JP5752343B2 - Ｓ／ｏ型経皮免疫剤 - Google Patents

Description

本発明は、Ｓ／Ｏ型経皮免疫剤に関し、詳細には、経皮免疫による皮膚の炎症を発症せず、抗体の産生も高められたＳ／Ｏ型経皮免疫剤に関するものである。

皮膚組織は、細菌やウイルスなどを始めたとした様々な感染源の侵入を非特異的に防止し得る物理化学的バリアとして作用するほか、病原体の一部である抗原を皮下投与するなどして生体内に抗体を産生する、所謂免疫機能を特異的に高める作用も有している。

ところが、皮下注射による経皮免疫では、無菌的に作成した高純度の抗原を必要とするほか、強い副作用、針刺しによる二次感染などの危険性に加えて、皮下投与した組織内で炎症を起こし、しこりなどを生じるといった問題があった。

そこで、注射針を用いた皮下投与に代わる経皮免疫法として、表皮組織の最外層にある角質層を何らかの手段で溶解したり（特許文献１）、微小な突起状の針を穿孔したり（特許文献２）、擦過したりする（特許文献３）などの方法が開示されている。しかしながら、これらの方法は、注射針を使わないというだけで、皮下注射と同様、バリア作用を有する角質層を物理的に侵襲するものであることに変わりない。

上記とは異なり、抗原を皮膚へ物理的に侵襲させない非侵襲経皮免疫法として、病原微生物由来のトキシンを利用する方法（例えば、特許文献４〜７、非特許文献１〜３など）が開示されているが、病原微生物由来のトキシンを使用している点で、安全性に問題がある。

一方、主に、酵素や生理活性ペプチド、親水性薬剤の吸収性を高めた製剤として、Ｓ／Ｏ（Solid in Oil）型製剤が知られている。Ｓ／Ｏ型製剤は、界面活性剤でコーティングした薬物を大豆油などの油状基材（油相）に分散・溶解させた製剤であり、薬物濃度などに応じて、薬物が油相に完全に溶解した透明なＳ／Ｏ型製剤や、薬物が油相に分散したサスペンジョン状態のＳ／Ｏ型製剤が得られる。

図１に、Ｓ／Ｏ型製剤１０の構成を模式的に示す。図１に示すように、薬物１は、界面活性剤２の分子膜でコーティングされた薬剤含有複合体（固相）３として存在しており、薬剤含有複合体３は、油状基材（油相）４中に分散した状態で存在する。このようなＳ／Ｏ型製剤は、通常、薬物含有水溶液と界面活性剤含有有機溶媒溶液とを混合→得られるＷ／Ｏ型エマルションを凍結乾燥し、薬物が界面活性剤２でコーティングされた薬剤含有複合体（固相）を得る→これを油相に溶解・分散させる、ことによって得られる。Ｓ／Ｏ型製剤は、エマルション製剤やリポソームに比べ、(ａ)薬物は固相として存在するために加水分解に対して安定である、（ｂ）熱安定性に優れている、（ｃ）室温での長期保存が可能である、（ｄ）テープ製剤化が可能である、などの利点を有している。

特に、上記のＳ／Ｏ化技術を用いれば、親水性薬剤を油状基材に可溶化でき、薬物の漏洩（漏出）を防止できることから、親水性薬剤の漏洩が抑制されたＳ／Ｏ型製剤がこれまでに提案されている。

本発明者も、例えば、特許文献８〜１０に記載のＳ／Ｏ型製剤を提案している。このうち、特許文献８には、インスリンなどのタンパク質組成物や塩酸イリノテカンなどのカンプトテシン誘導体の薬物を含むＳ／Ｏ型製剤や、当該Ｓ／Ｏ型製剤を更に水相に分散させたＳ／Ｏ／Ｗ型製剤が開示されている。また、特許文献９には、親水性低分子薬剤を、親水性の薬剤漏出抑制性タンパク質及び／又は薬剤漏出抑制性多糖類（安定化剤）と配合した混合物を界面活性剤で被覆したＳ／Ｏ化技術が開示されており、これにより、強酸性環境下での低分子薬剤の漏出は顕著に低減され、弱酸性から中性環境下にある腸管等との接触下での低分子薬剤の放出が顕著に促進されることが開示されている。このＳ／Ｏ化技術は、特に、水溶性非ステロイド消炎鎮痛剤（以下、「ＮＳＡＩＤｓ」という。）であるジクロフェナクナトリウム（ＤＦＮａ）やアスピリンなどのように、胃潰瘍などの深刻な胃粘膜障害発生が懸念される薬剤に対して極めて有効である。また、特許文献１０には、ＮＳＡＩＤなどの親水性薬剤の皮膚透過性が高められたＳ／Ｏ型外用剤が開示されている。
特表２００２−５０４５２２号公報 特表２００５−３３４５９４号公報 特表２００５−５１１２４８号公報 特開２００５−１７９３０１号公報 特表２００４−５３６８０４号公報 特表２００５−５０４００２号公報 特表２００６−５０３０７２号公報 特開２００４−４３３５５号公報 国際公開第２００５／０９４７８９号パンフレット 国際公開第２００６／０２５５８３号パンフレット F. Mawas et al., The Journal of Infection Disease, 190; 1177-1182. 2004 M.Guebre-Xabier, et al., Journal of Virology, 78: 7640-7618, 2004 G.M. Glenn, et al., Nature Med. 6(12): 1403-1406, 2000

