CN113631183A - 抗弹性蛋白抗体及使用方法 - Google Patents

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内伦德拉·R·维亚瓦哈雷
查尔斯·D·赖斯
纳西姆·诺索迪
萨克特·卡拉姆切德
瓦迪什·帕拉萨拉姆
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Clemson University Research Foundation (CURF)
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Abstract

描述了特异性识别和结合降解的弹性纤维中暴露和可及的弹性蛋白表位的抗体及其抗原结合片段。抗体和/或抗原结合片段可以可操作地连接到第二组分，该第二组分包括生物活性剂，诸如治疗剂和/或成像剂。任选地，抗体和/或其抗原结合片段可以附接于载体诸如颗粒的表面，用于特异性结合和将所携带的剂递送至降解的弹性纤维。

Description

抗弹性蛋白抗体及使用方法
背景
弹性蛋白是在大多数结缔组织和全身发现的弹性纤维的蛋白成分。弹性纤维包括被微纤维的覆盖物包围和支撑的无定形弹性蛋白的不溶性核心，微纤维由多种不同的蛋白、糖蛋白和弹性蛋白受体复合物形成。弹性纤维的无定形弹性蛋白核心是在可溶性原弹性蛋白单体沉积和整合到微纤维支架中，随后通过单体交联形成不溶性纤维聚合物时形成的。
弹性纤维的降解是许多病状的共同特征，病状包括动脉瘤(例如腹主动脉瘤、脑动脉瘤)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性肾病、高血压、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、马方氏综合征(Marfan’s syndrome)、动脉粥样硬化、动脉硬化及其他，以及衰老(即皮肤随着时间失去硬度/光滑度)。弹性纤维降解通常由可以攻击弹性纤维的弹性蛋白和支架组分中的一种或两种的酶引起，所述酶包括弹性蛋白酶、组织蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMP)。这样的酶可以由天然细胞分泌，包括动脉中的血管细胞、皮肤和肺中的分别的真皮(dermal)和肺成纤维细胞，以及多种不同疾病状态下的浸润性炎症细胞。
不幸的是，全身递送仍然是上述病状以及其他病状中最常见的治疗和诊断化合物的递送方法。全身性引入的剂通常经由首过效应和其他机制被身体过滤。因此，全身递送方法通常需要大剂量的化合物，这除了增加成本之外，还会对患者造成不必要的和/或有毒的副作用。例如，剂的全身和/或整体递送(generic delivery)可能具有脱靶效应——与体内非靶向结构的相互作用——这会改变正常的组织水平和/或器官水平的功能，并导致有害的副作用。
本领域需要可以用作靶向剂并且可以连同生物活性剂一起递送以靶向递送该剂用于治疗或诊断目的的抗弹性蛋白抗体。
概述
根据一种实施方案，公开了特异性识别和结合弹性蛋白的表位，并且特别是结合SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3之一的表位的抗弹性蛋白抗体或其抗原结合部分。例如，所公开的抗弹性蛋白抗体或抗原结合片段可以包括选自SEQ ID NO:9、11、13、27、29或31的一种或更多种CDR片段。
还公开了包含所描述的抗弹性蛋白抗体或其抗原结合部分的组合物。例如，组合物可以包括直接或间接地附接至剂，例如生物活性剂(诸如治疗剂)或诊断剂(诸如可检测标志物)的抗弹性蛋白抗体或其抗原结合部分(例如，完整抗体或其片段，包括选自SEQ IDNO:9、11、13、27、29或31的一种或更多种CDR片段)。组合物可以包括与活性剂(例如，治疗剂)缔合的颗粒和附接至颗粒外表面的抗弹性蛋白抗体或其抗原结合片段，使得抗体或其片段在与其抗原结合时可以将颗粒锚定至弹性纤维。
还描述了使用抗体的方法。例如，使用方法可以包括使降解的弹性纤维与所描述的抗体或其抗原结合片段接触，所述抗体或其抗原结合片段可操作地连接至剂，例如治疗剂和/或成像剂，任选地连接至颗粒或其他递送机制。治疗剂可以是用于在降解的弹性纤维的通用区域中使用的任何治疗剂。例如，它可以用于直接治疗包含弹性纤维的结缔组织，或者它可以用于另一种用途，例如与降解的弹性纤维的存在间接相关或者甚至与降解的弹性纤维的存在无关，但是在降解的弹性纤维的通用区域中包括靶组分(例如组织)的病症。
还公开了用于生产所公开的抗体和/或其抗原结合部分的物质和方法。例如，公开了用于形成产生所公开的单克隆抗弹性蛋白抗体的杂交瘤细胞的方法和由此形成的杂交瘤，以及包含一种或更多种编码抗弹性蛋白抗体或其抗原结合部分的核酸序列(例如选自SEQ ID NO:8、10、12、26、28或30的一种或更多种CDR编码区段)的遗传修饰细胞、载体等。
附图简述
对本领域普通技术人员来说，完整且可行的公开内容，包括其最佳模式，在说明书的其余部分更具体地阐述，包括参考附图，其中：
图1示出了大鼠主动脉，每条主动脉的一部分已用弹性蛋白酶处理，随后与用所公开的抗体加标签的纳米颗粒孵育。
图2示出了小鼠主动脉，每条主动脉的一部分已用弹性蛋白酶处理，随后与用所公开的抗体加标签的纳米颗粒孵育。
图3示出了通过用可检测标志物和所公开的抗体加标签的纳米颗粒进行体内靶向后的受损的大鼠主动脉。
图4示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的免疫组化染色。
图5示出了使用仅二抗作为对照的免疫组化(IHC)染色。
图6示出了用本文所公开的抗体加标签的人体组织的Verhoeff-van Gieson染色的结果。
图7示出了显示受损弹性纤维的人体组织的Verhoeff-van Gieson染色结果。
图8示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的来自大鼠肺的弹性蛋白酶肺气肿模型的组织的IHC染色。
图9示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的来自小鼠肺的弹性蛋白酶肺气肿模型的组织的IHC染色。
图10示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的来自小鼠主动脉的AngII动脉瘤模型的组织的IHC染色。
图11示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的弹性蛋白酶处理的小鼠皮肤的IHC染色。
图12示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的来自大鼠肺的弹性蛋白酶肺气肿模型的组织的IHC染色。
图13示出了使用二抗作为对照的来自大鼠肺的弹性蛋白酶肺气肿模型的组织的IHC染色。
图14示出了使用二抗作为对照的来自大鼠肺的弹性蛋白酶肺气肿模型的组织的IHC染色。
图15示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的来自小鼠主动脉的AngII动脉瘤模型的组织的IHC染色。
图16示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的来自小鼠主动脉的AngII动脉瘤模型的组织的IHC染色。
图17示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的来自小鼠主动脉的AngII动脉瘤模型的组织的IHC染色。
图18示出使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的来自小鼠主动脉的AngII动脉瘤模型的组织的IHC染色。
图19示出了使用二抗作为对照的来自小鼠主动脉的AngII动脉瘤模型的组织的IHC染色。
图20示出了使用二抗作为对照的来自小鼠主动脉的AngII动脉瘤模型的组织的IHC染色。
图21示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的弹性蛋白酶处理的小鼠皮肤的IHC染色。
图22示出了使用本文所公开的抗体作为方案的一抗的弹性蛋白酶处理的小鼠皮肤的IHC染色。
图23示出了使用二抗作为对照的弹性蛋白酶处理的小鼠皮肤的IHC染色。
图24示出了使用二抗作为对照的弹性蛋白酶处理的小鼠皮肤的IHC染色。
图25示出了检测在所公开的抗体和可溶性原弹性蛋白之间的结合的银染和蛋白印迹结果。
图26示出了使用所公开的抗体的人主动脉的H&E染色的IHC。
图27示出了具有轻度动脉瘤降解的人主动脉的Verhoeff van Gieson(VVG)染色。
图28示出了所描述的抗体与图27的受损组织的结合。
图29示出了当使用对照抗体时，缺乏与人主动脉组织的结合。
图30示出了使用所公开的抗体的人主动脉的H&E染色的IHC。
图31示出了具有轻度动脉瘤降解的人主动脉的Verhoeff van Gieson(VVG)染色。
图32示出了所描述的抗体与图27的受损组织的结合。
图33示出了当使用对照抗体时，缺乏与人主动脉组织的结合。
图34示出了在离体靶向方案中，所公开的抗体与动脉粥样硬化斑块(CEA)的结合。
图35示意性示出了IHC，包括负载染料的颗粒的直接检查、H&E染色和VVG染色，显示了所公开的抗体与人主动脉的动脉粥样硬化斑块中弹性蛋白的结合。
图36示意性示出IHC，包括负载染料的颗粒的直接检查、H&E染色和VVG染色，显示了所公开的抗体与人主动脉的动脉粥样硬化斑块中弹性蛋白的结合。
图37示意性示出本文描述的单克隆抗体。
图38呈现了基于CT扫描形成的三维模型的图像，其可视化了动脉瘤主动脉的形态(左)并且示出了用抗体加标签的金纳米颗粒在主动脉内的分布(右)。
图39提供了通过使用本文描述的抗体对标记有金纳米颗粒的动脉瘤主动脉的两个暗场显微图像。
图40示出了通过使用本文描述的抗体对标记有金纳米颗粒的动脉瘤主动脉的组织学分析。
图41提供了通过使用本文描述的抗体对标记有金纳米颗粒的肾上主动脉组织的高光谱作图。
详述
现在将详细参考当前公开的主题的各种实施方案，其中的一个或更多个实例如下所述。每个实施方案都是以解释而非限制主题的方式提供。事实上，对于本领域的技术人员来说明显的是，在不脱离本公开内容的范围或精神的情况下，可以对本公开内容进行多种修改和变化。例如，作为一个实施方案的一部分示出或描述的特征可以用在另一个实施方案中，以产生又一个实施方案。因此，本公开内容意图是包括在所附权利要求及其等同物的范围内的修改和变化。
