JPH05506459A - 未去勢のオスの家畜に対する抗ｌｈｒｈ免疫方法と、そのためのペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 未去勢のオスの家畜に対する抗ＬＨＲＨ免疫方法と、そのためのペプチド 未去勢の家畜のオスの肉の感覚上の品質を改良する方法と、この方法で用いられ るワクチンと、このワクチンを製造するための新規なペプチドと、ワクチンの製 造方法。

本発明は去勢されていない家畜、特に牛、羊およびブタのオスの肉の感覚上の品 質（ｑｕａｌｉｔｅｓ　ｏｒｇａｎｏｌｅｐｔｉｑｕｅ）　％特に臭いと味と柔 らかさを改良する方法に関するものである。

本発明はこの方法で使用可能なワクチンと、このワクチンを製造するための新規 なペプチドと、これらに関するワクチン方法とに関するものである。

食肉用の家畜を肥育する際には去勢されたオスよりも去勢されていないオスを利 用する方が有利であるということは過去数十年間、畜産学の専門家達が強調して きたことである。その理由は成長速度が速く　（特に牛と羊）、餌の利用効率が 良く、全ての家畜種において脂身が少なく筋肉が多い肉が得られるためである（ Ｓ、　Ｃ，ＳＥＩＤＥＭＡＮ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　５ｃ ｉｅｎｃｅ、　１９８２゜５５　（４）　８２６−８４０．　Ｍ、　ＢＯＮＮＥ Ａ［Ｊ、［ＮＲＡ　Ｐｒｏｄ、　Ａｎｉｍ、、　１９８ｇ、Ｈ２）１３３−１４ ０＞。

しかし、これら報告書でも指摘されているように、未去勢のオスを利用した場合 の最大の欠点は、オスのブタと羊の場合には肉に不快な臭いと味が残り、未去勢 のオスの牛と羊の肉は固いことである。そのため、一般には外科的な去勢手術が 行われている。

全ての家畜種で要求される速い成育右よび高い餌の利用効率に寄与する雄の性ホ ルモンステロイドの決定要素であるアンドロステネジオール、アンドロステネジ オンおよびテストステロンは、未去勢のオスの牛と羊の肉を固くする原因にもな っている。また、オスブタの非性ホルモンステロイドすなわち１６−アンドロス テン誘導体の５α−アンドロステノン（５α−アンドロスト−１６−オン−３） は思春期に達した未去勢のオスブタの多くの肉に不快臭と味を与える原因の１つ であり、肉の品質を落とし、生肉で市販する際の障害になっている。

また、未去勢のオスブタの肉が不快な臭いと味を有する原因の１つは腸内細菌に よって作られるトリプトファンの誘導体：スカトールである。この物質は環境、 栄養状！！！および品種等の要因ででき、未去勢のオスブタではこの物質が脂肪 組織に多く蓄積される。この物質は生殖腺での性ホルモンの分泌に関係するとい われている。

幼い動物での雄性の発達すなわち精巣ホルモン、特に精巣ステロイドの分泌を低 下または停止させるために、このステロイドまたはその分泌に関与するホルモン 、特に黄体形成ホルモンまたはＬ　Ｈ（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎ ｅ）および黄体形成ホルモン分泌ホルモン（Ｌ　ＨＲＨ，Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎ ｇ　ＨｏｒＩＩＩｏｎｅ　Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｈｏｒｉｚｏｎ）ともよばれる ゴナドリベリンホルモン（ＧｎＲＨ）を能動的すなわち積極的に免疫無効化（ｉ ｓ＋ｍｕｎｏｎｅｕｔｒａ　ｌ　１ｓａｔ　１ｏｎ）する試みは既に試験的に行 われている。

また、ブタの１６−アンドロステンの５α−アンドロステノンの組織内レベルを 下げるために、この化合物に対する能動免疫の試み（Ｅ、　Ｄ、　ＷＩＬＬＩＡ ＭＳＯＮ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　５ｃ ｉｅｎｃｅ。

１９ｇ５．１２．２５１−２６４）または受動免疫の試み（Ｒ，ＣＬＡＵＳ、　 ｌ＋ａ＋ｕｎｉｚａｒｔｉｏｎｗｉｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｉｎ　Ｒｅｐｒｏ ｄｕｃｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｎｉｅｓｃｈｌａｇ、１９７５）も行われ ている。さらに、精巣ステロイドの分泌を停止または低下するために、各々の種 に特異的な向生殖腺性ホルモンＬＨの免疫無効化（Ｒ，Ｅ、　ＦＡＬＶＯｅｔ　 ａｔ、、Ｊ、　Ａｎｉａ＋、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９ｇ６゜６３、９８６−９ ９４）または内因性ＬＨＲＨの抗ＬＨＲＨ免疫無効化も行われている。多くの人 が推薦するのは抗ＬＨＲＨ能動免疫のみである。ブタの場合にはこの方法でα− アンドロステノンの低下に成功している（Ａ、　ＣＡＲＡＴＹ、　Ｍ、　ＢＯＮ ＮＥＡＵ、　Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｐａｒｉｓ　１９８６．３０３．５ｅｒｉｅｓｌＩＩ　（１６）　６７３−６７ ６　；　Ｒ，Ｅ、　ＦＡＶＬＯｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｎｉｍ、　Ｓｃｉ、、 １９８６．６３．９８６−９９４）。

シャンバシ＋　−（Ｂ、口、　５ＣＩ（ＡＮＢＡＣＨ［ｉＲ，Ａｍ、　Ｊ、　Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、、　１９８２゜２４２、　Ｂ２０１−Ｂ２０５）は羊において抗 ＬＨＲＨ免疫によってオスの羊の精巣の発達を遅らせ、去勢効果を与える方法を 提案している。ロバ−ドア　７（Ｐ、　Ｓ、　ＲＯＢＥＲＴＳＯＮ　Ｖｅｔ、　 Ｒｅｃ、、　１９７９．　１０５゜５１６−５１７）は牛における抗ＬＨＲＨ免 疫による去勢法を報告している。

テストステロンの分泌を停止させ、精巣およびそれに付随する腺の重量を減少さ せ、精子形成を停止させ、性欲を消失させることができるということは実験動物 に対する抗ＬＨＲＨ免疫無効化試験の報告（ＡＲＩＭＬＩＲＡ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１９７３．９３゜１０９２−１１０３　：　 ＦＲＡＳＥＲ）！、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　［！ｎｄｏｃｒ、　１９７４． ６３．３９９−４０６；ＭＡＫＩＫＯＴ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏｎｔｒａｃｅ ｐｔｉｏｎ、　１９７３．８（２）、　１３３−１４５；　ＣＡＲＢＬＬＩ　Ｃ ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、 　１９８２゜７９、５３９２−５３９５）および数種家畜に対する抗ＬＨＲＨ免 疫無効化試験の報告（ＪＥＦＦＣＯＡＴＥ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅｒｉｏｇｅ ｎｏｌｏｇｙ、　１９７８．１０（４）。

