WO1992015330A1 - Procede d'immunoneutralisation anti-lhrh des animaux domestiques males non castres et peptide pour cela - Google Patents

Procede d'immunoneutralisation anti-lhrh des animaux domestiques males non castres et peptide pour cela Download PDF

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WO1992015330A1
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lhrh
vaccine
conjugate
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slaughter
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Raymond Dufour
Claude Roulet
Claire Chouvet
Michel Bernard Bonneau
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Rhône Merieux
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    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]

Definitions

  • the present invention relates to a process for improving the organoleptic qualities, in particular the odor, the palatability and the tenderness, of the meat of non-castrated male domestic animals, in particular cattle, sheep and male pigs.
  • the invention also relates to vaccines which can be used in this method, a new peptide for the production of such vaccines and a vaccination package relating thereto.
  • the androgenic steroids including androstenediol, androstenedione and testosterone are the determining elements of the expected benefits in all domestic species for faster growth and better use of the food ration, they are responsible for a lower tenderness of the meat of whole male cattle and sheep.
  • Non-androgenic steroids or 16-androstene derivatives including 5 ⁇ -androstenone (5 ° C-andr ⁇ stèn-16 one-3) in male pigs, are partly responsible for the unpleasant odor and palatability of the meat from a number of whole male pigs from puberty, which depreciate the meat and are an obstacle to its marketing in the fresh state.
  • Scatole a product derived from tryptophan and produced by the intestinal microbial flora, is a compound responsible in part for the unpleasant smell and palatability of whole male pork meat. Its production depends on factors of the environment, nutrition, race. Its accumulation in adipose tissue is greater in the boar and is linked to the secretions of gonadal sex steroids.
  • testicular hormones in particular testicular steroids
  • active or passive immunoneutralization against them or against the hormones involved in their secretion in particular the luteinizing hormone or LH (Luteinizing Hormone) and the gonadoliberine hormone (GnRH) also called Luteinizing Hormone Releasing Hormone (LHRH).
  • LH Luinizing Hormone
  • GnRH gonadoliberine hormone
  • LHRH Luteinizing Hormone Releasing Hormone
  • IS Robertson describes a method of immunization with LHRH conjugated to tetanus toxoid or thyroglobulin and suggests that the immunological approach would allow late castration with the advantages that can be expected in terms of weight growth. He concludes, however, that efforts are still to be made to arrive at a castration method which can be used in practice, whether at the level of the method itself or of the adjuvant, Freund's adjuvant being prohibited in convenient.
  • late immunoneutralisation poses in practice the important problem of the safety of the treatment and in particular of the local reactions caused by the vaccines, in particular the oily vaccines, with the risks of rejection or downgrading of the meat which results therefrom. .
  • the applicant has rightly found an industrially applicable process making it possible to improve the organoleptic properties of the meat of animals, process in which, shortly before the slaughter of the animal, the action of androgenic and non-androgenic steroids is substantially suppressed, by active or passive anti-LHRH immunoneutralization, while maintaining the advantages due to the male character of the animal practically until slaughter.
  • the animal is administered an LHRH vaccine, preferably as an emulsion, preferably during or before the fattening phase of the animal, then, shortly before slaughter. of the animal, an anti-LHRH vaccine is administered again.
  • LHRH vaccine preferably as an emulsion
  • the anti-LHRH vaccine with an aqueous-type adjuvant, in particular aluminum hydroxide gel and / or saponin.
  • This administration is preferably carried out 15 to 21 days before slaughter.
  • the administration before slaughter is preferably done with an adjuvant in emulsion, and preferably 1 to 2 months before slaughter.
  • This administration is preferably carried out at least 4 weeks, and preferably several months, after the first administration.
  • the emulsion vaccine intended for the first administration and, in cattle, for the second administration, that the vaccine is in the form of a water-in-oil emulsion.
  • the vaccine is in the form of a water-in-oil emulsion.
  • other forms of emulsion are possible.
  • This vaccine preferably of the emulsion type, is designed, according to the invention, for the induction of a first immune response of low intensity, without significant effect, or even measurable, on the secretion of gonadal steroids.
  • the emulsion formulation is preferred, but the other formulations can be used as long as they produce this same effect.
  • the administration which precedes slaughter is carried out with a vaccine formulated to produce at this time the significant suppression or reduction of the secretion of steroids without any local or general adverse reaction, liable to harm the appearance or the quality of meat.
  • the conjugate in aqueous solution, is put under the following two formulations: the first in stable water-in-oil emulsion, made of a mixture of animal mineral oils or highly purified plants and non-ionic surfactants for the induction of a weak immune response, without measurable effect on the secretion of gonadal steroids, the second, non-emulsified, with aluminum hydroxide gel and saponin, triggering a rapid and intense immune reaction resulting in the production of neutralizing anti-LHRH antibodies, sufficient to cause the reduction or suppression of gonadal steroids and the reduction of the associated transport of intestinal scatole.
  • the emulsion used is, unlike that obtained with the aid of Freund's complete or incomplete adjuvant, a stable emulsion making it possible to prepare a ready-to-use vaccine.
  • the inflammatory skin reaction remains very weak and localized at the points of administration of the two vaccine formulations and is manifested in the form of well circumscribed papules on external examination. Its internal development remains limited to the superficial dermis. It disappears without leaving an apparent granuloma when the animals are slaughtered.
  • the animal is administered, a few days before slaughter, in particular 5 to 15 days before, anti-LHRH hyperimmune plasma or serum or also anti-LHRH monoclonal antibodies.
  • Passive anti-LHRH immunization resulting in the reduction or even suppression of the secretion of androgenic and non-androgenic steroids was obtained by the intramuscular administration of equine hyperimmune plasma. Raised to a sufficient level, measured by the LHRH antibody titer of the serum of the recipient animal, it results in the reduction of plasma testosterone from the 3rd day; maintained at this same level for the next 12 days, it is sufficient to bring about the lowering of tissue androsterone below 0.50 microgram / g, value for which the unpleasant smell and the particular palatability of the male pork meat would no longer be perceived by the consumer.
  • This passive immunization method has shown that maintaining the significant decrease in testosterone for 12 days is sufficient to lower the concentration of tissue androsterone below the set threshold.
  • This passive immunization can be envisaged by the use of anti-LHRH monoclonal antibodies secreted by pig hybridomas or heterohybridomas.
  • the mode of administration of these formulations is preferably transcutaneous, in particular using an injection device without needle, by pressure jet, in particular according to patent application FR-A-2,652,257.
  • the method according to the invention has the important advantage of being perfectly harmless, in particular of not inducing local reactions liable to cause the downgrading of the meat.
  • the inflammatory skin reaction remains localized at the points of administration of the two vaccine formulations and manifests itself in the form of well circumscribed papules on external examination. Its internal development remains limited to the superficial dermis. It disappears without leaving an apparent granuloma when the animals are slaughtered.
  • the inflammatory reaction limited in time and at the points of administration, reflects the tolerance to the two vaccine formulations and is obtained by transcutaneous administration of these, carried out using an injector without needle.
  • Anti-LHRH immunization requires the conjugation of the LHRH peptide or a fragment of the LHRH peptide, non-immunogenic under the economic conditions of their use, with an immunogenic protein, termed carrier, by a covalent bond.
  • LHRH or GnRH is composed of 10 amino acids, numbered from 1 to 10 in going from the amino-terminal termination to the carboxy-terminal termination according to the following formula:
  • anti-LHRH immunogenic conjugates described by the various authors can be produced with regard to hapten with:
  • bovine serum albumin As regards the carrier protein, bovine serum albumin, human serum albumin, thyroglobulin, ovalbumin, human or equine globulins have been used.
  • European patent application EP-A-181 236 describes immogenic conjugates comprising a nonapeptide or a decapeptide including a sequence, corresponding to the last 8 amino acids of the LHRH molecule, to which is added a lysine or a cysteine-lysine sequence on the aminoterminal side.
  • patent application WO 88/05308 discloses conjugates formed using fragments of 5, 6 or 7 contiguous amino acids of the natural molecule, in which each fragment includes the pyroglutamic acid N- terminal or carboxyterminal glycinamide and to which an amino acid or an additional amino acid sequence may be added at the end linked to the immunogenic protein.
  • the conjugation agents used can be classified into three main categories: activating agents, homobifunctional agents, heterobifunctional agents. Whereas, for the activating agents, the connection between the two molecules takes place between two functions already present, for the others, the connection takes place via a hydrocarbon residue called ligand.
  • activating agents mention may be made of the periodic acid used to oxidize the oligosaccharide residues of the glycoproteins into aldehydes, on which the amino groups of the other molecule entering the conjugate will react subsequently.
  • Carbodiimides are widely used activating agents for the coupling of antigens on proteins and, among them, the most used is undoubtedly N-ethyl-N '- (3-dimethylamino propyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) which allows the reaction to be carried out in an aqueous medium.
  • EDC N-ethyl-N '- (3-dimethylamino propyl) carbodiimide hydrochloride
  • Their action leads to the formation of an amide bond between a carboxyl group of a protein, activated in an intermediate manner in the form of an O-alkylisourea, and an amino group carried by another molecule.
  • Their advantage lies in their ease of use.
  • Homobifunctional agents are molecules which have two identical reactive groups separated by a hydrocarbon chain. Among them, let us quote glutaraldehyde, which reacts on two primary amine groups, alkyl or aryl bisisothiocyanates, which react on primary amines and thiols, benzidine bisdiazotée, which copulates with the aromatic residues of tyrosine. Let us mention for the record the bismaleimides and the bisamidinates. The major drawback of homobifunctional agents is that they do not fully understand the nature of the conjugates formed because these agents can react on two molecules of the same nature and lead to the formation of oligomers or polymers.