本公开内容整体上涉及能够特异性结合弹性蛋白的表位的抗弹性蛋白抗体及其抗原结合片段。更具体地，公开了一种分离的抗体或抗原结合片段，该分离的抗体或抗原结合片段对大鼠、小鼠、猪、马、狗和人以及其它形式的无定形交联弹性蛋白具有特异性。具体地，所公开的抗体及抗原结合片段特异性识别和结合以下中的一种或更多种的表位序列：GALGPGGKPPKPGAGLL (SEQ ID NO:1)、LGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYPGGVAGAAGKAGYPTTGTGV(SEQ ID NO:2)或PGGYGLPYTTGKLPYGYP(SEQ ID NO:3)。还公开了递送剂，该递送剂可以掺入抗弹性蛋白抗体及其抗原结合片段作为靶向剂，用于将生物活性剂递送至包含弹性蛋白的区域。
以SEQ ID NO:1-3为例的表位序列是弹性纤维的无定形的、交联的弹性蛋白组分的多肽组分，其在弹性纤维降解，并且特别是在弹性纤维的微原纤维支架结构降解时，可以变得暴露和可接近。因此，在一种实施方案中，所公开的靶向剂可以用于结合受损的弹性纤维，并且可以表现出很少或不结合可能在血液中循环的健康的弹性纤维或可溶性弹性蛋白前体或分解组分。例如，包括特异性识别和结合SEQ ID NO:1-3中的一种或更多种的抗体或其抗原结合片段的靶向剂可以表现出很少或不结合α-弹性蛋白降解产物。在一种实施方案中，靶向剂可以结合不再可溶但未完全交联并形成弹性纤维的未成熟弹性蛋白，例如动脉粥样硬化纤维帽中的未成熟弹性蛋白。
所公开的抗体/片段包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，包含免疫特异性结合本文描述的多肽中的一种或更多种的抗原结合位点的分子)。完整的抗体通常可以包括两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链。在一种特定的实施方案中，本文公开的抗体可以包括SEQ ID NO:5作为重链和SEQ ID NO:23作为轻链。然而，应当理解，本发明包括完整的抗体(包含所公开的抗体的可变部分(SEQ ID NO:7(VH)和SEQ IDNO:25(VL))连同可选的恒定区)及其分离的抗原结合部分(例如，一个或更多个CDR区SEQID NO:9、11、13、27、29和31，任选地连同它们各自的FR区SEQ ID NO:15、17、19、21、33、35、37、39)。基于所公开的抗体的本文公开的靶向剂可以包括但不限于免疫球蛋白分子、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、非人抗体(例如来自小鼠、大鼠、山羊或任何其他动物)、完全人抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、基于重链可变结构域或轻链可变结构域的单结构域抗体(纳米抗体(nanobody))、双特异抗体(diabody)、多特异性抗体、双重特异性抗体(dual-specific antibody)、抗独特型抗体(anti-idiotypic antibody)、双特异性抗体(bispecific antibody)、其功能活性表位结合片段、双功能杂交抗体、抗体的单链等。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgA、IgM、IgE或IgD)。通常，抗体是IgG，例如IgG1、IgG2或IgG3同种型。在一个特定的实施方案中，抗体可以是IgG1同种型。此外，抗体通常可以包括κ轻链。
本文公开的抗原结合化合物不限于完整抗体。在一种实施方案中，所公开的化合物和方法可以使用完整抗体的一种或更多种抗原结合片段。例如，方法和物质可以掺入可以靶向并结合弹性蛋白的表位的完整抗体的一个或更多个CDR区。例如，靶向剂可以包括SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13中的一种或更多种(其描述了本文描述的重链的可变区(SEQ ID NO:7)的CDR片段)，任选地连同SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29或SEQ IDNO:31中的一种或更多种(其描述了本文描述的轻链的可变区(SEQ ID NO:25)的CDR片段)。在一种实施方案中，可以提供如完整可变区中发现的由一个或两个FR片段结合的CDR片段，或者可选地，CDR片段可以独立于天然FR片段以分离的形式被使用。例如，在一种实施方案中，本文描述的靶向剂可以掺入按顺序包括SEQ ID NO:15、9和17的肽序列，该肽序列包括本文描述的单克隆抗体的CDR片段(SEQ ID NO:9)连同天然存在于CDR片段任何一端的FR片段(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17)。在形成选择性识别降解的弹性蛋白的表位的靶向剂中，可与CDR片段连同使用的FR片段可以包括SEQ ID NO:15、17、19、21、33、35、37和39中的一种或更多种。
如本文所用，术语“选择性识别”和“选择性结合”是指分子与表位的结合比分子与不相关表位的结合或不相关分子与表位的结合大2倍或更多，例如大约2倍至约5倍，如通过本领域已知的技术诸如例如ELISA、免疫沉淀、双杂交测定、冷置换测定等确定的。通常，当解离常数(KD)为约1×10-5M或更小，或约1×10-6M或更小，例如在一些实施方案中约1×10- 7M时，特异性结合可以与非特异性结合区分开。
所公开的抗体的功能性抗原结合片段可以包括能够特异性识别和结合SEQ IDNO:1-3中的一种或更多种，例如SEQ ID NO:7、9、11、13、25、27、29或31中的一种或更多种的Fab、scFv-Fc二价分子、F(ab’)2和Fv。
如本领域技术人员所理解的，本文描述的抗原结合肽可以掺入修饰。例如，存在许多天然氨基酸，它们在大多数活生物体内以L-异构体存在；然而，本公开内容的实施方案不限于仅L-氨基酸，并且可以包括用D-氨基酸或不是由人类或任何其他生物体天然编码的其他非蛋白原性氨基酸取代L-氨基酸的修饰。本文中，除非特别提及D-氨基酸(即氨基酸标识符后面跟着(d))，提及通用氨基酸指示L-氨基酸。
在本公开内容的实施方案中，靶向剂可以包括对所公开的肽的鸟氨酸取代，例如对可在靶向剂中使用的所公开的CDR片段的鸟氨酸取代。在一些实施方案中，靶向剂可以包括选自以下组的人蛋白质氨基酸(proteinogenic amino acid)的一种或更多种氨基酸取代：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在一种实施方案中，靶向剂可以包括与本文所公开的那些在结构和/或功能上相似的肽。结构相似的肽可以包括变化形式，诸如具有第一氨基酸侧链的一种氨基酸被具有第二氨基酸侧链的第二氨基酸取代。第一氨基酸侧链和第二氨基酸侧链二者都提供了相似的特征来维持靶向剂的功能相似性，即弹性蛋白表位结合。相似的特征可以包括与第一氨基酸侧链具有相似的极性、电荷或大小的侧链。例如，亮氨酸包括疏水侧链，并且在一些实施方案中，靶向剂可以包括用异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸取代所公开序列(例如，CDR序列)的亮氨酸，因为这些氨基酸中的每一种都包括相似的疏水侧链。作为另一种实例，组氨酸包括也可以携带正电荷的芳香族侧链，并且在一些实施方案中，弹性蛋白结合抗体或其片段的一个或更多个组氨酸可以被包括芳香族侧链的氨基酸或可以携带正电荷的氨基酸诸如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸或赖氨酸取代。这些是作为可能的取代的实例提供，并不意味着限制通过取代具有相似侧链性质的氨基酸而预期的变化形式的范围。
在一些实施方案中，抗原结合片段包含Fab，其中该片段包含抗体分子的单价抗原结合片段，并且可以通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体(whole antibody)以产生完整的轻链(例如，SEQ ID NO:23)或其可变区(例如，SEQ ID NO:25)和一条重链的一部分(例如，SEQID NO:9、11、13中的一种或更多种，任选地连同SEQ ID NO:15、17、19、21中的一种或更多种)。
在一种实施方案中，抗原结合片段可以包含Fab’，Fab’是可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体然后还原以产生完整的轻链(例如，SEQ ID NO:23)或其可变区(例如，SEQ IDNO:25)和重链的一部分(例如，SEQ ID NO:9、11、13中的一种或更多种，任选地连同SEQ IDNO:15、17、19、21中的一种或更多种)而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子可以获得两个Fab’片段。包含抗体的F(ab’)2片段，其可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行随后的还原获得。F(ab’)2片段是具有由两个二硫键连接在一起的两个Fab’片段的二聚体。还包含Fv，其是包含表达为两条链的轻链的可变区和重链的可变区的基因工程片段。在一种实施方案中，抗体可以包含单链抗体(“SCA”)，其是包含通过合适的多肽接头连接为基因融合的单链分子的轻链的可变区和重链的可变区的基因工程分子。抗体片段可以是scFv-Fc，其在一种实施方案中通过将单链Fv(scFv)与来自免疫球蛋白(Ig)(诸如IgG)的铰链区和Fc区融合而产生。
抗体或其抗原结合片段可以包括本领域已知的不干扰对靶表位的特异性识别和结合的修饰。例如，修饰可以使抗体或片段在从展示形式(displayed form)转变为分泌形式的过程中的构象变化最小化。如本领域技术人员所理解的，修饰可以是本领域已知的赋予功能性质的修饰，如果不存在该修饰，则该功能性质原本不会存在。本发明包括在翻译过程中或翻译后被差异修饰的物质，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割，与颗粒、另一分子或其他细胞配体连接等被差异修饰。众多化学修饰中的任何一种都可以通过已知技术进行，包括但不限于通过溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4的特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、氧化、还原、在衣霉素存在下的代谢合成等。
