PT99991A - Analogos da hormona de libertacao de gonadotropina piscea e vacinas e composicoes veterinarias que os contem e processo para a sua preparacao - Google Patents
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Description
Descrição referente ã patente de invenção de PROTEUS MOLECULAR DESIGN LIMITED, britânica, industri^ al e comercial, com sede em 48 Stockport Road, Marple, Cheshire SK6 6AB, Inglaterra,(inventores: Robert Vincente Fishleigh e Barry Robson, residentes na Inglaterra), para "ANALOGOS DA HORMONA DE LIBERTAÇÃO DE GONADOTROPINA PÍSCEA E VACINAS E COMPOSIÇÕES VETERINÁRIAS QUE OS CONTEM E PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO11.
DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se a análogos prolongados da hormona de peixe referida como hormona de li bertação da gonadotropina píscea (pGnRH) e por vezes chamada hormona libertadora de hormona luteinizante píscea (pLHRH). Em particular, refere-se a análogos de pGnRH formados por adição à extremidade C da sequência de ácidos aminados da pGnRH nativa de uma curta sequência de ácidos aminados compreendendo um resí duo de cisterna ou tirosina, de modo a que a conformação em solução não é substancialmente modificada, aos seus conjugados com polipeptídeos adequados para criar anticorpos anti-pGnRH e a métodos para imunisar peixes. A criação comercial de peixes é uma in- * dústria em rápido crescimento a nível mundial. A Europa Ociden- • tal, a América do Norte e do Sul, o Canadá e as costas do Orien 1 N. te são todos grandes produtores de peixe, notavelmente de salmão. Por exemplo, os E.U.A. produziram 185 000 toneladas de sal mão em 1989, enquanto o seu mercado de bagre se aproximou destes valores. A Noruega, por outro lado, o maior produtor de sa]. mão do Atlântico na Europa Ocidental, produziram 120 000 tonela das em 1989/90. Calcula-se que o mercado mundial de salmão crejs cera a uma média de 7,5% cada ano até ao fim do século e envolve rá um volume de negócios no valor de 2000 milhões de libras esterlinas por ano. Prevê-se o desenvolvimento comercial da perca e do rodovalho e, a longo prazo, do halibute e do bacalhau, enquanto presentemente a Europa é o maior produtor de goraz e de perca, sendo a carpa produzida por aquacultura tanto na Europa de Leste como na Ãfrica.
Em aquacultura ha uma grande necessidade de controlar a maturação sexual dos peixes para prevenir o seguinte: desvio do crescimento somático para as gônadas; perda de qualidade da carne; e aparecimento de características sexuais secundárias comercialmente indesejáveis. Isto é particularmente verdadeiro no caso dos salmonídeos, onde a maturação sexual dos alevins de salmão e dos salmões jovens precoces (normalmente es tádios imaturos de desenvolvimento) pode ter efeitos económicos graves ao suspender o crescimento do salmão num tamanho não comercial, e obrigando à colheita dos salmões jovens durante um período curto, desta forma reduzindo o seu valor comercial. Adi. cionalmente, há um desejo para inibir a fertilidade dos peixes de criação se eles se extraviarem dos viveiros e contribuírem para linhagens de genes naturais.
Existem problemas logísticos associados â colheita dos peixes sexualmente maduros. Estes peixes não podem ser vendidos e invariavelmente uma certa percentagem de pei xes tornam-se maduros antes dos outros, sendo que os machos têm predominantemente a tendência para a maturação precoce. A separação dos peixes sexualmente maduros dos peixes imaturos ê um processo dispendioso e demorado. Uma vez começada a maturação dos peixes, ela decorre mais ou menos ao mesmo tempo e ao mesmo ritmo, o que torna a colheita uma tarefa extremamente difícil. Segue-se que um método para controlar a maturação dos peixes por fases seria claramente um benefício. 2 0 peso ideal para se proceder â colheita do salmão, por exemplo, muitas vezes não é atingido devido à maturação precoce, obrigando a uma colheita sub-óptima dos peixes. 0 controlo da maturação evitaria colheitas sub-óptimas e permitiria uma optimização completa do tamanho.
Até agora a forma mais eficaz para asse gurar que a maturação sexual não ocorre era a criação de peixes estéreis. Apesar de numerosas tentativas experimentais esta té£ nica ainda não foi conseguido para populações com dimorfismo se xual. vários métodos têm sido usados para con trolar a maturação sexual em peixes incluindo a castração cirúr gica, triploidização e controlo do sexo (das quais as duas últi. mas são técnicas genéticas). Eoram feitas tentativas no passado para castrar peixes cirurgicamente mas foram abandonadas devido à grande despesa que implicavam e ao trauma que tais procedimen tos provocam nos peixes. A triploidia é um método que origina a presença de três conjuntos de cromossomas num indivíduo, o que induz a esterilidade nos peixes triplõides, tanto machos como fêmeas. No entanto, existem várias desvantagens associadas à triploidia. Em primeiro lugar, é um processo difícil e demorado que se arrasta durante um longo período. Os ovos para a triploi dia têm de ser de alta qualidade para sobreviver aos tratamentos necessários. Embora os peixes resultantes pareçam ser intei^ ramente viáveis, a taxa de sobrevivência inclui perdas de 15 a 20% em média, sendo o ritmo de crescimento dos peixes triplõides ligeiramente inferior aos dos peixes diplôides fora da época da desova. Durante a preparação para a desova existe uma grande diferença entre os triplõides machos e fêmeas, desenvolvendo os machos testículos quase normais e todas as caracterís-ticas sexuais secundárias associadas, enquanto os triplõides f£ meas não desenvolvem ovários significativos e têm uma aparência juvenil durante o tempo natural de desova. A aplicação com sucesso da triploidia induzida requer a combinação desta com uma técnica exclusiva das fêmeas, que não i comercialmente económica. São também desvantagens associadas aos triplõides o facto de estes não cresce 3 rem bem em competição com diplóides no mesmo tanque, e as fêmeas triplõides não tendem a mostrar qualquer superioridade no crescimento sobre fêmeas diplóides em maturação.
Os peixes são altamente dimórficos, isto é, podem mudar de macho para fêmea e vice-versa, e a mudança de sexo pode ser controlada. Um dos sexos é normalmente preferi vel para propósitos de criação, por exemplo do ponto de vista da velocidade de crescimento. 0 rodovalho e a enguia são exemplos de peixes em que as fêmeas crescem até tamanhos muito supe riores aos dos machos. Nas espécies salmonídeas os machos e as fêmeas juvenis crescem mais ou menos à mesma velocidade, mas os machos desenvolvem mais tarde características indesejáveis. Na maturação, os machos param de crescer, perdem a cor, tornam-se agressivos e são de fraco valor, seja para fins de alimentação ou desportivos. Igualmente, os machos em maturação da truta arco-íris de criação e das espécies de salmão do Atlântico, uma vez colocados numa cultura de água do mar, não conseguem efec-tuar os ajustamentos necessários â água salgada e morrem. Um mé todo de mudança de sexo para obter populações exclusivamente compostas de fêmeas pode ser aplicado, mas envolve a incorporação de hormonas na alimentação dos peixes, tornando estes peixes inadequados para comida. Outros métodos para controlar a fertilidade dos peixes, tais como irradiação, quimioesteriliza-ção e administração de hormonas, têm-se mostrado até agora pouco seguros e economicamente desvantajosos ou inadequados para uso em peixes destinados â mesa. Métodos imunológicos para controlar a maturação sexual têm apresentado alguns sucessos em mamíferos. No entanto, os estudos das respostas hormonais e imunolõgicas de mamíferos não podem formar uma base firme para a investigação da fisiologia píscea. Os peixes são animais de sangue frio e o seu sistema imunitário varia sob diferentes condições. A temperatura tem um efeito marcado nas respostas imunitárias nos peixes, sendo que quanto mais alta é a temperatura dentro da ga ma fisiológica, mais alto é o nível da resposta imunológica. Temperaturas fisiologicamente baixas retardam a taxa de produção de anticorpos e podem inibir o estabelecimento da memória imunológica, onde os linfõcitos T parecem ser particularmente 4
sensíveis.
Para além disso, o sistema imunitário dos peixes é influenciado por hormonas que podem variar sazona_l mente. Os níveis de hormonas são modificados pelo stress implicado pelo manuseamento e transferência dos peixes, ou por fraca qualidade da água, como no caso. de um baixo conteúdo em oxigénio. Durante a transformação fisiológica do salmão que acompanha naturalmente a sua primeira descida ao mar e a maturação sexual, dois períodos de profundas mudanças hormonais, os peixes são mais vulneráveis às doenças, devido a uma redução no nú mero de linfócitos.
Adicionalmente, os peixes apenas produzem um tipo de moléculas de anticorpo, IgM, enquanto nos mamífe ros foram já identificadas cinco classes principais de anticorpos.
Igualmente, o sistema endócrino dos pej. xes é substancialmente diferente do dos mamíferos. Por exemplo a hormona libertadora da gonadotropina, que é produzida por sa]. monídeos, tais como o salmão e a truta por exemplo, tem a sequência: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro--Gly-NH2 (Sherwood et al, 1983; "Characterisation of a teleost GnRH", PNAS USA 80; 2794-2798) que difere nas posições 7 e 8 quando comparada com a LHRH de mamífero.
Descobrimos agora uma classe de análogos de GnRH píscea que pode ser conjugada com uma molécula portadora adequada e usada para imunizar peixes de tal forma que os anticorpos surgidos contra o imunogênio reagem entre si com alta afinidade e neutralisam a GnRH endógena.
De acordo com um aspecto da presente in venção, é proporcionado um análogo da GnRH píscea com a seguinte sequência de ácidos aminados: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro--Gly-X-Y-Z em que W representa Gly ou um ácido aminado D, X representa uma ligação, ou um ou mais ácidos aminados que podem ser iguais ou diferentes, Y representa Cys ou Tyr ou está ausente, • e 5 ϊ »
Ζ está ausente ou representa um ou mais ácidos aminados que podem ser iguais ou diferentes ou uma cadeia peptídica contínua ou descontínua, sendo a ou cada descon-tinuidade uma porção ligante polifuncional de um ácido aminado não pC ou de um ácido aminado retro-inverso com a condição de que quando W é Gly e X e Y estão ausentes Z está presente.
De preferência, o resíduo na posição W é Gly, que é o resíduo que ocorre naturalmente, e o resíduo que maior vantagem oferece na posição Y é Cys, porque proporciona uma conjugação mais específica e conveniente com uma proteína portadora que pode ser obtida com um Tyr C-terminal.
De preferência X representa um número relativamente pequeno de resíduos, por exemplo um a quinze, de preferência, ura a oito, de modo especialmente preferido um a três e de modo ainda mais especialmente preferido apenas um. Apesar de poder estar presentes na posição X qualquer ácido ami nado ou vários ácidos aminados, Gly é o resíduo de ácido aminado preferido. Naturalmente, outros ácidos aminados, de preferên cia com pequenas cadeias laterais tais como Ala, Ser, Asn e Vai, podem estar presentes na posição X e qualquer resíduo de ácido aminado nesta posição está incluído dentro do âmbito da presente invenção. Deve-se também notar que quando mais do que um resíduo está incluído na posição X, os resíduos podem ser iguais ou diferentes, tal como por exemplo: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Ala-Y-Z.
