ES2319483B1 - Construccion peptidica dendrimerica para la prevencion de la fiebre aftosa en animales. - Google Patents
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Abstract
Construcción peptídica dendrimérica para la
prevención de la fiebre aftosa en animales.
Esta construcción es una de fórmula (I) en
donde: T es un péptido que comprende la secuencia SEC ID NO: 1 ó un
fragmento de la misma; B es un péptido que comprende la secuencia
SEC ID NO: 2 ó un fragmento de la misma; X es un grupo acilo unido
al extremo N-terminal de B; n es 3 ó 4; y L
corresponde a un núcleo de lisinas de fórmula (II) en donde W es un
grupo conector; Z_{1}-Z_{4} son iguales o
diferentes entre sí y se seleccionan del grupo que consiste en
cisteína y OH, con la condición que al menos tres de los grupos
Z_{1} a Z_{4} sean cisteína; enlazándose B al núcleo de lisinas
por su extremo C-terminal y T enlazándose a dicho
núcleo por su extremo N-terminal.
Description
Construcción peptídica dendrimérica para la
prevención de la fiebre aftosa en animales.
Esta invención se relaciona con el campo de la
veterinaria en general y específicamente con la inmunología y la
síntesis química. En particular, la presente invención se refiere a
una construcción peptídica dendrimérica, a un procedimiento para su
preparación así como a las aplicaciones derivadas de su uso como
inmunógeno.
El virus de la fiebre aftosa (también abreviado
como VFA, en inglés
"foot-and-mouth disease
virus", FMDV) es un picornavirus que produce una enfermedad
altamente transmisible y devastadora en el ganado doméstico,
principalmente en vacas, ovejas y cerdos.
En los animales el virus penetra por el epitelio
(puede ser por la boca o las vías respiratorias). Llega a la sangre
y provoca fiebre en los primeros días para posteriormente aparecer
vesículas en boca, morro, espacios interdigitales, pezones, mamas y
zonas de piel fina en general; las vesículas se rompen dejando un
afta o erosión que luego se cubre de piel. Las heridas o aftas se
suelen infectar por bacterias y esto dificulta mucho la curación y
el restablecimiento de los animales. Las infecciones secundarias
pueden dar lugar a mamitis, desprendimiento de la pezuña, etc., que
complican y comprometen la supervivencia del animal. Si no hubiera
infecciones secundarias, la enfermedad por sí misma no causaría
tantas bajas.
La partícula del VFA contiene una cadena de RNA
de polaridad positiva de unos 8.500 nucleótidos, que se encuentra
incluida en la cápside icosaédrica compuesta por 60 copias de cada
una de las cuatro proteínas virales VP1-4. El RNA
genómico codifica una única poliproteína a partir de la cual se
generan las diferentes proteínas virales, mediante procesamiento
proteolítico debido a la acción de diferentes proteasas virales,
entre las que se incluyen nueve proteínas
no-estructurales (NSP) maduras. Cada una de estas
NSP, así como algunos de sus polipéptidos precursores, están
implicados en funciones importantes para el ciclo de multiplicación
vírico en las células infectadas. El VFA presenta una elevada
variabilidad genética y antigénica, que se refleja en la existencia
de siete serotipos y numerosas variantes.
Por otro lado, ha sido caracterizada en detalle
la estructura antigénica del VFA, tal como es reconocida por
linfocitos B. El principal epítopo B considerado como el principal
inmunógeno del virus (contra el que van la mayoría de anticuerpos,
especialmente los neutralizantes), localizado en uno de los motivos
estructurales definidos en la superficie de la cápside, es continuo
e inmunodominante (sitio A) y se sitúa en el bucle
G-H, en torno a las posiciones
140-160 de la proteína VP1 (cfr. Bittle J.L. et
al., "Protection against
foot-and-mouth disease by
immunization with a chemically synthesized peptide predicted from
the viral nucleotide sequence", Nature 1982, vol. 298,
pp. 30-33). Dicho epítopo ha sido utilizado como
inmunógeno en diversos estudios (cfr. Brown F., "New approaches
to vaccination against
foot-and-mouth disease",
Vaccine 1992, vol. 10(14), pp.
1022-1026). En 1986, DiMarchi y colaboradores (cfr.
DiMarchi et al., "Protection of cattle against
foot-and-mouth disease by synthetic
peptides", Science 1986, vol. 232, pp.
639-641) obtuvieron protección frente al desafío
viral, en vacas inmunizadas con un péptido en el que los residuos
140-160 de la proteína VP1 se sintetizaron
colinealmente con los residuos de las posiciones
200-213 de la misma proteína. Sin embargo, trabajos
posteriores empleando un número significativo de animales mostraron
limitaciones en la protección inducida por este epítopo peptídico
en hospedadores naturales del VFA (cfr. Barteling S.J,
"Possibilities and limitations of synthetic peptide vaccines",
Adv. Biotechnol. Processes. 1988, vol. 10, pp.
25-60).
Se han identificado además, varios epítopos T
celulares reconocidos por linfocitos de cerdos infectados con el
VFA, en proteínas no estructurales (cfr. Blanco E. et al.,
"Immunodominant T Cell epitopes in non-structural
polypeptides of Foot-and-mouth
Disease Virus", Journal of Virology 2001, vol. 75, pp.
3164-3174). Entre ellos, el epítopo T de la proteína
3A[21-35], sintetizado colinealmente con el
epítopo B de VP1 [137-156], fue capaz de estimular
eficientemente linfocitos de un animal infectado e inducir niveles
significativos de actividad neutralizadora del virus in
vitro, específica de serotipo.
Por un lado, el problema de la infección
provocada por el virus de la fiebre aftosa, que ha causado tanta
alarma sanitaria, es que es muy contagiosa. Los animales infectados
liberan virus por la saliva (además suele haber salivación
abundante en esta enfermedad), en la orina y en las heces; al
romperse las vesículas, éstas liberan también virus de su interior.
También la leche y la carne contienen virus. Todo ello hace que lo
que está en contacto con el animal se contamine fácilmente: suelo,
útiles, vehículos, carne, etc. Además, en determinadas condiciones,
el virus es muy resistente. Todo esto hace que sea muy fácil la
transmisión de la enfermedad al personal que trata a los animales.
Por tanto, es necesario tomar estrictas medidas de precaución, para
evitar el contagio y dispersión de ésta enfermedad que, aunque no
es peligrosa para el hombre, sí que puede ocasionar grandes
pérdidas económicas.
Actualmente, el control de la fiebre aftosa se
lleva a cabo, fundamentalmente, mediante el empleo de vacunas
basadas en el virus inactivado. Tanto la infección por VFA como la
inmunización basada en estas vacunas inducen, habitualmente, altos
niveles de anticuerpos circulantes específicos que se correlacionan
con la protección frente al virus homólogo y virus antigénicamente
relacionados.
\newpage
Por otro lado, a pesar de los avances realizados
en los últimos años, las vacunas conocidas y utilizadas hasta hoy
presentan limitaciones, como son el requerimiento de una cadena de
frío para preservar su estabilidad, la necesidad de revacunaciones
periódicas, el riesgo de liberación de virus infeccioso durante su
producción, y su carácter no-marcador, es decir la
dificultad para distinguir serológicamente animales infectados de
aquéllos que han sido vacunados.
Estas limitaciones llevan a la búsqueda de
inmunógenos alternativos y seguros.
Los inventores de la presente invención han
diseñado una construcción peptídica dendrimérica la cual
administrada a los animales, y en particular a los cerdos, genera
una respuesta del sistema inmune que resulta efectiva,
proporcionando una protección total contra el virus de la fiebre
aftosa.
Así, en un primer aspecto la presente invención
se refiere a una construcción peptídica dendrimérica de fórmula
(I):
(I)(X-B)_{n}-L-T
donde
T es un péptido que comprende la secuencia SEC
ID NO: 1;
B es un péptido que comprende la secuencia SEC
ID NO: 2;
X es un grupo acilo el cual está unido al
extremo N-terminal del péptido B;
n es 3 ó 4; y
L corresponde a un núcleo de lisinas de fórmula
(II)
- \quad
- donde
- \quad
- W es un grupo conector;
- \quad
- Z_{1}-Z_{4} son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan del grupo que consiste en cisteína y -OH, con la condición que al menos tres de los grupos Z_{1} a Z_{4} sean cisteína;
enlazándose el péptido B al núcleo
de lisinas por su extremo C-terminal al residuo de
cisteína y el péptido T enlazándose a dicho núcleo de lisinas por
su extremo
N-terminal.
La secuencia SEC ID NO: 1 corresponde al epítopo
T de la proteína no estructural 3A (residuos 21-35)
del VFA.
La secuencia SEC ID NO: 2 corresponde al epítopo
B de la proteína de la cápside VP1 (residuos
136-153) del VFA, también denominado sitio
antigenico A.
En la presente invención por "grupo
conector" se entiende una unidad bifuncional que permite durante
la síntesis de la construcción peptídica dendrimérica unir el
péptido B al núcleo de lisinas (a través de
Z_{1}-Z_{4}), mediante un enlace covalente de
tipo tioéter.
Las proteínas VP1 y 3A del virus de la fiebre
aftosa se encuentran ampliamente descritas en el estado de la
técnica, así como los epítopos T y B (SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2,
respectivamente) los cuales forman parte de la construcción de la
presente invención así como los fragmentos o derivados de
estos.
\newpage
De acuerdo con la presente invención, la
construcción peptídica dendrimérica se caracteriza por poseer un
núcleo central de tres residuos de lisina ramificados. Dicho núcleo
se prolonga en dirección C-terminal con dos
residuos más de lisina, que definen un sitio putativo de escisión
por proteasas tipo catepsina, a los que sigue la secuencia del
péptido T (que comprende la secuencia del epítopo T del VFA
definido por los residuos A1a21-Lys35 de la
proteína 3A, o un fragmento de la misma). Las cuatro ramas definidas
por los residuos de lisina del núcleo están conectadas, mediante un
grupo conector, a residuos de cisteína o a un grupo -OH. De esta
manera, las ramas que se unan a cisteína unirán, asimismo, una
copia del péptido B (que comprende la secuencia del epítopo B
inmunodominante de VFA, definido por los residuos
Tyr136-Arg153 de VP1, o un fragmento de la misma) y
que está acilado en su extremo
N-terminal.
N-terminal.
En otra realización del primer aspecto de la
invención, T es un péptido de secuencia SEC ID NO: 1 y B es un
péptido de secuencia SEC ID NO: 2.
En todavía otra realización del primer aspecto
de la invención, X es acetilo (abreviado Ac).
En todavía aún otra realización del primer
aspecto de la invención, W es un grupo
-(CH_{2})_{n}-CO-, siendo n un número
entero comprendido entre 1 y 3.
Preferiblemente W es -CH_{2}CO-.
En otra realización del primer aspecto de la
invención L representa:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde cada cisteína está unida al
grupo conector CH_{2}CO a través de su cadena lateral mediante un
enlace
tioéter.
\vskip1.000000\baselineskip
En aún otra realización preferida del primer
aspecto de la invención la construcción peptídica dendrimérica
tiene la estructura (III)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde
T es un péptido de secuencia SEC ID NO: 1;
B es un péptido de secuencia SEC ID NO: 2; y
X representa acetilo (abreviado como Ac).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también engloba
estructuras más complejas en las que se encadenan varias
construcciones de acuerdo con el primer aspecto de la
invención.