  • heterobifunctional agents in which the two groups have different specificities.
  • one of these groups is an ester of N-hydroxysuccinimide which, under mild conditions, reacts on the free amino groups of proteins to give on the one hand the N-hydroxysuccinimide and on the other hand the protein carrying a covalent bond amides the coupling agent on which the 2nd function is found.
  • this can react on the thiols provided by the molecule to be coupled, these thiols being either initially present in the molecule in the form of cysteine residues (these may be constitutive or, in the case of peptides, intentionally introduced during of the synthesis), or provided by agents such as imino-2 thiolane or N - ((pyridyl-2) dithio-3 propanoyloxy) succinimide (SPDP), after reduction.
  • cysteine residues these may be constitutive or, in the case of peptides, intentionally introduced during of the synthesis
  • agents such as imino-2 thiolane or N - ((pyridyl-2) dithio-3 propanoyloxy) succinimide (SPDP), after reduction.
  • SPDP succinimide
  • total LHRH it is preferred to use total LHRH.
  • natural LHRH is preferred to agonists such as (D-Lys 6 ) -LHRH by comparing the immunogenic activity of the conjugates prepared with these two peptides.
  • Carbodiimide is preferred over glutaraldehyde as the conjugate of naturally occurring LHRH on alpha globulin.
  • Human or equine alpha globulin, fraction IV-1 or IV-4, is preferred to human or bovine serum albumin.
  • the vaccines comprise the same active principle, preferably comprising an alpha-globulin-LHRH conjugate;
  • LHRH is preferably in natural form and alpha globulin of human or equine origin, in particular fractions IV-1 and / or IV-4.
  • the conjugate is preferably obtained by addition to 1 volume of alpha-globulin and LHRH mixture in solution of 2 to 20 mg / ml in 0.9% NaCl of 0.5 to 2 volumes of N-ethyl-N hydrochloride solution '- (dimetylamino-3-propyl) carbodiimide (EDC) in 2.5% solution in 0.9% NaCl. After stirring, the mixture is left overnight, then purified by gel permeation chromatography.
  • serum albumin in particular bovine or human, thyroglobulin, ovalbumin, human or equine globulin, toxoids, in particular tetanus toxoid.
  • the subject of the invention is therefore this new peptide (3-10) and the conjugates incorporating it coupled to an immonogenic carrier protein among those mentioned above,
  • carbodiimide is preferred to glutaraldehyde and to heterobifunctional agents as a conjugating agent for the peptide LHRH (3-10) in particular on equine alpha-globulin or 1 Ovalbumin.
  • LHRH (3-10) and the carrier protein, ovalbumin or alpha globulin are dissolved at 2 to 40 mg per ml each in 0.1M NaCl-acid buffer (N -morpholino) -2 0.1M sulfonic ethane. Then, 0.5 to 2 volumes of 2.5% N-ethyl-N '(3-dimethylamino propyl) carbodiimide solution in the same buffer are added. The pH is adjusted by adding 1N sodium hydroxide. After stirring, the mixture is left overnight, then is purified by gel permeation chromatography, which eliminates the uncoupled LHRH (3-10), the residual carbodiimide and its hydrolysis products.
  • a subject of the invention is also the new anti-LHRH vaccines using such conjugates as active principle, which can be used for the method according to the invention.
  • the invention also relates to passive anti-LHRH immunization (3-10) according to the method described above.
  • It also relates to sets bringing together in the same package an equal number of doses of vaccine to be administered before slaughter and of vaccine to be administered as a first injection.
  • these vaccines are packaged in reduced volume and increased concentration for administration by transcutaneous jet, for example according to the aforementioned French patent application.
  • the preparation of the (D-Lys 6 ) -LHRH-albumin conjugates is carried out in 3 stages: preparation of the (N- (pyridyl- 2) -dithio-3 propanoyl-D-Lys 6 ) -LHRH, preparation of the N- (mercapto-3 propanoyl) albumin, then coupling.
  • N- (3-mercapto propanoyl) albumin is obtained by the action of 0.2 mmol of SPDP on 1 g of human albumin dissolved in 100 ml of 0.1M phosphate buffer, then, after overnight contact at 4 ° C. and acidification to pH 6, by reduction with dithiothreitol. It is then purified by gel filtration chromatography. The dosage of thiols and proteins provides the average level of substitution.
  • the coupling is carried out by taking a (pyridyl-2) dithio group for 1.25 thiol group.
  • the pH is brought to 7-7.5, then, one hour later, the yield is determined by measuring the pyridine thione-2 released.
  • the conjugate is purified by chromatography and is concentrated by ultrafiltration.
  • the antibody titer is determined according to the technique described by JEFFCOATE et al., Acta. Endocr., Copenh., 1974, 75: 625-635.
  • Testosterone is dosed directly on plasma by an RIA technique using the radioligand Testosterone C19-carboxymethyl ether ( 125 I) histamine.
  • the binding to the labeled peptide is determined after labeling with iodine 125 the different peptides according to COPPOLAND et al., Endocr., 1979, 104: 1504-1506 and titration according to the technique described by JEFFCOATE et al., Acta
  • Vaccines A1 50 ug of (D-Lys 6 ) -LHRH conjugate
  • A1 vaccines 0.5 mg of (D-Lys 6 ) -LHRH conjugate
  • A2 - Comparative test of two anti-LHRH vaccines composed respectively of an LHRH- ⁇ -globulin conjugate by carbodiimide and a conjugate (D-Lys 6 ) -LHRH- ⁇ -globulin by SPDP emulsified oil-in -water and administered intramuscularly (IM) or transcutaneously (ID) in pigs.
  • IM intramuscularly
  • ID transcutaneously
  • Example A1 The method described in Example A1 is used in exactly the same way, but replacing the albumin at 10 mg / ml with cX-globulin at 6 mg / ml.
  • the overall yield of (D-Lys 6 ) -LHRH coupled is of the order of 45 to 50%.
  • Example A1 The method described in Example A1 is used in exactly the same way, but replacing human albumin with human tf-globulin.
  • the level of conjugation is 24 to 28 mg of LHRH fixed for 100 mg of human ⁇ -globulin.
  • the predominance of the response to the carboxyterminal fraction of the peptide results in a number of animals having antibodies fixing only the LHRH peptide (3-10) excluding the binding of LHRH free acid (10/58 for the anti-LHRH serum and 3/10 for anti-(D-Lys 6 ) -LHRH serum).
  • example A1 The method described in example A1 is used in exactly the same way, but replacing albumin human with equine ⁇ -globulin (fraction IV-1).
  • the emulsions examined are: an oil-in-water fluid emulsion (B), the emulsion of the invention (formula C in the table), a commercial emulsion to be diluted with the antigen (E), an oily phase to be emulsified with the conjugate (F).
  • the final amount ⁇ of antigen per dose is the same.
  • the emulsions are produced under the usual conditions for those experts in formulation of this type.
  • G.2 The tolerance to the vaccines used is judged by the evolution of the inflammatory skin reaction, noted from O to 4 in an animal according to the importance of the papules appearing after administration; a papule appears at each point of administration.
  • the summation of the scores in each of the groups is summarized as follows: average score at the end of the first week that follows administration (Ad. 1) and average score at the time of slaughter for each vaccine (Ab) (Table 13). The best tolerance is observed with the use of vaccines in group 4.
  • the anti-LHRH immune response is measured by the antibody titer which is determined according to the technique described by JEFFCOATE et al., A ⁇ to. Endocr. (Copenh.), 1974, 25, 625-635.
  • the binding to the labeled peptides is determined after labeling with iodine 125 the different peptides according to
  • F Biological efficacy is measured by the reduction or disappearance of the plasma testosterone and the tissue androstenone.
  • the assay of the plasma testosterone is carried out directly on the plasma by an RIA technique using the radioligand testosterone C19-carboxymethyl ether ( 125 I) histamine (FURUYAMA S. et al., Steroids, 1972, 16, 415).
  • the determination of tissue androstenone is carried out on a sample of adipose tissue by an RIA technique using the radioligand 5 ⁇ -H-androstenone, described by CLAUS, CR Acad. Sci., Paris, 1974, 278 f 299-302.
  • the conjugate is preferably obtained by adding to a volume of the ⁇ -globulin and LHRH mixture, in solution at 2 to 20 rag / ml in 0.9% NaCl, from 0.5 to 2 volumes of N-ethyl hydrochloride solution -N '- (3-dimethylamino propyl) carbodiimide (EDC) in 2.5% solution in 0.9% NaCl. After stirring, the mixture is left overnight, then purified by gel permeation chromatography.
  • EDC N-ethyl hydrochloride solution -N '- (3-dimethylamino propyl) carbodiimide
  • the preparation of human ([D.Lys 6 ] -LHRH) - ⁇ -globulin conjugates is carried out in 3 stages: preparation of [N- (pyridyl-2) -dithio-3 propanoyl-D-Lys 6 ] -LHRH, preparation of human N- (3-mercapto-propanoyl) ⁇ -globulin, then coupling.
  • [Ne- (pyridyl-2) dithio-3 propanoyl-D-Lys 6 ] -LHRH is prepared by reacting an excess of SPDP on LHRH, in aqueous solution (6 moles of SPDP per mole of [D-Lys 6 ] -LHRH, then, after one night at 4oC, by centrifuging the product obtained, which is dissolved in 8M urea and the groups (2-pyridyl-dithio) present are dosed.
  • Human N- (3-mercapto-propanoyl) ⁇ -globulin is obtained by the action of 0.2 mmol of SPDP on 0.6 g of human ⁇ -globulin dissolved in 100 ml of 0.1M phosphate buffer, then, after a night of contact at 4oC and acidification to pH 6, by reduction with dithiothreitol. It is then purified by gel filtration chromatography. The dosage of thiols and proteins provides the average level of substitution.
  • the coupling is carried out by taking a (pyridyl-2) dithio group for 1.25 thiol group.
  • the pH is brought to 7-7.5, then, one hour later, the yield is determined by measuring the pyridine thione-2 released.
  • the predominance of the immune response of male pigs to the carboxyterminal fraction of the LHRH peptide conjugated under the conditions described in A1 and A2 is determined by the comparison of the binding by the anti-LHRH and anti [D-Lys 6 ] -LHRH sera.
  • LHRH two labeled fragments of LHRH, respectively LHRH (3-10), (LHRH deleted from its aminoterminal fraction) and LHRH (1-10) in the form of free acid, (LHRH deleted from the amide fraction of its carboxyterminal fraction) .
  • the response to the carboxyterminal fraction of the peptide is general in all animals immunized with one or the other of the conjugates (68/68).
  • the sera of 3 out of 10 of the 10 animals immunized with conjugated [D-Lys 6 ] -LHRH and 10 out of 68 of the animals immunized with conjugated LHRH showed exclusively fixation of the carboxyterminal fraction.
  • the other animals exhibit a mixed response preferentially directed against the carboxyterminal fraction.
  • the response to the amino terminal fraction is not general (55/68). No serum showed exclusive binding to the LHRH free acid fraction.
  • the conjugate is purified by permeation chromatography on gel to separate the conjugate from the non-conjugated LHRH. Measuring the quantity of the latter makes it possible to have, by difference, the quantity of coupled LHRH. It is possible to determine the coupling efficiency.
  • LHRH (3-10) and 120 mg of ovalbumin are dissolved in 9 ml of 0.1M NaCl buffer - 0.1M (N-morpholino) -2 ethanesulfonic acid. Then 150 mg of N-ethyl-N '- (3-dimethylamino-propyl) carbodiimide hydrochloride dissolved in 12 ml of the same buffer are added. The pH is adjusted to 7.0 by adding IN sodium hydroxide (about 1.9 ml). The mixture is left overnight at room temperature and is then clarified by centrifugation. The supernatant is chromatographed on Sephadex gel to separate the conjugate from unreacted LHRH and products from the initial carbodiimide. By measuring the amount of LHRH (3-10) not fixed, it is possible to determine the coupling efficiency of LHRH (3-10).
  • the formulations consisting of conjugated LHRH (3-10) put in water-in-oil emulsion (1st vaccine) and in aluminum hydroxide gel and ⁇ aponin (2nd vaccine) were administered to 6 male pigs under a volume of 0.4 ml per dose, respectively at the start of fattening and 17 days before slaughter by transcutaneous route using an injector without needle called Pigjet delivering the volume of the dose in 2 applications of 0 , 2 ml distributed in 5 points at each of them.
  • the immune response was maximal 10 days after the administration of the second vaccine.
  • the individual antibody titers (inverse of the dilution by which iodine 125 is fixed at 50%) were respectively:
  • Tolerance to the vaccine is judged by the evolution of the inflammatory skin reaction, noted according to the importance of the papules appearing at each point of delivery of the vaccine after administration. This local inflammation disappeared completely from day 10 after the administration of the 2nd vaccine.

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Abstract

Le procédé pour améliorer les qualités organoleptiques, en particulier l'odeur, la sapidité et la tendreté, de la viande des animaux domestiques mâles non castrés, comprend, peu avant l'abattage de l'animal concerné, la suppression de l'action des stéroïdes androgènes et non androgènes, par immunoneutralisation active ou passive anti-LHRH, tout en maintenant pratiquement jusqu'à l'abattage les avantages liés au caractère mâle de l'animal. Les vaccins comprennent comme peptide la LHRH naturelle ou un peptide de formule Trp - Ser - Tyr - Gly -Leu - Arg - Pro - Gly - NH2, couplé à une protéine porteuse immunogène.

Description

PROCEDE DE IMMUNONEUTRALISATION ANTI-LHRH DES ANIMAUX DOMESTIQUES MALES NON CASTRES ET PEPTIDE POUR CELA
Procédé pour améliorer les qualités organoleptiques de la viande des animaux domestiques mâles non castrés, vaccins utilisables dans ce procédé, nouveau peptide notamment pour la réalisation de ces vaccins et ensemble de vaccination y relatif.
La présente invention concerne un procédé pour améliorer les qualités organoleptiques, en particulier l'odeur, la sapidité et la tendreté, de la viande des animaux domestiques mâles non castrés, notamment des bovins, des ovins et des porcins mâles.
L'invention concerne aussi des vaccins utilisables dans ce procédé, un nouveau peptide pour la réalisation de tels vaccins et un ensemble de vaccination y relatif.
Les avantages de l'utilisation du mâle entier sur le mâle castré dans l'engraissement des animaux domestiques destinés à la production de viande ont été soulignés depuis plusieurs décennies par les zootechniciens. Ils concernent un taux de croissance plus élevé, surtout chez les bovins et les ovins, une meilleure utilisation de la ration alimentaire et une carcasse plus maigre mais plus fournie en masse musculaire chez toutes les espèces domestiques (S.C. SEIDEMAN et al. J., of Animal Science, 1982, 55 (4) 826-840 et M. BONNEAU, INRA Prod. Anim., 1988, 1 (2) 133- 140).
Les inconvénients principaux de cette utilisation du mâle entier, rappelés dans les revues citées ci-dessus, concernent l'odeur et la sapidité désagréables chez les porcins et ovins mâles, la moindre tendreté «de la viande des bovins et ovins mâles entiers et justifient les pratiques actuelles de la castration chirurgicale.
En effet, si les stéroïdes androgenes dont l'androsténediol, l'androsténedione et la testostérone sont les éléments déterminants des avantages attendus dans toutes les espèces domestiques pour une croissance plus rapide et une meilleure utilisation de la ration alimentaire, ils sont rendus responsables d'une moindre tendreté de la viande des bovins et ovins mâles entiers. Les stéroîdes non androgenes ou les dérivés des 16-androstènes dont la 5 α-androsténone (5°C-andrσstèn-16 one-3), chez le porc mâle, sont responsables en partie de l'odeur et de la sapidité désagréables de la viande d'un certain nombre de porcins mâles entiers dès la puberté, lesquelles déprécient la viande et sont un obstacle à sa commercialisation à l'état frais.
Le scatole, produit dérivé du tryptophane et produit par la flore microbienne intestinale, est un composé responsable en partie de l'odeur et de la sapidité désagréables de la viande du porc mâle entier. Sa production dépend de facteurs de l'environnement, de la nutrition, de la race. Son accumulation dans le tissu adipeux est plus importante chez le verrat et serait liée aux sécrétions des stéroides sexuels gonadiques.
A titre expérimental, on a déjà essayé de diminuer ou de supprimer le développement du caractère mâle chez le jeune animal ou la sécrétion d'hormones testiculaires, notamment des stéroîdes testiculaires, par immunoneutralisation active ou passive contre ceux-ci ou contre les hormones intervenant dans leur sécrétion, notamment l'hormone lutéinisante ou LH (Luteinizing Hormone) et l'hormone gonadolibérine (GnRH) encore appelée Luteinizing Hormone Releasing Hormone (LHRH). Des essais ont été conduits sur le porc pour abaisser le taux tissulaire de la 5°(-androsténone, du groupe des 16-androstènes, par l'immunisation active dirigée contre ce composé (E.D. WILLIAMSON et al., Liverstock Production Science, 1985, 12, 251-264) ou par l'immunisation passive contre ce même composé (R. CLAUS, Immunization with Hormones in Reproduction Research, éd. Nieschlag, 1975). La suppression ou la diminution de la sécrétion des stéroîdes testiculaires peut être recherchée par l'immunoneutralisation de l'hormone gonadotrope LH, spécifique de l'espèce considérée (R.E. FALVO et al., J. Anim. Science, 1986, 63, 986-994) ou par l'immunoneutralisation anti-LHRH de la LHRH endogène. Seule l'immunisation active anti-LHRH à été préconisée par différents auteurs. Chez le porc, l'abaissement de l 'α-androsténone a été obtenu par cette méthode (A. CARATY et M. BONNEAU, C.R. Acad. Sci. Paris 1986, 303, Série III (16) 673-676 ; R.E. FALVO et al., J. Anim. Sci., 1986, 63, 986-994).
Chez le mouton, B.D. SCHANBACHER (Am. J.Physiol., 1982, 242, E201-E205) préconise l'immunisation anti-LHRH pour retarder le développement testiculaire et produire un effet de castration chez les agneaux mâles. Chez les bovins, P. S. ROBERTSON (Vet. Rec., 1979, 105, 516-517) décrit une castration immunologique anti-LHRH.
Les essais d'immunoneutralisation anti-LHRH décrits sur les animaux de laboratoire (ARIMURA et al. Endocri- nology, 1973, 93, 1092-1103 ; FRASER H.M. et al., J. Endocr. 1974, 63, 399-406 ; MAKINO T. et al. Contraception, 1973, 8 (2), 133-145 ; CARELLI C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1982, 79, 5392-5395) et sur plusieurs espèces domestiques (JEFFCOATE et al., Theriogenology, 1978, 10(4), 323-335 ; ROBERTSON I.S. et al., Veterinary Record., 1979, 105, 556 ; SCHANBACHER B.D. Am. J. Physiol., 1982, 242, E201-E205) ont montré qu'il est possible d'obtenir l'arrêt de la sécrétion de la testostérone, 1 ' involution pondérale des testicules et de ses glandes annexes, l'arrêt de la spermatogénèse et, sur le plan du comportement, la disparition de la libido.
Ces travaux ont conduit à suggérer le recours à une immunoneutralisation, notamment anti-LHRH, précoce pour remplacer la traditionnelle castration chirurgicale à des fins d'élevage. Dans le brevet US nº 4.556.555, il est ainsi décrit une méthode d'immunisation passive d'animaux avant leur puberté, à l'aide d'un antisérum contenant des anticorps dirigés contre la gonadotropine.
La demande de brevet internationale WO 90/11298 décrit un procédé d'immunisation anti-LHRH à la naissance à l'aide de 2 séquences de LHRH en tandem couplées à une protéine porteuse, pour améliorer la qualité de la viande chez le porc.
La demande de brevet internationale WO 88/00056 décrit une méthode de castration immunologique anti-LHRH destinée à améliorer le comportement social et sexuel des animaux mâles en remplacement de la castration chirurgicale qui affecte le taux de croissance. Les taureaux sont vaccinés à l'âge de 8 à 40 semaines et reçoivent ensuite plusieurs rappels.
Un vaccin anti-LHRH vendu sous la marque VAXSTRATE par la société australienne WEBSTERS est utilisé chez la vache.
R.E. Falvσ et al. (J. Anim. Sci. 1986, 63 : 986-994) ont immunisé plusieurs groupes de verrats à l'aide de conjugués LHRH-séroglobuline humaine en adjuvant complet de
Freund ou avec le muramylpeptide comme adjuvant. Les auteurs ont observé, après vaccination et plusieurs rappels, des titres élevés d'anticorps anti-LHRH, mais avec la nécessité de pratiquer des rappels répétés pour maintenir le titre élevé en anticorps.
I.S. Robertson décrit une méthode d'immunisation avec LHRH conjuguée à l'anatoxine tétanique ou à la thyroglobuline et suggère que l'approche immunologique autoriserait une castration tardive avec les avantages que l'on peut en attendre sur le plan de la croissance pondérale. Il conclut cependant que des efforts sont encore à faire pour arriver à une méthode de castration utilisable dans la pratique, que ce soit au niveau de la méthode elle-même ou de l'adjuvant, l'adjuvant de Freund étant proscrit en pratique.
Enfin, A. Caraty et M. Bonneau (C.R. Acad. Se. Paris, t. 303, Série III, nº16, 1986) ont pratiqué une immunisation anti-LHRH chez le porc mâle. Les auteurs suggèrent que le blocage de la production de stéroîdes, 2 à 3 semaines avant l'abattage, permettrait d'exploiter les potentialités élevées de ce type d'animal pour la production de viande en évitant les problèmes posés par l'accumulation d'androstérone dans le tissu adipeux. Ils concluent cependant que d'importants progrès restent à accomplir dans les techniques d'immunisation avant qu'il ne soit possible de proposer l'immunisation active anti-LHRH comme technique utilisable en élevage porcin.
Par ailleurs, l'immunoneutralisation tardive pose dans la pratique le problème important de l'innocuité du traitement et notamment des réactions locales engendrées par les vaccins, en particulier les vaccins huileux, avec les risques de rejet ou de déclassement de la viande qui en résultent.
L'amélioration des qualités organoleptiques chez les bovins et les ovins n'a pas été suggérée.
La déposante a justement trouvé un procédé applicable industriellement permettant d'améliorer les propriétés organoleptiques de la viande des animaux, procédé dans lequel, peu avant l'abattage de l'animal, on supprime sensiblement l'action des stéroîdes androgenes et non androgenes, par immunoneutralisation active ou passive anti-LHRH, tout en maintenant pratiquement jusqu'à l'abattage les avantages dus au caractère mâle de l'animal.
Selon un premier mode de réalisation préféré de ce procédé, on administre à l'animal un vaccin anti-LHRH, de préférence en émulsion, de préférence pendant ou avant la phase d'engraissement de l'animal, puis, peu avant l'abattage de l'animal, on administre à nouveau un vaccin anti-LHRH. On peut procéder en deux administrations distinctes ou par le biais d'un procédé à libération contrôlée.
Chez le porc, il est particulièrement avantageux d'administrer, avant l'abattage, le vaccin anti-LHRH avec un adjuvant de type aqueux, notamment gel d'hydroxyde d'aluminium et/ou saponine.
Cette administration est effectuée de préférence 15 à 21 jours avant l'abattage.
Au contraire, chez le bovin, et éventuellement chez l'ovin, l'administration précédant l'abattage est faite de préférence avec un adjuvant en émulsion, et de préférence 1 à 2 mois avant l'abattage. Cette administration est effec- tuée de préférence au moins 4 semaines, et de préférence plusieurs mois, après la première administration.
Dans tous les cas, on préfère, pour le vaccin en émulsion, destiné à la première administration et, chez le bovin, à la deuxième administration, que le vaccin se présente sous forme d' émulsion eau-dans-l'huile. Cependant, d'autres formes d'émulsion sont envisageables.
Ce vaccin, de préférence du type en émulsion, est conçu, selon l'invention, pour l'induction d'une première réponse immunitaire de faible intensité, sans effet notable, ou même mesurable, sur la sécrétion des stéroîdes gonadiques. La formulation en émulsion est préférée, mais les autres formulations sont utilisables dès lors qu'elles produisent ce même effet.
L'administration qui précède l'abattage est faite avec un vaccin formulé pour produire à ce moment la suppression ou l'abaissement significatif de la sécrétion des stéroîdes sans réaction locale ou générale adverse, susceptible de nuire à l'apparence ou à la qualité de la viande.
De façon préférée notamment pour le porc, le conjugué, en solution aqueuse, est mis sous les deux formulations suivantes : la première en émulsion eau-dans-l'huile, stable, faite d'un mélange d'huiles minérales animales ou végétales hautement purifiées et de tensioactifs non ioniques pour l'induction d'une réponse immunitaire de faible intensité, sans effet mesurable sur la sécrétion des stéroîdes gonadiques, la seconde, non émulsionnée, avec gel d'hydroxyde d'aluminium et saponine, déclenchant une réaction immunitaire rapide et intense se traduisant par la production d'anticorps anti-LHRH neutralisants, suffisante pour entraîner la diminution ou la suppression des stéroîdes gonadiques et la diminution du transport associé de scatole d'origine intestinale.
L'émulsion utilisée est, à la différence de celle qui est obtenue à l'aide de l'adjuvant complet ou incomplet de Freund, une émulsion stable permettant de préparer un vaccin prêt à l'emploi. La réaction inflammatoire cutanée reste très faible et localisée aux points d'administration des deux formulations vaccinales et se traduit sous la forme de papules bien circonscrites à l'examen externe. Son développement interne reste limité au derme superficiel. Elle disparaît sans laisser de granulome apparent au moment de l'abattage des animaux.
Selon un autre mode de réalisation de ce procédé, on administre à l'animal, quelques jours avant l'abattage, notamment 5 à 15 jours avant, du sérum ou du plasma hyperimmun anti-LHRH ou encore des anticorps monoclonaux anti-LHRH.
L'immunisation passive anti-LHRH entrainant la diminution voire la suppression de la sécrétion des stéroîdes androgenes et non androgenes a été obtenue par l'administration intramusculaire de plasma hyperimmun équin. Portée à un niveau suffisant, mesuré par le titre en anticorpsLHRH du sérum de l'animal receveur, elle entraîne la diminution de la testostérone plasmatique dès le 3ème jour; maintenue à ce même niveau les 12 jours suivants, elle est suffisante pour entraîner l' abaissement de l'androstérone tissulaire au-dessous de 0,50 microgramme/g, valeur pour laquelle l'odeur désagréable et la sapidité particulière de la viande du porc mâle ne seraient plus perçues par le consommateur. Cette méthode d'immunisation passive a montré que le maintien pendant 12 jours de la diminution significative de la testostérone est suffisant pour abaisser la concentration d'androstérone tissulâire au-dessous du seuil fixé. Cette immunisation passive peut être envisagée par l'emploi d'anticorps monoclonaux anti-LHRH sécrétés par les hybridomes ou hétérohybridomes porcins.
Le mode d'administration de ces formulations est de préférence transcutané, notamment à l'aide d'un appareil d'injection sans aiguille, par jet sous pression, notamment selon la demande de brevet FR-A-2.652.257.
Le procédé selon l'invention présente l'avantage important de présenter une parfaite innocuité, notamment de ne pas induire des réactions locales susceptibles d'entraîner le déclassement de la viande.
La réaction inflammatoire cutanée reste localisée aux points d'administration des deux formulations vaccinales et se traduit sous la forme de papules bien circonscrites à l'examen externe. Son développement interne reste limité au derme superficiel. Elle disparaît sans laisser de granulome apparent au moment de l'abattage des animaux. La réaction inflammatoire, limitée dans le temps et aux points d'administration, traduit la tolérance aux deux formulations vaccinales et est obtenue par l'administration transcutanée de celles-ci, effectuée à l'aide d'un injecteur sans aiguille.
L'immunisation anti-LHRH nécessite de conjuguer le peptide LHRH ou un fragment du peptide LHRH, non immunogène dans les conditions économiques de leur emploi, à une protéine immunogène, dite porteuse, par une liaison covalente.
La LHRH ou GnRH, qu'elle soit naturelle ou de synthèse, est composée de 10 acides aminés, numérotés de 1 à 10 en allant de la terminaison amino-terminale à la terminaison carboxy-terminale suivant la formule suivante :
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly NH2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ces symboles, par convention, représentent : pGlu, acide pyroglutamique ; His ; histidine ; Trp, tryptophane ; Ser, serine ; Tyr, tyrosine ; Gly, glycine ; Leu, leucine ; Arg, arginine ; Pro, proline.
Les conjugués immunogènes anti-LHRH, décrits par les différents auteurs peuvent être réalisés en ce qui concerne 1 'haptène avec :
a) la LHRH totale ou modifiée en une ou plusieurs de ses parties pour obtenir la conjugaison amino-terminale, carboxy-terminale ou intermédiaire souhaitée,
b) avec l'un de ses fragments peptidiques composés de 5 à 7 acides aminés modifiés ou non, pour obtenir la conjugaison aminoterminale, carboxyterminale ou intermédiaire souhaitée,
c) avec un agoniste portant un acide aminé substitué, le plus couramment en 6, pour obtenir une conjugaison intermédiaire.
En ce qui concerne la protéine porteuse, la sérumalbumine bovine, la sérumalbumine humaine, la thyroglobuline, 1 'ovalbumine, les globulines humaine ou équine ont été utilisées.
Ainsi, la demande de brevet européen EP-A-181 236 décrit des conjugués immogènes comprenant un nonapeptide ou un décapeptide incluant une séquence, correspondant aux 8 derniers acides aminés de la molécule LHRH, à laquelle est ajoutée une lysine ou une séquence cystéine-lysine du côté aminoterminal .
D'autre part, la demande de brevet WO 88/05308 divulgue des conjugués constitués à l'aide de fragments de 5, 6 ou 7 acides aminés contigus de la molécule naturelle, dans lesquels chaque fragment inclut l'acide pyroglutamique N- terminal ou le glycinamide carboxyterminal et auxquels un acide aminé ou une séquence d'acides aminés additionnels peuvent être ajoutés à l'extrémité liée à la protéine immunogène.
Les agents de conjugaison utilisés peuvent être classés en trois grandes catégories : les agents d'activation, les agents homobifonctionnels, les agents hétérobifonctionnels. Alors que, pour les agents d'activation, la liaison entre les deux molécules se fait entre deux fonctions déjà présentes, pour les autres, la liaison se fait par l'intermédiaire d'un résidu hydrocarboné appelé ligand.
Parmi les agents d'activation, on peut citer l'acide périodique employé pour oxyder les résidus oligosaccharidiques des glycoprotéines en aldéhydes, sur lesquels réagiront ultérieurement les groupements aminé de l'autre molécule entrant dans le conjugué.
Les carbodiimides sont des agents d'activation largement employés pour le couplage d'antigènes sur les protéines et, parmi eux, le plus utilisé est sans doute le chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl) carbodiimide (EDC) qui permet d'effectuer la réaction en milieu aqueux. Leur action conduit à la formation d'une liaison amide entre un groupement carboxyle d'une protéine, activé de façon intermédiaire sous la forme d'une O-alcoylisourée, et un groupement aminé porté par une autre molécule. Leur avantage réside dans leur simplicité d'utilisation.
Les agents homobifonctionnels sont des molécules qui possèdent deux groupements réactifs identiques séparés par une chaîne hydrocarbonée. Parmi eux, citons le glutaraldéhyde, qui réagit sur deux groupements aminé primaires, les bisisothiocyanates d'alkyle ou d'aryle, qui réagissent sur les aminés primaires et les thiols, la benzidine bisdiazotée, qui copule avec les résidus aromatiques de la tyrosine. Mentionnons pour mémoire les bismaleimides et les bisamidinates. L'inconvénient majeur des agents homobifonc- tionnels est de mal maîtriser la nature des conjugués formés car ces agents peuvent réagir sur deux molécules de même nature et conduire à la formation d'oligomères ou de polymères.
Pour y remédier, des chimistes ont introduit les agents hétérobifonctionnels, dans lesquels les deux groupements ont des spécificités différentes. Dans le cas général, l'un de ces groupements est un ester du N-hydroxysuccinimide qui, dans des conditions douces, réagit sur les groupements aminé libres des protéines pour donner d'une part le N-hydroxysuccinimide et d'autre part la protéine portant pa une liaison covalente amide l'agent de couplage sur lequel se trouve la 2ème fonction. Assez généralement, celle-ci peut réagir sur les thiols apportés par la molécule à coupler, ces thiols étant soit initialement présents dans la molécule sous forme de résidus cystéine (ceux-ci pouvant être constitutifs ou, dans le cas de peptides, introduits intentionnellement lors de la synthèse), soit apportés par des agents tels que l'imino-2 thiolane ou le N-((pyridyl-2)dithio-3 propanoyloxy) succinimide (SPDP), après réduction.
Parmi les possibilités énoncées ci-dessus, on préfère utiliser la LHRH totale. En ce cas, la LHRH naturelle est préférée aux agonistes tels que la (D-Lys6) -LHRH par la comparaison de l'activité immunogène des conjugués préparés avec ces deux peptides.
Le carbodiimide est préféré au glutaraldéhyde comme agent de conjugaison de la LHRH de forme naturelle sur l'alpha-globuline.
L'alpha-globuline humaine ou équine, fraction IV-1 ou IV-4, est préférée à la sérumalbumine humaine ou bovine.
De préférence, les vaccins comprennent un même principe actif, comprenant préférentiellement un conjugué alpha-globuline-LHRH ; la LHRH est de préférence sous forme naturelle et l'alpha-globuline d'origine humaine ou équine, notamment fractions IV-1 et/ou IV-4. Le conjugué est de préférence obtenu par addition sur 1 volume de mélange alpha-globuline et LHRH en solution de 2 à 20 mg/ml dans NaCl 0,9 % de 0,5 à 2 volumes de solution de chlorhydrate de N-éthyl-N' -(dimétylami- no-3-propyl) carbodiimide (EDC) en solution à 2,5 % dans NaCl 0,9 %. Après agitation, le mélange est laissé une nuit, puis purifié par chromatographie de perméation sur gel.
En ce qui concerne la protéine porteuse, on peut utiliser les sérumalbumines, notamment bovine ou humaine, la thyroglobuline, l'ovalbumine, les globulines humaine ou équine, les anatoxines, notamment l'anatoxine tétanique.
La prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH conjugué par le carbodiimide ou de son agoniste [D-Lys6]- LHRH conjugué par le SPDP sur l'alpha-globuline qui a été observée a conduit à la définition d'un conjugué immunogène anti-LHRH utilisant un peptide avantageux présentant la terminaison carboxy-terminale de la LHRH.
Par conséquent, selon un deuxième mode de réalisation préféré de l'invention, la déposante a trouvé qu'il était très avantageux d'utiliser un nouveau peptide comprenant les 8 derniers acides aminés de la LHRH, soit un décapeptide de formule :
Trp - Ser - Tyr - Gly - Leu - Arg - Pro - Gly - NH2
3 4 5 6 7 8 9 10
qui possède une grande activité immunogène sans présenter l'activité hormonale de la LHRH naturelle.
L'invention a donc pour objet ce nouveau peptide (3-10) et les conjugués l'incorporant couplé à une protéine porteuse immonogène parmi celles citées plus haut,
1' ovalbumine et l'alpha-globuline équine, notamment fractions IV-1 et/ou IV-4, étant préférées. Dans l'invention, le carbodiimide est préféré au glutaraldéhyde et aux agents hétérobifonctionnels comme agent de conjugaison du peptide LHRH (3-10) notamment sur l'alpha-globuline équine ou 1 Ovalbumine.
Dans la préparation préférée de conjugué, la LHRH (3-10) et la protéine porteuse, ovalbumine ou alpha-globuline, sont mises en solution à raison de 2 à 40 mg par ml chacune dans le tampon NaCl 0,1M- acide (N-morpholino)-2 éthane sulfonique 0,1M. Ensuite, 0,5 à 2 volumes de solution de N- éthyl-N'(diméthylamino-3 propyl)carbodiimide à 2,5 % dans le même tampon sont additionnés. Le pH est ajusté par addition de soude 1N. Après agitation, le mélange est laissé une nuit, puis est purifié par chroraatographie de perméation sur gel, qui élimine la LHRH (3-10) non couplée, le carbodiimide résiduel et ses produits d'hydrolyse.
L'invention a aussi pour objet les nouveaux vaccins anti-LHRH utilisant de tels conjugués comme principe actif, utilisables pour le procédé selon l'invention.
L'invention a également pour objet l'immunisation passive anti-LHRH (3-10) conformément au procédé décrit plus haut.
Elle a également trait aux ensembles regroupant dans un même emballage un nombre égal de doses de vaccin à administrer avant l'abattage et de vaccin à administrer en première injection. De préférence ces vaccins sont conditionnés sous volume réduit et concentration augmentée pour l'administration par jet transcutané, par exemple selon la demande de brevet français précitée.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'une part d'essais comparant plusieurs produits et procédés de vaccination selon l'invention et d'autre part d'essais ayant montré la prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH et de l 'essai de vaccination anti-LHRH effectué sur les porcs mâles selon l'invention. I - UTILISATION DE LA LHRH TOTALE.