Deve ficar claro que as pGnRH nas quais nenhum resíduo de ácido aminado ocorre na posição X estão incluídas dentro do âmbito da presente invenção.
Em formas de. concretização preferidas da pGnRH de acordo com a presente invenção, não existe nenhum resíduo de ácido aminado na posição Z e uma forma de concretiza ção particularmente preferida do análogo de acordo com a presen te invenção tem a seguinte sequência: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys.
No entanto, os nossos estudos mostraram que a inclusão de ácidos aminados adicionais na posição Z não \ vai ter de uma maneira geral efeitos significativos nas prefe-rências de conformação da parte restante da molécula. Se uma 6
tal extensão em Z for incluída, então em formas de concretização preferidas da presente invenção, a extensão irá incluir um ou mais segmentos de sequência de proteína com a capacidade de actuar como um epítopo de célula T. Por exemplo, segmentos de sequência de ácidos aminados da fórmula geral 1-2-3-4, em que 1 é Gly ou um ácido aminado carregado (por exemplo Lys, His, Arg, Asp ou Glu), 2 é um ácido aminado hidrófobo (por exemplo Ile, Leu, Vai, Met, Tyr, Phe, Trp, Ala), 3 pode ser ou um ácido aminado hidrófobo (conforme definido acima) ou um ácido aminado po lar não carregado (por exemplo Asn, Ser, Thr, Pro, Gin, Gly) e 4 i um ácido aminado polar (por exemplo Lys, Arg, His, Glu, Asp, Asn, Gin, Ser, Thr, Pro), parecem actuar como epítopos de células T pelo menos nalguns casos (Rothbard, J.B. & Taylor, W.R. (1988). Um padrão de sequências em comum com os epítopos de células T. The EMBO Journal 7(1): 93-100). De modo semelhante os segmentos podem apresentar a sequência 1'-2'-3'-4'-5', em que 1' é equivalente a 1 conforme definido anteriormente, 2' a 2, 3' e4' a3, e5' a4 (ibid). Ambas as formas estão incluídas numa forma geral conforme definido em baixo: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-S-T-S', em que T denota um segmento da sequência peptídica contendo um ou mais epítopos de células T (de pre ferincia menos do que cinco) que podem ser do tipo definido no parágrafo anterior ou podem ser de outra estrutura e que podem ser separados por segmentos espaçadores de qualquer comprimento e qualquer composição, e S e S' (podendo qualquer dos quais ser opcionalmente e independentemente omitido) representam segmentos espaçadores de sequência de ácidos aminados de qualquer com primento e qualquer composição. De preferência, S compreende me nos do que cinco resíduos de ácidos aminados em comprimento e compreende por exemplo resíduos seleccionados de entre Gly, Ala, Pro, Asn, Thr, Ser ou ligantes polifuncionais tais como ácidos aminados não oC. S' é de preferência menos do que dez resíduos de ácidos aminados e pode incluir, ligantes polifuncionais tais como ácidos aminados não eC. As porções de S" são de preferência retiradas do grupo definido anteriormente para S. É possí-] vel que S' represente uma proteína completa, obviando deste mo-' do a necessidade de conjugação com uma proteína portadora. 7
Deve-se notar que quando Z está ausente, os epítopos de células T supramencionados podem ocorrer na posi. ção X.
Estão também incluídos dentro do âmbito da presente invenção derivados do análogo básico no qual Z ê ou inclui um ácido aminado "retro-inverso", por exemplo uma amina bifuncional possuindo um grupo funcional correspondente a um ácido aminado. Por exemplo um análogo de acordo com a presente invenção e contendo um ácido aminado retro-inverso pode ter a fórmula:
R
I A1-N-C-N-A2
I I I
Η Η H em que R é qualquer grupo funcional, de preferência Gly, e AI e A2 são de preferência cada um uma cópia de um dos análogos aqui definidos (mas não necessariamente iguais) ligados pela sua extremidade C-terminal. Em formas de concretização particularmente preferidas,, o Tyr ou Cys na posição Y em AI ou A2 devem ser substituídos por qualquer tipo de ácido aminado que não seja o resíduo na posição correspondente da outra cópia, ou alternativamente pode ser omitido. A conjuga ção deste dímero é assim efectuada através da cadeia lateral de um ou de outro (e opcionalmente de ambos) dos resíduos na posição Y. Alternativamente, AI e/ou A2 podem ser pGnRH natural e o R do ácido aminado retro-inverso pode ser Cys ou Tyr. Os epítopos da célula T podem opcionalmente ser incluídos no segmento Z conforme discutido anteriormente.
Os análogos podem ter a fórmula: A1 - B " A2 em que B é um ácido aminado retro-inverso e e são iguais ou diferentes e têm a sequência: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z1 em que W, X e Y possuem os significados anteriormente definidos e Z' possui o significado anteriormente definido para Z com a excepção de que não inclui um ácido aminado retro-inverso. • A modificação retro-inversa de peptídeos 8
envolve a inversão de uma ou mais ligações peptídicas para criar análogos mais resistentes do que a molécula original â degradação enzimática e proporciona uma via conveniente para a geração de imunogénios ramificados que contêm uma alta concentração de epítopos para um imunogénio de dimensão média a grande. A utili zação destes compostos em síntese em solução em grande escala de análogos retro-inversos de peptídeos biologicamente activos de cadeia curta possui grandes potencialidades.
