WO2010013350A1 - Ｓ／ｏ型経皮免疫剤 - Google Patents

Ｓ／ｏ型経皮免疫剤 Download PDF

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WO2010013350A1
WO2010013350A1 PCT/JP2008/063910 JP2008063910W WO2010013350A1 WO 2010013350 A1 WO2010013350 A1 WO 2010013350A1 JP 2008063910 W JP2008063910 W JP 2008063910W WO 2010013350 A1 WO2010013350 A1 WO 2010013350A1
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WO
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antigen
surfactant
preparation
oil
type transdermal
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PCT/JP2008/063910
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後藤　雅宏
典穂 神谷
平田　彰彦
藤井　尊
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Ａｓｐｉｏｎ株式会社
国立大学法人九州大学
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    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers

Definitions

  • the present invention relates to an S / O type transdermal immunizing agent, and more particularly, to an S / O type transdermal immunizing agent that does not cause skin inflammation due to transcutaneous immunity and has increased antibody production.
  • Skin tissue acts as a physicochemical barrier that can non-specifically prevent the invasion of various infectious sources such as bacteria and viruses, and is also produced by subcutaneous administration of antigens that are part of pathogens. It also has the effect of specifically enhancing the so-called immune function that produces antibodies in the body.
  • transcutaneous immunization by subcutaneous injection requires high-purity antigens prepared aseptically, and in addition to the dangers of strong side effects and secondary infections due to needle sticks, it causes inflammation in the tissues administered subcutaneously. There was a problem of causing a lump.
  • Patent Document 1 the stratum corneum in the outermost layer of epidermal tissue is dissolved by some means (Patent Document 1), or a microprojection needle is perforated ( Patent Literature 2), rubbing (Patent Literature 3), and other methods are disclosed.
  • Patent Document 2 a microprojection needle is perforated
  • Patent Literature 3 rubbing
  • these methods do not use an injection needle, but, as with subcutaneous injection, remain physically invasive to the stratum corneum having a barrier action.
  • S / O (Solid-in-Oil) type preparations are mainly known as preparations with enhanced absorbability of enzymes, bioactive peptides, and hydrophilic drugs.
  • the S / O type formulation is a formulation in which a drug coated with a surfactant is dispersed and dissolved in an oily base material (oil phase) such as soybean oil. The drug is completely dissolved in the oil phase depending on the drug concentration and the like. Dissolved transparent S / O type preparations and suspension S / O type preparations in which a drug is dispersed in an oil phase are obtained.
  • FIG. 1 schematically shows the configuration of the S / O type preparation 10.
  • the drug 1 exists as a drug-containing complex (solid phase) 3 coated with a molecular film of a surfactant 2, and the drug-containing complex 3 is an oily base (oil phase).
  • oil phase oily base
  • Such an S / O type preparation is usually a drug in which a drug-containing aqueous solution and a surfactant-containing organic solvent solution are mixed. The resulting W / O emulsion is freeze-dried and the drug is coated with the surfactant 2.
  • Obtained complex (solid phase) is obtained by dissolving and dispersing this in the oil phase.
  • S / O type preparations are stable compared to emulsion preparations and liposomes because (a) the drug exists as a solid phase and is stable to hydrolysis, (b) excellent in thermal stability, (c) room temperature Can be stored for a long period of time, and (d) can be formulated into a tape.
  • the hydrophilic drug can be solubilized in the oily base material, and the leakage (leakage) of the drug can be prevented. Has been proposed so far.
  • Patent Document 8 discloses an S / O type preparation containing a protein composition such as insulin and a camptothecin derivative drug such as irinotecan hydrochloride, and an S / O type in which the S / O type preparation is further dispersed in an aqueous phase.
  • a / W type formulation is disclosed.
  • Patent Document 9 discloses an S / S coated with a surfactant in a mixture of a hydrophilic low molecular weight drug and a hydrophilic drug leakage inhibiting protein and / or a drug leakage inhibiting polysaccharide (stabilizer).
  • Patent Document 10 discloses an S / O-type external preparation in which the skin permeability of a hydrophilic drug such as NSAID is enhanced.
  • An object of the present invention is to provide a noninvasive transdermal system that does not cause inflammation or lump in the skin such as the stratum corneum as in the conventional percutaneous immunization method by subcutaneous administration, and has increased serum antibody production.
  • the object of the present invention is to physically dissolve, perforate, and scratch the stratum corneum that acts as a physicochemical barrier in the outermost layer of the epidermal tissue, as in the literature listed in the Background Art section. It is a highly safe non-invasive transcutaneous immunization method that is not destroyed by invasive means and does not use toxins derived from pathogenic microorganisms. It is an object to provide a novel transcutaneous immunization technique capable of effectively carrying out the above.
  • the S / O type transcutaneous immunizing agent of the present invention that has solved the above-mentioned problems includes a solid antigen-surfactant complex in which an antigen is coated with a surfactant, and an oil phase, and the solid The antigen-surfactant complex in a shape has a gist in that it is dissolved or dispersed in the oil phase.
  • the antigen is a protein or peptide.
  • the antigen is a live or inactivated bacterium and / or virus.
  • the antigen is derived from an animal or a plant.
  • the surfactant has an HLB value of 10 or less.
  • the oil phase is at least one selected from the group consisting of vegetable oils, animal oils, neutral lipids, and long-chain fatty acid esters.
  • the present invention also includes an S / O / W type transdermal immunizing agent in which the above S / O type transdermal immunizing agent is dispersed in an aqueous phase.
  • the transdermal immunizing agent of the present invention is very useful as a highly safe non-invasive immunogenic preparation or vaccine.
  • the transdermal immunizing agent of the present invention is not only useful for treatment such as protection against pathogenic bacteria and viruses and elimination from the body, but also provides immune tolerance by transdermally administering a small amount of antigen in several portions. It is also useful for inducing treatment.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a configuration of an S / O type preparation.
  • FIG. 2 is a view showing the particle size distribution of the preparation of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the time course of antibody amount in each administration group in Test Example 1.
  • FIG. 4A is a histopathological photograph (80 ⁇ ) of the preparation of the present invention (auricle application).
  • FIG. 4B is a histopathological photograph (400 times) of the preparation of the present invention (auricle application).
  • FIG. 5A is a histopathological photograph (80 ⁇ ) of the preparation of the present invention (back application).
  • FIG. 5B is a histopathological photograph (400 times) of the preparation of the present invention (back application).
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a configuration of an S / O type preparation.
  • FIG. 2 is a view showing the particle size distribution of the preparation of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the time course of antibody amount in each
  • FIG. 6A is a histopathological photograph (80 times) of Comparative preparation 1 (FCA added).
  • FIG. 6B is a histopathological photograph (200 ⁇ ) of Comparative preparation 1 (FCA added).
  • FIG. 6C is a histopathological photograph (400 times) of Comparative preparation 1 (FCA added).
  • FIG. 7A is a histopathological photograph (80 ⁇ ) of Comparative preparation 2 (without FCA addition).
  • FIG. 7B is a histopathological photograph (200 ⁇ ) of Comparative preparation 2 (without FCA addition).
  • FIG. 7C is a histopathological photograph (400 times) of Comparative preparation 2 (without FCA addition).
  • the transdermal immunizing agent of the present invention has the greatest feature when the antigen is converted to S / O by the S / O conversion technique described in Patent Document 7 described above.
  • Antigens typified by hydrophilic polymers such as proteins are inherently very low in skin permeability.
  • antigens are solubilized in an oily base material by S / O technology. It is considered that skin permeability is enhanced, skin inflammation is remarkably suppressed, and good antibody-producing ability is exhibited.
  • chicken egg white-derived lysozyme is used as an antigen, and the chicken lysozyme antigen is coated with a surfactant to form a W / O emulsion to make the antigen hydrophobic.
  • S / O transdermal immunizing agent S / O antigen
  • oil phase dispersion medium
  • the S / O type transdermal immunity agent of the present invention comprises a solid antigen-surfactant complex (A) in which an antigen (A-1) is coated with a surfactant (A-2), an oil phase ( B) and the solid antigen-surfactant complex (A) is dissolved or dispersed in the oil phase (B).
  • the antigen-surfactant complex (A) may contain a hydrophilic protein and / or a hydrophilic polysaccharide (A-3) as a stabilizer.
  • the preparation of the present invention is substantially the same as the S / O type preparation described in Patent Document 7 described above except that it contains an antigen instead of a drug in the S / O type preparation described in Patent Document 8 described above.
  • the configuration is the same.
  • each component will be specifically described.
  • the antigen-surfactant complex (hereinafter sometimes referred to as an antigen-containing complex) contains an antigen and a surfactant as main components. And it has the structure that the hydrophilic part of surfactant couple
  • the antigen-surfactant complex may be composed only of an antigen and a surfactant in order to prevent the particles from becoming too large, and a stabilizer or an antibody production enhancer as described later.
  • the composition may contain an adjuvant (auxiliary, which will be described later) used as a pharmaceutical preparation, or may contain a formulation component (addition component, which will be described later) which is acceptable in a pharmaceutical preparation.
  • the antigen used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that elicits a skin immune response and induces immunogenicity (antibody production).
  • Antigens, vaccines, immunogenic substances and the like used in the above are used.
  • proteins and peptides such as physiologically active substances (for example, lysozyme derived from chicken egg white, antigen domain peptides of cedar pollinosis, etc.), haptenizing substances bound with proteins and peptides, live or inactivated (dead) ) Bacteria or viruses (all) or partial degradation products thereof, and inactivated (dead) cancer cells (all), partial degradation products thereof, nucleic acids, and the like.
  • antigens those lacking antigenicity (for example, carbohydrates, lipids, inorganic substances, etc.) obtained by imparting antigenicity by means such as haptenization are also used as antigens.
  • the antigen either animal-derived or plant-derived is used.
  • the antigen may be a poultry / livestock antigen, a pet animal antigen, a cow antigen, a chicken antigen, a pig antigen, or an insect such as a tick.
  • the antigen may be derived from food.
  • a surfactant can be used without particular limitation as long as it is acceptable in pharmaceutical preparations. Examples thereof include nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants, and bile salts.
  • Nonionic surfactants include polyglycerin condensed ricinoleic acid ester, decaglycerin ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbite fatty acid ester, polyoxyethylene Castor oil / hardened castor oil, sucrose fatty acid ester (sucrose stearate ester, sucrose palmitate ester, sucrose myristic acid ester, sucrose oleate ester, sucrose laurate ester, sucrose erucate ester, sucrose Mixed fatty acid ester) and the like. One of these may be selected and used, or a mixture of two or more may be used.
  • ester compounds derived from unsaturated fatty acids such as erucic acid and oleic acid are suitable, and more preferably, sucrose erucic acid ester, sucrose oleic acid ester, sucrose mixed Examples include fatty acid esters. Or selected from the group consisting of glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene sorbit fatty acid ester, polyoxyethylene castor oil and hydrogenated castor oil 1 type (s) or 2 or more types can be used.
  • the surfactant it is preferable to use a highly hydrophobic one having an HLB value of 10 or less. This is because the antigen-containing complex can be easily dissolved or dispersed in the oil phase.
  • the antigen-containing complex (A) in the present invention has a structure in which the hydrophilic drug (A-1) is coated with the surfactant (A-2). Further, it may further contain a hydrophilic protein and / or a hydrophilic polysaccharide (A-3).
  • (A-3) Hydrophilic protein and / or hydrophilic polysaccharide as a stabilizer The above-mentioned stabilizer used in the present invention is coated with a surfactant together with an antigen to thereby form an antigen-containing complex. It has the effect of improving stability and, in particular, preventing leakage of the antigen out of the antigen-containing complex in the transdermal agent.
  • the stabilizer hydrophilic protein and / or polysaccharide
  • a protein having a number average molecular weight of about 10,000 or more is preferably used in order to effectively exert the drug leakage inhibiting action.
  • hydrophilic proteins examples include serum albumin (molecular weight: about 67,000), ovalbumin (molecular weight: about 45,000), casein (molecular weight: about 19,000 or more), lysozyme (molecular weight: about 14,000 or more), lipase (molecular weight: about 45,000), and the like.
  • serum albumin molecular weight: about 67,000
  • ovalbumin molecular weight: about 45,000
  • casein moleukin
  • lysozyme moleukin
  • lipase moleukin
  • lipase moleukin
  • hydrophilic proteins examples include serum albumin (molecular weight: about 67,000), ovalbumin (molecular weight: about 45,000), casein (molecular weight: about 19,000 or more), lysozyme (molecular weight: about 14,000 or more), lipase (molecular weight: about 45,000), and the like.
  • serum albumin molecular weight: about 67,000
  • ovalbumin moleukin
  • hydrophilic polysaccharides include maltose, sucrose, lactose, trehalose, cellobiose, pullulan, LM pectin, HM pectin, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, heparin, alginic acid, and carboxymethylcellulose.
  • One type can be selected, or two or more types can be selected and mixed for use.
  • one or more selected from the group consisting of sucrose, trehalose, pullulan, LM pectin, HM pectin and hydroxypropylmethylcellulose phthalate can be used.
  • the weight ratio of the stabilizer to the antigen is preferably in the range of 0.01 to 100. If it is less than 0.01, there is a possibility that the drug leakage inhibiting action in the transdermal agent may not be sufficiently exerted, and if it exceeds 100, the amount of the drug in the complex decreases, and the original effect of the drug is not obtained. This is because there are cases where it cannot be demonstrated. More preferably, it is in the range of 0.1 to 10, and still more preferably in the range of 0.5 to 5.
  • the weight ratio of the surfactant to the antigen and the stabilizer is preferably in the range of 0.5 to 100, more preferably in the range of 1 to 50, and still more preferably in the range of 2 to 25. .
  • the antigen-containing complex (A) in the present invention has a structure in which the antigen (A-1) is coated with the surfactant (A-2).
  • An adjuvant may be included for the purpose of increasing antibody production ability.
  • Adjuvants act as modulators to assist in the induction of an immune response and are usually administered with antigens, but in the present invention, adjuvants are used as optional components and are not essential components. As shown in the examples described later, it has been demonstrated that the use of the S / O type transdermal immunizing agent of the present invention increases the production of antibodies without the addition of an adjuvant.
  • the adjuvant used in the present invention is not particularly limited as long as it is usually used for subcutaneous injection or the like, and is typically a mixture of mineral oil, surfactant and heated tuberculosis killed by Freund (Freund's complete Adjuvant, FCA), heat-labile toxins such as cholera toxin and toxigenic E. coli.
  • FCA Full Adjuvant
  • heat-labile toxins such as cholera toxin and toxigenic E. coli.
  • FCA Full Adjuvant, FCA
  • FCA mixed adjuvant
  • a mutated detoxified cholera toxin or a mutated detoxified heat-resistant toxin which is detoxified by removing the ADP-ribosyltransferase activity which is diarrheagenic, and having an adjuvant activity, is also preferable.
  • an adjuvant was added together with the antigen, and an antigen-adjuvant-surfactant complex was obtained by the method described later. Thereafter, it may be dissolved or dispersed in an oil phase base material, or (b) an adjuvant-surfactant complex is prepared by a method similar to the preparation of an antigen-surfactant complex, and The antigen-surfactant complex may be dissolved or dispersed in the oil phase base material by the method described below.
  • the S / O type transdermal immunity agent of the present invention is a solution or suspension in which the antigen-containing complex described above is dissolved or dispersed in the oil phase. Whether it becomes a solution or a suspension depends on the type and amount of the surfactant and oil phase, the presence or absence of ultrasonic treatment, and the like.
  • the oil phase used in the present invention is not particularly limited as long as it is acceptable in pharmaceutical preparations.
  • vegetable oil, animal oil, neutral lipid (mono-substituted, di-substituted or tri-substituted glyceride), long chain fatty acid examples include esters, synthetic fats and oils, and sterol derivatives.
  • One of these may be selected and used, or two or more may be selected and mixed for use.
  • one or more selected from the group consisting of soybean oil, sesame oil, olive oil, safflower oil, sunflower oil, rapeseed oil and perilla oil are used.
  • triglyceride or a dietary oil containing this as a main component is used, and practically, soybean oil is preferable, and soybean oil purified to high purity is particularly preferable.
  • Neutral lipids or long-chain fatty acid esters can also be suitably used, more preferably long-chain fatty acid esters, and still more preferably isopropyl myristate (IPM).
  • the proportion of the oil phase in the S / O type transdermal immunity agent of the present invention varies depending on the type of oil component, other components, etc., but is preferably in the range of 50 to 99.5 w / v%, preferably 60 to 90 w. Within the range of / v% is preferable.
  • the S / O / W type preparation of the present invention is obtained by further dispersing the above S / O type transdermal immunizing agent in an aqueous phase.
  • the preparation has characteristics such as easy administration and high convenience.
  • the aqueous phase is not particularly limited as long as it is acceptable in pharmaceutical preparations. For example, pure water, purified water, distilled water, physiological saline, buffer solution, and the like can be used.
  • the method for producing the preparation of the present invention comprises (1) a step of preparing a W / O emulsion by mixing an antigen and a surfactant, and optionally an organic solvent solution containing an adjuvant or stabilizer, (2) the above A step of preparing an antigen-containing complex by drying the W / O emulsion of (3), and a step of dissolving or dispersing the antigen-containing complex in an oil phase.
  • (1) W / O type emulsion preparation step First, an antigen aqueous solution is prepared. Adjuvants and stabilizers are also added as necessary. Moreover, you may add the additive component accept
  • the concentration of the antigen in the aqueous solution is not particularly limited as long as these can be dissolved substantially completely, for example, about 0.1 to 30 mg / mL. It can be.
  • an organic solvent solution of the surfactant is not particularly limited as long as it can dissolve the surfactant and can be diffused and removed in the next step.
  • organic solvent used here is not particularly limited as long as it can dissolve the surfactant and can be diffused and removed in the next step.
  • alcohol such as methanol and ethanol
  • aliphatic hydrocarbon such as hexane
  • Aromatic hydrocarbons such as toluene
  • ester solvents such as ethyl acetate
  • halogenated aliphatic hydrocarbons such as methylene chloride.
  • concentration is not particularly limited, but can be, for example, about 1 to 10% by mass.
  • a W / O emulsion is prepared according to a conventional method using an aqueous solution of the above-described antigen (which may contain an adjuvant or a stabilizer) and an organic solvent solution of a surfactant.
  • a W / O type emulsion may be prepared by membrane emulsification using a porous membrane.
  • a porous membrane for example, a commercially available hydrophobic shirasu porous glass membrane (SPG, manufactured by SPG Techno) is preferably used. If this porous membrane is used, there is an advantage that dispersed phase particles (antigen-containing complex) having a particle size corresponding to the pore size of the porous glass membrane can be obtained.
  • the W / O emulsion obtained in the above step (1) is dried to obtain an antigen-containing complex.
  • the drying method is not particularly limited, and may be lyophilized or dried under reduced pressure, but lyophilization is preferable. Specific conditions may follow a conventional method.
  • S / O conversion is performed by dissolving or dispersing the antigen-containing complex obtained in the above step (2) in the oil phase.
  • high-speed stirring using a homogenizer may be used, stirring may be performed using a stirrer such as a propeller mixer or a disper, and ultrasonic waves may be irradiated in addition to these as necessary.
  • the amount of the oil phase used in the above step may be, for example, about 1 to 10 mL per 1 g of the antigen-containing complex, although it depends on the compatibility between the surfactant and the type of the oil phase.
  • the S / O type preparation thus obtained may be further converted into an S / O / W type preparation by dispersing in an aqueous phase according to a conventional method.
  • the solution or suspension may be applied as it is to a place where the skin is thin and easy to apply, such as the inner side of the arm, but it is preferably formulated by adding other additive components that are usually added as pharmaceuticals.
  • the additive component include excipients (for example, sugars such as sucrose; starch derivatives such as dextrin; cellulose derivatives such as carmellose sodium; water-soluble polymers such as xanthan gum), colorants, binders (for example, the aforementioned excipients and macrogol), emulsifiers, thickeners, wetting agents (eg, glycerin, etc.), stabilizers (eg, parahydroxybenzoates such as methylparaben and propylparaben; chlorobutanol, Alcohols such as benzyl alcohol and phenylethyl alcohol; benzalkonium chloride; phenols such as phenol and cresol; thimerosal; acetic anhydride; sorbic acid, etc.], preserv
  • the above solution or suspension and other additive components are mixed by conventional means according to each dosage form, and ointment, lotion, aerosol, plaster, aqueous cataplasm, cream, ointment, gel, plaster
  • the present invention is not limited to these agents, reservoir-type patches, matrix-type patches, and tapes.
  • the dose of the transdermal immunizing agent of the present invention may be appropriately adjusted according to the type and amount of antigen to be blended, the age and symptoms of the patient, and the like.
  • a transdermal immunizing agent containing only an antigen without an adjuvant it is generally in the range of 100 to 2000 ⁇ g, more preferably in the range of 100 to 500 ⁇ g per administration per adult. Therefore, it is preferable to administer at least twice over several weeks to several months.
  • it is usually in the range of 50 to 500 ⁇ g, more preferably in the range of 50 to 200 ⁇ g per adult, per administration, usually from several weeks to several It is preferable to administer at least twice over a month.
  • a transdermal immunization method using chicken egg white-derived lysozyme (Lysozyme from hen egg white, HEL) as a model antigen for S / O transcutaneous immunization and using a HEL-containing S / O transdermal immunization agent has been conventionally performed. It demonstrates that it does not develop skin inflammation like the subcutaneous immunization method, and is excellent in antibody production ability.
  • the composite was added with 4 mL of isopropyl myristate (IPM) and dispersed to obtain an S / O type composite suspension (formulation of the present invention) according to the present invention.
  • IPM isopropyl myristate
  • HEL is contained at a concentration of 0.5 mg / mL.
  • FIG. 2 shows the particle size distribution (frequency distribution) of the HEL-containing composite obtained by the above method.
  • the average particle size of the HEL-containing composite was measured by a laser scattering method (using a nano ZS device manufactured by Sysmex Corporation), and was 458.7 nm.
  • Comparative Formulation 1 As positive controls, Comparative Formulation 1 in which the same amount of HEL antigen and Freund's Complete Adjuvant (FCA) were added and emulsified, and Comparative Formulation 2 containing only HEL antigen were prepared.
  • FCA Freund's Complete Adjuvant
  • Comparative Formulation 1 was prepared by adding the same amount (2 mL) of FCA (stock solution) to a HEL-containing solution obtained by dissolving 2.0 mg of HEL in 2 mL of phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4).
  • Comparative preparation 2 was prepared in the same manner as comparative preparation 1 except that FCA was not added.
  • Test Example 1 4 male rabbits (New Zealand White) having a comparative body weight of about 2 kg of antibody production were prepared, 2 for the positive control group (Comparative preparations 1 and 2) and 2 for the experimental group (Preparation of the present invention). Feathers were assigned and administered as follows.
  • HEL phosphate buffered saline PBS, pH 7.4
  • PBS pH 7.4
  • a PBS solution containing BSA of 5.0 mg / mL
  • bovine serum albumin BovineBSerumSAAlbumin; BSA
  • the above microplate on which HEL is adsorbed was added at 200 ⁇ L / well for blocking (2 hours at 37 ° C.).
  • the microplate was carefully rinsed with PBS containing 0.2% Tween 80, and then an anti-rabbit IgG antibody derived from goat labeled with alkaline phosphatase (AP) was added to What was diluted 5,000 times with PBS containing 1% BSA was added to cause sufficient antigen-antibody reaction (37 ° C., 2 hours).
  • AP alkaline phosphatase
  • FIG. 3 collectively shows the results of the positive control group and the experimental group. From the left side, the comparative preparation 2 (subcutaneous injection without adjuvant), the comparative preparation 1 (subcutaneous injection with adjuvant), and the preparation of the present invention ( The results of the auricle application) and the preparation of the present invention (back application) are shown.
  • Comparative Formulations 1 and 2 which were percutaneously immunized by subcutaneous injection as in the prior art, an increase in the amount of anti-HEL antibody was observed in both the first immunization and the second immunization.
  • Comparative preparation 1 to which an adjuvant was added a significant increase in the amount of antibody was observed in the first immunization.
  • Test Example 2 Macroscopic observation regarding stimulation of administration site The administration site of each rabbit in the experimental group and the positive control group was macroscopically observed during the first immunization.
  • Comparative Formulation 1 and Comparative Formulation 2 which were subcutaneously injected into the back of the rabbit, a clear lump-like lump occurred from the first immunization, and in particular, in Comparative Formulation 1 in which the adjuvanted antigen was subcutaneously injected, The degree was remarkable (not shown).
  • the preparation of the present invention was administered, not only in the case of applying the back part, but also in the case of applying to the boat-like vortex of the auricle that is sensitive to irritation, no vascular anger or hyperemia was observed. No skin irritation was observed.
  • the skin of each rabbit on the 66th day after administration was stained with hematoxylin and eosin (HE) to prepare a histopathological specimen, followed by observation with an optical microscope (magnification 80 times, 200 And 400 times) to examine skin inflammation.
  • 4 to 7 show pathological photographs of the preparation of the present invention (auricle application), the preparation of the present invention (back application), comparative preparation 1 and comparative preparation 2, respectively.
  • FIG. 4 is a histopathological photograph of the preparation of the present invention (auricle application), FIG. 4A is an enlarged photograph of 80 times, and FIG. 4B is a magnified photograph of 400 times. As shown in FIGS. 4A and 4B, no inflammation was observed in the skin subjected to the pinna application, and normal epidermis, dermis layer, and subcutaneous tissue containing fat were observed.
  • FIG. 5 is a histopathological photograph of the preparation of the present invention (back application), FIG. 5A is an enlarged photograph of 80 times, and FIG. 5B is an enlarged photograph of 400 times (as shown in FIGS. 5A to 5B).
  • the skin did not show any inflammation, and normal epidermis, dermis layer, and subcutaneous tissue containing fat were observed.
  • FIG. 4 and FIG. 5 when transcutaneous immunization was performed using the preparation of the present invention, no inflammation of the skin was observed in either the auricle application or the back application.
  • FIG. 6 is a histopathological photograph of Comparative Preparation 1 (FCA added), FIG. 6A is an enlarged photograph of 80 times, FIG. 6B is 200 times, and FIG. 6C is 400 times. From the figure, a large cyst was observed in the dermis layer (see FIG. 6A), and necrotic tissue was observed around the large cyst (see FIG. 6B). In addition, as shown in FIG. 6C, inflammation is seen in a wide range from the dermis layer to the subcutaneous tissue, and the thickness is remarkably thickened. At these sites, large swollen macrophages and swollen macrophage populations were observed, with cell infiltration in the meantime.
  • FIG. 7 is a histopathological photograph of Comparative Preparation 2 (without FCA addition), FIG. 7A is an enlarged photograph of 80 times, FIG. 7B is 200 times, and FIG. 7C is 400 times. As shown in these figures, a slight thickening is observed in a part of the epidermis (the left end of FIGS. 7A, 7B, and 7C), and in the lower dermis layer, young fibroblasts run densely. With mild cell infiltration.

Abstract

　皮下投与による従来の経皮免疫法のように、皮膚に炎症やしこりなどを発生させることなく、血清中の抗体産生を高めることのできる非侵襲性経皮免疫技術を提供する。本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤は、抗原が界面活性剤によって被覆された固体状の抗原－界面活性剤複合体と油相とを含み、固体状の抗原－界面活性剤複合体は、油相に溶解または分散している。

Description

Ｓ／Ｏ型経皮免疫剤
　本発明は、Ｓ／Ｏ型経皮免疫剤に関し、詳細には、経皮免疫による皮膚の炎症を発症せず、抗体の産生も高められたＳ／Ｏ型経皮免疫剤に関するものである。
　皮膚組織は、細菌やウイルスなどを始めたとした様々な感染源の侵入を非特異的に防止し得る物理化学的バリアとして作用するほか、病原体の一部である抗原を皮下投与するなどして生体内に抗体を産生する、所謂免疫機能を特異的に高める作用も有している。
　ところが、皮下注射による経皮免疫では、無菌的に作成した高純度の抗原を必要とするほか、強い副作用、針刺しによる二次感染などの危険性に加えて、皮下投与した組織内で炎症を起こし、しこりなどを生じるといった問題があった。
　そこで、注射針を用いた皮下投与に代わる経皮免疫法として、表皮組織の最外層にある角質層を何らかの手段で溶解したり（特許文献１）、微小な突起状の針を穿孔したり（特許文献２）、擦過したりする（特許文献３）などの方法が開示されている。しかしながら、これらの方法は、注射針を使わないというだけで、皮下注射と同様、バリア作用を有する角質層を物理的に侵襲するものであることに変わりない。
　上記とは異なり、抗原を皮膚へ物理的に侵襲させない非侵襲経皮免疫法として、病原微生物由来のトキシンを利用する方法（例えば、特許文献４～７、非特許文献１～３など）が開示されているが、病原微生物由来のトキシンを使用している点で、安全性に問題がある。
　一方、主に、酵素や生理活性ペプチド、親水性薬剤の吸収性を高めた製剤として、Ｓ／Ｏ（Solid in Oil）型製剤が知られている。Ｓ／Ｏ型製剤は、界面活性剤でコーティングした薬物を大豆油などの油状基材（油相）に分散・溶解させた製剤であり、薬物濃度などに応じて、薬物が油相に完全に溶解した透明なＳ／Ｏ型製剤や、薬物が油相に分散したサスペンジョン状態のＳ／Ｏ型製剤が得られる。
　図１に、Ｓ／Ｏ型製剤１０の構成を模式的に示す。図１に示すように、薬物１は、界面活性剤２の分子膜でコーティングされた薬剤含有複合体（固相）３として存在しており、薬剤含有複合体３は、油状基材（油相）４中に分散した状態で存在する。このようなＳ／Ｏ型製剤は、通常、薬物含有水溶液と界面活性剤含有有機溶媒溶液とを混合→得られるＷ／Ｏ型エマルションを凍結乾燥し、薬物が界面活性剤２でコーティングされた薬剤含有複合体（固相）を得る→これを油相に溶解・分散させる、ことによって得られる。Ｓ／Ｏ型製剤は、エマルション製剤やリポソームに比べ、(ａ)薬物は固相として存在するために加水分解に対して安定である、（ｂ）熱安定性に優れている、（ｃ）室温での長期保存が可能である、（ｄ）テープ製剤化が可能である、などの利点を有している。
　特に、上記のＳ／Ｏ化技術を用いれば、親水性薬剤を油状基材に可溶化でき、薬物の漏洩（漏出）を防止できることから、親水性薬剤の漏洩が抑制されたＳ／Ｏ型製剤がこれまでに提案されている。
　本発明者も、例えば、特許文献８～１０に記載のＳ／Ｏ型製剤を提案している。このうち、特許文献８には、インスリンなどのタンパク質組成物や塩酸イリノテカンなどのカンプトテシン誘導体の薬物を含むＳ／Ｏ型製剤や、当該Ｓ／Ｏ型製剤を更に水相に分散させたＳ／Ｏ／Ｗ型製剤が開示されている。また、特許文献９には、親水性低分子薬剤を、親水性の薬剤漏出抑制性タンパク質及び／又は薬剤漏出抑制性多糖類（安定化剤）と配合した混合物を界面活性剤で被覆したＳ／Ｏ化技術が開示されており、これにより、強酸性環境下での低分子薬剤の漏出は顕著に低減され、弱酸性から中性環境下にある腸管等との接触下での低分子薬剤の放出が顕著に促進されることが開示されている。このＳ／Ｏ化技術は、特に、水溶性非ステロイド消炎鎮痛剤（以下、「ＮＳＡＩＤｓ」という。）であるジクロフェナクナトリウム（ＤＦＮａ）やアスピリンなどのように、胃潰瘍などの深刻な胃粘膜障害発生が懸念される薬剤に対して極めて有効である。また、特許文献１０には、ＮＳＡＩＤなどの親水性薬剤の皮膚透過性が高められたＳ／Ｏ型外用剤が開示されている。
特表２００２－５０４５２２号公報 特表２００５－３３４５９４号公報 特表２００５－５１１２４８号公報 特開２００５－１７９３０１号公報 特表２００４－５３６８０４号公報 特表２００５－５０４００２号公報 特表２００６－５０３０７２号公報 特開２００４－４３３５５号公報 国際公開第２００５／０９４７８９号パンフレット 国際公開第２００６／０２５５８３号パンフレット F. Mawas et al., The Journal of Infection Disease, 190; 1177-1182. 2004 M.Guebre-Xabier, et al., Journal of Virology, 78: 7640-7618, 2004 G.M. Glenn, et al., Nature Med. 6(12): 1403-1406, 2000
　本発明の目的は、従来の皮下投与による経皮免疫法の如く、角質層などの皮膚に炎症やしこりなどを発生させることなく、しかも、血清中の抗体産生が高められた非侵襲性経皮免疫技術を提供することにある。詳細には、本発明の目的は、前記背景技術の欄に掲げた文献のように、表皮組織の最外層にあり物理化学的バリアとして作用する角質層を溶解・穿孔・擦過するなどの物理的侵襲手段によって破壊することなく、また、病原微生物由来のトキシンを使用することのない、安全性の高い非侵襲性経皮免疫法であって、抗体産生能にも優れているために経皮免疫を効果的に行なうことが可能な、新規の経皮免疫技術を提供することにある。
　上記課題を解決することのできた本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤は、抗原が界面活性剤によって被覆された固体状の抗原－界面活性剤複合体と、油相とを含み、前記固体状の抗原－界面活性剤複合体は、油相に溶解または分散しているところに要旨を有している。
　好ましい実施形態において、上記抗原は、タンパク質またはペプチドである。
　好ましい実施形態において、上記抗原は、生または不活性化された細菌及び／又はウイルスである。
　好ましい実施形態において、上記抗原は、動物由来または植物由来である。
　好ましい実施形態において、上記界面活性剤のＨＬＢ価が１０以下である。
　好ましい実施形態において、上記油相は、植物油、動物油、中性脂質、および長鎖脂肪酸エステルよりなる群から選択される少なくとも一種である。
　本発明は、上記のＳ／Ｏ型経皮免疫剤が水相に分散しているＳ／Ｏ／Ｗ型経皮免疫剤も包含している。
　本発明によれば、従来の皮下注射による経皮免疫法と同様、抗体の産生が高められるだけでなく、皮下注射による問題点（皮膚組織の炎症発生、針刺し事故の発生、物理化学的バリアである角質層の溶解や破壊など）をすべて解消することができる。従って、本発明の経皮免疫剤は、極めて安全性の高い非侵襲性の免疫原性製剤またはワクチンとして非常に有用である。
　本発明の経皮免疫剤は、病原性細菌やウイルスの感染防御や体内からの排除といった治療に有用であるだけでなく、少量の抗原を数回に分けて経皮投与することによって免疫寛容を惹起させる治療法にも有用である。
図１は、Ｓ／Ｏ型製剤の構成を模式的に示す図である。 図２は、本発明製剤の粒度分布を示す図である。 図３は、試験例１における各投与群の抗体量の経時的推移を示す図である。 図４Ａは、本発明製剤（耳介塗布）の病理組織写真（８０倍）である。 図４Ｂは、本発明製剤（耳介塗布）の病理組織写真（４００倍）である。 図５Ａは、本発明製剤（背部塗布）の病理組織写真（８０倍）である。 図５Ｂは、本発明製剤（背部塗布）の病理組織写真（４００倍）である。 図６Ａは、比較製剤１（ＦＣＡ添加）の病理組織写真であり（８０倍）である。 図６Ｂは、比較製剤１（ＦＣＡ添加）の病理組織写真（２００倍）である。 図６Ｃは、比較製剤１（ＦＣＡ添加）の病理組織写真（４００倍）である。 図７Ａは、比較製剤２（ＦＣＡ添加なし）の病理組織写真（８０倍）である。 図７Ｂは、比較製剤２（ＦＣＡ添加なし）の病理組織写真（２００倍）である。 図７Ｃは、比較製剤２（ＦＣＡ添加なし）の病理組織写真（４００倍）である。
符号の説明
　１　薬物
　２　界面活性剤
　３　薬剤含有複合体（固相）
　４　油状基材（油相）
　１０　Ｓ／Ｏ型製剤
　本発明の経皮免疫剤は、前述した特許文献７に記載のＳ／Ｏ化技術によって抗原をＳ／Ｏ化させたところに最大の特徴がある。タンパク質などの親水性高分子に代表される抗原は、本来、皮膚透過性が非常に低いが、本発明では、Ｓ／Ｏ化技術によって抗原が油状基材に可溶化されているため、抗原の皮膚透過性が高められ、皮膚の炎症が顕著に抑えられると共に、良好な抗体産生能が発揮されると考えられる。具体的には、後記する実施例に示すように、抗原として鶏卵白由来リゾチームを用い、この鶏リゾチーム抗原を界面活性剤で被覆してＷ／Ｏ型エマルションにして抗原を疎水性に変化させ、これを植物油などの油相（分散媒）に分散させたＳ／Ｏ化経皮免疫剤（Ｓ／Ｏ化抗原）をウサギの耳介または背部に塗布して経皮免疫を行なったところ、従来の皮下免疫法に比べ、皮下に炎症やしこりを発生することなく、血清中に鶏リゾチームに特異的な抗体が産生することが判明した。
　本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤は、抗原（Ａ－１）が界面活性剤（Ａ－２）によって被覆された固体状の抗原－界面活性剤複合体（Ａ）と、油相（Ｂ）とを含んでおり、固体状の抗原－界面活性剤複合体（Ａ）は、油相（Ｂ）に溶解または分散しているものである。好ましくは、抗原－界面活性剤複合体（Ａ）は、安定化剤として、親水性のタンパク質および／または親水性の多糖類（Ａ－３）を含んでいてもよい。
　本発明製剤は、前述した特許文献８に記載のＳ／Ｏ型製剤において、薬剤の代わりに抗原を含有すること以外は、実質的に、前述した特許文献７に記載されたＳ／Ｏ型製剤の構成と同じである。以下、各構成要件について具体的に説明する。
　（Ａ）抗原－界面活性剤複合体
　抗原－界面活性剤複合体（以下、抗原含有複合体と呼ぶ場合がある。）は、抗原と界面活性剤を主な構成成分として含んでいる。そして、抗原に界面活性剤の親水性部分が会合し、周りを被覆するという構成を有している。抗原－界面活性剤複合体は、粒子が大きくなり過ぎるのを防ぐために、抗原と界面活性剤のみからなるものであってもよいし、また、後記するように安定化剤や、抗体産生増強剤として使用されるアジュバント（助剤、後記する。）を含んでいてもよいし、医薬用製剤において許容される製剤成分（添加成分、後記する。）を含んでいてもよい。
　（Ａ－１）抗原
　本発明に用いられる抗原は、皮膚の免疫応答を惹起する物質であって、免疫原性（抗体産生）を誘導するものであれば特に限定されず、従来の経皮免疫などに用いられる抗原やワクチン、免疫原性物質などが用いられる。具体的には、例えば、生理活性物質などのタンパク質やペプチド（例えば、鶏卵白由来リゾチーム、スギ花粉症の抗原領域ペプチドなど）、タンパク質やペプチドを結合したハプテン化物質、生または不活性化（死滅）された細菌やウイルス（全部）若しくはこれらの部分分解物、更には、不活性化（死滅）させた癌細胞（全部）やその部分分解物、核酸などが挙げられる。また、抗原性に欠けるもの（例えば、糖質や脂質、無機物など）にハプテン化などの手段によって抗原性を付与させたものも抗原として用いられる。抗原は、動物由来または植物由来のいずれもが用いられる。例えば、抗原は、家禽・家畜用抗原、愛玩動物用抗原であっても良いし、牛用抗原、鶏用抗原、豚用抗原であっても良いし、ダニなどの昆虫由来であっても良い。また、抗原は、食物由来のものであっても良い。
　（Ａ－２）界面活性剤
　界面活性剤は、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限なく用いることができる。例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、胆汁酸塩を挙げることができる。
　非イオン性界面活性剤としては、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、デカグリセリンエステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油・硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル（ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖オレイン酸エステル、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖エルカ酸エステル、ショ糖混合脂肪酸エステル）等を挙げることができる。これらから１種を選択して用いるか、或いは２種以上の混合物を用いてもよい。
　これら非イオン性界面活性剤としては、エルカ酸やオレイン酸などの不飽和脂肪酸を原料とするエステル化合物が好適であり、より好ましくは、ショ糖エルカ酸エステル、ショ糖オレイン酸エステル、ショ糖混合脂肪酸エステルが挙げられる。または、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油および硬化ヒマシ油よりなる群から選択される１種または２種以上を用いることができる。
　また、界面活性剤としては、ＨＬＢ価１０以下という疎水性の高いものを用いるのが好ましい。抗原含有複合体の油相への溶解または分散を容易にできるからである。
　本発明における抗原含有複合体（Ａ）は、上記のように、親水性薬剤（Ａ－１）が界面活性剤（Ａ－２）によって被覆された構造を有しているが、安定化剤として、親水性のタンパク質および／または親水性の多糖類（Ａ－３）を更に含んでいてもよい。
　（Ａ－３）安定化剤として、親水性のタンパク質および／または親水性の多糖類
　本発明に用いられる上記の安定化剤は、抗原と共に界面活性剤により被覆されることによって抗原含有複合体の安定性を向上させ、特に、経皮剤中で抗原含有複合体外への抗原の漏出などを防止する作用を有するものである。上記安定化剤（親水性のタンパク質及び／又は多糖類）は、医薬用製剤の成分として許容されるものであれば特にその種類は問わない。但し、薬剤漏出抑制作用を有効に発揮させるために、タンパク質の数平均分子量は約１０，０００以上のものを好適に用いる。
　このうち、親水性のタンパク質としては、例えば、血清アルブミン（分子量：約６７，０００）、オボアルブミン（分子量：約４５，０００）、カゼイン（分子量：約１９，０００以上）、リゾチーム（分子量：約１４，０００以上）、リパーゼ（分子量：約４５，０００）などを挙げることができ、これらから１種を選択するか、または２以上を選択の上混合して用いることができる。好適には、血清アルブミン、オボアルブミンおよびカゼインよりなる群から選択される１種または２種以上を用いることができる。
　また、親水性の多糖類としては、例えば、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セロビオース、プルラン、ＬＭペクチン、ＨＭペクチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヘパリン、アルギン酸およびカルボキシメチルセルロースなどを挙げることができ、これらから１種を選択するか、または２以上を選択の上混合して用いることができる。好適には、スクロース、トレハロース、プルラン、ＬＭペクチン、ＨＭペクチンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートよりなる群から選択される１種または２種以上を用いることができる。
　本発明に用いられる抗原含有複合体において、抗原に対する安定化剤の重量比は、０．０１～１００の範囲が好ましい。０．０１未満であれば、経皮剤中における薬剤漏出抑制作用が十分に発揮されないおそれがあるからであり、また、１００を超えると複合体に占める薬剤量が少なくなり、薬剤本来の効果が発揮できない場合があるからである。より好ましくは、０．１～１０の範囲であり、更に好ましくは、０．５～５の範囲内である。
　また、抗原と安定化剤に対する界面活性剤の重量比は、０．５～１００の範囲が好ましく、より好ましくは、１～５０の範囲であり、更に好ましくは、２～２５の範囲内である。
　（Ａ－４）その他
　本発明における抗原含有複合体（Ａ）は、上記のように、抗原（Ａ－１）が界面活性剤（Ａ－２）によって被覆された構造を有しているが、抗体の産生能を高める目的で、アジュバントを含んでいてもよい。アジュバントは、免疫応答の誘導を補助する調節因子として作用し、通常、抗原と共に投与されるが、本発明では、アジュバントは選択成分として用いられ、必須成分ではない。後記する実施例に示すように、本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤を用いれば、アジュバントを添加しなくても抗体の産生が高められることを実証している。
　本発明に用いられるアジュバントは、皮下注射などに通常用いられるものであれば特に限定されず、代表的には、Ｆｒｅｕｎｄによって開発された鉱物油、表面活性剤および加熱結核死菌の混合物（フロイント完全アジュバント、ＦＣＡ）、コレラ毒素や毒素原性大腸菌などの易熱性毒素が挙げられる。また、下痢原性であるＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ活性が除去されて無毒化され、しかも、アジュバント活性を有する変異型無毒化コレラ毒素、あるいは、変異型無毒化易熱性毒素なども好ましく例示される。
　アジュバントを添加して本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤を調製するに当たっては、（ａ）アジュバントを抗原と一緒に添加し、後記する方法によって抗原－アジュバント－界面活性剤複合体を得た後、油相基材に溶解または分散させてもよいし、あるいは、（ｂ）抗原－界面活性剤複合体の調製と同様の方法によってアジュバント－界面活性剤複合体を調製した後、これと、抗原－界面活性剤複合体とを、後記する方法によって油相基材に溶解または分散させてもよい。
　（Ｂ）油相
　本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤は、前述した抗原含有複合体が、油相に溶解または分散している溶液またはサスペンションである。溶液となるかサスペンションとなるかは、界面活性剤や油相の種類や量、超音波処理の有無などに依存する。
　本発明に用いられる油相は、医薬用製剤において許容されるものであれば特に制限はなく、例えば、植物油、動物油、中性脂質（モノ置換、ジ置換またはトリ置換のグリセライド）、長鎖脂肪酸エステル、合成油脂、ステロール誘導体を挙げることができる。
　具体的には、大豆油、綿実油、菜種油、ゴマ油、コーン油、落花生油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ナタネ油、シソ油、ウイキョウ油、カカオ油、ケイヒ油、ハッカ油、ベルガモット油、等の植物油；牛脂、豚油、魚油等の動物油；中鎖脂肪酸トリグリセリド、トリオレイン、トリリノレイン、トリパルミチン、トリステアリン、トリミリスチン、トリアラキドニン等の中性脂質；アゾン等の合成脂質；コレステリルオレエート、コレステリルリノレート、コレステリルミリステート、コレステリルパルミデート、コレスレリルアラキデート等のステロール誘導体；ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸セチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチル、リノール酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル等の長鎖脂肪酸エステル；乳酸エチル、乳酸セチル等の乳酸エステル；クエン酸トリエチル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジエチル、セバシン酸ジイソプロピル等の多価カルボン酸エステル；２－エチルヘキサン酸セチル等のその他のカルボン酸のエステル；ワセリン、パラフィンスクワラン等の炭化水素類；シリコーン類などを挙げることができる。これらから１種を選択して用いてもよいし、２種以上を選択し混合して用いてもよい。好適には、大豆油、ゴマ油、オリーブ油、サフラワー油、サンフラワー油、ナタネ油およびシソ油よりなる群から選択される１種または２種以上を用いる。特に好適には、トリグリセライドやこれを主成分とする食物油を用い、実用的には、大豆油が好ましく、特に、高純度に精製された大豆油が好ましい。また、中性脂質または長鎖脂肪酸エステルも好適に使用でき、より好ましくは長鎖脂肪酸エステル、さらに好ましくはミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）を使用できる。
　本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤に占める油相の割合は、油成分の種類や他の構成成分等によって異なるが、５０～９９．５ｗ／ｖ％の範囲内が好ましく、６０～９０ｗ／ｖ％の範囲内が好ましい。
