HUT66829A - Analogs of piscine lhrh - Google Patents
Analogs of piscine lhrh Download PDFInfo
- Publication number
- HUT66829A HUT66829A HU9301979A HU9301979A HUT66829A HU T66829 A HUT66829 A HU T66829A HU 9301979 A HU9301979 A HU 9301979A HU 9301979 A HU9301979 A HU 9301979A HU T66829 A HUT66829 A HU T66829A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- amino acid
- fish
- gly
- analog
- antibody
- Prior art date
Links
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 23
- NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N GnRH Chemical class C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 claims description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 18
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 claims description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000036301 sexual development Effects 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000035938 sexual maturation Effects 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000008574 D-amino acids Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 70
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 16
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 7
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 7
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- -1 His Chemical compound 0.000 description 5
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 241000157468 Reinhardtius hippoglossoides Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000002920 convulsive effect Effects 0.000 description 4
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 4
- WTPMRQZHJLJSBO-XQALERBDSA-N 11-oxotestosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WTPMRQZHJLJSBO-XQALERBDSA-N 0.000 description 3
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 241000607525 Aeromonas salmonicida Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010017553 Furuncle Diseases 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 2
- 241001135139 Vibrio ordalii Species 0.000 description 2
- 241001148129 Yersinia ruckeri Species 0.000 description 2
- JGGWZMZAZCBABX-UHFFFAOYSA-N [1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl] butanoate Chemical compound O=C1C(OC(=O)CCC)CC(=O)N1N1C(=O)C=CC1=O JGGWZMZAZCBABX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 208000003512 furunculosis Diseases 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 2
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIGPSBHTJZUPKU-UHFFFAOYSA-N 3-benzoyl-1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1C(=O)C1=CC=CC=C1 WIGPSBHTJZUPKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLANMTTYEJHZIE-UHFFFAOYSA-N 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzenediazonium Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C1=CC=C([N+]#N)C=C1 ZLANMTTYEJHZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 241001519451 Abramis brama Species 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 238000012375 Ion exchange chromatography - high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001024304 Mino Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000612182 Rexea solandri Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 241001233037 catfish Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N gonadorelin Chemical class C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 239000003668 hormone analog Substances 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002353 niosome Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036417 physical growth Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 229940070741 purified protein derivative of tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Circuits Of Receivers In General (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
Description
A találmány tárgya a hal gonadotropin kibocsátó hormonnak (pGnRH), illetve némelykor hal luteinizáló hormonkibocsátó hormonnak (pLHRH) nevezett hal hormon analógok széles köre. A találmány elsősorban olyan pGnRH analógokra vonatkozik, amelyeket úgy állítunk elő, hogy a természetes pGnRH aminosav szekvencia C-végéhez egy cisztein- vagy tirozincsoportot tartalmazó rövid aminosav szekvenciát adunk úgy, hogy oldatban a konformáció lényegében változatlan maradjon, és így anti-pGnRH antitestek kialakítására és halak immunizálására alkalmas polipeptid konjugátját kapjuk.The present invention relates to a wide variety of fish hormone analogs called fish gonadotropin-releasing hormone (pGnRH) and sometimes fish-luteinising hormone-releasing hormone (pLHRH). In particular, the present invention relates to pGnRH analogs which are prepared by adding to the C-terminus of the native pGnRH amino acid sequence a short amino acid sequence containing a cysteine or tyrosine moiety such that the conformation in solution remains substantially unchanged to form anti-pGnRH antibodies and a conjugate of a polypeptide suitable for immunization of fish.
Az ipari világban gyorsan terjednek a kereskedelmi célú halfarmok.Commercial fish farms are spreading rapidly in the industrial world.
A legfontosabb haltenyésztők, elsősorban lazactenyésztők,The most important fish farmers, especially salmon farmers,
Nyugat-Európában, Észak- és Dél-Amerikában,Western Europe, North and South America,
Kanadában és a Keleti-Tengerparton találhatók.They are located in Canada and the East Coast.
Az AmerikaiThe American
Egyesült Államokban például 1989-ben 185.000 t lazacot és majdnem ennyi törpeharcsát tenyésztettek. Norvégiában az atlanti-lazac fő nyugat-európai tenyésztő helyén pedig 1989/90ben 120.000 tonnát állítottak elő. Úgy számolnak, hogy a világpiacon a század végéig a lazacértékesítés évente 7,5 %-kal nő, és ez évente 2.000 millió angol font értékű forgalmat jelent. A tengeri süllő és nagy rombuszhal kereskedelmi fejlődése és hosszabb távon az óráási laposhal és tőkehal forgalom növekedése is várható, és míg a tengeri keszeg és tengeri süllő legfőbb tenyésztője jelenleg Európa, a pontyot Kelet-Európábán és Afrikában egyaránt tenyésztik.In the United States, for example, in 1985, 185,000 tons of salmon and nearly as many catfish were farmed. In Norway, in 1989/90, 120,000 tonnes were produced at the main western European farm for Atlantic salmon. Global salmon sales are estimated to grow by 7.5% annually by the end of the century, representing a turnover of £ 2,000 million a year. Trade in turbot and turbot is expected to grow and in the longer term, there will be an increase in the turnover of hake and cod, and while the main breeder of bream and turbot is currently in Europe, carp are reared in both Eastern Europe and Africa.
A vízkultúrák egyik fontos szükséglete a halak szexuális érettségének szabályozása a következő jelenségek megakadályozása érdekében: a testi növekedés ivarmirigyekbe való átterjedése, ι húsminőség romlása, és a nem kívánt másodlagos nemi jellemzők kereskedelmi megjelenése. Ez különösen a lazacfélékre igaz, amelyeknél a koraérett fiatal lazacok (a fejlődés különböző fázisaiban) szexuális érése súlyos gazdasági károkat okozhat, mert a nem kereskedelmi méretű nemes lazac növekedését megállítják, a fiatal lazacokat rövid idő alatt kell begyűjteni, így piaci értékük csökken.An important need of aquaculture is to regulate the sexual maturity of fish to prevent the spread of physical growth into the gonads, the deterioration of ι meat quality, and the commercial appearance of unwanted secondary sexual characteristics. This is especially true for salmonids, where the sexual maturation of premature young salmon (at different stages of development) can cause severe economic damage by stopping the growth of non-commercial size salmon and short-term harvesting, thereby reducing their market value.
Ezenkívül kívánatos a haltenyésztő telepekről elszökött és a természetes gén állományú tavakban továbbélő halak termékenységének gátlása is.In addition, it is desirable to inhibit the fertility of fish that have escaped from fish farming and survive in ponds with natural genes.
A szexuálisan érett halak befogása logisztikai problémákat is felvet. Ezek a halak nem adhatók el; a halak bizonyos százaléka állandóan a többiek előtt válik éretté, különösen a hímek hajlamosak koraérettségre.Catching sexually mature fish also raises logistical problems. These fish cannot be sold; a certain percentage of fish is constantly mature before the others, especially males are prone to early maturity.
A szexuálisan érett és éretlen halak szétválogatása időigényes és költséges eljárás. Az érés megkezdése után mindegyik hal többé-kevésbé azonos időben és sebességgel érik, ami a begyűjtésüket rendkívül nehézzé teszi. így a halak érésének fázisokban való szabályozása egyértelműen nagyon kívánatos.Separating sexually mature and immature fish is a time consuming and costly process. After maturation, each fish matures more or less at the same time and speed, which makes it extremely difficult to harvest. Thus, regulating fish maturation in phases is clearly highly desirable.
A koraérés miatt például a lazac ideális begyűjtési tömege gyakran nem érhető el, és ezért a begyűjtés az optimális tömegnél gyengébb állapotban történik. Az érés szabályozásával ez az állapot elkerülhető, és a méretoptimalizálás befejezését teszi lehetővé.For example, due to early maturity, ideal salmon harvesting masses are often unavailable and, therefore, harvesting occurs in a sub-optimal state. By controlling the maturation, this condition can be avoided and allows the size optimization to be completed.
A szexuális érettség megakadályozására a leghatásosabb eljárás a steril haltenyésztés. Ezt azonban a szexuális dimorfizmust mutató populációknál a számos kísérlet ellenére sem sikerült még megvalósítani.The most effective method of preventing sexual maturity is sterile fish farming. However, this has not yet been achieved in populations with sexual dimorphism despite many attempts.
A halak szexuális érettségének szabályozására számos eljárást, köztük a sebészeti kasztrálást, triploidizációt és szexszabályozást (ez utóbbi kettő genetikus eljárás) ismerünk. A sebészeti kasztrációs kísérleteket az igen magas költségek és az eljárást követő trauma miatt abba kellett hagyni.There are many methods for controlling the sexual maturity of fish, including surgical castration, triploidization, and sex regulation (the latter two genetic methods). Surgical castration attempts had to be discontinued due to the very high cost and trauma of the procedure.
A triploidia olyan eljárás, amely három kromoszómakészlet megjelenését okozza, és így a triploid hím és nőstény halnál egyaránt sterilitást eredményez. A triploidia azonban számos hátránnyal is jár. Elsősorban az eljárás unalmas és időigényes, és hosszú ideig tart. A triploidiás kezelésnek alávetett tojásoknak a kezelés túléléséhez nagyon jó minőségűnek kell lenniük.Triploidy is a process that causes the appearance of three sets of chromosomes, and thus triploidy results in sterility in both male and female fish. However, triploidy has several disadvantages. First of all, the process is tedious and time consuming and takes a long time. Eggs undergoing triploid treatment must be of very high quality to survive the treatment.
Az eljárás eredményeként halak ugyan teljesen életképesnek látszanak, azonban a túlélési hányad átlagosan 15-20 % veszteséget is magában foglal azáltal, hogy a triploid halak fejlődése az íváson kívül valamivel lassabb, mint a diploidoké. Az ívásig a hím és a nőstény triploidok fejlődése nagy mértékben különbözik abban, hogy míg a hímek majdnem normálisan fejlődnek és másodlagos szexuális jellemzőik is ennek megfelelőek, addig a nőstény triploidoknál a petefészek nem fejlődik ki számottevően, és a természetes ívási időszakban fiatal kinézetűek.As a result, the fish appear to be completely viable, but the survival rate also averages 15-20% loss, with triploid fish developing slightly slower than diploids when spawning. The development of the male and female triploids until spawning differs greatly in that while males develop almost normally and have secondary sexual characteristics, in female triploids, the ovaries do not develop significantly and appear young during the natural spawning period.
