JPH06504537A

JPH06504537A - 魚のｌｈｒｈ類似体

Info

Publication number: JPH06504537A
Application number: JP4502565A
Authority: JP
Inventors: フィッシュレイ、ロバート・ビンセント; ロブソン、バリー
Original assignee: プロテウス・モレキュラー・デザイン・リミテッド
Priority date: 1991-01-09
Filing date: 1992-01-08
Publication date: 1994-05-26
Also published as: HUT66829A; GB2267496B; IS3802A; GB2267496A; ZW392A1; FI933138A; KR930703444A; AU1161792A; EP0566611A1; CA2100057A1; CN1063109A; NO932491L; HU9301979D0; WO1992012247A1; IE920055A1; GB9100468D0; AU652611B2; NO932491D0; DK80993D0; GB9314141D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】魚のＬＨＲＨ類似体本発明は、魚の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｐＧｎＲＨ）と呼ばれ、時には魚の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｐＬＨＲＨ）とも呼ばれる魚のホルモンの伸長類似体に関する。特に、未変性のｐＧｎＲＨのアミノ酸配列のＣ末端に、システィン又はチロシン残基を含んでいる短いアミノ酸配列を、溶液中での構造を実質的に変えることなく付加することにより形成されるｐＧｎＲＨの類似体、そのポリペプチド結合体、抗−ｐＧｎＲＨ抗体の惹起に適したポリペプチド結合体及び、魚の免疫法に関する。

商業的な魚の養殖は、急激に成長しつつある世界的産業である。西ヨーロッパ、化アメリカ、南アメリカ、カナダ及び東部沿岸地方はすべて主要な魚とりわけサケの生産地である。例えば米国は１９８９年には１８５．０００　トンのサケを生産し、しかもナマズの市場が僅差で続いている。

一方、西ヨーロッパ最大の大西洋産サケの生産地であるノルウェーは、１９８９／９０年には１２０，０００　トンを生産した。

サケの世界市場は今世紀末まで、毎年平均７．５％ずつ成長することになり、その結果年間総売上高は２０億ボンドになると計算されている。現在ヨーロッパはタイ、スズキ及び、東ヨーロッパとアフリカで養殖されているコイの主要生産地であるが、スズキ及びカレイの商業的発展とオヒョウ及びタラの、より長い漁期における商業的発展が予想されている。

水産養殖においては、体成長の性腺への転換、肉の品質の損失及び、商売上好ましくない二次性徴の出現を防ぐため、魚の性成熟を調節する必要性が大きい。このことは、サケ科の魚に特にあてはまり、幼魚及び若ザケ（通常、発育の未熟な段階）の性成熟は、幼魚の成長を非商業的サイズで止めてしまい、若ザケの収穫を短期間にさせ、市場価値を低くすることにより、厳しい経済効果をもたらすことになる。さらに、養殖魚が養殖場からはぐれ、天然の遺伝子のプールに参加する場合にはその養殖魚の生殖能力を阻止することが要求される。

性成熟した魚の収穫には、後方業務上の問題が関連している。そのような魚は売り物にならず、又、一定の割合の魚は、決まって他よりも早く成長し、特に雄は早熟の傾向が強い。性成熟した魚を未成熟の魚から分離させることは、時間がかかり、費用のかかる工程である。魚は一度成熟を始めると、大体同時に同じ速さで成熟を始めるが、そのことは収穫を非常に難しい作業にしている。

この事から、魚の成熟を、ある段階で調節する方法は明らかに有益である。

例えば、収穫時にサケの理想的な体重は、しばしば早熟により達成されず、従って魚の最適状態に及びない収穫を余儀なくされる。成熟を調節することは、最適状態には及ばない収穫を避け、大きさが完全に最適化するまで成長させることができる。

従来、性成熟が起きないことを確実にする最も効果的な方法は不妊の魚を育てることである。このことは、数多くの実験的なアプローチにもかかわらず、性的二型性を示す集団についてはいまだ達成されていない。

去勢手術、二倍体化、及び性支配（後の２つはいずれも遺伝子的技法である）を含むいくつかの方法が、魚の性成熟の調製に用いられてきた。かっては、魚を外科的に去勢させることが試みられてきたが、莫大な出費を招くこと及び、その過程に伴う魚の外傷のために断念された。

三倍体法は１つの個体に３組の染色体を生じさせる方法であり、二倍体の雌雄の魚に不妊を引き起こす。しかしながら、三倍体法には、関連したいくつかの不都合がある。第一に、それは長期間にわたって行なわれる、冗長で時間がかかる方法である。二倍体法用の卵は、必要な処理に耐える為に、高品質のものでなければならない。

結果として得られる魚は十分に生育し得るが、生存率は平均１５〜２０％の損失を含み、産卵期以外の二倍体の魚の成長速度よりやや低い成長速度をもつ。産卵に近づく期間には、雌雄の二倍体の間には大きな差異があり、雄は正常に近い精巣と関連したすべての二次性徴を発現する一方、二倍体の雌は自然の産卵期に有意な卵巣を発現せず、幼若体の外見を有する。

誘導した二倍体の使用を成功させる為には、雌にだけ用いる技術と組み合わせる必要があり、それは商業的に経済的でない。二倍体法に関連したさらなる不利益は、同−水槽内での二倍体との競合において二倍体が良好に生育しないことであり、二倍体の雌は成長において二倍体の雌の成熟を上まわるいかなる優越性も示さない傾向がある。

