CZ20001706A3

CZ20001706A3 - Farmaceutický prostředek zahrnující činidlo a farmaceuticky akceptovatelnou pomocnou látku, způsob prevence a léčby Alzheimerovy choroby podáváním účinné dávky Aß peptidu, použití Aß peptidu nebo protilátky pro výrobu léku proti Alzheimerově chorobě a diagnostická sada pro monitirování léčby Alzheimerovy choroby

Info

Publication number: CZ20001706A3
Application number: CZ20001706A
Authority: CZ
Inventors: Dale B. Schenk
Original assignee: Neuralab Limited
Priority date: 1997-12-02
Filing date: 1998-11-30
Publication date: 2000-11-15
Also published as: ID25504A; EP1994937A3; IL193245A0; NO331425B1; HRP20000443B1; PT1679080E; EP1033996A4; BG104562A; JP4677334B2; AU1706199A; IL136252A0; EP1033996B1; ES2262460T1; US20050163788A1; EP1994937B1; US20050142132A1; TWI239847B; US20050249725A1; US8034339B2; PL202706B1

Description

Tato přihláška odvozuje prioritu od USSN 60/067, 740, která byla vyplněna 2. prosince 1997, a od USSN 60/080, 970, která byla vyplněna 7. dubna 1998, a které jsou pro všechny účely začleněny v odkazech, v celé své úplnosti.

Tento vynález spadá do oblastí technik imunologie a medicíny.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Alzheimerova choroba (AD) je progresivní chorobu, a jejím výsledkem je senilní demence. Obecně viz. Selkoe, TINS 16, 403 - 409 (1993); Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438 - 447 (1994); Duff et al., Nátuře 373, 476 - 477 (1995); Games et al., Nátuře 373, 523 (1995). Šířeji řečeno tato choroba spadá do dvou kategorií: pozdní začátek, který se objevuje v starším věku (65 a více let), a dřívější začátek, který se dobře vyvíjí před obdobím senility, to znamená 35 a 60 lety věku. V obou typech choroby je její patologický dopad stejný, ale abnormality jsou mnohem vážnější a rozšířenější v případech začínajících v mladším věku. Choroba je charakterizovaná dvěma typy poškození mozku, senilními plaky a neurofibrilární zámotky. Senilní plaky jsou oblasti neorganizovaného neuropilu délky do 150 pm překřížené s usazeninami extracelulárního amyloidu uprostřed sekce mozkové tkáně, která je viditelná mikroskopickou analýzou. Neurofibrilární zámotky jsou intracelulární usazeniny tau proteinu zahrnující dvě vlákna stočená navzájem v páry.

Základní složkou plaků je peptid označovaný jako Αβ peptid nebo β -amyloidový peptid. Αβ peptid je vnitřní fragment o délce 39 až 43 aminokyselinových zbytků proteinového prekurzoru nazývaného amyloidový prekurzorový protein (APP). Několik mutací uvnitř APP proteinu se vztahovalo k přítomnosti Alzheimerovy choroby. Viz. například Goate et al., Nátuře 349, 704 (1991) (valin⁷¹⁷ na isoleucin); Chartier Harlan et al., Nátuře 353, 844 (1991) (valin⁷¹⁷ na glycin); Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (valin⁷¹⁷ na fenylalanin); Mullan et al., Nátuře Genet. 1, 345 (1992) (dvojitá mutace měnící lysin⁵⁹⁵ a methionin⁵⁹⁶ na asparagin⁵⁹⁵ a leucin⁵⁹⁶). Předpokládá se, že takovéto mutace způsobují Alzheimerovu chorobu prostřednictvím zvýšené

• · · · · · · · · • · · · · · · · · · · • · · · · ······· · nebo pozměněné úpravy APP proteinu na A/? peptid, zvláště pak úpravy APP proteinu vedoucí k zvýšeným množstvím dlouhé formy Αβ peptidů (to znamená, ΑβΙ-42 a ΑβΙ-43). Předpokládá se, že mutace v jiných genech takových, jako jsou presenilní geny, PSI a PS2, nepřímo působí na úpravu APP proteinu a produkci zvýšených množství dlouhé formy Αβ peptid (viz. Hardy, TINS 20, 154 (1997). Tato pozorování naznačují, že Αβ peptid, a zvláště pak jeho dlouhá forma, je příčinným prvkem v případě Alzheimerovy choroby.

McMichael, EP 526, 5ll, navrhuje podávání homeopatických dávek (méně než nebo shodně s IO'² mg/den) Αβ peptidů pacientům s ještě nevyvinutou Alzheimerovou chorobou. U běžného člověka, který má 5 litrů plasmy, by dokonce i horní hranice této dávky očekávaně vytvářela koncentraci ne větší 2 pg/ml. Normální koncentrace Αβ peptidů v lidské plasmě je obvykle v rozmezí od 50 do 200 pg/ml (Seubert et al., Nátuře 359, 325 - 327 (l992)). Protože navrhovaná dávka v EP 526, 511 by stěží nahradila hladinu Αβ peptidů endogenně uváděného do oběhu, a protože vEP 526, 5ll není doporučeno použití jakéhokoliv podpůrného léku, zda se nepravděpodobné, že by výsledkem mohl být nějaký terapeutický prospěch.

Oproti tomu předkládaný vynález je zaměřen inter alia na léčbu Alzheimerovy choroby a jiných amyloidogenních onemocnění podáváním Αβ peptidů nebo jiného imunogenu pacientovi za podmínek, při nichž dochází u pacienta k tvorbě prospěšné imunitní odpovědi. Vynález tedy naplňuje dlouhodobou potřebu terapeutických režimů pro prevenci nebo zlepšení neuropatologických projevů Alzheimerovy choroby.

PODSTATA VYNÁLEZU

Z jednoho hlediska vynález zajišťuje způsoby prevence nebo léčby choroby, pro kterou je charakteristické ukládání amyloidu v těle pacienta. Takové metody způsobují u pacienta indukci imunitní odpovědi proti peptidové složce amyloidové usazeniny. Indukce imunitní reakce může být aktivní podáváním imunogenu nebo pasivní podáváním protilátky nebo aktivního fragmentu nebo derivátu protilátky. U některých pacientů je amyloidní usazenina spojená s Αβ peptidem, a chorobou o kterou se pak jedná je Alzheimerova choroba. V případě některých metod je pacient bez příznaků. V případě některých metod je pacientův věk pod hranicí 50 let. V případě některých metod má pacient dědičné rizikové faktory, které indikují náchylnost k Alzheimerově chorobě. Takovéto rizikové faktory zahrnují různé alely u presenilních genů PSI nebo PS2 a různé formy APP. U jiných metod má pacient neznámé rizikové faktory pro Alzheimerovu chorobu.

• · ··· · · · · ······· ·· · ·· ··

Při léčbě pacientů trpících Alzheimerovou chorobou jeden léčebný režim způsobí podáváním dávky Αβ peptidu pacientovy, aby došlo k indukci imunitní odpovědi. V případě některých metod je Αβ peptid podáván spolu s podpůrným lékem, který zesiluje imunitní odpověď na Αβ peptid. V případě některých metod je tímto podpůrným lékem síran hlinito-draselný. V případě některých metod je tímto podpůrnou látkou MPL. Dávka Αβ peptidu podávaná pacientovi je obvykle nejméně 1 nebo 10 pg pokud je podávána spolu s podpůrnou látkou, a nejméně 50 pg pokud je podávána bez podpůrné látky. V případě některých metod je dávka nejméně 100 pg.

V případě některých metod je Αβ peptidem Αβ 1-42. V případě některých je Αβ peptid podáván v agregované formě. V případě jiných metod je Αβ peptid podáván v disociované formě. V případě některých metod je terapeutickým činidlem účinná dávka nukleové kyseliny kódující Αβ peptid nebo jeho aktivní fragment nebo derivát. Nukleová kyselina kódující Αβ peptid nebo jeho fragment je exprimována u pacienta tak, aby došlo k produkci Αβ peptidu nebo jeho aktivního fragmentu, který indukuje imunitní odpověď. V případě některých těchto metod je nukleová kyselina podávána pacientovi přes kůži, volitelně cestou náplasti. V případě některých metod je terapeutické činidlo identifikováno prohlížením knihoven sloučenin, aby byla identifikována sloučenina reaktivní s protilátkami k Αβ peptidu, a podáváním této sloučeniny pacientovi, aby došlo k indukci imunitní odpovědi.

V případě některých metod je imunitní odpověď směřována k agregovanému Αβ peptidu bez toho, aby byla směřovaná k disociovanému Αβ peptidu. Například imunitní odpověď může zahrnovat T-buňky, které se váží k Αβ peptidu, který vytváří komplex s MCH I nebo MCH II na CD8 nebo CD4 buňkách. V případě jiných metod je imunitní odpověď indukována podáváním protilátky k Αβ peptidu pacientovi. V případě některých metod je imunitní reakce indukována odebráním T-buněk pacientovi, kontaktováním T-buněk s Αβ peptidem za podmínek, při kterých jsou T-buňky uvedeny do nejlepšího stavu, a navrácením těchto buněk zpět pacientovi. Terapeutické činidlo je obvykle podáváno orálně, intranasálně, intradermálně, podkožně, intramuskulárně, povrchově nebo intravenózně. V případě některých metod je pacient po podání následně monitorován, aby byla zhodnocena imunitní reakce. Jestliže je na základě pozorování zjištěno snížení imunitní reakce v daném čase, může být pacientovi podána jedna nebo více dalších dávek činidla.

Z dalšího hlediska vynález zajišťuje farmaceutické prostředky, které zahrnuji Αβ peptid a excipient vhodné pro podávání orálně a jinými dalšími cestami. Vynález také zajišťuje farmaceutické prostředky, zahrnující činidlo účinně u pacienta indukující imunogenní odpověď na Αβ peptid, a farmaceuticky akceptovatelné podpůrné látky. V případě některých takovýchto prostředků je činidlem Αβ peptid nebo jeho aktivní fragment. V případě některých prostředků • · ··· · · · · ······· ·· · ·· ·· podpůrná látka zahrnuje síran hlinito-draselný. V případě některých prostředků podpůrná látka zahrnuje emulzi olej-ve-vodě. V případě některých prostředků je A/? peptid nebo aktivní fragment složkou polylaktid-polyglykolidového kopolymerů (PLPG) nebo jiných částicí. Vynález dále zajišťuje prostředky zahrnující A/? peptid nebo aktivní fragment připojený do konjugátu s molekulou, která podporuje dopravu A/? peptidu do krevního řečiště pacienta a/nebo podporuje imunitní odpověď proti Αβ peptidu. Například může konjugát sloužit k podpoře imunitnní reakce proti Αβ peptidu. V případě některých prostředků je konjugátem toxin cholery.

V případě některých prostředků je konjugátem imunoglobulin. V případě některých prostředků je konjugátem zesílený toxin záškrtu CRM 197 (Gupta, Vaccine 15, 1341 - 3 (1997)).

Vynález také zajišťuje farmaceutické prostředky zahrnující činidlo působící tak, aby vyvolalo imunogenní odpověď proti Αβ peptidu u pacienta s výhradou, že prostředek neobsahuje kompletní Freundovu podpůrnou látku. Vynález také zajišťuje prostředky zahrnující virové vektory kódující Αβ peptid nebo jeho aktivní fragment účinné tak, aby indukovaly imunitní reakci proti Αβ peptidu. Vhodné virové vektory zahrnují herpes virus, adenovirus, adenoasociovaný virus, retrovirus, sindbis, semiliki lesní virus, vaccinia virus nebo avian poxvirus.

Vynález dále zajišťuje způsoby prevence nebo léčby Alzheimerovy choroby. V případě takovýchto metod je pacientovi podávána účinná dávka Αβ peptidu. Vynález dále zajišťuje použití Αβ peptidu nebo protilátky k tomuto peptidy při výrobě léku pro prevenci nebo léčbu Alzheimerovy choroby.

Z dalšího hlediska předkládaný vynález zajišťuje způsoby určení účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta. U těchto metod je nejdříve určeno standardní množství protilátky specifické pro Αβ peptid v tkáňovém vzorku pacienta před použitím léčebného činidla. Množství specifické protilátky pro Αβ peptid v tkáňovém vzorku pacienta po použití léčebného činidla je porovnáno se standardním množstvím Αβ peptid-specifické protilátky. Množství Αβ peptid-specifické protilátky změřené po podání léčebného činidla, které je podstatně vyšší než standardní množství Αβ peptid-specifické protilátky určuje pozitivní léčebný výsledek.

V případě jiných metod určování účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta je určeno standardní množství protilátky specifické pro Αβ peptid v tkáňovém vzorku pacienta před použitím léčebného činidla. Množství specifické protilátky pro Αβ peptid v tkáňovém vzorku subjektu po použití léčebného činidla je porovnáno se standardním množstvím Αβ peptidspecifické protilátky. Snížení nebo nedostatek podstatného rozdílu mezi množstvím Αβ peptid• · · · 9 · 9 · • 9 9 · · · · · «· ·· ·· ·· *

9 9 9 9 4 4 4 4 «······ 9· · ·· ·· specifické protilátky změřený po použití léčebného činidla v porovnání se standardním množstvím Αβ peptid-specifické protilátky určuje negativní léčebný výsledek.

V případě jiných metod určování účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta je určováno kontrolním množství protilátky specifické pro A/7 peptid v tkáňových vzorcích u kontrolní populace. Množství specifické protilátky pro A/7 peptid v tkáňovém vzorku pacienta po použití léčebného činidla je porovnáno s kontrolním množstvím Αβ peptid-specifické protilátky. Množství Αβ peptid-specifické protilátky změřené po podání léčebného činidla, které je podstatně vyšší než kontrolní množství Αβ peptid-specifické protilátky určuje pozitivní léčebný výsledek.

V případe jiných metod určování účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta je určováno kontrolním množství protilátky specifické pro Αβ peptid v tkáňových vzorcích u kontrolní populace. Množství specifické protilátky pro Αβ peptid v tkáňovém vzorku pacienta po použití léčebného činidla je porovnáno s kontrolním množstvím Αβ peptid-specifické protilátky. Nedostatek podstatného rozdílu mezi množstvím Αβ peptid-specifické protilátky změřené po zahájení zmíněné léčby v porovnání s kontrolním množství Αβ peptid-specifické protilátky určuje negativní léčebný výsledek.

Jiné způsoby monitorování Alzheimerovy choroby nebo její určitelnosti u pacienta zahrnují detekování imunitní odpovědi proti Αβ peptidů ve vzorku získaném od pacienta. V případě některých takovýchto metod je pacientovi podávána účinná látka za účelem léčby nebo prevence před Alzheimerovou chorobou a úroveň odpovědi určuje následný léčebný režim u pacienta.

V případě jiných metod určování účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta je určována hodnota množství protilátky specifické pro Αβ peptid v tkáňovém vzorku u pacienta, který byl činidlem léčen. Hodnota je porovnávána s kontrolní hodnotou určenou u populace pacientů, u nichž proběhlo zlepšení nebo vymizení symptomů Alzheimerovy choroby z důvodu léčby zmíněným činidlem. Hodnota u pacienta, která je přinejmenším shodná s kontrolní hodnotou, indikuje pozitivní odpověď na léčbu.

Vynález dále zjišťuje diagnostické sady pro provádění výše uvedených metod. Takovéto sady obvykle zahrnují činidlo, které specificky váže protilátky pro Αβ peptid, nebo které stimuluje proliferaci T-buněk reagujících s Αβ peptidem.

Definice - termín „podstatná identita“ znamená, že dvě peptidové sekvence, pokud jsou optimálně propojeny za použití takových programů, jako jsou GAP nebo BESTFIT, využívajících opominutí gap hmotností, sdílejí přinejmenším 65 procent sekvenční identity, vhodněji nejméně 80 nebo 90 procent sekvenční identity, nejvhodněji nejméně 95 procent • · ···· ·· • · · · · · · • · · · · * · • · · ·· · · · • · · · · · · • · · · · · · sekvenční identity nebo více (např.: 99 procent sekvenční identity nebo vyšší hodnotu). Vhodněji se pozice zbytků, které nejsou identické, odlišují v substitucích konzervativních aminokyselin. Pro porovnávání sekvencí obvykle jedna sekvence působí jako referenční sekvence, ke které jsou testované sekvence vztahovány. Pokud je používán sekvenční porovnávací algoritmus, jsou testovaná a referenční sekvence vloženy do počítače, subsekvenční koordináty jsou nastaveny, pokud je to nezbytné, a parametry sekvenčního algoritmického programu jsou nastaveny. Sekvenční porovnávací algoritmus potom vypočítá procento sekvenční identity pró testovanou sekvenci(e) ve vztahu k referenční sekvenci na základě nastavených programových parametrů. Optimální propojení sekvencí pro porovnávání může být prováděno například za použití algoritmu lokální homologie podle Smithe & Watermana, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); za použití algoritmu homologního propojení podle Needlemana & Wunsche, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); za použití metody hledání podobnosti podle Pearsona & Lipmana, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); za použití počítačové realizace těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA ve Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), nebo za použití zrakové prohlídky (obecně viz. Ausubel et al., výše). Jedním příkladem algoritmu, který je vhodný pro určení procenta sekvenční identity a sekvenční podobnosti, je algoritmus BLAST, který je popsán vAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Software pro provádění analýz za použití algoritmu BLAST je veřejně přístupný prostřednictvím The National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Obvykle mohou být použity programové parametry opominutí pro provádění porovnávání sekvencí, ačkoliv zákaznické parametry mohou být také použity. Pro aminokyselinové sekvence program BLASTP používá jako opominutí wordlength (W) 3, pravděpodobnost (E) 10 a stav předlohy BLOSUM62 (viz. Henikoff & Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)).

Pro účely klasifikování aminokyselinových substitucí jako konzervativních a nekonzervativních jsou aminokyseliny rozděleny do skupin následujícím způsobem: skupina I (hydrofobní postranní řetězce): norleucin, met, ala, val, leu, ile; skupina II (neutrální hydrofilní postranní řetězce): cys, ser, thr; skupina III (kyselé postranní řetězce): asp, glu; skupina IV (zásadité postranní řetězce): asn, gin, his, lys, arg; skupina V (zbytky s vlivem na orientaci řetězce): gly, pro; a skupina VI (aromatické postranní řetězce): trp, tyr, phe.

Konzervativní substituce zahrnují substituce mezi aminokyselinami v rámci stejné skupiny. Nekonzervativní substituce nastavují výměnu jednoho člena těchto tříd za člena jiné třídy. Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu jsou obvykle podstatně čisté. To znamená, že činidlo má obvykle 50% w/w (hmotnost/hmotnost) čistotu právě tak, jako je podstatně čisté od interferujících proteinů a nečistot. Někdy mají činidla přinejmenším 80% w/w a nejvhodněji nejméně 90 nebo okolo 95% w/w čistotu. Nicméně za použití konvenčních proteinových purifikačních technik mohou být získány homogenní peptidy přinejmenším 99% w/w.

Specifická vazba mezi dvěma entitami znamená, že afinita je přinejmenším 10⁶, ΙΟ⁷, ΙΟ⁸, 10⁹ M'¹nebo ΙΟ¹⁰ M'¹. Afinity větší než 10⁸ M'¹ jsou upřednostňovány.

Termín „protilátka“ je zde použit tak, aby zahrnoval intaktní protilátky a jejich vazebné fragmenty. Obvykle fragmenty soutěží s intaktní protilátkou, od které byly odvozeny, o specifické vazebné místo antigenu. Volitelně mohou být protilátky a jejich vazebné fragmenty chemicky navázány do, nebo exprimovány jako, fuzní proteiny s jinými proteiny.

APP⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹ a APP⁷⁷⁰ odkazují k 695, 751 a 770 aminokyselinovým zbytkům dlouhých polypeptidů kódovaných lidským APP genem. Viz. Kang et al., Nátuře 325, 773 (1987); Ponte et al., Nátuře 331, 525 (1988); a Kitaguchi et al., Nátuře 331, 530 (1988). Aminokyseliny uvnitř lidského amyloidního prekursorového proteinu (APP) mají přidělená čísla podle sekvence isoformy APP770. Termíny takové, jako A/B9, A/MO, A/241, A//42 a A/?43 odkazují na peptid obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 39, 1 až 40, 1 až 41, 1 až 42 a 1 až 43.

Termín „epitop“ nebo „antigenní determinanta“ odkazují na místo antigenu, na které B a/nebo T-buňky odpovídají. Epitopy pro B-buňky mohou být vytvořeny zobou, jak přilehlých aminokyselin nebo nepřilehlých aminokyselin umístěných vedle sebe terciálním složením proteinu. Epitopy tvořené z přilehlých aminokyselin jsou obvykle vydrží expozici denaturačními rozpouštědly, zatímco epitopy tvořené terciální strukturou se obvykle ztrácí po expozici denaturačními činidly. Epitopy obvykle zahrnují přinejmenším 3 a častěji nejméně 5 nebo 8 až 10 aminokyselin v unikátní prostorové konformaci. Metody určení prostorové konformace epitopů zahrnují například rentgenovou krystalografii a dvou-rozměrovou nukleární magnetickou rezonanci. Viz. např.; Epitope Mapping Protocols in Method in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, vydáno (1996). Protilátky, které rozeznávají stejné epitopy, mohou být identifikovány jednoduchým imunotestem, který ukazuje schopnost jedné protilátky blokovat vazbu jiné protilátky na cílový antigen. T-buňky rozeznávají kontinuální epitopy okolo devíti aminokyselin pro CD8 buňky nebo okolo 13 až 15 aminokyselin pro CD4 buňky. T-buňky, které rozeznávají epitop, mohou být identifikovány in vitro testem, který měří antigen-dependentní proliferaci, která je určena inkorporací ³H-thimidinu T-buňkami v nejlepším stavu, jako odpověď na epitop (Burke et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) nebo cytokinovou sekreci.

Termín „imunologická“ nebo „imunní“ odpověď je charakterizován, jako vyvinutí prospěšné humorální (zprostředkováváno protilátkou) a/nebo buněčné (zprostředkováváno antigenspecifickými T-buňkami nebo jejich sekrečními produkty) odpovědi řízené proti amyloidnímu peptidů v těle přijímajícího pacienta. Taková odpověď může být aktivní odpovědí indukovanou • ·· ····«· ·* ·· • · · · ·· · · * · * • « ··· · · · · • · · · · · · · · · · • · · · · ···· ··· ···· ·· · ·· ·· podáváním imunogenu nebo pasivní odpovědí indukovanou podáváním protilátky nebo T-buněk v nej lepším stavu. Buněčná imunitní odpověď je vyvolána přítomností polypeptidových epitop v asociaci s třídou I nebo třídou II MHC molekul, aby došlo k aktivaci antigen-specifických CD4⁺ T pomocných buněk a/nebo CD8⁺ cytotoxických T buněk. Odpověď může také zahrnovat aktivaci monocytů, makrofágů, NK buněk, basoilů, dendritických buněk, astrocytů, mikrogliiních buněk, eosinofilů nebo jiných složek přirozené imunity. Přítomnost buněk zprostředkujících buněčnou odpověď může být určena proliferačními testy (CD4⁺ T buňky) nebo CTL (cytotoxický T lymfocyt) testy (viz. Burke, výše; Tigges, výše). Relativní přispění humorální a buněčné odpovědi k ochrannému a terapeutickému účinku imunogenu může být charakterizováno separačním izolováním IgG a T-buněk z imunizovaného syngenního zvířete a měřením ochranného a terapeutického účinku v druhém subjektu.

„Imunogenní činidlo“ nebo „imunogen“ je schopný indukovat imunologickou odpověď proti sobě samému po podáváním pacientovi, volitelně ve spojení s podpůrnou látkou.

Termín „nahý polynukleotid“ odkazuje na polynukleotid, který není spojen s koloidními materiály. Nahé polynukleotidy jsou někdy klonovány v plasmidových vektorech.

Termín „pomocná látka“ odkazuje na sloučeninu, která po podání ve spojení santigenem zvyšuje imunitní odpověď na antigen, ale pokud je podána samotná nevyvolává imunitní odpověď na antigen. Pomocné látky mohou zvyšovat imunitní odpověď několika mechanismy, které zahrnují zmnožení lymfocytů, stimulaci B a/nebo T buněk a stimulaci makrofágů.

Termín „pacient“ zahrnuje lidský nebo savčí subjekt, který přijímá buď profylaktickou nebo terapeutickou léčbu.

Neagregovaný nebo monomerní A/? peptid znamená rozpustné, monomerní peptidové jednotky A/?. Jednou z metod jak připravit monomerní Αβ peptid je rozpustit lyofilizovaný peptid v čistém DMSO sonikací. Výsledný roztok je pak centrifugován, aby se odstranily jakékoliv nerozpustné částice. Agregovaný Αβ peptid je směsí oligomerů, v které jsou monomerní jednotky drženy pospolu nekovalentními vazbami.

Prostředky nebo metody „zahrnující“ jeden nebo více vyjmenovaných elementů mohou obsahovat jiné elementy, které nejsou specificky vyjmenovány. Například prostředek, který zahrnuje A/? peptid zahrnuje oba, izolovaný A/? peptid a Αβ peptid, jako složku větší polypeptidové sekvence.