A mesterséges triploidia sikeres alkalmazása azt követeli, hogy egy kereskedelmileg nem gazdaságos csak nőstény eljárással kombinálják. A triploidok további hátránya, hogy az ugyanabban a tartályban nevelt diploidok növekedésével nem tudnak versenyezni, és triploid nőstények sem növekednek jobban, mint a termékeny diploid nőstények.Successful use of artificial triploidy requires that it be combined with a commercially uneconomic females only procedure. A further disadvantage of triploids is that they cannot compete with the growth of diploids raised in the same container, nor do triploid females grow better than fertile diploid females.
A halak nagymértékben dimorf jellegűek, azaz képesek hímből nősténnyé és fordítva átváltozni, és a nemi jelleg megváltozása szabályozható. Az egyneműség tenyésztési célok, például növekedési sebesség tekintetében előnyösebb lehet. A nagy rombuszhal és az angolna nőstény egyedei például sokkal gyorsabban nőnek, mint a hímek. A lazacféléknél a fiatal hímek és nőstények körülbelül azonos mértékben fejlődnek, de később a hímek fejlődése nem kívánt mértékben csökken. Éréskor a hímek növekedése befejeződik, elszineződnek, és agresszívvé válnak, és ezért mind élelmezési, mind sport célra elértéktelenődnek. A tenyésztett szivárvány pisztráng és atlanti lazacfajták éréskor történő tengervízbe helyezésekor sósvízhez való alkalmazkodáshoz szükséges átállásra nem képesek, ezért elpusztulnak. Alkalmazható olyan eljárás, amellyel az összes egyed nőstény populációvá való szexuális átalakítása mellett a haltáplálékhoz hormonokat adnak, így azonban ezek a halak emberi táplálkozásra alkalmatlanná válnak. A táplálkozásra szánt halak termékenységének szabályozására végzett további kísérletek, például a besugárzás, kemosterilizálás és hormon adagolás mindezidáig megbízhatatlan, gazdaságtalan vagy nem megfelelő eredménnyel járt.Fish are highly dimorphic, ie they are able to convert from males to females and vice versa, and the alteration of sexuality can be controlled. Uniformity may be more advantageous for breeding purposes, such as growth rate. Females of the turbot and eel, for example, grow much faster than males. In salmonids, young males and females develop at approximately the same rate, but later males develop undesirably. Upon maturation, males stop growing, become discolored, and become aggressive, and are therefore devalued for both food and sport purposes. The farmed rainbow trout and Atlantic salmon are not capable of adapting to saltwater when matured into seawater and are therefore killed. A method can be used to add hormones to the fish diet while sexually converting all individuals to the female population, but rendering these fish unfit for human consumption. Further attempts to control the fertility of food-producing fish, such as irradiation, chemosterilization, and hormone administration, have so far yielded unreliable, uneconomic, or inadequate results.
Az emlősök esetében a szexuális érés szabályozására alkalmazott imunológiai eljárások eredményesebbek. Az emberi hormonális és immunológiai válaszra vonatkozó tanulmányok azonban a halfiziológia tekintetében nem nyújtanak megfelelő alapot. A halak hidegvérűek, és immunrendszerük különböző körülmények között változik. A halaknál a hőmérséklet az immunrendszer egyik fontos befolyásoló jellemzője, és a fiziológiás tartományon belüli hőmérsékletnövekedés magasabb immunválaszt eredményez. A fiziológiásán alacsonyabb hőmérséklet visszatartja az antitestképződés sebességét, gátolhatja a különösen érzékeny T-limfocitákat tartalmazó immunmemória létrejöttét.Immunological methods for controlling sexual maturation in mammals are more effective. However, studies on the human hormonal and immunological response do not provide an adequate basis for fish physiology. Fish are cold-blooded and their immune systems vary under different conditions. Temperature in fish is an important influencing characteristic of the immune system, and a rise in temperature within the physiological range results in a higher immune response. The physiologically lower temperature retards the rate of antibody formation and may inhibit the production of immune memory containing highly sensitive T lymphocytes.
Ezenkívül a hormonok által befolyásolt immunrendszer szezonálisan is változhat. A hormonszintet pedig a kezelésből adódó sztressz, a halak szállítása vagy a például oxigénhiányból adódó rossz vízminőség befolyásolja. A kétéves korszak és szexuális érés - mindkettő alapvető hormonális változás - alatt a halak a limfociták számának csökkenése miatt a betegségekre sokkal érzékenyebbek.In addition, the hormone-mediated immune system may change seasonally. And hormone levels are influenced by treatment stress, fish transport, or poor water quality, for example due to lack of oxygen. During the two-year period and sexual maturation, both of which are fundamental hormonal changes, fish are more susceptible to disease due to a reduction in lymphocyte counts.
Emellett a halakban csak egyfajta antitest molekula, az IgM képződik, az emlősöknél pedig öt antitestet ismerünk.In addition, only one type of antibody molecule, IgM, is produced in fish, and five antibodies are known in mammals.
A halak endokrinrendszere is különbözik az emlősökétől. Például a hal gonadotropin-kibocsátó hormon, amely a lazacfélékben, mint például lazacban és pisztrángban képződik, szekvenciája a következő:Fish also have a different endocrine system than mammals. For example, the fish gonadotropin-releasing hormone produced in salmonids such as salmon and trout has the following sequence:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (Sherwood és mtsai, 1983: Characterisation of a teleost GnRH, PNAS USA 80: 2794-2798), ez az emlős LHRH-hoz képest a 7. és 8. helyzetben mutat különbséget.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (Sherwood et al., 1983: Characterization of the Teleost GnRH, PNAS USA 80: 2794-2798), this mammalian LHRH- shows a difference between position 7 and position 8.
Munkánk során olyan hal GnRH analógokat találtunk, amelyek egy megfelelő hordozó molekulához kapcsolódva halak immunizálására alkalmazhatók úgy, hogy az immunogén keresztreakciók ellen nagy affinitással fellépő antitestek semlegesítik az endogén GnRH-t.In our work, we have found fish GnRH analogs that can be used to immunize fish when attached to a suitable carrier molecule by neutralizing endogenous GnRH with antibodies with high affinity for immunogenic cross-reactions.
A találmány egyik tárgya egy olyan pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z aminosav szekvenciát tartalmazó hal GnRH, amelybenOne object of the present invention is to provide a fish GnRH comprising the pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z amino acid sequence in which
W jelentése Gly- vagy D-aminosavcsoport ;W is Gly or D-amino acid;
X jelentése egy kötés vagy egy vagy több egymástól független jelentésű aminosavcsoport;X is a bond or one or more independent amino acid groups;
Y jelentése Cys- vagy Tyr-csoport vagy nincs jelen ésY is Cys or Tyr or absent and
Z nincs jelen vagy jelentése egy vagy több, egymástól független jelentésű aminosavcsoport vagy egy folytonos vagy olyan nem folytonos peptidlánc, amelyben az egy vagy több folytonossági hiány α-aminosavtól eltérő polifunkcionális kapcsolócsoport vagy egy retro-inverz aminosavcsoport, azzal a feltétellel, hogy ha W jelentése Gly-csoport és X és Y hiányzik, a Z jelenlévő csoport. A W-helyzetű csoport előnyösen olyan Gly-csoport, amely ebben a csoportban természetesen előfordul, és az Y-helyzetű csoport előnyösen Cys-csoport, mert ez a hordozó fehérjéhez specifikusabban és egyszerűbben kapcsolható, mint a C-végű Tyr-csoport.Z is absent or represents one or more independent amino acid residues or a continuous or discontinuous peptide chain in which one or more discontinuities is a polyfunctional linker other than an α-amino acid or a retro-inverse amino acid residue, provided that when W is Gly and X and Y are absent, Z is present. Preferably, the W position is a Gly moiety naturally occurring in this group, and the Y position is preferably a Cys moiety because it is more specific and easier to attach to the carrier protein than the C-terminated Tyr moiety.
Az az előnyös, ha X jelentése viszonylag kis számú csoport, például 1-15, előnyösen 1-8, még előnyösebben 1-3 csoport, és a legelőnyösebben csak egy csoport. Az X-helyzetben ugyan egy vagy több bármilyen aminosavcsoport lehet, azonban a legelőnyösebben ilyen csoport a Gly. Az X-helyzetben természetesen egyéb aminosavcsoportok, előnyösen rövid oldalláncú csoportok, mint például Alá-, Ser-, Asn- és Val-csoportok is lehetnek, és az ebben a helyzetben lévő bármelyik aminosavcsoport a találmány tárgyához tartozik.It is preferred that X is a relatively small group, for example 1-15, preferably 1-8, more preferably 1-3, and most preferably only one. While there may be one or more amino acid residues at the X position, Gly is most preferred. Of course, there may be other amino acid residues at the X-position, preferably short-chain residues such as Al, Ser, Asn and Val, and any amino acid residue at that position is contemplated.
Azt is meg kell jegyezni, hogy ha az X-helyzetben egynél több csoport van, ezek jelentése egymástól eltérő is lehet, lásd például a következő analógban: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Ala-Y-Z. Természetesen az X-helyzetben aminosavcsoportot nem tartalmazó pGnRH is a találmány terjedelméhez tartozik.It should also be noted that if there are more than one group at the X position, they may have different meanings, see, for example, the following analogue: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro- Gly-Ala-Gly-YZ. Of course, pGnRH having no amino acid residue at the X-position is also within the scope of the invention.
A találmány szerinti előnyös pGnRH a Z-helyzetben nem tartalmaz aminosavcsoportot, és különösen előnyös találmány szerinti analóg a következő szekvenciát tartalmazza:The preferred pGnRH of the invention does not contain an amino acid residue at the Z-position, and a particularly preferred analog of the invention comprises the following sequence:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys.