　本発明のＳ／Ｏ／Ｗ型製剤は、上記Ｓ／Ｏ型経皮免疫剤をさらに水相へ分散させたものである。当該製剤は、投与し易いことや、利便性が高いといった特性を有するものである。
　水相としては、医薬用製剤において許容されるものであれば特に種類は問わないが、例えば、純水、精製水、蒸留水、生理食塩水、緩衝液などを使用することができる。
　次に、本発明のＳ／Ｏ型経皮免疫剤を製造する方法について説明する。
　本発明製剤の製造方法は、（１）抗原と界面活性剤、必要に応じてアジュバントや安定化剤を含む有機溶媒溶液とを混合してＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程、（２）上記のＷ／Ｏ型エマルションを乾燥して抗原含有複合体を調製する工程、（３）上記抗原含有複合体を油相に溶解または分散させる工程、を包含している。
　（１）Ｗ／Ｏ型エマルション調製工程
　ここでは、先ず、抗原の水溶液を調製する。必要に応じて、アジュバントや安定化剤も添加する。また、医薬製剤において許容される添加成分を添加してもよい。ここで使用する水としては、例えば、純水、精製水、蒸留水、生理食塩水、緩衝液を挙げることができる。必要に応じて、エタノールなど水混和性の有機溶媒を少量添加してもよい。但し、アルコール等を加え過ぎるとエマルションが形成され難くなる場合があるので注意が必要である。
　上記水溶液における抗原の濃度（アジュバントや安定化剤を更に添加する場合は、これらの合計濃度）は、これらを実質的に完全に溶解できれば特に制限されないが、例えば、０．１～３０ｍｇ／ｍＬ程度とすることができる。
　別途、界面活性剤の有機溶媒溶液を調製する。ここで用いる有機溶媒は、界面活性剤を溶解することができ、且つ次工程で拡散除去できるものであれば特に制限されないが、例えば、メタノールやエタノール等のアルコール；ヘキサン等の脂肪族炭化水素；トルエン等の芳香族炭化水素；酢酸エチルエステル等のエステル系溶剤；塩化メチレン等のハロゲン系脂肪族炭化水素などを挙げることができる。また、その濃度も特に制限されないが、例えば、１～１０質量％程度にすることができる。
　次に、上記の抗原（アジュバントや安定化剤を含む場合もある）の水溶液、および界面活性剤の有機溶剤溶液を用い、常法に従ってＷ／Ｏ型エマルションを調製する。例えば、ホモジェナイザーによる高速撹拌を用いたり、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により撹拌したり、これらに加えて超音波を照射したりすればよい。あるいは、多孔質膜を用いた膜乳化によってＷ／Ｏ型エマルションを調製してもよい。多孔質膜として、例えば、市販の疎水性のシラス多孔質ガラス膜（ＳＰＧ、ＳＰＧテクノ社製）を用いることが好ましい。この多孔膜を用いれば、多孔質ガラス膜の細孔径に対応する粒径の分散相粒子（抗原含有複合体）が得られるという利点がある。
　（２）乾燥工程
　ここでは、上記工程（１）で得られたＷ／Ｏ型エマルションを乾燥し、抗原含有複合体を得る。乾燥方法は特に制限されず、凍結乾燥や減圧乾燥すればよいが、凍結乾燥が好ましい。具体的な条件は、常法に従えばよい。また、当該工程では、水分と有機溶媒を実質的に完全に除去することが好ましい。残存する水分は、タンパク質や抗原の加水分解を生む原因となる可能性があるからであり、また、有機溶媒は、敢えて言うわけでもなく、生体に悪影響を及ぼす可能性があるからである。具体的には、例えば、カールフィッシャー法による測定で、含水率が１％以下になる程度にすればよい。
　（３）分散工程
　ここでは、上記工程（２）で得られた抗原含有複合体を油相に溶解または分散することによってＳ／Ｏ化を行なう。具体的には、ホモジェナイザーによる高速攪拌を用いたり、プロペラミキサーやディスパー等の撹拌機により攪拌したり、必要に応じて、これらに加えて超音波を照射するなどすればよい。
　上記工程で使用する油相の量は、界面活性剤と油相の種類との相性などにもよるが、例えば、抗原含有複合体１ｇ当たり、１～１０ｍＬ程度にすればよい。
　このようにして得られたＳ／Ｏ型製剤は、さらに常法に従って水相に分散することによって、Ｓ／Ｏ／Ｗ型製剤としてもよい。
　上記溶液またはサスペンションは、そのまま、腕の内側など皮膚が薄く、塗布しやすい場所へ、そのまま塗布してもよいが、好ましくは、医薬として通常添加される他の添加成分を添加して製剤化する。上記の添加成分としては、例えば、賦形剤（例えば、白糖などの糖類；デキストリンなどのデンプン誘導体；カルメロースナトリウムなどのセルロース誘導体；キサンタンガムなどの水溶性高分子等）、着色剤、結合剤（例えば、前記の賦形剤やマクロゴール等）、乳化剤、増粘剤、湿潤剤（例えば、グリセリン等）、安定剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；無水酢酸；ソルビン酸等）、保存剤、溶剤（例えば、水、グリセリン、エタノールやオレイルアルコールなどの高級アルコール類等）、溶解補助剤、懸濁化剤（例えば、カルメロースナトリウム等）、緩衝剤、ｐＨ調整剤、基剤（例えば、ポリエチレングリコール、クロタミトン、セバシン酸ジエチル、ワセリン等）、ワセリンやマイクロクリスタンワックスなどの炭化水素類、ホホバアブアラやゲイロウなどのエステル類、牛脂やオリーブ油などのトリグリセリド類、メントールなどの吸収促進剤、等張化剤、有機溶媒、界面活性剤などを挙げることができ、これらを通常の配合量で配合できる。
　各剤形に応じた常套手段によって、上記溶液またはサスペンションと他の添加成分を混合して、軟膏剤、ローション剤、エアゾール剤、硬膏剤、水性パップ剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、プラスター剤、リザーバー型貼付剤、マトリックス型貼付剤、テープ剤などとすることができるが、これらに限定されない。
　本発明経皮免疫剤の投与量は、配合する抗原の種類や量、また、患者の年齢や症状などに応じて適宜調整すればよい。例えば、アジュバントを含まず抗原のみを含む経皮免疫剤の場合は、通常、成人１人あたり、１回の投与につき、おおむね、１００～２０００μｇの範囲、より好ましくは、おおむね、１００～５００μｇの範囲で、数週間から数ヶ月にわたって、少なくとも２回以上投与することが好ましい。また、抗原とアジュバントの両方を含む場合は、通常、成人１人あたり、１回の投与につき、おおむね、５０～５００μｇの範囲、より好ましくは、おおむね、５０～２００μｇの範囲で、数週間から数ヶ月にわたって、少なくとも２回以上投与することが好ましい。
　以下、実施例および試験例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
　以下では、Ｓ／Ｏ化経皮免疫のモデル抗原として鶏卵白由来リゾチーム（Lysozyme from hen egg white、ＨＥＬ)を用い、ＨＥＬ含有Ｓ／Ｏ化経皮免疫剤を用いた経皮免疫法が、従来の皮下免疫方法のように皮膚の炎症も発症せず、抗体産生能にも優れていることを実証する。
　（本発明製剤の調製）
　ＨＥＬ２．０ｍｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）２ｍＬに溶解したＨＥＬ含有溶液に、ショ糖エルカ酸エステル（三菱化学フーズ社製、ＥＲ－２９０、エルカ酸：９０重量％、ＨＬＢ：２）の５．０重量％シクロヘキサン溶液４．０ｍＬを加え、ホモジナイザーにより２６，０００ｒｐｍで２分間高速撹拌し、Ｗ／Ｏ型エマルションを調製した。このエマルションを一昼夜凍結乾燥することによって、界面活性剤－ＨＥＬ複合体を得た。
　この複合体に４ｍＬのミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）を加えて分散させ、本発明に係るＳ／Ｏ型複合体サスペンション（本発明製剤）を得た。ここには、ＨＥＬを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有している。
　図２に、上記の方法によって得られたＨＥＬ含有複合体の粒度分布（頻度分布）を示す。ＨＥＬ含有複合体の平均粒径をレーザー散乱法（シスメックス社製のナノＺＳ装置を使用）によって測定したところ、４５８．７ｎｍであった。
　（比較製剤の調製）
　陽性対照として、ＨＥＬ抗原とフロイントのコンプリートアジュバント（ＦＣＡ）とを同量加えて乳化させた比較製剤１、およびＨＥＬ抗原のみを含有する比較製剤２を用意した。
　詳細には、ＨＥＬ２．０ｍｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）２ｍＬに溶解したＨＥＬ含有溶液に、ＦＣＡ（原液）を同量（２ｍＬ）加えて乳化させ、比較製剤１を調製した。また、比較製剤２は、ＦＣＡを添加しなかったこと以外は比較製剤１と同様にして調製した。
　このようにして得られた本発明製剤および比較製剤１、２を用いて以下の実験を行ない、抗体産生量および投与部位に及ぼす影響（肉眼的観察および病理組織的検査）を比較検討した。
　試験例１　抗体産生量の比較
　体重約２ｋｇの雄ウサギ（ニュージーランドホワイト種）４羽を用意し、陽性対照群（比較製剤１、２）用に２羽、実験群（本発明製剤）用に２羽を割り当て、以下のように投与を行った。
　（陽性対照群）
　陽性対照群のウサギ（２羽）の背部皮膚をバリカンで剃毛し、比較製剤１（アジュバント添加）、比較製剤２（アジュバント無添加）をそれぞれ、１羽につき１ｍＬずつ皮下注射を行った。
　（実験群）
　実験群用に用意した２羽のウサギのうち、１羽の背部皮膚を上記と同様にバリカンで剃毛し、約１０ｃｍ四方の面積内に絵の具用筆で本発明製剤を１ｍＬ塗布した（背部塗布）。残りの１羽については、片方の耳介の舟状渦に本発明製剤を１ｍＬ塗布した（耳介塗布）。
　実験群および陽性対照群の両方について、投与後１４日目（第１回免疫）、２８日目（第２回免疫）、４２日目（第３回免疫）、５９日目（第４回免疫）に上記と同様の投与を行った。第１回免疫～第４回免疫のそれぞれの投与前に、耳（耳介塗布を行った本発明製剤投与群では、耳介塗布を行わなかった他方の耳）の外側の耳静脈から採血を行ってサンプルを採取し、サンプル中の抗ＨＥＬ抗体量をＥＬＩＳＡ法で調べた。ＥＬＩＳＡ法の詳細は、下記（１）～（５）に示すとおりであり、各ステップにおける洗浄操作は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＰＢＳＴ［ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ　２０（親水性界面活性剤）］、または１Ｍ　ＮａＣｌを用いて充分行った。なお、実験は、合計３回行なった。
　（１）ＨＥＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）（タンパク質量で５ｍｇ／ｍＬ）を９６穴マイクロプレートに２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、４℃で一晩静置してＨＥＬをマイクロプレートへ吸着させた。
　（２）非特異的な吸着を阻止するため、ブロッキング剤として、ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin;ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液（ＢＳＡを５．０ｍｇ／ｍＬ含有）を、ＨＥＬを吸着した上記のマイクロプレートに２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、ブロッキングを行った（３７℃で２時間）。
　（３）サンプルを２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、マイクロプレート基板に吸着させたＨＥＬとサンプル中の抗ＨＥＬ抗体との間で抗原抗体反応を起こさせた（３７℃、２時間）。
　（４）ブロッキング剤を除去した後、０．２％Ｔｗｅｅｎ　８０を含むＰＢＳでマイクロプレートを丁寧にリンスし、これに、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）で標識されたヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ抗体を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５，０００倍に希釈したものを加え、抗原抗体反応を充分起こさせた（３７℃、２時間）。
　（５）フリーのＡＰ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を洗浄操作によって充分除去した後、１．０ｍＭのｐ－ニトロフェニルリン酸（１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５に溶解）をマイクロプレートに２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加し、λ＝４１０ｎｍでの吸光度を測定することによってウサギ血清中の抗ＨＥＬ抗体量を求めた。
　これらの結果を図３にまとめて示す。図３には、陽性対照群および実験群の結果がまとめて示されており、左側側から順に、比較製剤２（アジュバントなし皮下注射）、比較製剤１（アジュバントあり皮下注射）、本発明製剤（耳介塗布）、および本発明製剤（背部塗布）の結果を示している。
　図３より、以下のように考察することができる。
　まず、従来のように皮下注射を用いて経皮免疫を行った比較製剤１、２では、いずれも、第１回免疫および第２回免疫で抗ＨＥＬ抗体量の増加が見られた。特に、アジュバントを添加した比較製剤１では、第１回免疫で著しい抗体量の増加が見られた。
　一方、Ｓ／Ｏ化を行った本発明製剤では、耳介塗布を行った例も、背部塗布を行った例も、いずれも、第１回免疫および第２回免疫で抗体量の増加が認められた。特に、皮膚組織が薄くて経皮吸収性の高い耳介塗布の例では、皮下組織が厚くて耳介に比べて経皮吸収性の低い背部塗布の例に比べ、抗体量の増加が顕著に見られ、その程度は、比較製剤２と、おおむね、同程度であった。
　試験例２　投与部位の刺激性に関する肉眼的観察
　実験群および陽性対照群の各ウサギの投与部位を、第１回免疫時に肉眼観察した。
　その結果、ウサギ背部に皮下注射を行った比較製剤１および比較製剤２では、第１回免疫から明瞭な瘤のようなしこりが発生し、特に、アジュバント入り抗原を皮下注射した比較製剤１において、その程度は顕著であった（図示せず）。これに対し、本発明製剤を投与した例では、背部塗布の例はもとより、刺激性に鋭敏な耳介の舟状渦に塗布を行った例においても、血管の怒張や充血などは何ら認められず、皮膚刺激は全く見られなかった。
　試験例３　病理組織学的検査
　ここでは、投与後６６日目における各ウサギの皮膚についてヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色を行い、病理組織標本を作製した後、光学顕微鏡による観察（倍率８０倍、２００倍、４００倍）を行って皮膚の炎症を調べた。図４～図７に、本発明製剤（耳介塗布）、本発明製剤（背部塗布）、比較製剤１、比較製剤２の病理組織写真をそれぞれ示す。
　まず、本発明製剤について考察する。
　図４は、本発明製剤（耳介塗布）の病理組織写真であり、図４Ａは８０倍、図４Ｂは４００倍の拡大写真である。図４Ａおよび図４Ｂに示すように、耳介塗布を行なった皮膚には炎症は全く見られず、正常な表皮、真皮層、脂肪を含む皮下組織が観察された。
　図５は、本発明製剤（背部塗布）の病理組織写真であり、図５Ａは８０倍、図５Ｂは４００倍（の拡大写真である。図５Ａ～図５Ｂに示すように、背部塗布を行なった皮膚には炎症は全く見られず、正常な表皮、真皮層、脂肪を含む皮下組織が観察された。　
　以上、図４および図５より、本発明製剤を用いて経皮免疫を行なった場合は、耳介塗布・背部塗布のいずれの場合にも、皮膚の炎症は観察されなかった。
　次に、比較製剤について考察する。
　図６は、比較製剤１（ＦＣＡ添加）の病理組織写真であり、図６Ａは８０倍、図６Ｂは２００倍、図６Ｃは４００倍の拡大写真である。図より、真皮層には大きな嚢胞が観察され（図６Ａを参照）、その大きな嚢胞の周辺部では壊死組織が認められた（図６Ｂを参照）。また、図６Ｃに示すように、真皮層から皮下組織にかけて炎症が広範囲に見られ、著しく肥厚している。これらの部位では、大きい空砲や泡沫状細胞質を有して膨らんだマクロファージの集団が観察され、その間に細胞浸潤が見られた。
　図７は、比較製剤２（ＦＣＡ添加なし）の病理組織写真であり、図７Ａは８０倍、図７Ｂは２００倍、図７Ｃは４００倍の拡大写真である。これらの図に示すように、表皮の一部（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃの左端）に軽度な肥厚が認められ、その下部の真皮層では、幼弱な線維芽細胞が密に走行しており、軽度の細胞浸潤を伴っていた。
　以上の結果より、従来の皮下注射を用いた経皮免疫法では、皮膚の炎症が認められ、炎症の程度は、ＦＣＡ添加なしの比較製剤２に比べ、ＦＣＡ添加の比較製剤１の方が顕著に見られた。

Claims (8)

  1. 　抗原が界面活性剤によって被覆された固体状の抗原－界面活性剤複合体と、油相とを含み、前記固体状の抗原－界面活性剤複合体は、油相に溶解または分散していることを特徴とするＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
  2. 　前記抗原は、タンパク質またはペプチドである請求項１に記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
  3. 　前記抗原は、生または不活性化された細菌及び／又はウイルスである請求項１に記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
  4. 　前記抗原は、動物由来または植物由来である請求項１に記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
  5. 　前記界面活性剤が非イオン界面活性剤である請求項１～４のいずれかに記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
  6. 　前記界面活性剤のＨＬＢ価が１０以下である請求項１～５のいずれかに記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
  7. 　前記油相が、植物油、動物油、中性脂質、および長鎖脂肪酸エステルよりなる群から選択される少なくとも一種である請求項１～６のいずれかに記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載のＳ／Ｏ型経皮免疫剤が、水相に分散していることを特徴とするＳ／Ｏ／Ｗ型経皮免疫剤。
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