SK282056B6

SK282056B6 - Spôsob zlepšenia organoleptických vlastností mäsa nevykastrovaných samcov domácich zvierat

Info

Publication number: SK282056B6
Application number: SK3280-92A
Authority: SK
Inventors: Raymond Dufour; Claude Roulet; Claire Chouvet; Michel Bernard Bonneau
Original assignee: Merial
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-02-26
Publication date: 2001-10-08
Also published as: SK328092A3; WO1992015330A1; HU9203419D0; ATE194625T1; UA40570C2; DE69231232D1; IE920648A1; PT501882E; EP0501882B1; KR100257214B1; DE69231232T2; TW221674B; CA2081660C; JP3177246B2; CZ328092A3; JPH05506459A; CA2081660A1; HUT63338A; HU214453B; GR3034509T3

Abstract

Vykrmujú sa nevykastrované samce dobytka, oviec a prasiat, pomocou androgénnych a neandrogénnych steroidov umožňujúcich vývoj samčej povahy zvierat. Pred výkrmom, alebo počas neho sa podá zvieratám anti-LHRH vakcína na vyvolanie primárnej imunitnej odpovede s nízkou intenzitou bez význačného alebo dokonca merateľného účinku na gonadálne steroidné sekrécie, za účelom umožnenia rozvoja samčej povahy zvierat a potom sa zvieratám krátko pred porážkou podá druhá dávka anti-LHRH vakcíny na vyvolanie anti-LHRH imunoneutralizácie na zrušenie účinku androgénnych a neandrogénnych steroidov.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu zlepšenia organoleptických vlastností mäsa nevykastrovaných samcov domácich zvierat, najmä dobytka, oviec a prasiat.

Doterajší stav techniky

Výhody výkrmu intaktných namiesto kastrovaných býkov, pri chove domácich zvierat na mäso, sú zdôrazňované zootechnikmi - špecialistami už niekoľko desaťročí. Tieto výhody sú vo väčšej rýchlosti rastu, hlavne u dobytka a oviec, v lepšom využití kŕmnych dávok a v kvalite mäsa zabitého zvieraťa, ktoré je chudšie, ale má súčasne vo všetkých domácich zvieratách vyšší podiel svalového tkaniva (S. C. SEIDEMAN a kol., J. of Animal Science, 1982, 55 (4) 826 - 840, a M. BONNEAU, INRA Prod. Anim., 1988, 1 (2) 133 -140).

Hlavné nevýhody takéhoto chovu intaktných býkov, ktoré sú zvýraznené v uvedených dokumentoch, spočívajú v nepríjemnom zápachu a chuti mäsa zo samcov prasiat a oviec a v menšej krehkosti mäsa z intaktných samcov dobytka a oviec a oprávňujú preto súčasné praktiky chirurgickej kastrácie.

Je skutočnosťou, že androgénne steroidy zahrnujú androstendiol, androstendion a testosterón, ktoré sú rozhodujúcimi faktormi na získanie výhod v chove domácich zvierat, pokiaľ ide rýchly rast a lepšie využitie kŕmnych dávok. Sú zodpovedné za menšiu krehkosť mäsa získaného z intaktných samcov dobytka a oviec. Neandrogénne steroidy alebo deriváty 16-androsteronu vrátane 5a-androstenu (5a-androst-16-en-3-onu) sú sčasti zodpovedné u samcov prasiat za nepríjemný zápach a chuť mäsa získaného potom, čo samčí dosiahli pubertu a tieto faktory znižujú kvalitu mäsa a sú zábranou jeho marketingu v čerstvom stave.

Skatol, zlúčenina odvodená od tiyptofanu a produkovaná mikrobiálnou flórou prítomnou vo vnútornostiach, je látkou čiastočne zodpovednou za nepríjemný zápach a chuť mäsa získaného z intaktných samcov prasiat. Jeho vznik závisí od ekologických, nutričných a chovateľských faktorov. Kumulácia skatolu v adiposovom tkanive je vyššia u kancov a usudzuje sa, že súvisí so sekréciou pohlavných steroidov gonádami.

Pokusne bola skúmaná možnosť zníženia alebo odstránenia samčích vlastností mladých zvierat a sekrécie testikulámych hormónov, hlavne testikulámych steroidov, cestou aktívnej, alebo pasívnej imunoneutralizácie proti týmto hormónom, alebo proti hormónom zúčastňujúcich sa na ich sekrécii, akými sú hlavne luteinizačný hormón alebo LH a hormón gonadoliberín (GnBH), taktiež známy ako hormón uvoľňujúci luteinizačný hormón (LHBH). Na prasatách boli taktiež robené pokusy na zníženie hladiny 5a-androstenonu, hormónu zo skupiny 16-androstenu v tkanive, cestou aktívnej imunizácie proti tejto látke (E. D. WILLIAMSON a kol., Livestock Production Science, 1985, 12, 251 - 264), alebo pasívnej imunizácii proti tej istej látke (R. CLAUS, Immunization with Hormones in Reproduction Research, red. Nieschlag, 1975). Je možné pokúšať sa zastaviť alebo znížiť sekréciu testikulámych steroidov imunoneutralizáciou gonadotropného hormónu LH, ktorý je špecifický pre daný druh (R. E. FALVO a kol., J. Anim. Science, 1986, 63, 986 - 994) alebo anti-LHRH imunoneutralizáciou endogénneho LHBH. Iba aktívna imunizácia pomocou anti-LHRH bola odporúčaná rôznymi autormi. U prasiat sa podarilo docieliť zníženie a-androstenonu touto metódou (A. CARATY a M. BONNEAU, C. R.

Acad. Scí. Paríš 1986, 303, Séria III (16) 673 - 676; R. E. FALVO a kol., J. Anim. Sci., 1986, 63, 986 - 994).

U oviec odporúča B. D. SCHANBACHER (Am. J. Physiol., 1982, 242, E201 - E205) anti-LHRH imunizáciu na spomalenie testikulámeho vývoja a na vyvolanie kastračného účinku u samčích jahniat. P. S. ROBERTSON (Vet. Rec., 1979, 105, 516 - 517) opisuje imunologickú kastráciu dobytka na báze anti-LHRH.

Testovanie imunoneutralizácie na báze anti-LHRH na laboratórnych zvieratách (ARIMURA a kol., Endocrinology, 1973, 93, 1092 - 1103; FRASER, H. M. a kol., J. Endocr. 1974, 63, 399 - 406; MAKINO T. a kol., Contraception, 1973, 8 (2), 133 - 145; CARELLI C., a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1982, 79, 5392 - 5395) a na niektorých domácich zvieratách (JEFFCOATE a kol., Theriogenology, 978, 10 (4), 323 - 335; ROBERTSON I.S. akol, Veterinary Record, 1979, 105, 556; SCHANBACHER, B. D., Am. J. Physiol., 1982,242, E201 - E205) ukázalo, že je možné dosiahnuť zastavenie sekrécie testosterónu, poklesu váhy semenníkov a ich priľahlých žliaz, zastavenie spermatogenézy a na behaviorálnej úrovni vymiznutie libida.

Výsledky tejto práce podnietili návrat k prvej imunoneutralizačnej metóde, založenej hlavne na anti-LHRH, aby bolo možné sa vyhnúť tradičnej chirurgickej kastrácii na chovateľské ciele.

Tak v US patente č. 4,556,555 je opisovaná metóda pasívnej imunizácie zvierat pred pubertou použitím antiséra, ktoré obsahuje protilátky proti gonadotropínu.

Medzinárodná patentová prihláška WO 90/11,298 opisuje metódu anti-LHRH imunizácie pri narodení; používa 2 LHRH sekvencie spojené do tandemu a naviazané na nosič bielkoviny, aby bola zlepšená kvalita mäsa prasiat.

Medzinárodná patentová prihláška WO 88/00,056 opisuje metódu imunologickej kastrácie na báze anti-LHRH, aby sa zlepšilo spoločenské a sexuálne správanie samcov a tak bola odstránená chirurgická nutnosť chirurgickej kastrácie, ktorá ovplyvňuje ich rast. Býky boli očkované vo veku 8 až 40 týždňov a potom dostali niekoľko posilňovacích dávok (boosterov).

Vakcína založená na anti-LHRH (predávaná pod obchodným názvom VAXTRATE austrálskou spoločnosťou WEBSTERS) je používaná pre kravy.

R. E. FALVO a kol. (J. Anim. Sci. 1986, 63. (986 - 994) imunizovali niekoľko skupín býkov pomocou konjugátov LHRH s ľudským sérovým globulínom v kompletnom Freudovom adjuvante alebo s muramylpeptidom ako adjuvantom. Po vakcinácii a použití niekoľkých posilňovacích dávok (boosterov) boli pozorované vysoké titry antiLHRH protilátok, avšak nemuseli sa znova použiť posilňovacie dávky (boosterov), aby tento vysoký titer protilátok udržali.

I. S. ROBERTSON opisuje metódu na imunizáciu pomocou LHRH, naviazaného na tetanový anatoxín alebo na tyroglobulín a usudzuje sa, že tento imunologický postup by umožnil neskoršiu kastráciu s priaznivým dopadom na váhové prírastky. Konštatuje však, že je nutné ďalej skúšať postupy, ktoré by viedli ku kastračnej metóde použiteľnej v praxi, a to ako z hľadiska metódy samej, tak aj i adjuvantu, pretože Freundovo adjuvans je pre prax zakázané.

Konečne A. CARATY a M. BONNEAU (C. R. Acad. Sci. Paris, zv. 303, séria III. č. 16, 1986) urobili imunizáciu na báze anti-LHRH so samcami prasiat. Autori usudzujú, že blokáda produkcie stereidov 2 až 3 týždne pred porážkou by poskytla možnosť využiť veľký potenciál zvierat tohto typu na výrobu mäsa a súčasne, že by sa odstránili problémy spojené s kumuláciou androsterónu v adiposovom tkanive. Uzatvárajú však, že bude nutné ešte ďalej po

SK 282056 Β6 kročiť v imunizačných technikách, kým bude možné navrhnúť metódu aktívnej anti-LHRH imunizácie ako techniku použiteľnú na chovateľské ciele.

Imunoneutralizácia navyše vedie v praxi k vážnym problémom z hľadiska bezpečnosti zákroku, hlavne poldaľ ide o miestne reakcie vyvolané vakcínami, hlavne olejovitými vakcínami a k nebezpečenstvu, že mäso zvieraťa bude nepoužiteľné alebo bude mať nižšiu kvalitu.

Návrhy na zlepšenie organoleptických vlastností mäsa dobytka a oviec neboli doteraz podané.

Prihlasovateľ tohto vynálezu teraz vypracoval priemyselne použiteľný postup, ktorý umožňuje zlepšenie organoleptických vlastností mäsa nevykastrovaných samcov domácich zvierat.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob zlepšenia organoleptických vlastnosti mäsa nevykastrovaných samcov domácich zvierat, pričom sa vykrmujú nevykastrované samce dobytka, oviec a kancov, obsahujúci androgénne a neandrogénne steroidy umožňujúce vývoj samčej povahy zvierat.

Podstata spôsobu podľa tohto vynálezu je v tom, že sa pred výkrmom, alebo počas neho, podá zvieratám anti-LHRH vakcína na vyvolanie primárnej, imunitnej odpovede s nízkou intenzitou bez vyznačeného alebo dokonca merateľného účinku na gonadálnu steroidnú sekréciu za účelom umožnenia rozvoja samčej povahy zvierat, pričom sa zvieratám krátko pred porážkou podá anti-LHRH vakcína na vyvolanie anti-LHRH imunoneutralizácie na zrušenie účinku androgénnych a neandrogénnych steroidov.

Pri spôsobe podľa vynálezu sa najskôr podáva antiLHRH vakcína pred výkrmom.

Najskôr podávaná anti-LHRH vakcína je vakcína v emulznej forme a anti-LHRH vakcína, podávaná pred porážkou, sa podáva bravom pred porážkou s adjuvantom vodného typu.

Výhodne vakcína, podávaná pred porážkou, obsahuje ako adjuvant vodný typ gélu hydroxidu hlinitého alebo saponín alebo ich zmes.

Výhodne sa vakcína podáva vo vodnom adjuvante 15 až 21 dní pred porážkou.

Anti-LHRH vakcína sa podáva býkom a baranom pred porážkou, s adjuvantom v emulznej forme, a to 1 až 2 mesiace pred porážkou, výhodne 4 týždne až niekoľko mesiacov po podaní prvej vakcíny podávanej pred výkrmom alebo počas neho.

Je výhodné podávať vakcínu v emulznej forme, pričom emulzia je typu, voda v oleji.

Pri jednom uskutočnení spôsobu, podľa tohto vynálezu, sa podáva vakcína v emulznej forme typu, voda v oleji, pričom emulzia obsahuje zmes vysoko čistých minerálnych olejov a neiónových povrchovo aktívnych látok.

Pri spôsobe podľa vynálezu sa podávajú anti-LHRH vakcíny obsahujúce konjugát LHRH napojený na imunogénny nosičový proteín, vybraný zo skupiny zahrnujúcej hovädzí sérový albumín, ľudský sérový albumín, tyroglobulín, ovoalbumín, antitoxíny, tetanus antitoxín, konské globulíny a ľudské globulíny.

Výhodne sa vakcína podáva transkutánne na niekoľkých miestach, použitím bezihlového injekčného zariadenia vstrekom pod tlakom.

Výhodne sa podáva vakcína obsahujúca konjugát, ktorý je zložený z LHRH, ktorý je napojený na imunogénny nosičový proteín, vybraný zo skupiny zahrnujúcej konský α-globulín, konský α-globulín frakcie IV-1, konský a-globulín frakcie IV-4 a ich zmesi.

Pri inom postupe sa podáva vakcína obsahujúca LHRH peptid a imunogénny nosičový proteín, ktoré sú napojené na karbodiimid.

Výhodne sa podáva vakcína obsahujúca konjugát zložený z LHRH (3-10), ktorý je napojený na imunogénny nosičový proteín, vybraný zo skupiny zahrnujúcej ovoalbumín, konský α-globulín, konský a-globulín frakcie IV-1, konský a-globulín frakcie IV-4 a ich zmesi, alebo sa výhodne podáva vakcína obsahujúca LHRH (3- 10) peptid a imunogénny nosičový proteín napojené na karbodiimid.

V prvom, preferovanom uskutočnení tejto metódy sa anti LHRH vakcína podá zvieraťu, najlepšie vo forme emulzie, a najlepšie počas výkrmnej fázy alebo pred ňou a potom krátko pred porážkou zvieraťa sa anti-LHRH vakcína aplikuje znova. Postup je možné urobiť v dvoch oddelených podaniach alebo metódou riadeného uvoľňovania.

Prasatám je výhodné podávať anti-LHRH vakcínu spolu s vodným adjuvantom, hlavne s gélom hydroxidu hlinitého a/alebo so saponínom. Aplikácia sa najlepšie urobí 15 až 21 dní pred porážkou.

Naopak, u dobytka, a keď je to vhodné aj u oviec, sa podanie urobí pred porážkou najlepšie s vakcínou v emulznom adjuvante, najlepšie 1 až 2 mesiace pred porážkou. Táto aplikácia sa najlepšie uskutočňuje najmenej 4 týždne a najlepšie niekoľko mesiacov po prvej aplikácii.

V každom prípade vakcína v emulzii, uvažovaná pre prvú aplikáciu a u dobytka pre druhú aplikáciu, je najvhodnejšia vo forme emulzie vody v oleji. Je možné uvažovať však aj o iných emulziách.

