KR20210104745A - 합성 펩티드 면역원에 대한 면역 자극제로서 인공 무차별적 t 헬퍼 세포 에피토프 - Google Patents

합성 펩티드 면역원에 대한 면역 자극제로서 인공 무차별적 t 헬퍼 세포 에피토프 Download PDF

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유나이티드 바이오메디칼 인크.
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Abstract

본 발명은 표적 항원 부위의 최적 면역원성을 제공하기 위해 설계된 신규한 무차별적 인공 T 헬퍼 세포 에피토프 (Th 에피토프)에 관한 것이다. 표적 항원 부위는 B 세포 에피토프, CTL 에피토프, 펩티드 합텐, 비-펩티드 합텐, 또는 이의 임의의 면역학적 반응성 유사체를 포함할 수 있다. 펩티드 면역원 작제물에서 표적 항원 부위에 공유 결합될 때, 개시된 Th 에피토프는 표적 항원 부위에 대해 강한 B 세포 항체 반응 또는 이펙터 T 세포 반응을 유발한다. Th 에피토프는 그 자체로 면역침묵이며, 즉, 존재하는 경우, 펩티드 면역원 작제물에 의해 생성된 항체 중 소수가 Th 에피토프를 향하여, 표적화된 항원 부위로 지향된 매우 집중된 면역 반응을 가능하게 할 것이다. 무차별적 인공 Th 에피토프는 투여 후 염증, 항-자기, 세포-매개 면역 반응을 생성하지 않는 효과적이고 안전한 펩티드 면역원을 제공한다.

Description

합성 펩티드 면역원에 대한 면역 자극제로서 인공 무차별적 T 헬퍼 세포 에피토프
본 출원은 2018년 12월 19일에 출원된, 그 전문이 본원에 참고로 포함된, 미국 가출원 일련 번호 62/782,253의 이익을 주장하는 PCT 국제 출원이다.
면역 반응은 항원 제시 세포와 T 헬퍼 (Th) 세포 간의 협업적인 상호작용을 필요로 한다. 유효한 항체 반응의 유발은 항원 제시 세포가 대상 면역원의 표적 항원 부위를 인식하고 T 헬퍼 세포가 T 헬퍼 세포 에피토프를 인식하는 것을 필요로 한다. 일반적으로, 대상 면역원 상의 T 헬퍼 에피토프는 이의 B 세포 에피토프(들) 또는 관련된 이펙터 T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 림프구 또는 CTL) 에피토프(들)와 상이하다. B 세포 및 관련된 이펙터 T 세포 에피토프는 B 세포 및 관련된 세포에 의해 인식되는 바람직한 표적 면역원 상의 부위이고, 이는 바람직한 표적 부위에 대한 항체 또는 사이토카인의 생산을 초래한다. 표적의 천연 형태는 항체 또는 관련된 이펙터 T 세포가 직접 결합하는 부위를 결정한다. Th 세포 반응의 유발은 표적 단백질의 처리된 펩티드 단편과 연관된 클래스 II 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 사이에 형성된 항원 제시 세포의 막 상에 복합체를 인식하는 Th 세포 수용체를 필요로 한다. 따라서, 표적 단백질의 펩티드 처리 및 3자 인식은 Th 세포 반응을 위하여 필요하다. 3부분 복합체는 1) 중요한 MHC 클래스 II 접촉 잔기가 상이한 MHC 결합 펩티드 (Th 에피토프) 내에 가변적으로 위치되고; 2) 상이한 MHC 결합 펩티드가 가변 길이 및 상이한 아미노산 서열을 갖고; 그리고 3) MHC 클래스 II 분자가 숙주의 유전적 구성에 따라 고도로 다양할 수 있기 때문에 정의하기 어렵다. 특정 Th 에피토프에 대한 면역 반응성은 부분적으로, 숙주의 MHC 유전자에 의해 결정되고, Th 에피토프의 반응성은 모집단의 개체 간에 상이하다. 단일 종 내의 종 및 개체에 걸쳐 반응성인 Th 에피토프 (즉, 무차별적 Th 에피토프)은 식별하기 어렵다.
다수의 인자가 T 세포 인식의 각 구성요소 단계, 예를 들어 항원 제시 세포에 의한 적절한 펩티드 처리, 유전적으로 결정된 클래스 II MHC 분자에 의한 펩티드의 제시, 및 Th 세포 상의 수용체에 의한 MHC 분자 및 펩티드 복합체의 인식을 위해 필요하다. 넓은 반응성을 제공하기 위한 무차별적 Th 에피토프 인식에 대한 요건은 결정되기 어려울 수 있다.
면역 반응에 대한 항체 및 관련된 사이토카인의 유도를 위해, 면역원은 B 세포 에피토프/이펙터 T 세포 에피토프 및 Th 세포 결정자(들) 모두를 포함하여야 하는 것은 명백하다. 보통, 표적 면역원의 면역원성을 증가시키기 위해 담체 단백질 (예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌; KLH)이 표적 면역원에 커플링되어 Th 반응을 제공한다. 그러나, 표적 면역원의 면역원성을 향상시키기 위해 큰 담체 단백질을 사용하는 것은 단점이 많다. 특히, (a) 화학적 커플링은 크기 및 조성의 이질성을 유발할 수 있는 반응, 예를 들어, 글루타르알데히드와의 접합이 연관되고 (Borras-Cuesta et al., Eur J Immunol, 1987; 17: 1213-1215); (b) 담체 단백질은 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 바람직하지 않은 면역 반응에 대한 가능성을 유도하고 (Bixler et al., WO 89/06974); (c) 큰 펩티드-담체 단백질은 표적 부위보다 오히려 담체 단백질로 주로 잘못된 무관한 면역 반응을 유발하고 (Cease et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84: 4249-4253); 그리고 (d) 담체 단백질은 또한 동일한 담체 단백질을 포함하는 면역원으로 미리 면역화된 숙주에서 에피토프 억제에 대한 가능성을 도입하기 때문에 잘 정의된, 안전하고, 효과적인 펩티드-담체 단백질 접합체를 제조하기 어렵다. 숙주가 동일한 담체 단백질이 상이한 합텐으로 커플링된 다른 면역원으로 후속적으로 면역화되는 경우, 얻어지는 면역 반응은 담체 단백질에 대해 향상되지만 합텐에 대해서는 저해된다 (Schutze et al., J Immunol, 1985; 135: 2319-2322).
상기 기술된 위험을 피하기 위해, 전통적인 담체 단백질을 사용하지 않고 T 세포를 유발하도록 돕는 것이 바람직하다.
본 개시내용은 예방 및 치료 용도를 위한 표적 항원에 대한 기능적 부위 지정 항체를 자극하는 무차별적 인공 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프를 제공한다. 본 개시내용은 또한 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물, Th 에피토프를 함유하는 조성물, Th 에피토프를 제조하고 사용하는 방법, 및 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물에 의해 생산된 항체에 관한 것이다.
개시된 인공 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프는 선택적 스페이서를 통해 B 세포 에피토프(들) 및/또는 이펙터 T 세포 에피토프(들) ("표적 항원 부위(들)")에 연결되어, 펩티드 면역원 작제물을 생산할 수 있다. 개시된 Th 에피토프는 표적 항원 부위에 대한 높은 수준의 항체 및/또는 세포 반응의 생산과 함께 강한 T 헬퍼 세포-매개 면역 반응을 유도하는 능력을 펩티드 면역원에 부여한다. 개시된 펩티드 면역원 작제물은 펩티드 면역원에서 큰 담체 단백질 및 병원체 유래 T 헬퍼 세포 부위의 표적 항원 부위의 면역원성을 개선하도록 특이적으로 설계된 개시된 인공 Th 에피토프로의 유리한 대체를 제공한다. 개시된 Th 에피토프를 함유하는 비교적 짧은 펩티드 면역원 작제물은 Th 에피토프에 대한 유의한 염증 반응 또는 면역 반응을 초래하지 않고 특정 표적 항원 부위에 대해 높은 수준의 항체 및/또는 이펙터 세포 관련된 사이토카인을 유발한다.
펩티드 면역원 작제물에 의해 유발된 면역 반응 (항체 역가, Cmax, 항체 생산의 개시, 반응의 지속 기간 등을 포함)은 하기 변화에 의해 조절될 수 있다: (a) B 세포 에피토프에 화학적으로 연결된 Th 에피토프의 선택, (b) B 세포 에피토프의 길이, (c) 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 제제에 사용되는 보조제, 및/또는 (d) 면역접종당 투여량 및 각 면역접종에 대한 프라임 및 부스트 시점을 포함하는 투여 요법. 따라서, 표적 항원 부위에 대한 특이적 면역 반응은 개시된 Th 에피토프를 사용하여 설계될 수 있고, 이는 임의의 환자 또는 대상체의 개별 특성에 맞춤화된 의료 치료를 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 개시된 인공 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물은 하기 식으로 표시될 수 있다:
(A)n-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
또는
(A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(A)n-X
또는
(A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
또는
{(A)n-(Th)p-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)p-(A)n-X}m
식 중,
각각의 A는 독립적으로 아미노산이고;
각각의 B는 독립적으로 이종성 스페이서이고;
각각의 Th는 독립적으로 인공 Th 에피토프이고;
표적 항원 부위는 B 세포 에피토프, CTL 에피토프, 펩티드 합텐, 비-펩티드 합텐, 또는 이의 면역학적 활성 유사체이고;
X는 아미노산, α-COOH, 또는 α-CONH2이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
m은 1, 2, 3, 또는 4이고;
o는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; 그리고
p는 0, 1, 2, 3, 또는 4이다.
표적 항원 부위로서 펩티드 합텐의 예시는 베타-아밀로이드 (Aβ) 단백질 (Aβ1-14)의 아미노산 1-14이다 (서열 번호 56). 비-펩티드 합텐의 예시는 종양 관련 탄수화물 항원 (TACA) 또는 소분자 약물을 포함한다.
본 개시내용은 또한 인공 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 면역화된 숙주에서 바람직한 표적 항원 부위에 항체 반응을 유발할 수 있다. 상기 표적 항원 부위는 병원성 유기체, 보통 면역 침묵인 자가 항원, 또는 종양 관련 표적으로부터 유래될 수 있다.
개시된 조성물은 감염성 질환으로부터의 보호 면역력을 제공하는 백신, 정상 생리학적 과정의 기능부전에 기인하는 장애의 치료에 대한 면역요법, 암의 치료를 위한 면역요법, 및 정상 생리학적 과정을 바람직하게는 개입하여 변형시키는 제제를 포함하는, 많은 다양한 의학적 및 수의학적 응용에 유용하다.
본 발명의 Th 에피토프에 공유 결합될 수 있는 일부의 표적 항원은 하기의 일부를 포함한다: 몇몇 예를 들면, 알츠하이머병의 치료를 위한 베타-아밀로이드 (Aβ), 파킨슨병의 치료를 위한 알파-시누클레인 (α-Syn), 알러지 질환의 치료를 위한 막 결합된 IgE의 세포외 막-근위 도메인 (또는 IgE EMPD), 알츠하이머병을 비롯한 타우병증의 치료를 위한 타우, 및 아토피성 피부염의 치료를 위한 인터루킨-31 (IL-31). 더욱 구체적으로, 상기 표적 항원은 Aβ1-14 (미국 특허 번호 9,102,752에 기술됨), α-Syn111-132 (국제 PCT 출원 번호 PCT/US2018/037938에 기술됨), IgE EMPD1-39 (국제 PCT 출원 번호 PCT/US2017/069174에 기술됨), 타우379-408 (국제 PCT 출원 번호 PCT/US2018/057840에 기술됨), 및 IL-3197-144 (국제 PCT 출원 번호 PCT/US2018/065025에 기술됨) 및 표 3A 및 표 3B에 기술된 이들 표적 항원 부위를 포함한다.
본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 (개시된 인공 Th 에피토프 및 항원 제시 에피토프를 포함하는) 펩티드 면역원 작제물을 투여함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 펩티드 면역원 작제물은 실시예 12에 나타낸 바와 같이, 대상체에서 양성 대조군의 면역원성 염증 반응보다 적어도 약 3배 낮은 면역원성 염증 반응을 생성한다.
본 개시내용은 또한 개시된 인공 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물에 의해 생산된 항체에 관한 것이다. 펩티드 면역원 작제물에 의해 생산된 항체는 인공 Th 에피토프가 아니라 표적 항원 부위에 대해 매우 특이적이다.
참고문헌:
본 출원에 인용된 각 특허, 간행물 및 비특허 문헌은 각각이 개별적으로 참고에 의해 포함된 것처럼 이의 전문이 참고에 의해 본 명세서에 포함된다.
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도 1a 및 1b: 본원에 기술된 T 헬퍼 세포 에피토프 플랫폼의 예시적인 제형 및 특징을 나타내는 개략도. 도 1a는 UBITh®을 포함하는, Th 에피토프 담체를 함유하는 펩티드 면역원을 갖는 제형에 포함될 수 있는 구성요소를 요약한 개략도이다. 도 1b는 UBITh®을 포함하는, 본원에 기술된 T 헬퍼 세포 에피토프 플랫폼의 여러 특징 및 기술적 이점을 요약한다.
도 2: 본원에 기술된 T 헬퍼 세포 에피토프 플랫폼을 사용하여 얻을 수 있는 이론적 결과를 예시하는 그래프.
도 3: 알파 시누클레인 (상단 패널) 및 IgE EMPD (하단 패널)로부터 유래된 짧은 비-면역원성 B 에피토프 펩티드를 갖는 선택된 개별 Th 에피토프 펩티드에 의한 펩티드 면역원 작제물의 면역원성의 향상. 알파 시누클레인 (상단 패널)에 대한 막대 그래프 아래의 숫자는 표 5에 기술된 펩티드 면역원 작제물에 해당하고; IgE EMPD (하단 패널)에 대한 막대 그래프 아래의 숫자는 표 6에 기술된 펩티드 면역원 작제물에 해당한다.
도 4a 및 4b: 표 8에 나타낸 개별 Th 에피토프에 공유 결합된 α-Syn (G111-G132), IgE-EMPD (G1-C39), 및 IL-6 (C73-C83)을 함유하는 3개의 개별 펩티드 면역원 작제물의 혼합물로 기니피그를 면역화한 후 얻은 ELISA에 의한 항-α-시누클레인 항체 역가를 예시하는 그래프. 이 그래프에서 평가된 특정한 α-시누클레인 펩티드 면역원 작제물은 표 5에 요약되어 있다. 도 4a는 평가된 모든 펩티드 면역원 작제물에 대한 항체 역가 데이터를 포함한다. 도 4b는 도 4a에 나타낸 데이터의 서브셋을 포함하여 상이한 펩티드 면역원 작제물이 상이한 속도로 유사한 Cmax 값에 도달 가능함을 강조한다.
도 5: 표 8에 나타낸 개별 Th 에피토프에 공유 결합된 α-Syn (G111-G132), IgE-EMPD (G1-C39), 및 IL-6 (C73-C83)을 함유하는 3개의 개별 펩티드 면역원 작제물의 혼합물로 기니피그를 면역화한 후 얻은 ELISA에 의한 항-IgE EMPD 항체 역가를 예시하는 그래프. 이들 그래프에서 평가된 특정한 IgE EMPD 펩티드 면역원 작제물은 표 6에 요약되어 있다.
도 6: 표 8에 나타낸 개별 Th 에피토프에 공유 결합된 α-Syn (G111-G132), IgE-EMPD (G1-C39), 및 IL-6 (C73-C83)을 함유하는 3개의 개별 펩티드 면역원 작제물로 기니피그를 면역화한 후 얻은 ELISA에 의한 항-IL-6 항체 역가를 예시하는 그래프. 이들 그래프에서 평가된 특정한 IL-6 펩티드 면역원 작제물은 표 7에 요약되어 있다.
도 7: 표 9에 나타낸 펩티드 면역원 작제물로 기니피그를 면역화한 후 얻은 ELISA에 의한 항-DPR (디-펩티드 반복) 항체 역가를 예시하는 그래프.
도 8: 2개의 펩티드 면역원 Aβ1-14-εK-KKK-MvF5 Th (서열 번호 67) 및 Aβ1-14-εK-HBsAg3 Th (서열 번호 68)를 포함하는, 상이한 양의 Aβ 백신 (UB-311)로 기니피그를 면역화한 후 얻은 ELISA에 의한 항-Aβ1-28 역가를 예시하는 그래프.
도 9: 2개의 펩티드 면역원 Aβ1-14-εK-KKK-MvF5 Th (서열 번호 67) 및 Aβ1-14-εK-HBsAg3 Th (서열 번호 68)를 포함하는, 상이한 프라임 및 부스터 용량의 Aβ 백신 (UB-311)으로 기니피그를 면역화한 후 얻은 ELISA에 의한 항-Aβ1-28 역가를 예시하는 그래프.
도 10: Aβ 백신 (UB-311)을 사용하여 3개월 부스팅 요법 (상단 패널) 또는 6개월 부스팅 요법 (하단 패널)에 걸쳐 Aβ 백신 (UB-311)으로 인간 대상체를 면역화한 후 얻은 ELISA에 의한 항-Aβ1-28 항체 역가를 예시하는 그래프. 각 그래프의 박스 부분은 본 연구에서 모든 인간 대상체의 평균 역가를 강조한다.
도 11A 및 11B: MONTANIDE ISA50V를 보조제로 사용하여 표 10 (서열 번호 239-241)에 나타낸 상이한 양의 LHRH 펩티드 면역원 작제물의 혼합물로 돼지를 면역화한 후 얻은 항-LHRH 항체 역가 및 테스토스테론 농도를 예시하는 그래프. 도 11A는 100 μg 양의 LHRH 제형으로 랫트를 면역화한 후 얻은 항체 역가 및 테스토스테론 농도를 나타낸다. 도 11B는 300 μg 양의 LHRH 제형으로 랫트를 면역화한 후 얻은 항체 역가 및 테스토스테론 농도를 나타낸다.
도 12: 상이한 보조제 (즉, MONTANIDE ISA51 또는 ADJUPHOS)를 함유하는 제형에서 상이한 양의 서열 번호 243의 IL-6 펩티드 면역원 작제물 또는 위약 대조군으로 랫트를 면역화한 후 얻은 ELISA에 의한 항-IL-6 항체 역가를 예시하는 그래프.
도 13A 및 13B: 상이한 양의 서열 번호 178의 IgE-EMPD 펩티드 면역원 작제물로 마카크를 면역화한 후 얻은 항-IgE-EMPD 항체 역가를 예시하는 그래프. 도 13A는 CpG3을 사용하여 안정화된 면역자극 복합체로서 제형화된 보조제로서 ADJUPHOS를 사용하여 얻은 항체 역가를 나타낸다. 도 13B는 CpG3을 사용하여 안정화된 면역자극 복합체로서 제형화된 보조제로서 MONTANIDE ISA51을 사용하여 얻은 항체 역가를 나타낸다.
도 14A 및 14B: 상이한 보조제를 사용하여 표 10 (서열 번호 239-241)에 나타낸 상이한 양의 LHRH 펩티드 면역원 작제물의 혼합물로 돼지를 면역화한 후 얻은 항-LHRH 항체 역가 및 테스토스테론 농도를 예시하는 그래프. 도 14A는 보조제로서 에멀시겐 D를 사용하여 얻은 항체 역가를 나타낸다. 도 14B는 보조제로서 MONTANIDE ISA50V를 사용하여 얻은 항체 역가를 나타낸다.
도 15: 정상 공여자의 나이브 말초 혈액 단핵 세포에서 무차별적 및 인공 Th 펩티드 반응성 T 세포의 검출.
도 16: 종양 관련 탄수화물 항원 (TACA)의 구조: GD3, GD2, 글로보-H, GM2, 푸코실 GM1, PSA, Ley, Lex, SLex, SLea 및 STn.
도 17 내지 21: 글리칸 접합 UBITh® 펩티드의 고체상 펩티드 합성 도식을 통한 예시적인 단계적 합성.
본 개시내용은 예방 및 치료 용도를 위한 표적 항원에 대한 기능적 부위 지정 항체를 자극하는 무차별적 인공 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프를 제공한다. 본 개시내용은 또한 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물, Th 에피토프를 함유하는 조성물, Th 에피토프를 제조하고 사용하는 방법, 및 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물에 의해 생산된 항체에 관한 것이다.
개시된 인공 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프는 선택적 스페이서를 통해 B 세포 에피토프 및/또는 이펙터 T 세포 에피토프 (예를 들어, 세포독성 T 세포; CTL) ("표적 항원 부위(들)")에 연결되어, 펩티드 면역원 작제물을 생산할 수 있다. 개시된 Th 에피토프는 치료 효과를 위한 표적 항원 부위에 대한 높은 수준의 항체 및/또는 세포 반응 (예를 들어, 사이토카인)의 생산과 함께 강한 T 헬퍼 세포-매개 면역 반응을 유도하는 능력을 펩티드 면역원에 부여한다. 개시된 펩티드 면역원 작제물은 펩티드 면역원에서 큰 담체 단백질 및 병원체 유래 T 헬퍼 세포 부위의 표적 항원 부위의 면역원성을 개선하도록 특이적으로 설계된 개시된 인공 Th 에피토프로의 유리한 대체를 제공한다. 개시된 Th 에피토프를 함유하는 비교적 짧은 펩티드 면역원 작제물은 Th 에피토프에 대한 유의한 염증 반응 또는 면역 반응을 초래하지 않고 특정 표적 항원 부위에 대해 높은 수준의 항체 및/또는 이펙터 세포 관련된 사이토카인을 유발한다.
펩티드 면역원 작제물에 의해 유발된 면역 반응 (항체 역가, Cmax, 항체 생산의 개시, 반응의 지속 기간 등을 포함)은 하기 변화에 의해 조절될 수 있다: (a) B 세포 에피토프에 화학적으로 연결된 Th 에피토프의 선택, (b) B 세포 에피토프의 길이, (c) 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 제제에 사용되는 보조제, 및/또는 (d) 면역접종당 투여량 및 각 면역접종에 대한 프라임 및 부스트 시점을 포함하는 투여 요법. 따라서, 표적 항원 부위에 대한 특이적 면역 반응은 개시된 Th 에피토프를 사용하여 설계될 수 있고, 이는 임의의 환자 또는 대상체의 개별 특성에 맞춤화된 의료 치료를 용이하게 할 수 있다.
인공 Th 에피토프를 함유하는 개시된 펩티드 면역원 작제물은 바람직한 표적 항원 부위에 대해 면역화된 숙주에서 항체 및/또는 사이토카인 반응을 유발할 수 있다. 표적 항원 부위는 특정 단백질, 암 항원-관련된 탄수화물, 소분자 약물 화합물, 또는 임의의 표적 펩티드 또는 단백질의 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 아밀로이드 β (Aβ), 구제역 (FMD) 캡시드 단백질, 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)로부터의 당단백질, 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH), 및 임의의 다른 펩티드 또는 단백질 서열로 표적화된 항체를 유발하는 펩티드 면역원을 제공하는데 사용될 수 있는 무차별적 인공 Th 에피토프를 기술한다.
특정 구현예에서, 표적 항원 부위는 보통 면역침묵 자기-항원 또는 종양 관련 신생항원 표적 (예를 들어, Aβ, 타우, 알파 시누클레인, 디펩티드 단백질, IgE EMPD, IL-6, CGRP, 아밀린, IL-31, 신생항원 등)으로부터 취한다. 자기 항원 및 종양 관련 신생항원 부위의 비-제한적인, 대표적인 서열은 표 3A에 나타낸다. 다른 구현예에서, 표적 항원 부위는 병원성 유기체 (예를 들어, FMDV, PRRSV, CSFV, HIV, HSV 등)로부터 취한다. 병원성 항원 부위의-제한적인, 대표적인 서열은 표 3B에 나타낸다.
본 발명의 펩티드 또는 표적 항원 부위는 의학적 및 수의학적 응용에 유용할 수 있다. 예를 들어, 개시된 인공 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 감염성 질환 또는 신경 퇴행성 질환으로부터의 보호 면역력을 제공하는 백신 조성물, 또는 정상 생리학적 과정의 기능부전에 기인하는 장애의 치료를 위한 약제학적 조성물, 암, 2형 당뇨병을 치료하는 면역요법에서, 또는 정상 생리학적 과정에 개입하는 약제로서 사용될 수 있다.
개론
본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이지, 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원에서 인용된 모든 참조문헌 또는 참조문헌의 일부분은 임의의 목적을 위해 본 명세서에 전문이 참고로 명시적으로 포함된다.
달리 설명되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어 "a," "an," 및 "the"는 문맥이 달리 분명하게 나타내지 않는 한, 복수 대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥이 달리 분명하게 나타내지 않는 한 "및"을 포함하도록 의도된다. 따라서 "A 또는 B를 포함하는"은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 폴리펩티드에 대해 제공된 모든 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이며, 설명을 위해 제공된 것임이 추가로 이해되어야 한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 개시된 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고 문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 용어의 설명을 포함하는, 본 명세서가 우선할 것이다. 추가적으로, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
펩티드 면역원 작제물
본원에 사용된 용어 "펩티드 면역원" 또는 "펩티드 면역원 작제물"은 단일의 더욱 큰 펩티드를 형성하기 위해, 이종성 스페이서 유무에 관계없이, 공유 결합 (예를 들어, 통상적인 펩티드 결합 또는 티오에스터)를 통해서 표적 항원 부위에 공유 결합된 인공 Th 에피토프를 포함하는 분자를 지칭한다. 전형적으로, 펩티드 면역원 작제물은 (a) 이종성 무차별적 인공 Th 에피토프; (b) B 세포 에피토프 또는 이펙터 T 세포 에피토프 (예를 들어, CTL)와 같은 표적 항원 부위; 및 (c) 선택적 이종성 스페이서를 포함한다.
펩티드 면역원에서 무차별적 인공 Th 에피토프의 존재는 펩티드 면역원으로 면역접종 후 동물에서 표적 항원 부위에 대한 강한 Th 세포-매개 면역 반응 및 높은 수준의 항체를 유도할 수 있다. 개시된 펩티드 면역원 작제물은 펩티드 면역원에서 큰 담체 단백질 및 병원체 유래 T 헬퍼 세포 부위의 표적 항원 부위의 면역원성을 개선하도록 특별히 설계된 개시된 인공 Th 에피토프로의 유리한 대체를 제공한다. 개시된 Th 에피토프를 함유하는 비교적 짧은 펩티드 면역원 작제물은 Th 에피토프에 대한 유의한 염증 반응 또는 면역 반응을 초래하지 않고 특정 표적 항원 부위에 대해 높은 수준의 항체 및/또는 이펙터 세포 관련된 사이토카인을 유발한다.
본 발명의 개시된 인공 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물은 하기 식으로 표시될 수 있다:
(A)n-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
또는
(A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(A)n-X
또는
(A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
또는
{(A)n-(Th)p-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)p-(A)n-X}m
식 중:
각각의 A는 독립적으로 아미노산이고;
각각의 B는 독립적으로 이종성 스페이서이고;
각각의 Th는 독립적으로 인공 Th 에피토프이고;
표적 항원 부위는 B 세포 에피토프, CTL 에피토프, 펩티드 합텐, 비-펩티드 합텐, 또는 이의 면역학적 활성 유사체이고;
X는 아미노산, α-COOH, 또는 α-CONH2이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
m은 1, 2, 3, 또는 4이고;
o는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; 그리고
p는 0, 1, 2, 3, 또는 4이다.
본 개시내용의 펩티드 면역원은 약 20 내지 약 100개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원 작제물은 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 또는 약 100개의 아미노산 잔기를 함유한다.
개시된 IL-31 펩티드 면역원 작제물의 다양한 구성요소가 하기에 기술된다.
A - 아미노산
본 개시내용의 면역원성 펩티드에서의 각각의 A는 독립적으로 이종성 아미노산이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종성"은 표적 항원 부위 (예를 들어, B 세포 에피토프)의 야생형 아미노산 서열의 일부가 아니거나, 이와 상동성이 아닌 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, A의 이종성 아미노산 서열은 표적 항원 부위의 단백질 또는 펩티드에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 서열을 함유한다. 구성요소 A의 서열이 표적 항원 부위에 대해 이종성이기 때문에, 표적 항원 부위의 천연 아미노산 서열은 구성요소 A가 표적 항원 부위에 공유 결합된 경우 N-말단 또는 C-말단 방향으로 연장되지 않는다.
일부 구현예에서, 각각의 A는 독립적으로 비-천연 발생 또는 천연 발생 아미노산이다.
천연 발생 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다.
비-천연 발생 아미노산, ε-N 라이신, β-알라닌, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 티록신, γ-아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린, 아미노벤조산, 6-아미노카프론산(Aca; 6-아미노헥산산), 히드록시프롤린, 머캅토프로피온산 (MPA), 3-니트로-티로신, 피로글루탐산 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, n은 식에서 그 위치에 아미노산이 첨가되지 않음을 나타내는 0이다. 다른 구현예에서, n은 1이고 임의의 천연 또는 비-천연 아미노산으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, n은 1보다 크고, 각각의 A는 독립적으로 동일한 아미노산이다. 다른 구현예에서, n은 1보다 크고 각각의 A는 독립적으로 상이한 아미노산이다.
B - 선택적 이종성 스페이서
본 개시내용의 면역원성 펩티드에서 각각의 B는 선택적 이종성 스페이서이다. 구성요소 B의 선택적 이종성 스페이서는 독립적으로 아미노산, -NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(εN)Lys-, -NHCH(X)CH2S-숙신이미딜(εN)Lys-, -NHCH(X)CH2S-(숙신이미딜)-, 및/또는 이의 임의의 조합이다. 스페이서는 구성요소 A에 대해 전술한 바와 같이 하나 이상의 천연 또는 비-천연 발생 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 용어 "이종성"은 표적 항원 부위 (예를 들어, B 세포 에피토프)의 야생형 아미노산 서열의 일부가 아니거나, 이와 상동성이 아닌 아미노산을 지칭한다. 따라서, 스페이서가 아미노산인 경우, 스페이서는 표적 항원 부위의 단백질 또는 펩티드에서 자연적으로 발견되지 않는 아미노산 서열을 함유한다. 구성요소 B의 서열이 표적 항원 부위에 대해 이종성이기 때문에, 표적 항원 부위의 천연 아미노산 서열은 구성요소 B가 표적 항원 부위에 공유 결합된 경우 N-말단 또는 C-말단 방향으로 연장되지 않는다.
스페이서는 에피토프와 표적 항원 부위의 분리를 향상시키기 위한 가요성 힌지 스페이서일 수 있다. 일부 구현예에서, 가요성 힌지 서열은 프롤린이 풍부할 수 있다. 특정 구현예에서, 가요성 힌지는 서열 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 번호 55)를 갖고, 이는 면역글로불린 중쇄에서 발견되는 가요성 힌지 영역으로부터 모델링된다. 그 안의 Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 구현예에서, Xaa는 아스파르트산이다. 일부 구현예에서, 스페이서에 의해 제공된 입체형태 분리는 제시된 펩티드 면역원과 적절한 Th 세포 및 B 세포 사이의 더욱 효율적인 상호작용을 허용할 수 있다. Th 에피토프에 대한 면역 반응은 개선된 면역 반응성을 제공하도록 향상될 수 있다.
o>1인 경우, 각각의 B는 독립적으로 동일하거나 상이하다. 일부 구현예에서, B는 Gly-Gly, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 번호 55), εNLys, εNLys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 번호 54), Lys-Lys-Lys, -NHCH(X)CH2SCH2CO-, -NHCH(X)CH2SCH2CO(εNLys)-, -NHCH(X)CH2S-숙신이미딜-εNLys-, 또는 -NHCH(X)CH2S-(숙신이미딜)-, 및/또는 이의 임의의 조합이다. 예시적인 이종성 스페이서는 표 2에 나타낸다.
표적 항원 부위
표적 항원 부위는 외래- 또는 자기 펩티드 또는 단백질, B 세포 에피토프, CTL 에피토프, 펩티드 합텐, 비-펩티드 합텐, 또는 이의 면역학적 활성 유사체를 포함하는, 임의의 표적 펩티드 또는 단백질로부터의 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 표적 항원 부위는 특정 단백질, 암 항원-관련된 탄수화물, 소분자 약물 화합물, 또는 임의의 표적 펩티드 또는 단백질로부터의 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 아밀로이드 β (Aβ), 구제역 (FMD) 캡시드 단백질, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV)로부터의 당단백질, 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH), 및 임의의 다른 펩티드 또는 단백질 서열로 표적화된 항체를 유발하는 펩티드 면역원을 제공하기 위해 사용될 수 있는 무차별적 인공 Th 에피토프를 기술한다.
특정 구현예에서, 표적 항원 부위는 보통 면역침묵 (예를 들어, Aβ, 타우, 알파 시누클레인, 디펩티드 단백질, IgE EMPD, IL-6, CGRP, 아밀린, IL-31, 신생항원 등)인 자기-항원 또는 종양 관련 신생항원 표적으로부터 취한다. 자기 항원 및 종양 관련 신생항원 부위의 비-제한적인, 대표적인 서열은 표 3A에 나타낸다. 다른 구현예에서, 표적 항원 부위는 병원성 유기체 (예를 들어, FMDV, PRRSV, CSFV, HIV, HSV 등)로부터 취한다. 병원성 항원 부위의 비-제한적인, 대표적인 서열은 표 3B에 나타낸다.
특정 구현예에서, 표적 항원 부위는 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) (예를 들어, 미국 특허 번호 6,025,468, 6,228,987, 6,559,282, 및 미국 공개 번호 US2017/0216418); 아밀로이드 β (Aβ) (예를 들어, 미국 특허 번호 6,906,169, 7,951,909, 8,232,373, 및 9,102,752); 구제역 캡시드 단백질 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,048,538, 6,107,021, 및 미국 공개 번호 2015/0306203); HIV 감염의 예방 및 치료를 위한 HIV 비리온 에피토프 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,912,176, 5,961,976, 및 6,090,388); 돼지 서코바이러스 2형의 캡시드 단백질 (PCV2) (예를 들어, 미국 공개 번호 2013/0236487), 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV)로부터의 당단백질 (예를 들어, 미국 공개 번호 2014/0335118), IgE (예를 들어, 미국 특허 번호 7,648,701 및 6,811,782), 알파-시누클레인 (α-Syn) (국제 PCT 출원 번호 PCT/US2018/037938), 막 결합된 IgE의 세포외 막-근위 도메인 (또는 IgE EMPD) (국제 PCT 출원 번호 PCT/US2017/069174), 타우 (국제 PCT 출원 번호 PCT/US2018/057840), 및 인터루킨-31 (IL-31) (국제 PCT 출원 번호 PCT/US2018/065025), 말라리아의 예방을 위한 말라리아원충의 CS 항원; 동맥경화증의 예방 및 치료를 위한 CETP; 2형 당뇨병의 예방 및 치료를 위한 IAPP (아밀린), 및 임의의 다른 펩티드 또는 단백질 서열의 일부로부터 유래된다. 모든 특허 및 특허 공보는 이들의 전문이 참고로 본원에 포함된다.
다른 구현예에서, 표적 항원 부위는 종양 관련 탄수화물 항원 (TACA) 및 소분자 약물 화합물을 포함하는, 비-펩티드 합텐이다. TACA의 예시는 실시예 11 및 도 16 및 17에서 추가로 논의되는 바와 같이, GD3, GD2, 글로보-H, GM2, 푸코실 GM1, GM2, PSA, Ley, Lex, SLex, SLea, Tn, TF, 및 STn을 포함한다.
Th - T 헬퍼 에피토프
펩티드 면역원 작제물의 무차별적 인공 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프는 표적 항원 부위의 면역원성을 향상시키고, 이는 합리적인 설계를 통해 최적화된 표적 B 세포 에피토프에 대해서 특정 고역가 항체의 생산을 용이하게 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "무차별적"은 종 및 단일 종의 개체에 걸쳐 반응성인 Th 에피토프를 지칭한다.
Th 에피토프와 관련하여 사용되는, 용어 "인공"은 자연에서 발견되지 않는 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 본 개시내용의 인공 Th 에피토프는 표적 항원 부위에 대해 이종성 서열을 갖는다. 상기 논의된 바와 같이, 용어 "이종성"은 표적 항원 부위의 야생형 서열의 일부가 아니거나, 이와 상동성이 아닌 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 이종성 Th 에피토프는 표적 항원 부위에서 자연적으로 발견되지 않는 아미노산 서열로부터 유래된 Th 에피토프이다. Th 에피토프가 표적 항원 부위에 대해 이종성이기 때문에, 표적 항원 부위의 천연 아미노산 서열은 이종성 Th 에피토프가 표적 항원 부위에 공유 결합된 경우 N-말단 또는 C-말단 방향으로 연장되지 않는다.
Th 에피토프는 임의의 종 (예를 들어, 인간, 돼지, 소, 개, 랫트, 마우스, 기니피그 등)으로부터 유래된 아미노산 서열을 가질 수 있다. Th 에피토프는 또한 다수 종의 MHC 클래스 II 분자에 대해 무차별적 결합 모티프를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, Th 에피토프는 면역 반응의 개시 및 조절을 유도하는 T 헬퍼 세포의 최대 활성화를 허용하는 다중 무차별적 MHC 클래스 II 결합 모티프를 포함한다. Th 에피토프는 바람직하게는 스스로 면역침묵이며, 즉, 존재하는 경우, 펩티드 면역원 작제물에 의해 생성된 항체 중 소수가 Th 에피토프를 향하여, 표적화된 항원 부위로 지향된 매우 집중된 면역 반응을 가능하게 할 것이다.
Th 에피토프는 대략 15 내지 대략 50개 아미노산 잔기의 크기 범위를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Th 에피토프는 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50개 아미노산 잔기를 가질 수 있다. Th 에피토프는 공통 구조적 특징 및 특정 랜드마크 서열을 공유할 수 있다. 일부 구현예에서, Th 에피토프는 양친매성 나선, 즉, 나선의 한쪽 면을 지배하는 소수성 아미노산 잔기와 그 둘레 면을 지배하는 하전된 극성 잔기를 알파-나선 구조를 갖는다.
Th 에피토프 및 WO 1999/066957의 개시내용, 및 해당하는 미국 특허 번호 6,713,301은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
무차별적 Th 결정자는 면역원성이 낮은 펩티드를 강화하는데 효과적일 수 있다. 잘 설계된 무차별적 Th/B 세포 에피토프 키메라 펩티드는 유전적으로 다양한 집단의 대부분의 구성원에서 B 세포 부위를 표적화하는 항체 반응으로 Th 반응을 유발할 수 있다. 일부 구현예에서, Th 세포는 펩티드-담체를 잘 특성화된 무차별적 Th 결정자에 공유 결합함으로써 표적 항원 펩티드에 공급될 수 있다.
무차별적 Th 에피토프는 추가의 1차 아미노산 패턴을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 무차별적 Th 에피토프는 로스바드 서열을 함유할 수 있고, 여기서 무차별적 Th 에피토프는 하전된 잔기 (예를 들어, -Gly-), 이어서 2 내지 3개의 소수성 잔기, 이어서 하전된 또는 극성 잔기를 함유한다 (Rothbard and Taylor, EMBO J, 1988; 7:93-101). 무차별적 Th 에피토프는 1, 4, 5, 8 규칙을 따를 수 있고, 여기서 양으로 하전된 잔기에 이어서 동일한 면에 위치한 위치 1, 4, 5 및 8을 갖는 양친매성 나선과 일치하는 네 번째, 다섯 번째 및 여덟 번째 위치에서 소수성 잔기가 이어진다. 일부 구현예에서, 소수성 및 하전된 극성 아미노산의 1, 4, 5, 8 패턴은 단일 Th 에피토프 내에서 반복될 수 있다. 일부 구현예에서, 무차별적 T 세포 에피토프는 로스바드 서열 또는 1, 4, 5, 8 규칙을 따르는 에피토프 중 적어도 하나를 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, Th 에피토프는 1개 초과의 로스바드 서열을 함유한다.
병원체로부터 유래된 무차별적 Th 에피토프는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: B형 간염 표면 Th 세포 에피토프 (HBsAg Th), B형 간염 코어 항원 Th 세포 에피토프 (HBc Th), 백일해 독소 Th 세포 에피토프 (PT Th), 파상풍 독소 Th 세포 에피토프 (TT Th), 홍역 바이러스 F 단백질 Th 세포 에피토프 (MVF Th), 클라미디아 트라코마티스 주요 외막 단백질 Th 세포 에피토프 (CT Th), 디프테리아 독소 Th 세포 에피토프 (DT Th), 플라스모디엄 팔시파룸 포자소체 Th 세포 에피토프 (PF Th), 쉬스토소마 만소니 트리오스 포스페이트 이성질화효소 Th 세포 에피토프 (SM Th), 및 에쉐리히아 콜라이 TraT Th 세포 에피토프 (TraT Th), 클로스트리듐 테타니, 보르데텔라 페르투시스, 콜레라 독소, 인플루엔자 MP1, 인플루엔자 NSP1, 엡스테인바 바이러스 (EBV), 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV). 본 개시내용에 사용되는 Th 에피토프의 실시예는 표 1에 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 Th 에피토프는 유사한 아미노산 서열을 함유하는 펩티드의 혼합물을 함유하는 조합 Th 에피토프일 수 있다. 또한 조합 인공 Th 에피토프로도 불리는, 구조화된 합성 항원 라이브러리 (SSAL)는 특정 위치에 치환을 갖는 불변 잔기의 구조적 프레임워크 주위에 조직된 아미노산 서열을 갖는 다수의 Th 에피토프를 포함한다. SSAL 에피토프의 서열은 상대적으로 불변 잔기를 유지하고 다양한 MHC 제한 요소의 인식을 제공하기 위해 다른 잔기를 변경함으로써 결정된다. SSAL 에피토프의 서열은 무차별적 Th의 1차 아미노산 서열을 정렬하고, 골격 프레임워크로서 Th 펩티드의 고유한 구조를 담당하는 잔기를 선택 및 유지하고, 알려진 MHC 제한 요소에 따라 나머지 잔기를 변경함으로써 결정될 수 있다. MHC 제한 요소의 바람직한 아미노산을 갖는 불변 및 가변 위치는 MHC-결합 모티프를 얻는데 사용할 수 있고, 이는 Th 에피토프의 SSAL을 설계하는데 사용될 수 있다.
조합 서열로서 제시된 이종성 Th 에피토프 펩티드는 그 특정 펩티드에 대한 상동체의 가변 잔기에 기초한 펩티드 프레임워크 내 특정 위치에 표시된 아미노산 잔기의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, Th 에피토프 라이브러리 서열은 무차별적 Th 에피토프의 구조적 모티프를 유지하고 더 넓은 범위의 일배체형에 대한 반응성을 수용하도록 설계된다. 일부 구현예에서, SSAL의 구성원은 홍역 바이러스의 F 단백질로부터 취한 무차별적 에피토프 (예를 들어, 서열 번호 1-5)를 모델링한, 퇴화 Th 에피토프 SSAL1 Th1일 수 있다. 다른 구현예에서, SSAL의 구성원은 HBsAg1로부터 취한 무차별적 에피토프 (예를 들어, 서열 번호 19-24)를 모델링한, 퇴화 Th 에피토프 SSAL2 Th2일 수 있다.
합성 후 조합 인공 Th 에피토프 (또는 SSAL)의 혼합물에 존재하는 펩티드의 총 수는 각각의 가변 위치에서 사용 가능한 옵션 수를 함께 곱하여 계산할 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 16은 5개의 가변 위치를 함유하기 때문에 32개의 상이한 펩티드의 조합을 나타내고, 여기서 각각의 가변 위치는 2개의 상이한 잔기 옵션을 갖는다 (즉, 2x2x2x2x2 = 25 = 32). 유사하게, 서열 번호 5는 524,288개의 상이한 펩티드의 조합을 나타낸다 (즉, 2x4x2x4x2x4x4x4x2x4x2x4 = 25x47 = 524,288). 조합 인공 Th 에피토프 서열은 (a) 가변 서열에 의해 포함된 모든 펩티드의 혼합물 및 (b) 조합 내에 단일 서열을 함유하는 각각의 개별 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 하전된 잔기 Glu 또는 Asp는 Th의 소수성 면을 둘러싸는 전하를 증가시키기 위해 위치 1에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 양친매성 나선의 소수성 면은 2, 5, 8, 9, 10, 13 및 16에서 소수성 잔기에 의해 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 2, 5, 8, 9, 10, 및 13에서 아미노산 잔기는 광범위한 MHC 제한 요소의 결합 능력을 갖는 파사드를 제공하도록 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기의 변이는 인공 Th 에피토프의 면역 반응성의 범위를 확대할 수 있다.
인공 Th 에피토프는 공지된 무차별적 Th 에피토프의 모든 특성과 특징을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인공 Th 에피토프는 SSAL의 구성원이다. 일부 구현예에서, 인공 Th 부위는 부위 특이적 표적에 대해 향상된 항체 반응을 제공하기 위해 자기 항원 및 외래 항원으로부터 취한 펩티드 서열과 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 인공 Th 에피토프 면역원은 효과적이고 안전한 항체 반응을 제공하고, 높은 면역능을 나타내고, 광범위한 반응성 반응을 입증할 수 있다.
이상적인 인공 Th 에피토프가 또한 제공된다. 이들 이상적인 인공 Th 에피토프는 WO 95/11998에서 개시된, 2개의 알려진 천연 Th 에피토프 및 SSAL 펩티드 원형에 대해 모델링한다. SSALS는 유전적으로 다양한 집단의 구성원 사이에서 광범위한 면역 반응을 유발하기 위해 의도하는 조합 MHC 분자 결합 모티프 (Meister et al., 1995)를 통합한다. SSAL 펩티드 원형은 다중 MHC-결합 모티프를 도입하여 변형된, 홍역 바이러스 및 B형 간염 바이러스 항원의 Th 에피토프를 기반으로 설계되었다. 다른 Th 에피토프의 설계는 일련의 신규한 인공 Th 에피토프를 생산하기 위해 다중 MHC-결합 모티프를 단순화, 추가, 및/또는 변형함으로써 다른 알려진 Th 에피토프를 모델링하였다. 무차별적 인공 Th 부위는 다양한 표적 항원 부위를 보유하는 합성 펩티드 면역원으로 통합되었다. 생성된 키메라 펩티드는 표적 항원 부위에 대해 효과적인 항체 반응을 자극할 수 있었다.
표 1에 "SSAL1 Th1"로 나타낸, 원형 인공 헬퍼 T 세포 (Th) 에피토프, 4개의 펩티드 (서열 번호 1-4)의 혼합물은 홍역 바이러스의 F 단백질의 무차별적 Th 에피토프로부터 모델링한 이상적인 Th 에피토프이다 (Partidos et al. 1991). "MVF Th (UBITh®5)" (서열 번호 6)로서 표 1에 나타낸 모델 Th 에피토프는 홍역 바이러스 F 단백질의 잔기 288-302에 해당한다. MVF Th (서열 번호 6)는 "로스바드 규칙"에 따라 에피토프의 소수성 면을 둘러싸는 전하를 증가시키기 위해 위치 1에서 하전된 잔기 Glu/Asp를 첨가하고; 위치 4, 6, 12 및 14에서 하전된 잔기 또는 Gly를 첨가하거나 유지하고; 위치 7 및 11에서 하전된 잔기 또는 Gly를 첨가하거나 유지함으로써 SSAL1 Th1 원형 (서열 번호 1-4)으로 변형되었다. Th 에피토프의 소수성 면은 위치 2, 5, 8, 9, 10, 13, 및 16에서 잔기를 포함한다. 무차별적 에피토프와 공통적으로 연관된 소수성 잔기는 조합 Th SSAL 에피토프, SSAL1 Th1 (서열 번호 1-4)를 제공하기 위해 이들 위치에서 치환되었다. 원형 SSAL1 Th1 (서열 번호 1-4)의 또 다른 유의한 특징은 위치 1 및 4가 위치 9의 어느 한쪽에서 회문구조로 불완전하게 반복되어, MHC-결합 모티프를 모방한다는 것이다. SSAL1 Th1의 이러한 "1, 4, 9" 회문구조 패턴은 원래의 MvF 모델 Th의 서열 (서열 번호 6)을 더욱 가깝게 반영하도록 서열 번호 2 (표 1)에서 추가로 변형되었다.
조합 인공 Th 에피토프는 일련의 단일-서열 에피토프를 제공하도록 단순화될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 5의 조합 서열은 서열 번호 1-4로 표시되는 단일 서열 Th 에피토프로 단순화될 수 있다. 이러한 단일 서열 Th 에피토프는 향상된 면역원성을 제공하도록 표적 항원 부위에 커플링될 수 있다.
일부 구현예에서, Th 에피토프의 면역원성은 N 말단을 비-극성 및 극성의 하전되지 않은 아미노산, 예를 들어, Ile 및 Ser로 연장하고, C 말단을 하전된 소수성 아미노산, 예를 들어, Lys 및 Phe로 연장함으로써 개선될 수 있다. 또한, Th 에피토프에 대한 라이신 잔기 또는 다중 라이신 잔기 (예를 들어, KKK)의 첨가는 물 중 펩티드의 용해도를 개선할 수 있다. 추가 변형은 공통 MHC-결합 모티프 AxTxIL에 의한 C-말단의 치환을 포함하였다 (Meister et al, 1995).
인공 Th 에피토프는 알려진 천연 Th 에피토프 또는 SSAL 펩티드 원형일 수 있다. 일부 구현예에서, SSAL로부터의 Th 에피토프는 유전적으로 다양한 집단의 구성원 사이에서 광범위한 면역 반응을 유발하도록 의도된 조합 MHC 분자 결합 모티프를 통합할 수 있다. 일부 구현예에서, SSAL 펩티드 원형은 다중 MHC-결합 모티프를 도입함으로써 변형된, 홍역 바이러스 및 B형 간염 바이러스 항원의 Th 에피토프에 기초하여 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 인공 Th 에피토프는 일련의 신규한 인공 Th 에피토프를 생산하도록 다중 MHC-결합 모티프를 단순화, 추가, 또는 및/또는 변형할 수 있다. 일부 구현예에서, 새롭게 조정된 무차별적 인공 Th 부위는 다양한 표적 항원 부위를 보유하는 합성 펩티드 면역원으로 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 생성된 키메라 펩티드는 표적 항원 부위에 대해 효과적인 항체 반응을 자극할 수 있다.
본 개시내용의 인공 Th 에피토프는 클래스 II MHC 분자 결합 부위를 포함하는 천연 또는 비-천연 아미노산의 연속 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 인공 Th 에피토프는 표적 항원 부위에 대해 항체 반응을 향상하거나 자극할 수 있다. 일부 구현예에서, Th 에피토프는 연속 또는 불연속 아미노산 세그먼트로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, Th 에피토프의 모든 아미노산이 MHC 인식과 연관되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 Th 에피토프는 면역학적 기능성 상동체, 예를 들어 면역-향상 상동체, 교차 반응성 상동체, 및 이의 세그먼트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 기능성 Th 상동체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기의 보존적 치환, 첨가, 결실, 및 삽입을 추가로 포함하고 Th 에피토프의 Th-자극 기능을 제공할 수 있다.
Th 에피토프는 표적 부위에 직접 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, Th 에피토프는 선택적 이종성 스페이서, 예를 들어, Gly-Gly 또는 (ε-N)Lys와 같은 펩티드 스페이서를 통해 표적 부위에 부착될 수 있다. 스페이서는 B 세포 에피토프로부터 Th 에피토프를 물리적으로 분리하고, 표적 항원 부위와 Th 에피토프 또는 기능적 상동체의 연결에 의해 생성되는 임의의 인공 2차 구조의 형성을 방해함으로써, Th 및/또는 B 세포 반응의 임의의 간섭을 제거할 수 있다.
Th 에피토프는 표 1에 나타낸, 이상적인 인공 Th 에피토프 및 조합성 이상적인 인공 Th 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, Th 에피토프는 서열 번호 1-52의 무차별적 Th 세포 에피토프, 이의 임의의 상동체, 및/또는 이의 임의의 면역학적 유사체이다. Th 에피토프는 또한 Th 에피토프의 면역학적 유사체를 포함한다. 면역학적 Th 유사체는 면역-향상 유사체, 교차 반응성 유사체 및 표적 항원 부위에 대한 면역 반응을 향상시키거나 자극하는데 충분한 이들 Th 에피토프 중 하나의 세그먼트를 포함한다.
Th 에피토프 펩티드의 기능성 면역학적 유사체는 또한 효과적이고 본 발명의 일부로 포함된다. 기능성 면역학적 Th 유사체는 Th 에피토프의 Th-자극 기능을 본질적으로 변형하지 않는 Th 에피토프에서 1개 내지 약 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환, 첨가, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 보존적 치환, 첨가, 및 삽입은 표적 항원 부위에 대해 전술한 바와 같이, 천연 또는 비-천연 아미노산으로 달성될 수 있다. 표 1은 Th 에피토프 펩티드에 대한 기능적 유사체의 다른 변이를 식별한다. 특히, MvF1 및 MvF2 Th의 서열 번호 6 및 7은 N- 및 C-말단에서 각각의 2개의 아미노산의 결실 (서열 번호 6 및 7) 또는 봉입 (서열 번호 16 및 17)에 의해 아미노산 프레임에서 구별된다는 점에서 MvF4 및 MvF5의 서열 번호 16 및 17의 기능적 유사체이다. 이 두 일련의 유사한 서열 사이의 차이는 이들 서열에 포함된 Th 에피토프의 기능에 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 기능적 면역학적 Th 유사체는 홍역 바이러스 융합 단백질 MvF1-4 Th (서열 번호 6-18) 및 간염 표면 단백질 HBsAg 1-3 Th (서열 번호 19-31)로부터 유래된 여러 버전의 Th 에피토프를 포함한다.
펩티드 면역원 작제물의 Th 에피토프는 표적 항원 부위의 N- 또는 C- 말단에 공유 결합되어 키메라 Th/B 세포 부위 펩티드 면역원을 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, Th 에피토프는 화학적 커플링을 통해 또는 직접 합성을 통해 표적 항원 부위에 공유적으로 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, Th 에피토프는 표적 항원 부위의 N-말단에 공유 결합된다. 다른 구현예에서, Th 에피토프는 표적 항원 부위의 C-말단에 공유 결합된다. 특정 구현예에서, 하나 초과의 Th 에피토프는 표적 항원 부위에 공유 결합된다. 하나 초과의 Th 에피토프가 표적 항원 부위에 연결된 경우, 각각의 Th 에피토프는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 하나 초과의 Th 에피토프가 표적 항원 부위에 연결된 경우, Th 에피토프는 임의의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, Th 에피토프는 표적 항원 부위의 N-말단에 연속적으로 연결되거나, 표적 항원 부위의 C-말단에 연속적으로 연결될 수 있거나, 개별 Th 에피토프가 표적 항원 부위의 C-말단에 공유 결합되는 동안 Th 에피토프가 표적 항원 부위의 N-말단에 연속적으로 연결될 수 있다. 표적 항원 부위와 관련하여 Th 에피토프의 배열에 제한이 없다.
일부 구현예에서, Th 에피토프는 표적 항원 부위에 직접 공유 결합된다. 다른 구현예에서, Th 에피토프는 하기 상세히 기술된 바와 같이 이종성 스페이서를 통해 표적 항원 부위에 공유 결합된다.
합성 방법
본 개시내용의 펩티드 면역원은 화학적 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 펩티드 면역원은 고체상 펩티드 합성을 사용하여 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 펩티드는 a-NH2 또는 측쇄 아미노산을 보호하기 위해 t-Boc 또는 Fmoc을 사용하는 자동화 메리필드 고체상 펩티드 합성을 사용하여 합성된다.
조합 서열로서 제시된 이종성 Th 에피토프 펩티드는 그 특정 펩티드에 대한 상동체의 가변 잔기에 기초한 펩티드 프레임워크 내의 특정 위치에 나타낸 아미노산 잔기의 혼합물을 함유한다. 조합 펩티드의 조립체는 합성 과정 동안 특정 위치에서, 하나의 특정 아미노산 대신에 지정된 보호된 아미노산의 혼합물을 첨가함으로써 하나의 과정에서 합성될 수 있다. 이러한 조합 이종성 Th 에피토프 펩티드 조립체는 다양한 유전적 배경을 가진 동물에 대한 광범위한 Th 에피토프 범위를 허용할 수 있다. 이종성 Th 에피토프 펩티드의 대표적인 조합 서열은 표 1에 나타낸 서열 번호 5, 10, 13, 16, 24, 및 27을 포함한다. 본 발명의 Th 에피토프 펩티드는 유전적으로 다양한 집단의 동물 및 환자에 대해 광범위한 반응성 및 면역원성을 제공한다.
흥미롭게도, Th 에피토프, B 세포 에피토프, 및/또는 Th 에피토프 및 B 세포 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물의 합성 중에 도입될 수 있는 불일치 및/또는 오류는 치료되는 동물에서 바람직한 면역 반응을 매우 자주 방해하거나 방지하지 않는다. 사실상, 펩티드 합성 중에 도입될 수 있는 불일치/오류는 표적화된 펩티드 합성과 함께 다중 펩티드 유사체를 생성한다. 이들 유사체는 아미노산 삽입, 결실, 치환, 및 조기 종결을 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 펩티드 유사체는 면역진단 목적의 고체상 항원 또는 백신접종 목적의 면역원으로서 면역학적 응용에 사용될 때 항원성 및 면역원성에 대한 기여자로서 펩티드 제조에 적합하다.
Th 에피토프를 포함하는 펩티드 면역원 작제물은 표적 항원 부위와 나란히 단일 고체상 펩티드 합성에서 동시에 생산된다. Th 에피토프는 또한 Th 에피토프의 면역학적 유사체를 포함한다. 면역학적 Th 유사체는 면역-향상 유사체, 교차 반응성 유사체 및 표적 항원 부위에 대한 면역 반응을 향상하거나 자극하기에 충분한 이들 Th 에피토프 중 하나의 세그먼트를 포함한다.
바람직한 펩티드 면역원의 완전한 조립 후, 고체상 수지는 수지로부터 펩티드를 절단하고 아미노산 측쇄 상의 작용기를 제거하기 위해 처리될 수 있다. 유리 펩티드는 HPLC로 정제되고 생화학적으로 특성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 유리 펩티드는 아미노산 분석을 사용하여 생화학적으로 특성화된다. 일부 구현예에서, 유리 펩티드는 펩티드 서열을 사용하여 특성화된다. 일부 구현예에서, 유리 펩티드는 질량 분광분석을 사용하여 특성화된다.
본 발명의 펩티드 면역원은 티오에테르 결합의 형성을 통해 할로아세틸화 및 시스테인화 펩티드를 사용하여 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인이 Th-함유 펩티드의 C 말단에 첨가될 수 있고, 시스테인 잔기의 티올 기가 Nα 클로로아세틸-변형기 또는 라이신 잔기의 말레이미드-유도체화 α- 또는 ε-NH2 기와 같은 친전자기성 기에 대해 공유 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 생성된 합성 중간체는 표적 항원 부위 펩티드의 N-말단에 부착될 수 있다.
더 긴 합성 펩티드 접합체는 핵산 클로닝 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 Th 에피토프는 재조합 DNA 및 RNA를 발현시킴으로써 합성될 수 있다. 본 발명의 Th/표적 항원 부위 펩티드를 발현하는 유전자를 작제하기 위해, 아미노산 서열은 핵산 서열로 역번역될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 유전자가 발현될 유기체에 대해 최적화된 코돈을 사용하여 핵산 서열로 역번역된다. 펩티드를 인코딩하는 유전자가 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드를 인코딩하는 유전자는 펩티드 및 필요한 조절 요소를 인코딩하는 중첩 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 합성 유전자는 조립되고 바람직한 발현 벡터로 삽입될 수 있다.
본 개시내용의 합성 핵산 서열은 본 발명의 Th 에피토프를 인코딩하는 핵산 서열, Th 에피토프를 포함하는 펩티드, 이의 면역학적 기능성 상동체, 및 펩티드 또는 인코딩된 Th 에피토프의 면역원성 특성을 변화시키지 않는 비-코딩 서열에서의 변화에 의해 특성화된 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 합성 유전자가 적합한 클로닝 벡터로 삽입될 수 있고, 제조합체를 얻고 특성화할 수 있다. 그런 다음 Th 에피토프 및 Th 에피토프를 포함하는 펩티드는 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적합한 조건하에서 발현될 수 있다. Th 에피토프 또는 펩티드는 정제되고 특성화될 수 있다.
약학 조성물
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 펩티드 면역원을 포함하는 약학 조성물을 기술한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 약학 조성물은 펩티드 면역원의 투여를 위해 약학적으로 허용 가능한 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 약학 조성물은 면역학적으로 효과적인 양의 펩티드 면역원 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드 면역원은 면역원성 조성물로서 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 보조제, 유화제, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 백신 조성물에 통상적으로 제공되는 다른 성분을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 보조제 또는 유화제는 명반, 불완전 프로인트 보조제 (IFA), 리포신, 사포닌, 스쿠알렌, L121, 에멀시겐, 모노포스포릴 지질 A (MPL), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA), QS21, 및 ISA 720, ISA 51, ISA 35, ISA 206, 및 다른 효과적인 보조제 및 유화제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 즉시 방출용으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 지속 방출용으로 제형화될 수 있다.
약학 조성물에 사용되는 보조제는 오일, 알루미늄 염, 비로좀, 인산 알루미늄 (예를 들어, ADJU-PHOS®), 수산화 알루미늄 (예를 들어, ALHYDROGEL®), 리포신, 사포닌, 스쿠알렌, L121, Emulsigen®, 모노포스포릴 지질 A (MPL), QS21, ISA 35, ISA 206, ISA50V, ISA51, ISA 720, 뿐만 아니라 다른 보조제 및 유화제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 MONTANIDE™ ISA 51 (식물성 오일로 이루어진 오일 보조제 조성물 및 유중수 에멀젼의 생산을 위한 만니드 올레이트), TWEEN® 80 (폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트로 또한 알려짐), CpG 올리고뉴클레오티드, 및/또는 이의 임의의 조합을 함유한다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 보조제로서 에멀시겐 또는 에멀시겐 D를 갖는 수중유중수 (즉, w/o/w) 에멀젼이다.
도 1a는 UBITh®을 포함하는 Th 에피토프 담체를 함유하는 펩티드 면역원을 갖는 제형에 포함될 수 있는 구성요소를 요약하는 개략도이다. 도 1a에 나타낸 예시적인 제형은 2개의 개별 펩티드 면역원 작제물을 함유한다. 각각의 펩티드 면역원 작제물은 (a) 바람직한 에피토프에 대해 고도로 면역화된 항체를 유발하기 위해 설계된 맞춤형 기능성 B 세포 에피토프, (b) 면역원성을 향상하기 위해 면역 시스템에 대한 B 세포 에피토프 제시를 최적화하는데 돕는 링커, 및 (c) 그 자체는 면역침묵이지만, B 세포 에피토프에 대한 강력한 반응을 유도하는데 도움이 되는 Th 에피토프를 함유한다. 제형은 또한 조성물이 사용될 특정 적용에 대해 적절한 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 담체를 함유한다. 더욱이, 조성물은 CpG 올리고뉴클레오티드를 사용하는 안정화된 면역자극 복합체로 제형화될 수 있다 (하기 추가로 기술됨).
도 1b는 UBITh®을 포함하는 본원에 기술된 T 헬퍼 세포 에피토프 플랫폼의 여러 특징 및 기술적 이점을 요약한다. 예를 들어, 본원에 기술된 Th 에피토프는 오래 지속되지만 부스트가 없으면 가역적이다. Th 에피토프 플랫폼은 만약 있다면, 링커 또는 Th 에피토프 서열에 대해 생성되는 항체가 거의 없는 B 세포 에피토프에 대해 고도로 특이적인 항체를 생성한다. 더욱이, Th 에피토프 플랫폼은 광범위한 B 세포 에피토프와 사용될 수 있어, 이는 펩티드 면역원 작제물의 무한한 조합을 허용한다.
일부 구현예에서, 조성물은 백신으로서 사용하기 위해 제형화된다. 백신 조성물은 피하, 경구, 근육 내, 복강 내, 비경구, 또는 장관 투여를 포함하는, 임의의 편리한 경로로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원은 단일 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 면역원은 다회 용량에 걸쳐 투여된다.
약학 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사용으로 제조될 수 있다. 타우 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 액체 비히클은 또한 주사 전에 제조될 수 있다. 약학 조성물은 임의의 적합한 적용 방식, 예를 들어, i.d., i.v., i.p., i.m., 비강 내, 경구, 피하 등 및 임의의 적합한 전달 장치로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 정맥 내, 피하, 피내, 또는 근육 내 투여용으로 제형화된다. 경구 및 비강 내 적용을 포함하는 다른 투여 방식에 적합한 약학 조성물이 또한 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효한 양의 하나 이상의 펩티드 면역원 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 투여 형태의 조성물은 대상체의 체중 ㎏당 약 0.5 μg 내지 약 1 mg의 펩티드 면역원을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 투여 형태의 조성물은 대상체의 체중 ㎏당 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg, 약 200 μg, 약 300 μg, 약 400 μg, 약 500 μg, 약 600 μg, 약 700 μg, 약 800 μg, 약 900 μg, 또는 약 1000 μg의 펩티드 면역원을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 투여 형태의 조성물은 대상체의 체중 kg당 약 100 μg, 약 150 μg, 약 200 μg, 약 250 μg, 약 300 μg, 약 350 μg, 약 400 μg, 약 450 μg, 또는 약 500 μg의 펩티드 면역원을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 투여 단위 형태의 조성물은 대상체의 체중 kg당 약 0.5 μg 내지 약 1 mg의 펩티드 면역원을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 투여 단위 형태의 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg, 약 200 μg, 약 300 μg, 약 400 μg, 약 500 μg, 약 600 μg, 약 700 μg, 약 800 μg, 약 900 μg, 또는 약 1000 μg의 펩티드 면역원을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 투여 형태의 조성물은 약 100 μg, 약 150 μg, 약 200 μg, 약 250 μg, 약 300 μg, 약 350 μg, 약 400 μg, 약 450 μg, 또는 약 500 μg의 펩티드 면역원을 함유할 수 있다.
다회 용량으로 전달되는 경우, 조성물은 용량당 적절한 양으로 분할될 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 약 0.2 mg 내지 약 2.5 mg이다. 일부 구현예에서, 용량은 약 1 mg이다. 일부 구현예에서, 용량은 약 1 mg이고 주사로 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 약 1 mg이고 근육 내로 투여된다. 일부 구현예에서, 1회 용량에 반복 (부스터) 용량이 이어질 수 있다. 투여량은 연령, 체중, 및 대상체의 일반적인 건강에 따라 최적화될 수 있다.
펩티드 면역원의 혼합물을 포함하는 백신은 보다 넓은 모집단에서 향상된 면역 효능을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원의 혼합물은 MVF Th 및 HBsAg Th로부터 유래된 Th 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원의 혼합물을 포함하는 백신은 표적 항원 부위에 대해 개선된 면역 반응을 제공할 수 있다.
Th/표적 항원 부위 접합체에 대한 면역 반응은 생분해성 미세입자에서 또는 그 위에서의 포착을 통한 전달에 의해 개선될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원은 보조제와 함께 또는 보조제 없이 캡슐화될 수 있고, 이러한 미세입자는 면역 자극 보조제를 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, 미세입자는 면역 반응을 강화하기 위해 펩티드 면역원과 함께 공동 투여될 수 있다.
면역자극 복합체
본 개시내용은 또한 CpG 올리고뉴클레오티드와의 면역자극 복합체 형태로 타우 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 면역자극 복합체는 보조제 및 펩티드 면역원 안정화제로서 작용하도록 특이적으로 조정된다. 면역자극 복합체는 미립자 형태이며, 이는 면역 반응을 생성하기 위해 면역계의 세포에 대해 타우 펩티드 면역원을 효율적으로 제시할 수 있다. 면역자극 복합체는 비경구 투여를 위한 현탁액으로 제형화될 수 있다. 면역자극 복합체는 또한 비경구 투여 후 숙주의 면역계의 세포에 타우 펩티드 면역원을 효율적으로 전달하기 위해 미네랄 염 또는 제자리 겔화 중합체와 조합된 현탁액으로서, w/o 에멀션의 형태로 제형화될 수 있다.
안정화된 면역자극 복합체는 정전기적 회합을 통해 타우 펩티드 면역원 작제물을 음이온성 분자, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합과 복합체화함으로써 형성될 수 있다. 안정화된 면역자극 복합체는 면역원 전달 시스템으로서 약학 조성물로 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 타우 펩티드 면역원 작제물은 5.0 내지 8.0의 범위의 pH에서 양으로 하전된 양이온성 부분을 함유하도록 설계된다. 타우 펩티드 면역원 작제물, 또는 작제물의 혼합물의 양이온성 부분에 대한 순 전하는 각각의 라이신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H)에 대해 +1 전하, 각각의 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)에 대해 -1 전하 및 서열 내의 다른 아미노산에 대해 0의 전하를 할당하여 계산한다. 전하는 타우 펩티드 면역원 작제물의 양이온성 부분 내에서 합산되고 순 평균 전하로 표현된다. 적합한 펩티드 면역원은 +1의 순 평균 양전하를 갖는 양이온성 부분을 갖는다. 바람직하게는, 펩티드 면역원은 +2보다 큰 범위에서 순 양전하를 갖는다. 일부 구현예에서, 타우 펩티드 면역원 작제물의 양이온성 부분은 이종성 스페이서이다. 특정 구현예에서, 타우 펩티드 면역원 작제물의 양이온성 부분은 스페이서 서열이 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), 또는 Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 번호 54)일 때 +4의 전하를 갖는다.
본원에 기술된 바와 같은 "음이온성 분자"는 5.0-8.0의 범위의 pH에서 음으로 하전된 임의의 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 음이온성 분자는 올리고머 또는 중합체이다. 올리고머 또는 중합체에 대한 순 음전하는 올리고머의 각각의 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 기에 대해 -1 전하를 할당하여 계산한다. 적합한 음이온성 올리고뉴클레오티드는 1 내지 10 범위의 CpG 모티프의 반복 수를 갖는 8 내지 64개의 뉴클레오티드 염기를 갖는 단일-가닥 DNA 분자이다. 바람직하게는, CpG 면역자극 단일-가닥 DNA 분자는 3 내지 8 범위의 CpG 모티프의 반복 수를 갖는 18-48개 뉴클레오티드 염기를 함유한다.
더욱 바람직하게 음이온성 올리고뉴클레오티드 하기 식으로 표현된다: 5' X1CGX2 3' 식 중 C 및 G는 메틸화되지 않고; 그리고 X1은 A (아데닌), G (구아닌) 및 T (티민)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 그리고 X2는 C (시토신) 또는 T (티민)임. 또는, 음이온성 올리고뉴클레오티드는 하기 식으로 표현된다: 5' (X3)2CG(X4)2 3' 식 중 C 및 G는 메틸화되지 않고; 그리고 X3는 A, T 또는 G 로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 그리고 X4는 C 또는 T임. 특정 구현예에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 CpG1 (서열 번호 146), CpG2 (서열 번호 147), 또는 CpG3 (서열 번호 148)일 수 있다.
생성된 면역자극 복합체는 일반적으로 1-50 마이크론 범위 크기를 갖는 입자 형태이고 상호 작용하는 종의 상대 전하 화학 양론 및 분자량을 포함하는 많은 인자의 함수이다. 미립자형 면역자극 복합체는 생체 내 특이적 면역 반응의 보조 및 상향 조절을 제공하는 이점을 갖는다. 게다가, 안정화된 면역자극 복합체는 유중수 에멀젼, 미네랄 염 현탁액 및 폴리머 겔을 포함하는 다양한 공정에 의해 약학 조성물을 제조하는데 적합하다.
응용
본 개시내용의 인공 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원은 의학적 및 수의학적 응용에 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원은 감염성 질환으로부터 보호 면역을 제공하기 위한 백신, 정상 생리학적 과정의 기능부전으로 인한 장애를 치료하기 위한 면역 요법, 암 치료를 위한 면역 요법, 및 정상 생리학적 과정에 개입하거나 변경하기 위한 제제로서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 인공 Th 에피토프는 다양한 미생물, 단백질, 또는 펩티드의 표적 B 세포 에피토프와 조합될 때 면역 반응을 유발할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 인공 Th 에피토프는 하나의 표적 항원 부위에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 인공 Th 에피토프는 2개의 표적 항원 부위에 연결될 수 있다.
본 개시내용의 인공 Th 에피토프는 다양한 질환 및 병태를 예방 및/또는 치료하기 위해 표적 항원 부위에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경 퇴행성 질환, 감염성 질환, 동맥 경화증, 전립선 암의 예방 및/또는 치료, 웅취의 예방, 동물의 면역거세, 자궁내막증, 유방암 및 생식선 스테로이드 호르몬에 의해 영향받은 기타 부인과 암의 치료, 및 남성 및 여성의 피임을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 인공 Th 에피토프는 하기 단백질의 항원 부위에 연결될 수 있다:
a. 농장 동물의 성장을 촉진시키기 위한 소마토스타틴.
b. 알레르기 질환을 치료하기 위한 IgE.
c. 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염 및 면역 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 Th 세포의 CD4 수용체.
d. FMD를 예방하기 위한 구제역 (FMD) 바이러스 캡시드 단백질.
e. HIV 감염을 예방하고 치료하기 위한 HIV 비리온 에피토프.
f. 말라리아를 예방하고 치료하기 위한 플라스모듐 팔시파룸의 포자소체 항원.
g. 동맥경화증을 예방하고 치료하기 위한 CETP.
h. 알츠하이머병에 대한 치료 및 백신접종을 위한 Aβ.
i. 파킨슨병에 대한 치료 및 백신접종을 위한 알파-시누클레인.
j. 알츠하이머병을 비롯한 타우병증에 대한 치료 및 백신접종을 위한 타우.
k. 아토피성 피부염을 치료하기 위한 IL-31.
l. 편두통의 예방 및 치료를 위한 CGRP.
m. 2형 당뇨병의 예방 및 치료를 위한 IAPP (아밀린).
이종성 인공 Th 에피토프의 사용은 신경퇴행성 질환에 연루된 단백질 (예를 들어, Aβ, 알파-시누클레인, 타우)를 표적화하는데 특히 중요한 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 표적화된 신경 퇴행성 단백질의 내인성 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원은 대상체에 투여될 때 뇌의 염증을 일으킬 수 있다. 대조적으로, 신경 퇴행성 단백질의 항원 부위에 선호되는 이종성 인공 Th 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물은 뇌 염증을 초래하지 않는다.
도 2는 본 출원에 기술된 Th 에피토프 플랫폼을 사용하여 얻을 수 있는 이론적인 결과를 나타내는 그래프이다. 그래프는 Th 에피토프에 접합된 B 세포 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 작제물이 개시 시간이 빠르고, 신속하게 Cmax에 도달함을 나타낸다. Cmax는 이론적인 범위 내이며, 이는 최소 유효 농도 (MEC) 및 최소 치료적 농도 (MTC) 사이에 있다. 하기 실시예는 Cmax, 작용 기간, 개시 시간, 및 tmax가 사용되는 Th 에피토프, 펩티드 면역원 작제물의 투여량, 및 보조제를 변화시킴으로써 모두 제어되고/거나 조정될 수 있음을 입증한다.
아밀로이드 β
Aβ 펩티드는 알츠하이머병의 개시 및 진행을 위한 핵심인 것으로 생각된다. Aβ 올리고머 및 Aβ 원섬유의 독성 형태가 알츠하이머병과 치매의 병리로 이어지는 시냅스 및 뉴런의 죽음에 대한 책임이 있다고 제시된다. 알츠하이머병에 대한 성공적인 질환 조절 요법은 뇌에서 Aβ의 배치에 영향을 미치는 생성물을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 펩티드 면역원은 Th 세포 에피토프 및 Aβ-표적화 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Th 세포 에피토프는 Th1 또는 Th2이다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원은 Th1 및 Th2를 포함할 수 있다. Aβ-표적화 펩티드, 또는 B 세포 에피토프는 Aβ1-14, A1-16, Aβ1-28, Aβ17-42, 또는 Aβ1-42일 수 있다. 일부 구현예에서, Aβ--표적화 펩티드는 Aβ1-14이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 Aβx-y는 전장 야생형 Aβ 단백질의 아미노산 x에서 아미노산 y까지의 Aβ 서열을 표시한다.
본 개시내용의 펩티드 면역원은 하나 초과의 Aβ-표적화 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원은 2개의 Aβ-표적화 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원은 하나의 Aβ1-14 및 하나의 Aβ1-42 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원은 2개의 Aβ1-14-표적화 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 면역원은 2개의 Aβ1-14-표적화 펩티드를 포함할 수 있고, 각각 키메라 펩티드로서 상이한 Th 세포 에피토프에 연결된다.
본 개시내용은 또한 2개의 Aβ1-14-표적화 펩티드를 포함하는 Aβ1-14 펩티드 백신을 제공하고, 각각 키메라 펩티드로서 상이한 Th 세포 에피토프에 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 Aβ1-14 펩티드는 T-세포 염증 반응성을 최소화하기 위해 Th1-편향된 전달 시스템으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 Aβ1-14 펩티드는 T-세포 염증 반응성을 최소화하기 위해 Th2-편향된 전달 시스템으로 제형화될 수 있다.
구체적인 구현예
(1) 서열 번호 32 - 52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 무차별적 인공 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프.
(2) 하기 식으로 표시되는 펩티드 면역원 작제물:
(A)n-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
또는
(A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(A)n-X
또는
(A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
또는
{(A)n-(Th)p-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)p-(A)n-X}m
식 중:
각각의 A는 독립적으로 아미노산이고;
각각의 B는 독립적으로 이종성 스페이서이고;
각각의 Th는 독립적으로 (1)의 무차별적 인공 Th 에피토프이고;
표적 항원 부위는 외래-항원 단백질, 자기-항원 단백질, 또는 이의 면역학적 활성 유사체로부터의 B 세포 에피토프이고;
X는 아미노산, α-COOH, 또는 α-CONH2이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
m은 1, 2, 3, 또는 4이고; 그리고
o는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; 그리고
p는 0, 1, 2, 3, 또는 4임.
(3) (2)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 구제역 (FMD) 캡시드 단백질, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV)로부터의 당단백질, 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 및 단순 포진 바이러스 (HSV)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 외래-항원 단백질의 B 세포 에피토프인 펩티드 면역원 작제물.
(4) (2)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자기-항원 단백질의 B 세포 에피토프인 펩티드 면역원 작제물:
(a) 서열 번호 56, 57, 58, 59, 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 Aβ 펩티드;
(b) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 알파-Syn 펩티드;
(c) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 IgE EMPD 펩티드;
(d) 서열 번호 63, 69, 70, 또는 71의 아미노산 서열을 갖는 타우 펩티드;
(e) 서열 번호 64 또는 72의 아미노산 서열을 갖는 IL-31 펩티드; 및
(f) 서열 번호 145의 아미노산 서열을 갖는 IL-6 펩티드.
(5) (2)에 있어서, 상기 구성요소 B의 이종성 스페이서는 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 번호 54), Gly-Gly, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 번호 55), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드 면역원 작제물.
(6) (2)에 있어서, 상기 이종성 스페이서는 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), 및 Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 번호 54)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드 면역원 작제물.
(7) (2)에 따른 펩티드 면역원 작제물을 포함하는 약학 조성물.
(8) 대상체에게 (7)의 약학적으로 유효한 양의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질환, 병태, 또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법.
(9) (8)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 구제역 (FMD) 캡시드 단백질, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV)로부터의 당단백질, 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 및 단순 포진 바이러스 (HSV)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 외래-항원 단백질의 B 세포 에피토프인 방법.
(10) (8)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자기-항원 단백질의 B 세포 에피토프인 방법:
(a) 서열 번호 56, 57, 58, 59, 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 Aβ 펩티드;
(b) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 알파-Syn 펩티드;
(c) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 IgE EMPD 펩티드;
(d) 서열 번호 63, 69, 70, 또는 71의 아미노산 서열을 갖는 타우 펩티드;
(e) 서열 번호 64 또는 72의 아미노산 서열을 갖는 IL-31 펩티드; 및
(f) 서열 번호 145의 아미노산 서열을 갖는 IL-6 펩티드.
(11) 하기 식으로 표시되는 펩티드 면역원 작제물:
(A)n-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
또는
(A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(A)n-X
또는
(A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
또는
{(A)n-(Th)p-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)p-(A)n-X}m
식 중:
각각의 A는 독립적으로 아미노산이고;
각각의 B는 독립적으로 이종성 스페이서이고;
각각의 Th는 독립적으로 서열 번호 1-52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 무차별적 인공 Th 에피토프이고;
표적 항원 부위는 CTL 에피토프, 종양 관련 탄수화물 항원 (TACA), 신생항원의 B 세포 에피토프, 소분자 약물, 또는 이의 면역학적 활성 유사체이고;
X는 아미노산, α-COOH, 또는 α-CONH2이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
m은 1, 2, 3, 또는 4이고; 그리고
o는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; 그리고
p는 0, 1, 2, 3, 또는 4임.
(12) (11)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 76-144로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
(13) (12)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 76-82로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HIV의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
(14) (12)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 83-106으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HSV의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
(15) (12)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 107-123으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 FMDV의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
(16) (12)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 124-142로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PRRSV의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
(17) (12)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 143-144로 이루어진 그룹으로부터 선택된 CSFV의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
(18) (11)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 GD3, GD2, 글로보-H, GM2, 푸코실 GM1, GM2, PSA, Ley, Lex, SLex, SLea, Tn, TF, 및 STn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 TACA인 펩티드 면역원.
(19) (11)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 73-75로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신생항원으로부터의 B 세포 에피토프인 펩티드 면역원.
(20) (11)에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 소분자 약물인 펩티드 면역원.
(21) (11)에 있어서, 상기 구성요소 B의 이종성 스페이서는 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 번호 54), Gly-Gly, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 번호 55), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드 면역원 작제물.
(22) (11)에 있어서, 상기 이종성 스페이서는 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), 및 Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 번호 54)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드 면역원 작제물.
(23) (11)에 따른 펩티드 면역원 작제물을 포함하는 약학 조성물.
(24) 대상체에 (23)의 약학적으로 유효한 양의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질환, 병태, 또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법.
(25) (24)에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 HIV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 76-82로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HIV의 CTL 에피토프인 방법.
(26) (24)에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 HSV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 83-106으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HSV의 CTL 에피토프인 방법.
(27) (24)에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 FMDV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 107-123으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 FMDV의 CTL 에피토프인 방법.
(28) (24)에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 PRRSV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 124-142로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PRRSV의 CTL 에피토프인 방법.
(29) (24)에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 CSFV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 143-144로 이루어진 그룹으로부터 선택된 CSFV의 CTL 에피토프인 방법.
(30) (24)에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 CSFV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 143-144로 이루어진 그룹으로부터 선택된 CSFV의 CTL 에피토프인 방법.
(31) (24)에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 암이고 상기 표적 항원 부위는 GD3, GD2, 글로보-H, GM2, 푸코실 GM1, GM2, PSA, Ley, Lex, SLex, SLea, Tn, TF, 및 STn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 TACA인 방법.
(32) (24)에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 암이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 73-75로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신생항원으로부터의 B 세포 에피토프인 방법.
(33) 하기 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 조정하는 방법:
(a) 표적 항원 부위는 변함없이 유지되고 Th 에피토프는 각각의 펩티드 면역원 작제물에서 상이한, (11)에 따른 하나 이상의 펩티드 면역원 작제물을 제조하는 단계;
(b) 이들 각각이 (a)에서 제조된 펩티드 면역원 작제물 중 하나 및 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 담체를 포함하는, 하나 이상의 약학 조성물을 제조하는 단계;
(c) (b)에서 제조된 각각의 약학 조성물을 상이한 대상체에게 투여하는 단계;
(d) 각각의 대상체에서 면역 반응을 모니터링하는 단계; 및
(e) 바람직한 면역 반응을 생성하는 약학 조성물을 선택하는 단계.
(34) (33)에 있어서, 상기 각각의 약학 조성물에서 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 담체가 동일한 방법.
(35) (33)에 있어서, 상기 각각의 약학 조성물에서 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 담체가 상이한 방법.
실시예 1
펩티드 및 펩티드 면역원 작제물의 제조
펩티드 면역원 작제물을 비롯한, 펩티드는 자동화 고체상 합성을 사용하여 합성하고, 분취 HPLC에 의해 정제하고, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행시간 (MALDI-TOF) 질량 분광분석, 아미노산 분석, 및 역상 HPLC로 특성화하였다.
Aβ 백신 (UB-311)은 2개의 펩티드 면역원을 포함하고, 각각 2개의 병원체 단백질: B형 간염 표면 항원 및 홍역 바이러스 융합 단백질로부터 유래된 상이한 Th 세포 에피토프 펩티드 (UBITh® 에피토프)에 대해 아미노산 스페이서를 통해 합성적으로 연결된 N-말단 Aβ1-14 펩티드를 갖는다. 구체적으로, 홍역 바이러스 융합 단백질에 연결된 펩티드 면역원은 Aβ1-14-εK-KKK-MvF5 Th (서열 번호 67)이고 B형 간염 표면 항원에 연결된 펩티드 면역원은 Aβ1-14-εK-HBsAg3 Th (서열 번호 68)였다.
UB-311을 명반 함유 Th2-편향된 전달 시스템에서 제형화하였고 등몰비의 펩티드 Aβ1-14-εK-HBsAg3 및 Aβ1-14-εK-KKK-MvF5 Th를 함유하였다. 2개의 Aβ 면역원을 미크론 크기 미립자의 안정한 면역자극 복합체를 형성하기 위해 폴리음이온성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합하였다. 알루미늄 미네랄 염 (ADJU-PHOS®)을 최종 제형에 등장성용 염화나트륨 및 보존제로서 0.25 % 2-페녹시에탄올과 함께, 첨가하였다.
여러 예시적인 표적 항원 부위 (B 세포 에피토프 및 CTL 에피토프)의 서열은 각각, 표 3A 및 3B에 나타낸다. Th 에피토프에 공유 결합된 표적 항원 부위로서 Aβ1-14, 랫트 IL-672-82, 및 IgE-EMPD1-39를 함유하는 여러 예시적인 펩티드 면역원 작제물의 서열은 표 4에 나타낸다. 다양한 Th 에피토프에 공유 결합된 α-시누클레인111-132를 함유하는 펩티드 면역원 작제물의 서열은 표 5에 나타낸다. 다양한 Th 에피토프에 공유 결합된 IgE-EMPDG1-C39를 함유하는 펩티드 면역원 작제물의 서열은 표 6에 나타낸다. 다양한 Th 에피토프에 공유 결합된 인간 IL-673-83을 함유하는 펩티드 면역원 작제물의 서열은 표 7에 나타낸다. UBITh®1에 공유 결합된 디-펩티드 반복 (DPR) 서열을 함유하는 펩티드 면역원 작제물의 서열은 표 9에 나타낸다. 다양한 Th 에피토프에 공유 결합된 LHRH를 함유하는 펩티드 면역원 작제물의 서열은 표 10에 나타낸다.
실시예 2
이들 선택된 B 에피토프 펩티드의 면역원성을 향상시키기 위한 알파-시누클레인 111-132 , IgE EMPD 1-39 , 및 IL-6 73-83 펩티드 면역원 작제물 설계에서 병원체 및 이들의 봉입으로부터 유래된 이종성 T 헬퍼 에피토프의 순위
a. 펩티드 면역원 합성
이들의 기능적 특성에 대해 광범위하게 특성화된 알파-시누클레인 (AAs 111-132; 서열 번호 61); IgE EMPD (AAs 1-39; 서열 번호 62); 및 IL-6 (AAs 73-83; 서열 번호 145)으로부터의 3개의 짧은 B 세포 에피토프 펩티드를 대표적인 표적 항원 부위로서 사용하였다. 이들 3개의 B 세포 에피토프를 3개의 개별 표적 항원 부위를 면역원성으로 만드는 대표적인 무차별적 인공 Th 에피토프 (서열 번호 1-52로부터 선택됨)의 능력을 평가하기 위해 하기 나타낸 식에 따라 펩티드 면역원 작제물로 제조하였다:
(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-X
식 중:
Th는 본원에 개시된 인공 Th 에피토프로부터 선택되고 m은 1이고;
(B)o는 서열 번호 53 또는 54의 아미노산 서열을 갖는 스페이서이고;
표적 항원 부위는 서열 번호 61, 62, 또는 145의 B 세포 에피토프이고; 그리고
X는 아미노산 -CONH2임.
생성된 α-시누클레인, IgE EMPD, 및 IL-6 펩티드 면역원 작제물의 아미노산 서열은 각각, 표 5, 6, 및 7에 나타낸다.
b. 펩티드 면역원 작제물 및 면역접종을 포함하는 제형
대표적인 면역원성 연구를 기니피그에서 표 1에 나타낸 각각의 이종성 T 헬퍼 에피토프의 상대적 효과를 평가하기 위해 수행하였다. 다양한 α-시누클레인, IgE EMPD, 및 IL-6 펩티드 면역원을 생산한 후, 동일한 Th 에피토프 서열을 함유하는 작제물을 표 8에 나타낸 바와 같이 1:1:1 비율로 함께 혼합하였다. 예를 들어, UBITH®1 에피토프 (서열 번호 149, 178, 및 207)를 함유하는 α-시누클레인, IgE EMPD, 및 IL-6 작제물을 표 8에 나타낸 1번 제형을 제조하기 위해 함께 혼합하였다. α-시누클레인, IgE EMPD, 및 IL-6 펩티드 면역원 작제물의 혼합물을 보조제 MONTANIDE ISA50V2와 혼합한 다음 CpG3 올리고뉴클레오티드를 사용하여 안정화된 면역자극 복합체로 제형화하였다. 표 8에 나타낸 29개의 제형 각각은 0.5 mL의 부피에 총 135 μg의 펩티드 (펩티드 당 45 μg)를 포함하였다.
제형을 근육 내 (i.m.) 주사를 통해 초기 면역접종 후 (wpi) 0, 3, 및 6주에 기니피그 (그룹당 3마리)에 투여하였다. 항체 역가 수준을 평가하기 위해 혈청 샘플을 0, 3, 6, 및 8 wpi에 채취하였다.
c. 면역원성 결과
초기 면역접종 후 8주 (8wpi)에 얻은 결과를 상이한 α-시누클레인 (도 3 상단 패널), IgE (도 3 하단 패널) 및 IL-6 (표 15) 펩티드 면역원 작제물의 순위를 매기는데 사용하였다. α-시누클레인에 대한 연구를 통해 얻은 면역원성 데이터를 포함하는 그래프는 도 4a에 나타내고; IgE-EMPD는 도 5에 나타내고; 그리고 IL-6은 도 6에 나타낸다.
모든 Th 에피토프는 3개의 짧은 B 세포 에피토프 펩티드의 면역원성을 다양한 정도로 향상할 시킬 수 있었다. 구체적으로, Th 에피토프: KKKMvF3 Th (서열 번호 13), 클로스트리듐 테타니 TT2 Th (서열 번호 36), EBV EBNA-1 Th (서열 번호 42), MvF5 Th; UBITh®1 (서열 번호 17), EBV BHRF1 Th (서열 번호 41), MvF4 Th; UBITh®3 (서열 번호 16), 및 콜레라 독소 Th (서열 번호 33)는 다른 Th 에피토프보다 α-시누클레인 펩티드 (서열 번호 61)의 면역원성을 향상시켰다 (도 3 상단 패널 및 도 4a). 이들 펩티드 면역원 작제물은 표 5에서 각각, 제형 번호 13, 22, 21, 01, 19, 03, 및 11로 표시된다.
IgE EMPD 펩티드 (서열 번호 62)의 경우, 클로스트리듐 테타니 TT4 Th (서열 번호 38), UBITh®1 (서열 번호 17), UBITh®3 (서열 번호 16), HBsAg1 Th; SSAL2 Th2 (서열 번호 24), KKKMvF3 Th (서열 번호 13), 클로스트리듐 테타니 TT2 Th (서열 번호 36), 콜레라 독소 Th (서열 번호 33), EBV BHRF1 Th (서열 번호 41), 및 HBsAg3 Th; UBITH®2 (서열 번호 28)의 Th 에피토프가 다른 Th 에피토프보다 IgE EMPD의 면역원성을 향상시켰다 (도 3 하단 패널 및 도 5). 이들 펩티드 면역원 작제물은 표 6에서 각각, 제형 번호 24, 01, 03, 14, 13, 22, 11, 19, 및 02로 표시된다.
IL-673-83 시클릭 펩티드 (서열 번호 145)의 경우, HBsAg3 Th; UBITH®2 (서열 번호 28), UBITh®1 (서열 번호 17), UBITh®3 (서열 번호 16), 클로스트리듐 테타니 TT1 Th (서열 번호 34), 및 클로스트리듐 테타니 TT4 Th (서열 번호 38)의 Th 에피토프가 IL-6의 생성된 면역원성을 향상시키는데 가장 강력한 것으로 밝혀졌다 (표 15 및 도 6). 이들 펩티드 면역원 작제물은 표 7에서 각각, 제형 번호 02, 01, 03, 20, 및 24로 표시된다.
이러한 결과는 본원에 개시된 상이한 인공 Th 에피토프를 사용하였을 때 단일 표적 B 세포 에피토프에 대한 상이한 면역원성이 수득될 수 있음을 입증한다. 영장류를 비롯한 상이한 종에서 각각의 펩티드 면역원 작제물에 대한 면역원성의 신중한 보정이 최고의 Th 펩티드 선택 및 최종 백신 제형 개발의 성공을 보장하기 위해 필요하다.
c. C max 에 대한 속도
상이한 Th 에피토프에 공유 결합된 α-시누클레인 펩티드 면역원 작제물에 대한 면역원성 데이터의 추가 분석은 어떤 Th 에피토프를 사용하는지에 따라 특정 Cmax가 상이한 속도로 달성될 수 있음을 밝혔다. 도 4b는 도 4a에 보고된 면역원성 데이터의 서브셋을 포함한다. 구체적으로, α-시누클레인 펩티드 (서열 번호 61)에 공유 결합된 KKKMvF3 Th (서열 번호 13) 및 EBV EBNA-1 Th (서열 번호 42)의 Th 에피토프를 함유하는, 제형 번호 13 및 21로 면역화된 기니피그는 8 wpi에 동일한 Cmax를 달성하였지만, 이들은 상이한 속도로 달성한다. 특히, KKKMvF3 Th (서열 번호 13)를 함유하는 α-시누클레인 펩티드 면역원 작제물은 EBV EBNA-1 Th (서열 번호 42)를 함유하는 α-시누클레인 펩티드 면역원 작제물보다 더 빨리 이의 Cmax에 도달한다. 유사하게, UBITh®1 (서열 번호 17)을 함유하는 α-시누클레인 펩티드 면역원 작제물은 EBV BHRF1 Th (서열 번호 41)를 함유하는 α-시누클레인 펩티드 면역원 작제물보다 더 빨리 이의 Cmax에 도달하고; 그리고 클로스트리듐 테타니 TT1 Th (서열 번호 34)를 함유하는 α-시누클레인 펩티드 면역원 작제물은 인플루엔자 MP1_1 Th (서열 번호 48)를 함유하는 α-시누클레인 펩티드 면역원 작제물보다 더 빨리 이의 Cmax에 도달한다. 도 4b에 나타낸 결과는 Th 에피토프의 선택이 항체 역가가 이들의 Cmax에 도달하는 속도에 영향을 미칠 수 있음을 입증한다.
d. 요약
이 실험의 결과는 펩티드 면역원 작제물에 의해 유발된 면역 반응 (항체 역가, Cmax, 항체 생산의 개시, 반응의 지속 기간 등을 포함)은 B 세포 에피토프에 화학적으로 연결된 Th 에피토프의 선택에 따라 조절될 수 있음을 입증한다. 따라서, 표적 항원 부위에 대한 특이적 면역 반응은 펩티드 면역원 작제물에서 B 세포 에피토프에 접합된 Th 에피토프를 변경하여 설계할 수 있고, 이는 임의의 환자 또는 대상체의 개별 특성에 맞춤화된 의료 치료를 용이하게 할 수 있다.
실시예 3
펩티드 면역원 작제물의 면역원성은 B 세포 에피토프 서열의 길이에 따라 달라질 수 있다
3개의 디-펩티드 반복 (DPR) 펩티드 면역원 작제물의 면역접종 및 평가는 하기에 상세히 기술되어 있다.
a. 면역접종 및 혈청 수집
표 9에 나타낸 바와 같이 서열 번호 236, 237, 및 238의 아미노산 서열을 갖는 3개의 DPR 펩티드 면역원 작제물을 생산하였다. 각각의 펩티드 면역원을 MONTANIDE™ ISA51 및 CpG에서 제형화하고 그룹당 기니피그 3마리를 프라임 면역접종으로 400 μg/ml 용량으로 그리고 주사 후 3, 6, 9, 및 12주 (WPI)에 부스트 용량으로 100 μg/ml로 기니피그를 면역접종하였다.
b. 항체 역가의 평가
디자이너 DPR 펩티드 면역원 작제물의 면역원성을 평가하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. DPR B 세포 에피토프 펩티드 또는 펩티드 면역원 작제물을 표적화 펩티드로서 역할을 하는, 플레이트 웰을 코팅하기 위해 사용하였다. 기니피그 면역 혈청을 1:100에서 1:100,000으로 10배 연속 희석으로 희석하였다. log10으로 표현되는, 검사된 혈청의 역가는 컷오프 A450을 0.5로 설정한 A450nm의 선형 회귀 분석으로 계산하였다. 모든 펩티드 면역원은 플레이트 웰에 코팅된 B 에피토프 펩티드에 대해 강한 면역원성 역가를 유도하였다.
c. 항체 특이성 분석을 위한 펩티드-기반 ELISA 검사
면역 혈청 샘플을 평가하기 위한 ELISA 분석은 하기 기술한 바와 같이 개발하였다.
