TW201603821A - 免疫性ｌｈｒｈ組成物及其於豬隻之應用 - Google Patents

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Abstract

一種豬隻去勢疫苗組成物，其包含：一胜肽免疫原和一獸醫學上可接受之載體或佐劑，其中此胜肽免疫原包含(a)SEQ ID NO：1之LHRH胜肽，以及(b)選自由SEQ ID NO：2、3、4以及5組成之群組的至少一Th抗原表位，以及，任選地，SEQ ID NO：6之免疫刺激胜肽，其中LHRH胜肽經由其胺基端殘基共價連結到Th抗原表位或免疫刺激胜肽。本發明另提供一種利用此疫苗組成物使豬隻去勢，或抑制由豬隻性成熟所引發之特徵(包含公豬臭)的方法。

Description

免疫性LHRH組成物及其於豬隻之應用
本發明係關於一種免疫性LHRH組成物，且特別是關於一種免疫性LHRH組成物，其含有包含可功能性抑制豬隻LHRH濃度的LHRH胜肽結構，以有效地免疫去勢豬隻、消除公豬臭和促進生長。
促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)，也被稱為促黃體激素釋放激素(Luteinizing-hormone-releasing hormone，LHRH)，是一種營養性胜肽激素，負責使濾泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和黃體成長激素(luteinizing hormone，LH)由腦下垂體前葉釋放。LHRH是由下視丘內的神經元合成與釋放。
自1970年代早期已證實接種下視丘激素LHRH疫苗可作為一種用以控制繁殖的免疫方法。引發對LHRH的免疫反應可預防激素LH和FSH由腦下垂體前葉釋放，LH和FSH為性腺(雄性之睪丸與雌性之卵巢)發展和維持所需。因此，減少LH和FSH水平可導致生殖功能之喪失。
絕育(或閹割)手術是獸醫學和畜牧動物管理上最為廣泛使用的手術方法。家畜和伴侶動物之兩種性別的顯著比 例是利用常規手術絕育以防止各種伴隨性成熟之非欲求的特性。
免疫阻絕LHRH作用可導致動物不孕，因為LHRH控制睪固酮生成，睪固酮生成進而調控精子發展與雌激素生成，雌激素生成進而導致卵子成熟。此外，基於LHRH之免疫療法提供一種用於雄性與雌性伴侶動物(例如：狗、貓、馬和兔子)的節育方法，以及和緩非欲求之雄性激素-驅動的行為(例如：發情、區域性標記和攻擊)。一旦接受基於LHRH之免疫療法的免疫接種，此種過程是可逆性的，其取決於受試動物之血清抗體水平。免疫去勢(例如：利用抗體對LHRH作用之抑制)於肉用動物畜產上已有一種其他應用。因為討人厭的氣味與風味與其肉品相關，是睪固酮代謝的結果(例如：公豬臭)，故雄性的肉品無法被加工製成特級肉塊。因為視雄性食用動物的機械去勢(例如：手術)為不人道，故免疫去勢針對此方法提供一種可接受的替代方案。
多種免疫性型式的LHRH用於試驗。例如，結合LHRH胜肽至載體蛋白以增強此胜肽激素的免疫效力。然而，此些蛋白載體對大規模使用過於昂貴，且作為結果的胜肽-蛋白結合物無法有效的(1)產生長期的免疫去勢，也無法(2)於所有動物產生抗-LHRH免疫反應，此二種條件對作為去勢手術之替代方案的有效疫苗是需要的。
更進一步，以一種非免疫性10-mer胜肽之LHRH有效的免疫接種，取決於LHRH和載體蛋白間的結合位置。此外，聯結至LHRH之蛋白質作為免疫原是有問題的，因為對此免疫 原之免疫反應的主體指向的是大的載體蛋白，而非LHRH胜肽(毒素或其他載體蛋白的質量遠大於LHRH的質量，LHRH為10-mer胜肽)。此現象頻繁地造成載體蛋白所引發的表位免疫抑制。據此，為了於免疫去勢的多種應用，應該尋找一種免疫增強劑，此免疫增強劑適用於連結LHRH胜肽以產生作為疫苗製劑關鍵成份的價錢低廉的胜肽結構，此免疫增強劑能夠刺激對LHRH早期且強烈的免疫反應。同樣地，此免疫增強劑也需避免載體蛋白所引發的表位免疫抑制。因此，對免疫去勢具有一貫高效力之LHRH疫苗包括(1)於豬隻的公豬臭消除和生長曲線促進的具體應用，以及(2)用於行為矯正以易於牧場中動物管理；特別是於豬隻，業界亟需解決目前基於LHRH之免疫療法所不足之處。
本發明提供一種用於豬隻去勢的疫苗組成物，其包含胜肽免疫原和獸醫學上可接受之載體或佐劑，其中胜肽免疫原包含(a)SEQ ID NO：1的LHRH胜肽，以及(b)選自由SEQ ID NO：2、3、4、5以及6組成之群組的至少一Th抗原表位或免疫刺激性元件，其中LHRH的胜肽可藉由Gly-Gly或εNLys間隔序列(spacer sequence)經由其胺基端與Th抗原表位和/或免疫刺激性元件共價連結。間隔“εNLys”是一個出現於二胺基酸間的離胺酸殘基，用以連接(1)位於離胺酸殘基之ε-NH2基團之在先的胺基酸的羧酸端，以及(2)位於離胺酸殘基羧酸端之接著的胺基酸的胺基端。本發明中所述之“εNLys”、“εLys”和“εK”可交替使用。
在另一實施例中，本發明之胜肽免疫原包含SEQ ID NO：7、8、9或10，或其混合物，且獸醫學上可接受之佐劑選自由ISA50V2和Emulsigen D組成之群組。每劑量之胜肽免疫原的總量為超過6.25μg，優選地為50μg至200μg。
本發明之另一範疇是關於一種用以抑制豬隻因性成熟所引發之特徵的方法，包含利用本發明之疫苗組成物的有效量投予豬隻，以降低豬隻的睪固酮及其衍生物(例如：二氫睪固酮和雌激素)產量。此特徵包含，但不限於，公豬臭、性活動力、生育力以及發情行為。本發明之方法可抑制公豬臭和睪丸與副睪的生長。
在一實施例中，藉由肌肉注射投予公豬兩劑疫苗組成物，第一劑施用於早至3週齡的豬隻，作為加強免疫的第二劑則於10至16週齡注射，或投予年齡更大的豬隻，其於加強免疫後約兩週造成有效的免疫去勢、生長促進和公豬臭消除。
本發明的詳細描述於以下的實施例中，並請參照附圖。
第1A圖和第1B圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2(第1A圖)或Emulsigen D(第1B圖)中之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)製劑免疫接種後個別抗-LHRH抗體的力價。所有試驗組的豬隻(第1至4組和第8至11組)在加強免疫後兩週(即初免後十週，或10 WPI，約為18週齡)具有高的抗-LHRH抗體力價。相對之下，注射目前市售疫苗Improvac®(第7組和第14 組)豬隻的LHRH-抗體力價只於14 WPI時上升，其力價低於本發明胜肽疫苗製劑(第1至4組和第8至11組)。第5和12組豬隻接受生理食鹽水作為陰性對照組，且第6和13組豬隻以手術程序去勢作為陽性對照組。
第2A圖和第2B圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2(第2A圖)或Emulsigen D(第2B圖)之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)製劑免疫接種後豬隻相對應的睪固酮濃度，用以說明個別動物的去勢持續性。配製於ISA50V2或Emulsigen D之所有組別於10 WPI前維持低濃度的睪固酮，並維持低水平直到16 WPI(24週齡)。相較之下，第7和14組接受Improvac®疫苗的豬隻具有高濃度的血清睪固酮直到12 WPI，且低濃度的睪固酮在14 WPI時濃度開始上升，顯示Improvac®免疫去勢的效力較低。
第3A圖和第3B圖係公豬以配製於ISA50V2(第3A圖)或Emulsigen D(第3B圖)之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)製劑免疫接種後於24週齡豬隻的個別體重。經標準化的陰性對照組和手術去勢組具有顯著較低的平均體重94.9kg(陰性對照組，第5和12組)和88kg(手術去勢組，第6和13組)。相對於手術去勢組，證明本發明之疫苗(第4和11組)可增加約27.9%的體重，具有顯著的好處。
第4A圖和第4B圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2(第4A圖)或Emulsigen D(第4B圖)中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後個別抗-LHRH抗體的力價。所有試驗組豬隻在加強免疫後兩週在10 WPI(即18週齡)具有高的抗-LHRH抗 體力價。不論是配製於ISA50V2或Emulsigen D組別的豬隻，此抗體力價可維持於接近3.0(Log10)直到16 WPI(即24週齡)，此相當於上市販售之時。
第5A圖和第5B圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2(第5A圖)或Emulsigen D(第5B圖)中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後的個別睪固酮濃度。在配製於ISA50V2之第1至4組和配製於Emulsigen D之第8至11組豬隻的血清睪固酮濃度相反地對應至LHRH-抗體的血清力價，即較高的抗-LHRH抗體力價具有較低的血清睪固酮濃度，去勢血清睪固酮濃度於加強免疫後兩週(即10 WPI或18週齡)達到1.87nmol/L之邊界值。除了第1組，配製於佐劑ISA50V2或Emulsigen D中所有組別豬隻均維持低濃度的血清睪固酮濃度直到16 WPI(24週齡)。
第6A圖和第6B圖係以配製於佐劑ISA50V2(第6A圖)或Emulsigen D(第6B圖)中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種公豬後豬隻的個別體重。陰性對照組(即未接種疫苗組(第5和11組))和手術去勢組(第6和12組)於24週齡時分別具有顯著較低的平均體重94.9kg和88kg。相對於手術去勢組的豬隻，本發明之疫苗製劑(第4和10組)可增加約20.3%的體重，具有顯著的好處。
第7圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2或Emulsigen D中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後抗-LHRH抗體力價的持續性。加強免疫後兩週(即10 WPI)，第1至4組抗-LHRH抗體力價達到超過3.0(Log10)，且此高力價持續至20 WPI。第2和3組的動物甚至可維持抗-LHRH抗體力價於3.0(Log10)直到24 WPI(即32週齡)。相較之下，陰性對照組(第5組)和手術去勢組(第6組)總是保持低的抗-LHRH抗體力價。
第8圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2或Emulsigen D中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後豬隻個別睪固酮濃度的去勢持續性。第1至4組所有豬隻在加強免疫後兩週(即10 WPI)具有低濃度的血清睪固酮，且證實可藉由抗-LHRH抗體之抑制達到去勢程度。第1至4組豬隻的睪固酮水平維持如去勢對照組(第6組)一樣低至20 WPI(即28週齡)。
第9圖係豬隻以配製於佐劑ISA50V2或Emulsigen D中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後於24 WPI時的睪丸重量。於第1至4組，豬隻的睪丸萎縮至無功能的尺寸。
第10圖係豬隻以配製於佐劑ISA50V2或Emulsigen D中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後於24 WPI時的副睪重量。於第1至4組，副睪的重量顯著地下降。
第11圖係豬隻以配製於佐劑ISA50V2或Emulsigen D中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後的體重。於第1至4組中的動物具有較陰性對照組和手術去勢組(第5和6組)更佳的體重增加表現。
第12圖係豬隻以配製於佐劑ISA50V2或Emulsigen D中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後對雄甾烯酮濃度的影響。於第1至4組中，脂肪中的雄甾烯酮濃度控制在0.5μg/g脂肪以下。於第3組，雄甾烯酮的平均值甚至控制在 0.1384μg/g脂肪。
第13圖係豬隻以配製於佐劑ISA50V2或Emulsigen D之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後對糞臭素濃度的影響。於第1至3組中，糞臭素濃度控制在低於0.1μg/g脂肪。以第3組的糞臭素平均值最低(為0.0514μg/g脂肪)。
第14圖係公豬臭因子分佈圖。第1組與第2組的表現相似，7/8樣品分布於低度風險區域，一個樣品位於中度/高度風險區域。第3組具有較佳的表現直到24 WPI，其中所有樣品分佈於低度風險區域。手術去勢組(第6組)總是保持公豬臭因子的最低濃度。生理食鹽水對照組(第5組)只有2/8位於低度風險區域，2/8位於中度風險區域，且4/8位於高度風險區域。
第15圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑利用不同初免和加強免疫時程表免疫接種後的抗-LHRH抗體力價，用以評估免疫去勢時程表的適應性。第1組豬隻證實了高度免疫原性，於22週齡時達到3.556(log10)的LHRH抗體平均力價，且於26週齡時維持於3.235(log10)。第2組達到其最高抗體力價，於18週齡時為3.526(log10)之平均力價，且於26週齡時維持於2.869(log10)。第3組於24週齡達到其最高平均抗體力價3.219(log10)，且於26週齡維持於2.682(log10)。
第16圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑利用不同初免和加強免疫時程表免疫接種後的血清睪固酮濃度，用以評估免疫去勢時程表的適應性。第1組的豬隻於20週齡(即加強免疫後兩週)時展現免疫去勢效 果(睪固酮濃度≦1.87nmol/L)，且此效果持續至少六週直到26週齡。第2組的豬隻睪固酮濃度在加強免疫後的2至6週期間(即由22週齡至26週齡)顯著地低於1.87nmol/L，且保持低水平(睪固酮濃度≦1.644nmol/L)直到26週齡。加強免疫後兩週，第3組的平均睪固酮濃度為4.535nmol/L。
第17A圖、第17B圖、第17C圖和第17D圖係豬隻以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)製劑免疫接種後睪丸和副睪的重量。睪丸的重量於10 WPI(第17A圖)、12 WPI(第17B圖)、14 WPI(第17C圖)和16 WPI(第17D圖)測量。睪丸和副睪隨著時間逐漸萎縮，且副睪於10 WPI時以及睪丸於12 WPI時重量顯著地減少(p<0.001)。
第18A圖、第18B圖、第18C圖和第18D圖係以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)製劑免疫接種後的公豬臭因子(雄甾烯酮和糞臭素)量。雄甾烯酮和糞臭素量於10 WPI(分別為第18A圖和第18C圖)和12 WPI(分別為第18B圖和第18D圖)評估。免疫接種後，睪固酮濃度抑制到去勢程度(即低於1.87nmol/L)，造成脂肪中的雄甾烯酮減少。
第19A圖和第19B圖係透過比較未接受處理之陰性對照組(第19A圖)與以LHRH胜肽疫苗製劑接種公豬(第19B圖)之脂肪中雄甾烯酮和糞臭素濃度進行風險評估。所有接種的組別從10 WPI至16 WPI皆處於敏化評估中的低度風險區域(低雄甾烯酮(<0.5μg/g脂肪)和低糞臭素濃度(<0.22μg/g脂肪))。
第20圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後對抗-LHRH抗體力價之持續性的影響。第1組的抗體力價從3.636±0.577(Log10)(最高點)減少到2.418±0.742(Log10)(實驗結束時)。第2組的抗體力價從3.868±0.221(Log10)減少到2.806±0.213(Log10)(實驗結束時)。
第21圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後的睪固酮濃度。於本試驗起始階段所有組別的睪固酮濃度為2.943±2.854(平均值±標準差)nmol/L。疫苗效力評估之時間點設為加強免疫後2週，其顯示最低睪固酮濃度。第1至4組豬隻於加強免疫後2週的平均睪固酮濃度分別為1.265±0.353、1.329±0.636、1.904±2.297以及1.222±0.445(平均值±標準差)nmol/L。
第22A圖和第22B圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後的睪丸長度(第22A圖)和體積(第22B圖)。第1至4組的豬隻於成對睪丸和成對副睪的重量與睪丸的長度並無差異。依據各組別以箭號指出加強免疫之時間點。
第23A圖、第23B圖和第23C圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後於屍體剖檢時豬隻的成對睪丸(第23A圖)和成對副睪(第23B圖)的重量，以及睪丸的長度(第23C圖)。
第24圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後於24週齡的雄甾烯酮和糞臭素濃 度。在公豬臭因子分佈圖中，除了第1組中的一隻豬以外，第1至4組中所有豬隻的危險因子均位於低度/中度危險。
第25圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後的抗-LHRH抗體力價。第1、2和3組於第0和3週齡之抗-LHRH抗體力價分別位在背景值1.718±0.297、1.765±0.340和1.770±0.283(Log10)附近。在16週齡加強免疫後，於18週齡時，第4組的抗-LHRH抗體力價為3.249±0.346，第5組為2.893±0.786。
第26圖係豬隻以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH1(SEQ ID NO：10)製劑免疫接種後的血清睪固酮濃度。第1和2組的豬隻血清睪固酮濃度分別為2.154±0.921nmol/L於10週齡，以及2.183±1.231nmol/L於6週齡。第3組豬隻於12週齡時有最低睪固酮濃度3.065±0.205nmol/L。第4和5組於20週齡之血清睪固酮濃度分別地被抑制至0.586±0.184和0.893±1.192nmol/L的低濃度。相較之下，接受疫苗Improvac®(第6組)豬隻的血清睪固酮於20週齡保持在高濃度(約9.415±7.560nmol/L)，且之後於22週齡下降至低濃度。
第27圖係公豬以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)製劑免疫接種後的抗-LHRH抗體力價。第1和2組豬隻的抗-LHRH抗體力價顯著地高於第3組(未去勢未接種疫苗(公豬))和第4組(手術去勢(閹豬))。
第28圖係第1和2組的公豬以不同劑量之配製於佐劑ISA50V2之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)製劑免疫接種後的完全(100%)免疫去勢。
第29圖係顯示在與手術去勢組相比時，對於以配製於佐劑ISA50V2中之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)製劑免疫接種的公豬而言，因平均日採食量(ADFI)的增加而有較高的平均體重。
下面的描述是用以實現本發明的最佳的預期模式。此描述之目的是說明本發明的一般原理，且不應被理解成具有限定意義。本發明的範圍藉由參照所附之專利申請範圍而被最適地裁定。
本發明提供包含LHRH之胜肽，LHRH為經由其胺基端連結至共同刺激或輔助T細胞抗原表位(Th抗原表位)的10-mer胜肽。
本發明之名詞“LHRH”是指促黃體激素釋放激素(GenBank：AAB34379.1)，其為營養性胜肽激素，負責使FSH和LH由腦下垂體前葉釋放。用於此揭露內容中的名詞LHRH包含衍生自不同門(包含鳥類、魚類、爬行動物和無脊椎動物)的LHRH同系物。此LHRH胜肽優選地包含如表1所示之SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
本發明之名詞“疫苗(vaccine)”為一般的臨床術語，用以描述可導致暴露於此疫苗之受試者產生抗體之免疫刺激性組成物。從臨床角度看，接受疫苗組成物之受試者將對存在於此疫苗中之抗原產生抗體。本申請案所敘述之疫苗組成物不限於用以改善對特定疾病或病原體之免疫力的生物製劑。
本發明之名詞“輔助T細胞抗原表位(Th抗原表位)” 指衍生自外源病原體的Th抗原表位，包含但不限於，例如：B型肝炎表面和核心抗原(HBsAg和HBc)輔助T細胞抗原表位、百日咳毒素輔助T細胞抗原表位(PT Th)、破傷風毒素輔助T細胞抗原表位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白質輔助T細胞抗原表位(MVF Th)、砂眼披衣菌的主要外膜蛋白質輔助T細胞抗原表位(CT Th)、白喉毒素輔助T細胞抗原表位(DT Th)、鐮狀瘧原蟲環圍種蟲輔助T細胞抗原表位(PF Th)、曼氏住血吸蟲三醣磷酸鹽異構酶輔助T細胞抗原表位(SM Th)、大腸桿菌TraT輔助T細胞抗原表位(TraT Th)。此等病原-衍生Th抗原表位作為濫交Th抗原表位的代表性例子，如美國專利號5,759,551中之SEQ ID NO：2-9和42-52併入本文作為參考。
有用的Th抗原表位可包含組合的Th抗原表位。Wang等人(WO 95/11998)描述一特別種類的組合Th抗原表位，稱為“結構性合成抗原庫(Synthetic Antigen Library，SSAL)”。此SSAL抗原表位包含眾多的Th抗原表位，以胺基酸序列圍繞一在特定位置具有取代物之不變的殘基之結構性架構而組成。SSAL之序列是藉由保留相對不變的殘基，同時改變其他殘基以提供各種不同的MHC限制元素之辨認而決定。此可藉下列達成，將濫交Th的初級胺基酸序列排成一列，選擇並保存造成Th胜肽獨特結構之殘基作為骨架，以及根據已知的MHC限制元素改變剩餘的殘基。已有不變位置及具MHC限制元素之較佳胺基酸的可變位置之清單，可用於得到MHC-結合特色(MHC-binding motifs)。此等可作為設計SSAL Th抗原表位時的參考((Meister等人，Vaccine，1995；13：581-591)。在一實施例 中，Th抗原表位包含如表1所示之SEQ ID NO：2、3、4及/或5。
SEQ ID NO：6是指衍生自致病的耶爾辛森氏屬(Yersinia spp.)細菌之侵染素蛋白質的胜肽片段，其為微生物外膜蛋白質，以調停細菌進入哺乳動物細胞。已證實細菌侵入培養的哺乳動物細胞時需要耶爾辛森氏菌之侵染素分子和多種出現於培養的細胞上之β1家族整聯蛋白質之間的交互作用。因為T淋巴球具有豐富的β1整聯蛋白質(特別是活化的免疫或記憶T細胞)，且證明T細胞協同刺激的特性與侵染素結構區域有關，其可連結至包含LHRH結構之濫交Th抗原表位，以進一步增強所設計之胜肽免疫原的免疫原性(美國專利號6,025,468)。
本發明之胜肽包含至少一LHRH、Th抗原表位，以及任選地共同刺激的侵染素胜肽結構區域。LHRH胜肽(包含其同系物)可經由其胺基端胺基酸與間隔共價連結到包含至少一已知含有Th抗原表位的序列。Th抗原表位可經由其胺基端共價連結至共同刺激的侵染素胜肽結構區域。間隔包含，但不限於，Gly-Gly、Lys、εNLys、εNLys-(Lys)n(此處n=1至3)，或Lys-Lys-Lys-εNLys(SEQ ID NO：11)等。
本發明之胜肽具有約20個至約100個胺基酸殘基，較佳介於約20個至約70個胺基酸殘基，以及更佳介於約25個至約50個胺基酸殘基。在另一較佳實施例中，胜肽具有約27個至約45個胺基酸殘基。
Th抗原表位的數量包含，但不限於，一、二、三、四或更多個如本發明表1所示的Th胜肽。本發明之胜肽包含至少一選自SEQ ID NO：2、3、4、5之Th抗原表位的胜肽，其可 任選地連結至SEQ ID NO：1之LHRH胜肽的胺基端。在一實施例中，Th抗原表位可連結至LHRH的胺基端以形成本發明之胜肽。例如，SEQ ID NO：2和3的胜肽可藉由間隔(Gly-Gly、Lys或εNLys)連續地連結至LHRH的胺基端。如果有必要，此領域之習知技藝者可改變Th抗原表位數目和用以連結至LHRH胜肽免疫原的間隔種類，以提供本發明之最理想胜肽。
在另一實施例中，本發明之胜肽包含如表2所示之SEQ ID NO：7、8、9和/或10，或與其具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少99%相似性者。
本發明之胜肽可以一般習知技藝者所熟知的化學合成方法製造；參見，例如，合成胜肽中的A User's Guide(Grant編輯，W.H.Freeman & Co.出版，New York,N.Y.,1992，第382頁)。因此，可利用叔丁氧基羰基(t-butyloxycarbonyl,t-Boc)或9-芴甲氧羰基(9-fluorenyl-methyloxycarbonyl,F-moc)化學法之自動化固相合成技術在應用生物系統自動化胜肽合成儀(430A或431型)上合成胜肽。為合成聚離胺酸核心部分，未保護的Di(t-Boc)或Di(F-moc)-Nα，Nε)離胺酸殘基可用以代替具有保護的ε-胺基的t-Boc或F-moc。為改進所設計之胜肽的溶解度，可在胜肽的胺基端增加額外的絲胺酸或/和離胺酸殘基加以延長。在組合完成所欲之胜肽後，依照標準程序處理樹脂，將胜肽由樹脂上切下，並去除位於胺基酸側鏈上的保護基團。以高效能液相層析純化游離的胜肽，並確認其生化特性。另外，較長的線性胜肽可利用習知的重組DNA技術合成。任何 DNA技術之標準手冊可提供詳細方法以製造本發明之胜肽。
當本發明之胜肽作為疫苗製劑的關鍵成份時，可於接受免疫接種之動物產生免疫去勢，其包含與性成熟有關之物理及/或化學特性(例如：性行為、戰鬥、徘徊、攻擊性行為、非欲求之感官特性、生殖器官腫瘤以及懷孕、動情週期、生育力)的喪失。因此，抑制的特性包含抑制性行為(例如，避免雄性牛隻駕乘其他雄性牛隻)、避免或延遲排卵、使睪丸和副睪萎縮、降低睪固酮濃度、減少攻擊行為或減少非欲求之感官特性(例如公豬臭)。
為了方便且有效地投予本發明之胜肽的有效量和適合的藥學上可接受之載體，以在此揭露之單位劑量型式配製本發明胜肽。單位劑量可為，例如，通常含有介於0.5μg至約2000μg之主要胜肽抗原量，較佳為超過6.25μg，最佳為25μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg或200μg。在含有補充活性成分之組成物的情況下，此劑量是透過參考所述成分之給藥的常用劑量和方式來決定。
本發明亦提供包含用於胜肽免疫原投予之藥學上可接受之傳輸系統的組成物。此組成物包含至少一種本發明胜肽之免疫學上的有效量。在本發明組成物(疫苗)中，本發明胜肽的數量包含，但不限於，一、二、三、四或更多。例如，本發明之組成物包含SEQ ID NO：7、8、9、10或其混合物。在一實施例中，本發明之組成物包含SEQ ID NO：7、8、9或10之單一胜肽。在其他實施例中，本發明之組成物包含SEQ ID NO：7、8和9(在以下範例稱為LHRH3)。在其他實施例中，本 發明之組成物包含SEQ ID NO：10(在以下範例稱為LHRH1)。當如此配製時，包含作為目標抗原性位點之LHRH或其同系物之本發明組成物，可用於預防/消除公豬臭、促進生長、豬隻免疫去勢，以及用於雄性和雌性的避孕。
本發明之胜肽免疫原可利用佐劑、乳化劑、醫藥上可接受的載劑或其他例行提供於疫苗組成物之成分，配製作為免疫性組成物。
可用於本發明之佐劑或乳化劑包括明礬、不完全弗羅恩特氏佐劑(IFA)、liposyn、皂角苷、鯊烯、L121、Emulsigen、單磷醯基脂質A(MPL)、QS21，和ISA 720、ISA 50、ISA 50V2、ISA 35或ISA 206，以及其他有效的佐劑和乳化劑。此類調配物可由此領域中一般熟知技藝者輕易決定，且也可包含可立即釋放及/或可持續釋放的調配物。此疫苗可藉由任何合宜的途徑施用，包含皮下、口服、肌肉、腹腔或其他非經腸途徑或腸胃途徑。相似地，免疫原可以單一劑量或多劑量施用。一般熟知技藝者可輕易地決定免疫接種的時程表。
在特定實施例中，傳輸系統和佐劑為MontanideTM ISA 50V2(一種包含植物油和二縮甘露醇油酸(mannide oleate)的油質疫苗佐劑組成物以製造油包水(即w/o)乳化液)、Tween® 80(也稱為聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨醇酐單油酸酯)、CpG寡核苷酸和/或其任意組合。在其他實施例，此藥物組成物為具有Emulsigen或Emulsigen D作為佐劑之水包油包水(即w/o/w)乳化液。亦提供其他例行合併於疫苗製劑的成分，以及劑量用法說明書，以產生良好的B和T細胞免疫反應。
適合注射用之藥物劑型包括無菌水溶液(水溶性)或分散體和無菌粉末，以當場配製無菌注射液或分散體。其於製造和儲存狀況下必須穩定，且必須可對抗微生物(例如細菌或真菌)汙染而加以保存。載體可為溶劑或分散介質，包含，例如：水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油。藉由例如塗層(例如卵磷脂)、藉由在懸浮狀況下維持所需粒徑，以及藉由使用界面活性劑，以維持適當的流動性。可藉由各種抗細菌和抗真菌劑(例如：對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等)預防微生物作用。在許多情況下，以含有等滲劑(例如：糖或氯化鈉)為較佳。可使用延遲吸收試劑(例如：單硬脂酸鋁或/和明膠)來延長注射用之組成物的吸收或延遲釋放。
本發明也提供藉由對哺乳動物投予目標胜肽組成物一段時間，以引發抗-LHRH抗體力價、降低睪固酮濃度、避免公豬臭、使睪丸和副睪萎縮、豬隻免疫去勢，以及避孕的方法。
普遍來說，本發明之方法可於豬隻引發抗-LHRH抗體力價，且抗-LHRH抗體力價於一或兩次疫苗接種後超過2.0，較佳為2.5或3.0(Log10)。本發明之方法也可抑制豬隻睪固酮濃度，睪固酮濃度於一或兩次疫苗接種後不超過2.5nmol/L，較佳為2.0、1.87或1.0nmol/L。再者，本發明之方法可增加豬隻體重，較佳為增加10%或更多。
本發明之組成物可以此領域已知的任何適當方法投予，包含，但不限於，口服或注射，以肌肉注射為優選。
本發明之組成物包含一或多個本發明胜肽免疫原的有效量，以及藥學上可接受之載體。適當劑型單位之組成物通常包含每公斤體重約0.5μg至約1mg的胜肽免疫原。當以多劑量投予，其可以方便地劃分為每劑量的適當量。劑量可例如為6.25μg至200μg，較佳為50μg，可透過注射給藥，較佳為肌肉注射。此後可重複(加強)劑量。劑量取決於受試者的年齡、體重，以及此疫苗和治療領域所熟知的一般健康狀況。
本發明更提供抑制豬隻由性成熟所引發之特徵的方法，包含投予本發明之疫苗組成物的有效量。
在本發明方法中，劑量投予次數與時機並無特別限制。普遍來說，本發明之方法包含至少一劑量，較佳為二、三、四、五劑量或更多，更佳為二劑量或更多。此領域之技術者可輕易知道增加劑量投予次數以引發功效。第一劑可投予任何時期的豬隻(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週齡)。疫苗接種時間點可依豬隻種類、劑量、佐劑和投予方式而改變或修改。
普遍來說，是於3週齡後進行初次免疫(第一劑)，以於3至8週齡為較佳。於初次免疫後3至13週間進行加強免疫(第二劑)為較佳。接種時程表於初免和加強免疫間有3至13週。
在一實施例中，較佳的疫苗接種時程表可依據以下事項：於約8週齡進行初次免疫，於約16週齡進行加強免疫，在某些狀況下於加強免疫後6至8週屠宰豬隻。
本發明之初免/加強免疫疫苗接種時程表適用於豬隻。其取決於不同國家的生產方法，在許多狀況下，豬隻並不 會生長到21週齡。
本發明之特定實施例包含，但不限於，以下事項：
(1)用於去勢豬隻之疫苗組成物，包含胜肽免疫原以及獸醫學上可接受之輸送載體或佐劑，其中胜肽免疫原包含(a)SEQ ID NO：1的LHRH胜肽，以及(b)選自由SEQ ID NO：2、3、4以及5組成之群組的至少一Th抗原表位，以及，任選地，SEQ ID NO：6之免疫刺激胜肽，其中LHRH胜肽經由其胺基端殘基共價連結至Th抗原表位。
(2)依據(1)之疫苗組成物，其中LHRH胜肽、Th抗原表位，以及，任選地，免疫刺激胜肽，是利用Gly-Gly、εNLys、Lys-εNLys、Lys-Lys-εNLys、Lys-Lys-Lys-εNLys(SEQ ID NO：1l)、εNLys-Lys-Lys或εNLys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：12)加以連接。
(3)依據(1)之疫苗組成物，其中胜肽免疫原包含SEQ ID NO：7、8、9和/或10，或其混合物。
(4)依據(1)之疫苗組成物，其中獸醫學上可接受之佐劑包含ISA50、ISA50V2或Emulsigen D。
(5)依據(1)之疫苗組成物，其中每一劑量之胜肽免疫原之總量為約12.5μg至200μg。
(6)用以抑制豬隻由性成熟所引發之特性的方法，包含投予專利申請範圍第1項之疫苗組成物的有效量給豬隻。
(7)依據(6)之方法，其中特性包含公豬臭、性活動力、性行為、生育力以及發情行為。
(8)依據(6)之方法，其中疫苗組成物是以肌肉或皮下注射投予。
(9)依據(6)之方法，其中疫苗組成物之第一劑是施用於3週齡至8週齡之豬隻。
(10)依據(6)之方法，其中疫苗組成物之第二劑是施用於6週齡至16週齡之豬隻。
本發明之額外的特定實施例包含，但不限於，以下事項：
(1)獸醫學組成物包含：胜肽免疫原，選自以下所組成的群組(i)SEQ ID NO：7、8以及9的混合物，(ii)SEQ ID NO：10，以及(iii)(i)和(ii)之結合；以及獸醫學上可接受之輸送載體或佐劑。
(2)依據(1)之獸醫學組成物，其中(a)中的胜肽免疫原為(i)SEQ ID NO：7、8和9之混合物。
(3)依據(2)之組成物，其中獸醫學上可接受之佐劑包含ISA50、ISA50V2或Emulsigen D。
(4)依據(2)之組成物，其中每一劑量之胜肽免疫原的總量為約12.5μg至200μg。
(5)用以抑制豬隻由性成熟所引發之特性的方法，包含投予(2)之組成物的有效量給豬隻。
(6)依據(5)之方法，其中特性包含公豬臭、性活動力、性行為、生育力以及發情行為。
(7)依據(5)之方法，其中組成物是以肌肉或皮下注射投予。
(8)依據(5)之方法，其中組成物之第一劑是施用於3週齡至8週齡之豬隻。
(9)依據(5)之方法，其中組成物之第二劑是施用於6週齡至16週齡之豬隻。
(10)用以減少動物睪固酮及其衍生物產量的方法，包含投予(2)之組成物的有效量給動物。
(11)依據(1)之獸醫學組成物，其中(a)中的胜肽免疫原為(ii)SEQ ID NO：10。
(12)依據(11)之組成物，其中獸醫學上可接受之佐劑包含ISA50、ISA50V2或Emulsigen D。
(13)依據(11)之組成物，其中每一劑量之胜肽免疫原的總量為約12.5μg至200μg。
(14)用以抑制豬隻由性成熟所引發之特性的方法，包含投予(11)之組成物的有效量給豬隻。
(15)依據(14)之方法，其中特性包含公豬臭、性活動力、性行為、生育力以及發情行為。
(16)依據(14)之方法，其中組成物是以肌肉或皮下注射投予。
(17)依據(14)之方法，其中組成物之第一劑是施用於3週齡至8週齡之豬隻。
(18)依據(14)之方法，其中組成物之第二劑是施用於6週齡至16週齡之豬隻。
(19)用以減少動物睪固酮及其衍生物產量的方法，包含投 予(11)之組成物的有效量給動物。
【實施例】
實施例1
LHRH胜肽的合成
關於有效的LHRH疫苗設計和製劑的開發工作中的LHRH相關胜肽結構的合成方法於下文描述。此胜肽可於小規模合成以進行實驗室試驗和現場研究，以及大規模(公斤)量產以進行工/商業的疫苗製劑生產和血清學測定。
設計LHRH相關抗原性胜肽的大型體系(長度介於約10至40個胺基酸)，以篩選和選擇供有效LHRH疫苗使用的最優化胜肽結構。每一個結構含有合成地連接至特定Th抗原表位或免疫刺激胜肽(記載於表1，SEQ ID NO：2至6)的LHRH胜肽(SEQ ID NO：1)。用於本發明LHRH疫苗的LHRH胜肽為SEQ ID NO：7至10。
用於偵測及/或測定抗-LHRH抗體之免疫原性的研究或相關血清學試驗的所有胜肽是使用應用生物系統自動胜肽合成儀(型號430A、431及/或433型)，以Fmoc化學法小規模合成。藉由於固相支持物上獨立合成以製造每一個胜肽，其於胺基端和側鏈具有Fmoc保護，用以保護三官能團胺基酸的基團。由固相支持物上切下完整的胜肽，且藉由90%三氟乙酸(TFA)移除側鏈保護基團。利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀評估合成胜肽製備以確認其正確胺基酸型式。另外也藉由逆相高效能液相層析(RP-HPLC)評估每一個合成胜肽以確認其合成概況和製品濃度。
儘管嚴格控制合成過程(包括階段性監測耦合效率)，但在延長循環期間之意外的事件(包括胺基酸插入、刪除、置換，和提前終止)也製造了胜肽相似物。因此，合成的製劑通常包含多種胜肽相似物和目標胜肽。即使包含這些非預期的胜肽相似物，得到的合成胜肽製劑仍然適合免疫學應用(包括免疫診斷(作為抗體捕獲抗原)和疫苗接種(作為胜肽免疫原)的使用)。一般來說，這樣的胜肽相似物，無論是有意設計，或是於合成過程所生成作為副產物的混合物，經常如所欲胜肽之純化製劑般有效，只要利用具鑑別力之品質管理程序監控製程和產品評估過程，以保證採用這些胜肽之最終產品的再現性和效力。數百至千公克量的大規模胜肽合成可於商業化自動合成儀UBI 2003上，以15mmole至50mmole規模，依據相同之固態胜肽合成原理加以實行。
為了獲得田間試驗中最終疫苗製劑的活性成分，利用淺洗脫梯度以逆相高效能液相層析純化LHRH胜肽結構，以MALDI-TOF質譜儀分析特性，並以胺基酸分析和逆相高效能液相層析分析純度和一致性。
實施例2
疫苗製劑的製備
三個LHRH胜肽免疫原(LHRH3：SEQ ID NO：7、8和9)之混合物和單一胜肽免疫原(LHRH1：SEQ ID NO：10)分別配製於使用Seppic(France)之ISA佐劑的油包水(W/O)乳化液，或MVP(USA)之Emulsigen D的水包油包水(W/O/W)乳化 液。簡而言之，以等莫爾比率混合在生理食鹽水中的胜肽(20%重量/體積氯化鈉溶液)，經無菌過濾(以0.22 micron之過濾器)，並以均質方式與ISA50V2或Emulsigen D佐劑混合。全程監測製備過程中的黏度。以鑑別測試(identity test)、物理測試和無菌試驗分析最終產物之特性。在無塵室中進行所有配製、充填和包裝程序以維持無菌狀態。
實施例3
利用不同劑量之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)疫苗製劑免疫接種公豬
本實施例總共使用40隻8週齡的公豬和8隻手術去勢公豬。如表3和表4所示，這些豬隻以每組8隻分組，LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)以油質基底佐劑(MontanideTM ISA50V或ISA50V2)配製以形成油包水(W/O)乳化液(如表3第1至4組所示)，或以油質基底佐劑Emulsigen D配製形成水包油包水(W/O/W)乳化液(如表4第8至11組所示)，以加強疫苗產品之免疫原性。三個對照組包含接受生理食鹽水的陰性對照組(第5和12組)、接受手術去勢的陽性對照組(第6和13組)，以及接受最先進市售LHRH疫苗Improvac®的功效對照組(第7和14組)。
血液樣品於初免後(或免疫接種後週數(WPI))0、4、8、10、12、14，和16週收集，分別測量豬隻抗-LHRH抗體的血清力價和睪固酮的血清濃度。
a.利用酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析血清抗 -LHRH抗體力價
開發用於評估抗-LHRH抗體血清力價的酵素連結免疫吸附分析法如以下所述。
除非特別說明，96-孔平底微盤的各孔洞分別以100μl的各目標胜肽於37℃下塗覆1小時(以各2μg/ml或等莫爾混合物，於10mM的碳酸氫鈉緩衝液(pH 9.5)中)。
塗覆胜肽的孔洞以250μl含3%(重量)之明膠的PBS於37℃下培育1小時，以阻斷非特異性蛋白結合位點，隨後以含有0.05%(體積)Tween® 20的PBS洗滌三次並乾燥。將100μl稀釋的血清樣品加入到每個孔洞中，並於37℃下反應60分鐘。隨後以含有0.05%(體積)之Tween® 20的PBS洗滌孔洞六次以移除未結合之抗體。加入100μl預先滴定為最佳稀釋濃度之以過氧化酶標示的山羊-抗-豬IgG抗體(置於含有1%(體積)之正常山羊血清與0.05%(體積)之Tween® 20的PBS中)於每個孔洞中，並在37℃下再培育30分鐘。這些孔洞以含有0.05%(體積)之Tween® 20的PBS洗滌六次以移除未結合之抗體，並以100μl受質混合物(含0.04%(重量)之3’,3’,5’,5’-四甲基聯苯胺(TMB)和0.12%(體積)過氧化氫於檸檬酸鈉緩衝液中)反應15分鐘。此受質混合物藉由形成有色的產物以檢測過氧化酶標示。加入100μl之1.0M硫酸停止反應並測定於450nm之吸光值(A450)。
根據測定LHRH抗體血清力價的目的實行血清稀釋。為測定接受LHRH胜肽疫苗製劑豬隻的抗體力價，將血清10倍連續稀釋(介於1：10至1：10,000)後，進行酵素連結免疫吸附分析，且所測定的血清力價以Log10表示，其由A450的線性回歸 分析計算而來。
依據第1A圖和第1B圖，除了陰性(第5和12組)和手術去勢(第6和13組)組，包含SEQ ID NO：7、8以及9的試驗組證明在加強免疫後兩週於10 WPI(18週齡)具有高力價的LHRH抗體。接受疫苗接種組別(不僅是配製於ISA50V2之組別(第1至4組)，也包括配製於Emulsigen D之組別(第8至11組))的抗體力價維持於接近或高於3.0(Log10)直到16 WPI(24週齡)(市場販售豬隻的時間)。相對來說，接受Improvac®豬隻(第7組)的抗體力價只於14 WPI(加強免疫後兩週)時上升，其抗體力價低於本發明之胜肽疫苗(第1至4組和第8至11組)。
b.血清睪固酮濃度之評估
藉由市售酵素連結免疫吸附分析法或放射免疫分析檢測血清睪固酮(TT)濃度。此試劑包括DRG®睪固酮酵素連結免疫吸附分析法試劑(型號：EIA-5179)、BioVendor酵素連結免疫吸附分析法試劑，以及Seamans的放射免疫分析試劑。配製於ISA50V2或Emulsigen D之第1至4組和第8至11組的血清中睪固酮濃度於特定實施例中分別地利用DRG®睪固酮酵素連結免疫吸附分析法試劑加以測定，其與豬隻相對應的血清抗體力價呈逆相關，豬隻於加強免疫後兩週(即10 WPI或18週齡)具有低於去勢邊界值的濃度(去勢邊界值一般為1.87nmol/L，或更嚴格的標準為1.0nmol/L)。在配製於ISA50V2或Emulsigen D之所有其他組別的豬隻則維持睪固酮的去勢程度，如第2A圖和第2B圖所示，直到16 WPI(即24週齡)，市場上豬隻出售的時期。結果顯示本發明的LHRH3疫苗製劑對睪固酮具有劑量依賴 性抑制，且第4和11組提供相對其他組別更高的抑制程度。
與接受疫苗製劑的豬隻相比，陰性和去勢對照組的豬隻總是維持低抗-LHRH抗體力價的背景值水平，於作為未去勢動物之陰性對照組(第5和12組)具血清睪固酮濃度波動。對手術去勢陽性對照組的豬隻(第6和13組)而言，血清睪固酮濃度均保持於低去勢程度。
接受LHRH疫苗Improvac®的豬隻直到12 WPI仍維持高濃度的血清睪固酮，此時給予加強免疫，血清睪固酮濃度於14 WPI(即加強免疫後兩週)後下降。結果清楚地顯示，Improvac®對豬隻去勢而言並不如本發明之疫苗製劑(第1至4組和第8至11組，包含配製於ISA50V2或Emulsigen D的SEQ ID NO：7、8和9胜肽)般具有效力。
c.體重
依據第3A圖和第3B圖，全程監測從免疫接種前(3週齡)至本試驗結束(16 WPI，24週齡)的豬隻體重。結果顯示疫苗接種對動物體重之影響。陰性對照組(接受生理鹽水)和陽性對照組(接受手術去勢)的豬隻於24週齡都具有顯著較低的平均體重，分別為94.9kg(陰性對照組，第5和12組)和88.8kg(手術去勢對照組，第6和13組)。相較於接受手術去勢的豬隻(第6和13組)，接受200μg/ml/劑量之本發明疫苗製劑的豬隻(第4和11組)具有顯著較高的經濟效益，其於體重增加約27.9%。
實施例4
利用不同劑量LHRH1(SEQ ID NO：10)疫苗製劑 免疫接種公豬
在本實施例中，使用與實施例3類似的試驗方法，除了將疫苗製劑中的胜肽免疫原改成SEQ ID NO：10，並根據表5和表6調整劑量。免疫接種後，於多個時間點收集來自所有動物的血清以測定LHRH抗體力價和血清睪固酮的相對應濃度。此外，在犧牲時，也收集於24週齡豬隻的性器官(睪丸和副睪)分析重量。
a.利用酵素連結免疫吸附分析法分析血清抗-LHRH抗體力價
依據第4A圖和第4B圖，除了陰性(生理食鹽水)和陽性(手術去勢)對照組，包含SEQ ID NO：10之胜肽免疫原的所有試驗組於加強免疫後二週的10 WPI(18週齡)具有高力價的抗-LHRH抗體。不僅配製於佐劑ISA50V2之第1至4組的豬隻，也包括配製於Emulsigen D之第7至10組的豬隻，此抗體力價維持於接近或高於3.0(Log10)直到16 WPI(24週齡)，即市場上豬隻出售的時期。
b.血清睪固酮濃度之評估
依據第5A圖和第5B圖，配製於ISA50V2之第1至4組或配製於Emulsigen D之第7至10組豬隻的血清睪固酮濃度均與相對應之抗體力價呈逆相關，且於加強免疫後兩週(即10 WPI，18週齡)均達到低於去勢邊界值(<1.87nmol/L)的水準。除了第1和7組之最低劑量，配製於ISA50V2或Emulsigen D之所有其他組別的豬隻均維持血清睪酮的去勢程度直到16 WPI(24週齡)，此為市場上豬隻出售的時期。
c.體重
依據第6A圖和第6B圖，全程監測從免疫接種前(3週齡)至本試驗結束(16 WPI，24週齡)的豬隻體重。結果顯示疫苗接種對動物體重之影響。接受生理鹽水的陰性對照組和接受手術去勢的陽性對照組豬隻於24週齡都具有顯著較低的平均體重，分別為94.9kg(陰性對照組，第5和11組)和88.8kg(手術去勢對照組，第6和12組)。相較於接受手術去勢的豬隻(第6和12組)，接受本發明疫苗製劑的豬隻(第4和10組)具有顯著較高的經濟效益，體重增加約20.3%。
實施例5
接受不同劑量LHRH1(SEQ ID NO：10)疫苗製劑豬隻的免疫持續性
在本實施例中，使用與實施例3類似的試驗方法，除了將胜肽免疫原改成SEQ ID NO：10，且根據表7調整劑量。於免疫接種後，在多個時間點收集血清以測定LHRH抗體力價和相對應的血清睪固酮濃度。此外，在豬隻於32週齡犧牲時，收集豬隻性器官(睪丸和副睪)測量重量。
此試驗的目的是延長田間試驗至24 WPI或32週齡，收集血清樣品以測定LHRH抗體力價和相對應之血清睪固酮濃度，用以評估依循標準免疫接種試驗方法(於8週齡(0 WPI)初免和於16週齡(8 WPI)加強免疫)使用本發明疫苗製劑之免疫去勢效力的持續性。
a.利用ELISA分析血清抗-LHRH抗體力價
如第7圖所示，收集來自第1至4組豬隻於加強免疫後兩週(即10 WPI)的血清樣品，並測定其抗-LHRH抗體力價。所有樣本的抗-LHRH抗體力價均超過3.0(log10)，且此力價在10週的期間，直到20 WPI(即28週齡)，仍維持於約3.0(log10)。此外，第2和3組維持抗-LHRH抗體力價於3.0(log10)直到24 WPI(即32週齡)。相反地，陰性對照組(第5組)和去勢對照組(第6組)的抗體力價總是維持在低濃度之背景值程度。
b.血清睪固酮濃度之評估
如第8圖所示，收集第1至4組豬隻於加強免疫後兩週(即10 WPI)的血清樣品，並測定血清睪固酮濃度。第1至4組豬隻的所有樣品因為高力價抗-LHRH抗體的抑制，而具有位於去勢程度的血清睪固酮濃度。直到20 WPI(即28週齡)，第1至4組之睪固酮濃度皆維持與手術去勢對照組(第6組)一樣低的程度。
c.經LHRH1疫苗製劑免疫去勢後之性器官(睪丸和副睪)萎縮
在於24 WPI(即32週齡)之擴大試驗結束時，犧牲豬隻並分析其性器官(包括睪丸和副睪)的重量，以評估免疫去勢效力。第1至4組豬隻的睪丸和副睪萎縮至無功能的尺寸，如第9圖至第10圖所示。睪丸和副睪的重量也與血清睪固酮濃度相關。
d.體重
如第11圖所示，第1至4組豬隻相較於對照組(第5和6組)於體重增加上具有較佳的表現。
e.以腹部脂肪之雄甾烯酮和糞臭素濃度衡量公豬臭之消除
在試驗期間，由試驗結束時的公豬臭因子定量證明腹部脂肪之公豬臭的有效消除可延長豬隻出售的時期至24 WPI(即32週齡)。在此試驗中，於豬隻犧牲時由腹部脂肪萃取出雄甾烯酮和糞臭素，並以高效能液相層析偵測。參照第12圖，來自第1至4組豬隻脂肪中雄甾烯酮濃度控制於0.5μg/g脂肪以下。特別於第3組，雄甾烯酮的平均值降低到0.1384μg/g脂肪。參照第13圖，第1至3組豬隻之糞臭素濃度控制在0.1μg/g脂肪以下。對第3組豬隻而言，其糞臭素的平均值為最低，為0.0514μg/g脂肪。
此外，繪製特定樣品之個別雄甾烯酮和糞臭素濃度以評估公豬臭的風險因子，如第14圖所示，將試驗所收集之所有樣品分成如低度、中度/低度、中度/高度和高度四個區域。依照第14圖，手術去勢組(第6組)總是維持最低濃度的公豬臭因子。來自第3組豬隻的樣品具有出色表現，其所有樣品均分佈於低度風險區域直到24 WPI。來自第2組豬隻的樣品具有良好的表現直到24 WPI，此時7/8的樣品分佈於低度風險區域，以及一個樣品位於高度風險區域。來自第1組與第2組的樣品具有相似表現，其中7/8的樣品分佈於低度風險區域，且一個樣品出現於中度/高度風險區域。相反地，生理食鹽水對照組只有2/8樣品位於低度風險區域，2/8位於中度風險區域，且4/8位於高度風險區域(第14圖)。本發明之LHRH1疫苗製劑證實其公豬臭消除效力可持續到24 WPI(即32週齡)。本試驗結果明確指 出，接受不同劑量之本發明LHRH1疫苗製劑的豬隻可有效地抑制雄甾烯酮和糞臭素的產生，以消除相對應肉製品的公豬臭。
實施例6
以LHRH1疫苗製劑於不同時間間隔實行初免與加強免疫之免疫接種時程表對免疫去勢的影響
在本實施例中，使用與實施例3類似的試驗方法，除了使用於疫苗製劑的胜肽免疫原改成SEQ ID NO：10和使用佐劑ISA50V2外，根據表8修改初免與加強免疫接種的時間點。收集不同時間點的血清以測定抗-LHRH抗體力價與睪固酮的血清濃度。
如第15圖所示，第1組豬隻證實了高度免疫原性，於22週齡豬隻測得為3.556(log10)的抗LHRH平均抗體力價，且此力價維持於3.235(log10)直到26週齡。對第2組豬隻而言，最高抗體力價為於18週齡的3.526(log10)，且於26週齡時維持在2.869(log10)。對第3組豬隻而言，因為在22週齡之晚期加強免疫接種時程表，最高抗體力價為於24週齡(即加強免疫後兩週)的3.219(log10)，且力價維持於2.682(log10)直到26週齡。
此外，如第16圖所示，第1組的豬隻在20週齡(即加強免疫後兩週)時顯現免疫去勢效應(睪固酮濃度≦1.0nmol/L)，免疫去勢效應持續至少6週至26週齡。第2組豬隻也顯現高度免疫去勢效力。第2組豬隻的睪固酮濃度於加強免疫後2至6週(即於22週齡)期間為低於1.0nmol/L，且維持相對低濃度(睪固酮濃度≦1.644nmol/L)直到26週齡。於加強免疫後 兩週，第3組豬隻的平均睪固酮濃度為4.535nmol/L。第3組豬隻的睪固酮濃度於26週齡抑制至1.968nmol/L。此對豬農有利，因為可於年齡較小的豬隻進行疫苗初次免疫，較佳於約3週齡，以方便進行動物管理。豬農也可以對年齡較大的豬隻進行加強免疫，因此對工作者提供緩衝時間以免疫豬隻。對於豬場實際的免疫去勢操作而言，可確保將睪固酮濃度穩定地維持在低的去勢程度。本試驗的結果指出，本發明疫苗製劑的應用可提早至3至4週齡，以及遲至於18週齡提供加強免疫。初免和加強免疫時程表均可誘導高免疫原性，有效抑制於22至26週齡豬隻的血清睪固酮濃度，此為肉品市場上一般豬隻出售的時期。
實施例7
藉由LHRH3疫苗製劑消除公豬臭
於肉品產業建立謹慎和對消費者友好的方法，設定雄甾烯酮之邊界值為0.5μg/g脂肪供公豬臭風險因子的評估。以中度雄甾烯酮水平(0.5-1.0μg/g脂肪)結合低度糞臭素水平(<0.1μg/g脂肪)，或以低度雄甾烯酮水平(<0.5μg/g脂肪)結合中度糞臭素水平(0.1-0.22μg/g脂肪)，表示發生公豬臭的低度風險。當公豬臭之參數(生物標記)均於中度水準(雄甾烯酮0.5-1.0μg/g脂肪；糞臭素0.1-0.22μg/g脂肪)時，表示發生公豬臭的中度風險。當生物標記(雄甾烯酮和糞臭素)同時超過此些邊界值時，其意謂著視肉品為具有發生公豬臭的高度風險(表9)。
在此實施例中，使用與實施例3類似的試驗方法。豬隻以配製於佐劑ISA50V2之LHRH3(SEQ ID NO：7、8和9)的油包水(W/O)乳化液進行免疫接種(如表10所示)。免疫接種後，收集多個時間點的血清以測定血清睪固酮濃度和抗-LHRH抗體力價。此外，收集豬隻的組織和器官以測定睪丸和副睪的重量，並利用高效能液相層析測定腹部脂肪的糞臭素和雄甾烯酮量。
a.睪丸和副睪的萎縮
由不同時間點(即於本研究中分別為10、12、14和16 WPI)犧牲的豬隻所分離器官的重量，可觀察到睪丸和副睪的萎縮(分別如第17A圖至第17D圖所示)。以本發明之疫苗製劑(LHRH3)免疫接種時，於本試驗期間，在增加濃度之抗-LHRH抗體的抑制性影響下，睪丸和副睪隨時間萎縮，於10 WPI時的副睪和於12 WPI(p<0.05)時的睪丸的重量顯著地減少，如第17圖所示。
b.公豬臭之測定
由接種的豬隻或未去勢的公豬收集5g背部脂肪，分別加入1.5ml的100%甲醇。然後將脂肪磨碎直到完全均質化。將脂肪萃取物置於15ml離心管中，並在室溫下超音波震盪5分鐘。將脂肪萃取物置於冰上冷卻15分鐘，然後在5℃下以4,000rpm離心20分鐘，以分離組織碎片。將上清液轉移至另一個1.5ml的離心管中。
豬隻以疫苗製劑免疫接種後，抗-LHRH抗體的最高力價出現在10 WPI(即加強免疫後兩週)，睪固酮濃度抑制至接 近去勢程度，為約或低於1.0nmol/L，其造成之脂肪中雄甾烯酮濃度的減少如第18A圖所示。接受本發明之LHRH3疫苗製劑豬隻的雄甾烯酮濃度為少於0.02至0.53μg/g脂肪，相較之下，接受生理食鹽水之陰性對照組豬隻的雄甾烯酮濃度為約少於0.02至2.12μg/g脂肪。相對於對照組，其雄甾烯酮濃度於10 WPI顯著地被抑制(p<0.05)直到16 WPI(24週齡)本試驗結束。
此外，當與陰性對照組的糞臭素濃度(為約0.04至0.36μg/g脂肪)(第19A圖)比較時，接受本發明之LHRH3疫苗製劑豬隻的糞臭素濃度介於約0.004至0.2μg/g脂肪(第19B圖)。因為常進行豬隻食物攝取和代謝衍生物(例如：儲存於相對應脂肪組織的糞臭素)的控制，接受本發明之LHRH3疫苗製劑豬隻的糞臭素濃度只有於14 WPI顯著地減少。依照產業結論，當雄甾烯酮和糞臭素二者同時超過邊界值(雄甾烯酮：0.5μg/g脂肪；糞臭素：0.22μg/g脂肪)時，其意謂著視肉品為發生公豬臭的高度風險。第19圖之結果指出，由疫苗接種組別提供之所有脂肪樣品於對厭惡氣味的敏化評估中屬於低度風險區域，其不論於10 WPI或於16 WPI具有低雄甾烯酮濃度(<0.5μg/g脂肪)和低糞臭素濃度(<0.22μg/g脂肪)；然而，陰性對照組豬隻中有約50%的肉品曝露於發生公豬臭的風險中。
實施例8
本發明LHRH1疫苗製劑之免疫接種時程表的適應性
在本實施例中，使用與實施例3類似的試驗方法， 除了劑量為25μg/2ml之外，以如表11所示配製於佐劑ISA50V2以形成油包水(W/O)乳化液的LHRH1(SEQ ID NO：10)胜肽進行免疫接種，且疫苗接種時間點如表11所示。
a.利用ELISA分析血清抗-LHRH抗體力價
實施例初始階段之抗-LHRH抗體的力價為1.458±0.007(Log10)(平均值±標準差)，以其作為背景值。初免和加強免疫接種後(第1至3組)，其抗體力價逐漸增加且均於加強免疫後兩週達到最高水準。第1組的平均抗體力價從10 WPI之最高水準3.636±0.577(Log10)下降到在試驗結束時的2.418±0.742(Log10)。第2組的平均抗體力價從此四組中的最高水準3.868±0.221(Log10)下降到研究結束時的2.806±0.213(Log10)。第3組和第4組的抗體濃度曲線相似。此結果顯示，第一次免疫接種可優選地於8週齡到3週齡時投予(第20圖)。
b.血清睪固酮濃度之評估
如第21圖所示，所有組別於試驗起始階段的睪固酮濃度為2.943±2.854(平均值±標準差)nmol/L。設定疫苗效力評估之時間點為加強免疫後兩週，其通常為免疫去勢中最低睪固酮(TT)濃度。基於此觀察，第1至4組的平均睪固酮濃度分別為1.265±0.353、1.329±0.636、1.904±2.297以及1.222±0.445(平均值±標準差)nmol/L。藉由克-瓦二氏單因子等級變異數分析法(Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks)分析，顯示組別間不具有統計上顯著性差異(p=0.992)。此外，抗-LHRH抗體力價與睪固酮濃度呈現負相關，具有-0.72的相關係數。在此，在加強免疫後，高抗-LHRH抗體力價造成 低睪酮濃度。
為評估免疫持續性，以第3組的豬隻表現最佳(即最低睪固酮濃度)，於24週齡的平均血清睪固酮濃度為0.896±0.386nmol/L。第3和4組之間則沒有顯著差異(P=0.835)。隨時程表推進，睪固酮的濃度增加至1.913±0.930nmol/L(第2組)和4.149±3.603nmol/L(第1組)。透過鄧恩法(Dunn’s method)分析，顯示第1和3組之間具有顯著差異(P=0.010)。
c.性器官測量
從12週齡起測量睪丸尺寸(長度和寬度)，並使用下述公式計算體積，：睪丸體積=1/2 x a x b2，此處
“a”為睪丸的長度
“b”為睪丸的寬度
性器官的測量包含：(1)活體的睪丸長度和寬度，以及(2)在屍體剖檢的睪丸和副睪重量、長度和寬度。根據第22圖和第23圖，第1至4組間的成對睪丸重量、成對副睪重量和睪丸長度沒有差異。活體的睪丸長度和體積(如第22A圖和第22B圖所示)於22週齡前均高度地被抑制。然而，於每一個參數中，第2組豬隻均具有最佳結果。
於24週齡之雄甾烯酮和糞臭素濃度分佈如第24圖所示。依據討人喜歡之公豬臭因子濃度的類別，第1、3和4組中87.5%的豬隻為“低度風險”，其對人類之味覺和嗅覺並不敏感。第2組的所有豬隻落於“低度風險”區域，因此呈現100%有效。
d.體重
測定本試驗中每頭豬隻的體重。各分組豬隻的生長模式類似。台灣市場上販售豬隻的平均重量為約115kg，此可於26週齡前達成。
總之，相較分別於8和16週齡實行初免和加強免疫的定期免疫接種計劃，本發明之初免時程表可彈性地改變至於3週齡的豬隻施用。此外，如本試驗所示，加強免疫之時程表可遲至於14至16週齡時施用。
實施例9
利用LHRH1疫苗製劑分析早期適應性處理
在本實施例中，使用與實施例3類似的試驗方法，除了於疫苗製劑使用的胜肽免疫原改成SEQ ID NO：10之外，疫苗接種時間點如表12所示。本實施例之目的為評估若疫苗製劑投予非常幼小豬仔時的去勢持續性，以及導致性器官萎縮的免疫治療。此試驗可評估非常早期的“彈性治療方案”，以決定免疫接種方案的最早初免時間。
a.血清抗-LHRH抗體力價分析
如第25圖所示，第1組(於3日齡(D3)進行初免，並於3週齡進行加強免疫)於12週齡的平均抗-LHRH抗體力價為2.346±0.451(Log10)。另外，第2組(於7日齡進行初免，並於3週齡進行加強免疫)於6週齡的抗-LHRH抗體力價為2.173±0.527(Log10)。
於這些組別中，只有第3組的豬隻(於3週齡進行初 次免疫且於6週齡進行加強免疫)於8週齡的抗-LHRH抗體力價高達2.767±0.476(Log10)。對於第1至3組的豬隻而言，於加強免疫二週後達到最高的抗-LHRH抗體力價之後，第1、2和3組的抗體力價分別高於1.718±0.297、1.765±0.340和1.770±0.283(Log10)。第4組豬隻於3週齡實行初免，但於16週齡加強免疫。第4和5組的豬隻於16週齡進行加強免疫後二週(於18週齡)可達到較高的抗體力價，分別為3.249±0.346和2.893±0.786。接受市售疫苗Improvac®的豬隻(第6組)，抗-LHRH抗體力價於22週齡(即加強免疫後二週)被誘發至高於1.724±0.339(Log10)。陽性對照(即接受手術去勢的豬隻(第7組))和陰性對照(即未接受疫苗接種的豬隻(第8組))皆不會引發超過背景水平之抗-LHRH抗體力價，其分別測定數值為1.451±0.006和1.445±0.010(Log10)。
b.血清睪固酮濃度之評估
如第26圖所描述，第1和2組豬隻的血清睪固酮濃度分別減少至最低濃度2.154±0.921nmol/L於10週齡以及2.183±1.231nmol/L於6週齡。第3組於3週齡投予第一劑，且睪固酮濃度曲線與第1和2組相似。第3組的最低睪固酮濃度為於12週齡的3.065±0.205nmol/L。
無論是否於3或8週齡投予第一劑，當延遲第4和5組的加強免疫接種至16週齡，第4和5組於20週齡之睪固酮濃度分別抑制至低水準，為約0.586±0.184和0.893±1.192nmol/L。相反地，第6組的豬隻依Improvac®使用說明進行接種，於20週齡豬隻的血清中，保持高濃度的睪固酮(約9.415± 7.560nmol/L)。對接受手術去勢之第7組的豬隻而言，每頭豬的睪固酮濃度始終保持在背景值(約0.559±0.372nmol/L)。對於未接受疫苗接種以作為陰性對照組(第8組)的豬隻而言，試驗期間中的平均睪固酮濃度維持在正常濃度(介於3.546±2.409nmol/L和7.380±3.269nmol/L之間)。
綜上所述，抗-LHRH抗體力價可利用早在3週齡的初免和之後的加強免疫有效地誘導，其維持高抗體力價至試驗結束，與依循常規疫苗接種時程表(於8週齡初免和16週齡加強免疫)者具有相似的抗體濃度曲線。因此，於3週齡至8週齡給予初次免疫，而於16週齡給予加強免疫時，血清睪酮濃度可有效地抑制至低水平。因此方便豬農可於3週齡豬隻(此時豬隻要投予許多其他一般疫苗)實行具彈性的早期階段免疫去勢時程表。
實施例10
以100μg/ml/劑量之LHRH3疫苗製劑於田間試驗(於8和16週齡分別進行初免和加強免疫並於22週齡結束)評估免疫去勢效力
於台灣南部之豬場施行大規模的田間試驗，利用二個GMP批次之LHRH3疫苗製劑於田間試驗評估免疫去勢效力。在此實施例中，於豬場內準備36頭公豬和8至9週齡的8隻去勢豬隻。
將豬隻分為4組，並於0、8、10、12以及14 WPI稱重。所有豬隻在0和8 WPI免疫接種，且於0、8、10、12以及14 WPI抽血以測定抗-LHRH抗體的血清力價和血清睪固酮濃度(如表13所示)。犧牲後，測量性器官(睪丸、副睪、精囊和前列腺腺體)重量、背部脂肪厚度和腰眼面積(最長肌)。
a.利用ELISA分析血清抗-LHRH抗體力價
如第27圖和表14所示，第1和2組豬隻的抗-LHRH抗體力價明顯高於第3組(未去勢對照組(公豬))和第4組(手術去勢對照組(閹豬))的豬隻。例如，第1組的抗-LHRH抗體力價約為1.52±0.12(Log10)至2.90±0.42(Log10)，以及第2組的抗-LHRH抗體力價約為1.45±0.01(Log10)至3.09±0.37(Log10)。相較之下，第3和4組的所有抗-LHRH抗體力價顯著地低於第1和2組。
b.對免疫去勢之血清睪固酮濃度的評估
如第28圖和表15所示，第1和2組所有豬隻在以每劑量100μg/ml的LHRH3疫苗製劑免疫接種後，具有100%的免疫去勢率。第1和2組所有豬隻的睪固酮濃度從8 WPI起抑制至非常低的水平，達到免疫去勢。試驗結果證實本發明之LHRH3疫苗製劑可有效地抑制豬隻性成熟的特性。
c.於接受疫苗接種豬隻的體重增加
豬隻體重的測定如表16所示。第1和2組豬隻體重高於第3組。
如第29圖和表17所示，與去勢對照組(第4組)相比，接種疫苗之豬隻(第1和2組)的平均日增重(ADG)較高。平均日增重增加的主要原因是平均日攝食量(ADFI)的增加，而非飼料換肉率(FE)。田間試驗之結果證明，本發明之LHRH3疫苗 製劑當利用分別於8和16週齡的初免和加強免疫方案以每劑量100μg投予時，可有效地免疫去勢及顯著地促進公豬生長。此促進生長的結果為豬隻可超前常規育種計劃二週於市場上販售，對豬農具有顯著的額外經濟效益。
d.生殖道性器官的萎縮
在14 WPI(即22週齡)本試驗結束時犧牲豬隻，對睪丸、副睪、精囊和前列腺稱重，以評估免疫去勢效力。對第1和2組的豬隻而言，生殖道性器官(包括睪丸、副睪、精囊和前列腺)的重量顯著地下降(表18)，且這些生殖道性器官萎縮至無功能的尺寸。
綜上所述，本發明之LHRH胜肽疫苗製劑具有比市售產品(Improvac®)更高的免疫去勢效果。於畜牧業領域中，除了因為人道因素將常規的手術去勢改變成免疫去勢之外，此種免疫去勢所造成的顯著重量增加還可產生顯著的經濟效益，故為往後動動物去勢的趨勢。
雖然本發明已經透過實施例及較佳實施例加以描述，可被理解的是，本發明並不限於所揭露的實施例。相反的，其意圖涵蓋各種修改和類似的排列(如對本領域技術人員為顯而易見者)。因此，應賦予本案所附之申請專利範圍最寬的解釋，以包含所有此種的修改和類似的排列。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。
由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發明之必要特徵，在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。
<110> 美國聯合生物醫學公司
<120> 免疫性LHRH組成物及其於豬隻之應用
<130> 1004263.212WO(2033-WO)
<140> TBD
<141> 2014-07-25
<150> PCT/US2014048164/
<151> 2014-07-25
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> LHRH胜肽
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(17)
<223> 破傷風毒素(aa.830-844)
<400> 2
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(17)
<223> 麻疹病毒F蛋白質助手T細胞抗原表位
<400> 3
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> B型肝炎表面抗原助手T細胞抗原表位
<400> 4
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> 結構性合成抗原庫(SSAL)助手T細胞抗原表位
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<400> 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(16)
<223> 來自侵染素之協同刺激的胜肽結構區域
<400> 6
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(17)
<223> 破傷風毒素助手T細胞抗原表位
<220>
<221> 胜肽
<222> (18)..(27)
<223> LHRH
<400> 7
<210> 8
<211> 45
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(16)
<223> 來自侵染素之協同刺激的胜肽結構區域
<220>
<221> 胜肽
<222> (17)..(18)
<223> 連接子
<220>
<221> 胜肽
<222> (19)..(35)
<223> 麻疹病毒F蛋白質助手T細胞抗原表位
<220>
<221> 胜肽
<222> (36)..(45)
<223> LHRH
<400> 8
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(16)
<223> 來自侵染素之協同刺激的胜肽結構區域
<220>
<221> 胜肽
<222> (17)..(18)
<223> 連接子
<220>
<221> 胜肽
<222> (19)..(33)
<223> B型肝炎表面抗原助手T細胞抗原表位
<220>
<221> 胜肽
<222> (34)..(35)
<223> 連接子
<220>
<221> 胜肽
<222> (36)..(45)
<223> LHRH
<400> 9
<210> 10
<211> 47
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(16)
<223> 來自侵染素之協同刺激的胜肽結構區域
<220>
<221> 胜肽
<222> (17)..(17)
<223> epsilon K作為連接子
<220>
<221> 胜肽
<222> (18)..(36)
<223> 結構性合成抗原庫1(SSAL1)助手T細胞抗原表位
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> T or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> T or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> K or R
<220>
<221> 胜肽
<222> (37)..(37)
<223> epsilon K作為連接子
<220>
<221> 胜肽
<222> (38)..(47)
<223> LHRH
<400> 10
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> 胜肽
<222> (4)..(4)
<223> epsilon K
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(4)
<223> 間隔
<400> 11
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(1)
<223> epsilon K
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(4)
<223> 間隔
<400> 12

Claims (19)

  1. 一種獸醫組成物，包含：(a)一胜肽免疫原，係選自以下所組成之群組，包含：(i)一SEQ ID NO：7、8與9的混合物，(ii)SEQ ID NO：10，以及(iii)一(i)和(ii)的組合；以及(b)一獸醫學上可接受之輸送載體或佐劑。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之獸醫組成物，其中該(a)之胜肽免疫原係為(i)SEQ ID NO：7、8與9的混合物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之組成物，其中該獸醫學上可接受之佐劑包含ISA50、ISA50V2或Emulsigen D。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之組成物，其中每劑量之該胜肽免疫原的總量係為約12.5μg至200μg。
  5. 一種用以抑制一豬隻由性成熟所引發之特性的方法，包含投予申請專利範圍第2項之該組成物的一有效量給一豬隻。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該特性包含公豬臭、性活動力、性行為、生育力以及發情行為。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該組成物係以肌肉或皮下注射投予。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該組成物的第一劑係施用於3週齡至8週齡之豬隻。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該組成物之第二劑係施用於6週齡至16週齡之豬隻。
  10. 一種用以降低一動物睪固酮及其衍生物產量的方法，包含投予一有效量之申請專利範圍第2項的組成物給一動物。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之獸醫組成物，其中該(a)之胜肽免疫原係為(ii)SEQ ID NO：10。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中該獸醫學上可接受之佐劑包含ISA50、ISA50V2或Emulsigen D。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之組成物，其中每劑量之該胜肽免疫原的總量係為約12.5μg至200μg。
  14. 一種用以抑制一豬隻由性成熟所引發之特性的方法，其包含投予申請專利範圍第11項之該組成物的一有效量給一豬隻。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該特性包含公豬臭、性活動力、性行為、生育力以及發情行為。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該組成物係以肌肉或皮下注射投予。
  17. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該組成物的第一劑係施用於3週齡至8週齡之豬隻。
  18. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該組成物的第二劑係施用於6週齡至16週齡之豬隻。
  19. 一種用以降低一動物之睪固酮及其衍生物產量的方法，包含投予一有效量之申請專利範圍第11項的組成物給一動物。
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