修饰可以包括N-末端修饰和/或C-末端修饰。例如，修饰可以包括N-末端生物素化和/或C-末端生物素化。在一种实施方案中，抗体或抗原结合片段的可分泌形式包含允许结合到免疫球蛋白(Ig)铰链区的N-末端修饰。在另一种实施方案中，Ig铰链区来自但不限于IgA铰链区。在另一种实施方案中，抗体或抗原结合片段的可分泌形式包括允许结合到酶促可生物素化位点的N-末端修饰和/或C-末端修饰。在另一种实施方案中，所述位点的生物素化可以使该位点功能化，以结合至任何用链霉亲和素、亲和素、亲和素衍生部分或第二试剂包覆的表面。
修饰可以包括，例如，添加N-连接或O-连接的碳水化合物链，将化学部分附接到氨基酸主链上，对N-连接或O-连接的碳水化合物链进行化学修饰，以及添加或缺失N-末端甲硫氨酸残基。
抗体或抗原结合片段可以通过诸如本领域周知的任何合成或重组方法产生。抗体或抗原结合片段可以通过本领域已知的技术手段进一步修饰以改变生物物理或生物特性。例如，抗体可以被修饰以增加其抗蛋白酶的稳定性，或改变其亲脂性、溶解性或对SEQ IDNO:1-3中的一种或更多种的结合亲和力。
例如，抗体可以通过用靶抗原免疫接种各种动物，包括小鼠、大鼠、兔、山羊、灵长类动物、鸡和人来产生，该靶抗原诸如所描述的完整肽序列或包括至少一个抗弹性蛋白表位的、包含所描述的序列中的一种或更多种的弹性蛋白的肽片段。在一种实施方案中，可以在免疫接种动物之前纯化抗原或包含抗原的肽片段。免疫接种后获得的抗体或抗原结合片段可以通过本领域已知的方法例如凝胶过滤、离子交换、亲和层析等纯化。亲和层析或本领域已知的许多其它技术中的任何一种可用于从血清、腹水或杂交瘤上清液中分离多克隆抗体或单克隆抗体。
“纯化的”是指抗体与通常与抗体结合的蛋白质中的至少一些分离，并且优选与除蛋白质以外的所有细胞物质分离。
抗体或其抗原结合片段可以通过使用基因重组技术产生。例如，在形成嵌合抗体、人源化抗体、抗体的功能片段等，诸如Fv、SCA、scFv-Fc等中，可以使用遗传重组技术。
在一种实施方案中，用于产生掺入重链的可变区(SEQ ID NO:7)和轻链的可变区(SEQ ID NO:25)的全部或一部分的靶向剂的方法可以通过使用遗传重组技术来进行，所述靶向剂例如包括一个或更多个CDR区(SEQ ID NO:9、11、13、27、29、31)，例如在嵌合抗体的形成中。
例如，制备编码由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列(VH区)的DNA。同样，制备编码由SEQ ID NO:25表示的氨基酸序列(VL)的DNA。这样的DNA的实例包括由SEQ ID NO:6和SEQID NO:24表示的那些；然而，可以使用具有其他核苷酸序列的那些。
仍保留所需活性的所公开的序列的部分或突变体也被认为在本公开内容的范围内。例如，突变体可以包括对SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:24的改变，所述改变编码一种或更多种氨基酸取代(例如，将缬氨酸密码子突变为丙氨酸密码子)。此外，或者可选地，DNA序列的突变体可以包括对天然cDNA序列的一种或更多种点突变，以将天然密码子取代为简并密码子。
对于包括所公开的核酸序列(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:24或其编码抗体的CDR区的部分)的突变体的公开内容的实施方案，突变体可以包括修饰所表达的蛋白质的一种或更多种密码子突变，以用一种疏水氨基酸(例如缬氨酸)取代另一种疏水氨基酸(例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸)来产生抗体变体。
由于密码子冗余，存在许多理论上可能的可以编码本文所描述的抗体或抗原结合片段的cDNA序列变体。此外，修饰天然蛋白序列同时保留结合活性的变体还增加了这一数目。对于这些实施方案，遗传修饰可以导致肽(例如，SEQ ID NO:7)或保留天然肽的结合功能的肽变体的表达。
在一种实施方案中，编码VH(例如，SEQ ID NO:7)或VL(例如，SEQ ID NO:25)的DNA可以插入到具有编码人抗体的相应恒定区(CH或CL)的序列的载体中，以构建嵌合抗体表达载体。可以使用的具有编码人抗体的CH或CL的序列的载体是商购可得的。通过将构建的表达载体导入宿主细胞，可以获得表达嵌合抗体的重组细胞。然后，可以培养重组细胞，并且可以从培养物中获得所需的嵌合抗体。
对宿主细胞没有特别限制，只要表达载体能够在其中发挥作用。例如，可以适当地使用动物细胞(例如COS细胞、CHO细胞、HEK细胞等)、酵母、细菌(大肠杆菌(Escherichiacoli)等)、植物细胞、昆虫细胞等。
在一种实施方案中，重组技术可用于产生包含特异性CDR的抗体，该特异性CDR包括SEQ ID NO:9、11、13、27、29或31中的一种或更多种。例如，可以使用一种方法来形成人源化抗体，如本文所用，人源化抗体是指具有来源于除人以外的动物的CDR和来源于人的其它区域(框架区、恒定区等)的抗体。
例如，可以制备编码抗体的重链CDR(SEQ ID NO:9、11、13)和轻链CDR(SEQ ID NO:27、29、31)的核苷酸序列。作为DNA，示例了对应于由SEQ ID NO:8、10、12、26、28、30表示的每个CDR核苷酸序列的序列；然而，如上所讨论的，可以使用具有其他核苷酸序列的那些。DNA可以通过已知的方法制备，诸如PCR。DNA可以通过化学合成来制备。
使用这些序列，可以制备编码可变区的序列，其中重链CDR编码区(例如，SEQ IDNO:8、10、12)被移植至各自的编码人抗体中的VH的框架区(FR)的区域。同样，可以制备编码可变区的序列，其中轻链CDR编码区(例如，SEQ ID NO:26、28、30)被移植至各自的编码人抗体中的VL的FR的区域。然后可以将制备的核酸序列插入到具有编码人抗体的所需恒定区(CH或CL)的序列的载体中，从而构建人源化抗体表达载体。通过将构建的表达载体导入宿主细胞，可以获得表达人源化抗体的重组细胞。然后可以培养重组细胞，并且可以从培养物中获得所需的人源化抗体。
包含少于完整抗体的全部CDR的靶向剂可以在类似的过程中产生。例如，可以以类似的方式产生仅包括抗体的VH区或仅包括抗体的VL区而不存在恒定区的靶向剂。
用于纯化根据本文描述的方法形成靶向剂的方法没有特别限制，并且可以采用已知的技术。例如，可以收集杂交瘤或重组细胞的培养上清液，并且抗体或抗原结合片段可以通过已知技术诸如各种层析、盐沉淀、透析、膜分离等的组合来纯化。当抗体的同型是IgG时，可以通过使用蛋白A的亲和层析方便地纯化抗体。
在使用所公开的物质时，抗体或抗原结合片段可以可操作地连接到第二物质，用于靶向和将剂递送到降解的弹性纤维或递送到降解的弹性纤维附近的区域。如本文所用，术语“可操作地连接”是指直接或间接连接，其可以是永久或暂时的(例如可降解的)连接，其中两个或更多个分子、序列、颗粒或其组合以确保组分的正常功能的方式附接，并且特别是以抗体或其抗原结合片段可结合其表位的方式附接。这样，抗体或其抗原结合片段可将任何种类的有用的剂递送至结缔组织中或结缔组织附近的区域，诸如动脉、肺、皮肤等。此外，在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以直接连接至可以携带和递送一种或更多种活性剂的载体(例如，如本文进一步描述的颗粒)。因此，可以使用组合物在延长的时间内经由剂从载体中的控制释放而递送活性剂。
抗体或其抗原结合片段可用于在治疗或诊断以弹性蛋白降解为标志的疾病中递送生物活性剂，所述疾病包括心血管疾病(如动脉粥样硬化和动脉硬化)，以及肺部疾病(诸如慢性支气管炎、COPD和肺气肿)。可以包括弹性纤维降解并且抗体或其抗原结合片段可用于剂递送的其他状况可包括与动脉瘤、动脉硬化、动脉粥样硬化、遗传紊乱、钝器伤、马方氏综合征、弹性假黄色瘤、皮肤老化等相关的状况。在一种实施方案中，所述物质可用于治疗在衰老以及许多遗传和代谢紊乱中常见的血管钙化。血管钙化现在被认为是在患有其他紊乱，诸如糖尿病和慢性肾病(CKD)以及在普通人群中的心血管事件的强预测因子。所述物质可用于治疗中层动脉钙化(medial arterial calcification，MAC)，中层动脉钙化可独立于动脉粥样硬化而存在，并且通常与弹性纤维降解有关。弹性蛋白特异性中层钙化导致收缩血压(SBP)和脉压(PP)升高，并促成单纯收缩期高血压(ISH)。在一种实施方案中，所公开的物质可用于同时靶向未成熟的弹性蛋白纤维和/或内膜钙化和中层钙化中受损的弹性蛋白纤维。例如，当受试者中存在动脉粥样硬化钙化和中层钙化二者时，所公开的物质可以同时靶向两种钙化。
在一种实施方案中，所公开的物质和方法可以在稳定脆弱的动脉粥样硬化斑块方面表现出益处。已经发现动脉粥样硬化斑块包括覆盖斑块(over the plaque)产生的纤维帽。最近发现，这些纤维帽可包括未成熟的弹性蛋白(即，未完全交联和形成的)。目前研究表明，一些患者具有带有厚的纤维帽的稳定的斑块，并且一些患者有脆弱的薄帽。由于存在相对较薄的帽而导致的斑块破裂可导致死亡。所公开的抗体可以结合这些动脉粥样硬化纤维帽中的未成熟的弹性蛋白，并且从而有助于将生物活性剂例如连同载体纳米颗粒递送至局部区域。例如，能够稳定纤维帽的胶原/弹性蛋白或以能够其他方式增加帽的强度并防止破裂的剂可以通过使用靶向抗体来递送。
所述物质可应用于皮肤护理，诸如用于包括疤痕、皮肤下垂和皱纹的状况，这些情况通常由于弹性纤维的损失/降解而随着年龄增长出现，包括由于日晒(sun exposure)或其他疾病状态引起的弹性纤维的损失/降解。可能受益于递送剂的使用的患者还可以包括患有皮肤动脉状况诸如皮肤血管炎的那些患者。皮肤血管炎可引起在皮肤的小动脉中的弹力膜(elastic lamina)损伤，并且使用所述物质递送治疗组合物可减轻这种损伤。
可以通过使用抗体或其抗原结合片段递送的剂可以包括生物活性剂，诸如但不限于抗凝血剂、抗血小板剂、抗炎剂、SMC增殖抑制剂、MMP和组织蛋白酶抑制剂、细胞抑制剂(cytostatic agent)、抗氧化剂、螯合剂、弹性蛋白稳定和再生剂、细胞因子、酶、趋化因子、放射性同位素、酶活性毒素或化疗剂。
在一种实施方案中，所述物质可用于递送可包括DNA和/或RNA核酸构建体的遗传物质。可以通过使用所描述的靶向物质递送的遗传物质可以包括但不限于微RNA、转运RNA、核糖体RNA、沉默RNA、调节RNA、反义RNA、RNA干扰、非编码RNA和编码RNA、DNA片段、包括基因连同调控序列的质粒、功能构建体的前体(例如mRNA前体)、DNA/RNA探针等，以及类似遗传物质。