３２３−３３５　；　ＲＯＢＥＲＴＳＯＮ　１．　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｖｅ ｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｃｏｒｄ、　１９７９゜ｎ　１０５．　５５６；５ＣＡ ＮＢＡＣＨＥＲＢ、ロ、Ａｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、、１９８２．　２４２゜Ｐ 、２０１−８２０５）が示している。

これらの報告では、繁殖目的で、従来の外科的去勢に代わって免疫無効化、特に 抗ＬＨＲＨ免疫無効化が採用されることを示唆している。

アメリカ合衆国特許第４．５５６．５５５号にはゴナドトロピンに対する抗体を 含む抗血清を用いて思春期前の動物を受動免疫する方法が記載されている。

国際特許出顆第Ｗ０９０／１１．２９８号には、ブタ肉の品質を向上させるため に、２つのＬＨＲＨ配列をキャリアー蛋白に結合させたものを用いて出生時に抗 ＬＨＲＨ免疫する方法が記載されている。

国際特許出願第Ｗ　Ｏ８８１００，０５６号には、オス動物の社会的行動または 性的行動を改善するために、成長速度に影響を与える外科的去勢手術に代わって 抗ＬＨＲＨ免疫による去勢方法が記載されている。この方法では生後８〜４０週 間のオス牛にワクチンを接種し、数回のブースター注射を行う。

オーストラリアのウェブスターズ（ＩＩＥＢｓＴＥＲｓ）社からワタストレイト （登録商！　ＶＡＸＳＴＲＡＴＥ）の商品名で市販されている抗ＬＨＲＨワクチ ンは牛で使用されている。

ファルボ達（ＲｏＥ、　Ｆａｌｖｏ　ａｔ　ａｌ、Ｊ、　Ａｎｉｍ、　Ｓｃｉ、 　１９８６．６３　：９８６−９９４＞はＬＨＲＨ−ヒト血清グロブリン結合体 を完全フロインドアジュバントに加えたものまたはアジュノくントとしてムラミ ルペプチドを用いて未去勢のオスブタ群を免疫化して、ワクチン接種と数回のブ ースター注射の後に高力価の抗ＬＨＲＨを観察している。しかし、この高抗体力 価を維持するため１二ｇｔブースター注射を繰り返し行う必要がある。

ロバートソン（１，Ｓ、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）は破傷風アナトキシンまたはチ ログロブリンと結合させたＬＨＲＨによる免疫法を報告している。筆者はこの免 疫手段を用いることによって去勢時期を遅らせ、それによって体重を有利に増加 させることができるという点を示唆している。しかし、フロイントのアジュノく ントは使用が禁止されているので、去勢方法そのものとアジュノイントとを実用 可能な段階にするにはさらに研究が必要であるとしている。

カラティとボノウ（Ａ、　Ｃａｒａｔｙ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｂｏｎｎｅａｕ、　Ｃ ，Ｒ，Ａｃａｄ。

Ｓｃ、　Ｐａｒｉｓ、　ｖｏｌ、　３０３．５ｅｒｉｅｓＩＩ１．　ｋ１６．１ ９８６）はオスブタに対して抗ＬＨＲＨ免疫を行っている。著言違は、層殺の２ 〜３週間前にステロイドの生成を停止させることによって、脂肪組織中にアンド ロステノンが蓄積して生じる問題を無くし、この種の動物の食肉への利用価値を 高めることができることを示唆している。しかし、著言違は養豚で使用可能な技 術として抗ＬＨＲＨ能動免疫を提案できるようになるまでにはこの免疫法の技術 をさらに大きく進歩させる必要があると結論付けている。

また、免疫無効化時期が遅れると、実用上で重要な問題すなわち処置の安全性、 特にワクチン（特に油性ワクチン）により生じる局所反応の問題が起こり、食肉 として拒絶されたり、グレードが下げられる危険がある。

なお、牛と羊の食肉の感覚上の品質を良くするという点についてはこれまでに触 れられたことは全くなかった。

本出願人は、動物の肉の感覚上の品質を良くするために産業上利用可能な方法を 見出した。

本発明方法は、能動または受動的な抗ＬＨＲＨ免疫無効化によって性ホルモンま たは非性ホルモンのステロイドの活性を動物を層殺する直前までほぼ停止させる とともに、動物の雄性に起因する利点を層殺時まで実質的に継続させることがで きる。

本発明の第１の好ましい具体例では、抗ＬＨＲＨワクチン、好ましくは乳化（エ マルジョン）状態の抗ＬＨＲＨワクチンを動物の肥大成長期またはその前に投与 し、その後、層殺の少し前に再度抗ＬＨＲＨを投与する。この方法は２回に分け て投与するか、コントロールリリース法を用いて行うことができる。

ブタの場合には、層殺前に水性アジュバント、特に水酸化アルミニウムゲルおよ び／またはサポニンと一緒に抗ＬＨＲＨワクチンを投与するのが好ましい。この 投与は層殺の１５〜２１日前に投与するのが好ましい。

これに対して牛の場合（場合によっては羊）では、層殺前のワクチン投与に乳化 剤状のアジュバントを使用し、層殺の１〜２力月前に行うのが好ましい。この屠 殺直前の投与は最初の投与から少なくとも４週間後、好ましくは数カ月後にする 。

いずれの場合でも１回目の投与に使用するワクチン（牛の場合は２回目の投与に も使用する）乳化剤状ワクチンは油中水型乳化剤の形にするのが好ましい。しか し、その他の形式の乳化剤を使用することもできる。

本発明のワクチン（好ましくは乳化剤型）は生殖腺ステロイドの分泌に実質的に 影響を与えない、あるいは影響が測定不可能であるような弱い免疫反応を最初に 起すように設計されている。本発明のワクチンはエマルジョンにするのが好まし いが、同じ効果が得られるならば、その他の製剤法でもよい。

層殺前の投与では、肉の品質または外観を損なう可能性がある局所反応または全 体反応を引き起こさないで、ステロイドの分泌を停止または大幅に低下させるよ うに処方されたワクチンを使用する。

ブタの場合には、下記２種類の製剤法で調合した水溶液の結合体（ｃａｎ　ｊｕ ｇｕｅ）にするのが好ましい：第１の製剤法は、生殖腺ステロイドの分泌が測定 できない程度の弱い免疫反応を起こす高純度の鉱物油、動物油または植物油と非 イオン性表面活性剤との混合物より成る安定な油中水型乳剤にする。

第２の製剤法は、生殖腺ステロイドを減少または消失させ、それに付随する腸由 来のスカトールの運搬を減少させるのに充分な量のニュートラライジング抗ＬＨ ＲＨ抗体（ａｎｔｉｃｏｒｐ　ａｎｔｉ−Ｌ　ＨＲＨｎｅｕｔｒａｌｉｓａｎｔ ｓ）が産生されるような迅速で強い免疫反応を引き起すエマルジョンではない水 酸化アルミニウムとサポニンとのゲルにする。

本発明で使用する乳剤はフロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバン トと違って、使用時にワクチンを直ぐに調整できる安定なエマルジョンである。

炎症性の皮膚反応は非常に弱く、２種のワクチン製剤を投与した位置に限定され 、外見上では極めて狭い範囲に限定された丘疹が現れる。内部への拡散＜１ｎｔ ｅｒｎａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）は表面真皮に限定され、層殺時には消失 し、特に目立った肉芽種が残ることはない。

本発明の他の具体例では、高度免疫抗ＬＨＲＨ血清または血漿あるいは抗ＬＨＲ Ｈモノクロナル抗体を層殺の数日前、好ましくは５〜１５日前に動物に投与する 。

ウマの高度免疫血漿を筋肉注射により投与する♂抗ＬＨＲＨ受動免疫が獲得され て、性ホルモンまたは非性ホルモンのステロイドの分泌が減少または停止するの が観察される。免疫した動物の血清中のＬＨＲＨ抗体力価の測定値を十分なレベ ルにすると、３日後に血漿テストステロンが減少し、その後１２日間同じレベル が維持される。オスブタの肉の不快奥方よび特殊な味が消費者に認識されない程 度にするには、組織内のアンドロステノン量を０，５０μｇ／ｇ以下まで下げれ ばよい。この受動免疫法の結果はテストステロンを１２日間大幅に減少させ続け れば、組織内のアンドロステノン濃度を閾値以下に低下させることができるとい うことを示している。この受動免疫はブタのバイブリド−７またはヘテロハイブ リドーマから分泌される抗ＬＨＲＨモノクロナル抗体を用いて行うことができる 。

本発明製剤の投与は経皮投与で行うのが好ましく、特にフランス国特許第Ｆ　Ｒ −Ａ　−２，６５２，２５７号に記載の針を使用しない注射装置を用いて加圧ジ ェットで行うのが好ましい。

本発明方法は肉の品質を下げる原因となる局部反応を起こさないという点で極め て重要である。

炎症性の皮膚反応は極めて弱く、ワクチン製剤の投与位置に限定され、外見上は 極めて狭い範囲に丘疹が現れる。内部拡散は表面真皮に限定され、層殺時には消 失し、特に目立った肉芽種が残るようなこともない。炎症反応は一時的で、投与 位置に限定されるので、上記２つの製剤法で作ったワクチンを針無しの注射器を 用いて経皮投与することができる。

本発明の抗ＬＨＲＨ免疫法では、非免疫原性のＬＨＲＨペプチドまたはＬＨＲＨ ペプチドの断片をキャリアーとよばれる免疫原性蛋白に経済的方法で共有結合に よって結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させる必要がある。

ＬＨＲＨまたはＧｎＲＨは、自然物でも合成物でもｉ　−ｉｏで表される１０個 のアミノ酸がアミノ末端からカルボキシ末端まで下記の式でつながっている： ｐＧ　Ｉｕ−１ｆ　１ｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｌｅｕ−Ａｒ ｇ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｙ−Ｎ　Ｈｚｌ　２　３　４　５　６　７　８　９　１０こ れらの記号は以下のものを意味している：ρＧｌｕ　ピログルタミン酸　Ｆｌｉ ｓ　ヒスチジンＴｒｐ　）リプトフＴン　Ｓｅｔ　セリンＬｅｕ　ロイシン　Ａ ｒｇ　アルギニンＰｒｏ　プロリン 抗ＬＨＲＨ免疫原結合体に関しては種々の報告があり、以下のものをハプテンと することができる：（ａ＞ＬＨＲＨ全体またはその一部または複数の部位を変性 させたものを用いて、アミノ末端、カルボキシ末端または所望の中間位置に結合 させる。

（ｂ）５〜７までのアミノ酸よりなる未変性または変性したペプチド断片を用い て、アミノ末端、カルボキシ末端または所望の中間位置で結合させる。

（Ｃ）置換アミノ基を有する　（最も一般的には６位に有する）作動薬（ａｇｏ ｌｉｓｔｅ）を用いて、中間位置で結合させる。

キャリアー蛋白としてはウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、チログロブ リン、オボアルブミンおよびヒトまたはウマのグロブリンが使用されている。

ヨーロッパ特許第Ｅ　Ｐ　−Ａ−１８１，２３６号にはＬＨＲＨ分子の最後の８ つのアミノ酸に対応する配列を含むノナペプチドまたはデカペプチドで構成され 、そのＴミノ末端側にリジンまたはシスティン−リジン配列が付加された免疫原 性結合体が記載されている。

国際特許第Ｗ　０８８１０５．３０８号には天然分子の５，６および７のアミノ 酸断片で構成される結合体が記載され、各断片はＮ−末端を有するピログルタミ ン酸またはカルボキシ末端を有するグリシナミドを含み、免疫原性蛋白と結合し た末端には別のアミノ酸またはアミノ酸配列をさらに付加することができる。

使用する結合剤は（１）活性化試薬、（２）ホモ三官能性試薬および（３）ヘテ ロ三官能性試薬の３種類に大別される。活性化試薬を用いた場合の二分子間の結 合は予め存在していた２つの官能基の間で起こり、それ以外の場合はリガンドと よばれる炭化水素残基によって行われる。

活性化剤としては糖蛋白のオリゴ糖類残基をアルデヒドへ酸化するのに使用され る過ヨウ素酸を挙げることができる。結合に関与する別の分子のアミノ基はこの アルデヒドと反応する。

カルボジイミドは抗原を蛋白にカップリングさせるのに広く用いられている活性 化剤で、その中で最もよく用いられるのはＮ−エチル−Ｎ’　−＜３−ジメチル アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の塩酸塩で、この場合には反応を水 性媒体中で行うことができる。この反応によって○−アルキルイソウレア中間体 の形に活性化された蛋白質のカルボキシル基と別の分子のアミングループとの間 にアミド結合が形成される。この利点は簡単に使用できる点にある。

ホモ三官能性試薬とは炭化水素鎖によって互いに隔てられた２つの同一な官能基 を有する分子である。例としては２つの第一アミン基と反応するグルタルアルデ ヒド、軍−アミンおよびチオールと反応するアルキルジイソシアネートまたはア リールジイソシアネート、チロシンの芳香族残基とカップリングするビスジアゾ 化ベンジジンを挙げることができ、特に、ビスマレイミドおよびビスアミンネー トを挙げるこ２かできる。ホモ三官能性試薬を用いた場合の主たる欠点は、これ らの試薬が性質特表千５−５０６４５９　（５＞ ５　が同じ２つの分子と反応してオリゴマーまたはポリマーを形成ｒ　すること があるため、生成する結合体の種類がコントロールできない点にある。

