲和力而与SIRPg具有低亲和力的抗SIRPα单克隆抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含含LCDR1、LCDR2、LCDR3的抗体轻链可变区和含HCDR1、HCDR2、HCDR3的抗体重链可变区。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包含选自氨基酸序列为SEQ IN NO：1-21或任何所述序列之变体的重链CDR；和/或选自氨基酸序列为SEQ IN NO：22-39或任何所述序列之变体的轻链CDR。
其中，HCDR1氨基酸序列选自SEQ IN NO：1、4、7、10、13、16或SEQ IN NO：19；
HCDR2氨基酸序列选自SEQ IN NO：2、5、8、11、14、17或SEQ IN NO：20；
HCDR3氨基酸序列选自SEQ IN NO：3、6、9、12、15、18或SEQ IN NO：21；
其中，LCDR1氨基酸序列选自SEQ IN NO：22、25、28、30、33、36或SEQ IN NO：38；
LCDR2氨基酸序列选自SEQ IN NO：23、26、29、31、或SEQ IN NO：34；
LCDR3氨基酸序列选自SEQ IN NO：24、27、32、35、37或SEQ IN NO：39。
在一些优选实施例中，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一组：
(1)氨基酸序列为SEQ IN NO：1的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：2的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：3的HCDR3。
(2)氨基酸序列为SEQ IN NO：4的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：5的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：6的HCDR3。
(3)氨基酸序列为SEQ IN NO：16的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：17的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：18的HCDR3。
(4)氨基酸序列为SEQ IN NO：7的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：8的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：9的HCDR3。
(5)氨基酸序列为SEQ IN NO：13的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：14的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：15的HCDR3。
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：10的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：11的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：12的HCDR3。
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：19的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：20的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：21的HCDR3。
进一步优选地，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一组：
(4)氨基酸序列为SEQ IN NO：7的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：8的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：9的HCDR3。
(5)氨基酸序列为SEQ IN NO：13的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：14的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：15的HCDR3。
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：10的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：11的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：12的HCDR3。
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：19的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：20的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：21的HCDR3。
更进一步优选地，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一组：
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：10的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：11的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：12的HCDR3。
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：19的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：20的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：21的HCDR3。
上述(1)-(7)分别为36D6、36G4、55G4、39D8、52B3、40F3、57B10的重链CDRs。
在一些优选实施例中，所述抗体或抗原结合片段的LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一组：
(1)氨基酸序列为SEQ IN NO：22的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：23的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：24的LCDR3。
(2)氨基酸序列为SEQ IN NO：25的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：26的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3。
(3)氨基酸序列为SEQ IN NO：36的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：26的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：37的LCDR3。
(4)氨基酸序列为SEQ IN NO：28的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：29的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3。
(5)氨基酸序列为SEQ IN NO：33的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：35的LCDR3。
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：30的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：31的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：32的LCDR3；
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：38的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：39的LCDR3。
进一步优选地，所述抗体或抗原结合片段的LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一组：
(4)氨基酸序列为SEQ IN NO：28的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：29的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3。
(5)氨基酸序列为SEQ IN NO：33的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：35的LCDR3。
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：30的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：31的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：32的LCDR3；
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：38的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：39的LCDR3。
更进一步优选地，所述抗体或抗原结合片段的LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一组：
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：30的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：31的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：32的LCDR3；
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：38的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：39的LCDR3。
上述(1)-(7)分别为36D6、36G4、55G4、39D8、52B3、40F3、57B10的轻链CDRs。
在一些优选实施中，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一组：
(1)氨基酸序列为SEQ IN NO：1的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：2的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：3的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：22的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：23的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：24的LCDR3。
(2)氨基酸序列为SEQ IN NO：4的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：5的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：6的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：25的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：26的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3。
(3)氨基酸序列为SEQ IN NO：16的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：17的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：18的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：36的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：26的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：37的LCDR3。
(4)氨基酸序列为SEQ IN NO：7的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：8的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：9的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：28的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：29的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3。
(5)氨基酸序列为SEQ IN NO：13的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：14的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：15的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：33的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：35的LCDR3。
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：10的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：11的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：12的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：30的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：31的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：32的LCDR3。
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：19的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：20的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：21的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：38的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：39的LCDR3。
进一步优选地，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一组：
(4)氨基酸序列为SEQ IN NO：7的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：8的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：9的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：28的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：29的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3。
(5)氨基酸序列为SEQ IN NO：13的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：14的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：15的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：33的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：35的LCDR3。
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：10的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：11的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：12的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：30的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：31的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：32的LCDR3。
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：19的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：20的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：21的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：38的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：39的LCDR3。
更进一步优选地，所述抗体或抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列选自以下氨基酸序列中的一组：
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：10的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：11的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：12的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：30的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：31的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：32的LCDR3。
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：19的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：20的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：21的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：38的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：39的LCDR3。
上述(1)-(7)分别为36D6、36G4、55G4、39D8、52B3、40F3、57B10的重轻链CDRs。
本发明的第二方面，提供了一种抗体或抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区氨基酸序列。
在一些优选实施例中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区氨基酸序列选自SEQ IN NO：40、41、42、43、44、45、46或任何所述序列之变体的重链可变区；和/或所述轻链可变区氨基酸序列选自SEQ IN NO：47、48、49、50、51、52、53或任何所述序列之变体的轻链可变区。
优选地，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区选自以下氨基酸序列中的一组：
(1)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：40，或与SEQ IN NO：40的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：47，或与SEQ IN NO：47的轻链可变区序列具有至少85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(2)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：41，或与SEQ IN NO：41的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：48，或与SEQ IN NO：48的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(3)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：45，或与SEQ IN NO：45的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：52，或与SEQ IN NO：52的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(4)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：42，或与SEQ IN NO：42的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：49，或与SEQ IN NO：49的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(5)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：44，或与SEQ IN NO：44的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：51，或与SEQ IN NO：51的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(6)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：43，或与SEQ IN NO：43的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：50，或与SEQ IN NO：50的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(7)所述重链氨基酸序列为SEQ IN NO：46，或与SEQ IN NO：46的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：53或与SEQ IN NO：53的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
进一步优选地，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区选自以下氨基酸序列中的一组：
(4)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：42，或与SEQ IN NO：42的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：49，或与SEQ IN NO：49的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(5)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：44，或与SEQ IN NO：44的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：51，或与SEQ IN NO：51的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(6)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：43，或与SEQ IN NO：43的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：50，或与SEQ IN NO：50的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(7)所述重链氨基酸序列为SEQ IN NO：46，或与SEQ IN NO：46的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：53或与SEQ IN NO：53的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
更进一步优选地，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区选自以下氨基酸序列中的一组：
(6)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：43，或与SEQ IN NO：43的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：50，或与SEQ IN NO：50的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
(7)所述重链氨基酸序列为SEQ IN NO：46，或与SEQ IN NO：46的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：53或与SEQ IN NO：53的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
上述(1)-(7)分别为36D6、36G4、55G4、39D8、52B3、40F3、57B10的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列。
本发明的第三个方面，提供了一种分离的多核苷酸，根据本发明的实施例，所描述的多核苷酸编码本发明抗体重链可变区氨基酸序列，具有下列之一所示的核苷酸序列：
(1)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：54。
(2)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：55。
(3)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：59。
(4)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：56。
(5)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：58。
(6)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：57。
(7)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：60。
进一步优选地，所述多核苷酸编码本发明抗体重链可变区氨基酸序列，具有下列之一所示的核苷酸序列：
(4)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：56。
(5)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：58。
(6)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：57。
(7)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：60。
更进一步优选地，所述多核苷酸编码本发明抗体重链可变区氨基酸序列，具有下列之一所示的核苷酸序列：
(6)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：57。
(7)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：60；
上述(1)-(7)分别为编码36D6、36G4、55G4、39D8、52B3、40F3、57B10抗体重链可变区的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，前面所描述的多核苷酸编码本发明抗体轻链可变区氨基酸序列，具有下列之一所示的核苷酸序列：
(1)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：61。
(2)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：62。
(3)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：66。
(4)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：63。
(5)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：65。
(6)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：64。
(7)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：67。
进一步优选地，所述多核苷酸编码本发明抗体轻链可变区氨基酸序列，具有下列之一所示的核苷酸序列：
(4)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：63。
(5)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：65。
(6)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：64。
(7)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：67。
更进一步优选地，所述多核苷酸编码本发明抗体轻链可变区氨基酸序列，具有下列之一所示的核苷酸序列：
(6)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：64。
(7)该多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：67。
上述(1)-(7)分别为编码36D6、36G4、55G4、39D8、52B3、40F3、57B10抗体轻链可变区的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，前面所描述的多核苷酸编码本发明所述抗体或其抗原结合片段，具有下列之一所示的核苷酸序列：
(1)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：54；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：61。
(2)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：55；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：62。
(3)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：59；并且编码轻链可变区SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQIN NO：66。
(4)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：56；并且多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：63。
(5)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：58；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：65。
(6)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：57；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：64。
(7)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：60；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：67。
进一步优选地，该多核苷酸编码本发明所述抗体或其抗原结合片段，具有下列之一所示的核苷酸序列：
(4)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：56；并且多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：63。
(5)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：58；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：65。
(6)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：57；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：64。
(7)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：60；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：67。
更进一步优选地，该多核苷酸编码本发明所述抗体或其抗原结合片段，具有下列之一所示的核苷酸序列：
(6)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：57；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：64。
(7)该多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：60；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：67。
上述(1)-(7)分别为编码36D6、36G4、55G4、39D8、52B3、40F3、57B10抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。
本发明的第四个方面，提供了制备抗SIRPα抗体的方法，单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来获得。例如，单克隆抗体可采用经典的杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256:495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(US4816567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nather，352:624-628(1991)和Marks等，Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。其中一种制备方法可包括如下步骤：
(1)制备免疫原，免疫动物。从Uniprot上查找SIRPα的氨基酸序列(Uniprot：P78324)，选取31-373位氨基酸，通过连接肽3个(GGGGS)将SIRPα胞外区与小鼠重链恒定区的连接，序列由金斯瑞生物科技有限公司进行序列优化和DNA合成，构建真核表达载体，转染CHO-S细胞，表达并纯化该融合蛋白，作为抗原，免疫小鼠。
(2)采用经典的杂交瘤技术制备SIRPα单克隆抗体。
(3)利用间接ELISA方法以及交叉流式细胞技术筛选与CHO-hSIRPα和CHO-cyno-SIRPα交叉结合的抗体。
(4)采用亲和层析纯化抗体，SDS-PAGE测定抗体的分子量和纯度，Biacore T200测定纯化抗体的亲和力。
本发明确定抗SIRPα抗体重链可变区和轻链可变区的方法为，根据抗体基因恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体SIRPα重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pMD19-T(simple)载体中，转化大肠杆菌E.coli DH5α后挑取阳性克隆，抽提质粒后测序，确定了SIRPα单克隆抗体的重链和轻链可变区序列。
在获得编码本发明单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后，还可通过以下方法来制备本发明的抗SIRPα单克隆抗体。具体操作如下：
首先，提供含有编码本发明抗SIRPα单克隆抗体的核苷酸序列的表达载体。
编码本发明抗SIRPα抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一阅读框内。
本发明中可用的表达载体是本领域技术人员公知的、各种市售的表达载体。包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是CHO细胞。
用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电击法、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。
然后，在适合本发明抗SIRPα单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的本发明抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。单克隆抗体的结合亲和力可用如SPR等分析方法来测定。
在一些实施例中，本发明还可采用另一方法以制备所述抗体，该方法包括：
(1)构建含有第三方面所述DNA分子的表达载体：用EcoR I和Not I限制性酶酶切表达载体pGS，将编码本发明抗体序列与酶切的表达载体进行酶连，构建表达载体。
(2)用步骤(1)所述的表达载体转化宿主细胞：将步骤(1)构建的表达载体分别转化大肠杆菌DH5a菌种，扩增培养，收集细胞，提取质粒，采用电转化法将上述质粒转染CHO细胞。
(3)培养步骤(2)所得的宿主细胞：将转染后的CHO细胞在MTX选择培养基上进行克隆筛选，采用有限稀释法培养，挑取单克隆细胞系在CD FortiCHO培养基中进行培养。
(4)分离、纯化、检测获得的所述单克隆抗体。
本发明的优点和有益效果：
本发明的抗SIRPα单克隆抗体纯化后抗体纯度在95％以上；抗体亲和力达10-11M，阻断效力强，抗SIRPα单克隆抗体能够以高亲和力与SIRPα结合阻断SIRPα与CD47之间的相互作用而不与SIRPg结合，同时不影响CD47与sirpg的结合。本发明为构建具有良好药用价值的抗人SIRPα嵌合抗体和人源化抗体等打下良好的基础。
术语
如本文所用，除非另有明确规定，否则单数形式“一个/一种”和“该/所述”包括复数指示物。因此，例如，关于“抗体”任选地包括两个或多个此类分子等的组合。
如本文所用的术语“约”是指此技术领域中的技术人员容易知晓的各自值的通常误差范围。
术语“抗体”在本文中以最宽的含义使用且包含多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自实质性同种的抗体群的抗体，即，包含该群的个别抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体外(例如，含有自然发生的突变的或在产生单克隆抗体制剂期间出现的变体抗体)，此类变体通常以少量存在。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇的(表位)的不同抗体)相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示如获自实质性同种的抗体群的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，依照本发明所用的单克隆抗体可通过多种技术制造，该技术包括但不限于杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256:495(1975)首先提出)制备，重组DNA方法(US4816567)制备，例如所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。例如噬菌体展示方法Clackson等，Nather，352:624-628(1991)和Marks等，Mol.Biol.,222:581-597(1991)，和利用含有全部和部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。
本文所用的术语“抗体”和“单克隆抗体”是由相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸在轻链和重链的可变区之间形成界面。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab'，Fab'-SH，F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，诸如scFv分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“结合与参考抗体相同的表位的抗体”或“具有与参考抗体相同的结合特异性的抗体”是指在竞争测定法中阻断参考抗体与其抗原的结合率达50％或更高的抗体，且相反地，参考抗体在竞争测定法中阻断该抗体与其抗原结合率达50％或更高。结合相同表位的抗体可结合与参考抗体相同的表位，或可结合该表位的一部分。示例性竞争测定法在本文中提供。
如本文所用的，“可变区”是指包含框架1，CDR1，框架2，CDR2，和框架3(包括CDR3和框架4)的区段的抗体可变区域，所述的区段由于在B细胞分化期间重链和轻链V-区基因的重排添加至V区段。
如本文所用的，“互补决定区(CDR)”是指每条链中的三种高可变区(HVR)，该三种高可变区打断由轻和重链可变区建立的四个“框架区”。CDR是结合抗原的表位的主要贡献者。将每条链的CDR称为CDR1，CDR2，和CDR3，依次从N-端开始编号，且通过特定CDR所位于的链鉴定。因此，VH CDR3位于发现它的抗体的重链的可变域中，而VL CDR1是来自发现它的抗体的轻链的可变域的CDR1。术语“CDR”可与“HVR”互换地使用。如本文所用，重链互补决定区或重链可变区CDR分别标记为HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链互补决定区或轻链可变区CDR分别标记为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
CDR和框架区的氨基酸序列可使用本领域中的多种已知定义确定，例如，Kabat，Chothia，国际免疫遗传学数据库(IMGT)，和AbM(参见，例如，Johnson等,supra；Chothia和Lesk,1987,Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins.J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia C.等,1989,Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions.Nature342:877-883；Chothia C.等,1992,structural repertoire of the human VH segments,J.Mol.Biol.227:799-817；AlLazikani等,J.Mol.Biol.1997,273(4))。抗原组合位点的定义也在下列中描述：Ruiz等,IMGT,国际免疫遗传学数据库,NucleicAcids Res.28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.IMGT,国际免疫遗传学数据库,Nucleic Acids Res.Jan 1；29(1):207-9(2001)；MacCallum等,Antibody-antigen interactions:Contact analysis andbinding sitetopography,J.Mol.Biol.262(5):732-745(1996)；和Martin等,Proc.NatlAcad.Sci.USA86:9268-9272(1989)；Martin等,Methods Enzymol.203:121-153(1991)；Pedersen等,Immunomethods 1:126(1992)；和Rees等,In Sternberg M.J.E.编,ProteinStructure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172,1996)。关于如通过Kabat编号确定的CDR是基于例如Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institute ofHealth,Bethesda,MD(1991))。Chothia CDR是如通过Chothia(参见例如Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))定义而确定的。
“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代。由于自然的、偶然的或有意的突变，该后代可以不必与原始亲本细胞(在形态学上或在基因组或总DNA互补性上)完全相同。宿主细胞包括在体内用本发明的载体转染的细胞。“宿主细胞”可以是指原核细胞，如细菌细胞，大肠杆菌或枯草菌等；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。“表达载体”是在引入合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常表示包含能够用来产生所需表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。
术语“平衡解离常数”缩写为(KD)，是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，是解离速率常数(kd)除以结合速率常数(Ka，时间-1M-1)得到的比值。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原。平衡解离常数可使用本领域技术人员知悉的方法测定。
当提及蛋白或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”抗原或靶标或“特异性(或选择性)免疫反应”是指结合反应，由此抗体结合感兴趣的抗原或靶标。在本发明的背景中，该抗体典型地以比其对其它抗原的亲和力大至少100倍的KD结合SIRPα。在一些实施方案中，该抗体以比其对其它抗原的亲和力大至少100倍的KD结合人SIRPα。在一些实施方案中，该抗体结合小鼠和人SIRPα。因此，如本文所用的“特异性结合”或“选择性结合”不一定需要(即使其可包括)专一性结合。特异性结合靶标的抗体可具有的结合常数为至少约10-3M或10- 4M，有时为约10-5M或10-6M，在其他情况中为约10-6M或10-7M，约10-8M至10-9M，或约10-10M至10-11M或更优。多种形式的免疫测定法可用于选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白特异性免疫反应的单克隆抗体。参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratory Manual，Cold SpringHarborPublications，NewYork，用于描述可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定法形式和条件。
附图说明
图1抗SIRPα抗体的SDS-PAGE测定。
从右向左依次为抗体蛋白Marker、36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4和57B10
图2a抗SIRPα抗体36D6、36G4、40F3、商业化抗体SE5A5与hu-SIRPα-his的结合活性测定。
图2b抗SIRPα抗体39D8、52B3、55G4、57B10、商业化抗体SE5A5与hu-SIRPα-his的结合活性测定。
图3a抗SIRPα抗体39D8、40F3、55G4、mIgG1、商业化抗体SE5A5与CD47竞争结合SIRPα的测定。
图3b抗SIRPα抗体52B3、36D6、36G4、57B10、mIgG1、商业化抗体SE5A5与CD47竞争结合SIRPα的测定。
图4 ELISA对抗SIRPα抗体与SIRPg结合的测定。
图5 SIRPα抗体是否影响CD47与sirpg的结合测定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释与说明，应当理解为以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的保护范围。
以下各实施例中，实验所用物料均可购买，也可参照现有公开的技术制备；未标明来源和规格的均为市售可得；未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
以下实施例中，商业抗体用作比较。第一种抗体是能够识别sirpa/β抗体，并命名为SE5A5(BiolegengdBLE323802)，第二种是小鼠抗人sirpa抗体，命名为Kwar23(CreativeBiolabs)。第三种是小鼠单克隆特异性抗sirpg抗体，命名为LSB2-20(Santa Cruz sc-53604)。
实施例1抗SIRPα抗体的获得
(1)制备抗原，具体步骤如下：
a、获得目的基因
在该实施例中，从Uniprot上查找SIRPα的蛋白序列(Uniprot：P78324)选取31-373位氨基酸，通过连接肽3个(GGGGS)将SIRPα胞外区与小鼠重链恒定区的连接，序列由金斯瑞生物科技有限公司进行序列优化和DNA合成。将优化合成的PUC-57-SIRPa-mFC质粒和PGS质粒用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。
b、构建重组真核表达载体
将序列及载体PGS均用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切，并回收目的片段，用T4连接酶连接，构建PGS-SIRPα-mFc载体。
c、获得含重组表达质粒的菌株及获得重组表达质粒
将步骤b获得的重组质粒转化E.coli DH5α感受态，用含有氨苄青霉素的固体LB培养基筛选，挑取单克隆，培养并小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的序列。将测序正确的重组质粒大量提取，保存部分质粒及菌株。
d、获得表达重组蛋白的细胞库
提取质粒PGS-SIRPα-mFc，用限制性内切酶PvuI进行线性化，转染CHOS细胞，并用MSX进行加压筛选，得到表达SIRPα-mFc的细胞库。
(2)蛋白表达及纯化，具体步骤如下：
扩大培养该细胞库2L，维持MSX加压，37℃，100rpm，8％CO2摇床培养10天，4500rpm离心5min，收集细胞培养上清，采用ProteinA亲和层析法纯化SIRPα-mFc蛋白，作为抗原。
(3)单抗的制备和纯化，具体步骤如下：
a、免疫动物
选用6只6-8周龄雌性Balb/c小鼠，进行三次免疫注射，其中一只不免疫，作对照。
首次免疫：SIRPα-mFc抗原蛋白，用PBS稀释，与完全弗式佐剂1：1混合、乳化，100μg/只，皮下注射免疫。
二次免疫：首次免疫10～14天后进行二次免疫，SIRPα-mFc抗原蛋白，用PBS稀释，与不完全弗式佐剂1：1混合、乳化，150μg/只，皮下注射免疫。
二次免疫后第4天，断尾采血ELISA测抗体滴度。
三次免疫：二次免疫14天后进行二次免疫，SIRPα-mFc抗原蛋白，用PBS稀释，与不完全弗式佐剂1：1混合、乳化，150μg/只，皮下注射免疫。
三次免疫后第3天，断尾采血ELISA测抗体滴度。选择效价最高的用于细胞融合。
加强免疫：细胞融合前两天，小鼠腹腔直接注射SIRPα-mFc抗原蛋白，50μg/只，两天后，取小鼠脾脏进行细胞融合。
b、小鼠腹腔细胞的制备
细胞融合24小时前，制备饲养细胞。脱臼处死小鼠，70％酒精浸湿消毒。腹部切口，撕开，70％酒精清洗腹壁。用镊子提起腹壁，腹腔注射4.5～5.5ml DMEM培养基。按摩腹部，抽回4～5ml液体。1000rpm离心7min，弃上清。细胞培养液悬浮至105/ml细胞，将细胞铺96孔板，0.1ml/孔。
c、细胞融合
加强免疫后3天，摘除小鼠眼球，取血。脱颈处死小鼠，70％酒精浸湿消毒。腹部切口，撕开至腹壁完全暴露，70％酒精清洗腹壁。剪开腹膜去脾脏。脾脏放在8ml无血清培养基中，注射器内芯压挤脾脏。制备脾细胞悬液，70μm滤网过滤，将细胞转移至50ml离心管。吹打3次，静置10min，使组织块沉淀。将上清吸至另一试管。加30ml DMEM，1000rpm离心5min，去上清，加3～5倍体积红细胞裂解液，静置1～2min。1000rpm离心5min，加20ml DMEM洗3遍，细胞计数。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1：5～1：10)，并加入聚乙二醇。加完聚乙二醇后，37℃水浴静置90秒，2～4分钟内加入15ml无血清RPMI-1640培养基，1000rpm离心10min，弃上清，加35ml HAT选择性培养基，分装至已有巨噬细胞的96孔板进行培养。2～3天换一次HAT选择性培养基，连续两周观察杂交瘤是否出现。2周后，用HT培养基培养。
(4)筛选阳性杂交瘤细胞
a、ELISA方法检测96孔板杂交瘤细胞培养上清：huSIRPα-his蛋白包被酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜。去掉包被液，每孔200μl 5％脱脂奶粉37℃封闭，PBST洗涤3次，加杂交瘤细胞培养上清100μl，37℃孵育1～2h。PBST洗涤3遍后，加二抗羊抗小鼠IgG-HRP，37℃孵育1h。PBST洗涤3遍，加显色液显色5min，终止显色。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。在此筛选中，取大于0.5倍OD值的克隆进行下一轮测试。利用筛选的抗原再测试阳性培养物以确认抗体分泌，利用不相关抗原(人转铁蛋白)以消除非特异性或“粘性”单抗并排除假阳性。
b、流式细胞方法检测96孔板杂交瘤细胞培养上清与CHO-huSIRPα和CHO-cyno-SIRPα的结合能力
将ELSIA筛选到的328株阳性克隆培养上清利用流式细胞法检测与结合在啮齿动物中国仓鼠卵巢细胞系上异位表达的人受体(CHO-huSIRPα)和猴受体(CHO-cyno-SIRPα)的能力，收获CHO-huSIRPα和CHO-cyno-SIRPα细胞，将细胞分别以105个细胞/孔铺板于96孔板中，洗涤，并在含有Fc阻断试剂和单克隆抗体上清的100μl FACS缓冲液中温育。然后，将细胞洗涤两次并在冰上在含有以1：200稀释的缀合PE抗小鼠IgG Fc二抗的FACS缓冲液中温育30min。将细胞在冰的FACS缓冲液中洗涤两次，并在BD FACS Canto上获得。用FlowJo(TreeStar)软件版本10.0.7进行平均荧光强度(MFI)值的数据分析和计算。结果如表1所示。
表1结合CHO-huSIRPα和CHO-cyno-SIRPα的抗体的MFI值
抗体 CHO-huSIRPα CHO-cyno-SIRPα
mIgG 86.56 76.36
36D6 9268 4997
36G4 9517 4560
39D8 17253 8652
40F3 17151 7568
52B3 13578 6985
55G4 12194 6719
57B10 18480 9230
结果表明7株杂交瘤细胞株36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10分泌抗体与CHO-huSIRPα和CHO-cyno-SIRPα具有较强的交叉结合。
(5)抗SIRPα鼠源抗体的亚型鉴定、亚克隆及大量制备
a、亚型鉴定：取杂交瘤细胞培养上清，采用IsoStripTM小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型。结果如表2所示，本发明抗SIRPα抗体均为IgG1,κ。
表2抗人SIRPα抗体亚型
抗体编号 重链 轻链
36D6 IgG1 k
36G4 IgG1 k
39D8 IgG1 k
40F3 IgG1 k
52B3 IgG1 k
55G4 IgG1 k
57B10 IgG1 k
b、杂交瘤细胞亚克隆化：
在转移至96孔板后，将以上7株杂交瘤细胞系36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10在24孔板中维持培养32天。这期间成为稳定期并测试克隆是否保持稳定分泌的能力。再次稳定期间，临时冷冻的细胞系备份由所有感兴趣的克隆组成，保存在-80℃(可存活6个月)。在此期间，定期地检测杂交瘤的分泌和特异性。
对36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10杂交瘤细胞系(克隆)亚克隆以确保单克隆性。通过使用有限稀释法进行克隆化培养，通过间接ELISA和抗体捕获ELSIA筛选亚克隆。采用每个亲本的顶级亚克隆用于扩大培养扩增与保存。对于<50％克隆的亲本克隆进行第二轮的亚克隆。
c、单克隆抗体的大量制备与纯化
将上述获得的细胞株36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10扩大培养，并收集细胞培养上清。采用ProteinA亲和层析法纯化抗体。首先制备ProteinA亲和柱，用PBS平衡柱子后，将离心并0.4μm滤膜过滤的细胞培养上清过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH7.5的甘氨酸-HCL溶液洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析后备用。
实施例2 SDS-PAGE检测抗体分子量
按照中国药典第三部附录的方法进行SDS-PAGE电泳，鉴定其分子量和表达量。纯化后抗体SDS-PAGE图谱如图1所示，分子量大小分别在50kd和25kd左右，符合抗体重链和轻链分子量大小，纯度在95％以上。
实施例3抗SIRPα鼠源单克隆抗体的可变区扩增
将候选杂交瘤细胞36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10分别进行培养至对数生长期，1000rpm离心10min收集细胞，并以试剂盒(Takara公司)提取总RNA，用反转录试剂盒prime script TMRT-PCR合成第一链cDNA，以第一链cDNA为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的抗体可变区DNA序列。根据亚型鉴定结果，获取该抗体亚型的重链和轻链恒定区序列，涉及特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补。
(1)鼠源抗体36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10的重链可变区的克隆
用mRNA纯化试剂盒(Takara)从小鼠杂交瘤细胞36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10分离出mRNA，依此制备cDNA(prime script TM RT-PCR试剂盒，Takara)。使用简并引物1：5'-CCTAGGAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'和引物2：5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3'通过PCR从cDNA中分离重链可变区DNA片段。将胶纯化后得到的DNA片段克隆入PMDA19-T(simple)载体并测序，得到编码鼠源抗体36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10重链的可变区核苷酸序列和氨基酸序列，及其互补决定区的氨基酸序列。
(2)鼠源抗体36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10的轻链可变区的克隆
以相似的PCR方法，使用5’引物5'-CCTAGGGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3'(引物3)和另一个与小鼠免疫球蛋白轻链恒定区同源反义的3’引物，即5'-CATATGGTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3'(引物4)，从cDNA中分离轻链可变区DNA片段。将这些得到的DNA片段克隆入TOPO-TA载体并测序，得到编码36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10小鼠杂交瘤轻链的可变区核苷酸序列和氨基酸序列，及其互补决定区的氨基酸序列。
使用标准技术，测定编码生成的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。抗体重链CDR序列、轻链CDR以及抗体重链和轻链可变区序列示于表3-1、3-2中，所述CDRs根据Kabat编号确定。
表3-1抗体重链、轻链可变区以及CDR的氨基酸序列
Figure BDA0002877425010000221
Figure BDA0002877425010000231
Figure BDA0002877425010000241
表3-2抗体可变区核苷酸序列
序列编号 抗体片段
SEQ ID NO：54 36D6-VH
SEQ ID NO：55 36G4-VH
SEQ ID NO：56 39D8-VH
SEQ ID NO：57 40F3-VH
SEQ ID NO；58 52B3-VH
SEQ ID NO：59 55G4-VH
SEQ ID NO：60 57B10-VH
SEQ ID NO：61 36D6-VL
SEQ ID NO：62 36G4-VL
SEQ ID NO：63 39D8-VL
SEQ ID NO：64 40F3-VL
SEQ ID NO：65 52B3-VL
SEQ ID NO：66 55G4-VL
SEQ ID NO：67 57B10-VL
实施例4抗SIRPα抗体与SIRPα的结合活性测定
将重组hu-SIRPα-his以0.5μg/ml用碳酸缓冲液(pH9.2)包被ELISA酶标板过夜；每孔2％BSA300μl，37℃封闭1h；0.1％PBST洗3次洗涤后，加入系列稀释纯化抗体，每孔100μl，37℃孵育1h，其中SE5A5为阳性对照抗体；0.1％PBST洗3次洗涤后，拍干，筛选板加入1:10000稀释的抗小鼠IgG-HRP二抗，每孔100μl；37℃1h；弃去二抗，0.1％PBST洗3次，拍干，加入TMB，每孔50μl显色20min，加入1M HCL每孔50μl终止；多功能酶标仪读取OD450值，读取原始数据。将数据导入GraphpadPrism 8.0中分析抗体与SIRPα结合的EC50值，结果如表4、图2a和图2b所示。这些结果表明，本发明所检测的抗体，与其他已知的抗SIRPα抗体SE5A5(22.47ng/ml)相比是良好的SIRPα结合物，本发明抗体的结合优于对照抗体，尤其是抗体40F3和57B10，EC50分别为5.866ng/ml和5.457ng/ml。
表4 ELISA结合EC50值
抗体 EC50(ng/ml)
36D6 19.15
36G4 23.49
39D8 8.06
40F3 5.866
57B10 5.457
52B3 7.358
55G4 19.48
SE5A5 22.47
实施例5抗SIRPα抗体与hSIRPα的亲和力测定
本实施例中，使用Biacore(T200)，用标准表面等离子共振(Surface PlasmonResonance，SPR)技术，测定抗体36D6、36G4、39D8、40F3、52B3、55G4、57B10与SIRPα抗原亲和力。采用捕获法，将人源化抗SIRPα单克隆抗体作为配体捕获于ProteinA芯片上，不同浓度的SIRPα蛋白作为分析物进样，进行亲和力分析和计算。具体操作流程为：
将超纯水用0.22μm滤膜过滤，配制HBS-EP+buffer；用HBS-EP+buffer将SIRPα单克隆抗体原液稀释到6μg/ml，作为配体；用HBS-EP+buffer将SIRPα蛋白从100nM起始，2倍稀释8个梯度，再加一个零点，作为分析物；吸取适量Glycine 1.5作为再生液；将配体、分析物、再生液、HBS-EP+buffer放置到样品托盘上；设置程序：配体流速10μl/min，20s；分析物30μl/min，结合时间100s，解离时间600s；再生液30μl/min，30s。启动程序。Biacore T200Control Software采集SPR信号并保存，进而采用Biacore T200 Evaluation分析软件进行数据处理。检测通道信号值减去相应参比通道信号值，得到校正后的信号曲线。亲和力评价采用双减法，在样品循环前增加一个相同参数设置的零浓度循环(Sample 0)，样品循环减去零浓度循环(Sample-Sample0)得到二次矫正后的信号曲线。亲和动力学曲线按照1:1Langmuir结合模型进行拟合，并计算KD值。结果如表5所示。
结果表明，本发明的抗体40F3和57B10亲和力数量级在10E-11，均优于SE5A5。
表5抗huSIRPα抗体的结合率，解离率和亲和力常数
Figure BDA0002877425010000251
Figure BDA0002877425010000261
实施例6竞争ELISA实验鉴定阻断和非阻断CD47的SIRPα抗体
重组hSIRPα以1μg/ml用碳酸盐缓冲液(pH9.2)包被在ELISA板上过夜；2％BSA300μl/w，37℃封闭1h，洗涤后，加入纯化的抗体(不同浓度)与生物素化的重组人生物素化CD47Fc蛋白，终浓度6μg/ml(固定浓度)混合，在37℃下孵育2h，其中SE5A5为阳性对照抗体，mIgG1为阴性对照抗体。经过培养和洗涤，1：1000加入二抗过氧化物酶标记的链霉亲和素，100μl/孔，37℃，1h；洗涤后，加50μl/孔TMB显色15min，加50μl/孔HCL终止，多功能酶标仪读取OD450值，保存原始数据。将数据导入GraphpadPrism 8.0中分析结果，结果如表6、图3所示。
结果显示抗体40F3(IC50值65.31ng/ml)和57B10(IC50值63.29ng/ml)的阻断效果强于商业抗体SE5A5(IC50值121.2ng/ml)；52B3(IC50值120.6ng/ml)和39D8(IC50值113.2ng/ml)阻断效果与商业抗体SE5A5相当；36D6(IC50值247.9ng/ml)弱于对照抗体；55G4不具有阻断CD47与SIRPα结合的功能。
表6阻断CD47的SIRPα抗体的IC50值
抗体 IC50(μg/ml)
mIgG1 NA
39D8 0.1132
40F3 0.06531
55G4 NA
52B3 0.1206
36D6 0.2479
57B10 0.06329
36G4 0.1504
SE5A5 0.1212
注：“NA”表示无量效关系。
实施例7通过ELISA检测抗SIRPα抗体与SIRPg的结合
将重组hSIRPg-his以1μg/ml用碳酸盐缓冲液(pH9.2)包被在ELISA板上过夜；2％BSA300μl/w，37℃封闭1h，洗涤后，加入纯化的抗体，100μl/孔，37℃孵育1h，其中Kwar23和LSB2-20为商业化抗体，IgG1为阴性对照抗体；0.1％PBST洗3次洗涤后，拍干，筛选板加入1:10000稀释的抗小鼠IgG-HRP二抗，或羊抗人IgG-HRP二抗100μl/w；37℃孵育1h；弃去二抗，0.1％PBST洗3次，拍干，每孔加入50μlTMB，显色20min，之后每孔加入50μl1M HCL进行终止；多功能酶标仪读取OD450值，读取原始数据。将数据导入GraphpadPrism 8.0中分析抗体与sirpg的结合活性。其中Kwar23和LSB2-20为商业化抗体，IgG1为阴性对照抗体。
结果如图4所示，抗SIRPα抗体40F3和57B10不结合sirpg，而已知抗体Kwar23，LSB2-20显示出与sirpg的显著结合。
实施例8 ELISA鉴定抗SIRPα抗体是否影响CD47与SIRPg的结合
重组hSIRPg-his以1μg/ml用碳酸盐缓冲液(pH9.2)包被在ELISA板上过夜；洗涤3次后，2％BSA300μl/w，37℃封闭1h；洗涤3次后，加入50μl纯化的抗体(不同浓度)先与sirpg孵育30min，再加入生物素化的重组人生物素化CD47-Fc，蛋白终浓度6μg/ml(固定浓度)混合；在37℃下孵育1h；洗涤3次，1：1000加入二抗过氧化物酶标记的链霉亲和素，100μl/孔，37℃，1h；洗涤4次后，加50μl/孔TMB显色15min，加50μl/孔HCL终止，多功能酶标仪读取OD450值，保存原始数据，其中Kwar23为商业化抗体。将数据导入Graphpad Prism 8.0中分析结果，结果如表7、图5所示，结果表明本发明抗sirpa抗体40F3和50B10完全不影响CD47与SIRPg的结合。
表7 CD47与SIRPα抗体竞争结合sirpg的的IC50值
抗体编号 IC50(μg/ml)
CD47 NA
39D8+CD47 0.1529
40F3+CD47 NA
52B3+CD47 0.1964
57B10+CD47 NA
Kwar23+CD47 0.03943
注：“NA”表示无量效关系。
序列表
<110> 鲁南制药集团股份有限公司
<120> 抗SIRPα单克隆抗体
<130> 1
<160> 67
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 1
Lys Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 2
Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Ala Lys Tyr Ser Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 3
Gly Glu Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Phe Val Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 4
Asn Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 5
Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Asp Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 6
Gly Gly Trp Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 7
Gly Tyr Asp Ile Asn
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 8
Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Ser Thr Arg Tyr His Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 9
Gly Gly Arg Gly Asp Tyr
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 10
Ser Tyr Tyr Ile Tyr
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 11
Gly Ile Asn Pro Ser Asn Asp Asp Thr His Leu Thr Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 12
Ser Tyr Tyr Ala Asn Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 13
Ser Tyr Asn Leu His
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 14
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 15
Asn Tyr Asp Tyr Tyr Phe Tyr Thr Met Gly Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 16
Asn Tyr Leu Thr Glu
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 17
Val Ile Ser Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 18
Ser Ala Tyr Trp Asp Gly Gly Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 19
Ser Tyr Asn Met His
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 20
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 21
Asn Tyr Asp Tyr Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 22
Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 23
Trp Thr Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 24
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 25
Arg Ala Ser Glu Ser Ala Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 26
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 27
Gln Gln Ile Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 28
Glu Ser Gly Asp Arg Tyr His Asn Arg Tyr Lys Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 29
Arg Ala Tyr Asn Arg Val Trp
1 5
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 30
Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ala
1 5 10 15
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 31
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 32
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 33
Lys Ala Ser Gln Asp Val Cys Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 34
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 35
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 36
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 37
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 38
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 39
Gln Gln His Phe Ser Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 40
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 40
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Leu
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Ala Lys Tyr Ser Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ile Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 117
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Asp Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Gly Trp Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 42
<211> 115
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Lys Gly Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Ser Thr Arg Tyr His Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Glu Val Thr Leu Ile Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Pro Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 119
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Gly Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Asp Asp Thr His Leu Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Ile Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Tyr Tyr Ala Asn Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 44
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 44
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Leu His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Asn Tyr Asp Tyr Tyr Phe Tyr Thr Met Gly Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Thr Glu Trp Val Lys Glu Gly Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Tyr Trp Asp Gly Gly Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 46
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Asp Tyr Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 47
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Thr Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 111
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ala Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 49
<211> 111
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 49
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Leu Gly Val Ser Ile Ala
1 5 10 15
Gln Arg Pro Pro Ile Ser Arg Arg His Arg Glu Ser Gly Asp Arg Tyr
20 25 30
His Asn Arg Tyr Lys Lys Trp Ser Gln Gln Asn Thr Ala Gln Pro His
35 40 45
Asn Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Tyr Asn Arg Val Trp Gly Ala Pro His
50 55 60
Arg His Ser His Arg Val Tyr Ser Thr Asp Leu Pro Leu Pro Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 50
<211> 112
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 50
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 51
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Cys Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 52
<211> 110
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 52
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg
1 5 10 15
Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn
20 25 30
Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val
65 70 75 80
Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp
85 90 95
Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 53
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln His Phe Ser Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 54
<211> 363
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 54
gaggtgcagc tgcaggagtc aggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aagtatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gttggcctgg ataaacaccg acactggaga ggcaaaatat 180
tctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaga cctctgccag cattgtctat 240
ttgcagatta acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagaggggaa 300
tcttatagta actacgtccg gtttgtttac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 55
<211> 351
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 55
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagacaaga ggctggagtt ggtcgcaaca ataaatagta atggtggtga cacctcttat 180
ccagacagtg tgaggggccg attcaccatt tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaagac acagccatgt attactgtac aagaggaggg 300
tggtcctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 56
<211> 345
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 56
caggttcagc tgcagcagtc tggaactgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggcta caacttcaaa ggttatgaca taaactgggt gagacagacg 120
cctgaacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gagatgatag tactaggtac 180
catgagaagt tcaaggacga agtcacactg attacagaca aatcttccag cacagcctac 240
atgcacctca gcaggctgac atctgaggac cctgctgtct atttctgtgc aagaggggga 300
cggggggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345
<210> 57
<211> 357
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 57
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggggaagc ctggggcctc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggtta caccttcagc agctactata tatactggct gaaacagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggggga attaatccta gcaatgatga tactcacctc 180
actgagaagt tcaagagtaa ggccacactg attgcagaca gatcctccag cactgcctac 240
atacaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagatcctac 300
tatgctaact cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 58
<211> 360
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 58
gaggtgcagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaggt ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctgacta cacatttacc agttacaatt tgcactgggt aaagcagaca 120
cctggacagg gcctggaatg gattggatat atttatcctg gaaatggtaa tactaagtac 180
agtcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagatca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtac aagaaactat 300
gattactatt tttatactat gggctactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 59
<211> 360
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 59
caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattatttga cagagtgggt aaaggagggg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggagtg attagtcctg gaagtggtgg cactaactac 180
aatgagaaat ttaagggcaa ggcaacactg actgcagaca aatcctccag cactgcctac 240
atgcacctca gcagcctgac atctgatgac tctgcggtct atttctgtgc aagatcagct 300
tactgggacg ggggtggtat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 60
<211> 360
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 60
gaggtgaagc tgcaggagtc tggggctgag ctggtgaggt ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactggat aaagcagaca 120
cctggacagg gcctggaatg gattggatat atttatcctg gaaatggtgc tactaactac 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagatca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagaaactat 300
gattactatt tctatactat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 61
<211> 321
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 61
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaagca 120
ggccattctc ctaaactatt gatttactgg acatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatactctca ccatcagcag tgtccaggct 240
gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cattatagca ctccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 62
<211> 333
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 62
gacattgtgc tgacacaatc tccaacttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgctgat agctatggca atagttatat gaactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc gcccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagagtct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 240
cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaattaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 63
<211> 333
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 63
gacattgtgc tgacccaatc tccagttttt ttgggtgtgt ctatagcgca gaggcccccc 60
atctcgcgca gacacagaga aagtggagat agatatcaca atagatataa gaagtggtca 120
cagcagaaca cagcacagcc gcacaatctt ctcatatatc gcgcatacaa cagagtgtgg 180
ggggcccctc acaggcacag tcacagggtg tatagcacag atctccccct ccccatagat 240
cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaattaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 64
<211> 336
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 64
gacattgtgc tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gaccattgta catagtaatg gaaacaccta tttagcatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtctc caaccggttt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagaattcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggatc acatgtcccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 65
<211> 321
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 65
gacattgtgc tgacccaatc tccaaaattc atgtccacat cggtaggaga cagggtcaac 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgtgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctatc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tcggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctcccctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 66
<211> 330
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 66
gacattgtgc tgacccaatc tccattggct gtgtctctag ggcagagggc caccatatcc 60
tgcagagcca gtgaaagtgt tgatagttat ggcaatagtt ttatgcactg gtaccagcag 120
aaaccaggac agccacccaa actcctcatc tatcttgcat ccaacctaga atctggggtc 180
cctgccaggt tcagtggcag tgggtctagg acagacttca ccctcaccat tgatcctgtg 240
gaggctgatg atgctgcaac ctattactgt cagcaaaata atgaggatcc tccgtacacg 300
ttcggagggg ggaccaagtt ggaaataaaa 330
<210> 67
<211> 321
<212> DNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 67
gacattgtgc tcacccaatc tacaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgtct actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tcggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttttta ctgtcagcaa cattttagtg ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321

Claims (8)

1.一种抗SIRPα单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或抗原结合片段包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，其HCDRs选自以下任意一组：
(1)氨基酸序列为SEQ IN NO：1的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：2的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：3的HCDR3；
(2)氨基酸序列为SEQ IN NO：4的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：5的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：6的HCDR3；
(3)氨基酸序列为SEQ IN NO：7的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：8的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：9的HCDR3；
(4)氨基酸序列为SEQ IN NO：10的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：11的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：12的HCDR3；
(5)氨基酸序列为SEQ IN NO：13的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：14的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：15的HCDR3；
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：16的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：17的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：18的HCDR3；
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：19的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：20的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：21的HCDR3；
其中所述CDRs根据Kabat编号确定。
2.根据权利要求1所述抗SIRPα单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或抗原结合片段还包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其LCDRs选自以下任意一组：
(1)氨基酸序列为SEQ IN NO：22的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：23的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：24的LCDR3；
(2)氨基酸序列为SEQ IN NO：25的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：26的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3；
(3)氨基酸序列为SEQ IN NO：28的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：29的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3；
(4)氨基酸序列为SEQ IN NO：30的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：31的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：32的LCDR3；
(5)氨基酸序列为SEQ IN NO：33的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：35的LCDR3；
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：36的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：26的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：37的LCDR3；
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：38的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：39的LCDR3；
其中所述CDRs根据Kabat编号确定。
3.根据权利要求1所述抗SIRPα单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或抗原结合片段包括LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，其CDRs选自以下任意一组：
(1)氨基酸序列为SEQ IN NO：1的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：2的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：3的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：22的LCDR1，氨基酸序列为SEQIN NO：23的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：24的LCDR3；
(2)氨基酸序列为SEQ IN NO：4的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：5的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：6的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：25的LCDR1，氨基酸序列为SEQIN NO：26的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3；
(3)氨基酸序列为SEQ IN NO：7的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：8的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：9的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：28的LCDR1，氨基酸序列为SEQIN NO：29的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：27的LCDR3；
(4)氨基酸序列为SEQ IN NO：10的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：11的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：12的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：30的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：31的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：32的LCDR3；
(5)氨基酸序列为SEQ IN NO：13的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：14的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：15的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：33的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：35的LCDR3；
(6)氨基酸序列为SEQ IN NO：16的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：17的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：18的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：36的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：26的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：37的LCDR3；
(7)氨基酸序列为SEQ IN NO：19的HCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：20的HCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：21的HCDR3；和氨基酸序列为SEQ IN NO：38的LCDR1，氨基酸序列为SEQ IN NO：34的LCDR2，以及氨基酸序列为SEQ IN NO：39的LCDR3；
其中所述CDR根据Kabat编号确定。
4.根据权利要求1所述抗SIRPα单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，其具有如下任意一组重链可变区和轻链可变区：
(1)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：40，或与SEQ IN NO：40的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：47，或与SEQ IN NO：47的轻链可变区序列具有至少85％或92％或98％或99％同源性的序列；
(2)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：41，或与SEQ IN NO：41的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：48，或与SEQ IN NO：48的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；
(3)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：42，或与SEQ IN NO：42的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：49，或与SEQ IN NO：49的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；
(4)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：43，或与SEQ IN NO：43的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：50，或与SEQ IN NO：50的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；
(5)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：44，或与SEQ IN NO：44的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：51，或与SEQ IN NO：51的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；
(6)所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：45，或与SEQ IN NO：45的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IN NO：52，或与SEQ IN NO：52的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；
(7)所述重链氨基酸序列为SEQ IN NO：46，或与SEQ IN NO：46的重链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列；并且所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ INNO：53或与SEQ IN NO：53的轻链可变区序列具有至少约85％或92％或98％或99％同源性的序列。
5.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1-4任一项所述单克隆抗体或抗原结合片段。
6.根据权利要求5所述的一种DNA分子，其特征在于所述DNA分子选自如下任意一组：
(1)所述多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：54；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：61；
(2)所述多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：55；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：62；
(3)所述多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：56；并且多核苷酸具有编码轻链可变区SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：63；
(4)所述多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：57；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：64；
(5)所述多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：58；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：65；
(6)所述多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：59；并且编码轻链可变区SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ INNO：66；
(7)所述多核苷酸具有编码重链可变区SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：60；并且具有编码轻链可变区SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IN NO：67。
7.一种制备权利要求1-4任一项所述单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤(1)：合成含SIRPα和鼠源Fc的核苷酸序列，构建真核表达载体，转染宿主细胞，表达并纯化所述融合蛋白，作为抗原；
步骤(2)：以(1)所述抗原免疫小鼠后，获得小鼠的脾细胞，采用细胞融合技术制备、筛选能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经体外培养，制得抗SIRPα单克隆抗体。
8.权利要求1-4任一项所述抗SIRPα单克隆抗体或抗原结合片段在制备阻断CD47与SIRPα结合而不影响CD47与sirpg之间相互作用的药物中的应用。
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