胱蛋白是组织蛋白酶抑制剂的一种示例性实例，可以通过使用这些物质来递送。MMP抑制剂的实例包括MMP-2、MMP-9和MMP-12的抑制剂，所有这些都与弹性蛋白降解有关。这样的MMP抑制剂可以包括但不限于四种金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)，即TIMP1、TIMP2、TIMP3或TIMP4中的一种或更多种。合成的MMP抑制剂包括包含螯合基团的抑制剂，该螯合基团结合MMP活性位点处的催化性锌原子。因此，本文包括由于MMP抑制和/或其他原因而可能有用的螯合剂。典型的螯合基团包括异羟肟酸根(hydroxamate)、羧酸根(carboxylate)、硫醇和氧膦基。四环素类抗生素诸如多西环素、米诺环素等可以通过使用所公开的抗体或其抗原结合片段来递送。
抗体或其抗原结合片段可用于递送一种或更多种免疫调节剂，该免疫调节剂可增加或降低一种或更多种细胞因子的产生，上调或下调自身抗原呈递，掩蔽MHC抗原，或促进一种或更多种类型的免疫细胞的增殖、分化、迁移或活化状态。免疫调节剂包括但不限于非甾体抗炎药(NSAID)；局部类固醇；细胞因子、趋化因子或受体拮抗剂；异源抗淋巴细胞球蛋白；等。
在一种实施方案中，用于靶向递送的生物活性化合物可以包括可用于直接处理降解的弹性蛋白的化合物。这样的化合物可以包括可以促进弹性蛋白交联从而为结缔组织提供额外的结构支持的那些化合物，以及能够上调弹性蛋白形成，特别是通过增加原弹性蛋白的形成和/或交联来上调弹性蛋白形成的化合物。例如，弹性蛋白交联剂，诸如五没食子酰葡萄糖(PGG)可以通过使用抗体或其抗原结合片段来递送。能够促进原弹性蛋白的形成和/或交联从而促进新弹性纤维形成的生物活性化合物包括赖氨酰氧化酶和/或增加赖氨酰氧化酶活性的剂，诸如铜离子或为环AMP(cAMP)诱导剂的福司可林(forskolin)。另一种可用于促进原弹性蛋白交联的化合物是TGF-β，其已被证明能增加赖氨酰氧化酶活性。铜离子(Cu2+)通过使电子能够从氧转移以促进弹性蛋白中赖氨酸残基的氧化脱氨和醛形成，可以增强内源性赖氨酰氧化酶的细胞外转运以及内源性和外源性赖氨酰氧化酶的功能活性。因此，抗体或其抗原结合片段可以直接或间接地与铜离子连接，用于递送至降解的弹性纤维。
在一种实施方案中，可递送可以溶解矿物质的剂，诸如例如，乙二胺四乙酸(EDTA)，其已经被证明是多用途的螯合剂(versatile chelating agent)；钙特异性螯合剂乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)；乙二醇四乙酸；腈基三乙酸，羟乙基乙二胺三乙酸；8-羟基-7-碘-5-喹啉磺酸；聚(γ-谷氨酸)；硫代硫酸钠；α-硫辛酸；双膦酸盐；二乙烯三胺五乙酸(DTPA)；和/或本领域已知的其他螯合剂。
抗体或其抗原结合片段可以直接或间接地连接至成像剂。当经由抗体与降解的弹性纤维结合时，成像剂可用于确定弹性纤维降解的位置和程度以及诊断相关或不相关的疾病状况。成像剂可以包括本领域已知的用于CT或MRI扫描或SPECT成像的那些成像剂。可直接或间接地连接到物质的可检测标志物可以包括光活化剂(photoactivatable agents)、荧光团、放射性同位素、生物发光蛋白或肽、荧光标签(例如荧光素、异硫氰酸酯(FITC)、花青染料等)、荧光蛋白或肽、亲和标记物(例如生物素、亲和素、蛋白A等)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、或同位素标记物(例如125I)、金颗粒、棒(rod)，x-射线不透明物质，和微气泡(例如用于超声成像)，或允许检测抗体和任选地对区域进行成像的任何其他这种可检测部分。
如所提到的，抗体或抗原结合片段可以直接连接至松散物质(bulk material)(通常但不一定是颗粒形式)，该松散物质可以携带用于递送至降解的弹性纤维的区域的剂。通常，能够形成有用的尺寸和形状的任何大块生物相容性合成物质或天然物质都可以用于形成载体。在一种实施方案中，可以使用聚合物颗粒。例如，可以使用由天然或合成聚合物形成的颗粒，该天然或合成聚合物包括但不限于聚苯乙烯、聚(乳酸)、聚缩酮、丁二烯苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸-乙烯基三元共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸烷基酯)、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯基吡啶)、聚(二乙烯基苯)、聚(对苯二甲酸丁二醇酯)、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯、聚(乙二醇)等，或者其醛、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物。可以使用由生物聚合物诸如蛋白质形成的颗粒。例如，可以使用由白蛋白(例如，牛血清白蛋白)、葡聚糖、明胶、壳聚糖、树枝状大分子、脂质体等形成的颗粒。在某些实施方案中，这种颗粒是优选的，因为它们可以根据已知方法在不使用有机溶剂的情况下形成。可用于形成载体颗粒的其它生物相容性物质可包括但不限于氧化物诸如二氧化硅、二氧化钛、氧化锆等，以及贵金属(noble metal)诸如金、银、铂、钯等。通常，所述物质将是生物相容的和非免疫原性的。合适的生物可降解物质可以包括但不限于多糖和/或聚(乳酸)均聚物和共聚物。例如，可以使用由聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)共聚物、聚(乙二醇)(PEG)/聚(乳酸)(PLA)嵌段共聚物及其衍生物形成的颗粒。
松散载体物质的选择可用于提供生物活性剂从负载颗粒中的释放速率的控制。例如，选择可生物降解的物质可以用来控制剂释放的速率，并提供可以在很大程度上通过颗粒降解速率并且在较小程度上通过活性剂扩散透过和离开大颗粒来控制的释放机制。可以使用所述物质，使得活性剂释放速率受到扩散(例如，不可降解颗粒)或纳米颗粒降解速率(例如，由于小的基质网孔尺寸，活性剂基本上不扩散透过颗粒)之一的限制，或者受到其可以被设计成期望的释放速率的某种组合的限制。
颗粒可以是微粒或纳米颗粒。如本文所用，术语纳米颗粒通常是指其尺寸(即平均直径)可为约1000纳米(nm)或更小，通常为约500nm或更小，例如约200nm或更小，或约100nm或更小的颗粒。在一种特定的实施方案中，纳米颗粒的尺寸可以为约50nm或更小，例如平均直径约20nm。在一种实施方案中，纳米颗粒可以具有约50nm至约400nm，或从约100nm至约300nm的平均直径。
可选地可以使用更大的颗粒。例如，在其他实施方案中，具有高达约50微米(μm)的平均尺寸的微粒可以用作载体。
通常，颗粒的优选尺寸可取决于具体应用，例如剂的具体递送方法，诸如经由表面应用(如在霜剂或洗剂中)、经由使用循环系统或消化道的肠胃外注射、经由吸入等，以及剂从颗粒中的期望释放速率。例如，颗粒可以具有阻止细胞摄取的尺寸，从而保留在细胞外基质中，并可用于与受损的弹性纤维相互作用。因此，在一种实施方案中，颗粒可以为约100nm或更大，因为更小的颗粒已被证明具有较高的细胞摄取。颗粒也可以足够小，以穿透内皮和穿透基底膜，从而接触结缔组织的弹性纤维。例如，在一种实施方案中，颗粒的平均直径可以为约400nm 或更小，以便穿透内皮和基底膜。当意图用于静脉施用制剂时，通常不偏向大颗粒(例如，大于约1μm)，因为它们会滞留在微血管中。此外，较大的颗粒可在体内积聚或聚集。因此，对于静脉内施用，通常使用低于1μm的颗粒。
通常，颗粒载体的形状可以大体上是球形的，尽管其他形状也适合使用，包括但不限于板、棒、条、不规则形状等。如本领域技术人员将理解的，颗粒的组成、形状、尺寸和/或密度可以广泛变化。
颗粒可以被设计成具有期望的表面电荷，以更好地靶向受损的弹性纤维。例如，与带负电的颗粒相比，带正电的纳米颗粒显示出更好的细胞摄取。因此，在一种实施方案中，颗粒可以用负表面电荷研制，以将颗粒保持在细胞外基质中并避免细胞摄取。
颗粒可以根据任何合适的方法负载一种或更多种剂。例如，沉淀方法可用于在一步形成方法中形成负载颗粒。根据该方法，颗粒松散物质(例如生物相容性聚合物，诸如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯或PGA/PLA共聚物)可以溶解在溶剂中。合适的溶剂可以取决于所涉及的具体物质。例如，可以使用有机溶剂，包括丙酮、四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或乙腈等。该溶液可以经过标准处理，诸如声处理等，以充分溶解聚合物。然后，可以将溶液添加，通常逐滴添加到第二溶液中。自发地或在乳化方法之后，例如在声处理之后，松散物质(bulk material)的颗粒可以在第二溶液中形成。
当使用一步形成方法时，用于递送的剂(例如治疗剂)也可以包含在第一溶液或第二溶液中。在颗粒形成时，剂可以与松散物质一起掺入颗粒中。
颗粒内或颗粒上的剂的初始浓度将根据剂的性质、递送速率等明显变化。例如，在一种实施方案中，颗粒中/颗粒上的生物活性剂的负载浓度可以从按颗粒的重量计的约4wt.％变化至大于约40wt.％，根据具体的剂、颗粒松散物质等，可以具有更高或更低的浓度。例如，在用于递送的剂在颗粒松散物质中表现出高溶解度的实施方案中，可以获得非常高的负载水平，特别是当两种物质都是高度疏水时。
形成方法可以包括两步方法，其中首先形成颗粒，随后是第二负载步骤，其中一种或更多种活性剂被负载到形成的颗粒中或负载到形成的颗粒的表面上。例如，方法可以包括在包含用于递送的剂的溶液中将预成型的、任选地交联的聚合物颗粒溶胀，以便经由扩散过程负载颗粒。在另一种实施方案中，负载方法可以包括双乳液聚合，双乳液聚合能够将亲水性化合物负载至疏水性颗粒中。用于纳米颗粒的形成方法没有特别限制，并且可以使用本领域已知的其他形成方法，例如声处理法、溶剂沉淀法等。
可以形成负载颗粒，以便控制活性化合物从颗粒中释放的速率。合适的控制机制是本领域技术人员已知的。例如，如已知的，释放速率可以取决于用于递送的剂与松散颗粒物质的相对浓度、松散纳米颗粒物质的分子量和降解特性、聚合物颗粒基质的网孔尺寸、颗粒表面和剂之间的结合机制等。在任何这些情况下，本领域的普通技术人员能够设计一种系统以获得期望的释放速率。例如，在纯扩散限制释放的情况下，这种控制可以通过改变颗粒内的剂的浓度和/或颗粒尺寸、颗粒聚合物网孔尺寸等来实现。在纯降解限制释放的情况下，聚合物单体单元，例如PLGA聚合物的乙醇酸含量，和/或颗粒松散物质的分子量以及颗粒尺寸可以被调节以“微调”活性化合物释放速率。例如，使用具有较高乙醇酸含量和较低分子量的PLGA聚合物可以导致用该聚合物形成的颗粒的降解速率增加。使用上述参数可以调节剂从颗粒中的释放速率，从而产生能够持续从几天到几个月变化的时间段持续释放的载体，最大释放速率通常从几小时到几周变化。
用于递送的剂不一定掺入到松散物质内部。例如，在一种实施方案中，剂可以键合至颗粒的表面。例如，使用类似于以下关于表位结合抗体或片段与颗粒结合的更详细描述的化学，可以将剂键合至颗粒的表面。
抗体或抗原结合片段可以根据任何合适的方法与载体缀合。例如，颗粒可以包括促进颗粒与抗体缀合的表面反应基团。表面活性基团可以包括但不限于醛、羧基、氨基、羟基等。如本领域中通常已知的，表面活性基团可以存在于形成的颗粒表面上，或者可以在形成后添加到形成的颗粒的表面上，例如经由氧化、胺化等。然后抗体或片段可以与颗粒缀合，例如通过与马来酰亚胺反应，其中抗体是巯基化抗体。
抗体或片段可以经由非特异性吸附或共价键附接到载体(例如颗粒)上。优选的附接方法通常可以取决于形成的缀合物的期望的应用。例如，在那些系统被设计成在体内发挥作用的实施方案中，预期载体颗粒会发生与各种生物制剂和组织的多次碰撞。因此，在这样的实施方案中，共价结合可以是优选的，以更好地确保抗体/片段将不会经由颗粒与其他物质的碰撞而移位。
用于将抗体/片段(以及任选地，另一种剂诸如活性治疗剂)结合到载体表面的具体化学没有特别限制。例如，在一种实施方案中，抗体或片段可以根据多肽的胺基团和氯甲基化颗粒的烷基氯之间的亲核取代反应附接到颗粒上。在另一种实施方案中，可溶性碳二亚胺(EDC)和戊二醛化学可分别用于实现多肽的胺基团与羧基化颗粒和胺化颗粒的共价结合。根据又另一种实施方案，肽可以通过链霉亲和素单层与颗粒初始共价附接，随后通过可控附接所需量的生物素化抗体而与颗粒键合。根据又另一种实施方案，抗体/片段可以使用能够交联肽的胺基团和聚合物颗粒的C-H或C-C键的光反应性试剂交联剂共价附接到颗粒，例如叠氮苯交联剂，诸如从Pierce Inc.可得的磺基-HSAB(N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯)。
在一种实施方案中，分子间隔物，例如亲水性间隔物，可用于将抗体/片段拴系(tether)到颗粒。使用间隔物可以防止共价结合的肽与颗粒表面的相互作用，并且因此防止抗体/片段的可以导致部分或完全丧失功能的结构变化。间隔物可以包括长的(例如，重均分子量在约2,000和约20,000Da之间)亲水性聚合物，诸如但不限于聚(乙二醇)、聚乙烯醇、多糖等。
间隔物和颗粒可以包含或被加工成包含官能度(functionality)，以便于促进彼此结合。例如，PEG间隔物可以包含醛官能度，并且可以通过间隔物的醛基团和颗粒的胺基团之间的共价反应结合至胺化颗粒。然后可以根据简单的方法将巯基化抗体/片段附接至间隔物，所述简单的方法包括在存在马来酰亚胺的情况下将包含巯基化抗体的溶液与颗粒的水性悬浮液混合。
在缀合的最后阶段，载体颗粒可以被例如用表面活性剂，诸如
Figure BDA0003262448430000211
20、
Figure BDA0003262448430000212
或右旋糖酐封闭，表面活性剂可以被吸附在颗粒上以封闭暴露于溶液中的任何疏水表面并置换(displace)任何未附接的剂。低浓度的这样的物质通常不会干扰剂的活性。表面活性剂的存在可以减少不需要的蛋白-颗粒相互作用并防止颗粒聚集。在使用可能会使系统失活的物质的环境中，它还可以防止颗粒表面被其他蛋白非选择性地“污染(fouling)”。
在一种实施方案中，载体可以被设计成对于需要的应用表现出锚定特性。例如，结合能力和载体颗粒可以保持附接于降解的弹性纤维的时间长度可以通过改变颗粒尺寸和/或颗粒表面上靶向抗体/片段的浓度来设计。
缀合化合物可以根据任何合适的方法递送至降解的弹性纤维，通常取决于靶纤维的位置。例如，当考虑全身递送方法时，诸如静脉内递送途径，缀合物可以循环，直到接触到受损的弹性纤维，这仅仅是为了说明的目的，而非意图限制，如在弹性组织变性的情况下。当经由抗体/片段结合至弹性纤维时，剂可以促进检测或者可以经由例如颗粒降解、扩散等从颗粒中释放以提供所需的活性。可以根据多种递送方法应急地(acutely)或长期地递送或施用化合物，包括结合血管周(perivascular)或血管内斑块的持续释放方法、局部应用、静脉内递送、渗透泵、吸入等。
参考以下的实施例可以更好地理解本公开内容。
形成方法
单克隆抗体形成
将匙孔戚血蓝蛋白(KLH)与大鼠弹性蛋白的选定氨基酸肽片段(即SEQ ID NO:1-3之一)缀合。使用标准方案，对RBF/dnj或balb/c小鼠用总体积为200μL的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的100μg总KLH-肽蛋白和
Figure BDA0003262448430000221
佐剂的初始剂量进行皮下(s.c.)致敏。14天后，在弗氏不完全佐剂中给予随后的增强剂。然后以21天间隔给予不含佐剂的增强剂，共进行4次免疫接种。最后一次免疫接种通过腹膜内(i.p.)注射给予。最后一次免疫接种后5天，在CO2室中对小鼠实施安乐死，并且收获脾以获得细胞，然后在聚乙二醇(PEG)存在下将细胞与FOX-NY或Sp2/0-Ag14骨髓瘤融合，以制备将在96孔微量滴定板中使用标准细胞培养程序培养的杂交瘤。融合后14天，通过ELISA步骤筛选来自这些粗杂交瘤混合物的上清液针对未缀合的游离肽片段的免疫反应性。通过限制稀释进一步培养和克隆阳性杂交瘤以获得分泌单克隆抗体的细胞系(杂交瘤)。然后再次检查杂交瘤培养物上清液的特异性，并对同种型和技术应用进行全面表征。
多克隆抗体形成
将匙孔戚血蓝蛋白(KLH)与大鼠弹性蛋白的选定氨基酸肽片段(即SEQ ID NO:1-3之一)缀合。用总体积为200μL的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的100μg总KLH-肽蛋白和
Figure BDA0003262448430000222
佐剂的初始剂量对新西兰白兔进行皮下(s.c.)致敏，在两个肩部区域的每一个和两个后臀部区域的每一个处给予。14天后，在弗氏不完全佐剂中给予随后的增强剂。然后以21天间隔给予不含佐剂的增强剂，共进行5次免疫接种。10天后，对兔实施安乐死并抽血，让血液凝结，并且离心后收集血清。然后对血清进行抗体滴度表征。
纳米颗粒形成
1)负载DiR染料的纳米颗粒(用于荧光标记和体内成像)
通过凝聚作用制备负载DiR染料的颗粒。简而言之，通过将250mg牛血清白蛋白(BSA)(SeraCare,MA)溶解在4mL去离子水中，获得负载荧光红外染料1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚三碳菁碘(DIR)的纳米颗粒(DIR-NP)。然后，将2.5mg DIR溶解在100μL丙酮中，并加入至BSA溶液。搅拌一小时后，在连续声处理(Omni Ruptor 400UltrasonicHomogenizer,Omni International Inc,Kennesaw,GA)下，经半小时将混合物逐滴加入到24mL乙醇中。为了交联，在搅拌过程中加入戊二醛(EM级70％，EMS，PA)(42μg每mg BSA)。接下来，将10mg DIR-NP与2.5mg异双官能交联剂α-马来酰亚胺-ω-N-羟基琥珀酰亚胺酯聚(乙二醇)(马来酰亚胺-PEG-NHS酯，MW 2000Da，Nanocs Inc.,NY)孵育，以获得巯基反应性颗粒系统。使用特劳特试剂(34μg，G-Biosciences,Saint Louis,MO)将10μg作为对照的兔抗大鼠弹性蛋白抗体(United States Biological,Swampscott,MA)或针对本文所述序列形成的抗体硫醇化，并且将混合物在HEPES缓冲液(20mM，pH＝9.0)中室温孵育1小时。将硫醇化抗体用HEPES缓冲液冲洗，并添加至纳米颗粒(4μg抗体每1mg NP)，并孵育过夜以缀合。
2)负载EDTA (螯合剂)的纳米颗粒
通过将200mg BSA (SeraCare，MA)和100mg乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)(FisherScientific，NJ)溶解在4mL去离子水中，并将pH调节至8.5，获得负载EDTA的纳米颗粒(EDTA-NP)。在探针声处理持续1小时下，将水溶液逐滴加入至16mL乙醇。为了交联，在声处理过程中加入戊二醛(10μg每mg BSA)。弹性蛋白抗体缀合过程类似于DIR-NP的过程。
3)负载PGG的纳米颗粒(用于稳定弹性蛋白)
通过将250mg BSA (SeraCare,MA)溶解在4mL去离子(DI)水中，获得负载PGG的纳米颗粒(PGG-NP)。将PGG(125mg)溶解在400μl二甲基亚砜中，并缓慢加入至BSA溶液中。搅拌一小时后，在连续声处理半小时下，将混合物逐滴加入至24mL乙醇中。在搅拌过程中以12μg/mg蛋白(BSA)的浓度加入戊二醛。弹性蛋白抗体缀合过程类似于DIR-NP的缀合过程。
4)负载有MMP抑制剂BB-94的纳米颗粒
使用基于溶剂扩散的纳米沉淀法制备聚(D,L-丙交酯)(PLA)纳米颗粒。将PLA(平均MW 75k-120k)(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)溶解在丙酮(VWR International,Radnor,PA)中。将1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG(2000)马来酰亚胺)(Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,AL)和BB-94(SigmaAldrich,St.Louis,MO)溶解于二甲基亚砜(DMSO)(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)中，然后将上述溶液加入至PLA溶液。保持在4℃声处理(Omni Ruptor 4000)20分钟下，将聚合物溶液逐滴加入(16μl/sec)至水中。声处理后，将颗粒用蒸馏水洗涤两次，在4℃、14000x g离心30分钟，并且然后在蒸馏水中重悬。所有实验的非溶剂(水)与溶剂(丙酮)的比为1:15。制备包含5:1、10:1和15:1的聚合物与BB-94的比的三个不同批次，其中两种聚合物(PLA:DSPE-PEG(2000)马来酰亚胺)的比为4:1。弹性蛋白抗体缀合过程类似于DIR-NP的缀合过程。
5)负载盐酸多西环素的纳米颗粒
负载盐酸多西环素(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)的BSA纳米颗粒用类似的过程制备。简而言之，将25mg盐酸多西环素(<DOXTot)与100mg BSA(BSATot)一起溶解于2mL水中，并允许以500rpm搅拌30分钟。随后，使用自动分液器以1ml/min的速度逐滴加入4mL乙醇，这使得溶液浑浊。向其中加入8％戊二醛(40μg/mg BSA)以交联白蛋白，并且将混合物在室温搅拌2小时。所得溶液以14,000rpm离心10分钟，以分离形成的纳米颗粒。将纳米颗粒用DI水洗涤三次，然后继续抗弹性蛋白抗体缀合。通过使用UV分光光度计(BioTek InstrumentsInc.,Winooski,VT)测量273nm处的吸光度，使用从洗脱获得的上清液来估计游离多西环素的量(DOXF)。DOXTot和DOXF之间的差异给出了约17％的封装的多西环素的量(DOXNP)。
实施例1
如所描述的，针对SEQ ID NO:1(GALGPGGKPPKPGAGLL)形成单克隆抗体和多克隆抗体。
大鼠和小鼠主动脉(n＝8)购自BioChemed Inc。弹性蛋白酶溶液通过将猪胰腺弹性蛋白酶(10U/mL)溶解在DI水中制备。将主动脉系在缝合线上，并且将主动脉的下半部分在37℃悬浮在弹性蛋白酶溶液中持续1小时。然后在盐水中彻底洗涤主动脉，并将整个主动脉在10mg/mL的用SEQ ID NO:1的单克隆抗体加标签的DiR-NP的溶液中孵育过夜。随后，主动脉在摇床上用盐水洗涤90分钟，并使用IVIS成像系统成像。图1示出了大鼠主动脉的结果，并且图2示出了小鼠主动脉的结果。如所示的，抗弹性蛋白抗体优先地键合到包含降解的弹性纤维的主动脉部分。
8只6周龄的斯普拉格-杜勒雄性大鼠通过外膜周应用0.5M CaCl2 3次，每次5分钟，经受腹主动脉损伤。损伤10天后，向大鼠注射浓度为10mg/kg、用SEQ ID NO:1的抗弹性蛋白单克隆抗体加标签的BSA-DiR NP。注射后24小时，对动物实施安乐死，并使用IVIS成像系统对它们的主动脉进行纳米颗粒靶向成像。如图3所示，抗体成功地靶向主动脉中受损的弹性蛋白(正方形区域)，同时放过主动脉其他部分中的健康弹性蛋白。
实施例2
处理钙化的人腿部动脉的一部分并包埋在石蜡中。切取5μm的切片并封固在带正电的载玻片上并进行组织学分析。使用商购可得的IHC试剂盒(Enzo Life Sciences)进行免疫组化(IHC)，以SEQ ID NO:1的单克隆抗体作为一抗(10μg/mL)检测弹性蛋白。此外，伟郝夫范吉森(VVG)染色被用来识别断裂(或受损)的弹性蛋白纤维。IHC显示，SEQ ID NO:1的抗体能够成功地标记动脉中存在的受损的弹性蛋白(由图4的较暗区域指示)。伟郝夫范吉森(VVG)染色示出了弹性蛋白断裂和受损(图6，图7)。尽管用VVG可以看到受损的弹性蛋白纤维，但是当与仅对照抗体孵育时，弹性蛋白的IHC没有显示出任何暗染色(图5)，有效地证实了SEQ ID NO:1的抗体能够识别和结合受损弹性纤维的人弹性蛋白，而对照抗体不能。
实施例3
在6周龄雄性斯普拉格-杜勒(SD)大鼠(n＝6)中建立肺气肿模型，大鼠接受气管内注射溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)并过滤灭菌的50U猪胰腺弹性蛋白酶(PPE)(ElastinProducts Company Inc.,Owensville,MO)。经过弹性蛋白酶处理的大鼠在四周内出现了弹性蛋白损伤。对动物实施安乐死并用盐水冲洗全身后，小心地分离主动脉。肺的一部分被处理并包埋在石蜡中。制作五微米厚的切片，并使用IHC试剂盒(Enzo Lifesciences)，使用本文描述的单克隆抗体作为一抗，对多种组织进行免疫组化。石蜡包埋切片的IHC根据制造商的方案进行。对于所有实验，抗体浓度保持在10μg/mL。
类似的方案被用于开发小鼠的肺气肿模型和小鼠的AngII动脉瘤模型。图8-图11示出了包括大鼠肺的弹性蛋白酶肺气肿模型(图8)、小鼠肺的弹性蛋白酶肺气肿模型(图9)、小鼠主动脉的AngII动脉瘤模型(图10)和弹性蛋白酶处理的小鼠皮肤(图11)的动物模型中，与针对SEQ ID NO:1的单克隆抗体孵育后多种组织的IHC染色。如所示的，针对SEQ IDNO:1产生的抗体能够标记多种不同组织类型中受损的弹性蛋白。
图8和图12示出了用针对SEQ ID NO:1产生的抗体孵育后，来自大鼠组织的肺气肿模型的肺组织。图13和图14示出了用对照抗体孵育后来自肺气肿大鼠模型的肺组织。可以看出，针对SEQ ID NO:1的抗体显示出与受损组织的良好结合。
实施例4
将小鼠麻醉，并将充满血管紧张素的渗透泵置于垂直于动物脊柱制成的皮下袋中。两周后，动物在它们的主动脉中自发形成动脉瘤。包含弹性蛋白损伤的主动脉部分被处理并包埋在石蜡中。制作5微米厚的切片，并使用IHC试剂盒(Enzo Lifesciences)，使用针对SEQ ID NO:1产生的单克隆抗体(mAb RE2)抗体作为一抗进行免疫组化。石蜡包埋切片的IHC根据制造商的方案进行。对于所有实验，抗体浓度保持在10μg/mL。小鼠主动脉的实例在图15和图16中示出。由图中的深色区域可以看出，抗体与降解的弹性蛋白键合。
实施例5
图17-20中所示的肺组织是从8周龄雄性C57BL/6小鼠中获得的，所述小鼠接受了溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)并过滤灭菌的0.50U猪胰腺弹性蛋白酶(PPE)(ElastinProducts Company Inc.,Owensville,MO)的气管内注射。经弹性蛋白酶处理的小鼠在四周内出现弹性蛋白受损。对动物实施安乐死并用盐水冲洗全身后，分离主动脉。肺的一部分被处理并包埋在石蜡中。制作5微米厚的切片，并使用IHC试剂盒(Enzo Lifesciences)，使用针对SEQ ID NO:1产生的单克隆抗体mAb RE2作为一抗，对多种组织进行免疫组化。石蜡包埋切片的IHC根据制造商的方案进行。对于所有实验，mAb RE2的浓度保持在10ug/mL。
图17和图18示出了用针对SEQ ID NO:1产生的抗体进行的IHC的切片，并且图19和图20示出了用对照抗体进行的IHC的切片。可以看出，针对SEQ ID NO:1的抗体与受损组织紧密结合。
实施例6
皮肤组织从8周龄无毛小鼠品系获得。将动物皮肤分成四份，并且皮内注射溶解在磷酸盐缓冲盐水中并过滤灭菌的猪胰腺弹性蛋白酶(30U)。两周后和四周后重复这一过程。皮肤中的弹性蛋白由于弹性蛋白酶活性而受损。动物被安乐死，并且皮肤被小心地收集和冷冻。皮肤样品随后被处理并包埋在石蜡中。制作5微米厚的切片，并使用IHC试剂盒(EnzoLifesciences)，使用mAb RE2抗体作为一抗进行免疫组化(图21和22)。图23和图24示出了使用对照抗体的结果。石蜡包埋切片的IHC根据制造商的方案进行。对于所有实验，抗体浓度保持在10μg/mL。
实施例7
蛋白印迹和银染用于检测所公开的抗体与原弹性蛋白的结合。使用细胞培养基、α弹性蛋白标准品和来自弹性蛋白酶消化的大鼠主动脉的上清液，通过针对SEQ ID NO:1产生的单克隆抗体和作为对照产生的小鼠单克隆弹性蛋白抗体(在杂交瘤之前从小鼠产生的单克隆抗体)来测试弹性蛋白的检测。银染(图25)示出了可溶性弹性蛋白在75kDa和50kDa蛋白标志物之间，但是两种抗体都不能检测可溶性弹性蛋白。当使用弹性蛋白酶消化的主动脉样品时，兔多克隆抗体显示在50kDa蛋白质标志物附近的条带。对于弹性蛋白酶消化的主动脉样品，小鼠单克隆在150kDa标志物以上有一个非常特异的单一条带，但细胞培养基没有条带。
实施例8
针对人弹性蛋白序列SEQ ID NO:3(PGGYGLPYTTGKLPYGYP)形成单克隆IgG1同种型抗体。
使用H&E染色的IHC(图26)示出了对患有轻度动脉瘤的人主动脉中降解的弹性蛋白的特异性。弹性蛋白VVG染色中的圈出部分(图27)显示弹性蛋白降解，并且同一区域显示抗体与切片结合(图28)。仅对照二抗显示无信号(图29)。
使用H&E染色的IHC(图30)示出了对患有轻度动脉瘤的人主动脉中降解的弹性蛋白的特异性。弹性蛋白VVG染色中的圈出部分(图31)显示弹性蛋白降解，并且同一区域显示抗体与切片结合(图32)。仅对照二抗显示无信号(图33)。
实施例9
新鲜的人颈动脉内膜切除术(CEA)样品分成两部分：一部分用于使用负载针对SEQID NO:3产生的抗体的DiR-NP的靶向(ELN组)，并且另一部分用于使用不含弹性蛋白抗体的DiR-NP的靶向(对照组)。将样品在4℃孵育12小时。然后用PBS洗涤样品，并且用IVIS测试纳米颗粒附接。IVIS结果(图34)示出，ELN缀合的DiR-NP附接于动脉中降解的和未成熟的弹性蛋白，而没有抗体的对照NP不附接。
然后样品经受脱钙以进行组织学制备，并包埋在
Figure BDA0003262448430000281
中以获得冰冻切片用于染色。如图35和图36所示，通过直接检查(左图)、H&E染色(中图)和VVG染色(右图)可以看到纳米颗粒对动脉粥样硬化中的弹性蛋白的靶向。没有抗体的对照NP(下图)没有被靶向。
实施例10
表征了表达针对人弹性蛋白序列SEQ ID NO:3形成的单克隆IgG1同种型抗体的杂交瘤。按照
Figure BDA0003262448430000291
试剂的技术手册从杂交瘤细胞中分离总RNA。然后按照PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。根据GenScript的cDNA末端快速扩增(RACE)的标准操作程序，扩增抗体片段VH、VL、CH和CL。将扩增的抗体片段分别克隆至标准克隆载体中。进行菌落PCR以筛选具有正确大小插入物的克隆。对每个片段测序不少于5个具有正确大小的插入物的克隆。对不同克隆的序列进行比对，并且获得共有序列。
图37示意性地示出单克隆抗体。通过对恒定区的序列进行分析，同种型为小鼠IgG/κ。对于共有序列，对五个克隆的VH、CH、VL和CL序列进行测序，所有序列具有大于99％的序列同一性。以下的表1提供了对V(D)J连接的IMGT分析。所有可变序列都是有效的，并且没有检测到D区段。
表1
Figure BDA0003262448430000292
SEQ ID NO:4提供了单克隆抗体的重链的完整的DNA序列，并且SEQ ID NO:5提供了完整氨基酸序列。SEQ ID NO:6(nt)和SEQ ID NO:7(aa)提供了重链的可变区的序列，而CDR区和FR区在SEQ ID NO:8-21中描述。SEQ ID NO:22提供了单克隆抗体的轻链的完整的DNA序列，并且SEQ ID NO:23提供了完整氨基酸序列。SEQ ID NO:24(nt)和SEQ ID NO:25(aa)提供轻链的可变区的序列，而CDR区和FR区在SEQ ID NO:26-39中描述。
实施例11
柠檬酸盐加帽的金纳米颗粒(citrate capped gold nanoparticle，GNP)购自Meliorum Technologies,Rochester,NY，平均尺寸为150±25nm。将异双官能硫醇-PEG-酸(SH-PEG-COOH)(2000MW，Nanocs,New York,NY)以4:1的重量比加入至GNP，并且混合物在4℃伴随温和摇动孵育48小时，以实现聚乙二醇化。在室温以10,000rpm离心20分钟后收集聚乙二醇化的GNP，并重悬在0.1M MES(pH:5.5)中。如本文描述的，使用EDC/NHS化学将聚乙二醇化的GNP与抗弹性蛋白抗体缀合。简而言之，将EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐)(Oakwood Chemical,Estill,SC)和磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)(SigmaAldrich,St.Louis,MO)分别以2:1和4:1的重量比加入至聚乙二醇化的GNP。将该混合物伴随温和涡旋在室温孵育6小时。在室温以10,000rpm离心20分钟后，收集得到的GNP，并重悬在1mL PBS(pH 7.8)中。向每mg GNP添加4μg抗弹性蛋白抗体，并且混合物在4℃缓慢摇动孵育过夜。通过将所得溶液以10,000rpm离心20分钟来除去过量的抗体。将得到的抗体/纳米颗粒缀合物重悬在盐水中至3mg/mL的浓度用于注射。
从杰克逊实验室(Bar Harbor,ME)获得15只雄性低密度脂蛋白受体缺陷型(LDLr)(-/-)小鼠(2月龄，在C57BL/6背景上)。11只小鼠用于动脉瘤研究，而另外4只小鼠用作健康的年龄对照。通过全身输注血管紧张素II(AngII，Bachem Americas，Torrance，CA)结合具有饱和脂肪(21％wt/wt)和胆固醇(0.2％wt/wt；目录号TD88137；Harlan Teklad)的饮食诱导动脉瘤。简而言之，在AngII输注前1周和AngII输注期间的6周向小鼠饲喂高脂饮食。在异氟醚麻醉下，将充满AngII的渗透泵(Model 2004；Alzet,Cupertino,CA)通过小鼠右后肩处的切口皮下植入。在整个手术过程中，小鼠吸入2％至3％的异氟醚作为麻醉剂。AngII的泵送速率被设定为1000ng/kg/min。植入后4周移出(explant)泵，并且允许小鼠恢复2周。通过使用线性阵列探头(MS-550D，宽带频率22MHz-55MHz)，使用高频超声机FujifilmVisualSonics Vevo 2100(Fujifilm VisualSonics,Toronto,ON,Canada)监测疾病进展。
在吸入2％-3％异氟醚的情况下，通过眶后注射给予小鼠(n＝15)10mg/kg动物体重的剂量的EL-GNP作为对比剂。注射后24小时对小鼠实施安乐死，并分离整个主动脉(从升主动脉到髂总动脉杈)。在显微CT扫描前，清除主动脉周围的结缔组织。将主动脉浸入玉米油中，并用高性能体内显微CT系统(Skyscan 1176,Bruker,Billerica,MA)成像(90kV,250mAs,300ms,0.2mm Al滤器)。使用基于Feldkamp算法的Skyscan Nrecon软件进行重建。主动脉的重建图像被可视化，并使用DataViewer和CT-Vox软件测量动脉瘤的尺寸。获得3D最大强度投影(MIP)图像(图38，左)以确定EL-GNP在主动脉内的分布，同时获得衰减图像(图38，右)以研究由EL-GNP和组织两者给出的信号的强度。使用CT-An软件进一步量化信号强度。
用CytoViva的增强暗场显微镜光学系统(CytoViva,Inc.，Auburn,AL)对冰冻切片组织样品(5μm)进行检查。该系统(Olympus BX51)采用浸油(类型A,nd>1.515,CargilleBrand)超暗场聚光器和具有在1.2至1.4的可调节数值孔径的40×空气平面-FL物镜。照明由Fiber-Lite DC-950调节层压机提供。使用Exponent 7软件以2.8的增益和53ms的曝光时间来获得增强的暗场显微图像(图39)，以可视化EL-GNP。使用超光谱成像仪(安装在显微镜上，并由Exelis Visual Information Solutions,Inc.的Environment forVisualization软件控制)以曝光时间为0.25ms，全视场(643行)提取光谱信息，用于绘制样品中的EL-GNP(图41)。对阴性对照样品进行成像和分析，以建立光谱库作为参考。通过从阳性对照的光谱库减去阴性对照的光谱库以应用过滤的光谱库来实现绘制。
动脉瘤和健康主动脉的冰冻切片用于组织学分析(图40)。主动脉在缓冲的福尔马林中固定，在DI水中洗涤后包埋在最佳切割温度(OCT)化合物(Sakura Finetek,Torrance,CA)中，并按照标准程序切片。将五微米的切片封固在带正电荷的玻璃载玻片上。将载玻片放入100％预冷丙酮(Fisher Science Education,Nazareth,PA)中10分钟，以将组织粘附到载玻片上。随后，用自来水冲洗载玻片3分钟，以去除OCT化合物用于进一步染色。载玻片用伟郝夫范吉森(VVG)染色，以确定不同样品中的弹性蛋白损伤。
图39和图40呈现了主动脉的两个切片(图像中的左和右)的暗场图像(图39)和VVG染色图像(图40)。如可以看出的，在图39的左图中可以看到更强的暗场图像信号，显示了相比每一个图右侧的组织切片所示的更多的弹性纤维受损(左，图40)，每一个图右侧的组织切片主要包含完整的弹性蛋白纤维(右，图40)。在降解的弹性蛋白暴露的位置发现由金纳米颗粒给出的信号，由图像中较暗的箭头指示，而健康和完整的弹性蛋白纤维没有GNP信号，如由图像中较亮的箭头指示的。
图41提供了通过使用抗体加标签的EL-GNP对金纳米颗粒标记的肾上主动脉组织进行高光谱作图的结果。图41的行从上到下分别对应主动脉壁内具有不同水平(从高到低)的弹性蛋白损伤的肾上主动脉。第一列(A)展示了VVG染色后的明场显微术图像(40X)，并展示不同的弹性蛋白降解水平。第二列(B)展示了增强的暗场显微术(40X)图像，显示组织中高对比度的EL-GNP的存在，如箭头指示的。第三列(C)包括高光谱图像(40X)。第四列(D)包括相对于用阴性对照生成的相应参考光谱库绘制的高光谱图像。与暗场显微术(图39)相比，这确定了EL-GNP的更广泛分布。此外，随着组织显示更多的弹性蛋白受损，绘制的EL-GNP数量增加。
尽管已经参照其具体实施方案详细描述了本主题，但是将理解，本领域技术人员在理解了前述内容后，可以容易地产生对这些实施方案的改变、变化形式和等效物。因此，本公开内容的范围是以示例性的方式，而不是以限制性的方式，并且本公开内容不排除包含对本主题的修改、变化形式和/或添加，这对于本领域普通技术人员来说是明显的。
CXU-985-PCT序列
SEQ ID NO.1：抗原
Figure BDA0003262448430000331
SEQ ID NO.2：抗原
Figure BDA0003262448430000332
SEQ ID NO.3：抗原
Figure BDA0003262448430000333
SEQ ID No.4：
重链-总-核苷酸
Figure BDA0003262448430000334
SEQ ID No.5：
重链-总-氨基酸
Figure BDA0003262448430000341
SEQ ID No.6：
重链-可变区-核苷酸
Figure BDA0003262448430000342
SEQ ID No.7：
重链-可变区-氨基酸
Figure BDA0003262448430000343
SEQ ID No.8：
重链-CDR1-核苷酸
Figure BDA0003262448430000344
SEQ ID No.9：
重链-CDR1-氨基酸
Figure BDA0003262448430000345
SEQ ID No.10：
重链-CDR2-核苷酸
Figure BDA0003262448430000351
SEQ ID No.11：
重链-CDR2-氨基酸
Figure BDA0003262448430000352
SEQ ID No.12：
重链-CDR3-核苷酸
Figure BDA0003262448430000353
SEQ ID No.13：
重链-CDR3-氨基酸
Figure BDA0003262448430000354
SEQ ID No.14：
重链-FR1-核苷酸
Figure BDA0003262448430000355
SEQ ID No.15：
重链-FR1-氨基酸
Figure BDA0003262448430000356
SEQ ID No.16：
重链-FR2-核苷酸
Figure BDA0003262448430000361
SEQ ID No.17：
重链-FR2-氨基酸
Figure BDA0003262448430000362
S：Q ID No.18：
重链-FR3-核苷酸
Figure BDA0003262448430000363
SEQ ID No.19：
重链-FR3-氨基酸
Figure BDA0003262448430000364
SEQ ID No.20：
重链-FR4-核苷酸
Figure BDA0003262448430000365
SEQ ID No.21：
重链-FR4-氨基酸
Figure BDA0003262448430000366
SEQ ID No.22：
轻链-总-核苷酸
Figure BDA0003262448430000371
SEQ ID No.23：
轻链-总-氨基酸
Figure BDA0003262448430000372
SEQ ID No.24：
轻链-可变区-核苷酸
Figure BDA0003262448430000373
SEQ ID No.25：
轻链-可变区-氨基酸
Figure BDA0003262448430000374
SEQ ID No.26：
轻链-CDR1-核苷酸
Figure BDA0003262448430000381
SEQ ID No.27：
轻链-CDR1-氨基酸
Figure BDA0003262448430000382
SEQ ID No.28：
轻链-CDR2-核苷酸
Figure BDA0003262448430000383
SEQ ID No.29：
轻链-CDR2-氨基酸
Figure BDA0003262448430000384
SEQ ID No.30：
轻链-CDR3-核苷酸
Figure BDA0003262448430000385
SEQ ID No.31：
轻链-CDR3-氨基酸
Figure BDA0003262448430000386
SEQ ID No.32：
轻链-FR1-核苷酸
Figure BDA0003262448430000391
SEQ ID No.33：
轻：-FR1-氨基酸
Figure BDA0003262448430000392
SEQ ID No.34：
轻链-FR2-核苷酸
Figure BDA0003262448430000393
SEQ ID No.35：
轻链-FR2-氨基酸
Figure BDA0003262448430000394
SEQ ID No.36：
轻链-FR3-核苷酸
Figure BDA0003262448430000395
SEQ ID No.37：
轻链-FR3-氨基酸
Figure BDA0003262448430000396
SEQ ID No.38：
轻链-FR4-核苷酸
Figure BDA0003262448430000401
SEQ ID No.39：
轻链-FR4-氨基酸
Figure BDA0003262448430000402

Claims (15)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的一种或更多种的表位。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是多克隆抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQID NO:31中的一种或更多种，或其中所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:25。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是为完全人抗体、非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体或纳米抗体的抗体。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫化物连接的Fv或scFv的抗原结合片段。
7.一种组合物，所述组合物包含直接或间接地可操作地连接到第二物质的权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述第二物质包括生物活性剂，诸如抗凝血剂、抗血小板剂、抗炎剂、SMC增殖抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、组织蛋白酶抑制剂、细胞抑制剂、抗氧化剂、胶原蛋白稳定剂、弹性蛋白稳定和再生剂、细胞因子、酶、趋化因子、放射性同位素、毒素、免疫调节剂、螯合剂、核酸构建体、化疗剂、弹性蛋白交联剂或原弹性蛋白交联剂。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述第二物质包括成像剂，诸如光活化剂、荧光团、放射性同位素、生物发光蛋白或肽、荧光标签、荧光蛋白或肽、亲和标记物、酶标记物、MRI剂、金颗粒、x射线不透明物质或同位素标记物。
10.根据权利要求7所述的组合物，其中所述第二物质包括载体，诸如颗粒形式的载体，例如纳米颗粒，该纳米颗粒任选地包括包含聚合物的可降解颗粒。
11.一种杂交瘤或遗传修饰细胞，所述杂交瘤或遗传修饰细胞包含编码权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段的核酸序列。
12.根据权利要求11所述的杂交瘤或遗传修饰细胞，所述核酸序列包括SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30中的一种或更多种，或其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:24。
13.一种方法，所述方法包括将降解的弹性纤维与权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，其中所述抗体或其抗原结合片段可操作地连接至第二物质。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二物质包括载体和掺入到所述载体中的生物活性剂，在所述抗体或其抗原结合片段结合至所述降解的弹性纤维之后，所述生物活性剂从所述载体中释放。
15.根据权利要求13所述的方法，所述第二物质包括成像剂。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090082280A1 (en) * 2005-04-15 2009-03-26 Felipe Jimenez Plant-derived elastin binding protein ligands and methods of using the same
CN101918846A (zh) * 2007-11-05 2010-12-15 北欧生物科技公司 用于进行cvd风险评估的生物化学标志物
US20110129531A1 (en) * 2009-04-20 2011-06-02 Allergan, Inc. Dermal Fillers Comprising Silk Fibroin Hydrogels and Uses Thereof
CN104059131A (zh) * 2014-07-04 2014-09-24 丝科普乐（北京）生物科技有限公司 抗丝素蛋白多克隆抗体及其制备方法
WO2015104342A1 (en) * 2014-01-13 2015-07-16 Nordic Bioscience A/S Biochemical markers for pulmonary and other diseases
CN105504055A (zh) * 2015-11-12 2016-04-20 浙江理工大学 利用特征十肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法
CN107266569A (zh) * 2017-07-28 2017-10-20 浙江理工大学 一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法
CN107847593A (zh) * 2015-04-20 2018-03-27 美侬米克国际有限公司 治疗抗体及其用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5376948B2 (ja) * 2005-09-13 2013-12-25 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 腫瘍細胞活性を調節する方法及び組成物
US9404932B2 (en) * 2007-11-05 2016-08-02 Nordic Bioscience A/S Pathology biomarker assay
EP2700652B1 (en) * 2011-04-18 2018-12-19 The University of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-itm2a antibody
US20140017263A1 (en) * 2012-06-28 2014-01-16 Clemson University Delivery Agents for Targeted Treatment of Elastin Degradation
ME03667B (me) * 2012-08-16 2020-10-20 Ipierian Inc Metodi lečenja tauopatije
KR101753553B1 (ko) * 2014-06-03 2017-07-03 엑스바이오테크, 인크. 스타필로코커스 아우레우스 감염의 치료 및 예방을 위한 조성물 및 방법
TWI700300B (zh) * 2014-09-26 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 中和具有第ｖｉｉｉ凝血因子（ｆｖｉｉｉ）機能替代活性的物質之抗體
TW201710286A (zh) * 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090082280A1 (en) * 2005-04-15 2009-03-26 Felipe Jimenez Plant-derived elastin binding protein ligands and methods of using the same
CN101918846A (zh) * 2007-11-05 2010-12-15 北欧生物科技公司 用于进行cvd风险评估的生物化学标志物
US20110129531A1 (en) * 2009-04-20 2011-06-02 Allergan, Inc. Dermal Fillers Comprising Silk Fibroin Hydrogels and Uses Thereof
WO2015104342A1 (en) * 2014-01-13 2015-07-16 Nordic Bioscience A/S Biochemical markers for pulmonary and other diseases
CN104059131A (zh) * 2014-07-04 2014-09-24 丝科普乐（北京）生物科技有限公司 抗丝素蛋白多克隆抗体及其制备方法
CN107847593A (zh) * 2015-04-20 2018-03-27 美侬米克国际有限公司 治疗抗体及其用途
CN105504055A (zh) * 2015-11-12 2016-04-20 浙江理工大学 利用特征十肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法
CN107266569A (zh) * 2017-07-28 2017-10-20 浙江理工大学 一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JACOB H KRISTENSEN ET AL.: "Serological assessment of neutrophil elastase activity on elastin during lung ECM remodeling", BMC PULM MED ., 3 May 2015 (2015-05-03) *
秦春英;梁继文;张锋;吴佳林;: "丝素蛋白在医学领域的应用研究", 轻纺工业与技术, no. 05, 25 October 2010 (2010-10-25) *

Also Published As

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