Munkánk során azonban azt tapasztaltuk, hogy további aminosavcsoportok Z-helyzetbe való beültetése a molekula többi részére általában nem nyújt további szerkezeti előnyöket. Az ilyen bővítés esetén a találmány szerint úgy járunk el, hogy egy vagy több olyan fehérje szekvenciát építünk be, amely T-sejt epitop hatással bír. Például az olyan 1-2-3-4 általános képletű szekvencia minosav szegmense, amelyben 1 jelentése Gly- vagy töltött aminosavcsoport, például Lys,However, it has been found in our work that insertion of additional amino acid residues at the Z position does not generally confer any additional structural advantage. In the case of such extension, the present invention involves the introduction of one or more protein sequences that have a T cell epitope effect. For example, the mino acid segment of the sequence 1-2-3-4 in which 1 is Gly or a charged amino acid residue such as Lys,
His, Arg, Asp vagy Glu, jelentése hidrofób aminosavcsoport, például Ile, Leu, Val,His, Arg, Asp or Glu represents a hydrophobic amino acid residue such as Ile, Leu, Val,
Met, Tyr, Phe, Trp, Alá, jelentése hidrofób aminosavcsoport (a fentiekben meghatározottak szerint), vagy nem töltött poláris aminosav -csoport, például Asn, Ser, Thr, Pro, Gin, Gly, és jelentése poláris aminosavcsoport, például Lys, Arg, His, Glu, Asp, Asn, Gin, Ser, Thr, Pro, bizonyos esetekben T-sejt epitopként viselkedik (Rothbard, J.B. and Taylor, W. R. (1988)).Met, Tyr, Phe, Trp, Ala represent a hydrophobic amino acid residue (as defined above) or an uncharged polar amino acid residue such as Asn, Ser, Thr, Pro, Gln, Gly, and represent a polar amino acid residue such as Lys, Arg , His, Glu, Asp, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro, in some cases behaves as a T-cell epitope (Rothbard, JB and Taylor, WR (1988)).
Hasonló szegmens lehet az 1'-21-3'-4'-51 szekvencia, amelyben 1' jelentése azonos az 1 jelentésénél fentiekben meghatározottakkal, 2' jelentése a 2 jelentésénél fentiekben meghatározottakkal, a 3' és 4’ jelentése azonos a 3 jelentésénél fentiekben meghatározottakkal, és 5' jelentése a 4 jelentésénél fentiekben meghatározottakkal.A similar segment may be the sequence 1'-2 1 -3'-4'-5 1 in which 1 'is as defined above for 1, 2' is as defined above for 2, and 3 'and 4' are as defined for 3. and 5 'is as defined above for 4.
Mindkét vegyület a következő olyan általános képlettel jellemezhető pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-S-T-S·, amelybenBoth compounds have the following general formula: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-S-T-S ·
T jelentése egy olyan peptid szekvencia szegmens, amely egy vagy több (előnyösen kevesebb, mint 5) T-sejt epitopot tartalmaz, amely lehet a fentiekben meghatározott típusú vagy attól eltérő szerkezetű és bármilyen hosszúságú és összetételű szegmenssel elválasztható;T is a segment of a peptide sequence comprising one or more (preferably less than 5) T-cell epitopes, which may be separated by segments of the type defined or different and of any length and composition;
S és S' jelentése (amelyek egyike adott esetben elhagyható) bármilyen hosszúságú és összetételű kitöltő (spacer) szegmens.S and S '(one of which may be optional) are spacer segments of any length and composition.
Az S hosszában legalább 5 aminosavcsoportot tartalmaz, amelyek lehetnek például a következő csoportok: Gly, Alá, Pro, Asn, Thr, Ser vagy polifunkcionális kapcsoló csoportok, például α-aminosavaktől eltérő aminosavak.S has at least 5 amino acid residues in its length, such as Gly, Ala, Pro, Asn, Thr, Ser or polyfunctional linking groups such as amino acids other than α-amino acids.
Az S' előnyösen kevesebb, mint 10 aminosavcsoportból áll és polifunkcionális kapcsoló csoportokat, mint például α-aminosavaktól eltérő aminosavakat tartalmazhat.Preferably, S 'has less than 10 amino acid residues and may contain polyfunctional linking groups, such as amino acids other than α-amino acids.
Az S' csoportok előnyösen az S jelentését képező, fentiekben ismertetett csoportok. Az S' lehet például teljes fehérje, és így elkerülhető a hordozó fehérjéhez való kapcsolás.Preferably, the S 'groups are the S groups described above. For example, S 'may be a complete protein and thus avoid binding to a carrier protein.
Meg kell jegyezni, hogy a Z csoport hiánya esetén a fentiekben ismertetett T-sejt epitópok építhetők be az X-helyzetbe.It should be noted that in the absence of the Z group, the T cell epitopes described above can be inserted at the X position.
A találmány tárgyához tartoznak továbbá az olyan alapanalógok is, amelyekben a Z jelentése un. retroinverzo aminosavcsoport, azaz egy aminosavcsoportnak megfelelő funkciós csoportot tartalmazó bifunkciós aminocsoport.The invention also relates to basic analogs wherein Z is a so-called analog. a retroinverted amino acid group, i.e. a bifunctional amino group containing a functional group corresponding to an amino acid group.
A találmány szerinti retro-inverz aminosavcsoportot tartalmazó analóg például egy olyan (I) általános képletű vegyület , amelybenAn example of a retro-inverse amino acid residue analog of the invention is a compound of formula (I) wherein
R jelentése bármilyen funkciós csoport, előnyösen Gly-csoport, ésR is any functional group, preferably Gly, and
Al és A2 jelentése egyaránt egy olyan találmány szerinti analóg másolata (de azzal nem szükségszerűen megegyező), amely a C-végével kapcsolódik.A1 and A2 are both copies of, but not necessarily the same as, the analog of the present invention that is linked to its C-terminus.
Különösen előnyös az olyan találmány szerinti analóg, amelyben az Al vagy A2 csoport Y-helyzetében lévő Tyr vagy Cys-csoport bármilyen olyan típusú aminosawal helyettesíthető, amely eltér a másik másolat megfelelő helyzetében lévő csoporttól, vagy alternatív módon el is hagyható. A dimer kapcsolása így a csoport Y-helyzetében lévő egyik vagy másik oldalláncán (vagy mindkettőn) keresztül hozható létre. Az Al és/vagy A2 lehet természetes pGnRH is, és a retro-inverz aminosav R csoportja lehet Cys- vagy Tyr-csoport. A T-sejt epitópok a fentieknek megfelelően adott esetben a Z szegmens részét is képezhetik.Particularly preferred is the analog of the present invention wherein the Tyr or Cys group at the Y position of the Al or A2 group can be replaced by any type of amino acid other than the corresponding position on the other copy or alternatively omitted. Coupling of the dimer can thus be accomplished through one or the other side chain (or both) at the Y position of the group. Al and / or A2 may also be natural pGnRH and the R group of the retro-inverse amino acid may be Cys or Tyr. As stated above, T cell epitopes may also be part of the Z segment.
Az analóg olyan A1-B-A2 (II) általános képletű vegyület is lehet, amelybenThe analogue may also be a compound of formula (A1-B-A2) in which
B jelentése egy retro-inverz aminosavcsoport; ésB is a retro-inverse amino acid residue; and
Αχ és A2 jelentése egymástól független, és a következő aminosav szekvenciával jellemezhető: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z', a képletben W, X és Y jelentése azonos a fentiekben meghatározottakkal, és Z' jelentése azonos a Z jelentésénél fentiekben meghatározottakkal, azzal a különbséggel, hogy nem tartalmaz retro-inverz aminosavcsoportot.Αχ and A 2 are independent and are characterized by the following amino acid sequence: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-XY-Z ', wherein W, X and Y are is as defined above and Z 'is as defined above for Z except that it does not contain a retro-inverse amino acid residue.
A peptidek retro-inverz módosítása magában foglalja egy vagy több peptidkötés megfordítását olyan analógok létrehozására, amelyek az enzimatikus degradációnak az eredeti molekulánál jobban ellenállnak, és olyan kényelmes eljárást kínálnak, amely segítségével közepestől nagy mértékig terjedően immunogén, nagy koncentrációjú epitopot tartalmazó elágazó immunogének állíthatók elő.Retro-inverse modification of peptides involves reversing one or more peptide bonds to produce analogs that are more resistant to enzymatic degradation than the parent molecule and provide a convenient method for the preparation of moderately to highly immunogenic branched immunogens with a high concentration of epitope.
Ezek a vegyületek a nagy jelentőséggel bírnak rövidláncú biológiailag aktív peptidek retro-inverz analógjainak ipari méretű oldatfázisú előállítása során.These compounds are of great importance in the industrial-scale solution-phase preparation of retro-inverse analogs of short-chain biologically active peptides.
A találmány másik tárgya eljárás olyan hal GnRH analóg előállításása során., amely a következő aminosav szekvenciával jellemezhető:Another object of the present invention is a process for the preparation of a fish GnRH analog which is characterized by the following amino acid sequence:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z, ahol a képletbenpGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z, wherein
W jelentése Gly- vagy D-aminosavcsoport ;W is Gly or D-amino acid;
X jelentése egy kötés vagy egy vagy több egymástól független aminosavcsoport;X is a bond or one or more independent amino acid residues;
Y jelentése Cys- vagy Tyr-csoport vagy nincs jelen ésY is Cys or Tyr or absent and
Z nincs jelen vagy jelentése egy vagy több, egymástól független jelentésű aminosavcsoport vagy egy folytonos vagy olyan nem folytonos peptidlánc, amelyben az egy vagy több folytonossági hiány α-aminosavtól eltérő polifunkcionális kapcsolőcsoport vagy egy retro-inverz aminosavcsoport, azzal a feltétellel, hogy ha W jelentése Gly-csoport és X és Y hiányzik, a Z jelenlévő csoport.Z is absent or represents one or more independent amino acid residues or a continuous or discontinuous peptide chain in which one or more discontinuities is a polyfunctional linker other than an α-amino acid or a retro-inverse amino acid residue, provided that W is Gly and X and Y are absent, Z is present.