この欠点を克服するために化学音速が開発したヘテロニ官能鴛　性試薬では、２ つの官能基がそれぞれ別の特性を有し、一般にで　は一方の官能基は緩やかな反 応条件下で蛋白の遊離アミン基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ルであす、コれがＮ−ハイドロキシサクシンイミドおよび共有アミド結合を介き 　して第２の官能基を有するカップリング剤を含む蛋白になる。

一般には、後者はカップリングされる分子のチオールと反応する。このチオール は分子内に最初からシスティン残基（これは天然成分でも、ペプチドの場合には 合成段階で意図的に導入したものでも良い）の形で存在しているか、２−イミノ チオレーンまたはＮ−［３−（２−ピリジルジチオ）ブロバノイロ牛シ］スクシ ンイミド（ＳＰＤＰ）のような試薬によって還元後に導入しても良い。

上記の使用可能なもののうち、ＬＨＲＨ全体を使用するのが好ましい。この場合 には（Ｄ−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨのような作動薬よりも天然のＬＨＲＨが好ま しい。これら２つのペプチドを用いて調製した結合体は免疫活性が異なる。

天然型ＬＨＲＨをα−グロブリンに結合するための試薬としてはグルタルアルデ ヒドよりもカルボジイミドが好ましい。

ヒトまたはウシ血清アルブミンよりもヒトまたはウマのα−グロブリンの■−１ 画分またはｒＶ−４画分がより好ましい。

各ワクチンは同一の活性成分、特にα−グロブリン−ＬＨＲＨ結合体を含むのが 好ましく、ＬＨＲＨは天然形が好ましく、α−グロブリンはヒトまたはウマ由来 のもの、特にＩＶ−１および／またはｒＶ−４画分であるのが好ましい。結合体 は２〜２０■／ｒｎｌのα−グロブリン／ＬＨＲＨ混合物を含む０．９％塩化ナ トリウム溶液ｌ容量に対して、Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３−ジメチル−アミノプ ロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の塩酸塩を２．５％含む０．９％の塩化ナト リウム溶液０．５〜２容量を添加し、攪拌後、混合物を一夜放置し、ゲル浸透ク ロマトグラフィーで精製して得るのが好ましい。

キャリアー蛋白上しては血清アルブミン、特にウシまたはヒト血清アルブミン、 チログロブリン、オバルブミン、ヒトまたはウマのグロブリンおよびアナトキシ ン、特に破傷風アナトキシンを用いることができる。

ＬＨＲＨペプチドのカルボキシ末端画分をカルボジイミドでαグロブリンに結合 させたもの、またはその作動薬である（Ｄ−Ｌｙｓ’）〜ＬＨＲＨを５ＰＤＰで α−グロブリンに結合させたものに対するオスブタの免疫反応が優越であること が観察されているので、ＬＨＲＨのカルボキシ末端を有する有利なペプチドを用 いた抗ＬＨＲＨ免疫原性結合体を定義することができる。

すなわち、本発明の第２の好ましい具体例では、本出願人はＬＨＲＨの最後の８ アミノ酸を含む新規なペプチドすなわち以下の式で表されるデカペプチド： Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｎ　Ｈｚ を使用するのが有利であるということと、このペプチドは中性ＬＨＲＨのような ホルモン活性を示さずに高い免疫原性を有するということを見出した。

ミンおよびウマのα−グロブリン、待に■−Ｆおよび／またはＩＶ−４画分が好 ましい）とカップリングされた結合体にある。

本発明では、ＬＨＲＨ（３−１０）ペプチドを特にウマのα−グロブリンまたは オバルブミンに結合する試薬としてはグルタルアルデヒドおよびヘテロ三官能性 試薬よりもカルボジイミドを用いるのが好ましい。

結合体の好ましい調製方法では、ＬＨＲＨ（３−１０）とキャリアー蛋白、オバ ルブミンまたはα−グロブリンをそれぞれ２〜４０■／−の割合で０．１Ｍ塩化 ナトリウム１０．１Ｍ　２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸緩衝液に添 加する。次いで、同じ緩衝液で調製したＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミ ノプロピル）カルボジイミドの２．５％溶液を０．５〜２倍量添加する。ＩＮの 水酸化ナトリウムを用いてＰＨを調節する。攪拌後、混合物を一夜放置し、ゲル 浸透クロマトグラフィーで精製する。

このクロマトグラフィーによってカップリングしていないＬＨＲＨ（３−１０＞ と、残留カルボジイミドと、その加水分解生成物とが除去される。

本発明の他の対象は上記本発明方法で使用可能な主活性成分として上記の結合体 を含む新規なＬＨＲＨワクチンにある。

本発明のさらに他の対象は上記方法を用いた抗ＬＨＲＨ（３−−１０）受動免疫 法にある。

本発明のさらに他の対象は、１回目の接種で投与するワクチンさ、屠殺前に投与 するワクチンとを同数ずつ単一の包装中に収容した免疫セットにある。各ワクチ ンは、例えば上記フランス国特許に記載の経皮ジェット投与用に少量に濃縮した 状態で包装されているのが好ましい。

以下、本発明の複数の製品およびワクチン接種方法を比較した試験き、ＬＨＲＨ ペプチドのカルボキシ末端画分に対してオスブタの免疫反応が優越であることを 示す試験と、本発明でオスブタに抗ＬＨＲＨのワクチンを接種した試験とを用い て本発明をさらに詳細に説明する。

１、ＬＨＲＨ全体を用いた場合 Ａ、ＬＨＲＨペプチドの一番外側のカルボキシ末端を修正しない結合体が強い免 疫原性を示し、（Ｄ−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨ作動薬を使用した結合体よりも天 然型のＬＨＲＨをベースとした結合体を選択すべきことを示す実験 Ａ１．未去勢のオスブタおよびオスのラットＯＦへでの抗ＬＨＲＨ免疫 天然型のＬＨＲＨ（Ｂ１方よび８２）または（Ｄ　−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨ（ ＡＩおよびＡ２）とヒトアルブミンとの結合体で構成される２種類の抗ＬＨＲＨ ワクチンの活性を比較した。各結合体は水相および５ＰＤＰ中でカルボジイミド を用いて油中水型乳化剤に調製し、ブタには筋肉注射によって、ラットには皮下 注射によって投与した。結果は以下の通り： （１）天然型ＬＨＲＨをベースとしたワクチンの方が活性が高い。

免疫反応を示す個体の内、より多くの個体において、ＬＨＲＨペプチド結合体の 量は（Ｄ　−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨペプチド結合体の量よりも少ない（表１お よび３）。

（２）多くの固体の中で同一結合体による免疫反応を示す固体に投与の効果が見 られる。

Ａ１．１　５ＰＤＰを用いた（Ｄ−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨとアルブミンとの結 合体の調製。

（Ｄ−Ｌｙｓ’）−ＬＨＲＨとアルブミンとの結合体を、（Ｎ−［３−（２−ピ リジルジチオ）プロパノイル］−Ｄ−Ｌｙｓａ−ＬＨＲＨの調製と、Ｎ−（３− メルカプトプロパノイル）アルブミンの調製と、カブプリングとの３段階で調製 する。

（Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロパノイル］−Ｄ−Ｌｙｓ’）−ＬＨＲ Ｈは、水溶液中で過剰の５ＰＤＰとＬＨＲＨとを反応させて調製する（ＬＨＲＨ １モルに対して５ＰＤＰ６モル）。−夜４℃に置いた後、生成物を遠心分離する 。生成物を８Ｍの尿素に溶解し、溶液中の２−ピリジルジチオ基を検定する。

Ｎ−（３−メルカプトロバノイル）アルブミンは０．ＩＭのリン酸緩衝液１００ ｍ１ｉ！に溶解させた１ｇのヒトアルブミンに０．２１１１１１０１の５ＰＤＰ を作用させて調製する。４℃で一夜接触させた後、ジチオスレイトールで還元し てｐＨ６に酸性化する。その後、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、チ オールと蛋白を測定して平均置換度を知る。

チオール基１．２５に対して２−ピリジルジチオグループを１にしてカップリン グする。ｐＨを７〜７．５にし、１時間後に遊離の２−ピリジンチオンを測定し て、収率を決定する。

この値から平均置換度をめる。最後に、クロマトグラフィーで結合体を精製し、 限外濾過で濃縮する。

Ａ１．２　カルボジイミドを用いたＬＨＲＨ−アルブミン結合体の調製。

１０００■のＮ−エチル−Ｎ’　−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ イミドの塩酸塩を使用する直前に４０−の０．９％塩化ナトリウム溶液に溶解し 、これを３００■のＬＨＲＨと３００■のヒトアルブミンとを３にの０，９％塩 化ナトリウム溶液に溶解したものに添加する。攪拌後、混合物を遮光し、−夜室 温に放置する。その後、セファデックスＧ−５０ゲルを用いたクロマトグラフィ ーで結合体画分を回収し、必要に応じて濃縮・凍結する。

カップリングしていないＬＨＲＨを含む画分からカップリングしていないＬＨＲ Ｈの量、従って平均結合度をめる。この値は再現性があり、１００■のアルブミ ンに対してカップリングするＬＨＲＨは８〜１０■の範囲で変化する。

クロマトグラフィー前後の結合体のＵＶスペクトルからクロマトグラフィーでの 結合体の回収率、従って結合しているＬＨＲＨの量（濃度）をめる。

Ａ１．３　測定法 抗体の力価はシェフコート達の方法（ＪＥＦＰＣＯＡＴＢ　ａｔ　ａｌ、、　Ａ ｃｔａ。

Ｅｎｄｏｃｒ、　、　Ｃｏｐｅｎｈ、　、　１９７４．７５　：　６２５−６３ ５）に従って決定した。

テストステロンは放射化したテストステロンＣｌ９−カルボキシメチルエーテル ［”’　Ｉ］　ヒスタミンを用いたＲＩＡ法で血漿から直接測定した。

各種ペプチドの結合はコツホランド達の方法（ＣＯＰＰＯＬＡＮＤ　ｅｔａｔ、 、Ｅｎｄｏｃｒ、、１９７９　１０４　：　１５０４−１５０６＞）でヨウ素− １２５でラベルした後、シェフコート達の方法（ＪＥＦＦＣＯＡＴＥ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ａｃｔａ。

Ｅｎｄｏｃｒ、　、　Ｃｏｐｅｎｈ、、　１９７４．７５　：　６２５−６３５ ）で測定した。

ＡＩ。４　具体例 （１）ラットでの試験 表１：ヨウ素−１２５でラベルしたＬＨＲＨの固定度から測定した抗ＬＨＲＨ抗 体反応 表２：血漿デストステロン濃度に対する抗ＬＨＲＨ免疫の効果 投与量 ワクチンＡｌ　：　（Ｄ　−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨ結合体５０μｇワクチンＢ １：ＬＨＲＨ結合体　１２μｇした抗ＬＨＲＨ抗体反応 投与量 ワクチンＡｌ　：　（Ｄ−Ｌｙｓ’）−ＬＨＲＨ結合体０．５■ワクチンＡ２　 ：　（Ｄ−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨ結合体　６■ワクチンＢ１：ＬＨＲＨ結合体 　０．１５■ワクチンＢ２　：　ＬＨＲＨ結合体　１．２０■表１ ヨウ５−１２５でラベルしたＬＨＲＨの固定度から測定した抗ＬＨＲＨ抗体反応 ラットの血清中の抗体（％Ｂｏ／Ｔ）　（１／　１００）（ａ）　Ｄｌｙｓ’− Ｌ　ＨＲＨ／　ＨＳ　Ａ／　Ａ　Ｅ　１（ｂ）　ＬＨＲＨ／ＥＣＤ／Ｈ３Ａ／Ａ Ｅ１表２ 血漿テストステロン濃度に対する抗ＬＨＲＨ免疫の効果ラットの血漿テストステ ロンの測定（ＮＧ／ＭＬ）（ａ）　Ｄｌｙｓ’−Ｌ　ＨＲＨ／　Ｐ　Ｄ　Ｐ／　 ＨＳ　Ａ（ｂ）　ＬＨＲＨ／ＥＣＤ／Ｈ３Ａ Ａ２　ブタに筋肉注射（ＩＭ）または経皮投与（［Ｄ）したカルボジイミドで結 合させたＬＨＲＨ−α−グロブリン結合体と、５ＰＤＰで結合させ油中水型乳化 剤にした（Ｄ−ＬＹＳ’）−ＬＨＲＨ−α−グロブリン結合体とからなる２種類 のワクチンの比較 実施例ＡＩに記載の方法を繰り返すが、濃度１０■／艷のアルブミンを濃度６■ ／ｄのα−グロブリンに代える。

カップリングした（Ｄ−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨの最終収量は４５〜５０％であ る。

なお、ＭＰ−α−グロブリンの調製時に、５ＰＤＰおよび／またはα−グロブリ ンの濃度を変えて、α−グロブリンの置換度、従って結合レベルを任意に変える ことができる。

実施例Ａ１に記載の方法を繰り返すが、ヒトアルブミンをヒト−α−グロブリン に代える。結合度は１００■のヒト−α−アルブミンに対して２４〜２８■のＬ ＨＲＨが結合するレベルである。