Outro aspecto da presente invenção proporciona um processo para a preparação de um análogo de GnRH píscea com a seguinte sequência de ácidos aminados: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-
-Gly-X-Y-Z em que W representa Gly ou um ácido aminado D, X representa uma ligação, ou um ou mais ácidos aminados que podem ser iguais ou diferentes, Y representa Cys ou Tyr ou está ausente, e Z está ausente ou representa um ou mais ácidos aminados que podem ser iguais ou diferentes ou uma cadeia peptídica contínua ou descontínua, sendo a ou cada descontinui-dade uma porção ligante polifuncional de ácido aminado não << ou um ácido aminado retro-inverso com a condição de que quando W é Gly e X e Y estão ausentes Z está presente, compreendendo o pro cesso as etapas de acoplamento dos resíduos usando técnicas quí micas, biológicas e/ou recombinantes conhecidas per se e isolamento do análogo.
Os análogos de acordo com a presente in venção podem ser sintetizados por técnicas de síntese peptídica correntes. Pode por exemplo ser usada a síntese peptídica em fa se sólida (SPFS) introduzida por Merrifield em 1963 (J. Am.
Chem. Soc. 85, 2149). Neste método, liga-se de forma covalente uma cadeia peptídica que se pretende prolongar através da sua extremidade C a um suporte sólido insolúvel. A síntese é levada a cabo pela adição sucessiva de ácidos aminados na sequência de sejada. Todas as etapas intermediárias de purificação, que são necessárias para a síntese na solução, são reduzidas neste caso a simples lavagens, uma vez que a maior parte dos produtos secur. 9
dários de reacção e de degradação se encontram dissolvidos na mistura de reacção. As vantagens da SPPS são a velocidade, a re lativa facilidade de implementação e o facto de ser um método que pode ser parcialmente ou completamente automatizado. Ê possível produzir várias dezenas de gramas de peptídeo usando SPPS, A SPFS, de acordo com o seu desenvolvimento por Merrifield em 1963, pode ser brevemente descrita como compreendendo quatro fases: (A) Um primeiro ácido, aminado protegido é ligado ao suporte só lido por uma ligação covalente que permanece estável ao longo da síntese; (B) Um grupo amina livre do resíduo ligado é regenerado por desprotecção sob condições nas quais os grupos protectores de quaisquer grupos funcionais de cadeias laterais são estáveis; (C) 0 seguinte ácido aminado protegido é emparelhado com o pri meiro por condensação para dar origem à formação de uma ligação amida. Os passos B e C são repetidos até a síntese ficar comple ta; (D) No fim da síntese, o peptídeo é libertado do suporte sólido e todos os grupos protectores das cadeias laterais dos ácidos aminados são removidas. Têm sido descritas na literatura um número considerável de combinações de grupos protectores de ácidos aminados. No entanto, actualmente, só duas dessas combinações são correntemente usadas. A primeira é a combinação de terc-butoxicarbonilo (Boc)/benzilo que foi usada por Merrifield desde 1963 e que continua ainda a ser a mais geralmente utiliza da. Mais recentemente, o sistema fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) /terc-butilo, desenvolvido por Sheppard et al, tem registado um campo de aplicação cada vez mais vasto (Sheppard, R C, 1986. Science Tools. The LKB Instrument Journal 33, 9). Exemplos adicionais incluem o método de Pmoc-poliamida usando a resina de fase sólida desenvolvida por Arsady, R. et al (J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1981 1_, 529-537), protecção por fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) dos ácidos aminados incorporados (Atherton, E. et al, J. chem. Soc. Perkin Trans. 1983 L 65-73) e derivados de 9-fluorenil-metoxicarbonilo (Fmoc)(ver, por exemplo, Atherton, E et al (1985) J. Chem. Soc. Chem. Comm. 165). 10
Também se consideram incluídas dentro do âmbito desta invenção as moléculas de ADN e de ARN que codificam, através do código genético, para as sequências de quaisquer dos análogos peptídicos aqui descritos. Moléculas semelhan tes têm sido sintetizadas em sistemas idênticos e estão descritas na literatura (ver por exemplo Pedido de Patente Europeia NO. 85307311.2).
Deve notar-se que os análogos que incor poram derivados de ácidos aminados retro-inversos não podem ser preparados directamente usando um sistema como o referido. No entanto, os análogos básicos podem-no, e podem ser purificados e quimicamente ligados aos ácidos aminados retro-inversos usando química orgânica de peptídeos padrão. Um procedimento novo, prático e conveniente para a síntese em fase sólida em resina do tipo poliamida de peptídeos retro-inversos foi descrita recentemente [Gazerro, H., Pinori, M. & Verdini, A.S. (1990). Um novo procedimento geral para a síntese de fase sólida de peptídeos retro-inversos. In "Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis" Ed. Roger Epton. SPCC (UK) Ltd, Birmingham, Reino Unido].
De preferência, o análogo é conjugado com uma molécula portadora para proporcionar um conjugado do análogo. Qualquer portador de pequenas moléculas ou macro-molecular ou microorganismo pode ser usado, mas os seguintes são preferidos entre os portadores convencionais: hemocianina de Megathura crenulata (KLH), albumina de soro de bovino (BSA), ga maglobulina de galinha (CGG), toxóide do tétano (TT), toxõide da difteria (DPT), derivado de proteína purificada de tuberculi na (PPD), dipeptídeo de muramil (MDP), inibidor de tripsina de soja (STI), e toxina da cólera ou a sua subunidade B. Note-se que a iniciação com a vacina BCG pode ser vantajosa no caso da PPD (Lachmann, P. et al., 1986. In "Synthetic Peptides as Anti-gens", Ciba Foundation Symposium 119 pp. 25-40). São particularmente preferidos como por tadores para os análogos de LHRH aquando da autoimunização dos peixes os seguintes microorganismos ou seus antigénios macro-mo \ leculares que são componentes das vacinas para peixes: Aeromonas • salmonicida (furunculose), Yersinia ruckeri (ERM) e uma mistura 11 de Vibrio anquillarium e Vibrio ordalii (vibriose).
Recentemente/ foram ensaiados cinco tipos básicos de vacina para protecção contra a furunculose que é causada pelas bactérias não móveis Gram-negativas Aeromonas sal-monicida: células inteiras mortas ou desintegradas (bacterinas), produtos celulares extra (ECP) e toxóides de ECP, células intei ras mortas em combinação com EPC, vacinas vivas atenuadas e an-tigênios purificados. Para além disso, têm sido usados para pro tecção píscea soros hiperimunes, para certos antigénios, criados em peixes ou mamíferos. Igualmente, tem sido produzida uma vacina com sucesso (ou bacteriana) contra a "redmouth" entérica (ERM) causada pela bactéria móvel gram-negativa Yersinia. ruckeri que compreende culturas bacterianas completas inactivadas por formalina. As vacinas comerciais da vibriose correntes no hemis: fério norte contêm misturas das espécies mais comuns, V. anquillarium e V. ordalii. Estas vacinas são culturas inactivadas sim pies contendo misturas de células inteiras e ECP.
Um aspecto adicional da presente invenção proporciona uma vacina compreendendo um análogo ou um conju gado de um análogo da pGnRH, de acordo com a presente invenção, e um excipiente aceitável do ponto de vista veterinário.
Estas vacinas podem ser usadas para au-toimunizar os peixes, e um aspecto adicional da presente invenção proporciona um método para inibir o desenvolvimento sexual em peixes que compreende a administração de um análogo ou um conjugado de um análogo da pGnRH aos referidos peixes numa quan tidade eficaz para produzir um teor de anticorpos anti-pGnRH su ficiente para reduzir significativamente a eficácia biológica da pGnRH endógena. A conjugação de análogos contendo Cys ou Tyr na posição Y pode facilmente ser feita usando reagentes e procedimentos bem descritos na literatura. Por exemplo, a M-í -maleimidobutiriloxissuccinimida (Calbiochem) pode ser usada pa ra conjugar através de uma ligação de tioéter análogos de GnRH píscea contendo um resíduo de Cys na posição Y a cadeias laterais de lisina da proteína portadora, enquanto uma ligação de diazo pode ser formada com N-(4-diazofenil)-maleimida para a conjugação de análogos contendo um resíduo de Tyr na posição Y. 12
Os peptídeos e os conjugados podem rapi. damente ser purificados até ao grau necessário usando métodos bem conhecidos da técnica incluindo, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência, electroforese em gel de dodecil-sul fato de sõdio-poliacrilamida e cromatografia líquida de rápido desempenho. 0 conjugado portador de peptídeos de acordo com a presente invenção pode ser usado para o seguinte 1) Imunizar qualquer animal para desenvolver anticorpos anti--GnRH píscea para usos especificados em seguida; 2) Autoimunizar peixes contra a GnRH com o fim de: - tornar mais lento, suspender ou inverter o desenvolvimen to sexual - controlar, limitar ou eliminar a fertilidade - tratar tumores písceos dependentes da GnRH empreender investigações fisiolõgica/veterinárias písce-as; 3) Como agente de diagnóstico para a presença de anticorpos an ti-GnRH píscea em, por exemplo, amostras de soro.
Fazem também parte da presente invenção anticorpos anti-GnRH píscea desenvolvidos contra o análogo. Podem ser usados por exemplo 1) Como elementos de investigação para explorar a fisiologia/-imunologia píscea; 2) Como imunogénios para desenvolver anticorpos anti-idiótipo; 3) Para imunização passiva com o fim de: - alcançar retardamento, suspensão ou regressão efémeros no desenvolvimento sexual - realizar um controlo efémero de fertilidade - tratar tumores písceos dependentes da GnRH interferir por outras formas com a actividade da GnRH píscea (A imunização passiva pode ser efectua-da através de administração de anticorpos policlonais, monoclo-nais ou de domínio simples criados em espécies de peixes ou de mamíferos) e 4) Como agentes de diagnóstico para a presença de GnRH píscea em, por exemplo, amostras de soro. 13
É evidente que os anticorpos anti-idió tipo mencionados anteriormente em 2) são parte da presente invenção . A preparação de anticorpos policlonais ou monoclonais, de formas quiméricas e piscizadas de tais anticorpos (ver, por exemplo, Morrison et ai. (1984) PNAS (USA) 81, 6851-6855; Riechmann et al. (1988) Nature 332, 323-327) e de an ticorpos de domínio simples (ver, por exemplo, Ward, E.S., Gussow, D., Griffiths, A.D., Jones, P. e Winter, G. (1989) Natu re 341 544-546), que se ligam espeeificamente a um polipeptídeo sintético de acordo com a presente invenção, pode ser levada a cabo por meios convencionais e, conforme referido anteriormente, tais anticorpos são considerados como fazendo parte da presente invenção,
No que respeita â detecção de anticorpos anti-GnRH píscea ou de GnRH píscea, o especialista na matéria aperceber-se-á de uma variedade de técnicas de análise imu-nológica conhecidas da técnica, inter alia, análise de sanduíche, análises competitiva e não competitiva e o uso de marcação directa e indirecta. De preferência, um conjunto ("kit") para a detecção de anticorpos anti-GnRH píscea compreenderá um análogo ou um conjugado de um análogo de acordo com a presente invenção, meios para a marcação e um suporte sólido.
Existem vários métodos para a administração de vacinas a peixes: por exemplo por injecção, por via oral e por imersão. A injecção intraperitoneal é o método mais eficaz de vacinação e adicionalmente permite o uso de adju vantes que aumentam a magnitude da resposta imunológica. As des^ vantagens são a necessidade de anestesiar e manusear os peixes, o que causa stress e ocupa muita mão de obra. No entanto, usando seringas repetidoras e uma linha de produção em série, é poj> sível injectar 1000 peixes por hora. No entanto, não pode ser usado em peixes muito abaixo de 15 g. A vacinação oral é adequada para adminis tração em massa a peixes de todos os tamanhos e não implica | stress devido ao manuseamento. No entanto, existem limitações * intrínsecas por serem necessárias grandes quantidades de vaci- 14
nas, aumentando o custo e a incerteza quanto à dosagem individual. As vacinas orais têm fraca potência o que tem como resultado níveis de protecção baixos ou inconsistentes. Muito do tra balho de administração oral tem sido levado a cabo com vacinas para a vibriose. A Imersão Directa (I.D.), que é a técni ca preferida, ê simples e rápida necessitando apenas de alguns segundos de exposição à vacina. Este método está agora automati zado e foi desenvolvida uma modalidade de 'banho' ou 'jacto' pa ra as vacinas da vibriose e EMR, e implica simplesmente verter a vacina para tanques contentores. Apesar de este método consumir maior quantidade de vacina e necessitar de uma exposição mais longa (cerca de uma hora), que implica oxigenação da água e uma vigilância atenta dos peixes para evitar o stress, não ne cessita de tanta mão de obra como a injecção.
Pode ser vantajoso imunizar com uma mi£ tura contendo (i) um determinado conjugado de um análogo com mais do que um tipo de molécula portadora, e/ou (ii) mais do que um tipo de conjugados de análogos com a mesma molécula portadora. Para além disso, qualquer dos análogos peptídicos, os seus conjugados ou respectivas misturas podem ser administrados em qualquer adjuvante adequado ou sistema de administração, e mais do que um adjuvante ou sistema de administração podem ser combinados para formar uma denominada "super-mistura". Os adjuvantes e sistemas de administração preferidos incluem hidróxido de alumínio, microesferas, lipossomas, micélios, niossomas, ISCOMS, lipoproteína de Brauns e células completas ou componentes de vacinas de peixes microbianas. A presente invenção será agora descrita por meio de exemplos não restritivos. EXEMPLO 1
Uma forma prolongada na extremidade car boxi de pGnRH de acordo com a presente invenção é sintetizada usando metodologias Fmoc de fase sólida padrão. 0 peptídeo é * cindido a partir da resina na presença de ácido trifluoroacéti. • co e efectua-se a purificação subsequente por filtração de gel, 15
cromatografia de permuta iónica e cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa. 0 peptídeo é conjugado com uma variedade de portadores por MBS (éster de m-maleimida de benzoil--N-hidroxisuccinimida). Jã foi demonstrado que a gamaglobulina de galinha (CGG) é um bom portador na truta arco-íris para outras vacinas e é usada neste exemplo. Usa-se igualmente PPD uma vez que é um portador comprovado em estudos com mamíferos (apesar de ser necessária imunização prévia com BCG). 0 análogo de pGnRH é acoplado com o por tador numa razão molar de peptídeo:proteína de 30-40:1 e injec-tam-se tris concentrações diferentes intraperitonealmente na truta arco-íris. A resposta do anticorpo do soro resultante é monitorizada semanalmente durante 10 semanas por análise imunológica de enzimas (ELISA) usando Ig anti-truta monoclo-nal conjugada com Peroxidase de Rábano Bastardo (HRP). Nalguns testes neste exemplo são efectuadas preimunizações com portador ou por meio de adjuvantes ou injecções de reforço com o fim de determinar um protocolo óptimo para a produção de anticorpos an ti-pGnRH. EXEMPLO 2 O protocolo óptimo determinado no Exemplo 1 é usado para imunizar um grupo de trutas arco-íris potencialmente em maturação. A resposta do anticorpo é monitorizada como no Exemplo 1 juntamente com monitorização da velocidade de crescimento e da produção de esteróides sexuais (por exemplo testosterona). No fim da experiência os peixes são mortos, as gónadas removidas e pesadas para determinar o índice gonadossomático (GSI). As gónadas são então fixadas para posterior estudo histológico por microscopia õptica. Os peixes imunizados apresentam um GSI significativamente melhor que o de peixes de controlo não tratados. 16
Imunização da truta arco-íris em matura ção com o análogo prolongado da hormona dos salmonídeos liberta dora da gonadotropina acoplado com derivado de proteína purificado da tuberculina (sGnRHa-PPD).
Métodos a) Conjugação de sGnRH-Gly-Cys com PPD
Dialisou-se de um dia para o outro PPD de tuberculina (1,008 mg/ml + conservante de fenol, Evans Limited) em condutas de celulose benziolada contra NaCl a 0,9% ã temperatura de 12QC para remover o fenol. O PPD foi então concentrado a 4,032 mg/ml com polietileno-glicol (PG 20000) durante 1,5 horas. A solução de PPD (2,5 ml contendo 10,08 mg de PPD] foi misturada durante 1 hora à temperatura ambiente com 1,08 mg de N- -maleimidobutiriloxissuccinimida (GMBS) em 5,04 ul de di-metil-formamida (DMP) e em seguida foi aplicada a uma coluna de Sephadex G-25M PD-10 e foi eluída com 3,5 ml de Tampão A (Nai^PO^ 0,05 M, NaCl 0,14 M, pH 7,0). Adicionados ao PPD gota a gota 4,687 ml de sGnRH-Gly-Cys 3 mg/ml dissolvida em água dejs tilada e em seguida Tampão A (isto é 14,0616 mg de sGnRH-Gly--Cys). A solução foi misturada durante 2 horas à temperatura am biente sob nitrogénio e determinou-se de forma contínua o conteúdo em tiol livre. O conjugado foi dialisado de um dia para o outro contra água destilada em condutas de celulose benziolada a 12ec e em seguida armazenou-se a -20°C até ser necessário. b) Análise de Tiol Livre i O conteúdo em tiol livre do conjugado fc determinado usando o reagente 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitroben-zõico) (DTNB) e padrões de glutatião reduzido. Usou-se uma versão reduzida da análise de Ellman em placa de micro-titulação, na qual se adicionaram 2 ul de DTNB 10 mM e 250 ul de PBS (pH8) a 50 ul da amostra e se determinou a absorção a 405 nm após 10 * minutos. 17 c) Truta arco-íris e regime de imunização
Cento e trinta trutas arco-íris em matu ração (comprimento - 30 cm) foram marcadas individualmente usan do várias combinações de marcas de congelação. Anotou-se o comprimento e o peso de cada peixe e colheu-se uma amostra de sangue de 600 ul para determinar níveis de anticorpo de soro de preimunização. Para além disso, analisaram-se os níveis de este rõide do soro para determinar o sexo do peixe. Os peixes foram divididos em dois grupos e receberam sGnRH-Gly-Cys-PPD ou salina administrada intraperitonealmente em Adjuvante Completo de Freund (FCA). Os grupos tratados e de controlo foram divididos em machos e fêmeas. Os machos for.am mantidos à luz e temperatura ambientes. As fêmeas foram ainda subdivididas em dois grupos: um ã luz e temperatura ambientes (com variações mas a 14£C ou abaixo desta temperatura) e o outro â luz ambiente e a 14QC. Os peixes no último grupo foram usados para avaliar o efeito da temperatura nos títulos do anticorpo anti-sGnRH-Gly-Cys e quaiss quer diferenças resultantes na maturação dos peixes. Ao longo da experiência, em quatro intervalos semanais, pesaram-se, medi ram-se e sangraram-se os peixes marcados individualmente. Os so ros foram analisados para determinação do anticorpo Anti-sGnRH--Gly-Cys por ELISA (usando sGnRH-Gly-Cys-BSA) e das hormonas e£3 terõides 17-^-estradiol e/ou 11-cetotestosterona por RIA. d) Análise de esterõides
Determinaram-se as concentrações de 17--^-estradiol (E2) e de 11-eetotestosterona (11-CT) em soros de peixes em maturação por análises radioimunolõgicas. Nesta análi se um esteróide marcado por isótopos radioactivos liga-se a uma quantidade limitada de anticorpo específico do esteróide, e esta interacção é parcialmente inibida pela adição de esteróide não marcado. e) Optimização de análise por ELISA para determinação de anti--sGnRH-Gly-Cys
Conjugou-se GnRH-Gly-Cys de salmonídeo com Albumina de Soro de Bovino (BSA) para uso em análise por ELISA. Combinaram-se 10 mg de BSA em 0,5 ml de Tampão A mais 1 18 mg de GMBS em 5 ul de DMF e em seguida conjugaram-se com 6,246 mg de sGnRH-Gly-Cys. Análises de ELISA em tabuleiro de xadrez permitiram a escolha de uma concentração de revestimento de sGnRH-Gly-Cys-BSA adequada para a ELISA para a determinação de anti-sGnRH-Gly-Cys na experiência de maturação.
Resultados i) Títulos dos anticorpos anti-sGnRH-Gly-Cys
Os títulos dos anticorpos anti-sGnRH--Gly-Cys 8 semanas após a imunização com sGnRH-Gly-Cys-PPD (20 ug de sGnRH-Gly-Cys/peixe, i.p. em FCA) aumentaram em relação ao grupo de controlo conforme é evidenciado no Quadro 1 (machos e fêmeas).
Quadro 1: Títulos médios dos anticorpos anti-sGnRH-Gly-Cys (log2 + EP) 4 semanas após a imunização 8 semanas após a imunização Grupo de sGnRH-Gly- -Cys-PPD, n = 65 1,42 + 0,17 4,33 + 0,37 Grupo de controlo, n = 65 1,03 + 0,02 1,20 + 0,08 ii) Níveis de soro de 17-^-estradiol durante a maturação da
truta arco-íris: efeito da imunização com sGnRH-Gly-Cys-PPD
Os níveis de soro de 17-^-estradiol con tinuaram a aumentar na truta fêmea em maturação â mesma velocidade no grupo tratado e no grupo de controlo até 4 semanas após a imunização, conforme é mostrado no Quadro 2. 8 semanas após a· imunização, o nível de 17-^-estradiol no grupo de controlo conti nuava a aumentar à mesma velocidade. No entanto, o grupo de fêmeas em maturação com sGnRH-Gly-Cys-PPD tinha níveis de 17η^-βΕ5 tradiol significativamente mais baixos do que as fêmeas em matu ração de controlo (p <0,05:teste t) 8 semanas após a imunização 19 ι
Quadro 2: Níveis médios de soro de 17-0-estradiol (ng/ml + EP) durante a maturação da truta arco-íris e efeito da imunização com sGnRHa-PPD
Antes da imunização 4 semanas após a imunização 8 semanas após a imunização grupo de tratado 7,35 + 0,77 16,85 + 1,57 21,04 + 2,29 n = 26 n = 23 n = 23 GRupo de 5,85 + 0,39 16,36 + 1,33 28,38 + 2,61 controlo n = 23 n = 21 n = 18 iii) Correlação entre os títulos dos anticorpos e os níveis de esteróides.
Torna-se evidente que o incremento nos títulos dos anticorpos após a imunização com sGnRH-Gly-Cys-PPD tem uma correlação com um incremento significativamente mais re duzido nos níveis no soro de 17-^-estradiol em trutas arco-íris em maturação. Os dados mostram que o pGnRH-Gly-Cys-PPD possui uma actividade retardadora do começo da maturidade sexual na truta arco-íris fêmea. - 20 -
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES - 18 - Análogo de GnRH (hormona de libertação de gonadotropina piscea) caracterizado por possuir a sequência de ácidos aminados: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z em que W representa Gly ou um ácido aminado D, X representa uma ligação ou um ou vários ácidos amina dos que podem ser iguais ou diferentes, Y representa Cys ou Tyr ou está ausente, e Z está ausente ou representa um ou vários ácidos aminados que podem ser iguais ou diferentes ou uma cadeia peptídi-ca continua ou descontínua, sendo a descontinuidade ou cada de£ continuidade uma fracção ligante polifuncional não formada por ácidos aminados «C ou um ácido aminado retro-inverso com a condição de que quando W e Gly e X e Y estão ausentes Z está presen te. - 23 - Análogo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por W ser Gly. - 33 - Análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por Y ser Cys. - 43 - Análogo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por X ser um ou vários re síduos de glicina. 21 53 -- 55 - Análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por X ou Y conterem pelo menos um epítopo de uma célula T. - 65 - Análogo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por Z conter um ácido ami nado retro-inverso. - 7β - Análogo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ter a fórmula: <Αχ - b - a2 em que B é um ácido aminado retro-inverso e A^ e A^ são iguais ou diferentes e possuem a sequência: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu~Arg-Pro-Gly-X-Y-Z' em que W, X e Y possuem os significados anteriormente definidos na reivindicação 1 e Z' possui o significado anteriormente defi nido para Z na reivindicação 1 excepto em que não inclui um ãci do aminado retro-inverso. - 85 - Análogo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ter a sequência: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys. - 9§ - Análogo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por estar conjugado com • uma molécula de suporte. 22 i t- 10â - Vacina caracterizada por conter um análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 ou um análogo conjugado de acordo com a reivindicação 9 em conjunto com um excipiente veterinário aceitável. - lia - Conjunto (kit) para a detecção de anticorpos anti-GnRH píscea numa amostra caracterizado por conter um análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 ou um análogo conjugado de acordo com a reivindicação 9, meios de rotulagem e um suporte sólido. - 12a _ Utilização de um análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9 para a preparação de um medicamento para retardar, fazer parar ou fazer regredir o desenvol vimento sexual em peixes ou para controlar a fertilidade de pei, xes. - 13a - Processo para a preparação de um análogo de GnRH píscea que possui a sequência de ácidos aminados: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z em que W representa Gly ou um ácido aminado D, X representa uma ligação ou um ou vários ácidos aminados que podem ser iguais ou diferentes, Y representa Cys ou Tyr ou está ausente, e Z está ausente ou representa um ou vários ácidos aminados que podem ser iguais ou diferentes ou uma cadeia peptídica contínua ou descontínua, sendo a descontinuidade ou cada descon tinuidade uma fracção ligante polifuncional não formada por áci- * dos aminados oC ou um ácido aminado retro-inverso com a condição • de que quando W é Gly e X e Y estão ausentes Z está presente, 23caracterizado por compreender as fases de acoplar os resíduos usando técnicas químicas, biológicas e/ou recombinantes conhec^ das em si e isolar o análogo. - 14a - ADN que codifica para um análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 ou com a reivindicação 8, caracterizado por o análogo ser uma cadeia peptídica contínua. - 15β - Anticorpo ou um fragmento de ligação de um antigénio caracterizado por se ligar de modo específico a um análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8. - 16ã - Conjunto (kit) para a detecção de GnRH píscea numa amostra caracterizado por conter um anticorpo ou um fragmento de ligação de um antigénio de acordo com a reivindica ção 15, meios de rotulagem e um suporte sólido. - 178 - Utilização de um anticorpo ou de um fragmento de ligação de um antigénio de acordo com a reivindica ção 15 para a preparação de um medicamento para retardar, fazer parar ou fazer regredir o desenvolvimento sexual em peixes ou para controlar a fertilidade de peixes. - 188 - Processo para a preparação de um anticorpo ou de um fragmento de ligação de um antigénio de acordo * com a reivindicação 15, caracterizado por compreender a imuniza l ção de um animal com um análogo de acordo com qualquer das rei- 24 vindicações 1 a 8 ou um análogo conjugado de acordo com a reivindicação 9 e o isolamento do anticorpo formado ou das células que produzem o anticorpo. - 19§ - Anticorpos anti-idiotipo caracterizado por serem específicos em relação a um anticorpo ou a um fragmen to de ligação de um antigénio de acordo com a reivindicação 15. - 20§ - Processo para a imunização de um peixe em relação a GnRH píscea a fim de retardar, fazer parar ou fazer regredir o desenvolvimento sexual, ou controlar, limitar ou eliminar a fertilidade caracterizado por compreender a fase de administrar ao peixe uma quantidade eficaz de um análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 ou um análogo conjugado de acordo com a reivindicação 9 ou um anticorpo ou um fragmento de ligação de um antigénio de acordo com a reivindica ção 15. - 213 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se imergir o peixe em água que contem um análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 ou um análogo conjugado de acordo com a reivindicação 9 ou um anticor po ou um fragmento de ligação de um antigénio de acordo com a reivindicação 15. - 22§ - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se administrar oralmente um análogo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 ou um análogo conjugado de acordo com a reivindicação 9 ou um anticorpo ou um fragmento de ligação de um antigénio de acordo com a reivindica 25 ção 15. A requerente reivindica a prioridade do pedido britânico apresentado em 9 de Janeiro de 1991, sob o NQ. 9100468-9. Lisboa, 8 de Janeiro de 1992.26
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