Az eljárás során a szakterületen ismert kémiai, biológiai és/vagy rekombinációs eljárással a csoportokat összekapcsoljuk, és az analógot elválasztjuk.In the process, chemical, biological and / or recombination methods known in the art are used to link the groups together and to separate the analog.
A találmány szerinti analógok standard peptidszintézis eljárásokkal állíthatók elő, például szilárd fázisú peptidszintézist ismertet (SPPS) Merrifield 1963-ban (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149). Ebben az eljárásban egy növekvő peptidláncot C-végén keresztül kovalensen kötünk egy oldhatatlan szilárd hordozóhoz. A szintézis kivitelezését úgy végezzük, hogy a kívánt sorrendben egymás után adagoljuk az aminosavakat. Az oldat-szintézisekben szükséges tisztítási lépések ebben az esetben egy egyszerű mosási műveletre csökkennek, mert a reakció melléktermékei és bomlástermékek a reakcióelegyben feloldódnak. Az SPPS-eljárás előnye a sebesség, a viszonylag egyszerű megvalósítás és az a tény, hogy az eljárás részben vagy teljesen automatizálható. Az SPPS-eljárással néhányszor tíz g peptid állítható elő.The analogs of the invention may be prepared by standard peptide synthesis techniques, for example, solid phase peptide synthesis (SPPS), Merrifield 1963 (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149). In this method, a growing peptide chain is covalently linked to an insoluble solid support through its C-terminus. The synthesis is carried out by sequential addition of the amino acids in the desired order. In this case, the purification steps required in solution synthesis are reduced to a simple washing step because the reaction by-products and decomposition products are dissolved in the reaction mixture. Advantages of the SPPS process are speed, relatively simple implementation and the fact that the process can be partially or fully automated. The SPPS process produces a few tens of grams of peptide several times.
A Merrifield által 1963-ban kifejlesztett SPPS-eljárás röviden a következő négy lépéssel jellemezhető:The SPPS process, developed by Merrifield in 1963, can be summarized as follows:
(A) egy elsődlegesen védett aminosavat egy, az egész szintézis során stabilan maradó kovalens kötésen keresztül a szilárd hordozóhoz kapcsoljuk;(A) attaching a primary protected amino acid to a solid support via a covalent bond which remains stable throughout the synthesis;
(B) a kötött csoport egy szabad aminosavcsoportját védelemmentesítéssel regeneráljuk olyan körülmények között, amelyben az oldallánc funkciós csoportok mindegyike stabil marad;(B) regenerating a free amino acid group of the linked group by deprotection under conditions in which each of the side chain functional groups remains stable;
(C) a következő védett aminosavcsoportot kondenzációval az elsőhöz kapcsoljuk, amelynek eredményeként aminkötés képződik és a (B) és (C) lépéseket a szintézis befejeződéséig ismételjük;(C) coupling the next protected amino acid group to the first one by condensation to form an amine bond and repeating steps (B) and (C) until the synthesis is complete;
(C) a peptidet a szintézis végén felszabadítjuk a szilárd hordozóról, és az aminosav oldallánc védőcsoportok mindegyikét eltávolítjuk.(C) releasing the peptide from the solid support at the end of the synthesis and removing each of the amino acid side chain protecting groups.
Az irodalomban számos aminosav védőcsoportot ismertetnek. Jelenleg azonban ezek közül csak két kombinációt alkalmaznak. Az első a terc-butoxi-karbonil(Boc)/benzil-csoport kombináció, amelyet Merrifield 1963 óta használ, és amely máig is a legszélesebb körben alkalmazott. Mostanában terjedt el aSeveral amino acid protecting groups are described in the literature. Currently, however, only two of these combinations are used. The first is the tert-butoxycarbonyl (Boc) / benzyl combination, which has been used by Merrifield since 1963 and is still widely used. Recently, the spread of
Sheppard és mtsai által kifejlesztett és növekvő mértékben alkalmazott rendszer,A system developed and increasingly used by Sheppard et al.
33, 9, 1986 fluorenil-metoxi-karbonil(Fmoc)/terc-butil-csoport amelyet a Science Tools, The LKB Instrument Journal irodalmi helyen ismertetnek.33, 9, 1986 Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) / tert-butyl group disclosed in Science Tools, The LKB Instrument Journal.
További ilyen példa az Arsady és mtsai által kifejlesztett szilárdfázisú gyantát alkalmazó Fmoc-poliamid eljárás (J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1., 529-537, 1981, valamint az egyedi aminosavcsoportok védelmére alkalmazott fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc)-csoportot (J. Chem. Soc. Perkin Trans. L 6573, 1983) és a 9-fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc) csoportot (Atherton E és mtsai J. Chem. Soc. Chem. Comm. 165 (1985) alkalmazó eljárás.Another example is the Fmoc-polyamide process using solid phase resin developed by Arsady et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 529-537, 1981, and fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) used to protect individual amino acid groups. (J. Chem. Soc. Perkin Trans. L 6573, 1983) and the 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group (Atherton E et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm. 165 (1985)). .
A találmány tárgyához tartoznak az olyan DNS és RNS molekulák is, amelyek a genetikus kódon keresztül a leírásban ismertetett peptid analóg bármelyikét kódolják. Ezek a DNS molekulák megfelelő mikrobiológiai vagy eukariotikus sejt tenyészetben a találmány szerinti analógok előállítására alkalmazható rendszer kifejezésére használhatók. Ilyen rendszerekben hasonló molekulákat állítottak elő, melyek ismertetését megtaláljuk például a 85307311.2 számú európai szabadalmi bejelentésben.The invention also encompasses DNA and RNA molecules that encode any of the peptide analogs described herein through the genetic code. These DNA molecules can be used to express a system suitable for the preparation of analogs of the invention in a suitable microbiological or eukaryotic cell culture. Such systems have produced similar molecules, such as those disclosed in European Patent Application No. 85307311.2.
Megjegyezzük, hogy a retro-inverz aminosav-származékokat tartalmazó analógok ezzel a rendszerrel közvetlenül nem állíthatók elő. Az alapanalógok azonban előállíthatok, majd tisztíthatok, és standard peptid/szerves kémiai eljárással kémiailag a retro-inverz aminosavakhoz köthetők.Note that analogs containing retro-inverse amino acid derivatives cannot be directly produced by this system. However, the parent analogs can be prepared and then purified and chemically linked to the retro-inverse amino acids by standard peptide / organic chemistry.
Mostanában egy olyan gyakorlati és kényelmes eljárást ismertetnek, amelyben a retro-inverz peptideket poliamid típusú gyantán megvalósított szilárd fázisú szintézissel állítják elő [Gazerro, Η., Pinori, M. and Verdini, A.S. (1990): A new generál procedure fór the solid-phase synthesis of retro-inverso peptides, Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, szerkesztő Roger Epton, SPCC Ltd., Birmingham, NagyBritannia].Recently, a practical and convenient process for the preparation of retro-inverse peptides by solid phase synthesis on a polyamide type resin has been described [Gazerro, J., Pinori, M. and Verdini, A.S. (1990): A New Generic Procedure for Solid-Phase Synthesis of Retro-Inverse Peptides, Editors and Perspectives in Solid Phase Synthesis, edited by Roger Epton, SPCC Ltd., Birmingham, UK].
A hordozóhoz kötött analóg molekula előnyösen egy analógkonjugátot eredményez. Hordozóként bármilyen kis- vagy makromolekuláris hordozó alkalmazható, de a legelőnyösebb hagyományos hordozó anyagok a következők:Preferably, the carrier-bound analog molecule results in an analog conjugate. The carrier may be any small or macromolecular carrier, but the most preferred conventional carrier materials are:
- kulcslyuk csiga haemocianin (keyhole limpet haemocyanin = KLH);- keyhole limpet haemocyanin (KLH);
- borjúszérum albumin (Bovine serum albumin = BSA);- bovine serum albumin (Bovine serum albumin = BSA);
- csirke gammaglobulin (chicken gammaglobulin = CGG);- chicken gammaglobulin (CGG);
- tetanus toxoid (TT);- tetanus toxoid (TT);
- diftéria toxoid (DPT);- diphtheria toxoid (DPT);
- tuberkulin tisztított fehérje származéka (purified protein derivative = PPD);- tuberculin purified protein derivative (PPD);
- muramii dipeptid (MDP);muramyl dipeptides (MDP);
- szójabab tripszin inhibitor (STI) ; és- soybean trypsin inhibitor (STI); and
- kolera toxin vagy B-alegysége.cholera toxin or its B subunit.
Megjegyezzük, hogy a BCC vakcinával végzett feltöltés a PPD esetén előnyös lehet, (Lachmann, P. és mtsai, 1986, Synthetic Peptides as Antigens, Ciba Foundation Symposium 119, 25-40. oldalak).Note that loading with BCC vaccine may be beneficial for PPD (Lachmann, P., et al., 1986, Synthetic Peptides as Antigens, Ciba Foundation Symposium 119, pages 25-40).
Halak autoimmunizálására különösen előnyös LHRH analóg hordozók a következő mikroorganizmusok vagy makromolekuláris antigének, amelyek emiatt a halvakcinák komponensei is: Aeromonas salmonicida (furunkulozis), Yersinia ruckeri (ERM) és egy Vibrio anguillarium és Vibrio ordalii (vibriozis) elegy.Particularly preferred carriers of LHRH analogs for autoimmunization of fish are the following microorganisms or macromolecular antigens, which are therefore components of fish vaccines: Aeromonas salmonicida (furunculosis), Yersinia ruckeri (ERM) and a mixture of Vibrio anguillarium and Vibrio ordalii (vibriosis).
A Gram-negatív nem mozgékony Aeromonas salmonicida baktérium által okozott furunkolózis elleni védekezésre mostanában a következő alaptípusú vakcinát vizsgálták:The following basic type of vaccine has recently been tested for the control of Gram-negative non-motile Aeromonas salmonicida bacterial furunculosis:
- teljesen elpusztított vagy elroncsolt sejtek (bakterinek) ;- completely killed or destroyed cells (bacterial);
- extracelluláris sejttermékek (extra cellular products = = ECP) és ECP toxoidok;- extracellular cell products (= ECP) and ECP toxoids;
- teljesen elpusztított sejtek ECP-vel kombinálva;- completely killed cells in combination with ECP;
- gyengített élő vakcinák; és- attenuated live vaccines; and
- tisztított antigének.- purified antigens.
A hiperimmun szérum mellett passzív védelemként bizonyos halfélékben és emlősökben termelődött antigének is alkalmazhatók.In addition to hyperimmune serum, antigens produced in certain fish and mammals may be used as passive protection.
A bélrendszeri eredetű ”vörösszáj (enteric redmouth = ERM) ellen, amelyet a Gram-negatív mozgékony Yersinia ruckeri baktérium okoz, is olyan sikeres vakcinát (vagy bakterint) állítottak elő, amely formalin-inaktivált teljes baktérium tenyészeteket tartalmaz.A successful vaccine (or bacterin) containing formalin-inactivated whole bacterial cultures has also been prepared against enteric redmouth (enteric redmouth = ERM) caused by Gram-negative motile Yersinia ruckeri.
Az északi féltekén jelenleg kereskedelmi forgalomban lévő vibriózis vakcinák a legközönségesebb V. anquillarium és V. ordalii fajták elegyei. Ezek a vakcinák olyan egyszerűen inaktivált tenyészetek, amelyek teljes sejteket és ECP-t tartaIma z nak.Vibriosis vaccines currently commercially available in the Northern Hemisphere are mixtures of the most common varieties of V. anquillarium and V. ordalii. These vaccines are simply inactivated cultures that contain whole cells and ECP.
A találmány további tárgya olyan vakcina, amely egy pGnRH analógot vagy analóg-konjugáltat, valamint egy állategészségügyileg elfogadható hordozót tartalmaz.A further aspect of the present invention is a vaccine comprising a pGnRH analogue or analogue conjugate and a veterinary acceptable carrier.
Ezek a vakcinák halak autoimmunizálására alkalmazhatók.These vaccines can be used to autoimmunize fish.
A találmány további tárgya olyan eljárás halak szexuális fejlődésének gátlására, amelyben a halaknak az endogén pGnRH biológiai hatásának lényeges csökkentésére elegendő mennyiségű anti-pGnRH antitest részt állítanak elő.It is a further object of the present invention to provide a method of inhibiting the sexual development of fish comprising producing sufficient portions of the anti-pGnRH antibody to substantially reduce the biological activity of the endogenous pGnRH.
Az Y-helyzetben akár Cys-, akár Tyr-csoportot tartalmazó analógok konjugációja a szakirodalomból jól ismert reagensekkel és eljárásokkal végezhető. Például az Y-helyzetben Cys-csoportot tartalmazó hal GnRH analógok tio-éter-kötésen keresztül megvalósított konjugálására N-maleimido-butiril-oxiszukcinimidet (Calbiochem) alkalmaznak, amellyel az analógot a hordozó protein lizin oldalláncához kötik, az Y-helyzetben Tyr17 • «·«· 4·«4 «·«« ·« · « | « « « · ··« · «· · csoportot tartalmazó analógok konjugálására pedig N-(4diazofenil)-maleimiddel diazokötést alakíthatnak ki.Conjugation of analogs having either Cys or Tyr at the Y position can be accomplished using reagents and methods well known in the art. For example, N-maleimido-butyryloxysuccinimide (Calbiochem) is used to conjugate fish GnRH analogues containing the Cys group at the Y-position with N-maleimido-butyryloxysuccinimide (Calbiochem), which binds the analogue to the lysine side chain of the carrier protein Tyr17. «· 4 ·« 4 «·« «·« · «| In addition, they can be conjugated with N- (4-diazophenyl) -maleimide to conjugate analogs containing the group.
A peptidek és konjugátok megfelelő mértékű tisztítását a szakterületen jól ismert eljárásokkal, például nagynyomású folyadékkromatográfiás vagy nátrium-dodecil-szulfát-poli(akrilamid) gélelektroforézissei vagy gyors folyadékkromatográfiás eljárással végezhetjük.Appropriate purification of the peptides and conjugates may be carried out by methods well known in the art, such as high pressure liquid chromatography or sodium dodecyl sulfate poly (acrylamide) gel electrophoresis, or flash liquid chromatography.
A találmány szerinti peptid-hordozó konjugát felhasználási területei a következők lehetnek:Applications of the peptide-carrier conjugate of the invention may include:
1) bármilyen állat immunizálása a későbbiekben specifikált felhasználási területeken alkalmazható anti-hal-GnRH-antitestek képződésének fokozására;1) immunizing any animal to enhance the production of anti-fish GnRH antibodies for use in further specified uses;
2) halak hal GnRH-ra való autoimmunizálása a2) autoimmunization of fish with fish GnRH a
- szexuális fejlődésük lassítására, megállítására vagy visszafejlesztésére;- slowing down, stopping or reversing their sexual development;
- termőképességük szabályozására, korlátozására vagy megszüntetésére;- to regulate, restrict or terminate their fertility;
- GnRH-függő hal daganatos betegségek kezelésére;- GnRH-dependent fish for the treatment of cancer;
- hal fiziológiai állatkutatási kísérletek lefolytatására;- the performance of fish physiological animal tests;
3) diagnosztizálószerként anti-hal-GnRH antitestek, például szérum mintákban való jelenlétének meghatározására.3) as a diagnostic agent for determining the presence of anti-fish GnRH antibodies, such as in serum samples.
Az analógok ellen képződött anti-hal-GnRH antitestek is a találmány tárgyköréhez tartoznak. Ezeket például a következő célra alkalmazhatjuk:Anti-fish GnRH antibodies raised against analogs are also within the scope of the invention. For example, they can be used for:
1) hal fiziológiai/immunológiai kutatási eszközként;1) fish as a physiological / immunological research tool;
2) immunogénként anti-idiotipikus antitestek képződésének elősegítésére;2) as an immunogen to promote the formation of anti-idiotypic antibodies;
3) passzív immunizálásra a ···· ♦··£ * h· • f ·· •*·3) passive immunization with ···· ♦ ·· £ * h · • f ·· • * ·
- szexuális fejlődés lelassítására, megállítására vagy visszafejlesztésére;- slowing down, stopping or reversing sexual development;
- GnRH-függő hal daganat kezelésére;- treatment of GnRH-dependent fish cancer;
- egyéb hal GnRH-tevékenységgel való beavatkozás (a passzív immunizálást a halakban vagy emlősökben kialakuló poliklonális, monoklonális és egyedi domain antitestek adagolásával végezzük), és- interference with other fish GnRH activity (passive immunization by administration of polyclonal, monoclonal and unique domain antibodies in fish or mammals), and
4) diagnosztizálószerként hal GnRH jelenlétének például szérummintákban való kimutatására.4) as a diagnostic agent for detecting the presence of fish GnRH in, for example, serum samples.
Nyilvánvaló, hogy a fenti 2) pontan ismertetett antiidiotipikus antitestek is a találmány tárgyköréhez tartoznak.It is understood that the anti-idiotypic antibodies described in (2) above are also within the scope of the invention.
A szintetikus polipeptidekhez specifikusan kötődő, találmány szerinti poliklonális és monoklonáis antitestek és ezek kiméra és hal-formáinak előállítási eljárását például a következő irodalmi helyeken ismertetik: Morrison és mtsai (1984) PNAS (USA) 81), 6851-6855; Riechmann és mtsai (1988) Natúré 332) 323-327, az egyedi domain antitestek előállítási eljárását pedig például Ward, E.S., Gussow, D., Griffiths, A.D., Jones, P. és Winter, G. : (1989) Natúré 341 544-546) irodalmi helyen ismertetik. Az előállítást valamilyen fentiekben ismertetett hagyományos eljárással végezhetjük, és az így kapott antitestek is a találmány tárgyköréhez tartoznak.Methods of making the polyclonal and monoclonal antibodies of the invention and their chimeric and fish forms that specifically bind to synthetic polypeptides are described, for example, in Morrison et al. (1984) PNAS (USA) 81, 6851-6855; Riechmann et al. (1988) Natura 332: 323-327, and the method for producing unique domain antibodies, e.g. -546). The preparation may be carried out by any of the conventional methods described above, and the antibodies thus obtained are within the scope of the invention.
A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az anti-hal-GnRH antitestek vagy hal GnRH kimutatására számos immunovizsgálati eljárás, többek között a szendvics-vizsgálat, kompetitív és nem kompetitív vizsgálat, valamint a közvetlen és közvetett jelzés áll rendelkezésre. Az anti-hal GnRH antitestek kimutatására alkalmazott készlet előnyösen tartalmaz egy találmány szerinti • · · ·» ·Those skilled in the art will recognize that a variety of immunoassays are available for the detection of anti-fish GnRH antibodies or fish GnRH, including sandwich assays, competitive and non-competitive assays, and direct and indirect labeling. The kit used to detect anti-fish GnRH antibodies preferably contains a kit of the invention.
- 19 analógot, vagy analóg konjugátot, egy jelző anyagot és egy szilárd hordozót. Ehhez hasonlóan a hal GnRH kimutatására alkalmas készlet tartalmaz egy, a találmány szerinti analógot specifikusan kötő antitest vagy antigén fragmentet, egy jelző anyagot és egy szilárd hordozót.- 19 analogs or analogue conjugates, a tracer and a solid support. Similarly, a kit for detecting fish GnRH contains an antibody or antigen fragment that specifically binds the analog of the invention, a label, and a solid support.
A hal oltóanyag alkalmazása számos eljárással, például injektálással, szájon át vagy bemerítéssel történhet.The fish vaccine can be administered by a variety of methods, such as injection, oral or dipping.
Az oltás kivitelezésére leghatásosabb eljárás az immunválasz nagyságának javítását elősegítő hatásjavító adalék alkalmazását is megengedő intraperitoneális injektálás. Hátránya, hogy altatást és stresszokozó kezelést igényel, és a kezelés nagyon munkaigényes. Azonban ismétlő fecskendőkkel és megfelelő berendezéssorozaton óránként 1000 hal is beoltható. A 15 g alatti tömegű halaknál azonban nem alkalmazható.The most effective method of administering the vaccine is by intraperitoneal injection, which also allows the use of an adjuvant that enhances the magnitude of the immune response. The disadvantage is that it requires anesthesia and stress-inducing treatment, and the treatment is very labor-intensive. However, up to 1000 fish per hour can be inoculated with repetitive syringes and appropriate equipment. However, it shall not apply to fish weighing less than 15 g.
A halak tömeges kezelésére minden méretű hal esetén a szájon át végzett adagolás a legmegfelelőbb, amely stresszhatást sem okoz. Azonban a belső korlátozások miatt nagymennyiségű oltóanyag szükséges, amely növeli a költségeket és az egyedi adagolást bizonytalanná teszi. A szájon át alkalmazható oltóanyagok hatásfoka alacsony, és ezért ezek alacsony vagy nem állandó szintű védelmet biztosítanak. A legtöbb szájon át való alkalmazást a vibriozis elleni oltóanyaggal végzik.For bulk fish treatment, oral administration of all sizes of fish is most appropriate without causing stress. However, due to internal limitations, a large amount of vaccine is required, which increases costs and makes individual dosing uncertain. Oral vaccines have low efficacy and therefore provide a low or non-constant level of protection. Most oral applications are done with the anti-vibration vaccine.
A közvetlen bemerítés [(direct immersion (Dl)] olyan előnyös eljárás, amely egyszerű és gyors, és az oltóanyag csak néhány percig érintkezik az állatokkal. Ez az eljárás ma már automatizált, és a vibriozis elleni és ERM oltáshoz fürdő és öblítő eljárást fejlesztettek ki, és egyszerűen egy tartályba öntött oltóanyaggal végezhető. Ez az eljárás ugyan az injektá*·· · »· ·Direct Immersion (Dl) is a preferred method that is simple and fast, and the vaccine only comes in contact with the animal for a few minutes and is now automated and has developed a bath and rinse method for anti-vibration and ERM vaccination. , and can simply be done with a vaccine poured into a container. * ·· · »· ·
- 20 láshoz képest több oltóanyagot és hosszabb érintkezési időt (kb. egy óra) igényel, amely a víz oxigénezését és a halak stresszfigyelését teszi szükségessé, azonban munkaigénye kisebb.- Requires more vaccines and longer contact time (about one hour) than 20 fish, which requires oxygenation of the water and monitoring of fish stress, but requires less work.
Előnyös lehet az immunizálást olyan italkeverékkel végezni, amelyIt may be advantageous to carry out the immunization with a beverage mixture which
i) egy adott analógot egynél több hordozómolekulához kapcsolva; és/vagy ii) ugyanazon hordozómolekulához kapcsolva egynél több fajta analógot tartalmaz.i) a given analogue linked to more than one carrier molecule; and / or ii) contains more than one type of analogue linked to the same carrier molecule.
Ezen kívül bármilyen peptidanalóg, ezek konjugátjai, valamint az ezeket tartalmazó italkeverékek bármilyen megfelelő hatásjavítószerrel vagy szétosztó közeggel kombinálható, és ennek eredményeként az úgynevezett szuperkoktél italkeverék állítható elő.In addition, any peptide analogue, conjugates thereof, and beverage mixtures containing them may be combined with any suitable adjuvant or delivery medium to give a so-called super cocktail beverage mixture.
Előnyös hatásjavító szerek és szétosztó közegek például a következő anyagok: aluminium-hidroxid (alum), mikrogyöngyök, liposzómák, micélliumok, nioszómák, ISCOMS-ok, Brauns lipoproteinek, valamint a mikrobiális hal oltóanyagok egész sejtjei vagy ezek összetevői.Preferred adjuvants and delivery media include aluminum hydroxide (alum), microspheres, liposomes, mycelia, niosomes, ISCOMS, Brauns lipoproteins, and whole cells or components of microbial fish vaccines.
A következő példákat a találmány részletesebb ismertetésére mutatjuk be.The following examples illustrate the invention in more detail.
1. példaExample 1
Egy találmány szerinti karboxi-bővített pGnRH-t állítunk elő standard szilárdfázisú eljárással.A carboxy-expanded pGnRH of the invention is prepared by a standard solid phase process.
A peptid gyantáról való lehasítását trifluor-ecetsav jelenlétében végezzük, majd a tisztítást gélszűréssel, ioncserélős kromatográfiás eljárással és fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással folytatjuk le. A peptidet MBS sel (m-maleimid-benzoil-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel) különböző hordozókhoz kötjük.The peptide is cleaved from the resin in the presence of trifluoroacetic acid, followed by purification by gel filtration, ion exchange chromatography, and reverse phase high performance liquid chromatography. The peptide is bound to various carriers with MBS (m-maleimide benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester).
A leírásban már ismertettük, hogy a csirke gammaglobulin (CGA) jól használható hordozó egyéb oltóanyagok szivárvány pisztrángnál való alkalmazásához. Az emlős kísérletekben kipróbált PPD-t is alkalmazzuk (bár előzőleg BCG-vel végzett immunizálás is szükséges).It has already been described that chicken gamma globulin (CGA) is a useful carrier for the use of other vaccines in rainbow trout. PPD tested in mammalian experiments was also used (although BCG immunization was required previously).
A pGriRH analóg hordozóhoz való kapcsolását a peptid fehérjéhez viszonyított (30-40):1 mólarányában végezzük, és a szivárvány pisztrángot három különböző koncentrációjú intraperitoneális injektálással beoltjuk.Coupling of the pGriRH to the analog carrier was performed at a molar ratio of peptide to protein of (30-40): 1, and the rainbow trout was inoculated with three different concentrations of intraperitoneal injection.
A létrejövő szérum antitestválaszt 10 héten át hetenként vizsgáljuk. A vizsgálatot torma peroxidáz (Horseradish Peroxidase, HRP) konjugált monoklonális anti-pisztráng lg alkalmazásával, enzim-immunvizsgálati eljárással (ELISA) végezzük.The resulting serum antibody response is monitored weekly for 10 weeks. The assay was carried out using Horseradish Peroxidase (HRP) conjugated monoclonal anti-trout Ig, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Ebben a kísérletben néhány vizsgálatot úgy végzünk, hogy hordozóval preimmunizálunk vagy hatásjavító vagy gyorsító injekciót alkalmazunk az anti-pGnRH-antitestek optimális előállítási programjának meghatározására.In this experiment, some assays are performed by preimmunization with a vehicle or by boosting or accelerating injection to determine the optimal program for the production of anti-pGnRH antibodies.
2. példaExample 2
Az 1. példában ismertetett optimális előállítási programot egy csoport potenciálisan érésben lévő pisztráng immunizálására alkalmazzuk.The optimal production program described in Example 1 is used to immunize a group of potentially maturing trout.
Az 1. példában ismertetett eljárással vizsgáljuk az antitestválaszt, emellett mérjük a növekedési sebességet és a szexszteroidok (például tesztoszteron) képződését.The antibody response assay described in Example 1 is used to measure growth rate and production of sex steroids (e.g., testosterone).
A halakat a kísérlet végén leöljük, az ivarmirigyeket eltávolítjuk, és aAt the end of the experiment, the fish are sacrificed, the gonads are removed, and the
(GSI) meghatározásához lemérjük. Az ivarmirigyeket ezután a későbbi fénymikroszkópos hisztológiai tanulmányozáshoz rögzítjük. Az immunizált halak GSI-je lényegesen jobb, mint a kezeletleneké.(GSI). The gonads are then fixed for subsequent light microscopic histological examination. Immunized fish have significantly better GSI than untreated fish.
3. példaExample 3
Érésben lévő szivárvány pisztráng immunizálás tuberkulin tisztított fehérjeszármazékhoz kapcsolt szalmonid gonadotropinkibocsátó hormonbővített analóg alkalmazásával (sGnRHa-PPD).Immunization of maturing rainbow trout using a salmonide gonadotrophin-releasing hormone-expanded analogue (sGnRHa-PPD) linked to a purified protein derivative of tuberculin.
Eljárásprocess
a) Az sGnRH-Gly-Cys PPD-hez való kapcsolásaa) Linking sGnRH-Gly-Cys to PPD
1,008 mg/ml tuberkulin PPD-t és Evans Limited gyártmányú fenol konzerválószert egy éjszakán át benziolátos cellulózcsőben, 12 °C-on, 0,9 %-os nátrium-klorid vizes oldattal egy éjszakán át dializálunk a fenol eltávolítására. A PPD-t ezutánTuberculin PPD (1.008 mg / ml) and phenol preservative (Evans Limited) were dialyzed overnight in a benzylated cellulose tube at 12 ° C with 0.9% aqueous sodium chloride solution to remove phenol. Then the PPD
1,5 órán át poli(etilén-glikol) (PG 20000) alkalmazásával 4,032 mg/ml-re koncentráljuk. 2,5 ml 10,08 mg PPD-t tartalmazó oldatot szobahőmérsékleten, 1 órán át 1,08 mg N-7~-malimidoConcentrate to 4.032 mg / ml for 1.5 hours using polyethylene glycol (PG 20000). 2.5 ml of solution containing 10.08 mg of PPD at room temperature for 1 hour 1.08 mg of N-7 ~ -malimido
-butiril-oxi imid 5,04 μΐ dimetil-formamidban (DMF) készült oldatával keverünk. Az elegyet ezután G-25 MPD-10 Sephadex kolonnára adjuk, és 3,5 ml A pufferral (0,05 mol/1 NaH2PO4,· 0,14 mol/1 NaCl, pH=7,0) eluáljuk. A PPD-re cseppenként 4,687 ml 3 mg/ml koncentrációjú, desztillált vízben oldott sGnRH-Gly-Cys-t majd A puffért (azaz 14,0616 mg sGnRHGly-Cys-t) adunk. Az oldatot szobahőmérsékleten nitrogén atmoszférában keverjük 2 órán át, és meghatározzuk a szabad tioltartalmat.-Butyryloxyimide in 5.04 μΐ dimethylformamide (DMF). The mixture was then applied to a G-25 MPD-10 Sephadex column and eluted with 3.5 mL of buffer A (0.05 M NaH 2 PO 4, 0.14 M NaCl, pH 7.0). To the PPD was added 4,687 ml of sGnRH-Gly-Cys in 3 mg / ml in distilled water followed by buffer A (i.e. 14.0616 mg of sGnRHGly-Cys). The solution was stirred at room temperature under nitrogen for 2 hours and the free thiol content determined.
A konjugátot egy éjszakán át benziolátos cellulózcsőben 12 °C-on desztillált vízzel dializáljuk, majd a felhasználásigThe conjugate was dialyzed in distilled water at 12 ° C in a benzoate cellulose tube overnight and
-20 °C-on tároljuk.Store at -20 ° C.
b) Szabad tiol meghatározás(b) Determination of free thiol
A konjugát szabad tioltartalmát 5,5'-ditiobisz-(2-nitro-benzoesav) (DTNB) és redukált glutation standardok alkalmazásával határozzuk meg.The free thiol content of the conjugate was determined using 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) and reduced glutathione standards.
A vizsgálatot egy Ellman-féle, mikrolyukas lemezen végezzük, amelyen 50 mmol/l-es DTNB-t és 250 pl PBS-t (pH = 8) skálával ellátott pl mintához 2 pl 10 adunk, és 10 perc után, 405 nm-en mérjük az abszorpciót.The assay is carried out on an Ellman microplate in which 50 µl DTNB and 250 µl PBS (pH 8) are plated with 2 µl 10 and after 10 min at 405 nm measure the absorbance.
c) Szivárvány pisztráng és immunizációs rendszere(c) Rainbow trout and their immunization system
Különböző fagyasztó bélyegzők alkalmazásával egyenként megjelölünk 130 érésben lévő szivárvány pisztrángot (hosszúság: kb. 30 cm) . A halak hosszát és tömegét egyenként feljegyezzük, és az immunizáció előtt szérum antitest szint meghatározására mindegyikből 600 pl vért veszünk. A halak nemének meghatározására szérum szteroid szintet is mérünk.130 individual rainbow trout (length: about 30 cm) are individually marked using different freezing stamps. The length and weight of the fish were recorded individually and 600 µl of blood was collected from each of them prior to immunization to determine serum antibody levels. Serum steroid levels are also measured to determine the sex of the fish.
A halakat két csoportra osztjuk, és az egyik csoportnak sGnRH-Gly-Cys-PPD-t a másik csoportnak sóoldatot adunk. Az alkalmazást Freud Complete Adjuvant (FCA) oldatban, intraperitoneálisan végezzük. A kezelt és a kontroll csoportot is hím és nősténycsoportokra osztjuk. A hímeket környezeti világítás mellett, környezeti hőmérsékleten tartjuk. A nőstényeket további két csoportra osztjuk, és ezek közül az egyiket környezeti világítás mellett, környezeti hőmérsékleten (ami 14 °C körül vagy kicsit alatta lévő hőmérséklet között ingadozik), a másikat környezeti megvilágítás mellett, 14 °C-on tartjuk.The fish were divided into two groups, and one group received sGnRH-Gly-Cys-PPD and the other group saline. Application is in Freud Complete Adjuvant (FCA) solution, intraperitoneally. The treated and control groups were divided into male and female groups. The males are kept under ambient light at ambient temperature. The females are divided into two groups, one of which is kept under ambient light at ambient temperature (which is about 14 ° C or slightly below) and the other under ambient light at 14 ° C.
Ez utóbbi halcsoportot a hőmérséklet anti-sGnRH-Gly-Cys antitest részarányra kifejtett hatásának és az ebből eredő hal érés eltérések vizsgálatára alkalmazzuk. Az egész kísérlet során folyamatosan, négy hetes intervallumban mérjük az egyenként megjelölt halak tömegét, méretét és vért veszünk tőlük.The latter group of fish is used to investigate the effect of temperature on the proportion of anti-sGnRH-Gly-Cys antibody and the resulting differences in fish maturation. The weight, size and blood of each individually tagged fish are continuously measured at four week intervals throughout the experiment.
Megmérjükaszérumanti-sGnRH-Gly-Cys antitesttartalmát (sGnRH-Gly-Cys-BSA alkalmazásával), és 17-B-ösztradiol és/vagy 11-ketotesztoszteron szteroid hormon tartalmát RIA alkalmazásával.Serum antibody sGnRH-Gly-Cys antibody content (using sGnRH-Gly-Cys-BSA) and 17-B-estradiol and / or 11-ketotestosterone steroid hormone were measured using RIA.
d) Szteroid elemzésd) Steroid analysis
Az érésben lévő halak szérumának 17-B-ösztradiol (E2) és 11-ketotesztoszteron (11-KT) koncentrációját radioimmunvizsgálattal mérjük. Ebben a vizsgálatban radioaktívan jelzett szteroid korlátozott számú szteroidspecifikus antitesthez kötődik, és ezt a kölcsönhatást nem jelzett szteroid hozzáadásával részlegesen gátoljuk.Serum concentrations of 17-β-estradiol (E2) and 11-ketotestosterone (11-KT) in mature fish are measured by radioimmunoassay. In this assay, a radiolabeled steroid binds to a limited number of steroid-specific antibodies and this interaction is partially inhibited by the addition of unlabeled steroid.
e) Anti-SGnRH-Gly-Cys ELISA optimalizáláse) Anti-SGnRH-Gly-Cys ELISA optimization
Borjú szérum albuminhoz [Bovine Serum Albumin = BSA] az ELISA-ban való alkalmazás céljából szalmonid GnRH-Gly-Cys-t kapcsolunk. 0,5 ml A jelű pufferben oldott 10 mg BSA-t és 5 μΐ DMF-ben oldott 1 mg GMBS-t elegyítünk, és végül 6,246 mg sGnRHGly-Cys-hez kapcsoljuk. Az ELISA vizsgálati eljárás lehetővé teszi, hogy az érési kísérletekben alkalmazandó anti-sGnRH-GlyCys ELISA-hoz a megfelelő sGnRH-Gly-Cys-BSA rétegkoncentrációt meghatározzuk.Salmonid GnRH-Gly-Cys is coupled to Bovine Serum Albumin (BSA) for use in the ELISA. 10 mg of BSA in 0.5 ml of buffer A and 1 mg of GMBS in 5 μ 5 of DMF were mixed and finally coupled to 6.246 mg of sGnRHGly-Cys. The ELISA assay allows the determination of the appropriate sGnRH-Gly-Cys-BSA layer concentration for the anti-sGnRH-GlyCys ELISA used in the maturation assays.
EredményekResults
i) Anti-SGnRH-Gly-Cys antitest részarányi) Anti-SGnRH-Gly-Cys antibody ratio
Az 1. táblázatban ismertetett eredmények azt mutatják, hogy az anti-sGnRH-Gly-Cys antitest részarány az sGnRH-Gly-Cys-PPDvel végzett 8 hetes utóimmunizáció (20 M9 sGnRH-Gly-Cys/hal,The results presented in Table 1 show that the proportion of anti-sGnRH-Gly-Cys antibody is 8 weeks post-immunization with sGnRH-Gly-Cys-PPD (20 M9 sGnRH-Gly-Cys / fish,
FCA-ban, i.p.) következtében a kontrolihoz képest jobban nő (hímek és nőstények).FCA (i.p.) results in a higher growth rate (males and females) than control.
1. táblázatTable 1
Átlagos anti-sGnRH-Glv-Cvs antitest titerek (lóg? ± SE)Mean anti-sGnRH-Glv-Cvs antibody titers (log ± SE)
ii) Érésben lévő szivárvány pisztráng 17-B-ösztradiol szérumszintje: SGnRH-Gly-Cys-PPD-vel végzett immunizáció hatásaii) Serum levels of 17-B-estradiol in ripening rainbow trout: effect of immunization with SGnRH-Gly-Cys-PPD
A 2. táblázatban ismertetett eredményekből látható, hogy a 4 hetes utóimmunizáció alatt az érésben lévő nőstény pisztrángok 17-B-ösztradiol-szintje a kezelt és kontroll csoportnál azonos sebességgel nőtt. A 8 hetes utóimmunizáció során a kontroll csoport 17-B-ösztradiol szintje ugyanolyan sebességgel nőtt, azonban az sGnRH-Gly-Cys-PDD-kezelt érésben lévő nőstények 17-β-ösztradiol-szintje lényegesen alacsonyabb, mint az érésben lévő kontroll nőstényeké (p<0,05:t-teszt).The results presented in Table 2 show that during the 4-week post-immunization, the levels of 17-B-estradiol in the maturing female trout increased at the same rate in the treated and control groups. During the 8-week post-immunization, the levels of 17-β-estradiol in the control group increased at the same rate, but the levels of 17-β-estradiol in the maturation females of sGnRH-Gly-Cys-PDD were significantly lower than that of the matured control females (p <0.05: t-test).
1. táblázatTable 1
Átlagos anti-sGnRH-Glv-Cys antitest titerek (log^ ± SE) (hímek és nőstények).Mean anti-sGnRH-Glv-Cys antibody titers (log ^ ± SE) (males and females).
ii) Érésben lévő szivárvány pisztráng 17-B-ösztradiol szérumszintje: SGnRH-Gly-Cys-PPD-vel végzett immunizáció hatásaii) Serum levels of 17-B-estradiol in ripening rainbow trout: effect of immunization with SGnRH-Gly-Cys-PPD
A 2. táblázatban ismertetett eredményekből látható, hogy a 4 hetes utóimmunizáció alatt az érésben lévő nőstény pisztrángok 17-B-ösztradiol-szintje a kezelt és kontroll csoportnál azonos sebességgel nőtt. A 8 hetes utóimmunizáció során a kontroll csoport 17-B-ösztradiol szintje ugyanolyan sebességgel nőtt, azonban az sGnRH-Gly-Cys-PDD-kezelt érésben lévő nőstények 17-β-ösztradiol-szintje lényegesen alacsonyabb, mint az érésben lévő kontroll nőstényeké (p<0,05:t-teszt).The results presented in Table 2 show that during 4 weeks post-immunization, the levels of 17-B-estradiol in the maturing female trout increased at the same rate in the treated and control groups. During the 8-week post-immunization, the levels of 17-β-estradiol in the control group increased at the same rate, but the levels of 17-β-estradiol in the maturation females of sGnRH-Gly-Cys-PDD were significantly lower than that of the matured control females (p <0.05: t-test).
