CZ289521B6 - Anti-LHRH vakcinační souprava pro výrobu masa se zlepąenými organoleptickými vlastnostmi, získávaného z nevykastrovaných samců domácích zvířat - Google Patents

Abstract

Samci dom c ch zv °at se m n samci skotu, prasat a ovc , vlastn c androgenn a neandrogenn steroidy. Souprava obsahuje a) anti-LHRH vakc nu pod vanou jako prim rn injekci p°ed v²krmem nebo b hem v²krmu zv °at, ur enou k vyvol n prim rn , m lo intenzivn imunn odezvy bez v²znamn ho ba dokonce m °iteln ho · inku na sekreci steroid pohlavn mi l zami, aby se umo nil v²voj sam povahy zv °at, a b) anti-LHRH vakc nu pod vanou po p°edchoz vakc n kr tce p°ed por kou, ur enou k vyvol n anti-LHRH imunoneutralizace, kterou se zru · inek androgenn ch a neandrogenn ch steroid , p°i em ob uveden anti-LHRH vakc ny obsahuj imunogenn LHRH peptidov² aktivn z klad a LHRH m vzorec pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH.sub.2.n..\

Description

(57) Anotace:

Samci domácích zvířat se míní samci skotu, prasat a ovcí, vlastnící androgenní a neandrogenní steroidy. Souprava obsahuje

a) anti-LHRH vakcínu podávanou jako primární injekci před výkrmem nebo během výkrmu zvířat, určenou k vyvoláni primární, málo intenzivní imunní odezvy bez významného ba dokonce měřitelného účinku na sekreci steroidu pohlavními žlázami, aby se umožnil vývoj samčí povahy zvířat, a

b) anti-LHRH vakcínu podávanou po předchozí vakcině krátce před porážkou, určenou k vyvolání anti-LHRH imunoneutralizace, kterou se zruší účinek androgenních a neandrogenních steroidů, přičemž obě uvedené anti-LHRH vakcíny obsahují imunogenní LHRH peptidový aktivní základ a LHRH má vzorec pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.

(13) Druh dokumentu: B6 (51) Int. Cl.⁷:

A61K 39/385

A61K 39/395

C07K 7/06

Anti-LHRH vakcinační souprava pro výrobu masa se zlepšenými organoleptickými vlastnostmi, získávaného z nevykastrovaných samců domácích zvířat

Oblast techniky

Vynález se týká anti-LHRH vakcinační soupravy pro výrobu masa se zlepšenými organoleptickými vlastnostmi, zejména vůní, chutí a křehkosti masa, získávaného z nevykastrovaných samců domácích zvířat, jako je skot, prasata a ovce, vlastních androgenní a neandrogenní steroidy.

Dosavadní stav techniky

Výhody výkrmu intaktních místo kastrovaných samců při pěstování domácích zvířat na maso jsou zdůrazňovány zootechniky-specialisty po několika desetiletí. Tyto výhody jsou ve vyšší rychlosti růstu, zejména u skotu a ovcí, v lepším využití krmných dávek a v kvalitě masa poraženého zvířete, které je libovolnější, ale má současně u všech domácích zvířat vyšší podíl svalové tkáně (S. C. SEIDEMAN a ost., J. of Animal Science, 1982, 55 (4) 826-840, a M. BONNEAU, INRA Prod. Amin., 1988, 1 (2) 133 - 140.

Hlavní nevýhody takovéhoto pěstování intaktních samců, tak jak jsou vyzdviženy ve výše uvedených přehledech, spočívají v nepříjemném zápachu a chuti masa ze samců prasat a ovcí a v menší křehkosti masa z intaktních samců skotu a ovcí a opravňují proto současné praktiky chirurgické kastrace.

Je skutečností, že androgenní steroidy zahrnující androstendiol, androstendion a testosteron, které jsou rozhodujícími faktory pro získání výhod v pěstování domácích zvířat pokud jde o rychlý růst a lepší využití krmných dávek, jsou i zodpovědné za menší křehkost masa získaného z intaktních samců skotu a ovcí. Neandrogenní steroidy anebo deriváty 16-androsteronu včetně 5a-androstenu (5a-androst-16-en-3-on) jsou zčásti zodpovědné u samců prasat za nepříjemných zápach a chuť masa získaného potom, co samci dosáhli puberty, a tyto faktory snižují kvalitu masa a jsou na zábranu jeho marketingu v čerstvém stavu.

Skatol, sloučenina odvozená od tryptofanu a produkovaná mikrobiální flórou přítomnou ve vnitřnostech, je látkou zčásti zodpovědnou za nepříjemný zápach a chuť masa získaného z intaktních samců prasat. Jeho vznik závisí ne ekologických, nutričních a pěstitelských faktorech. Kumulace skatolu v adiposové tkáni je vyšší v kancích a soudí se, že je svázána se sekrecí pohlavních steroidů gonádami.

Pokusně byla zkoumána možnost snížení anebo odstranění samčích vlastností v mladých zvířatech a sekrece testikulámích hormonů, zejména testikulámích steroidů, cestou aktivní anebo pasivní imunoneutralizace proti těmto hormonům anebo proti hormonům zúčastněným na jejich sekreci, jakými jsou zejména luteinizační hormon nebo LH a hormon gonadoliberin (GnRH), rovněž známý jako hormon uvolňující luteinizační hormon (LHRH). Na prasatech byly rovněž provedeny pokusy o snížení hladiny 5a-androstenonu, hormonu ze skupiny 16-androstenu vtkáni, cestou aktivní imunizace proti této látce (E. D. WILLIAMSON a ost., Livestock Production Science, 1985, 12, 251-264) anebo pasivní imunizací proti téže látce (R. CLAUS, Immunization with Hormones in Reproduction Research, red. Nieschlag, 1975). Je možné pokoušet se o zastavení anebo snížení sekrece testikulámích steroidů imunoneutralizací gonadotropního hormonu LH, který je specifický pro daný druh (R. E. FALVO a ost., J. Amin. Science, 1986, 63, 986-994) anebo anti-LHRH imunoneutralizací endogenního LHRH. Pouze aktivní imunizace pomocí anti-LHRH byla doporučena různými autory. U prasat se podařilo docílit snížení α-androstenonu touto metodou (A. CARATY a M. BONNEAU, C. R. Acad. Sci. Paris 1986, 303, Serie III (16) 673-676; R. E. FALVO a ost., J. Anim. Sci., 1986, 63,986-994).

-1 CZ 289521 B6

U ovcí doporučuje B. D. SCHANBACHER (Am. J. Physiol., 1982, 242, E201-E205) anti-LHRH imunizaci ke zpomalení testikulámího vývoje a k vyvolání kastračního účinku u samčích jehňat, P. S. ROBERTSON (Vet. Rec., 1979, 105, 516-517) popisuje imunologickou kastraci skotu na bázi anti-LHRH.

Testování imunoneutralizace na bázi anti-LHRH na laboratorních zvířatech (ARIMURA a ost., Endocrinology, 1973, 93, 1092-1103; FRASER, Η. M. a ost., J. Endocr. 1974, 63, 399-406; MAKINO T. a ost., Contraception, 1973, 8 (2), 133-145; CARELLI C., a ost., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1992, 79, 5392-5395) a na některých domácích zvířatech (JEFFCOATE a ost., Theriogenology, 1978, 10(4), 323-335; ROBERTSON I. S. a ost., Veterinaiy Record, 1979, 105, 556; SCHANBACHER B. D. Am. J. Physiol., 1982, 242, E201-E205) ukázalo, zeje možné dosáhnout zástavy sekrece testosteronu, poklesu váhy varlat a jejich přilehlých žláz, zástavy spermotogeneze a na bahaviorální úrovni vymizení libida.

Výsledky této práce podnítily návrat k první imunoneutralizační metodě, založené zejména na anti-LHRH, aby bylo možné se vyhnout tradiční chirurgické kastraci pro pěstitelské účely.

Tak v US 4 556 555 je popisována metoda na pasivní imunizaci zvířat před pubertou s použitím antiséra, které obsahuje protilátky proti gonadotropinu.

Mezinárodní patentová přihláška WO 90/11298 popisuje metodu anti-LHRH imunizace při narození; používá 2 LHRH sekvence spojené v tandemu a navázané k nosičové bílkovině, aby byla zlepšena kvalita masa u prasat.

Mezinárodní patentová přihláška WO 88/00056 popisuje metodu imunologické kastrace na bázi anti-LHRH, aby se zlepšilo společenské a sexuální chování samců a tak byla odstraněna nutnost chirurgická kastrace, která ovlivňuje jejich růst. Býci byli očkováni ve věku 8 až 40 týdnů a pak dostali několik posilovačích dávek (boosterů).

Vakcína založená na anti-LHRH je prodávána pod obchodním názvem VAXTRATE australskou společností WEBSTERS a je používána u krav.

R. E. FALVO a ost. (J. Anim. Sci. 1986, 63: (986-994)) imunizovali několik skupin býků pomocí konjugátů LHRH s lidským sérovým globulinem v kompletním Freudově adjuvantu anebo s muramylpeptidem jako adjuvantem. Po vakcinaci a použití několika posilovačích dávek (boosterů) autoři pozorovali vysoké titry anti-LHRH protilátek, avšak museli opětovně použít posilovačích dávek (boosterů), aby tento vysoký titr protilátek udržovali.

I. S. ROBERTSON popisuje metodu imunizace pomocí LHRH navázaného ktetanickému anatoxinu anebo k thyroglobulinu a soudí, že tento imunologický postup by umožnil pozdní kastraci s příznivým dopadem na váhové přírůstky. Uzavírá však, že je nutno dále zkoušet postupy, které by vedly ke kastrační metodě použitelné v praxi, a to jak z hlediska metody samé tak i adjuvantu, neboť FREUNDOVO adjuvans je pro praxi zakázáno.

Konečně A. CARATY a M. BONNEAU (C. R. Acad. Sc. Paris, sv. 303, Serie III, č. 16 1986) provedli imunizaci na bázi anti-LHRH se samci prasat. Autoři soudí, že blokáda produkce steroidů 2 až 3 týdny před porážkou by poskytla možnost využít velký potenciál zvířat tohoto typu pro výrobu masa a současně že by se odstranily problémy spojené s kumulací androsteronu a adiposové tkáni. Uzavírají však, že bude nutno ještě dále pokročit v imunizačních technikách než bude možno navrhnout metodu aktivní anti-LHRH imunizace jakožto techniku použitelnou pro pěstitelské účely.

-2CZ 289521 B6

Imunoneutralizace navíc vede v praxi k vážným problémům z hlediska bezpečnosti zákroku, zejména pokud jde o místní reakce vyvolané vakcínami, zejména olejovitými vakcínami, a k nebezpečí, že maso zvířete bude nepoužitelné anebo nižší kvality.

Návrhy na zlepšení organoleptických vlastností masa skotu a ovcí nebyly dosud podány.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je anti-LHRH vakcinační souprava pro výrobu masa se zlepšenými organoleptickými vlastnostmi, zejména vůní, chutí a křehkostí masa, získávaného z nevykastrovaných samců domácích zvířat, jako je skot, prasata a ovce, vlastnících androgenní a neandrogenní steroidy.

Podstata vakcinační soupravy podle tohoto vynálezu je v tom, že obsahuje

a) anti-LHRH vakcínu podávanou jako primární injekci před výkrmem nebo během výkrmu zvířat, určenou k vyvolání primární, málo intenzivní imunní odezvy bez významného ba dokonce měřitelného účinku na sekreci steroidů pohlavními žlázami, aby se umožnil vývoj samčí povahy zvířat, a

b) anti-LHRH vakcínu podávanou po předchozí vakcíně krátce před porážkou, určenou k vyvolání anti-LHRH imunoneutralizace, kterou se zruší účinek androgenních a neandrogenních steroidů;

přičemž obě uvedené anti-LHRH vakcíny obsahují imunogenní LHRH peptidový aktivní základ a LHRH má vzorec pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.

Jedním provedením vynálezu je anti-LHRH vakcinační souprava, která jako LHRH obsahuje úplný LHRH peptid shora uvedeného vzorce.

Druhým provedením vynálezu je anti-LHRH vakcinační souprava, v níž každá z uvedených LHRH vakcín obsahuje jako aktivní základ konjugát imunogenního nosičového proteinu a LHRH peptidů.

Třetí výhodné provedení vynálezu představuje anti-LHRH vakcinační souprava, která obsahuje LHRH peptid vybraný ze skupiny zahrnující úplný nebo modifikovaný LHRH, modifikovaný nebo nemodifikovaný peptidový fragment LHRH a LHRH agonistu.

Čtvrtým provedením vynálezu je anti-LHRH vakcinační souprava, která obsahuje úplný LHRH peptid mající uvedený vzorec.

Jako páté výhodné provedení lze uvést anti-LHRH vakcinační soupravu, která obsahuje imunogenní nosičový protein vybraný ze skupiny zahrnující sérový albumin, thyroglobulin, ovalbumin, anatoxiny, tetanový anatoxin, koňské globuliny, lidské globuliny a alfaglobulin.

Šestým provedením vynálezu je anti-LHRH vakcinační souprava, v níž anti-LHRH vakcínou k podávání jako primární injekce je vakcína v emulzní formě.

Sedmé provedení vynálezu představuje anti-LHRH vakcinační souprava, v níž vakcínou v emulzní formě je vakcína ve formě emulze vody v oleji.

-3CZ 289521 B6

Osmým výhodným provedením vynálezu je anti-LHRH vakcinační souprava, obsahující vakcínu v emulzní formě připravitelnou ze směsi minerálních olejů a neiontových povrchově aktivních látek.

Deváté provedení vynálezu představuje anti-LHRH vakcinační souprava, v níž anti-LHRH vakcínou k podávání krátce před porážkou je vakcína s vodným typem pomocné látky.

Jako desáté výhodné provedení tohoto vynálezu se může uvést anti-LHRH vakcinační souprava, v níž vodný typ pomocné látky pro vakcínu je vybrán ze skupiny zahrnující gel hydroxidu hlinitého, saponin a jejich směsi.

Jedenáctým provedením vynálezu je anti-LHRH vakcinační souprava, použitelná pro prasata, v níž vakcínou k podávání krátce před porážkou je vakcína s pomocnou látkou vodného typu.

Dvanácté provedení vynálezu představuje anti-LHRH vakcinační souprava, v níž anti-LHRH vakcínou k podávání krátce před porážkou je vakcína v emulzní formě.

Třináctým provedením vynálezu je anti-LHRH vakcinační souprava, v níž vakcínou v emulzní formě je vakcína ve formě emulze vody v oleji.

Čtrnáctým výhodným provedením vynálezu je anti-LHRH vakcinační souprava, obsahující vakcínu v emulzní formě připravitelnou ze směsi minerálních olejů a neiontových povrchově účinných látek.

Patnácté provedení vynálezu představuje anti-LHRH vakcinační souprava, použitelná pro skot a ovce, v níž anti-LHRH vakcínou k podávání krátce před porážkou je vakcína v emulzní formě.

Posledním provedením tohoto vynálezu je pak anti-LHRH vakcinační souprava, která sestává se stejného počtu dávek obou vakcín v jediném balení.

V prvním, preferovaným provedení této metody se anti-LHRH vakcína podá zvířeti, nejlépe ve formě emulze a nejlépe během fáze anebo před ní, a pak krátce před porážkou zvířete se anti-LHRH vakcína aplikuje znovu. Postup lze provést ve dvou oddělených podáních anebo metodou řízeného uvolňování.

U prasat je zejména výhodné podávat anti-LHRH vakcínu spolu s vodným adjuvantem, zejména s gelem hydroxidu hlinitého a/nebo se saponinem. Aplikace se nejlépe provede 15 až 21 dnů před porážkou.

Naopak u skotu a kde je to vhodné i u ovcí se podání provede před porážkou nejlépe s vakcínou vemulzním adjuvantu, nejlépe 1 až 2 měsíce před porážkou. Tato aplikace se nejlépe provádí přinejmenším 4 týdny a nejlépe několik měsíců po první aplikaci.

V každém případě vakcína v emulzi uvažovaná pro první aplikaci a u skotu pro druhou aplikaci je nejvhodnější ve formě emulze vody v oleji. Lze uvažovat ovšem i o jiných emulzích.

Vakcína, nejlépe emulzního typu je navrhována podle tohoto vynálezu tak, aby indukovala primární imunitní odpověď nízké intenzity bez měřitelného účinku na sekreci steroidů gonádami. Formulace založená na emulzi je preferována i když jiné formulace jsou rovněž použitelné pokud vedou k témuž účinku.

Podání vakcíny před porážkou je prováděno s vakcínou formulovatelnou tak, aby v tomto stadiu způsobila zástavu anebo významné omezení sekrece steroidů bez nežádoucí místní anebo celkové reakce schopné způsobit zhoršení vzhledu anebo kvality masa.

-4CZ 289521 B6

Je žádoucí, zejména u prasat, zvolit následující dvě formulace vodných roztoků konjugátu: předně, formulaci na bázi stálé emulze vody v oleji, přiváděné z vysoce čištěného minerálního, živočišného anebo rostlinného oleje a neiontových povrchově aktivních látek, a to tak, aby byla vyvolána imunitní odpověď o nízké intenzitě bez měřitelného účinku na sekreci steroidů gonádami, a za druhé, formulaci neemulzifikovanou s gelem oxidu hlinitého anebo saponinu, která spouští rychlou a intenzivní imunitní reakci vedoucí k dostatečné produkci neutralizujících anti-LHRH protilátek tak, aby byly odstraněny anebo sníženy gonádové steroidy a aby poklesl s tím související transport skatolu vzniklého ve vnitřnostech.

Emulze, na rozdíl od té, která se získá s úplným anebo neúplným Freundovým adjuvantem, je stálá emulze umožňující přípravu vakcíny pro okamžité použití. Zánětlivá kožní reakce je velmi slabá a je lokalizována do míst aplikace vakcíny v obou formulacích; reakce se projevuje při vnějším ohledání dobře ohraničenými pupínky. Její vlastní vývoj se omezuje na dermis. Vyrážka mizí bez zanechání granulomů viditelných při porážce zvířete.

V jiném provedení této metody se hyperimunní anti-LHRH sérum nebo plazma anebo anti-LHRH monoklonální protilátky podají zvířeti několik dnů před porážkou, zejména 5 až 15 dnů předem.

Pasivní imunizace na bázi anti-LHRH, vyvolávající pokles anebo i zástavu sekrece androgenních a neadrogenních steroidů, bylo docíleno intramuskulámím podáním hyperimunní koňské plazmy. PO dovedení do dostatečné hladiny, měřené titrem protilátek proti LHRH v séru imunizovaného zvířete, tato imunizace vede k poklesu plazmového testosteronu od 3. dne; je-li udržována na téže úrovni po následujících 12 dnů je dostatečná ktomu, aby vyvolala snížení tkáňového androsteronu na hodnotu pod 0,50 mikrogram/g, při kteréžto hodnotě spotřebitel již nezjistí nepříjemný zápach a zvláštní chuť masa ze samců prasat. Tato metoda pasivní imunizace ukazuje, že udržování významného poklesu obsahu testosteronu po 12 dnů je dostatečné pro snížení koncentrace testosteronu v tkáni pod prahovou hodnotu. Po tuto pasivní imunizaci lze uvažovat o použití monoklonálních anti-LHRH protilátek vylučovaných prasečích hybridomy anebo heterohybridomy.

Způsob podání těchto formulací je nejlépe transkutánní, zejména s použitím injekčního přístroje bez jehly, a to tryskou pod tlakem, zvláště podle patentové přihlášky FR-A-2 652 257.

Metoda podle tohoto vynálezu má velkou výhodu v tom, že je zcela bezpečná, zejména, že nevyvolává místní reakce, které by mohly znehodnotit maso.

Zánětlivá reakce kůže zůstává omezena na místa aplikace obou formulací a projevuje se při zevním ohledání formou dobře ohraničených pupínků. Její vnitřní vývoj zůstává omezen na povrchovou dermis. Vyrážka mizí bez zanechání granulomů zjevných v době porážky zvířat. Zánětlivá reakce, časově omezená na místa aplikace, odráží toleranci k oběma formulacím vakcíny a je jí docíleno jejich transkutánní aplikací s použitím injektoru bez jehly.

Pro anti-LHRH imunizace je nutná kovalentní vazba peptidu LHRH nebo jeho fragmentu, které nejsou imunogenní za ekonomických podmínek použití, na imunogenní protein, zvaný nosič.

LHRH anebo GnRH, ať již přírodní nebo syntetický, je složen z 10 aminokyselin, číslovaných 1 až 10 od aminového konce ke karboxylovému konci, podle tohoto vzorce:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly.NH₂

234567 89 10

Tyto symboly podle konvence představují: pGlu, pyroglutamovou kyselinu; His, histidin; Trp, tryptofan; Ser, serin; Tyr, tyrosin; Gly, glycin; Leu, leucin; Arg, arginin; Pro, prolin.

-5CZ 289521 B6

Anti-LHRH imunogenní konjugáty, popsané různými autory, mohou být připraveny, pokud jde o hepten,

a) s celým LHRH anebo LHRH modifikovaným na jednom nebo více místech, aby bylo docíleno žádoucí aminoterminální, karboxyterminální nebo intermediámí konjugace,

b) s jedním z jeho peptidových fragmentů, složeným z 5 až 7 aminokyselin, modifikovaných anebo jinak upravených, aby bylo docíleno žádoucí aminoterminální, karboxyterminální anebo intermediámí konjugace,

c) s agonistou nesoucím substituovanou aminokyselinu, nejčastěji v poloze 6, aby bylo docíleno intermediámí konjugace.

Pokud jde o nosičovou bílkovinu, je používáno hovězího sérového albuminu, lidského sérového albuminu, thyroglobulinu, ovalbuminu a lidských anebo koňských globulinů.

Tak evropská patentová přihláška EP-A-181 236 popisuje imunogenní konjugáty obsahující nonapeptid anebo dekapeptid se sekvencí odpovídající posledním 8 aminokyselinám molekuly LHRH k nimiž je přidán lysin anebo sekvence cystein-lysin na aminoterminálním konci.

Navíc patentová přihláška WO 88/05308 uvádí konjugáty připravené s použitím fragmentů obsahujících 5, 6 nebo 7 sousedních aminokyselin z molekuly přirozeného peptidu, kde pak každý fragment obsahuje N-terminální pyroglutamovou kyselinu anebo karboxyterminální glycinamid a kde je možné ke každému fragmentu přidat navíc další aminokyselinu anebo sled aminokyselin ke konci připojenému k imunogenní bílkovině.

Konjugační činidla spadají do třech hlavních kategorií: aktivační činidla, homobifunkční činidla a heterobifunkční činidla. Kdežto u aktivačních činidel je vazba mezi oběma molekulami uskutečněna vazbou mezi oběma funkcemi již přítomnými, u ostatních činidel je vazba uskutečněna uhlovodíkovým zbytkem zvaným ligand.

Z aktivačních činidel lze jmenovat kyselinu jodistou, používanou k oxidaci oligosacharidových zbytků na aldehydy, a nimiž aminová skupina druhé molekuly účastnící se na konjugátu následně reaguje.

Karbodiimidy jsou aktivační činidla široce používaná k vazbě antigenů na proteiny; z nich pak největšího použití doznal zajisté N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid (EDC) hydrochlorid, který umožňuje provedení reakce ve vodném prostředí. Působení karbodiimidů vede k vytvoření amidové vazby karboxylovou skupinou jednoho proteinu, aktivovaného ve formě intermediámí O-alkylizomočoviny, a aminovou skupinou nesenou jinou molekulou. Jejich výhoda je ve snadném použití.

Homobifunkční činidla jsou molekuly nesoucí dvě identické reaktivní skupiny oddělené uhlovodíkovým řetězcem. Z těchto činidel lze jmenovat glutaraldehyd, který reaguje s dvěma primárními aminovými skupinami, alkyl- anebo arylizodithiokyanáty reagující s primárními aminy a thioly, a bisdiazotovaný benzidin, který se váže na aromatické zbytky tyrosinu. Bismaleinimidy a bisamidináty lze jmenovat pro úplnost. Hlavní nevýhodou homobifunkčních činidel je nesnadnost regulace vznikajících konjugátů, jelikož tato činidla mohou reagovat s dvěma molekulami téhož charakteru a tak vést ke vzniku oligomerů anebo polymerů.

Chemici, aby tomu zabránili, vyvinuli heterobifunkční činidla v nichž tyto dvě skupiny mají odlišné specifíty. V obecném případě, jedna z těchto skupin je ester N-hydroxysukcinimidu, který za mírných podmínek reaguje s volnými aminoskupinami bílkovin a poskytuje jednak N-hydroxysukcinimid, jednak bílkovinu spojenou kovalentní vazbou s kopulačním činidlem na němž je druhá funkce. Obecně tato funkce může reagovat s thioly poskytovanými molekulou na

-6CZ 289521 B6 niž se váže, ať již jsou tyto thioly buď od začátku přítomné v molekule jako cyseinové zbytky (mohou tvořit její přirozenou složku anebo v případě peptidů mohou být úmyslně zabudovány o molekuly během syntézy) anebo jsou poskytnuty takovými činidly jako jsou 2-iminothiolan nebo N-[3-(2-pyridyldithio)propanoyloxy]sukcinimid (SPDP) po redukci.

Z množství popsaných výše je nejlepší zvolit celý LHRH. V takovém případě se dá přednost přirozenému LHRH před agonisty jako je (D-Lys⁶)-LHRH což vyplývá ze srovnání imunogenní aktivity konjugátů připravených s použitím těchto dvou peptidů.

Karbodiimid má přednost před glutaraldehydem jakožto činidlo pro konjugaci přirozeného LHRH s alfa-globulinem.

Lidský nebo koňský alfa-globulin, frakce IV-1 nebo IV-4, jsou preferovány před lidským nebo hovězím sérumalbuminem.

Je žádoucí, aby vakcíny obsahovaly tentýž aktivní princip, přednostně konjugát alfa-globulinu s LHRH; LHRH je nejlépe přirozený LHRH a alfa-globulin lidského nebo koňského původu jsou zejména frakce IV-1 a/nebo IV-4. Konjugát je přednostně získáván přidáním 0,5 až 2 objemů 2,5 % roztoku hydrochloridu N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) v 0,9 % NaCl k 1 objemu směsi alfa-globulinu a LHRH v roztoku obsahujícím 2 až 20 mg této směsi v 1 ml 0,9 % NaCl. Po promíchání je směs ponechána přes noc a pak přečištěna gelově permeační chromatografií.

Pokud jde o nosičovou bílkovinu je možné použít sérových albuminů, zejména hovězího nebo lidského, thyroglobulinu ovalbuminu, lidského nebo koňského globulinu a natoxinů, zejména tetanového anatoxinu.

Pozorovaný velký rozsah imunitní odpovědi samců prasat na karboxyterminální frakci LHRH peptidu konjugovaného pomocí karbodiimidu anebo jeho agonisty, (D-Lys⁶)-LHRH, konjugovaného pomocí SPDP, s alfa-globulinem, vedla k definici imunogenního konjugátu na bázi anti-LHRH používající s výhodou peptid obsahující karboxylový konec LHRH.

V důsledku toho a podle druhého preferovaného provedení vynálezu přihlašovatel nalezl, že je velmi výhodné použít nového peptidu, který obsahuje posledních 8 aminokyselin LHRH, tedy dekapeptidu o složení

Trp - Ser - Tyr - Gly - Leu - Arg - Pro - Gly.NH₂ 34567 8 9 10 kteiý má velkou imunogenní aktivitu a přitom nevykazuje hormonální aktivitu přirozeného LHRH.

Předmětem vynálezu je tedy tento nový peptid (3- 10) a konjugáty tento peptid zahrnující, navázaný na jednu z výše zmíněných imunogenních nosičových bílkovin, ovalbumin a koňský alfa-globulin, zejména na frakce IV-1 a/nebo IV-4, které jsou preferovány.

V tomto vynálezu je karbodiimid preferován před glutaraldehydem a před heterobifunkčními činidly jako činidlo pro konjugaci LHRH (3-10) peptidu zejména s koňským alfa-globulinem nebo s ovalbuminem.

Při přednostně používané přípravě konjugátu, LHRH (3 - 10) a nosičová bílkovina, ovalbumin nebo alfa-globulin, jsou rozpuštěny každý v poměru 2 až 40 mg na 1 ml pufru 0,lM NaCl/0,lM 2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina. Pak se přidá 0,5 až 2objemy 2,5 % roztoku N-ethylN'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu v témže pufru. Hodnota pH se nastaví IN NaOH. Po

-7CZ 289521 B6 promíchání se směs odstaví přes noc a pak se přičistí gelově permeační chromatografií, která odstraní nenavázaný LHRH (3 - 10), zbytek karbodiimidu a hydrolyzační produkty.

Předmětem vynálezu jsou rovněž nové vakcíny na bázi anti-LHRH, které používají takovéto konjugáty jako aktivní principy použitelné metodou podle tohoto vynálezu.

Předmětem vynálezu je rovněž pasivní anti-LHRH (3-10) imunizace v souladu s výše popsanou metodou.

Vynález se rovněž týká souprav v jednom balení obsahujících stejný počet dávek vakcíny, která má být aplikována před porážkou a vakcíny k aplikování v primární injekci. Přednostně jsou tyto vakcíny baleny ve sníženém objemu o zvýšené koncentraci pro aplikaci transkutánní tryskou, např. podle francouzské patentové přihlášky citované výše.

Vynález bude nyní popsán podrobněji pomocí srovnávajících testů různých produktů a vakcinačních metod podle tohoto vynálezu na straně jedné a na straně druhé pomocí testů, které prokázaly velký rozsah imunitní odpovědi u samců prasat na karboxyterminální část LHRH peptidů a testů vakcinace na bázi LHRH prováděné na samcích prasat podle tohoto vynálezu.

-Použití celého LHRH

A. Větší imunogenní aktivita konjugáty zachovávajícího nejdelší karboxyterminální část LHRH peptidů a výběr konjugátu založeného na přirozeném LHRH přednostně před konjugátem získaným na bázi agonisty (D-Lys⁶)-LHRH.

Al. Anti-LHRH imunizace intaktních samců prasat a samců krys. Porovnání aktivity dvou antiLHRH vakcín složených z konjugátu přírodní formy LHRH (B1 a B2) nebo (D-Lys⁶)-LHRH (Al a A2) s lidským albuminem, přičemž konjugáty jsou získány pomocí karbodiimidu ve vodné fázi resp. pomocí SPDP, uvedeny do emulze oleje ve vodě a podány intramuskulámě prasatům a subkutánně krysám, vede k těmto závěrům:

- Vyšší aktivita vakcíny založené na přirozeném LHRH: je zapotřebí menšího množství LHRH peptidů než konjugovaného (D-Lys⁶)-LHRH peptidů aby byl získán větší počet zvířat dávajících imunitní odpověď (tabulka 1 a 3).

- Účinek dávky, který se projevuje v získání většího počtu zvířat dávajících imunitní odpověď se stejným konjugátem (tabulka 3).

Al.l - Příprava konjugátů (D-Lys⁶)-LHRH s albuminem s pomocí SPDP.

Příprava konjugátů (D-Lys⁶)-LHRH s albuminem je prováděna ve třech stupních: příprava {N-[3-(pyridylthio)propynoyl]-D-Lys⁶}-LHRH, příprava N-(3-merkapropropanoyl)albuminu, pak vazba.

{N'-[3-(2-Pyridyldithio)propanoyl]-D-Lys⁶}-LHRH je připraven reakcí přebytku SPDP s LHRH ve vodném roztoku (6 mol SPDP na mol LHRH) a pak, po odstavení reakční směsi při 4 °C přes noc, je produkt získán odstředěním. Ten se rozpustí v 8M močovině a testuje se přítomnost 2-pyridylthioskupin.

N-(3-Merkaptopropanoyl)albumin se získá působením 0,2 mmol SPDP na 1 g lidského albuminu rozpouštěného ve 100 ml fosfátového pufru a, po odstranění reakční směsi při 4 °C přes noc a jejím okyselení na pH 6, redukcí dithiothreitolem. Pak je produkt přečištěn gelovou chromatografií. Zkouška thiolů a proteinu poskytuje údaj o stupni substituce.

-8CZ 289521 B6

Navázání je provedeno s použitím jedné pyridyldithioskupiny na 1,25 thiolových skupin. pH se nastaví na 7 až 7,5 a po jedné hodině se výtěžek stanoví měřením uvolněného 2-pyridinthionu.

Průměrný stupeň substituce je odvozen ze získaného údaje. Konečně je konjugát přečištěn chromatografií a zkoncentrován ultrafiltrací.

A 1.2- Příprava konjugátu LHRH s albuminem s pomocí karbodiimidu. Hydrochlorid N-ethylN'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu v množství 1 000 mg, rozpuštěný bezprostředně před použitím ve 40 ml 0,9 % NaCl, se přidá k 300 mg LHRH a 300 mg lidského albuminu, rozpuštěných v 30 ml 0,9 % NaCl. Po promíchání se směs odstaví přes noc při laboratorní teplotě a chrání se před světlem. Pak se směs chromatografie na Sephadexu G-50; frakce odpovídající konjugát jsou sbírány, případně zkoncentrovány a zmrazený.

Ve frakcích obsahujících nenavázaný LHRH se stanoví jeho množství a tím průměrná hladina konjugace, tato hodnota je reprodukovatelná a kolísá mezi 8 a 10 mg LHRH na 100 mg albuminu.

Výtěžek chromatografie konjugátu a tím i množství (nebo koncentrace) LHRH jsou odvozeny z ultrafialových spekter konjugátu před a po chromatografií.

A 1.3 - Testovací postupy

Titr protilátek se stanoví technikou popsanou JEFFOATEM a ost., Acta Endocr., Copenh., 1974, 75: 625-635.

Testosteron se stanovuje přímo v plazmě technikou RLA používající testosteron C19-karboxymethyl-[¹²⁵|]histamin jako radiogand.

Vazba na značený peptid je stanovena po substituci různých peptidů jódem 125 podle COPPOLANDA a ost., Endocr., 1979 104, 1504-1506 a technikou popsanou JEFFCOATEM a ost., Acta Endocr., Copenh., 1974,75, 625-635.

A 1.4 - Znázornění testy na krysách.

Tabulka 1: odpověď anti-LHRH protilátek měřená podle stupně vazby LHRH značeného jódem-125.

Tabulka 2: účinek anti-LHRH imunizace na koncentraci plazmového testosteronu.

Dávkování

Vakcíny AI: 50 pg konjugovaného (D-Lys⁶)-LHRH,

Bl: 12 pg konjugovaného LHRH,

- Testy na intaktních samcích prasat.

Tabulka 3: odpověď anti-LHRH protilátek měřená stupněm vazby LHRH značeného jódem-125.

-9CZ 289521 B6

Dávkování

Vakcíny: AI: 0,5 mg konjugovaného (D-Lys⁶)-LHRH,

A2: 6 mg konjugovaného (D-Lys⁶)-LHRH,

Bl: 0,15 mg konjugovaného LHRH, B2: 1,20 mg konjugovaného LHRH.

Tabulka 1

Odpověď anti-LHRH protilátek měřená stupněm vazby LHRH označeného jódem-125

Testování protilátek (% pl/č) v séru (1/100) u krys

Inj.	Čas týd.	Skupina AI 50 pg D-Lys6-LHRH/HS A/AE1	Skupina Bl 12 gg LHRH/EDC/HSA(AE1	Titr pl/č=50 %
SC	0	-	-
SC	4	0,0	15,4	<100
		7,8	7,6	<100
		0,0	35,3	<100
		0,0	51,1	100
	5	4,3	91,1	1600
		14,1	85,3	980
		5,9	70,8	270
		15,8	94,9	2100
	6	0,0	64,3	120
		11,3	67,9	220
		11,7	96,1	2400
		0,0	68,3	280
	7	14,5	72,5	400
		0,0	92,4	2100
		0,0	64,2	200
		11,5	67,2	240
	á	19,6	70,4	310
		0,0	98,8	3200
		9,2	68,7	2200
		0,0	38,8	310

-10CZ 289521 B6

Tabulka 2

Účinek anti-LHRH imunizace na koncentraci testosteronu v plazmě

Testování testosteronu v plazmě krys (ng/ml)

Inj.	Čas týd.	kontr.	Skupina AI 50 pg D-Lys6-LHRH/PDP/AE 1	Skupina Bl 12 pg LHRH/EDC/HSA
SC	0	0,40	—	—
		0,26	—	—
		0,47	—	—
		0,00	-	-
SC	4	2,25	4,16	2,51
		1,05	5,83	2,38
		2,34	4,43	3,63
		-	4,17	0,58
	5	3,80	2,99	0,00
		1,76	2,33	0,00
		5,05	2,85	0,00
		6,67	1,54	0,00
	6	2,01	3,26	0,00
		4,47	0,09	0,00
		4,69	1,10	0,00
		1,96	-	0,00
	7	2,28	1,32	0,00
		1,92	0,89	0,00
		1,89	1,59	0,00
		1,65	2,17	0,00
	8	0,97	1,75	0,00
		1,91	1,48	0,00
		2,71	1,91	0,00
		1,22	2,33	0,00

-11 CZ 289521 B6

Tabulka 3

Odpověď anti-LHRH protilátek měřená stupněm vazby LHRH značeného jódem-125

Testování anti-LHRH protilátek v séru (zřeď. 1/50)

Častýd.	D-Lys6-LHRH/PDP/HSA/AE 1 0,5pg(Al)	D-Lys6-LHRH/PDP/HSA/AE 1 6 pg (A2)	Titr (pl/č=50 %) Al
			počet prasat				221	počet prasat			počet prasat
	211	219	231 243	257	205	227	245	251		221
TO 1. inj.
T3	0	0	0	0	0	0	71,8	0	0	0		150
T4	0	0	0	0	0	0	67,3	0	0	0		100
T5 2. inj.	0	0	0	0	0	0	53,4	0	0	0		50
T6	0	0	0	0	0	14,2	58,5	42,1	6,6	0		55
T7	0	0	0	0	0	7,5	48,5	36,7	5	0		<50
T8	0	0	0	0	0	7,7	44,1	28,8	5	0		<50
T9	0	0	0	0	0	5	37,5	22,6	5	0		<50
Castýd.		LHRH-(KARBO)/HSA/AE I		LHRH-(KARBO)-HSA/AE 1		Bl	B2
			0,150 mg (Bl)				1,2 mg(B2)
			počet prasat					počet prasat			počet prasat	počet prasat
	213	225	247 255	261	209	215	235	241	259	247	235	259
TO l.inj.
T3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
T4	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
T5 2.inj.	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
T6	0	0	81,2	5	25,1	48,9	56,2	78,2	31,4	90,1	200	130	990
T7	0	0	81,7	5	49,1	64,7	49,9	86,3	52,3	92,9	170	220	880
T8	0	0	80,5	5	36,5	54,1	48,9	80,7	59,3	90,5	150	140	640
T9	0	0	74,4	5	34,5	54,4	40,1	68,5	51,6	89,1	220	220	490

A2 - Srovnávací test dvou anti-LHRH vakcín složených z konjugátu LHRH s a-globulinem připraveného s pomocí kabodiimidu, respektive konjugátu (D-Lys⁶)-LHRH s a-globulinem připraveného pomocí SPDP a aplikovaných v emulzi oleje ve vodě intramuskulámě (IM) anebo transkutánně (ID) prasatům.

A2.1 - Příprava konjugátu (D-Lys⁶)-LHRH s α-globulinem s pomocí SPDP Metoda popsaná v příkladu 1 se použije přesně stejným způsobem, ale albumin v koncentraci 10 mg/ml se nahradí α-globulinem v koncentraci 6 mg/ml.

Celkový výtěžek navázaného (D-Lys⁶)-LHRH je řádově 45 až 50 %.

Je navíc možné modifikovat libovolně stupeň substituce α-globulinu a tak stupeň konjugace tím, že se mění koncentrace SPDP a/nebo α-globulinu během přípravy MP-a-globulinu.

A2.2 - Příprava konjugátu LHRH s lidským α-globulinem s pomocí karbodiimidu (EDC).

Použije se metoda popsaná v příkladu Al přesně stejným způsobem, ale lidský se nahradí lidským α-globulinem. Hladina konjugace je 24 až 28 mg LHRH vázaného na 100 mg lidského a-globulinu.

A2.3 - Účinnost vakcíny založené na konjugátu LHRH, s α-globulinem je vyšší než u druhé vakcíny. Účinnost je vyjádřena v počtu zvířat, které vykazují úplné vymizení testosteronu z plazmy.

-12CZ 289521 B6

Tabulka 4

	LHRH-a-globulin.EDC (1,2 mg) IM+ID	(D-Lys6}-LHRH-a-globulin.SPDP (6 mg) IM+ID
vymizení testosteronu	5/10	2/10

A2 -Velký rozsah imunitní odpovědi samců prasat na aplikaci karboxyterminální peptidové frakce konjugované s pomocí karbodiimidu nebo jeho agonisty, (D-Lys⁶)-LHRH, konjugovaného s pomocí SPDP s lidským a-globulinem.

Tato odpověď se stanoví ze srovnání procenta vazby anti-LHRH a anti-(D-Lys⁶)-LHRH sér dvěma značenými fragmenty LHRH, a to LHRH (3 - 10) s delecí aminoterminální části, a LHRH (1-10), který je ve formě volné kyseliny v důsledku delece provedené v jeho terminální části. Tyto dvě frakce specificky rozeznávají protilátky proti karboxyterminální, resp. aminoterminální části řetězce peptidu.

Rozsáhlá odpověď na karboxyterminální část řetězce peptidu se projevuje v počtu zvířat, která mají protilátky vážící pouze peptid LHRH (3-10) oproti těm, která mají protilátky vážící výlučně LHRH ve formě volné kyseliny (10/58) u anti-LHRH séra a 3/10 u anti-(D-Lys⁶)LHRH séra.

Žádné sérum nevykazovalo 100 % vazbu LHRH ve formě volné kyseliny, která by ukazovala na specifické rozpoznání aminoterminální frakce.

Nejčastější byly smíšené odpovědi, které vykazovaly lepší rozpoznání aminoterminální frakce anti-(D-Lys⁶)-LHRH séry než anti-LHRH séry. Z anti-LHRH sér pouze 3 z 58 vykazovaly rozpoznávací schopnost pro aminoterminální frakci vyšší než 40 %, kdežto u anti-(D-Lys⁶)LHRH sér tato hodnota byla 4 séra z 10.

B -Větší imunogenní aktivita konjugátu LHRH s α-globulinem, připraveného pomocí karbodiimidu, ve srovnání s konjugátem připraveným pomocí glutaraldehydu.

B.l - Příprava konjugátu s α-globulinem s pomocí glutaraldehydu.

Objem 2,5 ml roztoku glutaraldehydu, který obsahuje 10 mg/ml se přidá po kapkách během 30 minut k 10 mg LHRH a 50 mg lidského α-globulinu (Serva), rozpuštěný v 5 ml 0,lM fosfátového pufru o pH 7,5; po každém přidání se promíchá. Reakční směs se ponechá 2,5 hodiny při laboratorní teplotě a reakce se zastaví přídavkem 25 mg bisulfitu sodného rozpuštěného v 5 ml vody. Konjugát se dialyzuje při 4 °C proti 150 mM NaCl v 10 mM fosfátového pufru o pH 7,5 a pak se zkoncentruje ultrafiltrací.

B2. - Srovnávací test anti-LHRH vakcín obsahujících stejné množství konjugovaného LHRH na prasatech (tabulka 7)

Tabulka 7

	LHRH-a-globulin (připraven s karbodiimidem) podán IM nebo ID	LHRH-a-globulin (připraven s glutaraldehydem) podán IM nebo ID
Vymizení testosteron u z plazmy	5/10	0/10

-13 CZ 289521 B6

C -Vyšší imunogenní aktivita konjugátu založeného na lidském α-globulinu ve srovnání s konjugátem na bázi lidského sérumalbuminu.

Účinnost je vyjádřena počtem zvířat, která vykazují úplné vymizení testosteronu z jejich plazmy (tabulka 8).

Tabulka 8

Testy na prasatech - intramuskulámí injekce

	LHRH-HSA připravený s karbodiimidem	LHRH-a-globulin připravený s karbodiimidem
Vymizení Testosteronu z plazmy	0/5	3/5

D - Imunogenní aktivita konjugátu používajícího koňský α-globulin, frakci IV-1, ekvivalentní konjugátu založenému na lidském a-globulinu.

D.l - Příprava konjugátu LHRH s koňským α-globulinem s pomocí karbodiimidu.

Je použito metody přesně stejným způsobem, jak je popsáno v příkladu Al stím rozdílem, že lidský albumin se nahradí koňským α-globulinem (frakce IV-1).

D.2 - Subkutánní aplikace vakcíny v dávce 12 pg LHRH konjugovaného s lidským nebo α-globulinem krysám v intervalu 4 týdnů.

Tabulka 9

Testy na krysách

	LHRH-lidský aglobulin frakce IV-1 s karbodiimidem	LHRH-koňský α-globulin frakce IV-1 připravený s karbodiimidem
Vymizení testosteronu z plazmy	12/12	12/12

E -Větší adjuvantní aktivita emulze oleje ve vodě podle vynálezu proti jiným emulzím (tabulka 10).

Testy provedeny na prasatech s použitím téhož konjugátu složeného z LHRH a lidského α-globulinu a připraveného s pomocí kabodiimidu, aplikována táž dávka transkutánně na 5 místech.

Zkoumané emulze: kapalná emulze oleje ve vodě (B), emulze podle vynálezu (vzorec C v tabulce), komerční emulze ředěná antigenem (E) a olejová fáze emulzifikovaná s konjugátem (F).

U všech těchto formulací bylo konečné množství antigenů v dávce stejné.

-14CZ 289521 B6

Emulze byly připraveny za obvyklých podmínek používaných těmi, kteří se zabývají formulacemi tohoto typu.

Tabulka 10

Emulze	B	C	E	F
Vymizení testosteronu z plazmy	2/5	4/4	1/5	3/5
Počet zvířat vykazujících koncentraci aldosteronu v tkáni pod 0,5 gg/g	2/2	4/4	3/5	3/5

F -Účinnost pasivní anti-LHRH imunizace na zlepšení organoleptických vlastností masa poklesem androsteronu v tkáni.

Tabulka 11

Obsah androsteronu v adiposové tkáni kontrolních zvířat a zvířat podrobených imunoneutralizaci pomocí hyperimunní koňské anti-(D-Lys⁶-LHRH plazmy podané v objemu 300 ml 16., 13., 9. a 5. den před porážkou

	Kontroly	Pokusná zvířata
Počet zvířat vykazujících koncentraci androsteronu pod 0,50 gg/g adiposové tkáně	2/5	5/5

(signifikantní rozdíl při α-riziku = 0,2)

G -Účinnost a tolerabilita formulací obsahujících LHRH konjugovaný s a-globulinem s pomocí karbodiimidu ve formě emulze vody voleji (1. vakcína) a v hydroxidu hlinitém a saponinu (2. vakcína); podány transkutánně s obsahem stejného množství LHRH v dávce na počátku výkrmného období, resp. 18 až 21 dnů před porážkou s použitím injektoru bez jehly známého jako Pigjet.

Dva testy byly provedeny ve dvou různých intervalech,a to pro skupiny 1,3 a 5 v prvním intervalu a pro skupiny 2 a 4 ve druhém intervalu (tabulka 12 a 13).

G.l -Účinnost imunoneutralizace spomocí anti-LHRH roste při stejném objemu vakcíny s počtem míst transkutánní aplikace.

Tabulka 12

Skupina	1	2	3	4	5
1. vakcína	1 ml (5 míst)	1 ml (3 místa)	1 ml (5 míst)	0,4 ml (10 míst)	0,4 ml (2 místa)
2. vakcína	1 ml (5 míst)	I ml (3 místa)	0,4 ml (2 místa)	0,4 mi (10 míst)	0,4 ml (2 místa)
Vymizení nebo výrazný pokles testosteronu (počet zvířat)	10/12	10/11	9/12	11/11	8/11
Koncentrace andosteronu v tkáni pod 0,5 pg/g (počet zvířat)	11/12	n	10/23	n	n

n = nestanoveno.

G.2 - Tolerance k vakcínám je posuzována podle vzniku zánětlivé reakce na kůži, odstupňované od 0 do 4 na daném zvířeti podle velikosti pupínků objevujících se po aplikaci; pupínek se objevuje na každém místě aplikace. Součet skóre v každé skupině je sumarizován takto:

-15CZ 289521 B6 průměrné skóre na konci prvého týdně po aplikaci (apl. 1) a průměrné skóre v době porážky pro každou vakcínu (Sl) (tabulka 13). Nejlepší tolerance byla pozorována při použití vakcín ve skupině 4.

Tabulka 13

Tolerance při transkutánní aplikaci během dvou testů (test 1 se skupinami 1,3 a 5, test 2 se skupinami 2 a 4)

Skupina	1	2	3	4	5
Vakcína 1 nebo 2	1. vak.	2. vak.	1. vak.	2. vak.	1. vak.	2. vak.	1. vak.	2. vak.	1. vak.	2. vak.
Počet míst aplikace	5	5	5	5	5	2	10	10	2	2
Ad. 1	42	11	31	11	41	16	33	11	30	10
Sl	2	4	0	0	5	3	0	0	2	0
Počet zvířat		12		11		12		11		11

II - Použití peptidu (3-10)

A. Techniky měření anti-LHRH imunitní odpovědi a biologické účinnosti pomocí stanovení testosteronu v plazmě a tkání.

Imunitní odpověď anti-LHRH je měřena stanovením titru protilátek postupem popsaným JEFFCOATEM a ost., Acto. Endocr. (Copenh.), 1974, 75,625-635.

Vazba na značené peptidy se stanoví po substituci různých peptidů jódem-125 podle COPPOLANDA a ost., Endocrinology, 1979, 104,1504-1506. Stanovení séra ve smyslu obsahu těchto peptidů se provede postupem JEFFCOATA a ost. popsaných výše.

Biologická účinnost se posuzuje podle snížení anebo vymizení testosteronu z plazmy a tkání. Test testosteronu v plazmě se provádí přímo s plazmou RIA technikou s použitím radioligandu, kterým je testosteron C19-karboxymethylether[¹²⁵| ] histamin (FURUYAMA S. a ost., Steroids, 1972, 16, 415). Test testosteronu vtkáni se provádí se vzorkem adiposové tkáně pomocí RIA techniky s použitím radioligandu, kterým je 5a-[³H]androsteron popsaný CLAUSENEM, C. R. Acad. Sci., Paris, 1974,229-302).

B. Velký rozsah imunitní odpovědi samců prasat na karboxyterminální frakci LHRH peptidu konjugovaného s α-globulinem pomocí karbodiimidu nebo jeho agonisty, (D-Lys⁶)-LHRH, konjugovaného s pomocí SPDP.

Konjugát s výhodou získaný přidáním 0,5 až 2 objemů 2,5 % roztoku hydrochloridu N-ethylN'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) v 0,9% NaCl kjednomu objemu směsi a-globulin/LHRH v roztoku obsahujícím 2 až 20 mg této směsi v jednom ml 0,9% NaCl. Po promíchání se směs odstaví přes noc a pak přečistí gelovou permeační chromatografií.

B.2 Příprava konjugátů (D-Lys⁶)-LHRH s lidským α-globulinem pomocí SPDP.

Příprava konjugátů (D-Lys⁶)-LHRH s lidským α-globulinem se provede ve třech stupních, kterými jsou příprava {N-[3-(2-pridyldithio)propanoyl]-D-Lys⁶}-LHRH, příprava N-(3merkaptopropanoyl) derivátu lidského α-globulinu a nakonec kopulace.

{N'-[3-(2-pyridylthio)propanoyl]-D-Lys⁶}-LHRH), směs se ponechá přes noc při 4 °C a pak se produkt získá centrifugací. Produkt se rozpustí v 8M močovině a pak se testuje na obsah 2-pyridylthioskupin.

-16CZ 289521 B6

N-(3-Merkapropropanoyl) derivát lidského a-globulinu se získá působením 0,2 mmol SPDP na 0,6 g lidského α-globulinu rozpuštěného ve 100 ml 0,1 M fosfátového pufru; po reakci přes noc při 4 °C a okyselení na pH 6 se produkt získá redukcí dithiothreitolem. Produkt se pak přečistí gelovou chromatografií. Průměrný stupeň substituce se posuzuje podle stanovení obsahu thiolových skupin a bílkoviny.

Vazba se provede s použitím jedné 2-pyridyldithioskupiny na 1,25 thiolových skupin. Hodnota pH se nastaví na 7 až 7,5 a pak, po jedné hodině, se stanoví výtěžek změřením uvolněného 2-pyridinthionu.

Průměrný stupeň substituce je dedukován z této hodnoty. Konjugát se konečně přečistí chromatografií a zkoncentruje ultrafiltrací. Celkový výtěžek navázaného (D-Lys)-LHRH je řádově 45 až 50 %.

B3. Rozsah imunitní odpovědi samců prasat na aplikaci karboxytermální frakce peptidů LHRH konjugovaného za podmínek popsaných v 1 a A2 se stanoví ze srovnání vazebných schopností anti-LHRH séra a anti-(D-Lys⁶)-LHRH séra pro dva značené fragmenty, (LHRH (3-10) (LHRH sdelecí v aminoterminální části řetězce) a LHRH (1-10) ve formě volné kyseliny (LHRH s delecí amidové skupiny v karboxyterminální částí řetězce). Tyto dvě frakce rozeznávají s větší specifitou protilátky proti karboxyterminální frakci na straně jedné a aminoterminální frakci na straně druhé

Odpověď na karboxyterminální frakci peptidů dávají obecně všechna zvířata imunizovaná jedním nebo druhým konjugátem(61/68). Séra 3 z 10 zvířat z celkového počtu 10 imunizovaných konjugátem (D-Lys⁶)-LHRH a séra 10 zvířat z celkového počtu 10 imunizovaných konjugátem (D-Lys⁶)-LHRH a séra 10 zvířat z celkového počtu 68 imunizovaných konjugovaných LHRH vázala výhradně karboxyterminální frakci. Ostatní zvířata dávají smíšenou odpověď převážně na karboxyterminální frakci.

Odpověď na aminoterminální frakci nemá obecný výskyt (55 až 68). Žádné sérum nevázalo specificky LHRH ve formě volné kyseliny.

C. Testy aktivní anti-LHRH imunoneutralizace s použitím konjugátu LHRH (3 až 10) s frakcí IV-4 koňského α-globulinu a konjugátu LHRH (3 až 10) s ovalbuminem, připravených s pomocí karbodiimidu.

Cl -Příprava konjugátu LHRH (3 až 10) sfrakcí IV-4 koňského α-globulinu spomocí karbodiimidu.

LHRH (3 až 10) v množství 85 mg a 170 mg frakce IV-4 koňského α-globulinu se rozpustí v 12,8 ml pufru o složení 0,lM NaCl/Ο,ΙΜ 2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina. Pak se přidá 212 mg N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu rozpuštěného v 17 ml uvedeného roztoku. Hodnota pH se ihned nastaví na 6,0 pomocí 1,3 ml IN hydroxidu sodného.

Směs se promíchá a odstaví na 16 h pří laboratorní teplotě a konjugát se pak přečistí gelovou permeační chromatografií, aby se oddělil konjugát od nezkonjugovaného LHRH. Odečtením nezkonjugováného LHRH lze stanovit množství navázaného LHRH. Lze tedy tak stanovit výtěžek vazby.

C2 . Příprava konjugátu LHRH (3 - 10) s ovalbuminem pomocí karbodiimidu.

LHRH (3-10) v množství 60 mg a 120 mg ovalbuminu se rozpustí v 9 ml pufru 0,lM NaCl/Ο,ΙΜ 2-(N-morfolino) ethansulfonová kyselina. Hydrochlorid N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu v množství 150 mg a rozpuštěný v 12 ml téhož pufru se pak přidá k roztoku. Hodnota pH se nastaví na 7,0 pomocí IN hydroxidu sodného (zhruba 1,9 ml). Směs se

-17CZ 289521 B6 odstaví přes noc při laboratorní teplotě a pak se vyčeří centrifugací. Supematant se chromatografuje na Sephadexu, aby se odstranil konjugát od nezreagovaného LHRH a produktů rozpadu karbodiimidu.

Výtěžek vazby LHRH (3 - 1 lze stanovit z určení množství nenavázaného LHRH (3 - 10).

C3. -Imunitní odpověď, biologická účinnost a tolerance kanti-LHRH vakcíně založené na konjugaci fragmentů LHRH (3 - 10) a frakce IV-4 koňského α-globulinu pomocí karbodiimidu.

Formulace složené z konjugovaného LHRH (3-10) v emulzi vody voleji (1. vakcína) a v emulzi gelu hydroxidu hlinitého a saponinu (2. vakcína) byly aplikovány transkutánně 6 samcům prasat v objemu 0,4 ml jedna dávka, a to na počátku výkrmného období a 17 dnů před porážkou s použitím injektoru bez jehly, známého jako Pidjet injektor, tak, že dávka byla rozdělena na dva podíly po 0,2 ml vstřiknuté na 5 místech.

Imunitní odpověď byla maximální 10 dnů po podání 2. vakcíny. Jednotlivé titry protilátek (reciproká hodnota zředění při němž bylo vázáno 50 % jódu—125) byly tyto:

Den 10 280 660 2700 3200 4600 13 000

Den 16 290 400 2000 2400 3100 8600

Biologická účinnost této imunitní odpovědi se projevuje vymizením testosteronu z plazmy od

10. dne po podání 2. vakcíny ve všech 6 zvířatech. Vymizení testosteronu je za týchž podmínek provázáno vymizením androsteronu z tkáně.

Tolerance k vakcíně je posuzována podle vzniku zánětlivé kožní reakce odstupňované podle velikosti pupínků objevujících se na každém místě vakcíny po jejím podání. Místní zánět zcela zmizel od 10. dne po aplikaci 2. vakcíny.

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Anti-LHRH vakcinační souprava pro výrobu masa se zlepšenými organoleptickými vlastnostmi, získávaného z nevykastrovaných samců domácích zvířat, jako je skot, prasata a ovce, vlastních androgenní a neandrogenní steroidy, vyznačující se tím, že obsahuje

   a) anti-LHRH vakcínu podávanou jako primární injekcí před výkrmem nebo během výkrmu zvířat, určenou k vyvolání primární, málo intenzivní imunní odezvy bez významného ba dokonce měřitelného účinku na sekreci steroidů pohlavními žlázami, aby se umožnil vývoj samčí povahy zvířat, a

   b) anti-LHRH vakcínu podávanou po předchozí vakcíně krátce před porážkou, určenou k vyvolání anti-LHRH imunoneutralizace, kterou se zruší účinek androgenních a neandrogenních steroidů, přičemž obě uvedené anti-LHRH vakcíny obsahují imunogenní LHRH peptidový aktivní základ a LHRH má vzorec pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.
2. 2. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 1,vyznačující se tím, že jako LHRH obsahuje úplný LHRH peptid shora uvedeného vzorce.

   -18CZ 289521 Β6
3. 3. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 1,vyznačující se tí m, že každá z uvedených LHRH vakcín obsahuje jako aktivní základ konjugát imunogenního nosičového proteinu a LHRH peptidů.
4. 4. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 1 nebo 3, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje LHRH peptid vybraný ze skupiny zahrnující úplný nebo modifikovaný LHRH, modifikovaný nebo nemodifikovaný peptidový fragment LHRH a LHRH agonistu.
5. 5. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 4, v y z n a č u j í c í se tím, že LHRH peptid je úplný LHRH mající uvedený vzorec.
6. 6. Anti-LHRH vakcinační soupravapodlenároku 3,4 nebo 5, vyznačující se tím, že obsahuje imunogenní nosičový protein vybraný ze skupiny zahrnující sérový albumin, thyroglobulin, ovalbumin, anatoxiny, tetanový anatoxin, koňské globuliny, lidské globuliny a alfaglobuliny.
7. 7. Anti-LHRH vakcinační souprava podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se t í m , že anti-LHRH vakcínou k podávání jako primární injekce je vakcína v emulzní formě.
8. 8. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m , že vakcínou v emulzní formě je vakcína ve formě emulze vody v oleji.
9. 9. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 7, vyznačující se tím, že vakcína v emulzní formě obsahuje směs minerálních olejů a neiontových povrchově aktivních látek.
10. 10. Anti-LHRH vakcinační souprava podle některého z nároků 1 až 9, v y z n a č u j í c í se tím, že anti-LHRH vakcínou k podávání krátce před porážkou je vakcína s vodným typem pomocné látky.
11. 11. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 10, vyzn ač u j í cí se tí m , že vodný typ pomocné látky je vybrán ze skupiny zahrnující gel hydroxidu hlinitého, saponin a jejich směsi.
12. 12. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 7, použitelná pro prasata, vyznačující se t í m , že vakcínou k podávání krátce před porážkou je vakcína s pomocnou látkou vodného typu.
13. 13. Anti-LHRH vakcinační souprava podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se t í m, že anti-LHRH vakcínou k podávání krátce před porážkou je vakcína v emulzní formě.
14. 14. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 13, vyznačující se tím, že vakcínou v emulzní formě je vakcína ve formě emulze vody v oleji.
15. 15. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 13,vyznačující se tím, že vakcína v emulzní formě obsahuje směs minerálních olejů a neiontových povrchově účinných látek.
16. 16. Anti-LHRH vakcinační souprava podle nároku 7, použitelná pro skot a ovce, vyznačující se tím, že anti-LHRH vakcínou kpodávání krátce před porážkou je vakcína v emulzní formě.

    -19CZ 289521 B6
17. 17. Anti-LHRH vakcinační souprava podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se t í m, že sestává se stejného počtu dávek obou vakcín v jediném balení.