A. Plus grande activité immunogène du conjugué maintenant intacte la fraction carboxyterminale la plus étendue du peptide LHRH et choix du conjugué à base de LHRH de formule naturelle de préférence à celui obtenu à l'aide de l'agoniste (D-Lys6)-LHRH. Al. - Immunisation anti-LHRH du porc mâle entier et du rat mâle OFA.
La comparaison d'activité de deux vaccins anti-LHRH constitués de conjugués entre la LHRH de forme naturelle (B1 et B2) ou la (D-Lys6)-LHRH (A1 et A2) et l'albumine humaine, conjugués obtenus par le carbodiimide en phase aqueuse et le SPDP respectivement, mis dans une émulsion huile-dans-l'eau et administrés par voie intramusculaire chez le porc et par voie sous-cutanée chez le rat, conduit aux conclusions suivantes :
- Activité plus grande du vaccin à base de LHRH de forme naturelle : masse du peptide LHRH conjugué inférieure à celle du peptide (D-Lys6)-LHRH conjugué pour un recrutement d'un plus grand nombre d'animaux présentant une réponse immunitaire (tableaux 1 et 3).
- Effet de dose qui se traduit par un recrutement d'un nombre plus élevé d'animaux présentant une réponse immunitaire par un même conjugué (tableau 3).
Al.l - Préparation des conjugués (D-Lys6)-LHRH-albumine par le SPDP.
La préparation des conjugués (D-Lys6)-LHRH-albumine est réalisée en 3 étapes : préparation de la (N-(pyridyl- 2)-dithio-3 propanoyl-D-Lys6)-LHRH, préparation de la N- (mercapto-3 propanoyl) albumine, puis couplage.
La (Nε -(pyridyl-2)dithio-3 propanoyl-D-Lys6)-LHRH est préparée en faisant réagir un excès de SPDP sur la LHRH, en solution aqueuse (6 moles de SPDP par mole de LHRH), puis, après une nuit à 4°C, en centrifugeant le produit obtenu. Celui-ci est dissous dans l'urée 8M et les groupements (pyridyl-2)dithio présents sont dosés.
La N-(mercapto-3 propanoyl) albumine est obtenue par action de 0,2 mmole de SPDP sur 1 g d'albumine humaine dissoute dans 100 ml de tampon phosphate 0,1M, puis, après une nuit de contact à 4°C et acidification à pH 6, par réduction par le dithiothréitol. Elle est ensuite purifiée par chromatographie de filtration sur gel. Le dosage des thiols et des protéines fournit le niveau de substitution moyen.
Le couplage est effectué en prenant un groupement (pyridyl-2)dithio pour 1,25 groupement thiol. Le pH est amené à 7-7,5, puis, une heure après, le rendement est déterminé par mesure de la pyridine thione-2 libérée.
Le niveau de substitution moyen s'en déduit. Finalement, le conjugué est purifié par chromatographie et est concentré par ultrafiltration.
A1.2 - Préparation du conjugué LHRH-albumine par le carbodiimide.
A 300 mg de LHRH et 300 mg d'albumine humaine dissous dans 30 ml de NaCl 0,9 % sont additionnés 1000 mg de chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamine-3 propyl) carbodiimide dissous extemporanément dans 40 ml de NaCl 0,9%. Après agitation, le mélange est laissé une nuit à température ambiante à l'abri de la lumière. Ensuite, il est chromatographie sur un gel de Séphadex G-50 ; les fractions correspondant au conjugué sont recueillies, éventuellement concentrées et congelées.
A partir des fractions contenant la LHRH non couplée est déterminée la quantité de LHRH non couplée et donc le niveau de conjugaison moyen. Celui-ci est reproductible et varie de 8 à 10 mg de LHRH couplée pour 100 mg d'albumine. A partir des spectres UV du conjugué avant et après chromatographie, sont déduits les rendements de la chromatographie en conjugué et donc la quantité (ou la concentration) de LHRH conjuguée.
A1.3 - Techniques de dosage
Le titre en anticorps est déterminé selon la technique décrite par JEFFCOATE et al., Acta. Endocr., Copenh., 1974, 75 : 625-635.
La testosterone est dosée directement sur plasma par une technique RIA utilisant le radioligand Testosterone C19-carboxyméthyl éther (125I)histamine.
La liaison au peptide marqué est déterminée après marquage à l'iode 125 des différents peptides selon COPPOLAND et al., Endocr., 1979, 104 : 1504-1506 et titrage selon la technique décrite par JEFFCOATE et al., Acta
Endocr., Copenh., 1974, 75, 625-635.
A.1.4 - Illustrations
- Essais sur rats
. Tableau nº 1 : Réponse anticorps anti-LHRH mesurée par le taux de fixation de LHRH marquée à l'iode125
. Tableau nº 2 : Effet de l'immunisation anti-LHRH sur la concentration de testosterone plasmatique
. Posologie
Vaccins A1 : 50 ug de (D-Lys6)-LHRH conjuguée
B1 : 12 jug de LHRH conjuguée
- Essais sur porcs mâles entiers
. Tableau nº 3 : Réponse anticorps anti-LHRH mesurée par le taux de fixation de LHRH marquée à l'iode125
. Posologie
Vaccins A1 : 0,5 mg de (D-Lys6)-LHRH conjuguée
A2 : 6 mg de (D-Lys6-)LHRH conjuguée
B1 : 0,15 mg de LHRH conjuguée
B2 : 1,20 mg de LHRH conjuguée
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
A2 - Essai comparatif de deux vaccins anti-LHRH composés respectivement d'un conjugué LHRH-α-globuline par le carbodiimide et d'un conjugué (D-Lys6)-LHRH-α -globuline par le SPDP mis en émulsion huile-dans-l'eau et administrés par voie intramusculaire (IM) ou transcutanée (ID) chez le porc.
A2.1 - Préparation de conjugué (D-Lys6)-LHRH- α - globuline par le SPDP
La méthode décrite dans l'exemple Al est employée exactement de la même façon, mais en remplaçant l'albumine à 10 mg/ml par l 'cX-globuline à 6 mg/ml.
Le rendement global en (D-Lys6)-LHRH couplée est de l'ordre de 45 à 50 %.
Par ailleurs il est possible de modifier à volonté le degré de substitution de l'α -globuline, donc le niveau de conjugaison, en jouant sur les concentrations en SPDP et/ou en α -globuline lors de la préparation de la MP-α - globuline.
A2.2 - Préparation de conjugué LHRH-of -globuline humaine, par le carbodiimide (EDC).
La méthode décrite dans l'exemple A1 est employée exactement de la même façon mais en remplaçant l'albumine humaine par l'tf-globuline humaine. Le niveau de conjugaison est de 24 à 28 mg de LHRH fixée pour 100 mg d'α -globuline humaine.
A2.3 - L'efficacité du vaccin à base du conjugué LHRH-α -globuline par le carbodiimide est supérieure au second. L'efficacité est exprimée par le nombre d'animaux présentant une disparition totale de la testosterone plasmatique (tableau 4).
Figure imgf000023_0001
A.3 - Prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH conjugué par le carbodiimide ou de son agoniste (D-Lys6)- LHRH conjugué par le SPDP sur l'α-globuline humaine.
Elle est déterminée par la comparaison des pourcentages de fixation des sérums anti-LHRH et anti-(D-Lys6)-LHRH par deux fragments marqués de LHRH, respectivement LHRH (3-10) délété de sa fraction aminoterminale et LHRH (1-10) sous forme d'acide libre et de ce fait délété de la fraction amide de sa fraction carboxyterminale naturelle. Ces deux fractions reconnaissent respectivement plus particulièrement les anticorps dirigés contre les fractions carboxyterminale d'une part, et aminoterminale d'autre part.
La prédominance de la réponse à la fraction carboxyterminale du peptide se traduit par un nombre d'animaux présentant des anticorps ne fixant que le peptide LHRH (3-10) à l'exclusion de la fixation de LHRH acide libre (10/58 pour le sérum anti-LHRH et 3/10 pour le sérum anti- (D-Lys6)-LHRH).
Aucun sérum n'a montré de fixation à 100 % de la fraction LHRH acide libre, laquelle traduirait une reconnaissance exclusive de la fraction aminoterminale.
Les réponses mixtes, les plus fréquentes, montrent une meilleure reconnaissance de la fraction aminoterminale par les sérums anti-(D-Lys6)-LHRH que celle des sérums anti- LHRH. Chez ces derniers, seuls 3 sérums sur 58 ont une reconnaissance supérieure à 40 % de la fraction aminoterminale, contre 4 sur 10 pour le sérum anti-(D- Lys6)-LHRH. B - Plus grande activité immunogène du conjugué LHRH- α-globuline réalisé par le cabodiimide, comparée à celle qui est obtenue par le conjugué préparé avec le glutaraldéhyde. B.1 - Préparation du conjugué LHRH-α-globuline par le glutaraldéhyde.
A 10 mg de LHRH et 50 mg d* «X -globuline humaine (Serva) dissous dans 5 ml de tampon phosphate 0,1M pH 7,5 sont ajoutés, goutte à goutte et sur une durée de 30 mn, 2,5 ml de solution de glutaraldéhyde à 10 mg/ml, en agitant doucement après chaque addition. Après avoir laissé le mélange 2,5 h à température ambiante, la réaction est arrêtée par addition de 25 mg de bisulfite de sodium dissous dans 0,5 ml d'eau. Le conjugué est dialyse à 4ºC contre le tampon NaCl 150mM-phosphate 10mM pH 7,5, puis est concentré par ultrafiltration.
B.2 - Essai comparatif sur le porc de vaccins anti-LHRH formulés à l'aide de quantités identiques de LHRH conjuguée. L'efficacité est exprimée par le nombre d'animaux présentant une disparition totale de la testosterone plasmatique (tableau 7).
Figure imgf000025_0001
C - Plus grande activité immunogène du conjugué utilisant l'α -globuline humaine comparée à celle qui est obtenue par le conjugué utilisant de la sérumalbumine humaine.
L'efficacité est exprimée par le nombre d'animaux présentant une disparition totale de la testosterone plasmatique (tableau 8).
Figure imgf000025_0002
D - Activité immunogène du conjugué utilisant l'α-globuline équine, fraction IV-1, équivalente à celle qui est obtenue par le conjugué utilisant l'α -globuline humaine.
D.1 - Préparation de conjugué LHRH-α -globuline équine par le carbodiimide.
La méthode décrite dans l'exemple A1 est employée exactement de la même façon, mais en remplaçant l'albumine humaine par l'α-globuline équine (fraction IV-1).
D.2 - Administration chez le rat par voie sous-cutanée à 2 reprises à 4 semaines d'intervalle d'un vaccin à la dose de 12 yug de LHRH conjuguée à l' α -globuline humaine ou équine.
Figure imgf000026_0001
E - Plus grande activité adjuvante de l'émulsion eaudans-l'huile de l'invention sur d'autres emulsions (tableau 10).
Essais sur le porc en utilisant le même conjugué composé de la LHRH et de l' α -globuline humaine par le carbodiimide et administré à la même dose sous un même volume par la voie transcutanée en 5 points.
Les emulsions examinées sont : une émulsion fluide huile-dans-l'eau (B), l'émulsion de l'invention (formule C du tableau), une émulsion du commerce à diluer avec l'antigène (E), une phase huileuse à émulsionner avec le conjugué (F).
Pour toutes ces formules, la quantité finale^ d'antigène par dose est la même.
Les emulsions sont réalisées dans les conditions habituelles pour ceux experts en formulation de ce type.
Figure imgf000027_0001
F. Efficacité de l'immunisation passive anti-LHRH pour l'amélioration des qualités organoleptiques de la viande, mesurée par l'abaissement de l'androsténone tissulaire.
Tableau 11
Teneur en adrosténone du tissu adipeux chez les animaux témoins et chez ceux qui ont été soumis à 1 ' immunoneutralisation anti-LHRH passive par un plasma hyperimmun équin anti- (D-Lys6)-LHRH administré sous un volume de 300 ml aux jours 16, 13, 9 et 5 avant abattage.
Figure imgf000027_0002
G. - Efficacité et tolérance des formulations renfermant la LHRH conjuguée à l'α-globuline par le carbodiimide en émulsion eau-dans-l'huile (ler vaccin) et en gel d'hydroxyde d'aluminium et saponine (2ème vaccin), administrées à la même dose de LHRH conjuguée, respectivement au début de la mise en engraissement et 18 à 21 jours avant l'abattage par voie transcutanée à l'aide d'un injecteur sans aiguille dénommé Pigjet.
Deux essais ont été effectués en deux temps, respectivement les groupes 1, 3 et 5 pour le premier et les groupes 2 et 4 pour le second (tableaux 12 et 13). G.1 - L'efficacité de l 'immunoneutralisation, anti-LHRH est augmentée pour un volume égal de vaccin par la multiplication des points d'administration transcutanée.
Figure imgf000028_0001
G.2 - La tolérance aux vaccins utilisés est jugée par l'évolution de la réaction inflammatoire cutanée, notée de O à 4 chez un animal en fonction de l'importance des papules apparaissant après l'administration ; une papule apparaît à chaque point d'administration. La sommation des notes dans chacun des groupes est résumée comme suit : note moyenne à l'i'sue de la première semaine qui suit l'administration (Ad. 1) et note moyenne au moment de l'abattage pour chacun des vaccins (Ab) (tableau 13). La meilleure tolérance est observée avec l'emploi des vaccins dans le groupe 4.
Tableau 13
Tolérance par administration par voie transcutanée observée au cours des 2 essais effectués (essai 1 groupes 1, 3 et 5, essai 2 groupes 2 et 4).
Figure imgf000029_0001
II - UTILISATION DU PEPTIDE (3-10).
A. Techniques de la mesure de la réponse immunitaire anti-LHRH et de l'efficacité biologique par le dosage de la testosterone plasmatique et de l'androstérone tissulaire.
La réponse immunitaire anti-LHRH est mesurée par le titre en anticorps qui est déterminé selon la technique décrite par JEFFCOATE et al., Aσto. Endocr. (Copenh.), 1974, 25, 625-635.
La liaison aux peptides marqués est déterminée après marquage à l'iode 125 des différents peptides selon
COPPOLAND et al., Endocrinology., 1979, 104, 1504-1506. Le titrage des sérums vis-à-vis de ces peptides est effectué selon la technique de JEFFCOATE et al. citée ci-dessus.
F L'efficacité biologique est mesurée par l'abaissement ou la disparition de la testosterone plasmatique et de 1 'androsténone tissulaire. Le dosage de la testosterone plasmatique est effectué directement sur le plasma par une technique RIA utilisant le radioligand testosterone C19-carboxyméthyl éther (125I) histamine (FURUYAMA S. et al., Steroids, 1972, 16, 415). Le dosage de l'androsténone tissulaire est effectué sur un échantillon de tissu adipeux par une technique RIA utilisant le radioligand 5α- H-androsténone, décrite par CLAUS, C.R. Acad. Sci., Paris, 1974, 278 f 299-302.
B. Prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH conjugué par le carbodiimide ou de son agoniste [D-Lys6]-LHRH conjugué par le SPDP sur l'α-globuline humaine.
Bl. Préparation du conjugué LHRH-α-globuline humaine par le carbodiimide.
Le conjugué est de préférence obtenu par addition à un volume du mélange α-globuline et LHRH, en solution à 2 à 20 rag/ml dans NaCl 0,9%, de 0,5 à 2 volumes de solution de chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl)carbodiimide (EDC) en solution à 2,5% dans NaCl 0,9%. Après agitation, le mélange est laissé une nuit, puis purifié par chromatographie de perméation sur gel.
B2. Préparation des conjugués ([D.Lys6]-LHRH)-α-globuline humaine par le SPDP.
La préparation des conjugués ([D.Lys6]-LHRH)-α-globuline humaine est réalisée en 3 étapes : préparation de la [N-(pyridyl-2)-dithio-3 propanoyl-D-Lys6]-LHRH, préparation de la N-(mercapto-3 propanoyl) α-globuline humaine, puis couplage.
La [Ne-(pyridyl-2)dithio-3 propanoyl-D-Lys6]-LHRH est préparée en faisant réagir un excès de SPDP sur la LHRH, en solution aqueuse (6 moles de SPDP par mole de [D-Lys6]-LHRH, puis, après une nuit à 4ºC, en centrifugeant le produit obtenu. Celui-ci est dissous dans l'urée 8M et les groupements (pyridyl-2)dithio présents sont dosés.
La N-(mercapto-3 propanoyl) α-globuline humaine est obtenue par action de 0,2 mmole de SPDP sur 0,6 g d'α-globuline humaine dissoute dans 100 ml de tampon phosphate 0,1M, puis, après une nuit de contact à 4ºC et acidification à pH 6, par réduction par le dithiothréitol. Elle est ensuite purifiée par chromatographie de filtration sur gel. Le dosage des thiols et des protéines fournit le niveau de substitution moyen.
Le couplage est effectué en prenant un groupement (pyridyl-2)dithio pour 1,25 groupement thiol. Le pH est amené à 7-7,5, puis, une heure après, le rendement est déterminé par mesure de la pyridine thione-2 libérée.
Le niveau de substitution moyen s'en déduit. Finalement, le conjugué est purifié par chromatographie et est concentré par ultrafiltration. Le rendement global en [ D-Lys6]-LHRH couplée est de l'ordre de 45 à 50%.
B3. La prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH conjugué dans les conditions décrites en Al et A2 est déterminée par la comparaison de la fixation par les sérums anti-LHRH et anti-[D-Lys6]-LHRH, de deux fragments marqués de LHRH, respectivement LHRH (3-10), (LHRH délétée de sa fraction aminoterminale) et LHRH (1-10) sous forme d'acide libre, (LHRH délétée de la fraction amide de sa fraction carboxyterminale). Ces deux fragments reconnaissent plus particulièrement les anticorps dirigés respectivement contre les fractions carboxyterminale d'une part, et aminoterminale d'autre part.
La réponse à la fraction carboxyterminale du peptide est générale sur tous les animaux immunisés par l'un ou l'autre des conjugués (68/68). Les sérums de 3 sur 10 des 10 animaux immunisés par la [D-Lys6]-LHRH conjuguée et de 10 sur 68 des animaux immunisés par la LHRH conjuguée ont montré exclusivement une fixation de la fraction carboxyterminale. Les autres animaux présentent une réponse mixte dirigée préférentiellement contre la fraction carboxyterminale.
La réponse à la fraction aminoterminale n'est pas générale (55/68). Aucun sérum n'a montré de fixation exclusive à la fraction LHRH acide libre.
C. Essais d' immunoneutralisation active anti-LHRH à l'aide des conjugués LHRH (3-10) -α-globuline équine IV-4 et LHRH (3-10)-ovalbumine réalisés par le carbodiimide. C1. Préparation du conjugué LHRH ( 3-10)-α-globuline équine IV-4 par le carbodiimide.
Quatre-vingt-cinq mg de LHRH (3-10) et 170 mg d' α-globuline équine IV-4 sont dissous dans 12,8 ml de tampon NaCl 0,1M - acide (N-morpholino)-2 éthanesulfonique 0,1H. Puis 212 mg de chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl)carbodiimide dissous dans 17 ml de solution précédente sont ajoutés. Le pH est immédiatement ajusté à 6,0 par addition de 1,3 ml de soude IN.
Après agitation, le mélange est laissé 16h à température ambiante, puis le conjugué est purifié par chromatographie de perméation sur gel pour séparer le conjugué de la LHRH non conjuguée. La mesure de la quantité de cette dernière permet d'avoir par différence la quantité de LHRH couplée. Il est possible de déterminer le rendement de couplage.
C2. Préparation du conjugué LHRH (3-10)-ovalbumine par le carbodiimide
Soixante mg de LHRH (3-10) et 120 mg d'ovalbumine sont dissous dans 9 ml de tampon NaCl 0,1M - acide (N-morpholino)-2 éthanesulfonique 0,1M. Puis 150 mg de chlorhydrate du N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl)carbodiimide dissous dans 12 ml du même- tampon sont ajoutés. Le pH est ajusté à 7,0 par addition de soude IN (1,9 ml environ). Le mélange est laissé une nuit à température ambiante, il est ensuite clarifié par centrifugation. Le surnageant est chromatographie sur gel de Séphadex pour séparer le conjugué de la LHRH n'ayant pas réagi et des produits provenant du carbodiimide initial. Par mesure de la quantité de LHRH (3-10) non fixée, il est possible de déterminer le rendement de couplage de la LHRH (3-10).
C3. Réponse immunitaire, efficacité biologique et tolérance au vaccin anti-LHRH formulé à partir du conjugué obtenu entre les fragments LHRH (3-10) et 1 'α-globuline équine IV-4 par le carbodiimide.
Les formulations constituées de la LHRH (3-10) conjuguée mises en émulsion eau-dans-l'huile (1er vaccin) et en gel d'hydroxyde d'aluminium et εaponine (2e vaccin) ont été administrées à 6 porcs mâles sous un volume de 0,4 ml par dose, respectivement au début de la mise en engraissement et 17 jours avant l'abattage par voie transcutanée à l'aide d'un injecteur sans aiguille dénommé Pigjet délivrant le volume de la dose en 2 applications de 0,2 ml réparties en 5 points à chacune d'elles.
La réponse immunitaire fut maximale 10 jours après l'administration du 2e vaccin. Les titres individuels en anticorps (inverse de la dilution par laquelle l'iode 125 est fixé à 50%) furent respectivement :
Jour 10 280 660 2 700 3 200 4 600 13 000 Jour 16 290 400 2 000 2 400 3 100 8 600 L'efficacité biologique de cette réponse immunitaire s'est traduite par la disparition de la testosterone plasmatique dès le 10e jour après l'administration du 2e vaccin chez tous les 6 animaux. La disparition de la testosterone s'accompagne, dans les mêmes conditions, de la disparition de l'androsténone tissulaire.
La tolérance au vaccin est jugée par l'évolution de la réaction inflammatoire cutanée, notée en fonction de l'importance des papules apparaissant à chaque point de délivrance du vaccin après administration. Cette inflammation locale a totalement disparu dès le jour 10 après l'administration du 2e vaccin.

Claims

REVENDICATIONS.
1. Procédé pour améliorer les qualités organoleptiques, en particulier l'odeur, la sapidité et la tendreté, de la viande des animaux domestiques mâles non castrés, dans lequel, peu avant l'abattage de l'animal concerné, on supprime sensiblement l'action des stéroîdes androgenes et non androgenes, par immunoneutralisation active ou passive anti-LHRH, tout en maintenant pratiquement jusqu'à l'abattage les avantages liés au caractère mâle de 1 ' animal.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on administre en premier lieu un vaccin anti-LHRH, puis, peu avant l'abattage de l'animal, on administre à nouveau un vaccin anti-LHRH.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on administre en premier lieu un vaccin conçu pour induire une première réponse immunitaire de faible intensité, sans effet notable, ou même mesurable, sur la sécrétion des stéroîdes gonadiques et en ce que, avant l'abattage, on administre un vaccin formulé pour produire la suppression ou l'abaissement significatif de la sécrétion des stéroîdes sans réaction locale ou générale adverse, susceptible de nuire à l'apparence ou à la qualité de la viande.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le vaccin anti-LHRH administré en premier lieu l'est avant la phase d'engraissement de l'animal.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le vaccin anti-LHRH administré en premier lieu est un vaccin en émulsion.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que, pour le porc, on administre, avant l'abattage, le vaccin anti-LHRH avec un adjuvant de type aqueux.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, comme adjuvant de type aqueux, on utilise du gel d'hydroxyde d'aluminium et/ou de la saponine.
8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on administre le vaccin en adjuvant aqueux de 15 à
21 jours avant l'abattage.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que, pour les bovins et les ovins, on administre, avant l'abattage, un vaccin anti-LHRH avec un adjuvant en émulsion.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on administre le vaccin en émulsion de un à deux mois avant l'abattage.
11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'on administre le vaccin en émulsion de quatre semaines à plusieurs mois après l'administration faite en premier lieu.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 9 à 11, caractérisé en ce que le vaccin en émulsion est un vaccin en émulsion eau-dans-l'huile.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'émulsion eau-dans-l'huile est faite d'un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensioactifs non ioniques.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que l'on administre un conjugué immunogène anti-LHRH comprenant :
- la LHRH totale ou modifiée,
- un fragment peptidique de LHRH modifié ou non, ou
- un agoniste de la LHRH,
couplé à une protéine porteuse immunogène choisie parmi :
- sérum albumine bovine ou humaine,
- thyroglobuline,
- ovalbumine,
- les anatoxines, notamment l'anatoxine tétanique, - globulines humaines ou équines.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le conjugué comprend la LHRH couplée à l'alpha- globuline équine, notamment fractions IV-1 et/ou IV-4.
16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le conjugué comprend la LHRH (3-10) couplée à l'alpha-globuline équine, notamment les fractions IV-1 et/ou IV-4, ou à l'ovalbumine.
17. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que la LHRH/LHRH (3-10) et la protéine porteuse immunogène sont couplées par un carbodiimide.
18. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' on administre à l'animal, quelques jours avant l'abattage, du sérum ou du plasma hyperimmun anti-LHRH.
19. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on administre à l'animal, quelques jours avant l'abattage, des anticorps monoclonaux anti-LHRH.
20. Procédé selon la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce que l'administration est faite de cinq à quinze jours avant l'abattage, par voie sous-cutanée ou intramusculaire.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 17, caractérisé en ce qu'on administre par voie transcutanée, de préférence en plusieurs points, à l'aide d'un appareil d'injection sans aiguille par jet sous pression.
22. Peptide de formule :
Trp - Ser - Tyr - Gly - Leu - Arg - Pro - Gly - NH2.
23. Conjugué comprenant le peptide selon la revendication 22, couplé à une protéine porteuse immunogène.
24. Conjugué selon la revendication 23, caractérisé en ce que la protéine porteuse immunogène est choisie parmi l'ovalbumine, les globulines équines et humaines, la thyroglobuline, les anatoxines, notamment l'anatoxine tétanique, et les sérumalbumines humaine et bovine.
25. Conjugué selon la revendication 24, caractérisé en ce que la protéine porteuse immunogène du groupe des globulines est l'alpha-globuline équine, notamment fraction IV-1 et/ou IV-4.
26. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 23 à 25, caractérisé en ce que le peptide et la protéine porteuse immunogène sont couplés par un carbodiimide.
27. Vaccin anti-LHRH conçu pour induire une réponse immunitaire de faible intensité, sans effet notable, ou même mesurable, sur la sécrétion des stéroîdes gonadiques et comprenant comme principe actif- un conjugué alpha-globuline-LHRH ou un conjugué selon l'une quelconque des revendications 23 à 26.
28. Vaccin anti-LHRH conçu pour produire la suppression ou l'abaissement significatif de la sécrétion des stéroîdes sans réaction locale ou générale adverse, susceptible de nuire à l'apparence ou à la qualité de la viande, et comprenant comme principe actif un conjugué alpha-globuline-LHRH ou un conjugué selon l'une quelconque des revendications 23 à 26.
29. Vaccin anti-LHRH selon la revendication 27 ou 28, caractérisé en ce qu'il est en émulsion eau-dans-l'huile.
30. Vaccin anti-LHRH selon la revendication 29, caractérisé en ce que l'émulsion comprend un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensioactifs non ioniques.
31. Vaccin anti-LHRH selon la revendication 27 ou 28, caractérisé en ce qu'il est en adjuvant aqueux.
32. Vaccin anti-LHRH selon la revendication 31, caractérisé en ce qu'il comprend un gel d'hydroxyde d'aluminium et/ou de la saponine.
33. Ensemble de vaccination anti-LHRH comprenant dans un même emballage un nombre égal de doses d'un vaccin à administrer en première injection et d'un vaccin à administrer avant l'abattage, selon l'une quelconque des revendications 27 à 32.
PCT/FR1992/000176 1991-03-01 1992-02-26 Procede d'immunoneutralisation anti-lhrh des animaux domestiques males non castres et peptide pour cela WO1992015330A1 (fr)

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