本発明の目的は、従来の皮下投与による経皮免疫法の如く、角質層などの皮膚に炎症やしこりなどを発生させることなく、しかも、血清中の抗体産生が高められた非侵襲性経皮免疫技術を提供することにある。詳細には、本発明の目的は、前記背景技術の欄に掲げた文献のように、表皮組織の最外層にあり物理化学的バリアとして作用する角質層を溶解・穿孔・擦過するなどの物理的侵襲手段によって破壊することなく、また、病原微生物由来のトキシンを使用することのない、安全性の高い非侵襲性経皮免疫法であって、抗体産生能にも優れているために経皮免疫を効果的に行なうことが可能な、新規の経皮免疫技術を提供することにある。

上記課題を解決することのできた本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤は、抗原が界面活性剤によって被覆された固体状の抗原−界面活性剤複合体と、油相とを含み、前記固体状の抗原−界面活性剤複合体は、油相に溶解または分散しているところに要旨を有している。

好ましい実施形態において、上記抗原は、タンパク質またはペプチドである。

好ましい実施形態において、上記抗原は、生または不活性化された細菌及び／又はウイルスである。

好ましい実施形態において、上記抗原は、動物由来または植物由来である。

好ましい実施形態において、上記界面活性剤のＨＬＢ価が１０以下である。

好ましい実施形態において、上記油相は、植物油、動物油、中性脂質、および長鎖脂肪酸エステルよりなる群から選択される少なくとも一種である。

本発明は、上記のＳ／Ｏ型経皮免疫剤が水相に分散しているＳ／Ｏ／Ｗ型経皮免疫剤も包含している。

本発明によれば、従来の皮下注射による経皮免疫法と同様、抗体の産生が高められるだけでなく、皮下注射による問題点（皮膚組織の炎症発生、針刺し事故の発生、物理化学的バリアである角質層の溶解や破壊など）をすべて解消することができる。従って、本発明の経皮免疫剤は、極めて安全性の高い非侵襲性の免疫原性製剤またはワクチンとして非常に有用である。

本発明の経皮免疫剤は、病原性細菌やウイルスの感染防御や体内からの排除といった治療に有用であるだけでなく、少量の抗原を数回に分けて経皮投与することによって免疫寛容を惹起させる治療法にも有用である。

本発明の経皮免疫剤は、前述した特許文献７に記載のＳ／Ｏ化技術によって抗原をＳ／Ｏ化させたところに最大の特徴がある。タンパク質などの親水性高分子に代表される抗原は、本来、皮膚透過性が非常に低いが、本発明では、Ｓ／Ｏ化技術によって抗原が油状基材に可溶化されているため、抗原の皮膚透過性が高められ、皮膚の炎症が顕著に抑えられると共に、良好な抗体産生能が発揮されると考えられる。具体的には、後記する実施例に示すように、抗原として鶏卵白由来リゾチームを用い、この鶏リゾチーム抗原を界面活性剤で被覆してＷ／Ｏ型エマルションにして抗原を疎水性に変化させ、これを植物油などの油相（分散媒）に分散させたＳ／Ｏ化経皮免疫剤（Ｓ／Ｏ化抗原）をウサギの耳介または背部に塗布して経皮免疫を行なったところ、従来の皮下免疫法に比べ、皮下に炎症やしこりを発生することなく、血清中に鶏リゾチームに特異的な抗体が産生することが判明した。

本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤は、抗原（Ａ−１）が界面活性剤（Ａ−２）によって被覆された固体状の抗原−界面活性剤複合体（Ａ）と、油相（Ｂ）とを含んでおり、固体状の抗原−界面活性剤複合体（Ａ）は、油相（Ｂ）に溶解または分散しているものである。好ましくは、抗原−界面活性剤複合体（Ａ）は、安定化剤として、親水性のタンパク質および／または親水性の多糖類（Ａ−３）を含んでいてもよい。

本発明製剤は、前述した特許文献８に記載のＳ／Ｏ型製剤において、薬剤の代わりに抗原を含有すること以外は、実質的に、前述した特許文献７に記載されたＳ／Ｏ型製剤の構成と同じである。以下、各構成要件について具体的に説明する。

（Ａ）抗原−界面活性剤複合体
抗原−界面活性剤複合体（以下、抗原含有複合体と呼ぶ場合がある。）は、抗原と界面活性剤を主な構成成分として含んでいる。そして、抗原に界面活性剤の親水性部分が会合し、周りを被覆するという構成を有している。抗原−界面活性剤複合体は、粒子が大きくなり過ぎるのを防ぐために、抗原と界面活性剤のみからなるものであってもよいし、また、後記するように安定化剤や、抗体産生増強剤として使用されるアジュバント（助剤、後記する。）を含んでいてもよいし、医薬用製剤において許容される製剤成分（添加成分、後記する。）を含んでいてもよい。

（Ａ−１）抗原
本発明に用いられる抗原は、皮膚の免疫応答を惹起する物質であって、免疫原性（抗体産生）を誘導するものであれば特に限定されず、従来の経皮免疫などに用いられる抗原やワクチン、免疫原性物質などが用いられる。具体的には、例えば、生理活性物質などのタンパク質やペプチド（例えば、鶏卵白由来リゾチーム、スギ花粉症の抗原領域ペプチドなど）、タンパク質やペプチドを結合したハプテン化物質、生または不活性化（死滅）された細菌やウイルス（全部）若しくはこれらの部分分解物、更には、不活性化（死滅）させた癌細胞（全部）やその部分分解物、核酸などが挙げられる。また、抗原性に欠けるもの（例えば、糖質や脂質、無機物など）にハプテン化などの手段によって抗原性を付与させたものも抗原として用いられる。抗原は、動物由来または植物由来のいずれもが用いられる。例えば、抗原は、家禽・家畜用抗原、愛玩動物用抗原であっても良いし、牛用抗原、鶏用抗原、豚用抗原であっても良いし、ダニなどの昆虫由来であっても良い。また、抗原は、食物由来のものであっても良い。

（Ａ−２）界面活性剤
界面活性剤は、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、胆汁酸塩を挙げることができる。

非イオン性界面活性剤としては、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、デカグリセリンエステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油・硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル（ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖オレイン酸エステル、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖エルカ酸エステル、ショ糖混合脂肪酸エステル）等を挙げることができる。これらから１種を選択して用いるか、或いは２種以上の混合物を用いてもよい。

これら非イオン性界面活性剤としては、エルカ酸やオレイン酸などの不飽和脂肪酸を原料とするエステル化合物が好適であり、より好ましくは、ショ糖エルカ酸エステル、ショ糖オレイン酸エステル、ショ糖混合脂肪酸エステルが挙げられる。または、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油および硬化ヒマシ油よりなる群から選択される１種または２種以上を用いることができる。

また、界面活性剤としては、ＨＬＢ価１０以下という疎水性の高いものを用いるのが好ましい。抗原含有複合体の油相への溶解または分散を容易にできるからである。

本発明における抗原含有複合体（Ａ）は、上記のように、親水性薬剤（Ａ−１）が界面活性剤（Ａ−２）によって被覆された構造を有しているが、安定化剤として、親水性のタンパク質および／または親水性の多糖類（Ａ−３）を更に含んでいてもよい。

（Ａ−３）安定化剤として、親水性のタンパク質および／または親水性の多糖類
本発明に用いられる上記の安定化剤は、抗原と共に界面活性剤により被覆されることによって抗原含有複合体の安定性を向上させ、特に、経皮剤中で抗原含有複合体外への抗原の漏出などを防止する作用を有するものである。上記安定化剤（親水性のタンパク質及び／又は多糖類）は、医薬用製剤の成分として許容されるものであれば特にその種類は問わない。但し、薬剤漏出抑制作用を有効に発揮させるために、タンパク質の数平均分子量は約１０，０００以上のものを好適に用いる。

このうち、親水性のタンパク質としては、例えば、血清アルブミン（分子量：約６７，０００）、オボアルブミン（分子量：約４５，０００）、カゼイン（分子量：約１９，０００以上）、リゾチーム（分子量：約１４，０００以上）、リパーゼ（分子量：約４５，０００）などを挙げることができ、これらから１種を選択するか、または２以上を選択の上混合して用いることができる。好適には、血清アルブミン、オボアルブミンおよびカゼインよりなる群から選択される１種または２種以上を用いることができる。

また、親水性の多糖類としては、例えば、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セロビオース、プルラン、ＬＭペクチン、ＨＭペクチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヘパリン、アルギン酸およびカルボキシメチルセルロースなどを挙げることができ、これらから１種を選択するか、または２以上を選択の上混合して用いることができる。好適には、スクロース、トレハロース、プルラン、ＬＭペクチン、ＨＭペクチンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートよりなる群から選択される１種または２種以上を用いることができる。

本発明に用いられる抗原含有複合体において、抗原に対する安定化剤の重量比は、０．０１〜１００の範囲が好ましい。０．０１未満であれば、経皮剤中における薬剤漏出抑制作用が十分に発揮されないおそれがあるからであり、また、１００を超えると複合体に占める薬剤量が少なくなり、薬剤本来の効果が発揮できない場合があるからである。より好ましくは、０．１〜１０の範囲であり、更に好ましくは、０．５〜５の範囲内である。

また、抗原と安定化剤に対する界面活性剤の重量比は、０．５〜１００の範囲が好ましく、より好ましくは、１〜５０の範囲であり、更に好ましくは、２〜２５の範囲内である。

（Ａ−４）その他
本発明における抗原含有複合体（Ａ）は、上記のように、抗原（Ａ−１）が界面活性剤（Ａ−２）によって被覆された構造を有しているが、抗体の産生能を高める目的で、アジュバントを含んでいてもよい。アジュバントは、免疫応答の誘導を補助する調節因子として作用し、通常、抗原と共に投与されるが、本発明では、アジュバントは選択成分として用いられ、必須成分ではない。後記する実施例に示すように、本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤を用いれば、アジュバントを添加しなくても抗体の産生が高められることを実証している。

本発明に用いられるアジュバントは、皮下注射などに通常用いられるものであれば特に限定されず、代表的には、Ｆｒｅｕｎｄによって開発された鉱物油、表面活性剤および加熱結核死菌の混合物（フロイント完全アジュバント、ＦＣＡ）、コレラ毒素や毒素原性大腸菌などの易熱性毒素が挙げられる。また、下痢原性であるＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性が除去されて無毒化され、しかも、アジュバント活性を有する変異型無毒化コレラ毒素、あるいは、変異型無毒化易熱性毒素なども好ましく例示される。

アジュバントを添加して本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤を調製するに当たっては、（ａ）アジュバントを抗原と一緒に添加し、後記する方法によって抗原−アジュバント−界面活性剤複合体を得た後、油相基材に溶解または分散させてもよいし、あるいは、（ｂ）抗原−界面活性剤複合体の調製と同様の方法によってアジュバント−界面活性剤複合体を調製した後、これと、抗原−界面活性剤複合体とを、後記する方法によって油相基材に溶解または分散させてもよい。

（Ｂ）油相
本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤は、前述した抗原含有複合体が、油相に溶解または分散している溶液またはサスペンションである。溶液となるかサスペンションとなるかは、界面活性剤や油相の種類や量、超音波処理の有無などに依存する。

本発明に用いられる油相は、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限はなく、例えば、植物油、動物油、中性脂質（モノ置換、ジ置換またはトリ置換のグリセライド）、長鎖脂肪酸エステル、合成油脂、ステロール誘導体を挙げることができる。

具体的には、大豆油、綿実油、菜種油、ゴマ油、コーン油、落花生油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ナタネ油、シソ油、ウイキョウ油、カカオ油、ケイヒ油、ハッカ油、ベルガモット油、等の植物油；牛脂、豚油、魚油等の動物油；中鎖脂肪酸トリグリセリド、トリオレイン、トリリノレイン、トリパルミチン、トリステアリン、トリミリスチン、トリアラキドニン等の中性脂質；アゾン等の合成脂質；コレステリルオレエート、コレステリルリノレート、コレステリルミリステート、コレステリルパルミデート、コレスレリルアラキデート等のステロール誘導体；ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸セチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチル、リノール酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル等の長鎖脂肪酸エステル；乳酸エチル、乳酸セチル等の乳酸エステル；クエン酸トリエチル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジエチル、セバシン酸ジイソプロピル等の多価カルボン酸エステル；２−エチルヘキサン酸セチル等のその他のカルボン酸のエステル；ワセリン、パラフィンスクワラン等の炭化水素類；シリコーン類などを挙げることができる。これらから１種を選択して用いてもよいし、２種以上を選択し混合して用いてもよい。好適には、大豆油、ゴマ油、オリーブ油、サフラワー油、サンフラワー油、ナタネ油およびシソ油よりなる群から選択される１種または２種以上を用いる。特に好適には、トリグリセライドやこれを主成分とする食物油を用い、実用的には、大豆油が好ましく、特に、高純度に精製された大豆油が好ましい。また、中性脂質または長鎖脂肪酸エステルも好適に使用でき、より好ましくは長鎖脂肪酸エステル、さらに好ましくはミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）を使用できる。

本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤に占める油相の割合は、油成分の種類や他の構成成分等によって異なるが、５０〜９９．５ｗ／ｖ％の範囲内が好ましく、６０〜９０ｗ／ｖ％の範囲内が好ましい。

本発明のＳ／Ｏ／Ｗ型製剤は、上記Ｓ／Ｏ型経皮免疫剤をさらに水相へ分散させたものである。当該製剤は、投与し易いことや、利便性が高いといった特性を有するものである。
水相としては、医薬用製剤において許容されるものであれば特に種類は問わないが、例えば、純水、精製水、蒸留水、生理食塩水、緩衝液などを使用することができる。

次に、本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤を製造する方法について説明する。

本発明製剤の製造方法は、（１）抗原と界面活性剤、必要に応じてアジュバントや安定化剤を含む有機溶媒溶液とを混合してＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程、（２）上記のＷ／Ｏ型エマルションを乾燥して抗原含有複合体を調製する工程、（３）上記抗原含有複合体を油相に溶解または分散させる工程、を包含している。

（１）Ｗ／Ｏ型エマルション調製工程
ここでは、先ず、抗原の水溶液を調製する。必要に応じて、アジュバントや安定化剤も添加する。また、医薬製剤において許容される添加成分を添加してもよい。ここで使用する水としては、例えば、純水、精製水、蒸留水、生理食塩水、緩衝液を挙げることができる。必要に応じて、エタノールなど水混和性の有機溶媒を少量添加してもよい。但し、アルコール等を加え過ぎるとエマルションが形成され難くなる場合があるので注意が必要である。

上記水溶液における抗原の濃度（アジュバントや安定化剤を更に添加する場合は、これらの合計濃度）は、これらを実質的に完全に溶解できれば特に制限されないが、例えば、０．１〜３０ｍｇ／ｍＬ程度とすることができる。

別途、界面活性剤の有機溶媒溶液を調製する。ここで用いる有機溶媒は、界面活性剤を溶解することができ、且つ次工程で拡散除去できるものであれば特に制限されないが、例えば、メタノールやエタノール等のアルコール；ヘキサン等の脂肪族炭化水素；トルエン等の芳香族炭化水素；酢酸エチルエステル等のエステル系溶剤；塩化メチレン等のハロゲン系脂肪族炭化水素などを挙げることができる。また、その濃度も特に制限されないが、例えば、１〜１０質量％程度にすることができる。

次に、上記の抗原（アジュバントや安定化剤を含む場合もある）の水溶液、および界面活性剤の有機溶剤溶液を用い、常法に従ってＷ／Ｏ型エマルションを調製する。例えば、ホモジェナイザーによる高速撹拌を用いたり、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により撹拌したり、これらに加えて超音波を照射したりすればよい。あるいは、多孔質膜を用いた膜乳化によってＷ／Ｏ型エマルションを調製してもよい。多孔質膜として、例えば、市販の疎水性のシラス多孔質ガラス膜（ＳＰＧ、ＳＰＧテクノ社製）を用いることが好ましい。この多孔膜を用いれば、多孔質ガラス膜の細孔径に対応する粒径の分散相粒子（抗原含有複合体）が得られるという利点がある。

（２）乾燥工程
ここでは、上記工程（１）で得られたＷ／Ｏ型エマルションを乾燥し、抗原含有複合体を得る。乾燥方法は特に制限されず、凍結乾燥や減圧乾燥すればよいが、凍結乾燥が好ましい。具体的な条件は、常法に従えばよい。また、当該工程では、水分と有機溶媒を実質的に完全に除去することが好ましい。残存する水分は、タンパク質や抗原の加水分解を生む原因となる可能性があるからであり、また、有機溶媒は、敢えて言うわけでもなく、生体に悪影響を及ぼす可能性があるからである。具体的には、例えば、カールフィッシャー法による測定で、含水率が１％以下になる程度にすればよい。

（３）分散工程
ここでは、上記工程（２）で得られた抗原含有複合体を油相に溶解または分散することによってＳ／Ｏ化を行なう。具体的には、ホモジェナイザーによる高速攪拌を用いたり、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により攪拌したり、必要に応じて、これらに加えて超音波を照射するなどすればよい。

上記工程で使用する油相の量は、界面活性剤と油相の種類との相性などにもよるが、例えば、抗原含有複合体１ｇ当たり、１〜１０ｍＬ程度にすればよい。

このようにして得られたＳ／Ｏ型製剤は、さらに常法に従って水相に分散することによって、Ｓ／Ｏ／Ｗ型製剤としてもよい。

上記溶液またはサスペンションは、そのまま、腕の内側など皮膚が薄く、塗布しやすい場所へ、そのまま塗布してもよいが、好ましくは、医薬として通常添加される他の添加成分を添加して製剤化する。上記の添加成分としては、例えば、賦形剤（例えば、白糖などの糖類；デキストリンなどのデンプン誘導体；カルメロースナトリウムなどのセルロース誘導体；キサンタンガムなどの水溶性高分子等）、着色剤、結合剤（例えば、前記の賦形剤やマクロゴール等）、乳化剤、増粘剤、湿潤剤（例えば、グリセリン等）、安定剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；無水酢酸；ソルビン酸等）、保存剤、溶剤（例えば、水、グリセリン、エタノールやオレイルアルコールなどの高級アルコール類等）、溶解補助剤、懸濁化剤（例えば、カルメロースナトリウム等）、緩衝剤、ｐＨ調整剤、基剤（例えば、ポリエチレングリコール、クロタミトン、セバシン酸ジエチル、ワセリン等）、ワセリンやマイクロクリスタンワックスなどの炭化水素類、ホホバアブアラやゲイロウなどのエステル類、牛脂やオリーブ油などのトリグリセリド類、メントールなどの吸収促進剤、等張化剤、有機溶媒、界面活性剤などを挙げることができ、これらを通常の配合量で配合できる。

各剤形に応じた常套手段によって、上記溶液またはサスペンションと他の添加成分を混合して、軟膏剤、ローション剤、エアゾール剤、硬膏剤、水性パップ剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、プラスター剤、リザーバー型貼付剤、マトリックス型貼付剤、テープ剤などとすることができるが、これらに限定されない。

本発明経皮免疫剤の投与量は、配合する抗原の種類や量、また、患者の年齢や症状などに応じて適宜調整すればよい。例えば、アジュバントを含まず抗原のみを含む経皮免疫剤の場合は、通常、成人１人あたり、１回の投与につき、おおむね、１００〜２０００μｇの範囲、より好ましくは、おおむね、１００〜５００μｇの範囲で、数週間から数ヶ月にわたって、少なくとも２回以上投与することが好ましい。また、抗原とアジュバントの両方を含む場合は、通常、成人１人あたり、１回の投与につき、おおむね、５０〜５００μｇの範囲、より好ましくは、おおむね、５０〜２００μｇの範囲で、数週間から数ヶ月にわたって、少なくとも２回以上投与することが好ましい。

以下、実施例および試験例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

以下では、Ｓ／Ｏ化経皮免疫のモデル抗原として鶏卵白由来リゾチーム（Lysozyme from hen egg white、ＨＥＬ)を用い、ＨＥＬ含有Ｓ／Ｏ化経皮免疫剤を用いた経皮免疫法が、従来の皮下免疫方法のように皮膚の炎症も発症せず、抗体産生能にも優れていることを実証する。

（本発明製剤の調製）
ＨＥＬ２．０ｍｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）２ｍＬに溶解したＨＥＬ含有溶液に、ショ糖エルカ酸エステル（三菱化学フーズ社製、ＥＲ−２９０、エルカ酸：９０重量％、ＨＬＢ：２）の５．０重量％シクロヘキサン溶液４．０ｍＬを加え、ホモジナイザーにより２６，０００ｒｐｍで２分間高速撹拌し、Ｗ／Ｏ型エマルションを調製した。このエマルションを一昼夜凍結乾燥することによって、界面活性剤−ＨＥＬ複合体を得た。

この複合体に４ｍＬのミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）を加えて分散させ、本発明に係るＳ／Ｏ型複合体サスペンション（本発明製剤）を得た。ここには、ＨＥＬを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有している。

図２に、上記の方法によって得られたＨＥＬ含有複合体の粒度分布（頻度分布）を示す。ＨＥＬ含有複合体の平均粒径をレーザー散乱法（シスメックス社製のナノＺＳ装置を使用）によって測定したところ、４５８．７ｎｍであった。

（比較製剤の調製）
陽性対照として、ＨＥＬ抗原とフロイントのコンプリートアジュバント（ＦＣＡ）とを同量加えて乳化させた比較製剤１、およびＨＥＬ抗原のみを含有する比較製剤２を用意した。

詳細には、ＨＥＬ２．０ｍｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）２ｍＬに溶解したＨＥＬ含有溶液に、ＦＣＡ（原液）を同量（２ｍＬ）加えて乳化させ、比較製剤１を調製した。また、比較製剤２は、ＦＣＡを添加しなかったこと以外は比較製剤１と同様にして調製した。

このようにして得られた本発明製剤および比較製剤１、２を用いて以下の実験を行ない、抗体産生量および投与部位に及ぼす影響（肉眼的観察および病理組織的検査）を比較検討した。

試験例１ 抗体産生量の比較
体重約２ｋｇの雄ウサギ（ニュージーランドホワイト種）４羽を用意し、陽性対照群（比較製剤１、２）用に２羽、実験群（本発明製剤）用に２羽を割り当て、以下のように投与を行った。

（陽性対照群）
陽性対照群のウサギ（２羽）の背部皮膚をバリカンで剃毛し、比較製剤１（アジュバント添加）、比較製剤２（アジュバント無添加）をそれぞれ、１羽につき１ｍＬずつ皮下注射を行った。

（実験群）
実験群用に用意した２羽のウサギのうち、１羽の背部皮膚を上記と同様にバリカンで剃毛し、約１０ｃｍ四方の面積内に絵の具用筆で本発明製剤を１ｍＬ塗布した（背部塗布）。残りの１羽については、片方の耳介の舟状渦に本発明製剤を１ｍＬ塗布した（耳介塗布）。

実験群および陽性対照群の両方について、投与後１４日目（第１回免疫）、２８日目（第２回免疫）、４２日目（第３回免疫）、５９日目（第４回免疫）に上記と同様の投与を行った。第１回免疫〜第４回免疫のそれぞれの投与前に、耳（耳介塗布を行った本発明製剤投与群では、耳介塗布を行わなかった他方の耳）の外側の耳静脈から採血を行ってサンプルを採取し、サンプル中の抗ＨＥＬ抗体量をＥＬＩＳＡ法で調べた。ＥＬＩＳＡ法の詳細は、下記（１）〜（５）に示すとおりであり、各ステップにおける洗浄操作は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＰＢＳＴ［ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ ２０（親水性界面活性剤）］、または１Ｍ ＮａＣｌを用いて充分行った。なお、実験は、合計３回行なった。

（１）ＨＥＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）（タンパク質量で５ｍｇ／ｍＬ）を９６穴マイクロプレートに２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、４℃で一晩静置してＨＥＬをマイクロプレートへ吸着させた。

（２）非特異的な吸着を阻止するため、ブロッキング剤として、ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin;ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液（ＢＳＡを５．０ｍｇ／ｍＬ含有）を、ＨＥＬを吸着した上記のマイクロプレートに２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、ブロッキングを行った（３７℃で２時間）。

（３）サンプルを２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、マイクロプレート基板に吸着させたＨＥＬとサンプル中の抗ＨＥＬ抗体との間で抗原抗体反応を起こさせた（３７℃、２時間）。

（４）ブロッキング剤を除去した後、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０を含むＰＢＳでマイクロプレートを丁寧にリンスし、これに、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）で標識されたヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ抗体を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５，０００倍に希釈したものを加え、抗原抗体反応を充分起こさせた（３７℃、２時間）。

（５）フリーのＡＰ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を洗浄操作によって充分除去した後、１．０ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５に溶解）をマイクロプレートに２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、λ＝４１０ｎｍでの吸光度を測定することによってウサギ血清中の抗ＨＥＬ抗体量を求めた。

これらの結果を図３にまとめて示す。図３には、陽性対照群および実験群の結果がまとめて示されており、左側側から順に、比較製剤２（アジュバントなし皮下注射）、比較製剤１（アジュバントあり皮下注射）、本発明製剤（耳介塗布）、および本発明製剤（背部塗布）の結果を示している。

図３より、以下のように考察することができる。

まず、従来のように皮下注射を用いて経皮免疫を行った比較製剤１、２では、いずれも、第１回免疫および第２回免疫で抗ＨＥＬ抗体量の増加が見られた。特に、アジュバントを添加した比較製剤１では、第１回免疫で著しい抗体量の増加が見られた。

一方、Ｓ／Ｏ化を行った本発明製剤では、耳介塗布を行った例も、背部塗布を行った例も、いずれも、第１回免疫および第２回免疫で抗体量の増加が認められた。特に、皮膚組織が薄くて経皮吸収性の高い耳介塗布の例では、皮下組織が厚くて耳介に比べて経皮吸収性の低い背部塗布の例に比べ、抗体量の増加が顕著に見られ、その程度は、比較製剤２と、おおむね、同程度であった。

試験例２ 投与部位の刺激性に関する肉眼的観察
実験群および陽性対照群の各ウサギの投与部位を、第１回免疫時に肉眼観察した。

その結果、ウサギ背部に皮下注射を行った比較製剤１および比較製剤２では、第１回免疫から明瞭な瘤のようなしこりが発生し、特に、アジュバント入り抗原を皮下注射した比較製剤１において、その程度は顕著であった（図示せず）。これに対し、本発明製剤を投与した例では、背部塗布の例はもとより、刺激性に鋭敏な耳介の舟状渦に塗布を行った例においても、血管の怒張や充血などは何ら認められず、皮膚刺激は全く見られなかった。

試験例３ 病理組織学的検査
ここでは、投与後６６日目における各ウサギの皮膚についてヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色を行い、病理組織標本を作製した後、光学顕微鏡による観察（倍率８０倍、２００倍、４００倍）を行って皮膚の炎症を調べた。図４〜図７に、本発明製剤（耳介塗布）、本発明製剤（背部塗布）、比較製剤１、比較製剤２の病理組織写真をそれぞれ示す。

まず、本発明製剤について考察する。

図４は、本発明製剤（耳介塗布）の病理組織写真であり、図４Ａは８０倍、図４Ｂは４００倍の拡大写真である。図４Ａおよび図４Ｂに示すように、耳介塗布を行なった皮膚には炎症は全く見られず、正常な表皮、真皮層、脂肪を含む皮下組織が観察された。

図５は、本発明製剤（背部塗布）の病理組織写真であり、図５Ａは８０倍、図５Ｂは４００倍（の拡大写真である。図５Ａ〜図５Ｂに示すように、背部塗布を行なった皮膚には炎症は全く見られず、正常な表皮、真皮層、脂肪を含む皮下組織が観察された。
以上、図４および図５より、本発明製剤を用いて経皮免疫を行なった場合は、耳介塗布・背部塗布のいずれの場合にも、皮膚の炎症は観察されなかった。

次に、比較製剤について考察する。

図６は、比較製剤１（ＦＣＡ添加）の病理組織写真であり、図６Ａは８０倍、図６Ｂは２００倍、図６Ｃは４００倍の拡大写真である。図より、真皮層には大きな嚢胞が観察され（図６Ａを参照）、その大きな嚢胞の周辺部では壊死組織が認められた（図６Ｂを参照）。また、図６Ｃに示すように、真皮層から皮下組織にかけて炎症が広範囲に見られ、著しく肥厚している。これらの部位では、大きい空砲や泡沫状細胞質を有して膨らんだマクロファージの集団が観察され、その間に細胞浸潤が見られた。

図７は、比較製剤２（ＦＣＡ添加なし）の病理組織写真であり、図７Ａは８０倍、図７Ｂは２００倍、図７Ｃは４００倍の拡大写真である。これらの図に示すように、表皮の一部（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃの左端）に軽度な肥厚が認められ、その下部の真皮層では、幼弱な線維芽細胞が密に走行しており、軽度の細胞浸潤を伴っていた。

以上の結果より、従来の皮下注射を用いた経皮免疫法では、皮膚の炎症が認められ、炎症の程度は、ＦＣＡ添加なしの比較製剤２に比べ、ＦＣＡ添加の比較製剤１の方が顕著に見られた。

図１は、Ｓ／Ｏ型製剤の構成を模式的に示す図である。 図２は、本発明製剤の粒度分布を示す図である。 図３は、試験例１における各投与群の抗体量の経時的推移を示す図である。 図４Ａは、本発明製剤（耳介塗布）の病理組織写真（８０倍）である。 図４Ｂは、本発明製剤（耳介塗布）の病理組織写真（４００倍）である。 図５Ａは、本発明製剤（背部塗布）の病理組織写真（８０倍）である。 図５Ｂは、本発明製剤（背部塗布）の病理組織写真（４００倍）である。 図６Ａは、比較製剤１（ＦＣＡ添加）の病理組織写真であり（８０倍）である。 図６Ｂは、比較製剤１（ＦＣＡ添加）の病理組織写真（２００倍）である。 図６Ｃは、比較製剤１（ＦＣＡ添加）の病理組織写真（４００倍）である。 図７Ａは、比較製剤２（ＦＣＡ添加なし）の病理組織写真（８０倍）である。 図７Ｂは、比較製剤２（ＦＣＡ添加なし）の病理組織写真（２００倍）である。 図７Ｃは、比較製剤２（ＦＣＡ添加なし）の病理組織写真（４００倍）である。

符号の説明

１ 薬物
２ 界面活性剤
３ 薬剤含有複合体（固相）
４ 油状基材（油相）
１０ Ｓ／Ｏ型製剤

Claims (8)

1. 抗原が界面活性剤によって被覆された固体状の抗原−界面活性剤複合体と、油相とを含み、前記固体状の抗原−界面活性剤複合体は、油相に溶解または分散していることを特徴とするＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
2. 前記抗原は、タンパク質またはペプチドである請求項１に記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
3. 前記抗原は、生または不活性化された細菌及び／又はウイルスである請求項１に記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
4. 前記抗原は、動物由来または植物由来である請求項１に記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
5. 前記界面活性剤が非イオン界面活性剤である請求項１〜４のいずれかに記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
6. 前記界面活性剤のＨＬＢ価が１０以下である請求項１〜５のいずれかに記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
7. 前記油相が、植物油、動物油、中性脂質、および長鎖脂肪酸エステルよりなる群から選択される少なくとも一種である請求項１〜６のいずれかに記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
8. 請求項１〜７のいずれかに記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤が、水相に分散していることを特徴とするＳ／Ｏ／Ｗ型経皮免疫剤。