Ａ２．３　カルボジイミドで結合させたＬＨＲＨ−α−グロブリンをベースとし たワクチンが２番目のものよりも効力が高いことを示す試験 効力は血漿テストステロンが完全に消失した個体数で表す（表４）。

表４ った。このことはアミノ末端のみを協議していることを示している。

最もよく観察された混合反応は抗ＬＨＲＨ血清よりも抗（Ｄ−Ｌｙｓ’）−ＬＨ ＲＨ血清でよりアミノ末端画分が認識されていることを示している。ＬＨＲＨ血 清ではアミン末端画分の４０％以上を認識を示した血清は５８検体中わずかに３ 検体であるが、抗（Ｄ　−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨ血清では１０検体中４検体で あった。

Ｂ　カルボジイミドを用いて調製したＬＨＲＨ−α−グロブリン結合体の免疫活 性は、グルタルアルデヒドを用いて調製した結合体の活性よりも高いことを示す 試験濃度１０■／ｄのグルタルアルデヒド溶液２．５ｄを、３０分かけて、１０ ■のＬＨＲＨおよび５０■のヒトα−グロブリン（セルヴｙ　（Ｓｅｒｖａ）社 製）をｐＨ７，５のＯ，１Ｍリン酸緩衝液５ｄに溶解したものに１滴ずつ添加す る。この際、１滴添加ごとに緩やかに攪拌する。混合物を２．５時間室温に放置 した後、２５■の亜硫酸ナトリウムを０．５ｍｌの水に溶解したものを添加して 反応を止する。結合体を、ｐｕ７．ｓの１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭＩ Ｊン酸緩衝液を用いて４℃で透析し、限外濾過で濃縮する。

８．２　等量のＬＨＲＨ結合体を用いて調製した抗ＬＨＲＨワクチンのブタでの 比較試験 効力は血漿テストステロンが完全に消失した個体数で示す。

（表７） 表７ り示す（表８）。

表８ ブタでの試験−筋肉内注射 り、ヒトα−グロブリンを用いた結合体に相当するウマのα−グロブリン、■− １画分を用した結合体の免疫活性実施例Ａ１に記載の方法を繰り返したがヒトア ルブミンをウマのα−グロブリンに代えた（ＴＶ−１画分）。

Ｄ、２　ヒトまたはウマのαグロブリンに結合させたＬＨＲＨの１２μｇを４週 間の間隔をおいて２回ラットに皮下投与しラットでの試験 の結合体を用いてブタに対して５個所に同じ量だけ経皮投与する試験を行った。

試験した乳剤は以下の通り： 油中水型の流動性乳剤（Ｂ） 本発明乳剤（表では製剤Ｃ） 抗原で希釈した市販の乳剤（Ｅ） 結合体で懸濁させた油相（Ｆ） 全ての製剤に対して最終的な抗体投与量は同じにした。

また、各乳剤はそれらの製剤に特有な通常の条件下で製造した。

上の品質を向上させるための抗ＬＨＲＨ受動免疫の効果表１１ 無処理の固体と、屠殺１６．１３．９ふよび５日前にウマの高度免疫抗（Ｄ　− Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨ血漿を３００ｄ投与した固体とにおける脂肪組織のアン ドロステノン濃度（有意差α＝０．２） Ｇ、カルボジイミドでα−グロブリンに結合させたＬＨＲＨを含む油中水型乳剤 （第１ワクチン）と、水酸化アルミニウムとサポニンのゲルからなる製剤（第２ ワクチン）との効力および許容値 これら２種のワクチンをＬＨＲＨ結合体の量が同じとなるように肥大成長期初期 と屠殺の１８〜２１日前とに公知の無針注射器（Ｐｉｇｊｅｔ）を用いて投与し た。

２回の試験を２段階で行った。第１．３′Ｊ６よび５群には第１段階で、軍２ｉ ３よび４群には第２段階で行った（表１２．１３）。

Ｇ、ｌ　ワクチン量が同じ場合には経皮投与の投与個所の増加とともに抗ＬＨＲ Ｈ免疫無効化の効力が大きくなることを表１２ ＮＤ：検出されず Ｇ、２　炎症性皮膚反応で判定した使用したワクチンの許容度炎症性皮膚反応は 投与後に動物に現れる丘疹（各投与部位に丘疹が生じる）の大きさによってＯ〜 ４で判定した。各群を以下の判定値で評価した（表１３）： 投与後第１週目の平均判定値（Ａｄ、　１）各ワクチンに対する屠殺時の平均判 定値（Ｓｌ）１ｇ４群のワクチンを用いた場合に最も許容度が良かった。

！胆 ２回の試験（第１試験；第１．３方よび５群、第２試験二第２および４群）で観 察された経皮投与の許容度抗ＬＨＲＨ免疫反応はシェフコート達（ＪＥＦＦＣＯ ＡＴＥ　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｃｔｏ、　［！ｎｄｏｃｒ、（Ｃｏｐｅｎｈ、）、　１９７４．７匠６２５− ６３５）の方法に従って抗体の力価をめた。

ラベルを受けたペプチドへの結合は、コツホランド達（（”０ＰＰＱＬＡＮＩ） ａｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１９７９．　１０４．１５０ ４−１５０６）の方法に従って各ペプチドをヨウ素−１２５でラベルし、血清中 のこれらぺブチドを前記シェフコーチ達の方法に従って測定した。

生物学的効果は、血漿内テストステロンおよび組織内アンドロステノンの減少度 または消失度によって測定した。

血漿内テストステロンの定量は放射化したＣ１９−カルボキシメチルエーテル− ［Ｉ２Ｓ■］ヒスタミン（ＦＵＲＵＹＡＭＡ　Ｓ、ｅｔ　ａｌ、。

組織内アンドロステノンの定量は放射化した５α−［３月アンドロステノンを用 いたＲＩＡ法によって、脂肪組織サンプルに対してクラウスの方法（ＣＬＡＵＳ 、　Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｐａｒｉｓ。

たＬＨＲＨペプチドまたは５ＰＤＰを用いたヒトのα−グロブリンに結合させた その作動薬（Ｄ−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨのカルボキシ末端画分に対するブタの 免疫反応の優越性この結合体は、２．５％のＮ−エチル−Ｎ“−（３−ジメチル アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を含む０．９％の塩化ナトリウム溶 液０．５〜２容積を２〜２０■／−の比率でαグロブリン／ＬＨＲＨ混合物を含 む０．９％の塩化す）　ＩＪウム溶液１容積に添加し、攪拌後、混合物を一夜放 置し、ゲル浸透クロマトグラフィーで精製して調製するのが好ましい。

Ｂ２．５ＰＤＰを用いた［　（Ｄ−Ｌｙｓ’）−ＬＨＲＨ］−ヒトα［（Ｄ　− Ｌｙｓ’）−ＬＨＲＨコーヒトα−グロブリン結合体の調製は以下の３段階で行 う＋　（Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロパノイル］　−Ｄ−Ｌｙｓ’） −ＬＨＲＨの調製、Ｎ−（３−メルカプトプロパノイル）−ヒトα−グロブリン の調製およびカップリング。

（Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロパノイル〕−Ｄ−Ｌｙｓ’）　−ＬＨ ＲＨは、過剰な５ＰＤＰとＬＨＲＨとを水溶液中で反応させ（Ｄ−Ｌｙｓ’　− Ｌ　ＨＲ８１ｍｏ＋に対して５ＰＤＰを６ｍｏｌ）、次いで一夜４℃に放置した 後、遠心分離して生成物を得る。それを８Ｍの尿素に溶かし、溶液中の２−ピリ ジルジチオ基を検定する。

Ｎ−（３−メルカプトプロパノイル）−ヒトα−グロブリンは、１００献の０． １Ｍ　ＩＪン酸緩衝液に溶解した０、６ｇのヒトα−グロブリンに０．２ｍｍ０ １の５ＰＤＰを反応させ、４℃で一皮接触させた後、ジチオスレイトールと反応 させてｐＨ６に酸性化し、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製する。チオールお よび蛋白の収率を検定し、平均置換度をめる。

カップリングはチオールグループ１，２５に対して２−ピリジルジチオグループ を１にして行う。ｐＨを７〜７．５にし、１時間後に遊離した２−ピリジンニチ オンを定量して収率をめる。

この値から平均置換度をめる。最後に、結合体をクロマトグラフィーで精製し、 限外濾過で濃縮する。カップリング後の（Ｄ−Ｌｙｓ’）　−ＬＨＲＨの最終的 な収率は４５〜５０％程度になる。

Ｂ３．ＡＩおよびＡ２に記載の条件下で結合させたＬＨＲＨペプチドのカルボキ シ末端画分に対するオスブタでの免疫反応の優越性を抗ＬＨＲＨおよび抗（Ｄ　 −Ｌｙｓ’）　−Ｌ　ＨＲＨ血清による２種類のラベルされたＬＨＲＨ断片の固 定度を比較して決定する方法 上記２種類の断片としてＬＨＲＨ（３−１０＞（アミノ末端部位を削除したＬＨ ＲＨ）と、遊ｔｓ＃ノ形ノＬＨＲＨ（１−１０）　（Ｌ　ＨＲＨのカルボキシ末 端部位のアミド部位を削除したもの）とを用いる。これらの断片はそれぞれカル ボキシ末端画分およびアミノ末端画分を特に認識する。

ペプチドのカルボキシ末端画分に対する反応はいずれの結合体で免疫した固体に 対しても全て共通である（６８／６８）。（Ｄ−Ｌｙｓａ　−ＬＨＲＨ結合体で 免疫した１０固体から得た１０血清の中の３つと、ＬＨＲＨ結合体で免疫した６ ８血清の中の１０つとがカルボキシ末端画分のみに結合した。その他の固体では カルボキシ末端画分に向う傾向の強い混合反応を示した。

アミノ末端画分に対する反応は全体に共通ではない（５５／６８）。

ＬＨＲＨの遊離酸両分のみに結合した血清はなかった。

Ｃ，カルボジイミドで調製したＬ　ＨＲＨ（３−１０）−ウマα−グロブリンＩ ’Ｖ−４とＬ　ＨＲＨ（３−１０）オバルブミン結合体を用いた抗ＬＨＲＨ能動 免疫試験 ８５■のＬ　ＨＲＨ（３−１０＞と、　１７０■のウマα−グロブリンＩＶ−４ とを０．１Ｍ塩化ナトリウム１０．１Ｍ　２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスル ホン酸緩衝液１２．８艷に溶解する。上記溶液１７ｍｆ！に溶解した２１２■の Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を添 加する。直後にＩＮの水酸化ナトリウムを１．３ｄ添加してＰＨを６．０に調節 する。

攪拌後、混合物を室温に１６時間放置し、結合体をゲル浸透クロマトグラフィー で精製して結合体を非結合ＬＨＲＨから分離する。後者の量を測定し、その差か らカップリングしたＬ　ＨＲＨの量をめる。

ＬＨＲＨ（３−１０）６０■と、オバルブミン１２０■とを０．１Ｍ塩化ナトリ ウム／　０．１Ｍ　２−　（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸緩衝液９ｉに 溶解する。同じ緩衝液１２１ｍ１に溶解した１５０■のＮ−エチル−Ｎ’−（３ −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を添加する。ＩＮの水酸化ナ トリウム（約１．９−）を添加してＰＨを７．０に調節する。混合物を室温に一 夜放置し、遠心分離で清澄化する。上清をセファデックスゲルを用いてクロマト グラフィーにかけて未反応のＬＨＲＨと最初のカルボジイミド由来の生成物とか ら結合体を分離する。結合していないＬＨＲＨ（３−１０）を測定することによ ってＬ　ＨＲＨ（３−１０）のカップリング収率がめられる。

Ｃ３，カルボジイミドを用いたＬ　ＨＲＨ（３−１０）断片とウマのα−グロブ リンＩＶ−４との結合体から調製した抗ＬＨＲＨワクチンに対する免疫反応、生 物学的効力、許容度Ｌ　ＨＲＨ（３−１０）の結合体を油中水型乳剤に添加した 製剤（第１ワクチン）と、水酸化アルミニウムとサポニンのゲルに添加した製剤 （第２ワクチン）とを投与量を０．４ｍｆにして６頭のオスブタにそれぞれ肥大 成長期初期および層殺の１７日前に経皮投与した。投与は公知の無針注射器（ビ ッグジェット）を用いて行った。投与は０．２ｄずつ２回に分けて１回の投与を ５箇所に分けて投与した。

免疫反応は２度目のワクチン接種の１０日後に最大となる。個々の抗体力価（ヨ ウ素−１２５が５０％結合を示す希釈度の逆数）はそれぞれ以下の通り； １０日後　２８０　６６０　２．７００　３．２００　４．６００　１３．００ ０１６日後　２９０　４００　２．０００　２．４００　３．１００　８．６０ ０この免疫反応から、６頭の固体全部で２回目の投与から１００回目ら血漿テス トステロンが無くなるという生物学的効果が得られることが分る。テストステロ ンが消失するとともに、組織内アンドステノンも同様に消失する。

ワクチンに対する許容度は炎症性皮膚反応で判定する。すなわち、投与後にワク チンを打った位置に現れる丘疹の寸法で段階を付けて評価する。この局部的な炎 症反応は２度目のワクチン投与後１０回目に完全に消える。

要約書 去勢していないオスの家畜の肉の感覚上の品質、特に臭い、味および柔らかさを 改善するために、動物を層殺する少し前に抗ＬＨＲＨ能動免疫または受動免疫す ることによって性ホルモンまたは非性ホルモンのステロイドの活性を実質的に抑 制すると同時に屠殺時まで雄性に起因する利点を実質的に維持する方法。使用す るワクチンは天然のＬＨＲＨまたはＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ 〜＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｎ　Ｈｚ構造を有するペプチドに免疫原性キャリア ー蛋白をカップリングさせたもの。

国際調査報告 ｌ１１１ｍ＋＃７〜−−Ｉ’ｍ　”−ＰＣＴ／ＦＲ９２１００１７６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．去勢していないオスの家畜の肉の感覚上の品質、特に臭い、味および柔らか さを改善するために、動物を屠殺する少し前に抗しＨＲＨ能動免疫または受動免 疫することによって性ホルモンまたは非性ホルモンのステロイドの活性を実質的 に抑制すると同時に屠殺時まで雄性に起因する利点を実質的に維持する方法。 ２．最初に抗しＨＲＨワクチンを投与し、動物を屠殺する少し前に再度抗ＬＨＲ Ｈワクチンを投与する請求項１に記載の方法。 ３．最初に、生殖腺ステロイドの分泌にほとんど影響を与えないか、測定不可能 な影響しかを与えないような弱い免疫反応を起すワクチンを投与し、屠殺前には 、肉の品質または外観を損なうような局所反応または全体反応を引き起こさずに ステロイドの分泌を停止または大幅に低下させるワクチンを投与する請求項２に 記載の方法。 ４．一回目に投与する抗しＨＲＨワクチンを、動物の肥大成長期の初期に投与す る請求項２または３に記載の方法。 ５．一回目に投与するワクチンが乳剤状のワクチンである請求項２〜４のいずれ か一項に記載の方法。 ６．ブタに対して屠殺前に水性アジュバントと共に抗しＨＲＨワクチンを投与す る請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。 ７．水性アジュバントとして水酸化アルミニウムゲルおよび／またはサポニンを 使用する請求項６に記載の方法。 ８．屠殺の１５〜２１日前に水性アジュバントと共にワクチンを投与する請求項 ６あるいは７に記載の方法。 ９．牛および羊に対して屠殺前に乳剤状でアジュバントと共に抗しＨＲＨワクチ ンを投与する請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。 １０．屠殺の１〜２か月前に乳剤状のワクチンを投与する請求項９に記載の方法 。 １１．１回目の投与の４週間から数ヶ月後に乳剤状のワクチンを投与する請求項 ９または１０に記載の方法。 １２．乳剤状のワクチンが油中水型乳剤状である請求項４および９〜１１のいず れか一項に記載の方法。 １３．油中水型乳剤が高純度の鉱物油と非イオン性の表面活性剤との混合物で作 られている請求項１２に記載の方法。 １４．下記の群の中から選択される免疫原性キャリアー蛋白：（１）ウシまたは ヒトの血清アルブミン（２）チログロブリン （３）オバルブミン （４）アナトキシン、特に破傷風アナトキシン（５）ヒトまたはウマグロブリン とカップリングさせた下記： （ａ）ＬＨＲＨ全体または変性したＬＨＲＨ（ｂ）未変性または変性したＬＨＲ Ｈペプチド断片または（ｃ）ＬＨＲＨ作動薬 で構成される抗しＨＲＨ免疫結合体を投与する請求項４および９〜１１のいずれ か一項に記載の方法。 １５．抗しＨＲＨ免疫結合体がウマのα−グロブリン、特にＩＶ−１および／ま たはＩＶ−４画分とカップリングさせたＬＨＲＨで構成される請求項１４に記載 の方法。 １６．抗しＨＲＨ免疫結合体がウマのα−グロブリン、得にＩＶ−１および／ま たはＩＶ−４画分またはオバルプミンとカップリングさせたＬＨＲＨ（３−４０ ）で構成される請求項１４に記載の方法。 １７．ＬＨＲＨ／ＬＨＲＨ（３−１０）と免疫原性キャリアー蛋白とがカルボジ イミドでカップリングされている請求項１５または１６に記載の方法。 １８．屠殺の数日前に高度免疫抗ＬＨＲＨ血清または血漿を動物に投与する請求 項１に記載の方法。 １９．屠殺の数日前に抗しＨＲＨモノクロナル抗体を動物に投与する請求項１に 記載の方法。 ２０．屠殺の５〜１５日前に皮下注射または筋肉内注射によって投与する請求項 １８または１９に記載の方法。 ２１．無針の注射器を用いた加圧ジェットによって好ましくは数個所に経皮投与 する請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。 ２２．下記のペプチド： 【配列があります】 ２３．請求項２２に記載のペプチドを免疫原性キャリアー蛋白に結合させたもの より成る結合体。 ２４．免疫原性キャリアー蛋白がオバルブミン、ウマおよびヒトのグロブリン、 チログロブリン、アナトキシン、特に破傷風アナトキシン、ヒトまたはウマの血 清アルブミンよりなる群の中から選択する請求項２３に記載の結合体。 ２５．グロブリン群の免疫原性キャリアー蛋白がウマα−グロブリン、特にＩＶ −１および／またはＩＶ−４画分である請求項２４に記載の結合体。 ２６．ペプチドと免疫原性キャリアー蛋白とがカルボジイミドでカップリングさ れている請求項２３〜２５に記載の結合体。 ２７．主活性成分としてα−グロブリン−ＬＨＲＨ結合体または請求項２３〜２ ６のいずれか一項に記載の結合体よりなる、生殖腺ステロイドの分泌にほとんど 影響を与えないか、測定不可能な影響しかを与えない弱い免疫反応を起す抗ＬＨ ＲＨワクチン。 ２８．主活性成分としてα−グロブリン−ＬＨＲＨ結合体または請求項２３〜２ ６のいずれか一項に記載の結合体よりなる、肉の品質または外観を損なうような 局所反応または全体反応を起こさずにステロイドの分泌を大幅に低下させる抗Ｌ ＨＲＨワクチン。 ２９．油中水型乳剤の形をした請求項２７または２８に記載の抗ＬＨＲＨワクチ ン。 ３０．乳剤が高純度の鉱物油と非イオン性表直活性剤との混合物より成る請求項 ２９に記載の抗ＬＨＲＨワクチン。 ３１．水性アジュバントとして作られた請求項２７または２８に記載の抗ＬＨＲ Ｈワクチン。 ３２．水酸化アルミニウムゲルおよび／またはサポニンを含む請求抗ＬＨＲＨ３ １に記載の抗ＬＨＲＨワクチン。 ３３．請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の１回目の接種で投与するワクチ ンおよび屠殺前に投与するワクチンが同数だけ単一の包装中収容されている抗Ｌ ＨＲＨワクチン接種セット。