\newpage
En un segundo aspecto la presente invención se
refiere a un procedimiento de preparación de una construcción
dendrimérica de acuerdo con el primer aspecto de la invención que
comprende la reacción de ligación de un péptido de fórmula
(IV):
con un péptido
(V),
(V)X-B-Cys
donde
Cl es cloro y
T, X, W y B son según se han definido
anteriormente,
y donde la reacción de ligación se lleva a cabo
en presencia de un agente caotrópico y a un pH comprendido entre 8
y 9.
En una realización preferida del segundo aspecto
de la invención, la reacción de ligación se lleva a cabo a un pH de
8.5.
En otra realización del segundo aspecto de la
invención, el agente caotrópico es hidrocloruro de guanidinio. La
presencia del agente caotrópico en la reacción de ligación minimiza
la posible autoagregación de las cadenas del dendrímero en
crecimiento.
En todavía otra realización del segundo aspecto
de la invención, el péptido de fórmula (V) se encuentra en un
exceso molar comprendido entre 3 y 5 respecto al péptido de fórmula
(IV).
En todavía aún otra realización del segundo
aspecto de la invención, el procedimiento se lleva a cabo en
presencia de un agente reductor. Preferiblemente el agente reductor
es tris-carboxietilfosfina (TCEP). La presencia de
dicho agente permite reconvertir el dímero (disulfuro) improductivo
del péptido X-B-Cys en su forma de
tiol reactivo. Este dímero improductivo se produce por la
competencia entre la reacción de sustitución haluro y la
dimerización (tiol-disulfuro) del péptido epitópico
B.
De acuerdo con lo indicado más arriba, los
inventores de la presente invención han comprobado que la
construcción peptídica dendrimérica tiene propiedades
inmunógenas.
De hecho, y tal y como se ilustra más abajo, se
ha comprobado que respecto a otros inmunógenos descritos en el
estado de la técnica, la construcción de la presente invención
tiene una actividad mejorada, de manera que previene de manera
eficaz la infección provocada por el virus de la fiebre aftosa y
además, tiene un carácter marcador, es decir permite la distinción
serológica de los animales infectados respecto a aquellos que han
sido vacunados. Prueba de ello es que la determinación de
anticuerpos frente a la proteína no estructural 3ABC fue negativa
en los cerdos inmunizados y desafiados por el virus, mientras que
en los controles la respuesta anti-3ABC fue
positiva, tal y como se ilustra más abajo. Esta seroconversión de
anticuerpos frente a la proteína 3ABC es uno de los parámetros más
utilizados para la identificación de animales infectados con VFA,
incluyendo aquellos portadores asintomáticos de la enfermedad
(vacas y ovejas, entre otros). Esto tiene una extraordinaria
importancia, puesto que tras realizar una vacunación de emergencia,
no sería necesario sacrificar los animales vacunados ya que pueden
ser claramente diferenciados los animales infectados de los
vacunados.
Además, la construcción de la presente invención
confiere una protección total contra el virus. En este sentido cabe
destacar que, a diferencia de otras construcciones, se ha
demostrado que esta construcción estimula la secreción de IgA,
localizable en hisopos del tejido mucosal de los animales a los que
se les ha administrado dicha construcción. En particular, se ha
comprobado que la construcción peptídica dendrimérica de la
invención induce altos títulos de anticuerpos específicos frente al
VFA (IgGs) en suero, así como también de anticuerpos específicos
frente al VFA (IgA) en suero y en fluidos nasales. El efecto
profiláctico que caracteriza a la construcción de la presente
invención se debe también a que se inducen linfocitos T capaces de
proliferar específicamente frente al VFA. Esto explicaría el efecto
profiláctico que caracteriza a la construcción dendrimérica de la
presente invención.
Por todo lo anterior, la presente invención se
refiere en un tercer aspecto a una construcción peptídica
dendrimérica de acuerdo con el primer aspecto de la invención para
utilizar como inmunógeno.
En un cuarto aspecto la presente invención se
refiere a una composición veterinaria que comprende una cantidad
efectiva de al menos una construcción peptídica dendrimérica de
acuerdo con el primer aspecto de la invención.
En una realización preferida del cuarto aspecto
de la invención la composición comprende cantidades adecuadas de al
menos un adyuvante para su administración en forma de vacuna.
Los adyuvantes que se pueden utilizar para la
preparación de una vacuna de acuerdo con la invención son conocidos
para el experto en la materia (cfr. McKercher PD et al.,
"A review of the current status of oil adjuvants in
foot-and-mouth disease", Dev.
Biol. Stand. 1976, vol. 35, pp. 107-112; Dong XN
et al., "Candidate
multi-peptide-vaccine against
classical swine fever virus induced potent immunity with
serological marker", Vaccine 2005, vol. 25, pp.
3630-3633). Ejemplos ilustrativos y no limitativos
de adyuvantes incluyen el adyuvante completo e incompleto de
Freund.
En un quinto aspecto la presente invención se
refiere al uso de una construcción de acuerdo con el primer aspecto
de la invención para la fabricación de un medicamento destinado a
la prevención de la fiebre aftosa en un animal. Preferiblemente el
animal es un cerdo.
La invención también se refiere a un método para
la prevención de la fiebre aftosa en un animal que comprende
administrar una cantidad efectiva de al menos una construcción de
acuerdo con el primer aspecto de la invención.
A no ser que se definan de otra manera, todos
los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo
significado que el que comúnmente entiende un experto en la materia
a la que pertenece la presente invención. A lo largo de la
descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus
variantes no pretenden excluir otras características técnicas,
aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia,
otros objetos, ventajas y características de la invención se
desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de
la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a
modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la
presente invención.
La Fig. 1 corresponde a una espectrometría de
masas MALDI-TOF de muestras recogidas tras 72 h de
iniciarse la reacción de ligación entre el epítopo T tetravalente
(cloroacetilado) y el péptido epitópico B. La mayor área del pico
eluído en último lugar refleja el progresivo enriquecimiento del
conjugado en especies con 3 y 4 copias del epítopo B, concentrados
en las fracciones frontales del pico, a la izquierda de la línea
punteada. (a) pico indicativo del péptido epitópico B; (b) pico
indicativo de la construcción peptídica dendrimérica con 3 y 4
péptidos epitópicos B; (c) pico indicativo de la construcción
peptídica dendrimérica con 2 y 3 péptidos epitópicos B.
La secuencia lineal SEC ID NO: 3
Lys-Lys-Ala-Ala-Ile-Glu-Phe-Phe-Glu-Gly-Met-Val-His-Asp-Ser-Ile-NH_{2}
se ensambló como carboxamida
C-terminal en una resina de
poliestireno-1%-divinilbenceno funcionalizada con un
espaciador de tipo Rink amida, empleando química Fmoc en un
sintetizador automatizado ABI433 (Applied Biosystems, Foster City,
CA) que ejecutaba el programa de síntesis
FastMoc.
Para las cadenas laterales de los aminoácidos
trifuncionales se emplearon los grupos protectores
tert-butoxicarbonilo (Lys),
tert-butilo (Ser, Asp, Glu) y tritilo (His). Para
los acoplamientos se emplearon 10 equivalentes (1 mmol) de
Fmoc-aminoácido, de hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HTBU), y de N-hidroxibenzotriazol (HOBt), en
presencia de 20 equivalentes de
N,N-diisopropiletilamina, todo ello con
N,N-dimetilformamida (DMF) como disolvente. Para
los cinco últimos residuos de la secuencia sintética (Ile a Lys) se
efectuaron reacoplamientos. A continuación la
peptidil-resina se desprotegió (20% piperidina en
DMF, 2 + 20 min) y se le acoplaron en modo manual 5 equivalentes de
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, empleando
activación con diisopropilcarbodiimida y HOBt. Tras eliminar el
Fmoc se efectuó un acoplamiento doble con 10 equivalentes de
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH y el mismo
tipo de activación. Tras eliminar (igual que antes) los grupos Fmoc
se realizó un acoplamiento con 24 equivalentes (6 equivalentes para
cada uno de los 4 grupos amino generados) del éster de
pentaclorofenilo del ácido cloroacético, en DMF. Tras ello, se
procedió a desproteger y escindir el péptido de su soporte
polimérico, por tratamiento con ácido
trifluoroacético-triisopropilsilano-agua
(96:2:2 v/v, 2 h, 25ºC). El crudo peptídico se precipitó de la
solución por dilución con 5 volúmenes de éter metil
tert-butílico frío, seguido de centrifugación a 4000
rpm y 5ºC durante 10 min El residuo se reconstituyó en ácido
acético acuoso al 10% y se liofilizó.
El producto se analizó por HPLC en fase inversa
en un sistema Shimadzu LC-2010A provisto de una
columna Phenomenex Luna C8 (3 p.m, 0.46 x 5 cm), empleando un
gradiente lineal (10-40%) de disolvente B en
disolvente A durante 15 min a un flujo de 1 mL/min, siendo el
disolvente A ácido trifluoroacético al 0.045% en agua, y el B el
mismo ácido al 0.036% en acetonitrilo. El producto se purificó a
escala preparativa en un sistema Shimadzu LC-8A
empleando una columna Phenomenex Luna C8 (10 \mum, 2.1 \times
25 cm) eluída con el gradiente arriba indicado a un flujo de 25
mL/min durante 60 min Las fracciones que contenían el producto con
la pureza adecuada se combinaron y liofilizaron, siendo
posteriormente caracterizadas por espectrometria de masas
MALDI-TOF en un instrumento Voyager
DE-STR (Applied Biosystems, Foster City, CA)
empleando como matriz ácido
\alpha-ciano-4'-hidroxicinámico.
Se obtuvo un pico con m/z 2637.4, compatible con la estructura
deseada (MH^{+}, monoisotópico).
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia SEC ID NO: 4
Ac-Tyr-Thr-Ala-Ser-Ala-Arg-Gly-Asp-Leu-Ala-His-Leu-Thr-Thr-Thr-His-Ala-Arg-His-Cys-NH_{2}
se ensambló por métodos de síntesis
en fase sólida, empleando química Fmoc en un sintetizador
automatizado ABI 433A y los mismos programas de síntesis descritos
en el apartado anterior. Se emplearon los mismos grupos protectores
de cadenas laterales, incluyendo además tert-butilo
para Tyr y Thr, y
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo
para Arg. La desprotección y escisión de la
peptidil-resina se llevaron a cabo por tratamiento
con ácido trifluoroacético, triisopropilsilano, etanoditiol y agua
(94:2:2:2 v/v, 2 h, 25ºC), con procesado posterior idéntico al
descrito en el apartado anterior. El producto purificado dio m/z
2222.3 en su análisis por espectrometría de masas
MALDI-TOF.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 8 mg del péptido correspondiente
al epitopo T, con su extensión N-terminal
tetravalente y cloroacetilada, en 30 mL de tampón Tris 20 mM, pH
8.5, conteniendo cloruro de guanidinio 2.5 mM. El péptido
correspondiente al epítopo B (90 mg) se añadió en siete porciones a
dicha solución durante un periodo de 4 h, controlando el pH de la
solución y corrigiéndolo por adición de solución de NaOH 0.001 M de
modo que se mantenga en el intervalo 8-8.5.
Se tomaron periódicamente alícuotas de la
reacción y se analizaron por HPLC empleando un gradiente lineal
(5-95%) de eluyente B en A durante 15 min
(eluyentes A y B definidos en apartado A anterior). La composición
de los picos de conjugado recién formados se determinó por
espectrometría de masas MALDI-TOF.
Tras 36 h de reacción a 25ºC, y cuando ya se
observaba la dimerización de una parte sustancial del péptido
epitópico B, se añadieron a la mezcla de reacción 2 mg de
tris-carbetoxietilfosfina, reajustando de nuevo el
pH a 8.5 y dejando evolucionar la reacción hasta las 72 h, en que
ya no se pudieron observar cambios en el perfil de HPLC. En este
punto la mezcla de reacción se acidificó con unas gotas de ácido
trifluoroacético, se concentró por liofilización parcial y se
purificó por HPLC preparativa tal como se describió anteriormente.
Las fracciones frontales del pico eluído en último lugar se
analizaron una por una por espectrometría de masas
MALDI-TOF, comprobándose que correspondían a
conjugados con tres y cuatro copias del péptido epitópico B (véase
Fig. 1). Se seleccionaron las fracciones más ricas en conjugado de
cuatro copias, que se combinaron y liofilizaron previamente a su
utilización como inmunógenos.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de VFA C-S8 (Sta.Pau/70)
(cedida por el laboratorio del Dr. Esteban Domingo
(CBM-CSIC)) se amplificó en monocapas de células BHK
(nº acceso ATCC: CCL10). El lote de virus utilizado en las
inoculaciones corresponde a un segundo pase en células, y el
utilizado en los ensayos de linfoproliferación a un cuarto
pase.
Para ello, se hicieron crecer los distintos
preparados del VFA por infección de monocapas confluentes de
células BHK-21. Tras un periodo de adsorción (1
hora a 37ºC), se añadió medio Eagle modificado por Dulbecco
(Dulbecco y Freeman, 1959) (DMEM, Bio-Whittaker),
suplementado con un 5-10% de suero fetal bovino
(SFB) (Bio-Whittaker) y empleando como antibióticos
penicilina (10 U/ml) y estreptomicina (0.1 mg/ml) (Gibco), y se
continuó con la incubación a 37ºC hasta conseguir un efecto
citopático del 90% (generalmente a las 24-48
horas). En ese momento se recogieron los sobrenadantes de
infección, se trataron con un 2% de cloroformo, se centrifugaron 10
minutos a 3.000 x g, a 4ºC. Los sobrenadantes clarificados se
conservaron a -70ºC hasta el momento de ser usados. Los pases
sucesivos se realizaron inoculando de nuevo monocapas celulares con
los sobrenadantes recogidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Cerdos Landrance x Large White (n=4), de
3-4 meses de edad se inmunizaron por vía
intramuscular con 1.4 mg de la construcción peptidica dendrimérica
TB, emulsionada con adyuvante completo de Freund (primera dosis) o
incompleto (segunda dosis), mezclando volúmenes equivalentes de la
construcción y adyuvante en un volumen final de 1 ml.
Dieciocho días después de administrar la segunda
dosis de la construcción peptídica dendrimérica, estos cerdos se
inocularon por vía intradérmica, (inoculación en rodete coronario),
con 10^{4} UFP del VFA tipo C, aislado C-S8 cl1
(Sta.Pau/70).
Se recogieron muestras de sangre y suero a los
días 0 (momento en que se administra la primera dosis de la
construcción peptídico dendrimérica), 14 (desde primera dosis de
vacuna), 21 (se administra una segunda dosis de vacuna) y 39 (se
administra el virus). Después de la inoculación con el VFA, además
de estas muestras se recogieron también hisopos nasales y faríngeos
a los 0, 3, 7 y 10 días post-inoculación.
Todos los animales se sacrificaron a los 10 días
post-inoculación. Tres de estos cerdos no
desarrollaron lesiones típicas de infección con VFA, durante los 10
días que se mantuvieron en observación tras la inoculación. En el
cuarto cerdo (cerdo nº 3), se observó solo una pequeña afta en el
morro, durante el día 4 post-inoculación, lesión
que fue resuelta a las 24 h.
Con objeto de controlar el desafío con virus, se
incluyeron en el experimento dos cerdos control. Los cerdos nº 5 y
6 estuvieron estabulados en contacto directo con los 4 animales
inmunizados y desafiados. Se recogieron muestras de sangre, suero e
hisopos nasales y faríngeos a 0, 3, 7 y 10 días
post-contacto con los cerdos inoculados. A los 14
días ambos cerdos se inocularon intradérmicamente con la misma
dosis y el mismo lote de virus empleado en el desafío de los cerdos
inmunizados. De nuevo se recogieron muestras de sangre, suero e
hisopos nasales y faríngeos a 0, 3, 7 y 10 días
post-inoculación. Ambos animales desarrollaron
lesiones típicas de infección con VFA a los 3-4
días post-inoculación.
Todos los animales empleados en este estudio
estaban, inicialmente, libres de infección con VFA, incluyendo los
controles, como se confirmó por la ausencia de anticuerpos
específicos frente al VFA a tiempo 0. Tras el desafío, los
inmunizados con la construcción peptídica dendrimérica siguieron
estando libres de infección mientras que los controles se infectaron
y desarrollaron la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
La respuesta humoral específica frente al virus
completo se determinó analizando los sueros de los cerdos números 1
a 6 en dilución 1/200 mediante un ELISA de captura.
Para ello, se tapizaron placas de ELISA de 96
pocillos (Maxisorp-Nunc) con suero de conejo
anti-VFA cepa C1-Noville
(suministrado por el laboratorio de referencia mundial para el VFA,
Pirbright, GB), toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron con PBST
(PBS con 0.05% de Tween20) y se bloquearon durante 1 hora a 37ºC,
añadiendo 50 \mul/pocillo de PBSTM (PBST con 5% de leche
descremada). Después de lavar, se añadió en cada pocillo de la placa
de ELISA 50 \mul de antígeno (virus CS8cl1) y se incubó a 37ºC
durante 1 hora.
Se analizaron diluciones en base dos de cada uno
de los sueros procedentes de los cerdos (números 1 a 6),
incubándolos durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron de nuevo
y se incubaron 1 hora más a 37ºC en presencia del conjugado
proteína-A marcada con peroxidasa (Sigma). Después
de un lavado final, se añadió el sustrato de la peroxidasa
utilizado, el OPD (Ortofenilendiamina, Sigma), habiendo añadido
previamente H_{2}O_{2}. La reacción se paró después de 10
minutos con H_{2}SO_{4} 3N, y se leyó en un lector automático a
492 nm. El título de anticuerpos se expresa como la dilución de
suero a la cual la OD_{492} es más del 50% de la obtenida en el
control de suero negativo.
En la siguiente tabla se incluyen los valores
obtenidos al analizar sueros recogidos a 0, 14 (14 días después de
primera inmunización), 21 (21 días después de la primera
inmunización y momento en que se administra una segunda dosis de
vacuna), 39 (18 días post-2ª inmunización y momento
en que se administra el virus) y 49 (10 días
post-inoculación).
\vskip1.000000\baselineskip
Los títulos de anticuerpos frente al VFA en los
cerdos inmunizados con la construcción peptídica dendrimérica TB
fueron significativos y elevados a los 18 días
post-inmunización de la segunda dosis.
En particular, los títulos de anticuerpos antes
y después del desafío viral fueron similares, alrededor de 1.5
log_{10}. Sin embargo, ninguno de los dos cerdos control (cerdos
nº 5 y 6) desarrollaron una respuesta de anticuerpos significativa
a tiempos 0 y 10 días post-contacto, pero sí a los
10 días post-inoculación. A este tiempo los títulos
máximos alcanzados fueron similares a los observados en los cerdos
inmunizados y desafiados.
Los resultados obtenidos indicaron que la
construcción peptídica dendrimérica fue capaz de inducir la
producción de anticuerpos que reconocían el VFA. Los títulos
obtenidos fueron elevados y tras el desafío no se incrementaron, lo
que sugirió que los animales estaban protegidos al no detectar un
incremento en el título de anticuerpos tras la inoculación del
VFA.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección de anticuerpos IgA se determinó
mediante ELISA indirecto, analizando sueros e hisopos nasales y
faríngeos recogidos a tiempos 0, 14, 21 y 39 días
post-inmunización y 3, 7 y 10 días
post-inoculación con el VFA. Para la realización de
este ELISA se siguió el procedimiento descrito en el punto 4 para
el ELISA-VFA, salvo que en lugar del conjugado
proteína A-HRPO, se utilizó un anticuerpo
monoclonal anti-IgA de cerdo marcado con HRPO,
diluido a 1/1000 (Serotec). El título de IgA se calculó como el log
de la dilución de suero que proporciona una señal de OD_{492}
igual a 1.
Los resultados obtenidos fueron los
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El pico máximo de respuesta IgA se detectó a los
39 días post-inmunización. Estos títulos máximos
fueron muy similares a los obtenidos 10 días
post-inoculación (día 49), lo que sugiere una
posible implicación de este mecanismo de respuesta inmune en la
respuesta protectora frente al VFA. El título de IgA determinado en
el suero de los dos cerdos control a los 10 días
post-inoculación fue de alrededor de 2 y 3,
significativamente inferior al alcanzado en los cerdos inmunizados
con la construcción peptídica dendrimérica antes del desafío.
También se detectaron IgA específicos en los hisopos nasales de los
cerdos inmunizados, aunque no en hisopos faríngeos.
El hecho de encontrar IgA en hisopos nasales
sugirió que la estimulación de la respuesta de mucosas estaba
especialmente focalizada aquí y no tanto en faringe, aunque estas
diferencias pudieron derivar de la mayor dificultad para tomar
muestras de hisopos faríngeos y no tanto nasales.
Con este experimento se confirmó la capacidad
inmunogénica de la construcción peptídica dendrimérica ya que se
detectaron niveles séricos elevados de IgA.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad neutralizante del VFA se determinó
in vitro en los sueros de los cerdos inmunizados, recogidos
a tiempo 0 y 39 días post-inmunización, y en los
sueros de los cerdos control, recogidos a los 10 días
post-contacto y 10 días
post-inoculación.
El ensayo consistió en un ensayo estándar de
neutralización, realizado en placas de 96 pocillos, incubando
volúmenes equivalentes de suero diluido en base 2, con 100 dosis
infectivas 50 (unidad en la que se suelen medir los virus
infectivos, dosis infectivas 50 son las que infectan aproximadamente
el 50% de las células inoculadas) del VFA- CS8cl1. Esta mezcla
suero-virus se incubó durante 1 hora a 37ºC, tras
lo cual se determinó la actividad neutralizante mediante la adición
de células BHK-21 (nº acceso ATCC: CCL10). Los
títulos de neutralización se expresan como el logro de la dilución
de suero que proporciona una neutralización del 50% del inóculo de
virus utilizado.
El título de anticuerpos neutralizantes antes
del desafío viral en los cerdos inmunizados con la construcción
peptídica dendrimérica fue alrededor de 1.9-2.2
log_{10}. Tras el desafío, estos títulos sólo se incrementaron
ligeramente.
El hecho de que se obtuvieran incrementos no
significativos fue una prueba indicativa más de que los animales ya
estaban estimulados y protegidos ya que con el desafío no se
incrementaron los parámetros inmunes.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ensayo se realizó tal y como se describe en
Blanco y colaboradores (cfr. Blanco E. et al., "An
interspecies MHC-restricted Th cell epitope on the
capsid protein VP4 of
foot-and-mouth disease virus",
Journal of Virology 2000, vol. 74, pp.
4902-4907).
Se recogieron muestras de sangre de los cerdos
nº 1 a 4 en un tampón EDTA 5 \muM y se utilizaron inmediatamente
para la obtención de las células mononucleares de sangre periférica
(abreviado como CMSP). Este ensayo se realizó en placas de 96
pocillos de fondo redondo (Nunc). Brevemente, se incubaron por
triplicado 2.5 x 10^{5} de CMSP por pocillo, en un volumen final
de 200 \mul, en medio de cultivo completo RPMI (SFB 10% (v/v),
2-mercaptoetanol 50 \muM), en presencia de varias
concentraciones de:
- i)
- VFA,desde 4 x 10^{3} a 2 x 10^{6} UFP,
- ii)
- Péptidos sintéticos, desde 100 \mug/ml a 0.03 \mug/ml. Como péptido sintético se utilizó el epítopo T (SEC ID NO: 1), el epítopo B (SEC ID NO:2) y la construcción peptídica dendrimérica de la invención.
- iii)
- Controles de CMSP sin estimular.
Las placas se incubaron a 37ºC en una atmósfera
del 5% de CO_{2} durante 4 días. A continuación, se añadió a cada
pocillo 0.5 \muCi de metil-[^{3}H] timidina y se incubó durante
18 h más a 37ºC. Las células se recogieron utilizando un
"harvester" y se determinó la incorporación de radioactividad
al DNA utilizando líquido de centelleo y leyendo en un contador de
radioactividad Microbeta counter (Pharmacia).
Los resultados se expresan en IE (Índice de
estimulación = cuentas por minuto de células estimuladas/media de
cuentas por minuto de células sin estimular):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores de IE obtenidos resultaron ser
significativos, con lo que se comprobó que la construcción
peptídica dendrimérica utilizada era capaz de primar in vivo
linfocitos que eran capaces de reconocer in vitro los
epítopos presentes en dicha construcción, e incluso en el contexto
de una partícula viral nativa. En definitiva, la construcción
peptídica dendrimérica estimulaba también la respuesta celular
porcina.
Para analizar el papel del Complejo de
Histocompatibilidad Mayor (abreviado como MHC) en la respuesta
linfoproliferativa, se utilizaron los siguientes anticuerpos
monoclonales anti-MHC porcino (SLA):
74-11-10 (IgG2\beta)
anti-SLA clase I (cfr. Pescovitz et al.,
"Effect of class II antigen matching on renal allograft survival
in miniature swine", J. Exp. Med. 1984, vol. 160, pp.
1495-1508) y MSA-3 (IgG2\alpha)
anti-SLA clase II (cfr. Hammerberg C. et al.,
"Characterization of monoclonal antibodies directed against swine
leukocytes", Vet. Immunol. Immunopathol. 1986, vol. 11,
pp. 107-121). Se añadió un total de 15 \mul del
monoclonal correspondiente (1 mg/ml) por pocillo al inicio del
cultivo y 15 \mul más se añadieron tras 24 horas de incubación.
Las placas se procesaron de la misma manera que se indica arriba.
La concentración del monoclonal anti-MHC clase II
utilizado inhibe la estimulación con ConA pero no con el ionóforo
PHA, mientras que el monoclonal anti-clase I no
afecta dichas proliferaciones (cfr. Bullido et al.,
"Characterization of five monoclonal antibodies specific for swine
class II major histocompatibility antigens and crossreactivity
studies with leukocytes of domestic animals", Dev. Comp.
Immunol. 1997, vol. 21, pp. 311-322). En las
condiciones experimentales utilizadas, la respuesta
linfoproliferativa observada no fue inhibida significativamente por
los monoclonales anti-SWC3 (marcador de monocitos)
ni anti-\gamma\deltaTCR (cfr. Blanco et
al., "An interspecies MHC-restricted Th cell
epitope on the capsid protein VP4 of
foot-and-mouth disease virus",
Journal of Virology 2000, vol. 74, pp.
4902-4907).
La respuesta linfoproliferativa frente al VFA y
a la construcción peptídica dendrimérica TB fue significativa y
elevada en los cerdos inmunizados, antes del desafío viral,
confirmando que la construcción peptídica dendrimérica estimulaba
la respuesta celular porcina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de anticuerpos frente a la
proteína 3ABC, se utilizó un ELISA indirecto, basado en la
utilización como antígeno de la proteína 3ABC recombinante
expresada en E. coli y purificada como describe Bergmann y
colaboradores (cfr. Bergmann IE et al., "Diagnosis of
persistent aphtovirus infection and its differentiation from
vaccination response in cattle by use of
enzyme-linked immunoelectrotranfer blot analysis
with bioengineered nonstructural viral antigens" Am. J. Vet.
Res. 1993, vol. 54(6), pp. 825-831) El
procedimiento seguido para la realización de este ELISA fue el
descrito por Blanco E. y colaboradores (cfr. Blanco E. et
al., "Serological evidence of subclinical FMD infection in
sheep population during the 1999 epidemic in Morocco",
Veterinary Microbiology 2002, vol. 85/1, pp.
13-21).
Siguiendo procedimientos descritos en los
apartados anteriores, se analizaron mediante
ELISA-3ABC los sueros antes y después del desafío
viral de los animales inmunizados con la construcción peptídica
dendrimérica (cerdos nº 1 a 4) y de los dos cerdos control (cerdos
nº 5 y 6). El ELISA-3ABC utilizado está basado en
el descrito por el laboratorio de PANAFTOSA y que ha sido
considerado como ensayo de referencia para la discriminación entre
animales infectados y vacunados por la Organización Mundial de la
Sanidad Animal (Office International des Epizooties, Capítulo 2:
Foot and mouth disease, en "Manual of standards for diagnostic
tests and vaccines", 5ª Edición, Ed. OIE Standards
Commission).
Mientras que los sueros de los dos controles
fueron positivos a 3ABC desde 10 dpi, ninguno de los cuatro cerdos
inmunizados mostró títulos de anticuerpos frente a esta proteína
significativos (señales <0.3), tal y como queda reflejado en la
siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
Un ELISA capaz de detectar anticuerpos frente a
proteínas no estructurales del VFA, puede ser utilizado para
discriminar entre animales infectados y no infectados,
independientemente de si han sido o no vacunados con vacuna
inactivada (Brocchi E. et al., "Comparative evaluation of
six ELISAs for the detection of antibodies to the
non-structural proteins of
foot-and-mouth disease virus",
Vaccine 2006). Los resultados obtenidos muestran que este
mismo principio puede ser aplicado a la inmunización utilizando la
construcción peptídica dendrimérica de la presente invención, ya que
la presencia de anticuerpos fue solo detectable en los animales
infectados, pero no en los protegidos (inmunizados con la
construcción peptídica dendrimérica y posteriormente
desafiados).
<110> Universitat Pompeu Fabra
\hskip1cmConsejo Superior de Investigaciones Científicas
\hskip1cmInstituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Construcción peptídica dendrimérica
para la prevención de la fiebre aftosa en animales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P774ES00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patentan version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
Foot-and-mouth disease virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
Foot-and-mouth disease virus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido derivado de la proteína 3A
del virus de la fiebre aftosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido modificado de la proteína
VP1 del virus de la fiebre aftosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETYLATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AMIDATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (19)
1. Construcción peptídica dendrimérica de
fórmula (I):
(I)(X-B)_{n}-L-T
donde
T es un péptido que comprende la secuencia SEC
ID NO: 1;
B es un péptido que comprende la secuencia SEC
ID NO: 2;
X es un grupo acilo el cual está unido al
extremo N-terminal del péptido B;
n es 3 ó 4; y
L corresponde a un núcleo de lisinas de fórmula
(II)
- \quad
- donde
- \quad
- W es un grupo conector;
- \quad
- Z_{1}-Z_{4} son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan del grupo que consiste en cisteína y -OH, con la condición que al menos tres de los grupos Z_{1} a Z_{4} sean cisteina;
enlazándose el péptido B al núcleo
de lisinas por su extremo C-terminal al residuo de
cisteína y el péptido T enlazándose a dicho núcleo de lisinas por
su extremo
N-terminal.
2. Construcción según la reivindicación 2,
donde
T es un péptido de secuencia SEC ID NO: 1, y
B es un péptido de secuencia SEC ID NO: 2.
3. Construcción según la reivindicación 1, donde
X es acetilo.
4. Construcción según la reivindicación 1, donde
W es un grupo -(CH_{2})_{n}-CO-, siendo n
un número entero comprendido entre 1 y 3.
5. Construcción según la reivindicación 4, donde
W es -CH_{2}CO-.
6. Construcción según la reivindicación 1, donde
L representa:
donde cada cisteína está unida al
grupo conector CH_{2}CO a través de su cadena lateral mediante un
enlace
tioéter.
7. Construcción según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que tiene la fórmula (III):
donde
T es un péptido de secuencia SEC ID NO:1;
B es un péptido de secuencia SEC ID NO: 2; y
X es acetilo.
8. Procedimiento de preparación de una
construcción peptidica dendrimérica definida en cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende
la reacción de ligación de un péptido de fórmula (IV):
con un péptido de fórmula
(V),
(V)X-B-Cys
donde
Cl es cloro, y
T, X, W y B se definen en cualquiera de las
reivindicaciones anteriores,
y donde la reacción de ligación se lleva a cabo
en presencia de un agente caotrópico y a un pH comprendido entre 8
y 9.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
donde la reacción se lleva a cabo a un pH de 8.5.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8-9, donde el agente caotrópico es
hidrocloruro de guanidinio.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8-10, donde el péptido de fórmula
(V) se encuentra en un exceso molar respecto el péptido de fórmula
(IV) comprendido entre 3 y 5.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8-11, donde la reacción se lleva a
cabo además en presencia de un agente reductor.
13. Procedimiento según la reivindicación 12
donde el agente reductor es
tris-carbetoxietilfosfina.
14. Construcción peptidica dendrimérica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para
utilizar como inmunógeno.
15. Composición veterinaria que comprende una
cantidad efectiva de al menos una construcción peptídica
dendrimérica definida en cualquiera de las reivindicaciones
1-7.
16. Composición según la reivindicación 15, que
comprende cantidades adecuadas de al menos un adyuvante para su
administración en forma de vacuna.
17. Uso de una construcción peptídica
dendrimérica definida en cualquiera de las reivindicaciones
1-7 como inmunógeno.
18. Uso de una construcción peptídica
dendrimérica definida en cualquiera de las reivindicaciones
1-7 para la fabricación de un medicamento destinado
a la prevención de la fiebre aftosa en un animal.
19. Uso según la reivindicación 18, donde el
animal es un cerdo.
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