2. táblázatTable 2
Érésben lévő szivárvány pisztrángok átlagos 17-B-ösztradiol-szintje (ng/ml ±SE) és az sGnRHa-PPD-vel végzett immunizáció hatása kezelt csoport kontroll immunizálás 4 előttMean levels of 17-B-estradiol (ng / ml ± SE) in ripening rainbow trout and the effect of immunization with sGnRHa-PPD before treated group control immunization
7,35 ± 0,77 n=267.35 ± 0.77 n = 26
5,85 ± 0,39 n=23 hetes utóimmunizálás5.85 ± 0.39 n = 23 weeks post-immunization
16,85 ± 1,57 n=2316.85 ± 1.57 n = 23
16,36 ± 1,33 n=21 hetes utóimmu nizálás16.36 ± 1.33 n = 21 weeks postimmunization
21,04 ± 2,29 n=2 321.04 ± 2.29 n = 2 3
28,38 ± 2,61 n=18 iii) Az antitest titerek és a szteroidszint korrelációja28.38 ± 2.61 n = 18 iii) Correlation between antibody titers and steroid levels
Nyilvánvalóan látható, hogy az sGnRH-Gly-Cys-PPD-vel végzett immunizálás utáni antitest titerek növekedése az érésben lévő szivárvány pisztrángokban mért lényegesen alacsonyabb 17-B-ösztradiol szérumszint-növekedéssel korrelál. Az adatok azt mutatják, hogy a pGnRH-Gly-Cys-PPD a nőstény szivárvány pisztráng szexuális érésének kezdetét késleltetve fejti ki hatását.Obviously, the increase in antibody titers after immunization with sGnRH-Gly-Cys-PPD correlates with the significantly lower increase in serum levels of 17-B-estradiol in ripening rainbow trout. The data show that pGnRH-Gly-Cys-PPD delays the onset of sexual maturation of female rainbow trout.
Claims (22)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB919100468A GB9100468D0 (en) | 1991-01-09 | 1991-01-09 | Improvements in and relating to hormones |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9301979D0 HU9301979D0 (en) | 1993-11-29 |
| HUT66829A true HUT66829A (en) | 1995-01-30 |
Family
ID=10688207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9301979A HUT66829A (en) | 1991-01-09 | 1992-01-08 | Analogs of piscine lhrh |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0566611A1 (en) |
| JP (1) | JPH06504537A (en) |
| KR (1) | KR930703444A (en) |
| CN (1) | CN1063109A (en) |
| AU (1) | AU652611B2 (en) |
| CA (1) | CA2100057A1 (en) |
| DK (1) | DK80993A (en) |
| FI (1) | FI933138A0 (en) |
| GB (2) | GB9100468D0 (en) |
| HU (1) | HUT66829A (en) |
| IE (1) | IE920055A1 (en) |
| IS (1) | IS3802A (en) |
| NO (1) | NO932491L (en) |
| NZ (1) | NZ241240A (en) |
| PT (1) | PT99991A (en) |
| WO (1) | WO1992012247A1 (en) |
| ZW (1) | ZW392A1 (en) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6261569B1 (en) * | 1992-08-27 | 2001-07-17 | Deakin Research Limited | Retro-, inverso- and retro-inverso synthetic peptide analogues |
| US5688506A (en) | 1994-01-27 | 1997-11-18 | Aphton Corp. | Immunogens against gonadotropin releasing hormone |
| US5760000A (en) * | 1994-05-13 | 1998-06-02 | University Technologies International,Inc. | Inhibition of liver cancer by the use of GnRH and GnRH analogs |
| CA2356452A1 (en) * | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Robert Brown | Compositions and methods for reducing or preventing fertilization in fish and birds |
| GB0226179D0 (en) | 2002-11-09 | 2002-12-18 | Millar Robert P | Vaccine |
| NO20075894L (en) * | 2007-11-15 | 2009-05-18 | Thia Medica As | Reduced maturation in fish |
| JP6909160B2 (en) * | 2015-11-27 | 2021-07-28 | 日本水産株式会社 | Fish feed using cell-penetrating peptide and cell-penetrating peptide |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4443368A (en) * | 1982-11-01 | 1984-04-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Peptides affecting gonadal function |
| US4410514A (en) * | 1982-12-06 | 1983-10-18 | The Salk Institute For Biological Studies | GnRH Agonists |
| US4608251A (en) * | 1984-11-09 | 1986-08-26 | Pitman-Moore, Inc. | LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues |
| GB8713240D0 (en) * | 1987-06-05 | 1987-07-08 | Proteus Biotech Ltd | Hormones |
| WO1993003058A2 (en) * | 1991-07-01 | 1993-02-18 | University Technologies International Inc. | NON-DESENSITIZING ANALOGS OF GnRH AND OTHER BIOLOGICALLY ACTIVE LIGANDS |
-
1991
- 1991-01-09 GB GB919100468A patent/GB9100468D0/en active Pending
-
1992
- 1992-01-07 NZ NZ241240A patent/NZ241240A/en unknown
- 1992-01-08 HU HU9301979A patent/HUT66829A/en unknown
- 1992-01-08 CA CA002100057A patent/CA2100057A1/en not_active Abandoned
- 1992-01-08 AU AU11617/92A patent/AU652611B2/en not_active Ceased
- 1992-01-08 JP JP4502565A patent/JPH06504537A/en active Pending
- 1992-01-08 EP EP92902189A patent/EP0566611A1/en not_active Withdrawn
- 1992-01-08 KR KR1019930702060A patent/KR930703444A/en not_active Application Discontinuation
- 1992-01-08 IE IE005592A patent/IE920055A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-01-08 PT PT99991A patent/PT99991A/en not_active Application Discontinuation
- 1992-01-08 WO PCT/GB1992/000040 patent/WO1992012247A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-01-08 IS IS3802A patent/IS3802A/en unknown
- 1992-01-09 CN CN92100141A patent/CN1063109A/en active Pending
- 1992-01-09 ZW ZW3/92A patent/ZW392A1/en unknown
-
1993
- 1993-07-06 DK DK080993A patent/DK80993A/en not_active Application Discontinuation
- 1993-07-08 NO NO93932491A patent/NO932491L/en unknown
- 1993-07-08 FI FI933138A patent/FI933138A0/en not_active Application Discontinuation
- 1993-07-08 GB GB9314141A patent/GB2267496B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06504537A (en) | 1994-05-26 |
| NO932491D0 (en) | 1993-07-08 |
| FI933138A (en) | 1993-07-08 |
| GB9314141D0 (en) | 1993-09-22 |
| CA2100057A1 (en) | 1992-07-10 |
| ZW392A1 (en) | 1992-07-22 |
| AU1161792A (en) | 1992-08-17 |
| AU652611B2 (en) | 1994-09-01 |
| CN1063109A (en) | 1992-07-29 |
| EP0566611A1 (en) | 1993-10-27 |
| GB9100468D0 (en) | 1991-02-20 |
| HU9301979D0 (en) | 1993-11-29 |
| PT99991A (en) | 1993-01-29 |
| WO1992012247A1 (en) | 1992-07-23 |
| NO932491L (en) | 1993-07-08 |
| NZ241240A (en) | 1992-11-25 |
| IE920055A1 (en) | 1992-07-15 |
| GB2267496A (en) | 1993-12-08 |
| FI933138A0 (en) | 1993-07-08 |
| DK80993D0 (en) | 1993-07-06 |
| IS3802A (en) | 1992-07-10 |
| DK80993A (en) | 1993-07-06 |
| GB2267496B (en) | 1994-09-07 |
| KR930703444A (en) | 1993-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0093652B1 (en) | Synthetic toxin st, process for its preparation and its use as a vaccination agent | |
| TWI225069B (en) | Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens including immunogenic LHRH peptides | |
| RU2078770C1 (en) | Peptide derivatives and composition causing immune response to lhrh | |
| EP0567512A1 (en) | Sperm cell surface protein ph-20. use in a contraceptive vaccine | |
| JPH08504090A (en) | Anti-feline immunodeficiency virus (FIV) vaccine | |
| KR100335320B1 (en) | Improved peptides, immunogenic compositions and vaccines or medical preparations for progesterone-releasing hormones, methods of immunizing animals, and their use as analogs and vaccines of luteinizing hormone-releasing hormone serial repeat peptides | |
| HUT66829A (en) | Analogs of piscine lhrh | |
| CN107073086B (en) | Immune LHRH composition and application thereof in pigs | |
| EP0450715B1 (en) | Immunogenic compounds, the process for their synthesis and their use in the preparation of antimalaria vaccines | |
| EP0323769B1 (en) | Peptide structures, immunogens containing them, and their use in the control of fertility | |
| WO1989000166A2 (en) | Growth hormone related peptide | |
| US20060188513A1 (en) | Novel inhibin-related multiple antigenic peptide compositions that enhance production performance in avians | |
| ES2280402T3 (en) | DISCRIMINATION BETWEEN GNRH-I AND GNRH-II. | |
| US4578219A (en) | Antigenic peptide compound | |
| WO2014118318A1 (en) | Kiss1r receptor agonist compounds and use thereof for inducing ovulation in mammals | |
| JP2002518033A (en) | Synthetic somatostatin immunogen for promoting growth of farm animals | |
| FR2532850A1 (en) | Immunogenic conjugates between a hapten and a carrier molecule derived from a toxin, vaccines comprising them and method for obtaining them | |
| HU210966B (en) | Method for the preparation of peptides and veterinary compositions containing them | |
| FR2551088A1 (en) | ||
| EP0088752A1 (en) | Antigenic peptide compound. | |
| CS272790A2 (en) | Peptides with biological effect | |
| CA2389196A1 (en) | Cyclic peptides and aids vaccines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |