PT501882E

PT501882E - Processo de imunoneutralizacao anti-lhrm de animais domesticos machos nao castrados e peptido para esse fim

Info

Publication number: PT501882E
Application number: PT92400496T
Authority: PT
Inventors: Raymond Dufour; Claude Roulet; Claire Chouvet; Michel Bernard Bonneau
Original assignee: Merial Sas
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-02-26
Publication date: 2000-12-29
Also published as: CZ328092A3; DK0501882T3; TW221674B; ATE194625T1; IE920648A1; SK328092A3; CZ287775B6; SK282056B6; HU9203419D0; KR100257214B1; EP0501882A3; UA40570C2; CA2081660A1; DE69231232D1; JP3177246B2; EP0501882A2; GR3034509T3; PL296623A1; WO1992015330A1; JPH05506459A

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO DE IMUNONEUTRALIZAÇÃO ANTI-LHRM DE ANIMAIS DOMÉSTICOS MACHOS NÃO CASTRADOS E PÉPTIDO PARA ESSE FIM" O presente invento refere-se a um processo de produção de carne de suíno, bovino, ovino, apresentando qualidades organolépticas, em particular o odor, o sabor e a maciez, melhoradas, a partir de animais domésticos machos não castrados. 0 invento refere-se também a um conjunto de vacinação e relacionados.

As vantagens da utilização do macho inteiro em relação ao macho castrado na engorda dos animais domésticos destinados à produção de carne têm sido sublinhadas desde há várias décadas pelos zootécnicos. Elas compreendem uma taxa de crescimento mais elevada, sobretudo nos bovinos e nos ovinos, uma melhor utilização da ração alimentar e uma carcaça mais magra mas mais provida de massa muscular em todas as espécies domésticas (S.C. SEIDEMAN et al. J., of Animal Science, 1982, 55 (4) 826-840 et M. BONNEAU, INRA Prod. Anim., 1988, 1 (2) 133-140).

Os principais inconvenientes desta utilização do macho inteiro, relatados nas publicações acima citadas, relacionam-se com o odor e o sabor desagradáveis nos suínos e ovinos machos, a menor maciez da carne dos machos bovinos e ovinos inteiros e justificam as práticas actuais de castração cirúrgica.

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Com efeito, se os esteróides androgénios entre os quais o androstenediol, a androstenediona e a testosterona são os elementos determinantes das vantagens esperadas em todas as espécies domésticas para um crescimento mais rápido e uma melhor utilização da ração alimentar, são no entanto responsáveis por uma menor maciez da carne dos machos bovinos e ovinos inteiros. Os esteróides não androgénios ou os derivados dos 16-androsténios como a 5a-androstenona (5a-16-androsten-3-ona), no porco macho, são responsáveis em parte pelo odor e pelo sabor desagradáveis da carne de um certo número de suínos machos inteiros desde a puberdade, os quais desvalorizam a carne e são um obstáculo à sua comercialização no estado fresco. O escatole, produto derivado do triptofano e produzido pela flora microbiana intestinal, é um composto responsável em parte pelo odor e pelo sabor desagradáveis da carne de porco macho inteiro. A sua produção depende de factores ambientais, da nutrição, da raça. A sua acumulação no tecido adiposo é mais importante no varrasco e estará ligada às secreções de esteróides sexuais das gónadas.

A título experimental, foi já testada a diminuição ou a supressão do desenvolvimento do carácter masculino no animal jovem ou da secreção de hormonas testiculares, particularmente dos esteróides testiculares, através de imunoneutralização activa ou passiva contra estes ou contra as hormonas intervenientes na sua secreção, particularmente a hormona luteinisante ou LH (Luteinizing Hormone) e a hormona gonadoliberina (GnRH) também designada por Luteinizing Hormone Releasing Hormone (LHRH) (hormona libertadora da hormona luteinizante (HLHL)). Os ensaios foram conduzidos em porco para reduzir a taxa tecidular da 5a—androstenona, do grupo dos 16-androsténios, através da imunização activa dirigida contra este composto (E.D. WILLIAMSON -3- et al., Liverstock Production Science, 1985, 12, 251-264) ou através da imunização passiva contra este mesmo composto (R. CLAUS, Immunization with Hormones in Reproduction Research, ed. Nieschlag, 1975). A supressão ou a diminuição da secreção dos esteróides testiculares pode ser alcançada através da imunoneutralização da hormona gonadotrófíca LH, específica da espécie considerada (R.E. FALVO et al., J. Anim. Science, 1986, 63, 986-994) ou pela imunoneutralização anti-LHRH da LHRH endógena. Somente a imunização activa anti-LHRH foi recomendada por diferentes autores. No porco, a redução de α-androstenona foi obtida através deste método (A. CARATY et M. BONNEAU, C.R. Acad. Sei. Paris 1986, 303, Série III (16) 673-676; R.E. FALVO et al., J. Anim. Sei., 1986, 63, 986-994).

Em carneiro, B.D. SCHANBACHER (Am. J. Physiol., 1982, 242, E201-E205) recomenda a imunização anti-LHRH para retardar o desenvolvimento testicular e produzir um efeito de castração em cordeiros machos. Em bovinos, P.S. ROBERTSON (Vet. Rec., 1979, 105, 516-517) descreve uma castração imunológica anti-LHRH.

Os ensaios de imunoneutralização anti-LHRH descritos para animais de laboratório (ARIMURA et al. Endocrinology, 1973, 93, 1092-1103; FRASER H.M. et al, J. Endocr. 1974, 63, 399-406; MAKINO T. et al. Contraception, 1973, 8 (2), 133-145; CARELLI C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1982, 79, 5392-5395) e para várias espécies domésticas (JEFFCOATE et ai, Theriogenology, 1978, 10(4), 323-335; ROBERTSON I.S. et al., Veterinary Record., 1979, 105, 556; SCHANBACHER B.D. Am. J. Physiol., 1982, 242, E201-E205) mostraram que é possível obter a paragem da secreção da testosterona, a involução ponderada dos testículos e das suas glândulas anexas, a paragem da espermatogénese e, a nível do comportamento, o desaparecimento da libido. -4-

Estes trabalhos conduziram a que se sugerisse o recurso a uma imunoneutralização, nomeadamente anti-LHRH, precoce para substituir a tradicional castração cirúrgica para fins de criação de gado.

Na patente US n° 4556555, está assim descrito um método de imunização passiva de animais antes da puberdade, com o auxílio de um anti-soro í contendo anticorpos dirigidos contra a gonadotrofina. O pedido de patente internacional WO 90/11298 descreve um processo de imunização anti-LHRH à nascença com o auxílio de 2 sequências de LHRH em cadeia ligadas a uma proteína transportadora, para melhorar a qualidade da carne de porco. O pedido de patente internacional WO 88/00056 descreve um método de castração imunológica anti-LHRH destinado a melhorar o comportamento social e sexual dos animais machos em substituição da castração cirúrgica que afecta a taxa de crescimento. Os touros são vacinados com a idade de 8 a 40 semanas e recebem em seguida vários reforços.

Uma vacina anti-LHRH vendida sob a marca VAXSTRATE pela sociedade australiana WEBSTERS é utilizada em vacas. R.E. Falvo et al. (J. Anim. Sei. 1986, 63: 986-994) imunizaram vários grupos de varrascos com o auxílio de conjugados LHRH-globulina do soro humano em adjuvante completo de Freund ou com o muramilpéptido como adjuvante. Os autores observaram, após vacinação e vários reforços, títulos elevados de anticorpos anti-LHRH, mas com a necessidade de praticar reforços repetidos para manter o título elevado em anticorpos. -5-

I.S. Robertson descreve um método de imunização com LHRH conjugada à anatoxina tetânica ou à tiroglobulina e sugere que a abordagem imunológica permitiria uma castração tardia com as vantagens que se podem esperar a nível do crescimento ponderado. Ele conclui no entanto que há ainda que fazer esforços para chegar a um método de castração utilizável na prática, que serão ao nível do próprio método ou do adjuvante, o adjuvante de Freund tem sido proscrito na prática.

Por fim, A. Caraty e M. Bonneau (C.R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, n°16, 1986) praticaram uma imunização anti-LHRH em porcos machos. Os autores sugerem que o bloqueio da produção de esteróides, 2 a 3 semanas antes do abate, permite explorar as potencialidades elevadas deste tipo de animal para a produção de carne evitando-se os problemas colocados pela acumulação de androsterona nos tecidos adiposos. Eles concluem todavia que se podem ainda alcançar progressos importantes nas técnicas de imunização antes que deixe de ser possível propor a imunização activa anti-LHRH como técnica utilizável na criação de suínos.

Por outro lado, a imunoneutralização tardia coloca na prática o problema importante da inocuidade do tratamento e nomeadamente das reacções locais desencadeadas pelas vacinas, em particular das vacinas oleosas, com os riscos de rejeição ou de desqualificação da carne daí resultantes. O melhoramento das qualidades organolépticas em bovinos e em ovinos não foi sugerido. O requerente encontrou precisamente um processo aplicável industrialmente permitindo melhorar as propriedades organolépticas da carne dos

-6- animais. O presente invento tem assim por objecto um processo de produção de carne de suíno, bovino, ovino apresentando qualidades organolépticas, em particular o odor, o sabor e a maciez, melhoradas, no qual se faz a engorda dos animais domésticos machos não castrados, se efectua nos animais uma imunoneutralização activa com o auxílio de uma vacina anti-LHRH, caracterizado por manter as vantagens ligadas ao caracter masculino dos animais praticamente até ao seu abate devido ao facto de que, antes ou durante o período de engorda dos animais, lhes é administrada uma vez uma vacina anti-LHRH concebida para induzir uma primeira resposta imunitária de fraca intensidade, sem efeito notável, ou mesmo mensurável, na secreção de esteróides das gónadas e que, somente pouco antes do abate, lhes é administrada uma vacina anti-LHRH para induzir uma imunoneutralização anti-LHRH que produz a supressão ou a redução significativa da secreção dos esteróides. A vacina administrada em primeiro lugar e a vacina administrada pouco antes do abate são escolhidas de entre as vacinas em emulsão e as vacinas em adjuvante aquoso.

De acordo com um primeiro modo de concretização preferido deste processo, administra-se ao animal uma vacina anti-LHRH, de preferência em emulsão, de preferência durante ou antes da fase de engorda do animal, em seguida, pouco antes do abate do animal, administra-se de novo uma vacina anti-LHRH. Pode-se proceder em duas administrações distintas ou através de um processo de libertação controlada.

No porco, é particularmente vantajoso administrar, antes do abate, a vacina anti-LHRH com um adjuvante de tipo aquoso, nomeadamente gel de hidróxido de alumínio e/ou saponina.

Esta administração é efectuada de preferência 15 a 21 dias antes do abate.

Ao contrário, em bovino, e eventualmente em ovino, a administração precedente ao abate é feita de preferência com um adjuvante em emulsão, e de preferência 1 a 2 meses antes do abate. Esta administração é efectuada de preferência pelo menos 4 semanas, e de preferência vários meses, após a primeira administração.

Em todos os casos, prefere-se, para a vacina em emulsão, destinada à primeira administração e, em bovinos, à segunda administração, que a vacina se apresente sob a forma de emulsão água-em-óleo. No entanto, outras formas de emulsão são de considerar.

Esta vacina, de preferência do tipo em emulsão, foi concebida, de acordo com o invento, para a indução de uma primeira resposta imunitária de fraca intensidade, sem efeito notável, ou mesmo mensurável, na secreção de esteróides das gónadas. A formulação em emulsão é preferível, mas as outras formulações são utilizáveis desde que produzam este mesmo efeito. A administração que precede o abate é feita com uma vacina formulada para produzir neste momento a supressão ou a redução significativa da secreção dos esteróides sem reacção local ou geral adversa, susceptível de prejudicar a aparência ou a qualidade da carne.

No modo preferido particularmente para o porco, o conjugado, em solução aquosa, é empregue nas duas formulações seguintes: a primeira em emulsão água-em-óleo, estável, feita de uma mistura de óleos minerais animais ou vegetais altamente purificados e de tensioactivos não iónicos para a indução

-8- de uma resposta imunitária de fraca intensidade, sem efeito mensurável na secreção dos esteróides das gónadas, a segunda, não emulsionada, com gel de hidróxido de alumínio e saponina, desencadeia uma reacção imunitária rápida e intensa traduzindo-se na produção de anticorpos anti-LHRH neutralizantes, suficientes para conduzir à diminuição ou à supressão dos esteróides das gónadas e à diminuição do transporte associado de escatole de origem intestinal. A emulsão utilizada é, diferentemente daquela que é obtida com o auxílio do adjuvante completo ou incompleto de Freund, uma emulsão estável permitindo preparar uma vacina pronta a ser empregue. A reacção inflamatória cutânea é muito fraca e localizada nos pontos de administração de duas formulações vacinais e traduz-se na forma de pápulas bem circunscritas no exame externo. O seu desenvolvimento interno fica limitado à derme superficial. Ela desaparece sem deixar granuloma aparente no momento do abate dos animais.

De acordo com um outro modo de concretização deste processo, administra-se ao animal, alguns dias antes do abate, nomeadamente 5 a 15 dias antes, soro ou plasma hiperimune anti-LHRH ou ainda anticorpos monoclonais anti-LHRH. A imunização passiva anti-LHRH conduzindo à diminuição até à supressão da secreção dos esteróides androgénios e não androgénios foi obtida através da administração intramuscular de plasma hiperimune equino. Trazendo a um nível suficiente, medido pelo título em anticorpos LHRH do soro de um animal recipiente, ela conduz à diminuição da testosterona plasmática a partir do terceiro dia; mantida neste mesmo nível os 12 dias seguintes, ela é suficiente para conduzir à redução da androsterona tecidular abaixo de 0,50 micrograma/g, valor para o qual o odor desagradável e o sabor particular da carne de porco macho já não serão sentidos pelo consumidor. Este método de imunização passiva -9- demonstrou que a manutenção durante 12 dias da diminuição significativa da testosterona é suficiente para baixar a concentração de androsterona tecidular abaixo do limite fixado. Esta imunização passiva pode ser realizada através do emprego de anticorpos monoclonais anti-LHRH segregados pelos hibridomas ou hetero-hibridomas suínos. O modo de administração destas formulações é de preferência transcutâneo, particularmente com o auxílio de um aparelho de injecção sem agulha, por jacto sob pressão, particularmente de acordo com o pedido de patente FR-A-2652257. O processo de acordo com o invento apresenta a vantagem importante de apresentar uma perfeita inocuidade, particularmente de não induzir as reacções locais susceptíveis de conduzirem à desqualificação da carne. A reacção inflamatória cutânea fica localizada nos pontos de administração das duas formulações vacinais e traduz-se sob a forma de pápulas bem circunscritas no exame externo. O seu desenvolvimento interno fica limitado à derme superficial. Ela desaparece sem deixar granuloma aparente no momento do abate dos animais. A reacção inflamatória, limitada no tempo e aos pontos de administração, traduz a tolerância às duas formulações vacinais e é obtida pela administração transcutânea destas, efectuada com o auxílio de um injector sem agulha. A imunização anti-LHRH necessita de conjugar o péptido LHRH ou um fragmento do péptido LHRH, não imunogénio nas condições económicas do seu emprego, a uma proteína imunogénio, dita transportadora, através de uma ligação covalente. - 10- A LHRH ou GnRH, quer seja natural ou de síntese, é composta de 10 aminoácidos, numerados de 1 a 10 desde a extremidade amino-terminal à extremidade carboxi-terminal segundo a fórmula seguinte: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly NH2 1 23456789 10

Estes símbolos, por convenção, representam: pGlu, ácido piroglutâmico; His, histidina; Trp, triptofano; Ser, serina; Tyr, tirosina; Gly, glicina; Leu, leucina; Arg, arginina; Pro, prolina.

Os conjugados imunogénios anti-LHRH, descritos pelos diferentes autores podem ser concretizados no que diz respeito ao hapteno com: a) a LHRH total ou modificada em uma ou várias das suas partes para obter a conjugação amino-terminal, carboxi-terminal ou intermediária desejada, b) com um dos seus fragmentos peptídicos compostos por 5 a 7 aminoácidos modificados ou não, para obter a conjugação amino-terminal, carboxi-terminal ou intermediária desejada, c) com um agonista possuindo um aminoácido substituído, o mais vulgarmente em 6, para obter uma conjugação intermediária.

No que respeita à proteína transportadora, a albumina do soro bovino, a albumina do soro humano, a tiroglobulina, a ovalbumina, as globulinas humana ou equina têm sido utilizadas.

Assim, o pedido de patente europeia EP-A-181236 descreve - 11 - conjugados imunogénios compreendendo um nonapéptido ou um decapéptido incluindo uma sequência, correspondente aos últimos 8 aminoácidos da molécula LHRH, à qual é adicionada uma lisina ou uma sequência cisteína-lisina no lado amino-terminal.

Por outro lado, o pedido de patente WO 88/05308 divulga conjugados constituídos com o auxílio de fragmentos de 5, 6 ou 7 aminoácidos contíguos da molécula natural, nos quais cada fragmento inclui o ácido piroglutâmico N-terminal ou a glicinamida carboxi-terminal e aos quais se podem juntar um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos adicionais na extremidade ligada à proteína imunogénio.

Os agentes de conjugação utilizados podem ser classificados em três grandes categorias: os agentes de activação, os agentes homo-bifuncionais, os agentes hetero-bifuncionais. Enquanto que, para os agentes de activação, a ligação entre as duas moléculas se faz entre duas funções já presentes, para os outros, a ligação faz-se por intermédio de um resíduo hidrocarbonado denominado de ligando.

Entre os agentes de activação, pode-se citar o ácido periódico empregue para oxidar os resíduos oligossacarídicos das glicoproteínas em aldeídos, sobre os quais reagirão posteriormente os grupos amina da outra molécula que entra no conjugado.

As carbodi-imidas são agentes de activação largamente empregues para a ligação de antigénios às proteínas e, entre eles, o mais utilizado é sem dúvida o cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC) que permite efectuar a reacção em meio aquoso. A sua acção conduz à formação de uma ligação amida entre um grupo carboxilo de uma proteína, activado por um

- 12- intermediário na forma de um O-alcoil-isourado, e um grupo amina da outra molécula. A sua vantagem reside na sua simplicidade de utilização.

Os agentes homo-bifuncionais são moléculas que possuem dois grupos reactivos idênticos separados por uma cadeia hidrocarbonada. Entre eles, cita-se o glutaraldeído, que reage sobre dois grupos amina primários, os bis-isotiocianatos de alquilo ou de arilo, que reagem sobre as aminas primárias e os tióis, a benzidina bisdiazotada, que se ligam aos resíduos aromáticos da tirosina. Menciona-se para recordação as bismaleimidas e os bis-amidinados. O inconveniente principal dos agentes homo-bifuncionais é de dominarem mal a natureza dos conjugados formados visto que os seus agentes podem reagir sobre duas moléculas da mesma natureza e conduzirem à formação de oligómeros ou de polímeros.

Para o impedir, os químicos introduziram os agentes heterobifun-cionais, nos quais os dois grupos têm especificidades diferentes. Em geral, um destes grupos é um éster de N-hidroxisuccinimida que, em condições suaves, reage sobre grupos amina livres das proteínas para dar por um lado a N-hidroxisuccinimida e por outro lado a proteína que possui através de uma ligação covalente amida o agente de ligação no qual se encontra a 2a função. De um modo geral, este pode reagir sobre tióis trazidos pela molécula a ligar, estes tióis que tinham estado inicialmente presentes na molécula sob a forma de resíduos de cisteína (estes podem ser constitutivos ou, no caso dos péptidos, introduzidos intencionalmente no momento da síntese), são transportados pelos agentes tais como o 2-iminotiolano ou o N-((2-piridil)3-ditiopropanoiloxi)succinimida (SPDP), após redução.

Entre as possibilidades enunciadas acima, preferiu-se utilizar a LHRH total. Neste caso, a LHRH natural é preferida em relação aos agonistas - 13 -

tais como a (D-Lys6)-LHRH por comparação da actividade imunogénica dos conjugados preparados com estes dois péptidos. A carbodi-imida é preferida ao glutaraldeído como agente de conjugação da LHRH de forma natural com a alfa-globulina. A alfa-globulina humana ou equina, fracção IV-1 ou IV-4, é preferida à albumina do soro humano ou de bovino.

De preferência, as vacinas compreendem um mesmo principio activo, compreendendo preferencialmente um conjugado alfa-globulina-LHRH; a LHRH está de preferência sob a forma natural e a alfa-globulina de origem humana ou equina, particularmente as fracções IV-1 e/ou IV-4. O conjugado é de preferência obtido através da adição sobre 1 volume de mistura alfa-globulina e LHRH em solução de 2 a 20 mg/ml em NaCl 0,9% de 0,5 a 2 volumes de solução de cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC) em solução de 2,5% em NaCl 0,9%. Após agitação, a mistura é deixada uma noite, em seguida purificada através de cromatografia de filtração em gel.

No que respeita à proteína transportadora, podem-se utilizar as albuminas do soro, nomeadamente de bovino ou humano, a tiroglobulina, a ovalbumina, as globulinas humana ou equina, as anatoxinas, nomeadamente a anatoxina tetânica. A predominância da resposta imunitária dos porcos machos à fracção carboxi-terminal do péptido LHRH conjugado através da carbodi-imida ou do seu agonista (D-Lys6)-LHRH conjugado através de SPDP com a alfa-globulina foi observada conduzir à definição de um conjugado imunogénio anti-LHRH utilizando um péptido vantajoso apresentando a extremidade carboxi-terminal da LHRH. - 14- O requerente verificou que era muito vantajoso utilizar-se um conjugado de um péptido compreendendo os 8 últimos aminoácidos da LHRH, ou seja um decapéptido de fórmula:

Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly NH2 3 4 5 6 7 8 9 10 que possui uma grande actividade imunogénica sem apresentar a actividade hormonal da LHRH natural. O invento prevê portanto a utilização de conjugados incorporando este péptido (3-10) ligado a uma proteína transportadora imunogénica entre aquelas citadas acima, a ovalbumina e a alfa-globulina equina, particularmente as fracções IV-1 e/ou IV-4, têm sido as preferidas.

No invento, a carbodi-imida é preferida ao glutaraldeído e aos agentes heterobifuncionais como agente de conjugação do péptido LHRH (3-10) particularmente com a alfa-globulina equina ou a ovalbumina.

Na preparação preferida de conjugado, a LHRH (3-10) e a proteína transportadora, ovalbumina ou alfa-globulina, são colocadas em solução na razão de 2 a 40 mg por ml cada uma no tampão NaCl 0,1M - ácido (N-2-etanomorfolino) sulfónico 0,1M. Seguidamente, 0,5 a 2 volumes de solução de N-etil-N’(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida a 2,5% são adicionados no mesmo tampão. O pH é ajustado por adição de soda IN. Após agitação, a mistura é deixada uma noite, de seguida é purificada através de cromatografia de filtração em gel, que elimina a LHRH (3-10) não ligada, a carbodi-imida residual e os seus produtos de hidrólise. 1 1

O invento tem igualmente por objecto a imunização passiva anti-LHRH (3-10) conforme o processo descrito acima. O invento tem ainda por objecto um conjunto de vacinação anti-LHRH utilizável para a produção de carne possuindo qualidades organolépticas melhoradas a partir de suínos, bovinos ou ovinos machos não castrados, este conjunto de vacinação compreende: - uma vacina anti-LHRH concebida para ser administrada em primeiro lugar antes ou durante a fase de engorda dos animais e concebida para induzir uma primeira resposta imunitária de fraca intensidade, sem efeito notável, ou mesmo mensurável, na secreção de esteróides das gónadas, para permitir o desenvolvimento do carácter masculino dos animais, e - uma vacina anti-LHRH concebida para ser administrada após a anterior e somente pouco antes do abate, sendo esta vacina concebida para induzir uma imunoneutralização anti-LHRH que produz a supressão ou redução significativa da secreção dos esteróides.

Ele refere-se assim aos conjuntos que agrupam numa mesma embalagem um número igual de doses de vacina a administrar antes do abate e de vacina a administrar numa primeira injecção. De preferência estas vacinas são acondicionadas em volume reduzido e concentração aumentada para a administração através de jacto transcutâneo, por exemplo segundo o pedido de patente francesa supra citado. O invento será agora descrito mais em detalhe com o auxílio de uma parte de ensaios comparando vários produtos e processos de vacinação de

- 16- acordo com o invento e de outra parte de ensaios visando mostrar a predominância da resposta imunitária dos porcos machos à fracção carboxi-terminal do péptido LHRH e do ensaio de vacinação anti-LHRH efectuado em porcos machos de acordo com o invento.

I - UTILIZAÇÃO DA LHRH TOTAL A. Maior actividade imunogénica do conjugado mantendo intacta a fracção carboxi-terminal a mais extensa do péptido LHRH e escolha do conjugado à base de LHRH de fórmula natural de preferência o obtido com o auxílio do agonista (D-Lys6)-LHRH.

Al. - Imunização anti-LHRH do porco macho inteiro e do rato macho OFA. A comparação de actividade de duas vacinas anti-LHRH constituídas por conjugados entre a LHRH de forma natural (BI e B2) ou a (D-Lysõ)-LHRH (Al e A2) e a albumina humana, conjugados obtidos através de carbodi-imida em fase aquosa e SPDP respectivamente, numa emulsão óleo-em-água e administradas por via intramuscular no porco e por via subcutânea no rato, conduziu às seguintes conclusões: - Actividade maior da vacina à base de LHRH de forma natural: massa do péptido LHRH conjugado inferior àquela do péptido (D-Lys6)-LHRH conjugado para um recrutamento de um maior número de animais apresentando uma resposta imunitária (tabela 1 e 3). - Efeito da dose que se traduz num recrutamento de um número mais elevado de animais apresentando uma resposta imunitária para um mesmo conjugado (tabela 3). - 17-

Al.l - Preparação dos conjugados (D-Lys6)-LHRH-aIbumina através de SPDP. A preparação dos conjugados (D-Lys6)-LHRH-albumina é realizada em 3 etapas: preparação de (N-(2-piridil)-3-ditiopropanoil-D-Lys6)-LHRH, preparação de N-(3-mercaptopropanoil) albumina, após ligação. (Nc-(2-piridil)-3-ditiopropanoil-D-Lys6)-LHRH é preparado fazendo reagir um excesso de SPDP sobre LHRH, em solução aquosa (6 moles de SPDP por mole de LHRH), e seguido, após uma noite a 4°C, centrifuga-se o produto obtido. Este é dissolvido em ureia 8M e os grupos (2-piridil)ditio presentes são doseados. A N-(3-mercaptopropanoil) albumina é obtida através da acção de 0,2 mmole de SPDP sobre 1 g de albumina humana dissolvida em 100 ml de tampão fosfato 0,1M, em seguida, após uma noite de contacto a 4°C e acidificação a pH 6, por redução pelo ditiotreitol. Ela é em seguida purificada através de cromatografia de filtração em gel. O doseamento dos tióis e das proteínas proporciona o nível de substituição médio. A ligação é efectuada tomando um grupo (2-piridil)ditio por 1,25 grupos tiol. O pH acerta-se a 7-7,5, em seguida, após uma hora, o rendimento é determinado através de medição da piridina 2-tiona libertada. O nível de substituição médio é deduzido. Finalmente, o conjugado é purificado através de cromatografia e é concentrado por ultrafiltração. AI .2 - Preparação do conjugado LHRH-albumina através de carbodi-imida. -18-

Α 300 mg de LHRH e 300 mg de albumina humana dissolvidos em 30 ml de NaCl 0,9% são adicionados 1000 mg de cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminapropil) carbodi-imida dissolvida extemporaneamente em 40 ml de NaCl 0,9%. Após agitação, a mistura é deixada uma noite à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Seguidamente, é cromatografado num gel de Sephadex G-50; as fracções correspondentes ao conjugado são recolhidas, eventualmente concentradas e congeladas. A partir das fracções contendo a LHRH não ligada é determinada a quantidade de LHRH não ligada e portanto o nível de conjugação médio. Este é reprodutível e varia de 8 a 10 mg de LHRH ligada por 100 mg de albumina. A partir dos espectros de UV do conjugado antes e depois da cromatografia, são deduzidos os rendimentos da cromatografia em conjugado e portanto a quantidade (ou a concentração) de LHRH conjugada. A1.3 - Técnicas de doseamento O título em anticorpos é determinado segundo a técnica descrita por JEFFCOATE et al., Acta. Endocr., Copenh., 1974, 75: 625-635. A testosterona é doseada directamente no plasma através de uma técnica RIA utilizando o radioligando Testosterona C19-carboximetil éter (125I)histamina. A ligação ao péptido marcado é determinada após marcação com iodo125 dos diferentes péptidos de acordo com COPPOLAND et al., Endocr., 1979, 104: 1504-1506 e titulação segundo a técnica descrita por JEFFCOATE et al., Acta. Endocr., Copenh., 1974, 75: 625-635. - 19- Α1.4 - Ilustrações - Ensaios em ratos

Tabela n° 1: Resposta de anticorpos anti-LHRH medida pela taxa de fixação de LHRH marcada com iodo125

Tabela n° 2: Efeito da imunização anti-LHRH na concentração de testosterona plasmática

Posologia

Vacinas AI: 50 pg de (D-Lys6)-LHRH conjugada Bl: 12 pg de LHRH conjugada -Ensaios em porcos machos inteiros

Tabela n° 3: Resposta de anticorpos anti-LHRH medida pela taxa de fixação de LHRH marcada com iodo125

Posologia

Vacinas Al: 0,5 mg de (D-Lys6)-LHRH conjugada A2: 6 mg de (D-Lys6)-LHRH conjugada Bl: 0,15 mg de LHRH conjugada B2: 1,20 mg de LHRH conjugada -20-

Tabela 1

Resposta dos anticorpos anti-LHRH medida através da taxa de fixação de LHRH marcada com o iodo 125 PESQUISA DE ANTICORPOS (% Ba/T) NO SORO (1/100) EM RATO INJECÇÕES TEMPO (SEM) GRUPO AI 50 ag DLys6-LHRH/HSA/AEl GRUPO BI 12 ag LHRH/EDC/HSA/AE1 TÍTULO B/T=50% SC 0 - - - SC 4 0,0 15,4 <100 7,8 7,6 <100 0,0 35,3 <100 0,0 51,1 100 5 4,3 91,1 1600 14,1 85,3 980 5,9 70,8 270 15,8 94,9 2100 6 0,0 64,3 120 11,3 67,9 220 11,7 96,1 2400 0,0 68,3 280 7 14,5 72,5 400 0,0 92,4 2100 0,0 64,2 200 11,5 67,2 240 8 19,6 70,4 310 0,0 98,8 3200 9,2 68,7 2200 0,0 38,8 310 -21 -

Tabela 2

Efeito da imunização anti-LHRH na concentração de testosterona plasmática DOSAGEM DA TESTOSTERONA PLASMÁTICA (ng/ml) EM RATO INJECÇÕES TEMPO (SEM) CONTROLOS GRUPO AI 50 μβ DLys6-LHRH/PDP/HSA GRUPO BI 12 μg HRH/EDC/HSA SC 0 0,40 - - 0,26 - - 0,47 - - 0,00 - - SC 4 2,25 4,16 2,51 1,05 5,83 2,38 2,34 4,43 3,63 - 4,17 0,58 5 3,80 2,99 0,00 1,76 2,33 0,00 5,05 2,85 0,00 6,67 1,54 0,00 6 2,01 3,26 0,00 4,47 0,09 0,00 4,69 1,10 0,00 1,96 - 0,00 7 2,28 1,32 0,00 1,92 0,89 0,00 1,89 1,59 0,00 1,65 2,17 0,00 8 0,97 1,75 0,00 L91 1,48 0,00 2,71 1,91 0,00 1,22 2,33 0,00 T abela 3

-J

Η £ <

GO Ο

Q < Η

GO Ο

Ph C/í

S -23 -

Α2 - Ensaio comparativo de duas vacinas anti-LHRH compostas respectivamente por um conjugado LHRH-a-globulina através de carbodi-imida e por um conjugado (D-Lys6)-LHRH-a-globulina através de SPDP colocados em emulsão óleo-em-água e administradas por via muscular (IM) ou transcutânea (ID) em porco.

A2.1 - Preparação do conjugado (D-Lys6)-LHRH-a-globulina através de SPDP O método descrito no exemplo AI é empregue exactamente do mesmo modo, mas substituindo a albumina a 10 mg/ml pela α-globulina a 6 mg/ml. O rendimento global em (D-Lys6)-LHRH ligado é da ordem de 45 a 50%.

Por outro lado é possível modificar à vontade o grau de substituição da α-globulina, portanto o nível de conjugação, jogando com as concentrações em SPDP e/ou em α-globulina no momento da preparação da MP-a-globulina. A2.2 - Preparação do conjugado LHRH-a-globulina humana, através de carbodi-imida (EDC). O método descrito no exemplo AI é empregue exactamente do mesmo modo mas substituindo a albumina humana pela α-globulina humana. O nível de conjugação é de 24 a 28 mg de LHRH fixada por 100 mg de a-globulina humana. A2.3 - A eficácia da vacina à base do conjugado LHRH-a- -24- globulina através de carbodi-imida é superior ao segundo. A eficácia é expressa pelo número de animais apresentando um desaparecimento total da testosterona plasmática (tabela 4).

Tabela 4 LHRH-a-glob.EDC (1,2 mg) IM + ID (D-Lys6)-LHRH-a-glob. SPDP (6 mg) IM + ID Supressão de testosterona 5/10 2/10 A.3 - Predominância da resposta imunitária dos porcos machos à fracção carboxi-terminal do péptido LHRH conjugado através de carbodi-imida ou ao seu agonista (D-Lys6)-LHRH conjugado através de SPDP sobre a a-globulina humana.

Ela é determinada pela comparação das percentagens de fixação dos soros anti-LHRH e anti-(D-Lys6)-LHRH por dois fragmentos marcados de LHRH, respectivamente LHRH (3-10) sem a sua fracção amino-terminal e LHRH (1-10) sob a forma de ácido livre deste modo sem a fracção amina da sua fracção carboxi-terminal natural. Estas duas fracções reconhecem respectivamente mais particularmente os anticorpos dirigidos contra as fracções carboxi-terminal de uma parte, e amino-terminal da outra parte. A predominância da resposta à fracção carboxi-terminal do péptido traduz-se num número de animais apresentando os anticorpos que não fixam senão o péptido LHRH (3-10) com exclusão da fixação de LHRH ácido livre (10/58 para o soro anti-LHRH e 3/10 para o soro anti-(D-Lys6)-LHRH). -25-

Nenhum soro mostrou fixação a 100% da fracção LHRH ácido livre, a qual traduziria um reconhecimento exclusivo da fracção amino-terminal.

As respostas mistas, as mais frequentes, mostram um melhor reconhecimento da fracção amino-terminal pelos soros anti-(D-Lys6)-LHRH que pelos soros anti-LHRH. Nestas últimos, somente 3 soros em 58 têm um reconhecimento superior a 40% da fracção amino-terminal, contra 4 em 10 para o soro anti-(D-Lys6)-LHRH. B - Maior actividade imunogénica do conjugado LHRH-a-globulina realizado através de carbodi-imida, comparada àquela que é obtida pelo conjugado preparado com glutaraldeído. B.l - Preparação do conjugado LHRH-a-globulina através de glutaraldeído. A 10 mg de LHRH e 50 mg de α-globulina humana (Serva) dissolvidos em 5 ml de tampão fosfato 0,1M pH 7,5 são adicionados, gota a gota e num período de 30 min, 2,5 ml de solução de glutaraldeído a 10 mg/ml, agitando suavemente após cada adição. Após ter deixado a mistura 2,5 h à temperatura ambiente, a reacção é parada através da adição de 25 mg de bi-sulfite de sódio dissolvida em 0,5 ml de água. O conjugado é dialisado a 4°C contra o tampão NaCl 150 mM - fosfato 10 mM pH 7,5, em seguida é concentrado por ultrafiltração. B.2 - Ensaio comparativo no porco de vacinas anti-LHRH formuladas com o auxílio de quantidades idênticas de LHRH conjugada. A eficácia é expressa pelo número de animais apresentando um desaparecimento total da testosterona plasmática (tabela 7).

Tabela 7 LHRH-a-glo. através de carbodi-imida administração IM ou ID LHRH-a-glo. através de gluta-raldeído administração IM ou ID Supressão de testosterona plasmática 5/10 0/10 C - Maior actividade imunogénica do conjugado utilizando a a-globulina humana comparada àquela que é obtida pelo conjugado utilizando a albumina do soro humano. A eficácia é expressa pelo número de animais apresentando um desaparecimento total da testosterona plasmática (tabela 8).

Tabela 8

Ensaios em porcos - injecção intramuscular LHRH-HSA. através de carbodi-imida LHRH-a-glo. através de carbodi-imida Supressão de testosterona plasmática 0/5 3/5 D - Actividade imunogénica do conjugado utilizando a a-globulina equina, fracção IV-1, equivalente àquela que é obtida pelo conjugado utilizando a α-globulina humana. D.l - Preparação do conjugado LHRH-a-globulina equina através de carbodi-imida. -27-

O método descrito no exemplo AI é empregue exactamente do mesmo modo, mas substituindo a albumina humana pela α-globulina equina (fracção IV-1). D.2 - Administração em rato por via subcutânea em 2 reforços com 4 semanas de intervalo de uma vacina com a dose de 12 pg de LHRH conjugada à α-globulina humana ou equina.

Tabela 9

Ensaios em ratos LHRH-a-globulina humana fracção IV-1 através de carbodi-imida LHRH-a-globulina equina fracção IV-1 através de carbodi-imida Supressão da testosterona plasmática 12/12 12/12 E - Maior actividade adjuvante da emulsão água-em-óleo do invento sobre outras emulsões (tabela 10).

Ensaios no porco utilizando o mesmo conjugado composto pela LHRH e pela α-globulina humana através de carbodi-imida e administrado na mesma dose num mesmo volume pela via transcutânea em 5 pontos.

As emulsões examinadas são: uma emulsão fluída óleo-em-água (B), a emulsão do invento (fórmula C da tabela), uma emulsão comercial para diluir com o antigénio (E), uma fase oleosa a emulsionar com o conjugado (F).

Para todas estas fórmulas, a quantidade final de antigénio por dose é a mesma. -28-

As emulsões são realizadas nas condições habituais para estas experiências em formulação deste tipo.

Tabela 10

Emulsões B C E F Supressão da testosterona plasmática 2/5 4/4 1/5 3/5 Número de animais apresentando uma concentração da androstenona tecidular abaixo de 0,5 pg/g 2/5 4/4 3/5 3/5 F. - Eficácia da imunização passiva anti-LHRH para o melhoramento das qualidades organolépticas da carne, medida através da redução da androstenona tecidular.

Tabela 11

Teor em androstenona do tecido adiposo em animais de controlo e naqueles que foram submetidos à imunoneutralização anti-LHRH passiva através de um plasma hiperimune equino anti-(D-Lys6)-LHRH administrado num volume de 300 ml aos dias 16, 13, 9 e 5 antes do abate.

Controlos Tratados Número de animais apresentando uma concentração de androstenona inferior a 0,50 pg/g de tecido adiposo 2/5 5/5 (diferença significativa com risco de α = 0,2) -29-

G. - Eficácia e tolerância das formulações contendo a LHRH conjugada com a α-globulina através de carbodi-imida em emulsão água-em-óleo (Ia vacina) e em gel de hidróxido de alumínio e saponina (2a vacina), administradas na mesma dose de LHRH conjugada, respectivamente no início da engorda e de 18 a 21 dias antes do abate por via transcutânea com o auxílio de um injector sem agulha denominado Pigjet.

Dois ensaios foram efectuados em dois tempos, respectivamente os grupos 1, 3 e 5 para o primeiro e os grupos 2 e 4 para o segundo (tabela 12 e 13). G.l - A eficácia da imunoneutralização anti-LHRH é maior para um volume igual de vacina através da multiplicação dos pontos de administração transcutânea.

Tabela 12

Grupos 1 2 3 4 5 Ia vacina 1 ml (5 pontos) 1 ml (5 pontos) 1 ml (5 pontos) 0,4 ml (10 pontos) 0,4 ml (2 pontos) 2a vacina 1 ml (5 pontos) 1 ml (5 pontos) 0,4 ml (2 pontos) 0,4 ml (10 pontos) 0,4 ml (2 pontos) Supressão ou diminuição marcada da testosterona (n° de animais) 10/12 10/11 9/12 11/11 8/11 Concentração da androstenona tecidular abaixo de 0,5 pg/g (n° de animais) 11/12 ND 10/23 ND ND ND: não determinado G.2 - A tolerância às vacinas utilizadas é julgada pela evolução da reacção inflamatória cutânea, classificada de 0 a 4 num animal em função da importância das pápulas que surgem após a administração; uma pápula surge em cada ponto de administração. O somatório das classificações em cada um dos grupos é resumido como se segue: nota média no fim da primeira semana que se segue à administração (Ad. 1) e nota média no momento do abate para cada uma das vacinas (Ab) (tabela 13). A melhor tolerância foi observada com o emprego das vacinas do grupo 4.

Tabela 13

Tolerância à administração pela via transcutânea observada no decurso dos 2 ensaios efectuados (ensaio 1 grupos 1, 3 e 5, ensaio 2 grupos 2 e 4).

Grupos 1 2 3 4 5 Vacinas 1 ou 2 Ia vac. 2a vac. Ia vac. 2a vac. Ia vac. 2a vac. Ia vac. 2a vac. Γ vac. 2a vac. Número de pontos de administração 5 5 5 5 5 2 10 10 2 2 Ad 1 42 11 31 11 41 16 33 11 30 10 Ab 2 4 0 0 5 3 0 0 2 0 Número de animais 12 11 12 11 11 II - UTILIZAÇÃO DO PÉPTIDO (3 - 101. A. Técnicas de medição da resposta imunitária anti-LHRH e da eficácia biológica através do doseamento da testosterona plasmática e da androsterona tecidular. -31 -

A resposta imunitária anti-LHRH é medida através do título em anticorpos que é determinado segundo a técnica descrita por JEFFCOATE et al., Act. Endocr., (Copenh.), 1974, 7S, 625-635. A ligação aos péptidos marcados é determinada após marcação com o iodo125 dos diferentes péptidos de acordo com COPPOLAND et al., Endocrinology, 1979, 104, 1504-1506. A titulação dos soros na presença destes péptidos é efectuada segundo a técnica de JEFFCOATE et al. citada acima. A eficácia biológica é medida através da redução ou do desaparecimento da testosterona plasmática e da androstenona tecidular. O doseamento da testosterona plasmática é efectuada directamente no plasma através de uma técnica RJ A utilizando o radioligando testosterona 09-carboximetil éter (125I) histamina (FURUYAMA S.s et al., Steroids, 1972, 16, 415). O doseamento da androstenona tecidular é efectuado numa amostra de tecido adiposo através de uma técnica RIA utilizando o radioligando 5a-3H-androstenona, descrito por CLAUS, C.R. Acad. Sei., Paris, 1974, 278, 299-302. B. Predominância da resposta imunitária dos porcos machos à fraeção carboxi-terminal do péptido LHRH conjugado através de carbodi-imida ou do seu agonista (D-Lys6)-LHRH conjugado através de SPDP sobre a a-globulina humana.

Bl. Preparação do conjugado LHRH-a-globulina humana através de carbodi-imida. O conjugado é de preferência obtido pela adição a um volume da mistura α-globulina e LHRH, em solução de 2 a 20 mg/ml em NaCl 0,9%, de 0,5 a 2 volumes de solução de cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC) em solução a 2,5% em NaCl 0,9%. Após agitação, a -32- mistura é deixada uma noite, em seguida é purificada por cromatografia de filtração em gel. B2. Preparação dos conjugados ([D-Lys6]-LHRH)-a-globulina humana através de SPDP. A preparação dos conjugados ([D-Lys6]-LHRH)-a-globulina humana é realizada em 3 etapas: preparação da [N-(2-piridil)-3-ditiopropanoil-D-Lys6]-LHRH, preparação da N-(3-mercaptopropanoiI) α-globulina humana, em seguida ligação. A [NE-(2-piridil)-3-ditiopropanoil-D-Lys6]-LHRH é preparada fazendo reagir um excesso de SPDP sobre a LHRH, em solução aquosa (6 moles de SPDP por mole de (D-Lys6)-LHRH, em seguida, após uma noite a 4°C, centrifuga-se o produto obtido. Este é dissolvido em ureia 8M e os grupos (2-piridiljditio presentes são doseados. A N-(3-mercaptopropanoil) α-globulina humana é obtida por acção de 0,2 mmole de SPDP sobre 0,6 g de α-globulina humana dissolvida em 100 ml de tampão fosfato 0,1M, em seguida, após uma noite de contacto a 4°C e acidificação a pH 6, por redução através de ditiotreitol. Ela é em seguida purificada através de cromatografia de filtração em gel. O doseamento dos tióis e das proteínas proporciona o nível de substituição médio. A ligação é efectuada ligando um grupo (2-piridil)ditio por 1,25 grupo tiol. O pH é acertado entre 7-7,5, em seguida, após uma hora, o rendimento é determinado através de medição da piridina tiona-2 liberta. O nível de substituição médio é deduzido. Finalmente, o conjugado é purificado por cromatografia e é concentrado por ultrafiltração. O rendimento global em (D-Lys6)-LHRH ligado é da ordem de 45 a 50%. -33- Β3. A predominância da resposta imunitária dos porcos machos à fracção carboxi-terminal do péptido LHRH conjugado nas condições descritas em AI e A2 é determinado pela comparação da fixação pelos soros anti-LHRH e anti-(D-Lys6)-LHRH, de dois fragmentos marcados de LHRH, respectivamente LHRH (3-10), (LHRH sem a sua fracção amino-terminal) e LHRH (1-10) sob a forma de ácido livre, (LHRH sem a sua fracção amida da sua fracção carboxi-terminal). Estes dois fragmentos reconhecem mais particularmente os anticorpos dirigidos respectivamente contra as fracções carboxi-terminal de uma parte, e amino-terminal da outra parte. A resposta à fracção carboxi-terminal do péptido é geral em todos os animais imunizados por um ou outro dos conjugados (68/68). Os soros de 3 em 10 dos 10 animais imunizados através de (D-Lys6)-LHRH conjugada e de 10 em 68 dos animais imunizados através de LHRH conjugada mostraram exclusivamente uma fixação da fracção carboxi-terminal. Os outros animais apresentam uma resposta mista dirigida preferencialmente contra a fracção carboxi-terminal. A resposta à fracção amino-terminal não é geral (55/68). Nenhum soro mostrou fixação exclusiva à fracção LHRH ácido livre. C. Ensaios de imunoneutralização activa anti-LHRH com o auxílio de conjugados LHRH (3-10) -α-globulina equina IV-4 e LHRH (3-10)-ovalbumina realizados através de carbodi-imida.

Cl. Preparação do conjugado LHRH (3-10) -α-globulina equina IV-4 através de carbodi-imida.

Oitenta e cinco mg de LHRH (3-10) e 170 mg de a-globulina equina IV-4 são dissolvidos em 12,8 ml de tampão NaCl 0,1 M - ácido 2-etano -34- •9 (N-morfolino) sulfónico 0,1M. Em seguida são adicionados 212 mg de cloridrato de N-etil-N,-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida dissolvidos em 17 ml da solução precedente. O pH é imediatamente ajustado a 6,0 através da adição de 1,3 ml de soda IN.

Após agitação, a mistura é deixada 16 h à temperatura ambiente, em seguida o conjugado é purificado por cromatografia de filtração em gel para separar o conjugado da LHRH não conjugada. A medição da quantidade desta r última permite ter por diferença a quantidade de LHRH ligada. E possível determinar o rendimento da ligação. C2. Preparação do conjugado LHRH (3-10)-ovalbumina através de carbodi-imida

Sessenta mg de LHRH (3-10) e 120 mg de ovalbumina são dissolvidos em 9 ml de tampão NaCl 0,1M - ácido 2-etano (N-morfolino) sulfónico 0,1M. Em seguida são adicionados 150 mg de cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida dissolvidos em 12 ml do mesmo tampão. O pH é ajustado a 7,0 por adição de soda IN (1,9 ml aproximadamente). A mistura é deixada uma noite à temperatura ambiente, e é em seguida clarificada por centrifugação. O sobrenadante é cromatografado em gel de Sephadex para separar o conjugado da LHRH que não reagiu e dos produtos provenientes da carbodi-imida inicial. Por medição da quantidade de LHRH (3-10) não fixada, é possível determinar o rendimento da ligação da LHRH (3-10). C3. Resposta imunitária, eficácia biológica e tolerância à vacina anti-LHRH formulada a partir do conjugado obtido entre os fragmentos LHRH (3-10) e a α-globulina equina IV-4 através de carbodi-imida.

As formulações constituídas por LHRH (3-10) conjugada em -35- emulsão água-em-óleo (Γ vacina) e em gel de hidróxido de alumínio e saponina (2a vacina) foram administradas a 6 porcos machos num volume de 0,4 ml por dose, respectivamente no início da engorda e 17 dias antes do abate por via transcutânea com o auxílio de um injector sem agulha denominado Pigjet libertando o volume da dose em 2 aplicações de 0,2 ml repartidas em 5 pontos a cada uma delas. A resposta imunitária foi máxima 10 dias após a administração da 2a vacina. Os títulos individuais em anticorpos (inverso da diluição pela qual o iodo 125 é fixado a 50%) foram respectivamente:

Dia 10 280 660 2 700 3 200 4 600 13 000

Dia 16 290 400 2 000 2 400 3 100 8 600 A eficácia biológica desta resposta imunitária traduziu-se pelo desaparecimento da testosterona plasmática a partir do 10° dia após a administração da 2a vacina em todos os 6 animais. O desaparecimento da testosterona é acompanhado, nas mesmas condições, do desaparecimento da androstenona tecidular. A tolerância à vacina é avaliada através da evolução da reacção inflamatória cutânea, notada em função da importância das pápulas que aparecem em cada ponto de libertação da vacina após administração. Esta inflamação local desapareceu totalmente a partir do dia 10 após a administração da 2a vacina.

Lisboa, 19 de Setembro de 2000

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

- 1 -

REIVINDICAÇÕES 1. Processo de produção de carne de suíno, bovino, ovino apresentando qualidades organolépticas, em particular odor, sabor e maciez, melhoradas, no qual se engordam os animais domésticos machos não castrados, se efectua nos animais uma imunoneutralização activa com o auxílio de uma vacina anti-LHRH, caracterizado por manter as vantagens ligadas ao carácter masculino dos animais praticamente até ao momento do abate pelo facto de, antes ou durante o período de engorda dos animais, lhes ser administrada uma vez uma vacina anti-LHRH concebida para induzir uma primeira resposta imunitária de fraca intensidade, sem efeito notável, ou mesmo mensurável, na secreção de esteróides das gónadas e que, somente pouco antes do abate, lhes ser administrada uma vacina anti-LHRH para induzir uma imunoneutralização anti-LHRH que produz a supressão ou a redução significativa da secreção dos esteróides.
2. Procedimento de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a vacina administrada em primeiro lugar e a vacina administrada pouco antes do abate serem escolhidas de entre as vacinas em emulsão e as vacinas em adjuvante aquoso.
3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por a vacina anti-LHRH administrada em primeiro lugar ser uma vacina em emulsão.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por, para o porco, se administrar, pouco antes do abate, a vacina anti-LHRH com um adjuvante de tipo aquoso. -2-
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por, como adjuvante de tipo aquoso, utilizar gel de hidróxido de alumínio e/ou saponina.
6. Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado por se administrar a vacina em adjuvante aquoso de 15 a 21 dias antes do abate.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de a 5, caracterizado por, para os ovinos e bovinos, se administrar, antes do abate, uma vacina anti-LHRH com um adjuvante em emulsão.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se administrar a vacina em emulsão de um a dois meses antes do abate.
9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado por se administrar a vacina em emulsão de quatro semanas a vários meses após a administração feita em primeiro lugar.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 e de 7 a 9, caracterizado por a vacina em emulsão ser uma vacina em emulsão água-em-óleo.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a emulsão água-em-óleo ser feita de uma mistura de óleos minerais altamente purificados e de tensioactivos não iónicos.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de -3- 1 a 11, caracterizado por se administrar um conjugado imunogénio anti-LHRH compreendendo: a LHRH total ou modificada, um fragmento peptídico de LHRH modificado ou não, ou um agonista da LHRH, ligado a uma proteína transportadora imunogénio escolhida de entre: albumina do soro bovino ou humano, tiroglobulina, ovalbumina, as anatoxinas, particularmente a anatoxina tetânica, globulinas humana ou equinas.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o conjugado compreender a LHRH ligada à alfa-globulina equina, particularmente às fracções IV-1 e/ou IV-4.
14. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o conjugado compreender a LHRH (3-10) ligada à alfa-globulina equina, particularmente as fracções IV-1 e/ou IV-4, ou à ovalbumina.
15. Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado por a LHRH/LHRH (3-10) e a proteína transportadora imunogénio estarem ligadas através de uma carbodi-imida.
16. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por em vez de vacina para imunoneutralização activa, se administrar ao animal, alguns dias antes do abate, soro ou plasma hiperimune anti-LHRH. -4-
17. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por em vez de vacina para imunoneutralização activa, se administrar ao animal, alguns dias antes do abate, anticorpos monoclonais anti-LHRH.
18. processo de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado por a administração ser feita de cinco a quinze dias antes do abate, através da via subcutânea ou intramuscular.
19. processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado por se administrar através da via transcutânea, de preferência em vários locais, com o auxílio de um aparelho de injecção sem agulha através de jacto sob pressão.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado por a vacina anti-LHRH administrada em primeiro lugar o ser antes da fase de engorda do animal.
21. Conjunto de vacinação anti-LHRH utilizável para a produção de carne possuindo qualidades organolépticas melhoradas a partir de suínos, bovinos ou ovinos machos não castrados, este conjunto de vacinação compreendendo: uma vacina anti-LHRH concebida para ser administrada em primeiro lugar antes ou durante a fase de engorda dos animais e concebida para induzir uma primeira resposta imunitária de fraca intensidade, sem efeito notável, ou mesmo mensurável, na secreção de esteróides das gónadas, para permitir o desenvolvimento do carácter masculino dos animais, e -5- uma vacina anti-LHRH concebida para ser administrada após a anterior e somente pouco antes do abate, sendo esta vacina concebida para induzir uma imunoneutralização anti-LHRH que produz a supressão ou a redução significativa da secreção dos esteróides.
22. Conjunto de vacinação de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por as vacinas compreenderem um princípio activo que é um conjugado entre uma proteína transportadora imunogénio e um péptido LHRH.
23. Conjunto de vacinação de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o péptido LHRH ser escolhido de entre o grupo que consiste em: LHRH total ou modificada, fragmento peptídico de LHRH, modificado ou não, agonista da LHRH.
24. Conjunto de vacinação de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado por a proteína transportadora imunogénio ser escolhida de entre do grupo que consiste em: albumina do soro, tiroglobulina, ovalbumina, anatoxinas, anatoxina tetânica, globulinas equinas, globulinas humanas, alfa-globulinas. -6-
25. Conjunto de vacinação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, caracterizado por a vacina anti-LHRH a administrar em primeira injecção ser uma vacina sob a forma de emulsão.
26. Conjunto de vacinação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 25, caracterizado por a vacina anti-LHRH a administrar pouco antes do abate ser uma vacina sob a forma de emulsão.
27. Conjunto de vacinação de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado por a vacina sob a forma de emulsão ser uma vacina sob a forma de emulsão água-em-óleo.
28. Conjunto de vacinação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 27, caracterizado por a vacina sob a forma de emulsão ser feita de uma mistura de óleos minerais e de tensioactivos não iónicos.
29. Conjunto de vacinação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 25, caracterizado por a vacina anti-LHRH destinada a ser administrada pouco antes do abate ser uma vacina em adjuvante de tipo aquoso.
30. Conjunto de vacinação de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o adjuvante de tipo aquoso ser escolhido de entre o grupo que consiste em gel de hidróxido de alumínio, saponina e mistura destes.
31. Conjunto de vacinação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 25 e de 29 a 30, destinado aos porcos, caracterizado por a vacina anti-LHRH a administrar pouco antes do abate ser uma vacina em adjuvante de tipo aquoso. -7-
32. Conjunto de vacinação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 28, utilizável em bovinos e em ovinos, caracterizado por a vacina anti-LHRH a administrar pouco antes do abate ser uma vacina sob a forma de emulsão.
33. Conjunto de vacinação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 32, caracterizado por o conjunto de vacinação ser constituído por um número idêntico de doses de cada uma das vacinas, dentro de uma embalagem única.
34. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado por se administrar uma vacina compreendendo um princípio activo imunogénico compreendendo o péptido LHRH.
35. Conjunto de vacinação de acordo com a reivindicação 21 ou de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 33 juntamente com a reivindicação 1, caracterizado por as vacinas anti-LHRH comportarem um princípio activo imunogénico compreendendo o péptido LHRH. Lisboa, 19 de Setembro de 2000

JORGE AFONSO CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA