JP2002504522A

JP2002504522A - Ａｄｐ−リボシル化外毒素により誘引される経皮免疫応答を促進するための皮膚浸透性エンハンサーおよびバリア崩壊剤の使用

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Publication number: JP2002504522A
Application number: JP2000533145A
Authority: JP
Inventors: グレゴリー・エム・グレン; カール・ビー・アルビング
Original assignee: アイオマイ・コーポレイション
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 2002-02-12
Anticipated expiration: 2019-02-25
Also published as: ES2289200T3; EP1061951A1; EP2286834A2; DE69936355T2; EP1061951B1; JP4875799B2; AU3311599A; EP2286834A3; DE69910743T2; DE69936355D1; CA2321596A1; BR9908278A; WO1999043350A1; ATE247979T1; CA2321596C; DE69910743D1; JP2012041355A; ATE365050T1

Abstract

(57)【要約】アジュバントおよび無傷皮膚に対する抗原または抗原をコードする核酸を局所適用して全身的または粘膜の抗体応答を誘引する経皮免疫システム。このように誘引した免疫応答は物理的または化学的な皮膚浸透を高めることにより増大することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンまたは抗原との他のアジュバン
トを用いた経皮的免疫化、および免疫応答を増大するための浸透増強剤およびバ
リヤー破壊剤の使用に関する。本発明は、誘発される抗原特異的免疫応答を増大
するための抗原、アジュバント、皮膚内の標的、またはそれらの組み合わせの活
性化にも関する。

【０００２】（背景技術）ヒトの体の最大の器官である皮膚は、感染物質による侵襲、および有毒な化学
薬品との接触に対する身体防御の重要な部分である（ボス（Bos）による１９９７を参照)。望まない皮膚反応（例えば、アレルギー性皮膚炎またはアトピー性皮膚炎）は知られているが、皮膚へのアジュバントおよび抗原の単なる適用によ
って、特定の免疫エフェクターを導き出して治療学的な利点を与える、アジュバ
ントおよび抗原の適用による全身免疫応答の誘発は我々の発明の以前には教示も
示唆もされていないようである。

【０００３】コレラ毒素（ＣＴ）およびＥ．Ｃｏｌｉ由来の易熱性エンテロトキシンは有毒
な化学薬品の例であり、有毒物質による浸透から保護するための皮膚の保護的な
層が期待されている。クレイグ（Graig)(１９６５）は、兎およびモルモットに皮内注射したコレラ患者の糞便ろ液が特有の遅延的、持続的な浮腫硬化（腫大）
を産生し、これは皮膚中の毒素の存在によって誘発されることを報告している。
腫大および血管の漏出現象は非常に劇的であり、そのため未知の浸透性因子が原
因とされ、それは後にＣＴそのものであることが分かった。従って、ＣＴが皮膚
上にあると非常に反応原性（reactogenecity）であり、もしそれが皮膚に入れば
、同様な赤みや腫大を引き起こすであろうと合理的に予想できた。皮膚にＣＴを
注射するクレイグ試験は、糞便ろ液または培地中のＣＴの存在およびその量につ
いての標準的な測定法であった。この皮膚の反応性はコレラ毒素に起因すること
がデータより確認された（フィンケルスタイン(Finkelstein)およびロスパルト(
LoSpallutto)による１９６９を参照)。

【０００４】クレイグ（１９６５）は、「十分な濃度で皮膚に適用した場合に、臨床コレラ
患者の皮膚病変の無いことは、消化管の損害の原因である病毒が皮膚にも心身に
有害な影響を及ぼすという可能性を必ずしも排除するものではない」と注意して
いる。皮膚中のコレラ毒素の非常な反応原性はその毒性の試験として使用され、
先行技術は皮膚に適用されればコレラ毒素は反応原性であり、望まない反応を生
むであろうという予想を証明している。そのような有害な反応は当該分野の有名
な著者によって十分に実証されている（クレイグによる１９７２)。

【０００５】それに反して、我々は、皮膚上に置いた場合にコレラ毒素が免疫原性であり、
抗原およびアジュベントの両方として作用するが、いずれの局所または全身副作
用を起こさないことを見出した。コレラ毒素が経皮的免疫化の目的で、皮膚上に
おかれた場合のこの反応原性の欠落は驚くべきことであり、先行技術から導き出
される結論とは矛盾していた。特に、我々の発明に従って皮膚上におかれたＣＴ
はクレイグらの予想に反して、無毒で非反応原性のアジュバントとして作用し、
一方で皮膚中へのＣＴの注射は腫大および赤みを引き起こす。従って、我々の発
明の以前には、コレラ毒素または他のＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンまたは
局所適用アジュバントが経皮的免疫化に有用であることは自明ではなかった。実
際、ヒトの皮膚上におかれた易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）は局所または全身
毒性を有することなく、全身免疫応答を誘発することを見出した。

【０００６】この予期しない反応原性の欠如はワクチンの使用にとって非常に重要である。
免疫化が有意な望まない反応を伴わずに、保護的な免疫応答を産生する場合には
、ワクチン抗原およびアジュバントは有用である。歴史的には、ワクチンの反応
原性（例えば、注射部位での腫大、圧痛および痛み）はある場合（例えば、チフ
スおよび百日咳）には、ワクチンの利便性を理由として許容されてきた。しかし
ながら、高レベルの反応原性および他の副作用は望ましくなく、また新規なワク
チンアジュバントおよび抗原候補の開発に問題となるであろう。刺激的であって
且つ望まない反応を誘発しないワクチンアジュバントを製造することに研究努力
が注がれている。全細胞チフスワクチンは全身および局所の副作用を誘発し、結
果としてこの有用なワクチンおよびワクチン試験時間は、単に反応原性が劣ると
いう理由で、無細胞チフスワクチンに代わられる。

【０００７】本発明は、哺乳動物宿主に生物学的に活性なペプチドをコードした裸プラスミ
ドの使用を教示した特許第５,８３０,８７７号の発明とは異なっている。本明細
書に記載の発明は、免疫応答を誘発する目的で、皮膚上に一緒に投与するアジュ
バントおよび、抗原または核酸の使用を教示する。本明細書に記載の発明は更に
特許第５,８３０,８７７号の発明とは異なっており、生物学的に活性なペプチド
が関与する毒性、ペプチドの単離、精製および合成上の問題や費用、および標的
組織中に存在するプロテアーゼによる分解から引き起こされるそれらペプチドの
インビボ半減期の短さの理由で、核酸中にコードされず且つ宿主細胞によって産
生されるペプチドの使用から離れて教示する。これは明らかに、コレラ毒素など
のアジュバントの共投与した抗原または核酸への添加から離れて教示している。
実際、皮膚からの適用によって、毒性を伴わずに大きな分子（例えば、ＣＴ）の
免疫応答を誘発する能力の新規性は、本新規性および皮膚への適用によるワクチ
ン処置のためのタンパク質の運搬に関する潜在的なインプリケーション以上の公
的な興奮を記載した多数の科学文献を導くことになった。特許第５,８３０,８７
７号とは違って、本発明は局所的な炎症および過敏状態の刺激にはよらない。特
許第５,８３０,８７７号とは違って、本発明は抗原、プラスミドまたはＲＮＡの
摂取を増大するための細胞膜の浸透性を増大するために、過敏状態または局所的
な炎症にはよらない。実際、経皮的免疫化に関する顕著な特徴は、局所的な炎症
のないことである。

【０００８】本発明とは違って、特許第５,８２４,３１３号では、抗体応答に影響を及ぼす
抗原の筋肉注射による、非常に小さい（５００ダルトンより少ない）リンパ様器
官修飾剤（例えば、１,２５−ジヒドロキシ−１６−エンビタミンＤ₃およびカル
シポトリエン（calcipotriene）またはデヒドロエピアンドロステロン（ＤＥＨＡ）、ＤＥＨＡコンジナーおよびＤＥＨＡ−誘導体）の適用を教示している。

【０００９】経皮的免疫化は、皮膚の外部バリヤーを通過する抗原の経路（該経路は不浸透
性であると考えられていた）、および抗原への免疫応答の経路の両方を必要とす
る。フィッシャーの接触皮膚炎は、５００ダルトンより大きい分子は通常は皮膚
に浸透できないと述べている。トランスフォーマソーム（transferosomes）によ
る免疫応答の誘発、リポソームとの脂質構造の違いについては、ポール（Paul）
ら（１９９５）による報告がある。この文献では、トランスフォーマソームは抗
原のためのビヒクル（ウシ血清アルブミンおよび狭間隙(gap)結合タンパク質）として使用され、そして抗原−感作リポソームの補体−媒介溶解についてアッセ
イされた。抗原による皮膚の浸透の限界は、７５０ダルトンであると述べられた
。それらの研究では、抗原を含有する溶液を皮膚上に置いた場合には免疫応答は
誘発されず；トランスファームソームだけが免疫応答を誘発することができた。
ポールとクベック（Cvec)(１９９５）は、「単一のペプチドおよびタンパク質溶
液を用いて表皮的に免疫化することは不可能である」とも述べている。

【００１０】それらの文献は、免疫化の際に、抗原またはアジュバントとしてコレラ毒素（
８５,０００ダルトンである）のような分子を使用する我々の成功が、そのような大きな分子は皮膚に浸透しないと予想されており、従って特定の免疫応答を誘
発しないと予想されていたので、当該分野によって驚きをもって迎えられた理由
を説明している。

【００１１】しかしながら、我々は米国特許出願番号０８／７４９,１６４(１９９６年１１
月１４日出願)、米国特許出願番号０８／８９６,０８５号（１９９７年７月１７
日出願）および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１３２４（１９９７年１１月
１４日出願）中で、ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン（例えば、コレラ毒素）
を抗原として使用することにより、非常に高い再現性で強い抗体応答を導き出せ
ることを見出した。ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシン（例えば、コレラ毒素）
を免疫アジュバントして使用し、別の抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）を
有する生理食塩水で皮膚に適用させた場合に、全身および粘膜の抗原特異的抗体
応答を導き出すことができる。本出願中、我々は浸透増強剤、バリヤー破壊剤、
またはそれらの組み合わせを用いた経皮的免疫化がバクテリアエキソトキシンの
アジュバント活性を改善可能であることを開示する。

【００１２】我々は、例えば、コレラ毒素（ＣＴ)、Ｅ.Ｃｏｌｉ由来の易熱性エンテロトキ
シン（ＬＴ)、シュードモナスエキソトキシンＡ（ＥＴ_A)、チフス毒素（ＰＴ）および広範囲にわたる様々な抗原（殺性狂犬病ウイルス)、組換え体（例えば、ＨＩＶｐ５５ｇａｇ)、多糖複合体（例えば、Ｈｉｂ)、音波処置産物、ペルタ
クチン（pertactin）が皮膚を通過することができ、免疫応答を誘発することができることを見出した。加えて、ＣＴ、ＬＴ、ＥＴＡおよびＰＴ、並びにバクテ
リアＤＮＡおよびサイトビーン（Cytobines）は皮膚上に一緒に投与された抗原への免疫応答を誘発するためのアジュバントとして作用することができる。従っ
て、破傷風トキソイド（これは皮膚上ではそれ自身は免疫原性ではない）はＣＴ
と一緒に皮膚上に置くと強い免疫応答を誘発し得る。我々は、適用部位の下にあ
るランゲルハンス細胞個体群が免疫系に抗原を運搬するのに好ましい抗原提供細
胞であると提案する。アジュバントは直接的であるか、またはリンパ球認識抗原
を通じて抗原提供細胞に作用し得る。

【００１３】我々は、浸透増強の技術に利用できる経皮アジュバントおよび／または抗原に
対する免疫応答を増大することを提案する。ハーレー（Hurley）らによれば、「
皮膚はその耐久性を真皮に負っているが、その化学的不浸透性を表皮およびほと
んど独占的には死んだ外層である解質層に帰する」。例えば、アジュバントして
ＡＤＰ−リボシル化エキソトキシンおよび溶解性タンパク抗原（例えば、ジフテ
リアトキソイド）を用いた経皮的免疫化の場合には、解質層の浸透は起こるに違
いない。浸透増強技術は、経皮的抗原およびアジュバントが皮膚の解質層を通過
する運動を増大するように設計される。

【００１４】更に、我々は定量的および定性的パラメーターによってアッセイされる通り、
少なくとも１つの抗原、アジュバントおよび皮膚成分の活性化を用いる経皮的免
疫化が免疫応答を増大させるであろうと提案する。製剤中の抗原−アジュバント
は、バクテリアエキソトキシンのトリプシン切断によって活性化され得る（例え
ば、トリプシン−切断ＬＴ、還元を伴ったり伴わなかったりする）。製剤の適用
部位での皮膚の活性化は、下にあるランゲルハンス細胞個体群の大きさまたは活
性化を増大するバリヤー破壊剤（例えば、アセトン、アルコール）を用いること
で達成可能であり、またはガングリオシドＧＭ１受容体の量または利用を増大さ
せる酵素もしくは酵素の組み合わせ（例えば、シアリダーゼ活性を有する酵素）
によって達成可能である。

【００１５】（発明の概要）本発明の目的は、被験者（被験者は動物またはヒトである）の免疫応答（例え
ば、体液性および／または細胞性エフェクター）を誘発する経皮的免疫化のため
の増大システムを提供することである。この運搬システムは、抗原に対する特異
的免疫応答を誘発するために、生物体の無傷の皮膚に抗原およびアジュバントか
らなる製剤の単なる適用を提供する。単純な運搬システムによる免疫応答の誘発
には必要ないが、浸透増強またはバリヤー破壊を有する前述のプロセスを補足す
ることは免疫化および／またはワクチン処置を増大可能とする。

【００１６】特に、アジュバントまたは抗原または皮膚は、解質層または表皮の浸透の際に
、免疫系の抗原提供細胞（例えば、表皮のランゲルハンス細胞、皮膚の樹状細胞
、樹状細胞、小胞の樹状細胞、マクロファージ、Ｂ型リンパ球）と遭遇するよう
に、および／または抗原提供細胞が抗原を食するよう誘発するのを助ける。次い
で、抗原提供細胞はその抗原をＴ型およびＢ型細胞に提供する。ランゲルハンス
細胞の場合、次いで抗原提供細胞は皮膚からリンパ節に移動し、抗原をリンパ球
（例えば、Ｂ型および／またはＴ型細胞）に提供し、その結果、抗原特異的免疫
応答を誘発する。

【００１７】加えて、免疫化プロセスを補足するのに、抗原、アジュバント、皮膚またはそ
れらの組み合わせの活性化を果たすことができる。

【００１８】抗原特異的Ｂ型リンパ球および／またはＴ型リンパ球（細胞毒性Ｔ型リンパ球
（ＣＴＬ）を含む）の発生を導く免疫反応を顕在化することに加えて、本発明の
別の目的は抗原特異的ヘルパー（Ｔｈ−１および／またはＴｈ−２）または遅延
型過敏症（ＤＴＨ）Ｔ−細胞族に影響を及ぼす目的で、経皮的免疫化システムを
用いることによって、免疫系の成分を正におよび／または負に調節することであ
る。このことはＣＴおよびＬＴの弁別的行動によって具現化され、これにより異
なるＴ−ヘルパー応答が生じたり、または経皮的免疫化を用いたインビボ攻撃模
型において異なるレベルの保護が生じ得る。

【００１９】（好ましい態様の説明）本発明の１実施態様において、抗原およびアジュバント（例えば、ＣＴおよび
ＤＴ）を含有する製剤は、皮膚の浸透増強の後に生物体の無傷の皮膚に適用され
、その抗原は免疫細胞に提供され、そして抗原特異的免疫応答は皮膚に穴をあけ
ずに誘発される。その製剤は、製剤の経皮的適用が多数の抗原に対して免疫応答
を誘発するような別の抗原または核酸を、または好ましくは２〜２０であるが、
できるだけ２００までの抗原をコードした核酸を含んでもよい。その場合、抗原
は同一の出所由来であってもなくてもよいが、抗原は異なる抗原に対して特異的
な免疫応答を誘発するために異なる化学構造を有する。抗原特異的リンパ球は免
疫応答に関与し、Ｂ型リンパ球による関与の場合には、抗原特異的抗体は免疫応
答の一部である。

【００２０】本発明の別の態様では、本発明は生物体を処置するのに使用される。抗原が病
原体由来である場合、処置は病原による感染、または病原の影響（例えば、毒素
分泌物によって引き起こされる該影響）から生物体をワクチン処置する。腫瘍抗
原を含む製剤は癌の処置を提供し；アレルゲンを含む製剤はアレルギー性疾患を
処置するのに使用され；自己抗原を含む製剤は生物体自身の免疫系によって引き
起こされる疾患（例えば、自己免疫疾患）の処置を提供し得る。本発明は、存在
する疾患を処置するのに治療学的に使用するか、疾患を予防するのにまたは疾患
の発病度および／または持続時間を軽減するのに保護的に使用可能である。

【００２１】本発明の更なる態様において、上記の方法における使用のためのパッチが提供
される。パッチは包帯、ならびに有効量の抗原もしくは核酸およびアジュバント
を含んでもよい。包帯は密封性であっても、非密封性であってもよい。パッチは
浸透増強剤を含有してもよく、または身体の浸透増強のための装置を含んでもよ
い。パッチは、パッチの適用により多数の抗原に対して免疫応答を誘発するよう
な別の抗原を含んでもよい。その場合、抗原は同一の出所由来であってもなくて
もよいが、抗原は異なる抗原に対して特異的な免疫応答を誘発するために異なる
化学構造を有する。有効な処置として、多数のパッチを煩雑な間隔で、または期
間中絶え間なく適用してもよい。

【００２２】その上、本発明の更に別の態様では、製剤を１回もしくは多数回の適用、また
はアジュバントもしくは抗原／核酸のための別のパッチを用いて、１より多いド
レイニングリンパ節領域の上にある無傷の皮膚に適用する。その製剤は、無傷の
皮膚に適用することにより多数の抗原に対して免疫応答を誘発するような別の抗
原を含んでもよい。そのような場合、抗原は同一の出所由来であっても、なくて
もよいが、抗原は異なる抗原に特異的な免疫応答を誘発するために異なる化学構
造を有する。

【００２３】製剤を、免疫化の他の経路と合わせて、免疫応答を追加免疫するか（boost)、
または初回免疫させる（prime）ために、皮膚に適用可能である。従って、１回または多数回の適用による経皮的免疫化を用いた初回免疫に続いて、同一抗原ま
たは改変抗原を用いた免疫化を追加免疫するための経口、鼻または非経口技術を
行ってもよい。該製剤は無傷の皮膚に適用させることにより、多数の抗原に対し
て免疫応答を誘発するような別の抗原を含んでもよい。そのような場合、抗原は
同一の出所由来であっても、なくてもよいが、抗原は異なる抗原に特異的な免疫
応答を誘発するために異なる化学構造を有する。

【００２４】抗原および活性化アジュバントに加えて、製剤はビヒクルを含んでもよい。例
えば、製剤はＡＱＵＡＰＨＯＲ（ペトロラタム、鉱油、鉱蝋、羊毛脂蝋、パンテ
ノール、ビサボール(bisabol)およびグリセリンの乳剤)、乳剤（例えば、水性ク
リーム)、マイクロエマルジョン、ゲル、ｏ／ｗ型乳剤（例えば、油性クリーム)
、無水脂質およびｗ／ｏ型乳化剤、脂肪、蝋、油、シリコーンおよび湿潤剤（例
えば、グリセロール）を含んでもよい。

【００２５】抗原は生物体に感染することができる病原（例えば、バクテリア、ウイルス、
菌または寄生虫)、または細胞（例えば、腫瘍細胞または正常な細胞）またはアレルゲンまたは生物学的に交戦状態の（warfare）薬剤の由来であってもよい。その抗原は腫瘍抗原であるか、または自己抗原であってもよい。化学的には、抗
原は炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リン脂質、ポリ
ペプチドまたは融合タンパク質（組換え型）または上記の化学的複合体であって
もよい。抗原の分子量は５００ダルトンより多くてもよく、８００ダルトンより
多いのが好ましく、１０００ダルトンよりも多いのが一層好ましい。

【００２６】抗原は組換え手法、化学合成または天然物からの精製によって得ることができ
る。経皮的免疫化の１利点は、抗原の精製が不必要なことであり、例えば全生物
を音波処置し、免疫化に使用することができる。そういった製造からの生成物を
注射することに伴う毒性レベルは、許容するにはあまりにも毒であることがよく
あり、例えばＬＰＳは注射されれば致命的であるが、皮膚上では無毒である。タ
ンパク質性抗原または多糖複合体が好ましい。抗原は細胞のない形態に少なくと
も一部精製することができる。別法として、抗原は生きたウイルス、減毒した生
きたウイルス、または失活したウイルス、音波処理もしくは溶解した全バクテリ
ア、寄生虫または洗浄剤で処理したウイルス、またはそれらの画分の形態で得る
ことができる。