Vakcína, najlepšie emulzného typu je navrhovaná podľa tohto vynálezu tak, aby indukovala primárnu imunitnú odpoveď s nízkou intenzitou bez merateľného účinku na sekréciu steroidov gonádami. Formulácia založená na emulzii je preferovaná, aj keď iné formulácie sú taktiež použiteľné, pokiaľ vedú k tomu istému účinku.

Podávanie vakcíny pred porážkou je robené s vakcínou formulovanou tak, aby v tomto štádiu spôsobila zastavenie, alebo významné obmedzenie sekrécie steroidov bez nežiaducej miestnej alebo celkovej reakcie, schopnej spôsobiť zhoršenie vzhľadu alebo kvality mäsa.

Je žiaduce, hlavne u prasiat, zvoliť nasledujúce dve formulácie vhodných roztokov konjugátu najskôr, formuláciu na báze stálej emulzie vody v oleji, pripravenú z vysoko čisteného minerálneho, živočíšneho alebo rastlinného oleja a neiónových povrchovo aktívnych látok, a to tak, aby bola vyvolaná imunitná odpoveď s nízkou intenzitou bez merateľného účinku na sekréciu steroidov gonádami, a za druhé, formuláciu neemulgovateľnú s gélom oxidu hlinitého alebo saponínu, ktorá spúšťa rýchlu a intenzívnu imunitnú reakciu, vedúcu k dostatočnej produkcii neutralizujúcich antiLHRH protilátok tak, aby boli odstránené alebo znížené gonádové steroidy a aby poklesol s tým súvisiaci transport skatolu vzniknutého vo vnútornostiach.

Emulzia, na rozdiel od tej, ktorá sa získa s úplným alebo neúplným Freundovym adjuvantom, je stála emulzia, umožňujúca prípravu vakcíny na okamžité použitie. Zápalová kožná reakcia je veľmi slabá a je lokalizovaná do miest aplikácie vakcíny v obidvoch formuláciách; reakcia sa prejavuje pri vonkajšom prezeraní dobre ohraničenými vyrážkami. Jej vlastný vývoj sa obmedzuje na kožu. Vyrážka mizne bez zanechania granulómov viditeľných pri porážke zvieraťa.

SK 282056 Β6

V inom uskutočnení tejto metódy sa hyperimúnne antiLHRH sérum alebo plazma alebo anti-LHRH monoklonálne protilátky podajú zvieraťu niekoľko dni pred porážkou, najmä 5 až 15 dní vopred.

Pasívna imunizácia na báze anti-LHRH, vyvolávajúca pokles alebo zastavenie sekrécie androgénnych a neandrogénnych steroidov, bola docielená intramuskulárnym podaním hyperimúnnej konskej plazmy. Po dodaní do dostatočnej hladiny, meranej titrom protilátok proti LHRH v sére imunizovaného zvieraťa. Táto imunizácia vedie k poklesu plazmového testosterónu od 3. dňa, ak je udržiavaná na tej istej úrovni počas nasledujúcich 12 dní, je dostatočná na to, aby vyvolala zníženie tkanivového androsterónu na hodnotu pod 0,50 pg/g, pri ktorej hodnote spotrebiteľ už nezistí nepríjemný zápach a zvláštnu chuť mäsa zo samcov prasiat. Táto metóda pasívnej imunizácie ukazuje, že udržiavanie významného poklesu obsahu testosterónu počas 12 dní je dostatočné na zníženie koncentrácie testosterónu v tkanive pod prahovú hodnotu. Pre túto pasívnu imunizáciu je možné uvažovať o použití monoklonálnych anti-LHRH protilátok vylučovaných prasacími hybridómami alebo heterohybridómami.

Spôsob podania týchto formulácií je najlepšie transkutánny, najmä použitím injekčného prístroja bez ihly, a to dýzou pod tlakom, najmä podľa patentovej prihlášky FR-A-2,652,25.

Metóda, podľa tohto vynálezu, má veľkú výhodu v tom, že je celkom bezpečná, najmä, že nevyvoláva miestne reakcie, ktoré by mohli znehodnotiť mäso.

Zápalová reakcia kože zostáva obmedzená na miesta aplikácie obidvoch formulácií a prejavuje sa pri vonkajšom ohliadnutí, formou dobre ohraničených vyrážok. Jej vnútorný vývoj zostáva obmedzený na povrchovú kožu. Vyrážka mizne bez zanechania granulómov, zjavných v čase porážky zvierat. Zápalová reakcia, časovo obmedzená na miesta aplikácie, odráža toleranciu k obidvom formuláciám vakcíny a je docielená ich transkutánna aplikácia použitím injektora bez ihly.

Pre anti-PHRH imunizáciu je nutná kovalentná väzba peptidu LHRH alebo jeho fragmentu, ktoré nie sú imunogénne v ekonomických podmienkach použitia, na imunogénny proteín, nazývaný nosič.

LHRH alebo GnRH, či už prírodný alebo syntetický, je zložený z 10 aminokyselín, číslovaných 1 až 10 od amínového konca ku karboxylovému koncu, podľa tohto vzorca:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly. NH2 123456789 10

Tieto symboly, podľa konvencie, predstavujú: pGlu, pyroglutámovú kyselinu; His, histidín; Trp, tryptofan; Ser, serín ; Tyr, tyrozín; Gly, glycín ; Leu, leucín; Arg, arginín; Pro, prolín.

Anti-LHRH imunogénne konjugáty, opísané rôznymi autormi, môžu byť pripravené pokiaľ ide o hapten,

a) s celým LHRH alebo LHRH modifikovaným na jednom alebo viacerých miestach, aby bola docielená žiaduca aminoterminálna, karboxyterminálna alebo intermediáma konjugácia,

b) s jedným z jeho peptidových fragmentov, zloženým z 5 až 7 aminokyselín, modifikovaných alebo inak upravených, aby bola získaná žiaduca aminoterminálna, karboxyterminálna alebo intermediáma konjugácia,

c) s agonistom nesúcim substituovanú aminokyselinu, najčastejšie v polohe 6, aby bola docielená intermediáma konjugácia.

Pokiaľ ide o nosičovú bielkovinu, používa sa hovädzí sérový albumín, ľudský sérový albumín, tyroglobulín, ovoalbumín a ľudské alebo konské globulíny.

Európska patentová prihláška EP-A-181,236 opisuje imunogénne konjugáty zobsahujúce nonapeptid alebo dekapeptid so sekvenciou odpovedajúcou posledným 8 aminokyselinám molekuly LHRH, ku ktorým je pridaný lyzín alebo sekvencia cysteín - lyzín na aminoterminálnom konci.

Navyše patentová prihláška WO 88/05,308 uvádza konjugáty pripravené s použitím fragmentov, obsahujúcich 5, 6 alebo 7 susedných aminokyselín z molekuly prirodzeného peptidu, kde potom každý fragment obsahuje N-terminálnu pyroglutámovú kyselinu alebo karboxyterminálny glycínamid a kde je možné ku každému fragmentu pridať navyše ďalšiu aminokyselinu alebo sled aminokyselín ku koncu pripojenému na imunogénnu bielkovinu.

Konjugačné činidlá spadajú do troch hlavných kategórií: aktivačné činidlá, homobilunkčné činidlá a heterobifunkčné činidlá Oproti tomu v aktivačných činidlách je väzba medzi obidvoma molekulami uskutočnená väzbou medzi obidvoma funkciami už prítomnými, v ostatných činidlách je väzba uskutočnená uhľovodíkovým zostatkom zvaným ligand.

Z aktivačných činidiel je možné menovať kyselinu jodistú, používanú na oxidáciu oligosacharidových zostatkov na aldehydy, s ktorými aminová skupina druhej molekuly, zúčastňujúca sa na konjugáte, následne reaguje.

Karbodiimidy sú aktivačné činidlá široko používané na väzbu antigénov na proteíny; z nich najväčšie použitie zaznamenal určite N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimíd (EDC) hydrochlorid, ktorý umožňuje uskutočnenie reakcie vo vodnom prostredí. Pôsobenie karbodiimidov vedie k vytvoreniu amidovej väzby medzi karboxylovou skupinou jedného proteínu, aktivovaného vo forme intermediárnej O-alkylizomočoviny a amínovou skupinou nesenou inou molekulou. Ich výhoda je v ľahkom použití.

Homobifimkčné činidlá sú molekuly nesúce dve identické reaktívne skupiny oddelené uhľovodíkovým reťazcom. Z týchto činidiel je možné menovať glutaraldehyd, ktorý reaguje s dvoma primárnymi aminovými skupinami, alkyl, alebo arylizoditiokyanáty reagujúce s primárnymi amínmi a tiolmi a bisdiazotovaný benzidín, ktorý sa viaže na aromatické zostatky tyrozínu. Bismaleínimidy a bisamidináty je možné menovať pre úplnosť. Hlavnou nevýhodou homobifunkčných činidiel je zložitosť regulácie vznikajúcich konjugátov, pretože tieto činidlá môžu reagovať s dvoma molekulami toho istého charakteru a tak viesť k vzniku oligomérov alebo polymérov.

Chemici, aby tomu zabránili, vyvinuli heterobifunkčné činidlá, v ktorých tieto dve skupiny majú odlišné špecifiká. Vo všeobecnom prípade, jedna z týchto skupín je ester N-hydroxysukcínimidu, ktorý pri miernych podmienkach reaguje s voľnými aminoskupinami bielkovín a poskytuje jednak N-hydroxysukcínimid, jednak bielkovinu spojenú kovalentnou väzbou s kopulačným činidlom, na ktorom je druhá funkcia. Všeobecne táto funkcia môže reagovať s tiolmi poskytovanými molekulou, na ktoré sa viaže, či už sú tieto tioly buď od začiatku prítomné v molekule ako cysteínové zostatky (môžu tvoriť jej prirodzenú zložku, alebo v prípade peptidov môžu byť úmyselne zabudované do molekuly počas syntézy), alebo sú poskytované takými činidlami, ako sú 2-iminotiolan alebo N-[3-(2-pyridylditio)propanoyloxyjsukcínimid (SPDP) po redukcii.

Z opísaných možností je najlepšie zvoliť celý LHRH. V tomto prípade sa dá prednosť prirodzenému LHRH pred agonistami, ako je (D-Lys⁶)-LHRH), čo vyplýva z porov4

SK 282056 Β6 nania imunogénnej aktivity konjugátov pripravených použitím týchto dvoch peptidov.

Karbodiimid má prednosť pred glutaraldehydom ako činidla na konjugáciu prirodzeného LHRH s a-globulínom.

Ľudský alebo konský α-globulín, frakcie IV-1 alebo IV-4, sú preferované pred ľudským alebo hovädzím sérumalbumínom.

Je žiaduce, aby vakcíny obsahovali ten istý aktívny princíp, prednostne konjugát α-globulínu s LHRH. LHRH je najlepšie prirodzený LHRH a α-globulín ľudského alebo konského pôvodu sú hlavne frakcia IV-1 a/alebo IV-4. Konjugát je prednostne získavaný pridaním 0,5 až 2 objemov 2,5 %-ného roztoku hydrochloridu N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropylj-karbodiimidu (EDC) v 0,9 % NaCl k 1 objemu zmesi α-globulínu a LHRH v roztoku obsahujúcom 2 až 20 mg tejto zmesi v ml 0,9 % NaCl. Po premiešaní je zmes ponechaná počas noci a potom prečistená gélovou permeačnou chromatografiou.

Pokiaľ ide o nosičovu bielkovinu, je možné použiť sérové albumíny, najmä sérové albumíny hovädzieho alebo ľudského, tyroglobulínu, ovoalbumínu, ľudského alebo konského globulínu a anatoxínov, hlavne tetanového anatoxínu.

Pozorovaný veľký rozsah imunitnej odpovede samcov prasiat na karboxyterminálnej frakcii LHRH peptídu konjugovaného pomocou karbodiimidu alebo jeho agonistu. (D-Lys⁶)-LHRH, konjugovaného pomocou SPDP, s a-globulínom, vedie k definícii imunogénneho konjugátu na báze anti-LHRH, používajúci výhodne peptid obsahujúci karboxylový koniec LHRH.

V dôsledku toho a podľa druhého preferovaného uskutočnenia vynálezu bolo teraz zistené, že je veľmi výhodné použiť nový peptid, ktorý obsahuje posledných 8 aminokyselín LHRH, čiže dekapeptid zloženia:

Tip- Ser - Tyr - Gly - Leu - Arg - Pro - Gly. NH₂ , 34567 8 9 10 ktorý má veľkú imunogénnu aktivitu a pritom nevykazuje hormonálnu aktivitu prirodzeného LHRH.

Výhodný je teda tento nový peptid (3 -10) a konjugáty tento peptid zahrnujúce, naviazaný na jednu z uvedených imunogénnych nosičových bielkovín, ovoalbumin a konský α-globulín, najmä na frakcie IV-1 a/alebo IV-4, ktoré sú preferované.

V tomto vynáleze je karbodiimid výhodnejší ako glutaraldehyd a ako heterobifunkčné činidlá ako činidlá na konjugáciu LHRH (3 - 10) peptídu hlavne s konským a-globulínom alebo s ovoalbumínom.

Pri výhodne používanej príprave konjugátu sa LHRH (3 - 10) a nosičová bielkovina, ovoalbumin alebo a-globulín, rozpustí každý v pomere 2 až 40 mg na ml pufŕu 0,1 M NaCl/0,1 M 2-(N-morfolino)etánsulfónová kyselina. Potom sa pridá 0,5 až 2 objemy 2,5 % -ného roztoku N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu v tom istom pufri. Hodnota pH sa nastaví 1 N NaOH. Po premiešaní sa zmes odstaví počas noci a potom sa prečistí gélovou permeačnou chromatografiou, ktorá odstráni nenaviazaný LHRH (3 - 10), zostatok karbodiimidu a hydrolyzačné produkty.

Vynález bude teraz opísaný podrobnejšie pomocou príkladov porovnávajúcich testy rôznych produktov a vakcinačných metód, podľa tohto vynálezu na jednej strane a na druhej strane pomocou testov, ktoré preukázali veľký rozsah imunitnej odpovede u samcov prasiat na karboxyterminálnu časť LHRH peptídu a testov vakcinácie na báze

LHRH uskutočnené na samcoch prasiat, podľa tohto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

I - Použitie celého LHRH

A. Väčšia imunogénna aktivita konjugátu zachovávajúceho najdlhšiu karboxyterminálnu časť LHRH peptidov a výber konjugátu založeného na prirodzenom LHRH výhodne pred konjugátom získaným na báze agonistu (D-Lys⁶)-LHRH.

Al. Anti-LHRH imunizácia intaktných samcov prasiat a samcov krýs. Porovnanie aktivity dvoch anti-LHRH vakcín zložených z konjugátov prírodnej formy LHRH (BI a B2) alebo (D-Lys⁶)-LHRH (Al a A2) s ľudským albumínom, pričom konjugáty sú získané pomocou karbodiimidu vo vodnej fáze, resp. pomocou SPDP, uvedené do emulzie oleja vo vode a podané intramuskuláme prasatám a subkutánne krysám, vedie k týmto záverom:

- vyššia aktivita vakcíny založenej na prirodzenom LHRH: je potrebné menšie množstvo LHRH peptídu ako konjugovaného (D-Lys⁶)-LHRH peptídu, aby sa získal väčší počet zvierat dávajúcich imunitnú odpoveď (tabuľka 1 a 3).