魚類は二型性が強く、すなわち雄から雌へ、そしてその逆へ転換することができ、その性転換は調製することが可能である。単一の性は通常、養殖の目的の為には、例えば成長速度の観点から、より好ましい。カレイ及びウナギは、雄よりも雌の方がより大きく成長する例である。サケ科の種類では、若い雄と雌は大体同じ速さで成長するが、雄は後に望ましくない特徴を現わす。成熟中、雄は成長を止め、色があぜ、攻撃的になり、食料としての価値もスポーツとしての価値も極めて低くなる。また成熟しつつある雄の養殖ニジマス及びタイセイヨウサケの種類は、ひとたび海水養殖に入れれば、塩水への必要な調製ができずに死ぬ。性転換させてすべてが雌である集団を得る方法が適用されるが、それは魚の飼料へのホルモンの混入を含むので、それらの魚は食卓用の食品としては不適当になる。

照射、化学的不妊化及びホルモン投与のような、魚の繁殖性を調節する為の他のアプローチは、これまで、食卓用に予定されている魚に使用するには信頼できないか又は経済的でない、又は不適当であることが証明されてきた。

性成熟を調節する免疫学的方法には、哺乳類ではいくつかの成功例が示されてきた。しかしながら哺乳類のホルモンの反応及び免疫学的反応の研究は、魚類生理学の研究の堅固な基盤を成し得ない。魚類は冷血動物であり、その免疫系は異なる情況下で変化する。温度は魚類の免疫応答に著しい効果を及ぼし、生理的範囲内で温度が高ければ高い程、免疫応答のレベルは高くなる。生理的温度内での低温は、抗体産生速度を遅＜Ｌ、Ｔ！、リンパ球が特に敏感になると考えられる、免疫記憶の確立を阻害するらしい。

さらに、魚類の免疫系は、季節ごとに変わるホルモンによって影響される。ホルモンの濃度は、魚を触ったり移したりすることからのストレス又は、低酸素濃度のような水質の悪さにより変化する。銀化及び性成熟の間は、ともにホルモンの変化の著しい期間であるが、魚類はリンパ球数の減少の為、病気にかかり易い。

さらに、哺乳類では５つの主要な種類の抗体が同定されているのに対して、魚類では単一のタイプの抗体分子、Ｉ　ｇＭＬか産生じない。

その上、魚類の内分泌系は、哺乳類の内分泌系とは本質的に異なる。例えば、魚類の性腺刺激ホルモン放出ホルモンは例えばサケ及びマスのようなサケ科の魚により産生され、ｐＧ　ｌ　ｕ−Ｈｉ　５−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｙ−ＮＨ２（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ　らによる、　１９８３；　”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｔｅｌｅｏｓｔ　ＧｎＲＨ” 　、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８０：　２７９４−２７９８）の配列を有し、哺乳類のＬＨＲＨと比較すると７及び８位が異なる。

本発明者らは今、魚類のＧｎＲＨの類似体の一種を見出だしたが、それは適当なキャリヤー分子に結合させることができ、それを用いて魚を免疫し、免疫原に対して誘発された抗体が、内在するＧｎＲＨと高い親和性をもって交叉反応し、中和するようにすることができる。本発明の１つの面によれば、本発明者らは、ｐＧ　ｌ　ｕ−Ｈｉ　５−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｔｙ　ｒ−１−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇ　１　ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｚし式中、ＷはＧｌｙ又はＤ−アミノ酸を表わし、Ｘは結合又は、同じか又は異なる１つ以上のアミノ酸を表わし、ＹはＣｙｓ又はＴｙｒ又は何もないことを表わし、そして２は何もないか又は１つ以上の、同じか又は異なるアミノ酸を表わすか又は、連続性又は不連続性のペプチド鎖であり、その不連続性又は各々の不連続性は、非αアミノ酸である多官能リンカ一部分であるか又は、ＷがＧＩＹであり、Ｘ及びＹがなく、２があるという条件でレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ　）なアミノ酸であるコのアミノ酸配列を有する、魚類のＧｎＲＨ類似体を提供する。

好ましくは、Ｗの位置の残基はＧｌｙで、それは天然に存在する残基であり、Ｙの位置の残基はＣｙｓが好都合で、それはキャリヤータンパク質に対して、Ｃ末端のチロシンを用いて得られるよりも更に特異的かつ都合のよい結合を提供するからである。

Ｘは、比較的少数の残基、例えば１から１５個が好ましいが、１から８個が好ましく、１から３個は、より好ましく、１個だけが最も好ましい。Ｘの位置には、１つ以上のいかなるアミノ酸も存在してよいが、Ｇｕｙが最も好ましいアミノ酸残基である。もちろん、好ましくはＡｌａ　。

Ｓｅｔ　、＾ｓｎ及びＶａｌのように小さな側鎖をもつ他のアミノ酸も、Ｘの位置に存在することが可能であり、この位置のいかなるアミノ酸残基も、本発明の範囲に含まれる。

さらに注意すべきことは、Ｘの位置に１つより多くの残基が含まれる場合には、例えば、ｐＧ　１　ｕ−Ｈｉ　５−Ｔｒｐ−３ｅ　ｒ−Ｔｙｒ−１−Ｔｒ　ｐ−Ｌｅｕ− Ａ　ｒｇ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１　ｙ−Ｇ　１　ｙ−＾１ａ−Ｙ−Ｚのようにその残基は同じでも異なってもよいことである。

Ｘの位置にアミノ酸残基のないｐＧｎＲＨも、本発明の範囲に含まれることが理解されるべきである。

本発明によるｐＧｎＲＨの好ましい態様においては、２の位置にはアミノ酸残基がなく、本発明による類似体の特に好ましい態様は、以下の配列、ｐＧ　Ｉｕ−［５−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｔｙ　ｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅ　ｕ −Ａ　ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１　ｙ−Ｃｙｓを有する。

しかしながら本発明者らの研究は、２の位置に付加的なアミノ酸を含むことは一般に、分子の残りの部分の立体配座上の選択に、何ら有意な効果を及ぼさないことを示してきた。もし、かかる２での伸長が含まれているとすれば、本発明の好ましい態様においては、その伸長は、Ｔ細胞エピトープとして作用する能力を有する１つ以上のタンパク質配列のセグメントを含む。例えば、一般式１、−２− ３−４というアミノ酸配列のセグメントで、１はＧｌｙ又は荷電アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ　５Ｈｉｓ　ＳＡｒｇ　、　Ａｓｐ　）又はＧＬｕ　）であり、２は疎水性アミノ酸（例えば、Ｉｌｅ　。

Ｌｅｕ　、　Ｖａｌ　ＳＭｅｔ　５Ｔｙｒ　５Ｐｈｅ　、　Ｔｒｐ　、＾ｌａ　）であり、３は疎水性アミノ酸（先きに定義したような）、又は荷電されていない極性アミノ酸（例えば、Ａｓｎ　５Ｓｅｒ　。

Ｔｈｒ　、　Ｐｒｏ　、　Ｇｉｎ　、　Ｇｌｙ　）であり、４は極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ　、　Ａｒｇ　、、Ｈｉｓ　、　Ｇｌｕ　、Ａｓｐ　、　Ａｓｎ　、　Ｇｌｎ　。

Ｓｅｒ　、　Ｔｈｒ　、　Ｐｒｏ　）であるセグメントは、少なくともいくつかの例では、Ｔ細胞エピトープとして働くようである（Ｒｏｔｈｂａｒｄ、　Ｊ、Ｂ、及びＴａｙｌｏｒ、　Ｗ、Ｒ，（１９８８年）＾５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｉｒｉ　ｃｏｍｍｏｎ　ｔｏ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　。

Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　７（１）：９３−１００　）　。同様に、１ ’　−２’−３°−４“−５“という配列で、１°は先に定義したように１と同等であり、２゛は２と、３”及び４゛は３と、５゛は４と同等であるセグメントが可能である（前記文献）。どちらの形も次のような一般形に含まれるが、式、ｐＧ　Ｉｕ−Ｈｉ　ｓ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｗ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ｘ−Ｙ−８−Ｔ−３’ ［式中、Ｔは、先の段落で定義したタイプか、又は他の構造を有し、いろいろな長さ又は組成のスペーサーセグメントによって分断されている１つ以上のＴ細胞エピトープ（好ましくは５つより少ない）を含んでいるペプチド配列のセグメントを表わしており、Ｓ及びＳｏ　は（いずれか一方は、任意にかつ独立に省略してもよい）、いろいろな長さ及び組成のアミノ酸配列から成るスペーサーセグメントを表わすコのような一般形に含まれる。好ましくは、Ｓは長さではアミノ酸残基５つより少なく、例えば、Ｇｌｙ　５Ａｌａ　５Ｐｒｏ　、　Ａｓｎ　、　Ｔｈｒ　５Ｓｅｒ又は、非αアミノ酸のような多官能リンカ−から選んだ残基を含む。Ｓｏは、好ましくは１０より少ないアミノ酸残基であり、非αアミノ酸のような多官能リンカ−を含む。Ｓｏの部分は好ましくは、上記のＳに与えたものと同じ群から得る。Ｓｏは完全なタンパク質を表わすことも可能であり、従ってキャリヤータンパク質への結合の必要性を取り除く。

Ｚがない場合には、上記のＴ細胞エピトープがＸの位置に与えられることは注目すべきことである。

さらに本発明の範囲に含まれるものは、基本的な類似体で、Ｚが「レトロインベルソ」なアミノ酸、すなわちアミノ酸に相当する官能基を有する三官能アミンであるか又は、それを含んでいる類似体の誘導体である。例えば、本発明による類似体で、レトロインベルソなアミノ酸を含んでいる類似体は次の式、Ａｌ−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ａ２ＨＨＨ［式中、Ｒはいずれかの官能基であるが、好ましくはＧｌｙであり、Ａ１及びＡ２は好ましくは、それぞれここに定義した誘導体の１つのコピーであり（必ずしも同じである必要はない）、Ｃ末端で結合しているコを有し得る。特に好ましい態様においては、Ａ１又はＡ２のいずれか一方のＹの位置のＴｙｒ又はＣｙｓが、もう一方のコピーの、相当する位置の残基以外のタイプのアミノ酸で置換されているか、又は二者択一的に省略されてもよい。従って、この二量体の結合は、Ｙの位置の残基のどちらか（任意に両方）の側鎖を介してなされる。二者択一的に、Ａ１及び（又は）Ａ２は天然のｐＧｎＲＨでよく、レトロインベルソなアミノ酸のＲはＣｙｓ又はＴｙｒでよい。

先に論じたように、Ｔ細胞エピトープはセグメント２の中に任意に含むことができる。

類似体は式、Ａ、−Ｂ−Ａ。

［式中、Ｂはレトロインベルソなアミノ酸であり、ＡＩ及びＡ２は同じか又は異なり、以下の配列、ｐＧ　ｌ　ｕ−Ｈｉ　ｓ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｗ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｘ−Ｙ−２゜（式中、Ｗ、Ｘ、及びＹは先きに定義した通りであり、Ｚｏ　はレトロインベルソなアミノ酸を含まないこと以外は先に定義した２と同じである）を有する。

ペプチドのレトロインベルソな修飾は、１つ以上のペプチド結合の反転を含み、もとの分子よりも酵素分解に対してより抵抗性のある類似体を生じ、大きな免疫原に対する媒体の為の高濃度のエピトープを含む、分枝の免疫原の生成への便利な道を提供する。これらの化合物を、生物学的に活性がある短鎖のペプチドのレトロインベルソ類似体の、大量の溶液合成に用いることは大きな可能本発明のもう一つの面は、アミノ酸配列、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｗ −Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、ＷはＧｌｙ又はＤ−アミノ酸を表わし、Ｘは結合を表わすか又は、１つ以上の、同じか異なるアミノ酸を表わし、ＹはＣｙｓ又はＴｒｙ又は、何もないことを表わし、２は何もないか又は１つ以上の、同じか異なるアミノ酸を表わすか又は、連続性又は不連続性のペプチド鎖であり、その不連続性又は各々の不連続性は、非αアミノ酸である多官能リンカ一部分であるか又は、ＷがＧｌｙであり、Ｘ及びＹがなく、Ｚがあるという条件でレトロインベルソなアミノ酸である）を有する、魚類のＧｎＲＨ類似体を製造する方法で、公知の化学的技法又は生物学的技法及び／又は組換え技術を用いた残基のカップリングの工程と、類似体の単離の工程とを含む方法を提供することである。

本発明による類似体は、標準的なペプチド合成法により合成することができる。

例えば１９６３年にｌ［ｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより紹介された固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）（Ｊ。

＾ｔｒｒ、　Ｃｈｅｃ、　Ｓｏｃ、　８５．２１４９）を使用することができる。

この方法では、成長しつつあるペプチド鎖を、Ｃ末端を介して不溶性の固体の支持体に共有結合で結合させる。

合成は、アミノ酸を希望する配列に、逐次的に加えていくことにより行なう。反応及び分解の副成物のほとんどは反応混合物中に溶解するので、溶液中での合成に必須である精製のすべての中間段階は、この場合には単なる洗浄に省略した。

５ｐｐｓの利点は、スピードと、相対的な履行の容易さと、その方法の一部又は全部の自動操作が可能であることである。５ｐｐｓの使用で、数十グラムのペプチドを産生ずることができる。

５ｐｐｓは、１９６３年にｌ１ｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより開発されたように、４つの段階から成るものとして簡単に述べることができる。

（Ａ）一番目の、保護されたアミノ酸を、固体の支持体に共有結合で結合させ、合成を通して安定に残るようにする、（Ｂ）結合した残基の遊離のアミノ基を、側鎖のいかなる官能基の保護グループも安定である条件下で保護を解くことによって、再生する、（Ｃ）二番目の保護されたアミノ酸を、縮合により最初のアミノ酸と結合させ、アミド結合の形成をする。

ＢとＣの段階は、合成が完了するまで繰り返す、（Ｄ）合成の最後に、ペプチドを固体の支持体からはずし、いかなるアミノ酸側鎖の保護グループも除去する。

相当な数の、アミノ酸保護基の組み合わせが文献に記述されてきた。しかしながら、現在は、それらの組み合わせのうちの２つだけが一般に使われている。第一は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）とベンジルの組み合わせで、１９６３年以来１１ｅｒｒｉｆｉｅｌｄが用いており、今でも広く使用されている。より最近では、５ｈｅｐｐａｒｄらの開発したフルオレニルメトキシカルボニル（１” ｍｏｃ）と１−ブチル系がますます広く応用されるようになってきた（Ｓｈｅｐｐａｒｄ、　ＲＣ、１９８６年、５ｃｉｅｎｃｅ　Ｔｏｏｌｓ、Ｔｈｅ　ＬＫＢＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　３３．９）。それ以外の例は、Ａｒ５ａｄｙ、Ｒ，らにより開発された固相樹脂を用いるＦｍｏ　ｃ−ポリアミド法（Ｊ、Ｃｈｅｔｎ、Ｓｏｃ、ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ、　１９８１年、１巻、５２９−５３７頁）及び、組み込まれた個々のアミノ酸のフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏ　ｃ）保護法（Ａｔｈｅｒｔｏｎ、　Ｅ、らによる、Ｊ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、　、１９８３　Ｌ　６５− ７３）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏ　ｃ）化学（例えば、Ａｒｔｈｅｒｔｏｎ、　Ｅ、らによる（１９８５年）　Ｊ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ。

Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍ、　１６５を参照）を含む。

さらに本発明の範囲内に含まれるものは、遺伝コードを介してここに述べた、いかなるペプチド類似体の配列もコードしているＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子である。かかるＤＮＡ分子は、適当な微生物又は真核生物の細胞培養物を用いた発現系に用いて、ここに述べた類似体を産生させることができる。同じような分子が、かかる発現系において合成されており、文献に述べられている（例えば、欧州特許出願筒８５３０７３１１．２号参照）。

かかる系を用いた場合、レトロインベルソなアミノ酸誘導体を組み込んでいる類似体を直接つくることはできないことは注目すべきである。しかしながら、基本的な類似体は作ることができ、次に精製し、標準的なペプチド／有機化学を用いてレトロインベルソなアミノ酸に化学的に結合させることができる。最近、レトロインベルソなペプチドの、ポリアミドタイプの樹脂上での固相合成法の為の実用的かつ便利な新規な方法が、記述されている［Ｇａｚｅｒｒｏ、　Ｈ，、Ｐｉｎｏｒｉ、　Ｍ、及びＶｅｒｄｉｎｉ、　Ａ、Ｓ。

（１９９０年）、Ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ　ｐｅｐｔｉｄｅｓＳ”Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　５ｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｒｏｇｅｒ　Ｅｐｔｏｎ　１ｉＳＳＰＣＣ（ＵＫ）　Ｌｔｄ、、英国、バーミンガム］。

好ましくは、類似体をキャリヤー分子に結合させ、類似体−結合体を得る。小さい分子又は大きい分子のいかなるキャリヤーも又は、微生物も用いることができるが、従来用いられてきたキャリヤーの中でも、スカシガイヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）　（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）　、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリガンマグロブリン（ＣＧＧ）　、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド（ＤＰＴ）、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）、コレラ毒素又はそのＢサブユニットが好ましい。ＰＰＤの場合には、ＢＣＧワクチンを用いたプライミングが有利であることに注目されたい（Ｌａｃｂｍａｎｎ。

Ｐらによる、１９８６年、”５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓＡｎｔｉｇｅｎｓ”　５Ｃｉｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　１１９．２５−４０頁）。

魚類の自己免疫化に際し、ＬＨＲＨ類似体のキャリヤーとして特に好ましいものは、次のような微生物又は高分子抗原であり、それらは魚のワクチンの成分である。

アエロモナスーサルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ　）（フルンケル症）、エルシニア拳ルケリー（Ｙｅｒｓｉｎｉａｒｕｃｋｅｒｉ）　（ＥＲＭ）　、及びビブリオ・アンギラリウム（Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉｌｌａｒｉｕｍ　）とビブリオ惨オルドリー（Ｖｉｂｒｉｏ　ｏｒｄａｌｉｉ）の混合物（ビブリオ病）。

最近、グラム陰性非運動性細菌であるアエロモナス・サルモニシダによって引き起こされるフルンケル症の防御のための５つの基本的なタイプのワクチン、すなわち全死滅細胞又は全粉砕細胞（細菌ワクチン）、細胞外生成物（Ｅ　ＣＰ）及びＥＣＰ　）キソイド、ＥＣＰと組み合わせた殺した全細胞、生きている弱毒化ワクチン及び精製した抗原が検査された。さらに、ある抗原に対して魚類又は哺乳類で生じた高度免疫血清が受動的な防御に使用された。さらに、グラム陰性運動性細菌であるエルシニア・ルケリーによって引き起こされる腸管レッドマウス病（ｅｎｔｅｒｉｅｒｅｄｉｏｕｔｈ）　（ＥＲＭ）に対して成功したワクチン（又は細菌ワクチン）が生産されており、ホルマリンで不活化した全細菌培養物を含む。北半球における今日の、商業用ビブリオ病ワクチンは最もありふれた種であるＶ、アンギラリウム及びＶ、オルドリーの混合物を含む。これらのワクチンは、全細胞及びＥＣＰの混合物を含んでいる単純な不活化した培養物である。

本発明の更なる面は、本発明によるｐＧｎＲＨ類似体又は類似体の結合体と、獣医学的に受け入れられる賦形剤とを含んでいるワクチンを提供する。

かかるワクチンは、魚類を自己免疫させる為に用いることができるので、本発明の更なる面は、魚類における性的発達を阻害する為の方法、すなわち、効果的な量のｐＧｎＲＨ類似体又は類似体結合体を、前記の魚類に投与して、内在性ｐＧｎＲＨの生物学的効果を有意に減少させるに十分な力価の抗ｐＧｎＲＨ抗体を作り出すことを含む方法を提供する。

Ｙの位置にＣｙｓ又はＴｙｒを含んでいる類似体の結合は、文献に詳しく述べられている試薬及び方法を用いて容易に作ることができる。例えば、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、Ｙの位置にＣｙｓ残基を含んでいる魚類のＧｎＲＨ類似体を、キャリヤータンパク質のリジン側鎖に、チオエーテル結合を介して結合させる為に用いることができ、一方Ｙの位置にＴｙｒ残基を含んでいる類似体の結合では、Ｎ−（４−ジアゾフェニル）−マレイミドとの間にジアゾ結合を形成することができる。

ペプチド及び結合体は、例えば高性能液体クロマトグラフィー、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーを含む、本技術分野で周知の方法を用いて、必要な度まで容易に精製することができる。

本発明によるペプチドキャリヤー結合体は、次の目的に使用することができる。

１）動物を免疫し、以下に特定した使用の為の抗魚類ＧｎＲＨ抗体を生じさせる為、２）魚類ＧｎＲＨに対して魚を自己免疫させ、性的発達を遅らせるか、停止させるか、又は退行させる為、生殖能力を調節するか、限定するか又は除去する為、ＧｎＲＨ依存性の魚類の腫瘍を治療する為、魚の生理学的、獣医学的研究をする為、３）たとえば、血清試料中の抗魚類Ｇ　ｎ、　ＲＨ抗体の存在を調べる為の診断薬として。

類似体に対して生じた抗魚類ＧｎＲＨ抗体も、本発明の一部を成す。それらはたとえば、次のように使うことができる。

１）魚類の生理学／免疫学を探求する為の研究手段として、２）抗イデイオタイプ抗体を生じさせる為の抗原として、３）受動免疫処理をして、性的発達を遅くするか、停止するか又は退行させる為、生殖能力の一時的な調節をする為、ＧｎＲＨ依存性の魚類の腫瘍を治療する為、その他の方法で魚類Ｇ　ｎ　ＲＨ活性を妨ぐ為（受動免疫処理は、魚類又は哺乳類で生じさせたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び単一ドメイン抗体の投与により行なう）、４）魚類ＧｎＲＨの、たとえば血清試料中の存在を調べる診断薬として。

上記２）で述べた抗イデイオタイプ抗体が、本発明の一部を成すことは明らかである。

本発明による合成ポリペプチドに特異的に結合する、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、かかる抗体のキメラ型、及び魚類型（ｐｉｓｃｉｎｉｓｅｄ　ｆｏｒｍｓ）の調製（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによる、（１９８４年）　ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）８１、６８５１．−６８５５頁；　Ｒｉｅｃｈｍａｎｎらによる（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ　３３２．３２３−３２７頁参照）、単一ドメイン抗体の調製（例えば、Ｗａｒｄ、　Ｅ、Ｓ、、Ｇｕｓｓｏｗ、　Ｄ、、ｒｉｆｆｆｔｈ、＾、Ｄ１、Ｊｏｎｅｓ、　Ｐ、及びＷｉｎｔｅｒ、　Ｇ、　（１９８９年）　Ｎａｔｕｒｅ　３４１．５４４−５４６頁）を、従来の方法で行ない、先に述べたように、かかる抗体は本発明の一部を成すと考えられる。

抗魚類ＧｎＲＨ抗体又は魚類ＧｎＲＨの検出に関しては、当業者は、本技術分野で公知の免疫検査法、中でもサンドイッチ分析法、競合及び非競合分析法及び、直接及び間接標識の使用などを承知しているであろう。好ましくは、抗魚類ＧｎＲＨ抗体を検出する為のキットは、本発明による類似体又は類似体結合物、標識手段及び固体の支持体を含む。

魚類ワクチンの投与には、いくつかの方法、たとえば注射、経口投与及び液浸がある。

腹膜腔内注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ　）は、予防接種の最も効果的な手段であり、さらに免疫応答の大きさを増すアジュバントの使用が可能である。不都合な点は、魚にストレスを引き起こす、麻酔及び取扱いを必要とすること及び、緊張する労働だということである。

しかしながら、連発式注射器及び生産ラインシステムを使用すれば、１時間あたり１０００匹の魚に注射することができる。しかしながら、１５ｇ未満の魚には用いることができない。

経口接種は、すべての大きさの魚に集団投与する為に適しており、取扱いによるストレスを負わせない。しかしながら、本質的な限界があり、それにより多量のワクチンが必要であり、経費が増し、個体ごとの投薬量の不確かさが増す。経口接種は有効性に乏しく、低いか又は矛盾した防御水準に終わる。はとんどの経口投与作業は、ビブリオ病のワクチンで行なわれてきた。

直接液浸（Ｄ、Ｉ、）は好ましく、ワクチンに数秒間さらすことのみを必要とする簡単で迅速な方法である。

この方法は、現在自動化され、ビブリオ病ワクチン並びにＥＲＭワクチン用に「バス」又は「フラッシュ」というような変法が開発されており、魚保持タンクに、ワクチンを注ぐだけでよい。この方法は、より多量のワクチンを消費し、さらす時間が長い為（約１時間）、水の酸素補給及び、魚のストレスに対する厳重な監視を含むが、注射はど緊張しない仕事である。

（ｉ）１種類より多いキャリヤー分子と結合している類似体及び／又は（ｉｉ）同一のキャリヤー分子に結合している１種類より多い類似体を含むカクテルで免疫する方法は有利である。さらに、いずれかのペプチド類似体、その結合体及び、それらのカクテルをいずれかの適当なアジュバント又はデリバリ−システムにより投与し、さらに１つより多いアジュバント又はデリバリ−システムを組み合わせ、いわゆる「スーパーカクテル」を形成することができる。好ましいアジュバント及びデリバリ−システムは、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）　、ミクロスフェア、リボゾーム、ミセル、ニオシーム（ｎｉｏｓｏｍｅ　）、ｌＳＣ０Ｍ５ＳＢｒａｕｎｓリポタンパク質及び魚類ワクチンの微生物の全細胞又は成分を含む。

ここに本発明を、制限しない実施例の方法で述べる。

実施例１本発明によるｐＧｎＲＨのカルボキシルが伸長された形を、標準的な固相Ｆｍｏ　ｃ方法論を用いて合成する。

トリフルオロ酢酸の存在下に、ペプチドを樹脂から切り離し、次にゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー及び逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製する。ペプチドを、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）により、種々のキャリヤーに結合させる。

ニワトリガンマグロブリン（ＣＧ　Ｇ）は、ニジマスでは、他のワクチンに良好なキャリヤーであることがすでに示されており、本実施例に使用する。ＰＰＤも、哺乳類の研究では、キャリヤーとして立証済みであるので使用する（ＢＣＧを用いてあらかじめ免疫することが必要だが）。ｐＧｎＲＨ類似体をキャリヤーに、ペプチド対タンパク質のモル比が３０〜４０：１になるように結合させ、３つの異なる濃度のものをニジマスの腹膜腔内に注射した。

続く血清抗体応答を、ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したモノクローナル抗ニジマスＩｇを用いた酵素免疫検定法（ＥＪ、ｌ５Ａ）により、週ごとに１０週にわたって検査する。本実施例のいくつかの検査では、抗ｐＧｎＲＨ抗体の産生の最適なプロトコールを決定する為、キャリヤーを用いた前免疫、又はアジュバントやブースターの注入を行なう。

実施例２実施例１で決定した最適プロトコールを用いて、成熟する潜在力のあるニジマスに一群を免疫した。抗体応答を、成長速度及び性ステロイド（たとえばテストステロン）の産生の検査と共に、実施例１と同様に検査する。

実験の最後に魚を殺し、性腺を取り出し、重さを測定し、成熟指数（ｇｏｎａｄｏｓｏｍａｔｉｃ　１ｎｄｅｘ　）　（Ｇ　Ｓ　Ｉ　）を決定する。次いで性腺を、後の光学顕微鏡による組織学的研究用に固定する。免疫した魚は、対照である未処理の魚より、有意に良好なＧＳＩを示す。

実施例３ツベルクリン精製タンパク質誘導体に結合させたサケ科の魚の性腺刺激ホルモン放出ホルモンの伸長類似体（５ＧｎＲＢａ−ＰＰＤ）を用いた成熟中のニジマスの免疫法。

方法ａ　）　５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−ＣｙｓのＰＰＤへの結合ツベルクリンＰ　Ｐ　Ｄ　［１，００８ｍｇ／ｍｌ＋フェノール防腐剤（Ｅｖａｎｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）を、ベンジオール化（ｂｅｎｚｙｏｌａｔｅｄ　）したセルロースチューブに入れ、０．９％ＮａＣｌに対して１２℃で一晩透析し、フェノールを除去した。次にポリエチレングリコール（ＰＧ２００００　）を用いてＰＰＤを１．５時間濃縮し、４．０３２ｍｇ／ｍｌとした。ＰＰＤ溶液（１０，０８ｍｇのＰＰＤを含む２．５ｍｌ　）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５．０４μｍ中の１．０８ｍｇのＮ−７−ｖレイミドブチリルオキシスクシンイミド（ＧＭＢＳ）と、室温で１時間混合し、次いでセファデックスカラムＧ−２５１ＰＤ−１０にかけ、３．５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ　Ａ　（０，０５１１Ｎａｔｌ　２ＰＯ４，０，１４１ＮａＣＩＳｐＢ７．０　）で溶出した。蒸留水に溶がし、次にＢｕｆｆｅｒ　Ａに溶かした、３ｍｇ／ｍｌの５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　４．６８７ｍ１（すなわち１４．０６１６ｍｇの５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　）を、−滴ずっＰＰＤに加えた。溶液を、室温で２時間、窒素の存在下に撹拌し、遊離なチオールの含有量をすべて査定した。

結合体をベンジオール化したセルロースチューブに入れ、蒸留水に対して１２℃ で一晩透析し、必要な時まで−２０℃で保存した。

ｂ）遊離チオールの分析結合体の遊離チオール含有量を、試薬５．５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を用いて、還元型グルタチオンを標準として測定した。Ｅｌ１ｍａｎ分析法の、段階的に下っていくマイクロタイタープレートの変形物を用いて、２　μｍ　（７）ＩＯＩＩＩＭＤＴＮＢと２５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ８）とを、５０．ｕｌｃ７）試料に加え、１０分後１１：４０５ｎｍ　（Ｄ吸収を測定した。

Ｃ）ニジマス及びその免疫処理管理成熟中のニジマス１３０匹（体長的３０ｃｍ）に、凍結焼き印（ｆｒｅｅｚｅ　ｂｒａｎｄｓ　）の種々の組み合わせを用いて、個々に標識をつけた。それぞれの魚の体長及び体重を記録し、６００μｌの血液試料を採り、前免疫血清抗体濃度を測定した。さらに、血清中のステロイド濃度を測定して魚の性を決定した。

魚を２つの群に分け、５ＧｎＲＢ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＰＤか又は生理食塩水のいずれかを、Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ完全アジュバント（ＦＣＡ）に加えたものを腹膜腔内に投与した。処理群及び対照群を雄と雌に分けた。雄は、周囲の明るさ及び温度の中に保持した。雌をさらに２群に分け、一方は周囲の明るさ及び温度（変動があるが、１４℃以下）に、もう一方は、周囲の明るさの中で、１４℃に保持した、後者の群の魚は、抗５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ抗体の力価に及ぼす温度の影響と、結果としての魚の成熟の差を査定する為に用いた。実験を通じて４週間ごとに、個々に標識した魚の体重を測り、体長を測り、採血した。血清は、抗５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ抗体についてはＥＬＩＳＡ法で（５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＢＳＡを用いて）分析し、ステロイドホルモンである１７−βエストラジオール及び／又は１１−ケトテストステロンについてはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）により分析した。

ｄ）ステロイド分析成熟中の魚の血清中の１７−βエストラジオール（Ｅ２）　、及び１１−ケトテストステロン（１１−１［Ｔ　）の濃度をラジオイムノアッセイ（放射性免疫検定）により測定した。この分析法では、放射活性標識ステロイドは限られた量のステロイド特異抗体と結合し、その相互作用は未標識のステロイドの添加により、部分的に阻害される。

ｅ）抗５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　ＥＬＩＳＡの最適化サケ科の魚のＧｎＲＨ −Ｇｌｙ−Ｃｙｓを、Ｅｌ、ＩＳＡに使用する為、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させた。

０、５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ　Ａ中のＢ　Ｓ　Ａ　１０ｏｇと、５　μＩ　ＤＭＦ中のＧＭＳ８１ｍｇとを化合させ、最終的に結合させて６、２４６ｍｇの５ＧｎＲｔｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓを得た。ＥＬ　Ｉ　ＳＡのチェ”７力−盤分析法は、成熟の実験における抗５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−ＣｙｓＥＬ　Ｉ　ＳＡ法に適した５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＢＳＡのコーティング濃度の選択を可能にした。

結果ｉ）抗５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ抗体の力価５ＧｎＲトＧｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＰＤで免疫してから（魚あたり２０μｇの５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓを、ＦＣＡに加え、腹膜腔内に注射）８週間後の抗５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ抗体価は、表１に示したように、対照群に比べて増加した（雌雄ともに）。

表１　抗５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ抗体の平均力価（ｌｏｇ２±５Ｅ）ｉｉ）成熟中のニジマス血清中の１７−β−エストラジオール濃度：　５ＧｎＲＨ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＰＤを用いた免疫処理の効果成熟中の雌のニジマスにおける１７−β−エストラジオールの血清中の濃度は、表２に示したように、免疫後４週までは処理群及び対照群ともに、同じ速度で増加し続けた。免疫後８週まで、対照群の１７−β−エストラジオール濃度は同じ速度で増加し続けた。しかしながら成熟中の雌の５ＧｎＲトＧｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＰＤ群は、免疫後８週では、成熟中の雌の対照よりも有意に低い１７−β−エストラジオール濃度を示した（ｐ＜０．０５：　を−検定）表２　成熟中のニジマス血清中の１７−β−エストラジオールの平均濃度（ｎｇ／ｍｌ　＋ＳＥ）及び、５ＧｎＲＨａ−ＰＰＤを用いた免疫処理の効果ｉｉｆ　）抗体価とステロイド濃度との相関関係成熟中のニジマスにおいて、５ＧｎＲ■−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＰＤで免疫した後の抗体価の上昇は、血清中の１７−β−エストラジオール濃度の有意に低い上昇と相互関係があることは明らかである。データは、雌のニジマスにおいて、ｐＧｎＲＢ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＰＰＤが性的成熟の開始の遅延に活性があることを示している。

、　、、　、　ＰＣＴ／ｉｓ　９２１０００４０国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｂ　８３１０−２Ｊ３３／６８　７０５５−２Ｊ／／　Ｃ１２Ｎ　１５／１６Ｃ１２Ｐ　２１１０２　ＺＮＡ　Ｃ８２１４−４Ｂ（７２）発明者　ロブラン、バリー英国　ニスケイ６・５エイエイ、チェシアー、マーブル・ブリッジ、タウン・ストリート２２　エイ、ジ・オールド・ペイカリ−Ｆ”　Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．アミノ酸配列、【配列があります】［式中、ＷはＧｌｙ又はＤ−アミノ酸を表わし、Ｘは結合又は、同じか又は異なる１つ以上のアミノ酸を表わし、ＹはＣｙｓ又はＴｙｒ又は何もないことを表わし、Ｚは何もないか又は１つ以上の、同じか又は異なるアミノ酸を表わすか、又は連続性又は不連続性のペプチド鎖であり、その不連続性又は各々の不連続性は、非α−アミノ酸多官能リンカー部分であるか又は、ＷがＧｌｙであり、ＸおよびＹがなく、Ｚがあるという条件でレトロインベルン（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）なアミノ酸である］を有する魚類のＧｎＲＨ類似体。
２．ＷがＧｌｙである請求項１に記載の類似体。
３．ＹがＣｙｓである、請求項１又は請求項２に記載の類似体。
４．Ｘが、１つ以上のグリシシ残基である、請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の類似体。
５．Ｘ又はＺが１つ以上のＴ細胞エピトープを含む、請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の類似体。
６．Ｚがレトロインベルンなアミノ酸から成る、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の類似体。
７．式、Ａ１−Ｂ−Ａ２［式中、Ｂはレトロインベルンなアミノ酸であり、Ａ１及びＡ２は同じか又は異なり、配列、【配列があります】（式中、Ｗ、Ｘ及びＹは請求項１に定義した通りであり、Ｚ′はレトロインベルソなアミノ酸を含まないことを除いて請求項１に定義したＺと同じである）を有する〕を有する、請求項６に記載の類似体。
８．配列、【配列があります】を有する、請求項１に記載の類似体。
９．キャリヤー分子に結合された、請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の類似体。
１０．請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の類似体又は請求項９に記載の類似体結合体を獣医学的に容認できる賦形剤とともに含むワクチン。
１１．請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の類似体又は請求項９に記載の類似体結合体、標識手段及び固体支持体を含む、試料中の抗−魚類ＧｎＲＨ抗体検査用キット。
１２．魚類の性的発達を遅くするか、停止させるか又は退行させるか又は魚類の生殖能力を制御する薬剤を製造するための、請求項１乃至９のいずれか１請求項に記載の類似体の使用。
１３．アミノ酸配列、【配列があります】［式中、ＷはＧｌｙ又はＤ−アミノ酸を表わし、Ｘは結合又は、同じか又は異なる１つ以上のアミノ酸を表わし、ＹはＣｙｓ又はＴｙｒ又は何もないことを表わし、Ｚは何もないか又は１つ以上の、同じか又は異なるアミノ酸を表わすか又は連続性又は不連続性のペプチド鎖であり、その不連続性又は各々の不連続性は、非α−アミノ酸多官能リンカー部分であるか又は、ＷがＧｌｙであり、Ｘ及びＹがなく、Ｚがあるという条件でレトロインベルン（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）なアミノ酸である］を有する魚類のＧｎＲＨ類似体の製造方法であり、それ自体、公知の化学的、生物学的及び／又は組換え技術を用いて残基をカップリングさせる工程及び、類似体を単離する工程を含む、方法。
１４．類似体が連続性のペプチド鎖である、請求項１乃至５のいずれか１請求項又は請求項８に記載の類似体をコードするＤＮＡ。
１５．請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の類似体に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメント。
１６．請求項１５に記載の抗体又は抗原結合フラグメント、標識手段及び固体支持体を含む、試料中の魚類ＧｎＲＨ検査用キット。
１７．魚類の性的発達を遅くするか、停止させるか又は退行させるか又は魚類の生殖能力を制御する薬剤を製造することにおける、請求項１５に記載の抗体又は抗原結合フラグメントの使用。
１８．請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の類似体又は請求項９に記載の類似体結合体で対象体を免疫すること及び生成された抗体又は抗体を生成する細胞を単離することを含む、請求項１５に記載の抗体又は抗原結合フラグメント製造する方法。
１９．請求項１５に記載の抗体又は抗原結合フラグメントに特異的である、抗イディオタイプ抗体。
２０．魚に有効量の、請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の類似体又は請求項９に記載の類似体結合体又は請求項１５に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを投与する工程を含む、性的な発達を遅くするか、停止させるか又は退行させるか又は、生殖能力を制御するか、制限するか又は除くために魚類のＧｎＲＨに対して魚を免疫化する方法。
２１．請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の類似体又は請求項９に記載の類似体結合体又は請求項１５に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含有する水に魚を含浸させる、請求項２０に記載の方法。
２２．請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の類似体又は請求項９に記載の類似体結合体又は請求項１５に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを経口的に投与させる、請求項２０に記載の方法。