【００２７】アジュバントの封入により、免疫応答の増強またはモジュレーションが可能と
なる。その上、適当な抗原またはアジュバントを選別することにより、体液性免
疫応答、細胞免疫応答もしくは粘膜応答、特異的抗原イソタイプ（例えば、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＤ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およ
び／またはＩｇＧ４）および／または特異的Ｔ−細胞群（例えば、ＣＴＬ、Ｔｈ
１、Ｔｈ２および／またはＴ_DTH）の優先的な誘発が可能となる。場合により、抗原、アジュバントは、抗原をコードした核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡ、ｃＲＮＡ)、適宜抗原を有するアジュバントまたは核酸に加えられてきたアジュバントの手法によって、製剤中に与えることができる。

【００２８】本発明で使用する用語「抗原」とは、生物体の免疫細胞に提供された場合に、
特定の免疫応答を誘発する物質を意味する。抗原は、単一免疫原性エピトープま
たはＢ−細胞受容体（すなわち、Ｂ細胞の膜上の抗体）またはＴ−細胞受容によ
って認識された免疫原性エピトープ多重度を含んでもよい。分子は抗原およびア
ジュバント（例えば、コレラ毒素）の両方であってもよく、したがって、製剤は
１成分のみを含んでもよい。抗原は全生物体（例えば、バクテリアまたはビリオ
ン）として提供され；抗原は抽出物ももしくは溶解物から、全細胞もしくは膜の
みから得ることができ；または抗原は化学的に合成するか、もしくは組換え手法
によって産生することができる。

【００２９】本発明で用いる用語「アジュバント」とは、抗原に対する免疫応答を誘発する
のを助けるために製剤に加える物質を意味する。

【００３０】本発明で用いる用語「有効量」とは、抗原特異的免疫応答を誘発する抗原の量
を意味する。そのような免疫応答の誘発は、処置（例えば、免疫保護、脱感作、
免疫抑制、自己免疫疾患のモジュレーション、癌免疫監視の強化または確立され
た感染性疾患に対する治療学的ワクチン処置）を提供し得る。

【００３１】表皮とは、我々は角質細胞の基底層および基底板から解質層まで及びそれに及
ぶ皮膚の細胞を意味する。

【００３２】経皮の定義は、一般には「皮膚から血流中への吸収形態での薬物療法との関連
、そのもの、またはその供給（〜薬物運搬）（〜ニトログリセリン）（〜ニコチ
ンパッチ)」である。２フレデリック（Frederick）Ｃ．ミシュ（Mish）らによる
編、Merrian-Webster’s Collegiate Dictionary、１０刊（スプリングフィール
ド、ＭＡ：Merrian-Webster社、１９９７)，８６１。

【００３３】本発明で使用する用語「ドレイニングリンパ節領域」とは、集めたリンパ液が
決まったリンパ節の組（例えば、頚リンパ節、腋窩リンパ節、鼡径リンパ節、滑
車上顆リンパ節、膝窩リンパ節、腹および胸郭のリンパ節）を通してろ過された
、解剖学上の領域を意味する。

【００３４】皮膚の浸透は、皮膚の水和作用を増加させる技術を用いて増大させることがで
きる。ロバート（Robert）およびウォルカー（Walker)(１９９３）らによれば、
「解質層（ＳＣ）の水和の状態は、ある溶質の浸透性吸収の速度を決定する際の
最も重要な要素の１つである。」。水和の状態は、皮膚を通して物質を吸収する
速度を決定する際に、拡散の原理（principal）と相互作用する。更に、ハーレー（Hurley）は以下のように述べている。「解質層からの物質の吸収は、フィック（Fick）らの拡散の法則によれば、拡散
によって起こると考えられ、該法則とは化学物質の吸収速度は膜の濃度差に比例
するというものである。従って、皮膚表面上での溶質の高濃度と解質層下の濃度
なしまたは低濃度の間の濃度勾配が本プロセスの推進力である。吸収の貫角膜（
transcorneal）運動とは古典的に細胞通過（percelluar)、すなわち高密度な角質層の細胞壁を直接に通過することであって、細胞間での通過ではないことを意
味する。細胞内タンパク質フィラメントは、極性（水溶性）化合物の経路として
記載され、およびフィラメント間の媒質は非極性（脂質可溶性）物質についての
経路として機能する。完全には分類されない多数の細胞物理学機構によって、水
和はほとんどの物質についての解質層の浸透性を増加させる。」。従って、皮膚
の水和が皮膚の浸透を増大させることは一般的には知られているが、このことが
起こる機構は完全には明らかではなく、従って本発明の以前には予想することは
できず、大きな分子（７７５０ダルトン）の浸透が可能であるとは考えられてい
なかった。

【００３５】水和を増加させるためにビヒクルを使用することはよく知られている。蒸気−
不浸透性のプラスチックフィルム（例えば、ポリビニルピロリドン、ポリエチレ
ン）などの密封包帯は、主に解質膜の増加した水和による吸収、結果としてのコ
ルネオサイトの膨大、および細胞間コリドー（corridor）への水の摂取を増大さ
せる。親水コロイドパッチも皮膚浸透作用を増大させるのに使用可能である。ス
テロイドの吸収は、プラスチック密封包帯を用いた場合、１００倍以上増加させ
ることができる。一般的に、グリース、油または不浸透性のプラスチックは密封
によって、大部分の水和を誘発する。例えば、イドソン（Idson)(１９７８)、ホ
リングスビー（Hollingsbee)(１９９５）およびマッケンジー（Mckenzie）とストートン（Stoughton)(１９６９）を参照。水和の使用または抗原およびアジュバントについての水和のためのビヒクルの使用は、我々の発明の以前は浸透とし
ては知られていなかった。水和された状態でさえも、皮膚は小さい分子に限定し
ていると考えられていた。

【００３６】皮膚からの薬物の吸収を増大させることが知られている適当な薬剤については
、スローン（Sloan）のUse of Solubility Parameteres from Regular Solution
Theory to Describe Partitioning-Driven Processes、５章、「Prodrugs: Top
ical and Ocular Drug Deliverly」(Marcel Dekkerによる１９９２）およびその
文章内の他の場所に記載されている。

【００３７】これらの技術（および薬物運搬を促進するのに従来使用されていた他の技術）
は、当業者が実験を行なわずに、本発明の方法を使用するための核酸の製造に適
用させることができると期待される。この適合を例示する具体的な例については
以下に述べる。

【００３８】皮膚への浸透の増大に関する分野の現状については、Pharmaceutical Skin Pe
netrration Enhancement、ケネス（Kenneth）Ａ．ウォルター（Walter）およびジョナサンハッドグラフト（Jonathan Hadgraft)、Marcel Dekker出版，ニューヨーク，１９９３に記載されている。

【００３９】皮膚浸透性および／または皮膚水和は、異なる群、例えば湿潤剤（例えば、グ
リコール、グリセロール)、散剤（例えば、クレー、振とうローション)、油／水
（Ｏ／Ｗ）型乳剤（例えば、水性クリーム)、水／油型乳剤（例えば、油性クリーム)、乳剤性基剤（例えば、無水脂質およびＯ／Ｗ型乳化剤)、吸収性基剤（例
えば、無水脂質およびＷ／Ｏ型乳化剤)、親油性基剤（例えば、脂肪、ワックス、油、シリコーン）および密封包帯（例えば、プラスチック包装）から適当なビ
ヒクルを選択することによって、期待することができる。

【００４０】本発明においては、浸透を増進するための、角質層タンパク質を破壊する他の
方法を用いることもできる。サリチル酸は、吸収を増加させるケラチン分解剤で
ある。尿素は、皮膚のケラチン分解剤および水和剤の両方として作用し、浸透増
進剤として作用することができる。ホスホリパーゼＡ２およびホスファチジルコ
リン依存性ホスホリパーゼＣは、浸透を増進するための上皮酵素として用いるこ
とができる。他の浸透増進剤として、エタノール、アセトン、洗剤、ベース、ネ
ア（コピーライト)、プロピレングリコール、ピリオリドン、ジメチルアセタミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルキルスルホキシド、酸
化ホスフィン、界面活性剤およびアゾンなどのカプロラクタムが挙げられる。浸
透増進剤として用いることができる他の化合物として、アミンおよびアミド、ア
ルキルＮ,Ｎ−分配−アミノアセテート、デシルメチルスルホキシド、ピロリドン、ピロチオデカン（ＨＰＥ−１０１)、ベンジルアルコニウム、ベンジルアルコニウムクロリドポリマー、シリコンベースポリマー、脂肪酸、環式尿素、テル
ペン、リポソームおよびシクロデキストリンが挙げられる。浸透増進剤は、当業
界で公知であり、たとえば、“医薬的浸透増進”（Marce Dekker、１９９３）に
記載されている。浸透増進用に用い得るたの技術として、イオン導入、超音波、
電気穿孔、テープストリッピング、遺伝子銃または他の推進用装置、ＴＢタイン
テストに用いるようなタイン（Mono−Vaccシステムによって提供されるものなど
）または皮膚の外表面を貫通するマイクロニードルの使用、または皮膚の外層を
除去する研磨剤および脂質抽出が挙げられる。

【００４１】角質層の破壊に用い得る他の装置（米国においてペンシルバニア州スイフトウ
ォーターのConnaught Laboratories，Inc.によって市販されている）は、一方の
端にシリンジプランジャーおよび他方の端にタインディスクを備えるプラスチッ
クコンテナからなる。タインディスクは、上皮細胞の最外層はひっかくが、上皮
へは貫通しない長さの非常に多数の細い直径のタインを支持する。ＭＯＮＯ−Ｖ
ＡＣＣキットにおける各タインは、古いツベルクリンで被覆されている；本発明
においては、各針を抗原／核酸およびアジュバントを含む医薬組成物で被覆する
。本発明を使用して該装置を用いる場合、上皮を貫通しないので、装置の製品に
含まれる使用指示書には従わない。この点に関して、該装置は、皮膚の最外層、
角質層、上部上皮を破壊して経皮免疫感作を増進するための表面破壊に使用する
ことができる。この具体例において用いることもできる類似した装置は、現在ア
レルギーテストに用いられている装置である。他のアプローチは、バリヤー破壊である。全身投与されたＨＮＧＣｏＡレダク
ターゼインヒビターおよび同様の薬物を用いるコレステロール合成の阻害によっ
て、バリヤー機能が妨げられ、製剤成分の浸透を増進される。

【００４２】皮膚を形質転換して経皮免疫応答を増強しうることも考えられる。ＣＴおよび
ＬＴは、Ｂサブユニットによって結合するガングリオシドＧＭ１を介して効果を
発揮する。ガングリオシドＧＭ１は、すべての哺乳動物細胞に見出される遍在性
細胞膜糖脂質である。胃腸管内において、五量体のＣＴＢサブユニットが細胞表面に結合する場合、親水性の孔が形成され、Ａユニットが脂質二重層を通って
浸透することができる。皮膚は、３０−３５ナノモル NeuＡＣ／ｇの濃度でガン
グリオシドを含有する。皮膚ガングリオシドは、上述したランゲルハンス細胞活
性化などのメカニズムを介した経皮免疫感作を開始するための可能な標的である
。皮膚を活性化するための、ＡＤＰリボシル化外毒素による経皮免疫感作の効果
を増進するひとつの可能な方法は、皮膚細胞内のＧＭ１ガングリオシド分子の数
を増加することによる。これは、毒素をシアリダーゼ−安定コレラ毒結合ガング
リオシドＧＧｎＳＬＣ（ガングリオシドＧＭ１）内へ結合しないように、ガング
リオシドを転換するシアリダーゼを用いて受容体細胞を活性化することによって
達成された：「おそらく最もよく知られたシアリダーゼ（またはノイラミニダーゼと呼ばれ
ることも多い）源がコレラビブリオであることは興味深い。このシアリダーゼは
毒素受容に適したより多くの受容体を作ることによる疾患の自然の歴史において
一部分を演じることができたか？もしそうなら、いずれの活性な免疫感作剤も、
抗ノイラミニダーゼエレメントを含有すべきか？腸内スクラッピングをシアリダ
ーゼとともに培養すると、毒素への結合能力が著しく増するが、このことは、コ
レラ毒結合ガングリオシドへのシアリダーゼ−不安定ガングリオシドの転換によ
るだけでなく、おそらく糖タンパク質を破壊することによって、他の点ではアプ
ローチ不能なガングリオシド結合部位の位置曝露によるものである。シアリダー
ゼでイヌの腸を前処理すると、産物は、コレラ毒に応答して、より液性になる；
腎臓細胞をシアリダーゼで処理すると、コレラ毒に対するその応答性が増大する
；ハト赤血球細胞をシアリダーゼで前処理すると、コレラ毒によって、その細胞
内のアデニル化シクラーゼの活性化が増大する」コレラの生化学；コレラ：The American Scientific Experience、１９４７−１
９８０、van Hayningen，W.E.およびSeal,J.R.編、ウォーター・ビュー・プレス
、ボールダー、１９８３、３２６３（引例省略）。

【００４３】皮膚をシアリダーゼで皮膚を処理すると、ＣＴなどのＡＤＰリボシル化外毒素
が経皮免疫感作によって標的化された免疫細胞へ結合するのが増大するという効
果が得られる。これは、免疫感作に対する、ある種の皮膚の活性化を表す。その
上、ノイラミニダーゼは、同時に浸透を増進する上皮酵素として作用する。浸透増進剤の使用は、皮膚の活性化に関連して用いられる。経皮免疫感作に対
する皮膚の活性化は、アセトンまたはアルコール塗布などの処理の後にも起こる
。皮膚のアセトン塗布を用いる皮膚バリヤーの破壊が、ランゲルハンス細胞密度
を８０％まで増加し、アレルゲンを接触させる反応がインビボで増大することが
明らかにされている。もし、ランゲルハンス細胞の密度が増加するならば、次い
で、免疫応答の強度が増大する。テープストリッピング、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、アルコール塗布、または水酸化カルシウムなどの脱毛剤の使用によって、同
様の化学的破壊がランゲルハンス細胞の数を増加することが予測され、その結果
として、経皮免疫感作の皮膚成分の活性化が起こる。浸透増進剤の使用およびア
レルギー性接触皮膚炎におけるバリヤー破壊については、ProkschおよびBrasch （１９９６、１９９７）を参照せよ。

【００４４】浸透増進は、免疫感作直前のアルコール塗布といったような単純な方法の実行
、浸透増進性化合物または技術の併用、またはランゲルハンス細胞の数を増やす
２４時間前のアセトン塗布などの技術、によって活性化される。医薬製剤を製造
する手順は、当業界で公知であり、それによって、抗原およびアジュバントを医
薬的に許容しうる担体ビヒクルと合わせる。適当なビヒクルおよびその調製につ
いては、E.W.Martinの“レミントンの医薬科学”などに記載されている。ヒトま
たは動物に投与するのに適した医薬的に許容しうる組成物を製造するために、こ
のような製剤は、有効量の抗原およびアジュバントならびに適当量のビヒクルを
含む。製剤は、クリーム剤、乳剤、ゲル剤、ローション剤、軟膏、ペースト、液
剤、懸濁剤、または他の当業界で公知の剤形で適用される。特に、皮膚含水、浸
透またはその両方を増進する製剤が好ましい。希釈剤、賦形剤、結合剤、安定剤
、保存剤および着色剤などの他の医薬的に許容しうる添加剤を配合してもよい。

【００４５】いずれかの特定の理論に結びつくものではなく、我々の観察を説明するものに
すぎないが、経皮免疫感作デリバリースステムが、免疫応答が誘発される免疫系
細胞へ抗原を運搬することが仮定される。抗原は、皮膚の正常な保護外層（角質
層など）を通過し、直接または加工された抗原をＴリンパ急に提示する抗原提示
細胞（マクロファージ、組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、皮膚樹状細
胞、Ｂリンパ球またはクップファー細胞など）を通して、免疫応答を誘発する（
Stingら、１９８９；StreileinおよびGrammer、１９８９；Tewら、１９９７を参
照）。必要に応じて、抗原は、小胞または皮膚小器官（汗腺、脂腺など）を介し
て角質層を通過することができる。

【００４６】細菌のＡＤＰ−リボシル化外毒素（ｂＡＲＥ）による経皮免疫感作は、抗原提
示細胞（ＡＰＣ）のうち、最も効率のよいものであることがわかっている、上皮
ランゲルハンス細胞を標的とすることができる。我々は、ｂＡＲＥが、生理的食
塩水の溶液として皮膚の上皮へ適用した場合に、ランゲルハンス細胞を活性化す
ることを発見した。活性化されたＬＴなどのアジュバントは、ランゲルハンス細
胞の活性化を非常に増進する。ランゲルハンス細胞は、抗原のファゴサイトーシ
スを介した特異的免疫応答、それらがＡＰＣとして作用して抗原をリンパ球へ提
示するリンパ節への移動、およびそれによる強力な抗体応答を指示する。皮膚は
一般に、生物侵入に対するバリヤーであるとみなされており、このバリヤーが不
完全であるかどうかは、皮膚を介しての生物侵入に対する免疫応答を組織化する
ように設計されている上皮のいたるところに分配された多数のランゲルハンス細
胞によって証明される。Udey（１９９７）によれば：「ランゲルハンス細胞は、すべての哺乳動物の層状扁平上皮に存在する骨髄誘
導細胞である。それらは、炎症を起こしていない上皮に存在するすべての補助細
胞の活性を含み、現在のパラダイムは、上皮的に適用された抗原に対して指示さ
れた免疫応答の開始および伝播にとって必須である。ランゲルハンス細胞は、上
皮およびソリッド器官ならびにリンパ組織に広く分散しているが、めったに説明
されることのない強力な補助細胞(樹枝状細胞)のファミリーのメンバーである。」「ランゲルハンス細胞（およびおそらく他の樹枝状細胞）は、少なくとも２つ
の別のステージをもつライフサイクルを有することが今や認識された。上皮に位
置するランゲルハンス細胞は、抗原をわなにかける見張り細胞の定常的ネットワ
ークを構成する。上皮ランゲルハンス細胞は、微生物などの異物を摂取すること
ができ、複合抗原の有効な加工者である。しかし、それらは、低レベルのクラス
ＩおよびIIのＭＨＣ抗原および共刺激性分子（ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−１およびＢ
７−２）のみを提示し、準備ができれいないＴ細胞に対する刺激性は乏しい。抗
原に接触した後、幾つかのランゲルハンス細胞は、活性化され、上皮を出て、そ
れらが成熟樹枝状細胞として存在する局所的リンパ節のＴ細胞依存性領域へ移動
する。上皮脱出およびリンパ節への移動の過程において、抗原運搬上皮ランゲル
ハンス細胞(今や‘メッセンジャー’）は、形態学的、表面表現型および機能において劇的な変化を示す。上皮ランゲルハンス細胞とは逆に、リンパ球樹状細胞
は、本質的に非食細胞性であり、タンパク質抗原を加工する効率は悪いが、高レ
ベルのクラスＩおよびIIＭＨＣ抗原および種々の共刺激性分子を急送し、同定さ
れていないナイーブＴ細胞の最も強力なスティミュレーターである。」

【００４７】我々は、上皮ランゲルハンス細胞の強力な抗原提示能力が、経皮的にデリバリ
ーされたワクチンにとって活用されうることを構想する。皮膚免疫系を用いる経
皮免疫応答は、角質層（角質化した細胞および脂質からなる皮膚の最外層）のラ
ンゲルハンス細胞のみへのワクチン抗原の受動的伝播を介したデリバリーおよび
それに続く、抗原を摂取し、Ｂ細胞小胞および／またはＴ細胞依存性領域へ移動
し、Ｂおよび／またはＴ細胞へ抗原を提示するためのランゲルハンス細胞の活性
化を要求する。他のｂＡＲＥ（ジフテリア毒など）抗原が、ランゲルハンス細胞
によって食作用される場合、次いでこれらの抗原は、Ｔ細胞に提示するためのリ
ンパ節に運ばれ、続いてその抗原（ジフテリア毒など）に特異的な免疫応答を誘
発する。したがって、経皮免疫感作の特徴は、ランゲルハンス細胞の活性化、Ａ
ＤＰ−リボシル化外毒素結合サブユニット（コレラ毒Ｂサブユニットなど）また
は他のアジュバントあるいはランゲルハンス細胞活性化物質である。次いで、ア
セトン塗布などの方策を用いるランゲルハンス細胞の皮膚集団の増加が、経皮免
疫応答を増大することが予測しえた。

【００４８】より一般的に知られる皮膚免疫応答の範囲は、接触皮膚炎およびアトピーに代
表されるものである。ＬＣ活性化の病的現れである接触皮膚炎は、抗原に食作用
し、リンパ節に移動し、抗原を提示し、皮膚へ移動して、影響を及ぼされた皮膚
部位に生じる強い破壊的な細胞応答を引き起こすＴ細胞を感作するランゲルハン
ス細胞によって指示される（Dahl、１９９６；Leung、１９９７)。アトピー性皮
膚炎は、同様の様式でランゲルハンス細胞を用いるが、Ｔｈ２細胞と結び付けら
れ、一般的に高レベルのＩｇＥ抗体に関連がある（Dahl、１９９６；Leung、１９９７)。これに対して、コレラ毒および関連ｂＡＲＥ経皮免疫感作は、免疫感作後２４
、４８および１２０時間の時点において、リンパ球浸潤がないことによって明ら
かな、表面上および微視的な免疫感作後の皮膚の所見が見られない（すなわち、
非炎症性皮膚）新規な免疫応答である。これは、単純な閉塞性パッチの下でヒト
をＬＴで免疫感作したフェーズトライアルの完了によって著しく明らかである。
強力な抗ＬＴおよびＩｇＡ抗体が刺激された。２人のボランティアが免疫感作部
位で行われる生検を受けた。微視的評価によって炎症が見られないという臨床上
の観察が確認された。これは、“非炎症性上皮に存在するすべての補助細胞の活
性を含み、現在のパラダイムにおいて、皮膚の上から適用された抗原に対する免
疫応答の開始および伝播にとって必須である” ランゲルハンス細胞が、補充されていたかもしれないことを示唆している（Udey、１９９７)。高レベルの高原特異的ＩｇＧ抗体および産生される抗体のタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、Ｉｇ
Ｇ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧＡ）の両方ならびに抗ＣＴＩｇＥ抗体がないこと
によっても、経皮免疫応答の唯一性が示される。しかし、他の免疫細胞は拘束す
ることができ、メカニズム上の推測から本発明を制限すべきではない。

【００４９】したがって、我々は、皮膚の表面に適用された細菌誘導性毒がランゲルハンス
細胞を活性化合物することができること、およびＴＣＩが高レベルの抗原特異的
循環性ＩｇＧ抗体として現れる強力な免疫応答を誘発することを見出し、浸透増
進剤が免疫応答を強化することを予測した。経皮アジュバントおよび浸透増進剤
は、経皮免疫感作に用いて、ＩｇＧ抗体または、皮膚の上に置いたときに他の点
ではそれ自体免疫原生のないタンパク質に対するＴ細胞応答を強化することがで
きる。ランゲルハンス細胞の経皮標的化は、それらの抗原提示機能を不活性化するの
に用いることもでき、それによって、免疫感作または感作を予防することができ
る。ランゲルハンス細胞または他の皮膚免疫細胞を起動し、さらに負の方向にそ
れらを調節する技術として、抗炎症性ステロイドまたは非ステロイド剤（ＮＳＡ
ＩＤ）、シクロホスファミドまたは他の免疫抑制剤、インターロイキン１０、イ
ンターロイキン１に対するＴＧＦβモノクローナル抗体、ＩＣＥインヒビターま
たはスタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）を介する誘発皮膚ランゲ
ルハンス細胞消耗などのスーパー抗原を介した消耗などが挙げられる。

【００５０】経皮免疫感作は、ＣＴ、ＬＴまたはＣＴＢなどのサブユニットのガングリオシ
ドＧＭ１結合活性を介して誘発することができる。ガングリオシドＧＭ１は、す
べての哺乳動物細胞にみられる遍在性細胞膜糖脂質である。五量体ＣＴＢサブユ
ニットが細胞表面に結合するとき、親水性孔が形成され、Ａサブユニットが脂質
二重層を貫通できるようになる。我々は、ＣＴまたはＣＴＢによる経皮免疫感作が、ガングリオシドＧＭ１結合
活性を要求することを明らかにしている。ＣＴ、ＣＴＡおよびＣＴＢでマウスを
経皮免疫感作するとき、ＣＴとＣＴＢのみが免疫応答を引き起こす。ＣＴＡは、
ＡＤＰ−リボシル化外毒素活性を含むが、結合活性をもつＣＴとＣＴＢのみが、
免疫応答を誘発することができ、このことは、Ｂサブユニットが皮膚を免疫感作
するのに必要十分条件であることを示している。我々は、ランゲルハンス細胞ま
たは他の免疫細胞は、細胞表面に結合するＣＴＢによって活性化されるが、Ａさ
部ユニットが同時に存在することにより、より強く活性化されるとの結論を下す
。

【００５１】本発明の免疫感作プロセスにおける皮膚成分の活性化に加えて、抗原および／
またはアジュバントが免疫感作を活性化して免疫感作を増強することができる。
ＣＴが分泌されるとき、トリプシン認識部位に開裂が生じ、毒素が活性化される
。しかし、ＬＴは、無傷のそのトリプシン認識部位で分泌される。ＬＴが胃腸管
内で分泌され、それによってトリプシンなどの胃腸作用剤に曝露されるとき、Ｌ
ＴのＡ１およびＡ２サブユニットを結合するタンパク質分解的感受性をもつ残基
が切断され、Ａ１サブユニットがＡＤＰ−リボシル化Ｇタンパク質へ許可され、
したがってその毒素効果を発揮する。皮膚におけるトリプシンおよび関連作用剤
の欠如は、ＬＴのＡ１およびＡ２サブユニットを結合するタンパク質分解的感受
性残基のトリプシン切断を防止し、そのアジュバント活性を減少させる。

【００５２】これらの２つの細菌性エンテロトキシンは、共通して多くの特徴をもつ。ＬＴ
およびＣＴは、同じサブユニット数（Ａ２：Ｂ５）および配置をもち、同じ生物
学的作用機構をもつ。ＬＴとＬＣを比較すると、７５−７７％のアミノ酸配列類
似性が両方の鎖に見出だされ、最も大きな差異は、それぞれのＡ鎖の１９２−１
９５位で起こる。この部位において、トリプシンによるＡ鎖の切断が起こり、該
部位は、Ａ鎖の内部ジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基の間に位
置を定められる。Mekalanosら、１９７９；Spangler、１９９２；およびSniderm
an、１９９５などを参照せよ。我々は、分子間のこれらの構造的差異がそれらの
エンテロトキシンとしての特性のみならずアジュバントとして機能する能力にも
重大な影響を及ぼすことを提案する。

【００５３】コレラ菌（Ｖ．cholerae）とは異なって、最初に細菌の細胞から単離されたと
き、ＬＴは、完全には生物学的に活性ではない。細菌毒素のＡ−Ｂモデルに一致
して、ＬＴは、完全に活性になるために、トリプシンのタンパク質分解およびジ
スルフィド還元を必要とする（Sniderman、１９９５)。タンパク質分解的加工の
欠如において、酵素的に活性のあるＡ１部分はＡ２成分から解離することができ
ず、腸上皮細胞の基底外側表面上にあるその標的（アデニレートシクラーゼ）に
到達することができない。単離されたマテリアルの活性化におけるこの差異から
、生物学上のシステムにおけるＬＴおよびＣＴへの応答閾値の差異が生じる。た
とえば、ＣＴは、マウス腸内で、５〜１０μｇの検出可能な正味流体の分泌を誘
発する。ＬＴはこのアッセイにおいて、５０〜１００μｇの検出可能な正味分泌
を誘発する。ウサギの結紮されたイリアル（illeal）ループにおいて、差異は、
より劇的であり明確である。しかし、重要なことには、ＬＴがトリプシン様特異
性をもつタンパク質分解性酵素に曝露されるとき、どのような生物学的アッセイ
システムを用いても、分子はＣＴから区別することができなくなる（ClementおよびFinkelstein、１９７９；DickensonおよびClements、１９９５)。

【００５４】 Spangler（１９９２、引例添付せず)：「コレラ菌および大腸菌の両方において、サブユニットＡは、一本鎖ポリペプ
チドとして合成される。ＣＴＡは、コレラ菌ヘマグルチニン／プロテアーゼによ
るコレラ菌からの分泌中に第１９２および１９５残基の間でタンパク質分解的に
ニックされ、第１８７および１９９残基の間のジスルフィドブリッジを介して共
有的に結合する２つのポリペプチドＡ１（Ｍｒ＝２８８２６）およびＡ２（Ｍｒ
＝５４０７）になる。逆に、ＬＴは、大腸菌のペリプラズム内に残り、ニックさ
れない。遺伝子工作されたコレラ菌の菌株に導入される場合、ＬＴは、ＣＴと同
じ仕方で分泌されたが、ニックされないままである。したがって、タンパク質分
解的加工は、分泌にとって必要条件ではない。しかし、精製されたＬＴｈはイン
ビトロでニックすることができ、これは、ニックされるＬＴＡの無能性を示すと
いうよりもむしろ、Hirstらによって用いられた突然変異ビブリオが、ニックを触媒するには不十分な可溶性ヘマグルチニンを含むこと示唆している。大腸菌内
へ工作されたプラスミドを介して導入される場合、ＣＴは、ニックされないまま
であり、細胞は大腸菌に結合される。したがって、大腸菌内のＣＴおよびＬＴの
加工における欠如は、大腸菌がニックおよび毒素分泌不能であることに関連する
。この不能であることから、コレラ菌と比較した場合に、大腸菌誘発性腸疾患の
重篤度が低くなっているを説明することができる。ＣＴおよびＬＴの両方におい
て、Ａ１およびＡ２を結合するジスルフィド結合は、還元されないままであり、
したがって、細胞内は入るまで毒素は本質的に不活性である。」「完全なＡサブユニットおよびホロトキシンは、Ａ１ポリペプチドと比べると
、相対的に不活性である。触媒活性は、Ａ１およびＡ２を結合するジスルフィド
結合（Ａ１：Ｃｙｓ−１８７、Ａ２：Ｃｙｓ−１９９）の還元を必要とする。Ａ
１−Ａｒｇ１９２およびＡ２：Ｍｅｔ１９５におけるＡ２ポリペプチドの開始の
間の切断は、ビブリオからのＣＴの分泌中に起こり、トリプシン消化はＬＴに対
するインビトロでの目的にかなう。ＣＴＡ２からＣＴＡ１を放出する還元は、種
々の作用剤（通常、インビトロではジチオスレイトールまたは２−メルカプトエ
タノールまたはチオール：プロテインオキシレダクターゼ）によって成し遂げら
れる。外来性還元剤および還元の機構はわかっていない。毒素の膜受容体への見
かけの結合と細胞内的に修飾された基質の最初の出現との間で観察された約１６
分のタイムラグは、挿入またはトランスロケーションに続いてまたはその最中に
生じるためにこのステップに要求された時間に関連する。」

【００５５】ＬＴｈは、ＬＴホロ酵素を表す。したがって、もしトリプシン処理ＬＴが経皮
免疫感作に用いられるべきであったなら、我々は、ジスルフィド結合の破壊には
、同様のメカニズムが起こっていることを提案する。これは、マウスのＹ−１バ
イオアッセイにおいて、ＬＴのトリプシン活性化に対して示されるものであり、
ＣＴと比べた場合に、ＬＴは、同様に強力であるかまたはより強力であり、非処
理ＬＴに対してさらにより強力である（DickinsonおよびClements、１９９５)。我々は、アジュバント活性およびＬＴの免疫原性を増強するために、皮膚に適
用する前に、トリプシンまたは同様の化合物を用いて、ＬＴなどの製剤の成分を
活性化することを提案する。ＬＴの活性化は、抗原としてのＬＴに対する免疫応
答を増強することも予測される。経皮免疫感作に対する活性化アジュバントは、
ＡＤＰ−リボシル化外毒素であるのが好ましい。要すれば、アジュバントの活性
化に加えて、経皮デリバリーシステムにおいて含水または閉塞性包帯を用いるこ
とができる。

【００５６】さらに、ＬＴは、炭水化物含有マトリックスに対して並外れた親和性をもつ。
特に、ＬＴは、グリコプロテインおよびリポサッカリドなどのガラクトースを含
有する生物学的分子のアレイに結合する。ＬＴのこのレクチン様特性から、ＧＭ
１のみに結合するＣＴよりも、ＬＴの方が、哺乳動物細胞において幅の広い受容
体分配が得られる。また、２つの分子は、Ｂサブユニット全全細胞コレラワクチ
ンを受けたボランティアにおけるＬＴ関連大腸菌下痢に対する免疫拡散実験によ
って証明されたように、多くの免疫学的差異をもつ。粘膜アジュバントとして用
いる場合、インターフェロン２またはγインターフェロンではなく、インターロ
イキン４および５の生産によって証明されたように、ＣＴは、幾つかの場合に、
パイアー斑および脾臓中のＴｈ２型細胞を選択的に誘発する：一方、ＬＴは、Ｔ
ｈ１とＴｈ２細胞の両方を誘発し、優勢的に抗原特異的ＩｇＡ応答を誘発する。
まとめると、これらの発見は、ＬＴおよびＣＴは、みかけの構造的類似性にもか
かかわらず、独特の分子であることを実証している。このような特異な性質は、
毒素それ自体およびにＬＴをアジュバントとして用い得る抗原の両方に対して産
生される免疫応答のタイプを扱うのに有用なＣＴに類似した効能をもつように、
ＬＴを活性化する能力をつくる。トリプシン切断部位の突然変異体などの遺伝子
的に改変されたトキソイドを経皮免疫感作によって活性化することも可能である
。このような突然変異毒素は、天然の毒素を摂取したり吸い込んだりするリスク
を避けうるので有用である。

【００５７】同様の仕方で、ＰＴを活性化してそのアジュバントおよび抗原活性を増強する
ことができる。六量体のＰＴタンパク質のＳ１サブユニットは、ＡＤＰ−リボシ
ルトランスフェラーゼ活性を含むが、残りのサブユニットは、Ｂドメインを含む
。ＬＴに類似して、ＰＴは、Ｓ１サブユニットとＢオリゴマーの関連において役
割を演じるトリプシン切断部位とジスルフィド結合部位の両方をもつ。トリプシ
ン切断による活性化、ジスルフィド結合の破壊またはこれらの両方が、経皮免疫
感作という状況において、ＰＴのアジュバントおよび抗原活性を増強することが
考えられる。活性化は、標的化という形体をとることもでき、六量体をサブユニ
ットへ破壊することによって達成される。たとえば、ＰＴサブユニットＳ３は、
単球のグリコリピドに排他的に結合し、皮膚におけるランゲルハンス細胞の標的
化に用いることができる。

【００５８】抗原またはアジュバントの活性化は、抗原およびアジュバントドメインを含む
融合タンパク質の生産による、ＤＮＡを用いる経皮免疫感作というコンセプトま
で拡張できる。この方法によって、ＣＴあるいはＬＴといったようなＡＤＰ−リ
ボシル化外毒素をコードし、マラリアまたはＨＩＶ抗原などの別の抗原を同時に
発現するように構築されたプラスミドを含水溶液または閉塞性パッチにて皮膚に
置き、次いで、ランゲルハンス細胞によって取りこむことができる。ＣＴまたは
ＬＴといったような融合タンパク質のＡＤＰ−リボシル化外毒素成分の発現は、
ランゲルハンス細胞を活性化させ、その移動およびリンパ節での抗原提示を引き
起こし、それによってコードされた抗原に対する免疫応答が誘発される。他の具
体例は、プラスミドとアジュバントのコンジュゲーションを含む；ＡＰＣを標的
化するためのプラスミドへのＩｇＧのＦｃタンパク質。類似の免疫感作が、ＣＴ
あるいはＬＴといったようなＡＤＰ−リボシル化外毒素を発現するプラスミドお
よびマラリアまたはＨＩＶ抗原などの抗原を発現するもう１つのプラスミドを用
いて達成される。多価免疫感作のために、多数の抗原のための単一構築物上の多
数の遺伝子を用いるか、多数のプラスミドを用いて、同時に抗原をデリバリーす
ることができるということが考えられる。ケモカイン（デフェンシン１または２
、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン８など）または
サイトカイン（インターロイキン１β、２、６、１０または１２；γインターフ
ェロン；腫瘍壊死因子α；または顆粒球−単球−コロニー刺激因子など)(Nohria
およびRubin、１９９４)、熱ショックタンパク質もしくは誘導体、森林型熱帯リ
ーシュマニアＬｅＩＦ（Skeikyら、１９９５)、コレラ毒トキシンＢ、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）誘導体（脂質Ａまたはモノホスホリル脂質Ａなど）または
スーパー抗原（Salogaら、１９９６）または他のＡＤＰ−リボシル化外毒素など
の他の分子または化合物をコードするプラスミドを、タンパク質抗原から誘導す
ることができる。

【００５９】ＡＤＰ−リボシル化因子によるＣＴ活性を増強するための、製剤への界面活性
剤およびホスホリピドの添加（Spangler、１９９２など)、などの経皮アジュバントを活性化する他の手段も有効である。アジュバントまたは抗原活性化を利用する免疫感作において、製剤中のアジュ
バントまたは抗原成分の修飾は、アジュバントおよび／または抗原が活性化され
るときに、経皮免疫感作における製剤の有用性を破壊することなく、非経口免疫
感作におけるその効果を低減化する。製剤中のアジュバントまたは抗原の望まし
くない特性（毒性、アレルギー反応性、他の副作用など）は、修飾によって、経
皮免疫感作におけるその有効性を破壊することなく低減化することができる。こ
のような修飾されたアジュバントまたは抗原の活性化には、可逆的化学修飾（タ
ンパク質分解など）または免疫系（すなわち、カプセル製剤）から可逆的に製剤
の成分を単離するコーティングの除去などが含まれる。別法として、アジュバン
トおよび／または抗原を含む製剤を、粒子（マイクロスフィア、ナノパーティク
ルなど）に封入してもよい。粒子の食作用は、主要組織適合性抗原および／また
は共刺激分子（クラスIIＭＨＣ、Ｂ７−２など）の発現をアップレギュレートす
ることによって、それ単独で、抗原提示細胞の活性化を増強することができる。

【００６０】抗原本発明の抗原は組換え法により、好ましくはアフィニティータグまたはエピト
ープタグ（Summers and Smith, 1987; Goeddel, 1990; Ausubel et al., 1996）
との融合物として発現させることができ；遊離の、あるいは担体タンパク質と共
役したオリゴペプチドの化学合成を用いて、本発明の抗原を得てもよい（Bodans
zky, 1993; Wisdom, 1994)。オリゴペプチドは一種のポリペプチドであると考え
る。６残基〜２０残基のオリゴペプチドの長さが好ましい。米国特許第５，２２
９，４９０号および第５，３９０，１１１号に開示されているような分岐状構造
としてポリペプチドを合成することもできる。抗原性ポリペプチドには、例えば
合成または組換えＢ細胞およびＴ細胞エピトープ、ユニバーサルＴ細胞エピトー
プおよび、１つの生物または疾患由来の混合Ｔ細胞エピトープおよびもう１つの
もの由来のＢ細胞エピトープが含まれる。組換え法またはペプチド合成によって
得られた抗原は、天然起源または抽出物から得られた本発明の抗原と同様に、抗
原の物理的および化学的性質を用いて、好ましくは分画またはクロマトグラフィ
ーによって精製することができる（Jonson and Ryden, 1989; Deutscher, 1990;
Scopes, 1993)。多価抗原製剤を用いて、同時に１つ以上の抗原に対する免疫応
答を誘導することができる。共役物を用いて、複数の抗原に対する免疫応答を誘
導するか、あるいは免疫応答を促進（追加免疫）し、あるいはその両方を達成す
ることができる。さらに、変性毒素（トキソイド）を用いて毒素（トキシン）を
促進するか、あるいは毒素を用いて変性毒素を促進することができる。経皮免疫
化を用いて、他の免疫化経路、例えば経口、鼻腔または非経口経路によって最初
に誘導された応答を促進することができる。抗原には、例えば、毒素、変性毒素
、そのサブユニット、またはそれらの混合物（例えば、コレラ毒素、破傷風トキ
ソイド）が含まれ；さらに、毒素、変性毒素、そのサブユニットまたはそれらの
混合物は、抗原とアジュバントの両方として作用し得る。

【００６１】抗原はバッファー中に可溶化することができる。適当なバッファーには、Ｃａ ²⁺ ／Ｍｇ²⁺を含まないリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ)、生理食塩水（１５０ｍＭ
ＮａＣｌ水溶液）およびトリスバッファーが含まれるが、これらに限定されない
。グリセロールは、本発明での使用に適当な非水性バッファーであり得る。また
、抗原は懸濁液にしてもよい。免疫化溶液に界面活性剤を入れておき、浸透を高
めてもよい。

【００６２】疎水性抗原、例えば膜貫通ドメインを含むポリペプチドは、界面活性剤中で可
溶化できる。さらに、リポソームを含む製剤用に、界面活性剤溶液中の抗原（例
えば細胞膜抽出物）を脂質と混合し、次いで希釈、透析またはカラムクロマトグ
ラフィーによって界面活性剤を除去して、リポソームを形成させることができる
。Gregoriadis (1993) を参照のこと。特定の抗原、例えばウイルス（例えばＡ型肝炎）由来の抗原は本質的に可溶性である必要はないが、ビリオンのみの懸濁
物、またはミクロスフェアナノ粒子または熱不活化バクテリアの懸濁物（これは
抗原提示細胞に取りこまれて、これを活性化することができる（例えばオプソニ
ン作用））中、脂質膜（例えば Morein and Simons, 1985 に記載のウイロソーム）に直接包含させることができる。

【００６３】 Plotkin and Mortimer (1994) は、動物またはヒトにワクチン注射し、特定の
病原体に特異的な免疫応答を誘導するのに用いることができる抗原、ならびに抗
原の調製方法、抗原の適当な用量の決定方法、免疫応答の誘導に関するアッセイ
方法、および病原体（例えばバクテリア、ウイルス、真菌または寄生虫）による
感染の処置方法を提供する。

【００６４】バクテリアには、例えば炭疽菌（anthrax)、カンピロバクター、コレラ、クロストリディア、ジフテリア、腸毒素原性大腸菌、ジアルディア、淋菌、ピロリ
菌（Helicobacter pylori）またはピロリ菌によって生産されるウレアーゼ（Lee
and Chen, 1994)、ヘモフィルスインフルエンザＢ（Hemophilus influenza B)
、分類不能なヘモフィルスインフルエンザ、髄膜炎菌、ミコバクテリウム、百日咳菌、肺炎双球菌、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ状球菌、連鎖球菌Ｂ、破傷
風菌、ビブリオコレラ、ボレリアブルドルフィ（Borrelia burgdorfi）およびエルシニア属；およびその生成物が含まれる。

【００６５】ウイルスには、例えばアデノウイルス、デング熱抗原型１〜４（Delenda et a
l., 1994; Fonseca et al., 1994; Smucny et al., 1995)、エボラ（Jahrling e
t al., 1996)、腸内ウイルス、ハンタウイルス、肝炎抗原型Ａ〜Ｅ（Blum, 1995
; Katkov, 1996; Lieberman and Greenberg, 1996; Mast, 1996; Shafara et al
., 1995; Smedila et al., 1994; 米国特許第５，３１４，８０８号および第５，４３６，１２６号)、単純ヘルペスウイルス１または２、ヒト免疫不全ウイルス(Deprez et al., 1996)、ヒト乳頭腫ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス（measles)、ノーウォーク、日本ウマ脳炎ウイルス、乳頭腫ウイルス
、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸合胞体ウイル
ス、ロータウイルス、風疹ウイルス、はしかウイルス（rubeola)、セントルイス
脳炎ウイルス、ワクシニアウイルス、他の抗原、例えばマラリア抗原、水痘およ
び黄熱をコードする遺伝子を含むワクシニア構築体；およびその生産物が含まれ
る。

【００６６】寄生虫には、例えば体内寄生性アメーバヒストリティカ（Entamoeba hystolyt
ica)(Zhang et al., 1995)；マラリア原虫（Plasmodium)(Bathurst et al., 199
3; Chang et al., 1989, 1992, 1994; Fries et al., 1992a, 1992b; Herringto
n et al., 1991; Khusmith et al., 1991; Malik et al., 1991; Migliorini et
al., 1993; Pessi et al., 1991; Tam, 1988; Vreden et al., 1991; White et
al., 1993; Wiesmueller et al., 1991)、リーシュマニア（Frankenburg et al
., 1996）およびヘルミント（Helminthes)；およびその生成物が含まれる。

【００６７】本発明において用いることができる他のウイルスは、Gordon, 1997 に記載されており、これには、例えばアデノウイルス（呼吸器疾患)、コロナウイルス（呼吸器および腸疾患)、サイトメガロウイルス（単球増加症)、デングウイルス（
デング熱、ショック症候群)、ＥＢウイルス（Epstein-Barr virus、単球増加症、バーキットリンパ腫)、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルス（肝臓疾患)、１型単純
ヘルペスウイルス（脳炎、口内炎)、２型単純ヘルペスウイルス（生殖器障害)、
ヒトヘルペスウイルス−６（未知、カポジ肉腫の可能性)、１および２型ヒト免疫不全ウイルス（後天性免疫不全症候群−ＡＩＤＳ)、１型ヒトＴ細胞リンパ親和性ウイルス（Ｔ細胞白血病)、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ（呼吸器疾患)、
日本脳炎ウイルス（肺炎、脳障害)、麻疹ウイルス（亜急性硬化性汎脳炎)、流行
性耳下腺炎ウイルス（髄膜炎、脳炎)、乳頭腫ウイルス（いぼ、頸部癌)、パルボ
ウイルス（呼吸器疾患、貧血)、ポリオウイルス（麻痺)、ポリオーマウイルスＪ
Ｃ（多病巣性白質脳症)、ポリオーマウイルスＢＫ（出血性膀胱炎)、狂犬病ウイ
ルス（神経機能不全)、ＲＳウイルス（Respiratory syncytial virus、呼吸器疾
患)、ライノウイルス（一般かぜ)、ロータウイルス（下痢)、風疹ウイルス（胎児性奇形（fetal malformations)、ワクシニアウイルス（一般化感染)、黄熱ウイルス（黄疸、腎臓および肝臓機能不全)、水痘帯状疱疹ウイルス（水痘）が含まれる。

【００６８】本発明に用いることができる他のバクテリアは、Gordon, 1997 に記載されており、これには、例えば炭疽菌（Bacillus anthracis)(炭疽)、百日咳菌（Borde
tella pertussis)(百日咳)、ボレリアブルドルフェリ（Borrelia burgdorferi)
(ライム病)、カンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jejuni)(胃腸炎)、
トラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis)(骨盤内炎症性疾患)、ボツリヌス菌
（Clostridium botulinum)(ボツリヌス中毒)、ジフテリア菌（Corynebacterium
dipththeriae)(ジフテリア)、大腸菌（Escherichia coli)(下痢、尿路感染症)、
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae)(肺炎)、ピロリ菌（Helicobacter
pylori)(胃炎、十二指腸潰瘍)、レジオネラニューモフィラ（Legionella pneum
ophila)(在郷軍人病)、リステリア菌（Listeria monocytogenes)(髄膜炎、腐敗症)、ライ菌（Mycobacterium leprae)(ハンセン氏病)、結核菌（Mycobacterium
tuberculosis)(結核)、淋菌（Neisseria gonorrhoeae)(淋疾)、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis)(腐
敗症、髄膜炎)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)(院内感染)、緑膿菌（Pseudo
monas aeruginosa)(院内感染)、リケッチア（Rickettsia)(ロッキー山熱)、サル
モネラ菌（Salmonella)(腸チフス、胃腸炎)、赤痢菌（Shigella)(赤痢)、黄色ブ
ドウ球菌（Staphylococcus aureus)(膿痂疹、毒性ショック症候群)、肺炎連鎖球
菌（Streptococcus pneumoniae)(肺炎、中耳炎)、ストレプトコッカスピオジェ
ネス（Streptococcus pyogenes)(リウマチ熱、咽頭炎)、梅毒トレポネーマ（Tre
ponema pallidum)(梅毒)、コレラ菌（Vibrio cholerae)(コレラ)、ペスト菌（Ye
rsinia pestis)(腺ペスト）が含まれる。

【００６９】本発明で用いることができる他の寄生虫は、Gordon, 1997 に記載されており、これには、例えばアフリカトリパノソーマ類（African trypanosomes)(トリパ
ノソーマ症)、体内寄生性アメーバヒストリティカ（Entamoeba histolytica)(ア
メーバ赤痢)、ジアルディア属ラムリア（Giardia lamblia)(下痢疾患)、レーシュマニア（Leishmania)(脾臓機能不全、熱帯性赤膚(tropical sores))、マラリア原虫（Plasmodium)(マラリア)、ミクロフィラリア（Microfilariae)(糸状虫症
)、住血吸虫類（Schistosomes)(住血吸虫症)、トキソプラズマゴンジ（Toxopla
sma gondii)(トキソプラズマ症)、膣トリコモナス症虫（Trichomonas vaginalis
)(膣炎)、トリパノソーマクルジ（Trypanosoma cruzi)(アメリカトリパノソーマ症）が含まれる。

【００７０】本発明で用いることができる真菌は、Gordon, 1997 に記載されており、これには、例えばカンジダアルビカンス（Candida albicans)(粘膜感染)、ヒストプ
ラズマ（Histoplasma)(肺リンパ節感染)、ニューモシスチスカリニ（Pneumocy
stis carinii)(ＡＩＤＳにおける肺炎)、アスペルギルスフミガティス（Asperg
illus fumigatis)(アスペルギルス症）が含まれる。

【００７１】アジュバントまた、本製剤はアジュバントを含み、単一の分子がアジュバント性と抗原性の
両方を含んでいてもよい（例えばコレラ毒素)(Elson and Dertzbaugh, 1994)。アジュバントは特異的または非特異的に抗原特異的免疫応答を強化するのに用い
られる物質である。通常、抗原を与える前にアジュバントと製剤を混合するが、
別法として、短い時間間隔の間に、これらを別々に与えてもよい。

【００７２】アジュバントは通常、バクテリア、寄生虫または、時にはウイルスの生産物、
またはバクテリアであるが、他の天然または合成起源から誘導してもよい。アジ
ュバントには、例えば油状エマルジョン（例えば完全または不完全フロインドア
ジュバント)、ケモカイン（chemokine)(例えばディフェンシン１または２、ＲＡ
ＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８）またはサイトカ
イン（例えばインターロイキン−１β、−２、−６、−１０または−１２；γ−
インターフェロン；腫瘍壊死因子−α；または顆粒性白血球−単核白血球−コロ
ニー刺激因子)(Nohria and Rubin, 1994 にまとめられている)、ムラミルジペプ
チド誘導体（例えばムラブチド(murabutide)、スレオニル−ＭＤＰまたはムラミ
ルトリペプチド)、熱ショックタンパク質または誘導体、リーシュマニア主要ＬｅＩＦの誘導体（Skeiky et al., 1995)、コレラ毒素またはコレラ毒素Ｂ、ｂＡ
ＲＥＳ、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）誘導体（例えば脂質Ａまたはモノホス
ホリル脂質Ａ、合成脂質Ａアナログ）またはスーパー抗原（Saloga et al., 199
6）遮断コポリマーまたは当分野に既知の他のポリマーが含まれる。また、免疫化に有用な他のアジュバントに関しては Richards et al., (1995) を参照のこと。

【００７３】抗体または細胞性エフェクター、特定の抗体イソタイプ（例えばＩｇＭ、Ｉｇ
Ｄ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ
３および／またはＩｇＧ４）または特定のＴ細胞サブセット（例えば、ＣＴＬ、
Ｔｈ１、Ｔｈ２および／またはＴ_DTH）を選択的に誘導するアジュバントを選択することができる（Munoz et al., 1990; Glenn et al., 1995)。

【００７４】ＣｐＧは、免疫系にその病原の起源を認識させ、本来の免疫応答を刺激して適
応した免疫応答を生じさせるパターンを有する、１つのクラスの構造に含まれる
（Medzhitov and Janeway, 1997)。これらの構造は病原体関連分子パターン（Ｐ
ＡＭＰ（群））と称され、これには、例えばリポポリサッカライド、テイコ酸、
メチル化されていないＣｐＧモチーフ、二本鎖ＲＮＡおよびマンニンズ（maninn
s）が含まれる。

【００７５】ＰＡＭＰは、免疫応答を高め、Ｔ細胞機能の協同刺激剤（costimulator)として働き、エフェクター機能を制御することができる、内因性の危険シグナルを誘
導する。ＰＡＭＰがこれらの応答を誘導する能力は、そのアジュバントとしての
潜在能力において重要な役割を果たし、その標的はＡＰＣ、例えばマクロファー
ジおよび樹状細胞である。皮膚の抗原提示細胞は、皮膚を通って輸送されるＰＡ
ＭＰによって同様に刺激される。例えば、樹状細胞の１つのタイプであるランゲ
ルハンス細胞は、経皮的な免疫原性に乏しい分子を含む皮膚上の溶液中のＰＡＭ
Ｐによって活性化され、誘導されて、この免疫原性に乏しい分子を移動させ、リ
ンパ節内でＴ細胞に提示し、免疫原性に乏しい分子に対する抗体応答を誘導する
ことができる。また、ＰＡＭＰを他の皮膚アジュバント、例えばコレラ毒素と組
み合わせて用い、種々の協同刺激剤分子を誘導し、種々のエフェクター機能を制
御して、免疫応答、例えばＴｈ２からＴｈ１の応答を導くことができる。

【００７６】コレラ毒素は、ＡＤＰリボソイル化外毒素のファミリー（ｂＡＲＥ（群）と称
される）由来のバクテリア外毒素である。ほとんどのｂＡＲＥは、結合Ｂサブユ
ニットおよびＡＤＰリボシルトランスフェラーゼを含むＡサブユニットを有する
Ａ：Ｂ二量体として構成される。このような毒素には、ジフテリア、シュードモ
ナス外毒素Ａ、コレラ毒素（ＣＴ)、大腸菌熱不安定性腸毒素（ＬＴ)、百日咳毒
素（ＰＴ)、ボツリヌス菌毒素Ｃ２、ボツリヌス菌毒素Ｃ３、Ｃ．リモーサム（C
.limosum）外酵素、Ｂ．セレウス（B. cereus）外酵素、シュードモナス外毒素Ｓ、黄色ブドウ球菌ＥＤＩＮおよびＢ．スフェリクス（B. sphaericus）毒素が含まれる。

【００７７】コレラ毒素は、ＡサブユニットとＢサブユニットによって構成されるｂＡＲＥ
の一例である。Ｂサブユニットは結合サブユニットであり、Ｂサブユニット５量
体を構成し、Ａサブユニットと非共有結合する。Ｂ細胞サブユニット５量体は対
称ドーナツ型構造に配置され、標的細胞のＧＭＩガングリオシド（GMI-ganglios
ide）に結合する。Ａサブユニットは、Ｇｓタンパク質を含むヘテロ３量体ＧＴＰタンパク質（Ｇタンパク質）のサブセットのαサブユニットをＡＤＰリボシル
化し、この結果、環状ＡＭＰの細胞内レベルが増加する。コレラの場合では、こ
れは腸細胞からのイオンおよび液の放出を刺激する。

【００７８】コレラ毒素（ＣＴ）およびそのＢサブユニット（ＣＴＢ）は、筋肉内免疫原ま
たは経口免疫原として用いられた場合にアジュバント性を有する（Elson and De
rtzbaugh, 1994; Trach et al., 1997)。大腸菌由来の熱不安定性腸毒素（ＬＴ）はＣＴとアミノ酸レベルで７５〜７７％の相同性を有し、同様の結合性を有す
る；また、腸（gut）のＧＭＩガングリオシドレセプターと結合し、同様のＡＤＰリボシル化外毒素活性を有すると思われる。別のｂＡＲＥ、シュードモナス外
毒素Ａ（ＥＴＡ）はα２−マクログロブリンレセプター−低密度リポタンパク質
レセプター−関連タンパク質と結合する（Kounnas et al., 1992)。ｂＡＲＥは
Krueger and Barbieri (1995) にまとめられている。ＣＴ、ＣＴＢ、ＬＴ、ＥＴ
ＡおよびＰＴは、異なる細胞結合部位を有しているにもかかわらず、経皮免疫化
についての強力なアジュバントであり、高レベルのＩｇＧ抗体を誘導するが、Ｉ
ｇＥ抗体を誘導しない。ＣＴを含まないＣＴＢはまた、高レベルのＩｇＧ抗体を
誘導可能である。したがって、ｂＡＲＥおよびその誘導体の両者は、単純溶液中
で皮膚に上皮（epicutaneously）適用された場合、有効に免疫化することが可能
である。

【００７９】すべての許容されるワクチンは、その承認に関してあるレベルの抗体を必要と
する−他の免疫成分、例えばＴ細胞増殖は利用されない。生命を脅かす感染、ジ
フテリア、百日咳および破傷風（ＤＰＴ）に対する保護は、高レベルの循環抗毒
素抗体を誘導することによって達成可能である。百日咳は、例外であるかもしれ
ず、幾人かの研究者は、その保護には侵入生物の他の部分に対する抗体が必要で
あると思っており（これは論争の的になっている（Schneerson et al., 1996 を
参照のこと))、ほとんどの新しい生成無細胞性百日咳ワクチンはＰＴをワクチン
の成分として有する（Krueger and Barbieri, 1995)。ＤＰＴによって引き起こされる疾患の病理学は、その毒素の作用と直接関係し、抗毒素抗体は、保護にお
いて最も確実な役割を担っている（Schneerson et al., 1996)。

【００８０】一般に、毒素を化学的に不活化し、より毒性が低いが、免疫原性を有したまま
である変性毒素を形成させることができる。我々は、ある態様の経皮免疫化系が
毒素に基づく免疫原とアジュバントを用いて、これらの疾患に対する保護に適当
な抗毒素レベルを達成すると考える。毒素または、遺伝学的（genetically）に脱毒素化された変性毒素自体を用いるか、あるいはトキソイドとアジュバント、
例えばＣＴを用いる免疫化によって抗毒素抗体を誘導することができる。遺伝学
的に変性毒素化された、変更されたＡＤＰリボシル化外毒素活性、またはトリプ
シン開裂部位突然変異または他の突然変異を有する毒素は、経皮免疫化において
用いられる抗原提示細胞の無毒の活性化剤として特に有用であると思われる。遺
伝的欠失によってＡＤＰリボシルトランスフェラーゼの触媒活性を不活化するこ
とに基づく突然変異体は、結合能を維持しているが、天然毒素の毒性を欠いてい
る。このアプローチは、Burnette et al., (1994), Rappuoli et al. (1995), a
nd Rappuoli et al. (1996) に記載されている。このような、遺伝学的に変性毒
素化されている外毒素は、変性毒素が有毒であるとは考えないので、安全性の心
配を生じさせないであろう点で、経皮免疫化系に有用であり得る。例えばトリシ
ン（trysin）開裂部位の欠失を有し、皮膚に対する無毒性および免疫原性（immu
nogeneric）の両方を利用するような、遺伝学的に変更された他の毒素も存在する。しかし、トリプシン開裂のような技術を用いる活性化は、本来トリプシン酵
素を欠く皮膚を介するＬＴのアジュバント性を高めることが予想される。さらに
、同問題に対処することができる、毒素を化学的に変性毒素化するいくつかの技
術が存在する（Schneerson et al., 1996)。これらの技術は特定の適用、特に、
取りこまれた毒素（例えばジフテリア毒素）が有害な反応を生じさせ得る、小児
への適用に関して重要である。

【００８１】場合により、ランゲルハンス細胞の活性化剤をアジュバントとして用いること
もある。このような活性化剤の例には、熱ショックタンパク質の誘導物質；接触
感作剤（例えばトリニトロクロロベンゼン、ジニトロフルオロベンゼン、窒素イ
ペリット、ペンタデシルカテコール)；毒素（例えば、赤痢菌（Shiga）毒素、ブ
ドウ球菌（Staph）腸毒素Ｂ)；リポポリサッカライド、脂質Ａ、またはその誘導
体；バクテリアＤＮＡ（Stacey et al., 1996)；サイトカイン（例えば腫瘍壊死
因子−α、インターロイキン−１β、−１０、−１２)；溶液中のカルシウムイオン；カルシウムイオノフォア、およびケモカイン（例えばディフェンシン１ま
たは２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８）が
含まれる。

【００８２】免疫化抗原が十分なランゲルハンス細胞活性化能を有するならば、抗原かつア
ジュバントであるＣＴの場合のように、別のアジュバントは必要とされない。全
細胞調製物、生ウイルス、弱毒化ウイルス、ＤＮＡプラスミドおよびバクテリア
ＤＮＡが経皮免疫化に十分であり、アジュバントが存在することを想定する。低
濃度の接触感作剤またはランゲルハンス細胞の他の活性化剤を用いて、皮膚障害
を引き起こさずに免疫応答を誘導することが可能である。

【００８３】経皮免疫化の実施側面抗原の経皮デリバリーはランゲルハンス細胞（Langerhans cell）を標的とし得るため、本発明を用いて効果的な免疫化を行うことができる。これらの細胞は
皮膚中に豊富に見られ、効果的な抗原提示細胞であり、Ｔ細胞記憶と強力な免疫
応答を生じさせる。皮膚には多数のランゲルハンス細胞が存在するため、経皮デ
リバリーの効率は抗原およびアジュバントに暴露される表面領域に関連し得る。
実際、経皮免疫化が筋肉内免疫化より効率的である理由は、多数のこれらの効果
的な抗原提示細胞を標的とするからであり得る。

【００８４】我々は、本発明が免疫化の利用能を高めつつ、強力な免疫応答を誘導すると考え
る。経皮免疫化は皮膚の物理的透過およびその複雑さおよび困難を含まないため
、訓練を受けた職員、滅菌技術および滅菌装置の必要性を減少させる。さらに、
複数の部位での免疫化に対する障壁または複数の免疫化に対する障壁を減少させ
る。また、製剤を１回適用することによって免疫化することを想定するが、追加
免疫（免疫の促進；boosting）は一般に必要である。針の再利用は針を媒介する
疾患を引き起こすため、針を使わない免疫は世界保健機関（ＷＨＯ）に優遇され
ている。

【００８５】免疫化は、閉鎖パッチ下でガーゼに染み込ませた抗原およびアジュバントの単
純溶液を上皮適用することによって行ってもよいし、あるいは他のパッチ技術を
用いてもよい；クリーム、ゲル、浸漬（immersion)、軟膏およびスプレーは他の
可能な適用方法である。この免疫化は、訓練を受けていない職員が行うことがで
き、自分でも適用しやすい。免疫化を容易に利用できることから、大規模なフィ
ールドでの免疫化を生じさせ得る。さらに、免疫化手法が簡単であるため、小児
患者および老人、および第三世界の国の人々の免疫の利用を改善するであろう。

【００８６】以前のワクチンに関しては、皮膚を介してその製剤を針で注射した。針を用いる
ワクチンの注射は、滅菌針およびシリンジ、ワクチンを投与するための訓練を受
けた医療職員の必要性、注射による不快、および針で皮膚に穴をあけることによ
って起り得る合併症を含む一定の欠点を有する。針を使わずに皮膚を介する免疫
化すること（すなわち経皮免疫化）は、前述の欠点を回避することによってワク
チンデリバリーに関する主要な進歩を示す。

【００８７】さらに、経皮免疫化は、皮膚の広い表面領域を標的とするいくつかの位置の利
用によって、より多くの免疫細胞が標的とされるため、針を用いる免疫化より優
れている。免疫応答を誘導するのに十分な治療有効量の抗原を、単一の皮膚部位
か、あるいは複数のドレイン領域リンパ節フィールド（例えば、頸部、腋窩部、
鼠蹊部、エピトロケリアー（epitrochelear)、膝窩部、腹部および胸郭のもの）
をカバーする無傷の皮膚領域にわたって経皮的にデリバリーすることができる。
全身にわたって位置する多数の種々のリンパ節に近接する、このような位置は、
皮内、皮下または筋肉内注射によって少量の抗原を単一の個所に注射した場合よ
り、広範囲にわたる、免疫系に対する刺激を提供する。

【００８８】皮膚を通るか、あるいは皮膚内へ通過した抗原は、免疫応答を引き起こすよう
に抗原をプロセッシングする抗原提示細胞と遭遇する。複数の免疫化部位は、多
数の抗原提示細胞を補充し、補充された抗原提示細胞の大集団は、免疫応答をよ
り強く誘導する。皮膚を通過する吸収は、皮膚の食細胞、例えば皮膚樹状細胞、
マクロファージおよび他の皮膚抗原提示細胞に抗原をデリバリーし；また、抗原
は、血流またはリンパ系を介して抗原提示細胞として作用することが知られてい
る、肝臓、脾臓および骨髄の食細胞にもデリバリーされることが考えられる。ラ
ンゲルハンス細胞、樹状細胞およびマクロファージは、共役しているか、あるい
はアジュバントととのタンパク質融合物として組換え的に生産されたＦｃレセプ
ターを利用して特異的に標的化され得る；また、補体レセプター（Ｃ３、Ｃ５）
を共役させ、あるいはプロテインＡまたはプロテインＧとのタンパク質融合物と
して組換え的に生産して、Ｂ細胞の表面免疫グロブリンを標的化することができ
る。この結果、現在の免疫化の実施によっては、達成できたとしてもほとんどま
れな程度にまで、抗原が抗原提示細胞に対して標的化されて分配される。

【００８９】経皮免疫化系は以下のようにして適用できる；直接皮膚に適用して空気乾燥す
る；皮膚または頭皮にすり込む；包帯パッチ（包帯またはばんそう膏）または吸
収剤とともに適所に保持する；浸漬（immersion)；さもなければ、デバイス、例
えばストッキング、スリッパ、手袋またはスカートによって保持する；または皮
膚にスプレーして、皮膚との接触を最大にする。本製剤は吸収包帯（absorbant
dressing）またはガーゼ中で適用することができる。閉鎖包帯法、例えばＡＱＵ
ＡＰＨＯＲ（ペトロラタム、鉱油、無機ワックス、ウールワックス、パンテノー
ル（panthenol)、ビサボール（bisabol）およびグリセリンのエマルジョン、Bei
ersdorf. Inc.)、プラスチックフィルム、ＣＯＭＦＥＥＬ（Coloplast）またはワセリン；または非閉鎖包帯法、例えばＤＵＯＤＥＲＭ（３Ｍ）またはＯＰＳＩ
ＴＥ（Smith & Napheu）で本製剤を覆ってもよい。閉鎖包帯法は水の透過を完全
に排除する。完全浸漬により、単一または複数の部位、単一または複数の肢また
は皮膚の広い表面領域に本製剤を適用することができる。本製剤を皮膚に直接適
用してもよい。

【００９０】遺伝的な免疫化は米国特許第５，５８９，４６６号、第５，５９３，９７２号
および第５，７０３，０５５号に記載された。製剤に含まれる核酸（群）は、抗
原、アジュバントまたは両者をコードし得る。一般に、アジュバント、例えば、
抗原をコードする核酸に対するＣＴ、ＬＴまたはＣｐＧ群を同時に投与すること
によって免疫応答が高められるであろうことが予想される。この核酸は複製能が
あってもよいし、なくてもよい；これは非組み込み性および非感染性であってよ
い。例えば、この核酸は、抗原およびユビキチンドメインを含む融合ポリペプチ
ドをコードし、クラスＩに限定された応答に対して免疫応答するようにしてもよ
い。この核酸にはさらに、抗原をコードする配列に作動可能に連結されている調
節領域（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、転写開始部位およ
び終結部位、ＲＮＡスプライシングアクセプターおよびドナー部位、ポリアデニ
ル化シグナル、内部リボソーム結合部位、翻訳開始および終結部位）を含ませる
ことができる。この核酸を、トランスフェクションを促進する物質、例えばカチ
オン性脂質、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレンＤＭＳＯ（
polybrene-DMSO）またはこれらを組み合わせたものと複合体形成させることがで
き；また、ＤＮＡをＦｃレセプターまたはプロテインＡ／Ｇと共役させることに
よって、あるいはＦｃレセプターまたはプロテインＡ／Ｇと結合させた物質中に
ＤＮＡをカプセル化することによって免疫細胞を標的化することができる。この
核酸はウイルスゲノム由来の領域を含み得る。このような材料および技術はKrei
gler (1990) and Murray (1991) に記載されている。

【００９１】免疫応答には、体液性（すなわち抗原特異的抗体）および／または細胞性（す
なわち、Ｂ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞、ＣＴＬ、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２
細胞および／またはＴ_DTH細胞のような抗原特異的リンパ球）のエフェクターアーム（effector arms）を含み得る。さらに免疫応答は、抗体依存性の細胞媒介性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を媒介するＮＫ細胞を含み得る。

【００９２】本製剤によって誘導される免疫応答には、抗原特異的抗体および／または細胞
障害性リンパ球（ＣＴＬ、Alving and Wassef, 1994 にまとめられている）の顕
在化または誘導（elicitation）が含まれ得る。抗体は免疫アッセイ技術によって検出可能であり、種々のイソタイプ（例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ１、Ｉｇ
Ａ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）
の検出が予想される。また、免疫応答は中和アッセイ（neutralizing assay）に
よっても検出可能である。抗体とは、Ｂリンパ球によって生産される保護タンパ
ク質である。これらは高度に特異的であり、一般に、抗原の１つのエピトープを
標的とする。しばしば抗体は、疾患を引き起こす病原体由来の抗原と特異的に反
応することにより、該疾患に対する保護において役割を担う。

【００９３】ＣＴＬは、病原体による感染に対して保護するために生産される、特別な保護
免疫細胞である。これらもまた高度に特異的である。免疫化は、自身の主要な組
織適合性抗原と関連する抗原、例えば、マラリアタンパク質に基づく合成オリゴ
ペプチドに特異的なＣＴＬを誘導する。経皮デリバリー系を用いる免疫化によっ
て誘導されたＣＴＬは病原体感染細胞を殺すことができる。免疫化はまた、抗体
およびＣＴＬの応答、抗原で刺激されたリンパ球の培養によるリンパ球の増殖、
および抗体単独の皮内皮膚チャレンジ（intradermal skin challenge）に対する
、遅延型過剰感作応答を促進することによって示されるような記憶応答を誘導す
る。

【００９４】ウイルス中和アッセイでは、血清の連続希釈物を宿主細胞に加え、これを感染
性ウイルスでのチャレンジ後の感染に関して観察する。別法として、血清の連続
希釈物を、動物への接種（免疫化）前に感染性力価のウイルスとインキュベート
し、次いで接種された動物を感染の徴候に関して観察してもよい。

【００９５】動物またはヒトにおけるチャレンジモデルを用いて、本発明の経皮免疫化系を
評価し、これにより、抗原での免疫化が患者を疾患から保護する能力を評価する
。このような保護は抗原特異的免疫応答を示すであろう。チャレンジの代わりに
、例えば５ＩＵ／ｍＬまたはそれ以上の抗ジフテリア抗体力価を達成することは
、一般に最適な保護を示すとされ、これは保護に対する強力なマーカーとして働
く（Plotkin and Mortimer, 1994)。

【００９６】また、ワクチン処置は癌および自己免疫疾患の処置として用いられてきた。例
えば、腫瘍抗原（例えば、前立腺特異的抗原）でワクチン処置すると、抗体、Ｃ
ＴＬおよびリンパ球増殖の形で免疫応答を誘導し、これにより、身体の免疫系に
腫瘍細胞を認識させ、殺させることができる。ワクチン処置に有用な腫瘍抗原は
、黒色腫（米国特許第５，１０２，６６３号、第５，１４１，７４２号および第
５，２６２，１７７号)、前立腺癌（米国特許第５，５３８，８６６号）およびリンパ腫（米国特許第４，８１６，２４９号、第５，０６８，１７７号および第
５，２２７，１５９号）に関して記載されている。Ｔ細胞レセプターオリゴペプ
チドでワクチン処置すると、自己免疫疾患の進行を停止させる免疫応答を誘導す
ることができる（米国特許第５，６１２，０３５号および第５，６１４，１９２
号；Antel et al., 1996; Vandenbark et al., 1996)。米国特許第５，５５２，
３００号もまた、自己免疫疾患の処置に適当な抗原を記載している。

【００９７】以下の実施例は本発明を例示するためのものである；しかし、本発明の実施は
いかなる意味においても、この実施例によって限定あるいは制限されない。

【００９８】実施例免疫感作方法免疫感作の24時間前に、マウスの背中を肩甲骨の末端部分から尾の付け根の0.
5ｃｍ上まで剃毛する。Ｃ５７ＢＬ/６マウスを用いる場合、剃る前に軽く麻酔を
かける(塩水中、40ｍｇ/ｋｇケタミン:4ｍｇ/ｋｇキシラジン混合物)。免疫感作
を行う日に動物に、最終用量としておよそ110ｍｇ/ｋｇケタミン、及び、11ｍｇ
/ｋｇキシラジンが与えられる、麻酔混合物(2.3ｍＬ滅菌塩水(Sigma):5ｍＬケタ
ミン(100ｍｇ/ｍＬ,Parke-Davis):0.5ｍＬキシラジン(100ｍｇ/ｍＬ,Phoenix Ph
armaceuticals)).04ｍｌで麻酔する。アルコールによる拭き取りが必要とされる
工程では、背中を10回(5回背中を頭部に向かって拭き、アルコールパッドを裏返
し、背中をもう5回拭く)、イソプロピルパッドを用いて拭く。5分間、アルコールを蒸発させる。背中を滅菌水で飽和させたガーゼパッドでこすり、背中に水た
まりが形成されるようにすることによって背中の含水は達成される。5分間の含水期の後、乾燥した脱脂綿で吸い取って乾燥する。次に、抗原(一般に、最終容量100μｌ中に、≦100μｇの抗原、及びアジュバント)を背中にピペットとチップを用いて適用し、皮膚上に60〜120分に載せたままにする。定義された免疫期間経過後、免疫感作した部分の全ての過剰な溶液を綿ガーゼで吸い取る。その後
、全ての過剰な抗原を除くため、動物を生ぬるい水道水のゆっくりと安定した流
水下で10秒間洗浄し、吸い取って乾燥し、洗浄工程を繰り返す。その後、麻酔か
ら完全に回復するまで、檻を電気パッドに載せる。

【００９９】ヒト抗-ＬＴ抗体力価の測定以前、記述されるように抗-ＬＴＩｇＧ力価を決定した(Svennerholm A-M.,Ho
lmgren J.,Black R.,Levine M.&Merson M.,"Serologic differentation between
antitoxin responses to infection with Vibrio cholerae and enterotoxin-p
roducing Escherichia coli",J.Infect.Dis.,147,541〜522(1983年))。96ウェル
(Type-Russell)プレートを、ＬＴ(Sigma,St.Louis,MO)のモノシアロガングリオシド-Ｇ_M1(Sigma)で一晩コートし、ＰＢＳ-0.05％Ｔｗｅｅｎ中の5％粉乳でブロ
ックした。反応は、ヤギ抗-ヒトＩｇＧ(γ)-ＨＲＰ(Kirkegaard and Perry,Gait
hersburg,MD.)、及び、基質として２,２'-アジノ-ジ[３-エチルベンズチアゾリン]スルホン酸塩(Kirkegaard and Perry)を用いて検出し、プレートを405ｎｍで
読み取った。結果は、1.0のＯＤとなる試料の逆希釈度として定義されるＥＬＩＳＡ単位(ＥＵ)で記録される。抗-ＬＴＩｇＡは、ヤギ抗-ヒトＩｇＡ(α)-ＨＲ
Ｐ(Kirkegaard and Perry)を第二抗体として用い、結果がｎｇ/ｍｌで明示されるよう、ＯＤを標準ＩｇＡ曲線に対してプロットした以外は、抗-ＬＴＩｇＧと
同じ方法で決定した。標準ＩｇＡ曲線、及び、総血清ＩｇＡは、標識していない
ヤギ抗-ヒトＩｇＡ(Kirkegaard and Perry)の使用に続き、上述のようにブロックを行った後、標準ＩｇＡの一連の希釈液を適用することにより決定した。

【０１００】実施例１．処置または未処置の綿棒で皮膚を拭き取ることは、物理的及び化学的に解質層
の一部を除き、それによって皮膚への浸透を増すと考えられている。綿棒は、例
えば、綿、ナイロン、レーヨン及びポリエチレン等の材料製であり得る。アルコ
ールによる拭き取りは、解質層の一部を除くと考えられており、浸透増大のため
の物理的手段及び化学的手段の両方として働く。上述の例では、経皮免疫感作に
対する免疫応答の増幅は、この浸透増大方法により取り計らわれることができる
。6〜8週齢のＢＡＬＢ/ｃマウスを、「免疫感作方法」に記載されるように麻酔し、剃毛した。24時間後、動物の背中を水をしみ込ませたガーゼパッドで拭くか
(「水」)、または、70％のイソプロピルアルコールを含むアルコール準備(prep)
パッドでおよそ10秒間拭いた(「イソプロパノール」)。アルコールをおよそ5分間かけて蒸発させた。「水」グループの背中から、過剰な水を吸い取って除去し
た。その後、全ての動物を20μｇのＣＴ(0.2ｍｇ/ｍｌ溶液100μｌ)で処置した。過剰な抗原の除去は、「免疫感作方法」に記載されるように行った。

【０１０１】抗-ＣＴ抗体力価は、上述の「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)」について記載され
るようにＥＬＩＳＡを用いて、単一の免疫感作の3週間後に決定した。結果を表１に示す。両グループにおいて、ＣＴは明らかに免疫原性であったが、アルコー
ル準備パッドで処置されたグループは、「水」動物よりも6倍高い相乗平均力価を
示し、個々の力価もより一致していた。従って、アルコールパッドによる皮膚表
面の化学的、及び、物理的な破壊は、経皮経路による抗原の運搬を増幅するよう
である。表１.化学的浸透増大による経皮免疫感作の増幅：抗原の適用前にアルコール準備パッドで処置したマウスにおける抗-ＣＴ力価。

【表１】

【０１０２】実施例２. 化学的浸透増大のみにより経皮免疫感作が増大されるかどうかを評価するため
に、皮膚に対して界面活性剤を用いた。6〜8週齢のＢＡＬＢ/ｃマウスを、「免疫感作方法」に記載されるように麻酔し、剃毛した。24時間後、「水」グループの背中を水をしみ込ませたガーゼパッドで拭き、背中に水たまりを作った。およ
そ5分後、全ての過剰な水を除き、25μｇのＣＴ(0.5ｍｇ/ｍｌ溶液50μｌ)を背中に適用した。或いは、「5％ＳＤＳ」グループの背中を、剃毛24時間後、界面活性剤である300μｌの5％ＳＤＳ(硫酸ドデシルナトリウム；脱イオン水、及び、市販品の10％ＳＤＳの1対1混合物)をおよそ12分間のしたたらせることにより処理し、続いて過剰のＳＤＳを乾燥したガーゼパッドで吸い取った。ＳＤＳは、
例えば、脱脂綿等の担体中に含ませて皮膚に適用し得、その後、過剰なＳＤＳは
乾燥したガーゼパッドによって除去し得る。その後、動物は「水」グループと同
じように含水、及び、免疫感作した。過剰な抗原の除去は、「免疫感作方法」に
記載されるように行った。

【０１０３】抗-ＣＴ抗体力価は、上述の「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)」について記載され
るようにＥＬＩＳＡを用いて、単一の免疫感作の2週間後に決定した。結果を表２ａ及び２ｂに示す。両グループにおいてＣＴは明らかに免疫原性であったが、
5％ＳＤＳで処置されたグループの相乗平均力価は「水」動物と比べて2倍高く、
各動物間の力価は前者の動物でより一致していた。従って、界面活性剤(5％ＳＤ
Ｓ)による皮膚表面の化学的な破壊は、経皮経路による抗原の運搬を増幅するようである。表２ａ.化学的浸透増大による経皮免疫感作の増幅：抗原の適用前に界面活性剤(
5％ＳＤＳ)で皮膚を処置したマウスにおける抗-ＣＴ力価

【表２】

【０１０４】表２ｂ.化学的浸透増大による経皮免疫感作の増幅：抗原の適用前に界面活性剤(
5％ＳＤＳ)で皮膚を処置したマウスにおける抗-ＣＴ力価。

【表３】

【０１０５】実施例３. 別の化学的浸透増大の形体である除毛剤(例えば、水酸化カルシウム等)が皮膚
科学実験で広く使われており、経皮免疫感作を増幅することが示されている。6 〜8週齢のＢＡＬＢ/ｃマウスを、「免疫感作方法」に記載されるように麻酔し、
剃毛した。24時間後、「水」グループの背中を水をしみ込ませたガーゼパッドで拭き、背中に水たまりを作った。およそ5分後、全ての過剰な水を除き、25μｇのＣＴ(0.5ｍｇ/ｍｌ溶液50μｌ)を背中に適用した。「ｎａｉｒ(登録商標)」グ
ループの背中は代わりに、剃毛24時間後、100μｌのｎａｉｒ(登録商標)クリームでおよそ12分間の処置し、製剤を水をしみ込ませたガーゼパッドで拭き取った
。この処置は、約0.1〜30分、好ましくは約20分、そしてより好ましくは約12分間続けられる。その後、動物は「水」グループと同じように含水、及び、免疫感
作した。過剰な抗原の除去は、「免疫感作方法」に記載されるように行った。

【０１０６】抗-ＣＴ抗体力価は、上述の「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)」について記載され
るようにＥＬＩＳＡを用いて、単一の免疫感作の2週間後に決定した。結果を表３ａ及び３ｂに示す。両グループにおいて、ＣＴは明らかに免疫原性であったが
、ｎａｉｒで処置されたグループの相乗平均力価は「水」動物と比べて3倍高く、各動物間の力価は前者の動物でより一致していた。従って、ｎａｉｒ(登録商標)クリーム中の活性成分である水酸化カルシウムによる皮膚表面の化学的な破壊は、経皮経路による抗原の運搬を増幅するようである。表３ａ.化学的浸透増大による経皮免疫感作の増幅：抗原の適用前に水酸化カルシウム(ｎａｉｒ(登録商標))で皮膚を処置したマウスにおける抗-ＣＴ力価。

【表４】

【０１０７】表３ｂ.化学的浸透増大による経皮免疫感作の増幅：抗原の適用前に水酸化カルシウム(ｎａｉｒ(登録商標))で皮膚を処置したマウスにおける抗-ＣＴ力価。

【表５】

【０１０８】実施例４. ケラチン分解性製剤(サリチル酸塩等)を用いて、化学的浸透増大の効果を評価
するための試験をさらに行った。6〜8週齢のＢＡＬＢ/ｃマウスを、「免疫感作方法」に記載されるように麻酔し、剃毛した。24時間後、「水」グループの背中を水をしみ込ませたガーゼパッドで拭き、背中に水たまりを作った。およそ5分後、全ての過剰な水を除き、25μｇのＣＴ(0.5ｍｇ/ｍｌ溶液50μｌ)を背中に適
用した。「サリチル酸塩/水」グループの背中は代わりに、剃毛24時間後、10％サリチル酸塩懸濁液(3.25ｍｌの脱イオン水に溶解した、認定された銘柄の1錠の
アスピリン(325ｍｇ))をしみ込ませたガーゼパッドで処置した。この処置は、約
0.1〜30分、好ましくは約20分、そしてより好ましくは約12分間続けられる。およそ10分後、全ての残っている溶液を吸い取り、動物の背中を5分間含水させ、続いて過剰な水を除去し、その後、25μｇのＣＴを局所適用した。過剰な抗原の
除去は、「免疫感作方法」に記載されるように行った。

【０１０９】抗-ＣＴ抗体力価は、上述の「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)」について記載され
るようにＥＬＩＳＡを用いて、単一の免疫感作の2週間後に決定した。結果を表４に示す。両グループにおけるＣＴは明らかに免疫原性であったが、サリチル酸
塩処置グループにおける相乗平均力価は、「水」動物と比べて4倍高く、各動物間の力価は前者の動物でより一致していた。従って、サリチル酸塩による皮膚表
面の化学的な破壊は、経皮経路による抗原の運搬を増幅するようである。表４.化学的浸透増大による経皮免疫感作の増幅：抗原の適用前にサリチル酸塩(
アスピリン)で皮膚を処置したマウスにおける抗-ＣＴ力価。

【表６】

【０１１０】実施例５. 物理的/機械的な浸透増大の役割を評価するため、一般的なエモリー板(emory
board)の形体の研磨用具を、解質層の一部を除去するのに用いた。6〜8週齢のＢ
ＡＬＢ/ｃマウスを、「免疫感作方法」に記載されるように麻酔し、剃毛した。2
4時間後、動物の背中を水をしみ込ませたガーゼパッドで拭くか(「水」グループ
)、または、中間砥粒(medium grain)のエモリー板で10回擦った後、水をしみ込ませたガーゼパッドで拭いた(「エモリー板」)。水処理からおよそ5分後、全ての過剰な水を除き、背中に20μｇのＣＴ(0.2ｍｇ/ｍｌ100μｌ)溶液を適用した。過剰な抗原の除去は、「免疫感作方法」に記載されるように行った。

【０１１１】抗-ＣＴ抗体力価は、上述の「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)」について記載され
るようにＥＬＩＳＡを用いて、単一の免疫感作の3週間後に決定した。結果を表５に示す。両グループにおけるＣＴは明らかに免疫原性であったが、エモリー板
処置グループの相乗平均力価は、「水」動物と比べて10倍高く、各動物間の力価
は前者の動物より一致していた。従って、エモリー板を用いた皮膚の外表面の物
理的な破壊は、経皮経路による抗原の運搬を増幅するようである。これは、皮下
注射、皮内注射、または筋肉内注射等の皮膚を貫通することを必要とする、皮膚
を通して抗原を運ぶ技術と区別することができる。

【０１１２】この簡単な装置を、解質層または表面の表皮のみを壊す長さのマイクロニード
ル、穿孔式ツベルクリン試験に用いられる装置、真皮に貫通しない空気銃、テー
プストリッピング(tape stripping)のための粘着テープ、または、解質層若しく
は表面の表皮のみを壊すことが知られている他の皮膚破壊装置等の抗原及びアジ
ュバントを表皮内に運ぶ他の物理的破壊装置により置換し得る。表５.物理的浸透増大による経皮免疫感作の増幅：抗原の適用前にエモリー板で皮膚を処置したマウスにおける抗-ＣＴ力価。

【表７】

【０１１３】実施例６. 解質層の一部を除去し、その下にある表皮への接触を可能にするのに、研磨用
パッド(abrasive pad)を用いた、別の物理的/機械的な浸透増大方法を用いた。6
〜8週齢のＢＡＬＢ/ｃマウスを、「免疫感作方法」に記載されるように麻酔し、
剃毛した。24時間後、動物の背中を水をしみ込ませたガーゼパッドで拭く(「水」グループ)か、水をしみ込ませたガーゼパッドでふいた後、ナイロンスポンジ(
ｂｕｆｐｕｆ(登録商標))で解質層の最外層を除くために10秒間擦った(「ｂｕｆｐｕｆ(登録商標)」)。「水」グループの背中から過剰の水を除き、全ての動
物の背中に20μｇのＣＴ(0.2ｍｇ/ｍｌ100μｌ)溶液を適用した。過剰な抗原の除去は、「免疫感作方法」に記載されるように行った。

【０１１４】抗-ＣＴ抗体力価は、上述の「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)」について記載され
るようにＥＬＩＳＡを用いて、単一の免疫感作の3週間後に決定した。結果を表６に示す。両グループにおけるＣＴは明らかに免疫原性であったが、ｂｕｆｐｕｆ処置グループの相乗平均力価は、「水」動物と比べて2倍高く、各動物間の力価は前者の動物でより一致していた。従って、ｂｕｆｐｕｆ(登録商標)を用いた皮膚の外表面の物理的な破壊は、経皮経路による抗原の運搬を増幅するよう
である。

【０１１５】この簡単な装置を、皮内注射で用いられる針及びツベルクリン注射、解質層ま
たは表面の表皮のみを壊す長さのマイクロニードル、穿孔式ツベルクリン試験に
用いられる装置、パッチを固定する前に皮膚に擦り込まれ、結晶若しくは基材中
に抗原を含む、ショ糖若しくは塩化ナトリウム等の溶解性の結晶を有する研磨パ
ッチ(abarding patch)、若しくは、生分解性のポリマーが含浸されたパッチ、空
気銃、テープストリッピングのための粘着テープ、または、解質層若しくは表面
の表皮のみを壊すことが知られている他の皮膚破壊装置等の抗原、及び、アジュ
バントを表皮内に運ぶ他の物理的浸透装置により置換し得る。表６.物理的浸透増大による経皮免疫感作の増幅：抗原の適用前に研磨パッド(例
えば、ｂｕｆ-ｐｕｆ(登録商標)等)で皮膚を処置したマウスにおける抗-ＣＴ力価。

【表８】

【０１１６】実施例７ＣＴおよびＬＴなどの細菌ＡＤＰリボシル化外毒素による経皮免疫化は、有意
に「危険な」シグナルを免疫系にもたらし、強い免疫応答を刺激すると考えられ
る。このような化合物はアジュバントとしてはたらく。意外にも、皮膚を水和す
るようにして皮膚上に適用したそのようなアジュバントの単純な混合物が、強い
免疫応答をもたらすことがわかった。このことは、以前の特許（ＰＣＴ／ＵＳ９
７／２１３２４）に記載されている。しかし、ＣＴ（８６ＫＤ）のようなアジュ
バントが皮膚上でアジュバントとしてはたらくと仮定すれば、特に細菌産生物ま
たはモチーフに基づいたその他のアジュバントは、皮膚を水和するようにしてお
よび/または浸透増強剤を使用して皮膚上に適用した時、刺激となるであろうと予想される。

【０１１７】我々は、細菌ＤＮＡを使用してこの予想が正しいかどうかを確認した。６〜８
週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、上記「免疫手順」に記載のとおり、剃毛および麻
酔した。免疫化を行なう日に、浸透を良くするためマウスの背中をイソプロパノ
ールで拭いた。アルコールを蒸発させた後（約５分）、１００μgのＤＮＡ（Ｃp
Ｇ１またはＣpＧ２）と１００μgのジフテリアトキソイド（ＤＴ）を含むリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬを、９０〜１２０分間背中に適用した。安
定性を改善するため、ホスホロチオエート骨格を有するOligos Etcによりオリゴ
ヌクレオチドを合成した。過剰な抗原の除去は、「免疫手順」に記載のとおり行
なった。４週間後および８週間後に免疫化を再び行なった。最初の免疫化から１
０週間後、マウスより採血し、「ＥＬＩＳＡＩgＧ（Ｈ＋Ｌ）」について上記したとおり、ＥＬＩＳＡを用いて抗ＤＴ力価を測定した。結果を表７Ａに示す。

【０１１８】ＤＴと対照ＤＮＡ配列（ＣpＧ２：ＴＣＣＡＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＴＣＴ）の同時投与では、抗ＤＴ力価における検出可能な上昇は誘発できなかった
。対照的に、２つの５’プリンと２つの３’ピリミジンが結合した、非メチル化
ＣpＧジヌクレオチドを含むＤＮＡ配列（ＣpＧ１（免疫刺激性ＤＮＡ）：ＴＣＣ
ＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴを添加すると、５匹のマウスのうちの５匹
とも、血清中の抗ＤＴＩgＧ力価に検出可能な増加を生じた。したがって、ＣpＧ
（６ＫＤ）のような適当なモチーフを含む細菌ＤＮＡは、抗原特異的抗体応答を
誘発するための、皮膚を介した抗原送達を増強するアジュバントとして使用する
ことができると考えられる。

【０１１９】表７Ａ.浸透増強を用いて皮膚へ適用した細菌ＤＮＡのアジュバント活性：体液性免疫応答

【表９】

【０１２０】経皮免疫化処置の経皮効果は、Ｔ細胞増殖によって検出することもできる。６
〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、上記「免疫手順」に記載のとおり、剃毛およ
び麻酔した。免疫化を行なう日に、マウスの背中をイソプロパノールで拭いた。
アルコールを蒸発させた後（約５分）、１００μgのＤＮＡ（ＣpＧ１またはＣp Ｇ２）と１００μgのジフテリアトキソイド（ＤＴ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬを、９０〜１２０分間背中に適用した。安定性を改善す
るため、ホスホロチオエート骨格を有するOligo Etcによりオリゴヌクレオチドを合成した。過剰な抗原の除去は、「免疫手順」に記載のとおり行なった。４週
間後および８週間後に免疫化を再び行なった。最初の免疫化から１２週間後に、
ドレイニング(draining)（鼡径）ＬＮを免疫化したマウス５匹から採取し、プー
ルした。媒質または抗原（ＤＴ）に応答する増殖能力を、３−Ｈ取り込みを読み
出しとして用いる標準４日間増殖分析で調べた。結果を表７Ｂに示す。ＤＴと、
２個の５’プリンおよび２個の３’ピリミジンが結合した、非メチル化ＣpＧジヌクレオチドを含むＤＮＡ配列（ＣpＧ１（免疫刺激性ＤＮＡ）：ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴとの同時投与は、抗原特異的な増殖応答における
検出可能な増大をもたらした。したがって、適当なモチーフを含む細菌ＤＮＡは
、増殖応答を誘発するための、皮膚を介した抗原送達を増強するアジュバントと
して使用することができると考えられる。

【０１２１】表７Ｂ.皮膚へ適用した細菌ＤＮＡのアジュバント効果：ＬＮ細胞増殖

【表１０】

【０１２２】実施例８ＣＴおよびＬＴなどの細菌ＡＤＰリボシル化外毒素による経皮免疫化は、有意
に「危険な」シグナルを免疫系にもたらし、強い免疫応答を刺激すると考えられ
る。このような化合物はアジュバントとしてはたらく。意外にも、皮膚を水和す
るようにして皮膚上に適用したそのようなアジュバントの単純な混合物が、強い
免疫応答をもたらすことがわかった。このことは、以前の特許（ＰＣＴ／ＵＳ９
７／２１３２４）に記載されている。しかし、ＣＴ（８６ＫＤ）のようなアジュ
バントが皮膚上でアジュバントとしてはたらくと仮定すれば、特に細菌産生物ま
たはモチーフに基づいたその他のアジュバントは、皮膚を水和するようにしてお
よび/または浸透増強剤を使用して皮膚上に適用した時、刺激となるであろうと予想される。遺伝的に改変した毒素を使用し、この予想について確認した。６〜
８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、「免疫手順」に記載のとおり、麻酔、剃毛およ
び免疫化した。最初の免疫化から３週間後および５週間後に追加抗原刺激を行な
い、最後の免疫化から２週間後に血清を採取した。アジュバントとして遺伝的に
改変した毒素：ＬＴＫ６３（酵素により不活化したＬＴ誘導体）およびＬＴＲ７
２（０.６％の酵素活性を保持するＬＴ誘導体）を用いた。ジフテリアドキソイド（ＤＴ）１００μｇを抗原として用いた。

【０１２３】抗ＤＴ抗体価は、「ＥＬＩＳＡＩgＧ（Ｈ＋Ｌ）」について上記したとおり、
ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を表８に示す。ＬＴＫ６３またはＬＴＲ７２
のいずれか一方とＤＴにより免疫された動物の血清は、免疫前（前採血）に採取
した血清中の力価と比較して、抗ＤＴ力価が明らかに上昇していた。したがって
、遺伝的に解毒化された易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）の突然変異体は、皮膚
上のアジュバントとして使用することができると考えられる。

【０１２４】表８. 皮膚上のアジュバントとしての遺伝的に改変した毒素ＬＴＫ６３およびＬ
ＴＲ７２の使用

【表１１】

【０１２５】実施例９アジュバントとして作用することが知られている別のクラスの化合物であるサ
イトカインは、アジュバントが、一般的に、コレラトキシンと同じ様式で作用す
ると期待できるという原則を例証する。ＴＮＦαは、ランゲルハンス細胞活性化
化合物としても知られている。

【０１２６】６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、「免疫手順」において上記したとおり、
剃毛および麻酔した。免疫化を行なう日に、マウスの背中をイソプロパノールで
拭いた。アルコールを蒸発させた後（約５分）、０.８３μgのＴＮＦα（組換え
マウスＴＮＦα、Endogen）、ＩＬ−２（１μｇ組換えマウスＩＬ−２(Sigma)）
または模擬アジュバント（ＣpＧ２）を、１００μgのジフテリアトキソイド（Ｄ
Ｔ）と共に、背中の皮膚に９０〜１２０分間適用した。安定性を改善するため、
ホスホロチオエート骨格を有するOligos Etcによりオリゴヌクレオチドを合成し
た。過剰な抗原の除去は、「免疫手順」に記載のとおり行なった。４週間後およ
び８週間後に免疫化を再び行なった。最初の免疫化から１０週間後に、マウスよ
り採血し、「ＥＬＩＳＡＩgＧ（Ｈ＋Ｌ）」について上記したとおり、ＥＬＩＳ
Ａを用いて抗ＤＴ力価を測定した。結果を表９に示す。

【０１２７】ＤＴと模擬アジュバント（ＣpＧ２）の同時投与は、抗ＤＴ力価における検出可能な上昇を誘発できなかった。対照的に、ＴＮＦαの局所適用（０.８μｇ）は、５匹のマウスのうち３匹について、模擬アジュバントで処置したマウスにお
ける抗ＤＴ力価または免疫前（前採血）に採取した血清中の抗ＤＴ力価のいずれ
と比較しても、血清の抗ＤＴＩgＧ力価における検出可能な増大をもたらした。同様に、ＩＬ−２の局所適用（１μｇ）は、５匹のマウスのうち４匹について、
模擬アジュバントで処置したマウスにおける抗ＤＴ力価または免疫前（前採血）
に採取した血清中の抗ＤＴ力価のいずれと比較しても、血清の抗ＤＴＩgＧ力価における検出可能な増大をもたらした。したがって、ＩＬ−２やＴＮＦなどのサ
イトカインは、皮膚上のアジュバントとして使用することができ、ランゲルハン
ス細胞活性化化合物は経皮免疫化に使用することができると考えられる。

【０１２８】表９.皮膚に適用したサイトカインＴＮＦαのアジュバント活性

【表１２】

【０１２９】実施例１０コレラトキシンのＢサブユニットは、別のクラスに属するアジュバントであり
、Ａ−サブユニットを欠くためＣＴのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を
欠いている。ＣＴＢそのものは、摂取時に毒性がないため独特で有用なアジュバ
ントとなる。

【０１３０】６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、「免疫手順」に記載したとおり、麻酔
および剃毛した。免疫化を行なう日に、マウスの背中をイソプロパノールで拭い
た。アルコールを蒸発させた後（約５分）、１００μgの精製コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）および／または１００μgのジフテリアトキソイド（ＤＴ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬを、９０〜１２０分間背
中に適用した。過剰な抗原の除去は、「免疫手順」に記載のとおり行なった。４
週間後および８週間後に免疫化を再び行なった。最初の免疫化処置から１０週間
後、マウスより採血し、「ＥＬＩＳＡＩgＧ（Ｈ＋Ｌ）」について上記したとお
り、ＥＬＩＳＡを用いて抗ＤＴ力価を測定した。結果を表１０に示す。

【０１３１】表１０に示すように、ＣＴＢおよびＤＴにより免疫化された動物の血清は、Ｄ
Ｔ単独で処置した動物の血清または前採血の血清試料における力価と比較して、
抗ＤＴ力価が明らかに上昇した。したがって、精製ＣＴＢは、皮膚上のアジュバ
ントとして使用することができると考えられる。

【０１３２】表１０. 皮膚上のアジュバントとしてのV.cholerae由来コレラトキシンＢサブユ
ニットの使用

【表１３】

【０１３３】実施例１１構造が異なるアジュバントは、異なった効果によって、その増大効果を発揮す
ると思われる。異なる機構によりその効果を発揮するアジュバントは、免疫応答
の増大に対し、付加的なまたは相乗的な効果を有する。我々は、個々のアジュバ
ント単独と比較して、２種類のアジュバントの同時使用が、経皮免疫化に対する
応答を増大するということを見い出した。

【０１３４】６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、「免疫手順」について上記したとおり、
剃毛および麻酔した。免疫化を行なう日に、マウスの背中をイソプロパノールで
拭いた。アルコールを蒸発させた後（約５分）、１００μgの免疫刺激性ＤＮＡ（ＣpＧ１）および／またはコレラトキシン（ＣＴ）１００μgを含むリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬを、可溶性リーシュマニア抗原抽出物（ＳＬＡ
）１００μｇと共に、９０〜１２０分間背中に適用した。ＳＬＡは、Walter Ree
d Army Institute of Research にて、Leishmania major 前鞭毛型抽出物の超音
波処理物中の可溶性タンパク質を９０〜１２０分間遠心して単離することにより
製造された抗原抽出物である。過剰な抗原の除去は、「免疫手順」に記載のとお
り行なった。４週間後および８週間後に免疫化を再び行なった。最初の免疫化か
ら１２週間後に、免疫化したマウス２匹からドレイニング(draining)（鼡径）Ｌ
Ｎを採取し、プールした。媒質または抗原（ＳＬＡ）に応答する増殖能力を、３
−Ｈ取り込みを読み出しに用いる標準４日間増殖分析で調べた。結果を表１１に
示す。

【０１３５】ＳＬＡと、ＣpＧ１（２個の５’プリンおよび２個の３’ピリミジンが結合した、非メチル化ＣpＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性ＤＮＡ配列：ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ）またはＣＴとの同時投与は、抗原特異的な増
殖応答における検出可能な増大をもたらした。しかし、ＣpＧ１とＣＴの両方に同時に曝した動物のリンパ節培養細胞における抗原（ＳＬＡ）特異的増殖応答は
、いずれか一方のアジュバントのみに曝した動物由来の培養細胞と比較して約２
０倍高かった。したがって、適当なモチーフを含む細菌ＤＮＡは、ＣＴのような
ＡＤＰリボシル化外毒素と、皮膚上のアジュバントとして相乗的に作用し、いず
れか一方のアジュバント単独と比較して、より高い免疫応答を誘発すると考えら
れる。

【０１３６】表１１.皮膚適用時における、アジュバントとしての免疫刺激性ＤＮＡとＡＤＰリボシル化外毒素（ＣＴ）の相乗効果

【表１４】

【０１３７】実施例１２経皮免疫化は、１つの送達方法として単独で使用したときに強い免疫応答を誘
発する。我々は、経皮免疫化は、他の送達経路に連続して使用し、免疫応答を刺
激することができるということを見出した。

【０１３８】０日目に、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの両群に、ミョウバン（Rehydrog
el：ＮaＣl中２５μｇ）と混合したＤＴ（５μg）を５０μLの筋肉内（im.）注射により後部大腿内へ投与した。ｉｍ／ｔｃ／ｔｃ群のマウスでは、８週間後お
よび１６週間後に「免疫手順」について上記したとおり剃毛、麻酔し、アジュバ
ントとして１００μｇのコレラトキシンと、抗原として１００μｇのジフテリア
トキソイドを用いて経皮経路により免疫化した。免疫化溶液を背中へ９０〜１２
０分間適用した。過剰な抗原の除去は、「免疫手順」に記載のとおり行なった。
最初の免疫化より２２週間後、マウスより採血し、「ＥＬＩＳＡＩgＧ（Ｈ＋Ｌ
）」について上記したとおり、ＥＬＩＳＡを用いて抗ＤＴ力価を測定した。結果
を表１２に示す。

【０１３９】ＤＴ５μｇの１回の筋肉内注射は、免疫前（前採血）に同じ動物から採取した
血清中の力価と比較して、血清抗ＤＴ力価における検出可能な増大を誘発した。
筋肉内注射により初回抗原刺激した動物の、経皮免疫化法を用いた追加抗原刺激
は、相乗平均力価において６０倍の上昇をもたらし、経皮追加抗原刺激を行なっ
た動物はすべて、筋肉内注射で初回抗原刺激した群で観察された力価と比較して
抗ＤＴ力価が明らかに高かった。したがって、経皮免疫化処置は、抗原を用いた
最初の免疫化が筋肉内経路であったマウスにおいて、抗原特異的力価をさらに高
めるために使用することができる。我々はさらに、筋肉内投与で初回抗原刺激を
行なった動物を経皮免疫化（ＴＣＩ）によって追加抗原刺激することができると
いうことを見出した。ＴＣＩ初回抗原刺激、または噴霧器（gun）もしくは他の送達手段による経口、バッカル、鼻、直腸、膣、皮内を含む他の経路とスケジュ
ールによる追加抗原刺激の様々な組合せを想到することができる。さらに、抗原
は、糖タンパク質でのタンパク質改変、ホロトキシン（holotoxin）を有するサブユニット、ＤＮＡ初回免疫刺激（priming）次いでタンパク質、核酸の筋肉内投与次いで核酸のＴＣＩ適用を含め、経路や構成が異なっていてもよい。経皮免
疫化処置は、幼児期において初回抗原刺激を受けた子供または子供のときに初回
抗原刺激を受けた大人に追加抗原刺激を行なうのに使用することができる。送達
が容易なことから、パッチ使用する複数回の追加抗原刺激が可能であり、インフ
ルエンザワクチンなどのワクチンの効力を増大し得る。

【０１４０】表１２.筋肉内投与で初回抗原刺激した動物の、経皮免疫化法を用いた追加抗原刺激

【表１５】

【０１４１】ＴＣＩはこのような強力に免疫系を刺激することが明らかであるので、ある部
位の皮膚上のアジュバント添加が他の部位に添加された抗原のためのアジュバン
トとして作用することができる。６〜８週令のＢＡＬＢ/cマウスを麻酔し、"免疫方法"に記載と同様にして毛を剃った。動物は耳にタグはつけなかったが、Ａ、ＣまたはＧと名付けたカゴの中に収容した。免疫刺激当日にマウスの耳の背側
の皮膚を７０％ソプロパノールを含む綿棒で皮膚表面を緩やかにこする処置をし
た。５分後に、過剰の水を水−処理した耳から吸い取り紙で吸い取り、アジュバ
ント(ＣＴ５０μg)および／またはリン酸緩衝食塩水５０μl中抗原(牡牛血清アルブミン(ＢＳＡ)１００μg)を左または右耳表面(表に記載)に塗抹した。２時間
半後に耳を濯ぎ、２回ふき取って乾燥させた。マウスは４および８週後に追加免
疫した。最初の免疫刺激の１２週後に動物を放血させ、抗−ＢＳＡ力価を、上記
"ＥＬＩＳＡＩgＧ(Ｈ＋Ｌ)"に記載と同様にしてＥＬＩＳＡを用いて測定した。
結果を表１３に示す。

【０１４２】皮膚に対するＢＳＡのみの塗抹は５匹のうち１匹のみに１００ＥＵ以上のＥＬ
ＩＳＡ力価を発現させ、殆ど免疫原性がなかった。これに対して、皮膚にＣＴお
よびＢＳＡを投与した９匹のうち９匹ともが１００ＥＵ以上の力価を発現させた
。抗原およびアジュバントを投与した動物のうち、同一部位(左耳)に試験材料を
投与されたマウスは、別々の部位(左および右耳)に抗原およびアジュバントを投
与された動物より、より高い(１０倍の)抗−ＢＳＡを発現させた。しかし、一方
の耳に抗原、他方の耳にアジュバントを投与された動物は、ＢＳＡのみを投与さ
れた動物より、約３０倍高い抗−ＢＳＡ免疫応答を発現させた。すなわち、抗原
およびアジュバントは別々の部位にＴＣＩで局所的に投与されると、体液性免疫
応答を誘発させることができる。この免疫刺激は他の経路で送達された抗原によ
って生じると考えられ、経口、バッカル、点鼻、直腸、膣、皮内を含み、皮下注
射器または他の投与手段による投与スケジュールを考えることができる。さらに
、アジュバントは応答を増強させるために、核酸免疫刺激とともに用いることが
できる。このような投与は免疫応答を増強するために同時である必要がない。例
えば、プラスミドＤＮＡの筋肉内投与の後にアジュバントの経皮投与をしてもよ
い。分子量５００ダルトンは皮膚を通過できないと考えられているから、ＣＴ、
ＬＴ、ＴＮＦ∝、ＣpＧsまたは同類のアジュバントによる免疫刺激は驚くべき結
果である。

【０１４３】

【表１６】表１３．透過増強による皮膚上の同一または遠隔部位における抗原およびアジュバントの送達

【表１７】

【０１４４】実施例１４．ヒトの皮下免疫本発明は適当な賦形剤または担体を用いて実施することができる。例えば、パ
ッチを賦形剤として用いて、本発明の製剤とともに処置することができ、また、
本発明の製剤で処置された皮膚領域を覆うのに用いることができる。適当なパッ
チは、例えば、木綿、ナイロン、レーヨン、ポリエステルまたはそれらの組合せ
から作製することができる。このようなパッチには接着剤や非接着性裏当てを付
加することができる。非接着性裏当てのパッチは非接着性手段、例えば、包装材
料で動物に固定することができる。適当な裏当ては例えば、シリコーン、アクリ
ルエステルまたはゴムなどの材料で作製することができる。用いることができる
他の賦形剤および担体としては上記のもの;例えば、粉末類、油類、水、クリームなどを挙げることができる。ヒトにおけるＴＣＩの潜在能力を評価するために
、第１相試験をＬＴを用いて行い、抗−ＬＴ抗体を誘導しようと試みた。６人の
志願者にＬＴ５００μg、コレラワクチン(ＣＴＢ１mg)に用いられた経口アジュ
バント投与量と同様の投与量が投与された。ＬＴはスイス血清・ワクチン研究所
(ベルン、スイス)にてＧＭＰ条件下で製造され、オラバックスインコーポレーテ
ッド、ケンブリッジ、マサチューセッツから販売された。志願者は滅菌食塩水５
００μlと混合したＬＴ５００μgが投与され、これはボリビニルで裏うちされた
２インチ四方の綿ガーゼパッドにしみこませ、４インチ四方のテガデルム(商品名)包帯で覆われている。免疫は未処置皮膚上にパッチを６時間あてて行われ、その後その部位を滅菌食塩水５００mlで完全に濯いだ。志願者は同様にして１２
週後追加免疫された。志願者は免疫部位の炎症の徴候について１、２、３および
７日目に検査され、予防接種に関する徴候について聞かれた。免疫は未処置皮膚
上にパッチを６時間あてて行われ、その後パッチをはがし、その部位を滅菌食塩
水５００mlで完全に濯いだ。志願者は１２週後追加免疫された。第１回または第
２回の免疫の後に全身および免疫部位のいずれにも副作用は見られなかった。抗
−ＬＴＩgＧ力価を前記と同様にして測定した。結果をＥＬＩＳＡ単位(ＥＵ)で
示し、これは１.０のＯＤを生じさせる試料の逆希釈として定義された。抗−ＬＴＩgＡは、ヒトＩgＡ(ＩＣＮ)を用いて作製したＩgＡ標準曲線を用いて、ヤギ
抗−ヒトＩgＡ(α)−ＨＲＰ(キルケガールド・アンド・ペリー、ゲティスバーグ
、メリーランド)を用いて、抗−ＬＴＩgＧと同様にして測定した。表１４に示すように、６人の志願者は血清抗−ＬＴＩgＧまたはＩgＡ抗体の産生を上昇させる応答をし、これは抗体力価において４倍増であった。抗−ＬＴＩgＧの平均
上昇倍数は１０.２であり、抗−ＬＴＩgＡの平均上昇倍数は７.２でった。免疫
部位および反対側の腕の生検は皮膚の炎症の徴候を示さなかった。これらの結果
はＴＣＩがヒトに皮膚の刺激作用や炎症がなく行われ得ることを立証するもので
ある。

【０１４５】適当なパッチ材料は前記に記載した。一般に、パッチは例えば、感圧性包帯、
ワクチンおよびアジュバントを坦持するためのマトリックスまたは吸収層、ワク
チン不透過性裏当ておよび放出インナーから構成することができる。これ自体ま
たは適当なパッチの例は米国特許第４９１５９５０および３７３４０９７号に記
載されている。

【０１４６】パッチは、例えばポリエステル／セルロース、ポリプロピレン、ポリエステル
、ポリエステル／レーヨンなどを含む織布または不織材料を含んで作製される。

【０１４７】不織性パッチ材の例には次のようなものが含まれる：ＢＢＡ不織布ａ．グレード番号１３１３２９０、湿性積層不織布、組成物＝ポリエステル／セルロース、重量(gsy)＝３５.４、重量(gsm)＝４２.３、厚さ(mils)＝７.９、伸帳性ＭＤ＝３.４、伸張性ＣＤ＝２.４。

【０１４８】ｂ．グレード番号２００６０８６、熱接着性不織布、組成物＝ポリエチレン、重量(gsy)＝１６.０、重量(gsm)＝１９.１、厚さ(mils)＝１０.２伸張性ＭＤ＝３.３、伸張性ＣＤ＝０.７。

【０１４９】ｃ．グレード番号１４９１４６、熱接着性不織布、組成物＝ポリエステル、重量(gsy)＝２５.６、重量(gsm)＝３０.６、厚さ(mils)＝６.５、伸張性ＭＤ＝５.３、伸張性ＣＤ＝０.９。

【０１５０】ｄ．グレード番号１４９０２４、熱接着性不織布、組成物＝ポリエステル／レーヨン、重量(gsy)＝３０.５、重量(gsm)＝３６.４、厚さ(mils)＝１３.２、伸張性ＭＤ＝５.５、伸張性ＣＤ＝１.１。

【０１５１】ｅ．グレード番号１４０−０２７、ハイドロジェンタングル不織布、組成物＝ポリエステル／レーヨン、重量(gsy)＝２８.０、重量(gsm)＝３３.５、厚さ(mils)＝２２.４、伸張性ＭＤ＝１０.４、伸張性ＣＤ＝３.８。

【０１５２】本発明において用いられ得る感圧接着剤は例えば、アクリルエステル、シリコ
ーン、ゴムなどである。

【０１５３】

【表１８】

【０１５４】実施例１５ＬＴは経皮投与によるヒトの免疫に有効であることが示されている。今回発明
者らもまたＬＴがＴＣＩのアジュバントとして作用するとの知見を得た。６〜８
週令のＣ５７ＢＬ／６マウスを麻酔し、"免疫方法"に記載と同様にして毛を剃っ
た。免疫刺激当日にマウスの背中をイソプロピルアルコールで拭いた。アルコー
ルを飛ばした後(約５分)、熱不安定性エンテロトキシン(ＬＴ)１００μgおよび／またはジフテリアトキソイド(ＤＴ)１００μgを含むリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ
)１００μlを９０〜１２０分間背中に接触させた。過剰の抗原を"免疫方法"に記
載と同様にして除去した。免疫を４および８週目に繰り返した。最初の免疫から
１０週後、動物を放血させ、抗−ＤＴ力価を上記"ＥＬＩＳＡＩgＧ(Ｈ＋Ｌ)"に
記載と同様にしてＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を表１５に示す。

【０１５５】ＤＴのみで処置された動物からの血清の力価または前採血試料の力価と比較す
ると、ＬＴおよびＤＴで免疫した動物からの抗−ＤＴ力価は明らかに上昇してい
た。すなわち、熱不安定性エンテロトキシン(ＬＴ)は皮膚のアジュバントとして
用いることができるのは明らかである。

【０１５６】

【表１９】

【０１５７】実施例１６物理的／機械的浸透増加の役割を評価するために、解質層の表在層をテープス
トリッピングで除いた。テープストリッピングは解質層の外層を除くためにこの
分野で良く知られた介在(intervention)である。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マ
ウスを麻酔し、「免疫工程」で述べたように毛を剃った。２４時間後、２５μｇ
のＣＴをリン酸緩衝生理食塩水５０μｌに溶解してマウスの背中に塗布し、非介
在群とした。別に、第２群の動物の背中の皮膚を穏やかにテープストリッピング
し、“テープストリッピング”介在群とした。テープストリッピング工程はセロ
ファンスコッチテープを背中に貼って、３分間皮膚表面に接着させ、ついでやさ
しくテープを除いて行った。接着／剥がす工程は３回繰り返して行った。ついで
２５μｇのＣＴをリン酸緩衝生理食塩水の５０μｌ溶液でマウスの背中に塗布し
た。抗原は約１.５時間背中に残留し、そして過剰の抗原除去を「免疫工程」に述べたように行った。

【０１５８】抗ＣＴ抗体力値は、１次免疫１１日後に採取した血清を用いる「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)」で上述したように、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を表１
６に示す。免疫前に同じ動物から採取した血清(前採血、prebleed)と比べ、ＣＴ
は両群において免疫原性であった。しかしながら、テープストリッピング群の相
乗平均力値は１００倍高く、力値は非介在群の動物と比べ、後者の動物間でさら
に一致していた。よって、テープストリッピングを用いた皮膚表面の物理的破壊
は経皮投与による抗原輸送を増強させるようである。

【０１５９】この簡単なデバイスは、抗原とアジュバントを表皮に輸送する他の物理的浸透
デバイス、例えば皮内注射に用いられる針やツベルクリンシリンジ、解質層や表
皮にのみ浸透する長さのマイクロニードル、ＴＢタインテスト(TB tine testing
)に用いられるデバイス、気体動力銃、テープストリッピング用粘着テープ、あるいは表皮あるいは皮下真皮にのみ浸透することで知られている他のデバイスで
置き換えることができる。テープストリッピングデバイスは他の浸透増強剤と共
に用いることができる。テープストリッピングデバイスはパッチ配置箇所を示す
マーカーと共に用いることができ、ロール状あるいは個別の単位形に分散するこ
とができる。

【０１６０】表１６物理的浸透増強による経皮免疫の増強：抗原投与前にセロファンテープを用いて皮膚が剥がされたマウスにおける抗ＣＴ
力値：

【表２０】

【０１６１】実施例１７プラスミドＤＮＡあるいはＲＮＡなどの核酸は免疫応答を誘発するために用い
ることができ、本分野では良く知られている。経皮免疫における核酸の使用は先
の特許(ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１３２４)に記載された。浸透増強技術と共に皮膚
への核酸(遺伝免疫としても知られている)の使用は以下の実施例に例示する。

【０１６２】６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを麻酔し、「免疫工程」で述べたように毛
を剃った。“ＮＰＤＮＡ”群では、マウスはイソプロパノールで拭き、アルコールが蒸発後(約１０分後)、背中を飽和ガーゼパッドを用いて水に浸した。約１
０分後、過剰の水を吸い取り、１００μｇのインフルエンザ核蛋白質をコードす
るＤＮＡプラスミド(ｐＣＭＶ−ＮＰ)を、１００μｌの生理食塩水に溶解して、
背中に塗布した。ＮＰ−ＤＮＡマウスの第２群は、背中をアルコール拭きの前に
３回テープストリッピングする以外は、同様の免疫プロトコールを行い、“ＮＰ
−ＤＮＡ−テープストリッピング”群とした。テープストリッピング工程はセロ
ファンスコッチテープを背中に貼って、５分間皮膚表面に接着させ、ついでやさ
しくテープを剥がして行った。マウスの第３群は上記のテープストリッピング／
免疫プロトコールを行い、１００μｇのアジュバント熱不安定性エンテロトキシ
ン(ＬＴ)を免疫溶液に含めた。１次免疫１６日後、動物を放血し、抗インフルエ
ンザＮＰ力値を、「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)］で上述したＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を表１７に示す。

【０１６３】抗インフルエンザ力値をスプリットウィルス抗原(フルゾン、Fluzone)標品を用いてＥＬＳＡプレートを被覆して測定した。ＥＬＩＳＡ力値は５匹の個々の動
物で測定し、各群で読まれた平均光学濃度を示す。３群の免疫群すべてにおいて
、免疫前に同じ動物から採取した血清(前採血、prebleed)の力値と比べ、高い抗
インフルエンザ力値を発現した。ＮＰＤＮＡのみのグループと比べ、免疫前のテープストリッピングはすべての３血清希釈試験(１：１００、１：２００、１：４００)において抗インフルエンザ力値を増強し、アジュバント(ＬＴ)の追加によりこの応答をさらに増強した。よって、ＤＮＡはワクチン抗原に対する免疫
応答を誘発するために皮膚に使用でき、その効果はアジュバントの添加と、テー
プストリッピングなどの浸透増強により、さらに強化され得る。

【０１６４】表１７アルコール浸透増強を用いた皮膚へ抗原として塗布したＤＮＡの免疫原性：

【表２１】

【０１６５】実施例１８輸送の簡便さのため、経皮免疫(ＴＣＩ)は異なる排膿リンパ節への適用が可能
である。このことは免疫応答を増強する点において、さらなる有利さを持つ。ウ
サギを麻酔し、毛を剃り、上記のように免疫した。動物を１００μｇのコレラ毒
素(ＣＴ)と１００μｇのインフルエンザ血球凝集素(ＨＡ)で背中の１箇所あるい
は２箇所に免疫した。ＨＡおよびＣＴは０、３および５週目に投与した。１次免
疫７週後、動物を放血させ、抗ＨＡ力値を、「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)］で上述したＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を表１８に示す。

【０１６６】抗ＨＡ力値は、ＣＴおよびＨＡで免疫した１０動物中の１０動物から得た血清
において、同じ動物から免疫前に採取した血清(前採血、prebleed)の力値と比べ
、上昇した。２箇所免疫群の相乗平均力値は１箇所免疫群のものに比べ３倍高く
、これは複数箇所での抗原輸送が、ＴＣＩの増強に用いることができることを示
唆している。よって、抗原は皮膚の１箇所あるいは複数箇所へのＴＣＩにより輸
送できる。

【０１６７】表１８単一あるいは複数箇所への抗原の経皮投与：

【表２２】

【０１６８】実施例１９ＴＣＩにより輸送できる様々な抗原を、抗多糖類抗体を誘発するために、多糖
類複合ワクチンの使用によりさらに例示する。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス
を麻酔し、毛を剃り、「免疫工程」で述べたように免疫した。マウスはコレラ毒
素(ＣＴ)およびヘモフィルスインフルエンザＢ(Haemophilus influenza B)多糖類(Ｈｉｂ−ＰＳ)で０、３および５週後に免疫した。１次免疫７週後、動物を放
血させ、抗Ｈｉｂ−ＰＳ力値を「ＥＬＩＳＡＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)］で上述したＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を表１９に示す。

【０１６９】抗Ｈｉｂ−ＰＳ力値はＣＴおよびＨｉｂ−ＰＳで免疫した１０動物中、４動物
の血清中で、同じ動物から免疫前に採取した血清(前採血、prebleed)の力値と比
べ、上昇した。よって、ＴＣＩは抗多糖類抗原を皮膚を介して誘発するために使
用することができる。これは一般的ヒト使用ワクチン抗原であり、免疫の重要な
戦略を代表する。

【０１７０】表１９経皮免疫による複合多糖類の輸送：

【表２３】

【０１７１】実施例２０ヒト用ワクチン抗原を用いるマウスの経皮免疫化ＣＴは単一のトキソイド（変性毒素）及びＢＳＡを用いる経皮免疫のためのア
ジュバントとして作用することが示されている。我々は表２０に記載のように、
アジュバントとしてＣＴを用いて、多価トキソイドワクチン（破傷風及びジフテ
リア毒素）、酵母で発現した組換え蛋白（HIV p55 gag)及び完全に死滅させた狂
犬病ウイルスを含む様々なヒト用ワクチン抗原でマウスを経皮免疫化した。文献
（Glenn.G.M., Scharton-Kereten, T., Vassell, R., Matyas, G. & Alving. C.
R. Transcutaneous immunization using bacterial ADP-ribosylating exotoxi
ns as antigens and adjuvants, Infect. Immun. (印刷中）)に先に記載された
ように BALB/cマウス（n=5)を免疫化し、２回追加免疫した。免疫化の用量は100
/50/50 μg CT/TT/DT via TCI 対 3/1/1 alum/TT/DT IM; 100/100 μg LT＋DT 対100μgDT単独を含む。死滅狂犬病ウイルス17IEで免疫化したマウス（ｎ＝１０
）は、筋肉内に初回抗原刺激（２ｘ）した後、軽くアルコールで皮膚を拭いてか
ら、経皮的に追加免疫刺激し、３ｘIM狂犬病ウイルス免疫化と比較した。DT,TT,
ｐ５５及び狂犬病に対する抗体レベルは、文献記載のようにしてELISAを用いて決定した（Grassi, M., Wandler, A. & Peterhans, E., Enzyme-linked immunoa
bsorbant assay for determination of antibodies to the envelope glycoprot
ein of rabies virus, J. Clin. Microbiol., 27, 899-902 (1989)), Miyamura,
K., Tajiri, E., Ito, A., Murata, R. & Kono, R. Micor cell culture metho
d for determination of diphtheria toxin and antitoxin titers using VERO
cells II, Comparison with the rabbit skin method and practical applicati
on for seroepidemiological studies, J. Biol. Satand., 2, 203-209 (1974))
。 TCIは、TT及びDTに対する抗体応答において同様の増加をもたらし、抗DT中和
力価は筋肉内免疫化（IM)によるものに匹敵していた。これらのデータはTCIが既
存の免疫化プラクティスに匹敵する程度の大きさの免疫応答を誘導させるのに用
いることができることを示している。IMで初回免疫刺激された動物のTCI追加免疫刺激も試験した10頭の動物全てで、有意な抗狂犬病力価をもたらした（0.53〜
1.03 IU, p<0.02, Student's t-test)。アジュバントなしに投与された抗原DT及
びp55に対する抗体は、アジュバントなしに投与した場合、抗原の免疫原性は極めて弱いという我々の事前の観察と一致して、極めて低いか検出不可能であった
。LTも、CTを用いる先の研究（１、２）と同じ様にアジュバントとして作用した
（表20）。免疫化は筋肉内投与との比較で最適化していないが、これらの抗原−
特異的応答から、種々の起源の、種々のサイズの、様々なヒト用ワクチンにTCI を使用しうること、及びLTが同時に投与（coadminister)されるワクチン抗原のためのアジュバントとして作用することができることが確認できる。

【０１７２】表２０

【表２４】 TCIによって投与されたヒト用ワクチン抗原に対するネズミ抗体応答 ND=実施せず、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）は幾何学的平均値であり、範囲を括弧内
に示す。

【０１７３】実施例２１ランゲルハンス細胞活性化２対象で、免疫化した側と、その反対側の腕のバイオプシー（生検）を、１つ
は免疫化後24時間、他は第二の免疫化の48時間後に行った。標本のヘマトキシリ
ン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により、免疫化後の炎症が無いことを示唆する臨
床所見を得た（図１Ａ，Ｂ）。慣例の組織学的切片では目立たないが、免疫化部
位から得た標本の抗CD1a染色を用いてLC類を可視化すると、反対側の腕から得た
対照生検と比較して、大いに拡大された細胞体があるが、それ以外は正常な細胞
数が存在することが確認された（図1C,D,E,F)。同様の所見が、LC類の可視化に抗HLA-DR及び抗S‐100を持った場合も得られた（図示せず）。TCI免疫化皮膚のL
C形態学は口内の叢由来のリポ多糖類によって慢性的に活性化されていると考えられる扁桃腺窩LC類と外観上同様であった（Noble)。

【０１７４】試験するヒト皮膚生検標本の大きさ及び数に制限があるために、補足的にネズ
ミでの研究を行った。接触増感薬、LPS、及び炎症誘発性サイトカインを用いるネズミ系におけるLC活性化は、形態学における両方の変化（Aiba)と表面マーカー発現の増加（Jakob and Udey)を通して、特性化された。マウスの耳の皮膚はしばしばLC活性化研究に用いられるが、経皮免疫化の優れた部位であるとが示さ
れている（Scharton-Kersten)。耳へのCT適用後24時間目に表皮シートを調製しM
IICクラスII、ネズミ皮膚のLC-拘束性マーカー、のために染色した。PBS処置耳に比較して（図２A)、CT処置耳におけるLCは、樹脂状プロセスの喪失、拡大され
た細胞体、及び細胞の強い染色−LC活性化の特徴、を伴うLC形態における顕著な
変化を示した（Aiba）（図２B,C)。CTのLC活性化能はフローサイトメトリーによ
って確認された。CT‐処理皮膚由来のLCは、MHCクラスII抗原及びCD86(B7-2)レベルの増加と、E-カドヘリンレベルの減少を表し、これは他に記載されたLC活性
化と一致していた（Pierre, Aiba, Jakob)。

【０１７５】実施例２２で使用しうる免疫化の方法 BALB/cマウスを＃４０バリカンで刈り込む（毛剃りする）ことができる。この
シェービングは皮膚になんらの外傷兆候を与えずに行うことができる。シェービ
ングは、胸郭中央から首筋の真下まで行う。次いでマウスを２４時間休ませる。
この前に、マウスの同定のために耳タグをつけ、免疫前血清サンプルを得るため
に予備採血するとよい。マウスは、シェービングせずに各耳に５−５００μlの免疫化溶液を適用することにより、経皮的に免疫化することもできる。マウスの
免疫化は以下の方法で行うことが出来る。20mg/mlキシラジン溶液0.03-0.06mlと
100mg/mlケタミン 0.5 mlとでマウスを麻酔し、この用量の麻酔薬で約１‐３時間固定しておく。マウスを温ブランケット上に腹部を下にして置く。

【０１７６】免疫化溶液と浸透促進化合物（または技術）を毛を剃った背面皮膚に、以下の
要領で載置する：1.2 cm x 1.6 cm ポリスチレン製ステンシルを静かに背中に置
き、食塩水で湿らせた滅菌ガーゼを用いて部分的に皮膚を湿らし（免疫化溶液が
均一に適用されるよう）、免疫化溶液をステンシルで囲んだ範囲内にピペットで
適用し２ｃｍ²の免疫化溶液のパッチを得る。ピペットで皮膚を削り取ったり、摩擦しないように注意する。ピペットチップの円滑な側で被うべき範囲に免疫化
溶液を広げることができる。別法として、皮膚を湿らせることなく、又は皮膚を
湿らせるがステンシルを用いずに皮膚に免疫化溶液を直接置くことができる。

【０１７７】免疫化溶液（約５μl〜約２００μl）はマウスの背部に６０−１２０分間残存
させることができる。免疫化期間の終了時に、マウスを首筋及び尾で静かに、多
量の微体温の水道水流の下に維持し、１０秒間洗浄する。マウスを滅菌ガーゼで
軽くたたいて乾かし、１０秒間、第２の洗浄を行う；次いで、マウスを第２回目
の乾燥（軽くたたいて）に付し、ケージに放置する。マウスは、麻酔、免疫化、
洗浄工程による悪影響又は又は外毒素に起因する毒性を示さなかった。免疫化後
の、皮膚の刺激、膨潤、又は赤化も認められず、マウスは成長していると思われ
た。耳からの免疫化は免疫化前に毛を除去しない点を除いて上記のようにして行
うことができる。

【０１７８】抗原以下の抗原を免疫化及びELISAに用いることができ、滅菌PBS又は生理食塩水を
用いて混合することができる。コレラ毒素又はCT（List Biologicals, Cat. # 1
01B, lot # 10149CB)、CTBサブユニット（List Biologicals, Cat. # BT01, lot
# CVXG-14E)、CTAサブユニット（List Biologicals, Cat. # 102A, lot # CVXA
-17B)、CTAサブユニット（Calbiochem, Cat. # 608562); 百日咳毒素、塩不含（
List Biologicals, lot # 181120a);破傷風毒素（List Biologicals, lot # 191
3a, #1915a)；シュードモナス外毒素Ａ（List Biologicals, lot # ETA25a); ジ
フテリアトキソイド（List Biologicals, lot # 1515I); 大腸菌由来の熱不安定
性エンテロトキシン（Sigma, lot # 9640625)；ウシ血清アルブミン又はＢＳＡ（Sigma, Cat # 3A-4503, lot #31F-0116); 及びHemophilus influenza B抱合体
（Connaught, lot # 6J81401)。

【０１７９】ＥＬＩＳＡ‐ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＣＴ、ＬＴ、ＥＴＡ、百日咳毒素、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド
、Hemophilus influenza B抱合体、及びＢＳＡはGlennら（1995）と同様の方法でＥＬＩＳＡを用いて測定することができる。

【０１８０】実施例２２ＬＴの活性化は、ＬＴをトリプシン（またはビーズに固定したトリプシン）と
共に、還元剤（例えばジチオスレイトール）を用いまたは用いずに、標準の反応
条件下にインキュベートして、トリプシン開裂部位近くのジスルフィド結合を切
ることにより行なわれる。天然のＬＴは、蛋白質１００μｇをトリプシン０．１
μｇで全反応液量１００μｌにて３７℃で４５分間インキュベートすることによ
り活性化される。別法として、トリプシンをビーズに固定し、ＬＴをトリプシン
ビーズ上に流す方法でもよい。

【０１８１】トリプシン開裂は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示すこともできる〔レミリ（Laem
illi)，Ｕ．Ｋ．１９７０，バクテリオファージＴ４のヘッドの組立て中の構造蛋白の開裂、Nature ２２７：６８０−６８５〕。トリプシンで処理または非処理のＬＴを、ジチオスレイトール含有緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の
前に１００℃で５分間加熱する。トリプシン処理ＬＴは、Ａ１およびＡ２のトリ
プシン開裂に一致する２１Ｋダルトンの蛋白分解フラグメントを有し、Ａ１サブ
ユニットがＡＤＰ−リボシル化Ｇ蛋白質に影響し、毒作用を示す。非処理ＬＴは
完全なＡサブユニットからなる２８Ｋダルトンのバンドを示す。活性化は、さら
に、マウスＹ−１細胞アッセイでも示され、そこでは天然ＬＴはＣＴよりも１０
００分の１と活性が少ない。しかし、トリプシン処理ＬＴはＣＴと同様の活性を
有する。活性化はまた酵素アッセイ、ＮＡＤ：アグマリンＡＤＰ−リボシルトラ
ンフェラーゼアッセイを用いても示され得る。そのようなアッセイでは、非トリ
プシン処理ＬＴは低活性または測定できない程度の活性しか示さないと考えられ
るが、トリプシン処理ＬＴはＣＴが示すものと同様の活性を示すものと予想され
る。

【０１８２】実施例２３経皮免疫は、もし免疫が短時間でなされるならば、より有益である。例えば、
免疫が通常の通院３０分の間に達成できれば有益である。この例では、水和アル
コール交換した皮膚では、そのような短時間で経皮免疫が達成されることを示し
た。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週令）を、「免疫操作法(immunization proced
ure)」に記載のようにして、麻酔し、毛ぞりをした。免疫した日にマウスの背を
イソプロパノールでふいた。アルコールが蒸発したのち（約１０分）、水２００
μを背中につけて水和した。１５分後、免疫溶液を背中につけ、一定期間放置し
た。「免疫操作法」に記載と同様にして過剰の抗原を除いた。マウスをｄＯにて
ＣＴ単独（５０μｌ中１００μｇ）で免疫し、４、６および９週間でＣＴ＋ＤＴ
（１００μｌ容量中各々１００μｇ）で免疫した。初期免疫後１２週間して動物
を採血し、ＥＬＩＳＡＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）について前期したようにＥＬＩＳＡに
て抗ＤＴ力価を測定した。その結果を表２３に示す。

【０１８３】抗ＤＴ力価は、免疫前に採血した血清（前採血）の力価に比べて、ＣＴおよび
ＤＴで免疫した動物全ての血清中で明らかに上昇していた。免疫の最大効果は、
動物を６０分間免疫処理した場合に得られた。しかし、力価は３０分でも１２０
分でも同様であった。１５分間免疫では効果が劣り、その力価は、３０分、６０
分および１２０分処理グループに比べて約１０分の１であった。これは、ＴＣＩ
が、１５分抗原適用で達成されるものに似ている。

【０１８４】表２３経皮免疫により低減された液性免疫に対する抗原適用時間の効果

【表２５】

【０１８５】

【表２６】

【０１８６】

【表２７】

【０１８７】

【表２８】

【０１８８】

【表２９】

【０１８９】

【表３０】

【０１９０】

【表３１】

【０１９１】

【表３２】

【０１９２】

【表３３】

【０１９３】

【表３４】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１ａ〜ｆは免疫化の部位で炎症がないこと（Ａ，Ｂ）、免疫化
の側のヒトの皮膚中のＬＴによるランゲルハンス細胞の活性化（Ｃ，Ｅ）、およ
び対側性の腕からの皮膚中でのランゲルハンス細胞の活性化の欠落を示す図であ
る（Ｄ，Ｆ）。

【図２】図２ａ〜ｄはマウスの皮膚中の正常なランゲルハンス細胞（Ａ，
Ｂ，２００および４００倍）およびマウスの皮膚中のコレラ毒素によるランゲル
ハンス細胞の活性化（Ｃ，Ｄ，２００および４００倍）を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 (Ａ６１Ｋ 39/39 (Ａ６１Ｋ 39/39 39:02） 39:02） (Ａ６１Ｋ 39/39 (Ａ６１Ｋ 39/39 39:106） 39:106）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 DA02 EA10 GA13 HA17 4C076 AA72 BB31 CC03 DD37 DD40 FF34 4C085 AA08 BA02 BA07 BA49 BA51 BA99 BB03 BB12 BB13 BB21 BB50 CC07 CC08 EE05 EE06 FF11 FF14 FF21 GG10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】患者における高められた治療的に有効な免疫応答を誘導する
方法であって、ａ．患者の皮膚のある領域を前処置し；そしてｂ．前処置した領域に、１）治療的有効量の少なくとも１つの抗原２）該少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を促進するのに有効な量存在す
る少なくとも１つのアジュバント、及び３）患者の皮膚に対する医薬的に許容できる担体、を含む製剤を適用すことを含み、該前処置した領域は穿孔されていない方法。
【請求項２】前処置が該製剤の皮膚浸透を高める請求項１に記載の方法。
【請求項３】担体が貼付剤である請求項１に記載の方法。
【請求項４】貼付剤が、閉鎖性の包帯、非閉鎖性の包帯、ハイドロゲル包
帯、及びリザーバー包帯よりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】前処置が綿棒で前処置する領域をぬぐうことを含む請求項１
に記載の方法。
【請求項６】綿棒が、木綿、ナイロン、ウール、及びその組み合わせより
なる群から選択される材料よりなる請求項５に記載の方法。
【請求項７】綿棒が、アルコール又はアルコールを含む組成物で処理され
る請求項５に記載の方法。
【請求項８】綿棒が、アセトン又はアセトンを含む組成物で処理される請
求項５に記載の方法。
【請求項９】前処置が前処置する領域に界面活性剤又は界面活性剤溶液を
塗布することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】綿棒が界面活性剤又は界面活性剤溶液で処理される請求項
５に記載の方法。
【請求項１１】前処置が脱毛製剤を塗布し、前処置する領域に該製剤を約
０．１−３０分の期間残すことを含む請求項５に記載の方法。
【請求項１２】該期間が好ましくは約４−２０分である請求項１１に記載
の方法。
【請求項１３】該期間がより好ましくは約１２分である請求項１１に記載
の方法。
【請求項１４】前処置がケラチン溶解性製剤を塗布し、前処置する領域に
該製剤を約０．１−３０分の期間残すことを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】ケラチン溶解性製剤がサリチレートである請求項１４に記
載の方法。
【請求項１６】該期間が約４−２０分である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】該期間が約１０分である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】前処置が、破壊装置で前処置する領域の表面層を破壊する
ことを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】破壊装置が、エモリイボード、研磨パッド、ＴＢタイン試
験装置、ガスパウダーガン、ミクロニードル装置、及び粘着テープよりなる群か
ら選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】アジュバントが、細菌ＤＮＡ，サイトカイン、ケモカイン
、腫瘍壊死因子α、遺伝的に改変された毒素、化学的に結合した毒素、及びリポ
多糖よりなる群から選択される少なくとも一つである請求項１に記載の方法。
【請求項２１】治療的に有効な免疫応答がＬＮ細胞増殖をもたらす請求項
２０に記載の方法。
【請求項２２】アジュバントが、細菌ＤＮＡ，ＣｐＧ，サイトカイン、ケ
モカイン、腫瘍壊死因子α、遺伝的に改変された毒素、化学的に結合した毒素、
及びリポ多糖よりなる群から選択されるアジュバントの少なくとも二つの組み合
わせである請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】患者における高められた治療的に有効な免疫応答を誘導す
る方法であって、ａ．前処置した領域に、１）治療的有効量の少なくとも１つの抗原２）該抗原に対する免疫応答を促進するのに有効な量存在する少なくとも１つ
のアジュバント、及び３）患者の皮膚に対して医薬的に許容できる担体を含む製剤を適用し（前処置した領域は穿孔されていない)、そしてｂ．患者に別の抗原製剤を投与する、ことを含む方法。
【請求項２４】該別の抗原製剤が、前処置した領域への該製剤の適用後の
時間に投与され、該別の抗原製剤が患者における更なる免疫応答を提供する請求
項２３に記載の方法。
【請求項２５】該別の抗原製剤が、前処置した領域への該製剤の適用前の
時間に投与され、該別の抗原製剤が患者における更なる免疫応答を提供する請求
項２３に記載の方法。
【請求項２６】アジュバントが患者の皮膚の一部位に適用され、該抗原が
患者の皮膚の第２の部位に適用され、該第１部位及び第２部位の少なくとも１つ
は前処置した領域にある請求項1に記載の方法。
【請求項２７】抗原及びアジュバントの適用がほぼ同時に行なわれる請求
項２６に記載の方法。
【請求項２８】患者における高められた治療的に有効な免疫応答を誘導
する方法であって、ａ．患者の皮膚の領域を前処置し；ｂ．治療的有効量の少なくとも１つの抗原を投与し；そして有効量の少なくとも１つのアジュバントを投与する、ことを含み、該抗原及び該アジュバントの少なくとも１つは該前処置した領域に投与され、
前処置した領域は穿孔されていない方法。
【請求項２９】該抗原は該前処置した領域に投与され、該アジュバントは
筋肉内注射、経口、鼻、及び直腸よりなる群から選択される方法により投与され
る請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】該アジュバントは該前処置した領域に投与され、該抗原は
筋肉内注射、経口、鼻、及び直腸よりなる群から選択される方法により投与され
る請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】該抗原はリンパ球に対するランゲルハンス細胞の細胞表面
に存在し、それにより生体における免疫応答を誘導する請求項1に記載の方法。
【請求項３２】該アジュバントへの暴露がリンパ節へのランゲルハンス細
胞の移動を起す請求項1に記載の方法。
【請求項３３】該アジュバントへの暴露がランゲルハンス細胞に樹状細胞
へ成熟する信号を送る請求項1に記載の方法。
【請求項３４】抗原が病原体、腫瘍細胞および正常細胞からなる群から選
ばれる１つの起源から誘導される、請求項１の方法。
【請求項３５】抗原がバクテリア、ウイルス、真菌および寄生虫からなる
群から選ばれる１つの起源から誘導される、請求項１の方法。
【請求項３６】抗原が腫瘍抗原、自己抗原、アレルゲンおよび生物学的交
戦剤（warfare agent)からなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項３７】抗原が炭水化物、糖脂質、糖蛋白、脂質、リポ蛋白、リン
脂質およびポリペプチドからなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項３８】組成(formulation)が、さらに弱毒化生ウイルスを含み、そして抗原が弱毒化生ウイルスによって発現された、請求項１の方法。
【請求項３９】抗原が、多価(multivalent)である、請求項１の方法。
【請求項４０】主要組織適合性コンプレックスクラスII発現を増加させる
ために、さらにランゲルハンス細胞を活性化することを含む、請求項３１の方法
。
【請求項４１】アジュバントがランゲルハンス細胞を活性化する、請求項
３１の方法。
【請求項４２】アジュバントがリンパ球に抗原の存在を増強する、請求項
１の方法。
【請求項４３】アジュバントがＡＤＰ−リボシル化外毒素である、請求項
１の方法。
【請求項４４】アジュバントがコレラ毒素（ＣＴ）またはコレラ毒素Ｂサ
ブユニット（ＣＴＢ）である、請求項４３の方法。
【請求項４５】アジュバントが大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ
）または百日咳毒素である、請求項４３の方法。
【請求項４６】当該組成におけるアジュバントがＡＤＰ−リボシル化外毒
素をコードする核酸として提供される、請求項４３の方法。
【請求項４７】当該組成(formulation)における抗原が該抗原をコードする配列を含む核酸として提供される、請求項１の方法。
【請求項４８】該核酸が非組込み、かつ非感染である、請求項４７の方法
。
【請求項４９】該核酸が、さらに該抗原をコードする配列にオペラブリー
に連結した調節領域を含む、請求項１の方法。
【請求項５０】組成(formulation)がゲル、エマルジョンまたは軟膏である請求項１の方法。
【請求項５１】組成(formulation)が１つ以上のドレインイング(draining
)リンパ節領域をカバーする無傷の皮膚に適用される、請求項１の方法。
【請求項５２】皮膚に接着するに適した貼付剤、少なくとも１種のアジュ
バント、少なくとも１種の抗原と皮膚浸透増強剤を含むワクチン組成からなるワ
クチン投与用製品。
【請求項５３】皮膚浸透増強剤がアルコール、アセトン、洗浄剤、脱毛剤
および角質溶解剤(keratinolytic)からなる群から選ばれる、請求項５２の製品。
【請求項５４】アルコールとアセトンが綿棒に結合している、請求項５２
の製品。
【請求項５５】以下の方法からなる患者の病気の治療方法：ａ.患者の皮膚領域を前処置し、その際の該前処置は該治療の効果を増強するものであり、そして b. 該前処置領域に以下の組成の組成物を適用することからなる方法。ただし、該前処置の領域はせん孔されていない。１）少なくとも１種の抗原の治療的有効量、２）上記少なくとも１種の抗原に対し免疫応答を促進するに有効量存する少なく
とも１種のアジュバント、および３）該患者皮膚への薬学的に許容されるキャリアー。
【請求項５６】以下の方法からなる患者の病気の予防方法：ａ.患者の皮膚領域を前処置し、その際の該前処置は該治療の効果を増強するものであり、そして b. 該前処置領域に以下の組成の組成物を適用することからなる方法。ただし、該前処置の領域はせん孔されていない。１）少なくとも１種の抗原の治療的有効量、２）上記少なくとも１種の抗原に対し免疫応答を促進するに有効量存する少なく
とも１種のアジュバント、および３）該患者皮膚への薬学的に許容されるキャリアー。
【請求項５７】以下の方法からなる、患者を抗原に曝す患者の保護方法：
ａ.患者の皮膚領域を前処置し、その際の該前処置は該治療の効果を増強するものであり、そして b. 該前処置領域に以下の組成の組成物を適用することからなる方法。ただし、該前処置の領域はせん孔されていない。１）少なくとも１種の抗原の治療的有効量、２）上記少なくとも１種の抗原に対し免疫応答を促進するに有効量存する少なく
とも１種のアジュバント、および３）該患者皮膚への薬学的に許容されるキャリアー。
【請求項５８】以下の組成からなる組成物で、該組成物を無傷の皮膚に適
用したとき、該抗原に特異的な免疫応答を惹起する組成物：少なくとも１種の抗原、少なくとも１種のアジュバントおよび少なくとも１種の皮膚浸透増強剤。
【請求項５９】該皮膚浸透増強剤がアルコール、アセトン、洗浄剤、脱毛
剤および角質溶解剤(keratinolytic)からなる群から選ばれる、請求項５８の組成物。