96-웰 플레이트의 웰을 10 mM NaHCO3 완충액, pH 9.5에서 2 μg/mL에서 동물을 면역화하기 위해 사용한 100 μL의 동일한 DPR 펩티드 면역원 작제물 (즉, 서열 번호 236, 237, 또는 238)을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 개별적으로 코팅하였다.
d. ELISA 검사에 의한 DPR에 대한 항체 반응성의 평가
펩티드-코팅된 웰을 비-특이적 단백질 결합 부위를 차단하도록 1시간 동안 37℃에서 250 μL의 PBS 중 젤라틴 중량 3%로 배양하였고, 이어서 0.05 부피 %의 TWEEN® 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고 건조하였다. 분석될 혈청을 20 부피 % 정상 염소 혈청, 1 중량 % 젤라틴 및 0.05 부피 % TWEEN® 20을 함유하는 PBS로 1:20 (달리 명시되지 않는 한) 희석하였다. 100 마이크로리터 (100 μL)의 희석된 표본 (예를 들어, 혈청, 혈장)을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 그런 다음 웰을 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 PBS 중 0.05 부피 % TWEEN® 20으로 6회 세척하였다. 홀스래디쉬 과산화효소 (HRP)-접합 종 (예를 들어, 마우스, 기니피그, 또는 인간) 특이적 염소 항-IgG를 양성 웰에서 형성된 항체/펩티드 항원 복합체와 결합하는 표지된 추적자로 사용하였다. 100 마이크로리터의 과산화효소-표지된 염소 항-IgG를 미리 적정한 최적 희석 및 PBS 중 0.05 부피 % TWEEN® 20을 갖는 1 부피 % 정상 염소 혈청에서 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 추가 30분 동안 배양하였다. 웰을 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 PBS 중 0.05 부피 % TWEEN® 20으로 6회 세척하고 추가 15분 동안 구연산 나트륨 완충액 중 0.04 중량 % 3', 3', 5', 5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 및 0.12 부피 % 과산화수소를 함유하는 100 μL의 기질 혼합물과 반응시켰다. 이러한 기질 혼합물을 착색 생성물을 형성함으로써 과산화효소 표지를 검출하는데 사용하였다. 100 μL의 1.0M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단하였고 450 nm (A450)에서의 흡광도를 측정하였다. 다양한 DPR 유래 펩티드 면역원을 투여받은 면역화된 동물의 항체 역가를 측정하기 위해, 1:100 내지 1:10,000의 혈청의 10-배 연속 희석액을 검사하였고, log10으로 표현된, 검사된 혈청의 역가를 컷오프 A450을 0.5로 설정한 A450의 선형 회귀 분석으로 계산하였다.
e. 면역원성 평가
동물의 면역 전 및 면역 혈청 샘플을 실험 면역접종 프로토콜에 따라 수집하고 혈청 보체 인자를 불활성화하기 위해 30분 동안 56℃에서 가열하였다. DPR 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 약학 조성물의 투여 후, 혈액 샘플을 프로토콜에 따라 수득하고 특이적 표적 부위(들)에 대한 이들의 면역원성을 평가하였다. 연속적으로 희석된 혈청을 검사하고 양성 역가를 상호 희석의 log10으로 표현하였다. 특정 약학 조성물의 면역원성은 바람직한 B 세포 반응의 향상을 제공하기 위해 사용되는 Th 에피토프에 대한 낮은 내지 무시할 만한 항체 반응성을 유지하면서 표적 항원 내에서 바람직한 에피토프 특이성에 대한 높은 역가 B 세포 항체 반응을 유발하는 이의 능력에 의해 평가된다.
f. 마우스 면역 혈청에서 DPR 수준에 대한 면역분석
DPR 유래된 펩티드 면역원을 투여받은 마우스에서 혈청 DPR 수준을 포획 항체로서 항-DPR 항체 및 검출 항체로서 비오틴-표지된 항-DPR 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA (Cloud-clon, SEB222Mu)에 의해 측정하였다. 간단하게, 항체를 코팅 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6) 중 100 ng/웰에서 96-웰 플레이트 상에 고정화시키고 밤새 4℃에서 배양하였다. 코팅된 웰을 실온에서 1시간 동안 200 μL/웰의 분석 희석액 (PBS 중 0.5% BSA, 0.05% TWEEN®-20, 0.02% ProClin 300)으로 차단하였다. 플레이트를 200 μL/웰의 세척 완충액 (0.05% TWEEN®-20을 갖는 PBS)으로 3회 세척하였다. 정제된 재조합 DPR을 5% 마우스 혈청을 갖는 분석 희석액에서 표준 곡선 (2배 연속 희석으로 156 내지 1,250 ng/mL 범위)을 생성하기 위해 사용하였다. 오십 마이크로리터 (50 μL)의 희석된 혈청 (1:20) 및 표준액을 코팅된 웰에 첨가하였다. 배양을 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 모든 웰을 흡인하고 200 μL/웰의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 포획된 DPR을 실온에서 1시간 동안 100 μl의 검출 항체 용액 (분석 희석액 중 50 ng/ml의 비오틴 표지된 HP6029)로 배양하였다. 그런 다음, 결합된 비오틴-HP6029를 1시간 동안 스트렙타비딘 폴리-HRP (1:10,000 희석, Thermo Pierce)을 사용하여 검출하였다 (100 μL/웰). 모든 웰을 흡인하고 200 μL/웰의 세척 완충액으로 6회 세척하고 반응을 100 μL/웰의 1M H2SO4를 첨가하여 중단하였다. 표준 곡선을 SoftMax Pro 소프트웨어 (Molecular Devices)를 사용하여 4개의 매개변수 로지스틱 곡선 적합을 생성하고 모든 검사된 샘플에서 DPR의 농도를 계산하는데 사용하였다. 스튜던트 t 검정을 Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 비교하는데 사용하였다.
g. 항-DPR 항체의 정제
항-DPR 항체를 친화도 컬럼 (Thermo Scientific, Rockford)을 사용하여 상이한 서열 (서열 번호 236, 237, 또는 238)의 펩티드를 함유하는 DPR 펩티드 면역원 작제물로 면역화된 기니피그 또는 마우스의 3 내지 15주 주사 후 (WPI)에 수집된 혈청으로부터 정제하였다. 간단하게, 완충액 (0.1 M 인산염 및 0.15 M 염화나트륨, pH 7.2) 평형 후, 400 μL의 혈청을 Nab 단백질 G 스핀 컬럼에 첨가한 다음 10분 동안 엔드-오버-엔드 믹싱 및 1분 동안 5,800 x g에서 원심 분리하였다. 컬럼을 결합 완충액 (400 μL)으로 3회 세척하였다. 후속적으로, 용출 완충액 (400 μL, 0.1 M 글리신 pH 2.0)을 1분 동안 5,800 x g로 원심분리 후 항체를 용출하기 위해 스핀 컬럼에 첨가하였다. 용출된 항체를 중화 완충액 (400 μL, 0.1 M 트리스 pH 8.0)과 혼합하고 이들 정제된 항체의 농도는 표준으로서 BSA (소 혈청 알부민)와 OD280에서 Nan-Drop을 사용하여 측정하였다.
h. 결과
면역화된 기니피그 혈청의 DPR 펩티드 또는 펩티드 면역원에 대한 면역원성 역가를 ELISA로 평가하였다.
도 7은 3개의 상이한 DPR 펩티드 면역원 작제물로 면역화된 기니피그에서 15주 기간에 걸친 항혈청의 특성을 나타낸다. 0, 3, 6, 9, 12 및 15 wpi의 기니피그 항혈청을 10배 연속 희석으로 희석하였다. ELISA 플레이트를 DPR 펩티드 또는 펩티드 면역원으로 코팅하였다. log10으로 표현된, 검사된 혈청의 역가는 컷오프 A450을 0.5로 설정한 A450nm의 선형 회귀 분석으로 계산하였다.
그런 다음 폴리-GA 펩티드 (서열 번호 236, 237, 및 238)를 함유하는 DPR 펩티드 면역원 작제물에 대한 ELISA 데이터를 도 7에 나타낸 그래프로서 플롯팅하였고, 여기서 동물을 면역화하는데 사용된 동일한 펩티드 면역원은 분석을 위해 ELISA 플레이트에 결합하였다. 모든 DPR 면역원 작제물은 해당하는 DPR 펩티드 또는 펩티드 면역원에 대해 높은 면역원성을 입증하였다. ELISA 결과는 0주에 면역접종 전 각각의 그룹에서 검출 가능한 항체 역가가 관찰되지 않았음을 나타냈다. 데이터는 DPR 펩티드 면역원 작제물에서 디펩티드 반복의 길이가 항체 역가에 적당한 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 구체적으로, 폴리-GA 10, 15 및 25 반복 작제물 (각각, 서열 번호 236, 237, 및 238)은 도 7에 나타낸 바와 같이, 서로 비교하여 상이한 면역원성을 갖는다.
흥미롭게도, B 세포 에피토프 펩티드의 길이는 펩티드 면역원 작제물의 면역원성 프로파일에 영향을 미칠 수 있다. 도 7 (왼쪽 그래프)은 GA10 펩티드 면역원 작제물 (서열 번호 236)의 면역원성이 정기적인 부스트로 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가함을 보여주는 반면, 도 7 (가운데 그래프)은 GA15 펩티드 면역원 작제물 (서열 번호 237)의 면역원성이 감소하기 전에 9 wpi 주위에서 피크를 나타내고, 그리고 도 7 (오른쪽 그래프)은 GA25 펩티드 면역원 작제물 (서열 번호 238)의 면역원성이 정기적인 부스트로 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가함을 보여준다.
도 7의 결과는 면역 반응이 펩티드 면역원 작제물에 사용되는 B 세포 에피토프의 길이에 따라 영향을 받을 수 있음을 입증한다.
i. 요약
이 실험의 결과는 펩티드 면역원 작제물에 의해 유발되는 면역 반응 (항체 역가, Cmax, 항체 생산의 개시, 반응의 지속 기간 등을 포함)이 펩티드 면역원 작제물에 사용되는 B 세포 에피토프의 길이에 의해 조절될 수 있음을 입증한다. 따라서, 표적 항원 부위에 대한 특이적 면역 반응은 펩티드 면역원 작제물에서 B 세포 에피토프의 길이를 변경하여 설계할 수 있고, 이는 임의의 환자 또는 대상체의 개별 특성에 맞춤화된 의료 치료를 용이하게 할 수 있다.
실시예 4
펩티드 면역원 작제물의 면역원성은 투여되는 펩티드의 양 및 투여 요법에 따라 달라질 수 있다
면역원 작제물의 다양한 용량 및 투여 요법의 면역접종 및 평가는 하기에 상세하게 기술되어 있다.
a. UB-311 백신 (Aβ 펩티드 면역원)
Aβ 백신 (UB-311)은 각각 2개의 병원체 단백질: B형 간염 표면 항원 및 홍역 바이러스 융합 단백질로부터 유래된 상이한 Th 세포 에피토프 펩티드 (UBITh® 에피토프)에 대해 아미노산 스페이서를 통해 합성적으로 연결된, N-말단 Aβ1-14 펩티드를 갖는, 2개의 펩티드 면역원을 포함한다. 구체적으로, 홍역 바이러스 융합 단백질에 연결된 펩티드 면역원은 Aβ1-14-εK-KKK-MvF5 Th (서열 번호 67)였고 B형 간염 표면 항원에 연결된 펩티드 면역원은 Aβ1-14-εK-HBsAg3 Th (서열 번호 68)였다.
UB-311은 명반 함유 Th2-편향된 전달 시스템에서 제형화되었고 펩티드 Aβ1-14-εK-HBsAg3 및 Aβ1-14-εK-KKK-MvF5 Th를 등몰비로 함유하였다. 2개의 Aβ 면역원을 미크론 크기 미립자의 안정한 면역자극 복합체를 형성하기 위해 폴리음이온성 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합하였다. 알루미늄 미네랄 염 (ADJU-PHOS®)을 등장성용 염화나트륨 및 보존제로서 0.25 % 2-페녹시에탄올과 함께, 최종 제형에 첨가하였다.
b. 기니피그에서 상이한 용량의 UB-311
Aβ 백신 (UB-311)을 0 μg, 1 μg, 3μg, 10 μg, 30 μg, 100 μg, 300 μg, 600 μg, 및 1,000 μg의 총 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 용량으로 0, 3, 및 6 wpi에서 기니피그에 투여하였다. 혈청 샘플을 항체 역가를 평가하기 위해 0, 3, 5, 7, 및 9 wpi에서 채취하였다.
도 8은 각각의 면역접종 용량에 대해 수득된 항체 역가 결과를 나타내는 그래프이다. 결과는 면역접종에 사용된 펩티드의 양이 항체 역가에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 입증하고; 그러나, 최적의 기술적 효과를 각각의 용량에 대해 평가하여야 한다. 구체적으로, 도 8은 0 μg에서 600 μg로 투여되는 펩티드의 용량을 증가시키는 것은 면역원성의 증가와 직접적으로 상응한다는 것을 나타낸다. 그러나, 1,000 μg의 펩티드 면역원이 투여되면, 면역원성이 더 낮은 용량의 펩티드 면역원 작제물과 비교하여 실질적으로 감소할 수 있다 (300 μg 및 600 μg과 1,000 μg과의 비교). 따라서, 펩티드 면역원 작제물에 의해 수득되는 최적 면역원성은 선형이 아니며 각각의 펩티드 면역원 작제물에 대해 신중하게 평가하여야 한다.
c. 기니피그에서의 상이한 투여 요법의 UB-311은 면역원성에 영향을 줄 수 있다
프라임 용량 및 부스터 용량으로서 투여되는 펩티드 면역원 작제물의 양이 조성물의 전체 면역원성에 영향을 줄 수 있는지 결정하기 위해 Aβ 백신 (UB-311)의 투여 요법을 평가하였다.
UB-311 백신을 상이한 프라임 및 부스터 용량을 투여하며 0, 3, 및 6 wpi에서 기니피그에 투여하였다. 구체적으로, 한 그룹의 동물을 100 μg의 UB-311의 1회 용량으로 0주 wpi에 프라이밍하고 400 μg의 UB-311의 2회 용량으로 부스팅하였고; 반면 두 번째 동물 그룹은 400 μg의 UB-311의 1회 용량으로 0주 wpi에 프라이밍하고 100 μg의 UB-311의 2회 용량으로 부스팅하였다. 이 실험의 결과를 도 9에 나타낸다.
도 9는 투여 요법이 UB-311 조성물의 면역원성 (Cmax 및 지속 기간)에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 구체적으로, 저용량 (100 μg의 UB-311)으로 프라이밍하고 고용량 (400 μg의 UB-311)으로 부스팅한 동물은 고용량 (400 μg의 UB-311)으로 프라이밍하고 저용량 (100 μg의 UB-311)으로 부스팅한 동물에 비해 더 높고 더 긴 Cmax를 달성하였다.
이 연구의 결과는 투여 요법이 펩티드 면역원 작제물의 면역원성에 영향을 미칠 수 있음을 입증한다.
도 10은 투여 요법이 펩티드 면역원 작제물의 면역원성에 영향을 미치는 추가 예를 제공한다. 구체적으로, 도 10 (상단 패널)은 Aβ 백신 (UB-311)을 사용하는 3개월 부스팅 요법 (상단 패널) 또는 6개월 부스팅 요법 (하단 패널)에 걸쳐 300 μg의 Aβ 백신 (UB-311)으로 인간 대상체를 면역화시킨 후 수득한 ELISA에 의한 항-Aβ1-28 항체 역가를 나타낸다. 각 그래프의 박스 부분은 연구에서 모든 인간 대상체의 평균 역가를 강조한다.
도 10의 결과는 상이한 면역원성 프로파일이 대상체에 제공되는 투여 요법에 따라 달성될 수 있음을 입증한다.
d. 렛트에서 상이한 투여 요법의 LHRH 펩티드 면역원 작제물
상이한 양의 LHRH 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 제형의 투여 요법을 펩티드 면역원 작제물의 총 양이 제형의 면역원성에 영향을 미칠 수 있는지 결정하기 위해 평가하였다.
구체적으로, 3마리의 랫트를 표 10에 나타낸 3개의 펩티드를 함유하는 LHRH 조성물로 면역화하였다. 한 그룹의 랫트는 100 μg의 3개의 LHRH 펩티드 면역원으로 면역화한 반면; 두 번째 그룹의 랫트는 300 μg의 3개의 LHRH 펩티드 면역원으로 면역화하였다. 면역원성 및 테스토스테론 농도를 평가하였고 도 11A 및 11B에 보고하였다.
도 11A는 100 μg 양의 LHRH 제형으로 랫트를 면역화 후 수득한 항체 역가 및 테스토스테론 농도를 나타낸다. 도 11B는 300 μg 양의 LHRH 제형으로 랫트를 면역화 후 수득한 항체 역가 및 테스토스테론 농도를 나타낸다. 도 11A 및 11B는 LHRH 펩티드 면역원 작제물의 경우, 300 μg의 더 높은 용량이 더 낮은 용량의 LHRH 펩티드 면역원 작제물에 비해 더 높은 항-LHRH 역가 및 더 높은 테스토스테론 농도 감소를 초래함을 입증한다.
따라서, 도 11A 및 11B의 결과는 펩티드 면역원 작제물의 투여량 수준과 달성된 기술적 효과 사이에 직접적인 상관 관계가 있음을 입증한다.
e. 요약
이 실험의 결과는 펩티드 면역원 작제물에 의해 유발되는 면역 반응 (항체 역가, Cmax, 항체 생산의 개시, 반응의 지속 기간 등을 포함)이 상이한 투여 요법을 사용하여 조절될 수 있음을 입증한다. 따라서, 표적 항원 부위에 대한 특이적 면역 반응은 환자 또는 대상체에서 투여 요법을 변경하여 설계될 수 있고, 이는 임의의 환자 또는 대상체의 개별 특성에 맞춤화된 의료 치료를 용이하게 할 수 있다.
실시예 5
펩티드 면역원 작제물의 면역원성은 사용되는 보조제에 따라 다를 수 있다
상이한 보조제로 제형화된 IL-6, IgE EMPD, 및 LHRH 펩티드 면역원 작제물의 면역접종 및 평가를 하기 기술된 바와 같이 평가하였다.
a. IL-6 펩티드 면역원 작제물
상이한 보조제를 사용하는 IL-6 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 제형의 면역원성을 평가하였다. CIA 랫트에서의 POC 연구는 IL-6 유발 병인에 대해 높은 면역원성 및 치료 효능을 갖는 설계된 펩티드 면역원 작제물이 류마티스 관절염 및 다른 자가면역 질환에서 잠재적인 면역 치료 적용과 관련됨을 입증하였다. 다음 연구는 펩티드 면역원 작제물의 최적화 및 보조제의 선택뿐만 아니라 CIA 루이스 랫트의 용량 결정에 초점을 맞추었다.
동일한 펩티드 면역원 (서열 번호 243) 뿐만 아니라 CpG로 각각 제형화된 상이한 보조제로서 MONTANIDE ISA 51 및 ADJU-PHOS를 랫트 CIA 면역접종 연구에서 평가하였다. 5개 그룹 각각으로 배정된 5마리의 랫트는 2개의 보조제 제형 중 하나를 받았으며, 이들 2가지 상이한 보조제에 대해 총 10그룹이었다. 치료 그룹의 모든 동물은 -7, 7, 14, 21 및 28일에 35일까지 임상 관찰과 함께 프라임 및 부스트에서 i.m. 경로를 통해 0.5 ml 중 5, 15, 45, 150 μg의 상이한 용량으로 주입되었다. 펩티드 면역원이 없는 2개의 상이한 보조제 위약 그룹은 제형에 보조 비히클만을 주입하였다.
항-IL-6 역가를 플레이트 웰에서 코팅된 랫트 IL-6 재조합 단백질에 대해 ELISA로 측정하였다. 결과는 2개의 상이한 보조 비히클을 주입한 2개의 위약 그룹 중 어느 것도 검출 가능한 항-IL-6 항체 역가가 발견되지 않는 반면, 보조제 제형을 모두 갖는 IL-6 면역원 작제물 (서열 번호 243)으로 면역화된 모든 치료 그룹은 ELISA에 의해 랫트 IL-6에 대해 항체를 생성함을 나타냈다. 일반적으로 말하면, 결과는 특히 ISA 51 제형을 사용하는 그룹에서, 용량 의존적 방식이 관찰됨을 나타냈다 (도 12). ISA 51 제형은 ADJUPHOS 보조제와 함께 제조된 제형에 대한 4 미만 면역원성 (log10)에 비해 각각, 모든 용량에서 4 초과 log10 값을 갖는 ISA 51 제형의 면역원성을 갖고, 면역화된 랫트에서 ADJUPHOS 제형보다 더 높은 면역 반응을 유도하였다.
도 12는 ISA 51/CpG 또는 ADJU-PHOS/CpG로 제형화된 상이한 용량의 서열 번호 243으로 면역화된 랫트에서 43일에 걸친 항체 반응의 동역학을 도시한다. ELISA 플레이트를 재조합 랫트 IL-6으로 코팅하였다. 혈청을 1:100에서 1:4.19 x 108로 4배 연속 희석에 의해 희석하였다. log10으로 표현된, 검사된 혈청의 역가는 0.45의 컷오프를 비선형 회귀로 각각의 혈청 샘플의 4개 매개변수 로지스틱 곡선으로 통합하여 계산하였다.
이 실험의 결과는 보조제의 선택이 펩티드 면역원 작제물의 면역원성의 유의한 기술적인 효과를 가질 수 있음을 입증한다.
b. IgE EMPD 펩티드 면역원 작제물
상이한 보조제를 사용하는 IgE EMPD 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 제형의 면역원성을 평가하였다. 마카크에서의 POC 연구는 IgE EMPD 유발 병인에 대해 높은 면역원성 및 치료 효능을 갖는 설계된 펩티드 면역원 작제물이 잠재적인 면역 치료 적용과 관련됨을 입증하였다. 다음 연구는 IgE EMPD 펩티드 면역원 작제물을 사용하는 펩티드 면역원 작제물의 최적화 및 보조제의 선택에 초점을 맞추었다.
동일한 IgE EMPD 펩티드 면역원 (서열 번호 178) 뿐만 아니라 CpG를 사용하여 제형화된 상이한 보조제로서 ADJU-PHOS 및 MONTANIDE ISA 51을 마카크 면역접종 연구에서 평가하였다.
도 13A 및 13B는 상이한 보조제에서 서열 번호 178의 다양한 양의 IgE-EMPD 펩티드 면역원 작제물로 마카크를 면역화한 후 수득한 항-IgE-EMPD 항체 역가를 예시하는 그래프를 나타낸다. 도 13A는 CpG3를 사용하여 안정화된 면역자극 복합체로 제형화된 보조제로서 ADJUPHOS를 사용하여 수득한 항체 역가를 나타내는 반면; 도 13B는 CpG3를 사용하여 안정화된 면역자극 복합체로서 제형화된 보조제로서 MONTANIDE ISA51를 사용하여 수득한 항체 역가를 나타낸다.
이 실험의 결과는 상이한 보조제에서 제형화된 IgE EMPD 펩티드 면역원 작제물이 ADJUPHOS를 함유하는 제형에 비해 MONTANTIDE ISA51과 함께 사용될 때 더 면역원성이 있음을 입증한다 (도 13A 및 13B). 따라서, 상이한 보조제의 사용은 펩티드 면역원 작제물의 상이한 기술적인 효과 (면역원성)를 생성할 수 있다.
c. LHRH 펩티드 면역원 작제물
상이한 보조제를 사용하는 LHRH 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 제형의 면역원성을 평가하였다. 돼지에서의 POC 연구는 LHRH 유발 병인에 대해 높은 면역원성 및 치료 효능을 갖는 설계된 펩티드 면역원 작제물이 잠재적인 면역 치료 적용과 관련됨을 입증하였다. 다음 연구는 LHRH 펩티드 면역원 작제물을 사용하는 펩티드 면역원 작제물의 최적화 및 보조제의 선택에 초점을 맞추었다.
동일한 농도에서 동일한 LHRH 펩티드 면역원 (서열 번호 239-241)으로 제형화된 상이한 보조제로서 에멀시겐 D 및 MONTANIDE ISA50V를 돼지 면역접종 연구에서 평가하였다.
도 14A 및 14B는 상이한 보조제에서 서열 번호 239-241의 다양한 양의 LHRH 펩티드 면역원 작제물로 돼지를 면역화 후 수득한 항-LHRH 항체 역가를 예시하는 그래프를 나타낸다. 도 14A는 보조제로서 에멀시겐 D을 사용하여 수득된 항체 역가를 나타내는 반면; 도 14B는 보조제로서 MONTANIDE ISA50V를 사용하여 수득한 항체 역가를 나타낸다.
이 실험의 결과는 상이한 보조제에서 제형화된 LHRH 펩티드 면역원 작제물이 에멀시겐 D를 함유하는 제형에 비해 MONTANTIDE ISA50V와 함께 제형화될 때 상이한 기술적인 효과 (테스토스테론 농도 감소)를 가짐을 입증한다 (도 15a 및 14B). 따라서, 상이한 보조제의 사용은 펩티드 면역원 작제물의 상이한 기술적인 효과 (효과의 지속, 즉 이 경우 면역 거세)를 생성할 수 있다.
d. 요약
이 실험의 결과는 펩티드 면역원 작제물에 의해 유발된 면역 반응 (항체 역가, Cmax, 항체 생산의 개시, 반응의 지속 기간 등을 포함)이 동일한 농도에서 펩티드 면역원 작제물을 함유하는 제제에서 사용되는 보조제의 선택에 의해 조절될 수 있음을 입증한다. 따라서, 표적 항원 부위에 대한 특이적 면역 반응은 B 세포 에피토프에 화학적으로 연결된 Th 에피토프 또는 제형에서 사용되는 보조제를 변경하여 설계될 수 있고, 이는 임의의 환자 또는 대상체의 개별 특성에 맞춤화된 의료 치료를 용이하게 할 수 있다.
실시예 6
Th 에피토프가 아닌 A베타 펩티드를 표적으로 하는 기니피그에서 펩티드 면역원 작제물의 배타적 면역원성
6마리의 기니피그를 0주 및 4주에 등몰비로 함께 제형화된 펩티드 면역원 작제물 Aβ1-14-εK-KKK-MvF5 (서열 번호 67) 및 Aβ1-14-εK-HBsAg3 (서열 번호 68)로 면역화하였다. 8주에, 동물을 채혈하고 ELISA 검사로 항-Aβ 펩티드 및 항-Th 에피토프 항체 역가 (log10)를 측정하기 위해 혈청 샘플을 수집하였다. 모든 6마리 기니피그의 항체 반응은 표 11에 나타낸 바와 같이, 2개의 인공 Th 에피토프 (MvF5 Th 및 HBsAg3 Th)가 아닌 Aβ1-42 펩티드를 특이적으로 표적화하였다.
실시예 7
UB-311 백신으로 면역화된 동물로부터의 비비 및 마카크 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 배양에서의 세포 면역 반응
UB-311로 면역화된 비비 및 시노몰구스 마카크로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-하이팩 구배 원심분리로 단리하였다. 펩티드-유도된 증식 및 사이토카인 생산을 위해, 세포 (웰 당 2Х105)를 단독으로 또는 첨가된 개별 펩티드 도메인 (Aβ1-14, Aβ1-42, UBITh®, 및 비-관련 펩티드를 포함)과 함께 배양하였다. 미토겐 (PHA, PWM, Con A)을 양성 대조군으로 사용하였다 (배양액의 1% v/v에서 10 μg/ mL). 6일에, 1 μCi의 3H-티미딘 (3H-TdR)을 3개의 복제 배양 웰 각각에 첨가하였다. 배양 18 h 후, 세포를 수확하고 3H-TdR 혼입을 측정하였다. 자극 지수 (S.I.)는 항원 존재시 cpm을 항원의 부재시 cpm으로 나누어 표시한다; S.I. > 3.0은 유의한 것으로 간주되었다.
시노몰구스 마카크 PMBC 배양물로부터 사이토카인 분석 (IL-2, IL-6, IL-10, IL-13, TNFα, IFNγ)을 단독 또는 펩티드 도메인 또는 미토겐의 존재하에 배양 배지의 분취액에서 수행하였다. 원숭이 특이적 사이토카인 샌드위치 ELISA 키트 (U-CyTech Biosciences, Utrecht, 네덜란드)를 키트 설명서에 따라 개별 사이토카인의 농도를 측정하기 위해 사용하였다.
PMBC를 면역화된 동물의 15, 21, 및 25.5주에서 마카크로부터 수집된 전혈에서 단리하였다. 단리된 PBMC를 다양한 Aβ 펩티드 (Aβ1-14 및 Aβ1-42)의 존재하에 배양하였다.
Aβ1-14 펩티드가 배양 배지에 첨가되었을 때 림프구에 의한 증식 반응은 관찰되지 않았다. 그러나, Aβ1-42 펩티드가 PBMC 배양에 첨가되었을 때 양성 증식 반응은 발견되었다.
15, 21 및 25.5주에 수집된 PBMC 샘플을 또한 Aβ 펩티드 또는 PHA 미토겐의 존재하에 사이토카인 분비에 대해 검사하였다. 표 12에 나타낸 바와 같이, 3개의 사이토카인 (IL-2, IL-6, TNFα)은 Aβ1-14 펩티드에 대해서는 아니지만 전장 Aβ펩티드에 대한 반응에서 검출 가능한 분비를 나타냈고; 위약 백신 샘플과 비교할 때 사이토카인 분비의 상향 조절은 UBITh® AD 백신-처리된 샘플에서 검출되지 않았다. Aβ 펩티드의 존재하에 검사된 3개의 다른 사이토카인 (IL-10, IL-13, IFNγ)은 모든 PBMC 배양에서 분석 검출 한계 미만이었다.
마카크를 Aβ17-42 펩티드 도메인 없이, 외래 T 헬퍼 에피토프를 갖는 N-말단 Aβ1-14 펩티드 면역원만을 갖는 UB-311 백신으로 면역화한 것은 Aβ1-42 펩티드의 존재하에 PBMC 배양에서 알려진 양성 증식 결과가 UB-311 백신 반응과 관련이 없고, 오히려 천연 전장 Aβ에 대한 배경 반응이었음을 나타낸다.
이러한 결과는 Aβ1-14 및 외래 T 헬퍼 에피토프만을 갖는 UB-311 백신의 안전성을 지지하며, 정상 마카크에서 천연 전장 Aβ 펩티드에 대한 염증 항-자가 세포-매개 면역 반응을 잠재적으로 생성하지 않음을 보여준다. 대조적으로, AN-1792 백신의 임상 시험 연구에서 뇌염과 관련된 부작용은 부분적으로, 해당 백신의 단량체 또는 원섬유성/응집된 Aβ1-42 면역원 내에 T 세포 에피토프의 포함에 기인한다.
실시예 8
UB311 백신으로 면역화된 알츠하이머 환자의 PBMC의 림프구 증식 분석 및 사이토카인 분석.
알츠하이머병 환자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-하이팩 구배 원심분리로 단리하였다. 펩티드-유도된 증식 및 사이토카인 생산을 위해, 세포 (웰 당 2.5 x 105)를 Aβ1-14 (서열 번호 56), Aβ1-16 (서열 번호 57), Aβ1-28 (서열 번호 59), Aβ17-42 (서열 번호 58), Aβ1-42 (서열 번호 60) 및 비-관련 38-mer 펩티드 (p1412)를 포함하는, 단독으로 또는 첨가된 개별 펩티드 도메인 (10 μg/mL의 최종 농도에서)과 함께 삼중으로 배양하였다. 배양물을 72시간 동안 5% CO2로 37℃에서 배양한 다음, 100 μL의 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고 사이토카인 분석을 위해 -70℃에서 동결하였다. 0.5 μCi의 3H-티미딘 (3H-TdR, Amersham, Cat No. TRK637)을 함유하는 10 μL의 배양 배지를 각각의 웰에 첨가하고 18 hr 동안 배양하고, 이어서 액체 섬광 계수에 의해 방사성동위원소 혼입을 검출하였다. 미토겐 파이토헤마글루타닌 (PHA)을 림프구 증식에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. Aβ 펩티드 또는 PHA 미토겐 없이 단독으로 배양된 세포를 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다. 자극 지수 (SI)는 삼중 음성 대조군 배양의 평균 cpm으로 나눈 Aβ 펩티드를 갖는 삼중 실험 배양의 분당 평균 계수 (cpm)로 계산하였고; SI > 3.0은 유의한 증식 반응으로 간주되었다.
a. 증식 분석
말초 혈액 단핵 세포 샘플을 UB-311 백신으로 백신접종한 알츠하이머병 환자로부터 0주 (기준선) 및 16주 (제3회 투여 후 4주)에 수집한 전혈로부터 단리한 다음 다양한 Aβ 펩티드가 부재 또는 존재하에 배양하였다. 표 13에 나타낸 바와 같이, 림프구에 의한 유의한 증식 반응은 Aβ1-14, 다른 Aβ 펩티드, 또는 p1412 (비-관련 대조군 펩티드)가 배양 배지에 첨가되었을 때 관찰되지 않았다. 예상한 바와 같이, PHA 미토겐을 배양 배지에 첨가하였을 때 양성 증식 반응이 주목받았다. UB-311 면역접종 (p=0.87) 전후 PHA에 대한 유사한 반응의 관찰은 연구 대상체의 면역 기능에서 유의한 변화가 없음을 시사한다 (표 13).
통계학적 분석. 0주와 16주 사이의 림프구 증식 차이는 대응표본 t-검정으로 조사하였다. 통계적 유의 수준을 양측 검정으로 결정하였다(p <0.05). R 버전 2.14.1을 모든 통계 분석에 대해 사용하였다.
b. 사이토카인 분석
PBMC 배양액으로부터의 사이토카인 분석 (IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ)을 세포 단독으로 또는 Aβ 펩티드 도메인 또는 PHA의 존재하에 배양 배지의 분취액에 대해 수행하였다. 인간 특이적 사이토카인 샌드위치 ELISA 키트 (U-CyTech Biosciences, Utrecht, 네덜란드)를 제조사 지시에 따라 개별 사이토카인의 농도 (pg/mL)를 측정하기 위해 사용하였다 (Clin Diag Lab Immunol. 5(1):78-81 (1998)).
0주 및 16주에 UB-311 백신을 받은 알츠하이머병 환자로부터 수집된 PBMC 샘플을 세포 단독 (음성 대조군) 또는 Aβ 펩티드, p1412 (비-관련 펩티드) 또는 PHA 미토겐 (양성 대조군)의 존재하에 3일 동안 배양한 후 사이토카인 분비에 대해 시험하였다. 키트의 정량 가능한 범위는 5 내지 320 pg/mL이다. 5 pg/mL 미만 또는 320 pg/mL 초과의 임의의 측정된 농도는 각각, 정량 한계 미만 (BQL) 또는 정량 한계 초과 (AQL)로 표시되었다. 그러나, 통계적 고려를 위해, BQL 또는 AQL은 각각 정량 가능한 하한 (5 pg/mL) 또는 정량 가능한 상한 (320 pg/mL)으로 대체되었다. 0주 및 16주에서 각각의 사이토카인의 평균 농도는 표 14에 나타낸다. 예상된 바와 같이, IL-2을 제외한, PHA, 양성 대조군의 존재하에 사이토카인이 유의하게 증가하였다. Aβ1-14, 또는 다른 Aβ 펩티드에 의한 자극에 대한 반응에서 사이토카인의 생산이 기준선 (0주) 및 16주에서 관찰되었지만, 대부분의 값은 해당 음성 대조군 (세포 단독)과 유사하게 나타났다.
면역접종 후 세포-매개 면역 반응의 변화를 평가하기 위해, 기준선으로부터 16주의 평균 사이토카인 농도 변화를 음성 대조군의 것과 비교하고 대응표본 윌콕슨 부호순위 검정에 의해 조사하였다. 4개의 사이토카인 (IFN-γ, IL-6, IL-10, TNF-α)은 전장 Aβ1-42 펩티드에 대한 반응에서 주목할 만한 분비 증가를 나타냈고; 이러한 관찰은 Aβ1-42 응집체의 입체형태 에피토프로 인한 것일 수 있다. 사이토카인 분비의 상향 조절은 Aβ1-14 또는 다른 Aβ 펩티드에서 검출되지 않았다.
c. 요약
UB-311 백신은 각각, MvF5 Th 및 HBsAg3 Th 에피토프에 합성적으로 연결된 N-말단 Aβ1-14 펩티드를 각각 갖는 2개의 펩티드 면역원을 함유한다. 시험관 내 림프구 증식 및 사이토카인 분석을 세포 면역 반응에 대한 UB-311 백신의 면역접종의 영향을 평가하기 위해 사용하였다. 표 13에 나타낸 바와 같이 Aβ1-14 펩티드 또는 임의의 다른 Aβ 펩티드를 배양 배지에 첨가하였을 때 림프구에 의한 증식 반응은 관찰되지 않았다. UB-311 백신-면역화 환자의 림프구에 의한 사이토카인 분비의 상향 조절은 Aβ1-42를 제외한 Aβ1-14 및 다른 Aβ 펩티드를 사용한 처리에서 검출되지 않았고, 이는 처리 전 0주 수준과 비교할 때 UB-311 면역접종 16주 후 4개의 사이토카인 (IFN-γ, IL-6, IL-10, TNF-α)의 상당한 증가를 유발하였다 (표 14). Th2 유형 T 세포 반응을 통한 사이토카인 방출의 증가는 Aβ1-14 단독으로 검출된 상향 조절이 없기 때문에 UB-311 백신 반응과 관련이 없을 가능성이 높다. Aβ1-42에 대한 반응은 Aβ1-42에 대해 식별된 천연 T 헬퍼 에피토프와 관련될 수 있는 천연 Aβ에 대한 배경 반응인 것으로 의심된다. PHA에 대한 반응에서 IL-2 생산의 결여를 관찰하였고, 이는 정상 인간 PBMC에 의한 유사한 실험 조건하에 Katial RK, et al.에 의해 Clin Diagn Lab Immunol 1998; 5:78-81에 의해 보고된 발견과 일치한다. 결론적으로, 이러한 결과는 UB-311 백신의 I상 임상 시험에 참여한 경증 내지 중등도 알츠하이머병 환자에서 잠재적으로 염증성 항-자기, 세포-매개 면역 반응을 생성하지 않았음을 나타내므로, UB-311 백신의 안전성을 추가로 입증하였다.
실시예 9
무차별적 인공 Th 반응성 세포는 음성 대조군과 비교하여 중간 면역원성 염증 반응이 있는 정상 혈액 공여자의 나이브 말초 혈액 단핵 세포 (PMBC)에서 검출될 수 있다
ELISpot 검정을 강력한 미토겐 파이토헤마글루타닌 (PHA) 및 음성 대조군과 비교할 때 염증 반응을 유발하는 이들의 효능을 평가하기 위해 정상 혈액 공여자에서 나이브 말초 혈액 단핵 세포의 무차별적 인공 Th 반응성 세포를 검출하는데 사용하였다.
ELISpot 검정은 샌드위치 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 기술을 사용한다. T 세포 활성화의 검출을 위하여, IFN-γ 또는 관련된 사이토카인을 분석물로서 검출하였다. 선택된 분석물에 특이적인 단일클론 또는 다클론 항체를 PVDF (폴리비닐리덴 디플루오라이드)-배킹된 마이크로플레이트상에 사전 코팅하였다. 적절하게 자극된 세포를 웰에 피펫팅하고 마이크로플레이트를 지정된 기간 동안 가습된 37℃ CO2 배양기에 배치하였다. 배양 기간 동안, 분비 세포 바로 근처에 있는, 고정화된 항체는 분비된 분석물에 결합한다. 임의의 세포 및 결합되지 않은 물질을 세척한 후, 선택된 분석물에 특이적인 비오티닐화된 다클론 항체를 웰에 첨가하였다. 임의의 결합되지 않은 비오티닐화된 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 스트렙타비딘에 접합된 알칼리성-포스파타제를 첨가하였다. 후속적으로 결합되지 않은 효소를 세척하여 제거하고 기질 용액 (BCIP/NBT)을 첨가하였다. 청색-흑색 침전물이 형성되고 사이토카인 국소화 부위에 각각의 개별 점이 개별 분석물-분비 세포로 나타나는, 점으로 나타났다. 점을 자동화 ELISpot 판독기 시스템 또는 입체현미경을 사용하여 수동으로 계수하였다.
수행된 시험관 내 연구에서, 10μg/mL 배양액에서의 PHA를 양성 대조군으로 사용하였다. UBITh®1 (서열 번호 17) 및 UBITh®5 (서열 번호 6) 펩티드를 보통의 정상 혈액 공여자의 말초 혈액 단핵 세포에 존재하는 반응성 세포의 수에 대해 시험하였다. 서열 번호 33 내지 52를 갖는 무차별적 인공 Th 에피토프 펩티드의 혼합물을 또 다른 양성 대조군으로 제조하였다. 배지 단독을 표준 T 세포 자극 세포 배양 조건에서 음성 대조군으로 사용하였다. 간단하게, 미토겐 (10μg/mL의 PHA)으로 자극된 100μL/웰의 PBMC (2x105 세포), 또는 Th 항원 (10μg/mL의 UBITh®1, UBITh®5 또는 다중-Th의 혼합물)을 48시간 동안 CO2 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 웰/플레이트로부터의 상청액을 수집하였다. 플레이트 상의 세포를 세척하고 표적 분석물, IFN-γ의 검출을 위해 처리하였다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 대표적인 공여자 1, 2, 및 3은 무차별적 인공 UBITh®1 또는 UBITh®5 에피토프 펩티드에 대해 이들의 반응성 세포를 시험하였다. 압도적인 IFN-γ ELISPOT 수가 항상 나이브 공여자 (PHA와 배양된 PBMC; 계수하기에 너무 많음)에서 검출되는 반면 대조 배지와 배양된 PBMC는 5 내지 50의 배경 IFN-γ ELISPOT 수를 제공하였다. 중간의 ELISPOT 수가 20 내지 약 120개의 UBITh®1 또는 UBITh®5와 배양된 나이브 공여자 PBMC에 대해 검출되었다. 서열 번호 33-52를 갖는 다중 Th 펩티드의 혼합물을 또한 예상한 바와 같이 20 내지 약 300으로 들어오는 ELISPOT 수와 비교하기 위해 나이브 공여자 PBMC와 배양하였다. UBITh®1 또는 UBITh®5 펩티드에 의해 촉발된 이러한 자극 반응은 음성 대조군에 비해 약 3 내지 5배이다.
요약하면, 무차별적 인공 Th 반응성은 시그니처 사이토카인을 분비함으로써 B 세포 항체 생산 및 대응하는 이펙터 T 세포 반응을 돕도록 면역 반응을 시작할 준비가 된 세포는 나이브 공여자 PBMC에서 용이하게 검출될 수 있다. IFN-γ는 이들 Th 에피토프 펩티드의 이러한 자극 특성을 예시하기 위해 여기에서 하나의 예로 사용되었다. 그러나, 이러한 자극 염증 반응은 백신접종 과정 동안 불리한 병리생리학적 반응을 일으키지 않도록 적합한 이펙터 세포 반응 (항체 생산을 위한 B 세포, 표적 항원 세포의 사멸을 위한 세포독성 T 세포)을 시작하기에 충분히 적당하다.
실시예 10
개인 맞춤화된 암 면역요법을 위한 신생-에피토프 기반 펩티드 면역원 작제물 및 이의 제형
우리는 암 치료에서 T 세포 혁명의 가운데에 있다. 지난 몇 년 동안, 면역 체크포인트 억제제 (ICI)와 같은 새로운 요법 및 키메라 항원 수용체 (CAR-T)와 같은 양자 세포 요법은 암으로 고통받는 수백만 명의 사람들에게 새로운 희망을 제공했다. ICI 약물은 우리 자신의 면역계, 및 특히, 우리의 T 세포가 암과 싸우는 것을 방지하는 암에 의해 세워진 자연적 장벽을 극복하도록 돕는다. 예를 들어, CAR-T 요법은 특정 종양 세포에 대한 면역 반응을 일으키도록 환자의 T 세포를 조작한다. 이러한 새로운 요법은 더욱 정확하게 종양을 공격하도록 T 세포를 "교육"하도록 설계된 미래 치료법을 가져온다.
암으로 고통받는 수백만 명의 사람들에게 새로운 희망을 제공하는 길로서 맞춤화된, 또는 신생항원, 암 백신을 둘러싼 흥분이 커지고 있다. 신생항원은 개인 맞춤화는 대부분의 개인의 면역계에 외래인 것으로 보이는 종양 돌연변이이다. 따라서, 개인 맞춤화된 백신은 종양을 찾아서 죽이도록 면역계를 교육하는, 이러한 신생항원을 표적으로 한다.
생물정보학, 단백질체학, 세포 기반 분석 및 비-표준 방법은 진정한 신생 항원의 효율적인 식별을 위해 널리 적용되었다. 엑손의 미소부수체 및 미스-스플라이싱에서 INDEL, 즉, 짧은 삽입 및 결실에 의해 형성되는, RNA 프레임시프트 (FS) 변이체는 고도의 면역원성 신생항원의 풍부한 공급원이다.
모든 가능한 (예를 들어, 400K) FS (프레임시프트) 종양 유래된 펩티드를 함유하는 어레이는 환자의 혈액 한 방울로부터 항체 반응성의 검출에 적용할 수 있고, 따라서 암 진단 및 신생항원 CTL 에피토프의 식별을 위한 뛰어난 도구를 제공한다.
MHC 형결정은 RNAseq를 사용하여 수행될 수 있는 반면, NetMHC 및 NetMHCpan을 신생항원 결합 친화도를 예측하는데 사용할 수 있다.
시험관 내 HLA 진단 분석, 환자의 종양에서 확인된 각각의 돌연변이를 나타내는 폴리펩티드는 자체 항원 제시 세포 (APC)로 개별적으로 전달되고, 그런 다음 처리되고 다양한 이펙터 T 세포에 의해 인식되는 세포의 표면상의 펩티드를 제시하였다. T 세포가 펩티드를 인식하고 결합하면, 사이토카인 반응이 촉발될 것이다. 진정한 항원은 측정되고 "양호" (즉, 또는 자극) 또는 "불량" (즉, 억제)으로 결정된다. 환자의 T 세포 - CD4+ (헬퍼 T 세포) 및 CD8+(킬러 T 세포) 모두 반응하는 실제 항원이 식별되고 신생-에피토프 펩티드 면역원 작제물의 설계를 위한 신생-에피토프로 선택될 수 있다.
환자가 기존 반응을 가지고 있는 경험적으로 확인된 신생-항원을 포함함으로써, 따라서 환자의 면역계가 이미 프라이밍된 개인 맞춤화된 암 백신이 개발된다.
간단하게, B 또는 CTL 신생-에피토프를 포함하는 특정 경험적으로 확인된 신생항원로부터 유래된 신생-에피토프 펩티드는 본 개시내용에 기술된 설계 원리를 사용하여 고도로 면역원성이 될 수 있다. 선택된 신생-에피토프에 공유 결합된 무차별적 인공 Th 에피토프의 참여로, 이러한 신생-에피토프 펩티드 면역원 작제물은 신생-항원으로 지향된 항체의 유도 및 유지 및 이펙터 CTL 기능의 유도뿐만 아니라 지속적인 B 및 CTL 반응 및 강력한 항종양 면역을 유발하는 B 및 CTL 기억 세포의 생성을 용이하게 할 수 있다.
흑색종 신생항원에 대해 선택된 표적 에피토프 서열을 갖는 대표적인 공개 신생항원, 신경교종에 대한 히스톤3 변이체 H3.3K27M, 및 대장암에 대한 KRAS (G에서 D로의 돌연변이)는 표 3A에 각각, 서열 번호 73, 74, 및 75로서 나타낸다.
본 개시내용의 설계된 신생-에피토프 펩티드 면역원 작제물 및 이의 제형은 세 부분으로 이루어진 안전성, 면역원성, 및 효능에 대한 임상 시험에서 추가로 평가될 수 있다:
1) 질환의 증거는 없지만 재발 위험이 높은 암 환자에서 단일요법으로서 안전성 및 면역원성의 연구.
2) 진행성 또는 전이성 고형 종양 환자에서 FDA-승인된 면역 체크포인트 억제제와 병용하는 신생-에피토프 백신의 안전성, 면역원성, 및 효능의 연구.
3) 면역 체크포인트 억제제 치료 후 반응하지 않았거나 암이 진행된 재발성 또는 불응성 고형 종양 환자에서 단일요법으로서 신생-에피토프 백신의 안전성, 면역원성, 및 효능의 연구.
피부 흑색종, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 두경부 편평 세포 암종 (SCCHN), 또는 요로상피세포암종에 대한 이들의 치료 (예를 들어, 외과적 절제, 신보조 및/또는 보조 화학요법, 및/또는 방사선 요법)를 완료하고 CT 또는 MRI에 의해 질환의 증거가 없는 대상 환자는 이러한 암 면역요법에 참여할 수 있다.
실시예 11
암 면역요법을 위한 종양 관련 탄수화물 항원 (TACA)-B 에피토프 면역원 작제물 및 이의 제형
종양 세포는 이질성, 절단 및 표면 올리고당의 과발현을 유발하는 비정상 당화 패턴을 특징으로 한다. 당 구조의 세 가지 주요 범주는 도 16에 나타낸 바와 같이 GD3, GD2, 글로보-H, GM2, 푸코실 GM1, PSA, Ley, Lex, SLex, SLea, 및 STn으로 나타낸 잠재적인 종양 관련 탄수화물 항원 (TACA)으로서 식별되어 있다.
(1) 뮤신-관련 o-글리칸: Tn, TF 및 STn
(2) 당질-스핑고지질: 글리오시드 GM3, GM2, GD2, GD3, 푸코실 GM1 및 중성 글로보시드 글로볼 H를 포함
(3) 혈액형 항원: SLe x, Le y Le x, SLe a 및 Le y
글로볼 H는 당지질로서 유방암 세포 표면 상에 발현되고 매력적인 종양 마커이다. 글로볼 H 육당류를 올리고당 합성에 대한 글리칼 조립체 접근법을 사용하여 합성하였다. 글로바 H는 B-합텐으로 역할을 하고 표 2에 나타낸 Th 헬퍼 펩티드와 고유 고정화를 허용하는 환원 말단에서 작용기를 갖추어 면역원성 펩티드 작제물을 형성한다. 이러한 유형의 적용에서 개시된 Th 에피토프의 용도는 다니셰프스키 및 리빙스턴에 의해 이전에 기술된 바와 같은 다른 종래의 담체 단백질 또는 KLH을 사용하는 다른 접근법보다 훨씬 더 다양하다 (웹사이트: glycopedia.eu/Hetero-TACA-vaccines-based-on-protein-carriers).
단백질의 라이신 (K) 잔기의 측쇄에서 각각의 폴리펩티드 또는 1차 아민의 N-말단은 N-히드록시숙신이미드 이탈기의 방출과 함께, pH 7-9에서 안정한 아미드 결합을 형성하기 위한 가교 링커 작용제의 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 유형에 대한 표적으로서 가능하다. 또한, 상이한 사슬 길이 링커와 함께 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS) (H.L. Chiang, et al. Vaccine. 2012 30(52), 7573-7581), p-니트로페닐 에스테르 (PNP) (S.J. Danishefsky, et al. Acc. Chem. Res. 2015, 48(3), 643-652)는 표 2에 나타낸 Th 헬퍼 펩티드에 대한 중요한 TACA 접합 링커로서 역할을 할 수 있다.
본 개시내용의 인공 Th 에피토프는 하기를 포함하는 암 백신 조성물에 사용될 수 있다: (a) 필수적으로 글로볼 H 또는 이의 면역원성 단편 글리칸을 포함하는 면역원성 조성물; (b) 표 2에 나타낸 무차별적 인공 T 헬퍼 에피토프 펩티드에 공유 결합된 면역원성 단편. 표 2에 나타낸 Th 에피토프 펩티드 (예를 들어, UBITh®)는 C-말단에서 N-말단으로 탈보호/커플링을 사용하는 고체상 펩티드 합성 (SPPS) 및 Fmoc 화학에 의해 단계별로 개별적으로 제조된다. 표적 펩티드 서열은 그것에 따라 구성되었다.
글리칸은 스페이서 유무에 관계없이 카이저 검사에 의해 모니터링되는 커플링 반응을 갖는 고체상 수지 상에 직접적 아미드 결합 형성을 통해 인공 Th 에피토프 펩티드에 연결될 수 있다. 두 가지 전략이 이 커플링을 위해 활용될 수 있다: (1) 활성화 이탈기에 이어서 N-말단이 유리 아민을 갖는 수지 결합 스페이서 연결된 Th 펩티드와의 커플링을 사용하여 글리칸 유도체를 제조하기 위해 또는 (2) 활성화 에스테르가 되기 위해 수지 결합 N-말단 아민기의 전환에 이어서 글리칸과의 커플링 반응. 수지-결합 및 스페이서-Th 펩티드에 대한 글리칸의 직접 커플링은 수지-결합 유리 아민기 상의 활성화 기에 대한 더 효율적인 커플링 반응에 이어서 표준 수지 유리 절단 반응에 의한 수지로부터 커플링된 글리칸 펩티드의 방출을 허용할 것이다. 2개의 큰 유리 분자, 예를 들어 다당류 및 긴 사슬 펩티드 간의 입체 장해는 글리칸-펩티드 커플링 반응을 더욱 어렵게, 따라서, 덜 효율적이고 수율이 낮게 만들 것이다.
일부 양태에서, B-합텐-연결된 T 헬퍼 운반체는 표 2에 기술된 스페이서 연결된 Th-펩티드이다.
일부 구현예에서, 링커는 p-니트로페닐 링커, N-히드록시숙신이미드 링커, p-니트로페닐 에스테르 (PNP 에스테르), 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS 에스테르)이다. NHS 에스테르는 N-히드록시숙신이미드 이탈기의 방출과 함께, pH 7-9에서 안정한 아미드 결합을 형성하기 위해 1차 아민과 반응할 수 있다.
하기 약어가 이 실시예에서 사용된다: PNP: p-니트로페닐 에스테르; NPC: N-니트로페닐 클로로포르메이트; DSS (디숙신이미딜 수베르에이트); 및 NHS: N-히드록시숙신이미드; MBS: m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르.
하기 단계의 화학 반응 및 제조는 다양한 구현예를 입증하기 위해 포함된다 (도 17 내지 21).
1. p-니트로페닐 (PNP) 기를 갖는 활성화된 UBITh®의 제조
인공 Th 에피토프 (예를 들어, UBITh®) 운반체는 자동화 고체상 합성 및 Fmoc 화학에 의해 합성될 수 있다. 신장 펩티드 사슬 상의 N-말단 아미노산의 Fmoc-탈보호 후, 유리 아미노기를 10 % 트리에틸아민을 함유하는 DMF 용액 중 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (NPC, 10 eq)로 처리하여 활성 4-니트로페닐 기로 전환시킬 수 있다. 생성된 펩티드-수지 혼합물을 시약 및 4-니트로페닐 잔기를 제거하기 위해 DCM 용액으로 세척할 수 있다. p-니트로페닐 기를 갖는 바람직한 활성화된 UBITh®은 글리칸과의 추가 접합을 위해 수득될 있다.
2. N-히드록시숙신이미드 (NHS) 기를 갖는 활성화된 UBITh®의 제조
UBITh® 펩티드 담체는 자동화 고체상 합성 및 Fmoc 화학을 사용하여 합성될 수 있다. 신장 펩티드 사슬 상의 N-말단 아미노산의 Fmoc-탈보호 후, 유리 아미노기를 DMF 용액 중 DSS로 처리하여 활성 N-히드록시숙신이미드로 전환할 수 있다. 생성된 펩티드-수지는 시약 잔기를 제거하기 위해 DCM 용액으로 세척할 수 있다. N-히드록시숙신이미드 기를 갖는 바람직한 활성화된 UBITh®은 글리칸과의 추가 접합을 위해 수득될 수 있다.
3. 글로볼 H 접합 UBITh® 펩티드의 합성
말단 아민기 (2)를 갖는 글로볼 H 육당류 유사체의 제조는 다음 원-팟 합성 전략으로 달성될 수 있다 (C.Y. Huang, et al., Proc. Natl Acad Sci USA 2006, 103, 15-20). 간단하게, 글로볼 H의 용액을 활성화된 UBITh®-수지로 도입될 수 있고 그런 다음 3h 동안 부드럽게 혼합한다. 수지로부터의 절단 및 완전한 탈보호 후, 조 글로볼 H 접합 UBITh® 펩티드를 분취 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 정제하고, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행시간 (MALDI-TOF) 질량 분광계 및 역상 HPLC 분석으로 특성화할 수 있다.
4. 글로볼 H 활성화된 에스테르의 제조
글로볼 H 헥실아민 (2)은 무수 DMF 용액에 용해될 수 있다. 그런 다음 p-니트로페닐 아디페이트 디에스테르를 첨가하고 실온에서 2-4시간 동안 교반할 수 있다. 유리 아민기의 소실을 확인하기 위해 TLC 및 카이저 검사로 반응을 모니터링할 수 있다. DMF 용매를 가열 없이 감압하에 제거할 수 있고 그런 다음 생성된 잔기를 0.5% 아세트산과 함께 디클로로메탄 및 물로 3회 추출할 수 있다. 생성된 수용액을 농축하고 역상 컬럼 (RP-C18) 크로마토그래피 (1% 아세트산과 함께 MeOH/H2O를 사용하는 등용매 용출)로 정제할 수 있다.
5. GM3 활성화된 에스테르의 제조
GM3 강글리시드 유사체의 합성 및 정제는 이전에 기술되어 있다 (Jacques S, et al., J. Am. Chem. Soc., 2012 134(10):4521-4). GM3 유사체 아민 X (4.5 mg; 5.2 μmol)를 디메틸포르마미드 (1.5 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민 (3.0 eq.)을 첨가할 수 있다. 그런 다음 p-니트로페닐 아디페이트 디에스테르 (10.0 eq.)을 첨가할 수 있다. 반응은 TLC로 모니터링하여 완결될 수 있다 (CH2Cl2-MeOH-H2O-AcOH; 4 : 5 : 1 : 0.5). 반응의 pH는 아세트산을 사용하여 5.0으로 조정된 다음 톨루엔 (3Х)으로 공동 증발시킬 수 있다. 잔기를 농축하고 수득된 잔기를 1% 아세트산을 함유하는 MeOH-H2O의 구배를 사용하여 HPLC (Beckman C18-실리카 반-분취 컬럼)로 정제할 수 있다. 1H NMR 스펙트럼을 CD3OD에서 얻을 수 있다.
6. Tn 활성화된 에스테르의 제조
당류 Tn은 이전 보고서 (T. Toyokuni, et al., Bioorg Med Chem. 1994, 11, 1119-32; 및 S.D. Scott, et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120(48), 12474-85)를 기반으로 합성될 수 있다. 건조 CH2Cl2 (25 mL) 중 Tn 아날로그 6 (mmol), NHS (160 mg, 1.39 mmol), 및 EDC (268 mg,1.40 mmol)을 실온에서 1시간 동안 교반할 수 있다. 혼합물을 사전냉각된 H2O (3 x 30 mL)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)하고, 농축하여 무색 시럽으로 숙신이미드-에스테르 유도체 (7)를 얻을 수 있다.
7. 시알릴 루이스 x (sLe x ) 활성 에스테르 (9)의 제조
sLex 사당류 유도체 (8)의 제조를 공개된 합성 전략 (G. Kuznik, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7(5):577-580, 1997)으로 달성할 수 있다. DMF/DCM 중 NPC (2 eq.)의 용액을 첨가한 화합물 (8)을 실온까지 올리고 추가 30분 동안 교반하였다. 농축된 조 혼합물을 DCM 및 수용액으로 세척할 수 있다. 생성된 수용액을 감압하에 처리하고 RP C18 컬럼으로 정제할 수 있다.
8. 당접합체를 생성하는 일반적인 절차
개별 글리칸의 개별 수지 결합 스페이서-통합된 Th 펩티드에 대한 표준 커플링 반응은 카르보이미드 커플링 반응을 통해 일반적인 고체상 펩티드 합성기(들)에 의해 실행되는 표준 펩티드 결합 형성 커플링 절차를 따른다.
수지 결합 글리칸-펩티드는 표준 펩티드 합성 절차에 따라 수지로부터 제거되고 회수되고 침전되고 동결건조될 수 있다.
T-세포 펩티드 에피토프 (예를 들어, UBITh®) 담체는 자동화 고체상 합성 및 Fmoc 화학에 의해 합성될 수 있다. 신장 펩티드 사슬 상의 N-말단 아미노산의 Fmoc-탈보호 후, 유리 아미노기는 추가 접합 반응을 위해 이용 가능하다. 활성화 이탈기 변형을 갖는 글로보 H, Tn, GM3, SLex 등의 합성 당류 유사체를 DMF 용액에 용해시키고 UBITh® 펩티드의 N-말단 아민과의 반응을 위해 SPPS 시스템에 첨가할 수 있다. 반응을 카이저 검사로 모니터링할 수 있다. 수지로부터의 절단 및 완전한 탈보호 후, 당류 접합 UBITh® 펩티드를 분취 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 정제하고, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행시간 (MALDI-TOF) 질량 분광계 및 역상 HPLC 분석에 의해 특성화할 수 있다.
요약하면, 이 실시예에서, 표 2에 나타낸 개별 Th 헬퍼 에피토프 펩티드에 대한 개별 글리칸의 효과적인 접합은 이러한 탄수화물-펩티드 면역원 작제물이 후속 백신 제형을 효율적으로 제조하도록 상세히 기술되어 있다. 인공 Th 에피토프를 사용하는 이들 탄수화물 백신 제형은 암 세포 상에 일반적으로 존재하는 표적화된 탄수화물 항원에 대한 집중된 항체 반응을 제공하여 임상 프로토콜에서 암 환자의 면역요법을 허용할 수 있다.
실시예 12
바이러스 감염에 대해 보편적인 T 세포 백신의 개발을 위한 이펙터 세포 에피토프 (예를 들어, CTL 에피토프) 및 이의 제형에 대한 무차별적 인공 T 헬퍼 에피토프(들)의 연결에 의한 이펙터 T 세포 기능의 향상
서론
T-헬퍼 세포는 표면 마커 CD4를 운반하고 폴리펩티드 이종이량체 (예를 들어, α/β로 표시됨)로 구성된 T 세포 수용체로 알려진 표면 수용체를 발현한다. T 헬퍼 세포는 일반적으로 항원 제시 세포 (APC)의 표면에서, 클래스 II MHC 단백질과 공동으로 바이러스 펩티드를 인식한다. 이러한 상호작용은 T 헬퍼 세포 활성화, 증식 및 분화를 초래하여, 충분히 높은 결합 친화성을 제공한다.
T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포)는 이들의 이펙터 기능을 촉발하고 조절하는 선천 및 적응 면역계 모두의 세포에 가용성 매개체 및 수용체-리간드 상호작용을 제공한다. 이들 세포는 이종성 집단이고, 지금까지, Th1, Th2, Th17, 및 T 여포 헬퍼 (Tfh) 세포를 포함하는 여러 서브셋이 특성화되었다. 또한, T 세포 헬퍼 및 세포독성 서브셋의 성장 및 기능을 억압하는 조절 CD4+ T 세포 (Treg)가 있다.
각각의 유형의 이펙터 T 세포는 주요 전사 인자에 의해 제어되고, 세포 표면 분자의 별개의 어레이를 발현하고, "시그니처" 사이토카인을 분비하여, 이는 함께 면역계의 암 내에서 그 T 세포 서브셋의 특정 역할을 용이하게 한다.
Tfh 세포는 B 세포 여포에 대한 집으로서 이들의 독특한 능력으로 다른 헬퍼 서브셋과 구별되고 이들의 Ig V 영역 유전자의 체세포 과돌연변이 (SHM)가 진행되고 항원에 대한 이들의 친화도가 변화되는 항원-특이적 B 세포에 도움을 제공한다. Tfh 세포는 B 세포 분화 및 높은 친화성의 발달, 바이러스에 대한 동형-전환 항체 반응에 필수적인 사이토카인 IL-21을 분비한다. Tfh-매개 신호는 면역 항원에 대해 더 높은 친화성을 갖는 B 세포의 선택을 보장하며, 그리고 이는 장수 혈장 세포 또는 기억 B 세포가 되도록 분화할 수 있다. SHM 과정을 통한 자기 반응성 B 세포 클론의 출현 가능성 및 선택된 클론의 수명 때문에, Tfh 세포에서 B 세포로의 양성 선택 신호의 전달을 제어하기 위해 엄격한 내성 메커니즘이 존재하는 것이 가장 중요하다.
Th1 세포는 주로 부스팅 세포독성 반응을 높이는 데 관여한다. 이들 세포는 부분적으로 사이토카인 IL-2 및 IFN-γ의 분비를 통해, 세포독성 T 세포 전구체의 성숙을 자극함으로써 바이러스 감염에 대한 세포-매개 반응을 촉진한다. Th1 세포는 또한, 종양 괴사 인자 (TNF)를 분비하고, 지연형 과민 반응을 매개하고, IgG2a 항체의 생산을 촉진한다. Th1 세포는 바이러스 감염 부위에서 대식세포 및 다른 T 세포를 활성화시킴으로써 면역 반응을 크게 증가시킨다. 이러한 반응은 많은 바이러스 감염의 발명의 인식된 부분인 지연형 과민 반응의 기초이다.
Th2 및 Th17 세포를 포함하는, 다른 Th 세포는 또한 염증 또는 특정 항체 동형의 생성을 촉진함으로써 바이러스 감염에 대한 면역 반응에 기여한다.
일부 T 세포는 다른 T 세포 및/또는 B 세포 반응을 하향조절할 수 있다. 조절 T 세포 (T-reg)으로 알려진 CD4+ T 세포의 별개의 서브셋. 2가지 기본 유형의 T-reg이 있다: (1) 음성 선택 중에 흉선에서 생성되고 자가면역 질환을 제어하는데 주로 관여하는 것으로 생각되는 tTreg; 및 (2) 면역 반응 동안 유도되고 면역 반응을 종결하고 면역계를 항상성으로 되돌리는데 관여하는 iTreg. T-reg 세포는 또한 보호와 면역-매개 병리 사이의 균형을 유지하는데 도움을 줄 수 있다.
펩티드 백신접종에서 헬퍼 T 세포의 영향은 엄청나다. 활성화 시, CD4+ T 헬퍼 세포는 동족 T 헬퍼 에피토프의 포함을 통해 강한 지속 가능한 CD8+ T-세포 반응을 제공할 수 있다. CD4 T 세포의 국소 면역조절 기능의 관점에서, 표적화된 바이러스 또는 종양의 항원으로부터 유래된 표적 조직에서 동족 도움을 활성화하는 것이 바람직하다. 외래 항원 및 동등한 종양 관련 단백질은 종종 면역계에 대한 핫스팟으로 기능하는 면역원성 스트레치 (Th 에피토프)를 함유한다. 표적 B 또는 이펙터 T 세포 (예를 들어, CTL 에피토프)에 대한 선택된 무차별적 인공 Th 에피토프의 공유 결합을 통한 본 발명에서 설계되고 기술된 펩티드 면역원 작제물은 최적의 보호 CD8 T-세포 반응의 유도를 위해 APC, CD4, 및 CD8 T 세포의 친밀한 상호작용을 용이하게 할 수 있다.
바이러스 특이적 보편적인 T 세포 백신으로의 통합을 위한 표적 항원 부위로서 CTL 에피토프 펩티드의 예시
1. HIV CTL 백신 구성요소:
Figure pct00001
항레트로바이러스 요법 (ART)에도 불구하고, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)-1은 안정한 잠복 저장소, 주로 휴식기 기억 CD4+ T 세포에서 지속한다. 이러한 저장소는 HIV-1 감염의 치료에 대한 주요 장벽을 제공한다. 저장소를 제거하기 위해, 잠복 HIV-1의 약리학적 재활성화를 시험관 내 및 생체 내에서 모두 시험하였다. 남은 핵심 질문은 세포독성 T 림프구 (CTL)를 포함하는, 바이러스 특이적 면역 메커니즘이 잠복기가 역전된 ART-처리된 환자에서 감염된 세포를 제거할 수 있는지 여부이다. 광범위한 데이터 마이닝 후, 시험된 모든 만성적으로 감염된 환자에서 돌연변이되지 않은 잠복 HIV-1로부터 에피토프를 인식할 수 있는 CTL을 보편적인 HIV T 세포 백신의 설계로 통합되는 표 3B (서열 번호 76-82)에 나타낸 바와 같은 이러한 CTL 에피토프의 대표적인 특정 펩티드로 확인하였다. 만성적으로 감염된 환자는 광범위 스펙트럼 바이러스 특이적 CTL 반응을 유지한다. 본 발명의 무차별적 인공 Th 에피토프 (서열 번호 1-52)에 대해 개별적으로 공유 결합으로 이들 CTL 에피토프 펩티드를 통합하는 이 HIV 보편적인 T 세포 백신을 통한 이러한 반응의 적절한 부스팅이 잠복 저장소의 제거를 초래할 것으로 예상한다.
2. HSV CTL 백신 구성요소
단순 포진 바이러스는 세계 인구의 높은 비율을 감염시키고 바이러스 게놈이 감각 뉴런에 유지되지만 비리온이 생성되지 않는 잠복 감염을 확립한다. 이 잠복 상태로부터 바이러스의 주기적 재활성화는 입과 입술의 점막 표면, 생식기 및 눈의 각막, 및 덜 빈번하게 뇌 및 피부에 영향을 미칠 수 있는 병변을 초래한다. HSV-2는 산도로부터 이를 획득한 신생아에게 치명적일 수 있고; 각막 HSV-1 감염은 실명의 주요 감염 원인이고; 뇌 HSV-1 감염은 치명적일 수 있는 바이러스성 뇌염 사례의 약 1/4을 차지한다. 임상 시험에 진출한 HSV-1 백신은 주로 Ab 생산을 위해 설계되었으며 대부분 효과가 없었다. 증거는 마우스와 인간 모두에서 HSV 감염을 제어하는 데 CD8+ T 세포에 대한 유의한 역할을 시시한다.
HSV 유형 1 (HSV-1)은 급초기 (α), 초기 (β), 누수 후기 (γ1), 및 참 후기 (γ2)와 같이 이의 유전자를 순차적으로 발현하고, 여기서 바이러스 DNA 합성은 γ2 유전자 발현만을 위한 절대 전제 조건이다. γ1 단백질 당단백질 B (gB)는 급성 감염 삼차 신경절 (TG)에서의 CD8+ 이펙터 T 세포 및 잠복 감염된 TG에서의 CD8+ 기억 T 세포 모두의 50%에 의해 인식되는 강한 면역우성 CD8+ T 세포 에피토프 (gB498-505)를 함유한다.
광범위한 데이터 마이닝 및 철저한 데이터 분석을 통해, C57BL/6 마우스의 전체 HSV-특이적 CD8+ T 세포 레퍼토리를 HSV CTL 백신 설계 고려 사항에 포함하였다. 더욱이, 상이한 세트의 HSV-1 gB 에피토프는 증상이 있는 개인과 무증상 개인의 CD4+ T 세포에 의해 인식되는 것으로 밝혀졌다. 이들 중, gB166-180, gB661-675, 및 gB666-680은 자가 HSV-1- 및 백시니아 바이러스 (gB [VVgB]를 발현)-감염된 LCL을 용해하는 CD4+ CTL에 의해 표적화되었다. gB166-180 및 gB666-680은 HSV-1-혈청양성 건강한 "무증상" 개인의 CD4+ T 세포에 의해 우선적으로 인식되는 것으로 나타난 반면, gB661-675는 심각하게 "증상이 있는" 개인의 CD4+ T 세포에 의해 우선적으로 인식되는 것으로 나타났다. 유효한 면역 치료 헤르페스 백신은 잠재적 "증상이 있는" gB661-675 에피토프를 배제할 것이다. 또한, 증상이 있는 개인에서 인식이 높은 세 VP11/12 CD8+ 에피토프는 안구 헤르페스의 "인간화된" HLA-A*02:01 유전자이식 마우스 모델에서 강한 보호 면역을 유발하는 것으로 밝혀진 것으로 확인되었다.
일련의 HSV CTL 에피토프는 보편적인 다중에피토프 기반 HSV T 세포 백신의 개발을 위해 본 발명의 설계로 통합되는 표 3B (서열 번호 83-106)에 나타낸 바와 같은 이러한 CTL 에피토프를 대표하는 특정 펩티드로 확인되었다.
3. 양돈 산업에서 FMDV, PRRSV, 및 CSFV 보편적인 T 세포 백신
구제역 바이러스 (FMDV), 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV) 및 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV)는 양돈 산업을 쇠약하게 하는 병원체이다. 이들 병원체에 대한 효과적인 백신의 개발은 양돈 산업에서 실질적으로 중요하다.
백신접종시 유도된 중화 항체가 질환 및 바이러스 전파를 제어하는데 매우 효과적이지만, 이들은 교차 아형 보호를 제공하지 않으며 항원 변화로 인해 효과가 없을 수 있다. 세포 면역 반응, 특히 세포독성 T 림프구 (CTL)의 생산은 다양한 바이러스에 대해 효율적이고 교차 보호 펩티드 백신을 개발하는데 이들의 잠재력으로 인해 많은 관심을 받고 있다. 예를 들어, CTL 에피토프 펩티드는 재조합 바이러스 벡터 및 펩티드 백신을 포함하는, 교차 보호 인간 인플루엔자 백신의 개발을 위해 사용될 수 있고; FMDV 혈청형 O에 대해 확인된 CTL 에피토프 펩티드는 다른 FMDV 혈청형에 대해 교차 반응하였다. 그러나, 분석의 대부분은 특정 바이러스 단백질로 제한되었으며 CTL 에피토프를 거의 식별할 수 없었다.
광범위한 데이터 마이닝, 설계, 합성, 노동 집약적 및 시간 소모적 면역원성 및 기능적 분석 절차 후, 대형 세트의 디자이너 CTL 펩티드의 평가는 다양한 FMDV, PRRSV, 및 CSFV 바이러스 단백질로부터 유래된 선택된 바이러스 특이적 CTL 에피토프의 유효성 검사를 허용하였다. 이들 에피토프의 선택된 CTL 펩티드 대표를 서열 번호 107-145로 표 3B에 나타낸다.
우리의 선택 및 확인 과정에서, 하기 여러 도전을 해결하기 위해 돼지 바이러스 서열의 분석을 위해 생물정보학 파이프라인을 통합하였다: (1) 유전적 변이, (2) 특정 표면 단백질의 불완전한 스크리닝, 및 (3) 비-돼지 백혈구 항원에 기초한 부적절한 예측. 본 발명의 펩티드 면역원 작제물을 생성하는 무차별적 인공 Th 에피토프 펩티드와 적절히 연결된 이들 CTL 에피토프 펩티드와의 통합은 지속적인 기억 및 장기간 CTL 반응을 갖는 T 세포 백신의 개발로 이어질 것이다. 양돈 산업을 자주 황폐화시키는 FMDV, PRRSV, CSFV 및 다른 바이러스 감염에 대한 이러한 고정밀 효과적인 펩티드 기반 돼지 백신의 상업적 개발은 축산 산업에서 가장 중요할 것이다.
표 1
펩티드 면역원 작제물의 설계에 사용하기 위한 이상적인 인공 Th 에피토프를 포함하는 병원체 단백질 유래 Th 에피토프의 아미노산 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
표 2
선택적인 이종성 스페이서 및 CpG 올리고뉴클레오티드의 예
Figure pct00004
표 3A
표적 항원 부위의 예 (B-세포 에피토프)
Figure pct00005
표 3B
표적 항원 부위의 예 (CTL 에피토프)
Figure pct00006
Figure pct00007
표 4
예시적인 펩티드 면역원 작제물
Figure pct00008
표 5
도 3, 4a, 및 4b에서 사용되는 알파-시누클레인 작제물
Figure pct00009
Figure pct00010
표 6
도 5에서 사용되는 IgE-EMPD 작제물
Figure pct00011
Figure pct00012
표 7
도 3 및 6에서 사용되는 IL-6 작제물
Figure pct00013
Figure pct00014
표 8
29개의 상이한 Th 에피토프의 면역원성을 평가하기 위해 기니피그 돼지에 투여되는 펩티드 면역원의 혼합물
Figure pct00015
Figure pct00016
표 9
도 7에서 사용되는 디펩티드 반복 (DPR) 작제물
Figure pct00017
표 10
도 13 및 14에서 사용되는 LHRH 작제물
Figure pct00018
표 11
Th 에피토프가 아닌 Aβ 펩티드를 표적화하는 기니피그 돼지에서 Aβ1-14 면역원의 배타적 면역원성
Figure pct00019
표 12
Aβ1-14, Aβ1-42 펩티드 또는 PHA (피토헤마글루틴) 미토겐으로 자극시 15, 21 및 25.5 wpi에서 수집된 UB311 백신접종된 또는 정상 시노몰구스 마카크 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 사이토카인 농도의 측정
Figure pct00020
표 13
19명의 알츠하이머병 환자로부터 평가된 PBMC의 자극 지수
Figure pct00021
표 14
Aβ 펩티드 또는 PHA 미토겐1으로 자극시 19명의 환자로부터 평가된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 사이토카인 농도
Figure pct00022
표 15
병원성 단백질로부터 이종성 Th 에피토프 펩티드의 순위와 IL-6 B 세포 에피토프 펩티드 (C73-C83) (서열 번호 145)의 면역원성 향상
Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> UBI US Holdings, LLC UBI IP Holdings Wang, Chang Yi <120> ARTIFICIAL PROMISCUOUS T HELPER CELL EPITOPES AS IMMUNE STIMULATORS FOR SYNTHETIC PEPTIDE IMMUNOGENS <130> 2039-WO <140> TBD <141> 2019-12-19 <150> US 62/782,253 <151> 2018-12-19 <160> 243 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <400> 1 Asp Leu Ser Asp Leu Lys Gly Leu Leu Leu His Lys Leu Asp Gly Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <400> 2 Glu Ile Ser Asp Glu Ile Arg Leu Ile Ile Ile Lys Arg Ile Glu Ile 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <400> 3 Asp Val Ser Asp Val Lys Gly Val Val Val His Lys Val Asp Gly Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <400> 4 Asp Phe Ser Asp Phe Lys Gly Phe Phe Phe His Lys Phe Asp Gly Phe 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> D or E <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> D or E <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> D or E <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> L or I or V or F <400> 5 Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF1 Th <400> 6 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF 2 Th <400> 7 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile 1 5 10 15 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF3 Th <400> 8 Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 3Th <400> 9 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF3 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> G or T <400> 10 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF3 Th <400> 11 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys 1 5 10 15 Ile Glu Gly Ile Leu Phe 20 <210> 12 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF3 Th <400> 12 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg 1 5 10 15 Ile Glu Thr Ile Leu Phe 20 <210> 13 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF 3 Th <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> G or T <400> 13 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe 20 <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF4 Th <400> 14 Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF4 Th <400> 15 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <400> 16 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 17 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF5 Th (UBITh1a) <400> 18 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg 1 5 10 15 Ile Glu Thr Ile Leu Phe 20 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 19 Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Gln Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 20 Arg Arg Arg Ile Lys Ile Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Pro Leu Ser 1 5 10 15 Ile Arg <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 21 Lys Lys Lys Val Arg Val Val Thr Lys Val Val Thr Val Pro Ile Ser 1 5 10 15 Val Asp <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 22 Lys Lys Lys Phe Phe Phe Phe Thr Lys Phe Phe Thr Phe Pro Val Ser 1 5 10 15 Phe Asp <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 23 Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Phe Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> D or R <400> 24 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg2 Th <400> 25 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Pro Gln Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg2 Th <400> 26 Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I <400> 27 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Asp <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 3 Th <400> 28 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> HBsAg4 Th (UBITh4) <400> 29 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp 1 5 10 15 <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> KKK-HBsAg Th <400> 30 Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> HBsAg Th <400> 31 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 24 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Bordetella pertussis Th <400> 32 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr 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PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT3 Th <400> 37 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT4 Th <400> 38 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys 1 5 10 15 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 2 Th <400> 39 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr <210> 40 <211> 23 <212> PRT <213> diphtheria bacilli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Diphtheria Th <400> 40 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys 20 <210> 41 <211> 19 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> EBV BHRF1 Th <400> 41 Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> EBV EBNA-1 Th <400> 42 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr His Ile 20 <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> EBV CP Th <400> 43 Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> EBV GP340 Th <400> 44 Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> EBV BPLF1 Th <400> 45 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> EBV EBNA-2 Th <400> 46 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu 1 5 10 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <220> <221> PEPTIDE <222> 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mansoni Th <400> 52 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> epsilon-K-KKK as a spacer <400> 53 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> KKK-epsilon-K as a spacer <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> epsilon-K <400> 54 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> Flexible Hinge Spacer <400> 55 Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro 1 5 <210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta1-14 <400> 56 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His 1 5 10 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Abeta1-16 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Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu 1 5 10 15 Met Pro Ser Glu Glu Gly 20 <210> 62 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(39) <223> IgE-EMPD1-39 <400> 62 Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val 1 5 10 15 Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Ser Val Pro His Pro Arg Cys 35 <210> 63 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(30) <223> Tau379-408 (Derived from GenBank: AGF19246.1) <400> 63 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 20 25 30 <210> 64 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(48) <223> IL-3197-144 (Derived from Uniprot C7G0W1-1; GenBank: BAH97742.1) <400> 64 Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys 1 5 10 15 Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp 20 25 30 Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser 35 40 45 <210> 65 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(18) <223> epsilon-K-KKK as a spacer <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(37) <223> MvF 4 Th <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (25)..(25) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (26)..(26) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (30)..(30) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (31)..(31) <223> K or R <400> 65 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile 20 25 30 Glu Thr Ile Leu Phe 35 <210> 66 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(33) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (21)..(21) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (26)..(26) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (29)..(29) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (30)..(30) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (31)..(31) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> L or I <400> 66 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Asp <210> 67 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(18) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(37) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 67 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile 20 25 30 Glu Thr Ile Leu Phe 35 <210> 68 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Abeta 1-14 <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(33) <223> HBsAg3 Th <400> 68 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr Ile 20 25 30 Asp <210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Tau145-160 <400> 69 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 1 5 10 15 <210> 70 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(50) <223> Tau1-50 <400> 70 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr 50 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Tau297-311 <400> 71 Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 72 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> IL-31 85-115 (S85 to C85, I115 to C115) <400> 72 Cys Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg Gln Leu Asp Asn 1 5 10 15 Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp Lys Leu Cys 20 25 30 <210> 73 <211> 25 <212> PRT <213> Melanomma radicans <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Melanoma Neoantigen <400> 73 Ser Gly Ser Pro Pro Leu Arg Val Ser Val Gly Asp Phe Ser Gln Glu 1 5 10 15 Phe Ser Pro Gln Glu Ala Gln Gln Asp 20 25 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glioma <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Histone 3 Variant H3.3K27M for Glioma <400> 74 Arg Met Ser Ala Pro Ser Thr Gly Gly Val 1 5 10 <210> 75 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS Metastatic Colorectal Cancer <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> KRAS Metastatic Colorectal Cancer (MUTANT G-to-D) <400> 75 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile 20 <210> 76 <211> 32 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> HIV CTL Gag P24 <400> 76 Ser Ile Leu Asp Ile Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr 1 5 10 15 Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu 20 25 30 <210> 77 <211> 22 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> HIV CTL Gag P17 <400> 77 Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu 1 5 10 15 Thr Ser Glu Gly Cys Arg 20 <210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> HIV CTL Gag 293-312 <400> 78 Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Ser Gln Glu 20 <210> 79 <211> 35 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(35) <223> HIV CTL POL PRT <400> 79 Pro Arg Thr Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg 1 5 10 15 Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr 20 25 30 Val Leu Val 35 <210> 80 <211> 26 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> HIV CTL POL RT <400> 80 Leu Arg Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro 1 5 10 15 Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His 20 25 <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> HIV CTL POL INT <400> 81 Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val 1 5 10 15 Tyr <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> HIV CTL VIF <400> 82 Cys Phe Ala Asp Ser Ala Ile Arg Lys Ala Ile Leu Gly His Ile Val 1 5 10 15 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL VP11/12 (66-74) <400> 83 Phe Leu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Val 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL VP11/12 (197-205) <400> 84 Arg Ile Gln Gln Tyr Met Phe Phe Met 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL VP11/12 (220-228) <400> 85 Arg Leu Asn Glu Leu Leu Ala Tyr Val 1 5 <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> HSV CTL VP11/12 (230-246) <400> 86 Val Leu Tyr Arg Trp Ala Ser Trp Met Leu Trp Thr Thr Asp Lys His 1 5 10 15 Val <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL VP11/12 (702-710) <400> 87 Ala Leu Ser Ala Leu Leu Thr Lys Leu 1 5 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> HSV CTL gamma1 gB498 <400> 88 Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL gamma1 gB452 <400> 89 Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL gamma1 gB560 <400> 90 Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL gamma1 gG4 <400> 91 Gly Ala Met Arg Ala Val Val Pro Ile 1 5 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> HSV CTL beta PR1982 <400> 92 Phe Ala Pro Leu Phe Thr Asn Leu 1 5 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> HSV CTL beta PR1_822 <400> 93 Gln Thr Phe Asp Phe Gly Arg Leu 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL beta PR1_372 <400> 94 Phe Gly Leu Leu Asn Tyr Ala Leu Val 1 5 <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> HSV CTL beta ICP_876 <400> 95 Gly Ala Ile Asn Phe Ile Asn Leu 1 5 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> HSV CTL beta ICP_168 <400> 96 Ala Val Cys Ile Asn Asn Thr Phe Leu His Leu 1 5 10 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> HSV CTL beta PR2_81 <400> 97 Ser Phe Tyr Arg Phe Leu Phe Ala Phe Leu 1 5 10 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL beta PR2_279 <400> 98 Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Val Arg Phe 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL beta UL9_251 <400> 99 Phe Leu Pro Arg Leu Gly Thr Glu Leu 1 5 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> HSV CTL beta UL41_181 <400> 100 Leu Gly Tyr Ala Tyr Ile Asn Ser 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL gamma2 gC8 <400> 101 Leu Ala Val Val Leu Trp Ser Leu Leu 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL beta UL28_629 <400> 102 Tyr Ser Val Glu Asn Val Gly Leu Leu 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL gamma2 gH391 <400> 103 Phe Ala Phe Val Asn Ala Ala His Ala 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> HSV CTL gamma2 gK54 <400> 104 Trp Met Lys Met Asn Gln Thr Leu Leu 1 5 <210> 105 <211> 20 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> HSV CTL gB161-180 <400> 105 Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val Trp Phe Gly 1 5 10 15 His Arg Tyr Ser 20 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> human herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> HSV CTL gB 666-680 <400> 106 Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp Leu Asn Ile Thr 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VP2_421 <400> 112 Arg Glu Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe 1 5 10 <210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> FMDV CTL VP3_622 <400> 113 Lys Ala Arg Tyr Met Ile Ala Tyr 1 5 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> FMDV CTL 2C1309 <400> 114 Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu Tyr 1 5 <210> 115 <211> 11 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> FMDV CTL 2C1369 <400> 115 Phe Gln Tyr Asp Cys Ala Leu Leu Asn Gly Met 1 5 10 <210> 116 <211> 10 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> FMDV CTL 3C1720 <400> 116 Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu 1 5 10 <210> 117 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> FMDV CTL 3D2083 <400> 117 Trp Gln Arg Phe Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp Asp 1 5 10 15 Val Asp Tyr <210> 118 <211> 11 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> FMDV CTL 3D2159 <400> 118 Asn Thr Ile Leu Asn Asn Ile Tyr Val Leu Tyr 1 5 10 <210> 119 <211> 31 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> FMDV CTL 3D2231/43/58 <400> 119 Ser Ile Thr Asp Val Thr Phe Leu Lys Lys Lys His Met Asp Tyr Gly 1 5 10 15 Thr Gly Phe Tyr Lys Lys Lys Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser Phe 20 25 30 <210> 120 <211> 17 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> FMDV CTL 3D2295 <400> 120 Phe Glu Pro Phe Gln Gly Leu Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu 1 5 10 15 Tyr <210> 121 <211> 10 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> FMDV CTL 3D2302 <400> 121 Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr 1 5 10 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> FMDV CTL Type O 750 <400> 122 Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe 1 5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> FMDV CTL Type O 881 <400> 123 Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr 1 5 <210> 124 <211> 14 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> PRRSV CTL ORF1a <400> 124 Arg Leu Gly Lys Ile Ile Ser Leu Cys Gln Val Ile Glu Asp 1 5 10 <210> 125 <211> 15 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> PRRSV CTL ORF1a <400> 125 Val Pro Val Ile Thr Cys Gly Val Val His Leu Leu Ala Ile Ile 1 5 10 15 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> PRRSV CTL ORF7 <400> 126 Leu Ser Asp Ser Gly Arg Ile Ser Tyr 1 5 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> PRRSV CTL ORF2 <400> 127 Arg Thr Ala Pro Asn Glu Ile Ala Phe 1 5 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> PRRSV CTL ORF2a <400> 128 Ala Ser Asp Trp Phe Ala Pro Arg Tyr 1 5 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> PRRSV CTL ORF5 <400> 129 Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr 1 5 10 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> PRRSV CTL NSP9 <400> 130 Thr Thr Met Pro Ser Gly Phe Glu Leu Tyr 1 5 10 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> PRRSV CTL NSP10 <400> 131 Asn Ser Phe Leu Asp Glu Ala Ala Tyr 1 5 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> PRRSV CTL ORF6 <400> 132 Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu 1 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<223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(43) <223> alpha-Synuclein (G111-G132) <400> 155 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr Lys Lys Lys Lys Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp 20 25 30 Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly 35 40 <210> 156 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Diphtheria Th <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(27) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (24)..(24) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (28)..(49) <223> alpha-Synuclein (G111-G132) <400> 156 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys Lys Lys Lys Lys Gly Ile Leu Glu Asp 20 25 30 Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu 35 40 45 Gly <210> 157 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Plasmodium falciparum Th <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(25) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(47) <223> alpha-Synuclein (G111-G132) <400> 157 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser Lys Lys Lys Lys Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro 20 25 30 Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly 35 40 45 <210> 158 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Schistosoma mansoni Th <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(21) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(43) <223> alpha-Synuclein (G111-G132) <400> 158 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His Lys Lys Lys Lys 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Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Gly Ile Leu Glu Asp Met 20 25 30 Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly 35 40 45 <210> 162 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> 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(8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> IL6 (C73-C83) <400> 209 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu 20 25 30 Thr Cys <210> 210 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(21) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (21)..(21) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(32) <223> IL6 (C73-C83) <400> 210 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 211 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(29) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (29)..(29) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (30)..(40) <223> IL6 (C73-C83) <400> 217 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln 20 25 30 Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 35 40 <210> 218 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(30) <223> IL6 (C73-C83) <400> 218 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 219 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF3 Th <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> G or T <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(26) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (26)..(26) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (27)..(37) <223> IL6 (C73-C83) <400> 219 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe 20 25 30 Asn Glu Glu Thr Cys 35 <210> 220 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R 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Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(33) <223> IL6 (C73-C83) <400> 221 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Asp Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr 20 25 30 Cys <210> 222 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza MP1_1 Th <220> <221> PEPTIDE 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PEPTIDE <222> (20)..(30) <223> IL6 (C73-C83) <400> 226 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 227 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> EBV EBNA-1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(24) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (24)..(24) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (25)..(35) <223> IL6 (C73-C83) <400> 227 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr His Ile Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu 20 25 30 Glu Thr Cys 35 <210> 228 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Clostridium tetani TT2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(25) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (25)..(25) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(36) <223> IL6 (C73-C83) <400> 228 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn 20 25 30 Glu Glu Thr Cys 35 <210> 229 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT3 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(20) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(31) <223> IL6 (C73-C83) <400> 229 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 230 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT4 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(20) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(31) <223> IL6 (C73-C83) <400> 230 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 231 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> EBV CP Th <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(33) <223> IL6 (C73-C83) <400> 231 Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr 20 25 30 Cys <210> 232 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> HCMV IE1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(18) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(29) <223> IL6 (C73-C83) <400> 232 Asp Lys Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 <210> 233 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> EBV GP340 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(30) <223> IL6 (C73-C83) <400> 233 Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 30 <210> 234 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> EBV BPLF1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (14)..(17) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(28) <223> IL6 (C73-C83) <400> 234 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln Lys Lys Lys 1 5 10 15 Lys Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 <210> 235 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> EBV EBNA-2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(15) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(26) <223> IL6 (C73-C83) <400> 235 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu Lys Lys Lys Lys Cys 1 5 10 15 Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 20 25 <210> 236 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DPR peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> (GA) 10 repeats <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(24) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (24)..(24) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (25)..(43) <223> UBITh1 <400> 236 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ala Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly 20 25 30 Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 35 40 <210> 237 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DPR peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(30) <223> (GA) 15 repeats <220> <221> PEPTIDE <222> (31)..(34) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (34)..(34) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (35)..(53) <223> UBITh1 <400> 237 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile 35 40 45 Glu Thr Ile Leu Phe 50 <210> 238 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DPR peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(50) <223> (GA) 25 repeats <220> <221> PEPTIDE <222> (51)..(54) <223> KKK-epsilon-K spacer <220> <221> SITE <222> (54)..(54) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (55)..(73) <223> UBITh1 <400> 238 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile 50 55 60 Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 65 70 <210> 239 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LHRH peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> TT1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(27) <223> LHRH <400> 239 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 20 25 <210> 240 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LHRH peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Invasin <220> <221> SITE <222> (17)..(18) <223> GG spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(33) <223> MVF Th <220> <221> SITE <222> (34)..(35) <223> GG spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (36)..(45) <223> LHRH <400> 240 Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe 1 5 10 15 Gly Gly Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly 20 25 30 Val Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 35 40 45 <210> 241 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LHRH peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Invasin <220> <221> SITE <222> (17)..(18) <223> GG spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(33) <223> HBsAg Th <220> <221> SITE <222> (34)..(35) <223> GG spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (36)..(45) <223> LHRH <400> 241 Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe 1 5 10 15 Gly Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Glu Gly Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 35 40 45 <210> 242 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 (72-82) (rat counterpart) <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> IL-6 (72-82) rat counterpart <400> 242 Cys Phe Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Ile Cys 1 5 10 <210> 243 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> rat counterpart IL-6 (72-82) <400> 243 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu 20 25 30 Ile Cys

Claims (35)

  1. 서열 번호 32 - 52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 무차별적 인공 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프.
  2. 하기 식으로 표시되는:
    (A)n-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
    또는
    (A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(A)n-X
    또는
    (A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
    또는
    {(A)n-(Th)p-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)p-(A)n-X}m
    식 중:
    각각의 A는 독립적으로 아미노산이고;
    각각의 B는 독립적으로 이종성 스페이서이고;
    각각의 Th는 독립적으로 제1항의 무차별적 인공 Th 에피토프이고;
    표적 항원 부위는 외래-항원 단백질, 자기-항원 단백질, 또는 이의 면역학적 활성 유사체로부터의 B 세포 에피토프이고;
    X는 아미노산, α-COOH, 또는 α-CONH2이고;
    n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
    m은 1, 2, 3, 또는 4이고; 그리고
    o는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; 그리고
    p는 0, 1, 2, 3, 또는 4인, 펩티드 면역원 작제물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 구제역 (FMD) 캡시드 단백질, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV)로부터의 당단백질, 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 및 단순 포진 바이러스 (HSV)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 외래-항원 단백질로부터의 B 세포 에피토프인 펩티드 면역원 작제물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자기-항원 단백질로부터의 B 세포 에피토프인 펩티드 면역원 작제물:
    (a) 서열 번호 56, 57, 58, 59, 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 Aβ 펩티드;
    (b) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 알파-Syn 펩티드;
    (c) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 IgE EMPD 펩티드;
    (d) 서열 번호 63, 69, 70, 또는 71의 아미노산 서열을 갖는 타우 펩티드;
    (e) 서열 번호 64 또는 72의 아미노산 서열을 갖는 IL-31 펩티드; 및
    (f) 서열 번호 145의 아미노산 서열을 갖는 IL-6 펩티드.
  5. 제2항에 있어서, 상기 구성요소 B의 이종성 스페이서는 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 번호 54), Gly-Gly, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 번호 55), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드 면역원 작제물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 이종성 스페이서는 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), 및 Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 번호 54)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드 면역원 작제물.
  7. 제2항에 따른 펩티드 면역원 작제물을 포함하는 약학 조성물.
  8. 대상체에서 제7항의 약학적으로 유효한 양의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 질환, 병태, 또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 구제역 (FMD) 캡시드 단백질, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV)로부터의 당단백질, 고전적 돼지 열병 바이러스 (CSFV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 및 단순 포진 바이러스 (HSV)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 외래-항원 단백질로부터의 B 세포 에피토프인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자기-항원 단백질로부터의 B 세포 에피토프인 방법:
    (a) 서열 번호 56, 57, 58, 59, 또는 60의 아미노산 서열을 갖는 Aβ 펩티드;
    (b) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 갖는 알파-Syn 펩티드;
    (c) 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 IgE EMPD 펩티드;
    (d) 서열 번호 63, 69, 70, 또는 71의 아미노산 서열을 갖는 타우 펩티드;
    (e) 서열 번호 64 또는 72의 아미노산 서열을 갖는 IL-31 펩티드; 및
    (f) 서열 번호 145의 아미노산 서열을 갖는 IL-6 펩티드.
  11. 하기 식으로 표시되는:
    (A)n-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
    또는
    (A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(A)n-X
    또는
    (A)n-(Th)m-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
    또는
    {(A)n-(Th)p-(B)o-(표적 항원 부위)-(B)o-(Th)p-(A)n-X}m
    식 중:
    각각의 A는 독립적으로 아미노산이고;
    각각의 B는 독립적으로 이종성 스페이서이고;
    각각의 Th는 독립적으로 서열 번호 1-52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 무차별적 인공 Th 에피토프이고;
    표적 항원 부위는 CTL 에피토프, 종양 관련 탄수화물 항원 (TACA), 신생항원의 B 세포 에피토프, 소분자 약물, 또는 이의 면역학적 활성 유사체이고;
    X는 아미노산, α-COOH, 또는 α-CONH2이고;
    n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
    m은 1, 2, 3, 또는 4이고; 그리고
    o는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; 그리고
    p는 0, 1, 2, 3, 또는 4인 펩티드 면역원 작제물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 76-144로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
  13. 제12항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 76-82로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HIV로부터의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
  14. 제12항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 83-106으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HSV로부터의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
  15. 제12항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 107-123으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 FMDV로부터의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
  16. 제12항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 124-142로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PRRSV로부터의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
  17. 제12항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 143-144로 이루어진 그룹으로부터 선택된 CSFV로부터의 CTL 에피토프인 펩티드 면역원.
  18. 제11항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 GD3, GD2, 글로보-H, GM2, 푸코실 GM1, GM2, PSA, Ley, Lex, SLex, SLea, Tn, TF, 및 STn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 TACA인 펩티드 면역원.
  19. 제11항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 73-75로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신생항원으로부터의 B 세포 에피토프인 펩티드 면역원.
  20. 제11항에 있어서, 상기 표적 항원 부위는 소분자 약물인 펩티드 면역원.
  21. 제11항에 있어서, 상기 구성요소 B의 이종성 스페이서는 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 번호 54), Gly-Gly, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 번호 55), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드 면역원 작제물.
  22. 제11항에 있어서, 상기 이종성 스페이서는 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호 53), 및 Lys-Lys-Lys-εNLys (서열 번호 54)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드 면역원 작제물.
  23. 제11항에 따른 펩티드 면역원 작제물을 포함하는 약학 조성물.
  24. 대상체에 제23항의 약학적으로 유효한 양의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질환, 병태, 또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 HIV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 76-82로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HIV로부터의 CTL 에피토프인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 HSV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 83-106으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HSV로부터의 CTL 에피토프인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 FMDV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 107-123으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 FMDV로부터의 CTL 에피토프인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 PRRSV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 124-142로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PRRSV로부터의 CTL 에피토프인 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 CSFV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 143-144로 이루어진 그룹으로부터 선택된 CSFV로부터의 CTL 에피토프인 방법.
  30. 제24항에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 CSFV이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 143-144로 이루어진 그룹으로부터 선택된 CSFV로부터의 CTL 에피토프인 방법.
  31. 제24항에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 암이고 상기 표적 항원 부위는 GD3, GD2, 글로보-H, GM2, 푸코실 GM1, GM2, PSA, Ley, Lex, SLex, SLea, Tn, TF, 및 STn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 TACA인 방법.
  32. 제24항에 있어서, 상기 질환, 병태, 또는 질병은 암이고 상기 표적 항원 부위는 서열 번호 73-75로 이루어진 그룹으로부터 선택된 신생항원으로부터의 B 세포 에피토프인 방법.
  33. 하기 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 조정하는 방법:
    (a) 상기 표적 항원 부위는 변함없이 유지되고 Th 에피토프는 각각의 펩티드 면역원 작제물에서 상이한, 제11항에 따른 하나 이상의 펩티드 면역원 작제물을 제조하는 단계;
    (b) 이들 각각이 (a)에서 제조된 펩티드 면역원 작제물 중 하나 및 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 담체를 포함하는, 하나 이상의 약학 조성물을 제조하는 단계;
    (c) (b)에서 제조된 각각의 약학 조성물을 상이한 대상체에게 투여하는 단계;
    (d) 각각의 대상체에서 면역 반응을 모니터링하는 단계; 및
    (e) 바람직한 면역 반응을 생성하는 약학 조성물을 선택하는 단계.
  34. 제33항에 따른 방법에 있어서, 상기 각각의 약학 조성물에서 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 담체가 동일한 방법.
  35. 제33항에 따른 방법에 있어서, 상기 각각의 약학 조성물에서 약학적으로 허용 가능한 보조제 또는 담체가 상이한 방법.
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