Detailní popis

Obecně - vynález zajišťuje farmaceutické prostředky a metody pro profylaktickou a terapeutickou léčbu chorob charakterizovaných akumulací amyloidních usazenin. Amyloidní usazeniny zahrnují peptid agregovaný do nerozpustné hmoty. Původ peptidu je různý od typu • A ♦♦ ··«· • ••••••••A*

A A AAA AAAA

A A A A A A A AA A AA AA onemocnění, ale ve většině případů má agregát β - strukturu a skvrnu barvy konžské červeni. Choroby charakterizované amyloidními usazeninami zahrnují Alzheimerovu chorobu (AD), obě, pozdní a ranný začátek. V případě obou chorob amyloidní usazenina obsahuje peptid nazývaný A/? peptid, který se kumuluje v mozku postižených individuí. Příklady některých dalších chorob charakterizovaných tvorbou amyloidních usazenin jsou SAA amyloidosa, dědičný Islandský syndrom, mnohočetný myelom a spongiformní encefalopatie, které zahrnují nemoc šílených krav, Creutzfeldovu-Jakobovu chorobu, nemoc ovcí scrapie a spongiformní encefalopatii norků (viz. Weissman et al., Curr. Opin. Neurobiol. 7, 695-700 (1997); Smits et al., Veterinary Quarterly 19, 101-105 (1997); Nathanson et al., Am. J. Epidemiol. 145, 945-969 (1997)), Peptidy tvořící agregáty při těchto chorobách jsou sérový amyloid A, cystantin C, IgG kappa lehký řetězec, respektive pro první tři, a prionový protein pro ostatní.

Terapeutická činidla - Alzheimerova choroba. Terapeutická činidla pro použití podle předkládaného vynálezu indukují imunitní odpověď proti Αβ peptidu. Tato činidla zahrnují A// peptid samotný a jeho varianty, analogy a napodobeniny Αβ peptidu, které indukují a/nebo křížně-reagují s protilátkami k Αβ peptidu, a protilátky nebo T-buňky reagující s Αβ peptidem. Indukce imunitní odpovědi může být aktivní tehdy, když je imunogen podáván, aby indukoval protilátky nebo T-buňky reagující u pacienta s Αβ peptidem, nebo pasivní tehdy, když je protilátka podávána tak, že se sama váže na Αβ peptid u pacienta.

Αβ peptid, také známí jako //-amyloidní peptid, nebo A4 peptid (viz. US 4, 666, 829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), je 39 až 43 aminokyselin dlouhý peptid, který je hlavní složkou charakteristických plaků Alzheimerovy choroby. Αβ peptid je vytvářen úpravou většího proteinu APP dvěma enzymy, nazývanými β a γ sekretázy (viz. Hardy, T1NS 20, 154 (1997)). Známé mutace v APP spojené s Alzheiměrovou chorobou se objevují bezprostředně v místě pro β nebo γ sekretázu nebo uvnitř Αβ peptidu. Například pozice 717 je bezprostředně v místě, kde γ sekretáza štípe APP při jeho sestřihu na Αβ peptid a pozice 670/671 jsou bezprostředně v místě, kde štěpí β sekretáza. Předpokládá se, že mutace způsobují Alzheimerovu chorobu interakcí s štěpícími reakcemi, při kterých vzniká Αβ peptid, takže je produkováno zvyšující se množství 42/43 aminokyselinové formy Αβ peptidu.

Αβ peptid má neobvyklou vlastnost, že může fixovat a aktivovat obě, klasickou i alternativní doplňovací kaskády. Zvláště se váže k Clq a konečně i k C3bi. Tyto asociační schopnosti vázání se k makrofágům vedou k aktivaci B-buněk. Kromě toho C3bi se dále přerušuje a pak se váže k CR2 na B buňkách způsobem závislém na T buňce, což vede k 10 000 násobnému zvýšení aktivace těchto buněk. Tento mechanismus způsobuje, že Αβ peptid vytváří imunitní odpověď v přebytku než jakékoliv jiné antigeny.

00 0000 ·· • 0 · · · · · 0

0 0 · 0 0 0

000 0000 000 0000 ·· * ·· ··

Terapeutickým činidlem používané v nárokovaných způsobech mohou být jakékoliv přirozeně se vyskytující formy Αβ peptidů a zvláště lidské formy (to znamená A/739, A/MO, A/241, A/742 nebo A/243). Sekvence těchto peptidů a jejich vztah k APP prekurzoru jsou vyjádřeny na obr. 1 publikovaném Hardym et al., TINS 20, 155-158 (1997). Například A/M2 má sekvenci:

HjN-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-LeuVal-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-MetVal-Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala-OH.

A/241 „ A/40 a A/339 se odlišují od A/242 vynecháním Ala, Ala-Ile a Ala-Ile-Val, respektive z Ckonce. A/M3 se odlišuje od A/M2 přítomností threoninového zbytku na C-konci. Terapeutickým činidlem může také být aktivní fragment nebo analog přirozeného Εβ peptidů, který obsahuje epitop indukující podobnou ochranou nebo terapeutickou imunitní odpověď po podání lidskému pacientovi. Imunogenní fragmenty mají obvykle sekvenci nejméně 3, 5, 6, 10 nebo 20 sousedních aminokyselin od přirozeného peptidů. Imunogenní fragnenty zahrnují Α/Π-5, 1-6, 1-12, 13-28, 17-28, 25-25, 35-40 a 35-42. Fragmenty pocházející z N-koncové poloviny Αβ peptidů jsou v některých metodách upřednostňovány. Fragmenty zahrnují alelické, druhové a indukované varianty. Analogy jsou obvykle odlišují od přirozeně se vyskytujících peptidů v jedné nebo více pozicích, často přednostně v konzervativních substitucích. Analogy obvykle vykazují nejméně 80 až 90% sekvenční identitu s přirozenými peptidy. Některé analogy také zahrnují nepřirozené aminokyseliny nebo modifikované N nebo C-konce aminokyselin. Příkladem nepřirozených aminokyselin jsou α,α-disubstituované aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, kyselina mléčná, 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, ε-Ν,Ν,Νtrimethyllysin, ε-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmethionin, 3-methylhistidin, 5-hydroxylysin, ω-N-methylarginin. Fragmenty a analogy mohou být testovány na profylaktickou nebo terapeutickou účinnost v transgenních zvířecích modelech, jak je popsáno níže.

Εβ peptid, jeho fragmenty, analogy a jiné amyloidogenní peptidy mohou být syntetizovány na pevné fázi peptidovou syntézou nebo rekombinantní expresí nebo mohou být získány z přírodních zdrojů. Automatické peptidové syntetizátory jsou komerčně dostupné od řady dodavatelů takových, jako jsou Applied Biosystems, Foster City, California. Rekombinantní exprese může probíhat v bakteriálních buňkách takových, jako je E. coli, kvasinkách, buňkách hmyzu nebo savčích buňkách. Postupy pro rekombinantní expresi jsou popsány v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989). Některé formy ·« ·«<· • · * * · ··· ···· ·· ♦ ·· ·♦ • · · 1 · · · • · · ·

11 1

11

A/?peptidu jsou také dostupné komerčně (např.: American Peptides Company, lne., Sunnyvale, CA and California Peptide Research, lne. Napa, CA).

Terapeutická činidla také zahrnují delší polypeptidy, které obsahují, například, A/? peptid, aktivní fragment nebo analog společně s jinými aminokyselinami. Například A/? peptid může být přítomen jako intaktní APP protein nebo jeho segment takový, jako C-lOO fragment, který začíná na N-konci A/? peptidu a pokračuje do konce APP. Takové polypeptidy mohou být testovány na profylaktickou nebo terapeutickou účinnost ve zvířecích modelech, jak je popsáno níže. A/? peptid, analog, aktivní fragment nebo jiné polypeptidy mohou být podávány v asociované formě (to znamená jako amyloidní peptid) nebo v disociované formě. Terapeutická činidla také zahrnují multimery monomerních imunogenních činidel.

V případě další varianty imunogenní pepid takový, jako A/? peptid, může být uváděn jako virová nebo bakteriální vakcína. Nukleová kyselina kódující imunogenní peptid je začleněna do genomu nebo episomu viru nebo bakterie. Volitelně je nukleová kyselina začleněna takovým způsobem, že imunogenní peptid je exprimován jako sekreční protein nebo jako fuzní protein s vnějším-povrchovým proteinem viru nebo s transmembránovým proteinem bakterie tak, že peptid je vykázán. Viry nebo bakterie používané v těchto metodách by měly být nepatogenní a oslabené. Vhodné viry zahrnují adenoviry, HSV, vaccinia a slepičí pox viry. Fúze imunogenního peptidu s HBsAg HSV viru je zvláště vhodná. Terapeutická činidla také obsahují peptidy a jiné sloučeniny, které nemají nezbytně hlavní sekvenční aminokyselinovou podobnost s A/? peptidem, ale přesto však slouží jako náhražky A/? peptidu a indukují podobnou imunitní odpověď. Například jakékoliv peptidy a proteiny tvořící //-struktury mohou být testovány zda jsou vhodné. Anti-idiotypické protilátky proti monoklonálním protilátkám k Αβ peptidu nebo jiným amyloidogenní peptidům mohou být také použity. Takové anti-Id protilátky nahrazují antigen a vyvolávají imunitní odpověď vůči sobě (viz. Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publication, Palo Alto, 6th ed.), p. I8l).

Náhodné knihovny peptidů nebo jiných sloučenin mohou být také testovány pro svou vhodnost. Kombinované knihovny mohou být vytvářeny z mnoha druhů sloučenin, které mohou být syntetizovány způsobem krok-za-krokem. Takové sloučeniny zahrnují polypeptidy, napodobeniny s beta-ohybem, polysacharidy, fosfolipidy, hormony, prostaglandiny, steroidy, aromatické sloučeniny, heterocyklické sloučeniny, benzodiazepany, oligomerní N-substituované glyciny a oligokarbamáty. Velké kombinované knihovny sloučenin mohou být konstruovány metodou kódovaných syntetických knihoven (ESL), která je popsána v Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 a Scripps, WO 95/30642 (každý z nich je začleněn v odkazech ke všem účelům). Peptidové ·· 9999

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9999 ·* · ·♦ ·· knihovny mohou také být vytvářeny metodami fágového vykázání. Viz. např.: Devlin, WO 91/18980.

Kombinované knihovny a jiné sloučeniny jsou zpočátku testovány zda jsou vhodné určením jejich kapacity vázat protilátky nebo lymfocyty (B nebo T), o kterých se ví, že jsou specifické pro Αβ peptid nebo jiné amyloidogenní peptidy. Například počáteční testy mohou být prováděny s jakýmkoliv polyklonálním sérem nebo monoklonální protilátkou k Αβ peptidů nebo jinému amyloidogennímu peptidů. Sloučeniny identifikované takovýmito testy jsou pak dále analyzovány pro svou kapacitu indukovat protilátky nebo reaktivní lymfocyty k Αβ peptidů nebo jinému amyloidogennímu peptidů. Například několikanásobná ředění séra mohou být testována na mikrotitračních destičkách, na které byl před tím nanesen Αβ peptid a standardní ELISA může být prováděna, aby byla určena reaktivita protilátek k Αβ peptidů. Sloučeniny mohou pak být testovány na profylaktickou a terapeutickou účinnost v transgenních zvířatech, u kterých byla dříve vyvolána amyloidogenní choroba tak, jak je popsáno v příkladech provedení vynálezu. Taková zvířata zahrnují například myši nesoucí 717 mutaci v APP, jak je popsáno v Games et al., výše, a myši nesoucí Švédskou mutaci v APP tak, jak je popsáno v McConlogue et al., US 5, 612, 486 a Hsiao et al., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997)). Stejný testovací přístup může být použit na jiná potenciální činidla taková, jako fragmenty Αβ peptidů, analogy Αβ peptidů a dlouhé peptidy zahrnující Αβ peptid, jak je popsáno výše.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu také zahrnují protilátky, které se specificky váží na Αβ peptid. Takové protilátky mohou být monoklonální nebo polyklonální. Některé z těchto protilátek se specificky váží na agregovanou formu Αβ peptidů, bez toho, aby se vázaly na formu disociovanou. Některé se váží specificky na disociovanou formu, aniž by se vázaly na agregovanou formu. Některé se váží k obou formám, jak na agregovanou, tak disociovanou formu. Produkce nehumánních monoklonálních protilátek, např.: myších nebo krysích, může být prováděna například imunizací zvířat Αβ peptidem. Viz. Harlow & Lané, Aníibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (začleněno v odkazech pro všechny účely). Takový imunogen může být získán z přírodního zdroje, peptidovou syntézou nebo rekombinantní expresí.

Humanizované formy myších protilátek mohou být vytvářeny připojením CDR oblastí nehumánních protilátek k humánním konstantním oblastem za použití rekombinačních DNA technik. Viz. Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989) a WO 90/07861 (začleněno v odkazech pro všechny účely).

·· ····

Humánní protilátky mohou být získány za použití metod fágového vykázání. Viz. např.: Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047. Při těchto metodách jsou vytvářeny fágové knihovny, jejichž členové vykazují odlišné protilátky na svých vnějších površích. Protilátky jsou obvykle vykazovány jako Fv nebo Fab fragmenty. Fágově vykazované protilátky s požadovanou specifitou jsou vybírány afmitním nahromaděním na Αβ peptidu, nebo jeho fragmentech. Humánní protilátky proti Αβ peptidu mohou být také získávány z nehumánních transgenních savců, kteří mají transgeny kódující přinejmenším segment lidského imunoglobulinového lokusu a inaktivovaný endogenní imunoglobulinový lokus. Viz. např.: Lonberg et al., WO 93/12227 (1993); Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (začleněno v odkazech v plném rozsahu pro všechny účely). Humánní protilátky mohou být vybírány na základě kompetetivních vazebných pokusů nebo jinak tak, aby měly stejnou specifitu k epitopů, jako jednotlivá myší protilátka. Takové protilátky zvláště pravděpodobně sdílí užitečné funkční vlastnosti myších protilátek. Humánní polyklonální protilátky mohou také být zajišťovány ve formě séra z lidí imunizovaných imunogenním činidlem. Volitelně mohou být takové protilátky koncentrovány afinitní purifikaci za použití Αβ peptidu nebo jiného amyloidního peptidu, jako afinítního činidla.

Humánní nebo humanizované protilátky mohou být navrhovány tak, aby měly IgG, IgD, IgA a IgE konstantní oblast a jakýkoliv isotyp, zahrnující IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Protilátky mohou být exprimovány jako tetramery obsahující dva lehké a dva těžké řetězce, jako dva oddělené těžké řetězce, lehké řetězce, jako Fab, Fab' F(ab')2 a Fv nebo jako jednoduchý řetězec protilátek, v kterých jsou těžký a lehký řetězec variabilními doménami spojenými prostřednictvím raménka. Terapeutická činidla pro použití podle předkládaných metod také zahrnují T-buňky, které se váží na Αβ peptid. Například T-buňky mohou být aktivovány proti Αβ peptidu expresí humánního genu MHC třídy I a humánního genu /7-2-mikroglobulinu z hmyzí buněčné linie, což znamená, že se vytváří prázdný komplex na povrchu buněk , a který může vázat Αβ peptid. T-buňky v kontaktu s buněčnou linií se stávají specificky aktivovanými proti peptidu. Viz. Peterson et al., US 5, 314, 813. Hmyzí buněčné linie exprimující antigen MHC třídy II, mohou být podobně použity k aktivaci CD4 T buněk.

Ostatní choroby - Stejné nebo analogické principy určují produkci terapeutických činidel pro léčbu ostatních amyloidogenních chorob. Obecně řečeno činidla popsaná výše pro použití při léčbě Alzheimerovy choroby mohou být také použita při léčbě Alzheimerovy choroby s dřívějším začátkem spojené s Downovým syndromem. V případě nemoci šílených krav jsou místo Αβ peptidu, aktivních fragmentů, analogů a protilátek proti Αβ peptidu používaných při léčbě Alzheimerovy choroby, použity prionový peptid, aktivní fragmenty, analogy a protilátky ·« ·toto to • »· • to to to ·· • ··· to ··«« • · · · ••••••to to ·· »· • ·· · • toto · • to· to • toto to proti prionovému peptidu. Při léčbě mnohočetného myelomu jsou používány IgG lehký řetězec, analogy a protilátky proti tomuto, a tak dále v případě dalších chorob.

Nosičové proteiny - Některá činidla indukující imunitní odpověď obsahují vhodný epitop pro vyvolání imunitní odpovědi proti amyloidním sraženinám, ale jsou příliš malá, aby byla imunogenní. V takové situaci může být peptidový imunogen připojen k vhodnému nosiči , aby došlo k napomožení vyvolání imunitní odpovědi. Vhodné nosiče zahrnují sérové albuminy, klíčový hemocyanin mořského hlemýždě, imunoglobulinové molekuly, thyroglobulin, ovalbumin, tetanus toxoid nebo toxoidy z jiných patogenních bakterií takových, jako jsou difteria, E. coli, cholera nebo H. pylori, nebo oslabený toxinový derivát. Jiné nosiče pro stimulaci nebo zesílení imunitní odpovědi zahrnují cytokiny takové, jako IL-1, IL-1 α a β peptidy, IL-2, ylNF, IL-10, GM-CSF a chemokiny takové, jako MlPla a β a RANTES. Imunogenní činidla mohou být také připojena k peptidů, které zvyšují transport skrz tkáně, jak je popsáno v 0'Mahony, WO 97/17613 a WO 97/17614.

Imunogenní činidla mohou být připojena k nosičům chemickou vazbou. Techniky pro připojení imunogenu na nosič zahrnují vytvoření disulfidového můstku za použití N-sukcinimidyl-3-(2pyridyl-thio)propionátu (SPDP) a sukcinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylátu (SMCC) (jestliže peptid postrádá thiolovou skupinu, může být tato skupina zajištěna přidáním cysteinového zbytku). Tato činidla tvoří disulfidový můstek mezi sebou samým a peptidovými cysteinovými zbytky jednoho proteinu a amidovou vazbu prostřednictvím εaminoskupinou lysinu nebo jinou volnou aminoskupinou jiných aminokyselin. Různá takováto disulfíd/amid vytvořená činidla jsou popsána v Immun. Rev. 62, 185 (1982). Jiná bifunkčně spojená činidla, tvoří spíše thioether než disulfidový můstek. Mnoho těchto thio-ether-tvořících činidel je komerčně dostupných a zahrnuje reaktivní estery 6-maleimidokapronové kyseliny, 2bromooctové kyseliny, 2-jodooctové kyseliny, 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-lkarboxylové kyseliny. Karboxylové skupiny mohou být aktivovány reakcí s sukcinimidem nebo sodnou solí l-hydroxyl-2-nitro-4-sulfonové kyseliny.

Imunogenní peptidy mohou také být exprimovány jako luzní proteiny s nosiči. Imunogenní peptid může být spojen s nosičem na N-konci, C-konci nebo uvnitř peptidu. Volitelně může být uveden ve fuzním proteinu násobně se opakující imunogenní peptid.

Nukleová kyselina kódující imunogenny - Imunitní odpovědi proti amyloidním usazeninám mohou také být vyvolány podáváním nukleových kyselin kódujících A/? peptid nebo jiné peptidové imunogeny. Takovými nukleovými kyselinami mohou být DNA nebo RNA. Segment nukleové kyselin kódující imunogen je obvykle spojen s regulačními prvky takovými, jako jsou promotor a zesilovač, které umožňují expresi segmentu DNA v předpokládaných cílových f ··

I · · <

I · · ( ·· ·»·· buňkách pacienta. Pro expresi v krevních buňkách, jak je požadováno pro vyvolání imunitní odpovědi, jsou pro přímou expresi vhodné promotorové a zesilovačové elementy pocházející z lehkého nebo těžkého řetězce imunoglobulinových genů nebo včasný promotor a zesilovač z hlavního meziproduktu CMV. Připojené regulační elementy a kódující sekvence jsou často klonovány do vektoru.

Rada virových vektorových systémů je přístupná, včetně retrovirových systémů (viz. např.: Lawrie a Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); adenovirových vektorů (viz. např.: Bett et al.,Virol. 67, 5911 (1993)); adenoasociované virové vektory (viz. např.: Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), virové vektory z rodiny poxvirů zahrnující vaccinia virus a ptačí poxviry, virové vektory z rodu alfavirů takové, jako ty odvozené od Sindbis a Semliki lesních virů (viz. např.: Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)) a papillomaviry (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et al., WO 94/12629 a Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).

DNA kódující imunogen nebo vektor obsahující to samé mohou být zabaleny do liposomů. Vhodné lipidy a příbuzné analogy jsou popsány v US 5, 208, 036; 5, 264,618; 5, 279, 833 a 5, 283, 185. Vektory a DNA kódující imunogen mohou také být adsorbovány na nebo spojeny s částicovými nosiči, jejichž příklady zahrnují polymethylmethakrylátové polymery a polylaktidy a poly(laktid-co-glykolid), viz. např.: McGee et al., J. Micro Encap. (1996).

Vektory genové terapie nebo prostá DNA mohou být dopraveny in vivo podáváním jednotlivému pacientovi, obvykle podáváním týkajícím se celého těla (např.: intravenózně, intraperitoneálně, do nosu, do žaludku, intradermálně, intramuskulárně, podkožně nebo intrakraniální infuzí) nebo místní aplikací (viz. např.: US 5, 399, 346). DNA může také být podávána za použití genovou pistolí. Viz. Xiao & Brandsma, výše. DNA kódující imunogen je vysrážena na povrchu mikroskopických kovových kuliček. Mikroprojektily jsou akcelerovány rázovou vlnou nebo expandujícím plynným heliem a prostupují tkáněmi do hloubky několika buněčných vrstev. Například The Accel™ Gene Delivery Device vyráběný firmou Agacetus, lne. Middleton WI je vhodný. Alternativně prostá DNA může procházet přes pokožku do krevního řečiště jednoduše nanesením DNA v místě chemického nebo mechanického narušení (viz. WO 95/05853).

V další variantě vektory kódující imunogeny mohou být dopraveny do buněk ex vivo, takových buněk, jako jsou buňky odebrané jednotlivému pacientovi (např.: lymfocyty, kostní dřeň, tkáňová biopsie) nebo univerzální donorové buňky hematopoetické větve, a následuje zpětná implantace těchto buněk pacientovi obvykle po vyselektování buněk, které mají začleněný vektor.

Pacienti přístupní k léčbě - Pacienti přístupní k léčbě zahrnují osoby u nichž je riziko výskytu choroby, ale nevykazují symptomy, právě tak jak pacienti, kteří v tomto momentě symptomy

• · • · • · · · * « a vykazují. V případě Alzheimerovy choroby je ve skutečnosti u každého riziko trpění Alzheimerovou chorobou, pokud on nebo ona žije dostatečně dlouho. Proto uváděné metody mohou být aplikovány profylakticky na obecnou populaci bez jakéhokoliv určení rizika vystavenému pacientovi. Předkládané metody jsou zvláště užitečné pro jednotlivce, u nichž je známé dědičné riziko Alzheimerovy choroby. Takový jednotlivci zahrnují ty, kteří mají mezi příbuznými osoby, u nichž se vyskytla tato choroba, a ti, u nichž bylo riziko určeno analýzou genetických a biochemických standardů. Genetické standardy rizika vzhledem k Alzheimerově chorobě zahrnují mutace v APP genu, zvláště mutace v pozici 717 a pozicích 670 a 671, známých jako Hardyho a švédská mutace, respektive (viz. Hardy, T1NS, výše). Ostatními standardy rizika jsou mutace v presenilinových genech, PSI a PS2, a ApoE4, rodinná historie Alzheimerovy choroby, hypercholesterolémie a ateroskleróza. Osoby právě trpící Alzheimerovou chorobou mohou být rozpoznáni podle charakteristické demence, právě tak jako podle výše popsaných rizikových faktorů. Kromě toho existuje řada diagnostických testů vhodných pro identifikaci osoby, které mají Alzheimerovu chorobu. Ty zahrnují měření hodnot CSF tau a A/?42. Vzrostlá hodnota tau a snížená hodnota A/?42 naznačují přítomnost Alzheimerovy choroby. Osoby trpící Alzheimerovou chorobou mohou být také diagnostikovány podle MMSE nebo ADRDA kritérií, jak je diskutováno v příkladech provedení vynálezu.

V případě asymptomatických pacientů může léčba začít vjakémkoliv věku (např.: v 10, 20, 30). Nicméně obvykle není nutné zahájit léčbu dříve než pacient dosáhne věku 40, 50, 60 nebo 70 let. Léčba obvykle vyžaduje násobné dávky po určitou dobu. Léčba může být monitorována testováním protilátek nebo odpovědí T-buněk nebo B-buněk na terapeutické činidlo (např.: Αβ peptid) po stanovenou dobu. Jestliže se odpověď snižuje, je indikována zesílená dávka.

V případě potenciálních pacientů s Downovým syndromem léčba může alternativně začít podáváním terapeutického činidla matce nebo krátce po narození.

Léčebné režimy - U profylaktických aplikací jsou farmaceutické prostředky nebo medikamenty podávány pacientovi citlivému k, nebo naopak u něhož se vyskytuje riziko, konkrétní chorobě v množství dostatečném k eliminaci nebo redukci rizika nebo zbrždění začátku vývoje choroby. U terapeutických aplikací jsou podávány prostředky nebo medikamenty pacientovi podezřelému, nebo již trpícímu takovouto chorobou, v množství dostatečném léčit, nebo přinejmenším zvláště zastavit, symptomy choroby a jí způsobené komplikace. Množství adekvátní tomu, aby toho bylo dosaženo, je definováno jako terapeuticky- nebo farmaceuticky-efektivní dávka. U obou, jak profylaktického, tak terapeutického režimu, jsou činidla obvykle podávána v několika dávkách tak dlouho, dokud nebyla dosažena dostatečná imunitní odpověď. Obvykle je imunitní odpověď monitorována a opakované dávky jsou podávány, pokud se imunitní odpověď začíná snižovat.

·· « · ·· tf··· • · • « • · * • 0 • 0 ·· *· • · · · · • · · · * • · · < · · • · · · · t *· »·

Účinné dávky prostředků podle předkládaného vynálezu pro léčbu výše popsaných podmínek se odlišují v závislosti na řadě odlišných faktorů, které zahrnují způsoby podávání, cílové místo, fysiologický stav pacienta, zda je pacientem lidská bytost nebo zvíře, ostatní podávané léky a zda léčba je terapeutická nebo profylaktická. Obvykle je pacientem lidská bytost, ale v případě některých onemocnění takových, jako je nemoc šílených krav, může být pacientem nehumánní savec takový, jako je hovězí dobytek. Léčebné dávky musejí mít optimální bezpečnou a účinnou koncentraci. Množství imunogenu závisí na tom zda je podávána také pomocná látka, u vyšších dávek se vyžaduje vynechání pomocné látky. Množství podávaného imunogenu je někdy různé, od 1 pg do 500 pg na pacienta, a mnohem častěji od 5 do 500 pg na injekci při humánním podávání. Příležitostně je použita vyšší dávka od 1 do 2 mg na injekci. Obvykle je používáno okolo 10, 20, 50 nebo 100 pg na každou humánní injekci. Četnost podávání injekcí se může významně odlišovat, od jednou denně, přes jednou za rok, pojednou za deset let. Jakýkoliv daný den, během něhož je dávka imunogenu podávána, je dávka vyšší než 1 pg/pacienta a obvykle vyšší než 10 pg/pacienta, pokud je podávána také pomocná látka, a vyšší než 10 pg/pacienta a obvykle než 100 pg/pacienta v nepřítomnosti pomocné látky. Typický režim zahrnuje imunizaci následovanou zesílenými injekcemi v 6 týdenních intervalech. Jiný režim zahrnuje imunizaci následovanou zesílenými injekcemi o 1,2 a 12 měsíců později. Jiný režim vyžaduje injektáž každé dva měsíce v životě. Alternativně mohou být zesílené injekce na nepravidelném základě, jak je indikováno monitorováním imunitní odpovědi. Pro pasivní imunizaci protilátkou je dávka v rozsahu od okolo 0,0001 do 100 mg/kg, mnohem častěji od 0,01 do 5 mg/kg hmotnosti hostitelova těla. Dávky nukleových kyselin, které kódují imunogeny, jsou v rozsahu od okolo 10 ng do lg, od 100 ng do 100 mg, 1 pg do 10 mg nebo 30 až 300 pg DNA na pacienta. Dávky infekčních virových vektorů se liší od 10 až 10⁹, nebo více virionů na dávku.

Činidla indukující imunitní odpověď mohou být podávána pro profylaktickou a/nebo terapeutickou léčbu parenterálním, lokálním, intravenózním, orálním, podkožním, intraperitoneální m, intranasálním nebo intramuskulárním způsobem. Nejobvyklejší cestou podávání je podkožní způsob, ačkoliv jiné způsoby mohou být stejně účinné. Dalším nejčastěji užívaným způsobem je intramuskulámí injikace. Tento typ injikace je nejčastěji prováděn do svalů na paži nebo noze. Intravenózní injikace, právě tak jako intraperitoneální injikace, intraarteriální, intrakraniální nebo intradermální injikace jsou také účinné pro vyvolání imunitní odpovědi. V případě některých metod jsou činidla injikována přímo do dané tkáně, kde jsou nakumulovány sraženiny.

Činidla podle předkládaného vynálezu mohou být volitelně podávána v kombinaci s jinými činidly, která přinejmenším částečně účinná při léčbě amyloidních onemocnění. V případě • · · · · · · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · · ····· ····· • · · · ···· ··· ···· ·· · ·· ··

Alzheimerovy choroby a Downova syndromu, u kterých se v mozku objevují amyloidní sraženiny, mohou být činidla podle předkládaného vynálezu podávána ve spojení sjinými činidly, která zvyšují průchod činidel podle předkládaného vynálezu přes bariéru krev-mozek.

Imunogenní činidla podle předkládaného vynálezu taková, jako peptidy, jsou někdy podávána v kombinaci s pomocnou látkou. Různé typy pomocných látek mohou být podávány v kombinaci s peptidem takovým, jako je A/? peptid, aby byla vyvolána imunitní odpověď. Upřednostňované pomocné látky zvyšují základní odpověď na imunogen bez způsobování konformačních změn v imunogenu, který zajišťuje kvalitativní formu odpovědi. Upřednostňovanými pomocnými látkami jsou síran hlinito-draselný, 3 De-O-acylovaný monofosforyl lipid A (MPL) (viz. GB

2220211). QS21 je triterpenglykosid nebo saponin izolovaný z kůry stromu Quillaja Saponaria

Molina, objeveného v Jižní Americe (viz. Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunii and

Adjuvant. Approach (eds. Powell & Newman, Pleum Press, NY, 1995); US Patent No. 5, 057,

540). Jinými pomocnými látkami jsou emulze olej-ve-vodě (takové, jako squalen nebo olej z burských oříšků), volitelně v kombinaci s látkami stimulujícími imunitu takovými, jako je monofosforyl lipid A (viz. Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Jinou pomocnou látkou je CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998). Alternativně může být A/? peptid napojen na pomocnou látku. Například lipopeptidová verze A/? peptidu může být připravena spojením palmitové kyseliny nebo jiných lipidů přímo sN-koncem Αβ peptidu, jak je popsáno pro hepatitis B antigen vakcinaci (Livingston, J. immunol. 159, 1383-1392 (1997)). Nicméně takové spojení by nemělo podstatně změnit konformaci Αβ peptidu, zrovna tak jako by nemělo mít vliv na přirozenou imunitní odpověď na něj. Pomocné látky mohou být podávány jako složka terapeutického prostředku s aktivním činidlem nebo mohou být podávány odděleně před, souběžně s nebo po podání terapeutického činidla.

Upřednostňovanou třídou pomocných látek jsou hlinité sole (síran hlinito-draselný) takové, jako hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitý. Takovéto pomocné látky mohou být použity spolu nebo bez jiných specifických imunostimulujících činidel takových, jako jsou MPL nebo 3DMP, QS21, polymerní nebo monomerní aminokyseliny takové, jako jsou polyglutamová kyselina nebo polylysin. Jinou třídou pomocných látek jsou emulze tvořící olej-ve-vodě. Takovéto pomocné látky mohou být použity spolu nebo bez jiných specifických imunostimulujících činidel takových, jako jsou muramyl peptidy (např.: N-acetylmuramyl-Lthreonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamil-L-alanin-2-(l'-2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)-ethylamin (MTP-PE), N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-LAla-dipalmitoxypropylamid (DTP-DPP) theramid™) nebo jiné složky bakteriální buněčné stěny.

·· ···· ·· ·· • ·· · · · · · • · · · · · · · ·· ·· ·· · · · • ··· ···· ··· ·· · · » *·

Emulze olej-ve-vodě zahrnují (a) MF59 (WO 90/14837), obsahující 5% Squalen, 0,5% Tween 80 a 0,5% Spán 85 (volitelně obsahují různá množství MTP-PE) tvořené submikronovými částicemi za použití mikrofluidizeru takového, jako je Model 110Y mikrofluidizeru (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF obsahující 10% Squalen, 0,4% Tween 80, 5% pluronikblokovaný polymer LI21 a thr-MDP, buď mikrofluidizované na submikronovou emulzi nebo vortexované tak, aby vznikly částice emulze o větší velikosti a (c) Ribi™ systém pomocné látky (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) obsahující 2% Squalen, 0,2% Tween 80 a jednu nebo více složek bakteriální buněčné stěny ze skupiny zahrnující monofosforylipid A (MPL), trehalosdimykolát (TDM) a skelet buněčné stěny (CWS), vhodněji MPL + CWS (Detox™). Jinou třídou upřednostňovaných pomocných látek jsou saponinové pomocné látky takové, jako je Stimulon™ (QS21, Aquila, Worcester, MA) nebo částice vytvořené od takových, jako jsou ISCOMy (imunostimulující komplexy) a ISCOMATRIX. Další pomocné látky zahrnují kompletní Freundovy pomocné látky (CFA) a nekompletní Freundovy pomocné látky (IFA). Jiné pomocné látky zahrnují cytokiny takové, jako interleukiny (IL-1, IL-2 a IL-12), makrofágový kolonii stimulující faktor (M-CSF), nádorový nekrózní faktor (TNF).

Pomocná látka může být podávána před, spolu s, nebo po podání imunogenu. Imunogen a pomocná látka mohou být zabaleny a dodávány ve stejné lahvičce nebo mohou být zabaleny v oddělených lahvičkách a smíšeny před použitím. Imunogen a pomocná látka jsou obvykle baleny s etiketou, která označuje zamýšlenou terapeutickou aplikaci. Jestliže imunogen a pomocná látka jsou zabaleny odděleně, balení obvykle obsahuje instrukce pro smíšení před použití. Výběr pomocné látky a/nebo nosiče závisí na stabilitě vakcíny obsahující pomocnou látku, způsobu aplikace, dávkovacímu programu, účinnosti pomocné látky pro druh organismů, u kterých je vakcína použita a, v případě lidských bytostí, je farmaceuticky akceptovatelná látka tou, která byla schválena nebo použitelná pro humánní podávání podle přiměřených regulačním podmínek. Například kompletní Freundova pomocná látka není vhodná pro humánní aplikaci. Síran hlinito-draselný, MPL a QS21 jsou upřednostňovány. Volitelně dvě nebo více odlišných pomocních látek může být použito společně. Upřednostňované kombinace zahrnují síran hlinitodraselný sMPL, síran hlinito-draselný sQS21, MPL s QS21 a síran hlinito-draselný, QS21 a MPL dohromady. Také nekompletní Freundova pomocná látka může být použita (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), volitelně v kombinaci s jakoukoliv pomocnou látkou, jako jsou síran hlinito-draselný, QS21 a MPL a všechny jejich kombinace. Činidla podle předkládaného vynálezu jsou často podávána jako farmaceutické prostředky zahrnující aktivní terapeutické činidlo, a různé jiné farmaceuticky akceptovatelné složky. Viz. Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). Upřednostňované formy závisí na zamýšleném způsobu podávání a • · · · • · ·· · · · · · • · · · ···· terapeutické aplikaci. Prostředky také mohou zahrnovat, v závislosti na požadovaném zadání, farmaceuticky akceptovatelné, netoxické nosiče a rozpouštědla, které jsou definovány jako částice obecně používané pro přípravu farmaceutických prostředků pro humánní a zvířecí použití. Rozpouštědlo je vybráno tak, aby nemělo vliv na biologickou aktivitu prostředku. Příkladem takových rozpouštědel je destilovaná voda, fyziologický fosfátem pufrovaný solný roztok, Ringerovy roztoky, roztok dextrózy Hankův roztok. Kromě toho farmaceutické prostředky nebo složení mohou také obsahovat jiné nosiče, pomocné látky nebo netoxické, neterapeutické, neimunogenní stabilizátory a podobně. Nicméně některé látky vhodné pro podávání zvířatům takové, jako kompletní Freundova pomocná látka, nejsou obvykle zahrnuty v prostředcích pro humánní použití.

Farmaceutické prostředky mohou také zahrnovat velké, pomalu metabolizovatelné makromolekuly takové, jako jsou proteiny, polysacharidy, polymléčné kyseliny, polyglykolové kyseliny a kopolymery (takové, jako jsou latexem upravená sepharóza, agaróza, celulóza a podobně), polymerní aminokyseliny, kopolymery aminokyselin a lipidové agragáty (takové, jako olejové kapičky a lipozomy). Kromě toho mohou mít tyto nosiče funkci jako imunostimulující činidla (to znamená jako pomocné látky).

Pro parenterální podávání mohou činidla podle předkládaného vynálezu být podávána jako injikovatelné dávky roztoků nebo suspenzí látky ve fyziologicky akceptovatelném rozpouštědle s farmaceutickým nosičem, kterým může být sterilní kapalina taková, jako jsou vodní oleje, solný roztok, glycerol nebo ethanol. Kromě toho pomocné látky takové, jako zvlhčovači nebo emulzní činidla, surfaktanty, pH pufrující látky a podobně, mohou být přítomny v prostředcích. Jinými složkami farmaceutických prostředků jsou ty, které jsou ropného, zvířecího, rostlinného nebo syntetického původu, například olej z burských oříšků, sojový olej a minerální olej. Obecně glykoly takové, jako jsou propylenglykol nebo polyethylenglykol, jsou upřednostňovanými kapalnými nosiči, zvláště u injikovatelných roztoků.

Obvykle jsou prostředky připravovány jako injikovatelné, buď jako kapalné roztoky nebo suspenze; pevné formy vhodné pro rozpuštění, nebo uvedení do suspenze, a kapalné částice předcházející injikaci mohou být také připraveny. Přípravek může být emulzifikován nebo enkapsulován v liposomech nebo mikročásticích takových, jako jsou polylaktid, polyglykolid nebo kopolymer pro zesílené působení pomocné látky, jak bylo diskutováno výše (viz. Langer, Science 249, 1527 (1990) a Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Činidla podle předkládaného vynálezu mohou být podávána ve formě injekce nebo očkovacího přípravku, který může být připraven takovým způsobem, aby umožňoval udržované nebo pulzující vypouštění aktivní složky.

9 ·· · · · · 9 9 9 9

9 99 9 · 9 9 · ·· 4 9 9 9 · · · ·· ·· · · >

999 9999

49*4 449 4949

Další přípravky vhodné pro ostatní způsoby podávání zahrnují orální, intranasální a plicní přípravky, čípky a transdermální aplikace.

V případě čípků, vazebná činidla a nosiče jsou obsaženy, například polyalkylenglykoly nebo triglyceridy; takové čípky mohou být vytvořeny ze směsí obsahujících aktivní ingredienci v rozsahu od 0,5 % do 10 %, vhodněji od 1 % do 2 %. Orální přípravky zahrnují excipienty takové, jako jsou manitol farmaceutických stupňů, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodný, celulóza a uhličitan hořečnatý. Tyto prostředky mají formu roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, kapslí, přípravků udržovaně vypouštějících aktivní látku nebo pudrů a obsahují od 10 % do 95 % aktivní složky, vhodněji od 25 % do 70 %.

Výsledkem povrchové aplikace může být transdermální nebo intradermální doprava. Povrchové podání může být zajišťováno spolupodáváním činidla stoxinem cholery nebo deriváty zbavenými toxicity nebo jejich podjednotkami nebo jinými podobnými bakteriálními toxiny (viz. Glenn et al., Nátuře 391, 851 (1998)). Spolupodávání může být dosaženo použitím složek jako směsí, nebo jako spojených molekul získaných chemickou vazbou nebo expresí jako íuzní protein.

Alternativně může být dosaženo transdermální dopravy použitím kožních náplastí nebo použitím trasferosomů (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta\368, 201-15 (1998)).

Diagnostické metody - Předkládaný vynález zajišťuje metody detekce imunitní odpovědi na Αβ peptid u pacienta trpícího nebo přístupného Alzheimerově chorobě. Metody jsou zvláště užitečné pro monitorování průběhu léčby, která je poskytována pacientovy. Metody mohou být použity pro monitorování obou, jak terapeutické léčby symptomatických pacientů, tak profylaktické léčby nesymptomatických pacientů.

Některé metody zajišťují určení základní hodnoty imunitní odpovědi u pacienta před podáním dávky činidla a porovnání této hodnoty s hodnotou imunitní odpovědi po léčbě. Významné zvýšení (to znamená vyšší než obvyklé rozpětí experimentální chyby u opakovaných měření stejného vzorku, vyjádřené jako jedna standardní odchylka od průměru těchto měření) hodnoty signálů imunitní odpovědi výsledku pozitivní léčby (to znamená, že podáváním činidla bylo dosažena nebo zvýšena imunitní odpověď). Jestliže hodnota imunitní odpovědi se významně nezměnila nebo se snížila, je indikován negativní výsledek léčby. Obecně u pacientů, kteří procházejí počátečním průběhem léčby činidlem, je očekáváno vykázání zvýšené imunitní odpovědi u úspěšných dávek, které eventuálně dosahují plata. Podávání činidla obvykle pokračuje dokud se zvyšuje imunitní odpověď. Dosažení plata je indikátorem, že poskytovaná léčba může být přerušena nebo snížena dávka nebo frekvence podávání.

• · · · · • •••••tt ·· tt

V případě jiných metod je určena kontrolní hodnota (to znamená průměr a standardní odchylka) imunitní odpovědi u kontrolní populace. Obvykle jednotlivci v kontrolní populaci dříve nedostávali žádnou léčbu. Změřené hodnoty imunitní odpovědi u pacienta po podání terapeutického činidla jsou pak porovnány s kontrolní hodnotou. Významné zvýšení vzhledem ke kontrolní hodnotě (např.: vyšší než jedna standardní odchylka od průměru) signalizuje pozitivní léčebný výsledek. Podávání činidla obecně pokračuje do té doby, dokud se imunitní odpověď vzhledem k ke kontrolní hodnotě zvyšuje. Stejně jako před tím, dosažení plata vzhledem ke kontrolním hodnotám indikuje, že podávání léčiva může být přerušeno nebo redukována jeho dávka nebo frekvence podávání.

V případě jiných metod kontrolní hodnota imunitní odpovědi (to znamená průměr a standardní odchylka) je určena u kontrolní populace jedinců, kteří podstoupili léčbu s terapeutickým činidlem a jejichž imunitní odpovědi dosáhly plata v odpovědi na léčbu. Změřené hodnoty imunitní odpovědi u pacienta jsou porovnávány s kontrolní hodnotou. Pokud změřená hladina u pacienta není významně odlišná (to znamená více než jedna standardní odchylka) od kontrolní hodnoty, může být léčba přerušena. Jestliže hodnota u pacienta je významně pod kontrolní hodnotou, pokračující podávání činidla je zaručeno. Jestliže hladina u pacienta setrvává pod kontrolní hodnotou, pak může být indikována změna v léčebném režimu, například použití jiné podpůrné látky.

V případě jiných metod je u pacienta, který v současné době neprodělává léčbu, ale v minulosti prošel procesem léčby, monitorována imunitní odpověď, aby bylo určeno zda je nezbytné znovuzahájení léčby. Změřená hodnota imunitní odpovědi u pacienta může být porovnána s hodnotou imunitní odpovědi u pacienta dříve dosažené po předchozí léčebném cyklu. Významné snížení vzhledem k předchozímu měření (to znamená vyšší než obvyklé rozpětí chyby u opakovaných měření stejného vzorku) je indikací, že léčba může být zahájena. Alternativně může být hodnota změřená u pacienta porovnána s kontrolní hodnotou (průměr plus standardní odchylka) určenou prou populaci pacientů, kteří prošli léčebným cyklem.

Alternativně může být hodnota změřená u pacienta porovnána s kontrolní hodnotou získané od populace profylakticky léčených pacientů, u kterých se neobjevily symptomy choroby, nebo od populace terapeuticky léčených pacientů, kteří vykazují zlepšené charakteristiky choroby. Ve všech těchto případech je významné snížení vzhledem ke kontrolní hladině (to znamená více než standardní odchylka) indikátorem, že by léčba u pacienta měla být znovu zahájena.

Tkáňovým vzorkem pro analýzu je obvykle krev, plazma, sérum, kapalina mukózní sliznice nebo mozkomíšní kapalina pacienta. U vzorku je analyzována indicie imunitní odpovědi na jakoukoliv formu Αβ peptidu, obvykle na Αβ42. Imunitní odpověď může být určena z přítomnosti, například, protilátek nebo T-buněk, které specificky váží Αβ peptid. ELISA metody detekce • · · · protilátek specifických pro Αβ peptid jsou popsány v příkladech provedení vynálezu. Metody detekce reaktivních T-buněk byly popsány výše (viz. definice).

Předkládaný vynález dále zajišťuje diagnostické sady pro provádění výše popsaných diagnostických metod. Obvykle takové sady obsahují činidlo, které se specificky váže k protilátkám proti Αβ peptidu nebo reaguje s T-buňkami specifickými pro Αβ peptid. Sada také může obsahovat značku. Pro detekci protilátek proti Αβ peptidu je obvykle značka ve formě značených antiidiotypických protilátek. Pro detekci protilátek může být činidlo dodáváno navázané na pevnou fázi takovou, jako jsou jamky mikrotitrační destičky. Pro detekcí reaktivních T-buněk může být značka dodávána jako ³H-thymidin, aby se měřila proliferační odpověď. Sady také obvykle obsahují návod zjišťující značení při použití sady. Značení může také zahrnovat diagram nebo jiný odpovídající režim vztahující hladiny změřené značky k hladinám protilátek proti Αβ peptidu nebo T-buněk reaktivních s Αβ peptidem. Výraz značení odkazuje k jakémukoliv psanému nebo zaznamenanému materiálu, který je připojen k, nebo jinak spojen se sadou v jakékoliv době během níž je sada vyráběna, transportována, prodávána nebo používána. Například termín značení zahrnuje inzerční letáky a brožurky, obalové materiály, návody, audio a videokazety, počítačové disky právě tak, jako nápisy vytištěné přímo na sadách.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obrázek 1: Koncentrace protilátky po injikaci A/Ů-42 do transgenních myší.

Obrázek 2: Amyloidní zátěž v hipokampu. Procento plochy hipokampální oblasti, která je okupována amyloidními plaky, definovanými reaktivitou s A/?-specifickým mA/? 3D6, bylo určeno za pomoci počítače kvantitativní obrazovou analýzou mozkových imunoreaktivních sekcí. Hodnoty pro jednotlivé myši jsou uvedeny rozdělené podle léčené skupiny. Horizontální čára pro každé seskupení vyznačuje střední hodnotu distribuce.

Obrázek 3: Neuritická dystrofie v hipokampu. Procento plochy hipokampální oblasti okupované dystrofickými neurity, definovanými jejich reaktivitou s humánním APP-specifickým mA/?8E5, bylo určeno za pomoci počítače kvantitativní obrazovou analýzou mozkových imunoreaktivních sekcí. Hodnoty pro jednotlivé myši jsou uvedeny pro skupinu léčenou AN1792 a kontrolní skupinu léčenou PBS. Horizontální čára pro každé seskupení vyznačuje střední hodnotu distribuce.

Obrázek 4: Astrocytóza v retrospleniálním kortexu. Procento plochy kortikální oblasti, která je okupována gliálním fibrilárním acidickým proteinem (GFAP) - pozitivní astrocyty byly určeny • · · · · · ·· ·· • · 1 · · • · · · · za pomoci počítače kvantitativní obrazovou analýzou mozkových imunoreaktivních sekcí.

Hodnoty pro jednotlivé myši jsou uvedeny rozdělené podle léčené skupiny. Horizontální čára pro každé seskupení vyznačuje střední hodnotu distribuce.

Obrázek 5: Geometrický průměr koncentrací k A/71-42 následujících imunizaci v rozpětí osmi dávek AN1792 obsahující 0,14; 0,4; 1,2; 3,7; 11; 33; 100 nebo 300 pg.

Obrázek 6; Kinetika odpovědi protilátek na ANI 792 imunizaci. Koncentrace jsou vyjádřeny jako geometrické průměry hodnot pro 6 zvířat v každé skupině.

Obrázek 7; Kvantitativní obrazová analýza kortikální amyloidní zátěže u PBS- a ANI 792léčených myší.

Obrázek 8: Kvantitativní obrazová analýza neuritické plakové zátěže u PBS- a AN1792-léčených myší.

Obrázek 9: Kvantitativní obrazová analýza procenta retrospleniálního kortexu okupovaného astrocytózou u PBS- a AN1792-léčených myší.

Obrázek 10: Test proliferace lymfocytů na slezinných buňkách z AN1792-léčených (horní panel) nebo PBS-léčených (dolní panel).

Obrázek 11: Celková hladina Αβ peptidů v kortexu. Rozptýlení jednotlivých Αβ peptidových profilů v myších imunizovaných Αβ peptidem nebo APP deriváty kombinovanými s Freundovou pomocnou látkou.

Obrázek 12: Amyloidová zátěž v kortexu byla určena kvantitativní obrazovou analýzou mozkových imunoreaktivních sekcí u myší imunizovaných Αβ peptidovými konjugáty Α/Π-5, A/?l-12 a A/713-28; celodélkovými Αβ peptidovými agregáty AN1792 (Α/Π-42) a AN1528 (A/71-40) a pro PBS-léčenou kontrolní skupinu.

Obrázek 13: Geometrický průměr koncentrací A/?-specifické protilátky pro skupiny myší imunizovaných Αβ peptidem a APP deriváty kombinovanými s Freundovou pomocnou látkou. Obrázek 14: Geometrický průměr koncentrací A/7-specifické protilátky pro skupiny morčat imunizovaných ANI792, nebo jeho deriváty s palmitoylem, kombinované s různými pomocnými látkami.

Obrázek 15: Hladiny Αβ peptidů v kortexu u 12 měsíců starých PDAPP myší léčených ANI792 nebo ANI528 s odlišnými pomocnými látkami.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Příklad 1 - Profylaktická účinnost Αβ peptidů proti Alzheimerově chorobě

9999 > · 9 k · ·

99 9 ► 99

9 9

9 · • ····

Tyto příklady popisují podávání Αβ 42 peptidu transgenním myší se zvýšenou expresí APP s mutací v pozici 717 (APP717v->f), která u nich předurčuje vyvinutí neuropatologíe jako v případě Alzheimerovy choroby. Produkce a charakteristiky těchto myší (PDAPP myší) jsou popsány v Games et al., Nátuře, výše. Tato zvířata, v jejich heterozygotní formě, začínají předčasně ukládat Αβ peptid ve věku 6 měsíců. Ve věku patnácti měsíců vykazují hladiny uloženého Αβ peptidu ekvivalentní těm pozorovaným v případě Alzheimerovy choroby. PDAPP myši byly injikovány agregovaným Αβν. (agregovaný Αβ^β nebo fosfátem pufrovaným roztokem NaCl. Agregovaný Αβ_η byl vybrán díky své schopnosti zavést protilátky k násobným epitopům Αβ peptidu.

A. Metody

1. Zdroj myší - Třicet PDAPP heterogenních myších samiček bylo náhodně rozděleno do následujících skupin: 10 myší bylo injikováno agregovaným Αβν. (jedna zemřela při tranzitu), 5 myší bylo injikováno PBS/pomocnou látkou nebo PBS a 10 myší jako neinjikovaná kontrola. Pět myší bylo injikováno sérovým amyloidním proteinem (SAP).

2. Příprava imunogenů - Příprava agregovaného Αβ^. dva miligramy Αβ_η (US Peptides lne, lot K-42-12) bylo rozpuštěno v 0,9 ml vody a doplněno na 1 ml přidáním 0,1 ml 10 x PBS. Směs byla vortexována a ponechána inkubovat přes noc při 37 °C, při těchto podmínkách se peptid agreguje. Jakýkoliv nepoužitý Αβ peptid byl skladován jako lyofilizovaný prášek při -20 °C do následující injikace.

3. Příprava injekcí - 100 pg agregovaného Αβ_η v PBS na jednu myš bylo emulzifikováno 1:1 s kompletní Freundovou pomocnou látkou (CFA) v konečném objemu 400 μΐ emulze pro první imunizaci, následovanou podporou stejným množstvím imunogenu v nekompletní Freundově pomocné látce (IFA) po dvou týdnech. Dvě další dávky v IFA byly podány v měsíčních intervalech. Následující imunizace byly provedeny v měsíčních intervalech v 500 pl PBS. Injekce byly aplikovány intraperitoneálně (i.p.)

PBS injekce byly podávány podle stejného programu a myši byly injikovány směsí 1:1 PBS/pomocná látka o objemu 400 μΐ na jednu myš nebo 500 μΐ PBS na jednu myš. SAP injekce byly podobně podávány podle stejného programu za použití dávky 100 pg na jednu injekci.

4. Titrace myší krve, příprava tkáně a imunohistochemie - zmíněné metody jsou popsány dále v obecných materiálech a metodách.

B. Výsledky

PDAPP myši byly injikovány buď agregovaným Αβ^ (agregovaný A/fo), SAP peptidy nebo fosfátem pufrovaným roztokem NaCl. Skupina PDAPP myší byla také ponechána nezainjikovaná, pozitivní kontroly. Koncentrace agregovaného Αβη u myší byly monitorovány

0 0 0 0 ·

0 0 0 0 0 0 0 0 • 0 00 0 0 0 0

0 0 0

0000

0 0 0 0 0 0 0 0 00 každý další měsíc od čtvrté podpůrné dávky do té doby, dokud myši nebyly staré jeden rok. Myši byly utraceny v 13 měsících věku. Ve všech měřených časových bodech osm z devíti myší injikovaných agregovaným A/?₄₂ vytvořilo vysokou koncentraci protilátky, která zůstala vysoká po dobu celé série injikací (koncentrace vyšší než 1/10000). Devátá myš měla nízkou, ale měřitelnou koncentraci přibližně 1:1000 (obrázek 1, tabulka 1). SAPP injikované myši měly koncentraci od 1:1000 do 1:30000 pro tento imunogen s pouze jednou myší přesahující 1:100000.

PBS-léčené myči byly titrovány na agregovaný A/?₄₂ šesti, deseti a dvanácti měsících. Při ředění 1/100 PBS myši, když byly titrovány na agregovaný A/?₄₂, pouze vjednom datovém bodě přesáhly čtyřikrát pozadí, jinak měly méně než čtyřikrát pozadí ve všech datových bodech (tabulka 1). SAP-specifická odpověď byla zanedbatelná v těch časových bodech, kde všechny koncentrace byly nižší než 300.

U sedmi z devíti myší ze skupiny s agregovaným A//1-42 nebyl detekován amyloid v jejich mozcích. Naopak mozková tkáň u myší ze skupin SAP a PBS obsahovala řadu 3D6-positivních amyloidních sraženin v hipokampu právě tak, jako ve frontálním a cingulátním kortexu. Vzor sraženiny byl stejný tomu, získanému s neléčených kontrol, s charakteristickým obsahem napadnutelných podoblastí takových, jako je vnější molekulová vrstva hipokampálního mozkového závitu. Jedna myš ze skupiny injikované A//1-42 měla vysoce redukovanou amyloidní zátěž omezující se na hipokampus. Ohraničený plak byl identifikován u jiné A//1-42 léčené myši.

Kvantitativní obrazová analýza amyloidní zátěže v hipokampu určila dramatickou redukci dosaženou u AN1792-léčených zvířat (obrázek 2). Střední hodnoty amyloidní zátěže u PBS skupiny (2,22%) a u neléčené kontrolní skupiny (2,65%) byly významně vyšší než u těch myší, které byly imunizovány ANI792 (0,00%, p = 0,0005). Naopak střední hodnota pro skupinu s SAP peptidy (SAPP) byla 5,74%. Mozková tkáň z neléčených kontrolních myší obsahovala řadu Αβ amyloidních sraženin vyzualizovaných A//-specifickou monoklonální protilátkou (mAb) 3D6v hipokampu právě tak, jako v retrosplenialním kortexu. Podobný vzor amyloidní sraženiny byl také pozorován u myší imunizovaných buď SAPP nebo PBS (obrázek 2). Kromě toho v těchto pozdějších třech skupinách byl charakteristický obsah napadnutelných podoblastí mozku klasicky pozorovatelných jako v případě Alzheimerovy choroby, takových, jako je vnější molekulová vrstva hipokampálního mozkového závitu, ve všech těchto třech skupinách.

Mozky, které neobsahují Αβ sraženiny také postrádaly neuritické plaky, které jsou obvykle vizualizovány u PDAPP myší s humánní APP protilátkou 8E5. Všechny mozky ze zbývajících skupin (SAP-injikované, PBS a neinjikované myši) měly řadu neuritických plaků typických pro

9* 99 9999 99 99 • 9 9 9 9999

9* 9 9999

999 99 9* 99 *

99* 9999

999 9999 99 * 99 99 neléčené PDAPP myši. Malé množství neuritických plaku bylo přítomno v jedné myši léčené ANI792 a jeden shluk dystrofických neuritů byl nalezen u druhé myši léčené ANI792. Obrazová analýza hipokampu, ukázáno na obrázku 3, demonstrovala opravdovou eliminaci dystrofických neuritů u AN1792-léčených myší (střed 0,00%) v porovnání s PBS recipienty (střed 0,28%, p = 0,0005).

Astrocytóza charakteristická pro zánět spojený s tvorbou plaků byla také nepřítomna v mozcích skupiny injikované A/71-42. Mozky od myší z ostatních skupin obsahovaly hojné a shluklé GFAP-pozitivní astrocyty typické pro s Αβ plaky spojenou gliózu. Podskupina GFAPreagujících vzorků na podložním sklíčku byla obarvena thioflavinem S a počítána, aby byly lokalizovány Αβ sraženiny. GFAP-pozitivní astrocyty byly asociovány s Αβ plaky u SAP, PBS a neléčených kontrol. Žádná taková asociace nebyla pozorována u, na plaky negativních, Αβ 142 léčených myší, zatímco minimální, splaky spojená, glióza byla identifikována v jedné myši léčené ANI792.

Obrazové analýzy, ukázáno na obrázku 4, retrospleniálního kortexu určily, že snížení astrocytózy bylo významné pro střední hodnotu 1,56% u těch myší, které byly léčeny ANI792, oproti středním hodnotám vyšším než 6% u skupin imunizovaných SAP peptidy, PBS nebo neléčených (p = 0,0017).

Důkaz z skupiny Αβ 1-42 injikovaných a PBS injikovaných myší indikující s plaky spojenou MHC II imunoreaktivitu byl nepřítomný u Αβ 1-42 injikovaných myší v souladu s nedostatečnou, k Αβ peptidů se vztahující, zánětlivou odpovědí.

Sekce myších mozků také reagovaly s η\Αβ specifickým pro MAC-1, buněčným povrchovým proteinem. MAC-1 (CDllb) je členem rodiny a existuje jako heterodimer sCD18. Komplex CDllb/CD18 je přítomen v monocytech, makrofázích, neutrofilech a přirozených zabijáckých buňkách (Mak a Simard). MAC-1-reaktivní buněčný typ sídlící v mozku je pravděpodobně, aby byl mikroglií, založen na podobné fenotypické morfologii v MAC-1 imunoreaktivních sekcích. Značení splaky spojeného MAC-1 bylo nižší v mozcích myší léčených ANI 792 v porovnání s PBS kontrolní skupinou, nalézající soulad s nedostatečnou A/?-indukovanou zánětlivou odpovědí.

C. Závěr

Nedostatek Αβ plaků a reaktivních neuronálních a gliotických změn v mozcích A/71-42injikovaných myší indikuje, že žádné nebo velmi malé množství amyloidu se srazilo vjejich mozcích a patologické následky takové, jako gliózy a neuritická patologie nebyly přítomny. PDAPP myši léčené Αβ\-42 vykazují hlavně stejný nedostatek patologie jako kontrolní netransgenní myši. Proto jsou A/?l-42 injekce vysoce efektivní při prevenci před ukládáním nebo • « · · · · · · ♦ · 9 9

9 9 9 ···· fc 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 fcfc · • ··· fc··· ··· ···· ·· · ·· ·· při odstraňování humánního Αβ peptidu z mozkové tkáně a eliminaci následných neuronálních a zánětlivě degenerativních změn. Tudíž podávání Αβ peptidu má terapeutický prospěch při prevenci proti Alzhei měrově chorobě.

Příklad 2 - Studie odpovědi na dávku

Skupiny pět týdnů starých, samiček Swiss Webster myší (N = 6 na skupinu) byly imunizovány 300; 100; 33; 11; 3,7; 1,2; 0,4 nebo 0,13 pg Αβ obsaženém v CFA/IFA podáváním intraperitoneálně. Tři dávky byly podány v dvoutýdenních intervalech a následovány čtvrtou dávkou o jeden měsíc později. První dávka byla emulzifikována sCFA a zbývající dávky byly emulzifikovány s IFA. Zvířatům byla odebrána krev 4 až 7 dní po každé imunizaci počínajíce druhou dávkou, aby byly změřeny koncentrace protilátky. Zvířatům z podskupin tří skupin, těm která byla imunizována 11; 33 nebo 300 pg antigenu, byla navíc odebrána krev v přibližně měsíčních intervalech po dobu čtyř následujících měsíců po čtvrté imunizaci, aby byl monitorován úpadek imunitní odpovědi v rozpětí vakcinačních dávek. Tato zvířata obdržela poslední pátou imunizaci sedmý měsíc poté, co byla studie zahájena. Zvířata byla utracena o jeden týden později, aby byly změřeny protilátkové odpovědi na AN1792 a provedeny toxikologické analýzy.

Snižující se odpověď na dávku byla pozorována od 300 do 3,7 pg s žádnou odpovědí na dvě nejnižší dávky. Průměrné koncentrace protilátky jsou okolo 1:1000 po 3 dávkách a okolo 1:10000 po 4 dávkách 11 až 300 pg antigenu (viz. obrázek 5).

Koncentrace protilátek rostou dramaticky pro všechny dávky, ale nejnižší dávková skupina následující třetí imunizaci má zvýšení v GMT v rozmezí od 5 do 25-krát. Nízké odpovědi protilátek byly pak detekovatelné pro dokonce 0,4 pg dávku u recipientů. Skupiny 1,2 a 3,7 pg měly porovnatelné koncentrace v GMT okolo 1000 a čtyři nejvyšší dávky shluknuté společně s GMT okolo 25000, kromě 33 pg dávkové skupiny s nižší GMT okolo 3000. Po čtvrté imunizaci bylo zvýšení koncentrace mnohem mírnější pro většinu skupin. Byla zde jasná dávková odpověď přes skupiny s nejnižší dávkou antigenu od 0,14 pg do 11 pg, kde škála byla od neděkované protilátky u recipientů s 0,14 pg k GMT 36000 pro recipienty sil pg. Opět koncentrace pro čtyři nejvyšší dávkové skupiny od 11 pg do 300 pg byly shluklé dohromady. Tudíž po dvou imunizacích byla koncentrace protilátky závislá na dávce antigenu přes širokou škálu od 0,4 do 300 pg. Po třetí imunizaci byly koncentrace pro čtyři nejvyšší dávky všechny porovnatelné a zůstaly na platu po dodatečné imunizaci.

• A A · A A

A A A A AA AA

Jeden měsíc po čtvrté imunizaci byly koncentrace 2- až 3-krát vyšší u 300 μg skupiny, než ty, které byly měřeny z krve odebrané pět dnů po imunizaci, (obrázek 6).

Na základě tohoto pozorování se předpokládá, že se pík anamnestické protilátkové odpovědi objevil později než 5 dnů po imunizaci. Mnohem mírnější (50%) zvýšení bylo pozorováno v tomto případě u 33 pg skupiny. V případě 300 pg dávkové skupiny dva měsíce po poslední dávce se GMT prudce snížila o 70 %. Po dalším měsíci bylo snížení méně prudké o 45 % (100 pg) a o 14 % pro dávky 33 a 11 pg. Tudíž rychlost snížení v cirkulujících koncentracích protilátky po imunizační pauze se jeví být dvoufázová s prudkým snížením prvním měsíci po píku odpovědi, následovaná potom mnohem mírnější rychlostí poklesu.

Koncentrace protilátky a kinetika odpovědi těchto Swiss Webster myší jsou podobné mladým heterozygótním PDAPP transgenním myším imunizovaným paralelním způsobem. Dávky účinné k vyvolání imunitní odpovědi u lidí jsou obvykle podobné dávkám účinným u myší.

Příklad 3 - Hledání terapeutické účinnosti proti již rozvinuté Alzheimerově chorobě

Tento test je vytvořen tak, aby mohla být testována imunogenní činidla na jejich aktivitu zastavit nebo zvrátit neuropatologické charakteristiky Alzheimerovy choroby u starých zvířat. Imunizace s 42 aminokyselin dlouhým Αβ (AN1792) byla zahájena v době, kdy byly amyloidní plaky již přítomny v mozcích PDAPP myší.

Po dobu stanovenou pro tuto studii se u neléčených PDAPP myší vyvíjela řada neurodegenerativních změn, které se podobají těm, které byly nalezeny v případě Alzheimerovy choroby (Games et al., výše a Johanson-Wood et al., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)). Ukládání Αβ amyloidních plaků je spojeno s degenerativní neuronální odpovědí, která zahrnuje aberační axonal a dendritické elementy, nazývané dystrofické neurity. Amyloidní sraženiny, které jsou obklopeny a obsahují dystrofické neurity, se nazývají neuritické plaky. U obou, jak myši s Alzheimerovou chorobou, tak PDAPP myši, mají dystrofické neurity zřetelnou globulární strukturu, jsou imunoreaktivní s skupinou protilátek, které rozeznávají APP a cytoskeletální složky a vykazují komplexní subcelulární degenerativní změny na ultrastrukturní úrovni. Tyto charakteristiky umožňují měření určující závažnost onemocnění, selektivní a reprodukovatelné měření neuritických plakových formací v PDAPP mozcích. Dystrofická neuronální složka PDAPP neuritických plaků je snadno vizualizovatelná protilátkou specifickou pro humánní APP (mA/í 8E5), a je rychle měřitelná za pomoci počítače obrazovou analýzou. Proto, kromě měření účinků ANI792 na amyloidní plakové formace, jsme monitorovali účinky této léčby na vývoj neuritické dystrofie.

• Φ «*·»

φφ *· φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ « • φ φ φ φ φ *·

Astrocyty a mikroglia jsou neneuronální buňky, které odpovídají stupni a odrážejí stupeň neuronálního poškození. GFAP-pozitivní astrocyty a MHC II-pozitivní mikroglia jsou obecně pozorovány v případě Alzheimerovy choroby a jejich aktivace se zvyšuje s tím, jak je choroba těžká. Proto jsme také monitorovali vývoj reaktivních astrocytů a mikroglií u AN1792-léčených myší.

A. Materiál a metody

Čtyřicet osm heterozygotních samiček PDAPP myší, věku od 11 do 11,5 měsíců, získaných od Charles River, bylo náhodně rozděleno do dvou skupin: 24 myší, aby bylo imunizováno 100 pg ANI792 a 24 myší, aby bylo imunizováno PBS, každé činidlo v kombinaci s Freundovou pomocnou látkou. Skupiny ANI792 a PBS byly opět rozděleny, když myší dosáhly ~15 měsíců věku. V patnácti měsících věku byla přibližně polovina z každé skupiny AN1792- a PBSléčených zvířat utracena (n = 10 a 9, respektive), zbytek pokračoval v přijímání imunizace až do ukončení v ~18 měsících věku (n = 9 a 12, respektive). Celkem 8 zvířat zemřelo během studie (5 AN1792, 3 PBS). Kromě imunizovaných zvířat pokus zahrnoval jeden rok staré (n = 10), 15 měsíců staré (n = 10) a 18 měsíců staré (n = 10) neléčené PDAPP myši pro porovnání metodou ELISA, aby byly měřeny hladiny Αβ a APP v mozku; jednoroční zvířata byla také začleněna do imunohistochemických analýz.

Metodologie byla stejná jako v příkladu jedna jestliže není uvedeno jinak. US Peptides šarže 12 a California Peptides šarže ME0339 látky AN1792 bylo použito k přípravě antigenu pro šest imunizací podávaných před časovým bodem 15 měsíců. California Peptides šarže ME0339 a ME0439 byly použity pro tři další imunizace podávané mezi 15 a 18 měsíci.

Pro imunizace bylo emulzifíkováno 100 pg ANI792 v 200 pl PBS nebo PBS samotné 1:1 (V/V) s kompletní Freundovou pomocnou látkou (CFA) nebo nekompletní Freundovou pomocnou látkou (IFA) nebo PBS do konečného objemu 400 μΐ. První imunizace byla podána s CFA jako pomocnou látkou, další čtyři dávky byly podány s IFA a poslední čtyři dávky se samotným PBS bez přidané pomocné látky. Všech devět imunizací bylo podáno v časové období sedmi měsíců v dvoutýdenním plánu pro první tři dávky, následováno čtyřtýdenním intervalem pro zbývající injekce. Skupina léčená čtyři měsíce byla utracena ve věku 15 měsíců a obdržela tedy pouze prvních šest imunizací.

B. Výsledky

1. Účinky léčby AN1792 na amyloidní zátěž - Výsledky léčby AN1792 kortikální amyloidní zátěže určené kvantitativní obrazovou analýzou jsou ukázány na obrázku 7. Střední hodnota kortikální amyloidní zátěže byla 0,28% ve skupině neléčených 12 měsíců starých PDAPP myší, hodnota reprezentující plakové zatížení u myší na počátku studie. Po 18 měsících ···· ·· « · • · »· »· • · · « » · · « • · · * • · · · • * »# amyloidní zátěž vzrostla 17-krát na 4,87% u PBS-léčených myší, zatímco AN1792-léčené myši měly amyloidní zátěž vysoce redukovanou na pouze 0,01%, významně méně než 12 měsíců neléčené a obě 15 a 18 měsíců PBS-léčené skupiny. Amyloidní zátěž byla významně snížena u ANI792 příjemců, u obou, jak 15 měsíců (96% snížení, p = 0,003), tak 18 měsíců (>99% snížení, p = 0,0002) starých.

Obvykle amyloidní ukládání začíná u PDAPP myší ve frontální a retrospleniální kůře (RSC) a vyvíjí se ve ventrálně-laterálním směru, aby dosáhlo temporální a entorhinální kůry (EC). Malé množství amyloidu nebo žádné bylo nalezeno vEC oblasti u 12 měsíců starých myší, což je přibližně věk, ve kterém bylo poprvé podáno ANI792. Po 4 měsících ANI792 léčby se amyloidní ukládání významně snížilo v RSC a progresivní zapojení EC bylo zcela eliminováno ANI792 léčbou. Pozdější pozorování ukázalo, že ANI792 zcela zastavilo progresi amyloidu, který by normálně napadnul temporální a ventrální kůry právě tak, jako zastavilo nebo možná zvrátilo ukládání v RSC.

Vážné účinky ANI792 léčby na vývoj kortikální amyloidní zátěže u PDAPP myší jsou dále demonstrovány na skupině myší 18 měsíců starých, která byla léčena po dobu sedmi měsíců. Byla nalezena téměř kompletní absence kortikálního amyloidu u AN1792-léčených myší, s totálním úbytkem rozptýlených plaků právě tak, jako úbytek kompaktních sraženin.

2. Buněčné a morfologické změny spojené s ANI792 léčbou - Populace A/?-pozitivních buněk byla nalezena v oblastech mozku, které obvykle obsahují amyloidní sraženiny. Pozorovatelně, v několika mozcích od ANI792 příjemců, bylo nalezeno jen velmi málo nebo žádné extracelulámí kortikální plaky. Většina Αβ imunioreaktivity se jeví být obsažena uvnitř buněk s velkým lobulárním nebo chomáčovitým sóma. Fenotypicky se tyto buňky podobají aktivovaným mikrogliím nebo monocytům. Byly imunoreaktivní s protilátkami rozoznávajícími ligandy exprimovanými aktivními monocyty a mikroglii (MHC II a CDllb) a byly příležitostně spojeny s stěnou nebo lumen krevních řečišť. Porovnání blízko přilehlých oblastí značných Afinebo MHC Π-specifickými protilátkami odhalilo, že podobné vzory těchto buněk byly rozpoznávány oběma třídami protilátek. Detailní prozkoumání AN1792-léčených mozků odhalilo, že MHC II-pozitivní buňky byly omezeny sousedstvím limitovaného amyloidu zbývajícího u těchto zvířat. Za použití daných podmínek buňky nebyly imunoreaktivní s protilátkami, které rozeznávají T buněčné (CD3, CD3e) nebo B buněčné (CD4RA, CD4RB) ligandy nebo obecný leukocytový antigen (CD45), ale reagovaly s protilátkou rozeznávající leukosialin (CD43), který křížově reaguje s monocyty. Žádné takové buňky nebyly nalezeny u PBS-léčených myší.

• · · · ·· · · · · · · · ··· ···· ·· « ·· ··

PDAPP myši konstantně vyvíjejí těžké ukládání amyloidu ve vnější molekulární vrstvě hipokampálního mozkového závitu. Ukládání tvoří odlišný pruh uvnitř perforační cesty, podoblasti, která obvykle obsahuje amyloidní plaky v případě Alzheimerovy choroby. Charakteristické zjevení se těchto sraženin u PBS-léčených myší se podobá tomu, již dříve charakterizovanému u neléčených PDAPP myší. Ukládání amyloidu zahrnovalo obě, jak rozptýlené, tak kompaktní plaky v kontinuálních skupinách. Naopak u řady mozků od AN1792léčených myší byl tento vzor drasticky změněn. Hipokampální amyloidové ukládání více neobsahovalo rozptýlený amyloid a skupinový vzor byl zcela přerušen. Navíc byla přítomna řada neobvyklých tečkovaných struktur, které jsou reaktivní s anti-A/? protilátkami, a řada z nich se jeví být buňkami, které obsahují amyloid.

MHC II-pozitivní buňky byly často pozorovány v sousedství extracelulárního amyloidu u AN1792-léčených zvířat. Vzor asociace A/?-pozitivních buněk s amyloidem byl velmi podobný v řadě mozků z AN1792-léčených myší. Distribuce těchto monocytických buněk byla omezena bezprostřední přítomnost uloženého amyloidu a byla zcela nepřítomná v jiných oblastech mozku postrádajících Αβ plaky.

Kvantitativní obrazová analýza MHC II a MAC I-značených oblastí odhalila trend směrem k zvyšující se imunoreaktivitě vRSC a hipokampu u AN1792-léčených myší v porovnání se skupinou PBS, která dosáhla významu s měřením MAC 1 reaktivity v hipokampu.

Tyto výsledky indikují aktivní, buňkami zprostředkovávané odstranění amyloidu z oblastí mozku nesoucích plaky.

3. Vlivy ΑΝ 1792 na hladiny A/?: ELIS A určení (a) Kortikální hladiny - U neléčených PDAPP myší byla střední hladina celkového Αβ peptidu v kortexu, v 12 měsíci, 1600 ng/g, a která se zvýšila na 8700 ng/g v 15 měsíci (tabulka 2). V 18 měsících byla hodnota 22000 ng/g, zvýšení bylo více než 10-násobné za dobu průběhu experimentu. PBS-iéčená zvířata měla 8600 ng/g celkového Αβ peptidu v 15 měsících, což se zvýšilo na 19000 ng/g v 18 měsících. Naopak AN1792-léčená zvířata měla o 81 % menší hladinu celkového Αβ peptid v 15 měsících (1600 ng/g), než PBS-imunizovaná skupina. Významně nižší (p = 0,0001) celkové množství Αβ peptidu (5200 ng/g) bylo nalezeno u 18 měsíčních myší, když byly porovnávány ANI792 a PBS skupiny (tabulka 2), což představovalo 72% snížení Αβ peptidu, který by jinak byl přítomen. Podobné výsledky byly získány, když byly porovnány kortikální hladiny A/242, zejména ANI792-1éčená skupina obsahovala mnohem méně Αβ42, ale v tomto případě odlišnosti mezi ANI792 a PBS skupinami byly významné u obou, jak u 15 měsíců (p = 0,04), tak u 18 měsíců (p = 0,0001; tabulka 2).

• ·· ·· · ·· · ·· ·· ···· ·· · ···· • · · · · · · · · • ····· ····· • · · · · · · · · ······· ·· · ·· ··

Tabulka 2: Střední hladiny A/? (ng/g) v kortexu neléčené PBS ANI 792

věk	celkový Αβ	A/342	(n)	celkový Αβ	ΑβΑΙ	(η)	celkový Αβ	A/M2	(η)
12	1600	1300	(10)
15	8700	8300	(10)	8600	7200	(9)	1600	1300*	(10)
18	22200	18500	(10)	19000	15900	(12)	5200	4000**	(9)

*p = 0,0412 **p = 0,0001 (b) Hipokampální hladiny - U neléčených PDAPP myší byly střední hladiny celkového Αβ peptidu v dvanácti měsíci 15000 ng/g, a které vzrostly na 51000 ng/g v 15 měsících a dále na 81000 ng/g v 18 měsících (tabulka 3). Podobně PBS imunizované myši vykazovaly hodnoty 40000 ng/g a 65000 ng/g v 15 měsících a 18 měsících, respektive. ANI792 imunizovaná zvířata vykazovala menší celkové množství Αβ peptidu, specificky 25000 ng/g a 51000 ng/g časových bodech 15 měsíců a 18 měsíců, respektive. Hodnota 18-měsíční AN1792-léčené skupiny byla významně nižší než hodnota u PBS-léčené skuiny (p = 0,0105; tabulka 3). Měření A/742 podalo stejný vzor výsledků, zejména tyto hladiny u AN1792-léčené skupiny byly významně nižší než u PBS skupiny (39000 ng/g vs. 57000 ng/g, respektive; p = 0,0022) v 18-měsíčním hodnocení (tabulka 3).

Tabulka 3: Střední hladiny Αβ (ng/g) v hipokampu neléčené PBS AN1792

věk	celkový Αβ	ΑβΑ2	(η)	celkový Αβ	Α/Μ2	(η)	celkový Αβ	A/J42	(η)
12	15500	11100	(10)
15	51500	44400	(10)	40100	35700	(9)	24500	22100*	(10)
18	80800	64200	(10)	65400	57100	(12)	50900 (9)	38900**

p = 0,0105 **p = 0,0022 • ·« · · ··· · ·· ·· ···· · * · ♦ · · · • · · · · · · · · • · · · · · · · · · · • · ··· ···· ······· · · · ·· ·· (c) Cerebelární hladiny - U 12-měsíčních neléčených PDAPP myší byla střední cerebelární hladina celkového Αβ peptidu 15 ng/g (tabulka 4). V 15 měsících se tento střed zvedl na 28 ng/g a v 18 měsících vzrostl na 35 ng/g. PBS-iéčená zvířata vykazovala střední hodnoty celkového

Αβ peptidu 21 ng/g v 15 měsících a 43 ng/g v 18 měsících. U AN1792-léčených zvířat bylo nalezeno 22 ng/g celkového A/? peptidu v 15 měsících a významně nižší (p = 0,002) celkové množství Αβ peptidu v 18 měsících (25 ng/g), než u odpovídající PBS skupiny (tabulka 4).

Tabulka 4: Střední hladiny Αβ(ng/g) v cerebelu neléčené PBS ANI 792

věk (měsíce)	celkový Αβ	(n)	celkový Αβ	(n)	celkový Αβ	(n)
12	15,6	(10)
15	27,7	(10)	20.8	(9)	21,7	(10)
18	35,0	(10)	43,1	(12)	24,8*	(9)

*p = 0,0018

4. Účinky ΑΝ 1792 léčby na hladiny APP - APP-α a celodélková molekula APP obsahují obě celou nebo části Αβ sekvence a tudíž by mohly být potenciálně potlačeny vyvinutím AN1792-řízené imunitní odpovědi. V současných studiích nepatrné zvýšení APP hladin bylo uvedeno, jako neuropatologické zvýšení u PDAPP myši. V kortexu byly hlavně hladiny buď ΑΡΡ-α/FL (celodélkový) nebo APP-a nezměněny léčbou, kromě toho, že APP-a byl redukován o 19 % v časovém bodě 18 měsíců u AN1792-léčené skupiny vs. PBS-léčené skupině. U 18měsíční AN1792-léčené skupiny nebyly hodnoty významně odlišné od hodnot 12-měsíční a 15měsíční neléčené a 15-měsíční PBS skupin. Ve všech případech zůstaly hodnoty uvnitř škál, které jsou normálně nalézány u PDAPP myší.

5. Účinky ANI792 léčby na neurodegenerativní a gliotickou pathologii - Neuritická plaková zátěž byla významně redukována ve frontálním kortexu AN1792-léčených myší v porovnání s PBS skupinou, v obou, jak v 15 (84%; p = 0,03), tak 18 (55%; p = 0,01) měsících věku (obrázek 8). Střední hodnota neuritické plakové zátěže se zvýšila z 0,32% na 0,49% u skupiny PBS mezi 15 a 18 měsíci věku. Toto kontrastuje s velmi redukovaným vývojem neuritických plaku u ANI792 skupiny, se středními hodnotami neuritické plakové zátěže od 0,05% do 0,22%, v 15 a 18-měsíčních skupinách, respektive.

• · · ·· ···· · · ·· • · · · ·· tt ···· • · · · · tttttttt • tttt tttt · tttt tttt · • · ··· tttttttt ······· tttt » ·· ··

Imunizace s ΑΝ 1792 se zdá být dobře tolerována a reaktivní astrocytóza byla také významně snížena v RSC AN1792-léčených myší, když je toto porovnáváno s PBS skupinou v obou, jak 15 (56%; p = 0,011) a 18 (39%; p = 0,028) měsících věku (obrázek 9). Procentuální střední hodnoty astrocytózy u PBS skupiny se zvýšily mezi 15 a 18 měsíci z 4,26 % na 5,21 %. AN1792-léčba potlačila vývoj astrocytózy v obou časových bodech na 1,89 % a 3,2 %, respektive. Předpokládá se tedy, že neuropil nebyl poškozen během procesu odstraňování.

6. Odpovědi na protilátky - Jak bylo popsáno výše, jedenáct měsíců staré, heterozygótní PDAPP myši (N = 24) obdržely série 5 imunizací 100 p.g ANI792 emulzifikovaných s Freundovou pomocnou látkou a podávaných intraperitoneálně v týdnech 0, 2, 4, 8 a 12 a šestou imunizaci se samotným PBS (žádná Freundova pomocná látka) šestnáctý týden. Jako negativní kontrola obdržela paralelní skupina 24 věkově shodných transgenních myší imunizace PBS emulzifikovaného s stejnou pomocnou látkou a podávaného stejným způsobem. Zvířatům byla odbírána krev od tří do sedmi dnů po každé imunizaci, což bylo zahájeno po druhé dávce. Odpovědi na protilátky k ANI792 byly měřeny metodou ELISA. Geometrické průměry koncentrací (GMT) pro zvířata, která byla imunizována AN1792, byly přibližně 1900, 7600 a 45000 po druhé, třetí a poslední (šesté) dávce, respektive. Žádná A/?-specifícká protilátka nebyla změřena u kontrolních zvířat po šesté imunizaci.

Přibližně jedna polovina zvířat byla léčena po dobu dalších tří měsíců, a přijímala tak imunizaci 20, 24 a 27 týdnů. Každá z těchto dávek byla podávána v PBS dopravní látce bez Freundovy pomocné látky. Průměrné koncentrace protilátky zůstaly nezměněné po toto časové období. Ve skutečnosti se koncentrace protilátky jevily stabilní od čtvrtého do osmého odebírání krve, což odpovídá období pokrývajícímu pátou až devátou injekci.

Aby se určilo, jestli jsou A/?-specifické protilátky vyvolávány imunizací, ty protilátky, které byly detekovány v séru ΑΝ 1792-léčených, a které byly také spojeny s amyloidem uloženým v mozku, byly podskupiny sekcí z ANI792- a PBS-léčených myší zreagovány s protilátkou specifickou pro myšímu IgG. Oproti PBS skupině byly Αβ plaky u ANI 792-léčených mozků pokryty endogenním IgG. Tento rozdíl mezi dvěma skupinami byl pozorován u obou, jak 15-, tak 18měsíčních skupin. Zvláště překvapující bylo oslabení značení u PBS skupiny vzdor přítomnosti těžké amyloidní zátěže u těchto myší. Tyto výsledky ukazují, že imunizace synthetickým Αβ proteinem vyvolává protilátky, které rozeznávají a váží se in vivo na Αβ amyloidní plaky.

7. Buněčné-zprostředkované imunitní odpovědi - Byly odebrány sleziny devíti ANI 792imunizovaným a dvanácti PBS-imunizovaným 18-měsíců starým PDAPP myším, sedm dní po deváté imunizaci. Splenocyty byly izolovány a kultivovány po dobu 72 h v přítomnosti A/340, Αβ42 nebo A/M0-1 (protein opačného pořadí). Mitogen Con A sloužil jako pozitivní kontrola.

• ·· 0 0 ···· 0 0 ·· • 0 · · 0· 0 · 0 · 0

0 000 000«

000 0000 0000000 00 0 00 00

Optimální odpovědi byly získány s >1,7 μΜ proteinem. Buňky ze všech devíti AN1792léčených zvířat proliferovaly v odpověď na buď A/71-40 nebo A/71-42 protein, se stejnými hladinami začlenění pro oba proteiny (obrázek 10, horní panel). Nebyla pozorována žádná odpověď na Α/Μ0-1 reverzní protein. Buňky z kontrolních zvířat neodpověděly na žádný z A/? proteinů (obrázek 10, dolní panel).

C. Závěr

Výsledky této studie ukazují, že ANI792 imunizace PDAPP myší, které mají existující amyloidní sraženiny, zpomaluje a ochraňuje od progresivního ukládání amyloidu a zabraňuje následným neuropatologickým změnám v mozku staré PDAPP myši. Imunizace AN1792 zabraňuje vývoji amyloidní zátěže ve strukturách, které by normálně zvrhly do amyloidózy. Tudíž podávání A/7 peptidů má terapeutický prospěch při léčbě Alzheimerovy choroby.

Příklad 4 - Hledání A/? fragmentů

100 PDAPP myší ve věku od 9 do 11 měsíců jsou imunizovány 9 různými oblastmi APP a Αβ peptidů, aby bylo určeno, které epitopy vedou k odpovědi. 9 různých imunogenů a jedna kontrola jsou injikovány i.p., jak je popsáno výše. Imunogeny zahrnují čtyři humánní Αβ peptidové konjugáty 1 až 12, 13 až 28, 32 až 42, 1 až 5, všechny spojené s ovčím proti-myším IgG přes cysteinový můstek; APP polypeptid aa 592 až 695, agregovaný humánní Αβ 1 až 40, agregovaný humánní Αβ25 až 35 a agregovaný hlodavčí A/242.

Agregovaný Αβ42 a PBS jsou použity jako kontroly. Deset myší je použito v každé léčené skupině. Koncentrace jsou monitorovány tak, jak je popsáno výše a myši jsou utráceny na konci čtyř měsíců imunizace. Histochemie, Αβ hladiny a toxikologie jsou určovány po smrti.

A. Materiál a metody

1. Příprava imunogenů - Příprava spojených Αβ peptidů: čtyři humánní Αβ peptidové konjugáty (aminokyselinové zbytky 1 až 5, 1 až 12, 13 až 28 a 33 až 42, každý spojen s ovčím proti-myším IgG) byly připraveny propojením přes cystein, uměle přidaný do Αβ peptidů, s použitím reakčního činidla sulfo-EMCS. Αβ peptidové deriváty byly synthetizovány podle následujících konečných sekvencí. V každém případě je pozice vloženého cysteinového zbytku označena podtržením. A/713-28 peptidový derivát měl také přidané dva glycinové zbytky před C-koncovým cysteinem, jak je naznačeno.

A/?l-12 peptid A/71-5 peptid

NH₂ - DAEFRHDSGYEVC COOH NH₂ - DAEFRC COOH

Αβ33-42 peptid Α/713-28 peptid

ΝΗ₂ - C - amino-heptanová kyselina - GLMVGGVVIA COOH Ac - NH - HHQKLVFFAEDVGSNKGGC - COOH

Pro přípravu spojovací reakce bylo dialyzováno deset mg ovčího proti-myšího IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) přes noc proti 10 mM pufru borátu sodného, pH 8,5. Dialyzovaná protilátka byla potom zakoncentrována na objem 2 ml za použití Amicon Centriprep kyvety. Deset mg sulfo-EMCS [N (ε-maleimidokuproyloxy) sukcinimid] (Molecular Sciences Co.) bylo rozpuštěno v jednom ml deionizované vody. Byl po kapkách za stálého míchání přidán 40-násobný molárni přebytek sulfo-EMCS k ovčímu proti-myšímu IgG, a poté byl roztok míchán dalších deset minut. Aktivovaný ovčí proti-myší IgG byl přečištěn a pufrován průchodem přes 10 ml gelovou filtrační kolonu (Pierce Presto Column, získána od Pierce Chemicals), která byla ekvilibrována 0,1 M NaPO₄, 5 mM EDTA, pH 6,5. Frakce obsahující protilátku, identifikované absorbanci při 280 nm, byly spojeny a rozpuštěny do koncentrace přibližně 1 mg/ml, za použití 1,4 mg/OD coby extinkčního koeficientu. 40-násobný molárni přebytek Αβ peptidů byl rozpuštěn v 20 ml 10 mM NaPO₄, pH 8,0, s výjimkou A/733-42 peptidů, kterého 10 mg bylo nejdříve rozpuštěno v 0,5 ml DMSO a pak rozpuštěno v 20 ml 10 mM NaPO₄ pufru. Roztoky peptidů byly každý přidán do 10 ml aktivovaného ovčího protimyšího IgG a míchány při laboratorní teplotě po dobu 4 hodin. Výsledné konjugáty byly zakoncentrovány na konečný objem menší než 10 ml za použití Amicon Centriprep kyvety a poté dialyzovány proti PBS, aby došlo k výměně pufrů a byl odstraněn volný peptid. Konjugáty byly převedeny přes 0,22 μ-pór velikostní filtry z důvodu sterilizace a pak rozděleny alikvotně do frakcí po 1 mg a uskladněny zmrzlé při -20 °C. Koncentrace konjugátů byly určeny za použití BCA proteinového testu (Pierce Chemicals) s koňským IgG pro standardní křivku.

2. Příprava agregovaných Αβ peptidů - Humánní 1 až 40 (ANI 528; California Peptides lne., šarže ME0541), humánní 1 až 42 (ANI792; California Peptides lne., šarže ME0339 a ME0439), humánní 25 až 35 a hlodavčí 1 až 42 (California Peptides lne., šarže ME0218) peptidy byly čerstvě rozpuštěny pro přípravu každé ze sady injekcí z lyofilizovaných prášků, které byly skladovány vysušené při -20 °C. Pro tento účel byly 2 mg peptidů přidány do 0,9 ml deionizované vody a směs byla vortexována tak, aby se vytvořil relativně homogenní roztok nebo suspenze. Ze čtyř peptidů byl pouze AN1528 rozpustný v tomto kroku. 100 μΐ stejného množství 10X PBS (IX PBS: 0,15 M NaCl, 0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,5) pak bylo přidáno, což znamenalo, že se v tomto momentě začal ANI528 srážet. Suspenze byla opět vortexována a inkubována přes noc při 37 °C, aby byla následující den použita.

• 94 * · 4··· 94 4· • · · · · · · · 4 4 9

4* 4 9 4 9 9 9 9

9999999 99 9 99 99

Příprava ρΒχό proteinu: expresní plasmid kódující pBxó, íuzní protein obsahující sto aminokyselinovou N-koncovou vedoucí sekvenci bakteriofágové MS-2 polymerázy následovanou aminokyselinami 592 až 695 APP (//APP), byl zkonstruován tak, jak je popsáno vOltersdorf et al., ./. Bio/, Chem. 265, 4492-4497 (1990). Plasmid byl transfekcí vnesen do E. coli a po indukci promotoru byl exprimován protein. Bakterie byly lyžovány v 8 M močovině a pBxó byl zvláště přečištěn metodou preparativní SDS PAGE. Frakce obsahující pBxó byly identifikovány metodou Western blot za použití králičí proti-pBx6 polyklonální protilátky, spojeny, zakoncentrovány za použití Amicon Centriprep kyvety a dialyzovány proti PBS. Čistota přípravy vyhodnocená metodou SDS PAGE barvenou látkou Coomassie Blue byla přibližně 5 až 10%.

B. Výsledky a diskuse

1. Plán studie - Sto samčích a samičích, devět až jedenáct měsíců starých heterozygótních PDAPP transgenních myší bylo získáno z Charles River Laboratory a Taconic Laboratory. Myši byly rozděleny do deseti skupin, aby byly imunizovány rozdílnými oblastmi Αβ peptidu nebo APP, kombinovanými s Freundovou pomocnou látkou. Zvířata byly rozdělena tak, aby se shodoval rod, věk, původ a zdroj zvířat uvnitř skupiny tak těsně, jak jen to bude možné. Imunogeny zahrnovaly čtyři Αβ peptidy odvozené od humánních sekvencí, 1 až 5, 1 až 12, 13 až 28 a 33 až 42, každý spojený z ovčím proti-myším IgG; čtyři agregované A/?peptidy, humánní 1 až 40 (ANI528), humánní 1 až 42 (ANI792), humánní 25 až 35 a hlodavčí 1 až 42; a íuzní polypeptid, označený jako pBxó, obsahující APP aminokyselinové zbytky 592 až 695. Deset skupin bylo imunizováno PBS kombinovaným s pomocnou látkou jako kontrola.

Pro každou imunizaci bylo emulzifikováno s Freundovou pomocnou látkou (CFA) v poměru 1:1 (V/V) 100 pg každého Αβ peptidu v 200 μΐ PBS nebo 200 pg APP odvozeného od pBx6 ve stejném objemu PBS nebo PBS samotné, do konečného objemu 400 μΐ pro první imunizaci, což bylo následováno podporou stejného množství imunogenu v nekompletní Freundově pomocné látce (IFA) pro následné čtyři dávky a s PBS pro konečnou dávku. Imunizace byly podávány intraperitoneálně v dvoutýdenním režimu pro první tři dávky, a pak v měsíční režimu. Zvířatům byla odbírána krev čtyři až sedm dní po každé imunizaci, což bylo zahájeno po druhé dávce, aby mohly být změřeny koncentrace protilátky. Zvířata byla utracena přibližně jeden týden po poslední dávce.

2. Hladiny Αβ peptidu a APP v mozku - Po přibližně čtyřech měsících imunizace s různými typy Αβ peptidů nebo deriváty APP byly odebrány mozky ze zvířat prostoupených roztokem NaCl. Jedna hemisféra byla připravena pro imunohistochemickou analýzu a druhá byla použita pro kvantifikaci hladin Αβ peptidu a APP. Pro měření koncentrací různých forem • tt toto toto·· tt tt ···· ·· · · « · · • · ··· ···· • · · · · · ····· • to ··· ···· • toto···· ·· · ·· ·· beta amyloidového peptidu a amyloidního prekurzorového proteinu byla hemisféra rozpitvána a homogenáty hipokampu, kortikalu a cerebelárních oblastí byly připraveny v 5 M guanidinu. Pak byly rozpuštěny a hladina amyloidu nebo APP byla kvantifikována porovnáním se sérií rozpuštěných standardů Αβ peptidu nebo APP o známých koncentracích metodou ELISA.

Střední koncentrace celkového Αβ peptidu pro kontrolní skupinu imunizovanou PBS byla 5,8-krát vyšší v hipokampu, než vkortexu (střední hodnota 24,318 ng/g hipokampální tkáně v porovnání k 4,221 ng/g v kortexu). Střední hladina v cerebelu pro kontrolní skupinu (23,4 ng/g tkáně) byla přibližně ΙΟΟΟ-krát nižší než v hipokampu. Tyto hladiny jsou podobné těm, které jsme dříve uvedli pro heterozygotní PDAPP transgenní myši tohoto věku (Johnson-Woods et al., 1997, výše).

Pro kortex, měl podsoubor léčených skupin střední celkové hladiny Αβ peptidu a A//1-42, které se významně lišily od těch z kontrolní skupiny (p < 0,05), a od těch zvířat, která obdržela ANI792, hlodavci A/21-42 nebo A/?l -5 peptidové konjugáty, jak je ukázáno na obrázku 11. Střední hladiny celkového Αβ peptidu byly redukovány na 75 %, 79 % a 61 %, respektive, v porovnání s kontrolu pro tyto léčené skupiny. Nebyly zde rozeznatelné korelace mezi koncentracemi A/?-specifické protilátky a hladinami Αβ peptidu v kortikální oblasti mozku pro jakékoliv skupiny.

V hipokampu nebylo střední snížení celkového Αβ peptidu spojené s ANI792 léčbou (46%, p = 0,0543) tak velké, jako bylo pozorováno v kortexu (75%, p = 0,0021).

Nicméně velikost redukce byla mnohem větší v hipokampu než v kortexu, konečná redukce 11,186 ng/g tkáně v hipokampu proti 3,171 ng/g tkáně vkortexu. Pro skupiny zvířat, které obdržely hlodavci Α/Π-42 nebo ΑβΧ-S byly střední celkové hladiny Αβ peptidu sníženy na 36 % a 26 %, respektive. Nicméně vzhledem k malé velikosti skupiny a vysoké variabilitě hladin amyloidového peptidu od zvířete ke zvířeti uvnitř obou skupin nebyla tato snížení významná. Když byly měřeny hladiny A/?l -42 v hipokampu, žádná snížení léčbou indukovaná nedosáhla významnosti. Tudíž z důvodu menší Αβ peptidové zátěže v kortexu jsou změny v této oblasti mnohem citlivějším indikátorem léčebných účinků. Změny v hladinách Αβ peptidu měřené metodou ELISA v kortexu jsou podobné, ale ne identické, výsledkům z imunohistochemické anylýzy (viz. níže).

Celkové množství Αβ peptidu bylo měřeno také v cerebelu, oblasti obvykle nepostižené při patologii Alzheimerovy choroby. Žádná střední hodnota koncentrací Αβ peptidu v jakékoliv skupině imunizované různými Αβ peptidy nebo APP deriváty se nelišila od té, která byla zjištěna u kontrolní skupiny v této oblasti mozku. Tento výsledek naznačuje, že nepatologické hladiny A/? peptidu nejsou léčbou postiženy.

·· · · · ·· · · · fcfc * · · * fc · ♦ · · • · · · · · · fc ····· ····· • ··· · · · · ·»· ···♦ ·* · ·· fc*

Koncentrace APP byla také určena metodou ELISA v kortexu a cerebelu u léčených a kontrolních myší. Dva odlišné APP testy byly použity. První, označený jako APP-a/FL, rozeznává oba APP-alfa (a, vypouštěnou formu APP, která byla štěpena uvnitř Αβ sekvence) a celodélkové formy (FL) APP, zatímco druhý rozeznává pouze APP-a. Oproti s léčbou spojenému úbytku Αβ peptidu v podsouboru léčených skupin byly hladiny APP nezměněny u všech léčených v porovnání s kontrolními zvířaty. Tyto výsledky naznačují, že imunizace Αβ peptidy nezmenšují APP; spíše je léčebný účinek specifický pro Αβ peptid.

Na závěr, celkové hladiny Αβ peptidu a A/71-42 byly významně sníženy v kortexu léčbou AN1792, hlodavčím A/71-42 nebo A/71-5 konjugátem. V hipokampu byla celkový Αβ peptid významně snížen jen léčbou ANI792. Žádné jiné změny v hladinách Αβ peptidu nebo APP spojené s léčbou v hipokampu, kortikální nebo cerebelární oblasti nebyly významné.

3. Histochemické analýzy - Mozky z podsouboru šesti skupin byly připraveny pro imunohistochemické analýzy, tří skupin imunizovaných Αβpeptidovými konjugáty Αβΐ-S, Αβ\12 a A/713-28; dvou skupin imunizovaných celodélkovými Αβ agregáty AN1792 a AN1528 a PBS-léčené kontrolní skupiny. Výsledky obrazové analýzy amyloidní zátěže v mozkových sekcích z těchto skupin jsou uvedeny na obrázku 12. Byla zde významná snížení amyloidní zátěže v kortikálních oblastech u tri z léčených skupin v porovnání s kontrolními zvířaty. Největší snížení amyloidní zátěže bylo pozorováno ve skupině, která obdržela ANI792, kde byla průměrná hodnota snížena o 97 % (p = 0,001). Významná snížení byla také pozorována u zvířat léčených ANI528 (95%, p = 0,005) a Αβλ-5 peptidovým konjugátem (67%, p = 0,02).

Výsledky obdržené kvantifikací celkového množství Αβ peptidu nebo A/71-42 metodou ELISA a amyloidní zátěže metodou obrazové amalýzy se v některém parametru liší. Léčení ANI528 mělo významný vliv na hladinu kortikální amyloidní zátěže, když bylo měřeno kvantitativní obrazovou analýzou, ale ne na koncentraci celkového Αβ peptidu ve stejné oblasti, když bylo měřeno metodou ELISA. Rozdíl mezi těmito dvěma výsledky je pravděpodobně z důvodu specifik těchto testů. Obrazová analýza měří pouze nerozpustný Αβ peptid agregovaný do plaků. Naopak metoda ELISA měří všechny formy Αβ peptidu, obě, rozpustnou i nerozpustnou, monomerní i agregovanou. Protože patologie choroby je považována za spojenou s nerozpustnou formou Αβ peptidu asociovanou do plaků, může technika obrazové analýzy mít větší senzitivitu odkrýt léčebné účinky. Nicméně, protože metoda ELISA je mnohem rychlejším a jednodušším testem, je velmi užitečná pro účely screeningu. Navíc může odkrýt to, že snížení hladiny Αβ peptidu spojené s léčbou je větší pro Αβ peptid asociovaný s plaky než pro celkový Αβ peptid.

• ·· ** * · · · · · ·· • · · · · · · ···» • · · · · ···· • ····· ····· ·· ♦ · · ···· ······· · · · · · ··

Pro určení, zda A/?-specifické protilátky vyvolané imunizací u léčených zvířat reagovaly s amyloidem uloženým v mozku, byl podsoubor sekcí z léčených zvířat a kontrolních myší podroben reakci s protilátkou specifickou pro myší IgG. Oproti PBS skupině, byly plaky obsahující A/? peptid pokryty endogenním IgG u zvířat, která byla imunizována A/? peptidovými konjugáty A/71-5, A/71-12 a A/713-28, a celodélkovými A/?agregáty ANI792 a ANI528. Mozky ze zvířat imunizovaných jinými A/7 peptidy nebo APP peptidem pBx6 nebyly tímto testem analyzovány.

4. Měření koncentrací protilátky - Myším byla odebrána krev čtyři až sedm dní po každé imunizaci, což bylo zahájeno druhou imunizací, celkem pět odběrů. Koncentrace protilátky byly měřeny jako A/?l-42-vázající protilátka za použití sendvičové metody ELISA s plastovými násobnými miskami pokrytými A/71-42. Jak je znázorněno na obrázku 13, píkové koncentrace protilátek byly vyvolány po čtvrté dávce pro ty čtyři vakcíny, které vyvolaly nejvyšší koncentrace AN 1792-specifických protilátek: AN1792 (pík GMT: 94647), AN1528 (pík GMT: 88231), A/71-12 konjugát (pík GMT: 47216) a hlodavčí A/71-42 (pík GMT: 10766). Koncentrace pro tyto skupiny trochu poklesly po páté a šesté dávce. Pro zbývajících šest imunogenů byly píkové koncentrace dosaženy po páté a šesté dávce a byly mnohem nižší velikosti, než ty ze čtyř vyšších koncentračních skupin: A/71-5 konjugát (pík GMT: 2356), pBx6 (pík GMT: 1986), A/713-28 konjugát (pík GMT: 1183), A/733-42 konjugát (pík GMT: 658), A/S25-35 (pík GMT:

125). Koncentrace protilátky byly také měřeny proti homoiogním peptidům za použití stejné sendvičové rozměru metody ELISA pro podsoubor imunogenů, těch skupin imunizovaných A/71-5, A/713-28, A/725-35, A/733-42 nebo hlodavčím A/71-42. Tyto koncentrace byly přibližně stejné, jako ty měřené proti A/71-42, kromě té pro hlodavčí A/71-42 imunogen, vjehož případě koncentrace protilátky proti homolognímu imunogenu byly přibližně dvakrát vyšší. Velikost koncentrace ΑΝ 1792-specifické protilátky u jednotlivých zvířat nebo průměrné hodnoty u léčených skupin nekorelovaly s účinností změřenou jako snížení A/7peptidu v kortexu.

5. Lymfoproliferativní odpovědi - A/7-závislá lymfoproliferace byla měřena za použití buněk sleziny, které byly odebrány přibližně jeden týden po poslední, šesté, imunizaci. Čerstvě odebrané buňky, 10⁵ na jehlu, byly kultivovány po dobu 5 dnů v přítomnosti A/71-40 o koncentraci 5 μΜ, z důvodu stimulace. Buňky z podsouboru sedmi z deseti skupin byly také kultivovány v přítomnosti reverzního peptidů, A/740-1. Jako pozitivní kontrola byly další buňky kultivovány s T buněčným mitogenem, PHA, a jako negativní kontrola byly buňky kultivovány bez přidaného peptidů. Lymfocyty od většiny zvířat proliferovaly jako odpověď na PHA. Nebyly zde žádné významné odpovědi na A/740-1 reverzní peptid. Buňky ze zvířat imunizovaných většími agregovanými peptidy, ANI792, hlodavčím A/71-42 a ANI528 proliferovaly masivně, když byly stimulovány ΑβΙ-40, s vyšším cpm u příjemců ANI792. Jedno zvíře v každé skupině imunizované konjugátem A/71-12, konjugátem A//13-28 a A/725-35 proliferovalo v odpověď na

A/71-40. U zbývajících skupin, které obdržely konjugát A/71-5, konjugát Α/Ώ3-42, pBxó nebo

PBS, nebylo žádné zvíře s A/?-stimulovanou odpovědí. Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 5 dole.

• φφ φ ♦ φφφφ φφ φφ φφφφ · φ φ φφφφ φ φ φφφ φφφφ φ ΦΦ··· φφφφφ ·· φφφ φφφφ φφφφφφφ φφ φ φφ φφ

Tabulka 5
imunogen	konjugát	Αβ aminokyseliny	odpovědi
ΑβΙ-5	ano	5-mer	0/7
A/71-12	ano	12-mer	1/8
A/713-28	ano	16-mer	1/9
A/325-35		11-mer	1/9
A/83-42	ano	10-mer	0/10
A/71-40		40-mer	5/8
A/71-42		42-mer	9/9
r A/71-42		42-mer	8/8
pBxó			0/8
PBS		0-mer	0/8

Tyto výsledky ukazují, že AN1792 a AN1528 stimulují silné odpovědi T-buněk, pravděpodobněji CD4 fenotyp. Absence A/?-specifícké T-buněčné odpovědi u zvířat imunizovaných ΑβΙ-5 není překvapující, protože peptidové epitopy rozpoznávané CD4⁺T-buňkami jsou obvykle okolo délky 15 aminokyselin, ačkoliv kratší peptidy občas mohou působit s menší účinností. Tudíž většina pomocných T-buněčných epitopů pro čtyři konjugované peptidy je pravděpodobně umístěna na IgG konjugovaném partnerovi, a ne v oblasti Αβ peptidu. Tato hypotéza je podporována velmi nízkou příčinností proliferačních odpovědí u zvířat v každé z těchto léčebných skupin. Protože A/71-5 konjugát byl účinný při významné redukci hladiny Αβ peptidu v mozku, v zjevné nepřítomnosti A/7-specifíckých T-buněk, jeví se být klíčovým efektorem imunitní odpovědi indukované imunizací s tímto peptidem protilátka.

Nedostatek T-buněk a nízká odpověď protilátky u fúzního proteinu pBxó, které zahrnuje aminokyseliny 592 až 695 obsahující všechny Αβ zbytky, může být z důvodu slabé imunogenicity zvláště tohoto přípravku. Slabé imunogenicita agregátu A/225-35 je pravděpodobně z toho důvodu, že peptid je příliš malý, aby pravděpodobně obsahoval dobrý T43 • 0« 00 0000 00 00

0000 00 0 0000

0 000 000« 0 000 00 00 00 0

000 0000

000 0000 00 0 00 00 buněčný epitop a tím pomohl k indukci protilátkové odpovědi. Pokud by tento peptid byl spojen s nosičovým proteinem, byl by pravděpodobně více imunogenní.

Příklad 5 - Příprava polyklonálních protilátek pro pasivní ochranu netransgenních myší je imunizováno Αβ peptidem nebo jiným imunogenem, volitelně spolu s pomocnou látkou, a je utraceno po 4 až 5 měsících. Krev je sloučena z imunizovaných myší. Volitelně je IgG oddělen od ostatních složek krve. Protilátka specifická pro imunogen může být zvlášť přečištěna afinitní chromatografií. Je získáno v průměru okolo 0,5 až 1 mg imunogenspecifické protilátky z jedné myši, což poskytuje celkové množství 5 až 10 mg.

Příklad 6 - Pasivní imunizace s protilátkami k Αβ peptidů

Skupiny 7 až 9 měsíců starých PDAPP myší jsou každý injikována 0,5 mg polyklonální proti-A/? protilátkou v PBS nebo specifickými proti-A/? monoklonálními protilátkami v PBS, jak je ukázáno níže. Všechny protilátkové přípravky jsou přečištěny, aby měly nízké hladiny endotoxinu. Monoklonální protilátky mohou být připraveny proti fragmentu injikací tohoto fragmentu nebo delší formy Αβ peptidů do myši, čímž jsou připraveny hybridomy a tyto hybridomy jsou testovány na protilátku, která se specificky váže na požadovaný fragment Αβ peptidů, bez jakéhokoliv vázání se na jiné nepřesahující fragmenty Αβ peptidů.

tabulka 6

protilátka	epitop
2H3	Αβ 1-12
10D5	A/? 1-12
266	Αβ 13-28
21F12	A/?33-42
myší polyklonální proti-humánní A/?42	proti-agregovaný Αβ42

Myši jsou injikovány i.p. jak je potřeba po dobu přes 4 měsíce, aby se udržovala cirkulující koncentrace protilátky, měřená metodou ELIS A titr, větší než 1/1000 a definovaná metodou ELISA vztaženou k Αβ42 nebo jinému imunogenu. Koncentrace jsou monitorovány tak, jak je popsáno výše, a myši jsou utráceny konci 4 měsíců injikace.

• ·«· »···#» ·« ·· • ♦ · · «· · · t * · • · · · · « · · · φ ····> ····· • i ··· · · · · ·····»· tt · · · ··

Histochemie, hladiny Αβ peptidů a toxikologie jsou určována po smrti. Na každou skupinu připadá deset myší.

Příklad 7 - Porovnání různých pomocných látek

Tyto příklady porovnávají CFA, síran hlinito-draselný, emulzi olej-ve-vodě a MPL pro kapacitu stimulovat imunitní odpověď.

A. materiál a metody

1. Plán studie - Jedno sto samiček, šest týdnů starých morčat kmene Hartley, získaných od Elm Hill, bylo rozděleno do deseti skupin, aby bylo imunizováno AN1792 nebo jeho deriváty s palmitoylem, a které byly kombinovány s různými pomocnými látkami. Sedm skupin obdrželo injekce AN1792 (33 pg pokud není určeno jinak) kombinovaným s a) PBS, b) Freundovou pomocnou látkou, c) MPL, d) squalenem, e) MPL/skvalen, f) malou dávkou síranu hlinitodraselného nebo g) vysokou dávkou síranu hlinito-draselného (300 pg ANI792). Dvě skupiny obdržely injekce derivátu ANI792 (33 pg) s palmitoylem kombinované s a) PBS nebo b) squalenem. Nakonec desátá skupina obdržela samotné PBS bez antigenu nebo dodatečné pomocné látky. Pro skupinu, která obdržela Freundovu pomocnou látku, byla první dávka emulzifíkována s CFA a zbývající čtyři dávky s IFA. Antigen byl podáván v dávce 33 pg pro všechny skupiny kromě skupiny s vysokou dávkou síranu hlinito-draselného, která obdržela 300 pg ANI792, Injekce byly podávány intraperitoneálně pro CFA/IFA a intramuskulárně do kvadricepsu zadní končetiny, alternativně na pravou a levou stranu, pro všechny ostatní skupiny. První tři dávky byly podávány v dvoutýdenním programu, což následovaly dvě dávky v měsíčním intervalu. Krev byla odebrána šest nebo sedm dní po každé imunizaci, což bylo zahájeno po druhé dávce, pro měření koncentrací protilátky.

2. Příprava imunogenů - Dva mg Αβ42 (California Peptide, šarže ME0339) byla přidány do 0,9 ml deionizované vody a směs byla vortexována, aby se vytvořila jednotná suspenze.

Byl přidán 100 pl alikvot 10X PBS (IX PBS, 0,15 M NaCl, 0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,5). Suspenze byla znovu vortexována a inkubována přes noc při 37 °C a použita následující den. Nepoužitý Αβ42 byl skladován se sušidlem, jako lyofilizovaný prášek při -20 °C.

Palmitoylovaný derivát ANI792 byl připraven spojením anhydridu kyseliny palmitové, který byl rozpuštěný v dimethylformamidu, s koncovým aminokyselinovým zbytkem AN1792, čemuž předcházelo odstranění vzniklého peptidů z polymerního nosiče kyselinou fluorovodíkovou.

Pro přípravu dávkových vakcin s Freundovou pomocnou látkou (CFA) (skupina 2), bylo 33 pg ANI792 v 200 pl PBS emulzifikováno 1:1 (V/V) s CFA do konečného objemu 400 pl pro první

A ·· • A A A A A • A · A • · · A A

A · · · ·»»»»»« A * «Α »««*

AA AA

A A A A

A A A A «Α AA imunizaci. Pro následující imunizace byl antigen podobně emulzifikován s nekompletní Freundovou pomocnou látkou (IFA).

Pro přípravu dávkových vakcín s MPL pro skupiny 5 a 8 byl přidán lyofilizovaný prášek (Ribi ImunoChem Research, lne., Hamilton, MT) do 0,2% vodného triethylaminu tak, aby konečná koncentrace byla 1 mg/ml a směs byla vortexována. Směs byla zahřívána od 65 do 70 °C po dobu 30 sekund, aby vznikla nepatrně neprůhledná jednotná suspenze micel. Roztok byl čerstvě připraven pro každou sadu injekcí. Pro každou injekci ve skupině 5 bylo 33 pg AN1792 v 16,5 μΐ PBS, 50 pg MPL (50 pl) a 162 μΐ PBS smíšeno v borosilikátové kyvetě těsně před použitím.

Pro přípravu dávkových vakcín s malou emulzí olej-ve-vode bylo přidáno ANI792 v PBS do 5% squalenu, 0,5% Tweenu 80, 0,5% Spánu 85 v PBS, aby bylo dosaženo konečné koncentrace v jednotlivé dávce 33 pg ANI 792 v 250 μΐ (skupina 6). Směs byla emulzifikována průchodem přes dvoukomorové ruční zařízení 15 až 20 krát dokud to nevypadalo, že kapky emulze mají přibližně stejný průměr k 1,0 pm průměru standardní latexové kuličky, když byly pozorovány pod mikroskopem. Výsledná suspenze byla opalescentní, mléčně bílá. Emulze byly čerstvě připravené pro každou sérii injekcí. Pro skupinu 8 bylo MPL v 0,2% triethylaminu přidáno v koncentraci 50 pg na dávku k skvalenu a detergentní směsi pro emulzifíkaci, jak bylo poznamenáno výše. Pro derivát palmitoylu (skupina 7) bylo 33 pg palmitoyl-NH-A/?l-42 na dávku přidáno k skvalenu a vortexováno. Tween 80 a Spán 85 byly pak přidány během vortexování. Tato směs byla přidána k PBS tak, aby bylo dosaženo konečné koncentrace 5% skvalenu, 0,5% Tweenu 80, 0,5% Spánu 85 a pak byla směs emulzifikována, jak bylo poznamenáno výše.

Pro přípravu dávkových vakcín se síranem hlinito-draselným (skupiny 9 a 10), bylo ANI792 v PBS přidáno k Alhydrogelu (gel hydroxidu hlinitého, Accurate, Westbury, NY) tak, aby byla dosažena koncentrace 33 pig (nízká dávka, skupina 9) nebo 300 pg (vysoká dávka, skupina 10) ANI792 na 5 mg síranu hliníto-draselného v konečném objemu dávky, v 250 μΐ. Suspenze byla jemně míchána po dobu 4 hodin při pokojové teplotě.

3. Měření koncentrací protilátky - morčatům byla odebrána krev šest až sedm dní po imunizaci, což bylo zahájeno po druhé imunizaci, celkem byly provedeny čtyři odběry. Koncentrace protilátky proti A//42 byly měřeny metodou ELISA, jak bylo popsáno v obecných materiálech a metodách.

4. Příprava tkáně - Po přibližně 14 týdnech byl všem morčatům aplikován CO2. Cerebrospinální kapalina byla sloučena a mozky byly odebrány a tři mozkové oblasti ·· ·» • · * « • · · · • · · · «· ♦· (hipokampus, kortex a ceiebelum) byly odpitvány a použity pro měření koncentrace celkového Αβ peptidu za použití metody EL1SA.

B. Výsledky

1. Protilátkové odpovědi - Bylo nalezeno široké rozpětí v síle různých pomocných látek, když byla měřena jako protilátková odpověď na ANI792 po imunizaci. Jak je ukázáno na obrázku 14, když bylo ANI792 podáváno v PBS, nebyla detekována žádná protilátka po dvou nebo třech imunizacích a byly zaznamenány bezvýznamné odpovědi po čtvrté a páté dávce s geometrickým průměrem koncentrací (GMT) pouze okolo 45. Emulze olej-ve-vodě indukovala mírné koncentrace po třetí dávce (GMT 255), které se udržely po čtvrté dávce (GMT 301) a poklesly po poslední dávce (GMT 54). Byla zde jasná antigenní dávková odpověď pro AN1792 navázaný na síran hlinito-draselný, a který byl pro 300 pg více imunogenní ve všech časových bodech než pro 33 pg. U píku protilátkové odpovědi po čtvrté imunizaci byl rozdíl mezi dvěmi dávkami 43% s geometrickými průměry koncentrací 1940 (33 pg) a 3400 (300 pg). Protilátková odpověď na 33 pg ANI792 s MPL byla velmi podobná té, kterou vyvolala téměř desetkrát vyšší dávka antigenu (300 pg) vázaného na síran hlinito-draselný. Přídavek MPL k emulzi olej-vevodě snížil sílu vakcíny v porovnání s tou, kde bylo MPL jako jediná pomocná látka, o tolik, jak 75 %. Palmitoylované deriváty ANI792 byly kompletně neimunogenní, když byly podávány v PBS a vykazovaly mírné koncentrace, když byly v přítomnosti emulze olej-ve-vodě s geometrickými průměry koncentrací 340 a 105 v třetím a čtvrtém odběru krve. Nejvyšší koncentrace protilátky byly vyvolány s Freundovou pomocnou látkou s pikem GMT okolo 87000, hodnotou téměř 30-krát větší, než geometrické průměry koncentrací další dvou silných vakcín, MPL a vysoké dávky AN1792/síran hlinito-draselný.

Nejslibnějšími pomocnými látkami identifikovanými v této studii jsou MPL a síran hlinitodraselný. Z těchto dvou se MPL jeví vhodnější, protože byla nezbytná desetkrát nižší dávka antigenu pro vyvolání stejné protilátkové odpovědi, než jaká byla obsažena v síranu hlinitodraselném. Odpověď může být zvýšena zvýšením dávky antigenu a/nebo pomocné látky a také optimalizací imunizačního programu. Emulze olej-ve-vodě byla velmi slabou pomocnou látkou pro AN1792 a přidání emulze olej-ve-vodě k MPL pomocné látce zmenšilo hlavní aktivitu pomocné látky MPL samotné.

2. Hladiny Αβ peptidu v mozku - Po přibližně 14 týdnech byla morčata hluboce anestetíkována, cerebrospinální kapalina (CSF) byla odebrána a mozky byly zvířatům vyříznuty v podsouborech podle skupin, ty které byly imunizovány s Freundovou pomocnou látkou (skupina 2), s MPL (skupina 5), s vysokou dávkou síranu hlinito-draselného, 300 pg AN1792 (skupina 10) a PBS imunizovaná kontrolní skupina (skupina 3). Pro měření hladiny Αβ peptidu • · • · · · · · ····· • · ··· · · · · ······· · · · * · · · byla jedna hemisféra odpitvána a homogenáty hipokampálních, kortikálních a cerebelárních oblastí byly připraveny v 5 M guaninu. Tyto vzorky byly rozpuštěny a kvantifikovány porovnáním se sérií rozpuštěných standardů Αβ proteinu o známých koncentrací metodou ELISA. Hladiny Αβ proteinu v hipokampu, kortexu a cerebelu byly velmi podobné pro všechny čtyři skupiny navzdory široké škále protilátkových odpovědí na Αβ peptid vyvolaných těmito vakcínami. Průměrné hladiny Αβ peptidů okolo 25 ng/g tkáně byly změřeny v hipokampu, 21 ng/g v kortexu a 12 ng/g v cerebelu. Tudíž přítomnost vysoké cirkulující koncentrace protilátky k Αβ peptidů po dobu tří měsíců u některých s těchto zvířat nezměnila celkové hladiny Αβ vjejich mozcích. Hladiny Αβ v CSF byly také docela podobné mezi skupinami. Snížení velkého účinku AN1792 imunizace na endogenní Αβ naznačuje, že imunitní odpověď je zaměřena na patologické formace Αβ.

Příklad 8 - Imunitní odpověď na různé pomocné látky u myší

Šest týdnů staré samičky Swiss Webster myší byly použity pro tuto studii, v každé skupině bylo 10 až 13 zvířat. Imunizace byly aplikovány v dne 0, 14, 28, 60, 90 a 20 a byly podávány podkožně v dávkovém objemu 200 pl. PBS bylo použito jako pufr pro všechny přípravky. Zvířatům byla odebrána krev sedm dní po každé imunizaci, což byío zahájeno po druhé dávce, pro analýzu koncentrací protilátky metodou ELISA. Léčebný režim pro každou skupinu je shrnut v tabulce 7.

tabulka 7

experimentální plán betablokové studie 010
skupina	N	pomocná látka ¹¹	dávka	antigen	dávka (pg)
1	10	MPL	12,5 pg	ANI 792	33
2	10	MPL	25 pg	ANI 792	33
3	10	MPL	50 pg	AN1792	33
4	13	MPL	125 pg	ANI 792	33
5	13	MPL	50 pg	ANI 792	150
6	13	MPL	50 pg	AN1528	33
7	10	PBS		ANI 792	33
8	10	PBS		žádný
9	10	skvalen emulzifikovaný	5 %	ANI 792	33

10	¹ 10	squalen přimíšený	5 %	ANI 792	33
11	10	síran hlinito-draselný	2 mg	ANI 792	33
12	13	MPL+siran hlinito-draselný	50 pg/2 mg	ANI 792	33
13	10	QS2I	5 pg	ANI 792	33
14	10	QS21	10 pg	ANI 792	33
15	10	QS21	25 pg	ANI 792	33
16	13	QS21	25 pg	ANI 792	150
17	13	QS21	25 pg	AN1528	33
18	13	QS21+MPL	25 pg/50 pg	ANI 792	33
19	13	QS21+síran hlinito-draselný	25 pg/2 mg	ANI 792	33

poznámky :

^a Počet myší v každé skupině na počátku experimentu.

^b Použité pomocné látky. Pufrem pro všechny tyto pomocné látky bylo PBS. U skupiny 8 nebyla použita žádná pomocná látka a žádný antigen.

Metodou ELISA určené koncentrace protilátky proti A/242 u každé skupiny jsou uvedeny v tabulce 8 níže.

tabulka 8

geometrický průměr koncentrací protilátky
týden odběru krve
léčebná skupina	2,9	5,0	8,7	12,9	16,7
1	248	1797	2577	6180	4177
2	598	3114	3984	5287	6878
3	1372	5000	7159	12333	12781
4	1278	20791	14368	20097	25631
5	3288	26242	13229	9315	23742
6	61	2536	2301	1442	4504
7	37	395	484	972	2149

8	25	25	25	25	25
9	25	183	744	952	1823
10	25	89	311	513	817
11	29	708	2618	2165	3666
12	198	1458	1079	612	797
13	38	433	566	1080	626
14	104	541	3247	1609	838
15	212	2630	2472	1224	1496
16	183	2616	6680	2085	1631
17	28	201	375	222	1540
18	31699	15544	23095	6412	9059
19	63	243	554	299	441

Tabulka ukazuje, že nejvyšší koncentrace byly získány u skupin 4, 5 a 18, v kterých byly pomocnými látkami 125 pg MPL, 50 pg MPL a QS21 plus MPL.

Příklad 9 - Terapeutická účinnost různých pomocných látek

Studie terapeutické účinnosti byla prováděna na PDAPP transgenních myších se sadou pomocných látek vhodných pro použití u lidí, aby byla určena jejich schopnost způsobit imunitní odpověď na Αβ peptid a indukovat imunitně-zprostředkovávané odstranění amyloidních sraženin z mozku.

Sto osmdesát samečků a samiček, 7,5 až 8,5 měsíců starých heterozygotních PDAPP transgenních myší, bylo získáno z Charles River Laboratories. Myši byly rozděleny do devíti skupin, každá obsahující 15 až 23 zvířat, aby byl imunizovány ANI792 a ANI528 kombinovanými s různými pomocnými látkami. Zvířata byla rozdělena tak, aby se rovnal jejich rod, věk a původ zvířat uvnitř skupin tak těsně, jak jen to bylo možné. Pomocné látky zahrnovaly síran hlinito-draselný, MPL a QS21, každá kombinovaná s oběma antigeny, a Freundovu pomocnou látku (FA) kombinovanou pouze s AN1792. Další skupina byla imunizována AN1792 v PBS pufru plus ochranným thimerosalem bez pomocné látky. Devátá skupina byla imunizována samotným PBS, jako negativní kontrola.

Příprava agregovaných Αβ peptidů: humánní A//1-40 (AN1528; California Peptides lne., Napa, CA; šarže ME0541) a humánní A/71-42 (AN1792; California Peptides lne., šarže ME0439) peptidy byly čerstvě rozpuštěny, pro přípravu každé sady injekcí, z lyofilizovaných prášků, které byly sušené skladovány při -20 °C. Pro tento účel byly 2 mg peptidů přidány k 0,9 ml • « · · · · · · · · · · • · · · · · · · * deionizované vody a směs byla vortexována, aby vznikl relativně jednotný roztok nebo suspenze. AN1528 byl rozpustný v tomto kroku, naopak AN1792 ne. 100 pl alikvot 10X PBS (IX PBS: 0,15 M NaCl, 0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,5) byl pak přidán vtom bodě, kdy se

AN1528 začal srážet. Suspenze byly opět vortexovány a inkubovány přes noc při 37 °C, aby byly použity následující den.

Pro přípravu dávkových vakcín se síranem hlinito-draselným (skupiny 1 a 5) byl Αβ peptid v PBS přidán k Alhydrogelu (dvouprocentní vodný gel hydroxidu hlinitého, Sargent, lne., Clifton, NJ), aby byly dosaženy koncentrace 100 pg Αβ peptidu na 1 mg síranu hlinitodraselného. 10X PBS bylo přidáno, aby byl dosažen konečný objem dávky, 200 μΐ v IX PBS. Suspenze byla pak jemně míchána po dobu přibližně 4 hodin za pokojové teploty před vlastní injikací.

Pro přípravu dávkových vakcín s MPL (skupiny 2 a 6) byl přidán lyofilizovaný prášek (Ribi ImunoChem Research, lne., Hamilton, MT; šarže 67039-E0896B) do 0,2% vodného triethylaminu tak, aby konečná koncentrace byla lmg/mí, a pak byl vortexován. Směs byla zahřívána od 65 do 70 °C po dobu 30 sekund, aby se vytvořila slabě matná, jednotná suspenze micel. Roztok byl skladován při 4 °C. Pro každou sadu injekcí bylo smíšeno 100 pg peptidu na dávku v 50 μΐ PBS, 50 pg MPL na dávku (50 pl) a 100 μΐ PBS na dávku, v borosilikátové kyvetě těsně před použití.

Pro přípravu dávkových vakcín s QS21 (skupiny 3 a 7) byl přidán lyofilizovaný prášek (Aquila, Framingham, MA; šarže A7018R) do PBS, pH 6,6 až 6,7 tak, aby konečná koncentrace byla 1 mg/ml, a vortexován. Roztok byl skladován při -20 °C. Pro každou sadu injekcí bylo smíšeno 100 pg peptidu na dávku v 50 pl PBS, 25 pg QS21 na dávku v 25 pl PBS a 125 pl PBS na dávku, v borosilikátové kyvetě těsně před použitím.

Pro přípravu dávkových vakcín s Freundovou pomocnou látkou (skupina 4) bylo 100 pg ANI792 v 200 pl PBS emulzifikováno 1:1 (V/V) s kompletní Freundovou pomocnou látkou (CFA) do konečného objemu 400 pl pro první imunizaci. Pro následující imunizace byl antigen podobně emulzifikován s nekompletní Freundovou pomocnou látkou (IFA). Pro vakcíny obsahující jako pomocné látky síran hlinito-draselný, MPL nebo QS21, bylo 100 pg AN1792 nebo ANI528 na dávku zkombinováno se síranem hlinito-draselným (1 mg na dávku) nebo s MPL (50 pg na dávku) nebo s QS21 (25 pg na dávku) do konečného objemu 200 pl PBS a podáváno podkožní inokulací na zádech mezi ramena. Pro skupinu, která obdržela FA bylo 100 pg AN1792 emulzifikováno 1:1 (V/V) s kompletní Freundovou pomocnou látkou (CFA) do konečného objemu 400 pl a podáváno intraperitoneáíně u první imunizace, což následovalo, pro posílení, stejné množství imunogenu v nekompletní Freundově pomocné látce (IFA) v dalších • 9 · · ···· ·· · · ·· · · · · · · • · · · · · · ·· ··· · · · * ··· ···· ·· · ·· 0· pěti dávkách. Pro skupinu, která obdržela AN1792 bez pomocné látky, bylo 10 μg AN1792 zkombinováno s 5 pg thimerosalu do konečného objemu 50 μΐ PBS a podáváno podkožně. Devátá, kontrolní skupina obdržela pouze 200 μΐ PBS podávaného podkožně. Imunizace byly podávány v dvoutýdenním programu pro první tri dávky, a pak v měsíčním programu, potom tedy ve dnech 0, 16, 28, 56, 85 a 112. Zvířatům byla odebírána krev šest až sedm dní po každé imunizaci, což bylo zahájeno po druhé dávce, aby mohly být měřeny koncentrace protilátky. Zvířata byla utracena přibližně jeden týden po poslední dávce. Výsledky byly měřeny ELISA testem hladin A/7 peptidu a APP v mozku a imunohistochemickým určením přítomnosti amyloidních plaků v mozkových oblastech. Kromě toho byly určeny koncentrace A/7-specifické protilátky, A/?-závislé proliferační a cytokinní odpovědi.

Tabulka 9 ukazuje, že nejvyšší koncentrace protilátky k A/71-42 byly vyvolány s FA a ANI792, koncentrace které měly pík po čtvrté imunizaci (pík GMT: 75386), a pak poklesly o 59 % po poslední, šesté imunizaci. Píková průměrná koncentrace vyvolaná MPL s AN1792 byla o 62 % nižší, než ta s FA (pík GMT: 28867) a byla také dosažena drive vimunizačním schématu, po třech dávkách, a poklesla o 28 % píkové hodnoty po šesté imunizaci. Píková průměrná koncentrace vyvolaná s QS21 kombinovaným sAN1792 (GMT: 1511) byla přibližně 5-krát menší, než ta dosažená s MPL. Kromě toho kinetiky odpovědi byly pomalejší, protože byla nezbytná další imunizace, aby bylo dosaženo píkové odpovědi. Koncentrace vyvolané AN1792 vázaným na síran lilinito-draselný byly nepatrně větší než ty, které byly dosaženy sQS21 a kineticky odpovědi byly mnohem rychlejší. Pro AN1792 dopravovaném v PBS s thimerosalem byly frekvence a velikost koncentrací stěží větší, než ty pro PBS samotné. Píkové koncentrace vyvolané MPL a ANI528 (pík GMT: 3099) byly přibližně 9-krát nižší než ty sANI792. ANI528 navázaný na síran hlinito-draselný byl velmi slabě imunogenní, s nízkými koncentracemi vyvolanými pouze u některých zvířat. Žádné protilátkové odpovědi nebyly zaznamenány u kontrolních zvířat imunizovaných samotným PBS.

tabulka 9

geometrický průměr koncentrací protilátky³
týden odběru krve
léčba	3,3	5,0	9,0	13,0	17,0
síran hlinito-draselný/ ANI 792	102 (12/21)'¹	1081 (17/20)	2366 (21/21)	1083 (19/21)	572 (18/21)
MPL/AN1792	6241	28867	11242	5665	8204

• · ··· · · · · ······· ·· · ·· ·· • ·· · · ··«· ·· · · ··*· · · · · * · · • · · · · · · · ·

	(21/21)	(21/21)	(21/21)	(20/20)	(20/20)
QS21/AN1792	30 (1/20)	227 (10/19)	327 (10/19)	1511 (17/18)	1188 (14/18)
CFA/AN1792	10076 (15/15)	61279 (15/15)	75386 (15/15)	41628 (15/15)	30574 (15/15)
síran hlinito-draselný/	25	33	39	37	31
AN1528	(0/21)	(1/21)	(3/20)	(1/20)	(2/20)
MPL/ANI 528	184 (15/21)	2591 (20/21)	1653 (21/21)	1156 (20/20)	3099 (20/20)
QS21/AN1528	29 (1/22)	221 (13/22)	51 (4/22)	820 (20/22)	2994 (21/22)
PBS plus Thimerosal	25 (0/16)	33 (2/16)	39 (4/16)	37 (3/16)	47 (4/16)
PBS	25 (0/16)	25 (0/16)	25 (0/15)	25 (0/12)	25 (0/16)

poznámky:

^a Geometrický průměr koncentrací protilátky měřený proti A//1-42.

^b Počet respondentů na skupinu.

Výsledky léčby s ANI792 nebo ANI528 s různými pomocnými látkami nebo thimerosalem kortikální amyloidní zátěže u 12 měsíců starých myší určené metodou ELISA jsou ukázány na obrázku 15. U PBS kontrolních PDAPP myší byla střední hladina celkového Αβ peptidu v kortexu ve 12 měsíci 1817 ng/g. Pozoruhodně snížené hladiny Αβ peptidu byly pozorovány u myší léčených ANI792 plus CFA/IFA, AN1792 plus síran hlinito-draselný, AN1792 plus MPL a QS21 plus AN1792. Snížení dosáhlo statistické významnosti (p < 0,05) pouze pro AN1792 plus CFA/IFA. Nicméně jak je ukázáno v příkladech 1 a 3, účinky imunizace na snížení hladin Αβ peptidu začínají být podstatně větší u 15 měsíců a 18 měsíců starých myší. Tudíž je předpokládáno, že nejméně prostředky ANI792 plus síran hlinito-draselný, ANI792 plus MPL a AN1792 plus QS21 budou dosahovat statistické významnosti v léčbě u starších myší. Naopak ANI792 plus ochranná látka thimerosal vykázaly střední hladinu Αβ peptidu přibližně stejnou, jako v případě PBS léčených myší. Podobné výsledky byly získány, když byly porovnány • 0 0 · · 0 0 · · · · ·· • · · 0 · · · · ♦ · 0 • · * · · »00» • · · · · · 0 0 0 0 0 ·· 0 0 0 · · 0 · ··· 00·· ·» · 00 00 kortikální hladiny Κβ42. Střední hladina A/M2 u PBS kontrol byla 1624 ng/g. Pozoruhodně snížené střední hladiny 403, 1149, 620 a 714 byly pozorovány u myší léčených AN1792 plus

CFA/IFA, ANI792 plus síran hlinito-draselný, AN1792 plus MPL a AN1792 plus QS21 respektive, se snížením dosahujícím statistické významnosti (p = 0,05) pro AN1792 CFA/IFA léčenou skupinu. Střední hladina u AN1792-thimerosal léčených myší byla 1619 ng/g.

Příklad 10 - Analýzy toxicity

Tkáně byly sloučeny pro histopatologický test po ukončení studií popsaných v příkladech 2, 3 a 7. Navíc byly provedeny hematologický test a test klinické chemie u posledních krevních vzorků z příkladů 3 a 7. Většina hlavních orgánů byla vyhodnocena, včetně mozku, plicního traktu, lymfatických uzlin, gastrointestinálního traktu, jater, ledvin, žláz vylučujících adrenalin a gonád. Ačkoliv byla pozorovány sporadická poškození u studovaných zvířat, nebyly zde zřetelné rozdíly, buď u ovlivňovaných tkání nebo silná poškození, mezi AN1792 léčenými a neléčenými zvířaty. Nebylo zde žádné unikátní histopatologické poškozeni zaznamenané u AN1792imunizovaných zvířat v porovnání s PBS-léčenými nebo neléčenými zvířaty. Nebyly také žádné rozdíly v testovací profilu klinické chemie mezi skupinami pomocných látek a PBS léčenými zvířaty v příkladu 7 Ačkoliv zde byla významná zvýšení v řadě hematologických parametrů mezi zvířaty léčenými ANI792 a Freundovou pomocnou látkou v příkladu 7 vzhledem kPBS léčeným zvířatům, tyto typy účinků jsou od léčby Freundovou pomocnou látkou očekávány a doprovázejí zánětlivou chorobu peritonea a neindikují jakékoliv nepříznivé účinky léčby AN1792. Ačkoliv ne jako součást toxikologického testu, byla patologie mozku PDAPP myšího mozku extensivně zkoušena jako část účinných koncových bodů. Nebyl zaznamenán žádný znak léčby, který by měl nepříznivý vliv na morfologii mozku u jakékoliv studie. Tyto výsledky naznačují, že ANI792 léčba je dobře tolerována a přinejmenším skutečně prostá vedlejších příznaků.

Příklad 11 - Prevence a léčba subjektů

Pokus s jedno-dávkovou fází I je prováděn, aby byla určena bezpečnost. Terapeutické činidlo je podáváno ve zvyšujících se dávkách různým pacientů, začínající od okolo 0,01, hladiny předpokládané účinnosti, a zvyšující faktorem 3 do hladiny přibližně 10-krát vyšší než je dosažena účinná myší dávka.

Pokus fáze II je prováděn, aby byla určena terapeutická účinnost. Jsou vybráni pacienti s časnou až střední Alzhei měrovou chorobou definovanou podle kritéria Alzheimer's Disease and Related • · · · · · tttt · · · • •tt· tt* · tttttt* tt · tttttt tttttttt • tttt··· ·· tttttt • tt tttttt tttttttt • tttt tttttttt tttt · ·· tttt

Disorders Association (ADRDA) pro pravděpodobnou Alzheimerovu chorobu. Vhodní pacienti spadají do škály 12 až 26 podle Mini-Mental State Exam (MMSE). Jinými selekčními kritérii jsou ta, že u pacientů je pravděpodobnost přežít délku studie a snížení komplikujících problémů takových, jako je použiti asociovaných léků, které mohou interferovat. Základní hodnoty určující pacientovou chování jsou získávány za použití klasických psychometrických měření takových, jako jsou MMSE a ADAS, která jsou vyčerpávající škálou pro určení stavu pacientů s Alzheimerovou chorobou a chováním. Tyto psychometrické škály zajišťují měření progrese stavu Alzheimerovy choroby. Vhodné kvalitativní životní škály mohou také být použity pro monitorování léčby. Progrese choroby může být také monitorována metodou MRI. Krevní obraz pacienta může také být monitorován včetně testů na imunogen-specifické protilátky a odpovědi T-buněk.

Po změření základních hodnot je u pacientů zahájena léčba. Jsou náhodně rozděleni a léčeni buď terapeutickým činidlem nebo placebo léčbou podle náhodného výběru. Pacienti jsou monitorováni přinejmenším každých šest měsíců. Účinnost je určena významným snížením progrese u léčené skupiny v porovnání s placebo skupinou.

Druhý pokus fáze 11 je proveden tak, aby určil konverzi pacientů ze stavu časné ztráty paměti nezaviněného Alzheimerovou chorobou, někdy odkazující ks věkem souvisejícímu poškození paměti (AAM1), do stavu pravděpodobné Alzheimerovy choroby tak definované, jak bylo popsáno podle ADRDA kritéria. Pacienti s vysokým rizikem konverze na Alzheimerovu chorobu jsou vybráni z neklinické populace testováním populací odkazujících se k znakům časné ztráty paměti nebo jiným obtížím spojeným se symptomatologií pre-Alzheimerovy choroby, populacím s rodinnou historií Alzheimerovy choroby, s genetickými rizikovými faktory, podle věku, pohlaví a jiných rysů zjištěných předpovědět vysoké riziko Alzeimerovy choroby. Základní hodnoty vhodných měřeních zahrnujících MMSE a ADAS společně s dalšími jinými měřeními vytvořenými pro určení normálnější populace jsou sebrány. Tyto populace pacientů jsou rozděleny do vhodných skupin s placebo léčbou porovnávanou proti dávkovým alternativám s činidlem. Tyto populace pacientů následují v intervalech okolo šesti měsíců a konečným bodem pro každého pacienta je zdali ano nebo ne, se u něho či ní na konci pozorování vyvine pravděpodobná Alzheimerova choroba tak, jak je definována kritériem ADRDA.

Příklad 12 - Obecné materiály a metody

1. Měření koncentrací protilátky - Myším byla odebírána krev tak, že jim byla udělán malý řez v ocasní žíle a bylo odebráno přibližně 200 μΐ krve do mikrocentrifugační kyvety. Morčatům byla odebírána krev tak, že jim byla nejdříve vyholena zadní pánevní oblast a za • 0· 00 0000 00 00 • 0 0 · · · · · 0 0 · • 0 0·· 0·«· 4 00000 00 40 0

000 0000 400 0400 00 0 00 00 použití jehly rozměru 18 byla napíchnuta metatarsální žíla a krev byla odebrána do mikrocentrifugační kyvety. Krev byla ponechána se srážet po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě (RT), vortexována, pak centrifugována při 14000 x g po dobu 10 minut, aby se sraženina oddělila od séra. Sérum bylo pak převedeno do čisté mikrocentrifugační kyvety a skladováno při 4 °C dokud nebylo titrováno.

Koncentrace protilátky byly měřeny metodou ELISA. 96-jamkové mikrotitrační destičky (Costar EIA plates) byly pokryty 100 μΐ roztoku, který obsahoval buď 10 μg/l, buď Αβ42 nebo SAPP, nebo jiné antigeny, jak je popsáno v jednotlivých zprávách, v Well Coating Buffer (0,1 M fosforečnan sodný, pH 8,5, 0,1% azid sodný) a ponechány přes noc při pokojové teplotě. Jamky byly vysáty a séra byla přidána do jamek s počátečním ředěním 1/1000 v Specimen Diluent (0,014 M fosforečnan sodný, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,6% hovězí sérový albumin, 0,05% thimerosal). Sedm následných ředění vzorků bylo vytvořena přímo na destičkách v trojnásobných krocích, aby bylo dosaženo konečného ředění 1/218700. Ředění byla inkubována v naplněných jamkách destiček po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě. Destičky pak byly omyty čtyřikrát v PBS obsahujícím 0,05% Tween 20. Druhá protilátka, ovčí protí-myší Ig spojený s křenovou peroxidázou (získáno od firmy Boehringer Mannheim), byla přidána do jamek jako 100 μΐ ředění 1/3000 v Specimen Diluent a inkubována po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě. Destičky byly poté opět omyty čtyřikrát v PBS, Tween 20. Aby došlo k vývoji chromogenu bylo přidáno 100 μΐ Slow TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidin získaný od firmy Pierce Chemicals) do každé jamky a inkubováno pro dobu 15 minut při pokojové teplotě. Reakce byla zastavena přidáním 25 μΐ 2 M H2SO4. Intenzita barvy pak byla čtena na zařízení Molecular Devices Vmax při (450 nm až 650 nm).

Koncentrace byly definovány jako reciproční hodnoty ředění séra, které vykazuje jednu polovinu maximální OD. Maximální OD byla obecně vzata z počátečního ředění 1/100, kromě případů velmi vysokých koncentrací, kdy v těchto případech bylo nezbytné nastavit vyšší počáteční ředění pro maximální OD. Jestliže 50% bod spadal mezi dvě ředění, byla provedena lineární extrapolace, aby byla vypočtena konečná koncentrace. Pro výpočet geometrického průměru koncentrací protilátky byla koncentracím menší než 100 arbitrážně přidělena hodnota koncentrace 25.

2. Test proliferace lymfocytů - Myši byly utraceny isofluranem. Sleziny byly odebrány a dvakrát opláchnuty v 5 ml PBS obsahujícím 10% srdce-inaktivující fetální hovězí sérum (PBSFBS) a pak homogenizovány v 50 μ Centricon jednotce (Dako A/S, Dánsko) v 1,5 ml PBS-FBS po dobu 10 sekund při 100 rpm v Medimachine (Dako), což následovala filtrace přes 100 μ porózní nylonový filtr. Splenocyty byly omyty jednou v 15 ml PBS-FBS, pak centrifugovány při

94 «99« 99 ··

99 4 9 9 9 9

4 4 4 4 9 4 4

4 4 4 4 9 9 4 4 4

4 4 4 4 4 4 9

9444499 44 9 49 44

200 x g po dobu 5 minut. Červené krvinky lyžovaly resuspendací pelety v 5 ml pufru obsahujícího 0,15 M NH₄C1, 1 M KHCO3, 0,1 M NaEDTA, pH 7,4 pro dobu pěti minut při pokojové teplotě. Leukocyty byly pak omyty jak je popsáno výše. Čerstvě izolované slezinné buňky (10⁵ buněk na jamku) byly kultivovány v trojitých sadách, pro kultivaci upravených, 96jamkových mikrotitračních destiček (Corning, Cambridge, MA), které měly dno ve tvaru U, vRPMI 1640 médiu (JRH Biosciences, Lenexa, KS) doplněným 2,05 mM L-glutaminem, 1% penicilín/streptomycinem a 10% srdce-inaktivujícím FBS, po dobu 96 hodin při 37 °C. Různé Αβ peptidy, A/71-16, A/71-40, A/71-42 nebo A/740-1 peptid s reverzní sekvencí, byly také přidány do dávek v škále od 5 μΜ do 0,18 μΜ ve čtyřech krocích. Buňky v kontrolních jamkách byly kultivovány v Concanavalinem A (Con A) (Sigma, cat. # C-5275, o 1 μg/ml) bez přidaného proteinu. Buňky byly ponechány pulzovat po dobu posledních 24 hodin s ³H-thymidinem (1 pCi/jamku, získáno od firmy Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Buňky pak byly přemístěny na UniFilter misky a spočítány v zařízení Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Výsledky jsou vyjádřeny pulsy za minutu (cpm) radioaktivity začleněné v nerozpustných makromolekulách.

3. Příprava mozkové tkáně - Po utracení byly mozky odebrány a jedna hemisféra byla připravena pro imunohistochemické analýzy, zatímco tři mozkové oblasti (hipokampus, kortex a cerebelum) byly odpitvány od daihé hemisféry a použity pro měření koncentrace různých Αβ peptidů a APP forem za použití specifických metod ELISA (Johnson-Wood et al., výše).

Tkáně určené pro metody ELISA byly homogenizovány v 10 objemech ledově studeného guanidinového pufru (5,0 M guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Homogenáty byly míchány jemnou rozrušováním za použití zařízení Adams Nutator (Fisher) po dobu tří až čtyř hodin při pokojové teplotě, a pak skladovány při -20 °C před kvantifikací Αβ peptidů a APP. Předchozí experimenty ukazují, že analyty byly stabilní za těchto skladovacích podmínek, a že syntetický Αβ protein (Bachem) mohl být kvantitativně nahrazen, když byl injikován do homogenátů kontrolních mozkových tkání z čerstvě vržených myší (Johnson-Wood et al., výše).

4. Měření hladin Αβ peptidů - Mozkové homogenáty byly rozpuštěny 1:10 v ledově studeném Casein Diluentu (0,25 % kasein, PBS, 0,05% azid sodný, 20 pg/ml aprotininu, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 pg/ml leupeptínu), a pak centrifugovány při 16000 x g po dobu 20 minut při 4 °C. Syntetické Αβ proteinové standardy (1 až 42 aminokyselin) a APP standardy byly připraveny tak, aby zahrnovaly 0,5 M guanidin a 0,1% hovězí sérový albumin (BSA) v konečném složeni. „Totální“ Αβ sendvičová metoda ELISA používá monoklonální protilátku (mA/7) 266, specifickou pro aminokyseliny 13 až 28 Αβ peptidů (Seubert, et al.), jako zachycenou protilátku a biotinylovou mA/7 3D6, specifickou pro aminokyseliny 1 až 5 Αβ • ·· 444444 44 44 • 94« 99 4 4494 • · · · · 9444

999 99 99 49 9 • 9 999 9999

9999999 94 9 44 44 peptidu (Jonhson-Wood, et al.), jako referenční protilátku. 3D6 mA// nerozpoznává vypuštěný APP nebo celodélkový APP, ale detekuje pouze druhy Αβ peptidu s aspartovou kyselinou na aminokonci. Tento test má nízký limit citlivosti ~50 pg/ml (11 pM) a nevykazuje žádnou křížovou reaktivitu k endogennímu murinovému Αβ proteinu při koncentracích do 1 ng/ml (Jonhson-Wood et al., výše).

A//1-42 specifická sendvičová ELISA využívá mA/?21F12, specifickou pro aminokyseliny 33 až 42 (Johnson-Wood, et al ), jako zachycenou protilátku. Biotinylovaná mA/J 3D6 je také jako referenční protilátka v tomto testu, která má nižší limit citlivosti přibližně 125 pg/ml (28 pM, Johnoson-Woods et al ). Pro metody Αβ ELISA bylo naplněno 100 μΐ buď mA/? 266 (při 10 pg/ml) nebo mA/721F12 (při 5 pg/ml) do jamek 96-jamkových destiček (Costar) imunotestu pro celonoční inkubaci při pokojové teplotě. Roztok byl odstraněn odsátím a jamky byly zablokovány přidáním 200 μΐ 0,25% humánního sérového albuminu v PBS pufru po dobu přinejmenším 1 hodiny při pokojové teplotě. Blokovací roztok byl odstraněn a destičky byly skladovány vysušené při 4 °C do té doby, než byly použity. Destičky byly opět hydratovány ve Wash Buffer [Tris-pufrovaný roztok NaCl (0,15 M NaCl, 0,01 tris-HCl, pH 7,5), plus Tween 20] před dalším použitím. Vzorky a standardy byly přidány v trojnásobných alikvotech 100 μΐ na jamku a pak inkubovány přes noc při 4 °C. Destičky pak byly přinejmenším třikrát omyty ve Wash Buffer mezi každým krokem tohoto testu. Biotinylovaná mA/? 3D6, rozpuštěná v 0,5 pg/ml v Casein Assay Buffer (0,25% kasein, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4) byla přidána a inkubována v jamkách po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Konjugát avidin-křenová peroxidasa (Avidin-HRP získaný od firmy Vector, Burlingame, CA), rozpuštěný v Casein Assay Buffer, byl přidán do jamek na 1 hodinu při pokojové teplotě. Kolorimetrický substrát, Slow TMB-ELISA (Pierce), byl přidán a ponechán reagovat po dobu 15 minut při pokojové teplotě, po kterých byla enzymová reakce zastavena přidáním 25 μΐ 2 N H₂SO₄. Reakční produkt byl kvantifikován za použití zařízení Molecular Devices Vmax měřením rozdílu absorbance při 450 nm a 650 nm.

5. Měření hladin APP - Byly použity dva odlišné APP testy. První označený jako ΑΡΡ-α/FL, rozeznávající oba, jak APP-alfa (a), tak celodélkové (FL) formy APP. Druhý test je specifický pro APP-α. APP-a/FL test rozeznává sekretovaný APP, který zahrnuje prvních 12 aminokyselin Αβ peptidu. Protože referenční protilátka (2H3) není specifická pro a-clip-místo, objevující se mezi aminokyselinami 612 až 613 APP695 (Esch et al., Science 248, 1122-1124 (1990)); tento test také rozeznává celodélkový APP (APP-FL). Předběžné experimenty používají imobilizované APP protilátky k cytoplasmatickému konci APP-FL, aby vyčerpaly mozkové • 0 · · 0 0 00 0 00 00

0· 00 00 0 0000

0 000 0000

0*0 00 00 00 0 00 000 0000

0000000 00 · 00 00 homogenáty od APP-FL za předpokladu, že přibližně 30 až 40 % ΑΡΡ-α/FL APP je FL (data nejsou uvedena). Zachycenou protilátkou pro oba, ΑΡΡ-α/FL a APP-a testy, je mA/? 8E5, vyzvednutá proti aminokyselinám od 444 do 592 APP695 formy (Games et al., výše). Referenční mA/? pro APP-ot/FL test je mA/J 2H3, specifická pro aminokyseliny 597 až 608 APP695 (Jonhson-Wood et al., výše) a referenční protilátkou pro APP-ot test je biotinylovaný derivát mA/ř 16H9, vyzvednutý proti aminokyselinám 605 až 611 APP. Nižší limit citlivosti APP-ot/FL testuje okolo 11 ng/ml (150 pM) (Johnson-Wood et al.) a nižší limit citlivosti APP-a specifického testu je 22 ng/ml (0,3 nM). Pro oba APP testy je mA/? 8E5 naplněno do jamek 96jamkových EIA destiček tak, jak je popsáno pro mA/? 266. Přečištěný, rekombinantní sekretovaný APP-a byl použit jako referenční stabdard pro APP-a test a ΑΡΡ-α/FL test (Esch et al., výše). Mozkové homogenátové vzorky v 5 M guanidinu byly rozpuštěny 1:10 v ELISA Specimen Diluentu (0,014 M fosfátový pufr, pH 7,4, 0,6% hovězí sérový albumin, 0,05% trimerosal, 0,5 m NaCI, 0,1% NP40). Pak byly rozředěny 1:4 v Specimen Diluentu obsahujícím 0,5 M guanidin. Rozředěné homogenáty byly pak centriftigovány při 16000 x g po dobu 15 sekund při pokojové teplotě. APP standardy a vzorky byly přidány na destičku v dvonásobných alikvotech a inkubovány po dobu 1,5 hodiny při pokojové teplotě. Biotinylovaná referenční protilátka 2H3 nebo 16H9 byla inkubována se vzorky po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Streptavidin-alkalická fosfatáza (Boehringer Mannheim), rozředěná v specimen diluentu, byla inkubována v jamkách po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Fluorescentní substrát 4-methylumbeliferyl-fosfát byl přidán pro 30 minutovou inkubaci při pokojové teplotě a destičky byly čteny na fluorimetru Cytofluor tm 2350 (Millipore) při excitaci 365 nm a emisi 450 nm.

6. Imunohistochemie - Mozky byly umístěny po dobu tří dnů při 4 °C v 4% paraformaldehydu v PBS a pak skladovány od jednoho do sedmi dnů při 4 °C v 1% paraformaldehydu v PBS dokud nebyly pitvány. Čtyřicet mikronů silné koronální oblasti byly vyříznuty na vibratomu za pokojové teploty a skladovány v kryoprotektantu (30% glycerol, 30% ethylenglykol ve fosfátovém pufru) při -20 °C před imunohistochemickým procesem. Z každého mozku bylo šest oblastí z hladiny dorzálního hipokampu, každá oddělena v konsekutivnich 250 pm intervalech, inkubováno přes noc s jednou z následujících protilátek: (1) biotinylovaná proti-A/? (mA/?, 3D6, specifická pro humánní A/? peptid) rozpuštěná do koncentrace 2 pg/ml v PBS a 1% koňském séru; nebo (2) biotinylovaná mA/? specifická pro humánní APP, 8E5, rozpuštěná do koncentrace 3 pg/ml v PBS a 1% koňském séru; nebo (3) mA/? specifická pro gliální fibrilární acidický protein (GFAP; Sigma Chemical Co.) rozpuštěná 1:500 s 0,25% Tritonem X-100 a 1% koňským sérem, v Tris-pufrovaném roztoku NaCI, pH 7,4 (TBS); nebo (4) mA/? specifická pro CD lib, MAC-1 antigen, (Chemicon International) rozpuštěná 1:100 s • Φ· ΦΦ φφφφ ΦΦ ·· ·♦ * φ φ φ φ φφφφ φ · · · · φφφφ φ · · φ φ · · φ φ φ φ

ΦΦ φφφ · φ φ φ φφφ φφφφ ΦΦ · ΦΦ ΦΦ

0,25% Tritonem Χ-100 a 1% králičím sérem v TBS; nebo (5) mA/? specifická pro MHC II antigen, (Pharmingen) rozpuštěná 1:100 s 0,25% Tritonem X-100 a 1% králičím sérem v TBS; nebo (6) krysí mA/ř specifická pro CD43 (Pharmingen) rozpuštěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS nebo (7) krysí mA/? specifická pro CD 45RA (Pharmingen) rozpuštěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS; nebo (8) krysí monoklonální Αβ specifická pro CD 45RB (Pharmingen) rozpuštěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS; nebo (9) krysí monoklonální Αβ specifická pro CD 45 (Pharmingen) rozpuštěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS; nebo (10) biotinylovaná polyklonální kíeččí Αβ specifická pro CD3e (Pharmingen) rozpuštěná 1:100 s 1% králičím sérem v PBS nebo (11) krysí γ&Αβ specifická pro CD3 (Serotec) rozpuštěná 1:200 s 1% králičím sérem v PBS; nebo s (12) roztokem PBS postrádajícím primární protilátku obsahujícím 1% normální koňské sérum.

Oblasti, které reagovaly s roztoky protilátky uvedenými výše pod čísly 1, 2 a 6 až 12, byly předpřipraveny v 1,0% Tritonu X-100, 0,4% peroxidu vodíku v PBS po dobu 20 minut za pokojové teploty, aby došlo k zablokování endogenní peroxidázy. Pak byly inkubovány přes noc při 4 °C s primární protilátkou. Oblasti, které reagovaly s 3D6 nebo 8E5 nebo CD3e mA/? protilátkami, byly pak nechány reagovat po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě s komplexem křenová peroxidáza-avidin-biotin spolu se složkami sady „A“ a „B“ rozředěnými 1:75 v PBS (Vector Elitě Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA). Oblasti, které reagovaly sCD 45RA, CD45RB, CD45, CD3 a PBS roztokem postrádajícím primární protilátku, byly inkubovány po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě s biotinylovaným proti-krysím IgG (Vector) rozředěným 1:75 v PBS nebo biotinylovaným proti-myším IgG (Vector) rozředěným 1:75 v PBS, respektive. Oblasti byly pak ponechány reagovat po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě s komplexem křenová peroxidáza-avidin-biotin spolu se složkami sady „A“ a „B“ rozředěnými 1:75 v PBS (Vector Elitě Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).

Oblasti byly vyvíjeny v 0,01% peroxidu vodíku, 0,05% 3,3'-diaminobenzidinu (DAB) při pokojové teplotě. Oblasti předurčené pro inkubaci sGFAP-, MAC-1- a MHC II-specifickými protilátkami byly předpřipraveny v 0,6% peroxidu vodíku při pokojové teplotě, aby došlo k zablokování endogenní peroxidázy, a pak inkubovány přes noc s primární protilátkou při 4 °C. Oblasti reagovaly s GFAP protilátkou byly inkubovány po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě s biotinylovaným proti-myším IgG, připraveným imunizací koně (Vectro Laboratories; Vectastain Elitě ABC Kit), rozpuštěným 1:200 v TBS.Oblasti byly potom nechány reagovat po dobu jedné hodiny komplexem avidin-biotin-peroxidáza (Vector Laboratories; Vectastain Elitě ABC Kit) rozředěným 1:1000 s TBS. Oblasti inkubované s MAC-1- nebo MHC II-specifickou m A/? jako primární protilátkou byly následně ponechány reagovat po dobu jedné hodiny při •fc ···· ·· fcfc • · · · • fcfc · • fcfc · • fcfc fc fcfc ·· pokojové teplotě s biotinylovaným proti-krysím IgG, který byl připraven imunizací králíka, rozředěným 1:200 s TBS, což následovala inkubace po dobu jedné hodiny s komplexem avidinbiotin-peroxidáza, rozředěným 1:1000 s TBS. Oblasti inkubované sGFAP-, MAC-1- a MHC IIspecifíckými protilátkami byly pak vizualizovány úpravou za pokojové teploty s 0,05% DAB, 0,01% peroxidem vodíku, 0,04% chloridem nikelnatým, TBS po dobu 4 a 11 minut, respektive. Imunoznačené oblasti byly umístěny na skleněná sklíčka (VWR, Superfrost slides), sušeny přes noc na vzduchu, namočeny v Propar (Anatech) a překryty sklíčky za použití Permountu (Fisher) jako pomocného média.

Pro počítání A/? plaků byl podsoubor GFAP-pozitivních oblastí umístěn na Superfrost sklíčka a inkubován ve vodném 1% Thioflavinu S (Sigma) po dobu 7 minut, což následoval imunohistochemický proces. Oblasti byly pak dehydratovány a očištěny v Proparu, pak překryty sklíčky s pomocí Permountu.

7. Obrazová analýza - Videometric 150 Image Analysis System (Oncor, lne., Gaithersburg, MD) spojený s Nikon Microphot-FX mikroskopem přes CCD video kameru a Sony Trinitron monitorem byl použit pro kvantifikaci imunoreaktivních sklížek. Obrázek sekce byl skladován ve video pufru a byl určen limit založený na barvě a založený na saturaci, aby mohla být vybrána a spočítána celková bodová plocha, která je zabírána imunoznačenými strukturami. Pro každou oblast byl hipokampus ručně ohraničen a celková bodová plocha zabíraná hipokampem byla spočítána. Procento amyloidní zátěže bylo měřeno jako: (frakce hipokampální oblasti obsahující Αβ sraženiny, které jsou imunoreaktivní s mA/? 3D6) x 100. Podobně bylo měřeno procento neuritické zátěže, jako: (frakce hipokampální oblasti, která obsahuje dystrofické neurity, které reagují s mA/?8E5) x 100. C-Imaging System (Compix, lne., Cranberry Townsbip, PA) pracující s Simple 32 Software Application program byl propojen s Nikon Microphot-FX mikroskopem přes Optronics kameru a použit pro kvantifikaci procenta retrospeniálního kortexu, který byl obsazen GFAP-pozitivními astrocyty a MAC-1- a MHC IIpozitivními mikroglii. Obrázek imuno-reagované oblasti byl skladován ve video pufru a byl určen monochromálně podmíněný limit, aby mohla být spočítána celková bodová plocha, která je zabírána imunoznačenými buňkami. Pro každou oblast byl retrospleniální kortex (RSC) ručně ohraničen a celková bodová plocha zabíraná RSC byla spočítána. Procento astrocytózy bylo měřeno jako: (frakce RSC zabíraná GFAP-reaktivními astrocyty) x 100. Podobně bylo definováno procento mikrogliózy, jako: (frakce RSC zabíraná MAC-1- a MHC II-reaktivními mikroglii) x 100. Pro všechny obrazové analýzy, šest oblastí na úrovni dorsálního hipokampu, každá oddělená v konsekutivních 240 pm intervalech, byly kvantifikováno pro každé zvíře. Ve všech případech byl typ léčby daného zvířete pozorovateli neznámí.

• 4 ♦♦ · A · A AA AA • A AA A A A A ·

A AA A AAAA

A AA AA AA AA A

A A A A AAAA

AAA AAAA AA A AA AA

Ačkoliv uvedený vynález byl popsán detailně z důvodu jasného pochopení, bude jasně patrné, že jisté modifikace mohou být uplatněny v rámci připojených patentových nároků. Všechny publikace a dokumenty uvedené v předkládaném vynálezu jsou začleněny v odkazech v jejich úplnosti pro všechny účely ve stejném rozsahu, v jakém byly každý individuálně vydán.

tabulka 1 koncentrace při 50% maximální OD myši injikované agregovaným Αβ

věk PDAPP	myš 100	myš 101	myš 102	myš 103	myš 104	myš 105	myš 106	myš 107	myš 108
4	70000	150000	15000	120000	1000	15000	50000	80000	100000
6	15000	65000	30000	55000	300	15000	15000	50000	60000
8	20000	55000	50000	50000	400	15000	18000	50000	60000
10	40000	20000	60000	50000	900	1000	50000	20000	40000
12	25000	30000	60000	40000	2700	20000	70000	25000	20000

myši injikované PBS s oběma imunogeny při 1/100

věk PDAPP	myš 1 13	myš 114	myš 115	myš 116	myš 117
6	< 4 x bkg	< 4 x bkg	< 4 x bkg	< 4 x bkg	< 4 x bkg
10	< 5 x bkg	< 4 x bkg	< 4 x bkg	< 4 x bkg	< 4 x bkg
12	< 4 x bkg	< 4 x bkg	< 4 x bkg	< 4 x bkg	< 4 x bkg

Claims

1. Farmaceutický prostředek zahrnující činidlo, účinné indukovat u pacienta imunitní odpověď proti Αβ peptidu, a farmaceuticky akceptovatelnou pomocnou látku.

2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že činidlem je Αβ peptid nebo jeho aktivní fragment.

3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že pomocná látka zahrnuje síran hlinito-draselný.

4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že pomocná látka zahrnuje monofosforyl lipid (MPL).

5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že pomocná látka zahrnuje QS21.

6. Farmaceutický prostředek podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že Αβ peptid nebo fragment je složkou částice.

7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 vyznačující se tím, že částicí je částice kopolymeru polylaktid-polyglykolid (PLPG).

8. Způsob prevence nebo léčby choroby charakterizované u pacienta amyloidní sraženinou, který zahrnuje podávání účinného činidla tak, aby došlo k indukci imunitní odpovědi proti peptidové složce amyloidní sraženiny u pacienta.

9. Způsob podle nároku 8, ve kterém amyloidní sraženina zahrnuje agregovaný Αβ peptid.

10. Způsob podle nároků 8 a 9, ve kterém je pacientem lidská osoba.

11. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém chorobou je Alzheimerova choroba.

12. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém je pacient asymptomatický.

99 MM

9 9 9 9

13. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém je pacientovi méně než 50 let.

14. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém má pacient dědičné rizikové faktory, indikující náchylnost k Alzheimerově chorobě.

15. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 8 až 13, ve kterém u pacienta nejsou známé rizikové faktory Alzheiměrový choroby.

16. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém činidlo zahrnuje Αβ peptid nebo jeho aktivní fragment.

17. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém činidlem je Αβ peptid nebo jeho aktivní fragment.

18. Způsob podle nároku 17, ve kterém dávka Αβ peptidů, kteráje podávána pacientovi, je přinejmenším 50 pg.

19. Způsob podle nároku 17, ve kterém dávka Αβ peptidů, kteráje podávána pacientovi, je přinejmenším 100 pg.

20. Způsob podle jakékoliv z předchozích nároků, ve kterém Αβ peptidem je Αβ42.

21. Způsob podle nároku 20, ve kterém Αβ peptid je podáván v agregované formě.

22. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém imunitní odpověď zahrnuje protilátky, které se váži na Αβ peptid.

23. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém imunitní odpověď zahrnuje T-buňky, které se váží na Αβ peptid, jako složku komplexu MHC I nebo MHC II.

24. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 8 nebo 10 až 15, ve kterém činidlem je protilátka k Αβ peptidů, a která indukuje imunitní odpověď vazbou na Αβ peptid u pacienta.

« ·· ·· · · · · • · · * • · · · · » · » · ·*·»«-·» *· «4 ···· • t ·· • · · · • · « «

4 · · · • 4 4 4

4· 44

25. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 8 nebo 10 až 15, ve kterém jsou T-buňky odebrány pacientovi, kontaktovány s Αβ peptidem za podmínek, za kterých T-buňky dosáhnou nejlepšího stavu, a pak jsou tyto T-buňky podávány pacientovy.

26. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém je činidlo podáváno orálně, podkožně, intramuskulárně, povrchově nebo intravenózně.

27. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, ve kterém je činidlo podáváno intramuskulárně.

28. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, který dále zahrnuje testování knihovny sloučenin, aby došlo k identifikování sloučeniny reaktivní s protilátkou k Αβ peptidů, a podáváním sloučeniny pacientovi k indukci imunitní odpovědi.

29. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 8, 10 až 15, 26 nebo 27, v kterém je činidlem účinná dávka nukleové kyseliny kódující Αβ peptid nebo jeho aktivní fragment, a kdy dochází k expresi nukleové kyseliny v těle pacienta, což následuje produkce Αβ peptidů nebo aktivního fragmentu, který pak vyvolává imunitní odpověď.

30. Způsob podle nároku 29, v kterém je nukleová kyselina podávána skrze pokožku.

31. Způsob podle nároku 30, v kterém je nukleová kyselina aplikována do pokožky prostřednictvím náplasti.

32. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, který dále zahrnuje monitorování pacientovy imunitní odpovědi.

33. Způsob podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, který dále zahrnuje podávání pomocné látky, která zesiluje imunitní odpověď na Αβ peptid.

34. Způsob podle nároku 33, v kterém jsou pomocná látka a činidlo podávány společně jako prostředek.

35. Způsob podle nároku 33, v kterém je pomocná látka podávána před činidlem.

9 toto • to « · • to • · • to ·«· toto·· • to • to • · • · · • toto • to · • ·· toto · to

36. Způsob podle nároku 33, v kterém je pomocná látka podávána po činidle.

37. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 33 až 36, v kterém je pomocnou látkou síran hlinitodraselný.

38. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 33 až 36, v kterém je pomocnou látkou MPL.

39. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 33 až 36, v kterém je pomocnou látkou QS21.

40. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 33 až 36, v kterém je dávka Αβ peptidu větší než 10 gg.

41. Způsob prevence nebo léčby Alzheimerovy choroby zahrnující podávání účinné dávky Αβ peptidu pacientovi.

42. Použití Αβ peptidu nebo protilátky k tomuto peptidu pro výrobu léku pro prevenci nebo léčbu Alzheimerovy choroby.

43. Použití podle nároku 42, v kterém je Αβ peptid kombinován s farmaceuticky akceptovatelnou pomocnou látkou pro výrobu léku.

44. Prostředek zahrnující Αβ peptid nebo fragment spojený s molekulou, která podporuje dopravu Αβ peptidu do krevního řečiště pacienta a/nebo podporuje imunitní odpověď proti Αβ peptid.

45. Prostředek podle nároku 44, v kterém konjugáty podporují imunitní odpověď proti Αβ peptidu.

46. Prostředek podle nároků 44 nebo 45, v kterém je konjugátem toxin cholera.

47. Prostředek podle nároků 44 nebo 45, v kterém je konjugátem imunoglobulin.

48. Prostředek podle nároků 44 nebo 45, v kterém je konjugátem oslabený toxin CRM 197 diftérie.

• · · · · · • · · · • · · · · • · · · ······· ··

49. Farmaceutický prostředek zahrnující účinek činidla indukovat imunitní odpověď proti Αβ peptidů u pacienta s podmínkou, že prostředek neobsahuje kompletní Freundovu pomocnou látku.

50. Prostředek zahrnující virový vektor kódující Αβ peptid nebo jeho fragment, který má schopnost indukovat imunitní odpověď proti Αβ peptidů.

51. Prostředek podle nároku 50, v kterém je virovým vektorem herpes virus, adenovirus, adenoasociovaný virus, retrovirus, sindbis, semiliki lesní virus, vaccinia virus nebo avian poxvirus.

52. Způsob určení účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta, zahrnující určení základního množství protilátky, specifické pro Αβ peptid, v pacientově tkáňovém vzorku před zahájením léčby činidlem, porovnáním množství protilátky specifické pro Αβ peptid v pacientově tkáňovém vzorku po léčbě činidlem, se základním množstvím Αβ peptid-specifické protilátky, kde, pokud je množství Αβ peptid-specifické protilátky změřené po léčbě významně větší, než základní množství Αβ peptid-specifické protilátky, indikuje to pozitivní léčebný výsledek.

53. Způsob podle nároku 52, v kterém jsou množství protilátky měřena jako koncentrace protilátky.

54. Způsob podle nároku 53, v kterém jsou množství protilátky měřena testem ELISA.

55. Způsob určení účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta, zahrnující určení základního množství protilátky, specifické pro Αβ peptid, v pacientově tkáňovém vzorku před zahájením léčby činidlem, porovnáním množství protilátky specifické pro Αβ peptid v tkáňovém vzorku subjektu po léčbě činidlem, se základním množstvím Αβ peptid-specifické protilátky, kde, pokud je redukce nebo snížení významně rozdílné mezi množství Αβ peptidspecifické protilátky změřené po léčbě v porovnání se základním množstvím Αβ peptidspecifické protilátky, indikuje to negativní léčebný výsledek.

56. Způsob určení účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta, zahrnující určení kontrolního množství protilátky, specifické pro Αβ peptid, v tkáňových vzorcích kontrolní • · populace, porovnáním množství protilátky specifické pro Αβ peptid v pacientově tkáňovém vzorku po podání činidla, s kontrolním množstvím A/7 peptid-specifické protilátky, kde, pokud je množství Αβ peptid-specifické protilátky změřené po léčbě významně větší, než kontrolní množství Αβ peptid-specifické protilátky, indikuje to pozitivní léčebný výsledek.

57. Způsob určení účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta, zahrnující určení kontrolního množství protilátky, specifické pro Αβ peptid, v tkáňových vzorcích kontrolní populace, porovnáním množství protilátky specifické pro Αβ peptid v tkáňovém vzorku pacienta po podání činidla, se zmíněným kontrolním množstvím Αβ peptid-specifické protilátky, kde, pokud je snížení významně rozdílné mezi množství Αβ peptid-specifické protilátky změřené po zahájení zmíněné léčby v porovnání s kontrolním množstvím Αβ peptid-specifické protilátky, indikuje to negativní léčebný výsledek.

58. Způsob monitorování Alzheimerovy choroby u pacienta nebo náchylnosti pacienta k Alzheimerově chorobě, který zahrnuje detekci imunitní odpovědi proti Αβ peptidu v pacientově vzorku.

59. Způsob podle nároku 58, podle něhož je pacientovi podáváno činidlo účinné léčit nebo ochraňovat před Alzheimerovou chorobou, a hladina odpovědi určuje u pacienta další léčebný režim.

60. Způsob podle nároku 59, v kterém činidlem je Αβ peptid.

61. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 57 až 60, který určování zahrnuje určení protilátky, která se specificky váže na Αβ peptid.

62. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 57 až 60, který určování zahrnuje určení T-buněk, které specificky reagují s Αβ peptidem.

63. Způsob určení účinnosti léčebné metody Alzheimerovy choroby u pacienta, zahrnující určení hodnoty množství protilátky, specifické pro Αβ peptid, v tkáňovém vzorku pacienta, který byl léčen činidlem, porovnáním hodnoty množství protilátky hodnoty s kontrolní hodnotou určenou u populace pacientů, u kterých došlo k zlepšení nebo osvobození se od symptomů Alzheimerovy tt · • tt tttttt tttttttt • tttt tttttttt tttt · ·· ·· choroby v důsledku léčby tímto činidlem, a kde hodnota u pacienta, která je přinejmenším shodná s kontrolní hodnotou, indikuje pozitivní odpověď na léčbu.

64. Použití Αβ peptidu pro monitorování léčby Alzheimerovy choroby u pacienta.

65. Diagnostická sada pro monitorování léčby Alzheimerovy choroby, která zahrnuje činidlo vázající se na protilátky specifické pro Αβ peptid.

66. Diagnostická sada podle nároku 65, která dále zahrnuje návod vyjadřující, jak sadu použít pro monitorování léčby Alzheimerovy choroby.