CN101469017B - 用于口蹄疫的合成肽疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肽组合物作为免疫原的应用，其中含有的每种肽包含一种来源于口蹄疫病毒(FMDV)VP1衣壳蛋白的目标抗原位点。该抗原位点与一种辅助T细胞表位，以及优选与其它免疫刺激序列共价连接，优选通过直接合成的常规肽键共价连接，用于预防FMDV感染和根除口蹄疫(FMD)。更具体地说，本发明涉及应用该肽组合物作为免疫原，在动物包括猪、牛、羊、山羊和易感野生动物品种中诱导产生高效价多克隆抗体，该抗体能够在体外有效地中和FMDV的多种病毒株或血清型，以及应用该组合物作为疫苗，防止、和/或减少无论何种血清型的FMDV感染的发生率，并因此实现根除FMD。本发明还涉及组合物中应用的肽，以及含有一种或多种该肽的免疫分析和/或诊断试剂盒，以及应用该材料在哺乳动物中诊断FMDV的方法。

Description

用于口蹄疫的合成肽疫苗
本申请是国际申请号“PCT/US99/13921”，国际申请日为1999年6月21日，中国申请号为“99807402.0”，发明名称为“用于口蹄疫的合成肽疫苗”的分案申请。
发明领域
本发明涉及肽组合物作为免疫原的应用，其中包含的每种肽包括一种来源于口蹄疫病毒(FMDV)VPI衣壳蛋白的目标抗原位点，所述抗原位点共价连接一种辅助T细胞表位，以及优选地，优选通过常规肽键经直接合成连接其它免疫刺激序列，用于预防FMDV感染和根除口蹄疫(FMD)。
更具体地说，本发明涉及应用该肽组合物作为免疫原在动物包括猪、牛、羊、山羊、和易感野生动物品种中诱导高效价的多克隆抗体，该抗体能够在体外中和FMDV的多种株系或血清型，以及应用该组合物作为预防和/或减少不论何种血清型的FMDV感染的发生率。
本发明还涉及用于该组合物的肽，以及含有一种或多种所述肽或其片段的免疫分析和/或诊断试剂盒。
发明背景
口蹄疫(FMD)是一种最有经济影响的家畜疾病。偶蹄目偶蹄动物，例如牛、猪、羊和山羊易受感染。致病因子，口蹄疫病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族(其正有义RNA基因组编码四种衣壳蛋白(VP1-VP4)和非结构多肽)的一种口疮病毒。图1示意地显示了FMDV基因组，衣壳和非结构蛋白的编码区，以及蛋白质被剪切的加工途径。
FMD随着感染和接触动物的隔离检疫和销毁以及通过使用化学灭活的病毒组合物免疫得以控制。配制这种疫苗的重大困难在于FMDV的显著的抗原多样性。已经描述了七种不同的血清型：A、O、C、Asia、和南非型SAT-1、2、和3，它们中的每一种还可以继续分成多种亚型。血清型A、O、和Asia型最为常见。血清型A病毒最多变种，具有超过30中亚型。
血清型之间没有交叉保护，因此从感染中恢复的动物或用一种血清型病毒接种的动物仍然容易被其它六种血清型的病毒感染。而且，在一种血清型中抗原变异的程度如此之大，以至有效地抗一种亚型的疫苗可能对同一血清型中的另一种亚型没有保护性。因此，目前的疫苗是基于含有各种参照株系的相关血清型或亚型的灭活病毒的混合物，所述参照株系通过监测局部流行中的病毒株系来确定。需要对野生分离株包括出现的变异体之间的抗原关系进行周期性监视，并且需要能够用于疫苗制品的病毒，以防止爆发。
因此，目前疫苗的生产需要生长几种病毒株系并对其灭活，同时确保它们每一种的效力，必须用最新的野生株系周期性重新配制该产品，以防止由于新变异体的出现丧失保护效力。在面对抗原变异的情况下，用于维持免疫原功效的制备多病毒株的方法导致制造期间病毒株对病毒株之间效力及产量的不确定的问题。
周期性依次改变灭活病毒疫苗的需要在疫苗制造上产生新的缺点。当将疫苗改变成适应一种新发展的野生株系引起的爆发时，爆发株系必须经人工调整以使其在组织培养中有效生长。适应组织培养的筛选方法会导致保护性免疫原性的减小，导致生产的进一步延迟。(Barteling和Breeswijk，疫苗，1991；9：75-88；Brown，疫苗，1992；10：1022-1026)。
灭活FMDV疫苗的其它明显缺点与生物安全性和稳定性问题有关。病毒必须在高度密封的设备中生产，以防止污染周围环境。这种潜在的危害将有资格的疫苗供应商限制为极少的数目，并限制了疫苗的可用供应性，并妨碍世界上以前不存在FMDV的区域爆发FMD时的应变能力。这种灭活病毒制品的无害性不能绝对保证。最近欧洲的几起疾病事件追溯到不完全灭活病毒。这种危害导致无此疾病的区域不推荐使用该类疫苗，导致以前未被感染的区域缺乏免疫保护。
产品的不稳定性及各批产品间的变异性来源于灭活病毒疫苗的复杂及不明确的组成。这些复杂混合物必须在固定时间进行检查，以确保免疫效力。在某些国家，这可以每年进行三次。需要一种冷箱以维持这种不稳定产品的效力，通常这在某些国家难以得到保证。
存在有害效果的可能性是这种复杂组合物的另一种结果。过敏性休克虽是不常发生的问题，但一旦发生就足以造成严重问题。这些缺点已由Brown(《小核糖核酸病毒感染和检测的分子方面》(MolecularAspects of Pic或navirus Infection and Detection)第11章，Semler和Ehrenfeld编，美洲微生物协会：Washington，DC，1989，pp179-191)综合回顾。由于目前FMDV疫苗的复杂组成导致的其它缺点是它不能通过血清学实验分辨被免疫动物和已感染动物(Lubroth等，疫苗，1996：14：419-427)。基于位点特异性免疫原的疫苗将有利于设计分辨疫苗诱导抗体和感染诱导抗体的免疫诊断试剂盒，并因此确保接种程序的有效性。
现有商业疫苗的缺点鼓励用更安全更明确的亚单元制品取代它们的研究。然而，为了达到接受性，这些制品将必须与目前提供的灭活病毒疫苗具有相同的免疫原性，并且将需要提供对抗抗原变异体的广泛的保护谱。
设计一种用于FMDV的明确亚单元疫苗的努力从打碎病毒颗粒开始，然后鉴定其组成蛋白质，如图1所示。这导致与完整灭活病毒颗粒相比，免疫活性明显丧失(Brown，1989)。然而，发现单独的衣壳蛋白(目前被统一命名为VP1)自身接种的牛和猪具有诱发中和抗体和免疫的能力，虽然其活性为亚型特异性的及数量级低于完整灭活病毒的数量级。没有其它病毒蛋白质诱发中和活性(Lapore等，CRAcad Sci Paris，1973；276:3399-3401和Bachrach等，免疫学杂志，1975，115：1636-1641)。
VP1的中和活性使人们将注意力集中于该蛋白质，而且一开始它就被慎重地考虑为基因工程亚单元疫苗的侯选物(Kleid等，科学，1981：214：1125-1129)。近来清楚地认识到重组VP1的免疫原性不足以保护动物(Brown，1989；Brown，1992)。尽管如此，这项工作导致VP1上免疫决定簇的发现，使基于合成肽的更强效区域特异性亚单元疫苗成为可能。
Strohmaier等(J Gen Virol，1982；59:295-306)实验了通过溴化氰和蛋白水解消化产生的VP1的酶切产物；Bittle和Lerner(WO83/03547)实验了相应于最高变异性区域的氨基酸序列的合成肽；Acharya等(自然，1989，337：709-711)通过X-射线结晶照相术验证了FMDV上的表面暴露位点；Pfaff等(EMBO J，1982，7：869-874)通过预测一种VP1的重要两亲螺旋构型筛选出一种诱导中和抗体的肽，由此对VP1的免疫原区进行了作图。所有这四项研究得出VP1的一种具有137-160个残基的环形区域携带诱导中和抗体的决定簇。
对应于VP1的141-160区域的血清型-特异性肽，也被称为“G-H环”，得自所有七种血清型的FMDV分离株，已显示在豚鼠中诱导保护水平的中和抗体(Francis等，免疫学，1990，69：171-176)。显然该区域含有一种主要的免疫原性位点，其也携带病毒的血清型特异性。通过结合于载体蛋白KLH(匙孔帽贝血蓝蛋白)的合成肽实现了对这种141-160VP1肽的免疫原性的最初观察，此过程忽略了生产明确定义的合成免疫原的优点。然而，DiMarchi和Brook(US专利号：4732971)表明来源于亚型O分离株的、连接在200-213Pro-Pro-Ser-141-158-Pro-Cys-Gly嵌合构建体中的两个VP1序列，诱导保护牛抵抗接种的抗体水平，由此他们推动VP1合成免疫原的发展。尽管如此，该肽免疫原的低免疫原性限制了这种作用的功效。需要1-5mg的高剂量才能获得对同型舌头皮下接种的保护，接受5mg剂量的三只动物中的一只没有得到保护。实际应用要求一种仅少量肽免疫原即可对无论同型还是异型接种均提供完全保护作用的疫苗制剂。
针对FMDV的有效肽疫苗的一个重要元件是从VP1的G-H环区中选择一个确切的序列，其对呈递能够诱导中和抗体的B细胞表位是最适的。一种肽结构域的最佳呈递的框架可以被小至单个氨基酸位置的转移而受影响(Moore，《合成肽，用户指南》第2章，Grant，WH编，Freeman和Company:New York，1992，pp63-67)。公开了含有中和抗原决定簇的免疫结构域G-H环的优选合成免疫原，其包括残基141-160(WO83/0357；Francis等，1990)，141-158(US4732971)，142-158(Parry等，WO91/03255)，137-168(Morgan和Moore，AmJ Vet Res，1990；51:40-45)，138-156(Taboga等，病毒学杂志，1997，71：2602-2614)，以及一些选自130-160(WO83/03547)的20个氨基酸的连续序列。显然，对于呈递G-H环VP1中和位点的优化的VP1独特片段没有达成一致。
另外，在现有肽疫苗中的有限种类的B细胞表位不足以刺激广泛反应性的、抗高度可变FMDV的保护作用所需的中和抗体。到目前为止，仅诱导相对有限的特异性的抗体，甚至由于长期发生点突变产生逃脱突变体，使这些有限特异性的价值还存在进一步的限制(Taboga等，1997)。需要提供一种免疫原性广泛到足以克服多种株系之间的抗原变异和由于逃脱突变体的出现所致的临时变异的肽疫苗的替换方法。
影响用于FMDV疫苗的合成肽的免疫原性的其它重要因素是呈递给免疫系统一种适合于宿主的T-辅助细胞表位。短的合成肽，只有当它们除含有抗体结合位点之外，还含有与辅助T-细胞受体和II类MHC分子反应的结构域时，才能够了解它们作为疫苗的潜力(Babbitt等，自然，1985，317：359-361)。单独的141-160VP1肽对豚鼠和小鼠具有某种程度的免疫原性，表明该序列中存在适合于这些物种的T细胞表位。相对于这些实验动物的结果，在牛和猪中的疫苗实验表明对该VP1结构域的T-细胞表位的免疫反应性变异太大，所以不能为这些具经济意义的远亲后代种的个体提供适当的保护(Rodriguez等，病毒学，1994，205：24-33；和Taboga等，病毒学杂志，1997，71：2606-2614)。最近，鉴定对应FMDV结构蛋白区域的其它合成肽为T-辅助细胞区域。发现在牛中对应VP1氨基酸21-40的肽能够对VP1中和环结构提供T细胞辅助(Collen等，免疫学杂志，1991，146：749-755)；然而，这些T细胞表位不足以给牛提供稳定的保护(Taboga等，1997)。仍然没有关于选择足够的T辅助细胞决定簇的信息，也没有关于已知FMDV疫苗中B-和T-细胞表位的最佳取向。
需要提供一种基于合成肽的、具有优越于经典疫苗的效力和宽范围的FMDV疫苗。前面讨论的现有技术肽不足以提供这种需要。
本发明的一个目的在于提供一种符合上述需要的合成肽FMD疫苗。实现该目的的方法是：
1.一种鉴定高亲合性表位的有效方法，
2.通过组合化学，表现一种具有较少数目的肽综合体的增大B细胞和T细胞表位功能的的方法，
3.通过将B细胞目标表位与强效T辅助细胞(Th)表位结合并使Th表位适应一种种群的可变免疫反应性，来增强B细胞目标表位的免疫原性的方法，和
4.通过引入一种环状限制稳定所需构象特征。
曾用合成肽进行“表位作图”，以鉴定蛋白质表面的免疫结构域决定簇或表位，用于研制新的疫苗和诊断试剂。表位作图应用一系列目标蛋白质上相应区域的重叠肽，以鉴定参与抗体-免疫原决定簇相互作用的位点。通常，表位作图应用长度相对较短的肽，以精确检测线形决定簇。一种被称为“PEPSCAN”的最快的表位作图法是基于同时合成数百个长度为8-14个氨基酸、结合于固相支持物的重叠肽。测试结合肽结合抗体的能力。该研究方法对于定位线形决定簇有效，但研制疫苗所需的免疫结构域表位通常为高度亲和力的不连续表位，难于通过PEPSCAN法鉴定(Meloen等，Ann Biol Clin，1991，49:231-242)。
一种替代方法依赖于一系列长度范围从15-60个残基不等的嵌套重叠肽合成物。这些较长的肽通过一系列烦琐的独立固相肽合成法合成，而不是通过快速同步PEPSCAN合成。然后得到的一系列嵌套重叠肽可以用于抗体结合研究，和实验免疫以鉴定最佳呈递免疫决定簇的长肽，包括简单的混杂表位。该方法通过Wang等关于来自HTLVI/II(US5476765)和HCV(US5106726)的免疫结构域位点作图研究示例说明。它被用于选择gp120序列上HIV中和表位最佳呈递的精确位置(Wang等，科学，1991，254：285-288)。
组合肽文库已经设计为覆盖由于地域或人种差异及高度可变性抗原的临时变异表现出的广泛范围的序列，同时设计超越个体肽免疫原的有限能力。例如，可以将一种特定肽免疫原设计为含有多种由一种不变残基的结构框架组织围绕起来的位置取代。该组合维持了免疫结构域位点的构型，并适应当前和预期的抗原变异。该组合肽，对应HIV和HCV的高可变免疫结构域位点，已由Gras-Masse等(肽研究，1992，5：211-216)描述为“混合表位”，由Wang等(WO95/11998)描述为“构建的合成抗原文库”或“SSAL”。
“构建的合成抗原文库”或SSAL由一组能够保持该位点抗原性、诊断价值或治疗生物活性的嵌入较大不变结构框架的有序的相关肽序列组成。
式1提供了SSAL氨基酸序列的一种代表。
AA1jAA2j…AAij…AAxj(式1)
序列AA1j到AAxj代表SSAL中的肽从N-端到C-端的氨基酸序列。文库中各肽的长度为x，对于每一个文库x是恒定值。在每个氨基酸中，位置i、j从1到n变化，其中n代表第1位置上已知的(或所需的)不同氨基酸数目。缺口或插入的人为引入或自然发生，例如，表1中VP1序列排列中的那些，由x值不同的单独SSAL的合成提供。
式2是代表SSAL序列中特定可变位置i上氨基酸相对比率的总合的数学式。
Σ j = 1 n [ A A ij ] = 1 (式2)
式2描述在每个位置i，n个单独氨基酸的摩尔份数总合是一致的。位置I上的第j个氨基酸[AAij]由实践者基于以下原则选择：(1)在自然界发现的FMDV血清型中的病毒株之间AAij的普遍性，和任选地(2)需要包括相似氨基酸，以便预期逃脱突变体。AAij的氨基酸通常将从天然氨基酸中选择，但可以包括修饰氨基酸，例如鸟氨酸和正亮氨酸和非天然氨基酸例如D-氨基酸。按照这些公式，可以在一步合成中同时制备长度为x的SSAL的所有变异序列。
SSAL的序列通过排列抗原相关家族的一级氨基酸序列，然后鉴定排列中的不变和可变位置。不变位置通常代表SSAL的结构框架。SSAL中的简并性通过具有相对于一种任意原型序列包含不同氨基酸残基的排列中的位置确定。确定了每个不变位置上的氨基酸之后，SSAL文库中可变位置的简并性程度从提供各替代氨基酸的变异体数目确定。然后用不变位置上的单一氨基酸和可变位置上必需的简并性合成SSAL。
可变位置上的氨基酸残基的相对比率可以设置为彼此相同，或者也可以由不同比率代表。在一个优选实施方式中，在一种或多种可变位置上的氨基酸比率设置为能够反应天然序列中发现的各氨基酸的相对普遍性。表2和3中示例说明的SSAL文库代表该优选实施方式，其中下标代表SSAL中各可变位置上个体残基的相对量。应当注意，SSAL中出现的肽的大分数可能代表自然界中尚未观察到的可变氨基酸的组合。SSAL的这种特征增加了由本发明的肽组合物赋予的抗新出现FMDV病毒株的FMDV感染的保护作用的程度。
因此，在一个简单方式中，特定氨基酸，以及任选地它们在SSAL中每个位置的出现频率，通过排列中应用的不同抗原的一级序列而确定。在预期逃脱突变体时，排列表位中变异位置上尚未发现天然存在的氨基酸可以任选地插入该文库。例如，可以将特定氨基酸类型(例如疏水、带电荷、中性或极性)中的几种或全部残基插入任何可变位置。插入特定位置的氨基酸类型可以通过抗原排列中该可变位置上出现的氨基酸的主要类型确定(WO95/11998)。
被称为“混杂Th”的表位诱导有效的T细胞辅助，并能够与自身具备很低免疫原性的合成B细胞表位混合，产生强效肽免疫原。设计良好的混杂Th/B细胞表位嵌合肽能够在表现多样性MHC单倍体的遗传多样性种群的大多数成员中诱导Th应答以及随之而来的抗体应答。来源于强效病毒和细菌来源的免疫原的特异性序列能够提供混杂Th，包括麻疹病毒F蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、和沙眼衣原体主要外膜蛋白。一些已知的混杂Th已经显示在强化对应十肽激素LHRH的低免疫原性肽方面是有效的(US5759551)。
强效Th表位在长度LHRH中的长度范围为约15-约50个氨基酸残基(US5759551)，通常具有共同的结构特征，可以含有特异性标志序列。例如，共同特征是两性分子螺旋，它是疏水氨基酸残基占据螺旋一面，带电荷和极性残基占据周围面的α-螺旋结构(Cease等，美国国家科学院科学进展，1987，84：4249-4253)。表位通常含有其它的一级氨基酸模式，例如一个Gly或带电荷残基后跟随两到三个疏水残基，其后依次跟随一个带电荷或极性残基。该模式描述了一种被称为Rothbard序列的模式。另外，Th表位通常遵循1、4、5、8规则，其中一个带正电荷的残基后第四位、第五位和第八位跟随疏水残基。因为所有这些结构由共同的疏水、带电荷和极性氨基酸构成，所以各结构能够在同一个Th表位中同时存在(Partidos等，遗传病毒学杂志(J Gen Virol)，1991，72:1293-99；Alexander等，免疫学，1994，1：751-761)。即使不是全部，但大多数混杂T细胞表位含有至少一个上述周期性。这些特征可以被插入“理想化人工Th位点”的设计，包括能够在与识别多样化MHC分子有关的位置上提供简并性并保留不变位置的SSAL Th表位。可变位置和优选氨基酸的列表由MHC-结合基元提供(Meister等，疫苗，1995；13：581-591)。例如，按照从麻疹病毒F蛋白质中得到一种混杂表位，模拟被称为“SSAL1TH1”的简并Th表位(Partidos等，1991)。将SSAL1TH1(WO95/11998)设计为与LHRH目标肽顺序连接。象麻疹表位一样，SSAL1TH1遵循Rothbard序列和1、4、5、8规则：
(参见，例如，SSALTH1中的6、9、10和13位)：
1                5                  10                   15
Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-Gly-Leu-
Glu Ile     Glu Ile Arg      Ile Ile Ile     Arg Ile Glu     Ile
    Val         Val          Val Val Val         Val         Val
    Phe         Phe         Phe Phe Phe        Phe        Phe
将带电荷残基Glu或Asp加在位置1，以增加Th疏水侧周围的电荷。然后在两性螺旋疏水侧的2、5、8、9、10、13和16位保留疏水残基，2、5、8、9、10、13和16位的可变性提供了一种具有结合广泛MHC限制元件能力的表面。SSAL特征的静作用在于增大了人工Th的免疫抑制的范围(WO95/11998)。在一个单一的固相肽合成中同时产生该SSAL中的所有变异体，其依次连接目标B细胞表位和其它序列。
肽免疫原通常比蛋白质更柔韧，不易保持任何优选结构。因此通过引入环形限制来稳定肽免疫原是有用的。一种准确环化的肽免疫原可以模拟和保守目标表位的构象，由此诱导真正分子上与该位点具有交叉反应性的抗体(Moore，合成肽第二章：用户指南，ed.Grant，WHFreeman and Company：New York，1992，pp/63-67)。这已经在一种代表FMDV免疫结构域VP1环区的肽上，通过在氨基和羧基末端添加半胱氨酸残基并通过氧化这两个半胱氨酸残基环化实现(WO83/03547)。然而，仍然需要更有效的VP1环区的肽类似物。
本发明提供了具有更为有效的免疫构象的肽。这通过发现形成对天然表位更准确模拟的半胱氨酸残基的位置实现(Valero等，生物医学肽，蛋白质和核酸，1995：1：133-140)。
发明概述
本发明提供了提供利用肽技术和前面讨论的肽设计元素即，精确的表位作图、SSAL文库肽、强效Th表位的设计、和环状限制设计的肽免疫原。这些肽免疫原是有效的合成FMDV疫苗的基础。这些肽是优选的，因为它们呈递具有优化位置和构象限制的VP1中和位点、由于它们呈递FMDV血清型变异体必需的宽范围序列、以及由于它们广泛的反应性Th应答。
本发明进一步提供了应用该肽组合物作为免疫原，其中包含的每一种肽含有一种来源于口蹄疫病毒(FMDV)VP1衣壳蛋白的目标抗原位点，优选所述抗原位点与一种辅助T细胞表位共价连接，和任选地，其它免疫刺激序列，优选经常规肽键通过直接合成连接，用于预防FMD感染和根除FMD。
更具体地说，本发明涉及应用该肽组合物作为免疫原，在动物包括猪、牛、羊、山羊、和FMDV易感野生动物品种中诱导产生高效价的、能够在体外有效中和FMDV的多种病毒株或血清型的多克隆抗体，以及应用该组合物作为有效预防、和/或降低FMDV感染的发生率，尽管存在抗原多样性，并因此导致FMD的根除。
本发明还涉及组合物中应用的肽，以及含有一种或多种这些肽或其片段的免疫分析和/或诊断试剂盒。
本发明的目标抗原位点通过基于来源于FMDV A12病毒株的VP1蛋白质的氨基酸序列信息进行表位作图选择，其代表FMDV VP1蛋白质上中和抗原决定簇，氨基酸134-168的最佳呈递框架。这些残基在表1中表示为氨基酸“134-169”(SEQ ID NO：1)，这是由于位置142存在一个为了排列引入的缺口。为了方便，它们在正文中也被称为氨基酸134-169，但应当理解讨论的真正片段是残基134-168(SEQID NO：1)。
本发明的目标抗原位点优选从天然G-H环区的FMDV VP1序列修饰而成，其通过将两个天然氨基酸取代为半胱氨酸，然后在这两个半胱氨酸之间形成一个二硫键，以产生一种两个半胱氨酸之间约由20-25个残基的环状结构(例如，SEQ ID NO：2)。VP1其它血清型的相应目标位点可以来源于相关血清型的同源G-H环区片段。
本发明进一步提供了与不变结构框架中携带高度可变位置的SEQ ID NO：1的优化框架具有共有序列的FMDV VP1目标抗原位点，其中提供了每种高度可变位置的最常使用的氨基酸，所述氨基酸通过对来自与一种特定FMDV血清型有关的FMDV亚型的VP1序列分析确定。
本发明进一步提供了按照SEQ ID NO：1的优化目标抗原肽框架的构建的合成抗原文库(或S SAL)，其中每种SSAL由一组有序的通过在一个单一肽合成步骤中同时合成的相关肽组成，所述肽具有应用于能够维持目标抗原肽抗原性的不变结构框架的序列。
另外，本发明的肽及其类似物的目标抗原位点经依次共价连接合成的免疫刺激元件的组合而被赋予免疫原性，所述免疫刺激元件包括一种来自耶尔森氏鼠疫杆菌的免疫刺激侵染素肽(Inv)(SEQ ID NO：22)，来源于外源性病原体的混杂Th表位；来源于FMDV蛋白质的自体固有Th表位(例如SEQ ID NO：24，表5)，人工Th表位(例如，SEQ ID NOS：25和26，表6)以及通过直接合成的其它成分。本发明的肽可以由下式表示：
(A)n-(FMDV抗原)-(B)o-(Th)m-X
              或
(A)n-(Th)m-(B)o-(FMDV抗原)-X
              或
(FMDV抗原)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
             或
(Th)m-(B)o-(FMDV抗原)-(A)n-X
其中：
各A独立地为一种氨基酸，或一种一般性免疫刺激肽；
各B独立地为一种氨基酸或一种下面将进一步限定的化学键；
每个Th独立地为一种构成一种辅助T细胞表位的氨基酸序列，或免疫增强类似物或其片段；
“FMDV抗原”是一种下面将进一步定义的合成肽抗原；
x为一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
n为从0到约10；
m为从1到约4；和
o为从0到约10。
还提供了佐剂和/或传送载体和疫苗制剂常规使用的其它成分，以及剂量说明书，以便能够产生针对FMDV VP1目标抗原位点的多克隆抗体。
本发明涉及应用肽组合物作为免疫原，诱导包括猪、牛、羊、山羊、和FMDV-易感野生动物品种在内的动物产生高效价多克隆抗体。由抗体介导和由本发明的肽组合物诱导的FMDV的保护机制将在体外有效中和FMDV的无论何种血清型或亚型的多种病毒株，并因此导致对FMDV感染的保护性免疫和帮助根除FMD。
附图简述
图1描绘了FMDV基因组的结构图，翻译产物被酶切成病毒蛋白质的处理途径，以及衣壳和非结构蛋白的命名。
图2A描绘了构建的合成抗原文库“SSAL(1)(完全)(134-169)”的氨基酸组成。下标代表相应位置上每种氨基酸的相对量。
图2B描绘了构建的合成抗原文库“SSAL(1)(完全)[134(N→C)-158(Q→C)-169]”的氨基酸组成。
图3A描绘了构建的合成抗原文库“SSAL(2)(完全)(134-169)”的氨基酸组成。
图3B描绘了构建的合成抗原文库“SSAL(2)(完全)(134(N→C)-158(Q→C)-169]”的氨基酸组成。
图4A描绘了构建的合成抗原文库“O SSAL(完全)(134-169)”的氨基酸组成。
图4B描绘了构建的合成抗原文库“O SSAL(完全)(134-158(Q→C)-169)”的氨基酸组成。
发明详述
本发明涉及应用肽组合物作为免疫原，所述组合物含有一种或优选多种肽，其中包含的每一种肽含有一种来源于口蹄疫病毒(FMDV)的VP1衣壳蛋白的目标抗原肽，所述抗原肽优选与一种辅助T细胞表位和任选的其它免疫刺激序列共价连接。共价键优选通过肽键经直接合成产生。
该肽组合物用于预防动物中的FMDV感染，以及期望帮助根除FMD。更具体地说，本发明涉及应用该肽组合物作为免疫原，在动物包括猪、牛、羊、山羊、和易感野生动物品种中诱导产生高效价多克隆抗体，所述抗体能够在体外有效中和FMDV的多种病毒株或血清型，以及应用该组合物作为疫苗，预防无论何种血清型的FMDV感染，并因此实现对FMD的根除。
本发明还涉及组合物中应用的肽，以及含有一种或多种这些肽的免疫分析和/或诊断试剂盒。含有一种或多种这些肽或其片段的免疫分析和/或诊断试剂盒将用于鉴定疫苗诱导的抗体和感染诱导的抗体，并因此能够用于筛选FMDV感染的存在和/或监测接种程序的有效性。
本发明提供了诊断哺乳动物中FMDV感染的方法，包括以下步骤：
(a)按照权利要求1将肽结合到固体支持物上，
(b)将所述结合于固体支持物的肽与含有来自所述哺乳动物的抗体的样品在有助于抗体与肽结合的条件下接触，和
(c)检测与结合在所述固体支持物上的所述肽结合的抗体的存在。
在考虑潜在环化构象和G-H环的残基表面暴露的基础上，优化含有FMDV VP1(G-H环)的主要中和决定簇的目标抗原序列，如从internet地址为http://www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids的Brookhaven国立实验室和Acharya等，自然337：709-711，1989提供的FMDV VPI的三维结构推测的那样。将环化的侯选位置插入肽构建体的设计，通过连续合成共价结合混杂Th表位以及有或没有其它免疫刺激物质合成修饰的和未修饰的序列。将特定二硫键引入其中，合成环状的修饰肽构建体，以便将易变动的肽稳定成为潜在的更具生物相关性的构象。通过制备超免疫血清和实验该血清在FMDV中和分析中的效力，鉴定含有相关免疫原性的VP1抗原位点的合成构建体。具体地说，通过基于FMDV病毒株A12的VP1蛋白质的氨基酸序列的表位作图选择本发明的目标抗原位点(实施例2)。
发现目标抗原肽的框架，如表1中的AA134-169(SEQ ID NO：1)所示，对于FMDV VP1上的G-H环中和决定簇的免疫呈递是优化的。抗原肽的目标抗原位点可以从天然FMDV VP1序列修饰得到，即通过将134位上的天然天冬氨酸和157位上的谷氨酰胺取代为半胱氨酸，在两个取代半胱氨酸之间形成一个二硫键，从而产生一种环状结构(SEQ ID NO：2)。所述环状结构还含有1-13个选自VP1的134-157片段的任意末端的附加氨基酸，只要保留如表1(SEQ ID NO：3)所示的单一二硫键环状结构。作为本发明的一种目标抗原肽的实例，提供了具有下列序列的FMDV VP1的目标位点(半胱氨酸取代表示为黑体)：
Cys-Lys-Tyr-Ser-Ala-Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Arg-Gly-Asp-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Pro-Arg-Val-Ala-Arg-Cys-Leu-Pro-Ala-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Lys
                                             (SEQ ID NO.:2)
或者，VP1的其它血清型的相应目标位点可以来源于相关血清型的同源片段。例如，可以按照来自FMDV血清型O和Asia型的相应序列，通过序列分别如下的表1中所示的序列排列，制备取代的肽类似物：
Cys-Lys-Tyr-Ser-Ser-Lys-Ala-Val-Pro-Asn-Val-Arg-Gly-Asp-Leu-Asn-Val-Leu-Glu-Gln-Lys-Ala-Ala-Arg-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Lys
                                                  (SEQ ID NO:5)
和
Cys-Pro-Tyr-Gly-Glu-Thr-Thr-Ser-Arg-Arg-Gly-Asp-Met-Ala-Ala-Leu-Ala-Gln-Arg-Leu-Ser-Ala-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Val-Lys
                                              (SEQ ID NO:7)
本发明进一步提供了环状和线形的FMDV VP1目标抗原肽，与高度可变位置置于不变结构框架中的SEQ ID NO：1(AA134-169)的优化框架具有相同序列，其中提供了所述框架中高度可变位置上最常使用的氨基酸，其通过分析来自一组与特定FMDV血清型有关的病毒的VP2序列而确定。作为本发明这种共有序列的例子，提供了六种共有序列，它们是来源于血清型A的FMDV变异体的共有序列(SEQ IDNOS：8，9)、血清型O的FMDV变异体的共有序列(SEQ ID NOS：10、11)和血清型Asia型的FMDV变异体的共有序列(SEQ ID NOS：12、13)，如表1所示。
本发明进一步提供了按照SEQ ID NO：1的优化目标抗原肽框架的，环化和线形的构建的合成抗原文库(或SSAL)，其中每个SSAL由一组有序的、在一个单一肽合成中同时产生的、具有用于能够维持目标抗原肽的抗原性的不变结构框架的序列的相关肽组成。作为这种本发明的这种SSAL的例子，提供了九种具有组合序列的SSAL，所述组合序列来源于编辑的FMDV亚型组，它们是分别如表2、3、4和10的血清型A(SEQ ID NOS：14-17)、血清型O(SEQ ID NOS：18、19)和Asia血清型(SEQ ID NOS：20、21、35)。
目标VP1位点是短肽序列。当合成它们自身作为本发明的肽时，这些肽通常具有较弱的免疫原性。通过化学连接来源于外源病原体的混杂Th表位，这些短肽可以被免疫加强，所述外源病原体包括但不限于，例如，乙肝病毒表面和核心抗原辅助T细胞表位(HBs TH和HBc Th)、百日咳毒素辅助T细胞表位(PT Th)、破伤风毒素辅助T细胞表位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白辅助T细胞表位(MVF Th)、沙眼衣原体主要外膜蛋白辅助T细胞表位(CT Th)、白喉毒素辅助T细胞表位(DTTh)、镰状疟原虫环孢子体辅助T细胞表位(PF Th)、曼森氏血吸虫三糖磷酸盐异构酶辅助T细胞表位(SM Th)，及大肠杆菌TraT辅助T细胞表位(TraT Th)。病原体衍生的Th在US5759551中的SEQ ID NOS：2-9和42-52列出；衣原体辅助位点P11在Stagg等，免疫学，1993，79：1-9中列出；HBc肽50-69在Ferrari等，临床研究杂志，1991，88：214-222中列出，它们经参考插入本文。混杂Th还包括来源于FMDV蛋白质的自体固有Th表位(表5，例如，SEQ ID NO：24)，被参考插入本文，或者设计的人工Th表位，如表6所示(例如，SEQ ID NOS：25、26、36、37、和38)。
本发明的免疫原均具有位点-特异性免疫反应性，以提供精确的指向FMDV的主要中和决定簇。提供了具体实施例，作为本发明肽的实施方式，例如，SEQ ID NOS：2、11。提供了进一步实施例，作为提供将合成的免疫刺激物质连接到FMDV VP2抗原位点上的本发明的优选肽(例如，表7-10中的SEQ ID NOS：27-34)，从而在遗传多样性宿种群种产生了抗FMDV VP1蛋白质上的目标抗原位点的广泛反应性的强效中和抗体。这些抗-VP1抗体导致对FMDV的有效中和，并因此保护免受FMDV感染。
对于主动免疫，本文中所指的术语“免疫原”涉及能够诱导抗FMDV的VP1蛋白质上存在的G-H环区抗体的肽组合物，产生对多种血清型FMDV的有效中和，因此预防FMDV感染。本发明的肽组合物优选包括含有混杂辅助T细胞表位(Th表位)和任选地其它免疫刺激物质的合成肽。Th肽经间隔区(例如，Gly-Gly)共价结合于FMDV VP1目标抗原区(例如，SEQ ID NOS：1-21、35)，从而结合于目标抗原位点的N-或C-末端，以便诱导有效的抗体应答。免疫原还可以包括一般性免疫刺激氨基酸序列，例如，相应于源自耶尔森氏鼠疫杆菌属的侵染素蛋白的结构域(Brett等，欧洲免疫学杂志，1993，23：1608-1614)(SEQ ID NO：22)。如果存在，一般性免疫刺激结构域可以包括一种间隔区，用于通过肽结合。
本发明的完全合成肽可以由下式表示：
(A)n-(FMDV抗原)-(B)o-(Th)m-X
                 或
(A)n-(Th)m-(B)o-(FMDV抗原)-X
                 或
(FMDV抗原)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
                 或
(Th)m-(B)o-(FMDV抗原)-(A)n-X
其中：
每个A独立地为一种氨基酸、或一种一般性免疫刺激序列；
每个B独立地选自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺基(ε-N)Lys-、和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺)-；
每个Th独立的是一种构成辅助T细胞表位的氨基酸序列，或一种免疫增强类似物或其片段；
“FMDV抗原”是一种合成的肽抗原，如下面的进一步定义；
X为一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
n为0至约10；
m为1至约4；和
o为0至约10。
本发明的肽免疫原包括约35到100个氨基酸残基，优选约45到90个氨基酸残基，更优选约50到75个氨基酸残基。
如果A为一种氨基酸，它可以是任何天然的或非天然的氨基酸。非天然的氨基酸包括但不限于D-氨基酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺氨酸、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸等。天然氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸。而且，如果m大于1，二个或三个A基团为氨基酸，那么每个氨基酸可以独立地相同或不同。
如果A为一种侵染素的结构域，则它可以是来自耶尔森氏鼠疫杆菌种侵染素蛋白的免疫刺激表位。这种免疫刺激特性来源于这种侵染素结构域与T细胞，特别是活化的免疫或记忆T细胞上存在的β1整联蛋白分子相互作用的能力。Brett等描述了与β1整联蛋白相互作用的侵染素结构域的特定序列(欧洲免疫学杂志，1993；23：1608)。在US5759551中已经描述过用于连接混杂Th表位的侵染素结构域(Inv)的一种优选实施方式，其经参考插入本文。Inv结构域优选具有如下序列：Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe(SEQ ID NO：22)，或为来源于另一种耶尔森氏鼠疫杆菌种侵染素蛋白相应区域的其免疫刺激类似物。因此这种类似物可以含有氨基酸残基的取代、删除或插入，以适应株系变异，只要类似物保留免疫刺激特性。(A)n优选包括一种间隔区，例如Gly-Gly，通过它所述侵染素结构域与肽连接。在一个优选实施方式中，(A)3依次为一种侵染素结构域(Inv)、甘氨酸和甘氨酸，即(Inv)-Gly-Gly。
B为一种间隔区，是一种上述的天然氨基酸或非天然氨基酸。每个B独立地相同或不同。B的氨基酸还可以在混杂Th表位和FMDVVP1抗原位点(例如，SEQ ID NOS：1-21和35)或其反应性和免疫功能类似物之间提供一种间隔区，例如Gly-Gly。除了使Th表位与B细胞表位物理分隔，Gly-Gly间隔区可以破坏Th表位与FMDV VP1抗原位点结合产生的所有人工二级结构，因此减弱了Th和/或B细胞应答之间的干扰。B的氨基酸还可以构成一种作为增强Th和FMDVVP1目标抗原位点分隔作用的柔韧性绞链的间隔区。在免疫球蛋白重链绞链区中发现了编码柔韧性绞链的序列的实例。柔韧性绞链序列通常富含脯氨酸。一种特别有用的柔韧性绞链为序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO:23)，其中Xaa为任意氨基酸，优选为天冬氨酸。白B的氨基酸提供的构象间隔使本发明的肽免疫原和合适Th细胞和B细胞之间的相互作用更为有效，由此增强了对Th表位和抗体-诱导性表位以及它们的交叉相互反应性和免疫功能类似物的免疫应答。
Th是一种含有Th表位的氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。Th表位可以由连续或不连续表位构成。因此不是Th的每一个氨基酸一定是表位的一部分。因此，Th表位，包括Th表位的类似物和片段，能够增强或刺激对FMDV VP1抗原位点(例如，SEQ ID NOS：1-21和35)及其免疫功能类似物的免疫应答。表现为免疫结构域和混杂的Th表位在动物和人群中与广泛的趋异进化MHC型具有高度和广泛的反应性(Partidos等，1991；US5759551)。本发明肽的Th结构域约具有10到50个氨基酸，优选约具有10到30个氨基酸。当出现多重Th表位(即m≥2)，则每个Th表位独立地相同或不同。Th片段是Th表位的连续部分，其足以增强或刺激对FMDV VP1抗原位点的免疫应答。
本发明的表位包括例如，但不限于，来源于外源病原体的Th，例如HBs TH、HBc Th、PT Th、TT Th、MVF Th、CT Th、DT Th、DF Th、SM Th，和TraT Th；来源于FMDV蛋白质的自体固有Th(表5，例如，SEQ ID NO：24)，被称为人工Th(例如，表6，SEQ ID NOS：25、26、36、37、和38)，以及免疫功能类似物。免疫功能Th类似物包括免疫增强类似物、反应性类似物和任何这些Th表位的片段。Th的免疫功能类似物优选在Th表位中插入保守取代、添加、删除，而基本上不改变Th表位的Th刺激功能。
“FMDV VP1抗原位点”指FMDV A12病毒株的VP1蛋白质的134-168位氨基酸(即，SEQ ID NO：1)，还指不同于FMDV A12病毒株的其它FMDV病毒株的VP1蛋白质片段的肽，其与FMDV A12病毒株的VP1蛋白质的134-168位氨基酸同源。FMDV VP1抗原位点还指相应于FMDV A12病毒株的VP1蛋白质的134-168位氨基酸的、具有来源于血清型为A、O或Asia型的FMDV病毒株VP1蛋白质氨基酸序列的共有序列的肽；以及符合SEQ ID NOS：14、16、18和20的一般定义的肽。FMDV VP1抗原位点还指为本文定义的SSAL的成员的肽。
按照本发明，FMDV VP1抗原位点(例如，SEQ ID NOS：1-21、35)的反应性和免疫功能类似物可以进一步含有保守取代、添加、删除、或插入1至约4个氨基酸残基，只要肽类似物能够诱导与FMDV VP1抗原位点(例如，SEQ ID NOS；1-21和35)反应的免疫应答。保守取代、添加、和插入可以用本文定义的天然或非天然氨基酸实现。
目标抗原位点优选从G-H环区的天然FMDV VP1序列通过将134位的天然天冬氨酸和157位的谷氨酰胺取代为半胱氨酸，在这两个半胱氨酸之间形成二硫键从而产生一种环状结构，修饰而成。(SEQ ID NO：2)。这些环状结构还可以含有1-13个来自VP1的134-157片段的任意末端的附加氨基酸，只要保留单一二硫键环状结构(SEQ ID NO：3)。对天然序列的修饰在表1中被表示为(N→C)、(Q→C)、(R→C)以及下划线的氨基酸。含有引入的半胱氨酸的肽序列可以提供为SSAL，例如，SEQ ID NOS：15、17、和19，这些SSAL也可以被用作FMDV VP2抗原肽位点。
因此，本发明的优选的肽免疫原是含有FMDV VP1抗原位点(例如，SEQ ID NOS：1-21和35)或其免疫功能类似物和Th肽的肽。更优选的肽免疫原是下述构建体，即含有一种FMDV VP1抗原位点或一种其反应性和免疫功能类似物；一种间隔区(例如，Gly-Gly)；一种Th表位，即HBs TH、HBc Th、PT Th、TT Th、MVF Th、CT Th、DT Th、DF Th、SM Th、TraT Th、FMDV蛋白质的自体固有Th(例如，SEQ ID NO：24)、或人工Th(例如，表6，SEQ ID NOS：25、26、36、37、和38)，或其类似物；以及，任选地，一种Inv结构域(SEQ ID NO：22)或其类似物。
含有本发明肽免疫原和两种或多种Th表位的混合物的疫苗可以增强更广泛种群的免疫效力，由此提供一种对FMDV VP1抗原位点的改善的免疫应答。
本发明的肽免疫原可以通过本领域普通技术人员公知的化学合成法制备。参见，例如，Fields等，《合成肽：用户指南》第三章，Grant，W.H.编，Freeman和Co.，NY，1992，p.77。因此，可以应用固相合成法——自动匹配Merrifield技术，用t-Boc或Fmoc化合物保护α-NH2，并应用侧链保护的氨基酸，在例如，430A或431型应用生物系统肽合成仪(the Applied Biosystems肽Synthesizer Models430A或431)上合成肽。可以通过以设计中具体说明的适当比例提供用于结合到一个特定可变位置上的选择氨基酸混合物，制备B或T细胞表位的含有构建的合成抗原文库(SSAL)的肽构建体。
完成所需肽免疫原的装配后，按照标准程序处理树脂，以从树脂上切除肽，并使氨基酸侧链上的功能基团脱封闭。通过HPLC纯化游离肽，通过例如氨基酸分析或通过测序鉴定生化特征。肽的纯化和特征鉴定方法对于本领域技术人员是公知的。
其它产生本发明的含有VP1G-H环和Th位点的肽构建体的化学方法包括通过形成一种“硫醚”键连接卤族乙酰化和半胱氨酰化肽。例如，可以将一个半胱氨酸加到含Th肽的C末端，半胱氨酸的巯基可以用于与结合到FMDV VP1抗原位点(例如，SEQ ID NOS：1-21)或其反应性和免疫功能类似物的N-末端的亲电基团，例如Nα氯乙酰修饰的或马来酰亚胺基来源的赖氨酸残基的α-或ε-NH2基形成一个共价键。在该模式中，可以得到Th-(FMDV VP1抗原位点)或其反向连接物，(FMDV VP1抗原)-Th。
本发明的免疫原还可以是聚合的。可以通过将免疫原与交联剂利用常规方法反应实现，例如通过戊二醛和赖氨酸残基的-NH2之间通过常规方法的反应。通过另一种方法，即通过应用一个添加到合成免疫原N-末端的附加半胱氨酸残基使合成肽免疫原聚合或共聚合。N-末端半胱氨酸的巯基可以用于与结合到分支的多聚-赖氨酰核心分子(例如，K2K、K4K2K或K8K4K2K)的卤族乙酰基修饰的氨基酸或一种马来酰亚胺来源的赖氨酸残基的α-或ε-NH2形成一种“硫醚”键。还可以通过在一种分支的多聚赖氨酰核心树脂上直接合成所需的肽结构，制备一种分支聚合物的本发明的免疫原(Wang等，科学，1991；254：285-288)。
或者，较长的合成肽免疫原可以通过公知的重组DNA技术合成。一些关于分子克隆技术的标准手册提供了详细的通过表达重组DNA和RNA制备本发明肽的方法。为了构建编码本发明肽的基因，将氨基酸序列逆向翻译成一种核酸序列，优选利用应用于基因将在其中表达的有机体的优化密码子。接着，制备编码肽的基因，通常通过合成编码肽和必需调控元件的重叠寡核苷酸。将合成基因整合入或插入适当的克隆载体。本发明包括的合成核酸序列包括编码本发明的肽、免疫功能同源物和类似物、以及特征在于非编码序列改变但没有改变被编码肽的免疫特性的核酸构建体的核酸序列。还提供了包含编码本发明肽序列的核酸。将合成基因插入适当的克隆载体，得到重组体并鉴定特征。然后在选择的表达系统和宿主适合的适当条件下表达肽。
本发明肽组合物的效果可以通过将免疫原制剂(例如SEQ IDNOS：27-34、36)注射动物，例如豚鼠和猪，然后监测对FMDV VP1抗原位点(例如，SEQ ID NOS：1-21、35，和其反应性和免疫功能类似物)的激素免疫应答，而证实，如实施例说明的那样。
本发明的另一方面提供了一种在一种药物可接受的传送系统中含有一种免疫有效量的一种或多种本发明的肽免疫原的药物组合物。因此，可以应用佐剂、药物可接受载体或其它疫苗组合物中常规提供的成分将本发明的肽组合物配制成一种疫苗组合物。可以用于本发明的佐剂或乳化剂包括明矾、不完全弗氏佐剂、liposyn、皂甙、角鲨烯、L121、emulsigen、单磷脂酰脂类A(MPL)、二甲基-二-十八烷基溴化氨(DDA)、QS21、ISA206、和ISA720，以及其它已知的有效佐剂和乳化剂。所述制剂包括速释和/或缓释制剂，以及用于诱导系统免疫性和/或诱导局部粘膜免疫性的制剂，其可以通过，例如，免疫原包封或与微粒共同给药实现。本领域普通技术人员能够容易地确定所述制剂。本发明的疫苗可以通过任何常规途径给药，包括皮下、口服、肌内、或其它非肠道或肠道途径给药。同样，免疫原可以作为单剂量或多剂量给药。本领域普通技术人员能够容易地确定免疫方案。
上述核酸自身可以用作称之为“DNA疫苗”的成分。在本发明的所述实施方式中，通过将编码所述肽的核酸导入患者自身细胞，诱导本发明的免疫原性肽在那些细胞中表达。制备和应用DNA疫苗的方法公开于US专利5580859，5589466，和5703055；同时参见WO97/02840和W.
Figure G2008101610837D0022171052QIETU
和F.Askari，新英格兰医学杂志，1996，334：2-45，它们均经被参考插入本文。认为制备和应用本发明的肽和肽结合物的方法在本发明的范围内。
本发明的免疫原性组合物含有一种有效量的一种或多种本发明的肽免疫原和一种药物可接受的载体。在一种适当剂量单位剂型中的组合物通常含有每公斤体重约0.5μg到约1mg的免疫原。如果以多剂量给药，可以方便地分成每剂量单位制剂适当量。例如，初始剂量，例如0.2-2.5mg；优选1mg由本发明的肽组合物表示的免疫原将通过注射优选肌肉内注射给药，然后施用重复剂量(增强量)。剂量将根据患者的年龄、体重和一般健康状况而定，正如疫苗和治疗领域公知的那样。
对FMDV VP1抗原位点免疫原的免疫应答可以通过捕获在O’Hagan等(疫苗，1991；9：768)描述类型的生物可降解微粒中或其上传送来改进。可以将免疫原与或不与佐剂包封入生物可降解微粒，以强化免疫应答，包括局部粘膜免疫，并提供用于口服给药和用于具备给药的延时或周期应答的时间控制释放(O’Hagan等，1991；和Eldridge等，1991；28：287)。
该肽组合物用于诱导对FMDV的中和抗体，并用作预防和根除FMD的疫苗。
在下面的实施例中提供了具体肽免疫原和组合物，用于举例说明本发明。这些实施例的目的仅在于说明，不对本发明的范围构成任何方式的限制。
实施例的目标抗原位点肽通过实施例1中描述的固相法合成。举例说明的是从已知病毒分离株修饰得到的线形和环状FMDV VP1抗原位点，包括来自其它FMDV血清型和亚型的类似物和肽同源物(例如，SEQID NOS：1-7)和共有区域(例如，SEQ ID NOS：8-13)和SSAL肽(例如，SEQ ID NOS：14-21和35)。用于这些实施例的每种肽在免疫原元件(例如，SEQ ID NOS：30-32)之间具有Gly-Gly间隔区，但本发明的肽还可以含有其它间隔区(例如，SEQ ID NO：23)或没有间隔区。Th包括来源于外源病原体例如乙肝病毒的混杂辅助位点，以及其它被参考插入本文的Th，来源于FMDV的自体固有Th(例如，SEQ ID NO：24)，和人工Th(例如，SEQ ID NOS：25、26、和36-38)。这些实施例的肽还包括一种任选的一般性免疫刺激位点(例如，SEQ ID NO：22)。
实施例1
评价目标抗原肽的典型程序
合成肽涉及的FMDV
通过Merrifield固相合成技术，在应用生物系统自动匹配肽合成仪(430、431和433A型)上，用Fmoc化合物合成具有来源于FMDV VP1G-H环区序列的肽。可以通过以表2、3、4、6和10中所示的用于SSAL的设计公式中具体说明的适当比例，或者如果设计公式中没有具体说明则以等摩尔比例，提供用于结合到一个特定可变位置上的选择氨基酸混合物，制备B或T细胞表位的含有构建的合成抗原文库(SSAL)的肽构建体，例如，“O SSAL”(SEQ ID NO：19)或“1、4、9PALINDROMIC Th”(SEQ ID NO：26)。完成所需肽免疫原的组装后，应用三氟乙酸按照标准程序处理树脂，以从树脂上切除肽，并使氨基酸侧链上的功能基团脱封闭。对于环状肽，将切除下来的肽在15％DMSO的水溶液中溶解48小时，以促进半胱氨酸之间链间二硫键的形成。切除、提取和清洗的肽通过HPLC纯化，通过质谱和反相HPLC鉴定特征。将它们用作研制疫苗的免疫原或评价其与免疫动物获得的血清的反应性的抗原底物。
豚鼠和猪的免疫
将三只Duncan Hartley豚鼠(雌性，9周龄，450gm，未感染病毒)和猪(雌性，9周龄)构成的实验组用于和合成FMDV VP1目标抗原肽免疫原的免疫原性研究。用每剂量100μg的含有本发明的肽组合物的单独目标抗原肽或其在特定佐剂制剂中乳化而成的混合FMDV疫苗，在第0周和第3周肌内注射免疫每只动物。在0、3、5和8或10周对动物取血，进行免疫原性测试。
免疫原性评价
合成目标抗原肽免疫原的免疫原性测试通过基于合成FMDVVP1肽的ELISA，利用仅含目标中和位点的相应FMDV VP1目标抗原肽仅作为固相抗原进行。实验连续稀释的实验动物血清，阳性效价表示为稀释度倒数的Log10。血清阳性样品收集成组，通过确定抗下述多种FMDV分离株的中和活性扩大免疫原性测试。
基于合成VP1(AA134-168)肽的ELISA
在用100μL5μg/ml FMDV VP1位点肽的10mL NaHCO3缓冲液(pH9.5)于37℃保温1小时涂布的96孔肽涂布平板中，进行基于肽的ELISA。将250μL3％重量百分比的明胶PBS溶液加入肽涂布孔中，于37℃保温1小时，以阻断非特异性蛋白结合位点，用含有体积比为0.05％TWEEN20的PBS冲洗3次，然后干燥。用含有体积比20％的正常山羊血清、重量比1％的明胶、和体积比0.05％的TWEEN的PBS溶液，以1：20(体积：体积)的稀释度稀释实验样品，除非另有说明。将100μL稀释样品加入各孔，使其在37℃反应1小时。然后用体积比0.05％TWEEN20的PBS冲洗各孔6次，除去未结合的标记抗体。将100μL辣根过氧化酶标记的山羊抗-豚鼠或抗猪IgG以预先确定的优化稀释度在体积比1％的正常山羊血清、体积比0.05％的TWEEN20的PBS中形成的溶液加入各孔，在37℃保温15分钟。用体积比0.05％TWEEN20的PBS冲洗各孔6次，除去未结合的标记抗体结合物，然后与100μL含有重量比0.04％的间苯二胺(OPD)和体积比0.12％的过氧化氢的柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)反应15分钟。加入100μL1.0M H2SO4中止反应，测定492nm(A492)的吸收度。在对吸收度进行线性回归分析，并将截止点A492设置为0.5的基础上，计算表示为Log10的ELISA效价。
EMDV病毒
在密封条件下，在Plum Island动物疾病中心，USDA(Greenp ort，NY)，基本上如Brown和Cartwright(遗传微生物杂志，1963，31：179-186)所述将各种FMDV病毒株(例如，血清型A的A12和A24、血清型O的O1、O2等)在小仓鼠肾(BHK)细胞单层中生长，然后，用1％SDS或1％Nonidet P-40处理沉淀，之后进行15-45％蔗糖梯度离心纯化。将各离心管中的内容物泵入波长设置在260nm的流动细胞分光光度计，鉴定和分离纯化的病毒峰。
FMDV中和活性的血清学评价
从猪(前大静脉)和豚鼠(心脏穿刺)采集的血液处理血清样品，在-20℃保藏直到用于实验。通过在一系列不断增加病毒浓度，应用上述制备的各种血清型等分样(10000MPD50)进行中和确定，对由1：100稀释度的血清样品中和的病毒进行列举。通过操作的实验方法(Morgan和Moore，Am J Vet Res，1990，51：40-45)产生的在1：100稀释度时提供FMDV微噬斑降低2.5Log10的血清的动物，对于抗FMDV感染的保护性免疫是高度可预测的。
实施例2
通过序列信息和免疫刺激元件优化FMDV目标抗原肽
表7中描述了7种FMDV VP1血清型A肽。排列它们相应的VP1氨基酸序列，并如表1中那样编号。该组的携带Th的肽具有鉴定作表5中描述的VP121-40(SEQ ID NO：24)的自体固有FMDV Th，其序列如下：Glu-Thr-Gln-Ile-Gln-Arg-Arg-Gln-His-Thr-Asp-Val-Ser-Phe-Ile-Met-Asp-Arg-Phe-Val(SEQ ID NO:24)。详细描述了表7中七个构建体中的五个的序列，表示为SEQ ID NOS：1、2、和27-29。合成了这些肽，产生的免疫血清进行免疫原性评价。通过肽-ELISA分析了初始免疫5周后得到的血清的FMDV VP1肽的反应性，并通过标准FMDV中和分析，应用病毒株AFP作为目标病毒分析了其中和FMDV血清型A的能力。
血清的效力表示为血清稀释度为1：100时，Log10抗FMDV VP1ELISA效价和Log10被中和的FMDV AFP(MPD50)。
结果：
无Th和环化的A12(134-159)肽p2228a，以及无环化的p2229c分别在三只动物中的一只和三只动物中的二只诱导抗-肽抗体应答。相比较而言，较长的肽p2224a、A12(134-169)，以及较长的环化肽在三只动物中的三只均具有免疫原性。另外，环化的A12(134-159)肽p2233c在三只豚鼠中的三只均具有免疫原性。在免疫反应血清样品中，所有七个肽构建体的ELISA效价相似。
然而，通过评价血清中和活性，肽构建体之间观察到明显的差异，其顺序排列为：p2228a<p2224a<p2229c<p2225c<p2223a<p2236c.
基于该中和效力的排列顺序，得出下列关于优化的FMDV VP1抗原肽的结论：
(1)覆盖从134-169位氨基酸残基的较长肽构建体提供较高的中和效力，因此比其它较短序列(AA134-159)(例如，p2224a>p2228a，p2225c>p2229c，and p2236c>p2233c)更为优选；
(2)人工环化合成构建体提供更理想的构象，因此比它们的相应非环化构建体(例如，p2223a>p2229c and p2236c>p2225c)更为优选；
含有免疫刺激元件的合成构建体提供更高的中和效力，因此比没有免疫刺激元件的构建体(例如，p2236c>p2223a；p2229c>p2228a；and p2225c>p2224a)更为优选。
实施例3
应用提供广泛FMDV中和作用的VP1蛋白质的超可变区共有序列的合成构建体
按照表1(SEQ ID NO：11)所示的共有血清型O序列，设计应用共有VP1目标抗原位点的两个合成的环状构建体。用包括Inv结构域(SEQ ID NO：22)和表6所示的人工SSAL Th(SEQ ID NO：26)的免疫刺激元件合成一种共有序列肽。合成了无附加免疫刺激元件序列的其它构建体。这些FMDV VP1构建体的全部结构描述为表8a的p2569a(SEQ ID NO：11)，和表8b(SEQ ID NO：30)的p2570c。
对超免疫豚鼠初始免疫3和5周后得到的血清，通过肽ELISA评价其FMDV VP1肽的反应性，通过标准FMDV中和分析，应用FMDV病毒株AFP、O-1PI、O-1Taiwan、OFran、OTaiwan、Okauf和Asia1作为目标病毒评价它们中和FMDV多种血清型O、A和Asia的能力。
当单次免疫证明两种合成FMDV免疫原的高免疫效力后的第3周，观察到高抗-FMDV VP1肽抗体效价。然而，早在初始免疫后第3周看到的血清的高中和活性，以及其对交叉血清型A、O、和Asia的特异性的宽范围是没有预料到的。该广泛范围的中和活性在甚至从灭活病毒储备液制得的最好FMDV疫苗中也很少观察到。
FMDV目标抗原肽的共有序列设计为广泛反应性中和活性的FMDV疫苗提供了基础。
实施例4
改善FMDV VP1免疫原性和FMDV中和范围宽度的人工Th和SSAL目标抗原肽
设计了两种目标抗原肽，p1522b(SEQ ID NO：31)和p1592c(SEQID NO：32)，每种具有作为构建的合成抗原文库(SSAL)的FMDV目标抗原位点。这两种肽在表9中描述。p1522b(SEQ ID NO：31)的SSAL目标抗原位点是从表3中的血清型O亚型编辑得到的G-H环VP1区的一种完全代表。该目标抗原位点按照表3所示的“O SSAL(完全)”序列(SEQ ID NO：19)设计。同样，p1592c含有一种代表表4列出的血清型Asia亚型的所有G-H环序列的SSAL目标抗原位点。该Asia的SSAL位点按照表4所示的“Asia SSAL”序列(SEQID NO：21)设计。将在表6中被称为“Syn Th(1、2、4)”(SEQID NO：25)的人工Th连接于1522b和p1592c，以产生免疫原性，将Inv免疫刺激位点(SEQ ID NO：22)偶联到p1592c上。
合成了这两种SSAL目标抗原肽，用于如实施例1所述超免疫3只豚鼠的实验组。通过肽-ELISA评价初始免疫后五周和十周得到的血清的FMDV VP1肽反应性，通过标准FMDV中和分析，应用FMDV病毒株A1、A12FP、AFL、A23、O-1JH、O-1p2、和Asia1作为目标病毒评价它们中和FMDV血清型O、A和Asia的能力。结果如表9所示。
p1522b和p1592c初始免疫后5周均诱导高抗目标抗原位点(>5.0Log10)抗-肽效价(没有进行更早的取血)。观察到这两种抗血清对属于三种不同血清型(即，A、O和Asia)的所有七种FMDV病毒株具有广泛和有效FMDV中和作用，尽管这些病毒株和血清型序列之间存在广泛的变异。这证明了SSAL在设计针对高可变性目标抗原/功能位点的基于合成肽的疫苗中的有用性。
SSAL用于设计FMDV目标抗原肽提供了广泛反应性中和活性FMDV疫苗的基础。
实施例5
保护性FMDV中和作用的多种血清型混合物
表10中描述了具有合成肽p1520b、p1522b、和p1888b(SEQ IDNO：33、31和34)的三种SSAL目标抗原肽混合物。该混合物包括连接于人工Th表位“Syn Th(1、2、4)”(SEQ ID NO：25)的代表血清型A(SEQ ID NO：15，表2)、血清型O(SEQ ID NO：19，表3)、和血清型Asia(SEQ ID NO：35，表10)的SSAL目标抗原位点。该混合物用于接种3只豚鼠的动物组。将100μg剂量0周在弗氏完全佐剂中，第3周在弗氏不完全佐剂中分3周给药。通过用于FMDV VP1抗原位点的肽ELISA，和FMDV中和分析，其中来自最近一次爆发的未知VP1序列的病毒株，O1-Taiwan用作目标病毒，评价初始免疫之后得到的血清的免疫原性。所有三只猪对免疫均产生高抗-肽反应性的应答(平均FMDV VP1ELISA效价未3.7Log10)。尽管FMDV01-Taiwan VP1序列的性质未知，从三次接种的宿主得到的1：100稀释的浓缩血清证明其具有显著的中和活性，即4.5Log10。该水平的中和活性预测可用于FMDV感染的保护性免疫。基于PlumIsland动物疾病中心，USDA(M或gan和Mo或e，1990)在预测一种疫苗的FMDV保护性质方面积累的大量经验来看，在体外分析中能够中和2Log10FMDV(MPD50)的血清预期在接种宿主中对抗FMDV感染具有有效的保护作用。
该观察与用本发明的保护猪(一种疫苗的目标宿主)免受感染的具保护作用的肽组合物接种的免疫应答相关。证明了本发明的FMDVVP1肽组合物作为一种有效的普遍性FMDV疫苗(即，有效地抗多种血清型的抗原性可变分离株)的潜力，以及自从早在二十世纪五十年代应用灭活FMDV疫苗以来没有实现的任务。
实施例6
评价免疫状况的肽
将本发明的肽加入ELISA实验，用于评价有接触FMDV和接种的已知状况畜群的血清反应性。选择使用的肽为具有代表性的用于接种的FMDV病毒株，认为该肽与动物可能接触的野生病毒株具有同样的血清型。
制备用于诊断实验的试剂盒，其曾在“基于合成VP1(AA134-168)肽的ELISA”实施例1部分中描述过。将平板用相应于病毒株01Campos(p2463＝AA128-158(T→C)-169)和病毒株01Manisa(p2466＝AA128-158(T→C)-169)的VP1肽作为固相抗原涂布。将这些试剂盒用于测试从曾经历FMD爆发9个月的农村畜群收集到的血清样品。将这些畜群按照它们的已知状况分成“可能感染”和“由于接种可能感染”(从经历爆发的区域)、“接种”、和“正常”(从认为没有FMDV的区域)。吸收度显示在或高于强烈反应性对照的吸收度截止点0.2倍的样品记录为反应性。结果如表11所示。
这些结果表明，基于肽的ELISA对畜群的接触具有预测性。接触的畜群表现明显的反应性，约为20％，而来自正常畜群的动物没有反应性。如果在比9个月更接近爆发的时间进行实验，接触畜群的20％反应性可能还会高。应用来自几个供应商的常规疫苗的各种接种程序的功效中，接种畜群的结果表现了出乎意料的可变性程度、高可变性的反应性。
本发明引证的所有参考文献被参考插入其中。
Figure G2008101610837D00311
Figure G2008101610837D00321
Figure G2008101610837D00331
Figure G2008101610837D00341
表5
EMDV T细胞辅助表位(Th)
 
FMDV Th的来源 宿主物种 参考文献
VP1(35-53) 牛 Van Lierop等，免疫学，84：79，1995
VP2(74-88) 牛 Van Lierop等，免疫学，84：79，1995
VP4(20-34) 牛 Collen等，遗传病毒学杂志，71：309，1990
VP1(21-40)(SEQ ID NO：24) 牛 Collen等，免疫学杂志，146：749，
VP1(135-144) 小鼠 Zar或ano等，病毒学212：614，1995
VP1(62-76) 猪 Rodriguez等，病毒学，205：24，1994
VP1(83-104) 猪 Rodriguez等，病毒学，205：24，1994
VP1(188-209) 猪 Rodriguez等，病毒学，205：24，1994
VP1(111-132) 猪 Rodriguez等，病毒学，205：24，1994
表6
人工T细胞辅助表位(Th)的序列
 
描述 氨基酸序列 Seq.ID No.
Syn Th(1，2，4) KKKIITITRIITIITTID SEQ ID NO:25
IS(1，4，9PALINDROMIC)LF简化Th ISISEIKGVIVHKIEGILFT RT TR T              SEQ ID NO:26
IS(1，4，9PALINDROMIC)LF Th ISISEIKGVIVHKIEGILFMT RT TRM TML L V                 SEQ ID NO:38
(1，4，9PALINDROMIC)Th ISEIKGVIVHKIEGIMT RT TRM TMLLV             SEQ ID NO:36
(1，4，9PALINDROMIC)LF简化Th ISEIKGVIVHKIEGIT RT TR T          SEQ ID NO:37
Figure G2008101610837D00361
Figure G2008101610837D00371
               
Figure G2008101610837D00381
Figure G2008101610837D00391
表11
ELISA鉴定已知免疫学状态的畜群的反应性
 
物种 畜群状态 n ELISA反应性数目        ％ELISA反应性 
猪 可能感染 108 21 19.4％
猪 接种可能感染 70 16 22.8％
猪 接种 100 92 92.0％
猪 接种 31 17 54.8％
猪 接种 70 26 37.1％
山羊 接种 288 155 53.8％
牛 接种 33 5 15.1％
牛 接种 30 2 6.7％
猪 正常 100 0 0％
SEQUENCE LISTING
<110>Chang Yi，Wang
     Ming，Shen
<120>口蹄疫的合成肽疫苗
<150>US09/100,600
<151>1998-06-20
<160>38
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>35
<212>PRT
<400>1
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<212>PRT
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Figure G2008101610837D00425
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Figure G2008101610837D00442
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>Xaa＝Asn，Ser或Gly
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>Xaa＝Ser，Thr或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝Val或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Ser，Gly或Asp
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>Xaa＝Ser，Thr或Met
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝Gly或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝Arg或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>Xaa＝Leu，Met或Phe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa＝Gly或Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa＝Ser或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa＝Ala或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa＝Ala或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa＝Lys，Arg或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa＝Gln或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa＝Ala或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>Xaa＝Tyr或Phe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Ile或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(35)..(35)
<223>Xaa＝Lys或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(35)..(35)
<223>Xaa＝″Lys或Gln″
<400>14
Figure G2008101610837D00471
<210>15
<211>35
<212>PRT
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝Ser，Thr或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝Val或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Ser，Gly或Asp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝Ser，Thr或Met
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝Gly或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝Arg或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>Xaa＝Leu，Met或Phe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa＝Gly或Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa＝Ser或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa＝Ala或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa＝Ala或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa＝Lys，Arg或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa＝Ala或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>Xaa＝Tyr或Phe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Ile或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(35)..(35)
<223>Xaa＝Lys或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(35)..(35)
<223>Xaa＝″Lys或Gln″
<400>15
Figure G2008101610837D00491
<210>16
<211>34
<212>PRT
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa＝Asn，Ser或Gly
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝Tyr或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝Ser或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝Thr，Ala，Pro，Arg，Ser或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Asp，Gly，Ser，Ala，Pro或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝Gly，Asp或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝Pro，Ser，Arg，Thr，Val，Gln或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝Arg，Gly或Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝Arg，Ser，Ala，Gly或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa＝Gly或Asp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa＝Asp或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa＝Leu，Met，Thr或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>Xaa＝Gly，Pro或Trp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa＝Ser，Pro，Ala或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa＝Leu，Pro，Thr或Ile
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa＝Ala，Thr，Leu，Arg或Ile
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa＝Ala，Gly，Thr或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa＝Arg，Glu或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa＝Ala，Val，Asp，Thr或Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>Xaa＝Ala或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa＝Lys，Thr，Arg或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa＝Leu或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>Xaa＝Pro或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>Xaa＝Ala或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>Xaa＝Tyr或Phe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(33)..(33)
<223>Xaa＝Ile或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Arg，Lys或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝″Arg，Lys或Gln″
<400>16
Figure G2008101610837D00531
<210>17
<211>34
<212>PRT
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Lyr或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝Tyr或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝Ser或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝Thr，Ala，Pro，Arg，Ser或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Asp，Gly，Ser，Ala，Pro或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝Asp，Gly或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝Pro，Ser，Arg，Thr，Val，Gln或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝Arg，Gly或Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝Arg，Ser，Ala，Gly或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa＝Gly或Asp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa＝Asp或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa＝Leu，Met，Thr或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>Xaa＝Gly，Pro或Trp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa＝Ser，Pro，Ala或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa＝Leu，Pro，Thr或Ile
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa＝Ala，Thr，Leu，Arg或I le
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa＝Ala，Gly，Thr或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa＝Arg，Glu或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa＝Ala，Val，Asp，Thr或Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>Xaa＝Ala或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa＝Lys，Thr，Arg或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa＝Leu或Pro
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>Xaa＝Pro或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>Xaa＝Ala或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>Xaa＝Tyr或Phe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(33)..(33)
<223>Xaa＝Ile或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝Arg，Lys或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>Xaa＝″Arg，Lys或Gln″
<400>17
Figure G2008101610837D00571
<210>18
<211>36
<212>PRT
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa＝″Cys或Ser″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝″Lys，Arg或Gln″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝″Gly，Ser或Asn″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝″Glu，Ser，Asp，Thr，Lys或Asn″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝″Asn，Ser，Gly，Val或Trp″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝″Ala，Ser，Thr或Gly″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝″Thr，Pro或Ala″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝″Asn或Ala″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa＝″Val，Ile或Leu″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa＝″Leu，Pro或Gln″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa＝″Gln或Asn″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa＝″Val，Ala或Leu″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa＝″Ala，Glu或Ser″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa＝″Gln或Arg″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa＝″Ala或Val″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa＝″Ala或Glu″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>Xaa＝″Thr，Ala或Met″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>Xaa＝″Thr或Ala″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa＝″Ser或Tyr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>Xaa＝″Lyr或Arg″
<400>18
Figure G2008101610837D00601
<210>19
<211>36
<212>PRT
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝″Lys，Arg或Gln″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝″Gly，Ser或Asn″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝″Glu，Ser，Asp，Lys或Asn″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝″Asn，Ser，Gly或Trp″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝″Ala，Ser或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝″Thr，Pro或Ala″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝″Asn或Ala″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa＝″Val，Ile或Leu″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa＝″Leu，Pro或Gln″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa＝″Gln或Asn″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa＝″Val，Ala或Leu″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>Xaa＝″Ala，Glu或Ser″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa＝″Gln或Arg″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa＝″Ala或Val″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa＝″Ala或Glu″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>Xaa＝″Thr，Ala或Met″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>Xaa＝″Thr或Ala″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa＝″Ser或Tyr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>Xaa＝″Lyr或Arg″
<400>19
Figure G2008101610837D00621
<210>20
<211>34
<212>PRT
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa＝″Thr，Pro或Arg″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝″Thr或Pro″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝″Thr，Glu或Lys″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝″Gln或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝″Pro或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝″Ser或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa＝″Met或Leu″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa＝″Ala或Val″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa＝″Leu或Val″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa＝″Arg，Asn或Ala″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>Xaa＝″Arg或Gln″
<400>20
Figure G2008101610837D00641
<210>21
<211>34
<212>PRT
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝″Thr或Pro″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝″Thr，Glu或Lys″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝″Gln或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝″Pro或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝″Ser或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa＝″Met或Leu″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>Xaa＝″Ala或Val″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa＝″Leu或Val″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>Xaa＝″Arg，Asn或Ala″
<400>21
Figure G2008101610837D00661
<210>22
<211>16
<212>PRT
<400>22
Figure G2008101610837D00662
<210>23
<211>6
<212>PRT
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝″任意氨基酸，优选天冬氨酸″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝″任意氨基酸，优选天冬氨酸″
<400>23
Figure G2008101610837D00663
<210>24
<211>20
<212>PRT
<400>24
Figure G2008101610837D00664
<210>25
<211>18
<212>PRT
<400>25
Figure G2008101610837D00671
<210>26
<211>19
<212>PRT
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝″Ser或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝″Lys或Arg″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝″Gly或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa＝″His或Thr″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa＝″Lys或Arg″
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa＝″Gly或Thr″
<400>26
Figure G2008101610837D00681
<210>27
<211>65
<212>PRT
<400>27
Figure G2008101610837D00682
<210>28
<211>75
<212>PRT
<400>28
Figure G2008101610837D00683
<210>29
<211>75
<212>PRT
<400>29
Figure G2008101610837D00684
Figure G2008101610837D00691
<210>30
<211>80
<212>PRT
<400>30
Figure G2008101610837D00692
<210>31
<211>56
<212>PR
<400>31
<210>32
<211>72
<212>PRT
<400>32
Figure G2008101610837D00694
Figure G2008101610837D00701
<210>33
<211>55
<212>PRT
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<400>38
Figure G2008101610837D00781

Claims (7)

1.一种肽，其序列为SEQ ID NO：11所示的序列。
2.一种药物组合物，含有免疫有效量的权利要求1的肽和药用载体。
3.权利要求2的药物组合物，其中所述免疫有效量是每剂量每公斤体重0.5μg到1mg。
4.权利要求2的药物组合物在制备用于在哺乳动物中产生抗-FMDV抗体的药物中的应用。
5.权利要求4的应用，其中所述哺乳动物选自由牛、猪、绵羊和山羊组成的组。
6.一种由编码权利要求1的肽的序列组成的核酸。
7.权利要求1的肽在制备用于诊断哺乳动物中FMDV感染的药物中的应用。
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