BRPI9912178B1

BRPI9912178B1 - peptídeo e conjugados de peptídeo, biblioteca de antígenos sintéticos estruturados, composição farmacêutica e método de diagnose in vitro de infecção por fmdv

Info

Publication number: BRPI9912178B1
Application number: BRPI9912178A
Authority: BR
Inventors: Yi Wang Chang; Shen Ming
Original assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1998-06-20
Filing date: 1999-06-21
Publication date: 2017-03-28
Also published as: CN101469017A; BR9912178A; EP1089759A1; EP1089759A4; CN101386641A; CN101469017B; CA2330178A1; IL139464A0; CN101353373A; CN101386641B; CN100435846C; CA2330178C; CN101353373B; US6107021A; TWI232108B; AU4826699A; EP1089759B1; KR20010053042A; AR019152A1; CN1354674A

Abstract

patente de invenção: <b>"vacinas de peptídeo sintéticas para febre aftosa"<d>. a presente invenção refere-se ao uso de uma composição de peptídeo como um imunógeno, como cada peptídeo contido ali compreendendo um sítio antigênico alvo derivado da proteína de capsídeo de vp1 de vírus de febre aftosa (fmdv). o sítio antigênico está covalentemente ligado ao epítopo de célula t auxiliar, de preferência, a outras seqüências imunoestimuladoras, de preferência por ligação(ões) de peptídeo convencional(is) através de síntese direta, para a prevenção de infecção de fmdv e erradicação de vírus de febre aftosa (fmdv). mais particularmente, a presente invenção refere-se ao uso de tal composição de peptídeo como um imunógeno para eliciar a produção de animais incluindo, suíno, gado bovino, carneiro, cabras e espécies de tipo selvagem suscetíveis, de anticorpos policlonais de alto título que pode eficazmente neutralizar, in vitro, múltiplas cepas ou sorotipos de fmdv, e ao uso de tal composição como uma vacina para prevenir, e/ou reduzir a incidência de infecção por fmdv apesar do sorotipo, e assim efetuar erradicação de fmd. a presente invenção também refere-se aos peptídeos nas composições, e a imunoensaios e/ou a kits de diagnóstico contendo um ou mais destes peptídeos, e a métodos de diagnose de fmdv em mamíferos usando tais materiais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEO E CONJUGADOS DE PEPTÍDEO, BIBLIOTECA DE ANTÍGENOS SINTÉTICOS ESTRUTURADOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DE DIAGNOSE IN VITRO DE INFECÇÃO POR FMDV". A presente invenção refere-se ao uso de uma composição de peptí-deo corro um imunógeno, com cada peptídeo contido ali compreendendo um sítio antigênico alvo derivado da proteína de capsídeo VP1 de Vírus de Febre Aftosa (FMDV), com o sítio sítio antigênico covalentemente ligado a um epítopo de célula T auxiliar e, de preferência outras sequências imunoestimuladoras, de preferência por ligação(ões) de peptídeo convencíonal(is) através de síntese direta, para a prevenção de infecção por FMDV e erradicação de Febre Aftosa (FMD), Mais particularmente, a presente invenção se refere ao uso de tal composição de peptídeo como um imunógeno para eliciar a produção de animais incluindo suíno, gado bovino, carneiro, cabras e espécies selvagens suscetíveis, de anticorpos políclonaís de alto título que podem eficazmente neutralizar, in vitro, múltiplas cepas ou sorotipos de FMDV, e ao uso de tal composição como uma vacina para prevenir e/ou reduzir a incidência de infecção por FMDV apesar do sorotipo. A presente invenção também se refere aos peptídeos usados nas composições, e a imunoensaios e/ou a kits de diagnósticos contendo um ou mais destes peptídeos, ou seus segmentos.

Fundamentos da invenção Febre aftosa (FMD) é a a doença mais economicamente significativa em animais domésticos de uma fazenda ou granja. Animais fissípides de cascos fendidos da ordem Artiodactyla, tais como gado bovino, porcos, carneiro e cabra, são suscetíveis, O agente causador, vírus febre aftosa (FMDV), é um aftovírus da família de Picornaviridae tendo um genoma de RNA sentido que codifica quatro proteínas de capsídeo (VP1-VP4) e poli-peptídeos não estruturais, O genoma de FMDV, a região de codifiaçio para proteínas não-estruturais e de capsídeo e a trajetória de processamento pela qual as proteínas são clivadas é mostrada esquematicamente na figura 1 (tirada de Tesar e outros, Vírus Genes, 1989, 3: 29-44). FMD é controlado por isola mentol e destruição de animais infecta- dos e expostos, e por vacinação com composições de vírus quimicamente ina-tivadas. Uma dificuldade significativa para a formulação destas vacinas é a diversidade antigênica notável de FMDV. Sete sorotipos distintos foram descritos: A, O, C, Ásia e os tipos da África do Sul SAT-1, 2 e 3, cada um dos quais pode ser subdividido em múltiplos subtipos. Vírus de sorotipos A, O, e Ásia são mais comuns. Vírus de sorotipos A são os mais variáveis, tendo mais do que 30 subtipos. Não há nenhuma proteção cruzada entre os sorotipos, portanto animais recuperados de infecção com ou vacinados contra um vírus de um sorotipo são ainda suscetíveis a infecção com vírus oriundo dos seis sorotipos remanescentes. Além do mais, o grau de variação antigênico dentro de um sorotipo é tal que uma vacina eficaz contra um subtipo não pode ser protetor contra um outro subtipo dentro do mesmo sorotipo. Correspondentemente, vacinas atuais são à base de uma mistura de vírus inativada compreendendo uma cepa de referência de cada subtipo ou sorotipo relevante, como determinado por monitoração das cepas de vírus em circulação local. Vigilâncias periódica sobre a relação antigênica entre os isolados de campo, incluindo variantes emergentes, os vírus sendo usados para a preparação de vacina são necessários para prevenir surtos.

Portanto, a produção de vacinas atuais necessita que cepas de vírus devem ser desenvolvidas e inativadas com a potência de cada uma assegurada, e o produto deve ser reformulado periodicamente com cepas de campo atuais para prevenir perda de eficácia protetora pelo surgimento de novas variantes. O processo de preparação de múltiplas cepas de vírus para a manutenção de eficácia imunogênica diante da variação antigênica resulta em problemas pesados com variabilidade de cepa para cepa em potência e rendimento durante a fabricação. A necessidade de uma vacina de vírus inativada para revisão periódica por sua vez gera um novo obstáculo para a fabricação de vacina. Quando uma vacina é reexaminada para satisfazer o desafio de um surto por uma cepa de campo recentemente desenvolvida, a cepa de surto deve ser artificialmente adaptada para o crescimento eficiente em cultura de tecido. 0 processo de seleção para a adaptação para cultura de tecido pode resultar em imunogenicidade protetora diminuída, resultando em demora ulterior na produção. (Barteling and Vreeswijk, Vaccine, 1991; 975-88 Brown, Vaccine, 1992; 10:1022-1026).

Outras deficiência significativas de vacinas de FMDV inativadas são associadas a questões de biosseguridade e estabilidade. O vírus deve ser produzido em uma facilidade de alto refreamento para prevenir contaminação do ambiente imediato. Este risco potencial limita os fornecedores de vacina qualificadas a uns poucos, limita o fornecimento de disponível de vacina, e impede esforços para responder a surtos em regiões livres de FMDV no mundo. A inocuidade do produto de vírus inativado não pode ser assegurada absolutamente. Vários casos recentes da doença na Europa foi traçado para vírus incompletamente inativado. Este risco desencoraja o uso das vacinas em áreas onde a doença está ausente, deixando áreas anteriormente afetadas destituídas de proteção imune.

Instabilidade de produto bem como a variabilidade de lote para lote origina-se da composição não-definida ou complexa das vacinas de vírus inativadas. Estas misturas complexas devem ser inspecionadas em intervalos regulares para assegurar imunopotência. Em alguns países isto pode ser tão freqüente quando três vezes a cada ano. Uma cabina fria é necessária para manter a potência do produto instável, e freqüentemente, isto é difícul de se assegurar em alguns países.

Um potencial para efeitos nocivos é uma consequência adicional da composição complexa. Choque anafilático é um problema não-freqüente mas no entanto ocorre suficientemente freqüente para colocar problemas. Estas desvantagens são revistas em Brown, Capítulo 11 em Molecular Aspects of Picornavirus Infection and Detection, eds Semler and Ehrenfeld, American Societyfor Microbiology: Washington, DC, 1989, págs. 179-191. Uma outra desvantagem que se origina da composição complexa de vacinas de FMDV atuais é que ela é difícil para distinguir por animais de testagem sorológicas que foram vacinados a partir de animais que foram infectados (Lubroth e outros, Vaccine 1996; 14: 419-427). Uma vacina com base em imunógenos específicos de sítio facilitaria o projeto de kits de imunodia-gnóstico para distinguir anticorpos induzidos por vacina de anticorpos induzidos por infecção, e assim assegurar a eficácia de programas de vacinação.

As desvantagens das vacinas comerciais existentes estimularam pesquisa para substituí-las com produtos de subunidade melhores definidos e mais seguros. No entanto, para ser aceitável, tais produtos necessitarão ser de imunogenicidade equivalente àqueles das vacinas de vírus inativa-das disponíveis atualmente, e necessitarão prover um amplo espectro de proteção contra variantes antigênicas.

Tentativas de projetar uma vacina de subunidade definida para FMDV se originou com rompimento da partícula de vírus e identificação de suas proteínas constituintes como mostrado na figura 1. Isto resulta em uma perda considerável de atividade imunogênica em comparação com partículas de vírus inativadas intactas (Brown, 1989). No entanto, verificou-se que a proteína de capsídeo separada agora uniformemente projetada como VPI tinha, por si próprio, a capacidade de eliciar anticorpos de neutralização e imunidade de desafio em gado bovino e suínos, embora a atividade fosse específica de subtipo e muitas ordens de magnitude mais baixas do que aquela do vírus inativado intacto. Nenhuma das outras proteínas de vírus evocaram atividade de neutralização (Laporte e outros, C R Acad Sei Paris, 1973; 276: 3399-3401 e, Bachrach e outros, J. Immunol, 1975; 115:1636-1641). A atividade de neutralização de VP1 focalizou atenção sobre esta proteína e inicialmente foi seriamente considerada como um candidato para uma vacina de subunidade geneticamente engenheirada (Kleid e outros, Science, 1981; 214:1125-1129). Logo se tornou claro que a imunogenicidade de VP1 recombinante foi insuficiente para proteger animais (Brown, 1989; Brown, 1992). No entanto, este trabalho leva à revelação de determinantes imunogênicos sobre VP1, e a possibilidade de vacinas de subunida-des específicas de sítio mais pontentes com base em peptídeos sintéticos. VP1 foi mapeado para sítios imunogênicos por Strohmaier e outros (J Gen Virol, 1982; 59: 295-306) o qual testou produtos de divagem de VP1 gerados por brometo de cianogênio e digestão proteolítica; por Bittle e Lerner (WO 83/03547) que testou peptídeos sintéticos cujas seqüências de aminoácidos correspondiam a regiões de variabilidade mais alta, por Acha-rya e outros (Nature, 1989, 337: 709-711) que identificou sítios de superfície exposta sobre FMDV por critalografia de raios X, e por Pfaff e outros (EMBO J. 1982; 7: 869-874) que selecionou um peptídeo que elicia anticorpo de neutralização por predição de uma conformação helicoidal afipática proeminente em VP1. Todos as quatro abordagens convergiam sobre uma região de laço de resíduos extensos de VP1 137-160 como portando um determinante que elicia anticorpos de neutralização.

Peptídeos específicos de sorotipo que correspondem à região 141-160 de VP1, também chamado do "laço G-H"), oriundo de isolados que pertencem a todos os sete sorotipos agora demonstraram eliciar níveis protetores de anticorpo de neutralização em cobaias (Francis e outros, Im-munology, 1990; 69; 171-176). Claramente esta região contém um sítio imunogênico dominante que também transporta a especificidade de sorotipo do vírus. As observações iniciais de imunogenicidade para estes peptídeos de VP1 de 141-160 foram realizadas usando-se peptídeos sintético conjugados para transportar proteína KLH (hemocianina de lapa de "keyhole"), um procedimento que nega a vantagem de fabricação de um imunógeno sintético bem definido. No entanto, o desenvolvimento de imunógenos sintéticos de VP1 foi avançado por DiMarchi and Brook (a patente U.S. Ne 4.732.971) o qual demonstrou que seqüências de VPI oriundas de um isolado de subtipo O, unidas em um construto quimérico 200-213 Pro-Pro-Ser-141-158-Pro-Cys-Gly, eliciaram níveis de anticorpo que protegeram gado bovino contra o desafio. No entanto, a eficácia deste efeito foi limitada pela baixa imunogenicidade do imunógeno de peptídeo. Altas doses de 1-5 mg foram necessárias para se conseguir proteção a contra o desafio intradermalingual homotípico e um dos três animais que receberam a dose de 5 mg não foi protegido. Aplicação prática exige que uma formulação de vacina provê proteção completa a partir de tanto desafio homotípico quanto heterotípico com quantidades menores de imunógeno de peptídeo.

Um importante elemento para uma vacina de peptídeo eficaz par FMDV é a seleção de uma seqüência precisa oriunda do domínio de laço G-H de VP1 que é ótimo para a apresentação do epítopo de célula B que é responsável por eliciar anticorpos de neutralização. O quadro para a ótima apresentação de um domínio por peptídeo pode ser afetado por um deslocamento tão pequeno quanto uma única posição de aminoácido (Moore, capítulo 2 em Synthetic Peptides A User’s Guide, ed Grant, WH Freeman and Company: New York, 1992, págs. 63-67). Imunógenos sintéticos preferidos compreendendo o determinante de neutralização de laço G-H imunodominante foi revelado incluindo resíduos 141-160 (WO 83/0357; Francis e outros, 1990), 141-158 (patente U.S. N5 4.732.971), 142-158 (Parry e outros, WO 91/03225), 137-168 (Morgan and Moore, Am J Vet Res, 1990; 51: 40-45), 138-156 (Tabo-ga e outros, J Virol, 1997; 71: 2602-2614), e qualquer seqüência contígua de 20 aminoácidos selecionados de 130-160 (WO 83/03547). Claramente, não há consenso sobre um único segmento de VP1 que é ótimo para a apresentação do sítio de neutralização de VP1 de laço G-H.

Além disso, a variedade limitada de epítopos de célula B em vacinas de peptídeo anteriores eram adequadas para estimular os anticorpos de neutralização amplamente reativos necessários para a proteção contra o FMDV altamente variável. Até o presente momento, apenas anticorpos com especificidades relativamente limitadas foram eliciados e há uma outra restrição sobre o valor mesmo destas especificidades limitadas devido à ocorrência durante um tempo de mutações de ponto que origina mutantes de escape (Taboga e outros, 1997). Métodos alternativos são necessários para prover uma vacina de peptídeo com imunogenicidade que é suficientemente ampla para superar variação antigênica entre múltiplas cepas e variação temporal causada pelo surgimento de mutantes de escape.

Um outro fator importante que afeta imunogenicidade de um peptídeo sintético para uma vacina de FMDV é a apresentação ao sistema imune de um epítopo de célula auxiliar T apropriado para o hospedeiro. Peptídeos sintéticos curtos podem realizar seu potencial como vacinas apenas se eles contêm domínio que reagem com receptores de célula T auxiliar e moléculas de MHC de classe II, além dos sítios de ligação de anticorpo (Babbit e outros, Nature, 1985; 317: 359-361). O peptídeo de VP1 141-160 sozinho é um tanto imunogênico para cobaias e camundongos, indicando à presença de epítopos de célula T na seqüência que são apropriadas para estas espécies. Em contraste com isso resultados com aqueles animais de laboratório, experiências de vacina em gado bovino e suínos sugerem que responsividade imune pelos epítopos de célula T deste domínio de VP1 é exatamente variável para proteção adequada entre os indivíduos destas espécies criadas significativas (Rodriguez e outros, Virology, 1994; 205: 24-33; e, Taboga e outros, J. Virol, 1997; 71: 2606-2614). Recentemente, outros peptídeos sintéticos correspondentes a regiões de proteínas estruturais de FMDV foram identificados que agem como sítios de célula auxiliar T. Um peptídeo que corresponde a aminoácidos de VP1 21-40 demonstrou prover auxílio de célula T em gado bovino para a seqüência de laço de neutralização de VP1 (Collen e outros, J Immunol, 1991; 146: 749-755); no entanto, a presença deste epítopo de célula T não foi suficiente para prover protenção consistente em gado bovino (Taboga e outros, 1997). Não há ainda nenhuma informação referente a seleção de determinantes de célula auxiliar T adequados nem é a ótima orientação de epítopos de célula T e B em vacinas de peptídeo de FMDV conhecidas.

Permanece uma necessidade de uma vacina à base de peptídeo sintético para FMDV que é de potência e amplitude superior às vacinas clássicas. Os peptídeos de técnica anterior discutidos acima não adequadamente levam em conta esta necessidade. É um objetivo da presente invenção prover uma vacina de FMD de peptídeo sintética que satisfaz esta necessidade. Os métodos usados para alcançar estes objetivo são: 1. Um procedimento eficaz para a identificação de epítopos de alta afinidade, 2. O meio para representar um repertório aumentado de epítopos de célula T e de célula B com um número pequeno de síntese de peptídeo através da química combinatória, 3. O meio para aumentar a imunogenicidade de epitopo alvo de célula B por combinação dele com um epitopo de célula auxiliar T (Th) potente e acomodação do epitopo de Th para a responsividade imune variável de uma população, e 4. A estabilização de características conformacionais pela introdução de limitações cíclicas.

Peptídeos sintéticos foram usados para "mapeamento de epíto-po" para identificar determinantes imunodominantes ou epítopos sobre a superfície de proteínas, para o desenvolvimento de novas vacinas e diagnósticos. Mapeamento de epitopo emprega uma série de peptídeos de sobreposição que correspondem a regiões sobre a proteína de interesse para identificar sítios que participam em interação de determinante de anticorpo-imunogênico. Mais comumente, o mapeamento de epitopo emprega peptídeos de comprimento relativamente curtos para precisamente detectar determinantes lineares. Um método rápido de mapeamento de epitopo conhecido como "PEPSCAN" é com base na síntese simultânea de centenas de peptídeos de sobreposição, de comprimentos de 8 a 14 aminoácido, acoplados a suportes sólidos. Os peptídeos acoplados são testados quanto a sua capacidade de ligar anticorpos. Esta abordagem é eficaz na localização de determinantes lineares, mas os epítopos imunodominantes necessários para o desenvolvimento de vacina são usualmente epítopos descontínuo de alta afinidade e são difícis de definir pelo método de PEPSCAN (Meloen e outros, Ann Biol Clin, 1991; 49: 231-242).

Um método alternativo conta com um conjunto de peptídeos de sobreposição e aninhados de múltiplos comprimentos que variam de 15 a 60 resíduos. Estes peptídeos mais longos são sintetizados por uma série trabalhosa de síntese de peptídeo de fase sólida independente, ao invés de pela síntese de PEPSCAN simultânea e rápida. O conjunto resultante de peptídeos de sobreposição e aninhados podem então ser usados em estudos de ligação de anticorpo e imunizações experimentais para identificar peptídeos longos que melhor apresentam determinantes imunodominates, incluindo epítopos descontínuos simples. Este método é exemplificado pelos estudos de Wang para o mapeamento de sítios imunodominantes oriundos de HTLV l/ll (patente U.S. N° 5.476.765) e HCV (patente U.S. N° 5.106.726); e foi usado para a seleção de uma posição precisa sobre a seqüência gp120 para a ótima apresentação de um epítopo de neutralização de HIV (Wang e outros, Science, 1991; 254: 285-288).

Bibliotecas de peptídeos combinatórios foram projetadas para cobrir a faixa ampla de sequências incluídas por diferenças populacionais e geográficas e variação temporal de antígenos hipervariáveis e para envolver a capacidade limitada de imunógenos de peptídeo individuais. Por exemplo, um antígeno de peptídeo particular pode ser projetado para conter múltiplas substituições posicionais organizadas em volta de uma estrutura estrutural de resíduos invariantes. Esta combinação mantém a conformação de um sítio imunodominante e acomada variação antigênica presente e antecipada. Tais peptídeos combinatórios, que correspondem aos sítios imunodomi-nantes hipervariáveis de HIV e HCV, foram descritos como "mixotopos" por Gras-Masse e outros (Peptide Research, 1992; 5: 211-216), e como "biblioteca de antígenos sintéticos estruturados" ou "SSAL" por Wang e outros (WO 95/11998).

Uma "biblioteca de antígenos sintéticos estruturados" ou SSAL é constituída de um conjunto ordenado de seqüências de peptídeos correlatas implantadas dentro de uma estrutura estrutural invariante capaz de manter a antigenicidade, valor de diagnóstico ou bioatividade terapêutica daquele sítio.

A equação 1 provê uma representação das seqüência de ami-noácidos de SSAL AAy AA^ ... AA=ij... AAXj (eq. 1) A seqüência de AAy a AAxj representa a seqüência de aminoáci-dos, do terminal N até 0 termina C, dos peptídeos no SSAL. Cada peptídeo na biblioteca tem comprimento x, e x é constante para cada biblioteca. Em cada posição de aminoácido i, j varia de 1 a n, onde n representa 0 número de aminoácidos diferentes conhecidos (ou desejados) na posição ith. A introdução deliberada ou de ocorrência natural de lacunas ("gaps") ou inserções, por exemplo, aqueles alinhamentos de seqüência de VP1 na tabela 1, é acomadada pela síntese de SSAIs separados com valores diferentes de x. A equação 2 é uma representação matemática da soma de razões relativas de aminoácidos em um dada posição variável i na sequência de SSAL. A equação 2 afirma que cada posição i, a soma das frações molares dos n aminoácidos individuais é a unidade. A fração molar do ami-noácido jth na posição 1, [AAy], é selecionada pelo praticante, com base em (1) a prevalência de AAy entre as cepas de subtipo de um sorotipo de FMDV como encontrado na natureza, e opcionalmente (2) o desejo de incluir aminoácidos similares a fim de antecipar mutantes de escape. Os aminoácidos AAy normamente serão selecionados dos aminoácidos de ocorrência natural, mas podem incluir aminoácidos modificados tais como ornitina e norleu-cina e aminoácidos não naturais tais como D-aminoácidos. Por seguir estas fórmulas, todas as seqüências variantes de uma SSAL tendo comprimento x podem ser preparadas simultaneamente em uma única síntese. A seqüência do SSAL é determinada por alinhamento das seqüências de aminoácidos primárias de uma família correlata de antígenos, e identificação dos locais variantes e invariantes dentro do alinhamento. Os locais invariantes em geral representam a estrutura estrutural do SSAL. A degeneração dentro do SSAL é determinada pelos locais dentro do alinhamento que abrigam resíduos de aminoácidos diferentes em relação a uma seqüência de protótipo arbitrário. Depois da determinação de que aminoácidos devem estar em cada posição invariante, o grau de degeneração para as posições variáveis na biblioteca de SSAL é determinado a partir do número de variantes que apresentam cada aminoácido alternativo. O SSAL é então sintetizado com aminoácidos simples nas posições invariantes e com as degenerações necessárias nas posições variantes.

As razões relativas dos resíduos de aminoácidos nas posições variantes podem ser ajustadas iguais entre si, ou elas podem ser representadas em proporções desiguais. Em uma modalidade preferida, as razões de aminoácido em uma ou mais posições variantes são ajustadas para refletir a prevalência relativa de cada aminoácido encontrado nas seqüências nativas. As bibliotecas de SSAL exemplificadas nas tabelas 2 e 3 representam tais modalidades preferidas, em que os subscritos representam as quantidades relativas dos resíduos individuais em cada posição variável no SSAL. Deve ser observado que uma grande fração dos peptídeos presentes em uma SSAL pode representar combinações de aminoácidos variáveis que ainda não foram observadas natureza. Esta característica de uma SSAI aumenta o grau ao qual a proteção contra infecção por FMDV por novas cepas ermergentes de FMDV é conferida pelas composições de peptídeo desta invenção.

Assim, em um modo simples, os aminoácidos específicos, e opcionalmente sua frequência de aparência em cada posição dentro do SSAL, são definidas pela sequência primária dos antígenos diferentes que são usados no alinhamento. Na antecipação de mutantes de escape, aminoácidos não são conhecidos como existentes na natureza e um local variante dentro dos epítopos alinhados pode opcionalmente ser incorporado para dentro da biblioteca. Por exemplo, vários ou todos os resíduos de uma classe específica de aminoácidos (por exemplo, hidrofóbica, carregada, neutra ou polar) podem ser incorporados em qualquer local variável. A classe de aminoácidos incorporada em um local específico pode ser determinada pelo tipo predominante de aminoácido encontrado naquele local variante dentro do alinhamento de antígeno (WO 95/11998).

Epítopos chamados de "Th promíscuo" evocam auxílio de célula T eficiente, e podem ser combinados com epítopos de célula B que por eles próprios são pobremente imunogênicos para gerar imunógenos de peptídeo potentes. Peptídeos quiméricos de epítopo de célula B/Th promíscuos são capazes de eliciar respostas de Th e respostas de anticorpo resultante na maioria dos membros de uma população geneticamente diversa que expressa haplótipos de MHC diversos. Th promíscuo pode ser provido por seqüências específicas derivadas de imunógenos potentes de origem bacterí-ana e viral, incluindo proteína F de vírus de sarampo, antígeno de superfície de vírus de hepatite B, e proteína de membrana externa principal de Chlamydia trachomatis. Muitos Ths promíscuos conhecidos demonstraram ser eficazes na potenciação de um peptídeo pobremente imunogênico que corresponde ao LHRH de hormônio de decappeptídeo (patente U.S. N5 5.759.551).

Epítopos de Th potentes variam de tamanho de cerca de 15 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos de comprimento de LHRH (patente U.S. N5 5.759.551), e frequentemente partilham características estruturais comuns e podem conter sequências marcantes específicas. Por exemplo, uma característica comum é as hélices anfipáticas, que são estruturas alfa-helicoidais com resíduos de aminoácidos hidrofóbicos que dominam uma face da hélice e com resíduos polares e carregados que dominam as faces envolventes (Cease e outros, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1987; 84: 4249-4253). Epítopos de Th freqüentemente contêm padrões de aminoácido adicionais tal como um Gly ou um resíduo carregado seguido por dois a três resíduos hidrofóbicos, seguido por sua vez por um resíduo carregado ou polar. Este padrão define aquelas que são chamadas seqüências de Rothbard. Também, epítopos de Th freqüentemente obedecem a regra 1, 4, 5, 8, onde um resíduo positivamente carregado é seguido por resíduos hidrofóbicos nas quarta, quinta e oitava posições depois do resíduo carregado. Uma vez que todas estas estruturas são constituídas de aminoácidos hidrofóbicos, carregados e polares, cada estrutura pode existir simultaneamente dentro de um único epítopo de Th (Partidos e outros, J. Gen Virol, 1991; 72: 1293-1200). A maioria, se não todos os epítopos de célula T promíscuos se ajustam a pelo menos uma das periodicidades descritas acima. Estas características podem ser incorporadas nos projetos de sítios de Th artificiais idealizados, incluindo epítopos de Th de SSAL que podem prover degene-ração nas posições associadas ao reconhecimento de diversas moléculas de MHC e retêm posições invariantes. Listas de posições variáveis e aminoácidos preferidos estão disponíveis para pedaços de ligação de MHC (Meister e outros, Vaccine, 1995; 13: 581-591). Por exemplo, o epítopo de Th degenerado descrito na WO 95/11998 como "SSAL1TH1" foi modelado depois de um epítopo promíscuo tirado da proteína F de vírus de sarampo (Partidos e outros, 1991). SSAL1TH1 (WO 95/11998) foi projetado para ser usado em tandem com um peptídeo alvo de LHRH. Semelhante a epítopo de sarampo, SSAL1TH1 segue a seqüência de Rothbard e a regra 1, 4, 5, 8. (Ver, por exemplo, posições 6, 910 e 13 em SSAL1TH1): 15 10 15 Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-Gly-Leu- Glu Ile Glu Ile Arg Ile Ile Ile Arg Ile Glu Ile Val Vai Vai Vai Vai Vai Vai Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Resíduos carregados Glu ou Asp são adicionados na posição para aumentar a carga que envolve a face hidrofóbica do Th. A face hidro-fóbica da hélice anfipática é então mantida pelos resíduos hidrofóbicos em 2, 5, 8, 9, 10, 13 e 16, com variabilidade em 2, 5, 8, 9, 10, 13 e 16 para prover uma fachada com capacidade de ligar uma ampla faixa de elementos de restrição de MHC. O efeito global da característica de SSAL é aumentar a faixa de responsividade imune a um Th artificial (WO 95/11998). Todas as variantes dentro de um tal SSAL são produzidas simultaneamente em uma síntese de peptídeo de fase sólida única em tandem com o epítopo de célula B direcionado e outras seqüências.

Imunógenos de peptídeo são em geral mais flexíveis do que proteínas e não tendêm a reter qualquer estrutura preferida. Portanto, pode ser útil estabilizar um imunógeno de peptídeo pela introdução de limitações cíclicas. Um imunógeno de peptídeo corretamente ciclizado pode imitar e preserar a conformação do epítopo direcionado e desse modo evocar anticorpos com reatividades naquele sítio sobre a molécula autêntica (Moore, capítulo 2 em Synthetic Peptides A User’s Guide, ed. Grant, WH Freeman and Company: New York, 1992, págs. 63-67). Isto foi realizado para um peptídeo que representa o domínio de laço de VP1 imunodominante de FMDV, por adição de resíduos de cisteína nos terminais tanto amino quanto carbóxi e ciclização por oxidação dos dois resíduos de cisteína (WO 83/03547). No entanto, permanece uma necessidade de análogos de peptídeo mais eficazes do domínio de laço de VP1.

Peptídeos tendo conformações imunologicamente mais eficazes são providos pela presente invenção. Estes foram obtidos pela constatação daquelas posições para os resíduos de cisteína que resultam em uma imitação mais exata do epítopo nativo (Valero e outros, Biomedical Peptides, Proteinsand Nucleic Acids, 1995; 1:133-140).

Sumário da Invenção A presente invenção provê imunógenos de peptídeo que foram projetados com as tecnologias de peptídeo e elementos de projeto de peptídeo discutidos acima, isto é, mapeamento de epítopo preciso, peptídeos de biblioteca de SSAL, projeto de epítopos de Th potentes, e limitação cíclica. Estes imunógenos de peptídeo são a base para vacinas de FMDV sintéticas eficazes. Tais peptídeos são preferidos para sua apresentação do sítio de neutralização de VP1 com o posicionamento otimizado e limitação confor-macional, para sua apresentação da ampla faixa de seqüências necessitadas por variação de sorotipo de FMDV, e para sua responsividade de Th amplamente reativa. A presente invenção ulteriormente provê o uso de tais composições de peptídeo como um imunógeno, com cada peptídeo contido ali compreendendo um sítio antigênico alvo derivado da proteína de capsídeo de VP1 de Vírus de Febre Aftosa (FMDV), de preferência o dito sítio antigênico covalentemente ligado a um epítopo de célula T auxiliar e, opcionalmente, outas seqüências imunoestimuladoras, de preferência por ligação(ões) de peptídeo convencional(is) através da síntese direta, para a prevenção de infecção por FMDV e erradicação de FMD.

Mais particularmente, a presente invenção se refere ao uso de tal composição de peptídeo como um imunógeno para eliciar a produção em animais incluindo suíno, gado bovino, carneiro, cabras, e espécies selvagens suscetíveis a FMDV, de anticorpos policlonais de alto título que podem eficamente neutralizar, in vitro, múltiplas cepas ou sorotipos de FMDV, e ao uso de tal composição como uma vacina para eficazmente prevenir, e/ou reduzir a incidência de infecção por FMDV apesar de sua diversidade anti-gênica, e assim causam a erradicação de FMD. A presente invenção também se refere aos peptídeos usados nas composições, e aos imunoensaios e/ou kits de diagnósticos contendo um ou mais destes peptídeos, ou seus segmentos.

Os sítios antigênicos alvo da presente invenção foram selecionados através de mapeamento de epítopo com base na informação de se-qüência de aminoácidos derivada da proteína de VP1 de cepa de A12 de FMDV e representam um quadro para a ótima penetração do determinante de neutralização sobre a proteína de VP1 de FMDV, aminoácidos 134 a 168. Estes resíduos aparecem como aminoácidos "134-169" na tabela 1 (SEQ ID NO: 1), devido à presença de uma lacuna na posição 142 que é introduzida para as finalidades de alinhamento. Eles serão chamados no texto de aminoácidos 134-169 a título de conveniência, mas será entendido que resíduos 134-168 (SEQ ID NO: 1) é o fragmento real sob discussão.

Os sítios antigênicos alvo da presente invenção são de preferência modificados a partir daquela das seqüências de VP1 de FMDV de ocorrência natural da região de laço G-H pela substituição de cisteína para dois aminoácidos nativos, e a formação de uma ligação de dissulfeto entre estas cisteínas de modo a produzir uma estrutura cíclica tendo de cerca de 20 a cerca de 25 resíduos entre as cisteínas (por exemplo, SEQ ID NO: 2). Sítios alvo correspondentes para VP1 de outros sorotipos podem ser derivados do segmento de região de laço G-H homólogo dos sorotipos relevantes. A presente invenção ulteriormente provê sítios antigênicos alvo de VP1 de FMDV com seqüências de consenso de acordo com a estrutura otimizada de SEQ ID NO: 1 com posições altamente variáveis implantadas dentro de uma estrutura estrutural invariante em que o aminoácido mais fre-qüentemente empregado para cada uma das posições altamente variáveis é representada, como determinada por análises das seqüências de VP1 oriundas de um grupo de subtipos de FMDV relacionados com um sorotipo de FMDV específico. A presente invenção ulteriormente provê bibliotecas de antíge-nos sintéticos estruturados (ou SSAIs) de acordo com o quadro de peptídeo de antígeno alvo otimizado de SEQ ID NO: 1, em que cada SSAI é consti- tuída de um conjunto ordenado de peptídeos correlatos produzidos simultaneamente em uma única síntese de peptídeo tendo seqüências impostas em uma estrutura estrutural invariante capaz de manter a antigenicidade do peptídeo antigênico alvo.

Além disso, o sítio alvo dos peptídeos e seus análogos da presente invenção são tornados imunogênicos via ligação covalente em combinações tandem com elementos imunoestimulatórios sintéticos incluindo um peptídeo de invasina imunoestimulador (Inv) tirado de Yersinia (SEQ ID NO: 22), epíto-pos de Th promíscuos derivados de patógenos estranhos; epítopos de Th au-tólogos derivados de proteína de FMDV (por exemplo, SEQ ID NO: 24, tabela 5), epítopos de Th artificiais (por exemplo, SEQ ID N~: 25 e 26, tabela 6) e outros através da síntese direta. Peptídeos da invenção podem ser representados pelas fórmulas: em que cada A é independentemente um aminoácido ou uma seqüência imunoestimuladora geral; cada B é independentemente aminoácido ou um ligador químico como ulteriormente definido abaixo; cada Th é independentemente uma seqüência de aminoácidos que constitui um epítopo de célula T auxiliar, ou um análogo de aumento imune ou seu segmento; "antígeno de FMDV" é um antígeno de peptídeo sintético como definido ulteriormente abaixo; X é um aminoácido alfa-COOH ou alfa-CONH2; n é de 0 a cerca de 10; m é de 1 a cerca de 4; e o é de 0 a cerca de 10.

Também provido são auxiliares e/ou veículos de fornecimento e outros ingredientes rotineiramente incorporados com formulações de vacina, e instruções para a dosagem de modo que anticorpos policlonais direcionados contra o sítio antigênico alvo de VP1 de FMDV são gerados. A presente invenção refere-se ao uso de composições de peptí-deo como um imunógeno para eliciar a produção em animais incluindo suíno, gado bovino, carneiro, cabras, e espécies selvagens suscetíveis a FMDV, de anticorpos policlonais de alto título. O mecanismo de proteção de FMDV, mediado pelos anticorpos e induzido pelas composições de peptídeo da presente invenção, eficientemente neutralizará, in vitro, múltiplas cepas de FMDV apesar do sorotipo ou do subtipo, e assim levar a imunidade protetora de infecção por FMDV e auxiliar na erradicação de FMD.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra a organização do genoma de FMDV, a trajetória de processamento pela qual os produtos de tradução são clivados para dar proteína viral, e a nomeclatura para as proteínas não-estruturais e de capsídio. A figura 2A mostra a composição de aminoácido da Biblioteca de Antígenos Sintéticos Estruturados "A SSAL(1) (COMPLETA) (134-169)". Subscritos representam as quantidades relativas de cada aminoácido na posição correspondente. A figura 2B mostra a composição de aminoácido da Bibliteca de Antígenos Sintéticos Estruturados "A SSAL(1) (COMPLETA) [134(N -> C)-158 (Q -> C)-169]". A figura 3A mostra a composição de aminoácido da Bibliteca de Antígenos Sintéticos Estruturados "A SSAL(2) (COMPLETO) [134-169]". A figura 3B mosta a composição de aminoácido da "A SSAL(2) (COMPLETA) [134(N -> C)-158 (Q -> C)-169]". A figura 4A mostra a composição de aminoácido da Bibliteca de Antígenos Sintéticos Estruturados "0 SSAL (COMPLETO) [134-169]". A figura 4B mostra a composição de aminoácido da Bibliteca de Antígenos Sintéticos Estruturados "O SSAL (COMPLETA) [134-158(T -> C) -169]".

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se ao uso de uma composição de peptídeo como um imunógeno, a dita composição compreendendo um ou de preferência mais peptídeos, com cada peptídeo contido aqui compreendendo um peptídeo antigênico alvo derivado da proteína de capsídeo de VP1 de Vírus de Febre Aftosa (FMDV), o dito peptídeo antigênico de preferência estando covalentemente ligado a um epítopo de célula T auxiliar e opcionalmente a outras seqüências imunoestimiladoras. A ligação covalente é de preferência por ligação(ões) de peptídeo gerada(s) através da síntese direta.

As composições de peptídeo são úteis para a prevenção de infecção por FMDV em animais, e são esperadas auxiliar na erradicação de FMD. Mais particularmente, a presente invenção se refere ao uso de tais composições de peptídeo como imunógenos para eliciar a produção em animais, incluindo, suíno, gado bovino, carneiro, cabras e espécies selvagens suscetíveis, de anticorpos policlonais de alto título que podem efica-zemente neutralizar, in vitro, múltiplas cepas ou sorotipos de FMDV, e ao uso de tais composições como uma vacina para prevenir infecção por FMDV apesar de sorotipos, e assim o efeito de erradicação de FMD. A presente invenção também se refere aos peptídeos usados nas composições, e aos imunoensaios e/ou kits de diagnósticos contendo um ou mais destes peptídeo, ou seus segmentos. Imunoensaios e/ou kits de diagnósticos contendo um ou mais destes peptídeo, ou seus segmentos, serão úteis para identificar anticorpos induzidos por vacina e anticorpos induzidos por infecção, e assim podem ser usados para triar quanto a presença de infecção por FMDV e/ou para monitorar a eficácia de um programa de vacinação. A invenção provê um método de diagnose de infecção por FMDV em um mamífero, compreendendo as etapas de: (a) ligação de um peptídeo de acordo com a reivindicação 1 a um suporte sólido, (b) exposição do dito peptídeo ligado ao dito suporte sólido a uma amostra contendo anticorpos a partir do dito mamífero, sob condições úteis a ligação do anticorpo ao peptídeo, e (c) detecção da presença de anticorpos ligados ao dito peptídeo ligado ao dito suporte sólido. A seqüência antigênica direcionada compreendendo o determinante de neutralização principal de VP1 de FMDV (o laço G-H) foi otimizada com base na consideração de conformação de laço pontencial e exposição de superfície para resíduos do laço G-H, como deduzido a partir da estrutura tridimensional de VP1 de FMDV tornada disponível pela Brookhaven National Laboratory no endereço na internet htpp://www.pdb.bnl.gov./pdb.bin/pdbids e relatado em Acharva e outros, Nature 337: 709-711, 1989. Posições de candidato para ciclização foram incorporadas no projeto de construtos de peptídeo e seqüências modificadas e não-modificadas foram sintetizadas como imunógenos por ligação covalente a epítopos de Th promíscuos com ou sem outros elementos imunoestimuladores, por síntese contínua. Os construtos de peptídeo modificados foram sintetizados como peptídeos cíclicos, com a incorporação de ligações de dissulfeto específicos, de modo a estabilizar os peptídeo móveis em conformações potencialmente mais biologicamente relevantes. Construtos sintéticos compreendendo sítios antigêni-cos de VP1 de imunogenicidade relevantes foram identificados pela preparação de soros hiperimunes e testagem dos soros quanto a sua potência em ensaios de neutralização de FMDV. Especificamente, os sítios antigênicos alvo da presente invenção foram selecionados através de mapeamento de epítopo com base na seqüência de aminoácidos da proteína de VP1 de cepa de FMDV A12 (exemplo 2). O quadro para os peptídeo de antígeno alvo, AA134-169 mostrado na tabela 1 por SEQ ID NO: 1 demonstrou ser ótimo para apresentação do determinante de neutralização de laço G-H sobre VP1 de FMDV. Os sítios antigênicos alvo dos peptídeo antigênicos podem ser modifiados a partir daquele das seqüências de VP1 de FMDV de ocorrência natural pelo uso como substituto para arpargina nativa na posição 134 e glutamina na posição 157 por cisteínas e a formação de uma ligação de dissulfeto entre as cisteínas substituintes de modo a produzir uma estrutura cíclica (SEQ ID NO: 2). A ditas estruturas cíclicas também compreendem de 1 a 13 aminoá-cidos adicionais tirados de quaisquer terminais C do segmento de 134-157 de VP1 com a condição de que a estrutura de laço de dissulfeto simples seja preservada como mostrada na tabela 1 por SEQ ID NO: 3. Como um exemplo de um peptídeo antigênico alvo da presente invenção é provido um sítio alvo para VP1 de FMDV tendo a seguinte seqüência (substituintes de cisteína são indicados em negrito): Cys-Lys-Tyr-Ser-Ala-Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Arg-Gly-Asp-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Pro-Arg-Val-Ala-Arg-Cys-Leu-Pro-Ala-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-lle-Lys (SEQ ID NO.:2) Do mesmo modo, sítios alvo correspondentes para VP1 de outros sorotipos podem ser derivados do segmento homólogo dos sorotipos relevantes. Por exemplo, análogos de peptídeo de substituição podem ser preprados de acordo com as seqüências correspondentes de sorotipos de FMDV O e Ásia até o alinhamento de seqüência como mostrado na tabela 1 tendo as seqüências respectivas de: Cys-Lys-Tyr-Ser-Ser-Lys-Ala-Val-Pro-Asn-Val-Arg-Gly-Asp-Leu-Asn-Val-Leu- Glu-GIn-Lys-Ala-Ala-Arg-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-lle-Lys (SEQ ID NO:5) e Cys-Pro-Tyr-Gly-Glu-Thr-Thr-Ser-Arg-Arg-Gly-Asp-Met-Ala-Ala-Leu-Ala-Gln- Arg-Leu-Ser-Ala-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Val-Lys (SEQ ID NO:7) A presente invenção ulteriormente provê peptídeos antigênicos alvo de VP1 de FMDV de acordo com o quadro otimizado de SEQ ID NO: 1 (AA134-169) com posições altamente variáveis impostas em uma estrutura estrutural invariente em que o aminoácido mais freqüentemente empregado para cada uma das posições altamente variáveis é representado, como determinado por análises das seqüências de VP1 a partir de um grupo de vírus relacionados com um sorotipo de FMDV específico. Como exemplos de tais seqüências de consenso da presente invenção, são providos seis sequências de consenso derivadas de variantes de FMDV de sorotipo A (SEQ ID N~: 8, 9), de sorotipo O (SEQ ID N~: 10,11) e de sorotipo Asia (SEQ ID N“: 12, 13) como mostrados na tabela 1. A presente invenção ulteriormente provê bibliotecas de antíge-nos sintéticos estruturados (ou SSALs), ciclizadas e lineares, de acordo com o quadro de peptídeo de antígeno alvo otimizado de SEQ ID NO: 1, em que cada SSAL é constituída de um conjunto ordenado de peptídeos correlatos produzidos simultaneamente em um síntese de peptídeo simples tendo seqüências impostas em uma estrutura estrutural invariante capaz de manter a antigenicidade do peptídeo antigênico alvo. Como exemplos de tais SSALs da presente invenção, são providos nove SSALs com as seqüências de compósi-tos derivadas de grupos de subtipos de FMDV de sorotipo A (SEQ ID 14-17), de sorotipo O (SEQ ID N-: 18,19) e de sorotipo Asia (SEQ ID N~: 20, 21, 35) das tabelas 2, 3, 4 e 10, respectivamente.

Os sítios de VP1 alvo são seqüências de peptídeos curtas. Quando sintetizados por eles próprios como peptídeos da invenção tais peptídeos são usualmente imunógenos fracos. Estes peptídeos curtos podem ser imunopotenciados por ligação química a epítopos de Th promíscuos derivados de patógenos estranhos incluindo mas não limitados a, como exemplos, epítopos de célula T auxiliar de antígeno de núcleo e superfície de hepatite B (HBsTh e HBcTh), epítopos de célula T auxiliar de toxina de coqueluche (Th de PT), epítopos de célula T auxiliar de toxina de tétano (Th de TT), epítopos de célula T auxiliar de proteína F de vírus de sarampo (Th de MVF), epítopos de célula T auxiliar de proteína de membrana externa principal trachomatis (Th de CT), epítopos de célula T auxiliar de toxina de difteria (Th de DT), epítopos de célula T auxiliar de circunsporozóites de Plasmodium falciparum (Th de PF), epítopos de célula T auxiliar de isome-rase de fosfato de triose de Schistosoma mansoni (Th de SM), e os epítopos de célula T auxiliar de TraT de Escherichia coli (Th de TraT). O Th derivado de patógeno selecionado aqui como exemplos representativos de Th promíscuo foram listados como SEQ ID N°s: 2-9 e 45-52 na patente U.S. N° 5.759.551; como sítio auxiliar de Chlamydia P11 em Stagg e outros, Immunolgoy, 1993; 70:1-9; e peptídeo de HBc 50-69 em Ferrari e outros, J Clin Invest, 1991; 88: 214-222, e são incorporados aqui por referência. Th promíscuo também inclui epítopos de Th autólogos derivados de proteínas de FMDV (tabela 5, por exemplo, SEQ ID NO: 24) incorporados aqui por referência, ou epítopos de Th artificiais projetados como mostrado na tabela 6, por exemplo, SEQ ID N5S: 25, 26, 36, 37 e 38.

Os imunógenos da invenção são todos de imunoreatividade específica de sítio para prover direcionamento preciso de determinante de neutralização principal de FMDV. Exemplos específicos são providos como peptídeos preferidos da invenção que provêem a ligação de elementos imunoestimuladores sintéticos aos sítios de VP1 de FMDV (por exemplo, SEQ ID N?s: 27-34 nas tabelas 7-10) tal que população de hospedeiro geneticamente diversa, contra o sítio alvo sobre a proteína de VP1 de FMDV. Estes anticorpos de anti-VP1 levam a neutralização eficaz de FMDV e assim proteção contra infecção por FMDV.

Para imunização ativa, o termo "imunógeo" mencionado aqui refere-se a uma composição de peptídeo que é capaz de induzir anticorpos contra um sítio de laço G-H sobre a proteína de VP1 de FMDV, que leva a neutralização eficaz de FMDV de múltiplos sorotipos e assim prevenção de infecção por FMDV. A composição de peptídeo da presente invenção de preferência inclui peptídeos sintéticos que contêm epítopos de célula T auxiliar promíscuos (epítopos de Th) e opcionalmente outros elementos imunoestimuladores. Os peptídeo de Th estão covalentemente ligados ao sítio antigênico alvo de VP1 de FMDV (por exemplo, SEQ ID Nes: 1-21, 35), com um espa-çador (por exemplo, Gly-Gly), de modo a ser adjacente ao terminal ou C ou N do sítio antigênico alvo, a fim de evocar respostas de anticorpo eficazes. O imunógeno pode também compreender seqüências de aminoácidos imunoestimuladores gerais, por exemplo, que correspondem a um domínio de uma proteína invasina oriunda das bactérias spp (Brett e outros, Eur J Immunol, 1993, 23: 1608-1614) (SEQ ID NO: 22). Quando presente, o do- mínio imunoestimulador geral pode incluir um espaçador para a ligação através de um peptídeo.

Os peptídeos desta invenção podem ser representados pelas fórmulas: em que cada A é independentemente um aminoácido ou uma seqüência imunoestimuladora geral; cada B é independentemente escolhido do grupo que consiste em aminoácidos, NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(e-N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil)(s-N)Lys-, e-NHCH(X)CH2S-(succinimidila)-; cada Th é independentemente uma seqüência de aminoácidos que constitui um epítopo de célula T auxiliar, ou um análogo de aumento imune ou seu segmento; "antígeno de FMDV" é um antígeno de peptídeo sintético como definido ulteriormente abaixo; X é um aminoácido alfa-COOH ou alfa-CONH2; n é de 0 a cerca de 10; m é de 1 a cerca de 4; e o é de 0 a cerca de 10. O imunógeno de peptídeo da presente invenção compreende de cerca de 35 a cerca de 100 resíduos de aminoácidos, de preferência de cerca de 45 a cerca de 90 resíduos de aminoácidos e mais de preferência de cerca de 50 a cerca de 75 resíduos de aminoácidos.

Quando A é um aminoácido, ele pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural ou qualquer aminoácido de ocorrência não natural.

Aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não são limitados a, beta-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido s-amino butírico, homosserina, citrulina e semelhantes. Aminoácidos de ocorrência natural incluem alanina, arginina, aspargina, ácido aspártico, cisteí-na, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, sèrina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Além do mais, quando m é maior do que um, e dois ou mais dos grupos A são aminoácidos, então cada aminoácido pode ser independentemente igual ou diferente.

Quando A é um domínio de invasina, ele é um epítopo estimu-latório imune oriundo da proteína de invasina de uma espécie Yersinia. Esta propriedade estimuladora imune resulta da capacidade deste domínio de invasina de interagir com as moléculas de betai integrina presentes sobre as células T, particularmente células T de memória ou imunes ativadas. A seqüência específica para um domínio de invasina demonstrou interagir com as betai integrinas foi descrita por Brett e outros (Eur J Immunol 1993). Uma concretização preferida do domínio de invasina (Inv) para a ligação a um epítopo de Th promíscuo foi anteriormente descrista na patente U.S. Ns 5.759.551, que é incorporada aqui por referência. O domínio de Inv preferido tem a seqüência Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-GIn-Phe (SEQ ID NO: 22) ou é um seu homólogo estimulador imune oriundo da região correspondente em uma outra espécie de Yersinia. Tais homólogos assim podem conter substituições, deleções ou inserções de resíduos de aminoácidos para acomodar cepa para variação de cepa, com a condição de que os homólogos retenham propriedades estimuladoras imune. (A)n de preferência inclui um espaçador, por exemplo, Gly-Gly, através do qual o domínio de Inv está ligado ao peptídeo. Em uma concretização, (A)3 é um domínio de invasina (Inv), glicina e glicina, pelo fato de que a ordem, isto é, (Inv)-Gly-Gly. B é um espaçador e é um aminoácido que pode ser aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural como descrito acima. Cada B é independentemente igual ou diferente. Os aminoácidos de B po- dem também prover um espaçador, por exemplo, GLy-Gly, entre o epítopo de Th promíscuo e o sítio antigênico de VP1 de FMDV (por exemplo, SEQ ID N°s: 1-21 e 35) ou um seu análogo imunologícamente funcional e reativo. Além da separação física o epítopo de Th do epítopo de célula B, o espaçador Gly-Gly pode romper quaisquer estruturas secundárias artificiais criadas pela união do epítopo de Th com o antigênico de VP1 de FMDV desse modo eliminar a interferência entre as respostas de célula B e/ou Th. Os aminoá-cidos de B podem também formar um espaçador que age como uma junta flexível que aumenta a separação do sítio antigênico alvo de VP1 de FMD e Th. Exemplos de sequências que codificam juntas flexíveis são encontradas na região de junta de cadeia pesada de imunoglobulina. Seqüências de junta flexível são freqüentemente ricas de prolina. Uma junta flexível particularmente útil é provida pela sequência Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 23), onde Xaa é qualquer aminoácido, e de preferência ácido aspártico. A separação conformacional provida pelos aminoácidos de B permite mais interações eficientes entre o imunógeno de peptídeo apresentado e as células B e células de Th apropriadas e assim aumentam as respostas imunes ao epítopo de Th e o epítopo de eliciação de anticorpo.

Th é uma seqüência de aminoácidos (aminoácidos naturais ou não naturais) que compreende um epítopo de Th. Um epítopo de Th pode consistir de um epítopo descontínuo ou contínuo. Portanto nem todo o aminoácido de Th é necessariamente parte do epítopo. Correspondentemente, epítopos de Th, incluindo análogos e segmentos de epítopos de Th, são capazes de aumentar ou de estimular uma resposta imune ao sítio antigênico de VP1 de FMDV (por exemplo, SEQ ID N~: 1-21, 35) e seus análogos imunologícamente funcionais. Os epítopos de Th que são imunodominantes e promísucos são altamente e amplamente reativos em populações de ser humano e de animais com tipos de MHC amplamente divergentes (Partidos e outros, 1991; a patente U.S. N° 5.759.551). O domínio de Th dos presentes peptídeos tem de cerca de 10 a cerca de 50 aminoácidos e de preferência de cerca de 10 a cerca de 30 aminoácidos. Quando múltiplos de epítopos de Th estão presentes (isto é, m > 2), então cada epítopo de Th é inde- pendentemente igual ou diferente. Os segmetnos são porções contíguas de um epítopo de Th que são suficientes para aumentar ou estimular uma resposta imune ao sítio antigênico de VP1 de FMDV.

Os epítopos de Th da presente invenção incluem como exemplo, mas não limitados a, Th derivados de patógenos estranhos, por exemplo, Th de HBs, Th de HBc, Th de PT, Th de TT, Th de MVF, Th de CT, Th de DT, Th de DF, Th de SM e Th de Tra; Th autólogos oriundos das proteínas de FMDV (tabela 5, por exemplo, SEQ ID NO: 24), Th artificial projetado (por exemplo, tabela 6, SEQ ID N-: 25, 26, 36, 37 e 38), e análogos imuno-logicamente funcionais. Análogos de Th imunologicamente funcionais incluem análogos de aumento imune, análogos reativos e segmetnos de qualquer um destes epítopos de Th. Análogos de Th imunologicamente funcionais de preferência incorporam substituições, adições, deleções e inserções conservadoras de desde um a cerca de 10 resíduos de aminoácidos no epítopo de Th que não essencialmente modificam a função de estimulação de Th do epítopo de Th. "Sítio antigênico de VP1 de FMDV" refere-se a aminoácidos 134-168 da proteína de VP1 de cepa Ai2 de FMDV (isto é, SEQ ID NO: 1), e a peptídeos que são fragmentos da proteína de VP1 de cepas de FMDV outras que não a cepa de A12 de FMDV que são homólogas a aminoácidos 134-168 da proteína de VP1 de cepa A12 de FMDV. O sítio antigênico de VP1 de FMDV também se refere a peptídeos tendo uma seqüência de consenso derivada da seqüência de aminoácidos da proteína de VP1 de cepas de FMDV de sorotipos A, O ou Asia, que correspondem a aminoácidos 134-168 da proteína de VP1 de cepa Ai2 de FMDV; e peptídeo que satisfaçam as definições genéricas de SEQ ID Nes: 14,16,18 e 20. Sítio antigênico de VP1 de FMDV também se refere a peptídeos que são membros de uma SSAL, como definido aqui.

Análogos imunologicamente funcionais e reativos dos sítios an-tigênicos de VP1 de FMDV (SEQ ID Nes: 1-21, 35) de acordo com a invenção, podem ulteriormente compreender substituições, adições, deleções ou inserções de desde um a cerca de quatro resíduos de aminoácidos com a condição de que os análogos de peptídeo sejam capazes de eliciar respostas imunes reativas com os sítios antigênicos de VP1 de FMDV (SEQ ID Nf: 1-21 e 35). Inserções, adições e substituições conservadoras podem ser realizadas com aminoácidos naturais ou não naturais como definidos aqui.

Os sítios antigênicos alvos são de preferência modificados a partir daquele das seqüências de VP1 de FMDV de ocorrência natural da região de laço G-H pelas substituições para a aspargina nativa na posição 134 e glutamina na posição 157 pelas cisteínas, e a formação de uma ligação de dissulfeto entre estas cisteínas de modo a produzir uma estrutura cíclica (SEQ ID NO: 2). Estas estruturas cíclicas podem também compreender de 1 a 13 aminoácidos adicionais tirados de cada terminal do segmento 134-157 de VP1 com a condição de que a estrutura de dissulfeto simples é preservada (SEQ ID NO: 3). Modificações a partir de seqüências nativas são indicadas por (N->C), (Q->C), (R->C) e por aminoácidos sublinhados, na tabela 1. Seqüências de peptídeos contendo cisteínas introduzidas podem ser providas como SSALs, por exemplo, SEQ ID N5S: 15, 17, e 19 e estas SSALs podem ser usadas como sítios antigênicos de VP1 de FMDV também.

Correspondentemente, imunógenos de peptídeo preferidos desta invenção são os peptídeos contendo os sítios antigênicos de VP1 de FMDV (por exemplo, SEQ ID N-: 1-21 e 35) ou seus análogos imunologicamente funcionais e peptídeo de Th. Os imunógenos de peptídeo preferidos são aqueles construtos contendo um sítio antigênico de VP1 de FMDV ou um seu análogo imunologicamente funcional; um espaçador (por exemplo, Gly-GLy); um epítopo de Th que é um Th de HBs, Th de HBc, Th de MVF, Th de PT, Th de TT, um Th de FMDV autólogo (por exemplo, SEQ ID NO: 24) ou um Th artificial (por exemplo, SEQ ID N-: 25, 26, 36, 37 e 38), ou um seu análogo; e opcionalmente, um domínio de Inv (SEQ ID NO: 22) ou seu análogo.

Vacinas que contêm coquitéis dos presentes imunógenos de peptídeo com dois ou mais dos epítopos de Th podem aumentar imunoefici-ência em uma população mais ampla e assim prover uma resposta imune aperfeiçoada ao sítio antigênico de VP1 de FMDV.

Os imunógenos de peptídeo desta invenção podem ser produzidos por métodos de síntese de químicos que são bem conhecidos por aquele especialista normalmente versado. Ver, por exemplo, Fields e outros, capítulo 3 em Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, pág. 382. Portanto, peptídeos podem ser sintetizados usando-se as técnicas de Merrifield automatizadas de síntese de fase sólida com o alfa-NH2 protegido por química ou de T-boc ou de Fmco usando-se aminoácidos protegidos por cadeia lateral sobre, por exemplo, um Sintetizador de Peptídeo de Biossistema Aplicado modelo 430A ou 431. Preparação de construtos de peptídeo compreendendo bibliotecas de antí-genos sintéticos estruturados (SSALs) para quaisquer epítopos de célula T e B podem ser realizados por provisão de uma mistura de aminoácidos alternativos para a acoplagem em uma dada posição variável, na razão apropriada como especificada no projeto.

Depois da montagem completa do imunógeno de peptídeo desejado, a resina é tratada de acordo com os procedimentos padrão para cli-var o peptídeo da resina e desbloquear os grupos funcionais sobre as cadeias laterais de aminoácido. O peptídeo livre é purificado por HPLC e é caracterizado bioquimicamente, por exemplo, por análise de aminoácido ou por seqüênciação. Métodos de purificação e caracterização para peptídeo são bem conhecidos por aquele normalmente versado na técnica.

Outro meio químico para gerar os construtos de peptídeo da invenção contendo laços G-H de VP1 e sítios de Th incluem a ligação do peptídeo haloacetilado e cisteinilado através da formação de uma ligação de "tioéter". Por exemplo, uma cisteína pode ser adicionada ao terminal C de um peptídeo contendo Th e o grupo tio de cisteína pode ser usado para formar uma ligação covalente para dar um grupo eletrofílico tal como um um grupo modificado por Nalfa cloroacetila ou alfa- ou ?-NH2 derivado por malei-mida de um resíduo de lisina ligado ao terminal N de um sítio antigênico de VP1 de FMDV (por exemplo, SEQ ID N“: 1-21 ou seus análogos imunologi-camente funcionais e reativos. Deste modo, um construto com Th-(sítio antigênico de VP1 de FMDV) ou seu reverso, (sítio antigênico de VP1 de FMDV)-Th, pode ser obtido.

Os presentes imunógenos podem também ser polimerizados. Poli-merização pode ser realizada, por exemplo, por reação do imunógeno com um agente de reticulação, por exemplo, por reação entre glutaraldeído e os grupos -NH2 de resíduos de lisina, usando-se metodologia rotineira. Por um outro método, um imunógeno sintético, tal como, por exemplo, "(A)n-Thm-Gly-GLy-(sítio antigênico de VP1 de FMDV)-X", pode ser polimerizado ou co-polimerizado com um outro imunógeno por utilização de uma cisteína adicional adicionada ao terminal N do imunógeno sintético. O grupo tiol de cisteína N-terminal pode ser usado para a formação de uma ligação de "tioés-ter" com um grupo alfa-NH2 ou ε-ΝΗ2 derivado por maleimida ou aminoácido modificado por haloacetila de um resíduo de lisina que está ligado ao terminal N de uma molécula de núcleo de poli-lisila ramificada (por exemplo, K2K, «4K2K ou KeK4K2K). O presente imunógeno pode também ser preparado como um polímero ramificado através de síntese do construto de peptídeo desejado diretamente sobre uma resina de núcleo de poli-lisila ramificada (Wang e outros, Science, 1991; 254: 285-288).

Alternativamente, os imunógenos de peptídeo sintéticos mais longos podem ser sintetizados por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas. Muitos manuais padrão sobre tecnologia de clonagem molecular provêem protocolos detalhados para produzir os peptídeos da invenção por expressão de RNA e DNA recombinantes. Para construir um gene que codifica um peptídeo desta invenção, a sequência de aminoácidos é traduzida reversa em uma seqüência de ácidos nucléicos, de preferência usando-se códon otimizado para o organismo em que o gene será expresso. A seguir, um gene que codifica o peptídeo é produzido, tipicamente por sintetização de oligonucleotídeos de sobreposição que codificam o peptídeo e elementos reguladores necessários. O gene sintético é montado e é inserido no vetor de expressão desejado. As sequências de ácidos nucléicos sintéticas incluídas por esta invenção incluem aquelas que codificam os peptídeos da invenção, análogos e homólogos imunologicamente funcionais, e construtos de ácido nucléico caracterizados por mudanças nas seqüências de não co- dificação que não alteram as propriedades imunogênicas do peptídeo codificado desse modo. Ácidos nucléicos que compreendem seqüências que codificam os peptídeos desta invenção são também providos. O gene sintético é inserido em um vetor de clonagem adequado e recombinantes são obtidos e caracterizados. O peptídeo é então expresso sob condições apropriadas para o sistema de expressão selecionado e hospedeiro. O peptídeo é purificado e é caracterizado por métodos padrão. A eficácia da composição de peptídeo da presente invenção pode ser estabelecida por injetar um animal, por exemplo, cobaia e suíno, com uma formulação de imunógenos (por exemplo, SEQ ID N~: 27-34, 36) seguido por monitoração da resposta imune humoral ao sítio antigênico de VP1 de FMDV (por exemplo, SEQ ID N~: 1-21, 35, e seus homólogos imunologicamente funcionais e reativos), como exemplificado nos exemplos.

Um outro aspecto desta invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um ou mais dos imunógenos de peptídeo desta invenção em um sistema de fornecimento farmaceuticamente aceitável. Correspondentemente, os presentes peptídeos podem ser formulados como uma composição de vacina usando-se auxiliares, veículos farmaceuticamente aceitáveis ou outros ingredientes rotineiramente providos em composições de vacina. Entre os ingredientes que podem ser usados nesta invenção são auxiliares ou emulsificadores incluem alume, auxiliar de Freund incompleto, liposina, saponina, esquale-no, L121, emulsigênio, lipídio A de monofosforila (MPL), QS21, ISA 35, ISA 206 e ISA 720 bem como outros emulsificadores e auxiliares eficazes. As formulações incluem formulações para liberação imediata e/ou para liberação sustentada, e para indução de imunidade sistêmica e/ou indução de imunidade mucosal localizada, que pode ser realizada por, por exemplo, aprisionamento de imunógeno por ou co-administração com micropartículas. Tais formulações são prontamente determinados por aquele normalmente versado na técnica. As presentes vacinas podem ser administradas por qualquer rota conveniente incluindo subcutânea, oral, intramuscular, ou outra rota parenteral ou enteral. Similarmente as vacinas podem ser adminis- tradas como uma dose única ou múltiplas doses. Escalas de imunização são prontamente determinadas pelo especialista normalmente versado.

Os ácidos nucléicos desta invenção podem por si próprios ser úteis como componentes de "vacinas de DNA" assim chamadas. Nesta modalidade da invenção, expressão dos peptídeo imunogênicos da invenção é induzida nas próprias células do paciente, por introdução para dentro daquelas células de ácidos nucléicos que codificam os peptídeos. Métodos de produção e uso de vacinas de DNA são revelados nas patentes U.S. n- 5.580.859, 5.589.466 e 5.703.055; ver também a WO 97/02840 e W. McDonnell and F. Askari, New Engl. J. Med., 1996, 334:2-45, todos os quais são incorporados aqui por referência. Tais métodos de produção e uso dos peptídeos e de conjugados de peptídeo desta invenção são contemplados estarem dentro do escopo desta invenção. A composição de vacina da presente invenção contém uma quantidade eficaz de um ou mais dos imunógenos de peptídeo da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma tal composição em uma forma por unidade de dosagem adequada em geral contém cerca de 0,5 μg a cerca de 1 mg do imunógeno por kg de peso de corpo. Quando fornecida em múltiplas doses, pode ser convenientemente dividida em uma quantidade apropriada por forma por unidade de dosagem. Por exemplo, uma dose inicial, por exemplo, de 0,2-2,5 mg; de preferência 1 mg de imunógeno representado como uma composição de peptídeo da presente invenção, deve ser administrado por injeção, de preferência intramuscular-mente, seguido por doses de repetição (reforçadora). A dosagem depdende-rá da idade, do peso e da saúde geral do indivíduo como é bem conhecido nas técnicas de vacina e terapêuticas. A resposta imune aos imunógenos de sítio antigênico de VP1 de FMDV pode ser aperfeiçoada por fornecimento através do aprisionamento em ou sobre micropartículas biodegradáveis do tipo descrito por 0’Hagan e outros (Vaccine, 1991; 9: 768-771). Os imunógenos podem ser encapsula-dos com ou sem um auxiliar nas micropartículas biodegradáveis, para po-tenciar respostas imunes, incluindo imunidade mucosal localizada, e para prover liberação controlada de tempo para respostas periódicas ou sustentadas, para a administração oral, e para a administração tópica (0’Hagan e outros, 1991; e, Eldridge e outros, Molec. Immunol, 1991; 28:287-294).

Tais composições de peptídeo são úteis para induzir anticorpos de neutralização a FMDV e como vacinas para a prevenção e erradicação de FMD.

Composições e imunógenos de peptídeo específicos são providos nos seguintes exemplos para ilustrar a invenção. Estes exemplos são para a finalidade de ilustração apenas, e não devem ser interpretados como limitante do escopo da invenção de maneira alguma.

Os peptídeos antigênicos alvo dos exemplos foram sintetizados pela método de fase sólida delineado no exemplo 1. O sítio antigênico de VP1 de FMDV é exemplificado por peptídeos ciclizados e lineares ajustados a partir de isolados virais conhecidos, incluindo análogos e homólogos de peptídeo oriundos de outros sorotipos e subtipos de FMDV (por exemplo, SEQ ID N~: 1-7) e sítios de consenso (por exemplo, SEQ ID N~: 8-13) e peptídeos de SSAL (por exemplo, SEQ ID 14-21 e 35). Cada peptídeo usado para estes exemplos tem espaçadores Gly-Gly entre os elementos imunogênicos (por exemplo, SEQ ID NO: 30-32) mas peptídeos da invenção podem também ter outros espaçadores (por exemplo, SEQ ID NO: 23) ou nenhum espaçador. Th inclui sítios auxiliares promíscuos derivados de pa-tógenos estranhos tais como vírus de hepatite B e outros incorporados aqui por referência, Th autólogo oriundo de FMDV (por exemplo, SEQ ID NO: 24), e Th artificial (por exemplo, SEQ ID N~: 25, 26 e 36-38). Peptídeos destes exemplos também incluem um sítio imunoestimulador geral opcional (por exemplo, SEQ ID NO: 22).

Exemplo 1 Procedimentos Típicos para Avaliação de Peptídeos Antigênicos Alvo Peptídeos sintéticos relacionados com FMDV

Peptídeos com sequência derivada do domínio de laço G-H de FMDV de VP1 foram sintetizados por técnica de síntese de fase sólida de Merrifield sobre sintetizadores de peptídeo automatizados Applied Biosys- tems (modelos 430, 431 e 433A) usando-se química de Fmoc. Preparação de construtos de peptídeo compreendendo bibliotecas de antígenos sintéticos estruturados (SSALs) para epítopos de célula ou Th ou B, por exemplo, "O SSAL" (SEQ ID NO: 19) ou "1, 4, 9 PALINDROMIC Th" (SEQ ID NO: 26), foi realizada por provisão de uma mistura de aminoácidos alternativas para o acoplamento em uma dada posição variável, na razão apropriada como especificada nas fórmulas de projeto para as SSALS como mostradas nas tabelas 2, 3, 4, 6 e 10 ou em uma proporção equimolar se não especificada na fórmula de projeto. Depois da montagem completa do peptídeo desejado, a resina foi tratada de acordo com o procedimento padrão usando-se ácido trifluoroacético para clivar o peptídeo da resina e desbloquear os grupos de proteção sobre as cadeias laterais de aminoácido. Para peptídeos cíclicos, o peptídeo clivado foi dissolvido em DMSO a 15% em água por 48 horas para facilitar a formação de ligação de intradissulfeto entre as cisteínas. Os peptídeos clivados, extraídos e lavados foram purificados por HPLC e foram caracterizados por espectrometria de massa e HPLC de fase reversa. Eles devem ser usados ou como imunógenos para o desenvolvimento de vacina ou como substrato antigênico para avaliação de sua reatividade com soros obtidos a partir de animais imunizados.

Imunizações de Cobaia e Suíno Grupos experimentais de três cobaias Ducan Hartley (fêmeas, 9 semanas de idade, 450 gm, livre de vírus), e suíno (fêmea, 9 semanas de idade) foram usados em estudos de imunogenicidade de imunógenos de peptídeo antigênicos alvo de VP1 de FMDV sintéticos. Cada animal foi imunizado intramuscularmente com 100 μg por dose de uma vacina de FMDV contendo uma composição de peptídeo da invenção, ou um único peptídeo antigênico alvo ou uma sua mistura, emulsificada em uma formulação auxiliar específica nas semanas 0 e 3. Os animais foram sangrados nas semanas 0, 3, 5 e 8 ou 10 para testagem de imunogenicidade.

Avaliação de Imunogenicidade A testagem de imunogenicidade dos imunógenos de peptídeo antigênicos alvo sintéticos foi por EIISA com base em peptídeo de VP1 de FMDV sintético usando-se peptídeos antigênicos alvo de VP1 de FMDV correspondente contendo apenas o sítio de neutralização alvo apenas como antígeno de fase sólida. Soros de animais experimentais diluídos em série foram testados e títulos positivos foram expressos como Log10 da diluição recíproca. Amostras soropositivas foram combinadas por grupo e testagem de imunogenicidade foi prolongada por determinações de atividade de neutralização contra vários isolados de FMDV como descritos abaixo. ELISAs com Base em Peptídeo VP1 Sintético (AA134-168) ELISAs com base em peptídeo foram conduzidas em placas de 96 cavidades revestidas por incubação por 1 h a 37°C com peptídeos de sítios de VP1 de FMDV a 5 pg/ml usando-se 100 μΙ por cavidade em 10 ml de tampão de NaHC03, pH 9,5. As cavidades revestidas por peptídeo foram incubadas com 250 μΙ de 3% em peso de gelatina em PBS a 37°C por 1 hora para bloquear sítios de ligação de proteína não-específicos, foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,05% em volume de Tween 20 e então foram secas. Amostras de teste foram diluídas com PBS contendo 20% em volume de soro de cabra normal, 1% em peso de gelatina e 0,05% em volume de TWEEN em diluições de 1:20 de volume para volume a não ser que de outra maneira indicada. 100 μΙ da amostra diluída foram adicionados a cada uma das cavidades e foram deixados reagir por 1 h a 37°C. As cavidades foram então lavadas seis vezes com 0,05% em volume de Tween 20 em PBS para remover anticorpos marcados não-ligados. 100 μΙ de IgG de anti-suíno ou de anti-cobaia de cabra marcado por peroxidase de rábano picante em ótima diluição pré-determinada em 1% em volume de soro de cabra normal, 0,05% em volume de TWEEN 20 em PBS foi adicionado a cada cavidade e foi incubado a 37°C por 15 minutos. As cavidades foram lavadas seis vezes com 0,05% em volume de TWEEN 20 PBS para remover conjugado de anticorpo marcado não-ligado e foram reagidas com 100 μΙ da mistura de substrato contendo 0,04% em peso de ortofenilenodiamina (OPD) e 0,12% em volume de peróxido de hidrogênio em tampão de citrato de sódio pH 5,0, por 15 minutos. Reações foram paradas pela adição de 100 μΙ de H2S04 a 1,0 M e a absorbância a 492 nm (A^) foi medida. Títulos de ELISA, expressos como Logio, foram calculados com base na análise de regressão linear das absorbâncias, corte de A492nm ajustado a 0,5.

Vírus de FMDV

As várias cepas de FMDV (por exemplo, A12 e A24 de sorotipo A, Oi, 02 de sorotipo O, etc.) foram desenvolvidas em monocamadas de células de rim de hamster bebê, e foram purificadas, sob restrição no Centro de Doença de Animal em Plum Island, USDA (Greenport, NY) essencialmente como descritas por Brown and Cartwright (J Gen Microbiol, 1963; 31:179-186), com um tratamento do pélete ou por SDS a 1% ou Nonidet P-40 a 1% antes da centrifugação através de uma gradiente sacarose a 15-45%. Picos de vírus purificados foram identificados e foram isolados por bombeamento dos conteúdos de cada tubo de centrífga através da célula de fluxo de um conjunto de espetrofotômetro a 260 nm.

Avaliação Sorológica de Atividade de Neutralização de FMDV

Amostras de soro foram processadas a partir de sangue coletado a partir de suíno (veia cava craniana) e cobaias (punção cardíaca) e foram mantidas a -20°C até que fossem testadas. Enumeração dos vírus neutralizados por uma diluição de 1:100 de amostras de soro foi realizada por determinações de neutralização em uma série de cargas virais de quantidade que entra crescentes, usando-se alíquotas (10.000 MPD50) dos vários sorotipos preparados como descritos acima. Pelo método de testagem que foi realizado (Morgan and Moore, Am J Vet Res, 1990; 51: 40-45), animais que dão origem a soros que provêem uma redução de 2.5 Logio de micro-placas de FMDV em diluição de 1:100 são altamente preditivas de imunidade protetora contra infecção por FMDV.

Exemplo 2 Otimização de Peptídeo Antiqênico Alvo de FMDV por Conformação de Se-qüência e Elementos Imunoestimuladores Sete peptídeos de sorotipo A de VP1 de FMDV são descritos na tabela 7. Suas seqüências de aminoácidos são alinhadas e são numeradas como na tabela 1. Os peptídeo que porta Th deste grupo têm o Th de FMDV autólogo identificado como VIP1 21-40 (SEQ ID NO: 24) descrito na tabela 5, da seguinte seqüência: Glu-Thr-GIn-lle-GIn-Arg-Arg-GIn-His-Thr-Asp-Val-Ser-Phe-lle-Met-Asp-Arg-Phe-Val (SEQ ID NO: 24). Inv é a seqüência de domínio de invasina (SEQ ID NO: 22). As seqüências para cinco dos sete cons-trutos da tabela 7 são detalhadas de acordo com SEQ ID N—: 1, 2 e 27-29. Estes peptídeos foram sintetizados e soros imunes gerados para avaliação de imunogenicidade. Soros obtidos a partir de cinco semanas pós-imunização inicial foram analisados quanto a sua reatividade de peptídeo de VP1 de FMDV por peptídeo-ELISA e sua capacidade de neutralizar FMDV de soro-tipo A pelo ensaio de neutralização de FMDV padrão usando-se cepa AFP como o vírus alvo.

Potência dos soros foi expressa como título de ELISA de VP1 de anti-FMDV Logi0 e Logi0 de FMDV AFP (MPD5o) neutralizado em uma diluição de soro de 1:100.

Resultados: Os peptídeos A12 (134-159) p2228a sem Th e ciclização, e p2229c sem resposta de anticorpo de antipeptídeo eliciado por ciclização em um dos três e dois dos três animais respectivamente. Em contraste com isso, peptídeo mais longo p222a, A12 (134-169), e os peptídeos ciclizados mais longos eram imunogênicos em três dos três animais. Também peptídeo A12 ciclizado (134-159) p2233c era imunogênico em três das três cobaias. Entre as amostras de soro imunoreativas, os títulos de ELISA eram similares para todos os sete construtos de peptídeo.

No entanto, diferenças significativas foram observadas entre os construtos de peptídeo quando avaliadas por atividade de neutralização de soro (mostrada na tabela 7) e graduadas como: p2228a < p2224a < p2229c < p2225c< p2223a< p2236c.

Com base nesta graduação de eficácia de neutralização, as seguintes conclusões foram tiradas com referência a otimização de peptídeo antigênico de VP1 de FMDV. (1) construtos de peptídeo mais longos que cobrem resíduos de AA de 134-169 provêem eficácia de neutralização mais alta e são assim preferidos do que aqueles de seqüências mais curtas (AA134-159) (por exemplo, p2224a > p2228a, p2225c > p2229c e p2236c > p2233c. (2) construtos sintéticos artificial mente ciclizados provêem conformação melhor e são assim mais preferidos do que seus construtos não-ciclizados correspondentes (por exemplo, p2223a > p2229c e p2236c > p2225c);

Construtos sintéticos contendo elementos imunoestimuladores provêem eficácia de neutralização mais alta e são assim mais preferidos do que aqueles sem (por exemplo, p2236c > p2223a; p2229c > p2228a; e p2225c > p2224a).

Exemplo 3 Construtos Sintéticos que Emprega Seqüências de Consenso para as Regiões Hipervariáveis de Proteína de VP1 Provêem Ampla Neutralização de FMDV

Dois construtos cíclicos sintéticos que empregam sítios antigê-nicos alvo de VP1 de consenso foram projetados de acordo com um sorotipo O de consenso mostrada na tabela 1 (SEQ ID NO: 11). Um peptídeo de consenso foi sintetizado com elementos imunoestimuladores incluindo o domínio de Inv (SEQ ID NO: 22) e o Th de SSAL artificial mostrado na tabela 6 (SEQ ID NO: 26). O outro foi sintetizado sem seqüências imunoesti-muladoras adicionais. As estrutuas globais destes construtos de VP1 de FMDV são mostradas p2569a na tabela 8a (SEQ ID NO: 11) e p2570c na tabela 8b (SEQ ID NO: 30).

Soros obtidos a partir de cobaias imunizadas de três e cinco semanas pós-imunização inicial foram avaliados quanto a suas reatividades de peptídeo de VP1 de FMDV por peptídeo-ELISA e sua capacidade de neutralizar FMDV de múltiplos sorotipos O, A e Asia pelos ensaios de neutralização de FMDV padrão usando-se cepas de FMDV AFp, 0-1 PI, 0-1Taiwan, °Fran, °Taiwan, °Kauf e Asia 1 como o vírus alvo.

Alto título de anticorpo de peptídeo de VP1 de anti-FMDV foi observado por 3 semanas depois de uma única imunização que demonstra alta imunopotência para ambos os imunógenos de FMDV sintéticos. No entanto, a alta atividade de neutralização do soro visto tão precoce quanto 3 semanas pós-imunização inicial, e a amplitude de sua especificidade atra- vés dos sorotipos A, O e Asia, foi inesperada. Atividade de neutralização de tal ampla faixa é raramente observada mesmo para as melhores vacinas de FMDV preparadas a partir de estoques de vírus inativados. O projeto de consenso para peptídeo antigênico alvo de FMDV provê a base para uma vacina de FMDV de atividade de neutralização reativa. Exemplo 4 Peptídeo Antigênico Alvo de SSAL e Th Artificial para Imunogenicidade de VP1 de FMDV Aperfeiçoada e Amplitude de Neutralização de FMDV

Dois peptídeos antigênicos alvo, p1522b (SEQ ID NO: 31) e p1592c (SEQ ID NO: 32), foram projetados, cada um com um sítio antigênico alvo de FMDV preparado como uma biblioteca de antígenos sintéticos estruturados (SSAL). Estes dois peptídeos são descritos na tabela 9. Sítio antigênico alvo de SSAL de Th de p1522b (SEQ ID NO: 31) é uma representação completa das regiões de laço G-H compiladas dos subtipos de sorotipo O na tabela 3. Este sítio antigênico alvo foi projetado de acordo com a "sequência de O SSAL (COMPLETA)" mostrada na tabela 3 por SEQ ID NO: 19. Similarmente, p1592c compreende o sítio antigênico alvo de SSAL que representa todas as sequências listadas na tabela 4 para subtipos de sorotipo Asia. Este sítio de SSAL para Asia foi projetado de acordo com com a seqüência de "SSAL de Asia" mostrada na tabela por SEQ ID NO: 21. O Th artificial chamado "Th de Syn (1,2,4)" da tabela 6 (SEQ ID NO: 25) estava ligado a 1522b e p1592c para imunogenicidade, e o sítio imuno-estimilador de Inv (SEQ ID NO: 22) foi acoplado a p1592c.

Estes dois peptídeos antigênicos alvo de SSAL foram sintetizados e foram usados para grupos hiperimune de 3 cobaias, como descrito (exemplo 1). Soros obtidos a partir de cinco e dez semanas pós-imunização inicial foram avaliados quanto a sua reatividade de peptídeo de VP1 de FMDV por peptídeo-ELISA e sua capacidade de neutralizar FMDV de sorotipos O, A e Asia pelo ensaio de neutralização de FMDV padrão usando-se cepa de FMDV A1, A12Fp, Afl, A23, 0-1 j.H, 0-1 p2 e Asia 1 como os vírus alvo. Resultados são mostrados na tabela 9.

Altos títulos de antipeptídeo contra os sítios antigênicos alvo (> 5,0 Logio) foram evocados tanto por p1522b quanto p1592c por 5 semanas pós-imunização inicial (sangrias precoces não foram tomadas). Neutralização de FMDV amplas e eficazes de todas as sete cepas de FMDV que pertencem a três diferentes sorotipos (isto é, A, O e Asia) foram observadas para ambos os anti-soros apesar das amplas variações em sequência entre estas cepas e sorotipos. Isto demonstra a utilidade de SSAL no projeto de um peptídeo sintético à base de vacina direcionada contra um sítio funcio-nal/antigênico alvo de alta variabilidade. O projeto de SSAL para peptídeos antigênicos alvo de FMDV provê a base de uma vacina de FMDV de atividade de neutralização amplamente reativa.

Exemplo 5 Misturas de Sorotipos Múltiplo para Neutralização de FMDV Eficaz Uma mistura de três peptídeos antigênicos alvo de SSAL, tendo peptídeos sintéticos p1520b, p1522b, p1522b e p1888b (SEQ ID NO: 33, 31 e 34) é descrita na tabela 10. Esta mistura compreende sítios antigênicos alvo de SSAL que representa sorotipo A (SEQ ID NO: 15, tabela 2), sorotipo O (SEQ ID NO: 19, tabela 3), e sorotipo Asia (SEQ ID NO: 35, tabela 10) ligados a epítopo de Th artificial "Th de Syn (1,2,4)" (SEQ ID NO: 25). Esta mistura foi usada para imunizar um grupo de 3 suínos. Doses de 100 pg foram administradas 3 semanas separadamente em Auxiliar Completo de Freund na semana 0 e Incompleto de Freund na semana 3. Soros obtidos depois da imunização inicial foram avaliados quanto a imunogenicidade por peptídeo-ELISA para o sítio antigênico de VP1 de FMDV e ensaio de neutralização de FMDV onde uma cepa de seqüência de VP1 desconhecida, 01-Taiwan, oriunda de surto recente, foi empregada como o vírus alvo. Todos os três porcos responderam à imunização com alta reatividade de antipeptídeo (um título de ELISA de VP1 de FMDV médio de 3,7 log10). Apesar da natureza desconhecida da seqüência de VP1 de 01-Taiwan de FMDV, o soro combinado e diluído de 1:100 obtido a partir dos três hospedeiros imunizados demonstraram uma atividade de neutralização significativa de 4,5 Log10. Este nível de atividade de neutralização é preditivo de imunidade protetora para infecção por FMDV. Com base na experiência extensa acumulada no Centro de Doença de Animal em Plum Island, USDA (Morgan and Moore, 1990) para o prognóstico de uma natureza protetora de FMDV da vacina, soros que podem neutralizar 2 log™ de FMDV (MPD50) por protenção eficaz prevista de ensaio in vitro contra infecção por FMDV nos hospedeiros vacinados.

Esta observação correlaciona resposta imune à vacinação por uma composição de peptídeo da invenção com proteção contra infecção em suíno, um dos hospedeiros visados da vacina. Demontrou-se 0 potencial de uma composição de peptídeo de VP1 de FMDV da invenção de se realizar como uma vacina de FMDV universal eficaz (isto é, eficaz contar os isolados antigenicamente variáveis de múltiplos sorotipos), uma realização não alcançada desde a introdução de vacinas de FMDV inativadas no início dos anos 50.

Exemplo 6 Peptídeos para Avaliação de Estado Imunológico Peptídeos da invenção foram incorporados em um teste ELISA para a avaliação das reatividades sorológicas dos rebanhos de estado conhecido com relação à exposição a FMDV e vacinação. Os peptídeos usados foram isolados a serem representativos das cepas de FMDV usadas para vacinar e acreditam-se que sejam do mesmo sorotipo das cepas do campo às quais os animais podem ter sítios expostos.

Kits para os testes de diagnótico foram preparados e foram usados como descrito na "ELISAs à base de peptídeo de VP1 sintético (AA134-1268) seção do exemplo 1. As placas foram revestidas com peptídeos de VP1 que correspondem a cepa 01 Campos (P2463=AA128-158(T->C)-169) e cepa OlManisa (P2466=AA128-158(T-»C)-169) como antígenos sólidos. Estes kits foram usados para testar amostras de soro coletadas a partir de rebanho de um país que tinha experimentado um surto de FMD 9 meses antes. Os rebanhos foram classificados por seu estado conhecido como "Infecção Suspeita" e "Infecção Suspeita com Vacinação" (oriundos de regiões que experimentaram um surto), 'Vacinados" e "Normais" (oriundos de regiões que acreditavam-se estejam livres de FMD). Amostras que exibiam absorbâncias a ou acima de um valor de corte de 0,2 vez a absorbância para um Forte Controle Reativo foram classificadas como reativas. Resultados mostrados na tabela 11.

Estes resultados demonstram que a reatividade ao ELISA à base de peptídeo é preditivos de exposição de rebanho. Os rebanhos que foram expostos exibiam reatividades significativas de cerca de 20% enquanto animais oriundos de rebanho normal não tinham nenhuma reatividade. A reatividade de 20% para os rebanhos expostos pode ter sido mais alta se os testes tiverem sido realizados mais perto no tempo dos surtos do que 9 meses. Os resultados para os rebanhos vacinados exibiam uma quantidade surpreendente de variabilidade, reflexiva de alta variabilidade na eficácia de vários programas de vacinação que usaram vacinas obtidas a partir de vários fornecedores.

Todas as referências relatadas são aqui incorporadas por referência. a N134 da sequência de VP1 nativa é substituído por C. b Q158 da seqüência de VP1 nativa é substituído por C. c N5 de animais que respondem de grupos de 3, 5 semanas pós-imunização inicial. d Resultados de teste para soros combinados oriundos de animais reativos a ELISA. e Soro para ensaios de neutralização diluídos de 1:100. a Τΐ5β da seqüência nativa foi substituído por C. b semanas pós-imunização inicial c reatividades para soros combinados oriundos de animais reativos a ELISA, d soro para ensaios de neutralização diluídos de 1:100.

Tabela 11 Reatividade por ELISA para Rebanhos de Estado Imunolóaico Conhecido REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NO’s: 2, 3, 5, 7, 9, 11 e 13.

2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a sequência de aminoácidos de um epítopo de célula T auxiliar (Th).

3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a sequência de aminoácidos da sequência imunoestimuladora geral SEQ ID NO: 22.

4. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda de 1 a 13 aminoácidos adicionais tirados de qualquer terminal do segmento 134-157 de VP1.

5. Peptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO’s: 29, 30 e 32.

6. Peptídeo ou conjugado de peptídeos, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula: em que: cada A é independentemente um aminoácido ou a sequência imunoestimuladora geral SEQ ID NO: 22; cada B é independentemente escolhido do grupo que consiste em aminoácidos -NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(s-N)Lys-, -NHCH(X)CH2S-succinimidil(s-N)Lys-, e -NHCH(X)CH2S-(succinimidila)-; cada Th é independentemente uma sequência de aminoácidos que constitui um epítopo de célula T auxiliar; o “antígeno de FMDV” é uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 7, 9, 11, e 13 e X é um aminoácido α-COOH or a-CONH2; n é de 0 a 10; m é de 1 a 4; e o é de 0 a 10.

7. Peptídeo ou conjugado de peptídeos de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o epítopo de Th é selecionado do grupo que consiste em Th de FMDV conhecido, Th conhecido de patógenos estranhos, SEQ ID NO’s: 25, 26, 36 e 37.

8. Peptídeo ou conjugado de peptídeos de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos um B é Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 23), onde Xaa é qualquer aminoácido.

9. Peptídeo ou conjugado de peptídeos de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que n é 3, e (A) é (domínio de invasi-na)-Gly-Gly.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um ou mais peptídeos como definidos na reivindicação 2 ou 6, e um veículo farmaceutica-mente aceitável.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que pelo menos um peptídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO’s: 2, 3, 5, 7, 9, 11 e 13.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo ou os polipeptídeos são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO’s: 2, 3, 5, 7, 9, 11 e 13.

13. Método de diagnose in vitro de infecção por FMDV, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) ligação do peptídeo como definido na reivindicação 1 a um suporte sólido, (b) exposição do referido peptídeo ligado ao referido suporte sólido a uma amostra contendo anticorpos a partir do referido mamífero, sob condições úteis à ligação do anticorpo ao peptídeo, e(c) detecção da presença de anticorpos ligados ao referido peptídeo ligado ao referido suporte sólido.