ES2289200T3 - Uso de mejoradores para penetracion de la piel y agentes de alteracion de barrera para mejorar la respuesta inmune transcutanea. - Google Patents

Abstract

Uso de por lo menos un antígeno, por lo menos un adyuvante, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la fabricación de una formulación para la inmunización transcutánea mediante inducir una respuesta inmune específica a antígeno en un sujeto; en donde dicha formulación se aplica en una cantidad terapéuticamente efectiva a un área pretratada de la piel del sujeto la cual no está perforada, y el pretratamiento rompe por lo menos el estrato corneo de la piel, y en donde el antígeno es por lo menos parcialmente purificado y seleccionado del grupo que consiste de carbohidrato, glicolípido, glicoproteína, lípido, lipoproteína, fosfolípido y polipéptido.

Description

Uso de mejoradores para penetración de la piel y agentes de alteración de barrera para mejorar la respuesta inmune transcutánea.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La invención se relaciona con inmunización transcutánea utilizando una exotoxina ribolizante ADP y otros adyuvantes con un antígeno, y el uso de mejoradores de la penetración y agentes para alteración de barrera para mejorar la respuesta inmune. La invención también se relaciona con la activación del antígeno, adyuvante, sus blancos en la piel, o una combinación de estos para mejorar la respuesta inmune específica de antígeno inducida para esta.

2. Descripción de la técnica relacionada

La piel, el órgano mas grande del cuerpo humano, es una parte importante de la defensa del cuerpo contra la invasión de agentes infecciosos y el contacto con químicos nocivos (ver Bos, 1997). Las reacciones indeseables de la piel tales como las alergias o la dermatitis atópica son conocidas, pero la inducción de una respuesta inmune sistémica mediante la aplicación de un adyuvante y un antígeno que elicite inmunoefectuadores específicos y suministre una ventaja terapéutica mediante la aplicación simple de un adyuvante y un antígeno para la piel no parece haber sido enseñada o sugerida antes de nuestra invención.

La toxina del cólera (CT) y la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT) son ejemplos de químicos nocivos, en las que uno habría esperado protección por las capas protectoras de la piel contra la penetración por las sustancias nocivas. Craig (1965) reportó que filtrados de heces de paciente con cólera inyectado intracutáneamente en conejos y cerdos de guinea produjeron un retrazo característico, un endurecimiento edematoso sostenido (hinchamiento), que fue inducido por la presencia de toxina en la piel. El hinchamiento y la chorreadura vascular fue tan dramática que esta se adscribió a un factor de permeabilidad desconocido que fue posteriormente mostrado por ser el CT mismo. Así, uno podría haber esperado razonablemente que el CT hubiera sido extremadamente reactogénico cuando se colocó sobre la piel si esta fuera a entrar en la piel, originando enrojecimiento e hinchamiento similares. La prueba de Craig inyectando CT a la piel, se volvió una medición estándar para la presencia y cuantificación de CT en filtrados de heces o medios de cultivo. Los datos confirmaron que esta reactividad de la piel fue debida a la toxina del cólera (ver Finkelstein y LoSpallutto, 1969).

Craig (1965) advirtió, "la ausencia de lesiones en la piel en cólera clínico ciertamente no precluye la posibilidad de que la noxa responsable por el daño en el intestino también pueda tener efectos deletéreos en la piel siempre y cuando esta se aplique a la piel en suficiente concentración". La reactogenicidad extrema de la toxina del cólera en la piel se utilizó como una prueba para su toxicidad y la técnica anterior evidenció una expectativa de que la toxina de cólera seria reactogénica si se aplicara a la piel produciendo una reacción indeseable. Tales reacciones adversas han sido bien documentadas por autoridades conocidas en el campo Craig (1972).

En contraste, hemos mostrado que la toxina del cólera es inmunogénica, actuando tanto como antígeno como adyuvante, cuando se coloca a la piel pero sin ningunos efectos colaterales locales o sistémicos resultantes. Esta falta de reactogenicidad cuando la toxina del cólera se colocó a la piel para inmunización transcutánea fue sorprendente y contradijo las conclusiones que uno podría extraer de la técnica anterior. Específicamente, el CT colocado sobre la piel de acuerdo con nuestra invención actúa como una adyuvante no tóxico, no reactogénico en contraste con expectativas de Craig aunque la inyección de CT en la piel dió como resultando en hinchamiento y enrojecimiento. Así, no era obvio antes de nuestra invención que la toxina del cólera y otras exotoxinas ribosilantes de ADP aplicadas tópicamente serian útiles para la inmunización transcutánea. De hecho grandes dosis de eterotoxina lábil al calor (LT) colocada sobre la piel de humanos ha mostrado inducir una respuesta inmune sistémica sin toxicidad local o sistémica.

Esta ausencia inesperada de reactogenicidad es extremadamente importante para el uso de vacunas. Las vacunas de antígenos de adyuvantes son útiles cuando la inmunización produce una respuesta inmune protectora sin reacciones no deseadas significativa. Históricamente, la reactogenicidad de las vacunas tal como el hinchamiento, ablandamiento y dolor en el sitio de la inyección ha sido en algunos casos (por ejemplo, tifoide y tosferina) aceptadas en razón a los beneficios de la vacunación. Sin embargo, altos niveles de reactogenicidad y otros efectos colaterales no son deseables, y serían problemáticos para el desarrollo de nuevos candidatos de adyuvantes y antígenos para vacuna. Los esfuerzos de los investigadores se han enfocado en hacer adyuvantes para vacuna que sean estimulatorios y no induzcan reacciones indeseables. Las vacunas contra tosferina de célula completa inducen efectos colaterales sistémicos y locales y, como resultado, esta vacuna aprobada en el tiempo está siendo reemplazada por vacunas para tos ferina a celulares solamente porque son menos reactogénicas.

La presente invención difiere de aquella de la patente No 5.830.877 que enseña el uso de un plásmido desnudo que codifica un péptido biológicamente activos en un huésped mamífero. La invención descrita aquí enseña el uso de un adyuvante y un antígeno administrados juntos sobre la piel para inducir una respuesta inmune. La invención descrita aquí difiere además de la patente No. 5.830.877 que enseña alejarse del uso de los péptidos que no están codificados en un ácido nucleico y producidos por la célula huésped en razón de la toxicidad asociada con los péptidos biológicamente activos, los problemas de costo de aislamiento, purificación y sintetización de péptidos y su corta vida media e in vivo resultante de la degradación de las proteasas presentes en el tejido blanco. Este claramente enseña alejarse de la adición de un adyuvante tal como la toxina del cólera a un antígeno coadministrado o ácido nucleico. De hecho la novedad de la capacidad de una molécula grande tal como CT para inducir una respuesta inmune mediante la aplicación a través de la piel sin toxicidad ha conducido a un número de documentos científicos que describen esta novedad y excitación del público sobre la implicación potencial del suministro de proteínas para vacunación mediante aplicación en la piel. A diferencia de la patente No. 5.830.877 la presente invención no es dependiente del estimulo de la inflamación local o de la irritación. A diferencia de la patente No. 5.830.877 la invención no depende de la irritación o de la inflamación local para incrementar la permeabilidad de las membranas celulares para mejorar la absorción de los antígenos, plásmidos o RNA. De hecho la característica afectante con relación a la inmunización transcutánea es la ausencia de inflamación local.

A diferencia de la presente invención, la patente No. 5.824.313 enseña la aplicación de antes modificadores del órgano linfoide extremadamente pequeños (menor de 500 daltons) tal como el 1,25-dihidroxi-16-eno vitamina D.sub 3 y calciproteína o dehidroepiandrosterona (DHEA), congéneres del DHEA y derivados del DHEA con la inyección intramuscular de un antígeno para afectar las respuestas del anticuerpo.

La inmunización transcutánea requiere tanto el paso de un antígeno a través de las barreras exteriores de la piel, que se creyó que eran impermeables a tal paso, y una respuesta inmune al antígeno. La dermatitis de contacto de Fisher establece que las moléculas de mas de 500 daltons no pueden normalmente penetrar la piel. Existe un reporte de Paul et al. (1995) de inducción de una respuesta inmune con transferosomas, una estructura lípida distinta de las liposomas. En esta publicación, las transferosomas fueron utilizadas como un vehículo para el antígeno (albúmina de suero bovino y proteínas de conexión comunicante) y lisis mediada por complemento de liposomas sensibilizados por antígeno que fueron ensayados. El límite para la penetración de la piel por el antígeno se estableció que era de 750 daltons. En su estudio, no se indujo una respuesta inmune cuando una solución que contiene antígeno se colocó sobre la piel; solamente las transferosomas fueron capaces de inducir una respuesta inmune. Paul y Cvec (1995) también establecieron que es "imposible inmunizar epicutáneamente con un péptido simple o soluciones de proteína".

Tales referencias explican porque nuestro uso exitoso de una molécula como la toxina del cólera (que es de 85.000 daltons) en razón a que un antígeno o adyuvante en la inmunización fueron saludados con sorpresa en el campo porque tales moléculas grandes no se esperara a que penetrara la piel y, por lo tanto, no se esperara a que indujeran respuestas inmunes específicas.

Sin embargo, hemos mostrado las solicitud US No 08/749.164 (presentada en noviembre 14, 1996 (US 5910306)); a solicitud US No 08/896.085 (presentada julio 17, 1997 (US 5980989)); y la solicitud internacional PCT/US97/21324 (presentada en noviembre 14, 1997) (WO98/20734) que utilizando una exotoxina ribolisante de ADP, la toxina del cólera, como un antígeno podrá elicitar una respuesta de anticuerpo fuerte que es altamente reproducible. Cuando la exotoxina ribolisante de ADP tal como la exotoxina del cólera, como un antígeno podría elicitar una respuesta de anticuerpo fuerte que es altamente reproducible. Cuando la exotoxina ribolisante de ADP, tal como la toxina del cólera, se utilizó como un inmunoadyuvante y se aplicó en la piel en una solución salina con un antígeno separado (por ejemplo, toxoide de difteria), una respuestas del anticuerpo específica del antígeno de sistémica y de mucosa podría ser elicitada. En la presente solicitud, hemos descrito que la inmunización transcutánea que utiliza un mejorador de penetración, un agente de afectación de barrera, o combinaciones de esta pueden mejorar la actividad adyuvante de una exotoxina bacterial.

Hemos mostrado que toxinas similares al cólera (CT), enterotoxinas labiles al calor de E. coli (LT), exotoxina de seudomonas A (ETA), toxina de tos ferina (PT) y una amplia variedad de antígenos que incluyen virus de rabia muertos, recombinantes tales como VIH p55gag, conjugados de polisacáridos tales como Hib, sonicados, pertactina por ejemplo, son capaces de pasar a través de la piel e inducir una respuesta inmune. Adicionalmente el Ct, LT, ETA y PT y el ADN bacterial y los citobinas, pueden actuar como adyuvantes para inducir una respuesta inmune a antígenos coadministrados sobre la piel. Así el toxoide del tétano no inmunogénico en si mismo sobre la piel puede inducir una respuesta inmune fuerte cuando se coloca sobre la piel con CT. Hemos propuesto que la población de célula Langerthans subyacente que subyace el sitio de la aplicación sean una célula que presenta el antígeno preferido para suministrar el antígeno al sistema inmune. El adyuvante puede actuar como la célula que presenta el antígeno directamente, o a través de linfocitos que reconocen el antígeno.

Proponemos mejorar la respuesta inmune a los adyuvante y/o antígenos transcutáneamente utilizando la técnicas de mejoramiento de penetración. De acuerdo con Hurley, "la piel debe su durabilidad a la dermis, pero su impermeabilidad química reside en la epidermis y casi exclusivamente en su capa exterior muerta, el estrato córneo". Para la inmunización transcutánea utilizando, por ejemplo, una exotoxina ribolisante de ADP como adyuvante y un antígeno de proteínas soluble tal como el toxoide de difteria, la penetración del estrato corneo debe ocurrir. Las técnicas mejoradas de penetración serian diseñadas para incrementar el movimiento de los antígenos transcutáneos y los adyuvantes a través de la capa del estrato corneo de la piel.

Además, proponemos que la inmunización transcutánea que utiliza la activación de por lo menos un antígeno, el adyuvante del componente de la piel mejorará la respuesta inmune como se ensayó mediante parámetros cuantitativos y cualitativos. El adyuvante de antígeno de la formulación se puede activar mediante división de tripsina de una exotoxina bacteriana (por ejemplo LT, dividido con tripsina, con o sin reducción). La activación de la piel en el sitio de aplicación de la formulación se puede lograr mediante el uso de agentes afectadores de barrera (acetona, alcohol) que incrementan el tamaño de la activación de las población de células Langeehans subyacentes, o mediante una enzima o combinación de enzimas (por ejemplo enzimas con actividad sialidasa) que incrementa la cantidad o accesibilidad del receptor GM1 de gangliósido.

Resumen de la invención

Un objeto de la invenciones es suministrar un sistema mejorado para la inmunización transcutánea que induce una respuesta inmune (por ejemplo y un efectuador y/o celular) en un sujeto, siendo el sujeto un animal o humano. Este sistema de suministro provee la aplicación simple a piel intacta de un organismo de una formulación comprendida de antígeno y adyuvante para inducir la respuesta inmune específica contra el antígeno. Aunque no se requiera para la inducción de una respuesta inmune por medio de éste sistema de suministro simple la suplementación del proceso anteriormente mencionado con el mejoramiento de penetración o el afectamiento de la barrera se puede mejorar la inmunización y/o vacunación.

En particular, el adyuvante o antígeno o la piel pueden ayudar en la penetración del estrato corneo o la epidermis para encontrar las células que presentan antígeno del sistema inmune (por ejemplo células de Langerhans y la epidermis, células dendríticas dérmicas, células dendríticas, células dendríticas foliculares, macrófagos, linfocitos B) y/o inducir las células que presentan antígeno para fagocitar el antígeno. Las células que presentan antígeno entonces presentan el antígeno a las células T y B. en el caso de las células Langerhans, las células que presentan antígeno entonces pueden migrar desde la piel a los nodos linfáticos y presentar antígeno a los linfocitos (células T y/o B) induciendo de esta manera una respuesta inmune específica de antígeno.

Además la activación del antígeno, adyuvante, piel, o cualquier combinación de éstos se puede lograr para suplementar el proceso de inmunización.

Además de licitar reacciones inmunes que conduzcan a la generación de un linfocito B especifico de antígeno y/o un linfocito T, que incluya un linfocito T citotóxico (CTL), otro objeto de la invención es regular positiva y/o negativamente los componente del sistema inmune al utilizar el sistema de inmunización transcutánea para afectar el adyuvante especifico de antígeno (Th1 y/o Th2) o los subconjuntos de células T (DTH) con hipersensibilidad de tipo retrasado. Esto se puede ejemplificar por el comportamiento diferencial del CT y LT que pueden resultar en diferentes respuestas de adyuvante T o diferentes niveles de protección en hongos expuestos in vivo utilizando inmunización transcutánea.

Descripción de los dibujos

Las figuras 1a-f son fotografías que no muestran inflamación en el sitio de inmunización (A, B), activación de células Langerhans mediante LT en piel de humanos en el sitio de inmunización (C, E) y la ausencia de la activación de células Langerhans en la piel proveniente de un brazo contra lateral (D, F).

Figura 2a-d son fotografías que muestran las células Langerhans normales (A, B, 200 y 400X) y la activación de la célula Langerhans mediante toxina de cólera en piel de ratón (C, D 200X, 400X).

Descripción de las modalidades preferidas

Los varios aspectos de la invención para la cual se busca protección se definen en las reivindicaciones finales.

En una modalidad de la invención, una formulación elaborada de acuerdo con la invención que contiene antígeno y adyuvante tal como CT y DT, se aplica a piel intacta de un organismo después del mejoramiento de la penetración de la piel, y el antígeno es presentado a las células inmunes, y la respuesta inmune específica del antígeno es inducida sin la perforación de la piel. La formulación puede incluir antígenos adicionales o ácidos nucleicos de tal forma que la aplicación transcutánea de la formulación induce una respuesta inmune para multiplicar los antígenos, o los ácidos nucleicos que codifican para antígenos preferiblemente de 2 a 20 pero posiblemente hasta de 200. En tal caso, los antígenos pueden o no derivarse de la misma fuente, pero los antígenos tendrán diferentes estructuras químicas de tal forma de inducir respuestas inmunes específicas para los diferentes antígenos. Los linfocitos específicos de antígeno pueden participar en la respuesta inmune y, en el caso de la participación de los linfocitos B, los anticuerpos específicos de antígeno pueden ser parte de la respuesta inmune.

La formulación elaborada de acuerdo con la invención se puede utilizar para tratar un organismo. Si el antígeno se deriva de un patógeno, el tratamiento vacuna el organismo contra la infección por el patógeno o contra sus efectos patógenos tal como aquellos causados por la secreción de la toxina. Una formulación que induce un antígeno tumoral puede proporcionar un tratamiento para el cáncer; una formulación que incluye un alérgeno puede ser utilizada para tratar enfermedades alérgicas; una formulación que incluya un autoantígeno puede suministrar tratamiento para una enfermedad originada por el sistema inmune propio del organismo (por ejemplo enfermedad auto inmune). La invención se puede utilizar terapéuticamente para tratar la enfermedad existente, protectoramente para evitar la enfermedad, o reducir la severidad y/o duración de la enfermedad.

En una modalidad adicional de la invención, se suministra un parche para uso de los métodos anteriores. El parche puede comprender un apósito, y una cantidad efectiva de antígeno ácido nucleico y adyuvante. El apósito puede ser oclusivo o no oclusivo. El parche puede contener mejoradores de penetración o puede incluir un dispositivo para el mejoramiento de la penetración física. El parche puede incluir antígenos adicionales de tal forma que la aplicación del parche induzca una respuesta inmune para multiplicar los antígenos. En tal caso, los antígenos pueden o no ser derivados de la misma fuente, pero los antígenos tendrán diferentes estructuras químicas con el fin de inducir una respuesta inmune específica para los diferentes antígenos. Para el tratamiento especifico, se pueden aplicar múltiples parches a intervalos frecuentes o constantemente durante un periodo de tiempo.

Mas aún, en aun otra modalidad de la invención, la formulación se aplica a piel intacta que está por encima de más de un campo de nodo linfático drenante utilizando aplicaciones simples o múltiples o un parche separado para adyuvante o antígeno/ácido nucleico. La formulación puede incluir antígenos adicionales de tal forma que la aplicación a la piel intacta induzca una respuesta inmune a los antígenos múltiples. En tal caso, los antígenos pueden o no ser derivados de la misma fuente, pero los antígenos tendrán diferentes estructuras químicas con el fin de inducir una respuesta inmune específica para los diferentes antígenos.

La formulación se puede aplicar a la piel para reforzar o inicial a la respuesta inmune en conjunto con otras frutas de inmunización. Así, iniciando con inmunización transcutánea con aplicaciones simples o múltiples se pueden seguir con técnicas orales, nasales o parenterales para reforzar la inmunización con los mismos antígenos o antígenos alterados. La formulación puede incluir antígenos adicionales de tal forma que la aplicación a la piel intacta induzca una respuesta inmune para multiplicar los antígenos. En tal caso, los antígenos pueden o no ser derivados de la misma fuente, pero los antígenos tendrán diferentes estructuras químicas con el fin de inducir una respuesta inmune específica para los diferentes antígenos.

Además del antígeno y el adyuvante activado, la formulación puede comprender un vehículo. Por ejemplo, la formulación puede comprender AQUAFOR® (una emulsión de petrolato, aceite mineral, cera mineral, cera de lana, pantenol, bisabol y glicerina) emulsiones (por ejemplo, cremas acuosas), microemulsiones, geles, emulsiones de aceite en agua (por ejemplo, cremas aceitosas), lípidos anhidros y emulsiones de agua en aceite, grasas, ceras, aceite, siliconas y humectantes (por ejemplo, glicerol).

El antígeno se puede derivar de un patógeno que puede infectar el organismo (por ejemplo, bacteria, virus, hongo, o parásitos), o una célula (por ejemplo célula tumoral o célula normal) o un alergeno o un agente para la lucha biológica. El antígeno puede ser un antígeno tumoral o un autoantígeno. Químicamente, el antígeno puede ser un carbohidrato, glicolípido, glicoproteína, lípido, lipoproteína, fosfolípido, polipéptido, o proteína de fusión (recombinante) o conjugado químico del anterior. El peso molecular del antígeno puede ser mayor de 500 daltons, preferiblemente mayor de 800 daltons, y más preferiblemente mayor de 1000 daltons.

El antígeno se puede obtener por medios recombinantes, síntesis química, o purificación de una fuente natural. Una ventaja de la inmunización transcutánea puede ser que la purificación de un antígeno no sea necesaria por ejemplo un organismo completo puede ser sonicado y utilizado para inmunización. El nivel de toxicidad asociado con inyectar un producto de tales preparaciones es a menudo demasiado tóxico para ser tolerado, tal como LPS, que puede ser fatal si se inyecta, pero no es tóxico sobre la piel. Se prefieren los antígenos o conjugados proteináceos con polisacáridos. El antígeno puede ser por lo menos parcialmente purificado en forma de célula libre. Alternativamente, el antígeno se puede suministrar en la forma de un virus vivo, un virus vivo atenuado, o un virus inactivado, o una bacteria completa lisada, parásito o virus tratado con detergente o fracción de este.

La inclusión de un adyuvante puede permitir la potenciación o la modulación de la respuesta inmune. Más aún, la selección de un antígeno adecuado o adyuvante puede permitir la inducción preferencial de una respuesta inmune humoral o celular o mucosal, los isotipos de anticuerpo específicos (por ejemplo IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, y/o IgG4), y/o los subconjunto de célula T específicos (por ejemplo, CTL, Th1, Th2, y/o T_{DTH}). Opcionalmente, el antígeno, adyuvante, se pueden suministrar en la formulación por medio de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, cADN, cARN) que codifica el antígeno adyuvante como apropiado con un antígeno o adyuvante que se ha agregado al ácido nucleico. Esta técnica es denominada inmunización genética.

El término "antígeno" como se utiliza en la invención, pretende describir una sustancia que induce una respuesta inmune específica cuando se presenta a células inmunes de un organismo. Un antígeno puede comprender un epítopo, inmugénico simple, o una multiplicidad de epítopos inmunogénicos reconocidos por un receptor de célula B (es decir anticuerpo sobre la membrana de la célula B) o un receptor de célula T. Una molécula puede ser tanto un antígeno como un adyuvante (por ejemplo toxina de cólera) y, así, la formulación puede contener solamente un componente. El antígeno se puede suministrar como un organismo completo, tal como, por ejemplo, una bacteria o virión; el antígeno se puede obtener de un extracto o lisado, o de células completas o de membrana sola; o el antígeno puede ser químicamente sintetizado para ser producido por medios recombinantes.

El término "adyuvante" como se utiliza en la invención, pretende describir una sustancia agregada a la formulación para ayudar a inducir una respuesta inmune al antígeno.

El término "cantidad efectiva" como se utiliza en la invención, pretende describir la cantidad de antígeno que induce una respuesta inmune específica de antígeno. Tal inducción de una respuesta inmune puede suministrar un tratamiento tal como, por ejemplo, inmunoprotección, desensibilización, inmunosupresión, modulación de la enfermedad autoinmune, potenciación del cáncer de inmunovigilancia, una vacunación terapéutica contra una enfermedad infecciosa establecida.

Por la epidermis significamos las células de la piel provenientes de la capa basal de los queratinocitos y la lámina basal hasta y a través del estrato corneo.

La definición de transdérmico es generalmente explicada como: relacionada con, que suministra un médicamente en una forma para la absorción a través de la piel hacia el torrente sanguíneo (\sim suministro de drogas) (\sim nitroglicerina) (\sim tanda de nicotina). Un ^{2}Frederick C. Mish et al., eds, Merriam-Webster'sCollegiate Dictionary, 10th ed. (Springfield, MA.:Merriam-Webster, Incorporated, 1997), 861.

El término campo de no linfático drenante como se utiliza en la invención significa un área anatómica sobre la cual los linfáticos recolectados se filtran a través de un conjunto definido de nodos linfáticos (por ejemplo, cervical, axilar, inguinal, epitroquelar, popliteal, aquellos del abdomen y el tórax).

La penetración de la piel se puede mejorar utilizando técnicas que incrementan la hidratación de la piel. De acuerdo con Robert y Walter (1993), "el estado de hidratación del estrato corneo (SC) es aquel de los factores más importantes para determinar la tasa de absorción percutanea de un soluto dado". El estado de hidratación interactúa con la principal de difusión para determinar la tasa de absorción de una sustancia a través de la piel. Adicionalmente, Hurley estableció:

"La absorción de sustancias a través del estrato corneo se cree que ocurre mediante la difusión de acuerdo con las leyes de difusión de Fick en la cual la tasa de absorción de un químico es proporcional a la diferencia de concentración a través de la membrana. Así, un gradiente de concentración entre la concentración alta del solito sobre la superficie de la piel y su ausencia o baja concentración por debajo del estrato corneo es la fuerza conductora de este proceso. El movimiento transcorneo de absorción es clásicamente representado como ``percelular'', esto es, directamente a través de las paredes celulares de la cornea compactada y no intracelularmente. Los filamentos de proteína intracelulares se describen como las sendas para los compuestos polares (agua soluble) y el medio ante los filamentos sirve como la ruta para las sustancias no polares (lípidos solubles). La hidratación incrementa la permeabilidad del estrato corneo para la mayoría de las sustancias por un número de mecanismos citofísicos que no están completamente clarificados".

Así, mientras que la hidratación de la piel se conoce generalmente por mejorar la penetración de la piel los mecanismos por medio de lo cual esto ocurre no son enteramente claros y, así, no previsibles antes de la presente invención y no se cree que permita la penetración de grandes moléculas (7750 daltons).

El uso de vehículos para incrementar la hidratación es bien conocido. Los emplastos oclusivos, tales como las películas plásticas impenetrables por el vapor (por ejemplo polivinilideno, polietileno) mejoran la absorción principalmente a través de la hidratación incrementada del estrato corneo, un resultado del hinchamiento de los corneocitos, y la absorción de agua hacia los corredores intercelulares. Los parches de hidrocoloide también se pueden utilizar para mejorar la penetración de la piel. La absorción de los esteroides se puede incrementar más de 100 veces utilizando una película oclusiva plástica. En general, las grasas, aceite o los plásticos impermeables inducen la mayoría de la hidratación mediante oclusión. Ver, por ejemplo, Idson (1978); Hollingsbee (1995); y Mckenzie y Stoughton (1962). El uso de la hidratación o el vehículo para la hidratación con un antígeno y adyuvante no fueron conocidos antes de nuestra invención como penetración. La piel se consideró que estaba limitada a pequeñas moléculas aún en el estado hidratado.

Los agentes adecuados que son conocidos por mejorar la absorción de las drogas a través de la piel se describen en Sloan, Use of Solubilidad Parameters from Regular Solution Theory to Describe Partitioning-Driver Proceso, Ch.5, "prodrugs: topical y ocular Drug Delivery" (Marcel Dekker, 1992), y lugares en otras partes del texto.

Se espera que estas técnicas y (otras que son convencionalmente utilizadas para facilitar el suministro de drogas) se puedan adaptar para la preparación de ácidos nucleicos para el uso en los métodos de la invención por aquellos medianamente versados en la materia técnica sin experimentación indebida. Los ejemplos específicos que ilustran esta adecuabilidad se establecen adelante.

El estado de la técnica en el mejoramiento de la penetración de la piel se describe en farmacéuticas Skin Penetration Enhace-ment editada por Kenneth A, Walters y Jonathan Hadgraft publicada por Marcel Dekker, Inc., New York, 1993.

La permeabilidad de la piel y/o la hidratación de la piel se pueden esperar al seleccionar un vehículo apropiado de diferentes clases, tal como humectante (por ejemplo, glicoles, gliceroles), polvo (por ejemplo, arcillas, lociones de agitación), emulsión de aceite/agua (O/W) (por ejemplo cremas acuosas), emulsión de agua/aceite (por ejemplo cremas aceitosas), base emulsificante (por ejemplo lípido anhidro y emulsificadores O/W), bases de absorción (por ejemplo, lípido anhidro y emulsificadores W/O), en plastos lipofílicos (por ejemplo, grasas, ceras, aceites, siliconas,) y oclusivos (por ejemplo envoltorios plásticos).

Otros métodos que afectan las proteínas del estrato corneo para mejorar la penetración en la presente invención se pueden emplear. El ácido salicílico es un queratinolítico que puede incrementar la absorción. La urea actúa tanto como un queratinolítico como un hidratador de la piel, y puede actuar como un mejorador de penetración. La fosfolipasa A2 y la fosfatidilcolina dependiente de fosfolipasa C se puede utilizar como enzimas epidérmicas para mejorar la penetración. Otros mejoradores de penetración puede incluir etanol, acetona, detergentes, bases, nair®, propilen glico, pirriolidonas, dimetilacetamida, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, alquil sulfóxido, óxido de fosfina, tensoactivos y caprolactamas tales como azona. Otros compuestos que se pueden utilizar para el mejoramiento de la penetración incluyen aminas y amidas, amino acetatos alquil N,N distribuidos, decilmetilsulfóxido, pirrolidonas, pirotiodecano (HPE-101), polímeros de cloruro de benzilalconio, polímeros basados en silicona, ácidos grasos, ureas cíclicas, terpenos, liposomas y ciclodextrinas. Los mejoradores de penetración son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describió en farmacéutica Penetration Enhancement, (Marcel Dekker, 1993) otras técnicas que se pueden emplear para el mejoramiento de la penetración incluyen iontoforesis, ultrasonido, electroporación, pelado de cinta, el uso de pistolas de genes u otros dispositivos propulsores, ensayos de punta TB (como los suministrados por Mono-Vacc® sistem) o microagujas para penetrar la superficie exterior de la piel, o abrasivos que remueven las capas exteriores de la piel y la extracción de lípido.

Un dispositivo que puede ser útil para el quebrantamiento del estrato corneo (que se distribuye en los Estados Unidos por Connaught Laboratorios, Inc. De Swiftwater, Pa.) Consiste de un recipiente plástico que tiene un émbolo de jeringa en un extremo y un disco pequeño en el otro. El disco pequeño sostiene una multiplicidad de puntas de diámetro estrecho de una longitud que pelará solo la parte exterior de la capa de las células de la epidermis pero no penetrará la epidermis. Cada una de las puntas en el kit MONO_VACC® está recubierta con tuberculina vieja; en la presente invención cada aguja se puede recubrir con una composición farmacéutica de antígeno/ácido nucleico y adyuvante. El uso del dispositivo con la presente invención puede no estar de acuerdo con las instrucciones descritas del fabricante incluidas dentro del producto dispositivo en razón a que cuando se utilizan con la presente invención no penetra la epidermis. En esta, el dispositivo se puede utilizar para el calentamiento superficial para quebrantar las capas más exteriores de la piel, el estrato corneo y la epidermis superior, para mejorar la inmunización transcutánea. Dispositivos similares que también se pueden utilizar en esta modalidad son aquellos que son habitualmente utilizados para desarrollar pruebas de alergia.

Otras aproximaciones incluyen el quebrantamiento de barrera. La inhibición de la síntesis de colesterol utilizando inhibidores de reductasa HMG CoA sistémicamente administrada y drogas similares interfieren con la función de barrera y pueden permitir la penetración mejorada del componente de formulación.

También es concebible que la piel se pueda trasformar para mejorar la respuesta inmune trasncutánea. El CT y LT ejercen su efecto por vía del gangliósido GM1 que se une a la subunidad B. el gangliósido GM1 es un glicolípido de membrana celular ubicua encontrada en todas las células de mamíferos. En el tracto gastrointestinal, cuando la subunidad CTB pentamerita se une a la superficie celular, se forma un poro hidrofílico que le permite a la subunidad de A penetrar a través de la bicapa de lípido. La piel contiene gangliósidos a una concentración de 30-35 nmol NeuAC/gm. Los gangliósidos de la piel son blanco posibles para iniciar la inmunización transcutánea por vía de mecanismos tales como la activación de las células de Langerhans como se describió anteriormente.

Un método posible para activar la piel para mejorar el efecto de la inmunización transcutánea con exotoxinas ribosilantes de ADP al incrementar el número de moléculas de gangliósido GM1 en las células de la piel. Esto se podría lograr mediante la activación de las células receptoras utilizando sialidasa para convertir los gangliósidos que no une la toxina en el gangliósido que une a la toxina de cólera estable de sialidasa GGnSLC (gangliósido GM1):

``Es interesante que el vibrio cólera es quizás la fuente mejor conocida de sialidasa (una neuraminidasa, como es a menudo llamada). Pondría esta sialidasa jugar una parte en la historia natural de la enfermedad al hacer más receptores disponibles para la toxina ¿si es así debe cualquier agente inmunizante activo de la enfermedad contener un elemento de anti-neuriminidasa? La incubación de las raspaduras intestinales con sialidasa conduce a una incremento considerable en su capacidad para unir la toxina, que es debida no solamente la conversión de gangliósido lábil de sialidasa a gangliósido de unión de toxina, si no también, aparentemente a un desenmascaramiento de los sitios de unión de gangliósido de otra manera no aproximables posiblemente al romper las licoproteínas. El pre tratamiento del intestino del perro con sialidasa lo hace producir mas fluido en respuesta a la toxina del cólera; el tratamiento de las células supra renales con sialidasa incrementa su respuesta a la toxina del cólera; el tratamiento de las células rojas de palomos con sialidasa incrementa la activación de la adenilata ciclasa en ellos por la toxina del cólera.

The biochemistry of colera, In: colera: the American Scientific Experience, 1947-1980, van Heyningen, W.E; y Seal, J.R.,Eds, Waterview Press, Boulder, 1983, paginas 263 (citas omitidas).

El efecto del tratamiento de la piel con sialidasa puede mejorar la unión de una exotoxina ribosilante de ADP tal como CT a las células inmunes apuntadas mediante inmunización trascutánea. Esto representa una clase de activación de la piel para inmunización transcutánea. Adicionalmente, la neuraminidasa puede actuar como una enzima epidérmica mejorando concurrentemente la penetración.

El uso de un mejorador de penetración se puede utilizar en conjunto con la activación de la piel. La activación de la piel de la inmunización transcutánea también puede ser después de tratamientos tales como acoplamiento con acetona o alcohol. Se ha mostrado que el quebrantamiento de la barrera de la piel que utiliza pelado con acetona de la piel incrementó la densidad de células Langerhans en 80% e incrementó la reacción para contactar alérgenos in vivo. Si la densidad de las células de Langerhans se incrementa, entonces la potencia de la respuesta inmune se puede incrementar. Similar el quebrantamiento químico se podría esperar para incrementar el número de células de Langerhans y resultar en la activación del componente de la piel de inmunización transcutánea, mediante pelado de cinta, dodecil sulfato de sodio, el uso de pelado con alcohol, o un depilatorio tal como hidróxido de calcio. Ver Proksch y Brasch (1996, 1997) para uso de mejoradores de penetración y quebrantamiento de barrera en dermatitis de contacto alérgico.

El mejoramiento de la penetración se puede lograr en el desempeño de simples maniobras tales como el pelamiento de alcohol inmediatamente antes de la inmunización, mediante el uso concurrente de los compuestos de mejoramiento de penetración a las técnicas o mediante las técnicas tales como pelamiento con acetona 24 horas antes de incrementar el número de células Langerhans.

Los procesos para preparar una formulación farmacéutica son bien conocidos en la técnica, por medio del cual el antígeno y el adyuvante se combinan con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y su preparación se describen, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences de E.W. Martin. Tales formulaciones contendrán una cantidad efectiva del antígeno y un adyuvante junto con una cantidad adecuada del vehiculo con el fin de preparar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración a un humano o animal. La formulación se puede aplicar en la forma de una crema, emulsión, gel, loción, ungüento, pasta, solución, suspensión, u otras formas conocidas en la técnica. En particular, las formulaciones que mejoran la hidratación de la piel, a la penetración, o ambas se prefieren. Se pueden incorporar otros adictivos farmacéuticamente aceptables que incluyen, por ejemplo, diluyentes, excipientes, ligadores, estabilizadores, preservativos, y colgantes.

Sin estar ligados por ninguna teoría particular sino solamente para suministrar una explicaron de nuestras observaciones, se presume que el sistema de suministro de inmunización transcutánea lleva antígeno a las células del sistema inmune donde se induce respuesta inmune. El antígeno puede pasar a través de las capas exteriores protectoras normales de la piel (es decir el estrato corneo) e inducir la respuesta inmune directamente, o a través de una célula que presenta antígeno (por ejemplo, macrófago de tejido, células de Langerhans, célula dendrítica, célula dendrítica dérmica, linfocito B, o célula Kupffer) que presentan antígeno procesado a un linfocito T (ver Stingl et al; 1989; Streilen y Grammer, 1989; Tew et al; 1997). Opcionalmente, el antígeno puede pasar a través del estrato corneo por vía del folículo velloso o un organelo de la piel (por ejemplo la glándula sudorípara, o la glándula aceitosa).

La inmunización transcutánea con exotoxina ribolisantes de ADP (bAREs) puede apuntar a las células Langerhans epidérmicas, conocidas por estar entre las más eficientes de las células que presentan antígeno (APCs). Hemos encontrado que las células de Langerhans activan los bAREs cuando se aplican epicutáneamente a la piel en solución salina. Los adyuvantes tales como el LT activado pueden mejorar grandemente la activación de la célula Langerhans. Las células Langerhans dirigen repuestas inmunes específicas a través de la fagocitosis de los antígenos, y la migración a los nódulos linfáticos donde ellos actúan como los ACPs para presentar el antígeno a los linfocitos, y de esta manera inducir una respuesta de anticuerpo potente. Aunque la piel se considera generalmente como una barrera para invadir los organismos, la imperfección de esta barrera está garantizada por las numerosas células Langerhans distribuidas a través de la epidermis que son designadas para orquestar la respuesta inmune contra los organismos que invaden por vía de la piel. De acuerdo a Udey (1997):

"Las células de Langerhans son células derivada de medula ósea que están presentes en todos los epitelios escamosos estratificados de los mamíferos. Ellos comprenden toda la actividad celular accesoria que esta presente en la epidermis no inflamada, y en el paradigma habitual son esenciales para la iniciación y la propagación de las respuestas inmunes dirigidas contra los antígenos aplicados epicutáneamente. Las células Langerhans son miembros de una familia de unas células accesorias potentes (``células dendríticas'') que están ampliamente distribuidas, pero infrecuentemente presentadas, en los órganos del epitelio y sólidos así como también en el tejido linfoide. ``se reconoce ahora que las células Langerhans (y presumiblemente otras células dendríticas) tiene un ciclo de vida con por lo menos dos etapas distintas. Las células Langerhas que están localizadas en la epidermis constituyen una red de regular de células ``centinela'' que atrapan antígenos. Las células Langerhans de la epidermis pueden ingerir partículas, incluyendo microorganismos, y son procesadores eficientes de antígenos complejos. Sin embargo, ellos expresan solamente bajos niveles de los antígenos MHC clase I y clase II y las moléculas coestimuladoras (ICAM-1, B7-1 y B7-2) y son pobres estimuladores de células T no cebadas. Después del contacto con el antígeno, algunas células Langerhans se activan, salen de la epidermis y migran a las regiones dependientes de célula T de los nódulos linfáticos regionales donde ellas se localizan como células dendríticas maduras. En el curso de la salida de la epidermis y migrar a los nódulos linfáticos, las células Langerhans epidérmicas que llevan antígeno (ahora ``mensajero'') exhiben cambios dramáticos en la morfología, fenotipo superficial y función. En contraste a las células Langerhans epidérmicas, las células dendríticas linfoides son esencialmente non fagocíticas y procesan los antígenos de proteína de manera ineficiente, pero expresan altos niveles de antígenos MHC clase I y clase II y varias moléculas coestimuladoras y son los estimuladores mas potentes de células T naturales que han sido identificadas".

Prevemos que el antígeno potente que presenta la capacidad de las células Langerhans epidérmicas se pueda explotar para vacunas suministradas transcutáneamente. Una respuesta inmune transcutánea que utiliza el sistema inmune de la piel requeriría el suministro del antígeno de vacuna solamente a las células Langerhans. En el estrato corneo (la capa mas exterior de la piel que consiste de células calificadas de callo y lípido) por vía de la difusión pasiva y la subsecuente activación de las células Langerhans para tomar antígeno migrar a los folículos de célula B y/o a las regiones dependientes de célula T y presentar el antígeno a las células B y/o T. si los antígenos diferentes de bAREs (por ejemplo el toxoide de difteria) van hacer fagocitados por las células Langerhans, entonces estos antígenos también podrían tomas el nodo linfático para la presentación a las células T y posteriormente inducir una respuesta inmune específica para ese antígeno (por ejemplo toxoide de difteria). Así, una característica de la inmunización trnascutánea es la activación de las células Langerhans presumiblemente por exotoxinas ribolisantes de ADP, sus unidades que se unen a exotoxina ribolisante de ADP (por ejemplo su unidad B de la toxina del cólera), u otros adyuvantes y sustancia que activa la célula langerhans. Incrementado la población de la piel de las células Langerhans que utilizan estrategias tales como limpieza con acetona, se podría entonces esperar que mejorara la respuesta inmune transcutánea.

El espectro de las respuestas inmunes de la piel mas comúnmente conocidas representa por la dermatitis de contacto y atopia. La dermatitis de contacto, una manifestación patogénica de la activación LC esta dirigida por las células Langerhans que fagocitan antígeno, migran a los nódulos linfático, presenta antígeno, y sensibilizan las células T que migran a la piel y originan la respuesta celular destructiva intensa que ocurre en los sitios de piel afectados (Dahl, 1996; Leung, 1997). La dermatitis atópica puede utilizar las células langerhans de forma similar, pero se identifica con las células Th2 y se asocia generalmente con altos niveles de anticuerpo y IgE (Dahl, 1996; Leung, 1997).

La inmunización transcutánea con la toxina del cólera y los bAREs relacionados de otra parte es una respuesta inmune novedosa con ausencia de hallazgos de piel pos inmunización superficiales y microscópicos (es decir, que non-inflamada) mostrada por la ausencia de la infiltración de linfocitos 24,48 y 120 horas después de inmunización. Esto se muestra de manera impactante al completar el ensayo fase I en el cual fueron inmunizados humanos con LT bajo un parche oclusivo simple. Fueron estimulados los anticuerpo IgG y IgA anti LT potentes. Dos voluntarios tuvieron biopsias desarrolladas en el sitio de la inmunización. La evaluación microscópica confirmo la observación química de que no fue vista inflamación. Estos sugiere que las células Langerhans que "comprenden toda la actividad celular accesoria que esta presente en la epidermis no inflamada, y en el paradigma habitual son esenciales para la iniciación y propagación de las respuestas inmunes dirigidas contra los antígenos aplicados epicutáneamente" (Udey, 1997) pude haber sido reclutada. La unicidad de la respuesta inmune transcutánea aquí también se indica tanto por los altos niveles de anticuerpo IgG específico de antígeno, como el tipo de anticuerpo producido (por ejemplo IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 y IgA) y la ausencia de anticuerpo IgE anti-CT. Sin embargo, otras células inmunes se pueden enganchar o comprometer y la especulación del mecanismo no debe limitar a la invención.

Así, hemos encontrado que las toxinas derivadas de bacterias aplicadas a la superficie de la piel pueden activar las células Langerhans y que el TCI induce una respuesta inmune potente manifestada como altos nivel es de los anticuerpos IgG circulantes específicos de antígeno y se esperaría que la mejora de la penetración mejoraría la respuesta inmune. El mejorador de adyuvante y penetración transcutánea se puede utilizar en inmunización transcutánea para mejorar el anticuerpo IgG o la respuesta de célula T a proteínas de otra manera no inmunogénicas por ellas mismas cuando se colocan sobre la piel.

El apuntamiento transcutánea de las células Langerhans también se pueden utilizar para desactivar su función que presenta antígeno, evitando de esta manera la inmunización o la sensibilización. Las técnicas para movilizar las células Langerhans u otras células inmune de la piel a un modulándolas en negativamente incluyen, por ejemplo, el uso de agentes de esteroides y no esteroides anti-inflamatorios (NSAID), ciclofosfamida u otros inmunosupresores, interleuquin-10, anticuerpo monoclonal TGF\beta a la interleucina-1 e inhibidores de ICE o vaciamiento por vía de los super antígenos tal como el vaciamiento de la célula Langerhans epidérmica inducida por enterotoxina-A de estafilococo (SEA).

La inmunización transcutánea se puede inducir por vía de la activada de GM1 de gangliósido del CT LT o las subunidades tales como el CTB. El GM1 de gangliósido es un glicolípido de la membrana celular ubicua encontrada en todas las células de mamífero. Cuando las subunidad CTB pentamérica se une a la superficie celular se forma un poro hidrofílico que le permite a la subunidad penetrar a través de la bicapa de lípido.

Hemos encontrado que la inmunización transcutánea por CT o CTB puede requerir la actividad de unión GM1 de gangliósido. Cuando los ratones son transcutáneamente inmunizados con CT, CTA y CTB, solamente CT y CTB resultan en una respuesta inmune. El CTA contiene la actividad de exotoxina ribulisante de ADP pero solamente el CT y CTB que contienen la activada de unión son capaces de inducir una respuesta inmune que indica que la subunidad B fue necesaria y suficiente para inmunizar a través de la piel. Nosotros concluimos que la célula Langerhans u otras células inmunes pueden ser activadas por medio de la unión de CTB a su superficie celular, pero mas activadas por la presencia habitual de la subunidad A.

Además de la activación del componente de la piel en el proceso de inmunización de la presente invención, el antígeno y/o adyuvante se puede activar para mejorar la inmunización. Cuando se secreta CT, ocurre división en el sitio de reconocimiento de tripsina y la toxina es activada. Sin embargo, el LT es secretado con su sitio de reconocimiento de tripsina intacto. Cuando se secreta LT en el tracto gastrointestinal y se expone de esta manera a los agentes gastrointestinales tales como la tripsina, los residuos proteolíticamente sensibles que se unen a la subunidades A1 y A2 del LT son divididos, permitiéndole a la subunidad A1 ribolizar con ADP las proteínas G y por lo tanto ejercer sus efectos tóxicos. La falta de tripsina o agentes relacionados en la piel puede evitar la edición de tripsina de los residuos proteolíticamente sensibles que se unen a las subunidades A1 a A2 del LT, desminuyendo su actividad adyuvante.

Estas dos enterotoxinas bacteriana tienen muchas características en común. El LT y CT tienen el mismo número de subunidades (A2:B5) y disposición, y el mismo mecanismo biológico de acción. La similitud de la secuencia de aminoácido del 75-77% se encuentra en ambas cadenas cuando se comparan el LT y el CT, y ocurren una diferencia más significativa en las cadenas A en las posiciones 192-195. En este sitio la división de la cadena A por tripsina ocurre en el sitio que se sitúa entre los dos residuos de cisteína que forman la unión de sulfuro interna de la cadena A. ver, por ejemplo, Mekalanos et al. (1979), Spangler (1992), y Sniderman (1995). Proponemos que estas diferencias estructurales entre las moléculas sean una influencia significativa no solamente sobre sus propiedades enterotóxicas, sino también en su capacidad para funcionar como adyuvante.

A diferencia del CT producido por el V. colerae, LT no es activo biológicamente de manera completa cuando se aísla primero de la célula bacteriana. Consistente con el modelo A-B para las toxinas bacterianas, el LT requiere la proteolisis de tripsina y la reducción del disulfuro para ser completamente activa (Sniderman, 1995). En la ausencia del procesamiento proteolítico, en la porción A1 enzimáticamente activa es incapaz de disociarse del componente A2 y no puede alcanzar su sustrato objetivo (adenilato ciclasa) sobre la superficie basolateral de la célula epitelial del intestino. Esta diferencia en la activación del material aislado da como resultado diferencias en los umbrales de respuesta para el LT y CT en los sistemas biológicos. Por ejemplo, el CT induce una secreción de fluido neto detectable en el intestino de ratón a una dosis de 5 a 10 \mug. el LT induce la secreción neta detectable en este ensayo a 50 a 100 \mug. en el aro ileal ligado a conejo, la diferencia es más dramática y el corte claro. Sin embargo significativamente, cuando el LT se expone a las enzimas proteolíticas con especificidad similar a tripsina, la molécula se vuelve indistinguible del CT en un sistema de ensayo biológico (Clements y Finkelstein, 1979; Dickenson y CLements, 1995).

De acuerdo a Spangler (1992, citas omitidas):

``La subunidad A se sintetiza como un polipéptido simple tanto como en V. colera y E. coli. El CTA es proteolíticamente "cortado" entre los residuos 192 y 195 durante las secreción del vibrio por la hemaglutinina/proteasa del V. cólera dando origen a dos polipéptidos, A1 (Mr = 28.826) y A2 (Mr = 5.407), covalentemente ligados a través de un puente de sulfuro entre los residuos 187 y 199. En contraste, el LT permanece en el periplasma del E. coli y no es cortado. Introducido en una sepa de V. colerae trabajada por ingeniería genética el LT permaneció sin cortar aunque este se secretó de la misma manera como el CT. El procesamiento proteolítico no es por lo tanto un prerrequisito para la secreción. El LTh purificado, puede, sin embargo, ser corta in vitro sugiriendo que el vibrio mutante utilizado por Hirst et al contenía insuficiente hemaglutinina soluble para catalizar el corte, en lugar de indicar una incapacidad de LTA a ser cortado. El CT, cuando se introdujo por vía de un plásmido trabajado por ingeniería en el E. coli, permaneció sin cortar y la célula asociada en el E. coli. Por lo tanto, el defecto en el procesamiento del CT y del LT en el E. coli, se relaciona con la falla del E. coli para cortar y secretar cualquier toxina. Este defecto puede explicar la severidad reducida de la enfermedad entérica inducida por el E. coli cuando se compara con el cólera. En ambos CT y Lt, el enlace de unión de sulfuro A1 y A2 permanece sin reducir y las toxinas están por lo tanto esencialmente inactivas, hasta que entran a la célula.

"Tanto la subunidad intacta A como la halotoxina son ADP-ribosiltransferazas relativamente inactivas comparadas con el polipéptido A1. La actividad catalítica requiere la reducción de enlace de la unión de sulfuro (A 1:Cys-187-A2:Cys-199) A1 a A2. La división (corte) entre los residuos A1-Arg 192 y el inicio del polipéptido A2 en A2: Met-195 tiene lugar entre la secreción de Ct del vibrio. La digestión tríptica sirve para el propósito in vitro para LT. La reducción, que libera el CTA1 del CTA2, se puede lograr por una variedad de agentes, usualmente ditiotreiton o 2-mercaptoetanol in vitro o una oxireductasa tiol: proteína. El agente reductor endógeno y los mecanismos de reducción no son conocidos. Un resano de tiempo observado de aproximadamente 16 min entre la unión aparente de la toxina al receptor de membrana y la primer aparición del sustrato modificado intracelularmente se puede relacionar con el tiempo requerido para que ocurra esta etapa o durante la inserción o translocación".

El LTH representa LT holoenzima. Así, si la LT tratada con tripsina fuera hacer utilizada para la inmunización transcutánea, proponemos mecanismos similares para que ocurriera la ruptura de las uniones de sulfuro. Esto se puede mostrar para la activación tripsina del LT en el cual el LT activado por tripsina es similarmente potente o de mayor potencia comparado con el CT y mucho mayor en potencia al LT no tratado en bioensayo Y-1 en ratón (ver Dickinson y Clements, 1995).

Proponemos activar los componentes de la formulación tal como el LT utilizando tripsina o compuestos similares antes de la aplicación a la piel para mejorar la actividad adyuvante y la inmunogenicidad del LT. La activación del LT también se podría esperar que mejorar la respuesta inmune al LT como un antígeno. El adyuvante para la inmunización transcutánea es preferiblemente una exotoxina de ADP ribosilante. Opcionalmente, la hidratación o los vendajes de hidratación oclusivos se pueden utilizar en el sistema de suministro transcutáneo además de la activación del adyuvante.

Además, el LT tiene una afinidad inusual para las matrices que contienen carbohidratos. Específicamente, el LT se une a un arreglo de moléculas biológicas que contiene galactosa incluyendo glicoproteínas y lipopolisacáridos. Esta propiedad de unión similar alectina del LT da como resultado una distribución del receptor mas amplia sobre las células de mamífero para LT que para CT la cual se une solamente a GM1. Las dos moléculas también tienen muchas diferencias inmunológicas, como se demostró mediante estudios de inmunodifusión, contra diarrea por E. coli asociada a LT en voluntarios que recibieron la vacuna del cólera de ser una completa con subunidad B total. El LT y el CT inducen diferentes respuestas de célula T adyuvante. Cuando se utiliza como un adyuvante de mucosa el CT induce selectivamente en algunos casos las células tipo Th2 en parches Peyers y vasos como se manifestó mediante la producción de las interleucinas 4 y 5, pero no interleucinas 2 o interferón gamma; mientras que el LT induce tanto células Th1 como Th2 y respuestas IgA predominantemente específicas de antígeno. Tomados juntos, estos hallazgos demuestran que el LT y CT son moléculas únicas, a pesar de sus similitudes estructurales aparentes. Tal comportamiento diferencial hace que la capacidad de activar el LT de tal forma que este tenga potencia similar al CT útil en la manipulación en el tipo de respuesta inmune producida tanto en la toxina misma como en los antígenos para los cuales el LT se puede utilizar como un adyuvante. También puede ser posible que toxoides genéticamente alterados tales como los mutantes y el sitio de clivaje de tripsina se pueda activar mediante inmunización transcutánea. Tal toxina mutante puede ser útil en la medida que esta emite el riesgo asociado con la ingestión o inhalación de toxinas nativas.

De manera similar, el PT puede activar para mejorar sus actividades de adyuvante y antígeno. La subunidad S1 de la proteína PT hexamérica contiene la actividad ADp-ribosiltransferasa aunque las subunidades restantes constituyen el dominio B. similar al LT, el PT tiene ambos sitios de división de tripsina y los sitios de unión de disulfuro que juegan un papel en la asociación de las subunidades S1 con el oligómero B. es concebible que la activación mediante edición de tripsina, la ruptura de la unión disulfuro o ambos puedan mejorar las actividades del adyuvante y el antígeno del PT en el contesto de la inmunización transcutánea. La activación también puede tomar la forma del blanco, logrado por el rompimiento del hexámero en subunidades. Por ejemplo, las subunidad PT S3 según exclusivamente a los glicolípidos de los monolitos y se podría utilizar como las células Langerhans blanco en la piel.

La activación del antígeno o adyuvante se podría extender al concepto de la inmunización transcutánea que utiliza el ADN mediante la producción de un proteína de fusión comprendida de dominios de antígeno y adyuvante mediante este método, un plasmado que codifica una hexotoxina ADP-ribosilante tal como CT o LT y construida para expresar un antígeno separado tal como un antígeno de malaria o VIH podría ser colocado simultáneamente sobre la piel en una solución hidratante o un parche oclusivo, y luego ser tomado por las células Langerhans. La expresión del componente de exotoxina ADP ribosilante de las proteínas de fusión tal como las CT o LT podría activar las células Langerhans, haciendo que esta migre y que presente antígeno en el nódulo linfático y de esta manera inducir una respuesta inmune al antígeno codificado. Otra modalidad podría incluir la conjugación de un adyuvante con un plásmido; una porción Fc del IgG a un plásmido a los APCs blanco. Una inmunización similar se podría lograr utilizando los plasmados separados para expresar una exotoxina ADP ribosilante tal como CT o LT y otra para expresar el antígeno tal como un antígeno de malaria o VIH. Es concebible que múltiples genes sobre una construcción simple para múltiples antígenos se pudieran utilizar múltiples plásmidos para suministrar simultáneamente antígenos para inmunización multivalente. Los plásmidos que codifican otras moléculas o compuestos tales como las quimioquinas (por ejemplo, defensinas 1 y 2, Rantes, MIP1-\alpha, MIP-2, interleucinas-8) o una citoquina (por ejemplo, interleucina-1\beta, -2, -6, -10 o -12; \gamma-interferón; factor de necrosis tumoral-\beta; o colonia de granulocitos-monocito) (revidado en Noria y Rubin, 1994), una proteína o un derivado de choque de calor, un derivado de LelF principal de Leismania(Skeiki et al., 1995), la toxina B de la toxina de cólera, un derivado de lipopolisacárido (LPS) (por ejemplo, lípido A o monofosforil lípido A), o un superantígeno (Saloga et al., 1996), u otras exotoxinas ADP-ribosilantes se podrían suministrar con antígenos de proteína.

Otros medios para activar los adyuvantes transcutáneos pueden ser efectivos, tal como agregar detergente y fosfolípidos a la formulación para mejorar la actividad CT y el factor de ribosilación ADP (ver, por ejemplo, Spangler, 1992).

Para la inmunización utilizando la activación de adyuvante o antígeno, la modificación del componente de adyuvante o antígeno de la formulación puede reducir su efectividad en la inmunización parenteral sin destruir la utilidad de la formulación en la inmunización transcutánea cuando se activa el adyuvante y/o antígeno. Las propiedades indeseables (por ejemplo toxicidad, reactividad alergia a otros efectos colaterales) o el adyuvante o antígeno en la formulación se puede reducir mediante la modificación sin destruir su efectividad en la inmunización transcutánea. La activación de tal adyuvante modificado o antígeno puede involucrar, por ejemplo, la remoción de una modificación química reversible (por ejemplo proteólisis) o un recubrimiento que aislé reversiblemente un componente de la formulación proveniente del sistema inmune (es decir una formulación en capsulada). Alternativamente, el adyuvante y/o antígeno que comprende la formulación se puede encapsular en una partícula (por ejemplo microesfereas, nanopartículas). La fagositosis de una partícula puede en si misma, mejorar la activación de la célula que presenta antígeno al sobreregular la expresión de los antígeno de histocompatibilidad principales, y/o las moléculas coestimuladoras (por ejemplo clase II de MHC B7-2).

Antígeno

El antígeno utilizado en la invención se puede expresar mediante medios recombinantes, preferiblemente como una fusión con la etiqueta de afinidad o epítopo (Summer y Smith, 1987; Goeddel, 1990; Ausubel et al 1996); la síntesis química de un oligopéptido, libre o conjugado a proteínas portadoras, se puede utilizar para obtener el antígeno utilizado en la invención (Bodanszhy, 1993; Wisdom, 1994). Los oligopéptidos se consideran un tipo de polipéptido. Las longitudes de los oligopéptidos de 6 residuos a 20 residuos son las preferidas. Los polipéptidos también se pueden sintetizar como estructura ramificada tales como aquellas descritas en la patente U:S. No. 5.229.490 y 5.390,111. Los polipéptidos antigénicos incluyen, por ejemplo, epítopos de células B y célula T sintéticos o recombinantes, los epítopos de célula T universales, y los epítopos de célula T mezclados provenientes de un organismo o enfermedad de epítopos de célula B provenientes de otra. El antígeno obtenido a través de medios recombinantes o síntesis de péptido así como también el antígeno utilizado en la invención obtenida de fuentes naturales o extractos, se pueden purificar por medio de unas características físicas y químicas de antígeno, preferiblemente mediante fraccionamiento o cromatografía (Janson y Ryden, 1989; Deutscher, 1990; Scopes, 1993). Una formulación de antígeno multivalente se puede utilizar para inducir una respuesta inmune a más de un antígeno al mismo tiempo. Los conjugados se pueden utilizar para inducir una respuesta inmune a antígenos múltiples, para reforzar la respuesta inmune, o ambas adicionalmente, las toxinas se pueden reforzar mediante el uso de toxoides, o toxoides reforzados mediante el uso de toxinas. La inmunización transcutánea se puede utilizar para reforzar las respuestas inducidas inicialmente por otras rutas de inmunizaciones tales como, las rutas oral, nasal o parenteral. El antígeno incluye, por ejemplo, toxinas, toxoides, subunidades de estos o combinaciones de estos (por ejemplo toxina del cólera, toxoide del tétano); adicionalmente, las toxinas, toxoides, subunidades de estos o combinaciones de estos pueden actuar tanto como antígeno como adyuvante.

El antígeno se puede solubilizar en un amortiguador. Los amortiguadores adecuados incluyen, pero no están limitados a, solución salina amortiguada con fosfato Ca^{++}/Mg^{++} libre (PBS), solución salina normal (150 mM NaCl en agua) y amortiguador de Tris. El glicerol puede ser un amortiguador no acuoso adecuado para uso de la presente invención. El antígeno también puede ser estar en suspensión. El detergente puede ser dejado en la solución inmunizante para mejorar la penetración.

El antígeno hidrófobo se puede solubilizar en un detergente, por ejemplo un polipéptido que contiene un dominio que abarca la membrana. Adicionalmente, para las formulaciones que contiene liposomas, un antígeno en una disolución detergente (por ejemplo un extracto de membrana de célula) si se puede mezclar con los lípidos, y los liposomas entonces se pueden formar mediante la remoción del detergente mediante dilución, diálisis, o cromatografía de columna. Ver, Gregoriadis (1993). Ciertos antígenos tales como, por ejemplo, aquellos provenientes de un virus (hepatitis A) no necesita ser soluble per se, pero se puede incorporar directamente en una membrana de lípido (por ejemplo un virosoma como se describió en Morein y Simona, 1985), en una suspensión de un virion solo, o suspensiones de nano partículas microesferas o bacterias inactivadas con calor que se pueden tomar y activar las células que presentan antígeno (por ejemplo opsonizacion).

Plotkin y Mortimer (1994) suministran antígenos que se pueden utilizar para vacunar animales o humanos para inducir una respuesta inmune específica para patógenos particulares, así como también métodos para preparar el antígeno, determinar una dosis de antígeno adecuada, ensayar para la inducción de una respuesta inmune y tratar la infección mediante un patógeno (por ejemplo bacteria, virus, hongo, o parasito).

La bacteria incluye, por ejemplo: ántrax, campilobacter, cólera, clostridia, difteria, E. coli enterotoxigenica, giargia, gonococus, helicobacter pilori y ureasa producida por H. pilori (lee y Chen, 1994), hemofilus influenza B, Hemofilus influenza no tipable, meningococos, micobacterium, pertusis, neumococo, salmonera, shígella, estafilococus, estreptococus B, tétano, vibrio cólera, borrelia burgdorfi y Yersinia; y productos de estos.

Los virus incluyen por ejemplo: adenovirus, serotipos dengue 1 a 4 (Delenda et al 1994., Fonseca et al 1994; Smucny et al, 1995), ébola (Jahrling et al, 1996), enterovirus, virus del anta, cerotitos de hepatitis A a E (Blue, 1995, Katkov, 1996; lieberman y Greenberg, 1996; Mast, 1996; Shafara et al, 1995; Smedila et al, 1994; U:S: patente No. 5.314.808 y 5.436.126), virus herpes simples 1 y 2, virus de la inmunodeficiencia humana (Deprez et al, 1996), virus del papiloma humano, influenza, sarampión, Norwalk, encefalitis equino japonesa, virus del papiloma, parbovirus B19, polio, rabias, virus sincitial respiratorio, rotavirus, rubela, rubéola, encefalitis de St. Luís, Vaccinia, genes que contiene construcciones de vaccinia que codifican para otros genes tales como antígenos de malaria, varicela, y fiebre amarilla; y productos de estos.

Para los parásitos incluyen por ejemplo: entamoeba histolitica (Zhang et al; 1995); Plasmodium (Bathurst et al, 1993; Cheng et al; 1989, 1992, 1994; Fries et al., 1992b; Herrington et al., 1991; Khusmith et al., 1991; Malik et al., 1991; Migliorini et al., 1993; Pessi et al., 1991; Tam, 1988; Vreden et al., 1991; White et al., 1993; Wiesmueller et al., 1991), Leishmania (Frankenburg et al., 1996), y el Helmintos, y productos de estos.

Otros virus que se puede utilizar en la presente invención se describen en Gordón, 1997 e incluye, por ejemplo, adenovirus (enfermedad respiratoria), coronavirus (enfermedad respiratoria y entérica), citomegalovirus (mononucleosis), virus del dengue (fiebre del dengue, síndrome de shock), el virus de Epstein Barr (mononucleosis, linfoma de Burkitt's), virus de la hepatitis A, B y C (enfermedad del hígado), virus herpes simples tipo 1 (encefalitis, estomatitis) virus herpes simples tipo 2 (lesiones genitales), herpes virus humano-6 (desconocido, posiblemente sarcoma de Kaposi's), virus de la inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2 (síndrome de la inmunodeficiencia adquirida sida), virus linfotropico de célula T humano tipo 1 (leucemia de célula T), influencia A, B, y C (enfermedad respiratoria), virus de la encefalitis japonesa (neumonía, encefalopatía), virus del sarampión (panencefalitis esclerosante o aguda), virus de las paperas (meningitis, encefalitis), papilomavirus (verrugas carcinoma cervical), palvovirosis enfermedad respiratoria, anemia), poliovirus (parálisis), poliomavirus JC (leucoencefalopatia multifocal), poliomavirus BK (cistitis hemorrágica), virus de la rabia (disfunción nerviosa), virus sincital respiratoria (enfermedad respiratoria), rinovirus (resfriado común), rotavirus (diarrea), virus rubéola (malformaciones fetales), virus vaccinia (infección generalizada), virus de la fiebre amarilla (ictericia, falla renal y hepática), virus zoster de varicela (virus del pollo).

Otras bacterias que se pueden utilizar en la presente invención se describen en Gordón, 1997 e incluyen, por ejemplo, bacilums antracis (ántrax), bordela pertusis (tosferina), borrelia burgdorferi (enfermedad de lime), canfilobacter de jejuni (gastroenteritis), clamidia trachomatis (enfermedad inflamatoria pélvica, ceguera), clostridium botulinum (botulismo), corinebacterium difteriae (difteria), escherichia coli (diarrea, infecciones del tracto urinario), hermofilus influencia (neumonía), elicobacter pilori (gastritis, un seduoadrenal), neumofila legionela (enfermedad de los legionarios), listeria monocitogenes (meningitis, sepsis), micobacterium lepra (lepra), micobacterium tuberculosis (tuberculosis), neiseria gonorrea (gonorrea), neiseria meningiditis (sepsis, meningitis), seudomonas aeruginosa (infecciones nosocomiales), seudomonas aeruginosa (infecciones nosocomiles), riscketsia (fiebre de manchas de las montañas rocosas), salmonela (fiebre tifoidea, gastroenteritis), shigella (disentería), estafilococos aureus (impectigo, síndrome de choque tóxico), estreptococos neumonía (neumonía, otitis media), estreptococos piogenes (fiebre reumática, faringitis), treponema palidum (sífilis), vibrio cólera (cólera), yersinia pestis (peste bubónica).

Otros parásitos que se pueden utilizar en la presente invención se describen en Gordón, 1997 e incluyen, por ejemplo, África tripanosomas (tripansomiasis), entamoeba histolítica (disentería amebiana), giardia lamblia (enfermedad de diarrea), leismania (lesiones del vaso, yagas tropicales), plasmodium (malaria), microfiliariae (filariasis), esquistosomes (esquistosomiasis), toxoplasma gondii (toxoplasmosis), tricomonas vaginales (vaginitis), tripanosoma cruzi (enfermedades Chagas).

Los hongos que pueden ser utilizado en la presente invención se describen en Gordón, 1997 e incluyen, por ejemplo, candida albicans (infecciones de la mucosa), histoplasma (pulmón, infecciones de los nódulos linfáticos), neumocistis carinii (neumonía en sida), aspergilus fumigatis (aspergilosis).

Adyuvante

La formulación también contiene un adyuvante, aunque una molécula simple puede contener tanto propiedades adyuvantes como de antígeno (por ejemplo, toxina del cólera) (Elson y Dertzbaugh, 1994). Los adyuvantes son sustancias que son utilizadas para potenciar específica o no específicamente una respuesta inmune específica de antígeno. Usualmente, el adyuvante en la formulación se mezclan antes de la presentación del antígeno, pero alternativamente, ellos se pueden presentar separadamente dentro de un corto intervalo de tiempo.

Los adyuvantes son usualmente productos de bacterias, parásitos o a un virus o bacterias pero se pueden derivar de otras fuentes naturales o sintéticas. Los adyuvantes incluyen por ejemplo, una emulsión de aceite (por ejemplo adyuvante de Freund's completo o incompleto), una quimioquina (por ejemplo defensinas 1 y 2, RANTES, MIP1-\alpha, MIP-2, interleucina-8) o una citoquina (por ejemplo interleucina1\beta, -2, -6, -10 o-12; \gamma-interferón; factor de necrosis tumoral -\alpha; un factor estimulante de colonia granulocito-monocito) (revisado en Nohria y Rubin, 1994), un derivado de muramil dipéptido (por ejemplo murabutido, treonil-MDP o muramil tripéptido), una proteína de choque de calor o un derivado de Leishmania mayo LelF (Skeiky et al., 1995), toxina del cólera o toxina del cólera B, bARES, un derivado de lipopolisacárido (LPS) (por ejemplo un lípido A o un monofosforil lípido A, análogos de lípidos A sintético), o un superantígeno (Saloga et al., 1996) copolímeros de bloque u otros polímeros conocidos en la técnica. También, ver Richards et al (1995) para otros adyuvantes útiles en la inmunización.

Un adyuvante se puede escoger para inducir preferencialmente anticuerpo o efectuadotes celulares, isotipos de anticuerpo especifico (por ejemplo IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgA secretorio, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4), o subconjuntos de célula T específicos (por ejemplo CTL, Th1, Th2 y/o T_{DTH}) (Munoz et al., 1990; Glenn et al., 1995).

Los CpGs están entre las clases de estructuras que tiene patrones que le permiten al sistema inmune reconocer sus orígenes patogénicos para estimular la respuesta inmune innata que conduce a respuestas inmunes adaptativas (Medzhitov y Janeway, 1997). Estas estructuras son denominadas patrones moleculares asociados a patógeno (PAMPs) e incluyen lipopolisacáridos, ácidos teichoico, motivos CpG no metilados, ARN de cadena doble y maninas por ejemplo.

Los PAMPs inducen señales de daño endógeno que pueden mejorar la respuesta inmune, actúan como coestimuladores de la función de la célula T y el control de la función efectuadota. La capacidad de los PAMPs para inducir esta respuesta juegan un papel en su potencial como adyuvantes y sus blancos son los APCs tales como las células macrófagas y dendríticas. Las células que presentan antígeno de la piel podrían de manera similar ser estimuladas por los PAMPs trasmitidos a través de la piel. Por ejemplo, las células de Langerhans, una tipo de célula dendrítico, se podría activar mediante un PAMP en solución sobre la piel con una molécula inmunogénica transcutáneamente pobre y ser inducida para migrar y presentar esta molécula pobremente inmunogénica a las células T y a los nódulos linfáticos, induciendo una respuesta de anticuerpo a la molécula pobremente inmunogénica. Los PAMPs también se podrían utilizar en conjunto con otros adyuvantes de la piel tales como la toxina del cólera para inducir diferentes moléculas coestimuladoras y controlar diferentes funciones efectuadotas para guiar la respuesta inmune, por ejemplo desde una respuesta Th2 a Th1.

La toxina del cólera es una exotoxina bacteriana de la familia de las exotoxinas ADP ribosilantes (denominadas como bAREs). La mayoría de los bAREs son organizados como un dimerados A:B con una subunidad B de unión y una subunidad A que contiene la ADP ribosiltrasferasa. Algunas toxinas incluyen difteria, exotoxinas de seudomonas A, la toxina de cólera (CT), la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT), la toxina de pertusis (PT), la toxina de C. botulinum C2, la toxina de C. botulinum C3, la exoenzima de C. limosum, la exoenzima B. cereus, la exotoxina S. pseudomonas, el EDIN estafilococos aureus y la toxina de B. esfericus.

La toxina del cólera es un ejemplo de un bARE que se organiza con una subunidades A y B. La subunidad A es la subunidad de unión y consiste de un pentámero de subunidad B que no esta covalentemente unido a la subunidad A. El pentámero de la subunidad B esta dispuesto en una estructura con forma de una simétrica que se une al gangliósido GM1 sobre la célula blanco. La subunidad A sirve para ribosilar ADP a la subunidad alfa de un subconjunto de unas proteínas GTP hetero trimeritas (proteínas G) que incluye la proteína Gs que da como resultado unos niveles intracelulares elevados de AMP cíclico. Este estimula la liberación de los iones y el fluido proveniente de las células intestinales en el caso del cólera.

La toxina del cólera (CT) y su subunidad B (CTB) tiene propiedades adyuvantes cuando se utiliza como un intramuscular o inmunógeno oral (Elson y Dertzbaugh, 1994; Trach et al., 1997). La entero toxina lábil al calor de la E. coli (LT) es 75-77% homologa al nivel de aminoácido con CT y posee propiedades de uniones similares; también párese unirse al receptor de gangliósido GM1 en el intestino y tiene actividades de exotoxina ADP ribosilantes. Otro bARE, la exotoxina A de las seudomonas (ETA), se unen a la proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad del receptor \alpha2-macroglobulina (Kounnas et al., 1992). Los bAREs son revisados por Krueger y Barbieri (1995). El CT, CTB, LT, ETA y PT, a pesar de tener diferentes sitios de unión celulares, son adyuvantes potentes para la inmunización transcutánea, induciendo altos niveles de anticuerpos IgG pero no anticuerpos IgE. El CTB sin el CT puede también inducir altos niveles de anticuerpos IgG así, ambos bAREs y derivados de estos se pueden inmunizar efectivamente cuando se aplican epicutaneamente a la piel en una solución simple.

Unas vacunas licenciadas requieren un nivel de anticuerpo para aprobación no se utiliza ningún otro componente inmune tal como la proliferación de célula T. La protección contra las difterias infecciosas que amenazan la vida, pertusis, y tétano (DPT) se pueden lograr al inducir altos niveles de anticuerpos de antitoxina circulante. La pertusis puede ser una excepción en que algunos investigadores siente que los anticuerpos dirigidos a otras porciones del organismo que invaden son necesarios para la protección, aunque esto es controversial (ver Schneerson et al., 1996) y la mayoría de las vacunas de pertusis a celular de nueva generación tiene PT como un componente de la vacuna (Krueger y Barbieri, 1995). Las patologías en las enfermedades causadas por DTP están directamente relacionadas con los efectos de sus toxinas y anticuerpo antitoxina mas ciertamente juegan un papel en la protección (Schneerson et al., 1996).

En general, las toxinas se pueden inactivar químicamente para formar toxoides que son menos tóxicos pero permanecen inmunogénicos. Nosotros prevemos que una modalidad del sistema de inmunización trascutáneo utilizara inmunógenos basados en toxina y adyuvante para lograr los niveles de antitoxina adecuados para la protección contra estas enfermedades. Los anticuerpos de antitoxina se pueden inducir a través de la inmunización con las toxinas, o los toxoides mismos genéticamente detoxificados o con toxoides y adyuvantes tales como CT. Las toxinas genéticamente toxoides que tiene actividad de exotoxina ADP ribosilante alterada, y mutaciones de sitio de división de tripsina u otras mutaciones se preveen que son especialmente útiles como activadores no tóxicos de las células que presentan antígeno utilizadas en la inmunización transcutánea. Los mutantes basados e inactivar la actividad catalítica de la ADP-ribosiltrasferasa mediante la supresión genética retiene las capacidades de unión, pero les falta la toxicidad, de las toxinas naturales. Esta aproximación se describe por Brunette et al (1994), Rappuoli et al (1995), y Rappuoli et al. (1996). Tales exotoxinas genéticamente toxoides se podrían utilizar para el sistema de inmunización transcutáneo porque ellas no crearían una preocupación de seguridad en la medida en que las toxinas no se considerarían toxicas. Ellas son otras toxinas genéticamente alteradas que tiene, por ejemplo, supresiones del sitio de división de tripsina y utilizan tanto no tóxicos como inmunogénicos sobre la piel. Sin embargo, la activación a través de técnicas tales como la división de tripsina se esperaría que mejorara las calidades adyuvantes del LT a través de la piel que es de encima de tripsina inherentemente faltantes. Adicionalmente, existen varias técnicas para las toxinas químicamente toxoides que puedan dirigir o manejar el mismo problema (Schneerson et al., 1996). Estas técnicas podrían ser importantes para ciertas aplicaciones como especialmente aplicaciones pediátricas, en la cual las toxinas ingeridas (por ejemplo toxina de difteria) podrían posiblemente crear reacciones adversas.

Opcionalmente, un activador de las células Langerhans se pueden utilizar como un adyuvante. Ejemplos de tales activadores incluyen: un inductor de proteína de choque de calor; sensibilizador de contacto (por ejemplo, triniclorobenceno, dinotrofluorobenceno, mostaza de nitrógeno, pentadecilcatecol); toxina (por ejemplo toxina Shiga, enterotoxina B Staph); lipopolisacárido, lípido A, o derivados de estos; ADN bacterial (Stacey et al., 1996) citoquina (por ejemplo factor de necrosis tumoral-\alpha, interleucina-1\beta, -10, -12); iones de calcio en solución; ionoforos de calcio, y quimioquina (por ejemplo defensinas 1 y 2, RANTES, MIP-1\alpha, MIP-2, interluquin-8).

Si un antígeno inmunizante tiene suficientes capacidades de activación de célula Langerhans entonces un adyuvante separado puede no requerirse, como en el caso del CT que es tanto antígeno como adyuvante. Se prevé que las preparaciones de célula completa los virus vivos, los virus atenuados, los plasmados de ADN y el ADN bacterial podría ser suficiente para inmunizar transcutáneamente entonces un adyuvante que este presente. Puede ser posible utilizar bajas concentraciones de sensibilizadores de contacto u otros activadores de células Langerhans para inducir respuesta inmune sin inducir lesiones de la piel.

Aspectos prácticos de la inmunización transcutánea

La inmunización eficiente se puede lograr con la presente invención por que el suministro de transcutáneo del antígeno puede apuntar a la célula Langerhans. Estas células se encuentran en abundancia en la piel y son células que presentan antígeno eficiente que conduce a respuestas de memoria de célula T e inmunes potentes. En razón de la presencia de grandes números de células Langerhans en la piel, la eficiencia del suministro trascutáneo se puede relacionar con el área de superficie expuesta al antígeno y adyuvante. De hecho, la razón de que la inmunización transcutánea sea tan eficiente puede ser que este apunta a un número grande de estas células que presentan antígeno eficiente que la inmunización intramuscular.

Prevemos que la presente invención mejorara el acceso a la inmunización, aunque induciendo una respuesta inmune potente. En razón a que la inmunización transcutánea no involucra la penetración física de la piel y las complicaciones y dificultades de esta, los requisitos del personal entrenado, la técnica estéril, y el equipo estéril se reducen. Adicionalmente, las barreras a la inmunización en sitios múltiples o inmunizaciones múltiples se disminuyen. La inmunización por una aplicación simple las formulaciones también se prevé, pero el refuerzo es generalmente necesario. La inmunización libre de aguja es prioritaria para la organización mundial de la salud (OMS) en razón de la reutilización de agujas que originaria enfermedades a partir de la aguja.

La inmunización se puede lograr utilizando la aplicación epicutanea de una solución simple de antígeno y adyuvante impregnado en gasa bajo un parche oclusivo, o al utilizar otras tecnologías de parche: cremas, geles, inmersión, ungüentos y pulverizados u otros métodos posibles de aplicación. La inmunización podría ser dada por un personal no entrenado, y es adecuado para auto aplicación. La inmunización de campo a gran escala podría ocurrir dada la fácil accesibilidad a la inmunización. Adicionalmente, el procedimiento de inmunización simple mejoraría el acceso a la inmunización por los pacientes pediátricos y por los viejos y las poblaciones de los países del tercer mundo.

Para vacunas previas, sus formulaciones fueron inyectadas a través de la piel con agujas, la inyección de las vacunas utilizando agujas llevan ciertos inconvenientes que incluyen la necesidad de esterilizar agujas y jeringa, personal medico entrenado para administrar la vacuna, incomodidad de la inyección y las complicaciones potenciales que implican la pulsación de la piel con la aguja. La inmunización a través de la piel sin el uso de agujas (es decir la inmunización transcutánea) representa un avance mayor para el suministro de vacuna al evitar los inconvenientes anteriores.

Más aún la inmunización transcutánea se puede ser superior a la inmunización que utiliza agujas como en la medida en que las células mas inmunes sean el blanco al utilizar varios sitios que apuntan a áreas de superficie grandes de la piel. Una cantidad terapéuticamente efectiva de antígeno suficiente para inducir una respuesta inmune se puede suministrar transcutáneamente a un sitio cutáneo o simple, o sobre un área de piel intacta que cubre múltiples campos de nódulos linfáticos drenantes (por ejemplo cervical, axilar, inguinal, epitroquelear, popliteal, aquellos del abdomen y el tórax). Tales localizaciones cerca a numerosos diferentes nódulos linfáticos y sitios todo sobre el cuerpo suministraran un estimulo de amplia dispersión al sistema inmune que cuando una pequeña cantidad de antígeno se inyecta en un sitio simple mediante inyección subcutánea o intramuscular intradérmica.

El antígeno que pasa a través o así la piel puede encontrar células que presentan antígeno que procesan el antígeno de una manera que induce una respuesta inmune. Los sitios de inmunización múltiples pueden reclutar un mayor numero de células que presentan antígeno y una población mayor de células que presentan antígeno que fueron reclutadas darían como resultado una mayor inducción de la respuesta inmune. Es concebible que la absorción a través de la piel pueda suministrar el antígeno a las células fagocíticas de la piel tales como, por ejemplo, las células dendríticas dérmicas, los macrófagos, y otras células que presentan antígeno de la piel; el antígeno también se puede suministrar a las células fagocíticas del hígado, vaso, y la medula espinal que son conocidas por servir como células que presentan antígeno a través del torrente sanguíneo o el sistema linfático. Las células Langerhans, las células dendríticas, y los macrófagos pueden ser específicamente apuntados utilizando el receptor Fc conjugado o recombinantemente producido como una fusión de proteína cuyo adyuvante; también, los receptores de complemento (C3, C5) se pueden conjugar o recombinantemente producir como una fusión de proteína con la proteína A o proteína G a una inmunoglobulina de superficie blanco de células B. El resultado seria una distribución de blanco de antígeno para células que presentan antígeno a un grado que es raro, si es que se logra, mediante las prácticas de inmunización habi-
tuales.

El sistema de inmunización transcutáneo se puede aplicar directamente a la piel y permitírsele secar al aire; ser restregado en la piel o cuero cabelludo; mantenido en su lugar con un emplaste, parche, o material absorbente; inmersión; mantenida de otra manera por un dispositivo tal como una media, zapatilla, o guante, o camisa; o esparcido sobre la piel para maximizar el contacto con la piel. La formulación se puede aplicar en un emplasto o gasa absorbente. La formulación se puede cubrir con un emplasto oclusivo tal como, por ejemplo, AQUAPHOR® (una emulsión de petrolato, aceite mineral, cera mineral, cera de lana, pantenol, bisabol, y glicerina de Beiersdorf, Inc), película plástica, COMFEEL® (coloplasto) o vaselina; o un emplasto no oclusivo tal como, por ejemplo, DUODERM® (3M) u OPSITE® (Smith y Napheu). Un emplasto oclusivo excluye completamente el paso de agua. La formulación se puede aplicar a sitios simples o múltiples, a limbos simples o múltiples, o a áreas de superficie grandes de la piel mediante inmersión completa. La formulación se puede aplicar directamente a la piel.

La inmunización genética se ha descrito en las patentes U.S Nos. 5.589.466, 5.593.972, y 5.703.055. Los ácidos nucleicos contenidos en la formulación pueden codificar el antígeno, el adyuvante, o ambos. Se esperaría de manera general que la respuesta inmune se mejorar mediante la coadministración de un adyuvante, por ejemplo, CT, LT o CPPS al ácido nucleico que codifica para el antígeno. El ácido nucleico puede o no ser capas de replicación; este puede ser no integrante.

Y no infeccioso. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar un polipéptido de fusión que comprende antígeno y un dominio de ubiquitina para dirigir la respuesta inmune a la repuesta restringida de clase I. El ácido nucleico puede adicionalmente comprender una región reguladora (por ejemplo, sitios promotores, mejoradores, silenciadores de transcripción de iniciación y de terminación, aceptor de división de ARN y sitios dolores, señal de poliadenilación, sitio de ligado de ribosoma interno, sitios de iniciación de traducción y terminación) operativamente ligado a la secuencia que codifica el antígeno. El ácido nucleico puede ser complejado con un agente que promueve la transfección tal como un lípido catiónico, fosfato de calcio, DEAE-dextran, polibreno-DMSO, o una combinación de estos, también, las células inmunes pueden ser objetivadas por conjugación de ADN al receptor Fc o a la proteína A/G, o encapsular el ADN en un agente ligado al receptor Fc o la proteína A/G. El ácido nucleico puede comprender regiones derivadas de genomas virales. Tales materiales y técnicas se describen por Kriegler (1990) y Murray (1991).

Una respuesta inmune puede comprender brazos efectores humorales (es decir, anticuerpo especifico a antígeno) y/o celulares (es decir, linfocitos específicos a antígeno tales como células B, células CD4^{+}T, células CD8^{+}T, CTL, células Th 1, células Th 2, y/o células T_{DTH}). Más aún, al respuesta inmune puede comprender células NK que median la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC).

La respuesta inmune inducida por la formulación fabricada de acuerdo con la invención puede incluir la producción de anticuerpos específicos a antígeno y/o linfocitos citotóxicos (CTL, revisado en Alving y Wassef, 1994). El anticuerpo puede ser detectado mediante técnicas de inmunoensayo, y la detección de varios isotipos (por ejemplo, IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgA secretorio, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) puede esperarse. Una respuesta inmune también puede ser detectada mediante un ensayo de neutralización. Los anticuerpos son proteínas protectoras producidas por linfocitos B. Ellas son altamente específicas, generalmente objetivan un epítopo de un antígeno. Frecuentemente, los anticuerpos juegan un papel en la protección contra enfermedades mediante reaccionar específicamente con antígenos derivados de los patógenos que causan la enfermedad.

Los CTL son células inmunes particularmente protectoras producidas para proteger contra la infección por un patógeno. Ellas también son altamente específicas. La inmunización puede inducir CTL específicos para el antígeno, tal como un oligopéptido sintético con base en una proteína de malaria, en asociación con histocompatibilidad propia mayor de antígeno. Los CTL inducidos por inmunización con el sistema de suministro transcutáneo pueden matar las células infectadas con el patógeno. La inmunización puede también producir una respuesta de memoria como se indico mediante promover respuestas en el anticuerpos y CTL, proliferación del linfocito mediante el cultivo de linfocitos estimulados por el antígeno, y respuestas de hipersensibilidad tipo retardadas para los retos de piel intradérmicos del antígeno solo.

En un ensayo de neutralización viral, diluciones seriales del suero son agregadas a células anfitrionas las cuales son entonces observadas en cuanto a la infección después del reto con el virus infeccioso. Alternativamente, las diluciones seriales del suero pueden ser incubadas con títulos infecciosos de virus antes de la inoculación en un animal, y los animales inoculados son entonces observados en cuanto a signos de infección.

El sistema de inmunización transcutánea de la invención puede ser evaluado usando modelos de reto en animales o humanos, los cuales evalúan la habilidad de la inmunización con el antígeno para proteger al sujeto de la enfermedad. Tal protección demostraría una respuesta inmune específica a antígeno. En vez del reto, por ejemplo lograr títulos de anticuerpo antidifteria de 5 IU/ml o mayores son asumidos generalmente como una indicación de protección óptima y sirve como un marcador subrogado para la protección (Plotkin y Mortimer, 1994).

La vacunación también ha sido usada como un tratamiento para el cáncer y la enfermedad autoinmune. Por ejemplo, la vacunación con un antígeno de tumor (por ejemplo antígeno específico a próstata) puede inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos, CTL y proliferación de linfocitos que permiten que le sistema inmune del cuerpo reconozca y mate las células de tumor. Los antígenos de tumor útiles para la vacunación han sido descritos para el menaloma (Patentes Estadounidenses Nos. 5,102,663, 5,141,742, y 5,262,177), el carcinoma de próstata (Patente Estadounidense No. 5,538,866), y el linfoma (Patentes Estadounidenses Nos. 4,816,249, 5,068,177, y 5,227,159). La vacunación con el oligopéptido receptor de célula T puede inducir una respuesta inmune que detenga la progresión de la enfermedad autoinmune (Patentes Estadounidenses Nos. 5,612,035 y 5,614,192; Antel et al., 1996; Vandenbark et al., 1996). La Patente Estadounidense No. 5,552,300 también describe antígenos adecuados para tratar la enfermedad autoinmune.

Lo siguiente tiene propósito de ser ilustrativo de la presente invención en donde el ejemplo 17 no cae dentro del alcance de las reivindicaciones; sin embargo, la practica de la invención no esta limitada o restringida de ninguna manera por los ejemplos.

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Ejemplos

Procedimiento de inmunización. Veinticuatro horas antes de la inmunización, la espalda del ratón es aplicada desde el respeto distante de la escapula hasta 0.5 cm por encima de la base de la cola. En el caso de ratones C57BL/6, los animales son anestesiados ligeramente (40 mg/kg de quetamina: 4 mg/kg de xilazina en solución salina) antes de la afeitada. En el día de la inmunización los animales son inmunizados con 04 ml de una mezcla de anestesia (2.3 mL de salina estéril (Sigma): 5 mL de quetamine (100 mg/mL, Parke-Davis): 0.5 mL de xilazina (100 mg/mL, Phoenix Pharmaceuticals)) que suministran una dosis final de aproximadamente 110 mg/kg de quetamine y 11 mg/kg de xilazina. Para los procedimientos que requieren muestras de alcohol, la espalda es limpiada con 10X (5x de muestra arriba de la espalda hacia la cabeza, voltear la almohadilla de alcohol y limpiar la espalda con 5x más) usando una almohadilla de isopropilo. El alcohol se le ha permitido evaporar durante 5 minutos. La hidratación de la espalda es llevada a cabo mediante frotar suavemente la espalda con una almohadilla de gasa saturada con agua estéril de modo que se forme un grupo de agua sobre la espalda. Después de un periodo de hidratación de 5 minutos, la espalda es secada con una almohadilla de gasa seca. Luego, el volumen final de antígeno, generalmente menor o igual a 100 \mug de antígeno y el adyuvante en 100 \mul, es aplicado a la espalda usando una pipeta y una punta y se deja sobre la piel durante 60 a 120 minutos. Después de que le periodo definido de inmunización ha sido alcanzado, cualquier exceso de solución en el área inmunizada es retirado con una gasa de algodón. Los animales son entonces enjuagados bajo una corriente constante y lenta de agua corriente tibia durante 10 segundos para remover cualquier exceso de antígeno, se limpia seco y el procedimiento de enjuague es repetido. Las jaulas son entonces colocadas en almohadillas de calentamiento hasta que los ratones son completamente recuperados de la anestesia.

Medición de los Títulos de Anticuerpo Anti-LT Humanos. Los títulos anti-LT IgG fueron determinados como se describió previamente (Svennerholm A-M., Holmgren, J., Black, R., Levine, M. & Merson, M. Serologic differentation between antitoxin responses to infection with Vibrio cholerae and enterotoxin-producing Escherichia coli. J. Infect. Dis. 147,541-522 (1983).Placas de 96 pozos (Tipo-Russell) fueron recubiertas durante la noche con monosialogangliosida-G_{M1}, (Sigma, St. Louis, MO) de LT (Sigma), se bloqueó con 5% de leche seca en PBS-0.05% Tween. Las respuestas fueron detectadas usando IgG (\gamma)-HRP antihumano de cabra (Kirkegaard y Perry, Gaithersburg, MD., y sulfonato de 2,2'-azino-di[3-etilbenztiazolina (Kirkegaard y Perry) como substrato y las placas fueron leídas en 405 nm. Los resultados se han reportado en unidades ELISA (EU) que están definidas como la dilución inversa de la muestra lo que produce un OD de 1.0. El IgA anti-LT fue determinado de la misma manera que el IgG anti-LT excepto que el IgA (\alpha)-HRP antihumano de cabra (Kirkegaard y Perry) fue usado como anticuerpo secundario y los OD fueron graficados contra una curva IgA estándar que produjo los resultado expresados en ng/ml. La curva IgA estándar y el IgA de suero total fueron determinados mediante usar IgA antihumano de cabra no marcado (Kirkegaard y Perry) seguido por bloqueo de la misma manera que se hizo anteriormente y luego la aplicación de diluciones seriales de IgA estándar

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Ejemplo 1

El refregado de la piel con una esponja tratada o no tratada se piensa que remueve física y químicamente una pequeña porción del estrato corneo y por lo tanto promueve la penetración en la piel. Las esponjas se pueden hacer de materiales tales como, por ejemplo, algodón, nylon, rayón y polietileno. El refregado con alcohol se piensa que remueve una pequeña porción del estrato corneo actúa tanto como un medio físico y un medio químico de mejoramiento de la penetración. En el ejemplo anterior, el mejoramiento de la respuesta inmune a la inmunización transcutánea puede verse con este método de mejoramiento de la penetración. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitados como se describió en el "procedimiento de inmunización". Veinticuatro horas después, las espaldas de los animales se limpiaron con una almohadilla de gasa saturada en agua "agua" o limpiada durante aproximadamente 10 segundos con una almohadilla preparada con alcohol que contiene 70% de alcohol de isopropilo "isopropanol". Al alcohol se le permitió evaporarse durante aproximadamente 5 minutos. El exceso de agua se removió de las espaldas del grupo "agua" mediante un secado. Todos los animales se trataron entonces con 20 Mg de CT (100 \mul de una solución de 0.2 mg/ml). La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización". Los títulos de anticuerpo anti-CT se determinaron utilizando ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)" 3 semanas después de una inmunización única. Los resultados se muestran en la tabla 1. Mientras el CT era claramente inmunogénico en ambos grupos, el grupo tratado con las almohadillas preparadas con alcohol exhibió un título de media geométrica que era 6 veces mayor y los títulos individuales fueron más consistentes con los animales "agua". Por lo tanto parece que la disrupción química y física de la superficie de la piel con el restregado con alcohol mejora el suministro del antígeno mediante la vía transcutánea.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Mejoramiento de la inmunización transcutánea mediante el mejoramiento de penetración química: Títulos anti-CT en ratones que habían sido tratados en la piel con una almohadilla preparada con alcohol antes de la aplicación del antígeno

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Ejemplo 2

Para determinar si el mejoramiento de penetración química solo puede aumentar la inmunización transcutánea un detergente se utilizó sobre la piel. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitados como se describió en el "procedimiento de inmunización". Veinticuatro horas después, las espaldas del grupo "agua" se limpiaron con una almohadilla de gasa saturada en agua y un poco de agua se colocó sobre la espalda.

Aproximadamente 5 minutos después, cualquier exceso de agua se removió y se aplicó 25 \mug de CT (50 \mul de una solución de 0.5 mg/ml) en la espalda. Alternativamente, 24 horas después del afeitado, las espaldas del grupo "5% SDS" se trataron por goteo con 300 \mul de SDS al 5% (Dodecil sulfato de sodio-una mezcla de 1 a 1 de agua desionizada y material comercial de 10% de SDS), un detergente, durante aproximadamente 12 minutos seguido por secado de cualquier exceso de SDS con una almohadilla de gasa seca. El SDS se puede aplicar a la piel en un portador tal como, por ejemplo, una almohadilla y luego cualquier exceso de SDS se puede remover con una almohadilla de gasa seca.

De ahí en adelante los animales se hidrataron e inmunizaron de acuerdo con el grupo "agua".

La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización".

Los títulos de anticuerpo anti-CT se determinaron utilizando ELISA como se describió anteriormente para el "ELISA IgG (H+L)" 2 semanas después de una inmunización única. Los resultados se muestran en las Tablas 2a y 2b. Aunque el CT era claramente inmunogénico en ambos grupos, el título de media geométrica en el grupo tratado con SDS al 5% fue de aproximadamente 2 veces mayor y los títulos fueron más consistentes entre los últimos los animales en comparación con los animales "agua". Por lo tanto parece que la disrupción química de la superficie de la piel con detergente (5% SDS) mejora el suministro del antígeno mediante la vía transcutánea.

TABLA 2a Mejoramiento de la inmunización transcutánea mediante el mejoramiento de la penetración química: Títulos anti-CT en ratones que habían sido tratados en la piel con detergente (5% SDS) antes de la aplicación del antígeno

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TABLA 2b Mejoramiento de la inmunización transcutánea mediante el mejoramiento de penetración química: Títulos anti-CT en ratones que habían sido tratados en la piel con detergente (5% de SDS) antes de la aplicación del antígeno

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Ejemplo 3

Otra forma de mejoramiento en la penetración química, una depilatoria (tal como, por ejemplo, hidróxido de calcio o similar) es ampliamente utilizada en experimentos dermatológicos y mostró que mejora la inmunización transcutánea. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitados como se describió en el "procedimiento de inmunización". Veinticuatro horas después, las espaldas del grupo "agua" se limpiaron con una almohadilla de gasa saturada en agua y un poco de agua se colocó sobre la espalda. Aproximadamente 5 minutos después, cualquier exceso de agua se removió y se aplicó 25 \mug de CT (50 \mul de una solución de 0.5 mg/ml) en la espalda. Alternativamente, veinticuatro horas después del afeitado, las espaldas del grupo "nair®" se trataron con 100 \mul de crema nair® durante aproximadamente 12 minutos seguido por un limpiado de la formulación con una almohadilla de gasa saturada en agua. Tal tratamiento puede continuar desde cerca de 0.1 a 30 minutos preferiblemente cerca de 20 minutos y más preferiblemente cerca de 12 minutos. De ahí en adelante los animales se hidrataron e inmunizaron de acuerdo con el grupo "agua". La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización".

Los títulos de anticuerpo anti-CT se determinaron utilizando ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)" 2 semanas después de una inmunización única. Los resultados se muestran en Tablas 3a y 3b. Aunque el CT era claramente inmunogénico en ambos grupos, el título de media geométrica en el tratado con el grupo nair® fue 3 veces mayor y los títulos fueron más consistentes entre los últimos animales en comparación con los animales "agua". Por lo tanto parece que la disrupción química de la superficie de la piel con hidróxido de calcio, el ingrediente activo en la crema nair®, mejora el suministro de antígeno mediante la vía transcutánea.

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TABLA 3a Mejoramiento de la inmunización transcutánea mediante el mejoramiento de la penetración química: Títulos anti-CT en ratones que habían sido tratados en la piel con hidróxido de calcio (nair®) antes de la aplicación del antígeno

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TABLA 3b Mejoramiento de la inmunización transcutánea mediante el mejoramiento de la penetración química: Títulos anti-CT en ratones que habían sido tratados en la piel con hidróxido de calcio (nair®) antes de la aplicación del antígeno

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Ejemplo 4

Estudios adicionales se condujeron parpara evaluar el efecto del mejoramiento en la penetración química utilizando una formulación queratinolítica (tal como un salicilato). Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitados como se describió en el "procedimiento de inmunización". Veinticuatro horas después, las espaldas del grupo "agua" se limpiaron con una almohadilla de gasa saturada en agua y un poco de agua se colocó sobre la
espalda.

Aproximadamente 5 minutos después, cualquier exceso de agua se removió y 25 g de CT (50 \mul de una solución de 0.5 mg/ml) en la espalda. Alternativamente, veinticuatro horas después de afeitado, las espaldas del grupo "salicilato/agua" se trataron con una almohadilla de gasa saturada con una suspensión de salicilato al 10% (1 Tableta (325 mg) Aspirina de marca registrada disuelta en 3.25 ml agua desionizada). Tal tratamiento puede continuar desde cerca de 0.1 a 30 minutos preferiblemente cerca de 20 minutos y más preferiblemente cerca de 10 minutos.

Aproximadamente 10 minutos después cualquier solución restante se limpió, las espaldas de los animales se hidrataron con agua durante 5 minutos, seguido por la remoción del exceso de agua, y luego la aplicación tópica de 25 \mug de CT. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización".

Los títulos de anticuerpo anti-CT se determinaron utilizando ELISA como se describió anteriormente para el "ELISA IgG (H+L)" 2 semanas después de una inmunización única. Los resultados se muestran en la tabla 4. Aunque el CT era claramente inmunogénico en ambos grupos, el título de media geométrica en el en el grupo tratado con salicilato fue 4 veces mayor y los títulos fueron más consistentes entre los últimos los animales en comparación con los animales "agua". Por lo tanto parece que la disrupción química de la superficie de la piel con salicilato mejora el suministro de antígeno mediante la vía transcutánea.

TABLA 4 Mejoramiento de la inmunización transcutánea mediante el mejoramiento de penetración química: Títulos anti-CT en ratones que habían sido tratados en la piel con salicilato (aspirina) antes de la aplicación del antígeno

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Ejemplo 5

Para determinar el papel del mejoramiento de la penetración física/mecánica, un abrasivo, en la forma de un cartón de esmeril, se utilizó para remover una porción del estrato corneo. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitados como se describió en el "procedimiento de inmunización". Veinticuatro horas después, las espaldas de los animales se limpiaron con una almohadilla de gasa saturada en agua "agua" o cepillados 10 veces con un cartón de esmeril de grano medio "cartón de esmeril," y luego limpiados con una almohadilla de gasa saturada en agua. Aproximadamente cinco minutos después del tratamiento con agua, cualquier exceso de agua se removió y 20 \mug de CT (100 \mu1 de una solución de 0.2 mg/ml) se aplicó en la espalda. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización".

Los títulos de anticuerpo anti-CT se determinaron utilizando ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)" 3 semanas después de una inmunización única. Los resultados se muestran en la tabla 5. Aunque el CT era claramente inmunogénico en ambos grupos, el título de media geométrica en el grupo tratado con el cartón de esmeril fue 10 veces mayor y los títulos fueron más consistentes entre los últimos los animales en comparación con los animales "agua". Por lo tanto parece que la disrupción física de la superficie exterior de la piel con un cartón de esmeril mejora el suministro de antígeno mediante la vía transcutánea. Esto puede ser diferenciado de las técnicas que buscan perforar la piel y suministrar el antígeno a través de la piel, tal como en la inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular.

Este dispositivo simple podría ser reemplazado por otros dispositivos de disrupción física parpara suministrar antígenos y adyuvantes dentro de la epidermis tal como micro agujas que tienen una longitud romper solamente el estrato corneo o la epidermis superficial, dispositivos utilizados para el ensayo tine de la TB, pistolas energizadas por gas que no penetran la dermis, cinta adhesiva para tiras de cinta, o otros dispositivos de rompimiento de barreras conocidos romper solamente el estrato corneo o la epidermis superficial.

TABLA 5 Mejoramiento de la inmunización transcutánea mediante el mejoramiento de la penetración física: Títulos anti-CT en ratones que habían sido tratados en la piel con un cartón de esmeril antes de la aplicación del antígeno

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Ejemplo 6

Otros medios de mejoramiento de la penetración física/mecánica se emplearon utilizando una almohadilla abrasiva para remover una porción del estrato corneo y permitir el acceso a la epidermis subyacente. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitados como se describió en el "procedimiento de inmunización". Veinticuatro horas después, las espaldas de los animales se limpiaron con una almohadilla de gasa saturada en agua,"agua", o limpiada con una almohadilla de gasa saturada en agua seguido por un frotado durante 10 segundos con una esponja de nylon (buf-puf®) para remover las capas más externas del estrato corneo, "buf-puf®". El exceso de agua se removió de las espaldas del grupo "agua" y luego 20 \mug de CT (100 \mul de una solución de 0.2 mg/ml) se aplicó a las espaldas de todos los animales. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización".

Los títulos de anticuerpo anti-CT se determinaron utilizando ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)" 3 semanas después de una inmunización única. Los resultados se muestran en la tabla 6. Aunque el CT era claramente inmunogénico en ambos grupos, el título de media geométrica del grupo tratado con buf-puf® fue 2 veces mayor y los títulos entre animales individuales fueron más consistentes entre los últimos los animales comparados con los animales "agua". Por lo tanto parece que la disrupción física de la superficie de la piel con un buf-puf® mejora el suministro de antígeno mediante la vía transcutánea.

Este dispositivo simple podría ser reemplazado por otros dispositivos de penetración física para suministrar antígenos y adyuvantes dentro de la epidermis tal como una aguja y una jeringa de tuberculina utilizada para inyección intradérmica, micro agujas que son de una longitud penetrar solamente el estrato corneo o la dermis superficial, dispositivos utilizados para el ensayo tine de la TB, parches abrasivos que tienen cristales que se disuelven tales como sacarosa o cloruro de sodio o polímeros biodegradables que están impregnados dentro del parche y se frotan sobre la piel antes de asegurar el parche con el antígeno sea que esté contenido en el cristal o en la matriz, pistolas energizadas por gas, cintas adhesivas para tiras de cinta, o otros dispositivos conocidos penetrar solamente dentro de la epidermis o la dermis superficial.

TABLA 6 Mejoramiento de la inmunización transcutánea mediante el mejoramiento de la penetración física: Títulos anti-CT en ratones que habían sido tratados en la piel con una almohadilla abrasiva (tal como, por ejemplo, buf-puf® antes de la aplicación del antígeno

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Ejemplo 7

La inmunización transcutánea con exotoxinas ribosilantes de ADP bacterial tales como CT y LT parecen suministrar señales de "peligro" significativas al sistema inmune estimulando una respuesta inmune potente. Tales compuestos actúan como adyuvantes. Fue sorprendente encontrar que mezclas simples de tales adyuvantes colocadas sobre la piel en una forma que hidrate la piel, resultan en respuestas inmunes potentes. Esto se describió en una solicitud de Patente anterior (PCT/US97/21324). Sin embargo, dado que un adyuvante tal como CT (86KD) puede actuar como un adyuvante sobre la piel, se esperaría que otros adyuvantes, particularmente aquellos basados en productos o motivos bacterianos, estimularían cuando se colocan sobre la piel en una forma que hidrate la piel y/o con el uso de mejoradores de penetración.

Utilizamos ADN bacteriano para confirmar que esta expectativa es correcta. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad fueron afeitados y anestesiados como se describió anteriormente para el "procedimiento de inmunización". En el día de la inmunización las espaldas de los ratones se limpiaron con isopropanol para mejorar la penetración. Después de que el alcohol se había evaporado (aproximadamente 5 minutos), se aplicó 100 \mul de salina amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 100 \mug de ADN (CpG1 o CpG2) y 100 \mug de toxoide de difteria (DT) se aplicó en la espalda durante 90 a 120 minutos. Los oligonucleótidos se sintetizaron por Oligos Etc con una estructura fosfotiolato para mejorar la estabilidad. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización". La inmunización se repitió 4 y 8 semanas después. Diez semanas después de la primera inmunización los animales se les tomó muestra de sangre y los títulos anti-DT se determinaron utilizando un ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 7A.

La coadministración de DT y una secuencia de ADN de control (CpG2: TCCAATGAGCTTCCTGAGTCT) falló en inducir una elevación detectable en los títulos anti-DT. En contraste, la adición de una secuencia de ADN que contiene un nucleótido CpG no metilado flanqueado por dos 5' y dos 3' pirimidinas (CpGl (ADN inmuno estimulatorio): TCCATGACGTTCCTGACGTT) resultó en un incremento detectable en el suero del título IgG anti-DT en 5 de 5 los animales. Por lo tanto parece que el ADN bacteriano que contiene motivos apropiados tales como CPGs (6KD) pueden ser utilizados como adyuvantes para mejorar el suministro del antígeno a través de la piel mediante la inducción de respuestas de anticuerpos específico a antígeno.

TABLA 7A Actividad del adyuvante de ADN bacteriano aplicado a la piel utilizando mejoramiento en la penetración: respuesta inmune humoral

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El efecto transcutáneo de la inmunización transcutánea puede también ser detectable mediante La proliferación de células T. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad fueron afeitados y anestesiados como se describió anteriormente para el "procedimiento de inmunización". En el día de la inmunización las espaldas de los ratones se limpiaron con isopropanol. Después de que alcohol se había evaporado (aproximadamente 5 minutos), se aplicó 100 \mul de salina amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 100 \mug de ADN (CpGl o CpG2) y 100 \mug de toxoide de difteria (DT) en la espalda durante 90 a 120 minutos. Los oligonucleótidos se sintetizaron por Oligos Etc con una estructura de fosfotiolato para mejorar la estabilidad. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización". La inmunización se repitió 4 y 8 semanas después. Doce semanas después del drenado de la primera la inmunización (inguinal) los LN se removieron y agrupados de cinco animales inmunizados. La capacidad para proliferar en respuesta a el medio o el antígeno (DT) de determinó en un ensayo de proliferación estándar de 4 días utilizando incorporación 3-H como lectura. Los resultados se muestran en la tabla 7B. La coadministración de DT y una secuencia de ADN que contiene un dinucleótido CpG no metilado flanqueado por dos 5' purinas y dos 3' pirimidinas (CpG1 (ADN inmuno estimulatorio): TCCATGACGTTCCTGACGTT) resultó en un incremento detectable en la respuesta proliferativa específica a antígeno. Por lo tanto parece que el ADN bacteriano que contiene los motivos apropiados puede ser utilizado como adyuvante para mejorar el suministro de antígeno a través de la piel para inducir respuestas proliferativas.

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TABLA 7B Efecto del adyuvante de ADN bacteriano aplicado a la piel: Proliferación de células LN

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Ejemplo 8

La inmunización transcutánea con exotoxinas ribosilantes de ADP bacterial tales como CT y LT parecen suministrar señales de "peligro" significativas al sistema inmune estimulando una respuesta inmune potente. Tales compuestos actúan como adyuvantes. Fue sorprendente encontrar que mezclas simples de tales adyuvantes colocados sobre la piel en una forma que hidrate la piel, resultan en respuestas inmunes potentes. Esto se describió en una solicitud de Patente anterior (PCT/US97/21324). Sin embargo, dado que un adyuvante tal como CT puede actuar como un adyuvante sobre la piel, se esperaría que otros adyuvantes, estimularían cuando son colocadas sobre la piel en una forma que hidrate la piel. Las toxinas alteradas genéticamente se utilizaron para confirmar esta expectativa. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron, afeitados, e inmunizaron como se describió en el "procedimiento de inmunización". Los animales se les promovió 3 a 5 semanas después de la primera la inmunización y suero se recolectó 2 semanas después de la inmunización final. Los adyuvantes utilizados fueron toxinas alteradas genéticamente; LTK63, un derivado de LT inactivo enzimáticamente, y LTR72, un derivado de LT que retiene 0.6% de la actividad enzimática. El Toxoide de difteria (DT) 100 \mug se utilizó como antígeno.

Los títulos de anticuerpo anti-DT se determinaron utilizando ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 8. Los títulos anti-DT se elevaron claramente en el suero de los animales inmunizados con LTR63 o LTR72 y DT cuando se comparó con los títulos en el suero recolectado antes de la inmunización (presangrado). Por lo tanto parece que los mutantes detoxificados genéticamente de enterotoxinas lábiles calientes (LT) pueden ser utilizados como adyuvantes sobre la piel.

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TABLA 8 Uso de toxinas alteradas genéticamente, LTK63 y LTR72, como adyuvantes sobre la piel

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Ejemplo 9

Otra clase de compuestos, las citosinas que son conocidas porque actúan como adyuvantes ilustra el principio de que los adyuvantes en general se pueden esperar de ellos que actúen en una forma similar a toxina del cólera. El TNF\alpha también es conocido por ser un compuesto activador de las células Langerhan.

Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad fueron afeitados y anestesiados como se describió anteriormente para el "procedimiento de inmunización". En el día de la inmunización las espaldas de los ratones se limpiaron con isopropanol. Después de que el alcohol se había evaporado (aproximadamente 5 minutos), 100 \mul de salina amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 0.83, de TNF-alfa (TNF-alfa recombinante de ratón, Endógeno), IL-2 (1 \mug de IL-2 recombinante de ratón (Sigma)) o un adyuvante de imitación (CpG2) se aplicó a la piel sobre la espalda con 100 \mug de toxoide de difteria (DT) durante 90 a 120 minutos. Los oligonucleótidos se sintetizaron por Oligos Etc con una estructura de fosfotiolato para mejorar la estabilidad La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización". La inmunización se repitió entre 4 y 8 semanas después. Diez semanas después de la primera la inmunización a los animales se les tomó muestra de sangre y los títulos anti-DT se determinaron utilizando un ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 9.

La coadministración de DT y un adyuvante de imitación (CpG2) fallaron en inducir una elevación detectable en los títulos anti-DT. En contraste, la aplicación tópica de TNF-alfa (0.8 \mug) resultó en un incremento detectable en el suero del título IgG anti-DT en 3 de 5 animales cuando se comparó con los títulos anti-DT en los ratones tratados con el adyuvante de imitación o el suero recolectado antes de la inmunización (presangrado). Similarmente, la aplicación tópica de IL-2 (1 \mug) resultó en un incremento detectable en el suero del título IgG anti-DT en 4 de 5 animales cuando se comparó con los títulos anti-DT en los ratones tratados con el adyuvante de imitación o el suero recolectado antes de la inmunización (presangrado). Por lo tanto parece que las citosinas tales como IL-2 y TNF-alfa pueden ser utilizadas como un adyuvante sobre la piel y que los compuestos que activan las células langerhans pueden ser utilizados para la inmunización transcutánea.

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TABLA 9 Actividad del adyuvante de citosina TNF-alfa aplicado a la piel

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Ejemplo 10

La subunidad B de la toxina del cólera es otra clase de adyuvantes que carecen de la subunidad A y por lo tanto de la actividad ADP-ribosiltransferasa de CT. Como tal el CTB representa un adyuvante que es único y que puede ser útil ya que no es tóxico cuando se ingiere.

Ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitados como se describió en el "procedimiento de inmunización". En el día de la inmunización las espaldas de los ratones se limpiaron con isopropanol. Después de que el alcohol se había evaporado (aproximadamente 5 minutos), 100 \mul de salina amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 100 \mug de la subunidad B de la toxina del cólera purificada (CTB) y/o 100 \mug del toxoide de difteria (DT) se aplicó en la espalda durante 90 a 120 minutos. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización". La inmunización se repitió 4 y 8 semanas después. Diez semanas después de la primera la inmunización a los animales se les tomó muestra de sangre y los títulos anti-DT se determinaron utilizando un ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 10.

Los títulos anti-DT se elevaron claramente en el suero de los animales inmunizaron con CTB y DT cuando se compararon con los títulos en el suero de los animales tratados con DT solo o aquellos en presangrado de las muestras de suero como se muestra en la tabla 10. Por lo tanto parece que el CTB purificado puede ser utilizado como un adyuvante sobre la piel.

TABLA 10 Uso de la subunidad B de la toxina del cólera purificado de V. cholerae como un adyuvante sobre la piel

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Ejemplo 11

Los Adyuvantes que son diferentes estructuralmente tienen la posibilidad de ejercer su mejoramiento mediante diferentes efectos. Los adyuvantes que inducen sus efectos mediante mecanismos diferentes pueden tener efectos aditivos o sinergísticos sobre el mejoramiento de la respuesta inmune. Encontramos que el uso de dos adyuvantes simultáneamente aumentó la respuesta a la inmunización transcutánea comparado con los adyuvantes individuales solos.

Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad fueron afeitados y anestesiados como se describió anteriormente para el "procedimiento de inmunización". En el día de la inmunización las espaldas de los ratones se limpiaron con isopropanol. Después de que el alcohol se había evaporado (aproximadamente 5 minutos), se aplicó 100 \mul de salina amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 100 Mg de ADN inmuno estimulatorio (CpG1) y/o toxina del cólera (CT) 100 \mug se aplicó en la espalda con 100 \mug de un extracto de antígeno leishmanial (SLA) durante 90 a 120 minutos. El SLA es extracto de antígeno preparado en el Walter Reed Arme institute of Research por aislamiento centrífugo de las proteínas solubles en un sonicato de Promastigotes principales de la Leishmania) extracto durante 90 a 120 minutos. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización". La inmunización se repitió 4 y 8 semanas después. Doce semanas después del drenado de la primera la inmunización (inguinal) LN se removió y agruparon de dos animales inmunizados. La capacidad para proliferar en respuesta a el medio o antígeno (SLA) de determinó en un ensayo de proliferación estándar de 4 días utilizando la incorporación 3-H como lectura. Los resultados se muestran en la tabla 11.

La coadministración de SLA y CpG1 (el ADN inmuno estimulatorio que contiene un dinucleótido CpG no metilado flanqueado por dos 5' purinas y dos 3' pirimidinas-TCCATGACGTTCCTGACGTT) o CT resultó en un incremento detectable en la respuesta proliferativa específica a antígeno. Sin embargo, la respuesta proliferativa específica al antígeno (SLA) fue de aproximadamente 20 veces mayor en los cultivos de células de nodo linfático de los animales expuestos simultáneamente tanto a CpG1 y CT en comparación con los cultivos derivados de los animales expuestos a solo un adyuvante. Por lo tanto parece que el ADN bacteriano que contiene motivos apropiados sinergiza con Exotoxinas ribosilantes de ADP tales como CT como adyuvantes sobre la piel para inducir respuestas inmune más altas que aquellas del adyuvante solo.

TABLA 11 Sinergia entre ADN inmuno estimulatorio y la exotoxina ribosilante de ADP (CT) como adyuvantes cuando se aplican a la piel

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Ejemplo 12

La inmunización transcutánea induce respuestas inmunes potentes cuando se utilizó como un método de suministro solo. También hemos encontrado que la inmunización transcutánea puede ser utilizada en secuencia con otras rutas del suministro para estimular una respuesta inmune.

Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad. En el día0 ambos grupos de animales recibieron 50 \mul de inyección intramuscular (im) de DT (5 \mug) mezclado con alúmina (Rehidrogel-25 \mug en NaCI) dentro de una de las extremidades. Ocho y 16 semanas después los ratones en el grupo im/tc/tc fueron afeitados, anestesiados e inmunizados mediante la vía transcutánea como se describió anteriormente para el "procedimiento de inmunización" utilizando 100 \mug de la toxina del cólera como adyuvante y 100 \mug del toxoide de difteria como antígeno. La solución de inmunización se aplicó en la espalda durante 90 a 120 minutos. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización". Veintidós semanas después de la primera inmunización a los animales se les tomó muestra de sangre y los títulos anti-DT se determinaron utilizando un ELISA como se describió anteriormente para el "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 12.

Una inyección im única de 5 \mug de DT indujo una elevación detectable en el suero de los títulos anti-DT en comparación con los títulos en el suero recolectado de los mismos animales antes de la inmunización (presangrado). La amplificación del im. en los animales utilizando el método de inmunización transcutánea resultó en un incremento de 60 veces en el título de la media geométrica y claramente todos los animales amplificados transcutáneamente tenían títulos anti-DT mayores que aquellos observados en el grupo solo con la im. Por lo tanto la inmunización transcutánea puede ser utilizada para amplificar los títulos específicos a antígeno en ratones en los cuales la primera inmunización con el antígeno fue mediante la vía im. También se encuentra que los animales inmunizados con im pueden ser amplificados mediante la inmunización transcutánea (TCI). Varias combinaciones de Amplificación TCI o la amplificación con otros rutas y programas pueden ser visualizados incluyendo oral, bucal, nasal, rectal, vaginal, intradérmica, por pistola o por otros medios de suministro.

Adicionalmente, los antígenos pueden diferir en la vía y la composición incluyendo proteínas que alternan con glicoproteínas, subunidades con holotoxina, Imprimado con ADN seguido por proteínas, ácido nucleico mediante im seguido por ácido nucleico mediante TCI. La inmunización transcutánea puede ser utilizada para amplificar niños vacunados en la infancia o adultos vacunados en su niñez. La facilidad de suministro puede mejorar la eficacia de las vacunas tales como las vacunas de influenza mediante permitir múltiples amplificaciones utilizando un parche.

TABLA 12 La amplificación de animales vacunados por im utilizando el método de inmunización transcutánea

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Ejemplo 13

Debido a que Parece que el TCI estimula el sistema inmune de tal manera potente, es posible que un adyuvante colocado sobre la piel en un sitio pueda actuar como un adyuvante para un antígeno colocado en otro sitio. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitaron como se describió en el "procedimiento de inmunización". Los animales no fueron marcados en la oreja pero se mantuvieron en jaulas marcadas A, C o G. En el día de la inmunización la superficie dorsal del de la oreja del ratón fue tratada mediante frotar suavemente la superficie de la piel externa con un aplicador con punta de algodón que contiene 70% de isopropanol. Después de 5 minutos el exceso de agua se secó de las orejas tratadas con agua y el adyuvante (CT 50 \mug) y/o antígeno (100 \mug de albúmina de suero bovino (BSA) se aplicó a la superficie de la oreja izquierda o derecha (descrito en la Tabla) en 50 \mul de salina amortiguada con fosfato. A las dos y media horas, las orejas se enjuagaron y secadas dos veces. Los Ratones fueron amplificados en una forma similar cuatro y ocho semanas después. Doce semanas después de la primera inmunización a los animales se les tomó muestra de sangre y se determinaron los títulos anti-BSA utilizando un ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 13.

La aplicación del BSA solo a la piel fue pobremente inmunogénica con solamente 1 de 5 animales desarrollando un título HELISA por encima de 100 EU. En contraste, 9 de 9 animales que recibieron CT y BSA sobre la piel desarrollaron títulos por encima de 100 EU. De los animales que recibieron antígeno y adyuvante, los ratones a los cuales se les dio los materiales en el mismo sitio (oreja izquierda) desarrollaron títulos anti-BSA más altos (10 veces) que los animales que recibieron antígeno y adyuvante en orejas separadas (izquierda y derecha). Sin embargo, los animales que recibieron antígeno en una oreja y adyuvante en la otra oreja desarrollaron una respuesta inmune anti-BSA que fue de aproximadamente 30 veces mayor que los animales a los cuales se les dio solamente BSA. Así, el antígeno y adyuvante pueden ser aplicados tópicamente durante el TCI en sitios diferentes para producir una respuesta inmune humoral. Esta inmunoestimulación puede ser esperada que ocurra con el antígeno suministrado por otras rutas y programas como pueden ser visualizados incluyendo la oral, bucal, nasal, rectal, vaginal, intradérmica, por pistola o mediante cualquier otro medio de suministro. Adicionalmente, los adyuvantes pueden ser utilizados con inmunización por ácido nucleico para mejorar la respuesta. Tal suministro puede no requerir ser simultáneo para mejorar la respuesta inmune. Por ejemplo, una inyección im de ADN de plásmido puede ser seguida después por administración transcutánea del adyuvante. La Inmunoestimulación por CT, LT, TNF\alpha, CpGs o adyuvantes similares resulta sorprendente porque se ha pensado que las moléculas de 500 daltons no podrían pasar a través de la
piel.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 13 Suministro de antígeno y adyuvante en sitios iguales o distintos sobre la piel con mejoramiento en la penetración

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Ejemplo 14

Inmunización transcutánea en Humanos

La invención puede ser practicada utilizando un vehículo o portador adecuado. Por ejemplo un parche puede ser utilizado como tal vehículo y puede ser tratado con la formulación fabricada de acuerdo con la invención o puede ser utilizada para cubrir el área de la piel que ha sido tratada con la formulación la invención. Un parche adecuado puede ser fabricado de, por ejemplo, algodón, nylon, rayón, poliéster o combinaciones de estos. Tales parches pueden ser provistos con un respaldo adhesivo o no adhesivo. Los parches con un respaldo no adhesivo pueden ser asegurados al animal mediante medios no adhesivos, tal como, por ejemplo, envoltura.

El respaldo adecuado puede ser fabricado de materiales tales como, por ejemplo, silicio, acrilato o caucho. Otros vehículos o portadores los cuales pueden ser utilizados incluyen aquellos listados anteriormente; tal como por ejemplo, polvos, aceites, agua, cremas y similares. Para evaluar el potencial para el TCI en humanos, un ensayo de fase I se condujo utilizando LT para intentar inducir anticuerpos anti-LT en el suero. Seis voluntarios recibieron una dosis de 500 \mug de LT, una dosis similar a dosis de adyuvante oral utilizada para una vacuna de cólera (1 mg CTB). El LT se produjo bajo Condiciones GMP en el Swiss Serum and Vaccine Institute (Berna, Suiza) y se suministró por Oravax Inc., Cambridge, MA. Los voluntarios recibieron 500 \mug de LT mezclado en 500 \mul de salina estéril los cuales se absorbió en un almohadilla de gasa de algodón de 2^{''2} con respaldo de polivinilo y cubiertas por una venda Tegaderm^{TM} de 4x4'^{'2}. La inmunización se condujo mediante colocar el parche sobre piel no manipulada durante 6 horas después de las cuales el sitio se enjuagó fuertemente con 500 ml de salina estéril. Los individuos fueron reinmunizados similarmente después de 12 semanas. Se examinó los voluntarios en los días 1, 2,3 y 7 en cuanto a signos de inflamación en el sitio de inmunización se intervino en cuanto a síntomas relacionados con la vacunación. La inmunización se condujo mediante colocar el parche sobre piel no manipulada durante 6 horas después de los cuales el parche se removió y el sitio se enjuagó fuertemente con salina. Los individuos se reinmunizaron después de 12 semanas. Ninguna reacción adversa fue visualizada. Sea sistémicamente o en el sitio de la inmunización después de la primera la segunda la inmunización. Los títulos Anti-LT IgG se determinaron como se describió previamente. Los Resultados son reportados en unidades ELISA (EU) que son definidos como la dilución inversa de la muestra que produjo un OD de 1.0. Anti-LT IgA se determinó de la misma manera como el anti-LT IgG utilizando IgA (\alpha)-HRP anti-humano de cabra (Kirkegaard y Perry, Gaithersburg, MD) contra una curva IgA estándar hecha utilizando IgA humano (ICN). Como se muestra en la tabla 14, 6 de 6 individuos respondieron mediante producir una elevación en el suero de anticuerpos anti-LT IgG o IgA, definido como un incremento de cuatro veces en los títulos de anticuerpo. La media de las veces de elevación en el anti-LT IgG fue de 10.2 y la media en las veces de elevación en el suero anti-LT IgA fue de 7.2. Las Biopsias del sitio de inmunización y del brazo contra lateral no mostraron signos de inflamación de la piel. Estos resultados confirman que el TCI puede ser conducido en humanos si irritación o inflamación de la piel.

Materiales de parche adecuados han sido previamente descritos. En general el parche puede consistir de, por ejemplo, un vendaje sensible a la presión, una matriz para o una capa absorbente para portar las vacunas y el adyuvante, un respaldo impermeable a la vacuna y un recubrimiento de liberación. Estos y otros ejemplos de parches son descritos en las Patente Estadounidense Nos. 4, 915,950 y 3, 734,097.

Los Parches pueden ser fabricados de materiales de matrices tejidas y no tejidas que incluyen, por ejemplo, poliéster/celulosa, polipropileno, poliéster, poliéster/rayón y similares.

Ejemplos de matrices de parches no tejidos pueden incluir:

no tejidos BBA

a.

Grado # 1313290, no tejido extendido en húmedo, composición= poliéster/celulosa, peso (gsy) = 35.4, peso (gsm) = 42.3, espesor (mils) = 7.9, diez MD de tensión= 3.4, diez CD de tensión = 2.4.

b.

Grado # 2006086, no tejido pegado térmicamente, composición= polipropileno, peso (gsy) = 16.0, peso (gsm) = 19.1, espesor (mils) = 10.2, MD de tensión= 3.3, CD de tensión = 0.7.

c.

Grado # 149146, no tejido pegado térmicamente, composición= poliéster, peso (gsy) = 25.6, peso (gsm) = 30.6, espesor (mils) = 6.5, diez MD de tensión= 5.3, diez CD de tensión = 0.9.

d.

Grado # 149020, no tejido pegado térmicamente, composición= poliéster/rayón, peso (gsy) = 30.5, peso (gsm) = 36.4, espesor (mils) = 13.2, MD de tensión= 5.5, CD de tensión = 1.1.

e.

Grado # 140-027, no tejido hidroenredado, composición= poliéster/rayón, peso (gsy) = 28.0, peso (gsm) = 33.5, espesor (mils) = 22.4, MD de tensión= 10.4, CD de tensión = 3.8.

El adhesivo sensible a la presión que puede ser utilizado en la presente invención incluye, por ejemplo adhesivo basado en acrilato, silicona, caucho y similar.

TABLA 14 Media de veces de incremento en anti-LT IgG e igA humanos

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Ejemplo 15

El LT ha mostrado que es efectivo para inmunizar humanos mediante la vía transcutánea. También hemos encontrado que el LT actúa como un adyuvante para TCI. C57BL/6 ratones de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitaron como se describió en el "procedimiento de inmunización". En el día de la inmunización las espaldas de los ratones se limpiaron con isopropanol. Después de que el alcohol se había evaporado (aproximadamente 5 minutos), 100 \mul de salina amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 100 \mug de enterotoxinas lábiles calientes (LT) y/o 100 \mug de toxoide de difteria (DT) se aplicó en la espalda durante 90 a 120 minutos. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización". La inmunización se repitió 4 y 8 semanas después. Diez semanas después de la primera la inmunización a los animales se les tomó muestra de sangre y los títulos anti-DT se determinaron utilizando un ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 15.

Los títulos anti-DT se elevaron claramente en el suero de los animales inmunizados con LT y DT cuando se comparan con los títulos en el suero de los animales tratado con DT solo o aquellos en las muestras de suero de presangrado. Por lo tanto parece que las enterotoxinas lábiles calientes (LT) pueden ser utilizadas como un adyuvante sobre la piel.

TABLA 15 Uso de la enterotoxina lábil caliente (LT) del E. coli como un adyuvante sobre la piel

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Ejemplo 16

Para determinar el papel de mejoramiento de la penetración física/mecánica, las capas superficiales del estrato corneo se removieron mediante cinta pegante. Retirar la cinta es una intervención bien conocida en la técnica para remover la capa exterior del estrato corneo. C57BL/6 ratones de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitaron como se describió en el "procedimiento de inmunización". Veinticuatro horas después, se aplicó CT (25 \mug) a las espaldas de los ratones en 50 \mul de salina amortiguada con fosfato; grupo de intervención "ninguno". Alternativamente, la piel en las espaldas de un segundo grupo de animales se sometió a un procedimiento de retirar una cinta pegante suavemente; grupo de intervención "despegar cinta de cinta". El proceso de despegar la cinta se llevó a cabo mediante aplicar cinta pegante de celofán en la espaldas, permitir que se apoye en la superficie de la piel durante 3 minutos, seguido por una remoción suave de la cinta. Las etapas Pegado/remoción se repitieron 3 veces. Luego se aplicó el CT (25 \mug) a las espaldas de los ratones en 50 \mul de salina amortiguada con fosfato.

El Antígeno permaneció sobre la espaldas durante aproximadamente 1.5 horas y después de ese tiempo se removió el exceso de antígeno y se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización".

Los títulos de anticuerpo anti-CT se determinaron utilizando ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)" utilizando el suero recolectado 11 días después de la primera la inmunización.

Los resultados se muestran en la tabla 16. El CT fue inmunogénico en ambos grupos en comparación con el suero recolectado de los mismos los animales antes de la inmunización (presangrado). Sin embargo, el título de media geométrica en el grupo de despegado de la cinta fue de 100 veces mayor y los títulos fueron más consistentes entre los últimos los animales en comparación con los animales "ninguno". Así parece que la disrupción física de la superficie de la piel utilizando el despegado de la cinta mejora el suministro del antígeno mediante la vía transcutánea.

Este dispositivo simple podría ser reemplazado por otros dispositivos de penetración física para suministrar antígenos y adyuvantes dentro de la epidermis tal como una aguja y una jeringa de tuberculina utilizada para inyección intradérmica, micro agujas que son de una longitud para penetrar solamente el estrato corneo o la dermis superficial, dispositivos utilizados para el ensayo tine de la TB, pistolas energizadas por gas, cinta adhesiva para el despegado de cinta, u otros dispositivos conocidos para penetrar solamente dentro de la epidermis o la dermis superficial. Los dispositivos de despegado de cinta podrían ser utilizados en conjunto con otros mejoradores de penetración. Los dispositivos de pegado de cinta pueden ser utilizados en conjunto con un marcador para delinear el sitio para la colocación del parche, y pueden estar dispersos en un rollo o en unidades individuales.

TABLA 16 Mejoramiento de la inmunización transcutánea mediante el mejoramiento de la penetración física: títulos anti-CT en ratones que tenían la piel limpiada utilizando cinta de celofán antes de la aplicación del antígeno

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Ejemplo 17

Los Ácido nucleicos tales como el ADN o el ARN de plásmido pueden ser utilizados para inducir una respuesta inmune y son bien conocidos en la técnica. El uso de Ácidos nucleicos en la inmunización transcutánea se describió en las Patentes anteriores (PCT/US97/21324).

El uso de ácidos nucleicos (también conocido como inmunización genética) sobre la piel con las técnicas mejoramiento en la penetración se ilustra en el siguiente ejemplo.

Ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitaron como se describió en el "procedimiento de inmunización". Para el grupo "NP ADN" los ratones se limpiaron con isopropanol, después de que el alcohol se había evaporado (aproximadamente 10 minutos), las espaldas se hidrataron con agua utilizando una almohadilla de gasa saturada. Aproximadamente 10 minutos después cualquier exceso de agua se limpió y se aplicó 100 \mug de ADN de aplicó en la espalda en 100 \mul de salina. Un segundo grupo de ratones NP-ADN se sometió al mismo protocolo de inmunización excepto que sus espaldas se trataron por despegado de cinta 3 veces antes del refregado con alcohol; "NP ADN -despegado de cinta". El proceso de despegar la cinta se llevó a cabo al aplicar cinta pegante de scotch de celofán en la espalda, permitiendo que se apoye en la superficie de la piel durante 5 minutos, seguido por una remoción suave de la cinta. Un tercer grupo de ratones se comprometió en el protocolo de despegado de cinta/inmunización descrito y 100 \mug de la enterotoxina lábil caliente como adyuvante (LT) se incluyó en el la solución de inmunización. Dieciséis días después de la primera inmunización a los animales se les tomó muestra de sangre y los títulos anti-influenza NP se determinaron utilizando un ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 17.

Los títulos anti-influenza se determinaron utilizando una preparación de antígeno de virus divido (Fluzone) para recubrir las placas ELISA. Los títulos ELISA se determinaron en 5 animales individuales y la densidad media óptica de lectura para cada grupo se muestra. Todos los tres grupos de inmunización desarrollaron los títulos anti-influenza en comparación con los títulos en el suero recolectado de los mismos los animales antes de la inmunización (presangrado). En comparación con el grupo que tenía solo NP ADN, despegar la cinta antes de la inmunización mejoró el título anti-influenza en todas las tres diluciones de suero ensayadas (1: 100,1: 200,1: 400) y la adición de un adyuvante (LT) mejoró adicionalmente esta respuesta. Así, el ADN puede ser utilizado sobre la piel para inducir la respuesta inmune a los antígenos de vacuna y su efectividad puede ser mejorada mediante la adición de adyuvantes y el mejoramiento en la penetración tal como el despegado de cinta.

TABLA 17 Inmunogenicidad de ADN aplicado como antígeno sobre la piel utilizando mejoramiento en la penetración por alcohol

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Ejemplo 18

La inmunización transcutánea (TCI), debido a que la facilidad de suministro, permitir que la aplicación sea dada sobre diferentes drenajes nodos linfáticos. Esto puede tener una ventaja adicional en que mejora la respuesta inmune. Conejos se anestesiaron, se afeitaron, e inmunizaron como se describió anteriormente. Los animales se inmunizaron con 100 \mug de la toxina del cólera (CT) y 100 \mug de hemaglutinina de la influenza (HA) en un sitio o dos sitios sobre la espalda. El HA y el CT se aplicaron a las 0,3 y 5 semanas. Siete semanas después de la primera la inmunización, a los animales se les tomó muestras de sangre y los títulos anti-HA se determinaron utilizando un ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 18.

Los títulos anti-HA se elevaron en el suero de 10 de los 10 animales inmunizados con CT y HA cuando se comparó con los títulos en el suero de los mismos los animales antes de la inmunización (presangrado). El título de media geométrica en el grupo de los dos sitios fue 3 veces mayor con que en el grupo de un sitio sugiriendo que el suministro de antígeno en múltiples sitios puede ser utilizado para mejorar el TCI. Así, los antígenos pueden ser suministrados por TCI sea en sitios únicos o múltiples sobre la piel.

TABLA 18 Suministro transcutáneo de antígeno en un sitio o múltiples sitios.

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Ejemplo 19

La variedad de los antígenos los cuales pueden ser suministrados por TCI es ilustrada adicionalmente por el uso de una vacuna de conjugado de polisacáridos para inducir anticuerpos anti-polisacárido. Ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron, afeitaron, e inmunizaron como se describió en el "procedimiento de inmunización". Los ratones se inmunizaron con la toxina del cólera (CT) y el polisacárido B del Haemofilus influenzae (Hib-PS) a 0,3 y 5 semanas. Siete semanas después de la primera la inmunización, a los animales se les tomó muestras de sangre y los títulos anti-Hib-PS se determinaron utilizando un ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 19.

Los títulos Anti-Hib-PS se elevaron en el suero de 4 de 10 animales inmunizados con CT y Hib-PS cuando se comparó con títulos en el suero de los mismos los animales antes de la inmunización (presangrado). Por lo tanto el TCI puede ser utilizado para inducir antígenos anti-polisacáridos a través de la piel. Este es un antígeno de vacuna de uso común humano y representa una estrategia importante para la inmunización.

TABLA 19 Suministro de un conjugado de polisacárido mediante la inmunización transcutánea

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Ejemplo 20

La inmunización transcutánea de ratones con antígenos de vacuna de uso humano CT ha mostrado que actúan como adyuvante para la inmunización transcutánea con toxoides únicos y con BSA. Inmunizamos transcutáneamente ratones con una variedad de antígenos de vacuna de uso humano, incluyendo una vacuna toxoide multivalente (toxoides de tétano y difteria, una proteína recombinante expresada por levadura (HIV p55 gag) y virus de rabia muertos completamente utilizando CT como un adyuvante como se muestra en la tabla 20. Ratones BALB/c (n=5) se inmunizaron y amplificados dos veces como se describió previamente (Glenn, G. M., Scharton-Kersten, T., Vassell, R., Matyas, G. & Alving. C. R. Transcutáneous immunization using bacterial ADP-ribosylating exotoxins as antigens and adjuvants. Infect. Immun. (en el periódico). Las dosis inmunizantes incluyen 100/50/50 \mug de CT/TT/DT vía TCI versus 3/1/1 para alum/TT/DT IM; 100/100 \mug para LT+DT versus 100 \mug de DT solamente. 100/100 \mug para CT/p55 vía TCI versus 100 \mug p55 solo. Los ratones inmunizados con 17 IE de virus de rabia muertos (n=10) habían sido vacunados intramuscularmente 2 veces y luego amplificados transcutáneamente (17 IE) después del refregado suave con alcohol de la piel y comparados con la inmunización contra la rabia IM 3 veces. Los niveles de anticuerpo contra DT, TT, p55 y la rabia se determinaron utilizando ELISA como se describió previamente (Grassi, M., Wandler, A. & Peterhans, E. Enzyme-linked immunoabsorbant assay for determination of antibodies of the envelope glicoproteins of rabies virus. J. Clin. Microbiol. 27,899-902 (1989). Miyamura, K., Tajiri, E., Ito, A., Murata, R. & Kono, R. Micro cell culture method for determination of diphtheria toxin y antitoxin titres using VERO cells. II. Comparison with the rabbit skin method y practical aplication for seroepidemiological studies. J. Biol. Stand. 2,203-209 (1974)). El TCI resultó en un incremento similar en la respuesta al anticuerpo para TT y DT y los títulos de neutralización anti-DT fueron comparables a aquellos producidos por la inmunización intramuscular (IM). Estos datos muestran que el TCI puede ser utilizado para inducir la respuesta inmune de magnitud comparable con aquellas inducidas por prácticas de inmunización existentes. Animales vacunados por im, reforzados por TCI también resultó en un incremento significativo en los títulos anti rabia en todos 10 los animales ensayadas (0.53 a 1.03 IU, p<0.02, ensayo T de Student). Los anticuerpos con respecto a los antígenos DT y p55 administrados sin adyuvantes fueron muy bajos o no detectables, consistentes con nuestras observaciones anteriores de que los antígenos son solamente inmunogénico débilmente cuando se aplicas sin adyuvante. El LT también actúa como adyuvante (Tabla 20) en una forma similar a los estudios previos utilizando CT (1,2). Aunque las inmunizaciones no fueron optimizadas en comparación con el suministro intramuscular, estas respuestas específicas de antígeno confirman que el TCI puede ser utilizado para una variedad de vacunas de uso humanos desde una variedad de fuentes y una variedad de tamaños y que el LT puede actuar como un adyuvante para antígenos de vacuna coadministrados.

TABLA 20 Respuestas al anticuerpo de murino para antígenos de vacuna de uso humano administrados por TCI

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Ejemplo 21

Activación de células Langerhans

En dos sujetos, el sitio de la inmunización y el brazo inmunizado colateralmente se les tomaron biopsias, una a las 24 horas post-inmunización y una a las 48 horas después de la segunda inmunización. El manchado con Hematoxilina y eosina (H&E) de los especimenes confirmó los hallazgos clínicos sugeridos de que no se vio inflamación después de la inmunización (Figuras 1 A, B). Aunque las secciones de rutina histológica no fueron notables, los LC visualizados utilizando manchado con anti-CDla de especimenes desde el sitio de la inmunización demostró un agrandamiento notable de cuerpos celulares pero de otra manera números normales de células cuando se comparó con las biopsias de control del brazo opuesto, tanto a las 24 y 48 horas (Figuras. 1 C, D, E, F). Hallazgos similares se vieron utilizando anti-HLA-DR y anti-S-100 para visualizar los LC (no se muestra). La morfología del LC en la piel inmunizada por TCI fue similar en apariencia a los LC de la cripta tonsilar que se piensa que son activados crónicamente por los lipopolisacáridos desde flora de la boca (Noble).

Debido al tamaño limitado y al número de especimenes de biopsia de piel humana examinados, estudios de purina complementarios se llevaron a cabo. La activación de LC en sistemas de murino utiliza sensibilizadores de contacto; LPS, y citosinas proinflamatorias se caracteriza tanto por cambios en la morfología (Aiba) y a través de elevaciones en la expresión marcadora de superficie (Jakob y Udey). La piel de la oreja del ratón es frecuentemente utilizada para estudios de activación de LC y también ha mostrado que es un sitio excelente para la inmunización transcutánea (Scharton-Kersten). Las hojas Epidérmicas se prepararon 24 horas después de la aplicación de CT a la oreja y se mancharon para MHC clase II, un marcador restringido de LC en la piel de murino. En comparación con los oídos tratados con PBS, Figuras 2A, los oídos tratados con LC en CT exhibieron cambios marcados en la morfología de LC con pérdida de procesos dendríticos, agrandamiento de los cuerpos celulares y manchado intenso de las células-rasgos de la activación del LC (Aiba) (Fig. 2 B, C). El potencial activante de LC del CT se confirmó utilizando citometría de flujo. El LC de la piel tratada con CT expresó niveles incrementales de antígenos MHC Clase II y CD 86 (B7-2) y niveles disminuidos de E-caderina, consistente con la activación del LC descrita en otras partes (Pierre, Aiba, Jakob).

Procedimiento de inmunización que puede ser utilizado por ejemplo 22.

Ratones BALB/c fueron afeitados con un cortador #40. Este afeitado podría haberse hecho sin ningún signo de trauma a la piel. El afeitado se pudo hacer desde la parte media del tórax hasta justo debajo del comienzo del cuello. Los ratones se les permitió entonces descansar durante 24 horas. Antes de esto los ratones podrían ser etiquetados en las orejas para su identificación, y se les tomó una muestra de sangre para obtener una muestra de suero preinmune. Los Ratones también se inmunizaron transcutáneamente sin afeitar mediante aplicar 5-500, \mul de solución inmunizante en cada oreja.

Los ratones pudieron ser inmunizados de la siguiente manera. Los ratones pudieron ser anestesiados con 0.03-0.06 ml de una solución de 20 mg/ml de xilazina y 0.5 ml de 100 mg/ml cetamina y se inmovilizaron mediante esta dosis de anestesia durante aproximadamente 1-3 horas. Los ratones podrían ser colocados hacia abajo por el lado ventral sobre una manta caliente.

La solución inmunizante y el compuesto mejorador de la penetración (o técnica) pudo ser colocado en la piel dorsal afeitada de un ratón de la siguiente manera: un esténcil de 1.2 cm x 1.6 cm hecho de poliestireno se coloca suavemente sobre la espalda y una gasa estéril húmeda son salina podría ser utilizada para humedecer parcialmente la piel (permitiendo aún la aplicación de la solución inmunizante), la solución inmunizante podría entonces aplicarse con una pipeta al área circunscrita por el esténcil para proporcionar un parche de 2 cm^{2} de solución inmunizante. Se tuvo cuidado de no frotar la piel con la punta de la pipeta. La solución inmunizante podría ser distribuida alrededor del área a ser cubierta con el lado suave de la punta de la pipeta. Alternativamente, la solución inmunizante podría colocada directamente sobre la piel sin humectación o con humectación con el uso de un esténcil.

La solución inmunizante (entre cerca de 5 \mul y cerca de 200 \mul) podría ser dejada sobre la espalda del ratón durante 60-120 minutos. Al final del periodo de inmunización, el ratón podría sostenerse suavemente por el cuello y la cola bajo una corriente copiosa de agua corriente tibia, y lavados durante 10 segundos. El ratón podría entonces secarse suavemente con una pieza de gasa estéril y se podría llevar a cabo un segundo lavado durante 10 segundos; el ratón entonces podía secarse una segunda vez y luego dejado en la jaula. El ratón parece no exhibir efectos adversos de la anestesia, inmunización, procedimiento de lavado, o toxicidad de las exotoxinas. No hubo irritación de la piel, hinchamiento o enrojecimiento que se hubiera visto después de la inmunización y el ratón parece tranquilo. La inmunización utilizando el oído pudo llevarse a cabo como se describió anteriormente excepto de que el pelo no se pudo remover antes de la inmunización.

Antígeno

Los siguientes antígenos podrían ser utilizados para la inmunización y ELISA, y ser mezclados utilizando PBS estéril o salina normal. Toxina del cólera o CT (List Biologicals, Cat # 101B, lote #10149CB), subunidades B de CT (List Biologicals, Cat #BT01, lote #CVXG-14E), subunidades A del CT (List Biologicals, Cat #102A, lote #CVXA-17B), subunidades A del CT (Calbiochem, Cat #608562); toxina de la tosferina, libre de sal (List Biologicals, lote #181120a); toxoide del tétano (List Biologicals, lote #1913a y #1915a); exotina de las seudomonas A (List Biologicals, lote #ETA25a); toxoide de la difteria (List Biologicals, lote #15151); enterotoxina lábil caliente de E. coli (Sigma, lote #9640625); albúmina de suero bovino o BSA (Sigma, Cat #3A-4503, lote #31F-0116); y conjugado B de la Hemofilus influenza B (Connaught,lot#6J81401).

ELISA-IgG (H+L)

Anticuerpos específicos para CT, LT, ETA, toxina de la tosferina, toxoide de la difteria, toxoide del tétano, conjugado B de Hemofilus influenza, y BSA se determinaron utilizando ELISA en una técnica similar a Glenn et al. (1995).

Ejemplo 22

La activación de LT puede llevarse a cabo mediante incubar el LT con tripsina (o tripsina inmovilizada en perlas) con o sin agentes reductores (por ejemplo, ditioteritol) para romper los enlaces de disulfuro cerca del sitio de división de la tripsina, bajo condiciones de reacción estándar. El LT nativo se puede activar mediante incubación de 100 \mug de proteína con 0.1 \mug de tripsina en un volumen de reacción total de 100 \mul durante 45 min a 37ºC. Alternativamente, la tripsina se puede fijar a las perlas y el LT se puede eludir cobre las perlas de tripsina. La división de tripsina se puede demostrar SDS-PAGE (Laemilli, U. K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227: 680-685). El LT sea tratado o no tratado con tripsina puede ser mezclado con amortiguador que contiene ditiotreitol, y calentado a 100ºC durante 5 min antes del análisis SDS-PAGE. El LP tratado con Tripsina podría tener un fragmento proteolítico de 21K daltons consistentes con la división de tripsina del A1 y A2, permitiendo que la subunidad Al a las proteínas G ribosilato-ADP y por lo tanto ejerza efectos tóxicos mientras que el LT no tratado demostraría una banda en 28K daltons, consistente de una subunidad A intacta. La activación se puede demostrar adicionalmente en el ensayo de célula Y-1 de ratón en la cual LT nativa seria 1000 veces menos activa que la CT, pero la LT tratada con tripsina sería sanativa igualmente que la CT. La activación también se puede demostrar utilizando un ensayo enzimático, el ensayo NAD: agmatine ADP-ribosiltransferasa. En tal ensayo, el LT no tratado con tripsina se esperaría que muestre un bajo o una actividad no detectable mientras que el LT tratado con tripsina se esperaría que muestre una actividad similar a la demostrada por CP.

Ejemplo 23

La inmunización transcutánea puede ser más útil si la inmunización puede ser llevada a cabo durante un periodo corto de tiempo. Esto puede ser útil por ejemplo para llevar a cabo una inmunización durante una visita clínica de rutina que dura hasta alrededor de 30 minutos. En este ejemplo mostramos que la inmunización transcutánea puede ser llevada a cabo en piel lavada con alcohol e hidratada en tal periodo corto.

Ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad se anestesiaron y afeitaron como se describió en el "procedimiento de inmunización". En el día de la inmunización las espaldas de los ratones se limpiaron con isopropanol. Después de que el alcohol se había evaporado (aproximadamente 10 minutos), 200 \mul de agua se aplicó en la espalda para la hidratación. 15 minutos después la solución de inmunización se aplicó en la espalda y se dejó durante el periodo de tiempo especificado. La remoción del exceso de antígeno se condujo como se describió en el "procedimiento de inmunización". Los ratones se inmunizaron con CT solo (100 \mug en 50 \mul) en d0 y con CT más DT (100 \mug cada uno en 100 \mul de volumen) en 4,6 y 9 semanas. Doce semanas después de la primera la inmunización a los animales se les tomó muestra de sangre y los títulos anti-DT se determinaron utilizando un ELISA como se describió anteriormente para "ELISA IgG (H+L)". Los resultados se muestran en la tabla 23.

Los títulos anti-DT se elevaron claramente en suero de todos de los animales inmunizados con CT y DT cuando se comparó con los títulos en suero de los mismos los animales antes de la inmunización (presangrado). Los efectos máximos de la inmunización parecen ocurrir en los animales vacunados durante un periodo de 60 minutos aunque los títulos eran similares en 30 y 120 minutos. Quince minutos de inmunización parecían menos eficientes ya que los títulos en este grupo fueron de aproximadamente 10 veces menos que aquellos observados en los grupos de 30, 60 y 120 minutos. Por lo tanto parece que el TCI puede ser logrado dentro de 15 minutos de la aplicación del antígeno.

TABLA 23 Efecto de la duración de la aplicación del antígeno sobre la inmunidad humoral inducida mediante la inmunización transcutánea

33

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Claims (88)

1. Uso de por lo menos un antígeno, por lo menos un adyuvante, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la fabricación de una formulación para la inmunización transcutánea mediante inducir una respuesta inmune específica a antígeno en un sujeto; en donde dicha formulación se aplica en una cantidad terapéuticamente efectiva a un área pretratada de la piel del sujeto la cual no está perforada, y el pretratamiento rompe por lo menos el estrato corneo de la piel, y en donde el antígeno es por lo menos parcialmente purificado y seleccionado del grupo que consiste de carbohidrato, glicolípido, glicoproteína, lípido, lipoproteína, fosfolípido y polipéptido.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho pretratar mejora la penetración en la piel por dicha formulación.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1o 2, en donde dicho vehículo es un vendaje.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho vendaje se selecciona del grupo que consiste de un vendaje oclusivo, un vendaje no oclusivo, un vendaje de hidrogel y un vendaje reservorio.

5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho pretratamiento comprende frotar dicha área pretratada con una esponja.

6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho pretratamiento comprende aplicar un agente que mejora la penetración en la piel por dicha formulación.

7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente la hidratación de dicha área pretratada.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha esponja contiene acetona o una composición que contiene acetona.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha esponja contiene un alcohol o una composición que contiene alcohol.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha esponja contiene un detergente o una solución con detergente.

11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho pretratamiento comprende aplicar una formulación depilatoria, dejar dicha formulación sobre dicha área pretratada durante un periodo de 0,1 a 30 minutos.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho periodo es de 4 a 20 minutos.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho periodo es de alrededor de 12 minutos.

14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho pretratamiento comprende aplicar una formulación queratinolítica, dejando dicha formulación sobre dicha área pretratada durante un periodo de 0,1 a 30 minutos.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha formulación queratinolítica es salicilato.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, en donde dicho periodo es de 4 a 20 minutos.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicho periodo es de alrededor de 10 minutos.

18. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho pretratamiento comprende romper la capa de superficie de dicha área pretratada con un dispositivo de rompimiento.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho dispositivo de rompimiento se selecciona del grupo que consiste de un cartón de esmeril, una almohadilla abrasiva, un dispositivo de ensayo tine de tuberculina, una pistola energizada por gas, una pistola de genes, un dispositivo propelente, un dispositivo de micro agujas y una cinta adhesiva.

20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha respuesta inmune terapéuticamente efectiva resulta en proliferación celular en el nodo linfático.

21. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde una molécula única de dicha formulación contiene tanto propiedades de antígeno como de adyuvante.

22. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente administrar una formulación de antígeno separada a dicho sujeto.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicha formulación de antígeno separada se administra en un tiempo después de dicha aplicación de dicha formulación a dicha área pretratada, en donde dicha formulación de antígeno separada suministra una respuesta inmune adicional en dicho sujeto.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicha formulación de antígeno separada se administra en el momento antes de dicha aplicación de dicha formulación a dicha área pretratada, en donde dicha formulación de antígeno separada suministra una respuesta inmune adicional en dicho sujeto.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicha aplicación de dicha formulación que contiene adyuvante y dicha administración de dicha formulación de antígeno separada ocurre simultáneamente.

26. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en donde dicha formulación de antígeno separada es administrada mediante inyección intramuscular, o una vía seleccionada del grupo que consiste de oral, nasal, bucal, rectal, vaginal e intradérmica.

27. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en donde dicha formulación de antígeno separada se administra parenteralmente

28. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antígeno es un antígeno proteináceo por lo menos parcialmente purificado con un peso molecular mayor a 1000 daltons.

29. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho antígeno presenta sobre una superficie celular de una célula Langerhans a un linfocito, induciendo por lo tanto la respuesta inmune en el organismo.

30. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la exposición a dicho adyuvante causa la migración de las células Langerhans a un nodo linfático.

31. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la exposición a dicho adyuvante le da señal a la célula Langerhans para madurar en una célula dendrítica.

32. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 30 o 31, que comprende adicionalmente activar la célula Langerhans para incrementar la expresión de histocompatibilidad compleja clase II.

33. El uso de acuerdo con la reivindicación 30, 31 o 32, en donde el adyuvante activa la célula Langerhans.

34. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antígeno es por lo menos purificado parcialmente y derivado de una fuente seleccionada del grupo que consiste de un patógeno, una célula de tumor y una célula normal.

35. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antígeno se purifica por lo menos parcialmente y se deriva de un patógeno seleccionado del grupo que consiste de una bacteria, virus, hongo y parásito.

36. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en donde el antígeno por lo menos es purificado parcialmente y se selecciona del grupo que consiste de un antígeno de tumor, un auto antígeno, un alérgeno, y un agente biológico de combate.

37. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antígeno es multivalente.

38. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el adyuvante mejora la presentación del antígeno a un linfocito.

39. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho adyuvante en un patrón molecular asociado a patógeno (PAMP).

40. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, en donde dicho adyuvante es un ácido nucleico que comprende ADN bacteriano o motivos CPG no metilados.

41. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, en donde dicho adyuvante es un lipopolisácarido o un derivado de este.

42. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, en donde adyuvante es una citosina o una quimiocina.

43. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, en donde dicho adyuvante es una toxina alterada genéticamente o conjugada químicamente.

44. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el adyuvante en dicha formulación está provisto como un ácido nucleico que incluye una secuencia que codifica un adyuvante.

45. El uso de acuerdo con la reivindicación 44, en donde el ácido nucleico es no integral y no infeccioso.

46. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es una crema, emulsión, gel, loción, ungüento, pasta, solución o suspensión.

47. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación se aplica a la piel intacta que cubre más de un campo de nodo linfático de drenaje.

48. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la inmunización es para tratar una enfermedad de dicho sujeto.

49. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la inmunización es para impedir o prevenir una enfermedad en dicho sujeto.

50. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la inmunización es para tratar una enfermedad de dicho sujeto causada por la exposición a dicho antígeno.

51. Un artículo para inmunización transcutánea comprende: (i) una formulación que incluye por lo menos un antígeno y por lo menos un adyuvante; (ii) un vendaje adecuado para su adhesión; (iii) un mejorador de penetración en la piel; en donde el artículo está adaptado para aplicar la formulación a una piel del sujeto bajo el vendaje, el mejorador de penetración de la piel está adaptado para romper por lo menos el estrato corneo de la piel sin perforar, y en donde el antígeno es por lo menos parcialmente purificado y seleccionado del grupo que consiste de carbohidrato, glicolípido, glicoproteína, lípido, lipoproteína, fosfolípido y polipéptido.

52. El artículo de la reivindicación 51, en donde dicho mejorador de penetración de la piel se selecciona del grupo que consiste de un alcohol, acetona, un detergente, un depilatorio y un queratinolítico.

53. El artículo de la reivindicación 52, en donde el mejorador de penetración de la piel es alcohol o acetona combinados con una esponja.

54. El artículo de la reivindicación 51, 52, o 53, en donde dicho adyuvante es un patrón molecular asociado a patógeno (PAMP).

55. El artículo de la reivindicación 51, 52, o 53, en donde dicho adyuvante es un ácido que comprende ADN bacteriano o motivos CPG no metilados.

56. El artículo de la reivindicación 51, 52, o 53, en donde dicho adyuvante es un lipopolisácarido o un derivado de este.

57. El artículo de la reivindicación 51, 52, o 53, en donde dicho adyuvante es una citosina o una quimiocina.

58. El artículo de la reivindicación 51, 52, o 53, en donde dicho adyuvante es una toxina alterada genéticamente o conjugada químicamente.

59. El artículo de la reivindicación 51 a 58, en donde una molécula única de dicha formulación contiene tanto propiedades de antígeno como de adyuvante.

60. El artículo de la reivindicación 51 a 59, en donde el antígeno es un antígeno proteináceo parcialmente purificado con un peso molecular mayor a 1000 daltons.

61. El artículo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 59, en donde el antígeno es por o menos purificado parcialmente y derivado de una fuente seleccionada del grupo que consiste de un patógeno, una célula de tumor y una célula normal.

62. El artículo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 59, en donde el antígeno se purifica por lo menos parcialmente y se deriva de un patógeno seleccionado del grupo que consiste de una bacteria, virus, hongo y parásito.

63. El artículo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 59, en donde el antígeno por lo menos es purificado parcialmente y se selecciona del grupo que consiste de un antígeno de tumor, un auto antígeno, un alérgeno, y un agente biológico de combate.

64 Un dispositivo para romper barrera con una multiplicidad de púas para inmunización transcutánea, en donde las púes están recubiertas con una formulación que contiene por lo menos un antígeno y por lo menos un adyuvante; y en donde las púas están diseñadas para romper por lo menos el estrato corneo de la piel de un sujeto sin perforar la piel del sujeto; y en donde el antígeno está por lo menos parcialmente purificado y seleccionado del grupo que consiste de carbohidrato, glicolípido, glicoproteína, lípido. Lipoproteína, fosfolípido y polipéptido.

65. El dispositivo de la reivindicación 64, en donde dicho adyuvante es un patrón molecular asociado a patógeno (PAMP).

66. El dispositivo de la reivindicación 64, en donde dicho adyuvante es un ácido nucleico que comprende ADN bacteriano o motivos CPG no metilados.

67. El dispositivo de la reivindicación 64, en donde dicho adyuvante es un lipopolisácarido o un derivado de este.

68. El dispositivo de la reivindicación 64, en donde el adyuvante es una citosina o una quimiocina.

69. El dispositivo de la reivindicación 64, en donde dicho adyuvante es una toxina alterada genéticamente o conjugada químicamente.

70. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 69, en donde una sola molécula de dicha formulación contienen tanto propiedades de antígeno como de adyuvante.

71. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 70, en donde el antígeno es un antígeno proteináceo por lo menos parcialmente purificado con un peso molecular mayor a 1000 daltons.

72. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 71, en donde el antígeno es parcialmente purificado y derivado de una fuente seleccionada del grupo que cosiste de patógeno, una célula de tumor y una célula normal.

73. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 72, en donde el antígeno se purifica por lo menos parcialmente y se deriva de un patógeno seleccionado del grupo que consiste de una bacteria, virus, hongo y parásito.

74. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 73, en donde el antígeno por lo menos es purificado parcialmente y se selecciona del grupo que consiste de un antígeno de tumor, un auto antígeno, un alérgeno, y un agente biológico de combate.

75. Un dispositivo propelente para inmunización transcutánea tal como una pistola, en donde el dispositivo comprende una formulación que contiene por lo menos un antígeno y por lo menos un adyuvante; y en donde el dispositivo está diseñado para administrar la formulación mediante penetrar dentro la epidermis o dermis superficial de la piel de un sujeto pero no penetra la dermis; y en donde el antígeno es por lo menos parcialmente purificado y seleccionado del grupo que consiste de carbohidrato, glicolípido, glicoproteína, lípido, lipoproteína, fosfolípido y polipéptido.

76. El dispositivo de la reivindicación 75, en donde dicho adyuvante en un patrón molecular asociado a patógeno (PAMP).

77. El dispositivo de la reivindicación 75, en donde dicho adyuvante es un ácido nucleico que comprende ADN bacteriano o motivos CPG no metilados.

78. El dispositivo de la reivindicación 75, en donde dicho adyuvante es un lipopolisácarido o un derivado de este.

79. El dispositivo de la reivindicación 75, en donde dicho adyuvante es una citosina o una quimiocina.

80. El dispositivo de la reivindicación 75, en donde dicho adyuvante es una toxina alterada genéticamente o conjugada químicamente.

81. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 75 a 80, en donde una sola molécula de dicha formulación contiene tanto propiedades de antígeno como de adyuvante.

82. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 75 a 81, en donde en el antígeno es un antígeno proteináceo por lo menos parcialmente purificado con un peso molecular mayor a 1000 daltons.

83. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 75 a 82, en donde dicho antígeno es por lo menos parcialmente purificado y derivado de una fuente seleccionada del grupo que consiste de un patógeno, una célula de tumor y una célula normal.

84. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 76 a 83, en donde el antígeno se purifica por lo menos parcialmente y se deriva de un patógeno seleccionado del grupo que consiste de una bacteria, virus, hongo y parásito.

85. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 76 a 84, en donde el antígeno por lo menos es purificado parcialmente y se selecciona del grupo que consiste de un antígeno de tumor, un auto antígeno, un alérgeno, y un agente biológico de combate.

86. Un kit para inmunización transcutánea comprende:

Por lo menos un antígeno y por lo menos un adyuvante en un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

Por lo menos un mejorador de penetración en la piel o dispositivo que rompe la barrera, en donde dicho mejorador de penetración en la piel o dispositivo que rompe barrera se adapta para romper por lo menos el estrato corneo de la piel de un sujeto sin perforar la piel del sujeto, para inducir una respuesta inmune específica a dicho antígeno; en donde el antígeno es por lo menos parcialmente purificado y seleccionado del grupo que consiste de carbohidrato, glicolípido, glicoproteína, lípido, lipoproteína, fosfolípido y polipéptido.

87. El kit de la reivindicación 86, en donde dicho mejorador de penetración en la piel se selecciona del grupo que consiste de un alcohol, acetona, un detergente, un depilatorio y un queratinolítico.

88. El kit de la reivindicación 86 u 87, en donde dicho dispositivo de rompimiento se selecciona del grupo que consiste de un cartón esmeril, una almohadilla abrasiva, un dispositivo de ensayo de púa de tuberculina, una pistola energizada a gas, una pistola de genes, un dispositivo propelente, un dispositivo de micro aguja y una cinta adhesiva.

89. El kit de la reivindicación 86, 87, o 88, en donde una molécula única contiene tanto propiedades de antígeno como de adyuvante.