- účinok dávky, ktorý sa prejavuje v získaní väčšieho počtu zvierat dávajúcich imunitnú odpoveď s rovnakým konjugátom (tabuľka 3).

A 1.1 - Príprava konjugátov (D-Lys⁶)-LHRH s albumínom pomocou SPDP. Príprava konjugátov (D-Lys⁶)-LHRH je uskutočňovaná v troch stupňoch: príprava {N-[3-(pyridylditio)propanoyl]-D-Lys⁶}-LHRH, príprava N-(3-merkaptopropanoyljalbumínu, potom väzba.

(N'-[3-(2-Pyridylditio)propanoyl]-D-Lys⁶j-LHRH sa pripraví reakciou prebytku SPDP s LHRH vo vodnom roztoku (6 mólov SPDP na mól LHRH) a potom po odstavení reakčnej zmesi pri 4 °C počas noci, sa produkt získa odstredením. Ten sa rozpusti v 8M močovine a testuje sa prítomnosť 2- pyridylditio-skupín.

N-(3-Merkaptopropanoyl)albumín sa získa pôsobením 0,2 mmol SPDP na 1 g ľudského albumínu rozpusteného v 100 ml fosfátového pufru a po odstavení reakčnej zmesi pri 4 °C, počas noci, a jej okyslení na pH 6 redukciou ditiotreitolom. Potom je produkt prečistený chromatografiou. Skúška tíolov a proteínov poskytne údaj o stupni substitúcie.

Naviazane je uskutočnené použitím jednej pyridyltiotioskupiny na 1,25 tiolových skupín. pH sa nastaví na 7 až 7,5 a po jednej hodine sa výťažok stanoví meraním uvoľneného 2-pyridíntionu.

Priemerný stupeň substitúcie je odvodený zo získaného údaja. Konečne je konjugát prečistený chromatografiou a skoncentrovaný ultrafiltráciou.

A 1.2. Príprava konjugátu LHRH s albumínom pomocou karbodiimidu. Hydrochlorid N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu v množstve 1000 mg, rozpustený bezprostredne pred použitím v 40 ml 0,9 % -ného NaCl, sa pridá do 300 mg LHRH a 300 mg ľudského albumínu, rozpustených v 30 ml 0,9 %-ného NaCl. Po premiešaní sa zmes odstaví, počas noci, pri laboratórnej teplote a chráni sa pred svetlom. Potom sa zmes chromatografúje na Sephadexe G-50, frakcie zodpovedajúce konjugátu sú zbierané, prípadne skoncentrované a zmrazené.

Vo frakciách obsahujúcich nenaviazaný LHRH sa stanoví jeho množstvo a tým priemerná hladina konjugácie.

SK 282056 Β6

Táto hodnota je reprodukovateľná a kolíše medzi 8 a 10 mg LHRH na 100 mg albumínu.

Výťažok chromatografie konjugátu a tým aj množstvo (alebo koncentrácia) LHRH sú odvodené z ultrafialových spektier konjugátu pred a po chromatografii.

A1.3. Testovacie postupy

Titer protilátok sa stanoví technikou opísanou JEFFCOATOM a kol., Acta Endocr., Copenh., 1974, 75: 625 - 635.

Testosterón sa stanovuje priamo v plazme technikou RIA, používajúcou testosterón C19-karboxymetyléter['“jjhistamín ako rádioligand.

Väzba na značený peptid sa stanoví po substitúcii rôznych peptidov jódom-125 podľa COPPOLANDA a kol., Endocr., 1979, 104. 1504 - 1506 a technikou opísanou JEFFCOATOM a kol., Acta Endocr., Copenh., 1974, 75, 625 - 635.

A1.4 - Znázornenie

- Testy na krysách

- Tabuľka 1: odpoveď anti-LHRH protilátok meraná podľa stupňa väzby LHRH označeného jódom -125.

- Tabuľka 2: účinok anti-LHRH imunizácie na koncentráciu testosterónu

- Dávkovanie

Vakcíny Al: 50 pg konjugovaného (D-Lys⁶)-LHRH

BI: 12 pg konjugovaného LHRH

- Testy na intaktných samcoch prasiat

- Tabuľka 3: odpoveď anti-LHRH protilátok meraná stupňom väzby LHRH značeného jódom 125.

- Dávkovanie

Vakcíny Al: 0,5 mg konjugovaného (D-Lys⁶)-LHRH

Až: 6 mg konjugovaného (D-Lys⁶)-LHRH

BI: 0,15 mg konjugovaného LHRH

B2:1,20 mg konjugovaného LHRH

Tabuľka 1

Odpoveď anti-LHRH protilátok meraná stupňom väzba LHRH označeného jódom -125

Testovanie protilátok (% pl/č) v sére

Injekcia	Cas	Skupina A1	Skupina Bi	Trter
	týždefl	50 μρ	12 PS	PVC s
		D-lysUHRH ihsa/aei	LHRH/EDC/HSA/AE	50%
SC	0		-
SC	4	0,0	15.4	<100
		7, B	7.8	<100
		0,0	35,3	<100
		0.0	51,1	100
		4.3	81,1	1600
		14,1	85,3	980
		5,8	70,8	270
		15.8	04,9	2100
	6	0,0	64.3	120
		11.3	67 9	220
		11,7	98,1	2400
		0.0	68.3	280
	7	14,6	72.5	400
		0.0	82,4	2100
		0.0	84.2	200
		11.5	67.2	240
	B	19,6	70.4	310
		0.0	88,8	3200
		9.2	68.7	2200
		o.o	38,8	310

Tabuľka 2

Účinok anti - LHRH imunizácie na koncentráciu testosterónu v plazme

Testovanie testosterónu v plazme krýs (ng/ml)

Injekcia	Ca« Týždeň	Kontroly	Skwina A i , 50« O-Lvs'-LHRH JPOP/AE1	Skupina B1 12 LHRH/EDOHSA
SC	0	0.40
		Q.28
		0.47
		0,00
SC	4	2,25	4.18	2.51
		1.05	5,83	2,38
		2.34	4.43	3,63
			4.17	0.58
	5	3,80	2,89	0,00
		1,78	2.33	0.00
		5.05	2.85	0,00
		6,87	1.54	0,00
	8	2.01	3,26	0,00
		4.47	0.09	0.00
		4,69	1.10	0,00
		1.96		0,00
	7	2.28	1,32	0,00
		1,82	0.89	0,00
		1.89	1.59	0,00
		1,65	2.17	0,00
	8	0.97	1.75	0,00
		1.91	1.48	0,00
		2,71	1.91	0,00
		1,22	2,33	0,00

Tabuľka 3

Odpoveď anti-LHRH protilátok meraná stupňom väzby

LHRH značeného j ódom-125

Testovanie anti-LHRH protilátok v sére (zriedenie 1/50)

A2 - Porovnávací test dvoch anti-LHRH vakcín zložených z konjugátu LHRH s α-globulinom pripraveného pomocou karbodiimidu, resp. konjugátu (D-Lys⁶)-LHRH s α-globulinom pripraveného pomocou SPDP a aplikovaných v emulzii oleja vo vode intramuskuláme (IM) alebo transkutánne (ID) prasatám.

A2.1 - Príprava konjugátu (D-Lys⁶)-LHRH s a-globulínom pomocou SPDP. Metóda opísaná v príklade 1 sa použije presne rovnakým spôsobom, ale albumín v koncentrácii 10 mg/ml sa nahradí α-globulínom v koncentrácií 6 mg/ml.

Celkový výťažok naviazaného (D-Lvs⁶)-LHRH je radovo 45 až 50 %.

Navyše je možné modifikovať ľubovoľne stupeň substitúcie α-globulínu a tak stupeň konjugácie tým, že sa mení koncentrácia SPDP a/alebo α-globulínu počas prípravy MP-a-globulinu.

A2.2 - Príprava konjugátu LHRH s ľudským a-globulínom pomocou karbodiimidu (EDC).

SK 282056 Β6

Použije sa metóda opísaná v príklade Al rovnakým spôsobom, ale ľudský albumín sa nahradí ľudským a-globulínom. Hladina konjugácie je 24 až 28 mg LHRH viazaného na 100 mg ľudského a-globulínu.

A2.3 - Účinnosť vakcíny založenej na konju^áte LHRH s α-globulínom je vyššia ako v druhej vakcíne. Účinnosť je vyjadrená v počte zvierat, ktoré vykazujú úplné vymiznutie testosterónu z plazmy.

Tabuľka 4

	LHRH a-globulín EDC 0.2 mg) IM + ID	(O-Lys’)-LHRH-a-gtobulinSPOP (Sme) IM UO
Zmiznutie testosterónu	5/10	2/10A

Veľký rozsah imunitnej odpovede, u samcov prasiat, na aplikáciu karboxyterminálnej peptidovej frakcie LHRH konjugovanej pomocou karbodiimidu alebo jeho agonistami (D-Lys^ó)-LHRH, konjugovaného pomocou SPDP na ľudský a-globulín.

Táto odpoveď sa stanoví z porovnania percenta väzby anti-LHRH a anti-(D-Lys⁶)-LHRH sér dvoma značenými fragmentárni LHRH a to LHRH (3 -10) s deléciou aminoterminálnej časti a LHRH (1 -10), ktorý je vo forme voľnej kyseliny v dôsledku dclécie uskutočnenej v jeho karboxyterminálnej časti. Tieto dve frakcie špecificky rozoznávajú protilátky proti karboxyterminálnej, resp. aminoterminálnej časti reťazca peptidu.

Rozsiahla odpoveď, na karboxyterminálnu časť reťazca peptidu, sa prejavuje v počte zvierať ktoré majú protilátky viažuce iba peptid LHRH (3 - 10) oproti tým, ktoré majú protilátky viažuce výlučne LHRH vo forme voľnej kyseliny (10/58 v anti-LHRH sére a 3/10 v anti-(D-Lys⁶)-LHRH sére).

Žiadne sérum nevykazovalo 100 %-nú väzbu LHRH vo forme voľnej kyseliny, ktorá by ukazovala na špecifické rozpoznanie aminotermálnej frakcie.

Najčastejšie boli zmiešané odpovede, ktoré vykazovali lepšie rozpoznanie aminoterminálnej frakcie anti-(D-Lys⁶)-LHRH sérami ako anti-LHRH sérami. Z anti-LHRH sér iba 3 z 58 vykazovali rozpoznávaciu schopnosť pre aminoterminálnu frakciu vyššiu ako 40 %, kým v anti-(D-Lys⁶)-LHRH sérach táto hodnota bola 4 séra z 10.

B - väčšia imunogénna aktivita konjugátu LHRH s a-globulínom, pripraveného pomocou karbodiimidu, v porovnaní s konjugátom pripraveným pomocou glutaraldehydu.

B.l - Príprava konjugátu LHRH s α-globulín pomocou glutaraldehydu

Objem 2,5 ml roztoku glutaraldehydu, ktorý obsahuje 10 mg/ml, sa pridá po kvapkách počas 30 min do 10 mg LHRH a 50 mg ľudského α-globulínu (Serva), rozpustených v 5 ml 0,lM fosfátového pufru s pH 7,5; po každom pridaní sa premieša. Reakčná zmes sa nechá 2,5 h pri laboratórnej teplote a reakcia sa zastaví prídavkom 25 mg bisulfitu sodného rozpusteného v 5 ml vody. Konjugát sa dialyzuje pri 4 °C oproti 150 mM NaCl v 10 mM fosfátovom pufre s pH 7,5 a potom sa skoncentruje ultrafiltráciou.

B.2 - Porovnávací test anti-LHRH vakcín obsahujúcich rovnaké množstvo konjugovaného LHRH na prasatách (tabuľka?).

Tabuľka 7

	LHRH-a-globulln (pripr. s karboditmidoin) podaný IM alebo ID	LHRH-a-fltobuiln (pripr. s glutaraklehydom) podaný IMafebolD
Zmiznutie testosterónu z plazmy	5/10	0/10

C - vyššia imunogénna aktivita konjugátu založeného na ľudskom α-globulíne v porovnaní s konjugátom na báze ľudského sérumalbumínu.

Účinnosť vyjadrená počtom zvierat, ktoré vykazujú úplné zmiznutie testosterónu z ich plazmy (tabuľka 8).

Tabuľka 8

Testy na prasatách - intramuskuláme injekcie

	IHRH-HSA pripravený s karbodbmdom	LHRH-a-gtobuHn pripravený s kartxxtamidom
Zmiznutie testosterónu z plazmy	0/5	3/5

D - Imunogénna aktivita konjugátu, používajúceho konský α-globulín, frakciu IV-1, ekvivalentný konjugátu založenému na ľudskom a-globulíne.

D.I - Príprava konjugátu LHRH s konským a-globulínom pomocou karbodiimidu.

Je použitý rovnaký spôsob ako je opísané v príklade Al s takým rozdielom, že ľudský albumín sa nahradí konským α-globulínom (frakcia IV-1).

D.2 - Subkutánna aplikácia vakcíny, v dávke 12 pg LHRH konjugovaného s ľudským alebo konským a-globulínom, krysám dvakrát v intervale 4 týždňov.

Tabuľka 9

	LHRH -ľudský -a-gtobuBn frakcie IV-1 pripravený s kartsodimidom	LHRH* konský a*globdin Frakcia IV-1 pripravený» kafbodämkkxn
Zmiznutia testosterónu z plazmy	12/12	12712

E - väčšia adjuvantná aktivita emulzie oleja vo vode podľa vynálezu oproti iným emulziám (tabuľka 10).

Testy robené na prasatách použitím toho istého konjugátu zloženého z LHRH a ľudského α-globulínu pripraveného pomocou karbodimidu, aplikovaná tiež dávka transkutánne na 5 miestach.

Skúmané emulzie: kvapalná emulzia oleja vo vode (B), emulzia podľa vynálezu (vzorka C v tabuľke), komerčná emulzia riedená antigénom (E) a olejová fáza emulzifikovaná s konjugátom (F).

Vo všetkých týchto formuláciách bolo konečné množstvo antigénu v dávke rovnaké.

Emulzie boli pripravené za obvyklých podmienok používaných tými, ktorí sa zaoberajú formuláciami tohto typu.

SK 282056 Β6

Tabuľka 10

Tabuľka 13

Emulzia	B	C	E	F
Zmiznutie testosterónu z plazmy	2/5	4/4	175	3/5
Počel zvierat vykazujúcich koncentráciu aldosteronu v tkanive pod 0,5 μρ/g	2/5	4/4	3/5	3/5

F. Účinnosť pasívnej anti-LHRH imunizácie na zlepšenie organoleptických vlastností mäsa, meraná poklesom androstenonu v tkanive.

Tabuľka 11

Obsah androsteronu vadiposovom tkanive kontrolných zvierat a zvierat podrobených pasívnej imunoneutralizácii pomocou hyperimúnnej konskej anti-(D-Lys⁶)-LHRH plazmy podanej v objeme 300 mí 16., 13., 9. a 5., deň pred porážkou

	Kontroly	Ošetrení pokusné zvieratá
Počet zvierat vykazujúcich koncentráciu androstenonu pod 0,50 pg/jj adiposovóho tkaniva	2/5	5/5

(signifikantný rozdiel pri α-riziku = 0,2)

G. - Účinnosť a tolerabilita formulácií obsahujúcich LHRH konjugovaný s α-globulínom pomocou karbodiimidu vo forme emulzie vody v oleji (1. vakcína) a v hydroxide hlinitom a saponíne (2. vakcína); podané transkutánne s obsahom rovnakého množstva LHRH, v dávke na začiatku výkrmného obdobia, resp. 18 až 21 dní pred porážkou s použitím injektora bez ihly známeho ako Pigjet.

Dva testy boli urobené v dvoch rôznych intervaloch, a to pre skupiny 1, 3 a 5 v prvom intervale a pre skupiny 2 a 4 v druhom intervale (tabuľka 12 a 13).

G.l - Účinnosť imunoneutralizácie s pomocou antiLHRH rastie pri rovnakom objeme vakcíny s počtom miest transkutánnej aplikácie.

Tabuľka 12

Skupina			3	4	5
1. vakcína	1 mi (5 miest)	1 ml (3 miesta)	1 ml (5 miest)	0.4 ml (10 miest)	0.4 ml β miesta)
2. vakcína	tmi (5 miest)	1 ml (5 miest)	0.4 mi (2 miesta)	0.4 ml (10 miest)	0.4 ml (2 miesta)
Zmiznutie alebo výrazný pokles testosterónu (počet zvierat)	10/12	1D/1Í	9/12	11/11	8/11
Koncenliáwa androstenonu v tkanive pod 0,5 pg/g (počet	11/12	A	10/23	n	n

n = nestanovené

G.2 - Tolerancia k vakcínam je posudzovaná podľa vzniku zápalovej reakcie na koži, odstupňovanej od 0 do 4, na danom zvierati, podľa veľkosti vyrážok objavujúcich sa po aplikácii; vyrážka sa objavuje na každom mieste aplikácie. Súčet, takmer v každej skupine, je sumarizovaný takto; priemerné skóre na konci prvého týždňa, po aplikácii (apl. 1) a priemerné skóre v čase porážky, pre každú vakcínu (SI) (tabuľka 13). Najlepšia tolerancia je pozorovaná pri použití vakcín v skupine 4.

Tolerancia pri transkutánnej aplikácii počas dvoch testov (test 1 so skupinami 1,3 a 5, test 2 so skupinami 2 a 4)

II - POUŽITIE PEPTIDU (3 -10)

A. Techniky merania anti-LHRH imunitnej odpovede a biologickej účinnosti pomocou stanovenia testosterónu v plazme a tkanive.

Imunitná odpoveď anti-LHRH je meraná stanovením titra protilátok, postupom opísaným JEFFCOATOM a kol., Acta Endocr. (Copenh.), 19/4, 75 625 - 635. Väzba na označené peptidy sa stanoví po substitúcii rôznych peptidov jódom-125 podľa COPPOLANDA a kol., Endocrinology, 1979, 104 1504 - 1506. Stanovenie séra v zmysle obsahu týchto peptidov sa robí postupom JEFFCOATA a kol., opísaným.

Biologická účinnosť sa posudzuje podľa zníženia alebo zmiznutia testosterónu z plazmy a tkaniva. Test testosterónu v plazme sa uskutočňuje priamo s plazmou RIA technikou s použitím rádioligandu, ktorým je testosterón C19-karboxymetyléter-[^l25I]histamín (FURUYAMA S. a kol., Steroids, 1972, 16,415). Test testosterónu v tkanive sa vykonáva, so vzorkou adiposovho tkaniva, pomocou RIA techniky, použitím rádioligandu, ktorým je 5a-[³H] androstenon opísaný CLAUSENOM, C. R. Acad. Sci., Paris, 19/4, 229 - - 302).

B. Veľký rozsah imunitnej odpovede samcov prasiat na karboxyterminálnu frakciu LHRH peptidu konjugovaného s α-globulinom pomocou karbodiimidu alebo jeho agonistov (D-Lys^-LHRH, konjugovaného pomocou SPDP.

BI. Príprava konjugátu LHRH- ľudského α-globulinu s karbodiimidom. Konjugát sa výhodne získava pridaním 0,5 až 2 objemov 2,5 %-ného roztoku hydrochloridu N-etyl-N'-(3-dicmtylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) v 0,9 % NaCl na jeden objem zmesi α-globulín/LHRH v roztoku obsahujúcom 2 až 20 mg tejto zmesi v jednom ml 0,9 %-ného NaCI. Po premiešaní sa zmes odstaví počas noci a potom sa prečistí gélovou chromatografiou.

B2. Príprava konjugátov (D-Lys^ó)-LHRH s ľudským a-globulínom pomocou SPDP.

Príprava konjugátov (D-Lys⁶)-LHRH s ľudským a-globulínom sa uskutočňuje v troch stupňoch, ktorými sú; príprava {N-[3-(2-pyridylditio)propanoyl]-D-Lys⁶} -LHRH, príprava N-(3-merkaptopropanoyl) derivátu ľudského a-globulínu a nakoniec po jednej noci pri 4 °C odstredením získaného produktu, ktorý sa rozpustí v 8M močovine a stanovia sa 2-pyridylditioskupiny.

{N'-[3-(2-Pyridylditio)propanoyl]-D-Lys⁶} -LHRH sa pripraví reakciou prebytku SPDP s LHRH vo vodnom roztoku (6 mólov) SPDP na mól (D-Lys⁶)-LHRH), zmes sa nechá pri 4 °C počas noci, a potom sa produkt získa centrifugáciou. Produkt sa rozpustí v 8M močovine a potom sa testuje obsah 2- pyridylditioskupín.

N-(3-merkaptopropanoyl) derivát ľudského a-globulínu sa získa pôsobením 0,2 mmol SPDP na 0,6 g ľudského α-globulínu rozpusteného v 100 ml 0,1 M fosfátového pufru; po reakcii, počas noci pri 4 °C a okyslení na pH 6 sa produkt získa redukciou ditiotreitolom. Produkt sa potom prečistí gólovou chromatografiou. Priemerný stupeň substitúcie sa posudzuje podľa stanovenia obsahu tiolových skupín a bielkoviny.

Väzba sa uskutoční použitím jednej 2-pyridylditioskupiny na 1,25 tiolových skupín. Hodnota pH sa nastaví na 7 až 7,6. Po jednej hodine, sa stanoví výťažok zmeraním uvoľneného 2-pyridíntionu.

Priemerný stupeň substitúcie je dedukovaný z tejto hodnoty. Konjugát sa nakoniec prečistí chromatografiou a skoncentruje ultrafiltráciou. Celkový výťažok naviazaného (D-Lys⁶)-LHRH je radovo 45 až 50 %.

B3. Rozsah imunitnej odpovede samcov prasiat na aplikáciu kaiboxyterminálnej frakcie peptidu LHRH konjugovaného v podmienkach opísaných v Al a A2 sa stanoví z porovnania väzbových schopností anti-LHRH séra a anti(D-Lys⁶)-LHRH séra. Pre dva označené fragmenty LHRH, (LHRH (3-10) LHRH s deléciou v aminotermálnej časti reťazca) a LHRH (1 -10) vo forme voľnej kyseliny (LHRH s deléciou amidovej skupiny v karboxyterminálnej časti reťazca). Tieto dve frakcie rozoznávajú s väčšou špecifickou protilátky proti karboxyterminálnej frakcii, na strane jednej, a aminoterminálnej frakcii na strane druhej.

Odpoveď na karboxyterminálnu frakciu peptidov dávajú všeobecne všetky zvieratá imunizované jedným alebo druhým konjugátom (68/68). Séra 3 z 10 zvierat z celkového počtu 10 imunizovaných konjugátom (D-Lys⁶)-LHRH a séra 10 zvierat z celkového počtu 68 imunizovaných konjugovaným LHRH, viazali výhradne karboxyterminálnu frakciu. Ostatné zvieratá dávajú zmiešanú odpoveď prevažne na karboxyterminálnu frakciu.

Odpoveď na aminoterminálnu frakciu nemá všeobecný výskyt (55/68). Žiadne sérum neviazalo špecificky LHRH vo forme voľnej kyseliny.

C. Testy aktívnej anti-LHRH imunoneutralizácie použitím konjugátu LHRH (3 - 10) s frakciou IV-4 konského α-globulínu a konjugátu LHRH (3 - 10) s ovoalbumínom, pripravených pomocou karbodiimidu.

Cl. - Príprava konjugátu LHRH (3 - 10) s frakciou IV-4 konského α-globulínu pomocou karbodiimidu.

LHRH (3 -10) v množstve 85 mg a 170 mg frakcie IV-4 konského α-globulínu sa rozpustí v 12,8 ml pufru so zložením 0,1 M NaCl/0,1 M 2-(N-morfolino)etánsulfónová kyselina. Potom sa pridá 212 mg N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu rozpusteného v 17 ml uvedeného roztoku. Hodnota pH sa ihneď nastaví na 6,0 pomocou 1,3 ml 1 N hydroxidu sodného.

Zmes sa premieša a odstaví na 16 h, pri laboratórnej teplote, a konjugát sa potom prečistí gélovou permeačnou chromatografiou, aby sa oddelil konjugát od nczkonjugovaného LHRH. Odpočítaním nezkonjugovaného LHRH je možné stanoviť množstvo naviazaného LHRH. Takto je možné stanoviť výťažok väzby.

C2. Príprava konjugátu LHRH (3 - 10) s ovoalbumínom pomocou karbodiimidu. LHRH (3 - 10), v množstve 60 mg a 120 mg ovoalbumínu, sa rozpustí v 9 ml pufru 0,1 M NaCl/0,1 M 2-(M-morfolino)etánsulfónová kyselina. Hydrochlorid N-etyl-N-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu v množstve 150 mg a rozpustený v 12 ml toho istého pufru sa potom pridá k roztoku. Hodnota pH sa nastaví na 7,0 pomocou 1 N hydroxidu sodného (asi 1,9 ml). Zmes sa odstaví počas noci pri laboratórnej teplote a potom sa vyčistí centrifugáciou. Supematant sa chromatografuje na Sephadexe, aby sa odstránil konjugát od nezreagovaného LHRH a produktov rozpadu karbodiimidu. Výťažok väzby LHRH (3 - 10) je možné stanoviť zo stanovenia množstva nenaviazaného LHRH (3 -10).

C3. - Imunitná odpoveď, biologická účinnosť a tolerancia k anti-LHRH vakcíne založenej na konjugácii fragmentov LHRH (3 -10) a frakcie IV-4 konského a-globulínu pomocou karbodiimidu.

Formulácie zložené z konjugovaného LHRH (3 - 10) v emulzii vody v oleji (1. vakcína) a v emulzii gélu hydroxidu hlinitého a saponínu (2. vakcína), boli aplikované transkutánne 6 samcom prasiat v objeme 0,4 ml jedna dávka, a to na začiatku výkrmného obdobia a 17 dní pred porážkou použitím injektora bez ihly, známeho ako Pidjet injektor tak, že dávka bola rozdelená na dva podiely, po 0,2 ml, vstrekom na 5 miestach.

Imunitná odpoveď bola maximálna 10 dní po podaní 2. vakcíny. Jednotlivé titre protilátok (recipročná hodnota zriedenia, pri ktorom bolo viazaných 50 % jódu -125) boli tieto:

Deň 10 280 eeo 2700 3200 4800 13000

Deň 16 290 400 2000 2400 3100 8600

Biologická účinnosť tejto imunitnej odpovede sa prejavuje zmiznutím testosterónu z plazmy od 10. dňa po podaní 2. vakcíny u všetkých 6 zvierat. Zmiznutie testosterónu je pri týchto podmienkach previazané zmiznutím androstenonu z tkanivá.

Tolerancia k vakcíne je posudzovaná podľa vzniku zápalovej kožnej reakcie, odstupňovanej podľa veľkosti vyrážok, objavujúcich sa na každom mieste vakcíny po jej podaní. Miestny zápal celkom zmizol od 10. dňa po aplikácii 2. vakcíny.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob zlepšenia organoleptických vlastností mäsa nevykastrovaných samcov domácich zvierat, pri ktorom sa vykrmujú nevykastrované samce hovädzieho dobytka, oviec a ošípaných, obsahujúci androgénne a neandrogénne steroidy umožňujúce vývoj samčej povahy zvierat, vyznačujúci sa tým, že sa pred výkrmom alebo počas neho, zvieratám podá anti-LHRH vakcína na vyvolanie primárnej imunitnej odpovede s nízkou intenzitou bez význačného alebo dokonca merateľného účinku na gonadálnu steroidnú sckréciu, čím je umožnený rozvoj samčej povahy zvierat, a potom sa zvieratám krátko pred porážkou podá anti-LHRH vakcína na vyvolanie imunoneutralizácie na zrušenie účinku androgénnych a neandrogénnych steroidov.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa najprv podávaná anti-LHRH vakcína podáva pred výkrmom.
3. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že najprv podávaná anti-LHRH vakcína je v emulznej forme.
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že anti-LHRH vakcína, podávaná pred porážkou obsahuje pomocnú látku vodného typu.
5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že pomocnou látkou vodného typu je gél hydroxidu hlinitého, alebo saponín, alebo ich zmes.
6. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že sa vakcína podáva spolu s pomocnou látkou vodného typu 15 až 21 dní pred porážkou.
7. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že anti-LHRH vakcína, ktorá sa podáva býkom a baranom pred porážkou, obsahuje pomocnú látku v emulznej forme.

SK 282056 Β6
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že sa anti-LHRH vakcína s pomocnou látkou y emulznej forme podáva 1 až 2 mesiace pred porážkou.
9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že anti-LHRH vakcína podávaná pred porážkou v emulznej forme je podávaná 4 týždne až niekoľko mesiacov po podaní prvej vakcíny podanej pred výkrmom alebo počas neho.
10. Spôsob podľa nároku 3 alebo 7, vyznačujúci sa tým, že anti-LHRH vakcína v emulznej forme obsahuje emulziu typu voda v oleji.
11. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že anti-LHRH vakcínová emulzia typu voda v oleji obsahuje zmes vysoko čistých minerálnych olejov a neiónových povrchovo aktívnych látok.
12. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že anti-LHRH vakcína obsahuje konjugát LHRH napojený na imunogénny nosičový proteín, vybraný zo skupiny zahrnujúcej hovädzí sérový albumín, ľudský sérový albumín, tyroglobulín, ovoalbumín, anatoxín, tetánový anatoxin, konský a ľudský globulín.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m , že vakcína je podávaná transkutánne na niekoľko miest, za použitia bezihlového injekčného zariadenia vstrekom pod tlakom.
14. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m , že sa podáva vakcína obsahujúca konjugát, ktoiý je zložený z LHRH napojeného na imunogénny nosičový proteín vybraný zo skupiny zahrnujúcej konský a-globulín, konský a-globulín frakciu IV-1, konský a-globulín frakciu IV-4 a ich zmesi.
15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa t ý m , že sa podáva vakcína obsahujúca LHRH peptid a imunogénny nosičový proteín, ktoré sú napojené na karbodiimid.
16. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m , že sa podáva vakcína obsahujúca konjugát zložený z LHRH (3-10), ktorý je napojený na imunogénny nosičový proteín vybraný zo skupiny zahrnujúcej ovoalbumín, konský α-globulín, konský a-globulín frakciu IV-1, konský a-globulin frakciu IV-4 a ich zmesi.
17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa t ý m , že sa podáva vakcína obsahujúca LHRH (3 - 10) peptid a imunogénny nosičový proteín, napojené na karbodiimid.
18. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že vakcína sa podáva transkutánne na niekoľkých miestach za použitia bezihlového injekčného zariadenia vstrekom pod tlakom.