TWI239847B

TWI239847B - N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease

Info

Publication number: TWI239847B
Application number: TW087119660A
Authority: TW
Inventors: Dale B Schenk
Original assignee: Elan Pharm Inc
Priority date: 1997-12-02
Filing date: 1998-11-26
Publication date: 2005-09-21
Also published as: WO1999027944A9; ES2310017T3; ES2262460T1; US20090191231A1; KR100936419B1; EE200000379A; ATE435659T1; JP4677334B2; US20040228865A1; JP4677094B2; EE05377B1; SI1033996T1; NO20002784L; SG111083A1; DE69840922D1; US8034348B2; CY1109368T1; WO1999027944A1; CY1111370T1; HUP0100627A1

Description

1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（1 ) 相關申請案之前後參照本申請案优先權出自USSN 60/067’740 (1 9 9 7年1 2月2日申請）以及USSN60/ 080，970 (1998年4月7日申請），兩案全部內容倂爲本案之參考資料。技術領域本發明係在於免疫及藥物之技術領域內。背景阿茲海默氏疾病（AD )係爲造成老年性痴呆症之進行性疾病。一般見於：3611^6，丁川316，4 0 3 -4 0 9 ( 1 9 9 3 ) ; Hardy et al·，WO 92/1 3069; Selkoe， J. Neuropathol. Exp. Neurol· 53，438 — 447 ( 1 9 9 4); Duff et al.，Nature 3 7 3，47 6 -477 (1995) » Games et al., Nature 3 7 3 J 523 (1995).廣義而言，此疾病分爲兩二類：晚期發生-其發作於晚年（6 5.歲以上）以及早期發生-其在年老前（亦即，3 5 - 6 0歲）早已發作。此二類疾病之病理學均相同，但早期發作之情況下，異常情形較爲嚴重且較普及。此疾病之特徵在於腦內之二種損害--老年斑及神經纖維糾結。老年斑係爲腦組織切片之顯微鏡分析中可見及的與中央胞外致澱粉樣沉積交錯之多達1 5 0 //m的瓦解神經氈區域。神經纖維糾結係爲由一對彼此交錯纖維 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -4- 1239847 A7 B7 五、發明説明（2 ) 所組成之t a u蛋白質的胞內沉積。斑之主成分係爲以A yS或/3 -致澱粉樣肽爲名之肽。 A /3肽係以致澱粉樣先驅蛋白質（A P P )爲名之先驅蛋白質的3 9 — 4 3胺基酸內在片段。APP蛋白質內之幾個突變已和阿茲海默氏疾病之存在有所關聯。見於，例如 ’ Goate et al·，Nature 349，704) ( 1 9 9 1 )(

Valine^^ toisoleucine) ; Chartier Harlan et al., Nature 3 5 3，8 4 4 ( 1 9 9 1 ) ) (valine717 to glycine); Murrell et al., Science 254, 97 ( 199 1 ) (valine 717 to 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 phenylalanine) ;Mullan et al., Nature Genet. 1 » 3 4 5 ( 1 9 9 2 )(改變賴胺酸595-甲硫胺酸596成爲門冬醯胺 5 9 5-白胺酸5 9 6之雙重突變）。前述突變被認爲是由於提高或改變APP之處理成，尤其是，APP之處理成較高量長形態A/3 (亦即，A/51 — 42及AySl - 43 )而引起阿茲海默氏疾病。在其他基因中之突變（諸如，早老基因，PS 1及PS 2)被認爲是間接影響APP之處理而產生較高量長形態A /3 (見於Hardy，TINS 20，154 ( 1 997).)。這些觀察指出AyS (尤其是長形態）是阿茲海默氏疾病之起因。

McMichael ( E P 5 2 6，5 1 1 )提議投服類似劑量（小於或等於l/l〇〇mg/day) A/S至預先發作阿茲海默氏疾病AD之病人。在具有5升血漿之一般人中，甚至此一劑量之上限亦預期產生不大於2 p g/m 1 之濃度。人體血漿中之Α Θ正常濃度通常係在5 0 - -5- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 ) 20〇pg/ml 範圍內（Seubert et aUNature 3 5 9 ， 325 — 327(1992)。因爲 EP 526，511 所提出之劑量幾乎不能改變A /3之內在循環値且E P 526，511不推薦使用佐助劑，所以’似乎不可能獲致任何治療效益。相反地，本發明係關於藉由在使病人產生有利免疫反應之情況下，投服A Θ或其他免疫原至病人以治療阿茲海默氏疾病及其他致澱粉樣變性病。本發明因而達到了有關預防或消除阿茲海默氏疾病之神經病理學治療法的長久以來需求。本發明總論一方面，本發明係提供預防或治療病人之以致澱粉樣沉積爲特徵之疾病。此等方法使能減少病人對致澱粉樣沉積之肽成分的免疫反應。前述降低可藉由投服免疫原而予以活化或投服抗體或抗體之活性片段或衍生物而予以鈍化。在某些病人中，致澱粉樣沉積係爲凝集之Α Θ肽而疾病係爲阿茲海默氏疾病。在某，些方法中’病人是無症狀的。在某些方法中，病人年齡小於5 0歲。在某些方法中，病人具有易罹患阿茲海默氏疾病之遺傳性危險因子。前述危險因子包括在早老基因P S 1或P S 2中的各種對偶値以及各種形態之A P P。在其他方法中’病人並沒有任何阿茲海默氏疾病之已知危險因子。有關罹患阿茲海默氏疾病之病人的治療，一種治療法 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 辞本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） · 6 · 1239847 A7 B7 五、發明説明（4 ) 是爲投服一劑量之A /3肽至病人以誘起免疫反應。在某些方法中，A Θ肽係與用以增強對A yS肽之免疫反應的佐助劑一起投服。在某些方法中，佐助劑係爲明礬。在某些方法中，佐助劑係爲Μ P L。投服至病人之A /3肽劑量通常爲至少1或1 0 u g (若與佐助劑一起投服的話）及爲至少5 0 U g (若未與佐助劑一起投服的話）。在某些方法中，此劑量爲至少1 0 0 u g。在某些方法中，A/3肽是爲A/3 1 — 42。在某些方法中，A Θ肽係以凝集形態投服。在其他方法中，A沒肽係以解離形態投服。在某些方法中，治療劑是有效劑量之編碼A /3的核酸或其活性片段或衍生物。編碼A /3之核酸或其片段係表現於病人體內以產生A /3或其活性片段（其誘起免疫反應）。在某些前述方法中，核酸係經皮膚投服，隨意地經由貼片。在某些方法中，治療劑係藉由篩選同系化合物以辨識出可與A /5抗體產生反應之化合物，再投服此化合物至病人以誘起免疫反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在某些方法中，免疫反應係針對凝集之A /3而不針對解離之A々。例如，免疫反.應包括T —細胞，該T 一細胞係結合至與CD 8或CD 4細胞上之MCH 1或 MHCI I錯合的A/5上。在其他方法中，免疫反應係由投服Α Θ之抗體至病人而誘起。在某些方法中免疫反應係藉由移除病人之T -細胞，在T -細胞已接觸抗原之情況下，令T 一細胞與ΑΘ肽接觸，再取代病人之T 一細胞。治療劑通常是經口，經鼻內，經皮內，經皮下，經肌本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 A7B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（5 ) 肉，局部或靜脈內投服。在某些方法中，在投藥後監視病人以評估免疫反應。若監視中顯示出免疫反應在此時間內降低的話，則投服額外之一或更多劑量的藥劑予病人。另一方面，本發明係提供包含A /3以及適供經口或其他投藥途徑之佐助劑的藥學組成物。本發明亦提供包含可有效降低病人對A /3之免疫反應的藥劑以及藥學上可接受佐助劑的藥學組成物。在某些前述組成物中，藥劑是A 0 或其活性片段。在某些組成物中，佐助劑包含明礬。在某些組成物中，佐助劑包含油在水中型乳液。在某些組成物中，A0或活性片段是聚交酯聚乙交酯共聚物或其他分子之一成分。本發明還提供包含連接至可促進A /3輸送至病人血流中和/或促進對A /3之免疫反應的共軛分子上的 A /3或其活性片段之組成物。例如，共軛體可供促進對 A沒之免疫反應。在某些組成物中，佐助劑係爲霍亂毒素。在某些組成物中，共軛體係爲免疫球蛋白。在某些組成物中，共軛體係爲減弱之白喉毒素CRM 1 9 7 ( Gupta, Vaccine 15，1341 — 3(1997)) · ,^ 本發明亦提供包含可有，效降低病人對A 之免疫反應的藥劑之組成物，唯其先決條件爲此組成物不含Complete Freund's佐助劑。本發明亦提供包含編碼A /3或其活性片段之病毒載體的有效降低對A /5之免疫反應的組成物。適當之病毒載體包括庖疹，腺病毒，腺伴隨病毒，逆病毒，辛德畢斯病毒（sindbis )，西門利克森林α病毒（semiliki f 〇 r e s t v i ru s )，牛痘或禽痘（a v i a η ρ ο X )。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -8- 1239847 A7 ___B7 五、發明説明（6 ) 本發明還提供預防或治療阿茲海默氏疾病的方法。在此等方法中，投服有效劑量之Α Θ肽給病人。本發明還提供A /3或其抗體在製造預防或治療阿茲海默氏疾病用藥物方面的用途。在另一方面，本發明提供一種評估阿茲海默氏疾病治療法對病人之效力大小的方法。在這些方法中，基底數量之對A Θ且專一性的抗體係在病人用藥劑治療前取得之組織樣本中測定。再以病人使用藥劑治療後取得之組織樣本中的對Α Θ具專一性之抗體數量與A /3肽-專一性抗體之基底數量相比較。治療後測得之A $肽-專一性抗體數量遠大於其基底數量代表正面治療結果。經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在其他評估阿茲海默氏疾病治療法對病人之效力大小的方法中，測定在病人用藥劑治療前取得之組織樣本中的 A 0肽-專一性抗體的基底數量。再以病人使用藥劑治療後取得之組織樣本中的對A 0具專一性之抗體數量與A f肽-專一性抗體之基底數量相比較。治療後測得之A /3肽·專一性抗體數量與其基底數量相較下，若其數量降低或無顯著差異，則代表負面治療結果，。在其他評估阿茲海默氏疾病治療法對病人之效力大小的方法中，測定由對照組取得之組織樣本中，A卢肽·專一性抗體的對照數量。再以病人使用藥劑治療後取得之組織樣本中的對Α Θ具專一性之抗體數量與A /3肽·專一性抗體之對照數量相比較。治療後測得之A 0肽-專一性抗體數量遠大於其對照數量代表正面治療結果。本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） 7〇Τ ' 1239847 A7 B7 五、發明説明（7 ) 在其他評估阿茲海默氏疾病治療法對病人之效力大小的方法中，測定由對照組取得之組織樣本中，Α Θ肽-專一性抗體的對照數量。再以病人使用藥劑治療後取得之組織樣本中的對A /3 具專一性之抗體數量與A /3肽-專一性抗體之對照數量相比較。治療後測得之A Θ肽-專一性抗體數量與其對照數量間缺乏顯著差異代表負面治療結果。其他監視病人之阿茲海默氏疾病或其易感性的方法包括偵測由病人取得之樣本對A Θ肽的免疫反應。在某些前述方法中，病人經投服有效治療或預防阿茲海默氏疾病之藥劑，再由反應大小決定病人之進一步治療法。在其他評估阿茲海默氏疾病治療法對病人之效力大小的方法中，測定病人使用藥劑治療後取得之組織樣本中的對A /3具專一性之抗體數量値。此數量値再與由使用藥劑治療而歷經改善或消除阿茲海默氏疾病徵狀之病人組取得的對照値相比較。病人之此數量値至少等於對照値代表正面治療反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 附圖之簡要說明 . / 附圖1 :用A /3 1 - 4 2注射突變鼴鼠後之抗體滴定度。附圖2 ··海馬內之致澱粉樣負荷。致澱粉樣斑佔據之海馬區的面積百分比（藉由與A/5 —專一性mA/3 3 D 6 之反應性定義）係由免疫反應之腦部的電腦協助定量影像分析測得。每一鼴鼠之値係以治療組分類示出。每一群組本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ · 1239847 A7 _______ B7 五、發明説明（8 ) 之水平線代表分布之中間値。附圖3 :海馬內之神經突失養症。神經突失養症占有之海馬區的面積百分比（藉由與人類A P P 一專一性 m A《8 E 5之反應性定義）係由免疫反應之腦部的電腦協助定量影像分析測得。每一鼴鼠之値係以A N 1 7 9 2 治療組及P B S治療對照組示出。每一群組之水平線代表分布之中間値。附圖4:逆脾皮質（retrosplenial cortex)內之星形細胞增多症。神經膠質之纖維酸性蛋白質（GFAP) -陽性星形細胞增多症佔據之海馬區的面積百分比係由免疫反應之腦部的電腦協助定量影像分析測得。每一鼴鼠之値係以治療組分類示出且每一群組之水平線代表分布之中間値〇附圖 5:在使用 0.14，0.4，1.2，3. 7 ’ 11 ，33，100，或300//g八種劑量範圍內之 AN 1 7 9 2免疫後，對A/3 1 - 4 2的幾何平均抗體滴定度。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 附圖6 :抗體對AN 1.7 9 2免疫作用之反應動力學。滴定度係以每一組中，6隻動物之幾何平均値表示。附圖7:在經PBS —及AN1792 —治療之鼴鼠中，皮質致澱粉樣負荷之定量影像分析。附圖8:在經PBS —及AN1 7 9 2 -治療之鼴鼠中，神經突斑負荷之定量影像分析。附圖9:在經PBS —及AN1792 -治療之鼴鼠本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ ” · 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（10 ) 線時（諸如，藉由染色體斷裂程式或使用短少染色體斷裂重量之BESTFIT)，至少6 5 %序列相同，宜爲至少8 0或 9 0 %序列相同，更宜爲至少9 5 %或以上（例如’ 9 9 %或以上）之序列相同。更理想的是，不相同之殘基位置僅爲保留性胺基酸取代所造成之差異而已。對序列比較而言，通常係以一序列作爲參考序列而以其與測試序列相比較。當使用序列比較計數法時，測試與參考序列被輸入電腦中，再命名序列位置。序列比較計數法再計算測試序列與參考序列之序列相同百分比（根據設定之程式參數）。序列在比較時之較理想排列成線可藉由，例如，Smith &Waterman，Adv. Appl. Math· 2 : 482 (1981)之局部同源染色體計數法，Needleman&Wunsch，J. Mol· Biol. 4 8 : 4 4 3 ( 1 9 7 0 )之同源染色體排列成線計數法，Pearson &Lipman，Proc. Nat'l Acad· Sci. USA 8 5 : 24444 (1988)之類比方法硏究，這些計數法之電腦運算(GAP, BESTFIT，FASTA，and TFASTA，in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 5 7 5 Science Dr.，Madison，WI)，或肉眼檢視（一般見於Ausubel et al.，同上）進行。一般而言，縱使亦可使用訂製之參數，但可使用短少程式參數法進行序列比較〇爲了區分胺基酸取代係爲保留性或非保留性，將胺基酸分組如下··第I組（疏水性側鏈）：正亮胺酸，甲硫胺本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) _ 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239847 A7 B7 五、發明説明（11 ) 酸，丙胺酸，纈胺酸，亮胺酸，異亮胺酸；第I I組（中性親水性側鏈）：半胱胺酸，絲胺酸，蘇胺酸，第I I I 組（酸性側鏈）：天冬胺酸，麩胺酸；第I V組（鹼性側鏈）：a s η，葡胺酸，組胺酸，賴胺酸，精胺酸；第V 組（殘基影響側鏈方位）：甘胺酸，脯胺酸；及第V I組 (芳族側鏈）：色胺酸，酪胺酸，苯丙胺酸。保留性取代涉及在同組胺基酸間之取代。非保留性取代則係不同組胺基酸間之取代。本發明之治療劑通常是實際上純一的。此意指該藥劑通常至少約5 0 % w / w (重量/重量）純度，以及實際上不含干擾蛋白質及雜質。有時，此藥劑爲至少約8 0% w/w，且更宜爲至少約9 0%w/w或約9 5%w/w 。但是，使用傳統之蛋白質純化技術可得到至少9 9 % w/w之同源肽。二實體間之專一性結合意指至少1 0 6，1 0 7， 1 0 8，1 0 9，或1 0 1 0 Μ — 1之親和力。大於 1 0 8 Μ 一1之親和力是較理想的。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ”抗體”一詞係用以每括完整抗競體及其結合片段。通常，片段與其所衍生的完整抗體相競爭以結合至抗原。任意地，抗體或其結合片段可與其他蛋白質化學共軛至，或表現爲融合蛋白質。 ΑΡΡ695 ，ΑΡΡ751 ，及 ΑΡΡ770 各別代表人類ΑΡΡ基因編碼之695，751及770胺基酸殘基長多肽。見於Kang,et aUNature 3 2 5，7 7 3 ( -14 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（12 ) 1 9 8 7 ); Ponte et al., Nature 33 1,525 ( 1 988 );及 K i t a g u c h i e t a 1 ·，N a t u r e 331，530 (1988) 〇在人類致澱粉樣先驅蛋白質（A P P )間之胺基酸係根據 A P P 7 7 0異構形態之序列指定號碼。諸如，A /3 3 9 ，A/S40 ，AyS41 ，Α々42及A/343之用語係指包含胺基酸殘基1 — 39，1 一 40，1 — 41， 1 — 42 及 1 — 43 的 AyS 肽。 ”抗原決定基”或”抗原決定子”係指B和/或丁-細胞反應之抗原位置。B -細胞抗原決定基可由蛋白質之第三摺並列的連續胺基酸或非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之抗原決定基通常在曝露於變性溶劑下時仍保持不變而由第三褶形成之抗原決定基通常在變性溶劑處理下喪失。抗原決定基通常包含至少3，且通常更多，至少5 或8 - 1 0個胺基酸於獨一空間構形中。決定抗原決定基之空間構形的方法包括，例如，X -射線結晶法及2 -維核磁共振。見於，例如，Epitope，Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 Glenn E. Morris, Ed. ( 1 9 9 6 )。識別相同抗原決定基之抗體可於示出一抗體阻止另一抗體結合至標的抗原之能力的簡單免疫分析法中辨識出來。T 一細胞識別C D 8之9個胺基酸或第 C D 4細胞之約1 3 — 1 5個胺基酸的連續抗原決定基。識別抗原決定基之T -細胞可藉由測定抗原-相依性增殖作用之體外分析法辨識出，如同藉由與抗原決定基反應之已和抗原接觸的T —細胞的3 Η —胸腺核苷倂入法（Burke (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 _ 五、發明説明（13 ) et al., J. Inf. Dis. 170，1110 - 19 (1994 ))，藉由抗原一相依性殺死（cytotoxic T lymphocyte assay, Tigges et al·，J. Immunol. 15 6 ，3901 — 3 9 1 0 )或胞質分泌法測定。 ”免疫的”或”免疫”反應用語是針對接受病人之致澱粉樣肽的有利體液（抗體媒介）和/或細胞（由抗原專一性T -細胞或其分泌產物所媒介）反應的發展。此一反應可爲藉由投服免疫原而引起之主動反應或爲藉由投服抗體或已接觸抗原之T -細胞而引起之被動反應。細胞免疫反應係由多肽抗原決定基以及第I類或第I I類MHC分子之存在以活化抗原-專一性C D 4 +協助者細胞和/或 C D 8 +胞毒性T -細胞而証實。反應亦涉及單核細胞，巨噬體，N K細胞，嗜鹼細胞，樹突細胞，星形膠質細胞，小神經膠細胞，嗜曙紅細胞或其他遺傳免疫成分的活化。細胞一媒介之免疫反應可藉由增殖性分析（C D 4 + T 一細胞）或C T L (胞毒性T淋巴球）分析（見於 Burke，同前；Tigges，同前）測得。體液及細胞對免疫原之保護或治療作用的相對反輝貢獻可藉由分別從經免疫之同基因動物分離出IgG及T-細胞並測定第二個體中之保護或治療作用。 ”免疫之藥劑”或”免疫原”在投服（任意地綜合佐助劑）至病人時，可引起對其本身的免疫反應。 ”裸露之聚核苷酸”一詞係指未錯合膠質物質之聚核苷酸。裸露之聚核苷酸有時在質粒載體中無性繁殖。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 1239847 A7 B7 五、發明説明（14 ) ’’佐助劑”一詞係指在與抗原綜合投服時，可增強對抗原之免疫反應，但在單獨投服時，不產生對抗原之免疫反應的化合物。佐助劑可藉由几種机轉來增強免疫反應，其机轉包括淋巴球反射增進，B及T -細胞之刺激，以及巨噬體之刺激。 ”病人”一詞包括接受預防及治療之人類及其他哺乳類。不凝集或單體的A Θ意指A 之可溶性單體肽。製備單體A /3之一方法是爲利用超音波溶解低壓凍乾肽於純的 D M S 0中。離心所得溶液以移除任何不可溶之顆粒。凝集之A /3是爲寡聚體混合物，其中，單體單元係藉由非共價鍵結維繫在一起。 ”包括”一或更多所述及元素之組成物或方法可能包括其他未述及之元素。例如，包含A /3肽之組成物涵括分離出之A Θ肽及較大多肽序列之一成分的A Θ肽。詳細說明 / 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I · 通論 , 本發明提供用以預防及治療以致澱粉樣沉積聚集爲特徵之疾病的藥學組成物及方法。致澱粉樣沉積包括凝集成不可溶塊體之肽。肽之性質因不同疾病而異，但在大多數情況下，凝集物具有Θ -褶薄層構造且可用剛果紅染料染色。以致澱粉樣沉積爲特徵之疾病包括阿茲海默氏疾病（ A D )，涵括晚期及早期發生兩者。在二種疾病中，致澱本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 17 · 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____B7_五、發明説明（15 ) 粉樣沉積包括以A /3爲名之肽，其積聚於罹病個體之腦部內。某些以致澱粉樣沉積爲特徵之其他疾病實例爲S AA 澱粉樣變性病，遺傳性冰島徵候群，多發性骨髓瘤，及海棉狀腦病---其包括狂牛症，Creutzfeldt Jakob疾病，羊搔癢症，及紹海棉狀腦病（見於Weissmann et al·，Curr. Opin. Neurobiol. 7，695 — 700 (1997) ; Smith et al·，Veterinary Quarterly 19，101 — 105 ( 1 9 9 7 ) ; Nathanson et al., Am. J. Epidemiol. 1 4 5 ，959 — 9 69 (1997))。在這些疾病中形成凝集體之肽係爲血淸致澱粉樣A，cystantin. C，IgG kappa輕鏈，其分別爲他者之前三個prion蛋白質。 I I ·治療 1 ·阿茲海默氏疾病用於本發明之治療劑包括對抗A Θ之免疫反應。這些藥劑包括A Θ肽本身）及其變體，同系物及擬態物（ numetics)…其誘起和/或與抗體交叉g應而成A/3肽。當投服免疫原以誘起抗體或T-細.胞與病人體內之A点反應時是爲主動的免疫反應而當投服本身結合至病人體內之A ^的抗體時是爲被動的免疫反應。 A厂，亦稱爲/3 —致澱粉樣肽，或A 4肽（見於 US46666829;Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120，1131(1984))是 39 - 43 之肽，其係爲阿茲海默氏疾病之特性斑的主成分。A /3係本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（19 ) 白質或融合蛋白質以展現肽。在此等方法中所用之病毒或細菌必須是非致病原的或被減弱的。適當病毒包括腺病毒，HSV，牛痘及禽痘。融合至HBV之Hb sAg的免疫原肽是最適當的。治療劑亦包括不需具有類似A，之重要胺基酸序列，但可充作A 之模仿體而誘起類似免疫反應的肽類及其他化合物。例如，任何形成yS -褶薄層之肽類及蛋白質可依適用性篩選。亦可使用對抗A Θ或其他致澱粉樣肽以單株抗體爲對比的非遺傳性型抗體。此等非遺傳性型抗體模仿抗原而產生對抗原之免疫反應（見於 Essential Immunology ( Roit ed.,Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed.) P . 1 8 1 )。肽類或其他化合物之自由基因庫亦可依適用性篩選。冷組合基因庫可供多種可以一步一步方式合成之化合物。前述化合物包括多肽，Θ -轉折模仿體，多糖類，磷脂，荷爾蒙，前列腺素，膽固醇，芳族化合物，雜環化合物，苯並二氮雜罩，N -經取代甘胺酸齊聚物及寡胺基甲酸鹽。化合物之大組合物基因庫可由Affymax，W 0 9 5 / 1 2 6 0 8，Affymax, W 0 9 3 / 0 6 1 21， Columbia University，W 〇 9 5 / 3 0 6 4 2 (每一者均倂爲本發明之參考資料）中所述之編碼合成基因庫（ E S L )方法構造出。肽類基因庫亦可由噬菌體顯示方法產生。見於，例如，Devlin，W0 91/18980。組合物基因庫及其他化合物先藉由測定它們結合已知對A Θ或其他致澱粉樣肽具專一性之抗體動淋巴細胞（B 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（2〇 ) 或T )的能力進行適用性篩選。例如，初始篩選可用A冷之任何多株血淸或多株抗體或其他致澱粉樣肽進行。由此篩選辨識出之化合物再進一步分析其誘使抗體或反應性淋巴細胞變成A Θ或其他致澱粉樣肽的能力。例如，血淸之多重稀釋液可於預先塗布Α Θ肽之微量滴定板上測試並可進行標準E L I S A以測定抗體對Α Θ之反應性。再如實例中所述地測定化合物在預先罹患致澱粉樣變性病之導入外來基因的動物中之預防或治療效力。前述動物包括，例如，Games et al·，（同上）所述之具有APP之7 1 7突變的鼴鼠，以及 McConlogue et al·，US 5612486 及 Hsiao et al., Science 274， 99 ( 1996 ) ; Staufenbiel et al·， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 4，1 3 2 8 7 一 13292 (1997) ;Borchelt et al., Neuron 19 ’ 939 — 946 (1997))中所述之具有 Swedish突變的鼴鼠。本發明之治療劑亦包括與A Θ專一性結合之抗體。前述抗體可爲單株或多株抗體。某些前_抗體專一性結合至凝集形態之A 0而不與解離形態結合。某些則專一性結合解離形態而不結合凝集形態。某些則與解離形態及凝集形態均可結合。非人類（例如，鼠科動物或家鼠）單株抗體之產製可由，例如，用A /3使動物免疫而完成。見於 Harlow&Lane, Antibodies, A Laboratiry Manual ( CSHP NY, 1 9 8 8 )(倂爲本發明之參考資料）。此一免疫原可由天然來源或由肽類合成方法或重組物表現法取得。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23- 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（21 ) 人類化形態之鼴鼠抗體可藉由重組D N A技術連接非人類抗體之C D R部分至人類固定部分而產生。見於Queen et al·， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 ’ 10029-10033 (1989)及 w 〇 90/0786 1 (倂爲本發明之參考資料）。人類抗體可使用巨噬體-顯示方法取得。見於，例如，Dower et al·， wo 91/17271; McCafferty et al.，W〇 92/01047。在這些方法中，巨噬體之基因庫係以各成分顯示不同抗體於其外表面上製成。抗體經常顯示爲F v或F a b片段。具有所需專一性之巨噬體顯示抗體係藉由富含A 0或其片段的親和力作選擇。對抗 A /3之人類抗體亦可由具有編碼至少一段人類免疫球蛋白區及去活化內源沾免疫球蛋白區之導入外來基因的非人類導入外來基因之哺乳類。見於，例如，Lonberg et al.， W 0 93/122 27 (1993) ； Kucherlapati, W 0 91/10741 (1991)(其均倂爲本發明之參考資料）。人類抗體可藉由競爭性結合實驗或其他方法選擇以具有如同特定鼴鼠抗，體之相同抗原決定基專一性。此等抗體最易於分享鼴鼠之有用功能性質。人類多株抗體亦可以使用免疫原試劑免疫之人類血淸形態提供。任意地，前述多株抗體可藉由使用A Θ或其他致澱粉樣肽作爲親和劑之親和力純化方法予以濃縮。人類或人類化抗體可被設計成具有I gG，I gD， I gA及I g E固有區，以及任何抗原決定基，其包括 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 24 - 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（22 ) IgGl，IgG2，IgG3 及 IgG4。抗體可被表現爲包含二輕鏈及二重鏈之四聚物，分開之重鏈，輕鏈， Fab，Fab’ F ( a b， ) 2及Fv，或爲單鏈抗體，其中，重及輕鏈可變區係經由間隔基連接。本方法中所用之治療劑亦包含結合至Α Θ之T -細胞。例如，T -細胞可藉由從昆蟲細胞系表現人類Μ H C第 I類基因與人類/3 - 2 -小球蛋白基因而使空的複合物形成於細胞表面上而可結合至A /3肽上，因此對A /3肽具有活性。與細胞系接觸之T -細胞變成對肽具有專一活性。見於 Peterson et al·， US 5 3 1 4 8 13。表現 MHC 第I I類抗原之昆蟲細胞糸可類似地用以活化C D 4 T細胞。 2 ·其他疾疾相同或類似的原理決定治療其他致澱粉樣變性病之治療劑的製備。一般而言，以上所示用以治療阿茲海默氏疾病之藥劑亦可用以治療伴隨Down's氏症候群之早期發作阿茲海默氏疾病。在狂牛病中，，使用Prion肽，活性片段及同系物以及prion肽之抗體取代阿茲海默氏疾病治療中之A冷肽，活性片段及同系物以及A /3肽之抗體。在多發性骨髓瘤之治療中、使用I g G輕鏈及其同系物與抗體’其他疾病亦然。 3 .載體蛋白質 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 25 - 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7五、發明説明（23 ) 某些誘起免疫反應之藥劑包含誘起對抗致澱粉樣沉積之免疫反應，但太小而不爲免疫原的適當抗原決定基。在此情況下，肽免疫原可被連接至適當載體上以協助產生免疫原。適當載體包括血淸白蛋白，keyhole limpet血藍質，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵白蛋白，破傷風毒素或來自其他致病細菌（諸如，白喉毒素，大腸桿菌，霍亂弧菌或H. pylori)之毒素或減弱之毒素衍生物。其他刺激或增強免疫反應之載體包括細胞質（諸如，I L - 1， IL— Ια 及 /3 肽類，IL — 2，rINF，IL—10 ，GM — C S F )及化學激素（諸如，Μ 1 P 1 α及冷與 R A N T E S。免疫劑可藉由化學交聯連接至載體上。連接免疫原至載體上之技術包括使用N -琥珀醯亞胺基一 3 -（ 2 -吡啶基一硫代）丙酸鹽（SPDP)及琥珀醯亞胺基酸4 一 (N—馬來醯亞胺基甲基）環己烷一1一甲酸鹽（ S M C C )(若肽缺乏硫氫基，則此可由加入半胱胺酸提供）形成二硫化物鏈結。這些試劑產生在其本身與一蛋白質上之半胱胺酸間的二硫化，物鏈結以及多經由賴胺酸上之 f -胺基或其他胺基酸中之解離胺基的醯胺鏈結。多種前述二硫化物/醯胺·形成劑揭示於Immun. Rev. 6 2， 1 8 5 ( 1 9 8 2 )。其他二官能基偶合劑形成硫醚而非二硫化物鏈結。許多這些硫醚形成劑係爲市面上買得到的且其包括6 —馬來醯亞胺基己酸，2 —溴基乙酸及2 —碘基乙酸，4 一（N —馬來醯亞胺基一甲基）環己烷一 1一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239847 A7 B7 五、發明説明（24 ) 甲酸之反應性酯類。羧基可由結合琥珀醯亞胺或1 -羥基一 2 -硝基一 4 一磺酸，鈉鹽而予活化。免疫原肽亦可用載體表現爲融合蛋白質。免疫原肽亦可連接至載體之胺基終端，羧基終端或內部。任意地，免疫原肽之多次重複可存在於融合蛋白質內。 4 ·核酸編碼免疫原對抗致澱粉樣沉積之免疫反應亦可藉由投服核酸編碼 A占肽或其他肽免疫原而誘起。前述核酸可爲D NA或 RNA。編碼免疫原之核酸段通常連接至調節元素（諸如，促進子及增強子）上而令DNA段表現於病人之標的細胞內。爲了表現於血液細胞內，如同誘起免疫反應所需地，促進子及增強子元素（來自輕或重鏈免疫球蛋白基因）或CMV主要中間體早期促進子及增強子適供直接表現。連接之調節元素及編碼序列經常被植入載體內。經濟部中央標準局員工消費合作社印裝多種病毒載體系統可供使用，其包括逆病毒系統（見於，例如，Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop 3，102 — 109 (1993 )) •，腺病毒載體（見於，例如，Bett et al·，J. Virol. 67，5911 (1993 ));腺結合病毒載體（見於，例如，Zhou et al.J. Exp. Med· 179，1867 (1994))，來自包括疫苗病毒及禽痘病毒之痘族的病毒載體，來自α病毒屬（諸如，源自Sindbis及Semliki森林病毒（見於，例如，〇he et al.， J. Virol. 70^508-519(1996))，及乳頭 -27- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（25 ) 狀瘤病毒（〇11€61&1.，1111111&11〇€116丁1161&?7 6，3 2 5 — 3 3 3 ( 1 9 9 5 ) ； Woo et al·，W 〇 94/ 1 2 6 2 9 及 Xiao& Brandsma， Nucleic Acids. Res. 24 ’ 2630 - 2622 (1996))之病毒載體。編碼免疫原之D ΝΑ或含彼之載體可被倂入微脂粒中。適當之微脂粒及相關同系物揭示於US 5208036 ’ 5264618，5279833 及 5283185 中。編碼免疫原之載汶及DNA亦可被特定載體吸收或相結合。其實例包括聚異丁烯酸甲酯聚合物及聚內交酯及聚（內父酯一共同一乙交酯），見於，例如，McGee et al，m J. Micro Encap. ( 1 9 9 6 ) 0 基因治療載體或裸露D ΝΑ可以藉由投服至個別病人而在體內輸送，其通常藉由全身性投服（例如，靜脈內，腹膜內，鼻內，胃內，真皮內，肌內，皮下、或顱內輸液 )或局部投服（見於，例如，U S 5 3 9 9 3 4 6 )。 D Ν Α亦可使用基因槍投服。見於Xiao&Brandsma，同上。編碼免疫原之DNA係沈澱至極小的金屬珠表面上。微投射物再以震動波或擴散氦氣.加速，再穿透組織至几個細胞層深。例如，Agacetus，Inc. Middleton WI 製造之 AccelTM Gene DeliverDevice是適用的。或者，裸露 D N A 可簡單地藉由使用化學或机械刺激以將D Ν Α放置於皮膚上而通過皮膚進入血流中（見於W〇95/05853) 〇在其他變化中，編碼免疫原之載體可被傳送至體外細 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28- 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝五、發明説明（26 ) 胞，諸如，由個別病人外在植入之細胞（例如，淋巴球’ 骨髓抽取液，活體組織檢查）或全適供血者造血幹細胞’ 隨之再移植此細胞至病人體內，經常在選擇已倂入載體之細胞以後。 III.可治療之病人可治療之病人包括具有罹病危險性，然未出現病徵之個體以及已出現病徵之病人。在阿茲海默氏疾病情況下，若活得夠久的話，則實際上任何人均有罹病的危險性。因此，本方法可用以避免一般人罹患該疾病之危險性而得預防之效果。本方法基本上係對已具有阿茲海默氏疾病已知遺傳危險性的病人有用。前述個體包括已罹患該疾病之病人親屬以及具有已由遺傳或生化標記之分析測出危險性的人。罹患阿茲海默氏疾病危險性之遺伝性標記包括在 A P P基因內之突變，尤其是在分別被稱爲Hardy及Swedish 突變之位置7 1 7與位置6 7 0及6 7 1上之突變（見於 Hardy，TINS，同上）。危險性之其他標記係爲在A D，高膽〆固醇血症或粥狀動脈硬化症之早老基因（PS1及PS2 )皮Α ρ ο E 4家族歷史中之突變。巳罹患阿茲海默氏疾病之個體可從特性痴呆及上述之危險因子的存在辨識出。此外，許多診斷測試可供辨識罹患阿茲海默氏疾病之個體。這些包括CSF tau及A/342値之測定。高tau 及低A Θ値証明阿茲海默氏疾病之存在。罹患阿茲海默氏疾病之個體亦可由實例部分中論及之MMS E及本紙張尺度適财關家料（CNS ) A4規格（210X297公釐)_ 9Q · —— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝五、發明説明（27 ) ADRDA評估準則診斷出。在無徵狀病人中，治療可開始於任何年齡（例如， 10，20，30)。但通常直到病人達到40，50， 6 0或7 0歲時才開始治療。治療通常是在一段時間內予以多重投藥。治療可藉由評估在投藥期間內之抗體，或經活化T 一細胞或B —細胞對治療劑（例如，A Θ肽）之反應。若反應降低則需追加劑量。在潛在唐氏（Down's)症候群病人中，治療可於出生前投服至母體或一出生即予投藥° IV·治療用藥法在預防性用途中，藥學組成物或藥物係以足以消除或減低危險性或延緩疾病發作之數量投服至易於罹患特定疾病或具有危險性之病人。在治療用途中，組成物或藥物係以足以治療或至少部分地遏止疾病及其倂發症之症狀的數量投服至疑似罹患或已罹患此一疾病之病人。適供投服之數量定義爲治療-或藥學-有效劑量。在預防及治療兩种用藥法中，藥劑經常以多劑量投服直到獲致足夠免疫反應爲止。通常，監視免疫反應而若免疫反應開始減低時給予重複劑量。本發明組成物治療上述症狀之有效劑量係隨多種不同因素而變化，前述因素包括投藥途徑，標的位置，病人之生理狀況，病人是爲人類或動物，其他投服藥物及治療係用以預防或治病。通常，病人是爲人類，但在某些疾病（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -30 - 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 __B7五、發明説明（29 ) 途徑亦同樣有效。其次最常用的是肌內注射。此類注射最常在手臂或腿部肌肉施行。靜脈內注射以及腹膜內注射，動脈內，顱內或真皮內注射亦有效產生免疫反應。在某些方法中，藥劑係直接注射於沉積已積聚之特定組織內。本發明之藥劑可任意與其他至少部分有效治療致澱粉樣變性病之藥劑綜合投服。在阿茲海默氏疾病及唐氏症候群（致澱粉樣沉積發生於腦內）之情況下，本發明之藥劑亦可與其他可促進本發明之藥劑通過血液一腦部障壁之藥劑一起投服。本發明之免疫劑（諸如，肽）有時與佐助劑一起投服。多種佐助劑可與肽（諸如，A /3 )綜合使用以產生免疫反應。較理想之佐助劑增強對免疫原之固有反應而反致引起免疫原之構型變化（其影響反應之定量形態）。較佳之佐助劑包括明礬，3 D e - 0 -醯化單磷脂A ( Μ P L ) (見於GB 2220211) °QS21是從南美發現之 Quillaja Saponaria Molina樹之樹幹分離出之配糖或植物层素三聚體（見於 Kensil et al·, Vaccine Design: The Subunit andAjuvant Approach ( eds. Powell&Newman, Plenum Press，NY，1 9 9 5 ) ; US Patent No · 5057540 )。其他佐助劑係爲油在水中型乳液（諸如，角鯊烯或花生油），任意地綜合免疫刺激物，諸如，單磷脂A (見於 Stoute et al.，N. Engl. J. Med. 336，86 — 91 ( 1 9 9 7 ))。另外之佐助劑是 C p G (Bioworld Today， Nov. 15，1998)。或者，A/3可偶合至佐助劑。例本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） ?32- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（30 ) 如，A/3之脂肽型可以藉由直接偶合棕櫚酸或其他脂質至 A冷之N —端而製得，其係如B型肝炎疫苗（Livingston， J· Immunol· 159，1383 — 1392 (1997)) 所述。但是，前述偶合必需實際上不改變A石之構型以免影響其免疫反應之性質。佐助劑可以治療組成物之一分子與活性試劑一起投服或者可以在投服治療劑之前，同時或之後，各別分開投服。較佳之佐助劑種類是鋁鹽（明礬），諸如，氫氧化鋁，磷酸鋁，硫酸鋁。前述佐助劑可以和或不和其他免疫刺激劑（諸如，MPL或3 — DMP，QS2 1，聚合或單體胺基酸，諸如，聚麩胺酸或聚賴胺酸）一起使用。其他種類之佐助劑是油在水中型乳化組成物。前述佐助劑可以和或不和其他免疫刺激劑（諸如，胞壁醯基肽（例如，N 一乙醯基胞壁醯基一 L 一蘇胺醯一 D -異麩胺醯胺（ t h r - MDP ) ，N -乙醢基一正胞壁醯基—L 一丙胺醯一 D —異麩胺醯胺（nor - MDP) ，N —乙醯基胞壁醯基一 L —丙胺醯一 D -異魅胺酿胺基一 L 一丙胺酸一 2 — (1’ 一 2’二棕櫚醯一 s η —甘油一 3 —經基憐醯氧基）一乙胺（MTP — PE) ，Ν —乙醯基葡胺基一 Ν 一乙醯基胞壁醯基一 L 一 A 1 - D —異麩胺基一 L — A 1 a —二棕櫚醯氧基丙醯胺（DTP - DPP) theramideTM )，或其他細菌胞壁成分。油在水中型乳液包括（a)MF59 (W〇 90/14837)，其包含 5 % 角鯊烯，0 · 5 % Tween80，及 0 · 5 % Span 85 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -33- 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 _五、發明説明（31 ) Micro fluidics，Newton MA)調製成（任意包含不同數量之 Μ T P - p E )，使用微流化劑（諸如，1 1 0 Υ型微流化劑（次微米顆粒，（b ) S A F，其包含1 0 %角鯊烯，0 · 4%Tween 80，5%pluronic -阻斷之聚合物 L1 2 1 ，及t h I* - M D P，微流化成次微米乳液或反轉而產生較大顆粒大小乳液，以及（c ) R i b i Τ Μ佐助劑系統 (R A S ) ，（ RIBI Immunochem，Hamilton，MT)，其包含 2%角鯊烯，0.2% Tween 80，及一或多種細菌胞壁成分，該等成分來自單磷脂A (MPL)，二黴菌酸海藻糖酯（TDM)，以及胞壁骨架（CWS)，宜爲MPL + CWS (DetoxTM)。另一類較佳佐助劑是植物皂素佐助劑，諸如，StimulonTM(QS21，Aquila，Worcester，MA)或由其產生之顆粒，諸如，ISCOMs (免疫刺激複合物）及 ISCOMATRIX 〇其他佐助劑包括完全弗瑞得佐助劑（ Complete Freund’s Adjuvant (CFA))及不完全弗瑞得佐助劑（I F A )。其他佐助劑包括細胞激素，諸如，干擾素 (IL— 1，IL — 2,及IL— 12)，巨噬體菌落刺激因子（M— CSF)，腫，瘤壞死因子（T N F )。佐助劑可與免疫原一起以單一組成物形態投服或者可以在投服免疫原之前，同時或之後各別分開投服。免疫原與佐助劑可以一起包裝於同一小玻瓶內或者分開包裝於各別小玻瓶內而在使用前再予混合供應。免疫原及佐助劑通常用指示治療用途之標箋紙包裝。若免疫原及佐助劑分開包裝’則其包裝通常包括使用前混合之指示。佐助劑及/ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4胁（210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239847 Δ7 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（32 ) 或載體之選擇依以下因素而定：包含佐助劑之疫苗安定性，投藥途徑，佐助劑對施打疫苗對象的效力，以及，在人體時，藥學上可接受佐助劑是爲藉由人體投服之合宜調節體所允許或可允許者。例如，完全弗瑞得佐助劑並不適供人體投服。明礬，Μ P L及Q S 2 1是較理想的。任意地，一或多種不同佐助劑可同時使用。較理想的組合包括明礬與MPL，明礬與QS21，MPL與QS21，以及明礬，QS2 1與MPL。而且，亦可使用不完全弗瑞得佐助劑（Chang et al·，Advanced Drug elivery Reviews 32，173-186 (1998))，任意地綜合明礬，Q S 2 1或MP L中任一種以及其所有組合。本發明之藥劑經常以包含活性治療劑以及各種其他藥學上可接受成分之藥學組成物形態投服。見於Remington、 t Vi Pharmaceutical Science ( 15L ed., Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。較理想的形態依所期望之投服模式及治療用途而定。組成物依所需組成物而定地亦可包括藥學上可接受之無毒性載體或稀釋劑，其被定義爲一般用以調配動物或Λ類投服用組成物的賦形藥。稀釋劑係選擇不致影響組成物的生化活性者。前述稀釋劑之實例爲蒸餾水，磷酸鹽緩衝之生理食鹽水，Ringer’s溶液，葡萄糖溶液，以及漢氏溶液（Hank、solution)。此外，藥學組成物或調合物亦可包含其他載體，佐助劑或無毒性 ’無治療性之非免疫原安定劑等。但是，某些適供投服至動物之藥劑（諸如，完全弗瑞得佐助劑）通常不包含在人本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239847 A7 B7 五、發明説明（33 ) 類使用之組成物內。藥學組成物亦可包含緩慢代謝之巨大分子，諸如，蛋白質，多糖類，聚乳酸，聚葡康酸及共聚合物（諸如，乳汁吕能化瓊脂糖’瓊脂糖，纖維素，等），胺基酸聚合物 ’胺基酸共聚物，以及脂質附聚物（諸如，油滴或脂質體 )。此外，這些載體可充作免疫刺激劑（亦即，佐助劑）〇爲供非經腸道投服，本發明之藥劑可以物質在含藥學載體（其可爲惰性液體，諸如，水油類，食鹽水，甘醇或乙醇）之藥學上可接受稀釋劑中的可注射溶液或懸浮液。此外，輔助物質（諸如，，潤濕劑，界面活性劑，PH緩衝物質等）可存在於組成物中。藥學組成物之其他成分係爲石油，動物的，植物的或合成來源，例如，花生油，黃豆油及礦物油。通常，諸如，丙二醇或聚乙二醇之二醇類是爲較理想的液態載體，尤其是供可注射溶液使用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一般而言，組成物係製成可注射之液態溶液或懸浮液 ;亦可製成注射前適供溶於或懸浮於g態賦形藥中之固體形態。製劑亦可乳化於或納，入微脂粒或巨顆粒（諸如，聚丙交酯，聚乙交酯或共聚物）中以增強佐助劑效力，其係如以上所討論的（見於Langer，Science 2 4 9 , 1 5 2 7 (1 9 9 0 )及 Hanes， Advanced Drug Delivery review 28，97 — 1 19 (1997)。本發明之藥劑可以儲存注射（depot injection)或植入物製劑（其可經調配成使能持續或脈動的釋放出活性成分）形態投服心適供其他投本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 36· 1239847 A7 B7 五、發明説明（34 ) 藥途徑之其他組成物包括經口，經鼻及經肺的調合物，栓劑及經皮塗佈。爲供栓劑之用，結合劑及載體包括，例如，聚烷二醇類或甘油三酸酯；前述栓劑可由包含〇 · 5%- 1 0%，宜爲1 % — 2 %範圍內之活性成分的混合物形成。口服組成物包括輔藥，諸如，藥品級甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素及碳酸鎂。這些組成物係爲溶液，懸浮液，片劑，藥九，膠囊，緩釋調合物或藥粉且包含 1 0% - 9 5%，宜爲2 5%— 70%活性成分。局部塗佈可導致經皮或皮內傳送。局部投服可利用共同投服藥劑與霍亂弧菌毒素或其去毒衍生物或其次單元或其他類似細菌毒素以利進行（見於Glenn et al.， Nature 391，851 (199 8 ))。共同投服可藉由使用各成分之混合物或化學交聯反應所得連接分子或表現爲融合蛋白質而達成。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 或者是，經皮伝送可由使用皮膚貼片或使用 transferosomes達成（Paul et al·，Eur. J. Immunol. 2 5， 3 5 2 1 — 2 4 ( 1 9 9 5，））； Cevc et al., Biochem.

Biophys. Acta 1368，201 - 15 (1998)) 〇 V .診斷方法本發明係提供一種偵測罹患或易於罹患阿茲海默氏疾病之病人對A /3肽之免疫反應的方法。此方法尤有用於監本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（35 ) 視病人之治療過程。此方法不但可監視症狀病人之治療過程，亦可監視無症狀病人之預防過程。某些方法能夠測定病人在投服藥物劑量前之免疫反應基本値，再以此値與治療後之免疫反應値相比較。免疫反應値顯著提高（亦即，大於相同値重複測試中之實驗誤差標準邊緣，以平均値之一個標準偏差表示）代表正面沿治療結果（亦即，投服藥劑己獲致或增強免疫反應）。若此値末顯著改變或降低則代表負面治療結果。一般而言，剛使用藥劑治療之病人預期在連續投藥下，免疫反應會提高直到最後達到高原値爲止。藥劑之投服是持續的而免疫反應同時提高。達到高原期代表治療可中斷或可減少劑量或用藥次數。在其他方法中，免疫反應之對照値（亦即，平均値與標準偏差）係由對照組測得。通常，對照組之個人未接受先行治療。投服治療劑之後，病人免疫反應三測定値再與對照値相比較。相對於對照値之顯著提高（例如，大於平均値一個標準偏差）代表正面治療結果，無明顯提高或降低代表負面治療結果。通常，持續投服藥劑之同時，相對於對照値之免疫反應隨之提高。如同前面一般地，達到相對終對照値之高原期代表治療可中斷或可減少劑量或用藥次數。在另一方法中，免疫反應之對照値（例如，平均値加上一個標準偏差）係由業已使用治療劑進行治療且其免疫反應已達高原期之對照組個體測得。再比較病人之免疫反應測定値與對照組。若病人之測定値與對照値並無顯著差 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 38 - 1239847 A7 __B7 五、發明説明（36 ) 異（例如，大於一個標準偏差），則可中斷治療。若病人之測定値低於對照値則需持續投服藥劑。若病人之測定値一直低於對照値，則可能表示治療用藥法（例如，使用不同的佐助劑）需改變。在另一方法中，監視目前未接受治療但已進行初始治療過程之病人的免疫反應以決定是否需要恢復治療。病人免疫反應之測定値可與進行初始治療過程之病人先前獲致之免疫反應値相比較。相對於先前測量値之明顯提高（亦即，大於相同値重複測量中之典型誤差邊緣）代表可恢復治療。或者，病人之測定値可與進行一段治療過程後之病人所測得之對照値相比較。或者，病人之測定値與無病徵之預防性治療病人或疾病特徵已消除之治癒病人的對照値相比較。在所有這些情況下，相對於對照値之明顯提高（亦即，大於一個標準偏差）代表病人必需恢復治療。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 分析用之組織樣品通常是爲病人之血液，血漿，血淸，粘膜或腦脊髓液。分析樣品對任何形態A /3肽，通常是 A yS 4 2之免疫反應。免疫反應可由，例如，專一性結合至A /3肽之抗體或T 一細胞，的存在而測得。偵測A B專一性之抗體的E L I S A方法揭示於實例部分。偵測反應性 T 一細胞之方法已說明於上文中（見於定義中）。實例 I · A万對阿茲海默氏疾病的預防效力這些實例說明投服A /3肽至已導入外來基因之鼴鼠（本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 7〇9 - 1239847 A7 --------B7 五、發明説明（1 2 37 ) 其在位置7 1 7上突變而過度表現AP P(AP P 7 1 7V —F )以致於使其易於罹患類似阿茲海默氏疾病之神經病理學）。這些鼴鼠（PDAPP)之產製及特性揭示於 Games et al·，同上。這些異合子形態之動物在長大6個月後開始沉積A/3。1 5個月大後，它們的A0沉積量等於阿茲海默氏疾病中所見及之量。P DA P P鼴鼠注射以凝集之A/3 4 2或磷酸鹽緩衝食鹽水。選擇ΑΘ之理由是基於它誘起對A /3多重抗原決定基之抗體的能力。 A ·方法丄_.鼴鼠來源將3 0隻P D A P P雌性鼴鼠任意分成以下幾組： Q隻鼴鼠用凝集之A /3 4 2注射(1隻鼴鼠在過渡中死 ί ) ，5隻鼴鼠用PBS/佐助劑或PBS注射，而10 I鼴鼠爲未注射之對照組。5隻鼴鼠用血淸致澱粉樣蛋白質（S A P )注射。經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 40 · 1 免疫原之製備 2 凝集 A 冷 4 2 之製備：，將 2 m g A /3 ( US Peptides Inc, lot k — 4 2 — 1 2 )溶入0 · 9 m 1水中並加入 0.1ml lOxPBS而成lml。將其反轉以於 3 7 °C下孵養過夜（肽在此情況下凝集）。任何未使用之 A /3以乾燥低壓凍乾粉末貯於- 2 0。C下直到下次注射爲止。 1239847 A7 B7 五、發明説明（38 ) 3__.注射液之製備每隻鼴鼠100//g PBS中之凝集用完全弗瑞得佐助劑（C F A )以1 : 1比例乳化而得最後體積爲 4 0 0 // 1之乳液以供首次免疫用，隨之在第二週追加相同數量之不完全弗瑞得佐助劑（I FA)中的免疫原。每隔1個月再給予二劑量（I F A中）。隨後之免疫作用係每隔一個月在500# 1 PBS中進行。注射係由腹膜內進行（i · P ·)。 P B S注射遵照相同程序且鼴鼠係用P B S /佐助劑之1 : 1混合物注射（每隻鼴鼠4 0 0 // 1或5 0 0 // 1 P B S ) 。S A P注射同樣遵照相同程序而使用每次注射 1 0 0 # g之劑量。 4 .鼴鼠血液之滴定，組織製備及免疫組織化學以上方法說明於以下一般物質與方法中。 B · 結果經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) P D A P P鼴鼠注射以凝集A /3 42，SAP肽，或磷酸鹽緩衝食鹽水。一組P D A P P鼴鼠亦未予以注射而充作正對照組。從第4次追加劑量開始，每隔一個月監視鼴鼠對凝集Α Θ 4 2之滴定度直到鼴鼠一歲爲止。在1 3 個月大時殺死鼴鼠。在所有檢測點，9隻鼴鼠中有8隻鼴鼠產生高抗體滴定度，其在一系列注射期間內均保持高値 (滴定度大於1/1 0000)。第9隻鼴鼠具有約1/ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 41 _ 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（40 ) 多AyS致澱粉樣沉積（用AyS -專一性單株抗體（mAb )3 D 6形像化於海馬區以及逆脾皮質內。類似形態之致澱粉樣沉積亦見於用SAPP或PBS免疫之鼴鼠中（附圖2)。此外，在這後三組中具有阿茲海默氏疾病中通常見及之腦部易受傷副區，諸如，海馬齒狀腦回之外分子層〇不含任何A /3沉積之腦部亦無通常在具有人類A P P 抗體8 E 5之PDA P P鼴鼠中所見及的神經斑。其餘各組（S A P -注射，P B S及未注射鼴鼠）之所有腦部具有未治療之P D A P P鼴鼠的許多典型神經斑。少數神經斑存在於用AN 1 7 9 2治療之一隻鼴鼠中，且單叢營養障礙神經突見於第二隻用A N 1 7 9 2沿治療之鼴鼠中。如附圖3中所示地，海馬區之影像分析証實了與P B S受體（中間値0 · 28%，P = 0 · 0005)相較之下，實際上消除了 A N 1 7 9 2治療之鼴鼠中的營養障礙神經突（中間値0 · 0 0 % )。斑結合發炎之星形細胞增多症亦不存在於A 0 1 一 4 2注射組中。其他各組鼴鼠之腦部包含許多叢集之A /3 斑結合神經膠樣變性的典型G F A P -陽性星形細胞。 G F A P —反應之載玻片副組用TMoflavin S對比染色以固定A/3沉積。在SAP，PBS及未治療對照組中， G F A P -陽性星形細胞結合A /3斑一起。在斑一陰性 A /3 1 - 4 2治療之誕鼠中並未見及則述結合，然而，最少量之斑結合神經膠樣變性見於用A N 1 7 9 2治療之一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂鮮本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -43- 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（41 ) 隻鼴鼠中。附圖4中所示之逆脾皮質的影像分析証實了星形細胞增多症之減少是顯著的，因爲用AN 1 7 9 2治療之組的中間値爲1 · 5 6 %而用S A P肽，P B S治療或未治療 (P = 0 · 0 0 1 7 )之組的中間値則大於6 %。由A/S1 — 42 —及PBS——結合之MHC II免疫反應性不存在於A θ 1 - 4 2注射之鼴鼠中，此與缺乏 A 0 -相關之發炎反應相符合。鼴鼠之腦切片亦與MA C - 1專一性之mAy3反應。 MAC— 1 (CD1 lb)是完整合家族元素且以含 CD 1 8之異二單體存在。CD 1 1 b/CD 1 8複合物係存在於單細胞，巨噬體，嗜中性細胞及天然殺手細胞（ Mak andSimard )上。腦內之固有M A C — 1 —反應性細胞種類根據M A C - 1免疫反應部分中之類似酚類形態可能是爲小神經膠質。斑一結合之M A C - 1標記與P B S對照組比較之下，低於用A N 1 7 9 2治療之鼴鼠，此發現與缺乏A /3 -誘起之發炎反應相符合。 C ·結論 A /3 1 — 4 2注射之鼴鼠腦內缺乏Α Θ斑及反應性神經元及神經膠變化代表沒有或極少致澱粉樣沉積於其腦內而不存在致病結果（諸如，神經膠樣變性及神經炎病理學 )。用A/3 1 - 42治療之PDAPP鼴鼠顯示出基本上和未和外來基因接觸之對照組同樣缺乏病理學。因此’ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 44 - 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（42 ) A /3 1 - 4 2注射係高度有效於預防腦組織之人類A石的沉積或淸除以及消除隨後之神經元與發炎退行性變化。因此之故，投服Α Θ肽在預防阿茲海默氏疾病中具有治療效果。 II.劑量反應硏究幾組5週大之Swiss Webster雌性鼴鼠（N = 6/組）用 300，100，33，11，3.7，1.2， 0.4或0.13//忌CFA/IFA中A冷腹膜內注射使其免疫。前三劑量係每隔二週投服而在一個月之後投服第四劑量。第一劑量係用C F A乳化而其餘劑量係用 I FA乳化。在第二次免疫後4 一 7天，對動物抽血以供測定抗體滴定度。用11，33或300/zg抗體免疫之三組動物在第四次免疫後之四個月內，大約每隔一個月抽血一次以監視疫苗劑量範圍內之抗體反應衰變。這些動物在硏究開始後第七個月接受最後第五次免疫。一週後殺死動物以測定對A N 1 7 9 2之抗體反應及進行毒性分析。從3 0 0至3 · 7 // g _劑量範圍內可見及遞減之劑量反應而最低二劑量則無任何反應。在三劑量1 1 一 3 0 0 //g抗原後之平均抗體滴定度爲約1 : 1 0 0 0而在四劑量之1 1 一 300//g抗原後之平均抗體滴定度爲約1 : 10000 (見於附圖5)。在第三次免疫後，除了最低劑量之外，所有抗體滴定度顯著地升高而GMT s提高5 —至2 5 -倍。甚至 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -45- 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__五、發明説明（44 ) 幼鼴鼠。有效誘起人類免疫反應之劑量通常類似於鼴鼠之有效劑量。 III.對已罹患阿茲海默氏疾病之治療效力的篩選此一分析係設計用以測試免疫劑消除或逆轉年老動物之阿茲海默氏疾病的神經病理特性。用4 2胺基酸長A yS (AN 1 7 9 2 )免疫係在致澱粉樣斑已存在於 P D A P P鼴鼠腦內時開始進行。在此一硏究所用之期間內，未治療之P DA P P鼴鼠產生類似阿茲海默氏疾病中見及之神經退行性變化（Games et al·,同上及 Johnson-Wood et al·，Proc. Natl· Acad· Sci· USA 94， 1550 — 1555(1997)) ·Α 冷之沉積至致澱粉樣斑內伴隨包括失常軸索及樹枝狀元素在內之退行性神經元反應，稱之爲營養障礙突。營養障礙神經突包圍且含彼之致澱粉樣沉積稱爲神經炎斑。在阿茲海默氏疾病及PDAP Ρ鼴鼠中，營養障礙神經突具有獨特的球狀構造，可與一組辨識A Ρ Ρ及細胞骨架成分之抗體行免疫反應且在超結構下展現第雜的次細胞退行性變化。這些特性使得P D A Ρ P腦之神經炎斑形成的疾病一相關性，選擇性及再現性測量可行。P D A Ρ P神經炎斑之營養障礙神經元成分易由使用人類A Ρ P專一性抗體（m A /3 8 E 5 )而見到且易由電腦協助之影像分析測得。因此之故，除了測定A N 1 7 9 2對致澱粉樣斑形成之作用以外，我們還監視此一治療對神經炎營養不良的作用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -47 · 1239847 A7 B7 五、發明説明（45 ) 星形細胞及小神經膠質是反映神經元受傷程度之非神經元細胞。G F A P —陽性星形細胞及Μ H C I I -陽性小神經膠質通常見於阿茲海默氏疾病中，且其活性隨疾病嚴重性增高。因此，我們亦監視A N 1 7 9 2 -治療鼴鼠中之反應性星形細胞增多症及小神經質細胞增生症的發展經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A .材料及方法 4 8隻來自查里士河（Charles River)之雜種 P D A P P雌性鼴鼠（1 1至1 1 · 5個月大）任意地分成二組·· 24隻鼴鼠用100/igAN1792免疫而另 2 4隻用P B S免疫，各別綜合弗瑞得佐助劑。當其達到約1 5個月大時再將A N 1 7 9 2及P B S組分組。在 1 5個月大時，每一 AN 1 7 9 2 —及P B S —治療動物組之半數安逸死（η分別等於1 0及9 )，其他動物持續接受免疫直到約1 8個月大時爲止（η分別等於9及1 2 )。硏究期間內共有8隻動物死亡（5隻ΑΝ1972, 3隻PBS)。除了免疫動，物外，在EL I SAs中亦包括比較用之一歲大（n=10) ，15個月大（n = l〇 )及1 8個月大（n=l 0)未治PDAPP鼴鼠以測定腦內之a 0及A P P値；一歲大動物亦包括在免疫組織分析中。方法除非另外指明否則如實例1所示。使用 A N 1 7 9 2 之 US Peptides lot 12及 California Peptides (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 48 - 1239847 Δ7 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（46 ) lot ME 〇 3 3 9製備在1 5個月前投服之六次免疫作用的抗原。使用 California Peptides lot Μ E 〇 3 3 9 及 ME 0 4 3 9於1 5至1 8個月間投服之另外三次免疫中〇爲供免疫之用，在200//1PBS中之100/zg AN1 7 9 2或PBS用完全弗瑞得佐助劑（CFA)或不完全弗瑞得佐助劑（I F A )或P B S以1 : 1乳化至最後體積爲400/i 1。第一次免疫係用CFA爲佐助劑，其後四次免疫則用I F A爲佐助劑而最後四次免疫則僅使用P B S而未加入佐助劑。在7個月期間內共進行9次免疫，前三次免疫係每隔二週投服而後每隔4週投服。4 個月治療組（在1 5個月大時安逸死）僅接受前6次免疫〇 B · 結果 1 · A N 1 7 9 2治療對致澱粉樣負荷的作用利用定量影像分析所得之A N 1 7 9 2治療對皮質致澱粉樣負荷的結果示於附圖，7中。在未治療之1 2個月大 PDAPP鼴鼠中之皮質致澱粉樣負荷中間値爲0·28 %，此値代表鼴鼠在硏究初期之斑負荷。1 8個月大時’ P B S -治療之鼴鼠的致澱粉樣負荷提高1 7倍而達 4·87%，但AN1792-治療之鼴鼠的致澱粉樣負荷則大大減少至僅爲0 · 0 1 %---明顯小於1 2個月大未治療組及1 5 -與1 8 -個月大P B S —治療組。致 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -49- 1239847 A7 B7 五、發明説明（47 ) 澱粉樣負荷在15個月大（96%降低；p = 0 · 〇〇3 )及18個月大（>99%降低；p = 0 . 0002)之 AN 1 7 9 2接受者中顯著降低。通常，在P D A P P鼴鼠中之皮質致澱粉樣沉積始於額面及逆夾肌皮質（R S C )中且以腹外側方向進行而涉及顳及entorhinal皮質（EC)。在12個月大（首次投服 AN 1 7 9 2之適當年齡）鼴鼠之E C中見及極少或者無任何致澱粉樣。在A N 1 7 9 2治療4個月後，致澱粉樣沉積在R S C中大大地減少而E C之進行性涉及亦由 AN 1 7 9 2治療完全消除。後一觀察結果証明 A N 1 7 9 2完全遏止致澱粉樣之進行性侵襲顳及腹面皮質以及阻止或者可能逆轉在R S C中之沉積。 AN 1 7 9 2治療對PDAP P鼴鼠中之皮質致澱粉樣負荷的重大影響又進一步藉由1 8個月大組鼴鼠（已治療7個月）証明。近乎完全缺乏皮質致澱粉樣見於 AN 1 7 9 2 —治療之鼴鼠，完全缺乏擴散斑以及密度大沉積減少。 / 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 · A N 1 7 9 2治療一伴隨之細胞及形態變化 A /3 -陽性細胞群見於通常包含致澱粉樣沉積之腦部內。恨明顯的，在來自AN 1 7 9 2接受者之幾個腦中，極少或者甚至沒有發現任何細胞外皮質致澱粉樣斑。大多數之A 0免疫活性似乎包含在具有小葉或凝集軀體之細胞內。遺傳表型地，這些細胞類似活化小神經膠質或單細胞本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） .g〇 - ' " 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（48 ) 。它們與辨識藉由活化單細胞及小神經膠質（Μ H C II 及CD 1 1 b )表現之配位基進行免疫反應且偶而與血管之壁或腔結合。用A/3與MHC II —專一性抗體標記之鄰近部分的比較顯示類似型態之這些細胞係由此兩類抗體辨識。A N 1 7 9 2 -治療之腦部的詳細檢視顯示出 Μ H C I I -陽性細胞局限於殘留在這些動物內之有限致澱粉樣周遭。在所用固定情況下，細胞並不與辨識T -細胞（CD3，CD3e)或 B —細胞（CD45RA， CD45RB)配位基或白血球普通抗原（CD45)之抗體進行免疫反應，但可與辨識leukosialin ( C D 4 3 )— 一其與單細胞交聯反應一一之抗體反應。在任何P B S -治療之鼴鼠中未發現此等細胞。 P D A P P鼴鼠一定產生嚴重之致澱粉樣沉積於海馬齒回之外分子層內。此沉積在穿通神經途徑內形成獨特之痕線，在阿茲海默氏疾病中之通常包含致澱粉樣斑的一副區。在P B S -治療之鼴鼠中，這些特性沉積之出現類似於先前在未治療P D A P P鼴鼠中之特徵。致澱粉樣沉積包括擴散及擁擠之斑於連續_帶內。相反地，在很多來自 A N 1 7 9 2 -治療之鼴鼠腦內，此一形態顯著地改變。海馬致澱粉樣沉積不再包含擴散致澱粉樣且帶狀形態完全中斷。取而代之地，存在很多與抗- A /3抗體反應之不尋常點狀結構，其中幾個似乎是含致澱粉樣之細胞。 Μ H C I I 一陽性細胞經常在A Ν 1 7 9 2 —治療之動物內之細胞外致澱粉樣周遭發現。A Θ -陽性細胞與致 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 51 - 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明U9 ) 澱粉樣之結合形態在來自AN 1 7 9 2 -治療之鼴鼠的幾個腦內極其類似。這些單細胞之分布限於沉積致澱粉樣附近且完全不存在於無A0斑之其他腦部分內。MHC II 及M A C I -標記部份之定量影像分析顯示出在 AN 1 7 9 2 -治療之鼴鼠的RS C及海馬內之免疫活性升高趨勢，其和P B S組相較之下，其在海馬中之 MAC 1測量具有意義。這些結果指示出在帶有斑之腦部份內之致澱粉樣的活性細胞媒介移除。 3 · A N 1 7 9 2對A S値之作用：E L I S A測定 (a )皮質値在未治療PDAP P鼴鼠中，在1 2個月時之皮質內的全部A/3中間値是爲1600ng/g，其在15個月時升高至8700ng/g (表2)。在18個月時之此中間値爲2 2 0 0 0 n g / g，在此實驗期間內升高1 〇倍以上。PBS -治療之動物在15個月時具有8600 ng/g之全部AyS，其在18個月時升高至19000 n g/g。相反地，AM1 7 9 2 -治療之動物在1 5個月時具有小於PBS —免疫組81%之全部A冷（ 1600ng/g)。當比較AN1792及PBS組時發現在18個月時之全部A/3 (520 0 ng/g)明顯較少（ρ = 0·0001)，其代表AyS之存在減少72 %。在比較Α Θ之皮質値時獲致類似結果，亦即，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ΤβΟ - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（5〇 ) A N 1 7 9 2 —治療組包含更少之A /3 4 2，但在此情況 P 時 ( ) 月 2 個表 5 ， IX IX在ο 異 ο 差 ο 的· 間 ο 之 I 一組 P S ( B 月 P 個與 8 2 1 9 及 7 j 。 1 4 義 Ν ο 意 A . 有， ο 具下二均 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -53 - 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（51 ) 表2:皮質內之A石中間値（ng/g) 未治療 PBS AN 1 792 年齡全部 Ay5 A /5 4 2 (η) 全部 A/3 A /3 42 ( n ) 全部 A/3 A β 42 ( n ) 12 1600 1300 (10) ί | 15 丨 8 7 00 8 3 00 ( 1 0 ) 8 600 7 200 ( 9 ) 1600 1300.(10) 18 22200 18500 (10) 19000 15900 (12) 5 200.· 4000·· ( 9 ) * P = 0.0412 * * P = 0.0001 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 54 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1239847 A7 B7 五、發明説明（52 ) (b )海馬値在未治療PDAPP鼴鼠中，12個月大時全部A/3 之海馬中間値爲15000ng/g，其在15個月大時升高至5 1 0 0 0 n g/g而在1 8個月大時再升高至 81000ng/g (表3)。類似地，PBS免疫之鼴鼠在1 5及1 8個月大時其値分別爲4 0 0 0 0 n g/g 及65000ng/g°AN1792免疫動物之全部 AyS値較低，其在1 5及1 8個月大時分別爲2 5 0 0 0 ng/g及51000ng/g。18個月大之 A N 1 7 9 2 —治療組之値顯著低於P B S治療組（p二 0 · 0 1 0 5 ;表3 ) 。A 0 4 2之測定產生類似形態結果，亦即，AN 1 7 9 2 -治療組之値在1 8個月大評估時顯著低於P B S組（分別爲3 9 0 0 0 n g / g比 57000ng/g；p = 0.0022)(表 3)。 (请先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 A7 B7五、發明説明（53 )表3 :海馬內之A々中間値（n g / g ) 1 1未治療 PBS AN 1 792 1-: 年齡全部 AyS Α β 42 (η) 全部 Ay5 Α β 42 (η) ； ! ' 全部 A yS A β 42 ( η ) I 12 15500 11100 (10) ! 1 15 51500 44400 (10) 4 0 1 00 3 5 7 00 ( 9 ) 24500 22100 (10) 18 80800 64200 (10) 65400 57100 (12) 50900* 38900" ( 9) * P=0.0105 * * P=0.0022 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -56- 1239847 A7 B7 —.———------ 五、發明説明（54 ) (c )小腦値在1 2個月大未治療之PDAPP鼴鼠中’全部A/S升高至35ng/g。PBS治療之動物在1 5個月大時之全部A/3中間値爲2 1 n g/g而在1 8個月大時爲43 n g/g。AN 1 7 9 2 —治療之動物据發現在1 5個月大時之全部A /3中間値爲2 2 n g/g而在1 8個月大時之全部A/S (25ng/g)顯著較低（P = 〇 · 002 )於對應之P B S組（表4 )。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _ 57 _ 1239847 A7 B7 五、發明説明（55 ) 表4 :小腦內之A /5中間値（n g / g ) 未治療 PBS ΑΝ 1 792 1 年齡全部AyS (η ) 全部AyS (η) 全部Α冷 (η ) (月） ! 12 15.6 (10) 15 27.7 (10) 20.8 (9) 21.7 (10) 18 35.0 (10) 43.1 (12 ) 24.8 * (9) * P=0.0018 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 . AN 1 7 9 2治療對APP値之作用 A P P - α與全部長度A P P分子均包含所有或部份之A/3序列而由於AN1 79 2 —指引之免疫反應而內在受衝擊。在迄今之硏究中，在AP P値之輕微升高已知是 PDAPP鼴鼠中之神經病理學提高。在皮質內，APP 一 α/FL (全長）或ΑΡΡ — α之ί|基本上均未因治療而改變，但唯一例外的是Α，Ρ Ρ — α在1 8個月大時，在 A Ν 1 7 9 2 —治療組對P B S —治療組中減少1 9 %。 1 8個月大AN1 79 2 —治療之APP値與1 2 —及 1 5 —個月大之未治療組與1 5 —個月大之PB S組之値並無顯著差別。在所有情況下，A P P値保持在 P DA P P鼴鼠中通常見及之範圍內。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -58 - 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（56 ) 5 . A N 1 7 9 2治療對神經退冇性及神經膠樣變性病狀的作用在15個月大（84%; P = 0 · 03)及18個月大（55%; P 二 0 · 01)時之AN1792 —治療之鼴鼠額面皮質內的神經炎斑負荷均顯著低於P B S組。在 1 5至1 8個月大之P B S組中的神經炎斑負荷中間値由 0 · 32%提高至0 · 49%。此與AN1792組之神經炎斑大大減少相反，因其在1 5及1 8個月大時之神經炎斑負荷中間値分別爲0 · 0 5 %及0 · 2 2 %。用AN 1 7 9 2免疫似乎耐受性佳且在AN 1 7 9 2 -治療鼴鼠之R S C中的反應性星形細胞增多症顯著低於 PBS組一一在15個月大時’ 56%; P^O · 11而在18個月大時，39%; P = 0 · 028 (附圖9)。在P B S組中的星形細胞增多症之中間値百分比在1 5至 18個月大期間，由4 · 26 %升高至5 · 21%。 A N 1 7 9 2 —治療在此二時間點分別抑制星形細胞增多症之發生至1 · 89%及3 · 2%。由此可見神經氈並未被淸除過程損害。 . 6 .抗體反應如上所述地，11個月大之雜種PDAPP鼴鼠（N = 24)接受一系列之五次用1 ΟΟ/ig完全弗瑞得佐助劑乳化的A N 1 7 9 2在第0，2，4，8及1 2週腹膜內注射免疫及在第16週僅單獨用PBS (無完全弗瑞得 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 59 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（57 ) 佐助劑）免疫。負面對照組係用年齡相當之導入外來基因的2 4隻鼴鼠組接受用相同佐助劑乳化之P B S在相同時刻免疫。在第二次投服後開始於每次免疫後之3 - 7天內從動物抽血。利用E L I S A測定抗體對A N 1 7 9 2的反應。用AN 1 7 9 2免疫之動物在第二，三次及最後一次（第六次）投服後之几何平均滴度度分別爲1 9 0 0， 7 6 0 0及4 5 0 0 0。在第六次投服後之對照組動物中並未測得任何A /3 —專一性抗體。約半數之動物再予以治療3個月-一一在約第2 0， 2 4及2 7週時接受免疫治療。每一劑量均於P B S中投藥而不用弗瑞得佐助劑。在此期間內平均抗體滴定度均保持不變。事實上，抗體滴定度在第5 - 9次注射第4 一 8 次抽血時均保持穩定不變。爲了決定A0 —專一性抗體（其由AN1 79 2 —治療之鼴鼠血淸中偵測之免疫誘出）是否亦伴生腦部致澱粉樣沉積，令一小部分之AN 1 7 9 2 -及P B S —治療之鼴鼠與對鼴鼠I g G專一性之抗體反應。與P B S組相反地，在AN1792 —治療_之腦內A /3斑包覆內源的 I g G。此二組間之差異見於1 5 -及1 8 —個月大組。特別是縱使嚴重之致澱粉樣負荷存在於這些鼴鼠中，但在 P B S組中缺乏條紋標記。這些結果証明用合成Α Θ蛋白質免疫產生辨識及體內結合至致澱粉樣斑中之A /3上的抗體0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 60 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（58 ) 7 ·細胞媒介之免疫反應在第9次免疫後第7天，從9隻AN 1 7 9 2 -免疫及1 2隻PBS —免疫之1 8個月大PDAPP鼴鼠中移除脾臟。分離脾細胞並在A0 4O，A/342或A，40 一 1 (逆順序蛋白質）存在下培養7 2小時。有絲分裂原 C〇nA充作正對照組。最適當反應係用>1·7蛋白質獲致。來自所有9隻AN1 79 2 -治療動物之細胞在 A冷一 40或Αθ 1 — 42蛋白質均增殖---以同量倂入二蛋白質內（附圖1 0，上組）。A/340 — 1逆蛋白質則無反應。對照組動物之細胞對任何A Θ蛋白質均無反應（附圖1 0，下組） C ·結論本硏究之結果顯示出已有致澱粉樣沉積之P D A P P 鼴鼠用A N 1 7 9 2免疫可減緩及避免進行性致澱粉樣沉積並阻止老年P D A P P鼴鼠腦內之隨後神經病理變化。用A N 1 7 9 2免疫基本上阻止致澱粉樣在通常易罹患致澱粉樣變性病之構造中的發，展。因此，投服A々肽可治療阿茲海默氏疾病。 I V · A /3片段之篩選 100隻9—11個月大之PDAPP鼴鼠用APP 與A 0之9個不同區段免疫以決定那一個抗原決定基傳達反應。9個不同免疫原及1個對照組如上所述地由腹膜內本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -61 · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1239847 A7 B7 五、發明説明（59 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 注射。免疫原包括4個人類A石肽共軛體1 一 12，13 一 28 ’ 32 — 42，1 一 5 (均經由胱胺酸連接而偶合至羊之抗一鼴鼠12〇);1個八？？多肽33 592— 695,凝集之人類A0 1 — 40及凝集之人類A沒25 一 3 5及凝集之齧齒動物A3。使用凝集A0及PBS作爲對照組。每一治療組使用1 〇隻鼴鼠。如上監視滴定度並令鼴鼠在注射之4個月後安逸死。死後檢驗組織化學， A /3値及毒性。 A ·材料與方法 1 ·免疫原之製備偶合A/3肽之製備：四個人類A/3肽共軛體（胺基酸殘基 1 — 5，1 — 12，13 — 28 及 33 — 42，其各共軛至羊之抗-鼴鼠I g G )係藉由使用交聯劑磺基-EMCS，經由人造半胱胺酸偶合加至ΑΘ上而製得。 A卢肽衍生物係用下列最後胺基酸序列合成。在每一情況下，插入半胱胺酸殘基之位置由底線ί旨出。Αθ 1 3 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2 8肽衍生物亦具有在所示_羧基終端半胱胺酸前加入之2 個甘胺酸殘基。

AyS 1-12 肽 NH2-DAEFRHDSGYEVC COOH A/3 1-5 肽 NH2-DAEFRC COOH

A/S 33-42肽 NH9-C-胺基-庚酸-GLMVGGVVIA COOH AyS 13-28 肽 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 62 - 1239847 A7 A7 B7 五、發明説明（60 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 ·爲了準備偶合反應，1 〇mg羊之抗一鼴鼠 I g G (Jackson ImmunoResearch Laboratories)對 1 0 Mm硼酸鈉緩衝液（Ph8 · 5)滲析過夜。滲析過之抗體再使用Amicon濃縮管濃縮至體積爲2M1。10mg磺基一 EMC S〔 N ( f -馬來醯亞胺基己醯氧基）琥珀醯亞胺〕（分子科學公司）溶入1M1去離子水中。在攪拌同時將4 0倍莫耳濃度過量之磺基- EMC S逐滴加至羊之抗一鼴鼠I g G中，再攪拌溶液1 〇分鐘。經活化羊之抗一鼴鼠I gG利用通過1 〇mL凝膠過濾管柱（Pierce Presto Column，得自Pierce Chemicals)純化及緩衝交換，用 0 . 1 M NaP〇4，5 Mm EDTA，PH 6.5 平衡。包含在2 8 0 n m吸收之部份的抗體經混合及稀釋至濃度爲約lmg/Ml (使用1 · 4mg/〇D作爲消光係數）。將40倍莫耳濃度過量A0肽溶入20mL之 10 m Μ N a Ρ 0 4 (PH 8·0)中，但A 冷 33 — 42例外，其係先將l〇mg溶入0.5M1 DMS0中，再用10mM NaP〇4緩衝液稀釋至20mL。將肽溶液分別加至1 0 Μ 1經活，化羊之抗—鼴鼠I gG中並於室溫下搖動4小時。所得共轭體再使用Amicon Centriprer 管濃縮至最後體積小於1 〇 Μ 1後，再對P B S滲析以緩衝交換緩衝液並移除解離肽。令共軛體通過〇 · 22 -孔徑過濾器以行消毒後，分成1 m g小部份並冷凍貯於-20 ° C下。共軛體之濃度使用BCA蛋白質分析（Pierce Chemicals )，以馬之I g G作爲標準曲線而測得。共軛作本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公羡） •63- 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（61 ) 用係由共軛肽之分子量大於經活化羊之抗-鼴鼠IgG分子量而獲諸証明。A石1 - 5羊之抗一鼴鼠共軛體係爲二共軛作用之混合，其餘則來自單一製備。 2 ·凝集Α Θ肽之製備人類 1 一 40 (AN1528 ; California Peptides Inc.，LotME〇541)，人類25 - 35及齧齒動物 1 — 42 ( California Peptides Inc., Lot Μ E 〇 2 1 8 ) 肽剛從乾燥貯於- 2 0 ° C下之低壓凍乾粉末溶解以供製備每一組注射劑。爲了此一目的，將2 m g肽加至0 · 9 m 1去離子水中並翻轉混合物以產生相當均勻之溶液或懸浮液。在四者當中，AN 1 5 2 8係爲此一步驟唯一溶解之肽。10 0//1 之 10X P B S (IX PBS: 0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉，ρΗ7·5) 再於A Ν 1 5 2 8開始沉澱時加入。再度翻轉懸浮液並於 3 7 ° C下孵養過夜以供次日使用。 pBx6蛋白質之製備：編碼pBx6之表現質體’ 包含1 0 0個胺基酸噬菌體，MS — 2聚合酶N -終端引導序列，隨後接首APP之胺基酸592-695 ( /3 A P P )之融合蛋白質如Oltersdorf et aU J· Bio1· Chem· 265，4492 - 4497 (1990)所述構築。將此質體轉染至大腸桿菌（E. co li)而蛋白質在促進子誘導後表現。細菌在8M尿素中溶解而PBx6 利用製備級S D S P A G E部份純化。含p B X 6之部份 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -64- 1239847 Α7 Β7 五、發明説明（62 ) 利用西方吸漬法，使用兔子之抗- p B X 6多株抗體辨識 ’混合，用Amicon Centriprep管濃縮並對P B S滲析。製劑之純度（利用 Coomassie Blue stained SDS PAGE預估）爲約5 — 1 〇 %。 B ·結果及討論 1 ·硏究設計經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 0 0隻9 — 11個月大之導入外來基因的雜種 P D A P P雌性及雄性鼴鼠係得自查理士河實驗及科技實驗室。將鼴鼠分成十組而用綜合弗瑞得佐助劑之A沒或 A P P不同區段免疫。分配動物以使同組中動物之性別，年齡，血統及來源儘可能相近。免疫原包括四個源自人類序列（1 — 5，1 — 12，13 -28 及 33 — 42，其均共軛至羊之抗一鼴鼠IgG上）之Af肽；四個凝集之 A/3 肽，人類 1 — 40(AN1528)，人類 1 — 42 (AN1792)，人類25 - 35及齧齒動物1一 42 ;以及融合多肽（命名爲pBx6，包含APP胺基酸殘基592 — 695)。第1.0組用綜合佐助劑之PBS免疫以充作對照組。每次免疫中，在200/zl PBS中之100"g ΑΘ肽或在相同體積PBS中之200/zg APP衍生物 pBx6或僅PBS用完全弗瑞得佐助劑（CFA)以1 ·· 1 (體積··體積）乳化而得最後體積爲4 0 0 V 1以供首度免疫之用，隨後追加相同數量在不完全弗瑞得佐助齊！· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1239847 A7 B7_ 五、發明説明（63 ) (I FA)中之免疫原於其後四次投服中而最後一次投服 P B S。在前三次投服係每二週由腹膜內注射一次，其後則每個月投服一次。在第二次投服後開始，在每次免疫後 4 - 7天對動物抽血以供測定抗體滴定度。動物在最後投服後約1週安逸死。 2 ·腦內之A石及A P P値在用不同A/9肽或AP P衍生物免疫約4個月後，從灌注食鹽水之動物移除腦部。製得一半球以供免疫組織分析而另一半球則用以定量A点及A P P之値。爲了測定不同形態/3致澱粉樣肽及致澱粉樣先驅蛋白質之濃度，切除半球並於5 Μ胍中製備海馬，皮質及小腦部份之勻漿。這些經稀釋並藉由與EL I SA程式中之Α0肽或ΑΡΡ- 系列已知標準濃度相比較而定出致澱粉樣或A Ρ Ρ之數量〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用Ρ B S免疫之對照組的全部A /5在海馬區內之中間濃度値係5 . 8倍高於皮質中（海馬g織之中間値爲 2 4 3 1 8 ng/g而皮f中之中間値爲4221 n g / g )。對照組之小腦內中間値（2 3 · 4 n g / g組織 )約1 0 0 0倍低於海馬區內之値。這些數値類似於先前述及之同齡導入外來基因的雜種P DA Ρ P鼴鼠之値（ Johnson-Woods et al·，1 9 9 7，同上）。對皮質而言，一部分治療組之全部Α Θ及A 0 1 -4 2中間値顥顯著與對照組不同（P，0 · 0 5 )，該等本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 66 _ 1239847 A7 B7 五、發明説明（64 ) 動物係接受AN1792，齧齒動物A/3或A0 1 — 5肽共軛體（如附圖1 1中所示）。與對照組比較之下，這些治療組之全部A /3中間値分別減低7 5 %，7 9 %及6 1 % °對任何組而言，腦皮質區內之A石-專一性抗體滴定度及A /3値之間並無任何可識別的關聯性存在。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在海馬區內，全部Α Θ之中間値減低伴隨著 AN1792 治療（46%，P = 0 · 0543)並未如皮質內見及之値一般大（75%，Ρ = 0· 0021)。然而，海馬區內之減低程度遠大於皮質區內，海馬區內減低淨値爲1 1 1 8 6 n g / g組織而皮質區內爲3 1 7 1 n g/g組織。接受齧齒動物1 一 4 2或A/3 1 — 5 之動物組的全部A /5中間値分別減低3 6 %及2 6 %。但是，在二組之間給予不同動物較小尺寸及高度變化致澱粉樣肽値時，這些減低並不明顯。當在海馬區內三測定 A /3 1 - 4 2値時，治療誘起之減低均極微小可予忽略。因此，由於皮質內之A /3負荷較小，所以，在此區內之變化是治療作用之較敏感指示器。由E L I S A測得之皮質內A 0値變化類似，但不同，於免疫組織化學分析結果。全部A /3亦在小腦（在阿茲海默氏疾病理學中通常不受影響之區域）內測定。用不同A /3肽或A P P衍生物免疫之任何組的A /5濃度中間値在此一腦部區域內均與對照組相同。此一結果喻示A /3之非-病理値並不受治療影響〇治療及對照組鼴鼠之皮質及小腦內的A P P濃度亦利本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -67 - 1239847 A7 B7 五、發明説明（65 ) 用EL I SA測定。使用二種不同的APP分析。第一種分析（命名爲APP — α/FL)辨識ΑΡΡ — α (α，已在A /5序列內裂解之分泌形態A Ρ Ρ )及全長形態（ FL)之APP，而第二種分析則僅辨識APP - α。與一部份治療組中之Α Θ的治療伴生減低相反地’在所有治療組動物中之A P P値均與對照組相同。這些結果顯示用 APP肽免疫並未用盡APP;而是治療作用對ΑΘ具專一性。總而言之，在使用AN1792，齧齒動物A/31 -42或A/3 1 — 5共軛體治療之皮質中的全部A/3及 A冷1 — 4 2値顯著降低。在海馬區中，全部A /3値僅因利用A N 1 7 9 2治療而降低。在海馬區，皮質區或小腦區中之A /3或A P P値並無任何治療伴生之變化是顯著的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2 ·組織化學分析製備6組鼴鼠之腦以供免疫組織化學分析，其中3組用 A/3 肽共軛體 A/3 1 — 5，，A/31 — 1 2 及 A 冷 1 3 — 28免疫；二組用全長A/3凝集物AN1792及 AN 1 5 2 8免疫以及PB S -治療之對照組。來自這些組之腦部份中的致澱粉樣負荷之影像分析結果示於附圖 1 2中。三治療組之皮質區內的致澱粉樣負荷降低顯著大於對照組。致澱粉樣負荷之最大降低見於接受 AN1 79 2之組（其平均値降低97%，P = 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _肪. 1239847 A7 B7 五、發明説明（66 ) 〇 · 001)。顯著降低亦見於用AN1528 (95%

’ P = 0 · 005)及 A/31-5 肽共軛體（67%，P = 0.02)治療之動物。全部AyS或A々l — 42利用EL I SA定量結果及利用影像分析之致澱粉樣負荷有某種程度的差異。用 A N 1 5 2 8治療對利用定量影像分析測得之皮質致澱粉樣負荷値有顯著衝擊，但對利用E L I S A測得之相同區域內的全部Α Θ濃度則否。這二種結果間之差異可能係出於分析之特性。影像分析僅測定凝集於斑內之不可溶A /3 。相反地，E L I S A則測定所有形態之A /3 (可溶與不可溶，單體及凝集的）。因爲疾病病因据認爲是AΘ之不可溶斑-伴生形態，所以，影像分析技術可能對顯示治療效果較爲敏感。但是，因爲EL I SA是較迅速及容易的分析，所以對篩選極其有用。而且，它可能顯示A Θ之治療-伴生降低在斑-伴生情況下大於全部A /3。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了測定治療動物中，由免疫誘出之A /3 —專一性抗體是否與沉積之腦部致澱粉樣反應，令來自治療動物及對照鼴鼠之切片與鼴鼠I g G，專一性之抗體反應。與P B S 組相反地，用肽共軛體A/31 — 5 ’A/31 — 12及 A/313 — 28;及全長A/3凝集物AN1792及 AN 1 5 2 8之動物中，含A/5之斑包覆著內源性I gG 。用其他A0肽或A P P肽p B X 6免疫之動物腦部並未利用此一分析法分析。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 69 - 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（67 ) 抗體滴定度之測定在第二次免疫後開始在每次免疫後之第4 - 7天對動物抽血，共計抽血五次。抗體係使用三明治EL I SA ( 使用塗佈A0 1 — 4 2之多分格塑膠培養皿）如同A石1 一 4 2 —結合抗體般測試。如附圖1 3中所示地，尖峰抗體滴定度係在第四次投服誘起AN 1 7 9 2 -專一性抗體最高滴定度的四種疫苗後出現：AN1792 (尖峰 GMT: 9 4 6 4 7 ) ，AN1528 (尖峰 GMT: 88231) ，A冷1 — 12共軛體（尖峰GMT: 47216)及齧齒動物A々1 — 42 (尖峰GMT: 10766)。這些組之滴定度在第五及六次投服後少許降低。其餘五種免疫原之尖峰滴定度則在第五或六次投服後達到且且値遠低於最高滴定度之四組：Α θ 1 — 5共軛體（尖峰滴定度：2356) ，pBx6(尖峰滴定度： 1 9 8 6 ) ，A/313-28共軛體（尖峰滴定度： 118 3) ，A/333 — 42共軛體（尖峰滴定度： 6 5 8 ) ，A/325 — 35 (尖峰滴考度：125)。同系肽之抗體滴定度亦使用相，同E l/l S A三明治程式對免疫原副組（用 A/31 — 5 ，AyS13-28 ，A/325-35，A/333 — 42或齧齒動物A々1 一 42免疫之組 )測定。這些滴定度大約與針對Α θ 1 - 4 2所測得之値相同，但齧齒動物A /3 1 - 4 2免疫原例外（在此情況下，對同系免疫原之抗體滴定度約爲二倍高）°各動物之 AN 1 7 9 2 —專一性抗體滴定度或治療組之平均値與皮 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 70 - 1239847 A7 B7 五、發明説明（68 ) 質內之A /3誘起效率並無關聯。 3 .淋巴增殖反應 A yS -依賴性淋巴增殖作用係使用第六次最後免疫後約一週收集之逆脾細胞測定。剛收集細胞（1 0 0 0 0 0 /分格）在AyS 1 - 40存在下，在5//M濃度培養5天以行刺激。來自1 0組中之7組的細胞亦在逆肽（經濟部中央標準局員工消費合作社印装 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A石4 0 - 1 )存在下培養。至於陽性對照組，細胞係用 T 一細胞促細胞分裂劑，Ρ Η A，培養，至於陰性對照組，細胞在未加入肽之下培養。大多數動物之淋巴細胞在 Ρ Η A促進下增殖。對A 4 〇 - 1逆肽則無顯著回應。用較大凝集ΑΘ肽，AN1792，齧齒動物ΑΘ1 — 42及AN1 5 2 8免疫之動物的細胞在A0 1 — 42刺激下健全的增殖，在AN 1 了 9 2接受體中獲致最高 c pm。用A/3 1 — 1 2共軛體，A沒1 3 — 28共軛體及A/3 2 5 — 3 5免疫之每一組動物中之1隻動物在 A冷1 一 40刺激下增殖。其餘接受A6 1 — 5共軛體， A冷3 3 — 4 2共軛體ρ B.x6或PB S之各組對A/3刺激無回應。這些結果總列於以下表5中。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -71 - 1239847 A7 B7 五、發明説明（69 ) 表5 免疫原共軛體 A /3胺基酸反應個數ί A/3 1-5 是 5-單體 0/7 丨 1-12 是 12-單體 1/8 Αβ 13-28 是 16-單體 1/9 ! Α β 25-35 11·單體 1/9 A β 33-42 是 10-單體 0/10 A/5 1-40 40-單體 5/8 A/S 1-42 42-單體 9/9 r A β 1-42 42-單體 8/8 pBx6 0/8 I i i i ! PBS \ 0-單體 0/8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製由這些結果証明A N 1 7 9 2及AN 1 5 2 8刺激強烈T 一細胞反應，最類似C D 4 +表現型。用A沒1 一 5 免疫之動物中無A Θ -專一性T細胞反應並不必感到驚訝，因爲C D 4 + T細胞辨識之肽抗原決定基通常約爲1 5 個胺基酸長度，雖然有時較短之肽可能作用效率較小。因此，四種肽共軛體之大多數協助子T -細胞抗原決定基可能存在於I g G共軛體配對中而不在A/3區域內。此一假說係以這些治療組中之動物很少出現增殖性反應而支持。因爲A /3 1 - 5共軛體顯著減低腦內之A 0値，所以在表面缺乏A/3 —專一性T -細胞中，由此肽之免疫誘起之主 1紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） J2 - " 1239847 A7 B7 五、發明説明（70 ) 要有效免疫反應似乎是抗體。缺少T 一細胞以及來自融合肽p B X 6 (包括所有 A冷殘基之APP胺基酸5 9 2 — 6 9 5 )之低抗體反應可能是由於此一特定製劑之不良免疫原性。A Θ 2 5 -3 5凝集物之不良免疫原性可能是因爲肽太小而不可能包含一优良之T -細胞抗原決定基以協助誘起抗體反應。若此肽共軛至載體蛋白質上則其可能免疫原性較大。 V .製備被動保護之多株抗體 2 0隻未導入外來基因的鼴鼠用Α Θ或其他免疫原（任意的加上佐助劑）免疫且於4 一 5個月安逸死。由經免疫之鼴鼠收集血液。任意的，從其他血液成分分離出 I g G。封免疫原具專一性之抗體可利用親和力層析法部份純化。每隻鼴鼠製得平均約1 0 · 5 - 1 m g免疫原一專一性抗體，共計得到5 - 1 0 m g。 VI ·使用A S抗體的被動免疫經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7 — 9個月大P D A P，P鼴鼠組各注射以〇 · 5 m g 在P B S中之如下所示多株A 0 —抗體或專一性單株a /3 -抗體。純化所有抗體製劑以具有低內毒性。單株抗體可藉由注射Α Θ之片段或較長形態至鼴鼠體內，製備雜種瘤且篩選專一性結合至A /3所要片段而不結合至a f之其他非重疊片段之抗體的雜種瘤而製成。 •73- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 A7 B7 五、發明説明（71 ) 表6 抗體抗原決定基 2H3 Αβ 1-12 10D5 Αβ 1-12 ! 266 Αβ 13-28 21F12 Α β 33-42 鼴鼠多株人類AyS抗體抗-凝集A冷 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製鼴鼠在4個月期間內視需要由腹膜內注射以維持對 A石4 2或其他免疫原之循環抗體濃度（利用E L I SA 測定）大於1/1000 (由ELISA定義）。如上監視滴定度且讓鼴鼠在注射之4個月後安逸死。組織化學，死後進行A /3値及毒性檢驗。 VII.不同佐肋劑之比較此一實例比較C F A，明礬，油在水中型乳液及 Μ P L刺激免疫反應的能力。 A .材料及方法 1 ·硏究設計 1 0 0隻得自Elm Hill之6週大Hartley屬天竺鼠分成 1 0組且用綜合不同佐助劑之A N 1 7 9 2或其棕櫚醯化衍生物免疫。7組接受綜合a ) P B S，b )弗瑞得佐助本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-74 - 1239847 A7 B7 五、發明説明（72 ) 劑’ c ) μ P L，d )角鯊烯，e ) Μ P L /角鯊烯，f )低劑量明礬，或g )高劑量明礬（3 〇〇 # g AN1792)之 AN1792 (33eg，除非另外指明）注射。二組接受綜合a ) P B S或b )角鯊烯之 A N 1 7 9 2 ( 3 3 // g )棕櫚醯化衍生物注射。最後第十組接受不含抗原或其他佐助劑之單獨P B S。接受弗瑞得佐助劑之組的第一次劑量用C F A乳化而其餘四次劑量用I F A乳化。所有組之抗原投服劑量均爲3 3 μ g (但高劑量明礬組除外，其接受300/zg AN1792)。 C F A / I F A係由腹膜內注射而所有其他各組肌內注射於後肢四頭肌內（左側及右側交替注射）。前三次劑量係每二週投服一次而隨後二劑量每個月投服一次。 2 ·製備免疫原經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將 2mgA/342 ( California PEPTIDE, Lot ME0339)加至0 · 9ml去離子水中並翻轉混合物以產生相當均勻之懸浮液。加入1 0 0 // 1之1 0 X P B S (IX PBS，0.15MNaCl，0.01 Μ磷酸鈉，p Η 7 · 5 )。再度翻轉懸浮液並於3 7。C 下孵養過夜以供次日使用。未使用之Α θ 1 - 4 2以低壓凍乾粉末形態用乾燥劑貯於—2 0。C下。A N 1 7 9 2 之棕櫚醯化衍生物係利用偶合棕櫚酸酐（溶於二甲基甲醯胺中）至A N 1 7 9 2之胺基終端，再用氫氟酸處理以從樹脂移除初生肽而製得。本紙張尺度適用中國國家標準（cnsIa4規格（2iox297公釐） -75- 1239847 A7 B7 五、發明説明（73 ) 爲了製備含完全弗瑞得佐助劑（CFA)(第2組）之疫苗藥劑，在200// 1 PBS中之33"g AN1792用CFA乳化（1 : 1，體積比）至最後體積爲4 0 0 // 1以供初次免疫之用。爲供其後之免疫使用，抗原係類似地用不完全弗瑞得佐助劑（I F A )乳化。爲了製備第5及6組使用之含MP L的疫苗藥劑，將低壓凍乾粉末（Ribi ImmunoChem Research, Inc.，Hamilton ，MT )加至〇 · 2 %三乙胺水溶液中至最後濃度爲1 m g /m 1且加以翻轉。加熱混合物至6 5 — 7 0。C經3 0 秒鐘以產生微胞之輕微不透明懸浮液。每次注射前才配製溶液。在第5組之每次注射中，在16 .5//1 PBS中之 33//gAN1792，50//g Μ P L ( 5 0 Μ 1 ) 及16 2^1 PBS在使用前才混合於硼基矽酸鹽試管中〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了製備含低油在水中型乳液之疫苗藥劑，將P B S 中之AN1792加至5%角鯊烯，0 · 5% Tween 80， 0.5% PBS 中之 Span 85直到獲致 3 3 // g / 2 5 0 β 1 A Ν 1 7 9 2之最後早一劑量濃度（第6組）。令混合物通過二小室手固定裝置1 5 - 2 0次直到乳化顆粒直徑似乎等於1 . 0 // m (在顯微鏡下觀察）爲止。所得懸浮液是爲發出蛋白光的乳白色。乳液係在每一系列注射前才配製。對第8組而言，在〇·2%三乙胺中之MPL以 5 0 // g /劑之濃度加至角鯊烯中且如上所示地乳化潔淨的混合物。對棕櫚醯衍生物（第7組）而言，3 3 // g / 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 76 - 1239847 A7 B7 五、發明説明（74 ) 劑之棕櫚醯基一 NH — A/3 1 — 4 2加至角鯊烯中並加以翻轉。再於翻轉同時加入Tween 80及Span 85。將此一混合物加至PBS中而達5%角鯊烯，0 · 5% Tween 80， 0 · 5% Span 85之最後濃度並如上所示地乳化該混合物〇爲了製備含明礬之疫苗藥劑（第9及10組），將 PBS中之AN1792加至Alhydrogel (氫氧化鋁凝膠， Accurate，Westbury< NY )而達到最後2 5 0 β 1劑量體積中3 3#g/5mg明礬（低劑量，第9組）或3 00 #g/5mg明礬（高劑量，第1 〇組）之AN1 79 2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 3 ·測定抗體滴定度天竺鼠在第二次免疫開始後之第6 - 7天抽血共四次。對A 0 4 2之抗體滴定度利用如一般材料及方法中所述之E L I S A測定。 4 ·組織製備，約1 4週後，所有天竺鼠投服C 0 2。收集腦脊髓液並移除腦子且切除三個腦區（海馬，皮質及小腦）而利用 E L I S A測定全部A 0蛋白質濃度。 B ·結果 1 .抗體反應本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -77- 1239847 Α7 Β7 五、發明説明（75 ) 在測定爲免疫後對A N 1 7 9 2之抗體反應時，不同佐助劑之潛效範圍廣泛。如附圖1 4中所示地，當 AN 1 7 9 2在P B S中投服時，在二或三次免疫後未偵得任何抗體且在第四及五次投藥後偵得幾何平均滴定度（ G Μ T s )僅約4 5之可忽略反應。〇 /w乳液在第三次投藥（GMT 255)後誘起適度滴定度，其維持至第四次投藥（G Μ Τ 3 0 1 )後而在最後投藥（G Μ Τ 5 4 )後降低。結合至明礬之AN 1 7 9 2有明顯的抗原劑量反應，因爲3 0 0 // g在所有時間點之免疫活性均大於 3 3 // g。在尖峰抗體反應下，第四次免.疫後，二劑量間之差異爲43%(33//g及300//g之GMTs分別爲 1940 及 3400)。對 33//g AN1792 及經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Μ P L之抗體反應極類似於幾乎高十倍以上劑量之結合至明礬的抗原（300#g)所產生之抗體反應。將MPL 加至〇 /w乳液中會使疫苗效力提高至高達僅用Μ P L作爲單獨佐助劑時之7 5 %。A Ν 1 7 9 2之棕櫚醯化衍生物在P B S中投服時是完全無抗原活性的而當在〇 /w乳液中投服時則產生適度滴定度（第三及四次抽血云 GMTs分別爲340及105)。最高抗體滴定度係用弗瑞得佐助劑時產生（G Μ T爲約8 7 0 0 0 )，該 GMT値幾乎3 0倍大於次二最高潛效疫苗（MP L及高劑量ΑΝ1 7 9 2/明礬）之GMT。在此一硏究中辨識出之最有希望佐助劑是Μ P L及明礬。此二者當中，MP L因爲需要1 〇倍高之抗原劑量以 -78- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 Χ297公釐） 1239847 A7 B7 五、發明説明（76 ) 產生與明礬所獲致之相同抗體反應，所以較爲理想。反應可藉由提高抗原和/或佐助劑劑量及令免疫療程最適宜而得提高。o/w乳液是AN 1 7 9 2之極弱佐助劑且將 o/w乳液加至MP L佐助劑中降低單獨MP L之固有佐助劑活性。 2 ·脳內之A汐經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 約1 4週大之天竺鼠深度麻醉，抽出腦脊髓液（ CSF)並將用弗瑞得佐助劑（第2組）1MPL (第5 組），含高劑量（3 0 0 // g A N 1 7 9 2 )之明礬（第 1 0組）免疫之各組以及P B S免疫對照組動物之腦部切除。爲了測定A Θ肽之値，切除腦半球且於5 Μ胍中製備海馬，皮質與小腦區之均化物。將其稀釋並藉由與 EL I SA程式中之一系列已知濃度ΑΘ標準蛋白質稀釋液比較以定量之。在海馬，皮質及小腦內之A 0蛋白質値在所有四組中均極類似，縱使由這些疫苗誘起之對A /5的抗體反應範圍廣泛。在海馬內測得平均A /3値爲約2 5 n g / g，皮質內之値爲2.1 n g / g，而小腦內之値爲 1 2 n g/g 。因此，在某些動物中幾乎3個月內存在之對Α Θ之高循環抗體滴定度並不改變其腦內之全部A点値。在C S F中之A値在各組之間亦極類似。A N 1 7 9 2 免疫對內源性A缺乏大作用顯示免疫反應著眼於A之致病原形成。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -79 - 1239847 A7 B7 五、發明説明（77 ) ' V 1 I I ·鼴鼠中對不同佐助劑之免疫反應此一硏究中使用6週大Swiss Webster雌性鼴鼠，每組 10 — 13隻鼴鼠。免疫係在第0，14，28，60， 9 0及2 0天進行皮下注射2 0 0 μ 1劑量。在所有調劑中使用P B S作爲緩衝液。在第二次投藥後開始，在每次免疫後第7天對動物抽血以供利用E L I S A分析抗體滴定度。每一組之治療過程總列於表7中。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8〇 - 1239847

7 B 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（78 ) 表7

Betabloc硏究010之實驗設計組 Na 佐助劑b 劑量抗原劑量1 1 ( β g) \ 1 10 MPL 12.5// g AN1792 33 2 10 MPL 25 β g AN1792 33 ! 3 10 MPL 50 β g AN1792 33 4 13 MPL 125 β g AN1792 33 5 13 MPL 50 β g AN1792 150 6 13 MPL 50 β g AN1792 33 7 10 PBS AN1792 33 8 10 PBS M 9 10 乳化角鯊烯 5% AN1792 33 10 10 混合角鯊烯 5% AN1792 33 11 10 明礬 2mg AN1792 33 12 13 i MPL +明礬 50 // g/2 // g AN1792 33 13 10 QS21 5 β g AN1792 33 14 10 QS21 . / -10 V，g AN1792 33 15 10 QS21 25 β g AN1792 33 16 13 QS21 25 β g AN1792 150 17 13 QS21 25 β g AN1792 33 18 13 QS21+MPL 25 β g /50 β g AN1792 33 19 13 QS21 +明礬 25 // g/2mg AN1792 33 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1239847五、發明説明（79 ) 附註： A7 B7 之有。 Θ 組所原 A 每。抗對時劑與體始助劑抗開佐助中驗明佐組實指無一 a b 組每。 8 中第 8 。表 S 下 B 以 P 於是示液度衝定緩滴之 A 物 S 目合 I 數調 L 鼠些 E 鼴這之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -82- 1239847 A7 B7 五、發明説明（80 ) _表8_ 幾何平均抗體滴定度經濟部中央標準局員工消費合作社印製抽血週數 ' 治療組 2.9 5.0 8.7 12.9 16.7 ' i !' 1. !248 1797 2577 6180 4177 2. 598 3114 丨3984 5 287 6878 ! 3. 1372 5000 7159 1 2333 1 278 1 4. 1278 2079 1 14368 20097 2563 1 5. 3288 26242 1 3229 9315 23742 6. 61 2536 2301 1442 4504 7. 37 395 484 972 2149 8. 25 25 25 25 25 丨9· 丨2 5 183 744 952 1823 | 1 110. 125 89 311 513 817 11. 29 708 2618 2165 3666 12. 198 1458 1079 612 797 I 13. 38 433 ί 566 1080 626 14. 104 541 . 3247 1609 838 15. 212 2630 2472 1224 1496 16. Il83 2616 6680 2085 1631 17. 28 201 375 222 1540 18. bl699 1 5544 23095 6412 9059 ! i |19. 163 243 554 299 441 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 33 _ 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（81 )

此表顯示出最高滴定度係在第4，5及1 8組獲致，其中，佐助劑係爲125//g MPL，50//g MPL 及 QS21+MPL。 I X ·不同佐助劑之治療效力治療效力硏究係於導入外來基因之P DA P P鼴鼠中，用適供人類使用之佐助劑進行以決定它們對A /3之潛在免疫反應以及誘起腦內致澱粉樣沉積之免疫媒介淸除的能力大小。180隻7 · 2 — 8 · 5月大之導入外來基因的雜種P D A P P雄性及雌性鼴鼠係得自查理士河實驗室。將其分成9組，每組1 5 - 2 3隻動物以使用綜合不同佐助劑之AN1 79 2或AN1 528免疫。動物依性別，年齡及血統分組而使各組儘可能相近。佐助劑包括明礬， Μ P L及Q S 2 1，共各綜合二種抗原，而弗瑞得佐助劑 (FA)僅綜合ΑΝ1 7 9 2。另一組係用調製於PBS 緩衝液及防腐性局部抗菌劑（thimerosal)中且不含佐助劑之AN1 79 2免疫。第9組僅用PBS免疫而充作負面對照組。 . 製備凝集之AyS肽：人類A/5 1 — 4 0 (AN 1528; California Peptides Inc.，Lot Μ E 〇 5 4 1 )及人類 Α 冷 1 — 42 (ΑΝ1792 ; California Peptides Inc.， Lot Μ E 0 4 3 9 )從乾燥貯於—2 0。C下之低壓凍乾粉末當即溶解以供製備每一組注射液。爲了此一目的，將 2mg肽加至〇 · 9m 1去離子水中並翻轉混合物而產生本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） -84 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

1239847 A7 B7 五、發明説明（82 ) 相當均勻之溶液或懸浮液。A N 1 5 2 8在此一步驟是可溶的而AN 1 7 9 2則否。在AN 1 5 2 8開始沉澱時再加入 100//1 之 10X P B S (IX PBS: 0.15MNaCl，0.01M磷酸鈉，Ph 7.5 )。再度翻轉懸浮液並於3 7。C下孵養過夜以供次曰使用。爲了製備含明礬之疫苗藥劑（第1及5組），將 PBS中之A/3肽加至Alhydrogel ( 2 %氫氧化鋁凝膠水溶液，Sargeant，Inc.，Clifton，NJ)中使達到 1 〇〇 // g A /3 肽 / 1 m g明礬之最後濃度。懸浮液再於注射前，在室溫下溫和地混合約4小時。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了製備含MPL之疫苗藥劑（第2及6組），將低壓凍乾粉末（Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton， MT;Lot 67039 — E0896B)加至 0 · 2% 三乙胺水溶液中使達到1 m g /m 1之最後濃度並予以翻轉。加熱混合物至6 5 - 7 0。C經3 0秒以產生微團之輕微不透明均勻懸浮液。溶液貯於4。C γ。對每一組注射液而言，在50// 1 PBS中之100//g肽/劑量，50 β g MPL/50//1/劑量及 100#1 PBS /劑量在使用前當即混合於硼矽酸鹽試管內。爲了製備含QS 2 1之疫苗藥劑（第3及7組），將低壓凍乾粉末（Aquila，Framingham，MA; Lot A 7 0 1 8 R )加至 PBS (pH6 · 6 — 6 · 7)中使達到 lmg/ m 1之最後濃度並予以翻轉。溶液貯於一 2 0。C下。對本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -85 - 1239847 A7 B7 五、發明説明（83 ) 每一組注射液而言，在50wl PBS中之lOOeg肽 / 劑量，25#g Q S 2 1 / 2 5 ^ 1 PBS /劑量及 125// 1 PBS /劑量在使用前當即混合於硼矽酸鹽試管內。爲了製備含弗瑞得佐助劑之疫苗藥劑（第4組）’在 2 0 0 // 1 PBS 中之 l〇〇/zg AN1792 用完全弗瑞得佐助劑（C F A )以1 : 1 (體積/體積）乳化而得最後體積爲4 0 0 // 1以供初次免疫之用。其後之免疫中，抗原用不完全弗瑞得佐助劑（I FA)以類似方式乳化。爲了含佐助劑（明礬，MPL或QS2 1 )之疫苗，每劑量100//gAN1792或AN1528綜合明礬 (Img /劑量）或MPL (50//g/劑量）或 QS21 (25//g /劑量）至最後體積爲200//1 P B S並由皮下接種於兩肩胛之間的背部。爲了接受F A 之組，100//g AN1792用完全弗瑞得佐助劑（ C F A )以1 : 1 (體積/體積）乳化而得最後體積爲經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 0 0 // 1並由腹膜內注射以行首次g疫，隨後追加相同數量之不完全弗瑞得佐助劑，中的免疫原於其餘五次免疫。爲了接受不含佐助劑之AN1792組，l〇//g AN1792 綜合 5//g thimerosal 至 50//1 PBS 最後體積並由皮下注射。第9組（對照組）僅由皮下注射以200// 1 PBS。免疫療程係爲前三次投服均每二週進行一次，其後每月進行一次而在第〇，16，28， 5 6，8 5及1 1 2天投服。在第二次投藥後開始，於每本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 86 1239847 A7 ______B7 五、發明説明（84 ) 次免疫後6 - 7天對動物抽血以測定抗體滴定度。動物在最後投服後約1週安逸死。結果係利用腦內之A 及 A P P値的E L I S A分析以及腦部份存在之致澱粉樣斑的免疫組織化學評估而得。此外，還測得A /3 -專一性抗體滴定度，以及Α Θ -依賴性增殖與細胞分裂反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表3顯示對A/3 1 — 4 2之最高抗體滴定度係由FA 及AN 1 7 9 2誘起，尖峰滴定度出現在第四次免疫後（尖峰GMT: 75386)而在最後第六次免疫後降低 5 9%。由含AN 1 7 9 2之MP L誘起之尖峰平均滴定度係6 2%低於由FA誘起之値且亦在免疫療程早期，在第三次投服後達到，隨後在第六次免疫後降低至尖峰値之 2 8%。由綜合AN 1 7 9 2之Q S 2 1產生的尖峰平均滴定度（G Μ T : 1 5 1 1 )約五倍低於由Μ P L所得値。此外，因爲需要額外免疫以達到尖峰反應，所以反應之動力學減緩。由明礬一結合A Ν1 7 9 2所產生之滴定度稍大於Q S 2 1所產生之値且反應動力學較快速。對含 thimerosal之PBS中輸送的AN1 7 9 2而言，滴定度之頻率及大小勉強大於單獨P_ B S所致値。由Μ P L及 ΑΝ1792產生之尖峰滴定度（尖峰GMT 3 0 9 9 ) 約9倍低於由A Ν 1 7 9 2所產生之値。明礬一結合之 AN 1 7 9 2因僅在少許動物中產生低滴定度，故其免疫活性極差。在僅用P B S免疫之對照組動物中未見及任何抗體反應。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ΓβΤΙ 1239847 五 '發明説明細）經濟部中央標準局員工消費合作社印製表9 ---— ——___ 幾何平均抗體滴定度a --fE &血週數治療 3.3 5.0 9.0 13.0 17.0 明礬/ 102 1081 2366 1083 572 AN1792 (12/21)b (17/20) (21/21) (19/21) (18/21) MPL/ 6241 28867 11242 5665 8204 AN1792 (21/21) (21/21) (21/21) (20/20) (20/20) QS21/ 30 227 327 1511 1188 AN1792 (1/20) (10/19) (10/19) (17/18) (14/18) CFA/ 10076 61279 75386 41628 30574 AN1792 (15/15) (15/15) (15/15) (15/15) (15/15) 明礬/ 25 33 3 9 37 31 AN1528 (0/21 ) (1/21) (3/20) (1/20) (2/20) MPL/ 184 259 1 1653 1156 3099 AN1528 (15/21) (20/21) (21/21) (20/22) (20/20) QS21/ 29 221 51 820 2994 AN1528 (1/22 ) (13/22) (4/22) (20/22) (21/22 ) PBS + 25 33 39 37 47 Thimerosal (0/16) (2/16) (4/16) (3/16) (4/16) PBS 25 25 25 25 25 (0/16) (0/16) (0/15) (0/12) (0/16) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 88 - 1239847 A7 B7__ 五、發明説明（87 ) 之鼴鼠，AN1 79 2 + CFA/I FA治療組之減低達到統計意義（P，〇 · 05) 。AN1 792+thimerosal 治療之鼴鼠的中間値是爲1619ng/g A々42。 X .毒性分析經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 收集組織以供實例2，3及7中所述之硏究結束處之組織致病學檢視之用。此外，血液學及臨床化學亦對實例 3及7之末梢血液樣品進行。評估大部份之主要器官，其包括腦，肺·，淋巴樣，胃腸，肝，腎，腎上腺及內芽胞。雖然在硏究動物中見及散發病灶，但經或未經 A N 1 7 9 2治療之動物，無論是罹患組織或病灶嚴重程度方面均無任何明顯差別。與P B S -治療或未治療動物比較之下，AN — 1 7 8 2免疫之動物中並未見及任何獨持之組織致病病灶。在實例7中，佐助劑組與P B S治療動物間亦無任何臨床化學模式差異。雖然相對於P B S治療動物而言，在實例7中之用AN 1 7 9 2及弗瑞得佐助劑治療之動物，幾個血液學參數顯著提高，但這些作用形態係爲弗瑞得佐助劑治療及.伴生之腹膜炎所預期的並不代表來自A N 1 7 9 2治療之任何負作用。即使並非毒性評估之一部份，進一步檢視P D A P P鼴鼠腦部病理學作爲效力結點的一部份。在任何硏究中均未見及治療相關之對腦部形態學的負作用。由這些結果顯示出A N 1 7 9 2治療是耐受性極佳且至少實際上無副作用。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） .Q〇. 1239847 A7 B7 五、發明説明（88 ) XI ·個體之預防及治療進行單一劑量第I期試驗以測定安全性。治療劑以預期效力値之約0 . 0 1漸增劑量投服至不同病人，再以3 之因子提高至達到約1 0倍於有效鼴鼠劑量之値爲止。進行第I I期試驗以測定治療效力。選擇罹患使用阿茲海默氏疾病及相關疾病結合（A D R D A )準則定義之早一中期阿茲海默氏疾病的病人。適當病人在Mini-Mental State Exam (MMSE)中在1 2 — 26範圍內評分。其他選擇標準是爲病人在硏究期間可能存活下來並無複雜影響因素，諸如，使用會產生干擾之倂服藥物。病人功能之基準評估係用典型精神測驗法進行，諸如，Μ M S E及 ADA S，其係爲評估阿茲海默氏疾病病人之疾病狀態與功能的範圍廣泛準繩。適當之定性生命準繩亦可用以監控治療。疾病進展亦可用MR I監控，病人的血液型態亦可監控，其包括免疫原-專一性抗體及T -細胞反應分析。經濟部中央標準局員工消費合作社印袋基準測定之後病人開始接受治療。他們以盲目方式任意用治療劑或安慰劑治療。至少每6個月監控病人。效力係藉由治療劑相對於安慰劑之進展顯著降低而測得。進行第I I期試驗以評估病人由非阿茲海默氏疾病早年記憶喪失（有時稱之爲年齡-伴生之記憶受損， AAM I )轉化成如ADRDA準則定義之可能阿茲海默氏疾病。具有轉化成阿茲海默氏疾病高危險性之病人係藉由篩選伴生預-阿茲海默氏疾病症候之記憶喪失或其他困難之參考人口，阿茲海默氏疾病家族史，遺傳性危險因子 -91 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（90 ) NaCl ，0 · 6%胎牛血淸白蛋白，0 · 05% thimersal )中的1 / 1 0 0稀釋液開始。樣品之7個系列稀釋液以3倍步驟直接在板內製備而達到1 / 2 1 8 7 0 0之最後稀釋液。各稀釋液在室溫下在經塗布一板分格內孵養1小時。該板再用含0 · 0 5% Tween 20 之P B S洗滌4次。將共軛至辣根過氧化酶（得自 Boehringer Mannheim)之第二抗體（羊之抗-鼴鼠ig)以在 Specimen Diluent 中之 1/3000 稀釋液（100// 1 ) 加至分格內並在室溫下孵養1小時。該板再用PBS， Tween 20洗滌4次。爲了發展色原，將1 〇〇 β 1之Slow TMB (3，3’ ，5，5’ 一四甲基聯苯胺，得自Pierce Chemicals)加至每一分格內且於室溫下孵養1 5分鐘。反應由加入2 5//1之2M H2S〇4而中止。再於 Molecular Devices Vmax( 4 5 0 nm - 6 5 0 nm)讀取顏色強度。滴定度定義爲產生1 /2最大0 D之血淸稀釋濃度。最大OD通常由初始之1/1 0 0稀釋濃度取得，但在極高滴定度之情況下例外，在.該情況下，需要較高初始稀釋濃度以得最大〇D。若5 0 %之點落在二稀釋濃度之間，則採線性外堆法計算最後滴定度。爲了計算幾何平均抗體滴定度，小於1 0 0之滴定度則任意定爲2 5。 2 ·淋巴細胞增殖分析用isoflurane麻醉鼴鼠。移除脾臟且用5 m 1含1 0 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ Q3 - · II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1239847 A7 B7 五、發明説明（91 ) 熱一去活化胎牛血淸之PBS (PBS - FBS)淸洗2 次，再於 1.5ml PBS — FBS 中之 50 n Centricon 單元（Dako A/S，Denmark)內，在Medimachine (Dako )中在1 0 0 r p m下均化1 0秒，隨後，經由 1 0 0 V孔徑尼龍篩網過濾。脾細胞用1 5 m 1 PBS — F B S洗滌1次，再於2 0 0 x g下離心5分鐘以成粒狀。紅色血液細胞係藉由在室溫下，再度懸浮九粒於5 m 1 含 0.15M N Η 4 C 1 » 1 M KHC〇3，〇.1m NaEDTA之緩衝液，pH7 · 4中5分鐘布溶解。白血球再如上洗滌。剛分離出之脾細胞（1 0 0 0 〇〇細胞 /分格）以三份方式，在9 6 -分格之U形底組織培養-處理的微滴定板（Corning，Cambridge，MA)中，在補充 2 . 0 5 m M L —麩胺酸，1%盤尼西林/鏈霉素及1〇 %熱—去活化FBS之RPMI 1640介質（JRH blOSCIENCES, Lenexa，KS )內，在 3 7。C 下培養 9 6 小時。各種 A/3 肽類，A/31 — 16 ，A/31 — 40 ，經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A冷1 一4 2或AyS 4 0 — 1逆序列—白質亦在四步驟內，在5 // Μ — 0 · 1 8 // M.劑量範圍內加入。對照組分格內之細胞用未加入蛋白質之Concanavalin A(Con Α)( Sigma, cat. # C — 5 27 5，1 //g/m 1 )培養。細胞在最後24小時用3H -胸腺核苷（1// Ci /分格，得白 Amersham Corp.，Arlington Heights IL)脈衝。細胞再收集至UniFilter板上並在Top Count Microplate閃爍計數器 (Packard Instruments，Downers Grove，IL)中計數。結果本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -94- 1239847 A7 B7 五、發明説明（92 ) 以倂入不可溶巨分子內之放射活性的次數/分鐘（c pm) 表示。 4 ·腦組織製備安逸死後，移除腦並製備一半球以供免疫組織化學分析之用而從另一半球切除三個腦區（海馬，皮質及小腦）且用以使用專一性 E L I S A s ( Johnson-Wood et al·，同上）測定各種形態A蛋白質及A P P的濃度。供E L I S A s用之組織在1 0體積冰冷胍緩衝液（ 5 · 0M 胍- HC1 ，50mMTr i s-HCl ，pH 8 · 0 )中均化。均化物使用 Adams Nutator (fisher)，在室溫下溫和攪拌3 - 4小時，再於定量Αθ及AP P前貯於- 2 0。C下。先前實驗已証明分析物在此一貯存條件下是安定的，而合成之A々蛋白質（Bachem)在釘入來自鼴鼠littermates( Johnson-Wood et al·，同上）之對照組腦組織均化物時可定量回收。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 ·測定A石値腦均化物用冰冷酪蛋白稀釋劑（0 . 2 5 %酪蛋白， PB S，0 · 0 5% 疊氮化鈉，2 0 g/m 1 aprotinin, 5 m Μ Ε D Τ A pH8.0，10g/ml leupeptin ) ，以1 : 10之比例稀釋並在4°C，16000xg下離心2 0分離。製備合成之A /5蛋白質標準物及A P P標準物以包含0 · 5M胍與〇 . 1%胎牛血淸白蛋白（本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） nc . 一經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1239847 A7 B7 五、發明説明（93 ) B S A )於最後組成物中。”全部” A 0三明治 EL I SA使用單株抗體（mA) 266 (對A/3之胺基酸1 3 — 2 8 ( Seubert，et al·，）具專一性）作爲捕捉抗體 ’而生物化mA 3D 6 (對A /3之胺基酸1 — 5 (Johnson -W〇od，et al)具專一性）作爲接受抗體。3D6 mA並不辨識分泌之A P P或全長A P P而僅偵測含天冬胺酸胺基終端之A/S。此一分析具有〜50pg/ml (llpM )之敏感性下限且在高達1 n g /m 1之濃度下，對內源性之鼴鼠A蛋白質無交叉反應力（j〇hnson-Wood et al.，同上）。 A/3 1 — 42專一性三明治EL I SA採用mA/3 2 1 F 1 2 (對 A /3 之胺基酸 3 3 — 4 2 (Johnson-Wood et al.)具專一性）作爲捕捉抗體。生物化之m A冷 3 D 6亦充作本分析中之接受抗體，此分析之敏感性下限爲約 1 2 5 /〇 g / m 1 ( 2 8 p m，Johnson-Wood et al.) 。對 AELISAs 而言，100//1 之 mA 2 6 6 ( l〇//g/ml)或 mA/321F12 (5//g/ml) 刊利用在室溫下培養過夜两塗布至'9 6 -分格免疫分析板 (Costar)之分格內。抽吸移除溶液且在室溫下，在至少1 小時內，將200/zl之〇 · 25%PBS緩衝液中的人類血淸白蛋白加至分格內而封阻之。移除封阻溶液並將該板乾燥貯存在4。C下直到使用爲止。各板在使用前再用洗滌緩衝液〔Tr i s -緩衝之食鹽水，〇 · 15M NaCl，〇.〇lMTris— HCl，pH 7.5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -96- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1239847 A7 B7 五、發明説明（94 ) 〕加上0 · 0 5 % Tween 20〕水合。樣品及標準物各以 1 00// 1/分格加入（3份）後再於4。C下孵養過夜。各板在分析之每一步驟間用洗滌緩衝液至少洗滌3次。加入生物化之mAyS 3D6 (在酪蛋白分析緩衝液（ 0.25% 酪蛋白，PBS，0.05% Tween 2 0， pH 7.4)中稀釋至〇.5//g/ml)並於室溫下，在分格中培養1小時。在室溫下，1小時內，在分格中加入抗生物素蛋白一辣根過氧化酶共軛體（Avidin-HRP，得自Vector，Builingame，CA，在酪蛋白分析緩衝液中以1 : 4 0 0 0比例稀釋）。加入比色基質（Slow TMB-ELISA ( Pierce ))並使其在室溫下反應15分鐘，其後，由加入 2 5 1之2N 1123〇4而中止酶化反應。反應產物利用

Molecular Devices Vmax 定量，測定在 4 5 0 nm 及 6 5 0 n m之吸收性差異。 6 ·測定A P P値經濟部中央標準局員工消費合作社印製採用兩種不同的A P P分析。第一種分析（定名爲 APP — α/FL)辨識 APP 之 ΑΡΡ — α (α)及全長（F L )兩种形態。第二種分析對A Ρ Ρ -具專一性。 APP-α/FL分析辨識含A0之前12個胺基酸的分泌胺基酸。因爲接受抗體（2 Η 3 )對出現於 A Ρ Ρ 6 9 5 ( Esch et al.,Science 248 J 1122 — 1 124 (1990))之胺基酸 612 — 613 間的一夾一位置無專一性；所以，此分析亦辨識全長A Ρ Ρ ( -97- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 A7 B7 五、發明説明（95 ) APP — FL)。使用APP — FL之細胞質尾部的固定不動A P P抗體以耗竭a p p 一 F L之腦均化物喻示約 30-40%APP—a/FLAPP是FL (數據未示出），APP — α/FL及APP - α分析之捕捉抗體均爲m Α β 8 Ε 5，其針對A Ρ Ρ 6 9 5形態之胺基酸 4 4 4 — 59 2 培植（Games et al·，同上）。ΑΡ Ρ — α/ FL分析之接受抗體mA/3是mA/32H3，其對 APP6 9 5 之胺基酸 5 9 7 - 6 08 具專一性（Johnson-Wood et al.，同上）而APP — α分析之接受抗體是 mA冷16Η9，其針對APP之胺基酸605 — 611 培植。A Ρ P - a / F L分析之敏感性下限爲約1 1 n g /ml (150/〇Μ) ( J 〇 h n s ο η - W ο o d e t a 1 ·)而 A Ρ Ρ — α專一性分析之敏感性下限爲2 2 n g /m 1 ( 〇 · 3 pM)。對二種APP分析而言，mA 8E5係如上 mAy3 2 6 6中所述地塗布至Ε I A板之9 6 —分格內。使用純化之重組分泌A Ρ Ρ _ α ^爲A Ρ P - α分析與 APP — α/FL分析之參考標準（Esch et al·，同上）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在5 Μ胍中之腦均化物用EL I S A樣品稀釋劑（ 0.014M磷酸鹽緩衝液，pH 7.4，0.6%胎牛血淸白蛋白，0 · 0 5%thimerosal，0 · 5M N a C 1 ， 0.1% NP40)以1 : 10之比例稀釋。它們再用含 0 · 5 Μ胍之樣品稀釋劑以1 : 4之比例稀釋。稀釋均化物再於室溫及1 6 0 0 0 X g下離心1 5秒鐘。A Ρ Ρ標準物及樣品以雙份方式加至板內並於室溫下孵養1小時。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 98 · 1239847 A7 B7 一五、發明説明（96 ) 生物化接受抗體2 Η 3或1 6 Η 9用樣品在室溫下孵養1 小時。以1 : 1 0 0 0比例稀釋於樣品稀釋劑中之鏈抗生物素蛋白一驗性磷酸酶（Boehringer Mannheim)在分格內，室溫下孵養1小時。加入螢光基質4 一甲基-繳形願1基一磷酸鹽作3 0分鐘室溫孵養且在Cytofluor tm 2 3 5 〇螢光計數器（Millipore )上，在365nm激發及450 n m發射波長處讀値。 7 .免疫組織化學腦子固定在4。C下之4%PBS內的伸甲醛中3天後，再貯於4。C下之1%伸甲醛，PBS中1 一 7天直到切斷爲止。4 0微米厚之冠狀部份在室溫下，在 vibratome上切割並在兌免疫組織化學處理前貯於一 2 0 C 下之低溫人保護劑（在磷酸鹽緩衝液中之3 0%甘醇， 3 0 %乙二醇）內。每一腦內在背側海馬處之6個各由連續2 4 0 // m間隔分開之部份用下列抗體之一孵養過夜：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (1 )在P B S及1%馬血淸中稀釋考濃度爲2 // g/ ml之生物素化抗一 A/S (.mA^S，3D6，對人類A/3 具專一性）；或（2 )在P B S及1 %馬血淸中稀釋至濃度爲3//g/ml之對人類APP，8E5具專一性的生物素化m A Θ ;或（3 )在T r i s —緩衝食鹽水， p Η 7 · 4 ( T B S )中之對神經膠纖維酸性蛋白質（ GFAP;Sigma Chemical Co.)具專一性之 m Α 冷，其用 0 · 2 5 % Triton X - 100 與 1% 馬血淸以 1 : 500 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^99 - 1239847 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（97 ) 之比例稀釋；或（4)在TBS中之對CDllb， M a c — 1 抗原（Chemicon International)具專一性的 mA冷，其用〇 · 25% 丁 riton X— 100與1%兔子血淸以1 : 1 0 0之比例稀釋；或（5 )在T B S中之對 Μ H C I I抗原（Pharmingen )具專一性的mA/3，其用 0 · 2 5 % Triton X— 100 與 1% 兔子血淸以 1 : 100之比例稀釋；或（6)在PBS中之對CD 4 3 ( Pharmingen )具專一性的兔子mA石，其用1 %兔子血淸以

1 : 1 0 0之比例稀釋；或（7 )在P B S中之對C D 4 5 R A ( Phamingen)具專一性的兔子mAyS，其用1% 兔子血淸以1 : 100之比例稀釋；或（8)在PBS中之對CD 45RB( Phamingen )具專一性的兔子單株 mA0，其用1%兔子血淸以1 : 1〇〇之比例稀釋；或 (9 )在 P B S 中之對 CD 4 5 (Pharmingen)具專一性的兔子單株mA/3，其用1%兔子血淸以1 : 1〇〇之比例稀釋；或（1 0 )在P B S中之對C D 3 e ( Pharmingen )具專一性的生物素化多株大鼠抗體兔子 mA々，其用1%兔子血淸以1 : 1 〇〇之比例稀釋；或 (11) 在PBS中之對CD 3( Serotec )具專一性的兔子mA/3，其用1%兔子血淸以1 : 2 0 0之比例稀釋或 (12) PBS溶液，其缺乏主要抗體而包含1%正常馬血淸。與以上1，2及6 - 1 2中所列抗體溶液反應之部份用PBS中之1% Triton X— 100，0 · 4%過氧化氫本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） _ ] 〇〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 1239847 A7 B7 五、發明説明（98 ) ’在室溫下預處理2 0分鐘以封阻內源性過氧化酶。它們隨後在4。C下，用主要抗體孵養過夜。與3D6或 8E5或CD3e mA/3s反應之部份再於室溫下，與 P B S中以1 : 7 5比例稀釋之含組成分” A ”及” B ” 的辣根過氧化酶-抗生物素蛋白一生物素-複合物（Vector E1 i t e S t a n d a r d K i t，V e c t 〇 r L a b s，B u r 1 i n g a m e，C A )反應。與對CD 45Ra，CD45RB，CD 45，CD及缺乏主要抗體之P B S溶液反應之各部份在室溫下，分別用PBS中之以1 : 7 5比例稀釋的生物素化抗一兔子 I g G ( vector)或PBS中之以1 : 75比例稀釋的生物素化抗一鼴鼠I g G ( vector )勝養1小時。各部份再與 P B S中以1 : 7 5比例稀釋之含組成分” A ”及” B ” 的辣根過氧化酶-抗生物素蛋白-生物素-複合物（Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA )反應 o 各部份在室溫下，0 . 01%過氧化氫，0 · 05% 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 3，3’ 一二胺基聯苯胺（DAB) $發展。預定用 GFAP — ’MAC— 1 —.及 M H'C I I —專一性抗體孵養之部份用0.6%過氧化氫於室溫下預先處理以封阻內源性過氧化酶，再用主要抗體於4。C下孵養過夜。與 G F A Ρ -抗體反應之部份在室溫下，用馬內製成之用 T B S以1 : 2 0 0比例稀釋的生物素化抗—鼴鼠I g G (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit)孵養 1 小時。其次，各部份再與用TBS稀釋（1 : 1000) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（2!0'〆297公釐〉 -1〇1 - 1239847 A7 B7 五、發明説明（99 ) 之抗生物素蛋白一生物素-過氧化酶複合物（Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit)反應 1 小時。用充作主要抗體之MAC— 1 -或MHC II —專一性mA 孵養之各部份隨後在室溫下，與用TB S稀釋（1 : 200)之兔子中製成的生物素化抗一兔子IgG反應，隨後用抗生物素蛋白一生物素-過氧化酶複合物（用 TBS 稀釋，1 : 1〇〇〇)。用 GFAP —，MAC — 1 一及MHC II -專一性抗體孵養之各部份再於室溫下，分別用0、05%DAB，0 . 01%過氧化氫， 0 · 04%氯化鎳，TBS處理4及1 1分鐘而使其看得見。將免疫標記部份置於玻璃片（VWR，Superfrost slide) 上，空氣乾燥過夜，浸入Propar ( Anatech )中並使用 Pemount ( Fisher)作爲裝載介質而與覆蓋片重疊。經濟部中央標準局員工消費合作社印製爲了逆染A斑，將幾組G F A P -陽性部份裝載於 Superfrost 片上並於含水之 l%Thioflavin S( Sigma)中孵養7分鐘，隨後免疫組織化學處理。各部份再予脫水並於 Propar內淸洗，然後與安裝載Permount之覆蓋片重疊。 8 .影像分析

Videometric 150 Image Analysis System ( Oncor, Inc., Gaithersburg，MD)經由 C C D 錄影机及 Sony Trinitron 螢幕連接至Nikon Microphot-FX顯微鏡而用以定量免疫反應性玻片。貯存切片影像於影像緩衝液中並測定色彩-及飽 -102- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 A7 B7 五、發明説明（10〇) 和度-爲主之臨界點以選擇及計算免疫標記結構所占有之全部影像面積。對每一切片而言，海馬係用手動方式繪圖而算出海馬占有之全部影像面積。致澱粉樣負荷百分比干係如下測得：（包含與m A 0 3 D 6免疫反應之海馬區分率）X 1 0 0。類似地，神經元負荷百分比係如下測得：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (包含與mA /3 8 E 5免疫反應之營養障礙神經突的海馬區分率）X 1 〇〇。操作Simple 32軟體應用程式之C-Imaging System ( Compix Inc., Cranberry Township, PA) 經由Optronics照相機連接至Nikon Microphot-FX顯微鏡並用以定量GFAP -陽性星形細胞增多症與MAC — 1 -及Μ H C I I -陽性小神經膠質所占有之逆脾皮質百分比。免疫反應切片之影像貯於影像緩衝液中並測定單色-爲主之臨界點以選擇及計算免疫標記細胞所占有之全部影像面積。對每一切片而言，逆脾皮質（R S C )係用手動方式繪圖而算出R S C占有之全部影像面積。星形細胞增多症百分比干係如下測得：（G F A P -反應性星形細胞所占有之R S C分率）X 1 〇〇。類似地，小神經膠質百分比係如下測得：（M A C -. 1 _或Μ H C I I —反應性小神經膠質所占有之R S C分率）X 1 0 0。對所有影像分析而言，定量每一動物在背側海馬區之各以連續2 4 0 # m間隔分開之6部份。在所有情況下，動物之治療情形是觀察者未知的。雖然前面發明已詳加說明以淸楚了解其內容，很明顯的某些改良亨在所附申請專利範圍內實行。所有本文中引 -103- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847 A7 B7 五、發明説明（1〇1 ) 証之公告與專利文件全部內容均以其個別所示目的倂爲本文參考資料。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -104- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1239847

：jiajos 1000001 60000| 60000I 400001 200001 g 鹽 βοοοοΙ 50000Ι 50000I 20000 25000| 駿鼠106 50000 15000 18000 50000 700001 喊鹽 5 V «S5 V σ X V 在50%最大O.D.時之滴定度 S 瞒哩 rwft 15000| 150001 15000| 15000| 20000 - (¾ X V S I 丨<Q ! X }^T ί V m — 鹽 Μ S 坩 PQ < 3ntU 笼鼹鼠104 1〇〇〇| 30〇| | 40〇| 90〇| 2700 - S 鹽 - 喊鹽 V «S3 V u. X V S 鹽 I 120000| i 55000| 50000| 50000I 40000| 11 鼹鼠m I •Q V «S5 V 5 J3 X V ，駿鼠102 | 15000 300001 500001 60000 60000 m 1 *—1 喊鹽貓 P-, 1 σι X V 5s X in σ <〇 X V i鼹鼠101 150000 65000 55000 20000 30000 CD ο ν·1 Csi 1鼹鼠100 70000Ι 15000 20000 40000 25000 PDAPP之年齡 CO GO I 〇 CVJ

Claims

1239断 Α8 Β8 C8 D8 申請專利範圍附件3A 第87 1 1 9660號專利申請案中文申請專利範圍替換本^ 民國94年月3'日修正經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 · 一種用於預防和治療阿玆海默氏疾病之藥學組成物’其包含A/3肽或其選自AyS40、AyS42、A/31-5、 Α/3 1·6、Α/3 1·12或AA13-28之免疫原性片段及選自明礬、單磷脂或QS21之藥學上可接受之佐助劑，且有效誘起免疫反應（包含產生對Α万·肽或其免疫原性片段之抗體），其中該佐助劑增強對A万肽或其免疫原性片段的免疫反應。 2 ·如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其中該 A /3肽或其免疫原性片段是包覆在顆粒內部。 3 .如申請專利範圍第2項之藥學組成物，其中該顆粒是聚內交酯聚乙交酯共聚物（p L p g )顆粒。 4 .如申請專利範圍第1或2項之藥學組成物〇之A /5肽。如申請專利範圍第1或2項之藥學組成物 0 之A /3片段。如申請專利範圍第1或2項之藥學組成物 0 μ;之 A /3 肽。如申請專利範圍第1或2項之藥學組成物〇 μβ之A /3片段。如申請專利範圍第1或2項之藥學組成物，其包含至少 5 含至少6 含至少7 含至少 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其包其包其包其包取..氏張尺度適用中國國家標率（CNS) (210><297公寶 1239847 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2 含至少5 0 μ£之A/3肽。 • 9 .如申請專利範圍第1或2項之藥學組成物，其包含至少5 0 之A，片段。 1 0 .如申請專利範圍第’1或2項之藥學組成物，其包含至少1 〇〇之A/3肽。 ]_ i •如申請專利範圍第1或2項之藥學組成物，其包含至少1 〇〇之αθ片段。 1 2 ·如申請專利範圍第1或2項之藥學組成物，其中該Α万肽或其免疫原性片段於投遞時呈聚集形式。 1 3 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項之藥學組成物，其中該佐助劑適於投服人體。 1 4 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之藥學組成物，其中該藥學組成物爲非經腸投服的藥學組成物。 1 5 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項之藥學組成物，其中該藥學組成物適於經肌肉內或經皮下投服。 1 6 . 一種用於預防和治療阿玆海默氏疾病之藥學組成物，其包含运自 A/3 1- 5' A/3 1- 6、A/3 1-12 或 A/3 13-28 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 之免疫原性Α Θ片段’該片段連接載體分子以形成共軛分子，其中該載體分子係免疫球蛋白或白喉類毒素。 1 7 如申請專利範圍第1 6項之藥學組成物，其中該載體分子係促進對抗Α Θ片段之免疫反應。 1 8 .如申請專利範圍第1 6項之藥學組成物，其中該白喉類毒素爲C R Μ 1 9 7。 i 9 •如申請專利範圍第1 7項之藥學組成物，其中本焱張尺度適用中國國家操準（CNS) A4規格（ 210X297公釐) I '— 1239847 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 該白喉類毒素爲C R Μ 1 9 7。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 0 .如申請專利範圍第1 6至1 9項中任一項之藥學組成物，其中該A /3片段係以融合蛋白質之形式連接至該載體。 2 1 ·如申請專利範圍第1 6至1 9項中任一項之藥學組成物，其中該藥學組成物係非經腸投服之藥學組成物〇 2 2 ·如申請專利範圍第1 6至1 9項中任一*項之藥學組成物，其中該藥學組成物適於經肌肉或經皮下投服。 2 3 · —種用於預防或治療特徵爲在病人體內具有包含A /3肽之澱粉樣沈.積的疾病之藥學組成物，其包含專一結合A 肽或其免疫原性片段的拮抗a /9之抗體，其中該抗體專一結合 Ay5l-12、A/5 13-28、A；S40 或 Ay542，且該抗體量係有效預防或治療該疾病，其中投服該抗體係降低病人腦中A /3量。 2 4 .如申請專利軔圍第2 3項之藥學組成物，其中該抗體爲單株抗體。 ‘ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 5 .如申請專利範圍第2 3項之藥學組成物，其中該爲人類化抗體。 2 6 ·如申請專利範圍第2 5項之藥學組成物，其中該抗體爲I g G 1。 .2 7 ·如申請專利範圍第2 5項之藥學組成物，其中該抗體與載體以藥學組成物之型式投服。 2 8 .如申請專利範圍第2 3至2 7項中任一項之藥本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） q 1239847 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 4 學組成物，其中該藥學組成物另包含佐助劑，其適於投服人體。 2 9 .如申請專利範圍第2 3至2 7項中任一項之藥學組成物，其中該藥學組成物係非經腸投服之藥學組成物〇 · 3 0 .如申請專利範圍第2 3至2 7項中任一項之藥學組成物，其中該藥學組成物適於經肌肉內或經皮下投服 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T έ 經濟部智慧財產¾員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家棵準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4-