BR112017000354B1 - Composição veterinária, método não terapêutico de remoção do odor de macho inteiro de produtos à base de carne, e uso de peptídeo imunogênico e um veículo ou adjuvante de liberação veterinariamente aceitável - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma composição vacinal para castrar suínos, que compreende um peptídeo imunogênico e um veículo ou adjuvante de liberação aceitável para uso veterinário, em que o peptídeo imunogênico compreende (a) um peptídeo de LHRH com SEQ ID NO: 1, e (b) pelo menos um epitopo T helper selecionado a partir de um grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 3, 4 e 5 e, opcionalmente, um peptídeo imunoestimulatório de SEQ ID NO: 6, em que o peptídeo de LHRH é ligado covalentemente através de seu resíduo N-terminal ao epitopo T helper ou ao peptídeo imunoestimulatório. Um método para castrar ou inibir características, incluindo o odor de macho inteiro, induzidas pela maturação sexual de suínos utilizando a composição da vacina também é descrito.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a uma composição imuno- gênica de LHRH e, especificamente, refere-se a uma composição imunogênica de LHRH, na qual o LHRH inclui peptídeos sintéticos que levam à supressão funcional do nível de LHRH em suínos e resultam na imunocastração efetiva, na remoção do odor de macho inteiro e no aprimoramento do crescimento em suínos. Antecedentes da invenção

[002] O hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), também conhecido como hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRH), é um peptídeo hormonal trófico responsável pela liberação do hormônio folículo-estimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH) pela hipófise anterior. LHRH é sintetizado e liberado por neurônios dentro do hipotálamo.

[003] Desde o início dos anos setenta, a vacinação contra o hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRH) hipotalâmico tem demonstrado ser um método imunológico para controlar a reprodução. A resposta imune suscitada contra o LHRH impede a liberação pela hipófise anterior de LH e FSH, hormônios necessários para o desenvolvimento e a manutenção das gônadas - os testículos, no sexo masculino, e os ovários no sexo feminino. Assim, a redução dos níveis de LH e de FSH leva à perda da função reprodutora.

[004] As operações para descaracterização do sexo (De-sexing ou castração) constituem os procedimentos cirúrgicos mais difusamente praticados na medicina veterinária e no manejo de animais de cria- ção. Uma proporção significativa de animais de pecuária doméstica e de estimação é submetida rotineiramente à castração cirúrgica para evitar várias características indesejáveis que acompanham a maturidade sexual.

[005] O bloqueio imunológico da ação de LHRH pode resultar em infertilidade nos animais, pois o hormônio LHRH controla a produção de testosterona, a qual, por sua vez, regula o desenvolvimento de es- permatozoides, e a produção de estrogênio, que provoca, por sua vez, a maturação de óvulos. Além disso, a imunoterapia com base em LHRH serve como recurso para a contracepção em animais machos e fêmeas de estimação (por exemplo, cães, gatos, cavalos e coelhos), bem como atenua o comportamento indesejável impulsionado por an- drogênios, como geração de calor, demarcação territorial e agressividade. Tal processo é reversível dependendo do nível de anticorpos séricos nos animais tratados quando da imunização com a imunotera- pia à base de LHRH. Finalmente, a castração imunológica (por exemplo, a inibição baseada em anticorpos da ação de LHRH) tem uma aplicação adicional na indústria de carnes de animais. Os machos não são processados em cortes nobres por causa do odor desagradável e o sabor associado à carne resultante da testosterona em circulação (por exemplo, odor de macho inteiro). Tendo em vista que a castração mecânica (por exemplo, cirúrgica) de animais destinados à produção de alimentos não é mais considerada humana, a castração imunológi- ca apresenta-se como uma alternativa aceitável a essa prática.

[006] Diversas formas imunogênicas de LHRH foram testadas. Por exemplo, o peptídeo LHRH foi conjugado a proteína(s) transporta- dora(s) para intensificar a imunopotência do hormônio peptídico. Contudo, o custo desses transportadores proteicos é muito alto para que possam ser utilizados em larga escala, e os conjugados resultantes peptídeo-proteína não são tão eficazes para (1) produzir uma imuno- castração durante um período longo nem são capazes de (2) gerar uma resposta imune anti-LHRH em todos os animais, duas condições que são necessárias para uma vacina eficaz substituta da castração cirúrgica.

[007] Além disso, a imunização eficaz com um peptídeo de LHRH não imunogênico de 10 mer depende do sítio de conjugação entre LHRH e a(s) proteína(s) transportadora(s). Além disso, a ligação da proteína ao LHRH é problemática, enquanto imunógeno, pois a maioria das respostas imunes frente a tal imunógeno são dirigidas à(s) pro- teína(s) transportadora(s) maior(es) em vez de ao peptídeo de LHRH (a massa das toxinas ou de outras proteínas transportadoras é bem maior do que aquela de LHRH, um peptídeo de 10-mer). Esse fenômeno frequentemente leva à supressão imune epitópica induzida pela proteína transportadora. Dessa forma, deve-se procurar um intensifi- cador de resposta imune que seja adequado para a ligação ao peptí- deo de LHRH e produza um peptídeo sintético pouco dispendioso para uso como o ingrediente fundamental em uma formulação de vacina capaz de estimular uma resposta imune precoce e forte ao hormônio LHRH, destinada a aplicações múltiplas em imunocastração. Do mesmo modo, esse intensificador de resposta imune também deve evitar a supressão epitótica induzida pela transportadora. Por conseguinte, uma vacina de LHRH que tenha eficácia consistentemente elevada para imunocastração, incluindo (1) aplicações específicas para remoção do odor de macho inteiro junto com perfil de crescimento aprimorado em suínos; e (2) modificação de comportamento para facilitar o manejo de animais em rebanhos; é ainda altamente desejada para solucionar as deficiências atuais na imunocastração à base de LHRH, especialmente em suínos.

Sumário da invenção

[008] A invenção provê uma composição de vacina para castra- ção de suínos, compreendendo um peptídeo imunogênico e um veículo ou adjuvante de liberação aceitável para uso veterinário, em que o peptídeo imunogênico inclui (a) um peptídeo de LHRH com SEQ ID NO: 1, e (b) pelo menos um epitopo T helper ou um elemento imu- noestimulatório selecionado a partir de um grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5 e 6, em que o peptídeo de LHRH pode ser ligado covalentemente através de seu N-terminal com o epitopo T helper e/ou um elemento imunoestimulatório por uma sequência espaçadora formada por Gly-Gly ou εNLys. O espaçador "εNLys" é um resíduo de lisina presente entre dois aminoácidos que é ligada a (1) a extremidade C-terminal do aminoácido precedente no grupo ε-NH2 do resíduo de lisina e (2) a extremidade N-terminal do aminoácido seguinte no C- terminal do resíduo de lisina. Os termos "εNLys" e "εLys" e "εK" podem ser usados alternadamente.

[009] Em outra modalidade, o peptídeo imunogênico da presente invenção compreende SEQ ID NOs: 7, 8, 9 ou 10, ou uma mistura destas, e um adjuvante aceitável para uso veterinário é selecionado a partir de um grupo consistindo em ISA50V2 e Emulsigen D. A quantidade total do peptídeo imunogênico é superior a 6,25 μg por dose, de preferência, 50 μg a 200 μg.

[0010] Outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método para inibir características induzidas pela maturação sexual de suínos, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma composição de vacina da presente invenção a suínos para reduzir a produção de testosterona e seus derivados como di-hidrotestosterona e estrogênio no hospedeiro imunizado. As características incluem, entre outras, odor de macho inteiro, atividade sexual, fertilidade e comportamento estral. O método da presente invenção inibe o odor de macho inteiro e o crescimento de testículos ou de epidídimos.

[0011] Em uma modalidade, a composição de vacina é adminis- trada por injeção intramuscular a suínos machos em uma série de duas doses, sendo a primeira dose da composição vacinal aplicada ao suíno ainda na 3a semana de vida com a segunda aplicada como reforço a partir de 10 a 16 semanas ou mais tarde, levando à imunocas- tração eficaz, ao crescimento melhorado e à remoção do odor de macho inteiro aproximadamente duas semanas depois do reforço.

[0012] A descrição detalhada da invenção é fornecida nas modalidades a seguir com referência aos desenhos. Referências: 1. Discussão científica sobre Improvac no site da European Medicines Agency (EMA) (última atualização em 22/04/2010): http://www.emea.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_- _Scientific_Discussion/veterinary/000136/WC500064057.pdf 2. Wang, CY; Zamb, TJ.; YE, John; Kaminsky, SM.; Hosein, Barbara; Nixon, DF.; Koff, CW; Kowalski, Jacek; Walfield, A M., Structured synthetic antigen libraries as diagnostics, vaccines and therapeutics. WO 95/11998. United States: United Biomedical Inc. 3. Anna Efim Ladd, Chang Yi Wang, Timothy Joseph Zamb., "Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immunes stimulators for vaccines", Patente U.S. No 5 759 551. United States: United Biomedical Inc. 4. Wang, CY. "Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens including immunogenic LHRH peptides", Patentes U.S. Nos 6 025 468, 6 228 987, 6 559 282. United States: United Biomedical, Inc. 5. Wang CY. Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens. Patentes U.S. No 6 713 301. United States: United Biomedical Inc. 6. Meister, et al., "Two novel T cell epitope prediction algorithms based on MHC-binding motifs; comparison of predicted and published epitopes from Mycobacterium tuberculosis and HIV protein sequences", Vaccine, 13(6):581-591. 7. Synthetic Peptides: A Users Guide. Grant GA, ed. New York: WH Freeman and Company: 1992

Breve descrição dos desenhos

[0013] As Figuras 1a e 1b ilustram os respectivos títulos de anticorpos anti-LHRH depois da imunização de suínos machos com formulações que continham LHRH3 (SEQ ID NOs: 7, 8 e 9) e o adjuvante ISA50V2 (1a) ou Emulsigen D (1b). Os suínos em todos os grupos de teste (Grupos 1 a 4 e Grupos 8 a 11) mostram um título elevado de anticorpos contra LHRH duas semanas após o reforço (ou seja, 10 semanas após a imunização inicial, ou 10 WPI, quando ocorre com aproximadamente 18 semanas de idade). Em comparação, os títulos de anticorpos contra LHRH em suínos que recebem a vacina comercial disponível atualmente Improvac® (Grupo 7 e Grupo 14) se desenvolveram somente em 14 WPI com títulos mais baixos do que aqueles das formulações da vacina com o peptídeo da presente invenção (Grupos 1-4 e Grupos 8-11). Os suínos nos Grupos 5 e 12 receberam solução salina e serviram como controles negativos e os suínos nos Grupos 6 e 13 foram castrados por procedimento cirúrgico e serviram como controles positivos.

[0014] As Figuras 2a e 2b ilustram a duração da castração dos respectivos animais, revelada pelas concentrações correspondentes de testosterona em suínos em suínos após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH3 (SEQ ID NOs: 7, 8 e 9) em formulações incluindo o adjuvante ISA50V2 (2a) ou Emulsigen D (2b). Todos os grupos que receberam formulações com ISA50V2 ou Emul- sigen D mantiveram um nível baixo de testosterona no 10 WPI e que permaneceu baixo até 16 WPI (24 semanas de idade). Em comparação, os suínos nos Grupos 7 e 14 que receberam a vacina Improvac® apresentaram níveis elevados de testosterona sérica até 12 WPI e cujo nível baixo começou a subir a partir da 14 WPI, indicando uma eficiência bem menor na imunocastração de Improvac®.

[0015] As Figuras 3a e 3b ilustram os respectivos pesos corporais de suínos na idade de 24 semanas após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH3 (SEQ ID NOs: 7, 8 e 9) em formulações contendo o adjuvante ISA50V2 (3a) ou Emulsigen D (3b). O controle negativo não imunizado e os grupos castrados cirurgicamente apresentaram pesos corporais médios significativamente menores de 94,9 kg (controles negativos, Grupos 5 e 12) e 88,8 kg (Grupos castrados 6 e 13). Em comparação aos grupos castrados cirurgicamente, a vacina da presente invenção (Grupos 4 e 11) demonstrou um benefício significativamente maior em ganho de peso corporal de aproximadamente 27,9%.

[0016] As Figuras 4a e 4b ilustram os respectivos títulos de anticorpos anti-LHRH após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2 (4a) ou Emulsigen D (4b). Os suínos em todos os grupos de teste apresentaram títulos elevados de anticorpos contra LHRH depois de duas semanas do reforço em 10 WPI (ou seja, 18 semanas de idade). Os títulos de anticorpos puderam ser mantidos próximos de 3,0 (Log10) até 16 WPI (ou seja, 24 semanas de idade) quando os suínos estão prontos para a venda nos mercados em ambos os grupos que receberam a formulação com ISA50V2 ou com Emulsigen D.

[0017] As Figuras 5a e 5b ilustram as respectivas concentrações de testosterona após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2 (5a) ou Emulsigen D (5b). As concentrações séricas de testosterona em suínos dos Grupos 1 a 4, que receberam a formulação com ISA50V, e dos Grupos 8 a 11 que receberam a formulação com Emulsigen D cor- respondem inversamente os títulos no soro de anticorpos contra LHRH, ou seja, quanto mais elevados os títulos de anticorpos anti- LHRH, mais baixa a concentração de testosterona no soro até alcançar o nível de castração da testosterona no soro, sendo o valor de corte estimado em 1,87 nmol/L em duas semanas após o reforço (ou seja, 10 WPI ou 18 semanas de idade). Todos os grupos, exceto o Grupo 1, que receberam a formulação com ISA50V2 ou Emulsigen D mantiveram um nível baixo da concentração sérica de testosterona até 16 WPI (24 semanas de idade).

[0018] As Figuras 6a e 6b ilustram os respectivos pesos corporais de suínos após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2 (6a) ou Emul- sigen D. O controle negativo, ou seja, grupos não vacinados (Grupos 5 e 11) e os grupos castrados cirurgicamente (Grupos 6 e 12) apresentavam pesos corporais médios significativamente menores de 94,9 kg e 88,8 kg, respectivamente, na idade de 24 semanas. Em comparação aos suínos nos grupos castrados cirurgicamente, as formulações de vacina da presente invenção (Grupos 4 e 10) trouxeram um benefício significativamente maior em ganho de peso corporal de aproximadamente 20,3%.

[0019] A Figura 7 ilustra a duração de títulos de anticorpos anti- LHRH após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2 ou Emulsigen D. Duas semanas após o reforço (ou seja, 10 WPI), os títulos de anticorpos anti-LHRH dos Grupos 1 a 4 atingiram mais de 3,0 (log10) e tais títulos elevados se sustentaram até 20 WPI. Os animais imunizados dos Grupos 2 e 3 puderam até mesmo manter os títulos de anticorpos anti-LHRH em 3,0 (log10) até 24 WPI (ou seja, 32 semanas de idade). Em contraste, o controle negativo (Grupo 5) e o controle com castração cirúrgica (Grupo 6) mantiveram sempre um nível baixo de anticor- pos anti-LHRH.

[0020] A Figura 8 ilustra a duração da castração das respectivas concentrações de testosterona em suínos após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2 ou Emulsigen D. Duas semanas após o reforço (ou seja, 10 WPI), encontrou-se um nível baixo de testosterona sérica em todos os suínos nos Grupos 1 a 4, que atingiu o nível de castração por supressão dos anticorpos anti-LHRH demonstrado nesses grupos. O nível de testosterona de suínos nos Grupos 1 a 4 manteve-se tão baixo como aquele do grupo controle com castração (Grupo 6) até 20 WPI (ou seja, 28 semanas de idade).

[0021] A Figura 9 ilustra o peso de testículos de suínos após a imunização com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2 ou Emulsigen D em 24 WPI. Nos Grupos 1 a 4, os testículos dos suínos encolheram para um tamanho não funcional.

[0022] A Figura 10 ilustra o peso de epidídimos de suínos após a imunização com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2 ou Emulsigen D em 24 WPI. Nos Grupos 1 a 4, o peso dos epidídimos diminuiu significativamente.

[0023] A Figura 11 ilustra o peso corporal de suínos após a imunização com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2 ou Emulsigen D. Os animais imunizados dos Grupos 1 a 4 tiveram um desempenho no ganho de peso corporal bem melhor do que os grupos de controle negativo e de controle com castração cirúrgica (Grupos 5 e 6).

[0024] A Figura 12 ilustra o efeito sobre a concentração de andros- tenona de suínos depois da imunização com LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2 ou Emulsigen D. A concentração de androste- nona na gordura foi controlada em abaixo de 0,5 μg/g de gordura nos Grupos 1 a 4. Para o Grupo 3, o valor médio de androstenona foi até mesmo controlado em 0,1384 μg/g de gordura.

[0025] A Figura 13 ilustra o efeito sobre a concentração de escatol de suínos depois da imunização com LHRH1 (SEQ ID NO: 10) incluindo o adjuvante ISA50V2 ou Emulsigen D. A concentração de escatol foi controlada em abaixo de 0,1 μg/g de gordura nos Grupos 1 a 3. No Grupo 3, encontrou-se o valor médio mais baixo de escatol (0,0514 μg/g).

[0026] A Figura 14 ilustra um gráfico de distribuição de fatores que afetam o odor de macho inteiro. O Grupo 1 teve um desempenho semelhante ao do Grupo 2 em que 7/8 das amostras distribuíram-se na seção de risco baixo com uma amostra na seção de risco médio/alto. O Grupo 3 teve um desempenho excelente até 24 WPI em que todas as amostras distribuíram-se na seção de baixo risco. O grupo da castração cirúrgica (Grupo 6) manteve sempre a concentração mais baixa de fatores que afetam o odor de macho inteiro. O grupo controle com solução salina (Grupo 5) teve apenas 2/8 na seção de risco baixo, 2/8 na seção de risco médio e 4/8 na seção de risco alto.

[0027] A Figura 15 ilustra os títulos de anticorpos anti-LHRH após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2, em vários esquemas de dose e reforço (prime and boost), para avaliação da flexibilidade no esquema de imunocastração. Os suínos no Grupo 1 demonstraram alta imunogenicidade com títulos médios de anticorpos contra LHRH até 3,556 (log10) em 22 semanas de idade e que se mantinham a 3,235 (log10) em 26 semanas de idade. O Grupo 2 alcançou seu título mais alto de anticorpos com um título médio de 3,526 (logw) na 18a semana de idade e manteve a 2,869 (logw) na 26a semana de idade. O Grupo 3 alcançou seu título médio mais alto de anticorpos de 3,219 (logw) na 24a semana de idade e manteve a 2,682 (logw) na 26a semana de idade.

[0028] A Figura 16 ilustra as concentrações séricas de testostero- na após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2, em vários esquemas de dose e reforço para avaliação da flexibilidade no esquema de imu- nocastração. Os suínos no Grupo 1 mostram um efeito de imunocas- tração (concentração de testosterona É 1,87 nmol/L) em 20 semanas de idade, ou seja, 2 após o reforço, e tal efeito sustentou-se por pelo menos 6 semanas até 26 semanas de idade. As concentrações de tes- tosterona de suínos no Grupo 2 foram significativamente mais baixas do que 1,87 nmol/L durante o período de 2 a 6 semanas antes do reforço (ou seja, de 22 semanas a 26 semanas de idade) e permaneceram baixas (concentração de testosterona É 1,644 nmol/L) até 26 semanas de idade. Duas semanas após o reforço, a concentração média de testosterona do Grupo 3 era 4,535 nmol/L.

[0029] As Figuras 17a, 17b, 17c e 17d ilustram o peso de testículos e epidídimos em suínos após a imunização com formulações contendo LHRH3 (SEQ ID NOs: 7, 8 e 9) e o adjuvante ISA50V2. O peso dos testículos foi medido em 10 WPI (17a), 12 WPI (17b), 14 WPI (17c) e 16 WPI (17d). Os testículos e os epidídimos encolheram gradualmente ao longo do tempo e tiveram uma perda considerável do peso em 10 WPI, para os epidídimos, e em 12 WPI (p < 0,001) para os testículos.

[0030] As Figuras 18a, 18b, 18c e 18d ilustram a quantidade de fatores que afetam o odor de macho inteiro (androstenona e escatol) após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH3 (SEQ ID NOs: 7, 8 e 9) e o adjuvante ISA50V2. A quantidade de androstenona e escatol foi avaliada em 10 WPI (18a e 18c, respectivamente) e 12 WPI (18b e 18d, respectivamente). Depois da imuni-zação, a testosterona estava suprimida ao nível de castração (ou seja, menos de 1,87 nmol/L) resultando na diminuição da androstenona na gordura.

[0031] As Figuras 19a e 19b ilustram a avaliação de riscos através de resultados dos níveis de androstenona e escatol na gordura em um grupo controle negativo de suínos machos que não recebeu tratamento (19a) quando comparados a suínos machos que foram imunizados com as formulações de vacina incluindo o peptídeo de LHRH (19b). Todos os grupos vacinados foram detectados na seção de risco baixo da avaliação da sensibilização (baixa concentração de androstenona (< 0,5 μg/g de gordura) e baixa de escatol (< 0,22 μg/g de gordura)) desde 10 WPI a 16 WPI.

[0032] A Figura 20 ilustra o efeito de duração de títulos de anticorpos anti-LHRH após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2. O título de anticorpos do Grupo 1 declinou de 3,636 ± 0,577 (Log10) (no pico) para 2,418 ± 0,742 (Log10) (no final do estudo). O título de anticorpos do Grupo 2 declinou de 3,868 ± 0,221 (Log10) para 2,806 ± 0,213 (Log10) (no final do estudo).

[0033] A Figura 21 ilustra a concentração de testosterona após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2. A concentração de testoste- rona de todos os grupos no estágio inicial do estudo era 2,943 ± 2,854 (média ± DP) nmol/L. O momento definido para a avaliação de potência da vacina foi 2 semanas após o reforço, o qual revelou a concentração mais baixa de testosterona. As concentrações médias de tes- tosterona de suínos nos Grupos 1 a 4 em 2 semanas após o reforço foram 1,265 ± 0,353; 1,329 ± 0,636; 1,904 ± 2,297 e 1,222 ± 0,445 (média ± DP) nmol/L, respectivamente.

[0034] As Figuras 22a e 22b ilustram o comprimento (Figura 22a) e o volume dos testículos (Figura 22b) após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2. Não houve diferença nos pesos do par de testículos, par de epidídimos e nos comprimentos dos testículos entre os suínos nos Grupos 1 a 4. A seta indica o momento do reforço de acordo com os respectivos grupos.

[0035] As Figuras 23a, 23b e 23c ilustram os pesos do par de testículos (Figura 23a), par de epidídimos (Figura 23b) e os comprimentos dos testículos (Figura 23c) de suínos na necropsia após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2.

[0036] A Figura 24 ilustra as concentrações de androstenona e escatol em 24 semanas de idade após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2. No gráfico de distribuição de fatores que afetam o odor de macho inteiro, os fatores de risco para todos os suínos no Grupo 1-4 estavam localizados no risco baixo/médio, exceto por um suíno no Grupo 1.

[0037] A Figura 25 ilustra os títulos de anticorpos anti-LHRH após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2. Os títulos de anticorpos anti- LHRH com 0 e 3 semanas de idade ficaram em torno do nível de fundo de 1,718 ± 0,297; 1,765 ± 0,340 e 1,770 ± 0,283 (Log10) para suínos nos Grupos 1, 2 e 3, respectivamente. Os títulos de anticorpos anti- LHRH foram 3,249 ± 0,346 no Grupo 4 e 2,893 ± 0,786 no Grupo 5 com 18 semanas de idade, depois do reforço na idade de 16 semanas.

[0038] A Figura 26 ilustra as concentrações séricas de testostero- na em suínos depois da imunização com formulações contendo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) e o adjuvante ISA50V2. Os níveis séricos de testosterona de suínos nos Grupos 1 e 2 foram 2,154 ± 0,921 nmol/L em 10 semanas de idade e 2,183 ± 1,231 nmol/L em 6 semanas de idade, respectivamente. O nível mais baixo de testosterona em suínos do Grupo 3 foi 3,065 ± 0,205 nmol/L em 12 semanas de idade. As con- centrações séricas de testosterona foram suprimidas aos níveis mais baixos em torno de 0,586 ± 0,184 e 0,893 ± 1,192 nmol/L para os Grupos 4 e 5 em 20 semanas de idade, respectivamente. Em comparação, o nível sérico de testosterona em suínos recebendo a vacina Im- provac® (Grupo 6) continuou em alta concentração (próxima a 9,415 ± 7,560 nmol/L) em 20 semanas de idade e, a seguir, diminuiu para uma concentração baixa em 22 semanas de idade.

[0039] A Figura 27 ilustra os títulos de anticorpos anti-LHRH após a imunização de suínos machos com formulações contendo LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 e 9) e o adjuvante ISA50V. Os títulos de anticorpos anti-LHRH em suínos dos Grupos 1 e 2 foram significativamente mais altos do que aqueles observados nos Grupos controle 3 (inteiros, não imunizados) e 4 (castrados cirurgicamente).

[0040] A Figura 28 ilustra a imunocastração completa (100%) de suínos machos nos Grupos 1 e 2 depois da imunização com a formulação contendo LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 e 9) e o adjuvante ISA50V em doses diferentes.

[0041] A Figura 29 ilustra Ganho Médio Diário (ADG) mais elevado que se deve ao maior Consumo Médio Diário de Ração (ADFI) de suínos machos recebendo imunização com a formulação contendo LHRH3 (SEQ ID NO: 7, 8 e 9) e o adjuvante ISA50V quando comparados ao grupo de castração cirúrgica.

Descrição detalhada da invenção

[0042] A descrição a seguir é o melhor modo contemplado para executar a invenção. Essa descrição tem como objetivo ilustrar os princípios gerais da invenção e não deve ser considerada no sentido de limitar. O âmbito da invenção é determinado melhor por referência às reivindicações anexadas.

[0043] A presente invenção provê peptídeos tendo LHRH, um pep- tídeo de 10-mer ligado através de sua extremidade N-terminal a um epitopo coestimulatório ou de célula T helper (epitopo Th).

[0044] O termo "LHRH" refere-se ao hormônio liberador do hormônio luteinizante (GenBank: AAB34379.1), que é um hormônio peptídeo trófico responsável pela liberação do hormônio folículo-estimulante (FSH) e do hormônio luteinizante (LH) pela hipófise anterior. O termo LHRH usado neste relatório descritivo inclui homólogos de LHRH derivados de filos diferentes, por exemplo, aves, peixes, répteis e invertebrados. Os peptídeos de LHRH compreendem preferivelmente uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 conforme mostrada na Tabela 1.

[0045] O termo "vacina" é um termo clínico geral para descrever uma composição imunoestimulatória que leva à produção de anticorpos em um sujeito que foi exposto à vacina. De uma perspectiva clínica, os sujeitos aos quais foram administradas composições de vacina gerarão anticorpos contra o antígeno presente na vacina. As composições de vacinas descritas no presente pedido de patente não se limitam aos preparados biológicos que melhoram a imunidade contra uma determinada doença ou patógeno.

[0046] O termo "epitopo de célula T helper (epitopo Th)" da invenção refere-se aos epitopos Th derivados de patógenos estranhos, incluindo, entre outros, como exemplos, os epitopos de células T helper do antígeno de superfície (HBsAg) e do antígeno central (HBc) do vírus da hepatite B, os epitopos de células T helper da toxina pertussis (PT Th), os epitopos de células T helper da toxina tetânica (TT Th), os epitopos de células T helper da proteína F do vírus do sarampo (MVF Th), os epitopos de células T helper da proteína da membrana externa principal de Chlamydia trachomatis (CT Th), os epitopos de células T helper da toxina diftérica (DT Th), os epitopos de células T helper da proteína circunsporozoíta de Plasmodium falciparum (PF Th), os epitopos de células T helper da triose fosfato isomerase de Schistosoma mansoni (SM Th), os epitopos de células T helper TraT de Escherichia coli (TraT Th). O Th derivado de patógenos selecionados acima como exemplos representativos de Th promíscuo foram listados como SEQ ID NOs: 2-9 e 42-52 na Patente U.S. No 5 759 551 e são aqui incorporados por referência neste pedido de patente.

[0047] Os epitopos Th úteis podem também incluir epitopos Th combinatórios. Em Wang et al. (WO 95/11998), foi descrita uma classe de epitopos Th combinatórios em particular, incluídos em uma "Structured Synthetic Antigen Library" (Biblioteca de antígenos sintéticos estruturados) (SSAL). Os epitopos SSAL compreendem múltiplos epitopos Th com as sequências de aminoácidos organizadas em torno de um arcabouço (framework) estrutural de resíduos invariantes com substituições em posições específicas. As sequências do SSAL são determinadas retendo resíduos relativamente invariantes ao mesmo tempo em que outros resíduos são variados permitindo o reconhecimento dos diversos elementos de restrição MHC. A determinação pode ser realizada alinhando a sequência primária de aminoácidos de um Th promíscuo, selecionando e retendo, como o arcabouço do esqueleto, os resíduos responsáveis pela estrutura única do peptídeo Th e variando os demais resíduos de acordo com elementos de restrição MHC conhecidos. Há disponíveis listas das posições invariantes e variáveis com os aminoácidos preferidos de elementos de restrição MHC possibilitando obter motivos de ligação ao MHC. Essas listas podem ser consultadas quando forem criados epitopos Th SSAL (Meister et al., Vaccine, 1995; 13:581-591). Em uma modalidade, os epitopos Th incluem as SEQ ID NOs: 2, 3, 4 e/ou 5 mostradas na Tabela 1.

[0048] A SEQ ID No: 6 refere-se a um fragmento peptídico derivado da proteína invasina da bactéria patogênica Yersinia spp., uma proteína da membrana externa microbiana que medeia a penetração das bactérias em células mamíferas. A invasina de células mamíferas culti- vadas pela bactéria demonstrou que requer a interação entre a molécula invasina de Yersinia e diversas espécies da família β1 de integri- nas presentes nas células cultivadas. Como os linfócitos T são ricos em β1 integrinas (especialmente células T imunes ativadas ou de memória), e a célula T demonstrou propriedades coestimulatórias associadas com esse domínio invasina, esse domínio pode ser ligado a um epitopo Th promíscuo compreendendo construções de LHRH para in-tensificar a imunogenicidade de um peptídeo imunogênico criado (Patente U.S. No 6 025 468).

[0049] Os peptídeos da invenção incluem pelo menos um LHRH, um epitopo Th e, opcionalmente, um domínio coestimulatório do peptídeo invasina. O peptídeo de LHRH (incluindo seus homólogos) pode ser ligado covalentemente através de seus aminoácidos N-terminais com um espaçador a um peptídeo contendo pelo menos uma sequência conhecida por conter um epitopo Th. O epitopo Th pode ser ligado covalente- mente através de sua extremidade N-terminal ao domínio do peptídeo coestimulatório de invasão. O espaçador inclui, entre outros, Gly-Gly, Lys, εNLys, εNLys-(Lys)n, onde n=1 a 3, ou Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 11), etc.

[0050] Os peptídeos da invenção possuem entre cerca de 20 e 100 resíduos de aminoácidos, de preferência entre cerca de 20 e 70 resíduos de aminoácidos e mais preferivelmente entre aproximadamente 25 e 50 resíduos de aminoácidos. Em outra modalidade preferida, o peptídeo possui entre aproximadamente 27 e 45 resíduos de aminoácidos.

[0051] O número de epitopos Th inclui, entre outros, um, dois, três, quatro ou mais dos peptídeos Th da invenção, conforme mostrados na Tabela 1. Os peptídeos da invenção compreendem pelo menos um peptídeo dos epitopos Th selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, que pode ser ligado opcionalmente à extremidade N-terminal do peptídeo de LHRH de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, epitopos Th podem ser ligados à extremidade N-terminal de LHRH para formar um peptídeo da invenção. Por exemplo, os peptídeos e SEQ ID NOs: 2 e 3 podem ser ligados sequencialmente à extremidade N-terminal de LHRH por espaçadores (Gly-Gly, Lys ou εNLys). O versado na técnica mudaria o número dos epitopos Th e os tipos de espaçadores ligados ao peptídeo imunogênico de LHRH para obter um peptídeo ideal da invenção, se necessário.

[0052] Em outra modalidade, os peptídeos da invenção compreendem as SEQ ID NOs: 7, 8, 9 e/ou 10 conforme mostradas na Tabela 2, ou tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de similaridade com essas sequências.

[0053] Os peptídeos desta invenção podem ser produzidos por métodos químicos sintéticos que são bem conhecidos pelo versado na técnica; ver, por exemplo, Grant, ed. (1992) Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman & Co., New York, N.Y., pp. 382. Consequentemente, os peptídeos podem ser sintetizados utilizando a síntese automática em fase sólida com a química de t-butiloxicarbonila (t-Boc) ou 9-fluorenil-metiloxicarbonila (F-moc) em um Sintetizador de Peptídeos, Modelo 430A ou 431 da Applied Biosystems. Para sintetizar uma unidade central de polilisina, resíduos de lisina Di(t-Boc) ou Di(F-moc)-Nα, Nε não protegidos são utilizados no lugar de t-Boc ou F-moc com um grupo ε-amino protegido. Para melhorar a solubilidade de um peptídeo criado, o peptídeo pode ser alongado com resíduos adicional de serina e/ou de lisina no N-terminal. Depois da montagem completa do peptí- deo desejado, a resina é tratada de acordo com procedimentos padrão para clivar o peptídeo da resina e retirar o bloqueio pelos grupos protetores nas cadeias laterais dos aminoácidos. O peptídeo livre é purifi- cado por HPLC e caracterizado bioquimicamente. Alternativamente, os peptídeos lineares mais longos podem ser sintetizados por técnicas bem conhecidas do DNA recombinante. Qualquer manual padrão sobre a tecnologia do DNA fornece protocolos detalhados para produzir os peptídeos da invenção.

[0054] O peptídeo da invenção, quando utilizado como o ingrediente fundamental em uma formulação de vacina, pode resultar na imunocastração, incluindo a perda das características físicas e/ou químicas associada com a maturidade sexual, tais como sexualidade, comportamento de luta, errante, sexual agressivo, características or- ganolépticas indesejadas, tumores de órgãos reprodutores e gravidez, ciclos estrais, fertilidade, gravidez e tumores dos órgãos reprodutores em um animal imunizado. Deste modo, inibir as características inclui inibir a atividade sexual (por exemplo, impedir a cobertura de um gado macho por outro do sexo masculino), impedir ou retardar a ovulação, encolher os testículos e os epidídimos, reduzir a concentração de tes- tosterona, reduzir o comportamento agressivo ou reduzir características organolépticas indesejadas tais como o odor de macho inteiro.

[0055] Os peptídeos da invenção são formulados para a administração conveniente e eficaz em quantidades eficazes com um veículo farmaceuticamente aceitável em forma de dose unitária conforme aqui descrito. Uma forma de dose unitária pode, por exemplo, conter o pep- tídeo antigênico principal em quantidades variando de 0,5 μg a cerca de 2.000 μg, em geral, de preferência acima de 6,25μg, mais preferi-velmente de 25 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 90 μg, 100, 150 ou 200 μg. No caso de composições contendo ingredientes dietéticos suplementares, as doses são determinadas por referência à dose habitual e ao modo de administração dos referidos ingredientes.

[0056] Esta invenção também provê composições compreendendo sistemas de liberação farmaceuticamente aceitáveis para a adminis- tração dos peptídeos imunogênicos. As composições compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de pelo menos um peptídeo desta invenção. O número do peptídeo da invenção inclui, entre outros, um, dois, três, quatro ou mais em uma composição (vacina) da invenção. Por exemplo, a composição da invenção compreende a SEQ ID No: 7, 8, 9, 10, ou uma mistura destas. Em uma modalidade, a composição da invenção inclui um único peptídeo de SEQ ID No: 7, 8, 9 ou 10. Em outra modalidade, a composição da invenção inclui as SEQ ID Nos: 7, 8 e 9, a qual é referida como LHRH3 nos exemplos a seguir. Em outra modalidade, a composição da invenção inclui a SEQ ID No: 10 e é referida como LHRH1 nos exemplos a seguir. Quando assim formuladas, as composições da presente invenção, compreen-dendo LHRH ou seu homólogo como sítio antigênico alvo, são utilizadas para prevenção/remoção de odor de macho inteiro, aprimoramento do perfil de crescimento, imunocastração de suínos e para contracepção em machos e fêmeas.

[0057] Os peptídeos imunogênicos da invenção podem ser formulados como composições imunogênicas utilizando adjuvantes, emulsi- ficantes, veículos farmaceuticamente aceitáveis ou outros ingredientes providos rotineiramente em composições de vacina.

[0058] Os adjuvantes ou emulsificantes que podem ser utilizados nesta invenção incluem alumínio, adjuvante incompleto de Freund (IFA), liposina, saponina, esqualeno, L121, Emulsigen, monofosforila lipídio A (MPL), QS21 e ISA 720, ISA 50, ISA 50V2, ISA 35 ou ISA 206, bem como os outros adjuvantes e emulsificantes eficazes. As formulações são facilmente determinadas pelo versado na técnica e também incluem formulações para liberação imediata e/ou para liberação pro-longada. As vacinas da invenção podem ser administradas por qualquer via conveniente, incluindo via subcutânea, oral, intramuscular, intraperitoneal ou outra parenteral ou enteral. Do mesmo modo, os imunógenos podem ser administrados em uma dose única ou em doses múltiplas. Os esquemas de imunização são prontamente determinados pelo versado na técnica.

[0059] Em uma modalidade específica, o veículo e adjuvante de liberação é Montanide™ ISA 50V2 (uma composição oleosa adjuvante de vacina, composta por óleo vegetal e oleato de manídeo para produção de emulsões água em óleo (ou seja, w/o)), Tween® 80 (também conhecido como: Polissorbato 80 ou mono-oleato de polioxietileno (20) sorbitana), um oligonucleotídeo CpG e/ou qualquer combinação destes. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é uma emulsão água em óleo em água (ou seja, w/o/w) com Emulsigen ou Emulsigen D como o adjuvante. São providos também outros ingredientes rotineiramente incorporados com formulações de vacina, e instruções para dosagem de tal modo que é gerada uma resposta imune equilibrada de células B e T.

[0060] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para o preparo extemporâneo de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Essas formas farmacêuticas devem permanecer estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento e conter conservantes contra a ação contaminante de microrganismos como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e os semelhantes), misturas adequadas destes, e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser ocasionada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbi- co, timerosal e os semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada ou a liberação retardada das composições injetáveis pode ser ocasionada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e/ou gelatina.

[0061] A invenção também provê um método para induzir o título de anticorpos anti-LHRH, a diminuição da concentração de testostero- na, a prevenção do odor de macho inteiro, o encolhimento de testículos e epidídimos, a imunocastração de suínos e para a contracepção pela administração das composições de peptídeos em questão aos mamíferos por um tempo.

[0062] Em geral, o método da invenção pode induzir o título de anticorpos anti-LHRH em um suíno, e o título de anticorpos anti-LHRH é superior a 2,0, de preferência 2,5 ou 3,0 (Log10) depois de uma ou duas vacinas. O método da invenção também pode suprimir a concentração de testosterona em suínos, e a concentração de testosterona é inferior a 2,5 nmol/L, de preferência, 2,0; 1,87 ou 1,0 nmol/L depois de uma ou duas vacinas. Além disso, o método da invenção pode aumentar o peso corporal de suínos, de preferência com um aumento igual ou superior a 10%.

[0063] As composições da invenção podem ser administradas por qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo, entre outros, administração oral ou por injeção, de preferência, injeção intramuscular.

[0064] A composição da presente invenção contém uma quantidade eficaz de um ou mais dos peptídeos imunogênicos da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal composição em uma forma de dose unitária adequada geralmente contém entre aproximadamente 0,5 μg e 1 mg do peptídeo imunogênico por kg de peso corporal. Quando liberada em doses múltiplas, a composição pode ser convenientemente dividida em uma quantidade apropriada por dose. Por exemplo, a dose, por exemplo, de 6,25 μg a 200 μg; de preferência 50 μg, por ser administrada por injeção, de preferência por via intramuscular. Esta pode ser seguida por doses repetidas (de reforço). A dose dependerá da idade, do peso e da saúde em geral do receptor, conforme bem conhecido nas áreas de vacinas e terapêutica.

[0065] A invenção também provê um método para inibir características induzidas pela maturação sexual de suínos, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma composição de vacina da invenção.

[0066] O número e o momento de administração das doses não são limitados no método da invenção. Em geral, o método da invenção inclui pelo menos uma dose, de preferência, duas, três, quatro, cinco ou mais doses, preferivelmente, duas ou mais doses. O versado na técnica saberia facilmente aumentar o número de doses para induzir a eficiência. A primeira dose pode ser dada aos suínos em qualquer idade (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas). Os momentos da vacinação podem ser mudados ou modificados dependendo dos diferentes tipos de suínos, doses, adjuvantes e modos de administração.

[0067] Em geral, a primeira vacinação (primeira dose) é realizada depois de 3, preferivelmente de 3 a 8 semanas de idade. Uma vacinação de reforço (segunda dose) é preferivelmente efetuada entre 3 e 13 semanas depois da primeira. O esquema padrão teria 3 a 13 semanas entre a aplicação da primeira vacina e a de reforço.

[0068] Em uma modalidade, um esquema preferido de vacinação seria o seguinte: a primeira vacina seria dada próxima às 8 semanas de idade, o reforço seria dado próximo às 16 semanas de idade e, em casos em que os suínos são abatidos, o abate ocorreria depois de 6 a 8 semanas do reforço.

[0069] O esquema de vacinação de dose/reforço da invenção é adequado para suínos. Dependendo dos métodos de produção utilizados em diferentes países, em muitos casos, os suínos podem não atingir a idade de 21 semanas.

[0070] As modalidades específicas da presente invenção incluem, entre outras, as seguintes:

[0071] (1) Uma composição de vacina para castrar suínos, com preendendo um peptídeo imunogênico e um veículo ou adjuvante de liberação aceitável para uso veterinário, em que o peptídeo imunogê- nico inclui: (a) um peptídeo de LHRH de SEQ ID NO: 1, e (b) pelo menos um epitopo T helper selecionado a partir de um grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 3, 4 e 5 e, opcionalmente, um peptídeo imunoestimulatório de SEQ IN NO:6, em que o peptídeo de LHRH é ligado covalentemente através de seu resíduo N-terminal ao epitopo T helper.

[0072] (2) A composição de vacina de acordo com (1), em que o peptídeo de LHRH, o epitopo T helper e, opcionalmente, um peptídeo imunoestimulatório são ligados por Gly-Gly, εNLys, Lys-εNLys, Lys-Lys-εNLys, Lys-Lys-Lys-εNLys (SEQ ID NO: 11), εN- Lys-Lys-Lys ou εNLys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 12).

[0073] (3) A composição de vacina de acordo com (1), em que o peptídeo imunogênico compreende SEQ ID NOs: 7, 8, 9 e/ou 10, ou uma mistura destas.

[0074] (4) A composição de vacina de acordo com (1), em que o adjuvante aceitável para uso veterinário compreende ISA50, ISA50V2 ou Emulsigen D.

[0075] (5) A composição de vacina de acordo com (1), em que a quantidade total do peptídeo imunogênico é de aproximadamente 12,5 μg a 200 μg por dose.

[0076] (6) Um método para inibir características induzidas pela ma turação sexual de um suíno, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma composição de vacina da reivindicação 1 a um suíno.

[0077] (7) O método de acordo com (6), em que a característica compreende odor de macho inteiro, atividade sexual, sexualidade, fertilidade e comportamento estral.

[0078] (8) O método de acordo com (6), em que a composição de vacina é administrada por injeção intramuscular ou subcutânea.

[0079] (9) O método de acordo com (6), em que a primeira dose da composição de vacina é aplicada ao suíno na idade de 3 a 8 semanas.

[0080] (10) O método de acordo com (6), em que a segunda dose da composição de vacina é aplicada ao suíno na idade de 6 a 16 semanas.

[0081] Modalidades específicas adicionais da presente invenção incluem, entre outras, as seguintes:

[0082] (1) Uma composição veterinária compreendendo: (a) um peptídeo imunogênico selecionado a partir do grupo consistindo em: (i) uma mistura de SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, (ii) SEQ ID NO: 10 e (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) um veículo ou adjuvante de liberação aceitável para uso veterinário.

[0083] (2) A composição veterinária de acordo com (1), em que o peptídeo imunogênico em (a) é (i) uma mistura de SEQ ID NOs: 7, 8 e 9.

[0084] (3) A composição de acordo com (2), em que o adjuvante aceitável para uso veterinário compreende ISA50, ISA50V2 ou Emul- sigen D.

[0085] (4) A composição de acordo com (2), em que a quantidade total do peptídeo imunogênico é de aproximadamente 12,5 μg a 200 μg por dose.

[0086] (5) Um método para inibir características induzidas pela maturação sexual de um suíno, compreendendo administrar uma quantidade eficaz da composição de (2) a um suíno.

[0087] (6) O método de acordo com (5), em que as características compreendem odor de macho inteiro, atividade sexual, sexualidade, fertilidade e comportamento estral.

[0088] (7) O método de acordo com (5), em que a composição é administrada por injeção intramuscular ou subcutânea.

[0089] (8) O método de acordo com (5), em que a primeira dose da composição é aplicada ao suíno na idade de 3 a 8 semanas.

[0090] (9) O método de acordo com (5), em que a segunda dose da composição é aplicada ao suíno na idade de 6 a 16 semanas.

[0091] (10) Um método para reduzir a produção de testosterona e seus derivados em um animal, compreendendo administrar uma quantidade eficaz da composição de (2) ao animal.

[0092] (11) A composição veterinária de acordo com (1), em que o peptídeo imunogênico em (a) é (ii) SEQ ID NO: 10.

[0093] (12) A composição de acordo com (11), em que o adjuvante aceitável para uso veterinário compreende ISA50, ISA50V2 ou Emul- sigen D.

[0094] (13) A composição de acordo com (11), em que a quantida de total do peptídeo imunogênico é de aproximadamente 12,5 μg a 200 μg por dose.

[0095] (14) Um método para inibir características induzidas pela maturação sexual de um suíno, compreendendo administrar uma quantidade eficaz da composição de (11) a um suíno.

[0096] (15) O método de acordo com (14), em que as característi cas compreendem odor de macho inteiro, atividade sexual, sexualidade, fertilidade e comportamento estral.

[0097] (16) O método de acordo com (14), em que a composição é administrada por injeção intramuscular ou subcutânea.

[0098] (17) O método de acordo com (14), em que a primeira dose da composição é aplicada ao suíno na idade de 3 a 8 semanas.

[0099] (18) O método de acordo com (14), em que a segunda dose da composição é aplicada ao suíno na idade de 6 a 16 semanas.

[00100] (19) Um método para reduzir a produção de testosterona e seus derivados em um animal, compreendendo administrar uma quantidade eficaz da composição de (11) ao animal. Exemplo 1 Síntese do peptídeo de LHRH

[00101] Métodos para sintetizar construções de peptídeos relacionados ao LHRH que foram incluídos no esforço para desenvolver o projeto e a formulação de uma vacina eficaz direcionada ao LHRH são descritos abaixo. Os peptídeos podem ser sintetizados em quantidades de pequena escala, que são úteis para estudos principais no laboratório e em campo, bem como quantidades em grande escala (quilograma), que são úteis para a produção industrial/comercial de formulações de vacina e ensaios sorológicos.

[00102] Criou-se um grande repertório de peptídeos antigênicos relacionados ao LHRH tendo sequências comprimentos desde aproximadamente 10 a 40 aminoácidos para o rastreio e a seleção dos pep- tídeos sintéticos mais ideais para o uso em uma vacina eficaz de LHRH. Cada construção contém um peptídeo de LHRH (SEQ ID NO: 1) ligado sinteticamente a um epitopo de célula T helper (Th) cuidadosamente desenhado ou um peptídeo imunoestimulatório, identificados na Tabela 1 (SEQ ID NOs: 2 a 6). Os peptídeos de LHRH utilizados na vacina de LHRH da invenção constituem as SEQ ID NOs: 7 a 10.

[00103] Todos os peptídeos utilizados para os estudos de imunoge- nicidade ou em testes sorológicos relacionados para detecção e/ou medição de anticorpos anti-LHRH foram sintetizados em pequena escala, utilizando a química de Fmoc por sintetizadores de peptídeos dos Modelos 430A, 431 e/ou 433 da Applied BioSystems. Cada peptídeo foi produzido por uma síntese independente em um suporte de fase sólida, com proteção pelo Fmoc na extremidade N-terminal e por grupos protetores de cadeias laterais de aminoácidos trifuncionais. Os peptídeos completados foram clivados do suporte sólido e os grupos protetores removidos das cadeias laterais por ácido trifluoroacético 90% (TFA). Os preparados de peptídeos sintéticos foram avaliados por dessorção e ionização a laser assistida por matriz - tempo de (MALDI- TOF) acoplada à espectrometria de massa para assegurar o teor correto de aminoácidos. Cada peptídeo sintético foi também avaliado por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) para confirmar o perfil de síntese e a concentração do preparado.

[00104] Apesar do controle rigoroso do processo de síntese (incluindo o acompanhamento passo a passo da eficiência de acoplamento), também se produziram análogos de peptídeos devido a eventos não intencionados durante os ciclos de alongamento, incluindo inserção, exclusão, substituição e substituição de aminoácidos, e encerramento prematuro. Assim, os preparados sintetizados incluíram tipicamente múltiplos análogos de peptídeos junto com o peptídeo planejado. Apesar da inclusão de tais análogos de peptídeos não intencionados, os preparados resultantes dos peptídeos sintetizados eram, não obstante, adequados para o uso em aplicações imunológicas, incluindo imunodi- agnóstico (como antígenos para anticorpos de captura) e vacinação (como peptídeos imunogênicos). Tipicamente, tais análogos de peptí- deos, sejam estes criados intencionalmente ou gerados através do processo sintético em uma mistura de subprodutos, são frequentemente eficazes como um preparado purificado do peptídeo desejado, desde que um procedimento exigente de controle de qualidade seja desenvolvido para monitorar tanto o processo de fabricação como o processo de avaliação do produto a fim de garantir a reprodutibilidade e a eficácia do produto final que emprega esses peptídeos. A síntese de peptídeos em grande escala nas quantidades de múltiplas centenas de quilogramas foi concluída em um sintetizador automático de peptídeos UBI 2003 personalizado para escala de 15 mmoles a 50 mmoles de acordo com o mesmo princípio da síntese de peptídeos em fase sólida.

[00105] Para os ingredientes ativos utilizados nas formulações finais de vacina para os testes em campo, os peptídeos sintéticos de LHRH foram purificados por RP-HPLC preparativa com gradiente de eluição raso e caracterizados por MALDI-TOF acoplada à espectrome- tria de massa, análise de aminoácidos e RP-HPLC para pureza e identidade. Exemplo 2 Preparo da formulação de vacina

[00106] Uma mistura de três peptídeos imunogênicos de LHRH (LHRH3: SEQ ID NOs: 7, 8 e 9) e uma de um peptídeo imunogênico único (LHRH1: SEQ ID NO: 10) foram formuladas respectivamente em um sistema de liberação em emulsão (W/O) utilizando um adjuvante ISA da Seppic (França) ou Emulsigen D em água em óleo em água (W/O/W) da MVP (EUA). Resumidamente, peptídeos em solução salina (solução de NaCl 20% p/v) foram combinados em razões molares iguais, filtrados assepticamente (com filtro de 0,22 mícron) e, a seguir, misturados com o sistema de liberação com o adjuvante ISA50V2 ou Emulsigen D através de homogeneização. Os processos de formulação foram monitorados continuamente quanto à viscosidade. Os pro- dutos finais foram caracterizados por teste de identidade, teste físico e teste de esterilidade. Todos os procedimentos de formulação, envase e embalagem foram realizados em uma sala limpa para manter a condição estéril. Exemplo 3 Imunização de suínos machos com doses diversas das formulações de vacina LHRH3 (SEQ ID NOs: 7, 8 e 9)

[00107] No total, 40 suínos machos com 8 semanas de idade e 8 suínos castrados cirurgicamente foram utilizados para o uso. Esses suínos foram divididos em grupos de 8 conforme mostrado nas Tabelas 3 e 4, com o LHRH3 (SEQ ID NOs: 7, 8 e 9) formulado com o adjuvante à base de óleo (MontanideTM ISA50V ou ISA50V2) para formar uma emulsão água em óleo (W/O) conforme mostrada na Tabela 3 (Grupos 1 a 4), ou com o adjuvante Emulsigen D à base de óleo para formar a emulsão água em óleo em água (W/O/W) mostrada na Tabela 4 (Grupos 8 a 11), para intensificar a imunogenicidade dos produtos vacinais acabados. Três grupos controle incluíram suínos que receberam solução salina como os controles negativos (Grupos 5 e 12), suínos que haviam sido castrados cirurgicamente como os positivos (Grupos 6 e 13) e suínos que receberam a vacina de LHRH de ponta Improvac® para comparação direta da eficácia (Grupos 7 e 14).

[00108] Amostras de sangue foram coletadas em 0, 4, 8, 10, 12, 14 e 16 semanas após a imunização inicial (ou WPI) para medir os títulos no soro de anticorpos anti-LHRH e as concentrações séricas de tes- tosterona, respectivamente, nos suínos. a. Titulação de anticorpos anti-LHRH no soro por ensaio imunoenzimá- tico (ELISA).

[00109] O ensaio ELISA, que foi utilizado para avaliar os títulos sé- ricos de anticorpos anti-LHRH, foi desenvolvido e está descrito abaixo.

[00110] As cavidades de placas de 96 cavidades foram revestidas individualmente por 1 hora a 37°C com 100 μL de peptídeos-alvo individuais, a 2 μg/mL individualmente ou como uma mistura molar igual, a menos que especificamente mencionado, em tampão de NaHCO3 10 mH, pH 9,5, a menos que anotado de outra forma.

[00111] As placas revestidas com os peptídeos foram incubadas com 250 μL de PBS contendo gelatina 3% em peso de a 37°C por 1 hora para bloquear sítios não específicos de ligação a proteínas, seguido por três lavagens com PBS, contendo Tween® 20 0,05% em volume, e secas. 100 μL das amostras de soro diluído foram adicionados a cada cavidade e deixados reagir por 60 minutos a 37°C. As cavidades foram então lavadas seis vezes com PBS contendo Tween® 20 0,05% em volume para remover os anticorpos não ligados. 100 μL do anticorpo de cabra anti-IgG de suíno marcado com peroxidase, diluído de modo ótimo antes da titulação e com PBS incluindo 1% em volume de soro de cabra normal com Tween® 20 0,05% em volume, foram adicionados a cada cavidade e incubados a 37°C por outros 30 minutos. As cavidades foram lavadas seis vezes com PBS incluindo Tween® 20 0,05% em volume para remover o anticorpo não ligado e reagidas com 100 μL da mistura de substratos contendo 3’,3’,5’,5’- tetrametilbenzidina (TMB) 0,04% em peso e peróxido de hidrogênio 0,12% em volume em tampão de citrato de sódio por outros 15 minutos. Essa mistura de substratos foi utilizada para detectar o marcador peroxidase ao ser formado um produto colorido. As reações foram interrompidas pela adição de 100 μL de H2SO4 1,0 M e a absorbância a 450 nm (A450) determinada.

[00112] As diluições do soro foram realizadas de acordo com o propósito de se medir os títulos séricos de anticorpos contra LHRH. Para a determinação dos títulos de anticorpos em suínos que receberam formulações de vacina contra LHRH à base do peptídeo, diluiu-se o soro dez vezes em série, desde 1:10 até 1:10.000, no ensaio ELISA, e o título de um soro testado, expresso em Log10, foi calculado pela análise de regressão linear da A450.

[00113] De acordo com as Figuras 1a e 1b, exceto pelos grupos negativos (Grupos 5 e 12) e da castração cirúrgica (Grupos 6 e 13), todos os grupos testados que continham SEQ ID NOs: 7, 8 e 9 demonstraram um título alto de anticorpos contra LHRH após duas semanas do reforço em 10 WPI (18 semanas de idade). Os títulos de anticorpos dos grupos vacinados (Grupos 1 a 4 e Grupos 8 a 11) se mantiveram próximos ou acima de 3,0 (Log10) até 16 WPI (24 semanas de idade), um momento para a venda de suínos no mercado, não só para os grupos que receberam a formulação com ISA50V2 (Grupos 1 a 4), mas também os grupos que receberam a formulação com Emulsigen D (Grupos 8 a 11). Em contraste, os títulos de anticorpos de suínos que receberam Improvac® (Grupo 7) somente subiram em 14 WPI, duas semanas depois do reforço, sendo os títulos de anticorpos mais baixos do que os dos grupos da vacina com o peptídeo da invenção (Grupos 1 a 4 e Grupos 8 a 11). b. Avaliação da concentração sérica de testosterona

[00114] A concentração de testosterona sérica (TT) foi medida por kits comerciais de ELISA ou RIA. Os kits incluíram o kit DRG® Testosterone ELISA (EIA-5179), o kit BioVendor ELISA e o kit Seamans RIA. As concentrações de testosterona no soro dos Grupos 1 a 4 e Grupos 8 a 11, que receberam a formulação com ISA50V2 ou Emulsigen D, respectivamente, foram medidas neste exemplo específico pelo kit DRG® Testosterone ELISA, e se correlacionaram inversamente com os títulos correspondentes de anticorpos no soro nos suínos, com as concentrações caindo abaixo do valor de corte para castração (1,87 nmol/L em geral ou 1,0 nmol/L com critérios mais rigorosos) duas semanas após o reforço (ou seja, 10 WPI ou suínos com 18 semanas de idade). Os suínos em todos os outros grupos que receberam a formu- lação com ISA50V2 ou Emulsigen D mantiveram a testosterona em níveis de castração, conforme mostrado nas Figuras 2a e 2b, até 16 WPI (ou seja, 24 semanas de idade), a janela para a venda de suínos no mercado. Os resultados revelaram que a formulação da vacina com LHRH3 da invenção exibiu uma inibição da testosterona dependente da dose, e os Grupos 4 e 11 forneceram um nível mais alto de inibição quando comparados aos outros grupos.

[00115] Em comparação a suínos receberam as formulações de vacina, suínos nos grupos de controle negativo e castração mantiveram sempre um perfil de títulos baixos de anticorpos anti-LHRH em nível de fundo com as concentrações séricas de testosterona oscilando nos controles negativos (Grupos 5 e 12) como nos animais não castrados; para suínos nos controles positivos de cirurgicamente castrados (Grupos 6 e 13), as concentrações séricas de testosterona se mantiveram todas no nível baixo de castração.

[00116] Os suínos que receberam a vacina de LHRH Improvac® mantiveram nível alto de concentração sérica de testosterona até 12 WPI quando o reforço foi fornecido, e tal nível diminuiu depois de 14 WPI, ou seja, duas semanas após o reforço. Os resultados mostraram claramente que o Improvac® não é tão potente quanto as formulações de vacina da invenção (Grupos 1 a 4 e Grupos 8 a 11, contendo peptí- deos com as SEQ ID NOs: 7, 8 e 9, formulados em ISA50V2 ou Emul- sigen D) para a imunocastração de suínos. c. Peso corporal

[00117] De acordo com as Figuras 3a e 3b, o peso corporal dos suínos foi monitorado em todos os momentos, desde antes da imunização (3 semanas de idade) até o final do estudo (16 WPI, 24 semanas de idade). Os resultados revelaram a influência da vacinação sobre o peso corporal do animal. Os suínos recebendo solução salina como os controles negativos e aqueles submetidos à castração cirúrgica como os controles positivos, todos tinham pesos corporais médios significativamente menores de 94,9 kg (controle negativo, Grupos 5 e 12) e 88,8 kg (controle com castração cirúrgica, Grupos 6 e 13) respectivamente em 24 semanas de idade. Em comparação aos suínos submetidos à castração cirúrgica (Grupos 6 e 13), os que receberam as formulações de vacina da invenção a 200 μg/mL/dose (Grupos 4 e 11) obtiveram um benefício econômico significativamente maior em ganho de peso corporal de aproximadamente 27,9%. Exemplo 4 Imunização de suínos machos com doses diversas de formulações de vacina com LHRH1 (SEQ ID NO: 10)

[00118] Neste Exemplo, o protocolo foi semelhante ao protocolo do Exemplo 3, exceto que o peptídeo imunogênico na atual formulação de vacina foi mudado para SEQ ID NO: 10, e a dose foi alterada de acordo com as Tabelas 5 e 6. Depois da imunização, o soro de todos os animais foi coletado em múltiplos momentos para a determinação dos títulos de anticorpos contra LHRH e as concentrações correspondentes de testosterona no soro. Adicionalmente, os órgãos sexuais (testí-culos e epidídimos) dos suínos com 24 semanas de idade foram também coletados para medir o peso no momento do sacrifício. a. Titulação de anticorpos anti-LHRH no soro por ELISA

[00119] De acordo com as Figuras 4a e 4b, exceto pelos grupos de controle negativo (solução salina) e positivo (castração cirúrgica), todos os grupos de teste contendo o peptídeo imunogênico SEQ ID NO: 10 apresentaram um título elevado de anticorpo contra LHRH após duas semanas do reforço em 10 WPI (18 semanas de idade). Os títulos de anticorpos se mantiveram próximos ou acima de 3,0 (Log10) até 16 WPI (24 semanas de idade), a janela para a venda de suínos no mercado, não só para os suínos nos Grupos 1 a 4 que receberam a formulação com o adjuvante ISA50V2, mas também os suínos nos Grupos 7 a 10 que receberam a formulação com o adjuvante Emulsigen D. b. Avaliação da concentração sérica de testosterona

[00120] De acordo com as Figuras 5a e 5b, as concentrações séri- cas de testosterona de suínos nos Grupos 1-4 que receberam a formulação com ISA50V2 ou nos Grupos 7-10 que receberam a formulação com Emulsigen D se correlacionaram todas inversamente com os títulos correspondentes de anticorpos, e todas atingiram um nível abaixo do valor de corte para castração (<1,87 nmol/L) duas semanas após o reforço (ou seja, 10 WPI, 18 semanas de idade). Exceto pela dose mais baixa nos Grupos 1 e 7, os suínos em todos os outros grupos que receberam a formulação com ISA50V2 ou Emulsigen D mantiveram a testosterona sérica em nível de castração até 16 WPI (24 semanas de idade), que constitui a janela para a venda de suínos no mercado. c. Peso corporal

[00121] De acordo com as Figuras 6a e 6b, o peso corporal dos suínos foi monitorado em todos os momentos desde antes da imunização (3 semanas de idade) até o final deste estudo (16 WPI, 24 semanas de idade). Os resultados revelaram a influência da vacinação sobre o peso corporal do animal. Os animais que receberam solução salina como os controles negativos e aqueles submetidos à castração cirúrgica como os controles positivos tinham um peso corporal médio significativamente menor de 94,9 kg (controles negativos, Grupos 5 e 11) e 88,8 kg (controles com castração cirúrgica, Grupos 6 e 12), respectivamente, com 24 semanas de idade. Em comparação aos suínos submetidos à castração cirúrgica (Grupos 6 e 12), aqueles que receberam as formulações de vacina (Grupos 4 e 10) da presente invenção obtiveram um benefício econômico significativamente maior em ganho de peso corporal de aproximadamente 20,3%. Exemplo 5 Duração da imunidade para suínos recebendo doses diversas de formulações de vacina com LHRH1 (SEQ ID No: 10)

[00122] Neste Exemplo, o protocolo foi semelhante ao protocolo do Exemplo 3, exceto que o peptídeo imunogênico foi mudado para SEQ ID NO: 10, com a dose mostrada de acordo com a Tabela 7. Depois da imunização, o soro foi coletado em múltiplos momentos para a determinação de títulos de anticorpos contra LHRH e das concentrações séricas correspondentes de testosterona. Adicionalmente, os órgãos sexuais (testículos e epidídimos) de suínos foram também coletados quando do sacrifício com 32 semanas de idade para medir o peso.

[00123] O objetivo deste estudo foi ampliar o teste em campo para 24WPI, ou 32 semanas de idade, com amostras do soro coletadas para medir os títulos de anticorpos contra LHRH e as concentrações sé- ricas correspondentes de testosterona a fim de avaliar a duração da eficiência da imunocastração das formulações de vacina da invenção empregando um protocolo de imunização padrão, sendo a dose aplicada com 8 semanas de idade (0 WPI) e um reforço com 16 semanas de idade (8 WPI). a. Titulação de anticorpos anti-LHRH no soro por ELISA

[00124] Conforme mostrado na Figura 7, foram coletadas amostras do soro de suínos nos Grupos 1 a 4 duas semanas após o reforço (ou seja, 10 WPI) e analisadas para os títulos de anticorpos anti-LHRH. Constatou-se, em todas as amostras, um título superior a 3,0 (log10) para anticorpos anti-LHRH e esses títulos se mantiveram por volta de 3,0 (log10) durante um período de 10 semanas até 20 WPI (ou seja, 28 semanas de idade). Além disso, os Grupos 2 e 3 mantiveram os títulos de anticorpos anti-LHRH em 3,0 (log10) até 24 WPI (ou seja, 32 semanas de idade). Em contraste, o grupo controle negativo (Grupo 5) e o grupo controle com castração (Grupo 6) sempre mantiveram um perfil baixo de títulos de anticorpos em nível de fundo. b. Avaliação da concentração sérica de testosterona

[00125] Conforme mostrado na Figura 8, foram coletadas amostras do soro de suínos nos Grupos 1 a 4 duas semanas após o reforço (ou seja, 10 WPI) e analisadas quanto à concentração sérica de testoste- rona. Constatou-se que todas as amostras de suínos nos Grupos 1 a 4 apresentavam concentrações séricas de testosterona em nível de castração, resultante da supressão pelos títulos elevados de anticorpos anti-LHRH. Os níveis de testosterona dos Grupos 1 a 4 mantiveram-se tão baixos quanto aquele do grupo controle com castração cirúrgica (Grupo 6) até 20 WPI (ou seja, 28 semanas de idade). c. Encolhimento de órgãos sexuais (testículos e epidídimos) quando da imunocastração por Formulações de vacina com LHRH1

[00126] No final do estudo prolongado em 24 WPI (ou seja, suínos com 32 semanas de idade), os suínos foram sacrificados e seus órgãos sexuais, incluindo testículos e epidídimos, foram pesados para avaliar a eficiência da imunocastração. Constatou-se que os testículos e os epidídimos dos suínos dos Grupos 1 a 4 haviam encolhido para tamanhos relacionados a mau funcionamento conforme mostrado nas Figuras 9-10. Os pesos de testículos e epidídimos também se correlacionaram com a concentração sérica de testosterona. d. Peso corporal

[00127] Os suínos dos Grupos 1 a 4 mostraram um desempenho melhor em termos de ganho de peso corporal quando comparados àqueles suínos nos grupos controle (Grupos 5 and 6) conforme mostrado na Figura 11. e. Remoção do odor de macho inteiro conforme medido por concentrações de androstenona e escatol na gordura da barriga

[00128] Neste estudo de duração, a quantificação de fatores que afetam o odor de macho inteiro no final do estudo demonstrou que a remoção eficaz do odor de macho inteiro na gordura da barriga pôde prolongar o cronograma para a janela de venda de suínos até 24 WPI (ou seja, 32 semanas de idade). Neste estudo, a androstenona e o es- catol foram extraídos da gordura da barriga quando os suínos foram sacrificados e, então, detectados por HPLC. De acordo com a Figura 12, as concentrações de androstenona na gordura foram controladas para abaixo de 0,5 μg/g de gordura nos suínos dos Grupos 1 a 4. Especialmente no Grupo 3, o valor médio de androstenona foi controlado para abaixo de 0,1384 μg/g de gordura. De acordo com a Figura 13, a concentração de escatol foi controlada para abaixo de 0,1 μg/g de gordura nos suínos dos Grupos 1 a 3. Para os suínos no Grupo 3, o valor médio de escatol mais baixo encontrado foi de 0,0514 μg/g.

[00129] Além disso, as concentrações individuais de androstenona e escatol de uma determinada amostra são inseridas em gráfico para avaliação dos fatores que afetam o odor de macho inteiro e, de todas as amostras coletadas neste estudo, são separadas em quatro setores, baixo, médio/baixo, médio/alto e alto conforme mostrado na Figura 14. De acordo com a Figura 14, o grupo de castração cirúrgica (Grupo 6) manteve sempre a concentração mais baixa de fatores que afetam o odoro de macho inteiro. As amostras de suínos no Grupo 3 tiveram um excelente desempenho com todas distribuídas no setor de baixo risco até 24WPI. As amostras de suínos no Grupo 2 tiveram bom desempenho até 24 WPI quando 7/8 das amostras distribuíram-se no setor de risco baixo com uma amostra no de risco alto. As amostras de suínos no Grupo 1 tiveram um desempenho semelhante ao daquelas do Grupo 2 com 7/8 s amostras distribuíram-se no setor de risco baixo e uma amostra mostrada no de risco médio/alto. Em contraste, o grupo controle com solução salina teve apenas 2/8 das amostras no setor de risco baixo, com 2/8 nos setores de risco médio e 4/8 no de risco alto (Figura 14). As formulações de vacina com LHRH1 da invenção demonstraram a potência para remover o odor de macho inteiro por todo o período até 24 WPI (ou seja, 32 semanas de idade). Os resultados mostrados neste estudo indicaram claramente que suínos recebendo as formulações de vacina com LHRH1 da invenção em doses diversas podem suprimir efetivamente a produção de androstenona e escatol, e remover, assim, o odor de macho inteiro do(s) produto(s) correspon- dente(s) derivado(s) da carne. Exemplo 6 Efeito do cronograma de imunização na imunocastração com a dose e o reforço conduzidos em vários intervalos de tempo com as formulações de vacina contendo LHRH 1

[00130] Neste Exemplo, o protocolo foi semelhante ao protocolo do Exemplo 3, exceto que o peptídeo imunogênico utilizado nas formulações de vacina foi mudado para SEQ ID NO: 10 com o adjuvante ISA50V2, e os momentos da imunização com a dose e o reforço foram modificados de acordo com a Tabela 8. O soro foi coletado em vários momentos para medir os títulos de anticorpos anti-LHRH e as concentrações séricas de testosterona.

[00131] Conforme ilustrado na Figura 15, os suínos no Grupo 1 demonstraram alta imunogenicidade com o título médio de anticorpos contra LHRH medidos em 3,556 (log10) para suínos com 22 semanas de idade, e tais títulos se mantiveram em 3,235 (log10) até 26 semanas de idade. Para suínos no Grupo 2, o título mais alto de anticorpos foi encontrado em 3,526 (logw) na 18a semana de idade e mantinha-se em 2,869 (logw) na 26a semana de idade. Para suínos no Grupo 3, em decorrência ao esquema tardio da imunização de reforço na 18a semana de idade, o título mais alto de anticorpos foi 3,219 (log10) com 20 semanas de idade, duas semanas após o reforço, e o título manteve- se em 2,682 (log10) até 26 semanas de idade.

[00132] Adicionalmente, conforme ilustrado na Figura 16, os suínos no Grupo 1 revelaram um efeito de imunocastração (concentração de testosterona i 1,0 nmol/L) com 20 semanas de idade, ou seja, duas semanas após o reforço, sendo o efeito da imunocastração sustentado por pelo menos 6 semanas com 26 semanas de idade. Os suínos no Grupo 2 também revelaram alta eficácia da imunocastração. A concentração de testosterona de suínos no Grupo 2 foi abaixo de 1,0 nmol/L durante um período de 2 a 6 semanas depois do reforço (ou seja, em 22 semanas de idade) e manteve-se em um nível relativo baixo (concentração de testosterona i 1,644 nmol/L) até 26 semanas de idade. Duas semanas após o reforço, a concentração média de testosterona em suínos do Grupo 3 estava em 4,535 nmol/L. A concentração de testosterona de suínos do Grupo 3 foi suprimida para 1,968 nmol/L com 26 semanas de idade. É benéfico para os suinocultores iniciar a primeira dose da vacina nos suínos em uma idade precoce, de preferência por volta de 3 semanas de idade, por facilidade de manejo dos animais. Os suinocultores poderiam também aplicar o reforço nos suínos em uma idade mais adiantada, assim fornecendo uma zona tampão de tempo para os trabalhadores imunizarem os suínos e assegurarem que a concentração de testosterona seja mantida estavelmente em nível baixo de castração por motivos de ordem prática na operação de imunocastração nas granjas de suínos. Os resultados mostrados neste estudo indicaram que as formulações de vacina da invenção já podem ser aplicadas com 3 a 4 semanas de idade e, para o reforço, tão tarde quanto a idade de 18 semanas. Os dois esquemas de dose e reforço puderam induzir alta imunogenicidade levando à supressão eficaz da concentração sérica de testosterona em suínos na idade de 22 a 26 semanas, que representa a janela habitual para vendas de suínos no mercado na indústria de suinocultura. Exemplo 7 Remoção do odor de macho inteiro por formulações de vacina com LHRH3

[00133] A indústria de suinocultura estabeleceu uma abordagem conservadora e amigável ao consumidor para definir o valor de corte para a androstenona em 0,5 μg/g de gordura na avaliação do fator de risco para odor de macho inteiro. O risco baixo para carne com odor de macho inteiro poderia ser obtido seja combinando nível médio de androstenona (0,5-1,0 μg/g de gordura) com nível baixo de escatol (<0,1μg/g de gordura) ou combinando nível baixo de androstenona (<0,5 μg/g de gordura) com nível médio de escatol (0,1-0,22 μg/g de gordura). Um risco médio ocorreria quando os dois parâmetros (bio- marcadores) para odor de macho inteiro se situassem em níveis médios (androstenona 0,5-1,0 μg/g de gordura; escatol 0,1-0,22 μg/g de gordura). Quando ambos os biomarcadores (androstenona e escatol) ultrapassassem esses valores de corte ao mesmo tempo, isso implicaria um risco alto para que a carne fosse considerada como alterada pelo odor de macho inteiro (Tabela 9).

[00134] Neste Exemplo, o protocolo foi aproximadamente o mesmo do seguido no Exemplo 3. Os suínos foram imunizados com LHRH3 (SEQ ID NOs: 7, 8 e 9) formulado com o adjuvante ISA50V2 para formar a emulsão água em óleo (W/O) mostrada na Tabela 10. Depois da imunização, o soro foi coletado em múltiplos momentos para medir as concentrações séricas de testosterona e os títulos de anticorpos anti- LHRH. Adicionalmente, os tecidos e órgãos dos suínos foram coletados para medir o peso dos testículos e dos epidídimos e para medir a quantidade de escatol e androstenona na gordura da barriga por HPLC. a. Encolhimento de testículos e epidídimos

[00135] O encolhimento de testículos e epidídimos foi observado com os órgãos isolados pesados quando os suínos foram sacrificados em vários momentos, ou seja, 10, 12, 14 e 16 WPI, respectivamente, do estudo (Figuras 17a-17d, respectivamente). Quando da imunização com as formulações de vacina (LHRH3) da invenção, foi constatado que os testículos e os epidídimos haviam encolhido ao longo do tempo sob a influência supressora da concentração crescente de anticorpos anti-LHRH durante esse período estudados, sendo mostrada perda significativa de peso em 10 WPI, para epidídimos, e em 12 WPI (p <0,05) para testículos conforme mostrado na Figura 17. b. Medição de odor de macho inteiro

[00136] 5 g de toucinho coletado de suínos vacinados ou de ma chos inteiros foram adicionados individualmente a 1,5 mL de metanol 100%. A gordura foi então triturada por lâminas com textura arenosa até que os tecidos estivessem completamente homogeneizados. O extrato gorduroso foi então transferido para tubos de centrífuga de 15 mL e sonicados por 5 minutos à temperatura ambiente. O extrato gorduroso foi resfriado sobre gelo por 15 minutos e, a seguir, centrifugado a 4.000 rpm por 20 minutos a 5°C para separar os resíduos do tecido. O sobrenadante foi transferido para outro tubo de centrífuga de 1,5 mL.

[00137] Depois da imunização dos suínos com as formulações de vacina, o título máximo de anticorpos anti-LHRH surgiu em 10 WPI, ou seja, duas semanas depois do reforço, sendo o nível de testosterona suprimido até próximo ao nível de castração, por volta ou inferior a 1,0 nmol/L, o que resultou em concentrações decrescentes da androste- nona na gordura conforme ilustrado na Figura 18a. As concentrações de androstenona de suínos que receberam as formulações de vacina com LHRH3 da invenção variaram de menos de 0,02 a 0,53 μg/g de gordura em comparação às concentrações de androstenona de suínos do grupo controle negativo que recebeu solução salina e que eram de aproximadamente menos de 0,02 a 2,12 μg/g de gordura. A concentração de androstenona estava suprimida significativamente em 10 WPI, em comparação aos grupos controle (p < 0,05), e permaneceu até o final deste estudo em 16 WPI (24 semanas de idade).

[00138] Além disso, a concentração de escatol dos suínos que receberam as formulações de vacina com LHRH3 da invenção era de aproximadamente 0,004 a 0,2 μg/g de gordura (Figura 19b) quando comparada à concentração de escatol de suínos do grupo controle negativo grupo que era de aproximadamente 0,04 a 0,36 μg/g de gordura (Figura 19a). As concentrações de escatol dos suínos que receberam as formulações de vacina com LHRH3 da invenção diminuíram signifi-cativamente apenas em 14 WPI devido ao fato de esta concentração ser frequentemente controlada pela ração ingerida pelos suínos e me- tabolizada a derivados, como escatol, armazenados no tecido gorduroso correspondente. De acordo com a conclusão da indústria, quando a androstenona e o escatol excedem o corte (androstenona: 0,5 μg/g de gordura; escatol: 0,22 μg/g de gordura) ao mesmo tempo, isto implicaria em risco alto para a carne ser considerada alterada pelo odor. Os resultados ilustrados na Figura 19 indicaram que todas as amostras de gordura obtidas dos grupos vacinados pertencem ao setor de risco baixo em uma avaliação da sensibilização ao odor desagradável com concentração baixa de androstenona (< 0,5 μg/g de gordura) e baixa de escatol (< 0,22 μg/g de gordura) em 10 WPI ou em 16 WPI; enquanto que os suínos no grupo controle negativo exibem 50% de qualidade baixa de exposição da carne ao risco de aroma desagradável no cozimento. Exemplo 8 Flexibilidade no esquema de imunização das formulações de vacina com LHRH1 da invenção

[00139] Neste Exemplo, o protocolo foi semelhante ao protocolo do Exemplo 3, sendo os suínos imunizados com o peptídeo LHRH1 (SEQ ID NO: 10) formulado com o adjuvante ISA50V2 para formar uma emulsão água em óleo (W/O), conforme mostrada na Tabela 11, exceto que a dose foi a 25 μg/2 mL/dose e os momentos da vacinação fo- ram modificados de acordo com a Tabela 11. a. Titulação de anticorpos anti-LHRH no soro por ELISA

[00140] O título de anticorpos anti-LHRH no estágio inicial deste estudo era 1,458 ± 0,007 (Log10) (Média ± DP), que era o valor básico do ensaio. Depois da primeira imunização e a de reforço (Grupos 1 a 3), os títulos de anticorpos aumentaram gradualmente e todos atingiram os níveis em 2 semanas após o reforço. O título médio de anticorpos do Grupo 1 declinou de 3,636 ± 0,577 (Log10), no pico do nível em 10 WPI, para 2,418 ± 0,742 (Log10) no final do estudo. O título médio de anticorpos do Grupo 2 declinou de 3,868 ± 0,221 (Log10), no nível mais alto entre esses 4 grupos, para 2,806 ± 0,213 (Log10) no final do estudo. As respostas imunes dos Grupos 3 e 4 foram semelhantes em termos de perfis de anticorpos. Os resultados indicaram que a 1a imunização poderia ser administrada desde 8 semanas de idade até 3 semanas de idade, de preferência (Figura 20). b. Avaliação da concentração sérica de testosterona

[00141] Conforme ilustradas na Figura 21, as concentrações de tes- tosterona de todos os grupos no estágio inicial do experimento eram 2,943 ± 2,854 (média ± DP) nmol/L. O momento definido para avaliar a potência da vacina é 2 semanas após o reforço, que geralmente indicou a concentração mais baixa de TT na imunocastração. Com base nessa observação, as concentrações médias de testosterona encontradas nos Grupos 1 a 4 foram 1,265 ± 0,353; 1,329 ± 0,636; 1,904 ± 2,297 e 1,222 ± 0,445 (média ± DP) nmol/L, respectivamente. Não houve diferença estatisticamente significante (p= 0,992) entre os grupos, a qual foi examinada pelo Teste de Kruskal-Wallis, Análise de Variância One Way (um fator) nas ordenações (ranks). Adicionalmente, os títulos de anticorpos anti-LHRH revelaram correlacionarem-se inversamente com as concentrações de testosterona, sendo o coeficiente de correlação igual a -0,72, em que o título elevado de anticorpos anti-LHRH fez com que as concentrações de testosterona fossem baixas depois do reforço.

[00142] Em relação à avaliação de duração da imunidade, os suínos no Grupo 3 indicaram o melhor desempenho (ou seja, as concentrações mais baixas de testosterona) cuja concentração sérica média de testosterona em 24 semanas de idade foi de 0,896 ± 0,386 nmol/L. Não houve diferença significativa (P = 0,835) entre os Grupos 3 e 4. À medida que o esquema avançou, a concentração de testosterona aumentou para 1,913 ± 0,930 nmol/L (Grupo 2) e 4,149 ± 3,603 nmol/L (Grupo 1). Houve uma diferença significativa entre os Grupos 1 e 3 (P = 0,010) conforme a análise pelo método de Dunn. c. Medição de órgãos sexuais

[00143] Os tamanhos em vida (comprimento e largura) foram medidos a partir das 12 semanas de idade em diante e foram calculados para volume, utilizando as fórmulas seguintes:

[00144] Volume do testículo = 1/2 x a x b2, onde "a" é o comprimento do testículo e "b" é a largura do testículo.

[00145] As medições dos órgãos sexuais incluíram (1) o comprimento e a largura do testículo em vida e (2) os pesos, comprimentos e larguras do testículo e do epidídimo na necropsia. De acordo com as Figuras 22 e 23, não houve diferença nos pesos do par de testículos, do par de epidídimos e no comprimento do testículo entre os Grupos 1 a 4. Tanto o comprimento como o volume do testículo em vida (Figuras 22a e 22b) estavam altamente suprimidos nas 22 semanas de idade. Contudo, em cada parâmetro, os suínos do Grupo 2 obtiveram os melhores resultados.

[00146] A distribuição das concentrações de androstenona e esca- tol em 24 semanas de idade foi conforme mostrada na Figura 24. De acordo com a categoria de concentração favorável do fator que afeta o odor de macho inteiro, 87,5% dos suínos dos Grupos 1, 3 e 4 eram de "risco baixo", o qual não é sensível para o paladar e olfato Todos os suínos no Grupo 2 situaram-se na zona de "risco baixo", portanto, 100% eficaz. d. Peso corporal

[00147] O peso corporal de cada suíno foi também medido neste estudo. Todos os grupos de suínos cresceram em um padrão semelhante. O peso médio para vendas de suínos no mercado de Taiwan é de aproximadamente 115 kg, o qual pôde ser alcançado em 26 semanas de idade.

[00148] Em conclusão, quando comparado ao programa regular de imunização com dose e reforço conduzidos em 8 e 16 semanas de idade respectivamente, o esquema para a primeira dose desta invenção poderia ser mudado com flexibilidade para a idade do suíno de 3 semanas. Além disso, o esquema para o reforço ainda poderia ser fornecido desde a idade de 14 até 16 semanas conforme mostrado neste estudo. Exemplo 9 Estudo da flexibilidade de tratamento em estágio precoce com a formulação de vacina LHRH1

[00149] Neste Exemplo, o protocolo foi semelhante ao protocolo do Exemplo 3, exceto que o peptídeo imunogênico empregado na formulação da vacina foi mudado para SEQ ID NO: 10 e os momentos de vacinação foram modificados de acordo com a Tabela 12. O propósito deste Exemplo é avaliar a duração da castração se a formulação de vacina for administrada a leitões muito jovens e se o tratamento imu- nológico resulta em atrofia dos órgãos sexuais. Esse experimento é delineado para avaliar "Regimes Flexíveis de Tratamento" muito precoces e determinar o momento mais cedo para a primeira dose no regime de imunização. a. Titulação de anticorpos anti-LHRH no soro

[00150] Conforme ilustrado na Figura 25, a imunização precoce alcançou um título médio de anticorpos anti-LHRH de 2,346 ± 0,451 (Log10) para o Grupo 1 com 12 semanas de idade, que foi imunizado aos três dias (D3) de idade, para a primeira dose, e com três semanas de idade para o reforço, e de 2,173 ± 0,527 (Log10) para o Grupo 2 com 6 semanas de idade, que foi imunizado aos sete dias de idade, para a primeira dose, e com três semanas de idade para o reforço (Figura 25).

[00151] Desses grupos, apenas os suínos no Grupo 3 que receberam a imunização da primeira dose com três semanas de idade e o reforço com 6 semanas de idade desenvolveram um título alto de anticorpos anti-LHRH de 2,767 ± 0,476 (Log10) em oito semanas de idade. Para os suínos nos Grupos 1 a 3, depois que os anticorpos anti-LHRH atingiram os títulos mais altos duas semanas após o reforço, os títulos de anticorpos se mantiveram em 1,718 ± 0,297; 1,765 ± 0,340 e 1,770 ± 0,283 (Log10) nos Grupos 1, 2 e 3, respectivamente. Os suínos nos Grupos 3 e 4 também receberam a primeira dose de imunização às três semanas de idade, mas o reforço com 16 semanas de idade. Os suínos nos Grupos 4 e 5 puderam desenvolver títulos elevados de anticorpos, 3,249 ± 0,346 e 2,893 ± 0,786 com 18 semanas de idade respectivamente, duas semanas depois do reforço na idade de 16 semanas. Quanto aos suínos que receberam a vacina comercial Improvac® (Grupo 6), os títulos de anticorpos anti-LHRH foram induzidos para 1,724 ± 0,339 (Log10) com 20 semanas de idade, ou seja, duas semanas após o reforço. Nem o controle positivo, ou seja, suínos submetidos à castração cirúrgica (Grupo 7), nem o controle negativo, ou seja, suínos que não receberam vacinação (Grupo 8), puderam induzir os títulos de anticorpos anti-LHRH para além do nível de fundo, o qual foi analisado com o valor de 1,451 ± 0,006 e 1,445 ± 0,010 (Log10) res- pectivamente. b. Avaliação da concentração sérica de testosterona

[00152] Conforme ilustrado na Figura 26, o nível sérico de testoste- rona dos suínos nos Grupos 1 e 2 declinou até a concentração mais baixa de 2,154 ± 0,921 nmol/L, em 10 semanas de idade, e 2,183 ± 1,231 nmol/L em 6 semanas de idade, respectivamente. No Grupo 3, a primeira dose foi administrada às três semanas de idade, e o perfil de testosterona é semelhante àquele dos Grupos 1 e 2. O nível mais baixo de testosterona do Grupo 3 foi 3,065 ± 0,205 nmol/L com 12 semanas de idade.

[00153] Quando a imunização de reforço é retardada para a idade de 16 semanas nos Grupos 4 e 5, independentemente se a primeira dose foi administrada com 3 ou 8 semanas de idade, a concentração de testosterona foi suprimida para níveis baixos por volta de 0,586 ± 0,184 e 0,893 ± 1,192 nmol/L nos Grupos 4 e 5 em 20 semanas de idade, respectivamente. Em contraste, embora os suínos no Grupo 6 seguissem as instruções para imunização do Improvac®, o nível de testosterona nos suínos permaneceu em alta concentração (aproximadamente 9,415 ± 7,560 nmol/L) no soro nas 20 semanas de idade. Para os suínos no Grupo 7 submetidos à castração cirúrgica, as concentrações de testosterona de cada suíno mantiveram-se sempre no nível de fundo (aproximadamente 0,559 ± 0,372 nmol/L). Quanto aos suínos no Grupo 8 que não receberam vacinação e serviram como controles negativos, a concentração média de testosterona foi mantida na concentração normal (entre 3,546 ± 2,409 nmol/L e 7,380 ± 3,269 nmol/L) durante o teste.

[00154] Em conclusão, os títulos de anticorpos anti-LHRH puderam ser induzidos de modo eficiente pela imunização com a primeira dose aplicada já na 3a semana de idade e um reforço posterior, a qual manteve títulos altos de tais anticorpos no final do teste fornecendo um perfil semelhante de anticorpos ao daqueles que seguiram um esquema regular de imunização da primeira dose aplicada com 8 semanas de idade e o reforço com 16 semanas de idade. Por conseguinte, a concentração sérica de testosterona pôde ser suprimida para níveis baixos com eficiência quando a primeira dose de imunização foi administrada na 3a semana à 8a semana de idade enquanto o reforço foi administrado na 16a semana de idade. É conveniente para os suinocul- tores conduzirem a imunocastração com o esquema de imunização flexível em estágio precoce em suínos com 3 semanas de idade quando muitas outras vacinas estão em geral sendo administradas. Exemplo 10 Imunocastração eficaz demonstrada por um teste em campo utilizando a formulação de vacina com LHRH3 a 100 μg/mL/dose com a imunização de dose e reforço conduzida na 8a e 16a semana de idade e encerramento do estudo na 22a semana de idade

[00155] Um estudo em campo em grande escala foi conduzido em uma granja de suínos situada na região sudeste de Taiwan para avaliar a eficácia da imunocastração na prática em campo com dois lotes, produzidos de acordo com as boas práticas de fabricação (BPF), de formulações de vacina com LHRH3. Neste estudo, trinta e seis suínos machos mestiços e oito suínos castrados com 8 a 9 semanas de idade foram preparados na granja.

[00156] Os suínos foram classificados em 4 grupos e pesados em 0, 8, 10, 12 e 14 WPI. Todos os suínos foram imunizados em 0 e 8 WPI e sangrados em 0, 8, 10, 12 e 14 WPI para obter os títulos de anticorpos anti-LHRH no soro e as concentrações séricas de testostero- na conforme mostrado na Tabela 13. Depois do abate, o peso dos órgãos sexuais (testículos, epidídimos, vesículas seminais e glândulas próstata) com a espessura do toucinho e a área de olho de lombo (músculo logissimus) foram medidos. a. Titulação de anticorpos anti-LHRH no soro por ELISA

[00157] Conforme ilustrado na Figura 27 e na Tabela 14, os títulos de anticorpos anti-LHRH de suínos nos Grupos 1 e 2 foram significativamente mais altos do que os de suínos nos Grupos 3 (controle inteiro) e 4 (controle com castração cirúrgica). Por exemplo, os níveis de títulos de anticorpos anti-LHRH foram aproximadamente 1,52 ± 0,12 (Log10) a 2,90 ± 0,42 (Log10) no Grupo 1, e 1,45 ± 0,01 (Log10) a 3,09 ± 0,37 (Log10) no Grupo 2. Em comparação, todos os títulos de anticorpos anti-LHRH dos Grupos 3 e 4 foram significativamente mais baixos do que aquele dos Grupos 1 e 2. b. Avaliação da concentração sérica de testosterona para imunocas- tração

[00158] Conforme ilustrado na Figura 28 e na Tabela 15, todos os suínos nos Grupos 1 e 2 foram castrados com 100% de taxa de imu- nocastração depois da imunização com a formulação de vacina contendo LHRH3 a 100 μg/mL/dose. As concentrações de testosterona de todos os suínos nos Grupos 1 e 2 foram suprimidas para um nível muito baixo a partir de 8 WPI em diante para obter a imunocastração. Os resultados demonstraram que a formulação de vacina com LHRH 3 da presente invenção pôde inibir efetivamente características da matura-ção sexual em suínos. c. Aumento do peso corporal em suínos vacinados

[00159] O peso corporal de cada suíno foi medido conforme listados na Tabela 16. De acordo com o observado, os pesos corporais de suínos nos Grupos 1 e 2 são mais maiores do que aquele do Grupo 3.

[00160] Conforme ilustrado na Figura 29 e na Tabela 17, o aumento no Ganho Médio Diário (ADG) de suínos foi maior em grupos vacinados (Grupos 1 e 2) e quando comparado ao do controle castrado (Grupo 4). O aumento em ADG deve-se principalmente ao Consumo Médio Diário de Ração (ADFI) aumentado, mas não à Eficiência Ali- mentar (FE). Os resultados deste teste em campo demonstraram que a formulação de vacina com LHRH3 da presente invenção, quando administrada a 100 μg por dose em um regime de dose e reforço nas 8 e 16 semanas de idade, respectivamente, revelou ser altamente eficaz, levando à imunocastração com crescimento significativamente aprimorado em suínos machos. Como resultado deste crescimento aprimorado, os suínos puderam ser vendidos no mercado por mais de duas semanas à frente do esquema regular de criação, gerando, assim, benefícios econômicos adicionais aos suinocultores também. d. Encolhimento de órgãos sexuais do trato genital

[00161] No final deste estudo em 14 WPI (ou seja, 22 semanas de idade), os suínos foram sacrificados e os testículos, os epidídimos, as vesículas seminais e a glândula próstata foram pesados para avaliar a eficiência da imunocastração. Para suínos nos Grupos 1 e 2, os pesos de órgãos sexuais do trato genital, incluindo testículos, epidídimo, vesículas seminais e glândula próstata, demonstraram ter diminuído sig-nificativamente (Tabela 18), sendo o encolhimento desses órgãos sexuais até tamanhos não funcionais.

[00162] Em suma, as formulações de vacina baseadas no peptídeo imunogênico de LHRH da presente invenção dispõem de um efeito mais elevado de imunocastração do que o produto comercial disponível atualmente (Improvac®). Além do fator humanitário da conversão de castração cirúrgica convencional para imunocastração em futuro próximo no campo da criação animal, os ganhos de peso significativos, resultantes dessa prática de imunocastração gerarão benefícios econômicos consideráveis que empurrariam a tendência da castração animal para a linha de frente depois de décadas de exploração.

[00163] Embora a invenção tenha sido descrita por meio de exemplos e em termos de modalidades preferidas, deverá ser entendido que a invenção não está limitada às modalidades reveladas. Ao con- trário, a intenção é abranger várias modificações e arranjos semelhantes (conforme seria evidente para os técnicos no assunto). Portanto, deve ser conferido ao âmbito das reivindicações anexadas a interpretação mais ampla possível a fim de abranger todas as tais modificações e arranjos semelhantes. Tabela 1 - As sequências de LHRH, de epitopos Th e de um domínio peptídico coestimulatório da invasina Tabela 2 - As sequências dos peptídeos imunogênicos de LHRH da invenção Tabela 3 – Desenho do estudo para a formulação de LHRH3 com ISA50V2 *Semanas de idade #WPI: Semanas após a (primeira) imunização §LHRH3 contém os peptídeos de SEQ ID NOs: 7, 8 e 9. Tabela 4 - Desenho do estudo para a formulação de LHRH3 com Emulsigen *Semanas de idade #WPI: Semanas após a (primeira) imunização §LHRH3 contém os peptídeos de SEQ ID NOs: 7, 8 e 9. Tabela 5 - Desenho do estudo para formulação de LHRH1 com ISA50V2 *Semanas de idade; #WPI: Semanas após a (primeira) imunização §LHRH1 contém o peptídeo de SEQ ID NO: 10 Tabela 6 - Desenho do estudo para formulação de LHRH1 com Emulsigen D *Semanas de idade; #WPI: Semanas após a (primeira) imunização §LHRH1 contém o peptídeo de SEQ ID NO. 10 Tabela 7 - Desenho do estudo para a duração da imunidade *Semanas de idade; #WPI: Semanas após a (primeira) imunização §LHRH1 contém o peptídeo de SEQ ID NO: 10 Tabela 8 - Momentos de vacinação Grupo Idade do macho (semanas) 4 8 16 18 20 22 24 26 Vacinação: SEQ ID NO: 10 de 25 μg/mL B: Sangria Tabela 9 - Avaliação do risco de odor de macho inteiro por valores combinatórios de corte de androstenona e escatol Tabela 10 - Desenho do estudo para remoção do odor de macho inteiro *Semanas de idade §LHRH3 contém os peptídeos de SEQ ID NOs: 7, 8 e 9. Tabela 11 - O esquema do estudo da flexibilidade na imunização Tabela 12 - O esquema do estudo da flexibilidade na idade inicial tD: Dias de idade; *W: Semanas de idade; #WPI: Semanas após a (primeira) imunização. Tabela 13 - Desenho do estudo para a duração da imunidade Tabela 14 - Titulação de anticorpos anti-LHRH Tabela 15 - Concentração de testosterona e Imunocastração *O nível de castração para a testosterona é definido em ^1,87 nmol/L (intervalo de confiança de 99%) duas semanas depois da segunda injeção (10 WPI). Tabela 16 - Pesos corporais de suínos que receberam formulações de vacina (Grupos 1 e 2) em comparação àqueles no controle (Grupos 3 e 4) Tabela 17 - Ganho médio diário, consumo médio diário de ração e efi-ciência alimentar Tabela 18 - Peso de órgãos sexuais do trato genital

Claims (11)

1. Composição veterinária, caracterizada pelo fato de que consiste em: (a) uma quantidade eficaz de uma mistura molar igual de pep- tídeos imunogênicos com uma sequência de aminoácidos representada pelas SEQ ID NOs: 7, 8 e 9 em uma solução salina; e (b) um veículo ou adjuvante de liberação veterinariamente aceitável em que o veículo ou adjuvante de liberação veterinariamente aceitável é ISA50V2 ou Emulsigen D.

2. Composição veterinária, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o veículo ou adjuvante de liberação vete- rinariamente aceitável é ISA50V2.

3. Composição veterinária, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o veículo ou adjuvante de liberação vete- rinariamente aceitável é Emulsigen D .

4. Composição veterinária, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo imunogênico em (a) está em solução salina compreendendo 20% p/v NaCl.

5. Composição veterinária, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a quantidade total do peptídeo imunogêni- co é de 12,5 μg a 200 μg por dose.

6. Composição veterinária, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição veterinária é formulada em um volume de 1 mL contendo: (a) um total de 100 μg da mistura equimolar de SEQ ID NOs: 7, 8 e 9 em solução salina de NaCl a 20% p/v; e (b) ISA50V2 como adjuvante veterinariamente aceitável.

7. Método não terapêutico de remoção do odor de macho inteiro de produtos à base de carne, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter um suíno macho que não foi castrado cirurgicamente; e (b) administrar uma quantidade eficaz da composição veterinária, como defnida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ao suíno.

8. Método não terapêutico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição veterinária é administrada por injeção intramuscular ou subcutânea.

9. Método não terapêutico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a primeira dose da composição veterinária é aplicada ao suíno na idade de 3 a 8 semanas.

10. Método não terapêutico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a segunda dose da composição veterinária é aplicada ao suíno na idade de 6 a 16 semanas.

11. Uso de um peptídeo imunogênico e um veículo ou adjuvante de liberação veterinariamente aceitável, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de uma composição veterinária, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para inibir características induzidas pela maturação sexual de um suíno; e/ou para reduzir a produção de testosterona e seus derivados em um suíno.