EA007218B1 - Предотвращение и лечение амилоидогенного заболевания - Google Patents

Предотвращение и лечение амилоидогенного заболевания Download PDF

Info

Publication number
EA007218B1
EA007218B1 EA200401473A EA200401473A EA007218B1 EA 007218 B1 EA007218 B1 EA 007218B1 EA 200401473 A EA200401473 A EA 200401473A EA 200401473 A EA200401473 A EA 200401473A EA 007218 B1 EA007218 B1 EA 007218B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
peptide
antibody
patient
agent
mcg
Prior art date
Application number
EA200401473A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401473A1 (ru
Inventor
Дэйл Б. Шенк
Original Assignee
Ньюралаб Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26748211&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA007218(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ньюралаб Лимитед filed Critical Ньюралаб Лимитед
Publication of EA200401473A1 publication Critical patent/EA200401473A1/ru
Publication of EA007218B1 publication Critical patent/EA007218B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/739—Lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/2031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyethylene oxide, poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2054—Cellulose; Cellulose derivatives, e.g. hydroxypropyl methylcellulose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4866—Organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2009—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A61K9/7023—Transdermal patches and similar drug-containing composite devices, e.g. cataplasms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

Изобретение предлагает композиции и методы терапии амилоидогенных заболеваний. Такие методы представляют собой введение агента, который индуцирует благотворный иммунный ответ на амилоидное отложение у больного. Методы особенно полезны для профилактического и терапевтического лечения болезни Альцгеймера. В таких методах пригодный (соответствующий) агент представляет собой Ab-пептид или антитело к нему.

Description

Изобретение относится к области иммунологии и медицины.
Предпосылки создания изобретения
Болезнь Альцгеймера (АО, БА) является прогрессирующим заболеванием, приводящим к старческому слабоумию (пресенильная деменция). См. в целом 8е1кое, ΤΙΝ8 16, 403-409 (1993); Нагбу е! а1., АО 92/13069; 8е1кое, 1. №игораШо1. Ехр. №иго1. 53, 438-447 (1994); ΟιιίΤ е! а1., Уинге 373, 476-477 (1995); Саше5 е! а1., №1!иге 373, 523 (1995). Вообще говоря, заболевание бывает двух видов: позднее, возникающее в старости (в 65 лет и старше) и раннее, развивающееся ранее старческого (сенильного) возраста, т.е. между 35 и 60 годами. В обоих видах заболевания патология та же самая, но в случае начала заболевания в более раннем возрасте имеется тенденция к более тяжёлым и обширным нарушениям. Заболевание характеризуется двумя типами патологических изменений мозга, старческими бляшками и нейрофибриллярными узлами. Старческие бляшки представляют собой участки дезорганизованных (разрушенных) нейропилей до 150 мкм в поперечнике с внеклеточными амилоидными отложениями в центре, видимыми при изучении под микроскопом разрывов ткани мозга. Нейрофибриллярные узлы представляют собой внутриклеточные отложения тау-белка, состоящим из двух филаментов, попарно скрученных вместе.
Основной составляющей бляшек является пептид, называемый АЬ или Ь-амилоидный пептид. АЬпептид представляет собой внутренний фрагмент 39-43 аминокислот белка-предшественника, называемого амилоидным белком-предшественником (АРР, АБП). Некоторые мутации в АРР-белке коррелировались с наличием болезни Альцгеймера. См., например, Соа!е е! а1., №1!иге 349, 704) (1991) (валин717 в изолейцин); Сйагбег Наг1ап е! а1., №1!иге 353, 844 (1991) (валин717 в глицин); Мигге11 е! а1., 8с1епсе 254, 97 (1991) (валин717 в фенилаланин); Ми11ап е! а1., №!иге Сепе!. 1, 345 (1992) (двойная замена лизин 595метионин596 в аспарагин595-лейцин596). Полагают, что такие мутации вызывают болезнь Альцгеймера за счет усиленного или изменённого процессинга АРР в АЬ, в частности процессинга АРР в повышенные количества. протяжённой формы АЬ (т.е. АЬ1-42 и АЬ1-43). Как полагают, мутации в других генах, таких как гены презенилина, Р81 и Р82, косвенно воздействуют на процессинг АРР, генерируя повышенные количества протяженной формы АЬ (см. Нагбу, ΤΙΝ8 20, 154 (1997)). Эти наблюдения показывают, что АЬ, и в частности его протяжённая форма, является причинным (каузальным) элементом болезни Альцгеймера.
МсМ1сйае1 в !вропейском патенте 526511 предлагает введение гомеопатических доз (менее или равных 10-2 мг/день) АЬ больным с предварительно установленной АО (БА - болезнь Альцгеймера). У обычного человека с примерно 5 л плазмы, как полагают, даже верхний предел этой дозы создаёт концентрацию не более 2 пг/мл. Нормальная концентрация АЬ в плазме человека обычно находится в интервале 50-200 пг/мл (8еиЬей е! а1., №1!иге 359, 325-327 (1992)). Так как предлагаемая в !вропейском патенте ЕР 526511 дозировка мало отличается от АЬ во внутреннем кровотоке и так как ЕР 526511 не рекомендует применение адъюванта, кажется маловероятным, что достигается какое-либо преимущество при лечении.
Напротив, данное изобретение направлено, среди прочего, на терапию болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний путем введения больному АЬ или другого иммуногена в условиях, которые вызывают у больного благоприятный иммунный ответ. Таким образом, изобретение удовлетворяет давнюю потребность в программе (схеме) лечения с целью предотвращения или уменьшения интенсивности невропатологии болезни Альцгеймера.
Сущность изобретения
В одном аспекте изобретение включает методы предотвращения или терапии заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями у больного. Такие методы вызывают у больного индуцирование иммунного ответа на пептидный компонент амилоидного отложения. Такая индукция может быть активной за счёт введения иммуногена или пассивной, при введении антитела или активного фрагмента антитела или производного антитела. У некоторых больных амилоидное отложение представляет собой сгруппированный (агрегированный) АЬ-пептид, а заболевание является болезнью Альцгеймера. В некоторых методах болезнь протекает бессимптомно. В некоторых методах больной имеет наследственные факторы риска, указывающие на восприимчивость к болезни Альцгеймера. Такие факторы риска включают аллельные варианты в гене презенилина Р81 или Р82 и вариантные формы АРР. В других методах у больного нет известных факторов риска относительно болезни Альцгеймера.
Для лечения больных, страдающих болезнью Альцгеймера, одна терапевтическая схема предлагает введение больному дозы АЬ-пептида с целью вызвать иммунный ответ. В некоторых методах АЬ-пептид вводят с адъювантом, который усиливает иммунный ответ на АЬ-пептид. В некоторых методах адъювант представляет собой квасцы. В некоторых методах адъювантом является МРЬ (МФЛ). Доза АЬ-пептида, назначаемая больному, как правило составляет по меньшей мере 1 или 10 мгк при введении с адъювантом и по меньшей мере 50 мкг при введении без адъюванта. В некоторых методах доза составляет по меньшей мере 100 мкг.
В некоторых методах АЬ-пептид представляет собой АЬ1-42. В некоторых методах АЬ-пептид вводят в форме агрегации. В других методах АЬ-пептид вводят в диссоциированной форме. В некоторых
- 1 007218 методах терапевтический агент представляет собой взятую в эффективной дозе нуклеиновую кислоту, кодирующую ЛЬ или его активный фрагмент или его производное. Нуклеиновая кислота, кодирующая ЛЬ или его активный фрагмент, экспрессирует в организме больного, продуцируя АЬ или его активный фрагмент, который вызывает иммунный ответ. В некоторых из этих методов нуклеиновую кислоту вводят через кожу, при необходимости через накладку. В некоторых методах терапевтический агент определяют скринингом библиотеки соединений с целью установить соединение, реакционноспособное относительно антител к АЬ, и введением соединения больному, чтобы вызвать иммунный ответ.
В некоторых методах иммунный ответ направлен на агрегированный АЬ-пептид, и не направлен на диссоциированный АЬ-пептид. Например, иммунный ответ может содержать антитела, которые связываются с агрегированным АЬ-пептидом, не связываясь с диссоциированным АЬ-пептидом. В некоторых методах иммунный ответ содержит Т-клетки, которые связываются с АЬ, образующим комплекс с МСН1 или МСН11 на клетках СИ8 или СИ4. В других способах иммунный ответ индуцирует введение больному антитела к АЬ. В ряде способов иммунный ответ индуцирует взятие у больного Т-клеток, контактирование Т-клеток с АЬ-пептидом в условиях, при которых осуществляется примирование Т-клетки, и возвращение Т-клеток больному.
Терапевтический агент обычно вводят перорально, назально, интрадермально (внутрикожно), подкожно, внутримышечно, местно или внутривенно. В некоторых методах больного постоянно контролируют (мониторинг) после введения для оценки иммунного ответа. Если мониторинг показывает (затихание) ослабление иммунного ответа со временем, больному можно дать одну или более дополнительных доз агента.
В другом аспекте изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие АЬ, и эксципиент, пригодный для перорального и других способов введения. Изобретение также охватывает фармацевтические композиции, содержащие агент, эффективный для того, чтобы вызвать иммуногенный ответ на АЬ у больного, и фармацевтически приемлемый адъювант. В некоторых подобных композициях агент представляет собой АЬ или его активный фрагмент. В некоторых композициях адъювант представляет собой квасцы. В некоторых композициях адъювант представляет собой эмульсию масла в воде. В некоторых композициях АЬ или его активный фрагмент является компонентом сополимера полилактида с полигликолидом (РЬРС) или другой частицы.
Изобретение дополнительно предлагает композиции, содержащие АЬ или его активный фрагмент, связанный с молекулой конъюгата, которая способствует доставке АЬ в кровоток больного и/или стимулирует иммунный ответ на АЬ. Например, конъюгат может стимулировать иммунный ответ на АЬ. В некоторых композициях конъюгат представляет собой холероген. В некоторых композициях конъюгат представляет собой иммуноглобулин. В некоторых композициях конъюгат представляет собой ослабленный токсин дифтерии СИМ 197 (6ир1а, Уассше 15, 1341-3 91997)).
Изобретение также включает фармацевтические композиции, содержащие агент, который вызывает у больного иммуногенный ответ на АЬ при условии, что композиция не содержит полный адъювант Фрейнда. Изобретение также предлагает композиции, содержащие вирусный вектор, кодирующий АЬ или его активный фрагмент, эффективно индуцирующий иммунный ответ на АЬ. Сответствующие вирусные векторы включают вирус герпеса, аденоассоциированный вирус, ретровирус, Синдбис-вирус, вирус леса семлики, вирус коровьей оспы или оспы птиц.
Изобретение дополнительно предлагает способы предотвращения или терапии болезни Альцгеймера. В соответствии с этими методами больному назначают эффективную дозу АЬ-пептида. Далее изобретение обеспечивает применение АЬ или антитела к нему в производстве лекарственного препарата для предотвращения или терапии болезни Альцгеймера.
В другом аспекте изобретение заключается в способах оценки эффективности метода терапии болезни Альцгеймера. В соответствии с этими способами в образце ткани больного, перед лечением агентом определяют базовое количество антитела, специфически связывающегося с АЬ-пептидом. Количество антитела, специфически связывающегося с АЬ-пептидом, в образце ткани больного после лечения агентом сравнивают с базовым количеством антитела, специфически связывающегося с АЬ-пептидом. Количество АЬ-пептид-специфического антитела, измеренное после лечения, значительно превышающее базовое количество АЬ-пептид-специфического антитела, указывает на положительный результат лечения.
В других способах оценки эффективности метода терапии болезни Альцгеймера определяют базовое количество антитела, специфического к АЬ-пептиду в образце ткани больного, перед лечением агентом. Количество антитела, специфического к АЬ-пептиду в образце ткани больного после терапии с помощью агента сравнивают с базовым количеством АЬ-пептид-специфического антитела. Уменьшение или отсутствие разницы между количеством АЬ-пептид-специфического антитела, измеренным после лечения, по сравнению с базовым количеством АЬ-пептид-специфического антитела указывает на отрицательный результат лечения.
В других способах оценки эффективности метода лечения болезни Альцгеймера определяют контрольное количество антитела, специфически связывающегося с АЬ-пептидом, в образце ткани контрольной популяции. Количество антитела, специфически связывающегося с АЬ-пептидом, в образце
- 2 007218 ткани больного после введения агента сравнивают с контрольным количеством АЬ-пептидспецифического антитела. Количество АЬ-пептид-специфического антитела, измеренное после лечения, значительно превышающее контрольное количество АЬ-пептид-специфического антитела, характеризует положительный результат лечения.
В других способах оценки эффективности метода лечения больного болезнью Альцгеймера определяют контрольное количество антитела, специфического к АЬ-пептиду, в образцах ткани контрольной популяции. Количество антитела, специфического к АЬ-пептиду, в образце ткани больного после введения агента сравнивают с контрольным количеством АЬ-пептид-специфического антитела. Отсутствие значительной разницы между количеством АЬ-пептид-специфического антитела, измеренным после начала указанного лечения, по сравнению с контрольным количеством АЬ-пептид-специфического антитела указывает на отрицательный результат лечения.
Другие способы мониторинга болезни Альцгеймера или чувствительности к ней больного включают обнаружение иммунного ответа на АЬ-пептид в образце, взятом у больного. В ряде подобных методов больному вводили агент, действующий как средство, лечащее или предотвращающее болезнь Альцгеймера, и уровень (степень) ответа определяет будущий режим лечения больного.
В других способах оценки эффективности метода лечения больного болезнью Альцгеймера определяют величину количества антитела, специфически связывающегося с АЬ-пептидом в образце ткани больного, пролеченного агентом. Значения сравнивают с контрольной величиной, определённой для группы больных, испытавших улучшение или исчезновение симптомов болезни Альцгеймера в результате терапии с помощью агента. Величина (количество антитела) у больного, по меньшей мере, равная контрольной величине, указывает на положительную реакцию на терапию.
Объектом настоящего изобретения являются также диагностические наборы для осуществления вышеописанных способов. Такие наборы, как правило, включают реагент, который специфически связывается с антителами к АЬ или стимулирует пролиферацию Т-клеток, реакционноспособных по отношению к АЬ.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - титр антител после инъекции АЬ1-42 трансгенным мышам;
фиг. 2 - амилоидная нагрузка в гиппокампе. Площадь (в %) участка гиппокампа, занимаемая амилоидными плашками, определяемая реактивностью в отношении АЬ-специфического тАЬ 3Ό6, устанавливается с помощью количественного компьютерного анализа изображения иммунореактивных участков мозга. Даны значения для отдельных мышей, классифицированные по группам терапии (опытным группам). Горизонтальная линия для каждого группирования показывает среднюю величину распределения;
фиг. 3 - невритная дистрофия в гиппокампе. Процент площади участка гиппокампа, пораженной дистрофическим невритом, определяемый её реактивностью относительно человеческого АРРспецифического тАЬ 8Е5, устанавливали количественным компьютерным анализом изображения иммунореактивных участков мозга. Значения (величины) для отдельных мышей даны для группы, пролеченной ΛΝ1792. и пролеченной РВ8 (ЗФР) контрольной группы. Горизонтальная линия для каждого группирования показывает среднюю величину распределения;
фиг. 4 - астроцитоз в ретросплениальной коре. Процентное содержание площади кортикального участка, занимаемого глиальным фибриллярным кислым белком (СТАР) - положительными астроцитами, определяли количественным компьютерным анализом изображения иммунореактивных участков мозга. Значения для отдельных мышей распределяются (классифицируются) в зависимости от обрабатываемой группы и средние групповые значения указаны горизонтальными линиями;
фиг. 5 - среднее геометрическое титров антитела к АЬ1-42 после иммунизации серией из восьми доз А№792, содержащих 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 33, 100 или 300 мкг;
фиг. 6 - кинетика гуморального иммунного ответа (антителогенеза) на А№792-иммунизацию. Титры выражаются как средние геометрические значения для 6 животных в каждой группе;
фиг. 7 - количественный анализ изображения кортикального амилоида (нагрузки) у мышей, получавших РВ8 (ЗФР) и АЮ792;
фиг. 8 - количественный анализ изображения нейритных бляшек (нагрузки) у мышей, получавших РВ8 (ЗФР) и АЮ792;
фиг. 9 - количественный анализ изображения процентного содержания ретросплениальной коры, занимаемой астроцитами, у мышей, получавших РВ8 (ЗФР) и АМ792;
фиг. 10 - анализ пролиферации лимфоцитов в клетках селезёнки принимавших АЮ792 (вверху) или РВ8 (ЗФР) (внизу) мышей;
фиг. 11 - уровни тотального АЬ в коре. График разброса профилей индивидуальных АЬ у мышей, иммунизированных АЬ- или АРР-производными в соединении с адъювантом Фрейнда;
фиг. 12 - содержание амилоида в коре определяли количественным анализом изображения иммунореактивных участков мозга для мышей, иммунизированных АЬ-пептидными конъюгатами АЬ1-5, АЬ1-12 и АЬ13-18, получавших агрегации непроцессированного АЬ АМ792 (АЬ1-42) и АМ528 (АЬ1-40) и РВ8 (ЗФР) (контрольная группа);
фиг. 13 - среднее геометрическое титров АЬ-специфического антитела для групп мышей, иммуни
- 3 007218 зированных производными ЛЬ или АРР вместе с адъювантом Фрейнда;
фиг. 14 - среднее геометрическое титров АЬ-специфического антитела для групп морских свинок, иммунизированных ΑΝ1792 или его пальмитоильным производным в соединении с различными адъювантами;
фиг. 15 - уровни АЬ в коре мышей ΡΌΑΡΡ в возрасте десяти месяцев, получавших ΑΝ1792 или ΑΝ1528 с различными адъювантами.
Определения
Термин практическая идентичность означает, что две пептидные последовательности, будучи оптимально совмещены, например, с помощью программ ОАР или ΒΕ8ΤΗΤ, заполняя разрывы (гэпы) по умолчанию, имеют по меньшей мере 65%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 80 или 90%-ную идентичность последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательностей или более (например, 99%-ную идентичность последовательностей или выше). Предпочтительно, чтобы неидентичные остатки отличались консервативными аминокислотными заменами.
Для сравнения последовательностей, обычно одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравниваются испытуемые последовательности. При применении алгоритма сравнения последовательностей испытуемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, если необходимо, устанавливают координаты последовательностей и определяют параметры программы алгоритма последовательностей. Алгоритм сравнения последовательностей позволяет рассчитать затем процент идентичности последовательностей для испытуемой(-ых) последовательности(-ей) по сравнению с эталонной последовательностью, исходя из установленных программных параметров.
Оптимальное совмещение последовательностей с целью сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита и Уотермана (8тйй апб Аа!еттаи), Αάν. Αρρί. Ма!11. 2:482 (1981); алгоритма совмещения гомологий Нидльмана и Вунша (№ей1таи апб Аипзск, 1. Μοί. Βίοί. 48:443 (1970); методом подобия Реагзоп апб Ыртаи, Ргос. №111. Αсаά. 8с1. υ8Α 85:2444 (1988); с помощью компьютерных разработок этих алгоритмов (ΟΑΡ, ΒΕ8ΤΕΙΤ, ΕΑ8ΤΑ и ΤΕΑ8ΤΑ в А1зсопзш Оепейсз 8оГ!\саге Раскаде, Оепейсз Сотри!ег Отоир, 575 8с1епсе Ит., МаФзоп, ΑΙ), или изучая визуально (в целом Ли8иЬе1 е! а1., см. выше). Одним из примеров алгоритма, пригодного для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, является алгоритм ΒΕΑ8Τ, описанный ΑΙΙδΟιιιΙ е! а1., 1. Мо1. ЕюГ 215:403-410 (1990). Программное обеспечение для осуществления ΒΕΑδΤ-анализа является общедоступным через №Шопа1 Сеп!ег Гог Β^οΐесйηοίοду 1пГотта1юп (национальный центр информации по биотехнологии) (1Шр://\\л\лу.псЬГп1т.ш11.до\7). Как правило, для проведения сравнения последовательностей можно применять параметры программы, принимающие значение по умолчанию, хотя также можно использовать специально разработанные (заказные) параметры. Для аминокислотных последовательностей программа ΒΕΑδΤΓ использует в качестве значений по умолчанию длину слова (разрядность, А) 3, ожидание (Ε) 10 и оценочную матрицу ΒΕΟ8υΜ62 (см. НешкоГГ апб НешкоГГ Ргос. №И. Αсаά. 8ск υ8Α 89, 10915 (1989)).
С целью классификации аминокислотных замен как консервативных, так и неконсервативных, аминокислоты группируют следующим образом. Группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, те!, а1а, νаί, 1еи, 11е; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): суз, зет, 1кг; группа III (кислые боковые цепи): азр, д1и; группа IV (основные боковые цепи): азп, д1п, Ыз, 1уз, агд; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): д1у, рго; и группа VI (ароматические боковые цепи): Гтр, 1уг, рке. Консервативные замены включают обмен между кислотами того же класса. Неконсервативные замены представляют собой обмен члена одного из этих классов на члена другого класса.
Терапевтические агенты по изобретению обычно являются практически чистыми. Это означает, что чистота агента обычно составляет по меньшей мере 50 вес.% (вес/вес), а также что агент практически не содержит вредных (мешающих) белков и загрязнений. Иногда агенты имеют чистоту по меньшей мере около 80 вес.%, более предпочтительна чистота по меньшей мере 90 или около 95 вес.%. Однако при применении соответствующих методов очистки белков можно получить по меньшей мере 99 вес.%-ные гомогенные пептиды.
Специфическое связывание между двумя объектами означает аффинность (сродство) по меньшей мере 106, 107, 108, 109 М-1 или 1010 М-1.Предпочтительно сродство выше 108 М-1.
Термин антитело включает интактные антитела и их связывающие фрагменты. Обычно фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они происходят, в специфическом связывании с антигеном. При необходимости антитела или их связывающие фрагменты могут химически конъюгироваться с белками, слитыми с другими белками, или экспрессировать в виде них.
ΑΡΡ695, ΑΡΡ751 и ΑΡΡ770 относится соответственно к 695, 751 и 770 протяженным полипептидам из аминокислотных остатков, кодируемым человеческим геном ΑΡΡ. См. Капд е! а1., №1!иге 325, 773 (1987); РопГе е! а1., №1!иге 331, 525 (1988); и КйадисЫ е! а1., №Ш.1ге 331, 530 (1988). Аминокислоты в человеческом амилоидном предшественнике белка (АРР) обозначены номерами в соответствии с последовательностями изоформы АРР770. Термины, такие, например, как АЬ39, ΑЬ40, АЬ41, АЬ42 и АЬ43 относятся к АЬ-пептиду, содержащему аминокислотные остатки 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 и 1-43.
- 4 007218
Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к сайту на поверхности антигена, на который отвечают В и/или Т-клетки. В-клеточные эпитопы могут образовываться как из прилегающих (соседних) аминокислот, так и не из прилегающих аминокислот, накладывающихся друг на друга за счёт третичной укладки (складчатости) белка. Эпитопы, образованные из прилегающих аминокислот, обычно сохраняются при действии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные за счёт третичной структуры (укладки), обычно утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитопы обычно содержат по меньшей мере 3 и более, обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в единичной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и двухмерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Ерйоре Марршд Рто1осок ίη Ме11юЙ5 ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. Уо1. 66, С1епи Е. Мотл8, Ей. (1996). Антитела, которые распознают тот же эпитоп, можно идентифицировать простым иммуноанализом, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с целевым антигеном. Т-клетки распознают секвенциальные эпитопы, примерно из девяти аминокислот в случае 008-клеток и примерно из 13-15 аминокислот в случае клеток СЭ4. Т-клетки, которые распознают эпитоп, могут быть идентифицированы ίη уйто анализами, которые определяют антигензависимую пролиферацию, как определяемая включением 3Н-тимидина в примированные Т-клетки в ответ на эпитоп (Вигке е1 а1., 1. Ιηί. Όίδ. 170, 1110-19 (1994)), антигензависимым киллингом (Т-лимфоцитотоксический тест, Т1дде§ е1 а1., 1. 1ттипо1. 156, 3901-3910) или секрецией цитокинов.
Термин иммунологический или иммунный ответ раскрывает благотворный (полезный) гуморальный (опосредуемый антителом) и/или клеточный (опосредуемый антиген-специфическими Тклетками или продуктами их секреции) ответ на амилоидный пептид у больного реципиента. Такой ответ может быть активным ответом, стимулированным введением иммуногена, или пассивным ответом, индицированным введением антитела или примированных Т-клеток. Реакция клеточного иммунитета выявляется презентацией полипептидных эпитопов в ассоциации с молекулами МНС класса I и класса II для активации антиген-специфических СЭ4' Т-хелперных клеток и/или СЭ8' цитотоксических Т-клеток. Ответ может также включать активацию моноцитов, макрофагов, ΝΚ-клеток, базофилов, дендритных клеток, астроцитов, микроглии, эозинофилов или других компонентов врождённого иммунитета. Наличие опосредуемого клетками иммунологического ответа можно определить анализами пролиферации (0Ό4' Т-клеток) или СТЬ (Т-лимфоцитотоксическими) анализами (Вигке, см. выше; Т1дде8, см. выше). Относительный вклад антительной и клеточной реакции в защитный или лечебный эффект иммуногена можно различить, выделяя по отдельности 1дО и Т-клетки иммунизированного сингенного животного и определяя защитный или терапевтический эффект у второго субъекта.
Иммуногенный агент или иммуноген способен стимулировать аутоиммунологический ответ при введении больному при необходимости в сочетании с адъювантом.
Термин голый полинуклеотид относится к полинуклеотиду, не дающему комплекс с коллоидным материалом. Голые полинуклеотиды иногда клонируют в плазмидный вектор.
Термин адъювант относится к соединению, которое при введении совместно с антигеном усиливает иммунный ответ на антиген, но будучи введено отдельно, не вызывает иммунный ответ на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ по нескольким механизмам, включая рекрутмент лимфоцитов, стимуляцию В и/или Т-клеток и стимуляцию макрофагов.
Термин больной включает человека или другое млекопитающее, которое получает профилактическое или терапевтическое лечение.
Дезагрегированный (диссоциированный) или мономерный АЬ означает растворимые, мономерные пептидные единицы АЬ. Один метод приготовления мономерного АЬ представляет собой растворение лиофилизированного пептида в чистом ДМСО под действием ультразвука. Полученный раствор центрифугируют для удаления нерастворимых (макро)частиц. Агрегированный АЬ представляет собой смесь олигомеров, в которой мономерные единицы удерживаются вместе нековалентными связями.
Композиции или методы, содержащие один или более описанных элементов, могут включать другие элементы, которые конкретно не описаны. Например, композиция, которая содержит АЬ-пептид, охватывает как изолированный АЬ-пептид, так и АЬ-пептид в качестве компонента большей полипептидной последовательности.
Подробное описание изобретения
I. Общие сведения.
Изобретение предоставляет фармацевтические композиции и методы профилактического и терапевтического лечения заболеваний, характеризующихся скоплением амилоидных отложений. Амилоидные отложения содержат пептид, соединённый (собранный) в нерастворимую массу. Природа пептида меняется в различных заболеваниях, но в большинстве случаев агрегация имеет Ь-складчатую структуру и окрашивается конго красным. Заболевания, характеризующиеся амилоидными отложениями, включают болезнь Альцгеймера (АО) как поздний, так и ранний случай. При обоих заболеваниях амилоидное отложение содержит пептид, называемый АЬ, который аккумулируется в мозгу страдающих болезнью людей. Примерами некоторых других заболеваний, характеризующихся амилоидными отложениями, являются 8АА амилоидоз, наследственный исландский синдром, множественная миелома и губковидные
- 5 007218 формы энцефалопатии, включая коровье бешенство, болезнь Якоба Кройцфельда, почесуха овец и губчатая энцефалопатия норок (см. \е1ззтапп е! а1., Сигг. Θρΐη. №игоЪю1. 7, 695-700 (1997); 8т1!з е! а1., Уе!егтагу ОиаПебу 19, 101-105 91997); ХаОтапзоп е! а1., Ат. I. Ер1бетю1. 145, 959-969 (1997)). Пептиды, образующие агрегации при этих заболеваниях, суть сывороточный амилоид А, цистантин С, лёгкая цепь каппа 1цС, соответственно, в случае первых трёх, и белок прион в остальных случаях.
II. Терапевтические агенты.
1. Болезнь Альцгеймера.
Терапевтические агенты для применения по данному изобретению стимулируют иммунный ответ на АЪ-пептид. Эти агенты включают сам АЪ-пептид и его варианты, аналоги и миметики АЪ-пептида, которые стимулируют антитела к АЪ-пептиду и/или перекрестную реакцию с ними, и антитела или Тклетки, реакционноспособные в отношении АЪ-пептида. Стимуляция (индукция) иммунного ответа может быть активной, как в том случае, когда вводят иммуноген для стимуляции антител или Т-клеток, реактивных в отношении АЪ в организме больного, или пассивным, когда вводят антитело, которое само связывается с АЪ в организме больного.
АЪ, также известный как Ъ-амилоидный пептид, или А4-пептид (см. патент США 4666829; О1еппег апб \\опд, ВюсБет. ВюрБуз. Кез. Соттип. 120, 1131 (1984)), представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характеристичных для болезни Альцгеймера. АЪ образуется при процессинге большего (по размеру) белка АРР под действием двух ферментов, называемых Ъ- и д-секретазы (см. Нагбу, ΤΙΝ8 20, 154 (1997)). Известные мутации в АРР, обусловленные болезнью Альцгеймера, происходят непосредственно близ сайта распознавания Ъ- и д-секретазы, или внутри АЪ. Например, положение 717 является ближайшим к сайту расщепления д-секретазой АРР при его процессинге в АЪ, а положения 670/671 являются ближайшими к сайту расщепления под действием Ъсекретазы. Полагают, что мутации вызывают АЭ-болезнь за счёт происходящих таким образом реакций расщепления, при которых образуется АЪ, что получается повышенное количество 42/43 аминокислотных форм.
АЪ обладает необычным свойством, он может фиксировать и активизировать как классический, так и альтернативный пути активации комплемента. В частности, он связывается с С1д и, в конечном счёте, с С3Ъ1. Эта ассоциация облегчает связывание с макрофагами, приводящее к активации В-клеток. Кроме того, С3Ъ1 распадается дальше, а затем связывается с СК2 на В-клетках зависящим от Τ-клеток образом, 10000-кратно активирующим эти клетки. Этот механизм заставляет АЪ вырабатывать иммунный ответ более сильный, нежели иммунный ответ других антигенов.
Терапевтический агент, применяемый в заявляемых методах, может быть любым из природных форм АЪ-пептида, и в особенности, человеческими формами АЪ-пептида (т.е. АЪ39, АЪ40, АЪ41, АЪ42 или АЪ43). Последовательности этих пептидов и их родство с предшествеником-АРР иллюстрируется фиг. 1 в Нагбу е! а1., ΤΙΝ8 20, 155-158 (1997). Например, АЪ42 имеет последовательность
Н2М-Азр-А1а-С-1и-РЬе-Агд-Н1з-Азр-8ег-Ст1у-Туг-О1и-Уа1-Н1з-Н1з-Ст1п-Ту5-Теи-Уа]РЪе-РЬе-А1а-С4и-Азр-Уа1-С1у-8е:г-А5п-Ьуз-С-1у-А1а-11е-11е-СИу-Ьеи-Ме1:-Уа1-(31уО1у-Уа1-Уа1-11е-А1а-ОН.
АЪ41, АЪ40 и АЪ39 отличаются от АЪ42 тем, что на С-конце отсутствуют соответственно А1а, А1а11е и А1а-11е-Уа1. АЪ43 отличается от АЪ42 наличием остатка треонина на С-конце. Терапевтический агент может также представлять собой активный фрагмент или аналог природного АЪ-пептида, который содержит эпитоп, стимулирующий подобный защитный или терапевтический иммунный ответ при введении человеку. Иммуногенные фрагменты обычно имеют последовательность по меньшей мере из 3, 5, 6, 10 или 20 прилегающих (соседних) аминокислот природного пептида. Иммуногенные фрагменты включают АЪ1-5, 1-6, 1-12, 13-28, 17-28, 25-25, 35-40 и 35-42. В некоторых методах предпочтительными являются фрагменты Ν-терминальной части АЪ. Аналоги включают аддельные, видовые и индуцированные варианты. Аналоги обычно отличаются от природных пептидов в одном или двух положениях, часто вследствие консервативных замен. Обычно идентичность последовательностей аналогов и природных пептидов составляет по меньшей мере 80 или 90%. Некоторые аналоги также включают неприродные аминокислоты или модификации Ν- или С-концевых аминокислот. Примерами неприродных аминокислот являются α,α-дизамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота, 4гидроксипролин, д-карбоксиглутамат, е-НН^триметиллизин, е-№ацетиллизин, О-фосфосерин, Νацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, ^-Ν-метиларгинин. Можно проводить скрининг фрагментов и аналогов на эффективность профилактического или терапевтического действия на моделях трансгенных животных, как описано ниже.
АЪ, его фрагменты, аналоги и другие амилоидогенные пептиды можно синтезировать реакцией твердофазного пептидного синтеза или рекомбинантной экспрессией, или их можно получать из природных источников. Автоматические синтезаторы пептидов в промышленности выпускаются множеством поставщиков, таких как, например, АррНеб Вюзуз!етз, Роз!ег Сбу, СаШогта. Рекомбинантную экспрессию можно осуществлять в бактериях, таких, например, как Е. со11, дрожжах, клетках насекомых или
- 6 007218 клетках млекопитающих. Методики рекомбинантной экспрессии описаны 8атЬгоок е! а1.. Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1 (С.8.Н.Р. Рге55. ΝΥ 2б еб.. 1989). Некоторые формы АЬ-пептида выпускаются промышленностью (например. Атепсап Рерббек Сотрапу. 1пс.. 8ипиууа1е. СА и СайГогша Рерббе Векеагсй. 1пс. №ара. СА).
Терапевтические агенты также включают более протяжённые полипептиды. к которым относятся. например. АЬ-пептид. активный фрагмент или аналог вместе с другими аминокислотами. Например. АЬпептид может присутствовать в виде интактного АРР-белка или его сегмента. такого. например. как фрагмент С-100. который начинается с Ν-конца АЬ и продолжается до конца АРР. Можно проводить скрининг таких полипептидов на профилактическую и терапевтическую эффективность на животных моделях. как описано ниже. АЬ-пептид. аналог. активный фрагмент или другой полипептид можно вводить в агрегированной форме (т.е. в виде амилоидного пептида) или в диссоциированной форме. Терапевтические агенты также включают мультимерные или мономерные иммуногенные агенты.
В других вариантах иммуногенный пептид. например. такой как АЬ. может присутствовать в виде вирусной или бактериальной вакцины. Нуклеиновая кислота. кодирующая иммуногенный пептид. встраивается в геном или в эписому вируса или бактерии. При необходимости нуклеиновая кислота встраивается таким образом. что иммуногенный пептид экспрессирует в виде секретируемого белка или слитого белка с поверхностным белком вируса или трансмембранным белком бактерий так. что пептид воспроизводится. Вирусы или бактерии. применяемые в таких методах. должны быть непатогенными или ослабленными. Соответствующие (пригодные) вирусы включают аденовирус. Н8У (вирус простого герпеса). вирус коровьей оспы или оспы птиц. Слияние иммуногенного пептида с НВкАд НВУ является особенно пригодным. Терапевтические агенты также включают пептиды и другие соединения. которые не обязательно имеют значительное сходство аминокислотных последовательностей с последовательностью АЬ. но. тем не менее. работают как миметики АЬ и индуцируют сходный иммунный ответ. Например. можно проводить скрининг на пригодность любых пептидов или белков. образующих Ь-складки. Также можно применять антиидиотипические антитела против моноклональных антител к АЬ или другим амилоидогенным пептидам. Такие анти-1б антитела имитируют антиген и вырабатывают иммунный ответ на него (см. Е55епШ11 1ттипо1оду (Вой еб.. В1аскхте11 Заепбйс РиЫюабопк. Ра1о Ако. б1к еб.). р. 181).
Также можно проводить скрининг на пригодность произвольных библиотек пептидов или других соединений. Можно получать комбинаторные библиотеки для многих типов соединений. которые можно синтезировать поэтапно (постепенно). Такие соединения включают полипептиды. миметики с бетаповоротом. полисахариды. фосфолипиды. гормоны. простагландины. стероиды. ароматические соединения. гетероциклические соединения. бензодиазепины. олигомерные Ν-замещённые глицины и олигокарбаматы. Большие комбинаторные библиотеки можно создать методом кодируемых синтетических библиотек (Е8Ь). описанным АГГутах. международная заявка АО 95/12608. АГГутах. АО 93/06121. Со1итЫа Ишуегайу. АО 95/08051. Рйагтасоре1а. АО 95/35503 и 8спрр5. АО 95/30642 (каждая из которых вводится ссылкой). Пептидные библиотеки также можно создать. отбирая нужные фаги из библиотеки фагов. См.. например. Эеу11п. АО 91/18980.
Комбинаторные библиотеки и другие соединения сначала подвергают скринингу на пригодность. определяя их способность связываться с антителами или лимфоцитами (В или Т). известными своей специфичностью к АЬ или другим амилоидогенным пептидам. Например. можно проводить начальный скрининг любых поликлональных сывороток или моноклонального антитела к АЬ или другому амилоидогенному пептиду. Соединения. идентифицируемые таким скринингом. затем дополнительно анализируют на способность индуцировать антитела к АЬ или реакционноспособные относительно АЬ или другого амилоидогенного пептида лимфоциты. Например. многократные разведения сывороток можно проверять на микропланшетах с предварительно нанесённым АЬ-пептидом. а для проверки реакционноспособного к АЬ антитела можно применять стандартный метод ЕЬ18А. Затем соединения можно испытать на профилактическую и терапевтическую эффективность на трансгенных животных. предрасположенных к амилоидогенному заболеванию. как описано в примерах. Такие животные включают. например. мышей. несущих 717-мутацию АРР. описанных см. выше. и мышей. несущих Шведскую (8\уебЛ11) мутацию АРР. как это описано МсСоп1одие патент США 5612486 и Нмао е! а1.. 8с1епсе 274. 99 (1996); 8Гаи£епЫе1 е! а1.. Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А 94. 13287-13292. (1997); 8!игсЫег-Р1егга! е! а1.. Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А 94. 13287-13292 (1997); ВогсйеИ е! а1.. №еигоп 19. 939-945 (1997)). Тот же метод скрининга можно применить для других потенциальных агентов. таких. например. как фрагменты АЬ. аналоги АЬ и более протяжённые пептиды. включая АЬ. описанные выше.
Терапевтические агенты по изобретению также включают антитела. которые специфически связываются с АЬ. Такие антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Некоторые такие антитела специфически связываются с агрегированной формой АЬ. не связываясь с диссоциированной формой. Некоторые связываются с диссоциированной формой и не связываются с агрегированной формой. Некоторые связываются как с агрегированной. так и с диссоциированной формой. Получение нечеловеческих моноклональных антител. например. антител мышей или крыс. можно осуществлять. например. иммунизацией животного АЬ. См. Наг1о\у апб Ьапе. ЛпЧЬоб1е5. А ЬаЬога!огу Мапиа1 (С8НР ΝΥ.
- 7 007218
1988) (вводится ссылкой). Такой иммуноген можно получать из природного источника, пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией.
Гуманизированные формы мышиных антител можно получать, связывая СПК-участки нечеловеческих антител с константными областями человеческих антител методами рекомбинантной ДНК. См. Оиееп е1 а1., Ргос. ИаИ. Асай. 8οί. И8Л 86, 10029-10033 (1989) и \МО 90/07861 (вводимый ссылкой).
Человеческие антитела можно получать фаг-дисплей методом (получение и анализ фагов, экспрессирующих или содержащих нужные гены). См., например, Потеет е1 а1., \¥О 91/17271; МсСаГГеПу е1 а1., XVО 92/01047. В этих методах получают библиотеки фагов, которые (фаги) обнаруживают различные антитела на своей внешней поверхности. Антитела обычно выявляются в виде фрагментов Ρν или РаЬ. Фаги, выявляющие (демонстрирующие) антитела с заданной специфичностью, выбираются исходя из повышенного сродства (из увеличения сродства) к АЬ или его фрагментам. АЬ также можно получить из трансгенных млекопитающих (не человека), имеющих трансгены, кодирующие, по меньшей мере, сегмент локуса человеческого иммуноглобулина и локус инактивированного эндогенного иммуноглобулина. См., например, международные заявки ЬоиЬегд е1 а1., νθ 93/12227 (1993); Кисйет1арай, νθ 91/10741 (1991) (каждая из которых вводится ссылкой во всей полноте). Человеческие антитела можно выбрать в экспериментах по конкурентному связыванию, или другим способом, чтобы иметь ту же самую специфичность эпитопа, что и определённое антитело мыши. По-видимому, такие антитела в особенности имеют общие с антителами мыши полезные функциональные свойства. Человеческие поликлональные антитела также могут предоставляться в виде сыворотки людей, иммунизированных иммуногенным агентом. При необходимости, такие поликлональные антитела можно концентрировать аффинной очисткой с АЬ или другим амилоидным пептидом в качестве аффинного реагента.
Можно создать человеческие или гуманизированные антитела, содержащие константную область 1дС, 1дП, 1дА и 1дЕ и любой изотип, включая 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. Антитела могут экспрессировать в виде тетрамеров, содержащих две лёгких и две тяжёлых цепи, в виде отдельных тяжёлых цепей, лёгких цепей, в виде РаЬ, РаЬ' Р(аЬ')2 и Ρν или в виде одноцепочечных антител, в которых вариабельные области тяжёлой и лёгкой цепей связаны через спейсер.
Терапевтические агенты для применения в данных методах также включают Т-клетки, которые связываются с АЬ-пептидом. Например, Т-клетки могут активироваться против АЬ-пептида с помощью экспрессии человеческого гена МНС класса I и человеческого гена Ь-2-микроглобулина линией клеток насекомых, вследствие чего комплекс образуется на поверхности клеток и может связываться с АЬ-пептидом. Т-клетки, контактировавшие с клеточной линией, становятся специфически активированными против пептида. См. Ре1ег5оп е1 а1., И8 5314813. Линии клеток насекомых, экспрессирующие антиген МНС класс II, можно таким же образом использовать для активации СЛ4 Т-клеток.
2. Другие заболевания.
Те же самые или аналогичные принципы определяют получение терапевтических агентов для лечения других амилоидогенных заболеваний. Вообще агенты, отмеченные выше, как применяющиеся для лечения болезни Альцгеймера, могут также применяться для лечения раннего случая болезни Альцгеймера, связанного с (обусловленного) синдромом Дауна. При бешенстве коров прион-пептид, активные фрагменты, аналоги и антитела к прион-пептиду используют вместо АЬ-пептида, активных фрагментов, аналогов и антител к АЬ-пептиду, используемых при лечении болезни Альцгеймера. При лечении множественной миеломы используют лёгкую цепь 1дС и аналоги и антитела к нему, и так далее при других заболеваниях.
3. Белки-носители.
Некоторые агенты для индуцирования иммунного ответа содержат подходящий эпитоп для стимулирования иммунного ответа против амилоидных отложений, но они слишком малы, чтобы быть иммуногенными. В этой ситуации пептидный иммуноген может быть связан с соответствующим носителем для того, чтобы выявить иммунный ответ. Соответствующие (пригодные) носители включают сывороточные альбумины, гемоцианин лимфы улитки, молекулы иммуноглобулина, тироглобулин, овальбумин, столбнячный токсин или анатоксины других патогенных бактерий, например, таких как дифтерия, Е. со11, холера или Н. ру1оп, или ослабленное производное токсина. Другие носители для стимулирования или усиления иммунного ответа включают цитокины, например, такие как 1Ь-1, 1Ь-1 а- и Ь-пептиды, 1Ь2, §ΙΝΡ, 1Б-10, СМ-С8Р М1Р1а и Ь и ΚΑΝΤΕ8. Иммуногенные агенты могут также быть связаны с пептидами, которые усиливают транспорт через ткани, как описано в О'Майопу, νθ 97/17613 и νθ 97/17614.
Иммуногенные агенты могут связываться с носителями за счёт перекрёстного сшивания. Методики связывания иммуногена с носителем включают образование дисульфидных связей с применением Νсукцинимидил-3-(2-пиридил-тио)пропионата (8РПР) и сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС) (если в пептиде отсутствует сульфгидрильная группа, её можно ввести добавлением цистеинового остатка). Эти реагенты образуют дисульфидную связь между собой и пептидными цистеиновыми остатками на одном белке и амидную связь за счёт е-аминогруппы в лизине или другой свободной аминогруппы в других аминокислотах. Множество таких дисульфид/амидообразующих агентов описано в 1ттип. Κν. 62, 185 (1982). Другие бифункциональные связы
- 8 007218 вающие агенты образуют скорее тиоэфирную, нежели дисульфидную связь. Многие из этих тиоэфиробразующих агентов выпускаются промышленностью и включают реакционноспособные эфиры 6малеинимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты и 2-иодуксусной кислоты, 4-(Ы-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Карбоксильные группы можно активировать за счёт их соединения с сукцинимидом или натриевой солью 1-гидроксил-2-нитро-4-сульфоновой кислоты.
Иммуногенные пептиды могут также экспрессировать в виде слитых белков с носителями. Иммуногенный пептид может связываться с носителем по аминному концу, по карбоксильному концу или внутренней частью молекулы. При необходимости, в слитом белке могут присутствовать множественные повторы иммуногенного пептида.
4. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногены.
Иммунный ответ на амилоидные отложения может индуцироваться также введением нуклеиновой кислоты, кодирующей АЬ-пептид или другие пептидные иммуногены. Такие нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий иммуноген, обычно связывается с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые дают возможность экспрессировать ДНК-сегмент в заданных клетках-мишенях больного. Для экспрессии в клетках крови, что желательно для стимуляции иммунного ответа, промоторные и энхансерные элементы лёгкой или тяжёлой цепи генов иммуноглобулина или ранний промотор и энхансер главного посредника СМУ пригодны для прямой экспрессии. Связанные регуляторные элементы и кодирующие последовательности часто клонируют в вектор.
Пригоден ряд вирусных векторных систем, включая ретровирусные системы (см., например, Ба\упе апб Титш, Сиг. Θρίη. Сеие1. Иеуе1ор. 3, 102-109 (1993)); аденовирусные векторы (см., например, Вей е! а1., 1. У1го1. 67, 5911 (1993)); аденоассоциированные вирусные векторы (см., например, Ζΐιοιι е! а1., 1. Ехр. Меб. 179, 1867 (1994)), вирусные векторы семейства оспы (рох), включая вирус коровьей оспы и вирусы оспы птиц, вирусные векторы из рода альфа вирусов, такие, например, как образованные из Синдбисвируса и вируса лесов Семлики (см., например, ИиЬепкку е! а1., 1. Упо1. 70, 508-519 (1996)), и вирусы папилломы (Ойе е! а1., Нитаи Сеие Тйегару 6, 325-333 (1995); Аоо е! а1., АО 94/12629 и Х1ао апб Вгапбкта, Иис1е1с Ас1б§. Век. 24, 2630-2622 (1996)).
ДНК, кодирующая иммуноген, или вектор, содержащий таковую, могут быть упакованы в липосомы. Пригодные липиды и родственные аналоги описаны в патентах США 5208036, 5264618, 5279833 и 5283185. Векторы и ДНК, кодирующие иммуноген, также могут абсорбироваться носителями в форме (макро)частиц или связываться с ними, примеры макрочастиц включают полиметилметакрилат и полилактиды и поли(лактид-со-гликолиды), см., например, МсСее е! а1., 1. Мюго Епсар. (1996).
Векторы или оголённая ДНК для генной терапии могут доставляться ш у1уо при введении больному, обычно при системном введении (например, путем внутривенного, внутрибрюшинного, назального, желудочного или внутричерепного вливания), или при местном применении (см., например, патент США 5339346). ДНК также можно вводить, применяя генное ружьё. Х1ао апб Вгапбкта, см. выше. ДНК, кодирующую иммуноген, осаждают на поверхности из микроскопических металлических гранул (бусин). Микроснаряды ускоряются за счёт ударной волны или расширения гелия и проникают в ткани на глубину нескольких слоев клеток. Например, пригоден Ассе1Ф Сепе Иейуегу Иеуюе, производимый Адасе!ик, 1пс. М1бб1е!оп ΑΙ. Или же оголённая ДНК может поступать через кожу в кровоток просто при наложении ДНК (накладка) на кожу с химическим или механическим раздражением (см. АО 95/05853).
В дополнительном варианте изобретения, векторы, кодирующие иммуноген, могут доставляться к клеткам ех у1уо, к таким клеткам, как клетки эксплантата отдельного больного (например, лимфоциты, костный мозг, биопсия тканей) или универсальные донорские гемопоэтические стволовые клетки, с последующей реплантацией клеток больному, обычно после отбора по клеткам, которые ассимилировали вектор.
III. Больные, подлежащие лечению.
В число больных, подлежащих лечению, входят люди с повышенным риском заболевания, но не проявляющие симптомов, а также больные с симптомами заболевания. В случае болезни Альцгеймера фактически любой человек рискует заболеть болезнью Альцгеймера, если он или она живёт достаточно долго. Следовательно, данные методы можно назначать профилактически целой популяции без какойлибо оценки риска у подвергаемого (лечению) больного. Данные методы особенно пригодны для тех людей, которые имеют известный генетический риск заболевания болезнью Альцгеймера. К таким людям относятся люди, имеющие родственников с этим заболеванием, и те, риск которых обнаружен анализом генетических или биохимических маркёров. Генетические маркёры риска в отношении болезни Альцгеймера включают мутации в гене АРР, особенно мутации в положении 717 и положениях 670 и 671, называемые мутации Харди и Шведская соответственно (Нагбу, ΤΙΝ8, см. выше). Другими маркёрами риска являются мутации в генах пресенилина Р81 и Р82, и АроЕ4, семейный анамнез относительно АИ, холестеринемии или атеросклероза. Людей, в данное время страдающих болезнью Альцгеймера, можно узнать по характерному слабоумию, а также по наличию описанных выше факторов риска. Кроме того, для определения людей с АИ применим ряд диагностических тестов. Они включают определение уровней С8Е тау и АЬ42. Повышенный уровень тау и пониженный уровень АЬ42 означают наличие АИ.
- 9 007218
Людей, страдающих болезнью Альцгеймера, также можно диагностировать с помощью критериев ММ8Е или ΑΌΚΌΑ, как описано в примерах.
Лечение больных с бессимптомным течением болезни можно начинать в любом возрасте (например, в 10, 20, 30 лет). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение до достижения больным возраста 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение обычно требует многократных доз в течение времени. Лечение можно постоянно контролировать, анализируя антительные (иммунные) ответы, реакции активированных Т-клеток и В-клеток на терапевтический агент (например, АЬ-пептид) во времени. Если реакция ослабляется, назначается (показана) бустерная доза. В случае больных с потенциальным синдромом Дауна, лечение можно начинать антенатально, вводя терапевтический агент матери, или вскоре после рождения.
IV. Схемы лечения.
При применении для профилактики фармацевтические композиции или лекарственные препараты вводят больному, чувствительному или, иначе, с повышенным риском, к конкретному заболеванию в количестве, достаточном для исчезновения или снижения степени риска или для отсрочки начала заболевания. При терапевтическом применении композиции или лекарственные препараты вводят больному с подозрением на наличие этой болезни либо уже страдающему этой болезнью в количестве, достаточном для лечения, или, по меньшей мере, частичного подавления симптомов заболевания и его осложнений. Количество, достаточное для выполнения этого, определяется как терапевтически или фармацевтически эффективная доза. Как при профилактической, так и при терапевтической схемах лечения агенты обычно вводят в виде нескольких дозировок до тех пор, пока не будет достигнут достаточный иммунный ответ. Обычно иммунный ответ контролируют и, если иммунный ответ начинает постепенно затихать, дают повторные дозы.
Эффективные дозы композиций по данному изобретению для лечения вышеописанных состояний варьируются в зависимости от множества различных факторов, включая способы введения, нужное место (введения), физиологическое состояние больного, является ли больной человеком или животным, другие вводимые препараты, и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно больным является человек, но при некоторых заболеваниях, например, таких, как коровье бешенство, больным может быть другое млекопитающее, такое как корова. Лечебные дозы нужно титровать, чтобы достичь оптимальной безопасности и эффективности. Количество иммуногена зависит от того, вводится ли также адъювант, причем в отсутствие адъюванта требуются более высокие дозы. Количество иммуногена для введения иногда варьируется от 1 до 500 мкг одному больному и более обычно от 5 до 500 мкг на инъекцию при введении человеку. Иногда применяют более высокую дозу, 1-2 мг на одну инъекцию. Как правило, на каждую инъекцию человеку применяют 10, 20, 50 или 100 мкг. Частота инъекций может варьироваться значительно от одного раза в день до одного раза в год и одного раза в десять лет. В любой день приёма дозы, доза составляет более 1 мкг/больной и обычно более 10 мкг/больной, если также вводится адъювант, и более 10 мкг/больной, а обычно более 100 мкг/больной в отсутствие адъюванта. Типичная схема представляет собой иммунизацию с послующими бустер-инъекциями с 6-недельными интервалами. Другая схема представляет собой иммунизацию с последующими бустер-инъекциями через 1, 2 и 12 месяцев. По другой схеме требуется инъекция каждые два месяца в течение жизни. Или же бустер-инъекции можно делать нерегулярно, по показаниям мониторинга иммунного ответа. Для пассивной иммунизации с помощью антитела вводят дозы в интервале от 0,0001 до 1 мг/кг и более обычно 0,01-5 мг/кг веса тела хозяина. Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногены, составляют интервалы примерно 10 нг - 1 г, 100 нг - 100 мг, 1 мкг - 10 мг или 30-300 мкг ДНК на одного больного. Дозы инфекционных вирусных векторов варьируются от 10 до 109 или более вирионов на дозу.
Агенты для индуцирования иммунного ответа можно вводить парентерально, местно, внутривенно, перорально, подкожно, внутрибрюшинно, назально, внутримышечно для профилактического и терапевтического лечения. Наиболее типичным способом введения является подкожный, хотя другие способы могут быть столь же эффективны. Следующим наиболее общим способом является внутримышечная инъекция. Такую инъекцию наиболее часто делают в мышцы рук или ног. Внутривенные инъекции, так же как внутрибрюшинные, внутриартериальные, внутричерепные или внутрикожные инъекции также эффективно вызывают иммунный ответ. В некоторых методах агенты вводят с помощью инъекции непосредственно в конкретную ткань, где аккумулируются отложения.
Агенты по изобретению можно, при необходимости, вводить в сочетании с другими агентами, которые, по меньшей мере, частично эффективны при лечении амилоидогенного заболевания. В случае синдромов Альцгеймера и Дауна, при которых амилоидные отложения происходят в мозге, агенты по изобретению можно также вводить с другими агентами, которые улучшают прохождение агентов по изобретению через гематоэнцефалический барьер.
Иммуногенные агенты по изобретению, например, такие как пептиды, иногда вводят в сочетании с адъювантом. Множество адъювантов может применяться в сочетании с пептидом, например, АЬ для выявления иммунного ответа. Предпочтительные адъюванты усиливают истинный ответ на иммуноген, не вызывая коформационных изменений в иммуногене, которые влияют на качественную форму ответа. Предпочтительные адъюванты включают квасцы, 3-Де-О-ацетилированный монофосфорильный липид А (МРЬ,МФЛ) (см. английский патент 2220211). 0821 представляет собой тритерпеновый гликозид, или
- 10 007218 сапонини, выделенный из коры дерева Ош11а)а 8аропапа Мо1ша, растущего в Южной Америке (см. Кеи811 с! а1., в Уассшс ЭсДдп: Тйс 8иЬиш1 апб АщуагИ Арртоасй (сбк. РохтеН апб Лс\утап. Р1епит Ргекк, ΝΥ, 1995); патент США № 5057540). Другие адъюванты являются эмульсиями масла (такого как сквален или арахисового масла) в воде, при необходимости в сочетании с иммуностимуляторами, такими как монофосфорильный липид А (см. 81ои1с с! а1., Ν. Епд1. 1. Меб. 336, 86-91 (1997)). Другим адъювантом является СрС (Вю\\'от1б Тобау, Νωυ. 15, 1998). Или же АЬ может быть связан с адъювантом. Например, липопептидный вариант АЬ можно получить, связывая пальмитиновую кислоту или другие липиды непосредственно с Ν-концом АЬ, как описано для антигенной вакцины при гепатите В (Ыушдйоп, 1. 1ттипо1. 159, 1383-1392 (1997)). Однако такое связывание практически не должно менять конформацию АЬ так, чтобы влиять на природу иммунного ответа на него. Адъюванты могут вводиться в качестве компонента терапевтической композиции с активным агентом или могут вводиться самостоятельно (отдельно) перед введением терапевтического агента, одновременно с ним или после.
Предпочтительным классом адъювантов являются соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия. Такие адъюванты могут применяться с или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как МРЬ (МФЛ) или 3-ДМЗ, 0821, полимерные или мономерные аминокислоты, такие как полиглутаминовая кислота или полилизин. Другими классами адъювантов являются рецептуры эмульсий масло-в-воде. Такие адъюванты могут применяться с или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких, например, как мурамилпептиды (например, Ν-ацетилмурамил-Ь-треонил-Э-изоглутамин (Шт-МЭР), Ν-ацетил-нормурамил-Ь-аланил-Э-изоглутамин (пот-МЭР), №ацетилмурамил-Ь-аланил-Э-изоглутаминил-Ь-аланин-2-(1 '-2'-дипальмитоил-8пглицеро-3 -гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), №ацетилглюксаминил-Н-ацстилмурамил-Ь-А1Э-18од1и-Ь-А1а-дипальмитокси пропиламид (ЭТР-ЭРР) терамидФ), или другие компоненты оболочек бактериальных клеток. Водомасляные эмульсии включают (а) МЕ59 (международная заявка АО 90/14837, содержащую 5% сквалена, 0,5% Т\тесп 80 и 0,5% 8рап 85 (при необходимости, содержащую различные количества МТР-РЕ), приготовленную в виде мельчайших частиц с применением микрофлюидизатора, например, такого как микрофлюидизатор модели ΗΟΥ (Мютойшбюк, Лс\\1оп МА), (Ь) 8АЕ, содержащую 10% сквалана, 0,4% Т\уссп 80, 5% Р1итошс блок-полимера Ь121, и Шт-МЭР, либо микрофлюидизированную в тончайшую эмульсию, либо встряхиваемую с целью получить более крупнодисперсную эмульсию, (с) В1Ь1Ф - адъювантную систему (КА8), (К1Ь1 1ттипосйст, НатШоп, МТ), содержащую 2% сквалена, 0,2% Тетсеп 80 и один или более компонентов оболочек бактериальных клеток из группы, состоящей из монофосфориллипида А (МРЬ, МФЛ), димиколята трегалозы (ТЭМ) и скелета клеточных оболочек (СА8), предпочтительно МРЬ (МФЛ) + СА8 (Эе1охФ). Другим классом предпочтительных адъювантов являются сапониновые адъюванты, например, такие как 8бти1опФ (0821, Ацийа, АотссЧет, МА) или порошки, получаемые из него, такие как 18СОМ (иммуностимулирующие комплексы) и 18СОМАТК1Х. Другие адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (СЕА) и неполный адъювант Фрейнда. Другие адъюванты включают цитокины, такие как интерлейкины (1Ь-1, 1Ь-2 и 1Ь-12), макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-СЕ8), фактор некроза опухолевых клеток (ΊΝΕ).
Адъювант можно вводить вместе с иммуногеном в виде единой композиции или можно вводить перед, одновременно или после введения иммуногена. Иммуноген и адъювант могут упаковываться и поставляться в одной и той же ампуле или в отдельных ампулах и смешиваться перед употреблением. Иммуноген и адъювант обычно упаковывают с этикеткой (вкладышем), где указывается предполагаемое терапевтическое применение. Если иммуноген и адъювант упакованы по отдельности, упаковка обычно содержит инструкции по смешению перед употреблением. Выбор адъюванта и/или носителя зависит от устойчивости вакцины, содержащей адъювант, способа введения, схемы применения, эффективности адъюванта в отношении вида организма, подлежащего вакцинации, и, если это человек, фармацевтически приемлемым адъювантом является такой, который был одобрен или заслуживает одобрения для введения человеку соответствующими органами власти. Например, полный адъювант Фрейнда не пригоден для введения человеку. Квасцы, МРЬ (МФЛ) и 0821 являются предпочтительными. При необходимости могут одновременно применяться два или более различных адъювантов. Предпочтительные комбинации включают квасцы с МРЬ, квасцы с 0821, МРЬ с 0821 и квасцы, 0821 и МРЬ вместе. Также можно применять неполный адъювант Фрейнда (Сйапд с! а1., Абуапсеб Эгид Эейуету Ясу1с\\'5 32, 173-186 (1998)), при необходимости, в сочетании с любым из квасцов, 0821 и МРЬ и всеми их сочетаниями.
Агенты по изобретению часто вводят в виде фармацевтических композиций, содержащих активный терапевтический и ряд других фармацевтически приемлемых компонентов. См. Рстшд1оп'5 РйаттассШ1са1 8с1спсс (15111 сб., Маск РиЬШЫпд Сотрапу, Еайоп, Реппкукаша, 1980). Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Композиции могут также включать, в зависимости от нужной рецептуры, фармацевтически приемлемые нетоксические носители или разбавители, которые называются наполнители, обычно применяемые при приготовлении фармацевтических композиций для введения человеку или животным. Разбавитель (растворитель) выбирают так, чтобы не повлиять на биологическую активность комбинации. Примерами таких растворителей являются дистиллированная вода, забуференный фосфатом физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка (Напк). Кроме того, фармацевтическая композиция или препа
- 11 007218 рат (состав) может также содержать другие носители, адъюванты или нетоксические, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и тому подобное. Однако некоторые реагенты, пригодные для введения животным, такие, например, как полный адъювант Фрейнда, обычно не включается в композиции, применяемые для людей.
Фармацевтические композиции также могут содержать большие, медленно преобразующиеся в ходе обмена веществ макромолеклы, например, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и сополимеры (такие как латексная функционализированная сефароза, агароза, целлюлоза и тому подобное), полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и агрегации липидов (такие как масляные капли или липосомы). Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимуляторы (т. е. адъюванты).
Для парентерального введения агенты по изобретению могут вводиться в виде вводимых в качестве инъекций доз раствора или суспензии вещества в физиологически приемлемом растворителе с фармацевтическим носителем, который может быть стерильной жидкостью, такой как водные масла, физиологический раствор, глицерин или этанол. Кроме того, в композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, поверхностно-активные вещества (сурфактанты), рНбуферирующие вещества и т.п. Другими компонентами фармацевтических композиций являются продукты переработки нефти, продукты животного, растительного происхождения или синтетические продукты, например, арахисовое масло, соевое масло или минеральное масло. Вообще говоря, гликоли, такие, например, как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, являются предпочтительными жидкими носителями, особенно для вводимых в качестве инъекций растворов.
Как правило, композиции готовят в виде инъецируемых, либо в качестве жидких растворов, либо суспензий; также можно готовить твёрдые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат также можно эмульгировать или поместить в липосом или микрочастицы, такие как полиактид, полигликолид или сополимер, с целью усиления действия адъюванта, как обсуждалось выше (см. Ьапдет, Заеисе 249, 1527 (1990) и Напек, Абуапсеб Эгид Бейуегу Ре\зе\\ъ 28, 97-119 (1997)). Агенты по этому изобретению можно вводить в форме беро!-инъекции, обеспечивающей замедленное всасывание, или имплантировать препарат, который можно готовить таким образом, чтобы обеспечить пролонгированное или пульсирующее высвобождение активного ингредиента.
Дополнительные рецептуры, пригодные для других способов введения, включают пероральные, интраназальные и лёгочные рецептуры, суппозитории и трансдермальные аппликации.
В случае суппозиториев связующие и носители содержат, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно получать из смесей, содержащих активный ингредиент в нитервале 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные рецептуры содержат эксципиенты, например, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрийсахарин, целлюлоза и карбонат магния, фармацевтической степени чистоты. Эти композиции бывают в виде растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов пролонгированного действия или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%.
Местные аппликации могут обеспечить трансдермальную или интрадермальную (внутрикожную) доставку. Местному введению может способствовать совместное введение агента с холерогеном или производным с пониженной токсичностью, или их субъединицами, или другими подобными бактериальными токсинами (см. О1еии е! а1., Иа!ше 391, 851 (1998)). Совместное введение можно осуществлять, применяя компоненты в виде смеси или в виде связанных молекул, полученных химическим перекрёстным сшиванием, или экспрессией в виде слитого белка.
Или же трансдермальную доставку можно осуществлять, используя путь через кожу (8кш ра!й кожный путь) или с помощью трансферосом (Раи1 е! а1., Еиг. 1. 1ттиио1. 25, 3521-24 (1995); Сеус е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Ас!а 1368, 201-15 (1998)).
V. Методы диагностики.
Изобретение предлагает методы выявления иммунного ответа на АЬ-пептид у больного, страдающего болезнью Альцгеймера, или восприимчивого к ней. Методы особенно применимы для мониторинга курса лечения, назначаемого больному. Методы можно применять для контроля как терапевтического лечения больных с симптомами заболевания, так и профилактического лечения больных с бессимптомным течением болезни.
Некотрые методы требуют определения базового значения иммунного ответа у больного перед введением дозы агента и сравнения этого базового значения с величиной иммунного ответа после лечения. Значительное увеличение (т.е. более обычной ошибки опыта при повторных измерениях одного и того же образца, выраженной как одно стандартное отклонение от среднего из таких измерений) величины иммунного ответа говорит о положительном результате лечения (т.е., что введение агента достигло результата или стимулировало иммунный ответ). Если величина иммунного ответа не изменяется значительно или уменьшается, это указывает на отрицательный результат лечения. В целом, ожидается, что у больных, проходящих начальный курс лечения агентом, при последующих дозах усилится иммунный ответ, который в конечном счёте стабилизируется. Введение агента обычно продолжают, пока иммунный ответ увеличивается. Достижение постоянного значения (стабилизация) является показателем того, что
- 12 007218 лечение можно прекратить или уменьшить дозу или частоту введения.
В других методах контрольное значение (т.е. среднее и стандартное отклонение) иммунного ответа определяют для контрольной популяции. Обычно отдельные представители контрольной популяции не получали предварительного лечения. Величины иммунного ответа у больного, измеренные после введения терапевтического агента, сравнивают затем с контрольным значением. Значительное увеличение в сравнении с контрольным значением (например, большее, нежели одно стандартное отклонение от среднего) говорит о положительном результате лечения. Отсутствие заметного увеличения или снижение говорит об отрицательном результате лечения.
Введение агента обычно продолжают, пока иммунный ответ увеличивается по сравнению с контрольным значением. Как и ранее, прекращение роста по сравнению с контрольным значением является показателем того, что лечение можно прекратить или уменьшить дозу или частоту.
В других методах контрольное значение иммунного ответа (например, среднее и стандартное отклонение) определяют у контрольной популяции отдельных представителей, которых подвергали лечению терапевтическим агентом и у которых иммунный ответ при лечении был постоянным. Измеренные величины иммунного ответа у больного сравнивают с контрольным значением. Если уровень, измеренный у больного, незначительно отличается (например, более одного стандартного отклонения) от контрольного значения, лечение можно прекратить. Если уровень у больного значительно ниже контрольного значения, оправдано продолжение введения агента. Если уровень у больного удерживается ниже контрольного значения, показано изменение схемы лечения, например, применение другого адъюванта.
В других методах больного, который в настоящее время не получает лечения, но проходил курс лечения ранее, проверяют иммунный ответ для того, чтобы определить, требуется ли возобновить лечение. Значение иммунного ответа, измеренное у больного, можно сравнить с величиной иммунного ответа, ранее достигавшегося у больного после предыдущего курса лечения. Значительное снижение по сравнению с предыдущим измерением (т.е. более обычной ошибки опыта в повторных измерениях того же образца) является показателем того, что лечение можно возобновить. Или же значение, измеренное у больного, можно сравнить с контрольным значением (среднее плюс стандартное отклонение), определённым для популяции больных после прохождения ими курса лечения. Или же измеренное у пациента значение можно сравнить с контрольным значением для популяции профилактически пролеченных больных, у которых продолжают отсутствовать симптомы заболевания, или для популяции терапевтически пролеченных больных, у которых наблюдается улучшение показателей болезни. Во всех этих случаях значительное уменьшение по сравнению с контрольным уровнем (т.е. более стандартного отклонения) является показателем того, что лечение больного следует возобновить.
Образцом ткани для анализа, как правило, является кровь, плазма, сыворотка, слизь или цереброспинальная жидкость больного. Образцы анализируют на признаки иммунного ответа на любую форму АЬ-пептида, как правило, АЬ42. Иммунный ответ можно определять по наличию, например, антител или Т-клеток, которые специфически связываются с АЬ-пептидом. ЕЫ8А-методы обнаружения антител, специфических к АЬ, описаны в разделе Примеры. Способы обнаружения реактивных Т-клеток описаны выше (см. Определения).
Изобретение дополнительно предоставляет диагностические наборы для описанных выше методов диагностики. Как правило, такие наборы содержат агент, который специфически связывается с антителами к АЬ или реагирует с Т-клетками, специфическими относительно АЬ. Набор также может содержать метку. Для обнаружения антител к АЬ метка обычно находится в виде меченых антиидиотипических антител. Для обнаружения антител агент можно поставлять в предварительно связанном с твёрдой фазой виде, как например, связанным с лунками микропланшета. Для обнаружения реактивных Т-клеток метка может вводиться в 3Н-тимидин для измерения пролиферативного ответа. Наборы также обычно содержат описания по пользованию набором. Описания также могут содержать схему или другие соответствующие указания, величины коррелирующие значения измеренных уровней с уровнями антител к АЬ или Тклеток, реактивных в отношении АЬ. Термин описания, ярлыки, этикетки относятся к любому написанному или зафиксированному материалу, который относится к набору или иным образом сопровождает набор всё время в процессе производства, транспортировки, продажи или использования. Например, термин описания охватывает рекламные листовки и брошюры, упаковочные материалы, инструкции, аудио и видеокассеты, компьютерные диски, а также описания, напечатанные непосредственно на наборах.
Примеры
I. Профилактическая эффективность АЬ против АО.
Эти примеры описывают введение пептида АЬ42 трансгенным мышам, характеризующимся сверхпродукцией АРР с мутацией в положении 717 (АРР-|-У^н). что делает их предрасположенными к проявлению Альцгеймероподобной нейропатологии. Получение и характеристики этих мышей (РЭАРРмышей) описано в Сатез е1 а1., ЫаШге, см. выше. У этих животных, в их гетерозиготной форме, начинают появляться отложения АЬ в шестимесячном возрасте. К пятнадцати месяцам уровни отложений АЬ у них эквивалентны уровню отложений, наблюдаемому при болезни Альцгеймера.
Мышам РЭАРР вводили агрегации АЬ42 (агрегированные АЬ42) или забуференный фосфатом фи
- 13 007218 зиологический раствор. Агрегированный АЬ42 выбран вследствие своей способности индуцировать антитела к множественным эпитопам АЬ.
A. Методы.
1. Источник мышей.
Тридцать самок гетерогенных мышей РИАРР произвольно делят на следующие группы: 10 мышам вводят агрегации АЬ42 (одна умерла при перемещении), 5 мышам вводят РВ8/адъювант или РВ8 и 10 контрольных не получают ничего. Пяти мышам вводят сывороточный амилоидный белок (8АР).
2. Приготовление иммуногенов.
Приготовление ассоциированного АЬ42: 2 мг АЬ42 (И8 Рерйдек 1пс. Ιοί К-42-12) растворяют в 0,9 мл воды и доводят до 1 мл, добавляяя 0,1 мл 10 х РВ8. Всё стряхивают и перемешивают и термостатируют в течение ночи при 37°С в условиях агрегации пептида. Весь не использованный АЬ хранят в виде сухого лиофилизированного порошка при -20°С до следующей инъекции.
3. Приготовление инъекций.
100 мг агрегированного АЬ42 в РВ8 на одну мышь эмульгируют в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (СТА) с конечным объёмом эмульсии 400 мкл для первой иммунизации, с последующей добавочной инъекцией такого же количества иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (1ЕА) через 2 недели. Две дополнительные дозы в 1ЕА дают с месячными интервалами. Последующие иммунизации проводят с месячными интервалами в 500 мкл РВ8. Инъекции делают внутрибрюшинно (1.р.).
Инъекции РВ8 осуществляют по такому же графику и мышам вводят смесь 1:1 РВ8/адъювант в количестве 400 мкл на мышь или 500 мкл РВ8 на мышь. Инъекции 8АР делают по тому же расписанию, используя дозу 100 мкг на инъекцию.
4. Титрование образцов крови мышей, подготовка тканей и иммуногистохимия.
Вышеназванные методы описаны в “Общих материалах и методах”.
B. Результаты.
Мышам РИАРР вводят либо агрегации АЬ42 (ассоциированные АЬ42), 8АР-пептиды, либо забуференный фосфатом физиологический раствор. Группу мышей РИАРР оставляют без инъекций, в качестве позитивного контроля. Титры мышей на агрегации АЬ42 контролируют каждый следующий месяц с четвёртого бустера до тех пор, пока мышам исполнится год. Мышей умерщвляют в 13 месяцев. Во всех изученных временных точках восемь из девяти инъецированных агрегациями АЬ42 мышей имеют высокий титр антивирусных антител, который остается высоким в серии инъекций (титры выше 1/10000). У девятой мыши низкий, но поддающийся измерению титр примерно 1/1000 (фиг. 1, табл. 1). Титр 8АРРинъецированных мышей составляет титры от 1:1000 до 1:30000 для этого иммуногена, за единственным исключением: мышь с титром 1:100000.
В случае мышей, инъецированных РВ8, титрование проводят против агрегированного АЬ42 через шесть, десять и двенадцать месяцев. При разбавлении 1/100 в группе РВ8-инъецированные мыши при титровании против ассоциированного АЬ42 титры превышают фон более чем в 4 раза только в одной точке, в других случаях они превышают фон менее чем в 4 раза во всех временных точках (табл.1). 8АРспецифический ответ незначителен во всех временных точках, значения всех титров менее 300.
У семи из девяти мышей в ассоциированной АЬ1-42 группе не обнаружен амилоид в мозге. Напротив, ткань мозга мышей в 8АР- и РВ8-группах содержит множественные 306-положительные амилоидные отложения в гиппокампе, а также в лобной и поясной коре. Характер отложения подобен отложениям у контрольных животных с типичным поражением восприимчивых подобластей, таких как внешний молекулярный слой зубчатой извилины гиппокампа. Одна мышь из АЬ1-42-инъецированной группы имеет значительно уменьшенную амилоидную нагрузку, ограниченную гиппокампом. Изолированную (отдельную) бляшку идентифицируют у другой АЬ1-42-обработанной мыши.
Количественный анализ изображения амилоидного отложения (нагрузки) в гиппокампе подтверждает резкое уменьшение (его) у животных, получавших АЮ792 (фиг. 2). Средние значения амилоидной нагрузки для РВ8-группы (2,22%) и для необработанной контрольной группы (2,65%) значительно больше значений для группы, иммунизированной АМ792 (0,00%, р = 0,0005). Напротив, среднее значение для группы, иммунизированной 8АР-пептидами (8АРР), составляет 5,74%. Ткань мозга необработанных контрольных мышей содержит множественные АЬ-амилоидные отложения, визуализированные с помощью АЬ-специфического моноклонального антитела (тАЬ) 3Ό6 в гиппокампе, а также в ретросплениальной коре. Такие же особенности амилоидного отложения наблюдаются у мышей, иммунизированных 8АРР или РВ8 (фиг. 2). Кроме того, в этих последних трёх группах наблюдается характерное поражение восприимчивых подобластей мозга, типичных для АО, например, таких как внешний молекулярный слой зубчатой извилины гиппокампа, во всех трёх из этих групп.
Мозг, не содержащий АЬ-отложений, не имеет также нейритных бляшек, которые обычно визуализируются у РИАРР-мышей с помощью антитела 8Е5 к человеческому АРР. Мозг всех животных оставшихся групп (8АР-инъецированных, РВ8 и неинъецированных мышей) содержит множественные нейритные бляшки, типичные для непролеченных мышей РИАРР. Малое число нейритных бляшек имелось у одной мыши, получавшей А№792, и единственное скопление дистрофических нейритов обнаружено у второй мыши, пролеченной АЮ792. Анализ изображения гиппокампа, как изображено на фиг. 3, пока
- 14 007218 зывает действительное исчезновение дистрофических нейритов у ЛЫ1792-пролеченных мышей (в среднем 0,00%) по сравнению с РВ8-реципиентами (среднее 0,28%, р = 0,0005).
Астроцитоз, характерный для ассоциированного с бляшками воспаления, также отсутствует в мозге АЫ-42-инъецированной группы. Мозг мышей в других группах содержит обильные и составляющие скопления СЕАР-позитивные астроциты, типичные для ассоциированного с АЬ-бляшками глиоза. Препараты субпопуляции, взаимодействующие с СЕАР, контрастно окрашивают тиофлавином 8, чтобы локализовать АЬ-отложения. СЕАР-позитивные астроциты дают ассоциаты с АЬ-бляшками у 8АР-, РВ8- и непролеченных контрольных мышей. Такой ассоциации не обнаружено у бляшко-негативных АЬ1-42пролеченных мышей, хотя минимальный обусловленный бляшками глиоз найден у одной мыши, пролеченной АЫ1792.
Анализ изображения, показанный на фиг. 4 для ретросплениальной коры, подтверждает, что уменьшение астроцитоза является значительным со средним значением 1,56 для мышей, пролеченных ΛΝ1792. по сравнению со средними значениями более 6% для групп, иммунизированных 8АРпептидами, РВ8 или непролеченных (р = 0,0017).
Данные, полученные для субпопуляции АЬ1-42- и РВ8-инъецированных мышей, показывают, что обусловленная бляшками МНС II иммунореактивность отсутствует у АЬ1-42-инъецированных мышей, что согласуется с отсутствием связанной с АЬ воспалительной реакцией.
Срезы мозга также реагировали с тАЬ, специфически связывающимся с МАС-1, белков поверхности клеток. МАС-1 (СЭ11Ь) является членом семейства интегринов и существует в качестве гетеродимера с СЭ18. Комплекс СЭ11/СО18 находится в (на поверхности) моноцитах, макрофагах, нейтрофилах и природных клетках-киллерах (Мас апб 81тагб). Резидентным МАС-1-реактивным типом клеток мозга является, по-видимому, микроглия, на основании сходной (подобной) фенотипической морфологии в МАС-1 иммунореактивных срезах. Обусловленное бляшками МАС-1-мечение ниже в мозге мышей, пролеченных АШ792, по сравнению с РВ8 контрольной группой, это открытие согласуется с отсутствием АЬ-индуцированной воспалительной реакции.
С. Выводы.
Отсутствие АЬ-бляшек и реактивных нейронных и глиотических изменений мозга АЬ1-42инъецируемых мышей указывает, что в их мозгу либо совсем не откладывается, либо откладывается чрезвычайно мало амилоидных отложений, и патологические последствия, такие, например, как глиоз и невритическая (невритная) патология, отсутствуют. У РИАРР-мышей, пролеченных АЬ1-42, наблюдается практически такое же отсутствие патологии, как у контрольных нетрансгенных мышей. Следовательно, АЬ1-42-инъекции являются высокоэффективными для предотвращения отложения или для удаления человеческого АЬ из тканей мозга и ликвидации последующих нейронных и воспалительных дегенеративных изменений. Т. е. введение АЬ-пептида оказывает благоприятное терапевтическое действие при предотвращении АО.
II. Изучение эффекта дозы.
Группы самок мышей 8^188 ХУсЬЧсг в возрасте пяти недель (Ν = 6 в группе) иммунизируют с помощью 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,4 или 0,13 мкг АЬ в виде рецептуры с СΕΛ/IΕА, вводимой внутрибрюшинно. Вводят три дозы с двухнедельными интервалами с последующей через один месяц четвёртой дозой. Первую дозу эмульгируют в СЕА, а остальные дозы эмульгируют с ЕЕА. У животных берут кровь через 4-7 дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для определения титров антител. У животных субпопуляции из трёх групп, иммунизированных с помощью 11, 33 или 300 мкг антигена, дополнительно отбирают пробу крови примерно с месячными интервалами в течение четырёх месяцев после четвёртой иммунизации для котроля за ослаблением иммунного ответа в интервале доз для вакцинации. Последнюю, пятую иммунизацию этих животных проводят через семь месяцев после начала исследования. Их умерщвляют через неделю после этого с целью измерения гуморального иммунного ответа на АNВ1792 и для проведения токсикологических анализов.
Убывающий эффект дозы наблюдают от 300 к 3,7 мкг или отсутствие эффекта в случае двух самых низких доз. Средние титры антител составляют примерно 1:1000 после 3 доз и примерно 1:10 000 после 4 доз по 11-300 мкг антигена (см. фиг. 5).
Титры антител резко возрастают во всех случаях, за исключением группы с самыми низкими дозами, после третьей иммунизации с увеличением СМТ в 5-25-кратном интервале. Низкий (слабый) гуморальный иммунный ответ затем наблюдают даже у 0,4 мкг - реципиентов. У групп, получавших 1,2 и 3,7 мкг, титры сравнимы с СМТ примерно 1000, а самые высокие четыре дозы ассоциируются с СМТ, примерно, 25000, за исключением группы, получавшей дозу 33 мкг, с более низким СМТ 3000. При последующих четырех иммунизациях увеличение титра более умеренное для большинства групп.
Наблюдается чёткий эффект дозы в группах с более низкой дозой антигена от 0,14 мкг до 11 мкг в интервале от неразличимого антитела для 0,14 мкг-реципиентов до СМТ 36000 для реципиентов 11 мкг. И снова титры для четырех групп с наиболее высокими дозами от 11 до 300 мкг соответствовали друг другу. Так, после двух иммунизаций титр антител зависит от дозы антигена в широком интервале от 0,4 до 300 мкг. При третьей иммунизации титры для всех четырех групп с наиболее высокими дозами сопоставимы и остаются постоянными после дополнительной иммунизации.
- 15 007218
Через месяц после четвертой иммунизации в группе с дозой 300 мкг титры в 2-3 раза выше, чем титры, измеренные в крови, взятой через пять дней после иммунизации (фиг. 6). Это наблюдение подтверждает, что максимальный анамнестический гуморальный иммунный ответ возникает позднее 5 дней после иммунизации. Более умеренное (50%) увеличение наблюдают в это время в группе, получавшей дозу 33 мкг. В группе, получавшей дозу 300 мкг, через два месяца после последней дозы значения СМТ резко понижаются примерно на 70%. Ещё через месяц падение менее резкое, 45% (100 мкг) и около 14% для доз 33 и 11 мкг. Следовательно, скорость уменьшения титров циркулирующих антител после прекращения иммунизации, по-видимому, имеет две фазы с резким падением в первый месяц после максимального (пика) ответа с последующей более умеренной скоростью уменьшения впоследствии.
Титры антител и кинетика иммунного ответа этих мышей δχνίκκ ХУсЬДсг подобны титрам антител и кинетике иммунного ответа молодых гетерозиготных трансгенных ΡΌΆΡΡ-мышей, иммунизированных аналогичным образом. Дозировки, эффективные для того, чтобы индуцировать иммунный ответ у человека, обычно сходны с дозировками, эффективными в случае мышей.
III. Скрининг на терапевтическую активность в отношении установленной АО (болезни Альцгеймера).
Этот анализ проводят для того, чтобы испытать иммуногенный агент на активность по угнетению или реверсии нейропатологических характеристик АО у животных. Иммунизацию с помощью АЬ протяженостью 42 аминокислоты (ΑΝ1792) начинают в той временной точке, когда амилоидные бляшки уже присутствуют в мозгу ΡΏΑΡΡ-мышей.
По истечении периода лечения, применяемого в данном исследовании, у непролеченных ΡΟΑΡΡмышей наблюдается ряд нейродегенеративных изменений, которые напоминают изменения при АО (батек е! а1., см. выше и 1о11П8Оп-\Уоо6 е! а1., Ρτοε. №11. Асаб. §с1. И8А 94, 1550-1555 (1997)). Отложение АЬ в виде амилоидных бляшек ассоциируется с дегенеративной нейронной реакцией, представляющей собой аберрантные (неправильные) аксоны и дендриты, называемые дистрофическими нейритами. Амилоидные отложения, окружённые дистрофическими нейритами и содержащие их, называются нейритными бляшками. Как у АО-, так и у Ρ^ΑΡΡ-мыши, дистрофические нейриты имеют определённую глобулярную структуру, иммунореактивны в отношении антител, распознающих ΑΡΡ и цитоскелетные компоненты, и демонстрируют комплексные субклеточные дегенеративные изменения на ультраструктурном уровне. Эти особенности позволяют делать необходимые в случае заболевания селективные и воспроизводимые измерения образования нейритных бляшек в мозгу Ρ^ΑΡΡ-мыши. Дистрофическая нейронная компонента Ρ^ΑΡΡ нейритных бляшек легко визуализируется с помощью антитела, специфического к человеческому ΑΡΡ (тАЬ 8Е5), и легко определима с помощью компьютерного анализа изображения. Следовательно, помимо измерения влияния АЮ792 на образование амилоидных бляшек мы контролируем влияние этого лечения на развитие нейритной дистрофии.
Астроциты и микроглия не-нейронными клетками, которые отвечают на нейронное повреждение и отражают степень нейронного повреждения. СЕΑΡ-позитивные астроциты и микроглия МНС II степени обычно наблюдаются при АО, и их активация повышается с тяжестью заболевания. Следовательно, мы также контролируем развитие реактивных астроцитов и микроглиоза у пролеченных АШ792пролеченных мышей.
A. Материалы и методы.
Сорок восемь гетерогенных самок Ρ^ΑΡΡ-мышей, в возрасте 11-11,5 месяцев, полученных от Сйа1ек Жует, произвольно делят на две группы: 24 мышей иммунизируют с помощью 100 мкг АЮ792 и 24 мышей иммунизируют ΡΒ§, во всех случаях вместе с адъювантом Фрейнда. Группы АЮ792 и ΡΒ§ снова делят по достижении ~15 мес. В возрасте 15 мес. примерно половину каждой группы АЮ792- и ΡΒδ-пролеченных мышей умерщвляют (эвтаназия) (п=10 и 9 соответственно), иммунизацию остальных продолжают до окончания в возрасте 18 мес. (п=9 и 12 соответственно). В целом 8 мышей (5 АЮ792. 3 ΡΒ§) (сами) умерли во время исследования. Помимо иммунизированных животных для сравнения были включены непролеченные Ρ^ΑΡΡ-мыши - в возрасте одного года (п=10), 15 месяцев (п=10) и 18 месяцев (п=10) - в ЕЫБА для измерения АЬ и АРР-уровней в мозге; животные в возрасте одного года также участвуют в иммуногистохимических анализах.
Методология такая же, как в примере 1, если не указано иначе. Для приготовления антигена для шести иммунизаций до достижения мышами 15-месячного вораста применяют АЮ792 - и§ Ρеρ1^άе лот 12 и СаШОтша Ρеρ1^άе5 лот МЕ0339. СаШОтша Ρеρ1^άе5 лоты МЕ0339 и МЕ0439 применяют для трёх дополнительных иммунизаций от 15 до 18 мес.
Для иммунизации 100 мкг АЮ792 в 200 мкл ΡΒ§ или один ΡΒ§ эмульгируют в соотношении 1:1 (по объёму) с полным адъювантом Фрейнда (СЕА) или неполным адъювантом Фрейнда (ГРА) или ΡΒ§ в конечном объёме 400 мкл. Первую иммунизацию проводят с СЕА в качестве адъюванта, следующие четыре дозы делают с ША и конечные четыре дозы с одним ΡΒ§ без добавления адъюванта. Всего проводят девять иммунизаций за семь месяцев с двухнедельным интервалом для первых трёх доз, с последующим четырёхнедельным интервалом для остальных инъекций. Группа мышей, пролеченная в течение четырёх месяцев, умерщвленная в возрасте 15 мес., получает только первые 6 иммунизаций.
B. Результаты.
- 16 007218
1. Действие АЫ1792-терапии на амилоидную нагрузку.
Результаты АЫ1792-терапии на кортикальную амилоидную нагрузку, определённые количественным анализом изображения, показаны на фиг. 7. Среднее значение кортикальной амилоидной нагрузки 0,28% в группе непролеченных ΡΌΑΡΡ-мышей 12-месячного возраста, типичная величина нагрузки бляшек у мышей в начале исследования. В возрасте 18 мес. амилоидная нагрузка увеличивается более чем в 17 раз до 4,87% у ΡΒδ-пролеченных мышей, тогда как у АЫ1792-пролеченных мышей амилоидная нагрузка значительно снижена и составляет лишь 0,01%, заметно меньше, чем у 12-месячных непролеченных и в обоих 15- и 18-месячных ΡΒδ-обработанных группах. Амилоидная нагрузка значительно снижена у АЫ1792-реципиентов как в случае 15 (96%-ное снижение; р = 0,003), так и 18 (>99% снижение; р = 0,0002) месяцев.
Обычно кортикальное амилоидное отложение у ΡΌΑΡΡ-мышей начинается во фронтальной и ретросплениальной области коркового вещества (КБС) и прогрессирует в направлении вентральнолатеральной области (ЕС). Мало амилоида или совсем его не обнаружено в ЕС 12-месячных мышей, примерный возраст, при котором начинают вводить ΑΝ1792. Через 4 месяца лечения ΑΝ1792 амилоидное отложение значительно уменьшается в К8С-области, и прогрессивное воспаление ЕС совершенно исчезает при ΑN1792-терапии. Последнее наблюдение показывает, что ΑΝ1792 полностью останавливает прогрессирование амилоида, который при естественном течении занял бы височную и брюшную (темпоральную и вентральную) области коркового вещества, а также прекращает или, возможно, ревертирует отложение в Р8С.
Глубокое воздействие АМ1792-терапии на развитие кортикальной амилоидной нагрузки у ΡΌΑΡΡмышей дополнительно демонстрируется на примере 18-месячной группы, которую лечили семь месяцев. У ΑN1792-пролеченных мышей обнаружено почти полное отсутствие кортикального амилоида при полном исчезновении диффузных бляшек, а также уменьшение плотных отложений.
2. Цитологические и морфологические измерения, обусловленные ΑN1792-терапией.
Популяция АЬ-позитивных клеток обнаружена в тех областях мозга, в которых как правило наблюдаются амилоидные отложения. Удивительно то, что в мозге нескольких ΑN1792-реципиентов обнаружено очень мало или совсем не обнаружено экстрацеллюлярных кортикальных амилоидных бляшек. Повидимому, большая часть АЬ-иммунореактивности сосредоточена в клетках с большой дольчатой или агглютинированной сомой. Фенотипически эти клетки похожи на активированные микроглию или моноциты. Они являются иммунореактивными в отношении антител, распознающих лиганды, экспрессируемые активированными моноцитами или микроглией (МНС II и СО116), и в редких случаях (случайно) ассоциируются со стенкой или полостью кровеносных сосудов. Сравнение почти примыкающих (почти сопредельных) срезов, меченых ΑΚ и МНС ΙΙ-специфических антител показывает, что сходные особенности этих клеток распознаются обоими классами антител. Детальное изучение ΑN1792-пролеченного мозга показывает, что МНС ΙΙ-позитивные клетки ограничены близостью органических остатков амилоида у этих животных. В применяемых условиях фиксации клетки не являются иммунореактивными в отношении антител, которые распознают Т-клеточные (СО3, СО3е) или В-клеточные (ί.'Ό45ΒΑ. СО45ВВ) лиганды или общий лейкоцитарный антиген (СО45), но являются реактивными в отношении антитела, распознающего лейкозиалин (СО43), который перекрёстно реагирует с моноцитами. Такие клетки не обнаружены ни у одной из ΡΒδ-пролеченных мышей.
У ΡΌΑΡΡ-мышей обнаруживается плотное амилоидное отложение во внешнем молекулярном слое зубчатой извилины гиппокампа. Отложение образует четкую полосу внутриперфорантного пути, подобласти, в которой традиционно находятся амилоидные плашки при ΑΌ. Характерное появление этих отложений у ΡΒδ-пролеченных мышей напоминает таковое, ранее характеризовавшее непролеченных ΡΌΑΡΡ-мышей. Амилоидное отложение состоит как из диффузных, так и из плотных (компактных) бляшек в виде непрерывной полосы (кромки). Напротив, эта структура в мозгу ряда ΑΝ-пролеченных мышей резко изменяется. Амилоидное отложение в гиппокампе более не содержит диффузного амилоида, а слитая (в виде полосы) структура полностью разрушается. Вместо этого имеется ряд необычных точечных структур, реактивных в отношении анти-АЬ антител, некоторые из которых, по-видимому, являются амилоидсодержащими клетками.
МНС ΙΙ-позитивные клетки часто наблюдаются вблизи от экстрацеллюлярного амилоида у ΑΝ1792пролеченных животных. Характер ассоциации АЬ-позитивных клеток с амилоидом в мозгу нескольких АШ792-пролеченных мышей очень похож. Распространение этих моноцитарных клеток ограничивается близостью амилоидного отложения и совершенно в других областях мозга, не содержащих АЬ-бляшек.
Количественный анализ изображения МНС ΙΙ и МΑС 1-меченых срезов показывает тенденцию к повышенной иммунореактивности в Р8С и гиппокампе ΑN1792-пролеченных мышей по сравнению с ΡΒδ-группой, которая становится значимой при измерении МΑС 1-реактивности в гиппокампе.
Эти результаты указывают на активное, опосредуемое клетками удаление амилоида в содержащих бляшки участках мозга.
3. Влияние ΑΝ1792 на уровень ΑΕ определение с помощью ΕΌΙδΑ.
(а). Содержание (уровни) в коре.
У непролеченных ΡΌΑΡΡ-мышей средний уровень тотального ΑЬ в коре в возрасте 12 месяцев со
- 17 007218 ставляет 1600 нг/г, который повышается до 8700 нг/г к 15 месяцам (табл. 2). В возрасте 12 месяцев эта величина составляет 22000 нг/г, увеличение более чем в 10 раз за время эксперимента. У РВ8пролеченных животных тотальный АЬ составляет 8600 нг/г в 15 месяцев и увеличивается до 19000 нг/г в 18 месяцев. Напротив, АМ1792-пролеченные животные содержат на 81% меньше тотального АЬ в 15 месяцев (1600 нг/г), чем РВ8-иммунизированная группа. Значительно меньшее (р = 0,0001) тотального АЬ (5200 нг/г) обнаружено в 18 месяцев, когда сравнивают АМ1792-и РВ8-группы (табл. 2), эта величина соответствует 72% уменьшению АЬ по сравнению с возможным уровнем (который был бы без этой терапии). Сходные результаты получены при сравнении кортикальных уровней АЬ42, а именно, что ΆΝ1792пролеченная группа содержит значительно меньше АЬ42, но в этом случае разница между АМ1792- и РВ8-группами значительна, как в 15 месяцев (р = 0,04), так и в 18 месяцев (р = 0,0001, табл. 2).
Таблица 2 Средние уровни АЬ (нг/г) в коре
Непролеченные РВ8 АМ792
Возраст Тотальный АЬ АЬ42 (и) Тотальный АЬ АЬ42 (п) Тотальный АЬ АЬ42 (п)
12 1600 1300 (10)
15 8700 8300 (10) 8600 7200 (9) 1600 / 4 V IV/ * * 1300* * *
18 22000 18500 (10) 19000 15900 (12) 5200 (9) 4000
* р = 0.0412 * р = 0.0001 (Ь). Содержание (уровни) в гиплокампе.
У непролеченных РЭАРР-мышей средний уровень тотального АЬ в гиппокампе в двенадцать месяцев составляют 15000 нг/г, в 15 месяцев увеличиваются до 51000 нг/г и затем до 81000 нг/г в 18 месяцев (табл. 3). Аналогично, у РВ8-иммунизированных мышей эти величины составляют 40000 нг/г и 65000 нг/г в 15 месяцев и в 18 месяцев соответственно. У АМ1792-иммунизированных мышей наблюдаются меньшие уровни тотального АЬ, а именно, 25000 нг/г и 51000 нг/г, соответственно, в 15 месяцев и в 18 месяцев. В группе 18-месячных АМ1792-пролеченных мышей значение значительно ниже значения в РВ8-пролеченной группе (р = 0,0105; табл. 3). Измерение АЬ42 дает подобные результаты, а именно, уровни в АМ1792-пролеченной группе значительно ниже, чем в РВ8-группе (39000 нг/г по сравнению с 57 нг/г соответственно; р = 0,0022) при оценке в 18 месяцев (табл.3).
Таблица 3
Средние уровни АЬ (нг/г) в гиппокампе
Непролеченные РВ8 ΑΝ1792
Возраст Тотальный АЬ АЬ42 (п) Тотальный АЬ АЬ42 (п) Тотальный АЬ АЬ42 (п)
12 15500 11100 (10)
15 51500 44400 (10) 40100 35700 24500 22100*
18 80800 64200 (10) (9) 65400 57100 (12) (10) * * 50900 * * 38900
(9)
р = 0.0105 р = 0.0022 (с). Содержание (уровни) в мозжечке.
У 12-месячных непролеченных РОАРР-мышей средний уровень тотального АЬ в мозжечке составляет 15 нг/г (табл. 4). В 15 месяцев этот средний уровень повышается до 28 нг/г и к 18 месяцам увеличивается до 35 нг/г. У РВ8-пролеченных мышей средние значения уровней тотального АЬ составляют 21 нг/г в 15 месяцев и 43 нг/г в 18 месяцев. Обнаружено, что у АМ1792-пролеченных животных содержание тотального АЬ в 15 месяцев составляет 25 нг/г и значительно меньше (р = 0,002) содержание тотального АЬ в 18 месяцев (25 нг/г), чем в соответствующем РВ8-группе (табл. 4).
- 18 007218
Таблица 4
Средние уровни АЬ (нг/г) в мозжечке Непролеченные РВ8 ΑΝ1792
Возраст (месяц.) Тотальный АЬ (п) Тотальный АЬ (п) Тотальный АЬ (п)
12 15.6 (10)
15 27.7 (10) 20.8 (9) 21.7 (10)
18 35.0 (10) 43.1 (12) 24.8* (9)
р = 0.0018
4. Эффект А^792-терании на уровни АРР.
Обе молекулы - АРР-α и непроцессированного АРР - содержат всю или часть последовательности и, следовательно, потенциально, на них может влиять возникновение АШ792-направленного иммунного ответа. В современных исследованиях было отмечено слабое повышение уровней АРР по мере увеличения невропатологии у РБАРР-мышей. В коре уровни либо АРР-а/ТЬ (непроцессированный), либо АРР-α практически не изменяются при лечении, за исключением того, что уровень АРР-α снижен на 19% в 18 месяцев у А^792-пролеченных по сравнению с РВ8-пролеченной группой. Значения АРР у 18месячных А^792-пролеченных мышей незначительно отличаются от значений в группах 12-месячных непролеченных и 15-месячных РВ8. Во всех случаях значения АРР остаются в интервалах значений, обычно обнаруживаемых у РБАРР-мышей.
5. Эффект АМ1792-терапии на нейродегенеративную и глиотическую патологию.
Нейритные бляшки значительно уменьшаются во фронтальной области коры головного мозга у А^792-пролеченных мышей по сравнению с РВ8-группой как в 15- (84%; р = 0,03), так и в 18-месячном (55%; р = 0,01) возрасте (фиг. 8). Средняя величина нагрузки - нейритных бляшек - увеличивается от 0,32 до 0,49% в РВ8-группе между 15 и 18 месяцами. Это противоположно значительному замедлению роста нейритных бляшек в АШ792-группе со средним значением нагрузки - нейритных бляшек - равным 0,05 и 0,22% в 15- и 18-месячных группах соответственно.
По-видимому, иммунизация ΕΝ1792 хорошо переносится, и реактивный астроцитоз также значительно уменьшается в К8С А^792-пролеченных мышей по сравнению с РВ8-группой как в возрасте 15 (56%; р = 0,011), так и в возрасте 18 (39%; р = 0,028) месяцев (фиг. 9). Средние значения (в процентах) астроцитоза в К8С-группе увеличивается между 15 и 18 месяцами от 4,26 до 5,21%. АN1792-терапия подавляет развитие астроцитоза в обеих временных точках до 1,89 и 3,2% соответсвенно. Это подтверждает, что нейрофил не нарушается в процессе клиренса.
7. Гуморальный (антительный) иммунный ответ.
Как описано выше, одиннадцатимесячные гетерозиготные РБАРР-мыши (Ν = 24) получают серию из 5 иммунизаций по 100 мкг А№792, эмульгированного с адъювантом Фрейнда, и вводимого внутрибрюшинно в 0, 2, 4, 8 и 12 недели, и шестой иммунизации одним РВ8 (без адъюванта Фрейнда) на 16 неделе. В качестве негативного контроля аналогичная группа из 24 трансгенных мышей того же возраста подвергают иммунизации РВ8, эмульгированным с теми же адъювантами и даваемым по той же схеме. У животных берут кровь на анализ через три-семь дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы. Гуморальный иммунный ответ на А№792 определяют методом ЕЫ8А. Геометрические средние титры (ОМТ) для животных, иммунизированных ΕΝ1792, равны, примерно, 1900, 7600 и 45000 после второй, третьей и последней (шестой) доз соответственно. Никакого АЬ-специфического антигена не найдено у контрольных животных после шестой иммунизации.
Примерно половину животных пролечивают ещё в течение трёх месяцев, иммунизируя их, примерно, на 20, 24 и 27 неделе. Каждую из этих доз дают в одном носителе РВ8 без адъюванта Фрейнда. Средние титры антител остаются постоянными в течение этого времени. В действительности титры антител, по-видимому, постоянны с четвёртого до восьмой пробы крови, соответствующих периоду, охватывающему с пятой до девятой инъекции.
Чтобы определить, ассоциируются ли АЬ-специфические антитела, выявляемые иммунизацией, обнаруженные в сыворотке А^792-пролеченных мышей, также с амилоидными отложениями в мозге, проверяют реакцию серии срезов А^792-и РВ8-пролеченных мышей с антителом, специфическим относительно мышиного ЕСС В противоположность РВ8-группе, АЬ-бляшки мозга животных, пролеченных ΕΝ1792, покрыты эндогенным ЕС!. Это различие двух групп наблюдается как в 15-, так и в 18месячных группах. Особенно удивительно отсутствие лечения в РВ8-группе, несмотря на наличие плотной амилоидной нагрузки у этих мышей. Эти результаты показывают, что иммунизация синтетическим АЬ-белком генерирует антитела, которые распознают и связываются ΐη у1уо с АЬ в амилоидных бляшках.
7. Опосредуемый клетками иммунный ответ.
Через 7 дней после девятой иммунизации у девяти А^792-иммунизированных и 12 РВ8иммунизированных 18-месячных РБАРР-мышей удаляют селезёнку. Спленоциты отделяют и культиви
- 19 007218 руют в течение 72 ч в присутствии АЬ40, АЬ42 или АЬ40-1 (белок с обратным порядком аминокислотных остатков). В качестве позитивного контроля служит митоген Соп А. Оптимальные ответы получены с белком >1,7 мкМ. В ответ как на белок АЬ1-40, так и на белок АЬ1-42 происходит пролиферация клеток всех девяти АЫ!792-пролеченных животных, с равными уровнями включения обоих белков (фиг. 10, верхний рисунок). Не наблюдается ответа на АЬ40-1-обратый белок. Клетки котрольных животных не отвечают ни на один из АЬ-белков (фиг. 10, нижний рисунок).
С. Выводы.
Результаты этого исследования показывают, что АЫ1792-иммунизация РБАРР-мышей с имеющимися амилоидными отложениями замедляет и предотвращает амилоидное отложение и задерживает последующие не невропатологические изменения мозга у старых РБАРР-мышей. Иммунизация с помощью ΛΝ1792 практически прекращает рост структур, которые в нормальных условиях подверглись бы амилоидозу. Следовательно, введение АЬ-пептида оказывает терапевтическое действие при лечении АО.
IV. Скрининг АЬ-фрагментов.
100 РБАРР-мышей в возрасте 9-11 месяцев иммунизируют с помощью 9 различных областей АРР и АЬ для определения, какие эпитопы передают иммунный ответ. 9 различных иммуногенов и один контрольный вводят 1.р. (интраперитонеально, внутрибрюшинно), как описано выше. Иммуногены включают четыре конъюгата человеческого АЬ-пептида 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, все связанные с антителом овцы к 1дС мыши через цистеиновую связь; АРР-полипептид аа 592-695, ассоциированный (агрегация) человеческий АЬ1-40, и ассоциированный человеческий АЬ 25-35 и ассоциированный АЬ42 грызунов. Агрегация АЬ42 и РВ8 использовались в качестве контрольных. В группу для терапии берут десять мышей. Титры контролируют как указано выше и мышей умерщвляют по окончании 4 месяцев инъецирования. Гистохимические анализы, определение АЬ-уровней и токсикологические анализы проводят после умерщвления (рок! тойет).
А. Материалы и методы.
1. Приготовление иммуногенов.
Получение связанных АЬ-пептидов: четыре конъюгата человеческого АЬ-пептида (аминокислотные остатки 1-5, 1-12, 13-28, и 33-42, каждый конъюгирован с антителом овцы к 1дС мыши) получают связыванием через синтетический цистеин, присоединенный к АЬ-пептиду с применением перекрёстно связывающего реагента сульфо-ЕМС8. Производные АЬ-пептида синтезируют с помощью следующих конечных аминокислотных последовательностей. В каждом случае местоположение цистеиновой вставки указано подчёркиванием. Производное АЬ13-28-пептида также содержит два остатка глицина, присоединенных перед цистеином на карбоксильном конце, как указано.
АЬ1-12 пептид NН2-^АЕΡΚН^86ΥЕVС СООН
АЬ1-5 пептид NН2-^АЕΡΚС СООН
АЬ33-42 пептид NН2-С-аминогептЯΗовая кислотЯ-θ^МVΟΟVVIА СООН
АЬ13-28 пептид Ас-NН-НН^Κ^VΡΡΛЕ^V68NΚ66С-С00Н
Для приготовления к реакции связывания десять мг антител овцы к 1дС мыши (1асккои 1ттииоКекеагск ЬаЬога!опек) подвергают диализу в течение ночи против 10 мМ натрийборатного буфера, рН 8,5. Антитело после диализа концентрируют до объёма 2 мл, используя пробирку Аписон Сеи1пргер. Десять мг сульфо-ЕМС8 [№(е-малеимидокупроилокси)сукцинимида] (Мо1еси1аг Заеисек Со.) растворяют в одном мл деионизированной воды. К антителу овцы к 1дС мыши при перемешивании по каплям прибавляют 40-кратный молярный избыток сульфо-ЕМС8, а затем раствор перемешивают ещё десять минут. Активированное антитело овцы против 1дС мыши очищают и осуществляют буферный обмен, пропуская через 10мл-овую колонку для гель-фильтрации (Р1егсе Ргек!о Со1ити, поставляется Р1егсе СНет1са1к). уравновешенную 0,1 М NаРО4, 5 мМ ЕБТА, рН 6.5. Фракции, содержащие антитело, идентифицируют с помощью поглощения при 280 нм, объединяют и разбавляют до концентрации примерно 1 мг/мл, используя 1,4 мг на ОБ в качестве коэффициента экстинции. 40-кратный молярный избыток АЬ-пептида растворяют в 20 мл 10 мМ NаРО4, рН 8,0, за исключением АЬ33-42-пептида, 10 мг которого сначала растворяют в 0,5 мл ДМСО, а затем разбавляют до 20 мл 10 мМ NаРО4 буфером. Каждый раствор пептида добавляют к 10 мл активированного антитела овцы к 1дС мыши и встряхивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Образующиеся конъюгаты концентрируют до конечного объёма менее 10 мл, применяя пробирку Аписон Сейпргер, а затем подвергают диализу против РВ8, чтобы провести буферный обмен и удалить свободный пептид. Конъюгаты пропускают через фильтры с размером пор 0,22 мк для стерилизации, а затем готовят аликвоты-фракции по 1 мг и хранят в замороженном виде при -20°С. Концентрации конъюгатов определяют ВСА-белковым анализом (Р1егсе С11еписа1к) с лошадиным 1дС для стандартной кривой. Конъюгация подтверждается увеличением молекулярного веса конъюгированных пептидов по сравнению с молекулярным весом активированного антитела овцы к 1дС мыши. Конъюгат АЬ1-5 с антителом овцы к 1дС мыши является пулом двух конъюгатов, остальные представляют собой единичный препарат.
2. Препарат агрегаций (ассоциированных) АЬ-пептидов.
Человеческий 1-40 (АШ528; СаНГогша Рерйбек 1ис., лот МЕ0541), человеческий 1-42 (АШ792; СаНГогша Рерйбек 1ис., лоты МЕ0339 и МЕ0439), человеческий 25-35 и 1-42 грызунов (СаНГогша Рерйбек
- 20 007218
1пс., лот МЕ0218) пептиды солюбилизируют непосредственно перед приготовлением каждого набора инъекций, используя лиофилизированные порошки, хранящиеся в сухом виде при -20°С. Для этой цели 2 мг пептида добавляют к 0,9 мл деионизированной воды и смесь встряхивают и перемешивают до получения сравнительно однородного раствора или суспензии. Из четырёх только АЮ528-пептид растворим на этой стадии. Добавляют затем аликвоту - 100 мкл 10Х РВ8 (1Х РВ8: 0,15 М №С1, 0,01 М фосфата натрия, рН 7,5) и в этот момент ΛΝ1528 начинает выпадать. Суспензию встряхивают и перемешивают снова и термостатируют в течение ночи при 37°С для использования на следующий день.
Получение рВх6-белка: плазмида экспресс, кодирующая рВх6, слитой белок, состоящий из Νконцевой лидерной последовательности полимеразы 100-аминокислотного бактериофага М82 с последующими аминокислотами 592-695 белка АРР (ЬАРР) конструируют, как описано О11ег5ЙогГ е1 а1., 1. Вю1. С’Нет. 265, 4492-4497 (1990). Плазмиду трансфицируют в Е. сой и белок экспрессирует после индукции промотора. Бактерии лизируют в 8 М мочевине и рВх6 частично очищают препаративным 8Ό8 РАСЕ. Фракции, содержащие рВх6, идентифицируют вестерн-блоттингом, используя кроличье поликлональное антитело к рВх6, объединяют, концентрируют, с применением пробирки Атюоп СепРгргер и подвергают диализу против РВ8. Чистота препарата, оцениваемая окрашиванием 8Ό8 РАСЕ с помощью Кумасси синего, составляет примерно 5-10%.
В. Результаты и обсуждение.
1. Порядок исследования.
Сто мужских и женских особей 9-11-месячных гетерозиготных трансгенных РОАРР-мышей получены из лабораторий Сйаг1е8 КАег и Тасошс. Мышей делят на десять групп для иммунизации различными участками АЬ или АРР вместе с адъювантом Фрейнда. Животных делят так, чтобы внутри группы они как можно более соответствовали друг другу по полу, возрасту, родословной и источнику. Иммуногены включают четыре АЬ-пептида, полученных из последовательности человеческого белка, 1-5, 1-12, 13-28 и 33-42, каждый в виде конъюгата с антителом овцы к 1дС мыши; четыре агрегации АЬ-пептидов, человеческого 1-40 (АМ528), человеческого 1-42 (А№792), человеческого 25-35 и 1-42 грызунов; и слитой полипептид, обозначенный рВх6, содержащий аминокислотные остатки 592-695 белка АРР. Десятую группу в качестве контрольной иммунизируют РВ8 в сочетании с адъювантом Фрейнда.
Для каждой иммунизации 100 мкг каждого АЬ-пептида в 200 мкл РВ8 или 200 мкг АРРпроизводного рВх6 в том же объёме РВ8 или один РВ8 эмульгируют в объёмном соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (СРА) с конечным объёмом 400 мкл для первой иммунизации с последующей бустер-иммунизацией тем же количеством иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (1РА) для последующих четырёх доз и РВ8 для конечной дозы. Иммунизацию осуществляют внутрибрюшинно по двухнедельному графику для первых трёх доз, затем с месячным интервалом. Пробы крови животных берут через четыре-семь дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для измерения титров антител. Животных умерщвляют примерно через неделю после конечной дозы.
2. Уровни АЬ и АРР в мозге.
После примерно четырёх месяцев иммунизации различными АЬ-пептидами или производным АРР, мозг удаляют из находящихся в физиологическом растворе животных. Одно полушарие готовят для иммуногистохимического анализа, а второе используют для количественного определения АЬ- и АРРуровней. Для измерения концентрации различных форм амилоидного пептида и амилоидного белкапредшественника полушарие рассекают и готовят гомогенаты области гиппокампа, коры и мозжечка в 5 М гуанидине. Эти гомогенаты разбавляют и уровень амилоида или АРР определяют количественно, сравнивая с серией разведений стандартного АЬ-пептида или АРР с известными концентрациями в формате ЕЫ8А.
Средняя концентрация тотального АЬ для контрольной группы, иммунизированной РВ8, в 5,8 раз выше в гиппокампе, чем в коре (в среднем 24318 нг/г в ткани гиппокампа по сравнению с 4221 нг/г в коре). Средний уровень в мозжечке в контрольной группе (23,4 нг/г ткани) примерно в 1000 раз ниже, чем в гиппокампе. Эти уровни подобны уровням для гетерозиготных РОАРР-трансгенных мышей того же возраста, о которых мы сообщали ранее Со11П5оп^ооЙ5 е1 а1., 1997, см. выше).
В коре субпопуляции из пролеченных групп средние уровни тотального АЬ и АЬ1-42 значительно отличаются от уровней контрольной группы (р<0,05), причем этим животным дают А№792, АЬ1-42 грызунов или конъюгат АЬ1-5-пептида, как показано на фиг. 11. Средние уровни тотального АЬ понижены на 75, 79 и 61% соответственно по сравнению с контрольными для этих подопытных групп. Нет заметной корреляции между титрами АЬ-специфических антител и уровнями АЬ в области коры головного мозга ни в одной из групп. В гиппокампе среднее уменьшение тотального АЬ, обусловленное А№792терапией (46%, р = 0,0543) не так велико, как в коре (75%, р = 0,0021). Однако величина уменьшения значительно больше в гиппокампе, чем в коре: общее уменьшение 11186 нг/г ткани в гиппокампе по сравнению с 3171 нг/г ткани в коре. В группах животных, получавших АЬ1-42 грызунов или АЬ1-5, средние уровни тотального АЬ понижаются на 36 и 26% соответственно. Однако если принимать во внимание малые размеры групп и то, что уровни амилоидного пептида очень сильно изменяются от животного к животному внутри обеих групп, это уменьшение является незначительным. Когда измеряют уровни АЬ1-42 в гиппокампе, ни одно индуцированное лечением снижение не достигает значимой величины.
- 21 007218
Следовательно, из-за меньшей АЬ-нагрузки в коре измерения на этом участке является более чувствительным индикатором эффекта терапии. Изменения уровней АЬ в коре, определенные методом ЕЫ8А, подобны, но не идентичны результатам иммуногистохимического анализа (см. ниже).
Тотальный АЬ измеряют также в мозжечке, обычно не пораженной при АО-патологии области. Ни одна из средних концентраций АЬ ни в одной из групп, иммунизированных различными АЬ-пептидами или АРР-производным, не отличается от концентрации в контрольной группе в этой области мозга. Этот результат подтверждает, что на непатологическом уровне АЬ не подвергается воздействию терапии.
Концентрацию АРР также определяют методом ЕЫ8А в коре и мозжечке пролеченных и контрольных мышей. Применяют два различных метода анализа АРР. Первый, называемый АРР-о/РЬ, распознает как АРР-α (α, секретируемая форма АРР, в котором происходит расщепление АЬ-последовательности), так и непроцессированные формы (РЬ) АРР, тогда как второй распознает только АРР-α. В противоположность обусловленному терапией уменьшению количества АЬ в субпопуляции испытуемых групп уровни АРР не изменяются у всех испытуемых животных по сравнению с контрольными. Эти результаты показывают, что иммунизация АЬ-пептидами не сокращает количество АРР; скорее терапевтический эффект является специфическим относительно АЬ.
В целом, уровни тотального АЬ и АЬ1-42 значительно снижаются при терапии с помощью ΛΝ1792. АЬ1-42 грызунов или конъюгата АЬ1-5. В гиппокампе уровень тотального АЬ значительно снижается только при АШ792-терапии. Никакие другие обусловленные лечением изменения уровней АЬ или АРР в гиппокампе, коре или мозжечке не являются значительными.
2. Гистохимические анализы.
Мозг субпопуляции из шести групп готовят для иммуногистохимического анализа: три группы, иммунизированные АЬ-пептидными конъюгатами АЬ1-5, АЬ1-12 и АЬ13-18; две группы, иммунизированные агрегациями непроцессированного (полной длины) АЬ А№792 и А№528, и пролеченная РВ8 контрольная группа. Результаты анализа изображения (создания образа) амилоидной нагрузки в срезах мозга животных этих групп показаны на фиг. 12. Имеется значителное уменьшение амилоидной нагрузки в области коры головного мозга у животных трёх испытуемых групп по сравнению с контрольными. Наибольшее уменьшение амилоидной нагрузки наблюдается в группе, получающей А№792, где среднее значение снизилось на 97% (р = 0,001). Значительное уменьшение наблюдается также у животных, пролеченных АМ528 (95%, р = 0,005) и конъюгатом АЬ1-5-пептида (67%, р = 0,02).
Результаты, полученные при количественном определении тотального АЬ или АЬ1-42 методом ЕЫ8А и амилоидной нагрузки методом анализа изображения, до некоторой степени различаются. Лечение с помощью А№528 оказывает значительное воздействие на уровень кортикальной амилоидной нагрузки, определенной методом количественного анализа изображения, но не на концентрацию тотального АЬ в той же области, определяемой методом ЕЫ8А. Разница между этитми двумя результатами, повидимому, связана со спецификой этих методов. Методом анализа изображения измеряют только нерастворимый АЬ, скапливающийся в виде бляшек. Напротив, методом ЕЫ8А определяют все формы АЬ как растворимые, так и нерастворимые, мономерные и ассоциированные (агрегации). В связи с тем, что, как полагают, патология заболевания обусловлена нерастворимой, связанной с бляшками формой АЬ, техника анализа изображения должна быть более чувствительной для того, чтобы обнаружить терапевтический эффект. Однако так как ЕЫ8А является более быстрым и более легким методом анализа, он полезен для целей скрининга. Более того, он может обнаружить, что обусловленное терапией уменьшение уровня АЬ больше для связанного бляшками, чем тотального АЬ.
Чтобы определить, регулируют ли АЬ-специфические антитела, выявляемые иммунизацией в испытуемых животных, с отложенным в мозгу амилоида, субпопуляция срезов испытуемых животных и контрольных мышей реагирует с антителом, специфическим к мышиному 1дС. В противоположность РВ8-группе, АЬ-содержащие бляшки покрыты эндогенным 1дС для животных, иммунизированных АЬпептидными конъюгатами АЬ1-5, АЬ1-12 и АЬ13-28; и агрегациями непроцессированного АЬ АШ792 и А№528. Мозг животных, иммунизированных другими АЬ-пептидами или АРР-пептидом рВхб, не анализировался этим методом.
3. Определение титров антител.
У мышей берут пробу крови через четыре-семь дней после каждой иммунизации, начиная со второй иммунизации, всего пять проб (раз). Титры антител измеряют как титры АЬ1-42-связывающего антитела, применяя сэндвич-ЕЫ§А с пластиковыми планшетами, покрытыми АЬ1-42. Как показано на фиг. 13, максимальные титры антител обнаружены после четвертой дозы в случае тех четырёх вакцин, которые связывают наиболее высокие титры АN1792-специфических антител: А№792 (пик СМТ: 94647), АМ528 (пик СМТ: 88231), АЬ1-42-конъюгат (пик СМТ: 47216) и АЬ1-42 грызунов (пик СМТ: 10766). Титры для этих групп несколько уменьшаются после пятой и шестой доз. В случае остальных пяти иммуногенов максимальные титры достигаются после пятой или шестой доз и величина этих титров значительно ниже величины для четырёх групп с наиболее высокими титрами: АЬ1-15-конъюгат (пик СМТ: 2356), рВх6 (пик СМТ: 1986), АЬ13-18-конъюгат (пик СМТ: 1183), АЬ33-42-конъюгат (пик СМТ: 658), АЬ25-35 (пик СМТ: 125). Также измеряют титры антител против гомологичных пептидов, применяя тот
- 22 007218 же ЕЬ18А-сэндвич формат для субпопуляции иммуногенов, при этом группы иммунизируют АЬ1-15, АЬ13-28, АЬ25-35, АЬ33-42 или АЬ1-42 грызунов. Эти титры практически такие же, как титры, найденные против АЬ1-42, за исключением иммуногена АЬ1-42 грызунов, при применении которого титры против гомологичного иммуногена, примерно, вдвое выше. Величина титра А№792-специфического антитела индивидуальных животных или средние значения испытуемых групп не коррелируются с эффективностью, измеряемой снижением уровней АЬ в коре головного мозга.
4. Лимфопролиферативный иммунный ответ.
АЬ-Зависимую лимфопролиферацию определяют, используя клетки селезёнки, собираемые примерно через неделю после конечной, шестой, иммунизации. Свежесобранные клетки, 105 на лунку, культивируют в течение 5 дней в присутствии АЬ1-40 с концентрацией 5 мкМ для стимуляции. Клетки субпопуляции семи из десяти групп также культивируют в присутствии обратного пептида, АЬ1-40. В качестве позитивного контроля дополнительные клетки культивируют с Т-клеточным митогеном, РНА и в качестве негативного контроля клетки культивируют без добавления пептида.
В ответ на РНА происходит пролиферация лимфоцитов большинства животных. Заметной реакции нет на АЬ40-1-обратный пептид. Клетки животных, иммунизированных большими по размеру ассоциированными АЬ-пептидами, АN1792, АЬ1-42 грызунов и ΛΝ1528. устойчиво пролиферируют после стимуляции АЬ1-40 с высочайшим срт (числом импульсов в минуту) у реципиентов ΆΝ1792. У одного животного в каждой группе, иммунизированной конъюгатом АЬ1-12, конъюгатом АЬ13-28 и АЬ25-35, наблюдается пролиферация в ответ на АЬ1-40. В остальных группах, получающих АЬ1-5-конъюгат, АЬ3342-конъюгат, рВх6 или РВ8, нет ни одного животного с АЬ-стимулированным иммунным ответом. Эти результаты сведены в табл. 5, см. ниже.
___ Таблица 5
Иммуноген Конъюгат АЬ-аминокислота Респондёры
АЫ-5 да 5-эпитоп 0/7
АМ-12 да 12-эпитоп 1/8
АМЗ-28 да 16-эпитоп 1/9
А&25-35 И-эпитоп 1/9
А633-42 да 10-эпитоп 0/10
А61-40 40-эпитоп 5/8
АМ-42 42-эпитоп 9/9
А&1-42 грызунов 42-эпитоп 8/8
рВхб 0/8
РВ8 0-эпитоп 0/8
Эти результаты показывают, что АМ1792 и АМ1528 стимулируют сильной Т-клеточной иммунной реакцией, наиболее вероятно, СЭ4' фенотипа. Отсутствие АЬ-специфической Т-клеточной иммунной реакции у животных, иммунизированных АЬ1-5, не является неожиданным, так как эпитопы пептидов, распознаваемые СЭ4 Т-клетками, имеют обычно протяжённость около 15 аминокислот, хотя более короткие пептиды могут иногда работать с меньшей эффективностью. То есть большинство эпитопов хелперных Т-клеток четырёх пептидных конъюгатов, по-видимому, находящихся в 1дС партнёре конъюгата, расположены не в области АЬ. Эта гипотеза подтверждается очень малым числом случаев пролиферативного ответва у животных в каждой из этих подопытных групп. Так как конъюгат АЬ1-5 действительно значительно снижает уровень АЬ мозга при явном отсутствии АЬ-специфических Т-клеток, то, повидимому, ключевым действующим началом иммунного ответа, индуцированного иммунизацией этим пептидом, является антитело.
Отсутствие Т-клеточной иммунной реакции и слабый гуморальный иммунный ответ на введение слитого пептида рВх6, охватывающий аминокислоты 592-695 АРР, включая все АЬ-остатки, возможно, вызван слабой иммунологичностью этого конкретного препарата. Слабая иммуногенность агрегации АЬ25-35, по-видимому, вызвана тем, что пептид слишком мал, чтобы содержать хороший Т-клеточных эпитоп, который бы помог индуцировать гуморальный иммунный ответ. Если этот пептид был бы конъюгирован с белком-носителем, он, возможно, был бы более иммуногенным.
V. Препарат поликлональных антител для пассивного иммунитета.
нетрансгенных мышей иммунизируют с помощью АЬ или другого иммуногена, при необходимости, плюс адъювант и умерщвляют в 4-5 месяцев. Кровь иммунизированных животных собирают. При необходимости, 1дС отделяют от других компонентов крови. Антитело, специфическое к иммуногену, можно частично очистить аффинной хроматографией. В среднем на одну мышь получают около 0,5-1 мг иммуноген-специфического антитела, что в общем дает 5-10 мг.
VI. Пассивная иммунизация антителами к АЬ.
Группы из 7-9-месячных РЭАРР-мышей инъецируют 0,5 мг поликлональных антител к АЬ или спе
- 23 007218 цифических моноклональных антител к АЬ в РВ8, как показано ниже. Все препараты антител очищают так, чтобы у них были низкие уровни эндотоксинов. Можно приготовить моноклональные антитела против фрагмента инъекцией мыши фрагмента или более протяжённой формы АЬ, получением гибридом и скринингом гибридом на антитело, связывающееся с заданным фрагментом АЬ без связывания с другими неперекрывающимися фрагментами АЬ.
____ Таблица 6
Антитело Эпитоп
2НЗ АЬ 1-12
10Ό5 АЬ 1-12
266 АЬ 13-28
21Р12 АЬ 33-42
Поликлональное антитело мыши к человеческому А&42 Антитело к агрегации АЬ42
Мышам вводят инъекции 1.р. (в.б. - внутрибрюшинно), при необходимости, в течение 4 месяцев, чтобы поддержать концентрацию циркулирующего антитела, измеряемую титром ЕЬ18А, более высоким, чем 1/1000, найденный методом ЕЫ8А к АЬ42 или другому иммуногену. Титры контролируют, как указано выше, и мышей умерщвляют по окончании 4 месяцев инъекций. Анализы: гистохимический, АЬуровней и токсикологический - проводят после вскрытия. В группу входит десять мышей.
VII. Сравнение различных адъювантов.
В этих примерах сравнивают СРА (полный адъювант Фрейнда), квасцы, водомасляную эмульсию и МРЬ (МФЛ) по способности стимулировать иммунный ответ.
А. Материалы и методы.
1. Порядок исследования.
Сто самок шестимесячных морских свинок линии Хартлин (НагЙеу), полученных от Е1т Н111, делят на десять групп для иммунизации ΛΝ1792 или его пальмитоильным производным в сочетании с различными адъювантами. Семи группам делают инъекции АМ1792 (33 мкг, если не уакзано иначе) в сочетании с а) РВ8 (ЗФР), Ь) адъювантом Фрейнда, с) МРЬ (МФЛ), б) скваленом, е) МРЬ/сквален, ί) малой дозой квасцов или д) высокой дозой квасцов (300 мкг АМ1792). Двум группам вводят инъекции пальмитоильного производного АМ1792 (33 мкг) в сочетании с а) РВ8 или Ь) скваленом. Последней, десятой группе дают только РВ8 без антигена или дополнительного адъюванта. Для группы, получающей адъювант Фрейнда, первую дозу эмульгируют с СРА (полный адъювант Фрейнда), а остальные четыре дозы - с 1РА (неполный адъювант Фрейнда). Доза вводимого антигена составляет 33 мкг для всех групп, кроме группы, получающей высокую дозу квасцов, которой дают 300 мкг АМ1792. Инъекции вводят внутрибрюшинно в случае СРА/1РА и внутримышечно в четырёхглавную мышцу задней конечности или же в правый или левый бок для всех других групп. Первые три дозы дают по двухнедельному графику, а затем две дозы с месячным интервалом. Пробы крови берут через шесть-семь дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для определения титров антител.
2. Получение иммуногенов.
мг АЬ42 (СаНГогша Рерйбе, лот МЕ0339) добавляют к 0,9 мл деионизированной воды и смесь встряхивают и перемешивают для получения сравнительно однородной суспензии. Добавляют 100 мкл аликвоту 10Х РВ8 (1Х РВ8, 0,15 М КаС1, 0,01 М фосфата натрия, рН 7,5). Суспензию снова встряхивают и перемешивают и термостатируют в течение ночи при 37°С с целью использования на следующий день. Неиспользованный АЬ1-42 хранят с осушителем в виде лиофилизированного порошка при -20°С.
Пальмитоильное производное АМ1792 получают присоединением пальмитинового ангидрида, растворенного в диметилформамиде, к концевой аминогруппе АМ1792 и выделением получающегося пептида из смолы обработкой фтористоводородной кислотой.
Чтобы приготовить дозы вакцины с полным адъювантом Фрейнда (СРА) (группа 2), 33 мкг АМ1792 в 200 мкл РВ8 эмульгируют в соотношении 1:1 (по объему) с СРА с конечным объемом 400 мкл для первой иммунизации. Для последующих иммунизаций антиген аналогично эмульгируют с неполным адъювантом Фрейнда (1РА).
Для приготовления доз вакцины с МРЬ (МФЛ) для групп 5 и 8, лиофилизированный порошок (К1Ь1 1ттипоСЬет КезеагсЬ, 1пс., НатШоп, МТ) добавляют к 0,2% водному триэтиламину до конечной концентрации 1 мг/мл и встряхивают при перемешивании. Смесь нагревают до 65-70°С в течение 30 с до получения слегка мутной однородной суспензии из мицелл. Раствор готовят заново перед каждой серией инъекций. Для каждой инъекции в группе 5 33 мкг АМ1792 в 16,5 мкл РВ8, 50 мкг МРЬ (50 мкл) и 162 мкл РВ8 смешивают в пробирке из боросиликатного стекла непосредственно перед употреблением.
Для приготовления доз вакцины с низким содержанием водомасляной эмульсии АМ1792 в РВ8 добавляют к 5% сквалена, 0,5% Тшееп 80, 0,5% 8рап 85 в РВ8 так, чтобы достичь конечной концентрации однократной дозы 33 мкг АМ1792 в 250 мкл (группа 6). Смесь эмульгируют, пропуская через портатив
- 24 007218 ное двухкамерное устройство 15-20 раз до тех пор, пока капельки эмульсии не станут примерно равными 1,0 мкм, диаметру сфер стандартного латекса, если рассматривать их под микроскопом. Образующаяся суспензия является опалесцирующей, молочно-белой. Эмульсию готовят непосредственно перед каждой серией инъекций. Для группы 8 добавляют МРЬ в 0,2% триэтиламине с концентрацией 50 мкг на дозу к сквалену и смеси детергентов для эмульгирования, как описано выше. Для пальмитоильного производного (группа 7) к сквалену добавляют 33 мкг на дозу пальмитоил-ХН-АЬ1-42 и перемешивают при встряхивании. Затем добавляют при перемешивании Пуееп 80 и 8рап 85. Эту смесь добавляют к ΡΒ8 до достижения конечной концентрации 5% сквалена, 0,5% Пуееп 80, 0,5% 8рап 85 и смесь эмульгируют, как описано выше.
Чтобы приготовить дозы вакцины с квасцами (группы 9 и 10), ΑΝ1792 в ΡΒ8 добавляют к ΑШуά^οдеί (гель гидроокиси алюминия, Лсси^а!е. Аез!Ьигу, ΝΥ) до достижения концентрации 33 мкг (низкая доза, группа 9) или 300 мкг (высокая доза, группа 10) ΑΝ1792 на 5 мг квасцов в конечном объеме дозы 250 мкл. Суспензию осторожно перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре.
3. Измерение титров антител.
У морских свинок берут пробу крови через шесть-семь дней после иммунизации, начиная со второй иммунизации, всего четыре раза. Титры антител к АЬ42 измеряют методом ΕΗ8Α, как описано в Общих материалах и Методах.
4. Подготовка ткани.
Через примерно 14 недель всем морским свинкам дают СО2. Цереброспинальную жидкость собирают и мозг удаляют и три участка мозга (гиппокамп, кору и мозжечок) разделяют и используют для измерения концентрации тотального АЬ-белка методом ΕΜ8Α.
В. Результаты.
1. Гуморальный (антительный) иммунный ответ.
Эффективность различных адъювантов, измеряемая как гуморальный иммунный ответ на иммунизацию ΑΝ1792, находится в широком интервале. Как показано на фиг. 14, когда ΑΝ1792 вводится в ΡΒ8, никаких антител не обнаружено после двух или трёх иммунизаций и незначительный иммунный ответ наблюдается после четвертой и пятой доз со средними геометрическими титров (СМ^ только около 45. Водомасляная (м/в) эмульсия приводит к умеренным значениям титров после третьей дозы (СΜΤ 255), которые сохраняются после четвертой дозы (СΜΤ 301) и падают с конечной дозой (СΜΤ 54). Наблюдается четкий эффект дозы антигена, т.к. ΑΝ1792, связанный с квасцами с концентрацией 300 мкг, является более иммуногенным, чем при 33 мкг, во всех временных точках. При максимальном значении иммунного ответа (пик) разница между двумя дозами составляет 43% при значениях СΜΤ примерно 1940 (33 мкг) и 3400 (300 мкг). Гуморальный иммунный ответ на 33 мкг ΑΝ1792 плюс МРЬ очень похож на ответ, вызываемый почти десятикратной дозой антигена (300 мкг), связанного с квасцами. Добавление МРЬ к м/в эмульсии снижает иммуногенность вакцины относительно иммуногенности с МРЬ в качестве единственного адъюванта на 75%. Пальмитоильное производное ΑΝ1792 является полностью неиммуногенным при введении в ΡΒ8 и дает умеренные титры в м/в эмульсии с СΜΤ 340 и 105 для третьей и четвертой проб крови. Наивысшие титры антител достигнуты с адъювантом Фрейнда с пиком СΜΤ примерно 87000, величина почти в 30 раз большая, чем СΜΤ следующих двух наиболее иммуногенных вакцин, с МРЬ и с высокой дозой ΑN1792/квасцы.
Самыми многообещающими адъювантами в этом исследовании являются МРЬ и квасцы. Из этих двух МРЬ, по-видимому, является предпочтительным, потому что для того, чтобы вызвать такой же гуморальный иммунный ответ, как и в случае квасцов, требуется в 10 раз меньшая доза антигена. Иммунный ответ увеличивается при повышении дозы антигена и/или адъюванта и при оптимизации схемы иммунизации. М/в эмульсия является очень слабым адъювантом для ΑΝ1792 и добавление м/в эмульсии к адъюванту МРЬ снижает свойственную самому МРЬ адъювантную активность.
2. Уровни ΑЬ в головном мозге.
Примерно через 14 недель морских свинок усыпляют, цереброспинальную жидкость (С8Е) отбирают и мозг удаляют из животных субпопуляции групп, иммунизированных адъювантом Фрейнда (группа 2), МРЬ (группа 5), квасцами с высокой дозой, 300 мкг, ΑΝ1792 (группа 10) и иммунизированной ΡΒ8 контрольной группы (группа 3). Чтобы определить уровень АЬ-пептида одно полушарие мозга отсекают и готовят гомогенаты гиппокампа, кортикального и мозжечкового участков мозга в 5 М гуанидине. Эти гомогенаты разводят и количественно определяют сравнением с серией разведений стандартного АЬбелка известной концентрации в формате ΕΜ8Α. Уровни ΑЬ-белка в гиппокампе, коре и мозжечке очень похожи во всех группах, несмотря на очень широкий интервал гуморального иммунного ответа на Αό, выявляемого этими вакцинами. Средние АЬ-уровни, примерно, 25 нг/г ткани, определяют в гиппокампе, 21 нг/г в коре и 12 нг/г в мозжечке. Следовательно, присутствие циркулирующего антитела к ΑЬ с высоким титром в течение почти трёх месяцев у некоторых из этих животных не изменяет уровней тотального ΑЬ в головном мозге. Уровни ΑЬ в С8Е также совершенно аналогичны в группах. Отсутствие значительного влияния ΑN1792-иммунизации на эндогенный ΑЬ указывает, что иммунный ответ сосредоточен на патологических образованиях ΑΕ.
VIII. Иммунный ответ на различные адъюванты у мышей.
- 25 007218
Для этого исследования берутся самки 8^188 АеЬз1ег мышей в возрасте шести недель. по 10-13 животных в группе. Иммунизацию проводят на 0. 14. 28. 60. 90 дни и вводят 20 подкожных инъекций. объём дозы составляет 200 мкл. Для всех рецептур в качестве буфера берут РВ8. Через семь дней после каждой иммунизации. начиная со второй дозы. у животных отбирают пробы крови для определения титров антител методом ЕЬ18А. Схема лечения для каждой группы сведена в табл. 7.
Таблица 7
Экспериментальная схема бетаблок-исследования 010
Группа ыа Адъювант^ Доза Антиген Доза (мкг)
1 10 МРЬ 12.5 мкг ΑΝ1792 33
2 10 МРЬ 25 мкг ΑΝ1792 33
3 10 МРЬ 50 мкг ΑΝ1792 33
4 10 МРЬ 125 мкг ΑΝ1792 33
5 10 МРЬ 50 мкг ΑΝ1792 150
6 10 МРЬ 50 мкг ΑΝ1792 33
7 10 РВ8 ΑΝ1792 33
8 10 РВ8 нет
9 10 Сквален эмульгированный 5% ΑΝ1792 33
10 10 Сквален в смеси 5% ΑΝ1792 33
И 10 Квасцы 2 мг ΑΝ1792 33
12 13 МРЬ + квасцы 50 мкг/2 мкг ΑΝ1792 33
13 10 0821 5 мкг ΑΝ1792 33
14 10 0821 10 мкг ΑΝ1792 33
15 10 0321 25 мкг ΑΝ1792 33
16 13 0521 25 мкг ΑΝ1792 150
17 13 0521 25 мкг ΑΝ1792 33
18 13 0821 + МРЬ 25 мкг/50 мкг ΑΝ1792 33
19 13 0821 + квасцы 25 мкг/2 мкг ΑΝ1792 33
Примечания:
а Количество мышей в каждой группе в начале исследования.
Ь Указаны адъюванты. Буфером для всех этих рецептур является РВ8. В группе 8 нет адъюванта и нет антигена.
ЕЬ18А-титры антител против АЬ42 в каждой группе показаны ниже в табл. 8.
Таблица 8
Среднее геометрическое титров антител Неделя взятия пробы крови
Испытуемая группа 2.9 5.0 8.7 12.9 16.7
1 248 1797 2577 6180 4177
2 598 3114 3984 5287 6878
3 1372 5000 7159 12333 12781
4 1278 20791 14368 20097 25631
5 3288 26242 13229 9315 23742
6 61 2536 2301 1442 4504
7 37 395 484 972 2149
8 25 25 25 25 25
9 25 183 744 952 1823
10 25 89 311 513 817
И 29 708 2618 2165 3666
12 198 1458 1079 612 797
13 38 433 566 1080 626
14 104 541 3247 1609 838
15 212 2630 2472 1224 1496
16 183 2616 6680 2085 1631
17 28 201 375 222 1540
18 31699 15544 23095 6412 9059
19 63 243 554 299 441
- 26 007218
Таблица показывает, что наиболее высокие титры получены для групп 4, 5 и 18, в которых адъювантами являются 125 мкг МРЬ, 50 мкг МРЬ и 0821 плюс МРЬ.
IX. Терапевтическая эффективность различных адъювантов.
Изучение терапевтической эффективности проводят на РЭАРР трансгенных мышах с набором адъювантов, пригодных к применению на людях, с целью определения их способности потенциировать иммунный ответ на АЬ и стимулировать иммунно-опосредуемый клиренс амилоидных отложений мозга.
Сто восемьдесят самцов и самок 7,5-8,5-месячных гетерозиготных РОАРР-трансгенных мышей получают из лабораторий СНаг1с8 ΚίνβΓ. Мышей делят на девять групп по 15-25 животных в группе, которых иммунизируют АШ792 или АЮ528 в сочетании с различными адъювантами. Животных распределяют в максимально близком соответствии с полом, возрастом, происхождением. Адъюванты включают квасцы, МРЬ и 0821, каждый в сочетании с обоими антигенами, и адъювант Фрейнда (ЕА) в сочетании только с АЮ792. Дополнительную группу иммунизируют АМ792 в рецептуре с РВ8-буфером плюс консервант тимерозаль (11шпего5а1) без адъюванта. Девятую группу иммунизируют одним РВ8 в качестве негативного контроля.
Получение агрегации АЬ-пептидов: человеческий АЬ1-40 (АМ528; СаЕГогша РерЕбек Шс., №ра, СА; лот МЕ0541) и человеческий АЬ1-42 (АМ792; СаЕГогша РерЕбек Ею., лот МЕ0439) пептиды солюбилизируют непосредственно перед приготовлением набора (серии) инъекций лиофилизированных порошков, которые хранятся в сухом виде при -20°С. Для этой цели два мг пептида добавляют к 0,9 мл деионизированной воды и смесь встряхивают и перемешивают для получения относительно однородного раствора или суспензии. АЮ528 растворяется на этой стадии в отличие от АЮ792. Затем добавляют 100 мкл аликвоту 10Х РВ8 (1Х РВ8, 0,15 М №С1, 0,01 М фосфата натрия, рН 7,5); при этом АМ528 начинает выпадать.
Суспензии снова перемешивают и встряхивают и термостатируют в течение ночи при 37°С, чтобы использовать на следующий день.
Для приготовления доз вакцины с квасцами (группы 1 и 5) АЬ-пептид в РВ8 добавляют к АШубгоде1 (двухпроцентный водный гель гидроокиси алюминия, 8агдеап1, Шс., СЕйоп, ΝΥ) до получения концентрации 100 мкг АЬ-пептида на 1 мг квасцов. 10Х РВ8 добавляют к объему конечной дозы 200 мкл в 1Х РВ8. Затем суспензию осторожно перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре перед инъекцией.
Для приготовления доз вакцины с МРЬ (группы 2 и 6) лиофилизированный порошок (КгЬ1 [штипоСНет КекеагсН, Мс., НатШоп, МТ; лот 67039-ЕО896В) добавляют к 0,2% водному триэтиламину до конечной концентрации 1 мг/мл и перемешивают при встряхивании. Смесь нагревают до 65-70°С в течение 30 с до получения слегка мутной однородной суспензии из мицелл. Раствор хранят при 4°С. Для каждой серии инъекций 100 мкг пептида на дозу в 50 мкл РВ8, 50 мкл МРЬ на дозу (50 мкл) и 100 мкл РВ8 на дозу смешивают в пробирке из боросиликатного стекла непосредственно перед употреблением.
Для приготовления доз вакцины с 0821 (группы 3 и 7) лиофилизированный порошок (Адш1а, ЕгаттдЕат, МА; лот А7018К) добавляют к РВ8, рН 6,6-6,7 до конечной концентрации 1 мг/мл и перемешивают при встряхивании. Раствор хранят при -20°С. Для каждой серии инъекций 100 мкг пептида на дозу в 50 мкл РВ8, 25 мкл Р821 на дозу в 25 мкл РВ8 и 125 мкл РВ8 на дозу смешивают в пробирке из боросиликатного стекла непосредственно перед употреблением.
Для приготовления доз вакцины с адъювантом Фрейнда (группа 4), 100 мкг АЮ792 в 200 мкл РВ8 эмульгируют в объемном соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (СЕ А) с конечным объемом 400 мкл для первой иммунизации. Для последующих иммунизаций антиген аналогично эмульгируют с неполным адъювантом Фрейнда (ГЕА). Для вакцин, содержащих адъюванты: квасцы, МРЬ или 0821, 100 мкг на дозу АЮ792 или АЮ528 объединяют с квасцами (1 мг на дозу) или МРЬ (50 мкг на дозу) или 0821 (25 мкг на дозу) с конечным объемом 200 мкл РВ8 и вводят с помощью подкожной иммунизации в спину между лопатками. Для группы, получающей ЕА, 100 мкг АЮ792 эмульгируют в объемном соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (СЕА) с конечным объемом 400 мкл и вводят внутрибрюшинно для первой иммунизации, с последующим повторным (бустер) введением того же количества иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (ГЕА) в последующих пяти дозах. Для группы, получающей АЮ792 без адъюванта, 10 мкг АЮ792 объединяют с 5 мкг тимерозаля в конечном объеме 50 мкл РВ8 и вводят подкожно. Девятая, контрольная группа получает только 200 мкл РВ8, вводимого подкожно. Иммунизацию проводят по двухнедельной схеме для первых трёх доз, затем по месячной схеме в дни 0, 16, 28, 56, 85 и 112. У животных берут пробу крови на шестой-седьмой день после каждой иммунизации, начиная со второй дозы для измерения титров антител. Животных умерщвляют, примерно, через неделю после конечной дозы. Результаты определяют методом ЕЫ8А-анализа уровней АЬ и АРР в мозге и с помощью иммуногистохимической оценки присутствия амилоидных бляшек на участках мозга. Кроме того, определяют титры АЬ-специфических антител, АЬ-зависимые пролиферативный ответ и реакцию цитокинов.
В табл. 9 показано, что самые высокие титры антител на АЬ1-42 выявляются с ЕА и А№792, титры, достигающие пика после четвертой иммунизации (пик СМТ: 75386), а затем снижается на 59% после последней, шестой иммунизации. Максимальное значение титра, получаемое с МРЬ с А№792, на 62%
- 27 007218 ниже, чем значение, получаемое с БА (пик ΘΜΤ: 28867) и также достигается на ранней стадии схемы иммунизации, после 3 доз, с последующим понижением до 28% от максимального значения после шестой иммунизации. Средние значения максимальных титров с ^821 в сочетании с АМ792 (ΘΜΤ: 1511) примерно в 5 раз ниже, чем полученные с МРБ. Кроме того, кинетика иммунного ответа медленнее, так как требуется дополнительная иммунизация для достижения максимального ответа. Титры, получающиеся под действием связанного с квасцами А№792, в самой малой степени превышают титры, полученные с ^821, и кинетика иммунного ответа имеет более высокую скорость. Для А№792, доставляемого в РВ8 с тимерозалем, частота и величина (размер) титров едва ли больше, чем таковые для одного РВ8. Максимальные титры, получаемые с МРБ и АМ792 (пик ΘΜΤ 3099), примерно, в 9 раз ниже, чем титры с АШ792. Связанный с квасцами АШ528 является очень слабо иммуногенным с низкими титрами антител, вырабатываемых только у некоторых животных. У контрольных животных, иммунизированных только РВ8, не наблюдается никакого иммунного ответа.
Таблица 9
Среднее геометрическое титров антитела Неделя взятия пробы крови
Терапия 3.3 5.0 9.0 13.0 17.0
Квасцы/ 102 1081 2366 1083 572
ΑΝ1792 (12/21)Ь (17/20) (21/21) (19/21) (18/21)
МРБ/ 6241 28867 11242 5665 8204
ΑΝ1792 (21/21) (21/21) (21/21) (20/20) (20/20)
0821/ 30 227 327 1511 1188
ΑΝ1792 (1/20) (10/19) (10/19) (17/18) (14/18)
СРА/ 10076 61279 75386 41628 30574
ΑΝ1792 (15/15) (15/15) (15/15) (15/15) (15/15)
Квасцы/ 25 33 39 37 31
ΑΝ1528 (0/21) (1/21) (3/20) (1/20) (2/20)
МРБ/ 184 2591 1653 1156 3099
ΑΝ1528 (15/21) (20/21) (21/21) (20/20) (20/20)
0521/ 29 221 51 820 2994
ΑΝ1528 ’ (1/22) (13/22) (4/22) (20/22) (21/22)
РВ8 плюс 25 33 39 37 47
тимерозаль (0/16) (2/16) (4/16) (3/16) (4/16)
РВ8 25 25 25 25 25
(0/16) (0/16) (0/15) (0/12) (0/16)
Примечания:
а Среднее геометрическое титров антител, измеренное против АЬ1-42 Ь Число респодёров на группу
Результаты введения АШ792 или АШ528 с различными адъювантами или тимерозалем на кортикальную амилоидную нагрузку у 12-месячных мышей, определяемые методом ЕБ18А, даны на фиг. 15. У РВ8-контрольных РЭАРР мышей средний уровень тотального АЬ в коре в 12 месяцев составляет 1817 нг/г. Заметно меньшие уровни АЬ наблюдаются у мышей, пролеченных АШ792 плюс СБА/1БА, АМ792 плюс МРБ и ^821 плюс АШ792. Уменьшение достигает статистического значения (р < 0,05) только для АШ792 плюс СБА/1БА. Однако, как показано в примерах I и III, влияние иммунизации на снижение уровней АЬ становится существенно больше у 15- и 18-месячных мышей. То есть ожидается, что, по меньшей мере, композиции АШ792 плюс квасцы, АШ792 плюс МРБ и АШ792 плюс ^821 достигнут статистического значения у более взрослых мышей. Напротив, АШ792 плюс консервант тимерозаль показывают средний уровень АЬ примерно такой же, как у мышей, получавших РВ8. Сходные результаты получены при сравнении кортикальных уровней АЬ42. Средний уровень АЬ42 у РВ8-контрольных мышей составляет 1624 нг/г. Заметно пониженные уровни - 403, 1149, 620 и 714 - получены у мышей, пролеченных АМ792 плюс СБА/ША, АМ792 плюс квасцы, АМ792 плюс МРБ и АМ792 плюс ^821 соответственно при уменьшении, достигающем статистического значения (р = 0,05) для группы, получавшей АШ792 СБАЛБА. Средний уровень у мышей, получавших АШ792 - тимерозаль, составляет 1619 нг/г АЬ42.
X. Анализ на токсичность.
Ткани собирают для гистопатологического исследования в конце исследования, описанного в примерах 2, 3 и 7. Кроме того, проводят гематологические и клинические химические анализы конечных образцов крови из примеров 3 и 7. Большую часть основных органов удаляют, включая мозг, лёгкие, лимфоидную ткань, желудочно-кишечный тракт, печень, почки, надпочечники и гонады (половые железы). Хотя у подопытных животных наблюдаются случайные поражения, не наблюдается явных различий ни в пораженных тканях, ни в тяжести поражения между АШ792-пролеченными и непролеченными животными. Нет каких-либо особых гистопатологических поражений, замеченных у АШ792
- 28 007218 иммунизированных животных по сравнению с РВ8-пролеченными или непролеченными животными. Нет также различий клинических химических показателей между группами животных с адъювантами и с РВ8 в примере 7. Хотя наблюдается значительное повышение некоторых гематологических параметров у животных, получавших АЮ792 и адъювант Фрейнда в примере 7 по сравнению с получавшими РВ8 животными, такого рода эффекты ожидают от введения адъюванта Фрейнда и сопутствующего перитонита и не это указывает на какие-либо побочные эффекты АЮ792-терапии. Не являясь частью токсикологических анализов, тем не менее патология мозга мышей РЭАРР серьёзно изучается как часть показателей эффективности. Не было отмечено никаких признаков вредного влияния лечения на морфологию мозга ни в одном из исследований. Эти результаты показывают, что введение АЮ792 хорошо переносится и, по меньшей мере, практически свободно от побочных эффектов.
XI. Профилактика и терапия людей.
Для определения безопасности проводят стадию Ι опыта с введением однократной дозы. Различным больным вводят терапевтический агент с увеличением дозы, начиная, примерно, от 0,01 уровня предполагаемой эффективности и увеличивая с коэффициентом 3 до достижения 10-кратной эффективности на мышах.
Стадию ΙΙ опыта проводят, чтобы определить терапевтическую эффективность. Выбирают больных с болезнью Альцгеймера - от ранней до средней - определение, употребляемое по критериям Ассоциации Болезнь Альцгеймера и родственные заболевания (АЭКОА) для возможных АО. Соответствующих больных оценивают в интервале 12-26 по шкале умственной неполноценности - Мш1-Меп1а1 8!а!е Ехат (ММ8Е). Другой критерий отбора это - больные, которые перенесли продолжительное исследование и не имеют осложняющих проблем, таких как применение существующих лекарственных препаратов, которые могут нанести вред. Оценки базовой линии функции больных делают, используя классические психометрические определения, такие, например, как ММ8Е и АЭА8, которые представляют собой полную (исчерпывающую) шкалу оценки больных со статусом Болезнь Альцгеймера и её специфическими свойствами. Эти психометрические тесты обеспечивают измерение прогрессирования болезни Альцгеймера. Для мониторинга лечения можно также применять соответствующие качественные методы оценки. Прогрессирование заболевания также можно контролировать методом ЯМР. Показатели крови больных можно также контролировать, включая анализы иммуноген-специфических антител и Т-клеточный иммунный ответ.
После определения базовой линии больные начинают принимать лечение. Их произвольно делят и лечат либо терапевтическим агентом, либо плацебо вслепую. Больных проверяют по меньшей мере каждые шесть месяцев. Эффективность определяется заметным уменьшением (замедлением) прогрессирования пролеченной группы по сравнению с плацебогруппой.
Вторую фазу ΙΙ испытания осуществляют, чтобы оценить переход больных от болезни, не являющихся болезнью Альцгеймера - ранней потери памяти, иногда называемой связанным с возрастом ослаблением памяти (ААМ1) - вероятной болезни Альцгеймера, как она определяется критериями АЭКЭА. Больных с высокой степенью риска превращения в больных болезнью Альцгеймера выбирают из неклинической популяции скринингом референтной группы (популяции) на ранние признаки потери памяти или других затруднений, связанных с пре-Альцгеймеровой симптоматологией, семейным анамнезом болезни Альцгеймера, генетическими факторами риска, возрастом, полом и другими особенностями, по которым можно предвидеть высокую степень риска заболевания болезнью Альцгеймера. Суммируют основные оценки в соответствующих измерениях (метриках) включая ММ8Е и АЭА8, вместе с другими измерениями (метриками), позволяющие оценить более нормальную популяцию. Эти популяции больных делят на соответствующие группы для сравнения плацебо с альтернативой - агентом. Эти популяции больных с интервалами, примерно, шесть месяцев, и конечный результат для каждого больного - это перейдет ли он или она в состояние вероятной болезни Альцгеймера по шкале АЭРЭА в конце наблюдения.
XII. Общие материалы и методы.
1. Определение титров антител.
У мышей берут пробу крови, делая небольшой надрез хвостовой вены и отбирая около 200 мкл крови в пробирку для микроцентрифуги. У морских свинок пробу крови берут, сначала выбривая поверхность заднего скакательного сустава, а затем, используя иглу Ν 18 для вскрытия (разреза) плюсневой вены и отбирая кровь в микроцентрифужные пробирки. Процесс свертывания крови проводят в течение одного часа при комнатной температуре (ΡΤ). её перемешивают и встряхивают, затем центрифугируют при 14000 об/мин в течение 10 мин, чтобы отделить коагулянт от сыворотки. Сыворотку затем переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и хранят при 4°С до титрования. Титры антител определяют методом ЕЫ8А. 96-луночные микропланшеты (планшеты СоЧаг Е1А) покрывают 100 мкл раствора, содержащего либо 10 мкг/мл АЬ42 или 8АРР, либо другие антигены, как указано в каждом отдельном сообщении, в буфере для сенсибилизации планшетов (0,1 М фосфата натрия, рН 8,5, 0,1% азида натрия) и выдерживают в течение ночти при ΚΤ.
После аспирации лунок в них добавляют сыворотку, начиная с разбавления 1/100 в разбавителе образцов (0,014 М фосфата натрия, рН 7,4, 0,15 М №С1, 0,6% бычьего сывороточного альбумина, 0,05%
- 29 007218 тимерозаля). Непосредственно в планшетах проводят семь серийных (в три раза) разведений образцов до достижения конечного разведения 1/218700. Разведения термостатируют в сенсибилизированных лунках планшетов в течение одного часа при КТ. Затем планшеты отмывают четыре раза ΡΒ8, содержащим 0,05% Тетееп 20. Второе антитело, козье антитело к мышиному ^, конъюгированное с пероксидазой хрена (получено от БоеНппдег Маппйет), добавляют в лунки в виде 100 мкл разведения 1/3000 в разбавителе образцов и термостатируют один час при КТ. Планшеты снова отмывают четыре раза в ΡΒ8, Тетееп 20. Чтобы получить хромоген, в каждую лунку добавляют 100 мкл медленного (81оте) ТМБ (3,3',5,5'тетраметилбензидин, получен от Г1егсе СйетюаН) и термостатируют в течение 15 мин при КТ. Реакцию прекращают, добавляя 25 мкл 2 М Н2§04.
Интенсивность цвета читают затем на молекулярных устройствах Утах при (450-650 нм).
Титры определяют как обратную величину разведения сыворотки, дающей половину максимальной 0Ό (оптической плотности). Максимальную 0Ό обычно берут из начального разведения 1/100, за исключением случаев с очень высокими титрами, и тогда требуется более высокое начальное разведение для установления максимальной 0Ό. Если точка 50% попадает между двумя разведениями, для расчёта конечного титра делают линейную экстраполяцию. Чтобы рассчитать среднее геометрическое титров антитела, произвольно берут значение титров менее 100 равным 25.
2. Анализ пролиферации лимфоцитов.
Мышей усыпляют изофлюраном. Селезенки удаляют и дважды промывают 5 мл ΡΒ§, содержащего 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (ΡΒ8-ΕΒ8), и затем гомогенизируют в устройстве 50 мк Сеп!псоп (Оако А/8, Эептагк) в 1,5 мл ΡΒ8-ΕΒ8 в течение 10 с при 100 об./мин в МеШтасЫпе (Эако) с последующим фильтрованием через нейлоновое сито с размером пор 100 мк. Спленоциты отмывают один раз 15-мл ΡΒ8-ΕΒ8, затем высаживают при центрифугировании при 200 об./мин в течение 5 мин. Эритроциты лизируют, повторно суспендируя осадок в 5 мл буфера, содержащего 0,15 М ΝΗ4Ο, 1 М КНС03, 0,1 М NаЕ^ТΑ, рН 7,4 в течение 5 мин при КТ. Затем лейкоциты отмывают, как описано выше. Свежеизолированные клетки селезёнки (105 клеток на лунку) культивируют в трёх ячейках (трижды) в 96-луночных микрокультуральных планшетах с ϋ-образным дном (Согшпд, СатЬпбде, МА) в среде КГМН640 (1КН Β^ο5с^епсе5, Ьепеха, К§), дополненной 2,05 мМЬ-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина и 10% термоинактивированного ΕΒ§, в течение 96 ч при 37°С. Также добавляют различные АЬ-пептиды, АЬ1-16, АЬ1-40, АЬ1-42 или белок с обратной последовательностью АЬ40-1 в дозах в интервале 5-0,18 мкМ в четыре стадии. Клетки в контрольных лунках культивируют с конканавалином А (Соп А) (§1дта, са!. # С-5274, при 1 мкг/мл) без добавления белка. Клетки выдерживают в пульсовом режиме последние 24 ч с Н-тимидином (мкки/лунка, получен от Атегкйат Согр., Аг1тд1оп Не1дН(8 Ж). Клетки собирают на пластины ип1ЕН(ег и считают с помощью сцинтилляционного счётчика для микропланшетов Тор Соип! М1сгор1а!е 8ст!111а!юп Соип!ег (Таскагб ШкРитеШк, Оо^пегк Огоуе, ΣΕ). Результаты выражены как число импульсов радиоактивности, введенной в нерастворимые макромолекулы, в минуту (срт).
4. Подготовка ткани головного мозга.
После усыпления головной мозг удаляют и одно полушарие готовят для иммуногистохимического анализа, тогда как три участка мозга (гиппокамп, кора и мозжечок) отсекают от второго полушария и используют для определения концентрации различных АЬ-белков и АРР-форм, применяя специфический метод ЕЫ8А (ЗоНпкоп-ХУооб е! а1., см. выше).
Ткани, предназначенные для анализа ЕЫ8А, гомогенизируют в 10 объёмах охлаждённого на льду (ледяного) буфера гуанидина (5,0 М гуанидин-НС1, 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0). Гомогенат осторожно перемешивают в нутаторе Адамса (Е1кйег) от 3 до 5 ч при КТ, затем хранят при -20°С до количественных измерений АЬ и ΑΡΡ. Предварительные эксперименты показали, что аналиты устойчивы при таких условиях хранения и что синтетический АЬ-белок (БасНет) можно количественно регенерировать при впрыскивании (введении) в гомогенаты контролируемой ткани головного мозга мышиного помёта (Зойпкоп\Уоо6 е! а1., см. выше).
5. Измерение уровней АЬ.
Гомогенаты головного мозга разводят 1:10 ледяным казеиновым разбавителем (0,25% казеина, ΡΒ§, 0,05% азида натрия, 20 мкг/мл апротинина, 5 мМ ЕОТА рН 8,0, 10 мкг/мл лейпептина) и затем центрифугируют при 16000 об./мин в течение 20 мин при 4°С. Готовят стандарты синтетических АЬ-белков (1-42 аминокислоты) и АРР-стандарты, включающие в конечный состав 0,5 М гуанидина и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (Ь8А). Сэндвич-ЕЫ8А тотального АЬ использует моноклональное антитело (тАЬ) 266, специфическое относительно аминокислот 13-28 белка АЬ (8еиЬей е! а1.,) в качестве иммобилизованного антитела, и биотинилированное тАЬ 3Ό6, специфическое в отношении аминокислот 1-5 АЬ (ЗоНпкопгХУооб е! а1.) в качестве антитела-репортёра. 3Ό6 тАЬ не распознает секретируемые ΑΡΡ или непроцессированные ΑΡΡ, но обнаруживает только вид АЬ с аспарагиновой кислотой на Ν-конце. Этот анализ имеет нижний предел чувствительности ~50 нг/мл (11 пМ) и не проявляет перекрёстной реактивности относительно эндогенного мышиного АЬ-белка при концентрации вплоть до 1 нг/мл (Зойпкоп\Уоо6 е! а1., см. выше).
АЬ1-42 специфический сэндвич-ЕЫ8А использует тАЬ 21Е12, специфический относительно ами
- 30 007218 нокислот 33-42 ΑЬ (Ιοίιηκοη-Χνοοά е! а1.) в качестве иммобилизованного антитела. Биотинилированный тАЬ 3Ό6 также используется в качестве антитела-репортёра в этом анализе, который имеет нижний предел чувствительности около 125 нг/мл (28 пМ, Ιοίιηκοη-Χνοοά е! а1.). Для ΑЬ ЕБ-ΙΞΑ 100 мкл либо тАЬ 266 (с 10 мкг/мл) или тАЬ 21Б12 (с 5 мкг/мл) наносят на лунки 96-луночных планшетов для иммуноанализа (ί,'οδΙαΓ) с помощью термостатирования в течение ночи при КТ. Раствор удаляют отсасыванием и лунки блокируют добавлением 200 мкл 0,25% человеческого сывороточного альбумина в ΡΒδ-буфере в течение примерно 1 ч при КТ. Раствор для блокирования удаляют и планшеты хранят в сухом виде при 4°С до использования. Планшеты регидратируют водным буфером [Трис-забуференный физиологический раствор (0,15 М №С1, 0,01 М Тпк-НСБ рН 7,5), плюс 0,05 Т\уееп 20] перед применением. Образцы и стандарты добавляют в тройные аликвоты 100 мкл на лунку и затем термостатируют в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывают по меньшей мере три раза водным буфером перед каждой стадией анализа. Биотинилированное тАЬ 3Ό6, разбавленное до 0,5 мкг/мл в казеиновом буфере для анализа (0,25% казеина, ΡΒ8, 0,05% Тетееи 20, рН 7,4), добавляют и термостатируют в лунках в течение 1 ч при КТ. Конъюгат авидин-пероксидаза хрена (Авидин-НКΡ, получен от Vесΐο^, Βи^1^ηдате, СΑ), разбавленный 1:4000 в казеиновом аналитическом буфере, добавляют в лунки в течение 1 ч при КТ. Колориметрический субстрат, медленный ТМЕ-ЕМЕА ^егое), добавляют и дают реагировать в течение 15 мин при КТ, после чего ферментативную реакцию прекращают, добавляя 25 мкл 2Ν Н2804. Продукт реакции количественно определяют, используя Мο1еси1а^ Эеу1се5 Vтаx - измерение разницы поглощения при 450 и 650 нм.
6. Определение уровней ΑΡΡ.
Применяются два различных АРР-анализа. Первый, называемый ΑΡΡ-α/БЬ, распознает как АРР-α, так и непроцессированную (БЬ) форму ΑΡΡ. Второй анализ является специфическим относительно АРРα. Анализ ΑΡΡ-α/БЬ распознает секретируемый ΑΡΡ, включая первые 12 аминокислот Αό. Так как репортёрное антитело (2Н3) не является специфическим относительно α-клин-сайту, находящемуся между аминокислотами 612-613 АРР695 (ЕксЬ е! а1., 8с1епсе 248, 1122-1124 (1990)); этот анализ также позволяет распознавать непроцессированный (полноразмерный) ΑΡΡ (ΑΡΡ-БЬ). Предварительные эксперименты, использующие иммобилизованные АРР-антитела к цитоплазматическому хвосту ΑΡΡ-БЬ для истощения ΑΡΡ-БЬ-гомогенатов головного мозга, подтверждают, что, примерно 30-40% АРР-о/БЬ ΑΡΡ представляет собой БЬ (данные не показаны). Иммобилизованное антитело в обоих анализах - ΑΡΡ-α/БЬ И АРР-α это тΑЬ 8Е5, полученный против аминокислот 444-592 формы АРР695 (батек е! а1., см. выше). Репортёрным тАЬ для АРР-а/РЬ-анализа является тΑЬ 2Н3, специфически связывающееся с аминокислотами 597-608 АРР695 (Ιοίιηκοη-Χνοοά е! а1., см. выше), а репортёрным антителом для анализа АРР-α является биотинилированное производное тΑЬ 16Н9, полученное против аминокислот 605-611 ΑΡΡ. Нижний предел чувствительности анализа ΑΡΡ-α/БЬ составляет примерно 11 нг/мл (150 рМ) (ΙοΗηκοη-νοοά е! а1.), а нижний предел чувствительности АРР-а-специфического анализа составляет 22 нг/мл (0,3 нМ). При проведении обоих анализов тΑЬ 8Е5 наносят на поверхность лунок 96-луночных МА-планшетов, как описано выше для тАЬ 266. Очищенное рекомбинантное секретируемое АРР-α используют в качестве образцового стандарта для АРР-п.-анализа и ΑΡΡ-α/БЬ-анализа (ЕксЬ е! а1., см. выше). Образцы гомогената мозга в 5 М гуанидина разбавляют 1:10 в разбавителе для образцов в методе Ε^I8Α (0,014 М буферный фосфат, рН 7,4, 0,6% бычий сывороточный альбумин, 0,05% тимерозаль, 0,5 М №С1, 0,1% ΝΡ40). Их разбавляют затем 1:4 разбавителем для образцов, содержащим 0,5 М гуанидина. Разбавленные гомогенаты затем центрифугируют при 16000 об./мин в течение 15 с при КТ. Точные аликвоты опытных и стандартных образцов ΑΡΡ добавляют в планшеты и термостатируют в течение 1,5 ч при КТ. Биотинилированное репортёрное антитело 2Н3 или 16Н9 термостатируют с образцами в течение 1 ч при КТ. Стрептавидин-щелочную фосфатазу (ΒοеЬ^^ηде^ МаппЬе1т), разбавленную в соотношении 1:1000 разбавителем для образцов, термостатируют в лунках в течение 1 ч при КТ. Флуоресцентный субстрат - 4метилумбеллиферилфосфат - добавляют для 30-минутного термостатирования при КТ и планшеты считывают на флуориметре СуЮП1ЮГ 1т 2350 ^ΠΗροι^) при возбуждении 365 нм и при излучении 450 нм.
7. Иммуногистохимия.
Головной мозг фиксируют в течение трёх дней при 4°С в 4% растворе параформальдегида в ΡΒ8, а затем хранят от одного до семи дней при 4°С в 1% растворе параформальдегида, ΡΒ8 до рассечения. Венечные срезы толщиной сорок микрон делают на вибраторе при КТ и хранят в криопротекторе (30% глицерина, 30% этиленгликоля в фосфатном буфере) при -20°С перед иммуногистохимической обработкой. При обработке мозга каждого животного шесть срезов на уровне дорсального гиппокампа, - каждый отделен от следующего интервалами 240 мкм (с интервалами 240 мкм) - термостатируют в течение ночи с одним из следующих антител: (1) биотинилированным анти-АЬ (тΑЬ, 3Ό6, специфически связывающимся с человеческим Αδ), разбавленным до концентрации 2 мкг/мл ΡΒ8 и 1% лошадиной сывороткой; или (2) биотинилированным тАЬ, специфически связывающимся с человеческим ΑΡΡ, 8Е5, разбавленным до концентрации 3 мкг/мл ΡΒ8 и 1% лошадиной сывороткой; или (3) тАЬ, специфически связывающимся с глиальным фибриллярным кислым белком (ΟБΑΡ; 8щта С11е1шса1 6ο.), разбавленным 1:500 0,25% Тритоном Х-100 и 1% лошадиной сывороткой в Тпк-забуференном физиологическом растворе, рН 7,4 ('ΓΒ8); или (4) тАЬ, специфически связывающимся с СЬ11Ь, МΑС-1 антигеном (ΟκιηΕοη
- 31 007218
1п(егпа(1опа1). разбавленным 1:100 Тритоном Х-100 и 1% кроличьей сывороткой в ТВ8; или (5) тАЪ, специфически связывающимся с МНС II антигеном (Рйагттдеи), разбавленным 1:100 Тритоном Х-100 и 1% кроличьей сывороткой в ТВ8; или (6) тАЪ крыс, специфически связывающимся с СО 43 (Рйагттдеп). разбавленным 1:100 1% кроличьей сывороткой в РВ8; или (7) тАЪ крыс, специфически связывающимся с СО 45КА (Рйагттдеп), разбавленным 1:100 1% кроличьей сывороткой в РВ8; или (8) моноклональным АЪ крыс, специфически связывающимся с СО 45КВ (Рйагттдеп), разбавленным 1:1 1% кроличьей сывороткой в РВ8; или (9) моноклональным АЪ крыс, специфически связывающимся с СО 45 (Рйагттдеп), разбавленным 1:100 1% кроличьей сывороткой в РВ8; или (10) биотинилированным поликлональным АЪ хомяков, специфически связывающимся с СЭ3е (Рйагттдеп), разведенным 1:100 1% кроличьей сывороткой в РВ8; или (11) тАЪ крыс, специфически связывающимся с СЭ3 (8его1ес), разведенным 1:100 1% кроличьей сывороткой в РВ8; или (12) раствором РВ8, не содержащим первичного антитела, но содержащим 1% нормальную лошадиную сыворотку.
Срезы, прореагировавшие с растворами антител, перечисленные выше в 1, 2 и 6-12, предварительно обрабатывают 1,0% тритоном Х-100, 0,4% перекиси водорода в РВ8 в течение 20 мин при КТ, чтобы блокировать эндогенную пероксидазу. Затем их термостатируют в течение ночи при 4°С с первичным антителом. Срезы, взаимодействовавшие с 3Ό6, или 8Е5, или СЭ3е тАЪ, затем реагируют в течение одного часа при КТ с комплексом пероксидаза хрена-авидин-биотин с компонентами набора А и В, разбавленными 1:75 в РВ8 (Уес1ог Е1йе 81апбагб КН, Уес1ог ЬаЪз, ВшИпдате, СА). Срезы, реагировавшие с антителами, специфически связывающимися с СО 45КА, СО 45КВ, СО 45, СЭ3 и РВ8-раствором, свободным от первичного антитела, термостатируют в течение 1 ч при КТ с биотинилированным антителом к [дС крыс (Уес1ог), разбавленным 1:75 РВ8 или биотинилированным антителом к мышиному [дС (Уес1ог), разбавленным 1:75 РВ8 соответственно. Срезы затем реагируют в течение одного часа при КТ с комплексом: пероксидаза хрена-авидин-биотин с компонентами набора А и В, разбавленными 1:75 РВ8 (Уес1ог Е1йе 81апбагб КН, Уес1ог ЬаЪз, ВшИпдате, СА).
Срезы обрабатывают 0,01% перекиси водорода, 0,05% 3,3'-диаминобензидином (ΌΛΕ) при КТ. Срезы, предназначенные для термостатирования с СЕАР-, МАС-1- и МНС-П-специфическими антителами, предварительно обрабатывают 0,6% перекисью водорода при КТ для того, чтобы блокировать эндогенную пероксидазу, затем термостатируют в течение ночи с первичным антителом при 4°С. Срезы, реагировавшие с СЕАР-антителом, термостатируют в течение 1 ч при КТ с биотинилированным антителом к мышиному БС, полученному при иммунизации лошадей (Уес1ог ЬаЪогаШпез; Уес1а81аш Е1йе АВС Кй), разбавленным 1:200 ТВ8. Затем срезы реагируют далее в течение 1 ч с комплексом авидин-биотинпероксидаза (Уес1ог ЬаЪогаШпез; Уес1а81а1п Е1йе АВС Кй), разбавленным 1:1000 ТВ8. Срезы, термостатированные с МАС-1- или МНС П-специфическим тАЪ в качестве первичного антитела, затем реагируют в течение 1 ч при КТ с биотинилированным антителом к БС крыс, полученным при иммунизации кроликов, разбавленным ТВ8 (1:200), с последующим термостатированием в течение одного часа с комплексом авидин-биотин-пероксидаза, разбавленным ТВ8 (1:1000). Срезы, термостатированные с СЕАР-, МАС-1- и МНС П-специфическими антителами, затем визуализируют обработкой при КТ 0,05% ОАВ, 0,01% прекисью водорода, 0,04% хлорида никеля, ТВ8 в течение 4 и 11 мин соответственно.
Срезы с иммунной меткой помещают на предметные стекла (У\К, 8ирегГго51 зйбез - сверхморозоустойчивые стекла), сушат на воздухе в течение ночи, погружают в Ргораг (Апа1есй) и накрывают покровными стеклами, применяя Регтоип! (ЕЕйег) в качестве среды для заключения ткани.
8. Анализ изображения.
Система анализа изображения У1беоте1гю 150 Инаде АнаИтй 8уз1ет (Опсог, Шс., СаййегзЪигд, МО) соединенная с микроскопом №коп М1сгорйо1-ЕХ через видеокамеру ССЭ и монитор 8опу Тггпйгоп применяется для количественной обработки иммунореактивных препаратов (слайдов). Изображение среза вводят в видеопамять, определяют цветовой порог и порог насыщенности, чтобы выбрать и подсчитать общую площадь элементов изображения, занятую структурами с иммунной меткой. Для каждого среза контур гиппокампа вычерчивается вручную и рассчитывается общая площадь элементов изображения, занимаемая гиппокампом. Процент амилоидной нагрузки определяют как: (часть площади гиппокампа, содержащая тАЪ 3Ό6) х 100. Аналогично процент нейритной нагрузки определяют как: (часть площади гиппокампа, содержащая дистрофические нейриты, реактивные в отношении тАЪ 8Е5) х 100. Система формирования изображений - Сйтадшд 8уз1ет (Сотр1х, Шс., СгапЪеггу То^пзЫр, РА), оперирующая с простой 32 прикладной программой (81тр1е 32) соединена с микроскопом №коп М1сгорйо1-ЕХ через оптоэлектронную камеру и используется для расчета процентного содержания ретросплениальной коры, занимаемой СЕАР-позитивными астроцитами и МАС-1- и МНС П-позитивной микроглией. Изображение иммунореактивного среза вводят в видеопамять и определяют на основе монохромности порог, чтобы выбрать и рассчитать общую площадь элементов изображения, занимаемых клетками с иммунной меткой. Для каждого среза вручную вычерчивают контур ретросплениальной коры (К8С) и высчитывают общую площадь элементов изображения, занимаемую К8С. Процентное содержание астроцитоза определяют как: (часть К8С, занимаемая СЕАР-реактивными астроцитами) х 100. Аналогично процент микроглиоза определяют как: (часть К8С, занимаемая МАС-1- или МНС П-реактивной микроглией) х 100.
- 32 007218
Для всех случаев анализа изображения для каждого животного рассчитываются шесть срезов на уровне дорсального гиппокампа, разделенных интервалами 240 мкм. Во всех случаях наблюдателю не был известен характер (статус) лечения животного.
Хотя вышеприведённое изобретение описано подробно с целью четкого понимания, очевидно, что на практике могут применяться определённые модификации в объёме прилагаемой формулы изобретения. Все публикации и патентные документы, цитируемые в данном описании, вводятся в него ссылками во всей полноте и в таком объёме, как если бы они были таким образом отмечены отдельно.
Таблица 1
Титр при 50% минимальной □ϋ (оптической плотности)
| |
Мыши, инъецированные агрегированными АЬ
Возраст ΡΌΑΡΡ Мышь 100 Мышь 101 Мышь 102 Мышь 103 Мышь 104 Мышь 105 Мышь 106 Мышь 107 Мышь 108
4 70000 150000 15000 120000 1000 15000 50000 80000 100000
6 15000 65000 30000 55000 300 15000 15000 50000 60000
8 20000 55000 50000 50000 400 15000 18000 50000 60000
10 40000 20000 60000 50000 900 15000 50000 20000 40000
12 25000 30000 60000 40000 2700 20000 70000 25000 20000
Мыши, инъецированные РВ8 на обоих иммуногенах при 1/100
Возраст РИАРР Мышь ИЗ Мышь 114 Мышь 115 Мышь 116 Мышь 117
6 < 4х фон < 4х фон < 4х фон < 4х фон < 4х фон
10 5 х фон < 4х фон < 4х фон < 4х фон < 4х фон
1 12 < 4х фон < 4х фон < 4х фон < 4х фон < 4х фон
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (67)

1. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуногенный агент, эффективно индуцирующий иммунный ответ, представляющий собой антитела против Ар пептида больного, и фармацевтически приемлемый адъювант, причём адъювант повышает иммунный ответ на Ар пептид.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой 8йти1опТМ 08.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что агент инкапсулирован в частицу.
4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что частица представляет собой частицу сополимера полилактид-полигликолида (РЬРС).
5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что агент представляет собой Ар пептид.
6. Фармацевтическая композиция по п.5, содержащая по меньшей мере 20 мкг Ар пептида.
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что агент представляет собой иммуногенный фрагмент Ар пептида.
8. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что иммуногенный фрагмент Ар пептида представляет собой фрагмент Ν-концевой половины Ар пептида.
9. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что иммуногенный фрагмент Ар пептида выбирают из группы, состоящей из Ар1-5, Ар1-6, Ар1-12, Ар13-28, Ар17-28, Ар25-35, Ар33-42, Ар35-40 и Ар35-42.
10. Применение иммуногенного агента, эффективно вызывающего иммунный ответ, представляющий собой антитела к Ар пептиду, для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями в организме больного.
11. Применение по п.10, отличающееся тем, что лекарственный препарат дополнительно содержит фармацевтически приемлемый адъювант, который повышает иммунный ответ на Ар пептид.
12. Применение по п.10, отличающееся тем, что адъювант представляет собой 8йти1оп™ 08.
13. Применение по любому из пп.10-12, отличающееся тем, что агент инкапсулируют в частицу.
- 33 007218
14. Применение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что агент представляет собой Ав пеп тид.
15. Применение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что агент представляет собой иммуногенный фрагмент Ав пептида.
16. Применение по п.15, отличающееся тем, что иммуногенный фрагмент Ав пептида представляет собой фрагмент Ν-концевой половины Ав пептида.
17. Применение по п.15, отличающееся тем, что иммуногенный фрагмент Ав пептида выбирают из группы, состоящей из Ав1-5, Ав 1-6, Ав1-12, Ав13-28, Ав17-28, Ав25-35, Ав33-42, Ав35-40 и Ав35-42.
18. Композиция, содержащая Ав пептид или его иммуногенный фрагмент, связанный с молекулой носителя с образованием конъюгата.
19. Композиция по п.18, отличающаяся тем, что молекула носителя представляет собой молекулу холерогена.
20. Композиция иммуноглобулина.
21. Композиция по
п.18,
п.18, отличающаяся тем, отличающаяся тем, что что молекула молекула носителя носителя представляет представляет собой собой молекулу молекулу по дифтерийного токсина.
22. Композиция по п.21, отличающаяся тем, что дифтерийный токсин представляет собой СВМ 197.
23. Композиция по п.18, отличающаяся тем, что молекула носителя представляет собой молекулу столбнячного токсина.
24. Композиция по любому из пп.18-23, дополнительно содержащая адъювант.
25. Композиция по п.24, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой 8!1ти1оп™ 08-21.
26. Композиция по любому из пп.18-25, отличающаяся тем, что агент представляет собой
Ав пептид.
27. Композиция по любому из пп.18-25, отличающаяся тем, что агент представляет собой иммуногенный фрагмент Ав пептида.
28. Композиция по п.27, отличающаяся тем, что иммуногенный фрагмент Ав пептида представляет собой фрагмент Ν-концевой половины Ав пептида.
29. Композиция по любому из пп.18-28, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
30. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что композиция не содержит полный адъювант Фрейнда.
31. Применение Ав пептида или его иммуногенного фрагмента, связанного с молекулой носителя с образованием конъюгата, для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями у больного.
32. Применение по п.31, отличающееся тем, что молекула носителя представляет собой молекулу холерогена.
33. Применение иммуноглобулина.
34. Применение по
п.31,
п.31, отличающееся тем, отличающееся тем, что что молекула молекула носителя носителя представляет представляет собой собой молекулу молекулу по дифтерийного токсина.
35. Применение по п.34, отличающееся тем, что дифтерийный токсин представляет собой СВМ 197.
36. Применение по п.31, отличающееся тем, что молекула носителя представляет собой молекулу столбнячного токсина.
37. Применение по любому из пп.31-36, отличающееся тем, что лекарственный препарат дополни тельно содержит адъювант.
38. Применение по п.37, отличающееся тем, что адъювант представляет собой 8ити1оп|Л|О8-21.
39. Применение по любому из пп.31-38, отличающееся тем, что агент представляет собой Ав пеп тид.
40. Применение по любому из пп.31-38, отличающееся тем, что агент представляет собой иммуногенный фрагмент Ав пептида.
41. Применение по п.40, отличающееся тем, что иммуногенный фрагмент Ав пептида представляет собой фрагмент Ν-концевой половины Ав пептида.
42. Применение по любому из пп.31-41, отличающееся тем, что лекарственный препарат дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
43. Композиция, содержащая вирусный вектор, кодирующий Ав пептид или его фрагмент, эффективно индуцирующий иммунный ответ, представляющий собой антитела против Ав пептида.
44. Применение вирусного вектора, кодирующего Ав пептид или его фрагмент, эффективно индуцирующий иммунный ответ, представляющий собой антитела против Ав пептида, для изготовления медицинского препарата для лечения или предупреждения заболевания.
- 34 007218
45. Способ оценки эффективности метода лечения болезни Альцгеймера у больного, заключающийся в определении базового количества (исходного уровня) антитела, специфичного к Ав пептиду, в тканевом образце больного перед лечением агентом, сравнении количества антитела, специфичного к Ав пептиду, в тканевом образце больного после лечения агентом с исходным уровнем Ав пептидспецифичного антитела, причем увеличение количества Ав пептид-специфичного антитела, измеренного после лечения, по сравнению с исходным уровнем Ав пептид-специфичного антитела указывает на положительный результат лечения.
46. Способ оценки эффективности метода лечения болезни Альцгеймера у больного, заключающийся в определении базового количества (исходного уровня) антитела, специфичного к Ав пептиду, в тканевом образце больного перед лечением агентом, сравнении количества антитела, специфичного к Ав пептиду, в тканевом образце субъекта после лечения агентом с исходным уровнем Ав пептидспецифичного антитела, причем уменьшение количества Ав пептид-специфичного антитела, измеренного после лечения, по сравнению с исходным уровнем Ав пептид-специфичного антитела или отсутствие заметной разницы между этими значениями указывает на отрицательный результат лечения.
47. Способ оценки эффективности метода лечения болезни Альцгеймера у больного, заключающийся в определении контрольного количества антитела, специфичного к Ав пептиду, в тканевых образцах контрольной популяции, сравнении количества антитела, специфичного к Ав пептиду, в тканевом образце больного после введения агента с контрольным количеством Ав пептид-специфичного антитела, причем увеличение количества Ав пептид-специфичного антитела, измеренного после лечения, в сравнении с контрольным количеством Ав пептид-специфичного антитела указывает на положительный результат лечения.
48. Способ оценки эффективности метода лечения болезни Альцгеймера у больного, заключающийся в определении контрольного количества антитела, специфичного к Ав пептиду, в тканевых образцах контрольной популяции, сравнении количества антитела, специфичного к Ав пептиду, в тканевом образце больного после введения агента с указанным контрольным количеством Ав пептидспецифичного антитела, причем отсутствие заметной разницы между количеством Ав пептидспецифичного антитела, измеренным после начала указанного лечения, по сравнению с контрольным количеством Ав пептид-специфичного антитела указывает на отрицательный результат лечения.
49. Способ мониторинга болезни Альцгеймера или восприимчивости к ней у больного, заключающийся в обнаружении иммунного ответа против Ав пептида в образце, взятом у больного.
50. Способ оценки эффективности метода лечения болезни Альцгеймера у больного, заключающийся в определении значения количества антитела, специфичного к Ав пептиду, в тканевом образце больного, которого лечили агентом; сравнении этого значения с контрольным значением, определенным для популяции больных, почувствовавших уменьшение интенсивности или исчезновение симптомов болезни Альцгеймера в результате лечения агентом; причем значение показателя у больного, по меньшей мере, равное контрольному значению, указывает на положительный результат лечения.
51. Фармацевтическая композиция, содержащая человеческое химерное или гуманизированное антитело, специфически связывающееся с Ав пептидом, и фармацевтически приемлемый носитель.
52. Композиция по п.51, отличающаяся тем, что антитело является моноклональным антителом.
53. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело, специфически связывающееся с Ав пептидом, и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что изотип указанного антитела представляет собой человеческий ЦСЕ
54. Композиция по п.53, отличающаяся тем, что антитело является моноклональным антителом.
55. Применение химерного или гуманизированного антитела, специфически связывающегося с Ав пептидом, для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями в организме больного.
56. Применение по п.55, отличающееся тем, что антитело является моноклональным антителом.
57. Применение антитела, специфически связывающегося с Ав пептидом, отличающееся тем, что изотип указанного антитела представляет собой человеческий IдС1 для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями в организме больного.
58. Применение по п.57, отличающееся тем, что антитело является моноклональным антителом.
59. Применение по любому из пп.10-17, 31-42, 44 или 55-58, отличающееся тем, что амилоидные отложения представляют собой агрегированную форму Ав пептида.
60. Применение по любому из пп.10-17, 31-42, 44 или 55-58, отличающееся тем, что заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
61. Применение по любому из пп.10-17, 31-42, 44 или 55-58, отличающееся тем, что больной является бессимптомным больным.
62. Применение по п.14, отличающееся тем, что Ав пептид представляет собой агрегированную форму.
- 35 007218
63. Применение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что агент представляет собой химерное или гуманизированное антитело к Αβ пептиду, которое вызывает иммунный ответ, связываясь с Αβ пептидом в организме больного.
64. Применение по п.63, отличающееся тем, что антитело является моноклональным антителом.
65. Применение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что агент является антителом к Αβ пептиду, которое вызывает иммунный ответ, связываясь с Αβ в организме больного, причём изотип антитела представляет собой человеческий ^Ο1.
66. Применение по п.65, отличающееся тем, что антитело является моноклональным антителом.
67. Применение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что агент представляет собой эффективную дозу нуклеиновой кислоты, кодирующей Аβ пептид или его активный фрагмент, при этом нуклеиновая кислота экспрессируется в организме больного, продуцируя Αβ пептид или его активный фрагмент, который вызывает иммунный ответ.
Титры агрегированного Αβ42, , инъецированного мышам РДАРР во времени I
Возраст РДАРР -мышей (месяцы)
Фиг. 1
- 36 007218
Исследование 001
792 непролеченные 8АРР
Фиг. 4
- 37 007218
Исследование 002 Кортикальная амилоидная нагрузка
Исследование 002
Фиг. 8
Фиг. 7
0.60 - 1 <Ъ о о □ о о £0.40- 2! В □ § □г> <Ъ о и Ё о с- □ о 0.20к . о
- 38 007218
Исследование 002
Ретросплениальный кортикальный астроцид
РВ5 ΑΝ1792 РВ8 ΑΝ 1792
15 месяц
18 месяц
Фиг. 9
- 39 007218
Исследование 006
Терапевтическая эффективность Αβ-фрагментов * Данные о кортикальном тотальном Αβ
16000' 14000“
ЙАВ25-35
--Ш-- КАВЗЗ-42
КАВ1-40
Н АВ 1-42 неделя
Фиг. 13
12000“
10000- X К 8000- ч 99 Н 6000- н 4000- 2000-
Подопытная группа
Фиг. 11
Исследование 006
Кортикальная амилоидная нагрузка
Фиг. 12
Исследование 006
Титры антитела, связывающегося с Αβ-42 —V-- ГАВ1-42
- 40 007218
Фиг. 14
33 мкг ΑΝ 1792 ‘ в РВ8 .33 мкг ΑΝ 1792 в СРА/1РА . 33 мкг Пальмигойл Αβ.
ί в сквалине мкг ΑΝ 1792 в 50 мкг РМЬ/РВ8 мкг ΑΝ 1792 в сквалине
33 мкг ΑΝ 1792/50 мг РМЬ
1792 в 5 мкг квасцов 300 Мкг ΑΝ 1792 I в 5 мкг квасцов
Кора
РВ8 -контроль Не пролеченные контрольные 624-165 272 764-181 3470 625-166 1802 785-182 171 626-167 62 766-183 91 633-168 4696 767-184 6692 634-169 3090 768-185 1353 671-170 2417 771-186 1153 672-171 2840 772-187 3800 829-172 3320 780-188 3740 830-173 1833 843-189 163 831-174 416 ί 844-190 122 792-175 126 845-191 427 793-176 2559 846-192 2674 794-177 289 887-193 453 732-178 179 888-194 2996 733- 179 734- 180 1329 5665 889-195 1075 Среднее ! значение р (М-АУ11 1817 Среднее значение р (МАУ); 1153 Среднее значение ; 1931 Среднее значение 1825 Стандартное отклонение( 1718 Стандартное отклонение' 1769 ' 97 %СУ . ι 89 %СУ Значение р (Т-тест) . . п=16 Значение р (Т-тест) п=15
Фиг. 15А
- 41 007218
КОРА
2мг квасцов 100μκγΑΝ1528 ’ 660-083 295 661-084 3180 662-085 2480 663-086 3014 664-087 5870 665-088 5978 693-089 1620 694-090 35 695-091 3400 697-092 2630 ί 698-093 983 699-094 5327 701-095 1862 702-096 1849 703-097 2239 739-098 806 740-099 5303 741-100 459 800-103 154 801-104 852 Среднее значение р (М-УУ) 2051 Среднее значение 2407 1913 Стандартное отклонение %СУ . 79 Значение р (ΐ-тест) п=20
50 мкг МРЬ 100 мкг ΑΝ1528 643-105 385 644-106 2640 645-107 2403 654-108 1741 655-109 3053 656-110 5990 678-111 3360 679-112 1230 704-114 2680 : 705-115 78 706-116 1290 729-117 3180 730-118 1833 731-119 4590 736-120 1112 737-121 1653 757-122 992 758-123 4692 808-124 785 809-125 244 810-126 32 Среднее значение р (М-УУ); 1741 ' Среднее значение 2140 1659 Стандартное отклонение %СУ 78 Значение р (1-тест) п=21
Фиг. 15В
КОРА
‘ 25мкг <5821 · 100 мкг ΑΝ1528 СЕА/1РА 100 мкг ΑΝ1792 615-128 1257 539-068 693 616-129 361 640-069 508 617-130 1008 641-070 440 536-131 3290 642-071 467 637-132 2520 690-072 42 638-133 3880 691-073 2491 744-134 627 692-074 121 745-135 58 795-075 137 746-136 2610 796-076 822 747-137 1509 797-077 475 769-138 1788 748-087 600 770-139 988 749-079 78 773-140 1199 750-080 1267 774-141 339 751-081 1351 775- 142 776- 143 840- 144 841- 145 821- 146 822- 147 823- 148 402 537 1119 194 1259 5413 2233 761-082 . 69 I Среднее значение р (МАУ) 1199 Среднее , значение р (М-УУ) ] 475 0.0481 Среднее значение 1552 Среднее значение 637 ' Стандартное отклонение! 364 Стандартное отклонение 655 %СУ 88 %СУ 103 0.0106 ^Значение р (1-тест) п=21 Значение р (ΐ-тест) п=15
Фиг. 15С
- 42 007218
КОРА
5 мкг Тимерозоль/РВ8 13 10 мкг ΑΝ1792 2 мкг Квасцов 100 мкг ΑΝ1792 635-149 1337 610-001 432 669-150 4644 611-002 1012 670-151 6335 612-003 3607 673-152 3700 613-004 508 674-153 2750 620-005 465 676-154 1687 621-006 16 681-156 185 622-007 28 682-157 8031 623-008 217 683-158 3450 708-009 2738 754-159 157 709-010 927 755-160 6857 710-011 1609 756-161 482 716-012 1608 805-162 524 784-014 3890 806-163 397 785-015 1614 807-164 234 786- 018 787- 017 788- 018 789- 019 815- 020 816- 021 817-022 285 3102 1617 1474 424 1375 2323 Среднее , 1687 Среднее 1375 значение ρ (Μ-λ¥) ’ значение ρ (М-А) 0.5000 Среднее значение .. 971 я Среднее значение 1394 Стандартное отклонение 2685 Стандартное отклонение-ι 166 %СУ 99 %СУ 84 0.2650 Значение υ (ΐ-тест) ί п=15 Значение р (ΐ-тест) п=21
Фиг . 15Ό
КОРА
50 мкг МРЬ 25 мкг 0821 100 мкг ΑΝ1792 100 мкг ΑΝ1792 646-023 2002 627-045 91 647-024 147 628-046 3397 648-025 1304 631-049 3702 649-026 34 632-050 1776 650-027 980 667-052 1832 724-028 1282 668-053 3023 726-030 1966 686-054 189 727-031 733 687-055 891 720-032 2563 688-056 240 721-033 5563 689-057 110 802-034 113 712-059 3311 803-035 671 825-061 1009 804-036 51 826-082 18165 811-037 613 827-063 73 812-038 332 828-064 78 813-039 1454 837-065 1051 814-040 2441 838-066 270 833-014 742 839-067 371 834-042 40 836-044 807 Среднее , 774 Среднее 950 значение р (М-А) 0. 1710 значение ρ (М-А) 0.4076 Среднее значение 1102 Среднее значение 21 сю Стандартное отклонение -| 299 Стандартное отклонение4187 %СУ 109 %СУ 190 0.1506 0.8131 Значение р (ΐ-тест) п=21 Значение р (ΐ-тест) п=18
Фиг. 15Е
EA200401473A 1997-12-02 1998-11-30 Предотвращение и лечение амилоидогенного заболевания EA007218B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6774097P 1997-12-02 1997-12-02
US8097098P 1998-04-07 1998-04-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401473A1 EA200401473A1 (ru) 2005-04-28
EA007218B1 true EA007218B1 (ru) 2006-08-25

Family

ID=26748211

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601132A EA009283B1 (ru) 1997-12-02 1998-11-30 Предупреждение и лечение амилоидогенного заболевания
EA200000608A EA200000608A1 (ru) 1997-12-02 1998-11-30 Предотвращение и лечение амилоидогенного заболевания
EA200401473A EA007218B1 (ru) 1997-12-02 1998-11-30 Предотвращение и лечение амилоидогенного заболевания

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601132A EA009283B1 (ru) 1997-12-02 1998-11-30 Предупреждение и лечение амилоидогенного заболевания
EA200000608A EA200000608A1 (ru) 1997-12-02 1998-11-30 Предотвращение и лечение амилоидогенного заболевания

Country Status (38)

Country Link
US (26) US20040171816A1 (ru)
EP (5) EP1033996B1 (ru)
JP (4) JP4677094B2 (ru)
KR (3) KR101248711B1 (ru)
CN (1) CN100374151C (ru)
AR (1) AR020050A1 (ru)
AT (4) ATE433760T1 (ru)
AU (1) AU1706199A (ru)
BG (1) BG104562A (ru)
BR (1) BR9815357A (ru)
CA (1) CA2312920C (ru)
CO (1) CO4980846A1 (ru)
CY (3) CY1108331T1 (ru)
CZ (1) CZ303137B6 (ru)
DE (7) DE06075704T1 (ru)
DK (4) DK1679080T3 (ru)
EA (3) EA009283B1 (ru)
EE (1) EE05377B1 (ru)
ES (4) ES2310017T3 (ru)
GE (2) GEP20043319B (ru)
HK (2) HK1095265A1 (ru)
HR (2) HRP20000443B1 (ru)
HU (2) HU228061B1 (ru)
ID (1) ID25504A (ru)
IL (5) IL136252A0 (ru)
IS (1) IS5500A (ru)
MY (1) MY134906A (ru)
NO (3) NO328865B1 (ru)
NZ (1) NZ504569A (ru)
PE (1) PE20001383A1 (ru)
PL (2) PL202706B1 (ru)
PT (4) PT1994937E (ru)
SA (1) SA99191269B1 (ru)
SG (1) SG111083A1 (ru)
SI (4) SI1033996T1 (ru)
TR (1) TR200001608T2 (ru)
TW (1) TWI239847B (ru)
WO (1) WO1999027944A1 (ru)

Families Citing this family (293)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997021728A1 (en) 1995-12-12 1997-06-19 Karolinska Innovations Ab PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US6703015B1 (en) 1999-09-03 2004-03-09 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Filamentous bacteriophage displaying an β-amyloid epitope
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20080050367A1 (en) * 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6743427B1 (en) 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US7179892B2 (en) * 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US7588766B1 (en) * 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
DE69942274D1 (de) * 1998-05-21 2010-06-02 Univ Tennessee Res Foundation Methoden zur amyloidentfernung mit anti-amyloid-antikörper
US7060670B1 (en) 1999-05-05 2006-06-13 Neurochem (International) Limited Stereoselective antifibrillogenic peptides and peptidomimetics thereof
CN1192799C (zh) 1999-05-13 2005-03-16 惠氏控股有限公司 佐剂组合制剂
AU2008203784B2 (en) * 1999-05-28 2012-01-19 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) * 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
AU2005202644B2 (en) * 1999-06-01 2009-03-05 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidogenic disease
PE20010212A1 (es) * 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
US6582945B1 (en) 1999-06-16 2003-06-24 Boston Biomedical Research Institute Immunological control of β-amyloid levels in vivo
IL142948A0 (en) * 1999-09-03 2002-04-21 Univ Ramot Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases
US7384640B1 (en) 1999-09-30 2008-06-10 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant
US20070135337A2 (en) * 1999-11-29 2007-06-14 Neurochem (International) Limited Vaccine for the Prevention and Treatment of Alzheimer's and Amyloid Related Diseases
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
EP1752472A3 (en) * 1999-12-08 2007-04-25 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
IL149976A0 (en) * 1999-12-08 2002-12-01 Mindset Biopharmaceuticals Usa Chimeric peptides as immunogens, antibodies thereto, and methods for immunization using chimeric peptides or antibodies
EP1259251B1 (en) * 2000-02-21 2005-10-19 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
CA2400838C (en) * 2000-02-21 2013-04-23 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
CZ306683B6 (cs) 2000-02-24 2017-05-03 Washington University Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci
US7485616B2 (en) 2000-04-05 2009-02-03 University Of Tennessee Research Foundation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
DE60108111T2 (de) 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
JP2003516929A (ja) * 2000-06-01 2003-05-20 ニユーララブ・リミテツド アミロイド形成性疾患の予防および治療
US7371920B2 (en) 2000-06-20 2008-05-13 The Governing Council Of The University Of Toronto Transgenic mouse model of neurodegenerative disorders
PT1292187E (pt) * 2000-06-20 2006-07-31 Univ Toronto Modelo animal transgenico de disturbios neurodegenerativos
JP5008244B2 (ja) 2000-06-23 2012-08-22 ワイス・ホールディングズ・コーポレイション 野性型およびキメラのインフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ）のアセンブリー
NZ523428A (en) * 2000-06-28 2008-03-28 Prana Biotechnology Ltd Neurotoxic oligomers
JP5362164B2 (ja) * 2000-07-07 2013-12-11 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー アルツハイマー病の予防及び治療
AU2007200047B2 (en) * 2000-07-07 2009-11-26 Bioarctic Neuroscience Ab Prevention and treatment of Alzheimer's disease
DK1317479T3 (da) * 2000-09-06 2009-11-23 Aventis Pharma Sa Fremgangsmåder og sammensætninger for sygdomme, der er associeret med amyloidosis
US20040038302A1 (en) * 2000-09-19 2004-02-26 Roger Nitsch Methods and compounds for treating brain amyloidosis
IL139308A0 (en) * 2000-10-26 2001-11-25 Marikovsky Moshe Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis
BR0115271A (pt) 2000-11-10 2005-12-13 Wyeth Corp Composição antigênica, método para incrementar a capacidade de uma composição antigênica em elicitar a resposta imunológica de um hospedeiro vertebrado, em elicitar linfócitos t citotóxicos em um hospedeiro vertebrado, em elicitar um efeito terapêutico ou profilático anti-câncer em um hospedeiro vertebrado, em moderar uma resposta alérgica em um hospedeiro vertebrado, e em prevenir ou tratar doença caracterizada por deposição amilóide em um hospedeiro vertebrado, e, formulação adjuvante
DE60141976D1 (de) 2000-11-29 2010-06-10 Univ Rochester Helfervirus-freie herpesvirus-amplifikatpartikel und deren verwendungen
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7118756B2 (en) 2000-12-28 2006-10-10 Wyeth Recombinant protective protein from Streptococcus pneumoniae
US7264810B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US6815175B2 (en) 2001-03-16 2004-11-09 Cornell Research Foundation, Inc. Anti-amyloid peptide antibody based diagnosis and treatment of a neurological disease or disorder
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2002088307A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
EP1385545B1 (en) 2001-04-30 2009-01-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide
US8092791B2 (en) 2001-05-23 2012-01-10 University Of Rochester Method of producing herpes simplex virus amplicons, resulting amplicons, and their use
US6906169B2 (en) 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
IL159209A0 (en) 2001-06-07 2004-06-01 Wyeth Corp Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant
KR100898648B1 (ko) 2001-06-07 2009-05-22 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 보조제로서 콜레라 홀로톡신의 돌연변이체 형태
US7829087B2 (en) 2001-07-09 2010-11-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cognitive impairment
JP4351043B2 (ja) 2001-07-09 2009-10-28 エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド アミロイド毒性の阻害方法
EP1519740A4 (en) * 2001-08-17 2005-11-09 Lilly Co Eli FASTER IMPROVEMENT OF COGNITION IN DISEASES ASSOCIATED WITH A-BETA
US20040192898A1 (en) * 2001-08-17 2004-09-30 Jia Audrey Yunhua Anti-abeta antibodies
CA2452104A1 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Use of antibodies having high affinity for soluble ass to treat conditions and diseases related to ass
US7771722B2 (en) * 2001-08-17 2010-08-10 Eli Lilly And Company Assay method for alzheimer's disease
PT1416965E (pt) * 2001-08-17 2008-04-01 Lilly Co Eli Método de ensaio para a doença de alzheimer
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030082191A1 (en) * 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
CA2466841A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University Synthetic immunogenic but non-deposit-forming polypeptides and peptides homologous to amyloid .beta., prion protein, amylin, .alpha.-synuclein, or polyglutamine repeats for induction of an immune response thereto
US20040052928A1 (en) 2002-09-06 2004-03-18 Ehud Gazit Peptides and methods using same for diagnosing and treating amyloid-associated diseases
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US20040001848A1 (en) * 2002-03-01 2004-01-01 Szu-Yi Chou Method of producing disease-specific antigens
EP1480666B1 (en) 2002-03-05 2012-06-13 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Immunizing composition and method for inducing an immune response against the beta-secretase cleavage site of amyloid precursor protein
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CA2493119A1 (en) * 2002-07-17 2004-01-22 Mindset Biopharmaceuticals Usa Inc. Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against alzheimer's disease
SI1524994T1 (sl) 2002-07-19 2011-08-31 Cytos Biotechnology Ag Sestavki cepiv, ki vsebujejo amiloidne beta 1-6 antigenske mreĹľe
AU2003256789A1 (en) 2002-08-13 2004-02-25 U.S. Department Of Veterans Affairs Method of detecting and preventing alzheimer's disease, particularly at prodromal and early stages
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US9535076B2 (en) 2002-09-12 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for eliciting an amyloid-selective immune response
JP2006516535A (ja) * 2002-09-12 2006-07-06 ザ、リージェンツ、オブ、ザ、ユニバーシティ、オブ、カリフォルニア 異なる配列のタンパク質から形成されたアミロイドに共通する高分子量凝集中間体に対して特異的な免疫原および対応する抗体
US20040146512A1 (en) * 2002-10-09 2004-07-29 Arnon Rosenthal Methods of treating Alzheimer's disease using antibodies directed against amyloid beta peptide and compositions thereof
US9034337B2 (en) 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8697082B2 (en) 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
CN100450551C (zh) * 2002-11-29 2009-01-14 中国医学科学院基础医学研究所 用于治疗和预防阿尔茨海默病的重组腺相关病毒基因疫苗及其用途
US20070010435A1 (en) 2002-12-19 2007-01-11 New York University Method for treating amyloid disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
CN1745175A (zh) * 2003-02-01 2006-03-08 神经实验室有限公司 自动免疫产生针对可溶性A－β的抗体
ES2344645T3 (es) 2003-02-10 2010-09-02 Applied Molecular Evolution, Inc. Moleculas de union al abeta.
JP5036302B2 (ja) * 2003-02-10 2012-09-26 ティオー − ビービービー ホールディング ベスローテン フェンノートシャップ 炎症状態下に血液脳関門で示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）に発現される核酸
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
US20060251675A1 (en) * 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
KR100546066B1 (ko) * 2003-03-21 2006-01-26 한국생명공학연구원 베타아밀로이드 유전자의 다중 연결체를 발현하는 형질전환 식물 세포 및 이로부터 배양된 식물
WO2004087733A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-14 New York University Prevention and treatment of alzheimer amyloid deposition
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
ES2246178B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
JP4888876B2 (ja) 2003-06-13 2012-02-29 田平 武 アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター
CA2530927A1 (en) 2003-06-30 2005-01-06 Tel Aviv University Future Technology Development L.P. Peptides antibodies directed thereagainst and methods using same for diagnosing and treating amyloid-associated diseases
WO2005014041A2 (en) * 2003-07-24 2005-02-17 Novartis Ag Use of an amyloid beta dna vaccine for the treatment and/or prevention of amyloid diseases
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
EP1682171A4 (en) * 2003-11-07 2008-02-27 Univ Rochester COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING NEUROLOGICAL ILLNESSES
US7674599B2 (en) 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
PT2336147E (pt) * 2003-12-17 2014-07-16 Janssen Alzheimer Immunotherap Conjugados transportadores de péptidos beta imunogénicos e seus processos de produção
US20050225165A1 (en) * 2004-04-13 2005-10-13 Naik Sanjeev M Brake by-wire control system
WO2005102385A1 (en) 2004-04-26 2005-11-03 Innate Pharma Adjuvant composition and methods for its use
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
KR101347105B1 (ko) * 2004-06-25 2014-01-02 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 신경계 장애의 예방을 위한 조성물 및 방법
US7955812B2 (en) 2004-07-19 2011-06-07 The General Hospital Corporation Methods of diagnosing alzheimer's disease by detecting antibodies to cross-linked β-amyloid oligomers
US7807165B2 (en) 2004-07-30 2010-10-05 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
CN101080421A (zh) 2004-08-11 2007-11-28 三菱化学株式会社 抗体以及其利用
ZA200703561B (en) * 2004-10-05 2009-09-30 Wyeth Corp Methods and compositions for improving recombinant protein production
WO2006044666A2 (en) * 2004-10-15 2006-04-27 Northeastern University Detection of disease associated proteolysis by direct mass spectrometry analysis of low molecular weight peptides
GB0424563D0 (en) 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
AR052051A1 (es) 2004-12-15 2007-02-28 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion
TW200635608A (en) * 2004-12-15 2006-10-16 Neuralab Ltd Aβ antibodies for use in improving cognition
CA2593846A1 (en) * 2005-01-14 2006-08-10 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for inhibiting drusen formation and for diagnosing or treating drusen-related disorders
CA2589860A1 (en) 2005-01-24 2006-08-03 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
JP2008528638A (ja) * 2005-01-28 2008-07-31 ワイス ポリペプチドの安定化液体処方
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
CA2605957A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Dnavec Corporation Highly safe intranasally administrable gene vaccines for treating alzheimer's disease
JP4903159B2 (ja) * 2005-04-20 2012-03-28 ディナベック株式会社 アルツハイマー病の治療のための安全性に優れた鼻腔内投与可能遺伝子ワクチン
MY148086A (en) * 2005-04-29 2013-02-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
WO2006119352A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 University Of South Florida Method of treating cognitive decline and synaptic loss related to alzheimer's disease
CA2607868A1 (en) 2005-05-05 2006-11-16 Merck & Co., Inc. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
WO2006126682A1 (ja) * 2005-05-27 2006-11-30 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute アルツハイマー病の予防・治療用ワクチン
ES2402650T3 (es) * 2005-06-17 2013-05-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta
AU2006268293B2 (en) 2005-07-10 2011-03-17 Assia Spe, Llc Adaptive margin and band control
WO2007056401A1 (en) * 2005-11-09 2007-05-18 Merck & Co., Inc. Method for identifying modulators of osbp useful for treating alzheimer's disease
EP1963369B1 (en) * 2005-11-28 2013-05-15 Zymogenetics, Inc. Il-21 antagonists
JP2009517406A (ja) * 2005-11-28 2009-04-30 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｉｌ−２１受容体アンタゴニスト
DK1954718T3 (en) 2005-11-30 2014-12-15 Abbvie Inc Anti-A-globulomer antibodies antigenbindingsgrupper thereof, corresponding hybridomas, nucleic acids, vectors, host cells, methods for producing said antibodies,
EP1976877B2 (en) 2005-11-30 2016-10-05 AbbVie Inc. Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
WO2007067512A2 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Merck & Co., Inc. Method for identifying modulators of adprh useful for treating alzheimer's disease
MX358175B (es) * 2005-12-12 2018-08-08 Ac Immune Sa Anticuerpos monoclonales especificos 1-42 beta con propiedades terapeuticas.
TWI382990B (zh) 2005-12-12 2013-01-21 Hoffmann La Roche 可變區域抗體之糖化
CA2638775A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-30 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Peptide vaccine for inducing production of anti-amyloid-.beta.-peptide antibody
ATE492561T1 (de) 2006-03-23 2011-01-15 Bioartic Neuroscience Ab Verbesserte protofibrilselektive antikörper und deren verwendung
WO2009017467A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
US7479550B2 (en) 2006-06-02 2009-01-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Amyloid β gene vaccines
WO2008011348A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
WO2008021296A2 (en) * 2006-08-14 2008-02-21 Thymon, L.L.C. Compositions and methods for the treatment and prophylaxis of alzheimer's disease
MX2009003542A (es) * 2006-10-12 2009-04-15 Wyeth Corp Metodos y composiciones con opalescencia reducida.
US8188046B2 (en) * 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US20080214987A1 (en) 2006-12-22 2008-09-04 Nanomed Devices, Inc. Microdevice And Method For Transdermal Delivery And Sampling Of Active Substances
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
KR101735257B1 (ko) 2007-01-05 2017-05-12 유니버시티 오브 취리히 질환 특이적 결합 분자 및 표적을 제공하는 방법
IL199534A (en) 2007-01-05 2013-01-31 Univ Zuerich An isolated human antibody capable of detecting a neoepitope in a disease-related protein, a polynucleotide encoding an antibody, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or vector, a preparation containing the antibody and related methods and uses.
DK2104682T3 (en) 2007-01-11 2017-01-16 Michael Bacher DIAGNOSIS AND TREATMENT OF ALZHEIMER'S AND OTHER DEMENTIA DISEASES
ES2535641T3 (es) 2007-01-18 2015-05-13 Eli Lilly & Company Amiloide beta Fab pegilado
US8147833B2 (en) 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2583978B1 (en) 2007-02-23 2016-04-06 Prothena Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2486928A1 (en) 2007-02-27 2012-08-15 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US7618944B2 (en) * 2007-03-01 2009-11-17 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
NZ579310A (en) 2007-03-01 2012-03-30 Probiodrug Ag Use of glutaminyl cyclase inhibitors for the treatment of mild cognitive impairment and diagnostic purposes thereof
EP2142514B1 (en) 2007-04-18 2014-12-24 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
JP2011526240A (ja) * 2007-04-18 2011-10-06 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー 脳アミロイド血管症の予防および治療
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
EP2012122A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
JP2010528583A (ja) * 2007-06-11 2010-08-26 エーシー イミューン ソシエテ アノニム アミロイドβに対するヒト化抗体
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
EP2170389B1 (en) * 2007-06-12 2014-10-29 AC Immune S.A. Humanized antibodies to amyloid beta
ES2466916T3 (es) 2007-06-27 2014-06-11 Admune Therapeutics Llc Complejos de IL-15 e IL-15R alfa y usos de los mismos
AU2008303023B2 (en) 2007-09-27 2014-01-09 Immunovaccine Technologies Inc. Use of liposomes in a carrier comprising a continuous hydrophobic phase for delivery of polynucleotides in vivo
EP2205631B1 (en) * 2007-10-05 2016-11-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for diagnosis and treatment of amyloidosis
SG178809A1 (en) * 2007-10-05 2012-03-29 Genentech Inc Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
CA2701793C (en) 2007-10-05 2017-04-25 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
JO3076B1 (ar) * 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
WO2009057664A1 (ja) * 2007-10-29 2009-05-07 Mitsubishi Chemical Corporation 抗体及びその利用
CA2707026C (en) * 2007-12-07 2017-04-11 Zymogenetics, Inc. Anti-human il-21 monoclonal antibodies
EP2261254A3 (en) 2007-12-21 2011-04-13 Amgen, Inc Anti-amyloid antibodies and uses thereof
WO2009090650A2 (en) * 2008-01-16 2009-07-23 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Vaccine for alzheimer's disease
US20110070298A1 (en) * 2008-06-05 2011-03-24 Immunovaccine Technologies Inc. Compositions Comprising Liposomes, An Antigen, A Polynucleotide and A Carrier Comprising a Continuous Phase of a Hydrophobic Substance
JP5699081B2 (ja) * 2008-09-05 2015-04-08 アイ ディー バイオメディカル コーポレーション オブ ケベック 新規の組成物及びアジュバント
US20110263450A1 (en) * 2008-09-26 2011-10-27 The University Of Melbourne Alzheimer's disease biomarkers
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
CN102272301A (zh) * 2008-10-31 2011-12-07 生物载体株式会社 用于治疗阿尔茨海默病的载体
RU2478396C2 (ru) 2008-11-05 2013-04-10 ВАЙЕТ ЭлЭлСи МНОГОКОМПОНЕНТНАЯ ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗВАННОГО β-ГЕМОЛИТИЧЕСКИМИ СТРЕПТОКОККАМИ (БГС)
EP2949666B1 (en) 2008-12-19 2018-12-19 Biogen International Neuroscience GmbH Human anti-alpha-synuclein antibodies
US8614297B2 (en) * 2008-12-22 2013-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide
US9925282B2 (en) 2009-01-29 2018-03-27 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
AU2010221418B2 (en) 2009-03-02 2015-06-04 Dignity Health Diagnostic devices and methods of use
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
JP5883384B2 (ja) 2009-08-13 2016-03-15 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー 免疫機能を調節する方法
CA2772488C (en) 2009-09-11 2018-04-17 Probiodrug Ag Heterocyclic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
US9757398B2 (en) 2010-02-20 2017-09-12 Euroespes Biotecnnologia, S.L. Prevention and treatment of alzheimer's disease by amyloid beta peptide and sphin-gosine-1-phosphate
PE20130527A1 (es) 2010-03-03 2013-05-09 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a a-beta biparatopicos
SG183854A1 (en) * 2010-03-03 2012-10-30 Univ British Columbia Oligomer-specific amyloid beta epitope and antibodies
US9181233B2 (en) 2010-03-03 2015-11-10 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase
US8269019B2 (en) 2010-03-10 2012-09-18 Probiodrug Ag Inhibitors
CA2796339C (en) 2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
EP2560953B1 (en) 2010-04-21 2016-01-06 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2576617B1 (en) 2010-06-04 2016-04-27 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts Universitätsmedizin MONOCLONAL ANTIBODIES TARGETING Aß OLIGOMERS
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
WO2012020124A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Ac Immune S.A. Vaccine engineering
US9062101B2 (en) 2010-08-14 2015-06-23 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
ES2639035T3 (es) 2010-08-23 2017-10-25 Wyeth Llc Formulaciones estables de antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis
RU2546873C2 (ru) 2010-09-10 2015-04-10 УАЙТ ЭлЭлСи Нелипидизированные варианты антигенов neisseria meningitidis orf2086
CA2817973C (en) 2010-10-15 2019-06-25 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind amyloid oligomers
AR083561A1 (es) 2010-10-26 2013-03-06 Ac Immune Sa Preparacion de una construccion antigenica
MX2013005413A (es) 2010-11-15 2014-02-27 Univ Ramot Analogos de dipeptidos para el tratamiento de afecciones asociadas con la formacion de fibrillas amiloides.
JP6050264B2 (ja) 2011-03-16 2016-12-21 プロビオドルグ エージー グルタミニルシクラーゼの阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体
RU2473133C2 (ru) * 2011-03-30 2013-01-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Осетинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития РФ Способ профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных
EP2691393B1 (en) 2011-03-31 2016-09-14 Pfizer Inc Novel bicyclic pyridinones
BR112013030963B1 (pt) * 2011-06-01 2020-12-01 Xiamen University proteína de fusão, polinucleotídio, constructo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica ou vacina, uso da proteína de fusão, método para modificar uma proteína alvo para melhorar sua imunogenicidade e uso do fragmento de crm197 ou um fragmento do mesmo
WO2012172449A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Pfizer Inc. Lactams as beta secretase inhibitors
PT2723379T (pt) 2011-06-23 2018-11-14 Univ Of Zuerich Moléculas de ligação anti-alfa-sinucleína
WO2013012811A2 (en) 2011-07-19 2013-01-24 New York University Immunotherapeutic modulation of amyloidogenic disease using non-fibrillogenic, non-amyloidogenic polymerized proteins and peptides
WO2013013056A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 New York University Method for treating amyloid disease
CN102895659B (zh) * 2011-07-29 2014-10-29 复旦大学 一种防治老年痴呆症复合疫苗及其制备方法
US20150065449A1 (en) 2011-08-12 2015-03-05 Florida State University Research Foundation, Inc. Treating Amyloidoses With A Vitamin B12 Composition Including Melatonin, Resveratrol, and EGCG
US20150065448A1 (en) * 2011-08-12 2015-03-05 The Florida State University Research Foundation Inc. Methods of treating amyloidoses with vitamin b12 and diagnostic test for detecting the presence of amyloid-beta peptides
EP2751116B1 (en) 2011-08-31 2016-10-12 Pfizer Inc Hexahydropyrano [3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
PL2579042T3 (pl) 2011-10-04 2014-12-31 Affiris Ag Sposób wykrywania przeciwciał swoistych wobec Aß w próbce biologicznej
CA2853100A1 (en) * 2011-10-24 2013-05-02 Intellect Neurosciences, Inc. Compositions and methods for treatment of proteinopathies
JP2012102131A (ja) * 2012-01-05 2012-05-31 Elan Pharma Internatl Ltd アミロイド形成性疾患の予防および治療
AU2013229063B2 (en) 2012-03-09 2016-10-06 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
ES2585262T3 (es) 2012-05-04 2016-10-04 Pfizer Inc Compuestos heterocíclicos de hexahidropiran[3,4-d][1,3]tiazin-2-amina sustituidos como inhibidores de PPA, BACE1 y BACE2
ES2637245T3 (es) 2012-06-29 2017-10-11 Pfizer Inc. Nuevas 4-(amino sustituido)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas como inhibidores de LRRK2
EP2897964A1 (en) 2012-09-20 2015-07-29 Pfizer Inc. Alkyl-substituted hexahydropyrano [3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
UA110688C2 (uk) 2012-09-21 2016-01-25 Пфайзер Інк. Біциклічні піридинони
US10058530B2 (en) 2012-10-25 2018-08-28 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders
JP6499077B2 (ja) 2012-10-25 2019-04-10 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション アルツハイマー病と関連疾患の治療のための併用療法
US9295393B2 (en) 2012-11-09 2016-03-29 Elwha Llc Embolism deflector
EP2931731A1 (en) 2012-12-11 2015-10-21 Pfizer Inc. Hexahydropyrano [3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds as inhibitors of bace1
WO2014097038A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Pfizer Inc. CARBOCYCLIC- AND HETEROCYCLIC-SUBSTITUTED HEXAHYDROPYRANO[3,4-d][1,3]THIAZIN-2-AMINE COMPOUNDS
AU2014203873A1 (en) 2013-01-07 2015-07-30 Biomedical Research Models, Inc. Therapeutic vaccines for treating herpes simplex virus type 2 infections
EP2956458B1 (en) 2013-02-13 2017-08-09 Pfizer Inc Heteroaryl-substituted hexahydropyrano[3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
US9233981B1 (en) 2013-02-15 2016-01-12 Pfizer Inc. Substituted phenyl hexahydropyrano[3,4-d][1,3]thiazin-2-amine compounds
PE20151332A1 (es) 2013-02-19 2015-09-20 Pfizer Compuestos de azabencimidazol
EP2964665B1 (en) 2013-03-08 2018-08-01 Pfizer Inc Immunogenic fusion polypeptides
WO2014159614A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Flow Pharma, Inc. Adjuvant and antigen particle formulation
US9102752B2 (en) 2013-03-15 2015-08-11 United Biomedical, Inc. Peptide vaccine for prevention and immunotherapy of dementia of the Alzheimer's type
EP2787347A1 (en) 2013-04-03 2014-10-08 Affiris AG Method for detecting Aß-specific antibodies in a biological sample
US10525005B2 (en) 2013-05-23 2020-01-07 The General Hospital Corporation Cromolyn compositions and methods thereof
EP3027205A4 (en) 2013-07-28 2017-07-19 Qantu Therapeutics, Inc. Vaccine formulations that induce a th2 immune response
KR20210002757A (ko) 2013-09-08 2021-01-08 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
WO2015049616A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Pfizer Inc. Novel bicyclic pyridinones as gamma-secretase modulators
CN106102737B (zh) 2013-10-22 2019-06-14 综合医院公司 色甘酸衍生物以及成像和治疗的相关方法
WO2015092592A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Pfizer Inc. Novel 3,4-disubstituted-1h-pyrrolo[2,3-b]pyridines and 4,5-disubstituted-7h-pyrrolo[2,3-c]pyridazines as lrrk2 inhibitors
BR112016022519A8 (pt) 2014-04-01 2018-03-06 Pfizer cromeno e 1,1a,2,7b-tetra-hidrociclopropa[c]cromeno piridopirazinadionas como moduladores de gama-secretase
CR20160455A (es) 2014-04-10 2016-12-16 Pfizer 2-AMINO-6-METIL-4,4a,5,6-TETRAHIDROPIRANO[3,4-d][1,3]TIAZIN-8a(8H)-IL-1,3-TIAZOL-4-ILA
DK3137094T3 (da) 2014-04-29 2023-02-27 Advantage Therapeutics Inc Behandling og forebyggelse af alzheimers sygdom (ad)
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
WO2015165964A1 (en) * 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
WO2015165971A1 (en) * 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
SI3137093T1 (en) * 2014-04-29 2018-01-31 Affiris Ag Treatment and prevention of Alzheimer's disease
KR101892837B1 (ko) * 2014-06-17 2018-08-28 아카데미아 시니카 B 림프구 상에서 CD23을 가교시키지만 비만 세포는 감작하지 않는 인간화된 항-IgE 항체
JO3537B1 (ar) 2014-07-10 2020-07-05 Bioarctic Neuroscience Ab أجسام مضادة لييفية أولية لاميلويد بيتا الببتيد ab المحسنة
JP6713982B2 (ja) 2014-07-24 2020-06-24 ファイザー・インク ピラゾロピリミジン化合物
KR102061952B1 (ko) 2014-08-06 2020-01-02 화이자 인코포레이티드 이미다조피리다진 화합물
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
KR102000382B1 (ko) 2015-02-03 2019-07-15 화이자 인코포레이티드 신규 시클로프로파벤조푸라닐 피리도피라진디온
RU2723045C2 (ru) 2015-02-19 2020-06-08 Пфайзер Инк. Композиции neisseria meningitidis и способы их получения
CA2989456C (en) 2015-06-17 2022-01-04 Pfizer Inc. Tricyclic compounds and their use as phosphodiesterase inhibitors
EP4074730A1 (en) 2015-06-24 2022-10-19 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity
CN108137586B (zh) 2015-09-14 2021-04-13 辉瑞大药厂 作为LRRK2抑制剂的新颖咪唑并[4,5-c]喹啉和咪唑并[4,5-c][1,5]萘啶衍生物
WO2017051303A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Pfizer Inc. Tetrahydropyrano[3,4-d][1,3]oxazin derivatives and their use as bace inhibitors
EP3353174A1 (en) 2015-09-24 2018-08-01 Pfizer Inc N-[2-(3-amino-2,5-dimethyl-1,1-dioxido-5,6-dihydro-2h-1,2,4-thiadiazin-5-yl)-1,3-thiazol-4-yl]amides useful as bace inhibitors
BR112018003489A2 (pt) 2015-09-24 2018-09-25 Pfizer n-[2-(2-amino-6,6-dissubstituído-4,4a,5,6-tetra-hidropirano[3,4-d][1,3]tiazin-8a(8h)-il)-1,3-tiazol-4-il]amidas
NZ741067A (en) 2015-10-02 2023-07-28 Hoffmann La Roche Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
EP3374381A4 (en) * 2015-11-09 2019-05-15 The University Of British Columbia EPITAOPES IN THE CENTRAL REGION OF BETA-AMYLOID AND RELATED CONFORMATIONAL ANTIBODIES
JP7452829B2 (ja) * 2015-11-09 2024-03-19 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア アミロイドベータのエピトープおよびそれに対する抗体
EP3374379A4 (en) 2015-11-09 2019-05-15 The University Of British Columbia N-TERMINAL EPITOPES IN BETA-AMYLOID AND CONFORMATIONALLY SELECTIVE ANTIBODIES THEREOF
RU2719599C2 (ru) 2016-02-23 2020-04-21 Пфайзер Инк. Соединения 6, 7-дигидро-5H-пиразоло[5,1-b][1,3]оксазин-2-карбоксамида
JP7046018B2 (ja) 2016-07-01 2022-04-01 ファイザー・インク 神経性疾患および神経変性疾患を処置するための５，７－ジヒドロピロロピリジン誘導体
US20190240194A1 (en) 2016-08-31 2019-08-08 The General Hospital Corporation Macrophages/microglia in neuro-inflammation associated with neurodegenerative diseases
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
IL303108B1 (en) 2017-01-31 2024-03-01 Pfizer NEISSERIA MENINGITIDIS preparations and methods therefor
ES2910083T3 (es) 2017-03-10 2022-05-11 Pfizer Derivados de imidazo[4,5-c]quinolina cíclicos sustituidos
JP7219223B2 (ja) 2017-03-10 2023-02-07 ファイザー・インク ＬＲＲＫ２阻害剤としての新規のイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン誘導体
RU2678987C2 (ru) 2017-04-28 2019-02-05 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" Пептид для лечения болезни альцгеймера
WO2018226992A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Adrx, Inc. Tau aggregation inhibitors
KR20200013783A (ko) 2017-06-22 2020-02-07 화이자 인코포레이티드 디히드로-피롤로-피리딘 유도체
US11209638B2 (en) * 2017-07-05 2021-12-28 West Virginia University Systems and methods for supporting and positioning body tissue samples in a microscope
CA3070386A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 Aztherapies, Inc. Powdered formulations of cromolyn sodium and ibuprofen
US11453701B2 (en) 2017-08-18 2022-09-27 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
CA3073066A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Biogen Ma Inc. Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies
PL3461819T3 (pl) 2017-09-29 2020-11-30 Probiodrug Ag Inhibitory cyklazy glutaminylowej
EP4219464A1 (en) 2018-03-23 2023-08-02 Pfizer Inc. Piperazine azaspiro derivaves
JP2021529771A (ja) 2018-07-02 2021-11-04 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション クロモリンナトリウムおよびα−ラクトースの粉末製剤
TW202208409A (zh) 2020-05-19 2022-03-01 愛爾蘭商歐薩爾普羅席納有限公司 用於治療阿茲海默症之多抗原決定基疫苗

Family Cites Families (433)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US589566A (en) * 1897-09-07 meevten
US6096318A (en) 1973-05-07 2000-08-01 The Ohio State University Antigenically modified HCG polypeptides
JPS57212347A (en) * 1981-06-25 1982-12-27 Nissan Motor Co Ltd Air-fuel ratio control system
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5158769A (en) 1984-03-07 1992-10-27 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5417986A (en) 1984-03-16 1995-05-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
IT1190383B (it) * 1985-08-01 1988-02-16 Eniricerche Spa Sostanze peptidominetiche ad azione ipotensiva
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4713366A (en) * 1985-12-04 1987-12-15 The Ohio State University Research Foundation Antigenic modification of polypeptides
US5096706A (en) * 1986-03-25 1992-03-17 National Research Development Corporation Antigen-based treatment for adiposity
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) * 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5278049A (en) * 1986-06-03 1994-01-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Recombinant molecule encoding human protease nexin
US5231170A (en) * 1986-08-27 1993-07-27 Paul Averback Antibodies to dense microspheres
US5223482A (en) 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5187153A (en) * 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US5220013A (en) * 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US4879213A (en) 1986-12-05 1989-11-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse
US4818397A (en) * 1986-12-22 1989-04-04 Sundstrand Corporation Shut-off valve seal
DE3702789A1 (de) 1987-01-30 1988-08-18 Bayer Ag Vorlaeuferprotein des apc-polypeptids, dafuer codierende dna und diagnostische verwendung der dna und des proteins
US4912206A (en) * 1987-02-26 1990-03-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CDNA clone encoding brain amyloid of alzheimer's disease
DE3883899T3 (de) * 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4883666A (en) 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5245015A (en) 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5583112A (en) 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5571500A (en) * 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens
US5571499A (en) * 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
WO1988010120A1 (en) 1987-06-24 1988-12-29 Brigham And Women's Hospital Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens
US5645820A (en) * 1987-06-24 1997-07-08 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5869054A (en) * 1987-06-24 1999-02-09 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens
US5641474A (en) * 1987-06-24 1997-06-24 Autoimmune, Inc. Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5849298A (en) 1987-06-24 1998-12-15 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin
US4912208A (en) * 1987-06-29 1990-03-27 Abbott Laboratories Fluorophores for encapsulation into liposomes
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US4966753A (en) 1987-08-18 1990-10-30 Molecular Rx, Inc. Immunotherapeutic methods and compositions employing antigens characteristic of malignant neoplasms
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5231000A (en) * 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
CA1339014C (en) 1987-10-08 1997-03-25 Ronald E. Majocha Antibodies to a4 amyloid peptide
AU2728588A (en) 1987-10-23 1989-05-23 Genetics Institute Inc. Composition and method for treating cancers characterized by over-expression of the c-fms proto-oncogene
US5089603A (en) * 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
WO1989006689A1 (en) 1988-01-13 1989-07-27 The Mclean Hospital Corporation Genetic constructs containing the alzheimer brain amyloid gene
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5576184A (en) * 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
US5098706A (en) * 1988-11-01 1992-03-24 The Regents Of The University Of California Juvenile hormone esterase for insect control
EP0442926A1 (en) 1988-11-10 1991-08-28 Imperial Cancer Research Technology Limited Polypeptides
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5227159A (en) 1989-01-31 1993-07-13 Miller Richard A Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies
US5262332A (en) 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
AU5439790A (en) 1989-04-14 1990-11-16 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Cerebrovascular amyloid protein-specific monoclonal antibody sv17-6e10
AU5525090A (en) 1989-04-14 1990-11-16 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Monoclonal antibody to amyloid peptide
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE69033487T2 (de) 1989-12-20 2000-06-29 Autoimmune Inc Behandlung von autoimmunkrankheiten durch verabreichung von autoantigenen in form von aerosol
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
CA2050918A1 (en) 1990-01-12 1991-07-13 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
JPH05508621A (ja) 1990-03-02 1993-12-02 オートイミューン　インク 自己抗原の経口投与による自己免疫疾患のダウンコントロール
GB9005705D0 (en) 1990-03-14 1990-05-09 Health Lab Service Board Particle manipulation
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
EP0451700A1 (en) 1990-04-10 1991-10-16 Miles Inc. Recombinant APP minigenes for expression in transgenic mice as models for Alzheimers's disease
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0527823A1 (en) * 1990-04-24 1993-02-24 The Regents Of The University Of California Purification, detection and methods of use of protease nexin-2
US5753624A (en) 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
GB9009548D0 (en) 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
DE69126304T2 (de) * 1990-04-27 1997-09-04 John Mcmichael Verfahren und zusammensetzung zur behandlung von erkrankungen des zns hervorgerufen durch abnormales beta-amyloid-protein
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
CA2084307A1 (en) 1990-06-01 1991-12-02 Cetus Oncology Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
AU646877B2 (en) * 1990-06-15 1994-03-10 Scios Nova Inc. Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
US5914109A (en) * 1990-06-15 1999-06-22 New York University Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to HIV-1
CA2085897A1 (en) 1990-06-19 1991-12-20 George Pieczenik Nonpathogenic variant virus
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
KR970005049B1 (ko) * 1990-07-16 1997-04-11 더 리젠츠 오브 더 유니벌시티 오브 캘리포니아 바쿨로비루스 발현 시스템, 이 벡터 시스템을 포함하는 이종성 무척추동물 숙주세포, 상기 시스템에 의해 생산되는 가용성의 정제된 야생형 망막아세포종 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드의 생산 방법
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
NZ239643A (en) 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
US5702906A (en) 1990-09-25 1997-12-30 Genentech, Inc. Antibodies to neurotrophic factor-4 (NT-4)
CA2092823A1 (en) 1990-09-28 1992-03-29 Barry D. Greenberg Transgenic animals with alzheimer's amyloid precursor gene
EP0553244B8 (en) * 1990-10-05 2005-06-08 Celldex Therapeutics, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
AU9023791A (en) 1990-10-15 1992-05-20 Brigham And Women's Hospital Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens
GB9023352D0 (en) * 1990-10-26 1990-12-05 Lynxvale Ltd Vaccinia vectors,vaccinia genes and expression products thereof
ES2335720T3 (es) 1991-01-21 2010-03-31 Elan Pharmaceuticals, Inc. Ensayo y modelo para la enfermedad de alzheimer.
WO1992015330A1 (fr) * 1991-03-01 1992-09-17 Rhône Merieux Procede d'immunoneutralisation anti-lhrh des animaux domestiques males non castres et peptide pour cela
DE4107857A1 (de) * 1991-03-12 1992-09-17 Thomae Gmbh Dr K Cyclische harnstoffderivate, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und verfahren zu ihrer herstellung
US5192753A (en) * 1991-04-23 1993-03-09 Mcgeer Patrick L Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia
CA2086831C (en) 1991-05-08 1999-03-16 Reinhard Gluck Immunostimulating and immunopotentiating reconstituted influenza virosomes and vaccines containing them
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
US5672805A (en) 1991-07-18 1997-09-30 The Regents Of The University Of California Transgenic mice expressing the neurotoxic C-terminus of β-amyloid precursor protein
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
JP2001524926A (ja) 1991-09-18 2001-12-04 アフィマックス テクノロジーズ ナームロゼ フェンノートシャップ オリゴマーの雑多ライブラリーの集合体を合成する方法
US5837268A (en) 1991-10-16 1998-11-17 University Of Saskatchewan GnRH-leukotoxin chimeras
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
CA2127450C (en) 1992-01-07 2007-04-17 Samuel Wadsworth Transgenic animal models for alzheimer's disease
US5679348A (en) * 1992-02-03 1997-10-21 Cedars-Sinai Medical Center Immunotherapy for recurrent HSV infections
AU685047B2 (en) 1992-02-11 1998-01-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
US5314813A (en) 1992-02-19 1994-05-24 Scripps Research Institute Drosophila cell lines expressing genes encoding MHC class I antigens and B2-microglobulin and capable of assembling empty complexes and methods of making said cell lines
BR9306042A (pt) 1992-02-28 1997-11-18 Autoimmune Inc Método para tratar uma doença auto-immune em um mamifero e formas de dosagens farmacêuticas oral e inalável
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0561087B1 (en) 1992-03-20 1999-08-04 N.V. Innogenetics S.A. Mutated form of the beta-amyloid precursor protein gene
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
US5441870A (en) * 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5851787A (en) * 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
GB9209118D0 (en) 1992-04-28 1992-06-10 Sb 120 Amsterdam Bv Vaccine compositions
CA2138137C (en) 1992-06-18 2004-11-09 R. John Collier Diphtheria toxin vaccines
ES2143716T3 (es) * 1992-06-25 2000-05-16 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna que contiene adyuvantes.
US6610493B1 (en) 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
US5766846A (en) * 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5837672A (en) * 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
WO1994001772A1 (en) 1992-07-13 1994-01-20 The Children's Medical Center Corporation SCREEN FOR ALZHEIMER'S DISEASE THERAPEUTICS BASED ON β-AMYLOID PRODUCTION
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US6680182B1 (en) 1992-07-31 2004-01-20 Acambis Research Limited Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria
BR9306984A (pt) * 1992-08-27 1999-01-12 Deakin Res Ltd Análogo de antígeno de peptídeo de um antígeno de peptídeo nativo vacina anticorpo processo para vacinar um hospedeiro necessitando deste tratamento estojo diagnóstico processos para preparar um análogo de um antiígeno de um antígeno de peptídeo nativo para preparar uma vacina para analisar uma amostra para um antígeno de peptídeo nativo e para analisar uma amostra para um anticorpo
FI96267C (sv) 1992-09-16 1996-06-10 Formit Foodprocessing Ab Oy Vals och maskin för skalning eller formning av potatis och liknande produkter
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
DE69311048T2 (de) * 1992-09-29 1997-12-11 Nippon Telegraph & Telephone Multi/Demultiplexer mit Gitter aus gruppierten Wellenleitern und zurückgefürten optischen Wegen
ATE244769T1 (de) 1992-10-01 2003-07-15 Univ Columbia Komplexe kombinatorische chemische banken, die mit markierungen versehen sind
WO1994009364A1 (en) 1992-10-13 1994-04-28 Duke University Method of inhibiting binding of amyloid precursor protein to beta-amyloid protein
PT1298436E (pt) 1992-10-26 2010-10-21 Lilly Co Eli Métodos para a identificação de compostos inibidores da libertação de péptido beta-amilóide (bap)
US5605811A (en) * 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
US5972336A (en) * 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
US5733647A (en) * 1992-11-05 1998-03-31 Polymer Innovations, Inc. Insole
US6210671B1 (en) * 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
ATE237357T1 (de) * 1993-01-22 2003-05-15 Sloan Kettering Inst Cancer Gangliosid-klh-konjugatimastoffe mit qs-21
US5955317A (en) * 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
EP0683234B2 (en) * 1993-01-25 2007-06-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody against beta-amyloid or their derivative and use thereof
US5750106A (en) * 1993-01-28 1998-05-12 Novartis Ag Human monoclonal antibodies to cytomegalovirus
US5989565A (en) * 1993-01-29 1999-11-23 University Of Pittsburgh Elution and identification of T cell epitopes from viable cells
US5358708A (en) 1993-01-29 1994-10-25 Schering Corporation Stabilization of protein formulations
US5472693A (en) * 1993-02-16 1995-12-05 The Dow Chemical Company Family of anti-carcinoembryonic antigen chimeric antibodies
DE614989T1 (de) * 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
CA2115900A1 (en) 1993-02-22 1994-08-23 Gerald W. Becker Pharmaceutical screens and antibodies
AU692152B2 (en) * 1993-03-17 1998-06-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
DE69433870T2 (de) * 1993-03-18 2005-06-30 Cytimmune Sciences, Inc. Zusammensetzung und methode zur reduktion der toxizität von biologisch-aktiven faktoren
EP0689454B2 (en) * 1993-03-23 2005-02-23 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a
CA2119090A1 (en) * 1993-03-26 1994-09-27 Wayne R. Gombotz Compositions for controlled release of biologically active tgf-.beta.
IT1270939B (it) 1993-05-11 1997-05-26 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili.
ES2150493T5 (es) 1993-05-25 2004-07-01 Wyeth Holdings Corporation Adyuvantes para vacunas contra el virus sincitico respiratorio.
AU7043894A (en) 1993-05-28 1994-12-20 Miriam Hospital, The Composition and method for (in vivo) imaging of amyloid deposits
ES2171454T3 (es) 1993-06-04 2002-09-16 Whitehead Biomedical Inst Proteinas de estres y sus usos.
US5464823A (en) * 1993-07-20 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Mammalian antibiotic peptides
JPH09500540A (ja) 1993-07-30 1997-01-21 メデヴァ ホールディングス ビー．ヴイ． ワクチン組成物
JPH08503490A (ja) 1993-08-18 1996-04-16 モルフォシス・ゲゼルシャフト・フュア・プロタインオプティミールング・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング リポ多糖結合性および中和能のあるペプチド
DK96493D0 (da) 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
WO1995005853A1 (en) 1993-08-26 1995-03-02 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides
AU707083B2 (en) 1993-08-26 1999-07-01 Bavarian Nordic Inc. Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign T-cell epitopes
FR2709247B1 (fr) * 1993-08-27 1995-09-29 Martin Jean Raymond Dispositif d'ancrage d'une instrumentation rachidienne sur une vertèbre.
WO1995006407A1 (en) 1993-08-30 1995-03-09 The Regents Of The University Of California Novel component of amyloid in alzheimer's disease and methods for use of same
ES2236693T3 (es) 1993-09-07 2005-07-16 Smithkline Beecham Corporation Anticuerpos recombinantes contra il4 utiles en el tratamiento de afecciones mediadas por il4.
US5652334A (en) * 1993-09-08 1997-07-29 City Of Hope Method for design of substances that enhance memory and improve the quality of life
US5385887A (en) 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
ES2318848T3 (es) * 1993-09-14 2009-05-01 Pharmexa Inc. Peptidos que se unen a pan dr para potenciar la respuesta inmunitaria.
US5415584A (en) 1993-09-21 1995-05-16 Tomco2 Equipment Company Particle blast cleaning apparatus
US5470951A (en) 1993-09-29 1995-11-28 City Of Hope Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein
US5858981A (en) * 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
WO1995011311A1 (en) 1993-10-20 1995-04-27 Duke University METHOD OF BINDING MATERIAL TO THE β-AMYLOID PEPTIDE
CA2172507C (en) 1993-10-22 2008-12-02 Jeffrey L. Cleland Methods and compositions for microencapsulation of antigens for use as vaccines
CA2175587A1 (en) 1993-11-02 1995-05-11 Jeffrey H. Sugarman Synthesizing and screening molecular diversity
US5744368A (en) * 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5434170A (en) * 1993-12-23 1995-07-18 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Method for treating neurocognitive disorders
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
JPH09511388A (ja) * 1994-01-27 1997-11-18 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ ミネソタ 進行性神経疾患を持つヒト以外のトランスジェニック哺乳類
US5877399A (en) * 1994-01-27 1999-03-02 Johns Hopkins University Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease
EP0802797A1 (en) * 1994-02-03 1997-10-29 The Picower Institute For Medical Research Compositions and methods for advanced glycosylation endproduct-mediated modulation of amyloidosis
AUPM411994A0 (en) * 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
CN1069667C (zh) 1994-02-28 2001-08-15 住友化学工业株式会社 聚烯烃系树脂组合物及树脂薄膜
US5795954A (en) 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
US6270757B1 (en) 1994-04-21 2001-08-07 Genetics Institute, Inc. Formulations for IL-11
US6372716B1 (en) 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
EP0758313A4 (en) 1994-05-06 1999-09-15 Pharmacopeia Inc COMBINATORIAL LIBRARY OF DIHYDROBENZOPYRANES
CA2191101C (en) 1994-05-25 2001-08-07 Ellis L. Kline Materials and methods for treatment of plaquing diseases
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US5798100A (en) * 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US6417178B1 (en) * 1994-07-19 2002-07-09 University Of Pittsburgh Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
NZ290089A (en) 1994-07-27 1999-05-28 Queensland Inst Med Res Recombinant polyepitope cytotoxic t lymphocyte (ctl) vaccines
EP0784684B8 (en) 1994-09-16 2008-03-26 Cancer Research Institute of Contra Costa RECOMBINANT PEPTIDES DERIVED FROM THE Mc3 ANTI-BA46 ANTIBODY, METHODS OF USE THEREOF, AND METHODS OF HUMANIZING ANTIBODY PEPTIDES
DE69508521T2 (de) * 1994-10-14 1999-10-07 Oriental Sangyo Co Ltd Elektrolytische Vorrichtung zur Herstellung von Kohlenstoff-Dioxyd
NL9401735A (nl) * 1994-10-19 1996-06-03 Crown Gear Bv Tandwieloverbrenging van een cilindrisch rondsel met een kroonwiel, het kroonwiel dat toegepast wordt in deze tandwieloverbrenging, een werkwijze volgens welke het kroonwiel gemaakt kan worden alsmede een gereedschap waarmee het kroonwiel gemaakt kan worden.
US5872005A (en) * 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors
JPH08137927A (ja) * 1994-11-07 1996-05-31 Hitachi Ltd 部品配置配線表示方法
US6114133A (en) * 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US5589154A (en) 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
US5688651A (en) 1994-12-16 1997-11-18 Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. Prevention of protein aggregation
AU695129B2 (en) * 1995-02-06 1998-08-06 Genetics Institute, Llc Formulations for IL-12
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US5624937A (en) 1995-03-02 1997-04-29 Eli Lilly And Company Chemical compounds as inhibitors of amyloid beta protein production
US5854215A (en) * 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
US6303567B1 (en) * 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5817626A (en) * 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
WO1996028471A1 (en) 1995-03-14 1996-09-19 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
EP0871755A1 (en) * 1995-03-23 1998-10-21 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Vectors for gene delivery
US5869046A (en) * 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
ATE274064T1 (de) 1995-05-23 2004-09-15 Morphosys Ag Multimere proteine
WO1996039176A1 (en) 1995-06-05 1996-12-12 Brigham & Women's Hospital USE OF ORAL TOLERANCE TO SUPPRESS BOTH Th1 AND Th2 IMMUNE RESPONSES AND TO SUPPRESS ANTIBODY PRODUCTION
US5948763A (en) 1995-06-07 1999-09-07 New York University Peptides and pharmaceutical compositions thereof for treatment of disorders or diseases associated with abnormal protein folding into amyloid or amyloid-like deposits
AU6264996A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Athena Neurosciences, Inc. Method for identifying alzheimer's disease therapeutics usin g transgenic animal models
IT1276680B1 (it) * 1995-06-08 1997-11-03 Oris Spa Processo di sintesi dell'1-piridiniopropan-3-solfonato
US5910427A (en) 1995-06-22 1999-06-08 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antigen non-specific glycosylation inhibiting factor derivatives
US5780361A (en) * 1995-06-23 1998-07-14 Nec Corporation Salicide process for selectively forming a monocobalt disilicide film on a silicon region
PT750907E (pt) * 1995-06-30 2002-08-30 American Cyanamid Co Formulacoes de vacinas estaveis para administracao parenterica metodo para a sua utilizacao e processo para a sua preparacao
EP1637600A1 (en) * 1995-07-07 2006-03-22 Darwin Molecular Corporation Chromosome 1 gene and gene products related to Alzheimer's disease
AUPN443995A0 (en) 1995-07-27 1995-08-17 Csl Limited Papillomavirus polyprotein
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
DE69621940T2 (de) 1995-08-18 2003-01-16 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
US5824322A (en) * 1995-08-21 1998-10-20 Cytrx Corporation Compositions and methods for growth promotion
BR9610580A (pt) 1995-09-14 2000-10-24 Univ California Anticorpos especìficos para prpse nativos
US5664823A (en) * 1995-09-18 1997-09-09 Ford Global Technologies, Inc. Instrument panel brace
US5731284A (en) 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
AU3804995A (en) 1995-10-10 1997-04-30 Novartis Ag Melanoma-associated protein
US5985242A (en) * 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
US5750361A (en) * 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
ES2203722T3 (es) 1995-11-10 2004-04-16 Elan Corporation, Plc Peptidos que faccilitan el transporte a traves de tejidos y metodos de identificarlos y usarlos.
WO1997018855A1 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Eduard Naumovich Lerner Device for enhanced delivery of biologically active substances and compounds in an organism
WO1997021728A1 (en) 1995-12-12 1997-06-19 Karolinska Innovations Ab PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
JPH09178743A (ja) 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性ａｐｐの定量法
US6015662A (en) 1996-01-23 2000-01-18 Abbott Laboratories Reagents for use as calibrators and controls
ZA97452B (en) 1996-01-25 1997-08-15 Trinity College Dublin Streptococcus equi vaccine.
US5770700A (en) 1996-01-25 1998-06-23 Genetics Institute, Inc. Liquid factor IX formulations
AU1832797A (en) 1996-01-26 1997-08-20 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The A polypeptide from lung extract which binds amyloid-beta peptide
GB9602294D0 (en) * 1996-02-05 1996-04-03 Zeneca Ltd Heterocyclic compounds
US6096313A (en) 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
WO1997032017A1 (en) 1996-02-26 1997-09-04 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Novel method for the identification of nucleic acid sequences encoding two or more interacting (poly)peptides
US6150091A (en) * 1996-03-06 2000-11-21 Baylor College Of Medicine Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia
US5870587A (en) * 1996-03-20 1999-02-09 International Business Machines Corporation Information-handling system, method, and article of manufacture including a mechanism for providing an improved application binary interface
JP4229341B2 (ja) 1996-03-23 2009-02-25 財団法人阪大微生物病研究会 破傷風毒素の機能的フラグメント抗原及び破傷風ワクチン
JP2000507449A (ja) * 1996-03-29 2000-06-20 ユニバーシティ オブ オタゴ パラポックスウイルスベクター
AU713067B2 (en) * 1996-04-03 1999-11-25 Anergen, Inc. Cyclic peptide vaccines for treatment and prevention of diabetes
JP2002506419A (ja) * 1996-04-19 2002-02-26 アメリカ合衆国 Ａ型肝炎ウイルスポリタンパク質の抗原反応性領域
US6284533B1 (en) * 1996-05-01 2001-09-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Plasmid-based vaccine for treating atherosclerosis
EP0938506B1 (en) 1996-07-16 2003-11-05 Plückthun, Andreas, Prof. Dr. Immunoglobulin superfamily domains and fragments with increased solubility
JP2000516090A (ja) 1996-07-26 2000-12-05 スローン―ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 遺伝子的免疫化のための方法と試薬
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
GB9617616D0 (en) 1996-08-22 1996-10-02 Osteometer Biotech As Assaying protein fragments in body fluids
CA2183901A1 (en) 1996-08-22 1998-02-23 Johanna E. Bergmann Targets for therapy and diagnosis of alzheimer's disease and down syndrome in humans
DK0929574T3 (da) 1996-08-27 2005-10-31 Praecis Pharm Inc Modulatorer af beta-amyloidpeptidaggregering, som omfatter D-aminosyrer
US6057367A (en) * 1996-08-30 2000-05-02 Duke University Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses
US6797495B2 (en) * 1996-11-05 2004-09-28 The Regents Of The University Of California Somatic cells with ablated PrP gene and methods of use
US6022859A (en) * 1996-11-15 2000-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibitors of β-amyloid toxicity
WO1998022120A1 (en) 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
US6962984B2 (en) 1996-12-05 2005-11-08 Nihon University IgA nephropathy-related DNA
US20030068316A1 (en) 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US6218506B1 (en) * 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998039303A1 (en) 1997-03-03 1998-09-11 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Small molecules useful in the treatment of inflammatory disease
US5798102A (en) 1997-03-04 1998-08-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Treatment of cardiomyopathy
US6611610B1 (en) * 1997-04-02 2003-08-26 Gentex Corporation Vehicle lamp control
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
WO1998044955A1 (en) 1997-04-09 1998-10-15 Mindset Ltd. Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, dna encoding and methods of use thereof
US20020086847A1 (en) * 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
PL194221B1 (pl) 1997-04-15 2007-05-31 Pharmexa As Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFalfa, dimery, oligomery lub multimery zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa, wyizolowana cząsteczka DNA, wektor, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa, szczepionki przeciwko TNFalfa oraz zastosowanie przynajmniej jednej zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa
US6787319B2 (en) * 1997-04-16 2004-09-07 American Home Products Corp. β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same
US5858205A (en) * 1997-05-13 1999-01-12 Uop Llc Multizone catalytic reforming process
AU7690898A (en) 1997-05-20 1998-12-11 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
EP0999853B1 (en) 1997-06-13 2003-01-02 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
AU8269898A (en) 1997-06-27 1999-01-19 Regents Of The University Of California, The Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor
IT1293511B1 (it) 1997-07-30 1999-03-01 Gentili Ist Spa Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati
WO1999006545A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation
WO1999006587A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
DE69840962D1 (de) 1997-08-29 2009-08-20 Antigenics Inc Adjuvant qs-21 enthaltende zusammensetzungen mit polysorbate oder cyclodextrin als hilfsmittel
US6175057B1 (en) 1997-10-08 2001-01-16 The Regents Of The University Of California Transgenic mouse model of alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy
US7588766B1 (en) * 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6923964B1 (en) 1997-12-02 2005-08-02 Neuralab Limited Active immunization of AScr for prion disorders
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6750324B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6913745B1 (en) * 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6743427B1 (en) * 1997-12-02 2004-06-01 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6710226B1 (en) * 1997-12-02 2004-03-23 Neuralab Limited Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics
JP2002511385A (ja) 1997-12-03 2002-04-16 ニューララブ リミテッド アルツハイマー病におけるβ−アミロイド関連変化を抑制する方法
HUP0004821A2 (hu) 1997-12-03 2001-06-28 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Lágy pellet alakjában lévő gyógyszerkészítmény és előállítása
FR2777015B3 (fr) 1998-02-23 2000-09-15 Financ De Biotechnologie Procede et moyens pour l'obtention de modeles cellulaires et animaux de maladies neurodegeneratives
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20050059591A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
JP2002512776A (ja) * 1998-04-28 2002-05-08 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 免疫原性の低下したモノクローナル抗体
NO314086B1 (no) 1998-05-08 2003-01-27 Gemvax As Peptider og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse, nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slike DNA-sekvenser samt anvendelse av disse for fremstilling avfarmasöytiske preparater til
EP1080110A2 (en) 1998-05-19 2001-03-07 Yeda Research And Development Co. Ltd. Use of activated t cells, nervous system-specific antigens for treating disorders of the nevrous system
US20030147882A1 (en) * 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
DE69942274D1 (de) 1998-05-21 2010-06-02 Univ Tennessee Res Foundation Methoden zur amyloidentfernung mit anti-amyloid-antikörper
US6432710B1 (en) 1998-05-22 2002-08-13 Isolagen Technologies, Inc. Compositions for regenerating tissue that has deteriorated, and methods for using such compositions
US6710228B1 (en) * 1998-05-29 2004-03-23 Mycogen Corporation Cotton cells, plants, and seeds genetically engineered to express insecticidal and fungicidal chitin binding proteins (lectins)
US6727349B1 (en) * 1998-07-23 2004-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Recombinant anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
EA003634B1 (ru) 1998-10-05 2003-08-28 Фармэкса А/С Новые способы терапевтической вакцинации
CA2354862A1 (en) * 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
US7112661B1 (en) 1998-10-30 2006-09-26 The Research Foundation Of State University Of New York Variable heavy chain and variable light chain regions of antibodies to human platelet glycoprotein Ib alpha
GB2348203B (en) 1998-11-04 2002-06-19 Imp College Innovations Ltd Solube beta-forms of prion proteins, methods of preparation and use
ES2216509T3 (es) 1999-01-19 2004-10-16 PHARMACIA &amp; UPJOHN COMPANY Procedimiento de envasado para sustancias medicinales sensibles a la oxidacion.
EP1146898A1 (en) 1999-01-22 2001-10-24 Matthew John During Vaccine-mediated treatment of neurological disorders
US7629311B2 (en) 1999-02-24 2009-12-08 Edward Lewis Tobinick Methods to facilitate transmission of large molecules across the blood-brain, blood-eye, and blood-nerve barriers
US7282570B2 (en) 1999-04-20 2007-10-16 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
ATE384077T1 (de) 1999-05-05 2008-02-15 Neurochem Int Ltd Stereoselektive antifibrillogene peptide
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
PE20010212A1 (es) 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
US6582945B1 (en) 1999-06-16 2003-06-24 Boston Biomedical Research Institute Immunological control of β-amyloid levels in vivo
JP2003503083A (ja) 1999-07-01 2003-01-28 サイオス，インコーポレーテッド アミロイド関連疾患の予防及び治療
WO2001005355A2 (en) 1999-07-15 2001-01-25 Genetics Institute, Inc. Formulations for il-11
ATE445639T1 (de) 1999-08-04 2009-10-15 Univ Southern California Globularer aufbau vom amyloid-beta- protein und deren verwendungen
IL142948A0 (en) 1999-09-03 2002-04-21 Univ Ramot Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases
US6294171B2 (en) 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
US20020094335A1 (en) 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
AU784312B2 (en) 1999-11-29 2006-03-09 Bellus Health (International) Limited Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
IL149976A0 (en) 1999-12-08 2002-12-01 Mindset Biopharmaceuticals Usa Chimeric peptides as immunogens, antibodies thereto, and methods for immunization using chimeric peptides or antibodies
US6399314B1 (en) * 1999-12-29 2002-06-04 American Cyanamid Company Methods of detection of amyloidogenic proteins
EP1259251B1 (en) 2000-02-21 2005-10-19 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
CA2400838C (en) * 2000-02-21 2013-04-23 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
CZ306683B6 (cs) 2000-02-24 2017-05-03 Washington University Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci
US6294221B1 (en) * 2000-03-08 2001-09-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for spray-coating with frequent changes between aqueous and non-aqueous coating agents inside a spray-coating chamber
US6548840B1 (en) * 2000-04-03 2003-04-15 Hrl Laboratories, Llc Monolithic temperature compensation scheme for field effect transistor integrated circuits
US7485616B2 (en) 2000-04-05 2009-02-03 University Of Tennessee Research Foundation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
AU5162201A (en) 2000-04-13 2001-10-30 Corixa Corporation Immunostimulant compositions comprising an aminoalkyl glucosaminide phosphate and qs-21
DE60108111T2 (de) * 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
JP5362164B2 (ja) 2000-07-07 2013-12-11 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー アルツハイマー病の予防及び治療
US20020009445A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-24 Yansheng Du Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
EP1172378A1 (en) 2000-07-12 2002-01-16 Richard Dr. Dodel Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US7199102B2 (en) * 2000-08-24 2007-04-03 The Regents Of The University Of California Orally administered peptides synergize statin activity
US20030092145A1 (en) * 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
DK1317479T3 (da) 2000-09-06 2009-11-23 Aventis Pharma Sa Fremgangsmåder og sammensætninger for sygdomme, der er associeret med amyloidosis
IT1319277B1 (it) 2000-10-24 2003-09-26 Chiesi Farma Spa Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer.
IL139308A0 (en) 2000-10-26 2001-11-25 Marikovsky Moshe Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis
WO2002064084A2 (en) 2000-11-02 2002-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. In vivo multiphoton diagnostic detection and imaging of a neurodegenerative disease
PT1346041E (pt) * 2000-11-27 2007-06-05 Praecis Pharm Inc Agentes terapêuticos e métodos para a sua utilização no tratamento de uma doença amiloidogénica.
PE20020574A1 (es) * 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
WO2002060920A2 (en) * 2000-12-27 2002-08-08 Board Of Regents, University Of Texas System Prion isomers, methods of making, methods of using, and compositions and products comprising prion isomers
US20020160394A1 (en) * 2001-01-24 2002-10-31 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
DE60121729T2 (de) * 2001-04-19 2007-11-29 Dr. Hermann Schätzl Prion Proteindimere für Impfungen
EP1385545B1 (en) 2001-04-30 2009-01-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide
WO2002088307A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
US6524624B1 (en) * 2001-05-16 2003-02-25 Alcide Corporation Two-part disinfecting systems and compositions and methods related thereto
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
GB0113179D0 (en) 2001-05-31 2001-07-25 Novartis Ag Organic compounds
US6888849B2 (en) * 2001-06-15 2005-05-03 Lucent Technologies Inc. Method for evaluating capacity utilization of a terminus in a communication system
AU2002345843A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-08 Panacea Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
JP4317010B2 (ja) 2001-07-25 2009-08-19 ピーディーエル バイオファーマ，インコーポレイティド ＩｇＧ抗体の安定な凍結乾燥医薬製剤
US20030135035A1 (en) 2001-08-09 2003-07-17 Mark Shannon Human ZZAP1 protein
CA2452104A1 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company Use of antibodies having high affinity for soluble ass to treat conditions and diseases related to ass
US20040192898A1 (en) 2001-08-17 2004-09-30 Jia Audrey Yunhua Anti-abeta antibodies
EP1519740A4 (en) 2001-08-17 2005-11-09 Lilly Co Eli FASTER IMPROVEMENT OF COGNITION IN DISEASES ASSOCIATED WITH A-BETA
US20030082191A1 (en) 2001-08-29 2003-05-01 Poduslo Joseph F. Treatment for central nervous system disorders
EP1435774B1 (en) 2001-09-10 2010-08-25 AntiCancer, Inc. Enhanced resolution of tumor metastasis
US6736142B2 (en) * 2001-09-13 2004-05-18 Gines Sanchez Gomez Protective tube and harness
US6907297B2 (en) 2001-09-28 2005-06-14 Ethicon, Inc. Expandable intracardiac return electrode and method of use
US6597198B2 (en) * 2001-10-05 2003-07-22 Intel Corporation Current mode bidirectional port with data channel used for synchronization
GB0124446D0 (en) * 2001-10-11 2001-12-05 Short Brothers Ltd Aircraft propulsive power unit
US7781413B2 (en) 2001-10-31 2010-08-24 Board Of Regents, The University Of Texas System SEMA3B inhibits tumor growth and induces apoptosis in cancer cells
WO2003039485A2 (en) 2001-11-08 2003-05-15 Protein Design Labs Stable liquid pharmaceutical formulation of igg antibodies
CA2466841A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University Synthetic immunogenic but non-deposit-forming polypeptides and peptides homologous to amyloid .beta., prion protein, amylin, .alpha.-synuclein, or polyglutamine repeats for induction of an immune response thereto
WO2003051374A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 New York State Office Of Mental Health SEQUESTRATION OF Aβ IN THE PERIPHERY IN THE ABSENCE OF IMMUNOMODULATING AGENT AS A THERAPEUTIC APPROACH FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF BETA-AMYLOID RELATED DISEASES
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US6688651B2 (en) * 2002-02-21 2004-02-10 Dmt Co., Ltd. Device for locking cap nut for coupling
EP1476120B1 (en) 2002-02-21 2010-09-29 Duke University Treatment methods using anti-cd22 antibodies
MY139983A (en) * 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
CA2390700C (en) * 2002-06-11 2004-09-07 Henry Tsang Illuminated soap bar with sound
GB0213437D0 (en) 2002-06-12 2002-07-24 Univ Cranfield Temporary tattoos: A novel vehicle for skin testing
US6892535B2 (en) * 2002-06-14 2005-05-17 Volvo Construction Equipment Holding Sweden Ab Hydraulic circuit for boom cylinder combination having float function
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
SI1524994T1 (sl) 2002-07-19 2011-08-31 Cytos Biotechnology Ag Sestavki cepiv, ki vsebujejo amiloidne beta 1-6 antigenske mreĹľe
WO2004013172A2 (en) 2002-07-24 2004-02-12 Innogenetics N.V. Fragments of beta-amyloid as targets for vaccination against alzheimer disease
JP2006508072A (ja) 2002-10-01 2006-03-09 ノースウエスタン ユニバーシティ アミロイドベータ由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬｓ）、ＡＤＤＬ代替物、ＡＤＤＬ結合性分子、およびそれらの使用
US20040080762A1 (en) * 2002-10-25 2004-04-29 Xerox Corporation Half-tone based enhancement of black
US20060019850A1 (en) * 2002-10-31 2006-01-26 Korzenski Michael B Removal of particle contamination on a patterned silicon/silicon dioxide using dense fluid/chemical formulations
FR2846667B1 (fr) 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
WO2004055164A2 (en) 2002-12-13 2004-07-01 Abgenix, Inc. System and method for stabilizing antibodies with histidine
US6787129B1 (en) 2003-01-13 2004-09-07 Zenitech Llc Castor polyester as gloss agents in anionic systems
CN1745175A (zh) 2003-02-01 2006-03-08 神经实验室有限公司 自动免疫产生针对可溶性A－β的抗体
ES2344645T3 (es) 2003-02-10 2010-09-02 Applied Molecular Evolution, Inc. Moleculas de union al abeta.
AU2004229335C1 (en) 2003-04-04 2010-06-17 Genentech, Inc. High concentration antibody and protein formulations
EP1480041A1 (en) 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2005002444A1 (en) 2003-07-07 2005-01-13 Agency For Science, Technology And Research Method and apparatus for extracting third ventricle information
WO2005014041A2 (en) 2003-07-24 2005-02-17 Novartis Ag Use of an amyloid beta dna vaccine for the treatment and/or prevention of amyloid diseases
US20060233788A1 (en) 2003-09-05 2006-10-19 Heiman Mark L Anti-ghrelin antibodies
CA2445743A1 (en) 2003-10-08 2005-04-08 The University Of British Columbia Methods for modulating neuronal responses
AU2003271174A1 (en) 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
PT2336147E (pt) 2003-12-17 2014-07-16 Janssen Alzheimer Immunotherap Conjugados transportadores de péptidos beta imunogénicos e seus processos de produção
SG182163A1 (en) 2003-12-17 2012-07-30 Wyeth Corp Immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
US20050214222A1 (en) 2004-02-13 2005-09-29 Mckinnon Stuart J In vivo imaging of amyloid plaques in glaucoma using intravenous injectable dyes
DK2653465T3 (da) 2004-03-15 2016-08-22 Janssen Pharmaceutica Nv Opioid-receptormodulatorer
AU2005270026A1 (en) 2004-07-02 2006-02-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of thioflavin radiolabeled derivatives in amyloid imaging for assessing anti-amyloid therapies
US7807165B2 (en) 2004-07-30 2010-10-05 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
US7328838B2 (en) * 2004-09-09 2008-02-12 Igt Counterfeit cashless instrument detection methods and systems
CN101035564A (zh) 2004-09-10 2007-09-12 惠氏公司 人源化的抗5t4抗体和抗5t4抗体/加利车霉素缀合物
ZA200703561B (en) 2004-10-05 2009-09-30 Wyeth Corp Methods and compositions for improving recombinant protein production
US20060160161A1 (en) 2004-10-26 2006-07-20 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing antibodies to neurodegenerative disease-associated antigens
US20060026911A1 (en) * 2004-11-18 2006-02-09 Sutton Adam F Footer track with moisture vent
WO2006066118A2 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Contextual fear test for predicting efficacy of alzheimer immunotherapeutic treatment
TW200635608A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Neuralab Ltd Aβ antibodies for use in improving cognition
AR052051A1 (es) 2004-12-15 2007-02-28 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion
WO2006066233A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited An immunoprecipitation-based assay for predicting in vivo efficacy of beta-amyloid antibodies
US7625560B2 (en) 2004-12-15 2009-12-01 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
JP2008528638A (ja) 2005-01-28 2008-07-31 ワイス ポリペプチドの安定化液体処方
CA2607868A1 (en) 2005-05-05 2006-11-16 Merck & Co., Inc. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
ES2402650T3 (es) 2005-06-17 2013-05-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta
WO2007011833A2 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Merck & Co., Inc. Spiropiperidine beta-secretase inhibitors for the treatment of alzheimer's disease
EP1951750A4 (en) 2005-11-10 2009-12-09 Roskamp Res Llc MODULATION OF THE ANGIOGENESIS BY A-BETA PEPTIDE FRAGMENTS
EA015654B9 (ru) 2006-03-30 2012-01-30 Глаксо Груп Лимитед Антитела против бета-амилоидного пептида
WO2009017467A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
WO2010044803A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic diseases
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
WO2008011348A2 (en) 2006-07-14 2008-01-24 Ac Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta
JP2010521651A (ja) 2007-03-12 2010-06-24 独立行政法人放射線医学総合研究所 脳内のアミロイド関連神経炎症の画像化
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
JP2011526240A (ja) 2007-04-18 2011-10-06 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー 脳アミロイド血管症の予防および治療
WO2011133919A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Janssen Alzheimer Immunotherapy Use of tau to monitor immunotherapy
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
PT2237803E (pt) 2007-12-28 2015-10-16 Prothena Biosciences Ltd Tratamento e profilaxia da amiloidose
TR201816335T4 (tr) 2008-09-18 2018-11-21 Cedars Sinai Medical Center Alzheimer hastalığının tespitine yönelik optik yöntem.
US20130084245A1 (en) 2010-02-25 2013-04-04 Wyeth Llc Pet monitoring of a-beta-directed immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999027944A9 (en) 1999-09-23
ES2310017T3 (es) 2008-12-16
ES2262460T1 (es) 2006-12-01
US20090191231A1 (en) 2009-07-30
KR100936419B1 (ko) 2010-01-12
EE200000379A (et) 2001-04-16
ATE435659T1 (de) 2009-07-15
JP4677334B2 (ja) 2011-04-27
US20040228865A1 (en) 2004-11-18
JP4677094B2 (ja) 2011-04-27
EE05377B1 (et) 2011-02-15
SI1033996T1 (sl) 2009-02-28
NO20002784L (no) 2000-07-31
SG111083A1 (en) 2005-05-30
DE69840922D1 (de) 2009-07-30
US8034348B2 (en) 2011-10-11
CY1109368T1 (el) 2014-07-02
WO1999027944A1 (en) 1999-06-10
CY1111370T1 (el) 2015-08-05
HUP0100627A1 (hu) 2001-06-28
US20080227718A1 (en) 2008-09-18
US20050163788A1 (en) 2005-07-28
US20050191314A1 (en) 2005-09-01
US20050249727A1 (en) 2005-11-10
US20050048049A1 (en) 2005-03-03
PL342649A1 (en) 2001-06-18
IL136252A0 (en) 2001-05-20
ID25504A (id) 2000-10-05
EP2305282A3 (en) 2011-05-18
GEP20053715B (en) 2005-12-26
DE69840969D1 (de) 2009-08-20
EA009283B1 (ru) 2007-12-28
HU228493B1 (en) 2013-03-28
DE06075479T1 (de) 2006-11-16
EP2305282A2 (en) 2011-04-06
PT1679080E (pt) 2009-09-10
TWI239847B (en) 2005-09-21
CA2312920A1 (en) 1999-06-10
US6946135B2 (en) 2005-09-20
SI2305282T1 (sl) 2013-10-30
CZ303137B6 (cs) 2012-04-25
NZ504569A (en) 2005-01-28
US20050196399A1 (en) 2005-09-08
JP2006131639A (ja) 2006-05-25
CY1108331T1 (el) 2014-02-12
ATE493149T1 (de) 2011-01-15
NO332813B1 (no) 2013-01-21
US20130058869A1 (en) 2013-03-07
EP1033996A4 (en) 2004-05-26
NO20092874L (no) 2000-07-31
HU228061B1 (en) 2012-09-28
ES2428740T3 (es) 2013-11-11
CA2312920C (en) 2016-07-12
DK2305282T3 (da) 2013-10-07
DE1033996T1 (de) 2001-06-07
HRP20000443A2 (en) 2000-10-31
NO331425B1 (no) 2011-12-27
US6972127B2 (en) 2005-12-06
EA200601132A1 (ru) 2007-02-27
EP1690547A1 (en) 2006-08-16
GEP20043319B (en) 2004-05-10
US20050037026A1 (en) 2005-02-17
EP1033996A1 (en) 2000-09-13
DE69839647D1 (de) 2008-08-07
US20080227719A1 (en) 2008-09-18
KR101248711B1 (ko) 2013-03-28
IL191904A (en) 2014-05-28
CZ20001706A3 (cs) 2000-11-15
US8535673B2 (en) 2013-09-17
DE69842082D1 (de) 2011-02-10
US20040171816A1 (en) 2004-09-02
HRP20000443B1 (en) 2009-11-30
SI1994937T1 (sl) 2011-04-29
AU1706199A (en) 1999-06-16
DK1679080T3 (da) 2009-09-28
ES2263408T1 (es) 2006-12-16
JP2002502802A (ja) 2002-01-29
CO4980846A1 (es) 2000-11-27
IL193245A0 (en) 2009-09-22
US20050031629A1 (en) 2005-02-10
KR20090078366A (ko) 2009-07-17
US20080096818A1 (en) 2008-04-24
NO328865B1 (no) 2010-06-07
SI1679080T1 (sl) 2009-12-31
EA200000608A1 (ru) 2000-12-25
US20050013815A1 (en) 2005-01-20
PT1994937E (pt) 2011-02-22
IL191904A0 (en) 2008-12-29
JP2010215651A (ja) 2010-09-30
ATE433760T1 (de) 2009-07-15
DK1994937T3 (da) 2011-02-07
DK1033996T3 (da) 2008-09-22
IL136252A (en) 2010-11-30
PE20001383A1 (es) 2000-11-25
EP1679080B1 (en) 2009-06-17
EP1679080A2 (en) 2006-07-12
MY134906A (en) 2007-12-31
BG104562A (en) 2001-01-31
BR9815357A (pt) 2000-10-24
ATE399016T1 (de) 2008-07-15
TR200001608T2 (tr) 2001-07-23
EP1679080A3 (en) 2006-07-19
NO20002784D0 (no) 2000-05-31
EP1994937A3 (en) 2008-12-24
HRP20090568A2 (hr) 2010-06-30
JP4677333B2 (ja) 2011-04-27
US20050019330A1 (en) 2005-01-27
PL202706B1 (pl) 2009-07-31
US8034339B2 (en) 2011-10-11
IL205298A0 (en) 2011-07-31
KR20120135915A (ko) 2012-12-17
US6808712B2 (en) 2004-10-26
PT1033996E (pt) 2008-10-02
EP2305282B1 (en) 2013-07-10
US20060029611A1 (en) 2006-02-09
US20140227274A1 (en) 2014-08-14
NO20100061L (no) 2000-07-31
KR20010032635A (ko) 2001-04-25
PT2305282E (pt) 2013-09-27
US20120276116A1 (en) 2012-11-01
EP1033996B1 (en) 2008-06-25
US20040171815A1 (en) 2004-09-02
EA200401473A1 (ru) 2005-04-28
AR020050A1 (es) 2002-04-10
PL202698B1 (pl) 2009-07-31
US20040170641A1 (en) 2004-09-02
US20050249725A1 (en) 2005-11-10
JP2006077030A (ja) 2006-03-23
CN100374151C (zh) 2008-03-12
DE06075704T1 (de) 2006-12-28
EP1994937B1 (en) 2010-12-29
IS5500A (is) 2000-05-17
ES2263408T3 (es) 2009-11-16
EP1690547B1 (en) 2009-07-08
HK1095265A1 (en) 2007-05-04
HK1094535A1 (en) 2007-04-04
US8642044B2 (en) 2014-02-04
US20060034858A1 (en) 2006-02-16
HUP0100627A3 (en) 2006-03-28
CN1281366A (zh) 2001-01-24
US7014855B2 (en) 2006-03-21
SA99191269B1 (ar) 2006-03-15
EP1994937A2 (en) 2008-11-26
US20050019343A1 (en) 2005-01-27
US20050142132A1 (en) 2005-06-30
US6982084B2 (en) 2006-01-03
US20050191292A1 (en) 2005-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA007218B1 (ru) Предотвращение и лечение амилоидогенного заболевания
KR101058482B1 (ko) 아밀로이드증 질환의 예방 및 치료
KR100930559B1 (ko) 아밀로이드 형성성 질환의 예방 및 치료
EP1578253B2 (en) Prevention and treatment of synucleinopathic disease
JP5211290B2 (ja) シヌクレイノパシー（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｃ）およびアミロイド生成性疾患の予防および処置
US6743427B1 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
EA013752B1 (ru) Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
JP2003516929A (ja) アミロイド形成性疾患の予防および治療
JP2012102131A (ja) アミロイド形成性疾患の予防および治療
MXPA00005426A (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MK4A Patent expired

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU