FR2685333A1 - Nouveau peptide notamment pour la realisation de conjugues immunogenes anti-lhrh, vaccins les incorporant et ensemble de vaccination y relatif. - Google Patents

Abstract

Le peptide de formule: Trp - Ser - Tyr - Gly - Leu - Arg - Pro - Gly - NH2 , lorsqu'il est couplé à une protéine porteuse immunogène, est utile comme principe actif de vaccins anti-LHRH conçus soit pour induire une réponse immunitaire de faible intensité, sans effet notable, ou même mesurable, sur la sécrétion des stéroïdes gonadiques, soit pour produire la suppression ou l'abaissement significatif de la sécrétion des stéroïdes sans réaction locale ou générale adverse, susceptible de nuire à l'apparence ou à la qualité de la viande. Un ensemble pour la vaccination anti-LHRH des animaux comprend un nombre égal de doses d'un vaccin à administrer en première injection et d'un vaccin à administrer avant l'abattage.

Description

Nouveau peptide notamment pour la réalisation de conjugués immunogènes anti-LHRH, vaccins les incorporant et ensemble de vaccination y relatif.

La présente invention concerne un nouveau peptide correspondant à une fraction de la séquence de la LHRH, notamment pour la réalisation de conjugués immunogènes anti-LHRH, les vaccins les incorporant et un ensemble de vaccination y relatif, à des fins d'amélioration des qualités organoleptiques, en particulier de l'odeur, de la sapidité et de la tendreté, de la viande des animaux domestiques mâles non castrés, notamment des bovins, des ovins et des porcins mâles.

Les avantages de l'utilisation du mâle entier sur le mâle castré dans l'engraissement des animaux domestiques destinés à la production de viande ont été soulignés depuis plusieurs décennies par les zootechniciens. Ils concernent un taux de croissance plus élevé, surtout chez les bovins et les ovins, une meilleure utilisation de la ration alimentaire et une carcasse plus maigre mais plus fournie en masse musculaire chez toutes les espèces domestiques (S.C. SEIDEMAN et al. J., of Animal Science, 1982, 55 (4) 826-840 et M. BONNEAU, INRA Prod. Anim., 1988, 1 (2) 133140).

Les inconvénients principaux de cette utilisation du mâle entier, rappelés dans les revues citées ci-dessus, concernent l'odeur et la sapidité désagréables chez les porcins et ovins mâles, la moindre tendreté de la viande des bovins et ovins mâles entiers et justifient les pratiques actuelles de la castration chirurgicale.

En effet, si les stéroïdes androgènes dont l'androsténediol, l'androsténedione et la testostérone sont les éléments déterminants des avantages attendus dans toutes les espèces domestiques pour une croissance plus rapide et une meilleure utilisation de la ration alimentaire, ils sont rendus responsables d'une moindre tendreté de la viande des bovins et ovins mâles entiers.

Les stéroïdes non androgènes ou les dérivés des 16-androstènes dont la 5 o( -androsténone (50(-androstèn-16 one-3), chez le porc mâle, sont responsables en partie de l'odeur et de la sapidité désagréables de la viande d'un certain nombre de porcins mâles entiers dès la puberté, lesquelles déprécient la viande et sont un obstacle à sa commercialisation à l'état frais.

Le scatole, produit dérivé du tryptophane et produit par la flore microbienne intestinale, est un composé responsable en partie de l'odeur et de la sapidité désagréables de la viande du porc mâle entier. Sa production dépend de facteurs de l'environnement, de la nutrition, de la race. Son accumulation dans le tissu adipeux est plus importante chez le verrat et serait liée aux sécrétions des stéroïdes sexuels gonadiques.

A titre expérimental, on a déjà essayé de diminuer ou de supprimer le développement du caractère mâle chez le jeune animal ou la sécrétion d'hormones testiculaires, notamment des stéroïdes testiculaires, par immunoneutralisation active ou passive contre ceux-ci ou contre les hormones intervenant dans leur sécrétion, notamment l'hormone lutéinisante ou LH (Luteinizing Hormone) et l'hormone gonadolibérine (GnRH) encore appelée Luteinizing
Hormone Releasing Hormone (LHRH). Des essais ont été conduits sur le porc pour abaisser le taux tissulaire de la 5 o( -androsténone, du groupe des 16-androstènes, par l'immunisation active dirigée contre ce composé (E.D.

WILLIAMSON et al., Liverstock Production Science, 1985, 12, 251-264) ou par l'immunisation passive contre ce même composé (R. CLAUS, Immunization with Hormones in Reproduction Research, ed. Nieschlag, 1975). La suppression ou la diminution de la sécrétion des stéroïdes testiculaires peut être recherchée par l'immunoneutralisation de l'hormone gonadotrope LH, spécifique de l'espèce considérée (R.E.

FALVO et al., J. Anim. Science, 1986, 63, 986-994) ou par l'immunoneutralisation anti-LHRH de la LHRH endogène. Seule l'immunisation active anti-LHRH a été préconisée par différents auteurs. Chez le porc, l'abaissement de l'-androsténone a été obtenu par cette méthode (A. CARATY et M. BONNEAU, C.R. Acad. Sci. Paris 1986, 303, Série III (16) 673-676 ; R.E. FALVO et al., J. Anim. Sci., 1986, 63, 986-994).

Chez le mouton, B.D. SCHANBACHER (Am. J.Physiol., 1982, 242, E201-E205) préconise l'immunisation anti-LHRH pour retarder le développement testiculaire et produire un effet de castration chez les agneaux mâles. Chez les bovins, P.S.

ROBERTSON (Vet. Rec., 1979, 105, 516-517) décrit une castration immunologique anti-LHRH.

Les essais d'immunoneutralisation anti-LHRH décrits sur les animaux de laboratoire (ARIMURA et al. Endocrinology, 1973, 93, 1092-1103 ; FRASER H.M. et al., J.

Endocr. 1974, 63, 399-406 ; MAKINO T. et al. Contraception, 1973, 8 (2), 133-145 ; CARELLI C. et al., Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 1982, 79, 5392-5395) et sur plusieurs espèces domestiques (JEFFCOATE et al., Theriogenology, 1978, 10(4), 323-335 ; ROBERTSON I.S. et al., Veterinary Record.,1979, 105, 556 ; SCHANBACHER B.D. Am. J. Physiol., 1982, 242,
E201-E205) ont montré qu'il est possible d'obtenir l'arrêt de la sécrétion de la testostérone, l'involution pondérale des testicules et de ses glandes annexes, l'arrêt de la spermatogénèse et, sur le plan du comportement, la disparition de la libido.

Ces travaux ont conduit à suggérer le recours à une immunoneutralisation, notamment anti-LHRH, précoce pour remplacer la traditionnelle castration chirurgicale à des fins d'élevage.

Dans le brevet US n" 4.556.555, il est ainsi décrit une méthode d'immunisation passive d'animaux avant leur puberté, à l'aide d'un antisérum contenant des anticorps dirigés contre la gonadotropine.

La demande de brevet internationale WO 90/11298 décrit un procédé d'immunisation anti-LHRH à la naissance à l'aide de 2 séquences de LHRH en tandem couplées à une protéine porteuse, pour améliorer la qualité de la viande chez le porc.

La demande de brevet internationale WO 88/00056 décrit une méthode de castration immunologique anti-LHRH destinée à améliorer le comportement social et sexuel des animaux mâles en remplacement de la castration chirurgicale qui affecte le taux de croissance. Les taureaux sont vaccinés à l'âge de 8 à 40 semaines et reçoivent ensuite plusieurs rappels.

Un vaccin anti-LHRH vendu sous la marque VAXSTRATE par la société australienne WEBSTERS est utilisé chez la vache.

R.E. Falvo et al. (J. Anim. Sci. 1986, 63 : 986-994) ont immunisé plusieurs groupes de verrats à l'aide de conjugués LHRH-séroglobuline humaine en adjuvant complet de
Freund ou avec le muramylpeptide comme adjuvant. Les auteurs ont observé, après vaccination et plusieurs rappels, des titres élevés d'anticorps anti-LHRH, mais avec la nécessité de pratiquer des rappels répétés pour maintenir le titre élevé en anticorps.

I.S. Robertson décrit une méthode d'immunisation avec
LHRH conjuguée à l'anatoxine tétanique ou à la thyroglobuline et suggère que l'approche immunologique autoriserait une castration tardive avec les avantages que l'on peut en attendre sur le plan de la croissance pondérale. Il conclut cependant que des efforts sont encore à faire pour arriver à une méthode de castration utilisable dans la pratique, que ce soit au niveau de la méthode elle-même ou de l'adjuvant, l'adjuvant de Freund étant proscrit en pratique.

Enfin, A. Caraty et M. Bonneau (C.R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, ne16, 1986) ont pratiqué une immunisation anti-LHRH chez le porc mâle. Les auteurs suggèrent que le blocage de la production de steroïdes, 2 à 3 semaines avant l'abattage, permettrait d'exploiter les potentialités élevées de ce type d'animal pour la production de viande en évitant les problèmes posés par l'accumulation d'androstérone dans le tissu adipeux. Ils concluent cependant que d'importants progrès restent à accomplir dans les techniques d'immunisation avant qu'il ne soit possible de proposer l'immunisation active anti-LHRH comme technique utilisable en élevage porcin.

Par ailleurs, l'immunoneutralisation tardive pose dans la pratique le problème important de l'innocuité du traitement et notamment des réactions locales engendrées par les vaccins, en particulier les vaccins huileux, avec les risques de rejet ou de déclassement de la viande qui en résultent.

L'amélioration des qualités organoleptiques chez les bovins et les ovins n'a pas été suggérée.

La déposante a justement trouvé un procédé applicable industriellement permettant d'améliorer les propriétés organoleptiques de la viande des animaux, procédé dans lequel, peu avant l'abattage de l'animal, on supprime sensiblement l'action des stéroïdes androgènes et non androgènes, par immunoneutralisation active ou passive anti-LHRH, tout en maintenant pratiquement jusqu'à l'abattage les avantages dus au caractère mâle de l'animal.

Selon un premier mode de réalisation préféré de ce procédé, on administre à l'animal un vaccin anti-LHRH, de préférence en émulsion, de préférence pendant ou avant la phase d'engraissement de l'animal, puis, peu avant l'abattage de l'animal, on administre à nouveau un vaccin anti-LHRH.

Chez le porc, il est particulièrement avantageux d'administrer, avant l'abattage, le vaccin anti-LHRH avec un adjuvant de type aqueux, notamment gel d'hydroxyde d'aluminium et/ou saponine.

Cette administration est effectuée de préférence 15 à 21 jours avant l'abattage.

Au contraire, chez le bovin, et éventuellement chez l'ovin, l'administration précédant l'abattage est faite de préférence avec un adjuvant en émulsion, et de préférence 1 à 2 mois avant l'abattage. Cette administration est effectuée de préférence au moins 4 semaines, et de préférence plusieurs mois, après la première administration.

Dans tous les cas, on préfère, pour le vaccin en émulsion, destiné à la première administration et, chez le bovin, à la deuxième administration, que le vaccin se présente sous forme d'émulsion eau-dans-l'huile. Cependant, d'autres formes d'émulsion sont envisageables.

Ce vaccin, de préférence du type en émulsion, est conçu, selon l'invention, pour l'induction d'une première réponse immunitaire de faible intensité, sans effet notable, ou même mesurable, sur la sécrétion des stéroïdes gonadiques. La formulation en émulsion est préférée, mais les autres formulations sont utilisables dès lors qu'elles produisent ce même effet.

L'administration qui précède l'abattage est faite avec un vaccin formulé pour produire à ce moment la suppression ou l'abaissement significatif de la sécrétion des stéroïdes sans réaction locale ou générale adverse, susceptible de nuire à l'apparence ou à la qualité de la viande.

De façon préférée notamment pour le porc, le conjugué, en solution aqueuse, est mis sous les deux formulations suivantes : la première en émulsion eau-dans-l'huile, stable, faite d'un mélange d'huiles minérales animales ou végétales hautement purifiées et de tensioactifs non ioniques pour l'induction d'une réponse immunitaire de faible intensité, sans effet mesurable sur la sécrétion des stéroïdes gonadiques, la seconde, non émulsionnée, avec gel d'hydroxyde d'aluminium et saponine, déclenchant une réaction immunitaire rapide et intense se traduisant par la production d'anticorps anti-LHRH neutralisants, suffisante pour entraîner la diminution ou la suppression des stéroïdes gonadiques et la diminution du transport associé de scatole d'origine intestinale.

L'émulsion utilisée est, à la différence de celle qui est obtenue à l'aide de l'adjuvant complet ou incomplet de
Freund, une émulsion stable permettant de préparer un vaccin prêt à l'emploi. La réaction inflammatoire cutanée reste très faible et localisée aux points d'administration des deux formulations vaccinales et se traduit sous la forme de papules bien circonscrites à l'examen externe. Son développement interne reste limité au derme superficiel.

Elle disparaît sans laisser de granulome apparent au moment de l'abattage des animaux.

Selon un autre mode de réalisation de ce procédé, on administre à l'animal, quelques jours avant l'abattage, notamment 5 à 15 jours avant, du sérum ou du plasma hyperimmun anti-LHRH ou encore des anticorps monoclonaux anti-LHRH.

L'immunisation passive anti-LHRH entratnant la diminution voire la suppression de la sécrétion des stéroïdes androgènes et non androgènes a été obtenue par l'adminis tration intramusculaire de plasma hyperimmun équin. Portée à un niveau suffisant, mesuré par le titre en anticorps
LHRH du sérum de l'animal receveur, elle entraîne la diminution de la testostérone plasmatique dès le 3ème jour; maintenue à ce même niveau les 12 jours suivants, elle est suffisante pour entraîner 1' abaissement de l'androstérone tissulaire au-dessous de 0,50 microgramme/g, valeur pour laquelle l'odeur désagréable et la sapidité particulière de la viande du porc mâle ne seraient plus perçues par le consommateur.Cette méthode d'immunisation passive a montré que le maintien pendant 12 jours de la diminution significative de la testostérone est suffisant pour abaisser la concentration d'androstérone tissulaire au-dessous du seuil fixé. Cette immunisation passive peut être envisagée par l'emploi d'anticorps monoclonaux anti-LHRH secrétés par les hybridomes ou hétérohybridomes porcins.

Le mode d'administration de ces formulations est de préférence transcutané, notamment à l'aide d'un appareil d'injection sans aiguille, par jet sous pression, notamment selon la demande de brevet FR-A-2.652.257.

Le procédé selon l'invention présente l'avantage important de présenter une parfaite innocuité, notamment de ne pas induire des réactions locales susceptibles d'entraîner le déclassement de la viande.

La réaction inflammatoire cutanée reste localisée aux points d'administration des deux formulations vaccinales et se traduit sous la forme de papules bien circonscrites à l'examen externe. Son développement interne reste limité au derme superficiel. Elle disparaît sans laisser de granulome apparent au moment de l'abattage des animaux. La réaction inflammatoire, limitée dans le temps et aux points d'administration, traduit la tolérance aux deux formulations vaccinales et est obtenue par l'administration transcutanée de celles-ci, effectuée à l'aide d'un injecteur sans aiguille.

L'immunisation anti-LHRH nécessite de conjuguer le peptide LHRH ou un fragment du peptide LHRH, non immunogène dans les conditions économiques de leur emploi, à une protéine immunogène, dite porteuse, par une liaison covalente.

La LHRH ou GnRH, qu'elle soit naturelle ou de synthèse, est composée de 10 acides aminés, numérotés de 1 à 10 en allant de la terminaison amino-terminale à la terminaison carboxy-terminale suivant la formule suivante
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly NH2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ces symboles, par convention, représentent : pGlu, acide pyroglutamique ; His , histidine ; Trp, tryptophane
Ser, sérine ; Tyr, tyrosine ; Gly, glycine ; Leu, leucine
Arg, arginine ; Pro, proline.

Les conjugués immunogènes anti-LHRH, décrits par les differents auteurs peuvent être réalisés en ce qui concerne l'haptène avec
a) la LHRH totale ou modifiée en une ou plusieurs de ses parties pour obtenir la conjugaison amino-terminale, carboxy-terminale ou intermédiaire souhaitée,
b) avec l'un de ses fragments peptidiques composés de 5 à 7 acides aminés modifiés ou non, pour obtenir la conjugaison aminoterminale, carboxyterminale ou intermédiaire souhaitée,
c) avec un agoniste portant un acide aminé substitué, le plus couramment en 6, pour obtenir une conjugaison intermédiaire.

Ainsi, la demande de brevet européen EP-A-181 236
un decrit des conjugues imtogènes comprenant un nonapeptide ou un décapeptide incluant une séquence, correspondant aux 8 derniers acides aminés de la molécule LHRH, à laquelle est ajoutée une lysine ou une séquence cystéine-lysine du côté aminoterminal.

D'autre part, la demande de brevet WO 88/05308 divulgue des conjugués constitués à l'aide de fragments de 5, 6 ou 7 acides aminés contigus de la molécule naturelle, dans lesquels chaque fragment inclut l'acide pyroglutamique Nterminal ou le glycinamide carboxyterminal et auxquels un acide aminé ou une séquence d'acides aminés additionnels peuvent être ajoutés à l'extrémité liée à la protéine immunogène.

En ce qui concerne la protéine porteuse, on peut utiliser les sérumalbumines, notamment bovine ou humaine, la thyroglobuline, l'ovalbumine, les globulines humaine ou équine, les anatoxines, notamment l'anatoxine tétanique.

La prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH conjugué par le carbodiimide ou de son agoniste ED-Lys6 ]-
LHRH conjugué par le SPDP sur l'alpha-globuline qui a été observée a conduit à la réalisation de l'invention définissant un conjugué immunogène anti-I;HRH utilisant un peptide avantageux présentant la terminaison carboxyterminale de la LHRH.

La déposante a trouvé qu'il était très avantageux d'utiliser un nouveau peptide comprenant les 8 derniers acides aminés de la LHRH, soit un dêcapeptide de formule
Trp - Ser - Tyr - Gly - Leu - Arg - Pro - Gly - NH2
3 4 5 6 7 8 9 10 qui possède une grande activité immunogène sans présenter l'activité hormonale de la LHRH naturelle.

L'invention a donc pour objet ce nouveau peptide (3-10) et les conjugués l'incorporant couplé à une protéine porteuse immunogène parmi celles citées plus haut, l'ovalbumine et l'alpha-globuline équine, notamment fractions IV-1 et/ou IV-4, étant préférées.

L'invention a aussi pour objet les susdits vaccins anti-LHRH utilisant de tels conjugués comme principe actif.

Les agents de conjugaison utilisés peuvent être classés en trois grandes catégories : les agents d'activation, les agents homobifonctionnels, les agents hétérobifonctionnels.

Alors que, pour les agents d'activation, la liaison entre les deux molécules se fait entre deux fonctions déjà présentes, pour les autres, la liaison se fait par l'intermédiaire d'un résidu hydrocarboné appelé ligand.

Parmi les agents d'activation, on peut citer l'acide periodique employé pour oxyder les résidus oligosaccharidiques des glycoprotéines en aldéhydes, sur lesquels réagiront ultérieurement les groupements amine de l'autre molécule entrant dans le conjugué.

Les carbodiimides sont des agents d'activation largement employés pour le couplage d'antigènes sur les protéines et, parmi eux, le plus utilisé est sans doute le chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl) carbodiimide (EDC) qui permet d'effectuer la réaction en milieu aqueux. Leur action conduit à la formation d'une liaison amide entre un groupement carboxyle d'une protéine, activé de façon intermédiaire sous la forme d'une O-alcoylisourée, et un groupement amine porté par une autre molécule. Leur avantage réside dans leur simplicité d'utilisation.

Les agents homobifonctionnels sont des molécules qui possèdent deux groupements réactifs identiques séparés par une chaîne hydrocarbonée. Parmi eux, citons le glutaraldéhyde, qui réagit sur deux groupements amine primaires, les bisisothiocyanates d'alkyle ou d'aryle, qui réagissent sur les amines primaires et les thiols, la benzidine bisdiazotée, qui copule avec les résidus aromatiques de la tyrosine. Mentionnons pour mémoire les bismaleimides et les bisamidinates. L'inconvénient majeur des agents homobifonctionnels est de mal maîtriser la nature des conjugués formés car ces agents peuvent réagir sur deux molécules de même nature et conduire à la formation d'oligomères ou de polymères.

Pour y remédier, des chimistes ont introduit les agents hétérobifonctionnels, dans lesquels les deux groupements ont des spécificités différentes. Dans le cas général, l'un de ces groupements est un ester du N-hydroxysuccinimide qui, dans des conditions douces, réagit sur les groupements amine libres des protéines pour donner d'une part le Nhydroxysuccinimide et d'autre part la protéine portant par une liaison covalente amide l'agent de couplage sur lequel se trouve la 2ème fonction.Assez généralement, celle-ci peut réagir sur les thiols apportés par la molécule à coupler, ces thiols etant soit initialement présents dans la molécule sous forme de résidus cysteine (ceux-ci pouvant être constitutifs ou, dans le cas de peptides, introduits intentionnellement lors de la synthèse), soit apportés par des agents tels que l'imino-2 thiolane ou le N-((pyridyl2)dithio-3 propanoyloxy) succinimide (SPDP), après reduc- tion.

Dans l'invention, le carbodiimide est préféré au glutaraldéhyde et aux agents hétérobifonctionnels comme agent de conjugaison du peptide LHRH (3-10) notamment sur l'alpha-globuline équine ou l'ovalbumine.

Dans la préparation préférée de conjugue, la LHRH (310) et la protéine porteuse, ovalbumine ou alpha-globuline, sont mises en solution à raison de 2 à 40 mg par ml chacune dans le tampon NaCl 0,lM- acide(N-morpholino)-2 éthane sulfonique 0,lM. Ensuite, 0,5 à 2 volumes de solution de Néthyl-N'(diméthylamino-3 propyl)carbodiimide à 2,5 % dans le même tampon sont additionnés. Le pH est ajusté par addition de soude 1N. Après agitation, le mélange est laissé une nuit, puis est purifié par chromatographie de perméation sur gel, qui élimine la LHRH (3-10) non couplée, le carbo-diimide résiduel et ses produits d'hydrolyse.

L'invention a également pour objet l'immunisation passive anti-LHRH (3-10).

Elle a également trait aux ensembles regroupant dans un même emballage un nombre égal de doses de vaccin à administrer avant l'abattage et de vaccin à administrer en première injection. De préférence ces vaccins sont conditionnés sous volume réduit et concentration augmentée pour ltadministration par jet transcutané, par exemple selon la demande de brevet français précitée.

L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide des essais ayant montré la prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH et de l'essai de vaccination anti-LHRH effectué sur les porcs mâles selon l'invention.

A. Techniques de la mesure de la reponse immunitaire anti-LHRH et de l'efficacité biologique par le dosage de la testostérone plasmatique et de l'androsténone tissulaire.

La réponse immunitaire anti-LHRH est mesurée par le titre en anticorps qui est déterminé selon la technique décrite par JEFFCOATE et al., Acto. Endocr. (Copenh.), 1974, 75, 625-635.

La liaison aux peptides marqués est déterminée après marquage à l'iode 125 des différents peptides selon
COPPOLAND et al., Endocrinology., 1979, 104, 1504-1506. Le titrage des sérums vis-à-vis de ces peptides est effectué selon la technique de JEFFCOATE et al. citée ci-dessus.

L'efficacité biologique est mesurée par l'abaissement ou la disparition de la testostérone plasmatique et de l'androsténone tissulaire. Le dosage de la testostérone plasmatique est effectué directement sur le plasma par une technique RIA utilisant le radioligand testostérone C19-carboxyméthyl éther (125I) histamine (FURUYAMA S. et al., Steroids, 1972, 16, 415). Le dosage de l'androsténone tissulaire est effectué sur un échantillon de tissu adipeux par une technique RIA utilisant le radioligand 5a3H-androsténone, décrite par CLAUS, C.R. Acad. Sci., Paris, 1974, 278, 299-302.

B. Prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH conjugué par le carbodiimide ou de son agoniste [D-Lys6]-LHRH conjugué par le
SPDP sur l'a-gîobuline humaine.

B1. Préparation du conjugué LHRH-a-globuline humaine par le carbodiimide.

Le conjugué est de préférence obtenu par addition à un volume du mélange a-globuline et LHRH, en solution à 2 à 20 mg/ml dans NaC1 0,9%, de 0,5 à 2 volumes de solution de chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl)carbodiimide (EDC) en solution à 2,5% dans NaCl 0,9%. Après agitation, le mélange est laissé une nuit, puis purifié par chromatographie de perméation sur gel.

B2. Préparation des conjugués (D.Lys6] -LHRH) -a-globuline humaine par le SPDP.

La préparation des conjugués ([D.LysJ-LHRH)-a-globuline humaine est réalisée en 3 étapes : préparation de la [N-(pyridyl- 2)-dithio-3 propanoyl-D-Lys-LHRH, préparation de la N-(mercapto-3 propanoyl) a-globuline humaine, puis couplage.

La ENE- (pyridyl-2 ) dithio-3 propanoyl-D-Lys61-LHRH est préparée en faisant réagir un excès de SPDP sur la LHRH, en solution aqueuse (6 moles de SPDP par mole de [D-Lys6]-LHRH, puis, après une nuit à 4 C, en centrifugeant le produit obtenu.

Celui-ci est dissous dans l'urée 8M et les groupements (pyridyl-2)dithio présents sont dosés.

La N-(mercapto-3 propanoyl) a-globuline humaine est obtenue par action de 0,2 mmole de SPDP sur 0,6 g d'a-globuline humaine dissoute dans 100 ml de tampon phosphate 0,lM, puis, après une nuit de contact à 4 C et acidification à pH 6, par réduction par le dithiothréitoî. Elle est ensuite purifiée par chromatographie de filtration sur gel. Le dosage des thiols et des protéines fournit le niveau de substitution moyen.

Le couplage est effectué en prenant un groupement (pyridyl2)dithio pour 1,25 groupement thiol. Le pH est amené à 7-7,5, puis, une heure après, le rendement est déterminé par mesure de la pyridine thione-2 libérée.

Le niveau de substitution moyen s'en déduit. Finalement, le conjugué est purifié par chromatographie et est concentré par ultrafiltration. Le rendement global en [D-Lys6]-LHRH couplée est de l'ordre de 45 à 50%.

B3. La prédominance de la réponse immunitaire des porcs mâles à la fraction carboxyterminale du peptide LHRH conjugué dans les conditions décrites en Al et A2 est déterminée par la comparaison de la fixation par les sérums anti-LHRH et anti-[D Lys6]-LHRH, de deux fragments marqués de LHRH, respectivement
LHRH (3-10), (LHRH délétée de sa fraction aminoterminale) et LHRH (1-10) sous forme d'acide libre, (LHRH délétée de la fraction amide de sa fraction carboxyterminale). Ces deux fragments reconnaissent plus particulièrement les anticorps dirigés respectivement contre les fractions carboxyterminale d'une part, et aminoterminale d'autre part.

La réponse à la fraction carboxyterminale du peptide est générale sur tous les animaux immunisés par l'un ou l'autre des conjugués (68/68). Les sérums de 3 sur 10 des 10 animaux immunisés par la D-Lys6]-LHRH conjuguée et de 10 sur 68 des animaux immunisés par la LHRH conjuguée ont montré exclusivement une fixation de la fraction carboxyterminale. Les autres animaux présentent une réponse mixte dirigée préférentiellement contre la fraction carboxyterminale.

La réponse à la fraction aminoterminale n'est pas générale (55/68). Aucun sérum n'a montré de fixation exclusive à la fraction LHRH acide libre.

C. Essais d'immunoneutralisation active anti-LHRH à l'aide des conjugués LHRH (3-10)-a-globuline équine IV-4 et LHRH (3-10)ovalbumine réalisés par le carbodiimide.

C1. Préparation du conjugué LHRH (3-10)-a-globuline équine
IV-4 par le carbodiimide.

Quatre-vingt-cinq mg de LHRH (3-10) et 170 mg d'a-globuline équine IV-4 sont dissous dans 12,8 ml de tampon NaCl 0,lM - acide (N-morpholino)-2 éthanesulfonique 0,lM. Puis 212 mg de chlorhydrate de N-éthyl-N'-(diméthylamino-3 propyl)carbodiimide dissous dans 17 ml de solution précédente sont ajoutés. Le pH est immédiatement ajusté à 6,0 par addition de 1,3 ml de soude 1N.

Après agitation, le mélange est laissé 16h à température ambiante, puis le conjugué est purifié par chromatographie de perméation sur gel pour séparer le conjugué de la LHRH non conjuguée. La mesure de la quantité de cette dernière permet d'avoir par différence la quantité de LHRH couplée. Il est possible de déterminer le rendement de couplage.

C2. Préparation du conjugué LHRH (3-10)-ovalbumine par le carbodiimide
Soixante mg de LHRH (3-10) et 120 mg d'ovalbumine sont dissous dans 9 ml de tampon NaCl 0,lM - acide (N-morpholino)-2 éthanesulfonique 0,lM. Puis 150 mg de chlorhydrate du N-éthyl-N' (diméthylamino-3 propyl)carbodiimide dissous dans 12 ml du même tampon sont ajoutés. Le pH est ajusté à 7,0 par addition de soude 1N (1,9 ml environ). Le mélange est laissé une nuit à température ambiante, il est ensuite clarifié par centrifugation. Le surnageant est chromatographié sur gel de Séphadex pour séparer le conjugué de la LHRH n'ayant pas réagi et des produits provenant du carbodiimide initial. Par mesure de la quantité de
LHRH (3-10) non fixée, il est possible de déterminer le rendement de couplage de la LHRH (3-10).

C3. Réponse immunitaire, efficacité biologique et tolérance au vaccin anti-LHRH formulé à partir du conjugué obtenu entre les fragments LHRH (3-10) et l'a-globuline équine IV-4 par le carbodiimide.

Les formulations constituées de la LHRH (3-10) conjuguée mises en émulsion eau-dans-l'huile (ler vaccin) et en gel d'hydroxyde d'aluminium et saponine (2e vaccin) ont été administrées à 6 porcs mâles sous un volume de 0,4 ml par dose, respectivement au début de la mise en engraissement et 17 jours avant l'abattage par voie transcutanée à l'aide d'un injecteur sans aiguille dénommé Pigjet délivrant le volume de la dose en 2 applications de 0,2 ml réparties en 5 points à chacune d'elles.

La réponse immunitaire fut maximale 10 jours après l'administration du 2e vaccin. Les titres individuels en anticorps (inverse de la dilution par laquelle l'iode 125 est fixé à 50%) furent respectivement
Jour 10 280 660 2 700 3 200 4 600 13 000
Jour 16 290 400 2 000 2 400 3 100 8 600
L'efficacité biologique de cette réponse immunitaire s'est traduite par la disparition de la testostérone plasmatique dès le 10e jour après l'administration du 2e vaccin chez tous les 6 animaux. La disparition de la testostérone s'accompagne, dans les mêmes conditions, de la disparition de l'androsténone tissulaire.

La tolérance au vaccin est jugée par l'évolution de la réaction inflammatoire cutanée, notée en fonction de l'importance des papules apparaissant à chaque point de délivrance du vaccin après administration. Cette inflammation locale a totalement disparu dès le jour 10 après l'administration du 2e vaccin.

Claims (12)

REVENDICATIONS.

1. Conjugué comprenant le peptide de formule

Trp - Ser - Tyr - Gly - Leu - Arg - Pro - Gly - NH2, couplé à une protéine porteuse immunogène.

2. Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine porteuse immunogène est choisie parmi 1'ovalbumine, les globulines équines et humaines, la thyroglobuline, l'anatoxine tétanique et les sérumalbumines humaine et bovine.

3. Conjugué selon la revendication 2, caractérisé ence que la protéine porteuse immunogène est l'alpha-globuline équine, notamment fraction IV-1 et/ou IV-4.

4. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le peptide et la protéine porteuse immunogène sont couplés par une carbodiimide.

5. Vaccin anti-LHRH conçu pour induire une réponse immunitaire de faible intensité, sans effet notable, ou même mesurable, sur la sécrétion des stéroïdes gonadiques et comprenant comme principe actif un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.

6. Vaccin anti-LHRH conçu pour produire la suppression ou l'abaissement significatif de la sécrétion des stéroïdes sans réaction locale ou générale adverse, susceptible de nuire à l'apparence ou à la qualité de la viande, et comprenant comme principe actif un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.

7. Vaccin selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que le conjugué comprend de l'alpha-globuline équine, notamment fractions IV-1 et/ou IV-4, ou de l'ovalbumine comme protéine porteuse immunogène.

8. Vaccin anti-LHRH selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il est en émulsion eau-dans-lthuile.

9. Vaccin anti-LHRH selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'émulsion comprend un mélange d'huiles minérales hautement purifiées et de tensioactifs non ioniques.

10. Vaccin anti-LHRH selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il est en adjuvant aqueux.

11. Vaccin anti-LHRH selon la revendications 10, caractérisé en ce qu'il comprend un gel d'hydroxyde d'aluminium et/ou saponine.

12. Ensemble de vaccination anti-LHRH comprenant dans un même emballage un nombre égal de doses d'un vaccin à administrer en première injection et d'un vaccin à administrer avant l'abattage, selon l'une quelconque des revendications 5 à 11.