CN1310628A - 提高动物肉产量的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了提高雄性动物肉产量的方法。方法使用含有GnRH免疫原的组合物。方法适用于生产具有改善的感官质量的肉块。

Description

提高动物肉产量的方法
技术领域
本发明涉及提高雄性动物肉产量的方法。更具体而言，本发明涉及的方法是：初次接种GnRH免疫原来免疫动物，从而降低循环中性类固醇水平，在屠宰动物前不久再次接种GnRH免疫原以显著降低一种或多种雄性和/或非雄性类固醇水平。
发明背景
雄性牛、猪和山羊的肌肉通常更为强壮，而且其成年体格也大于雌性。传统的解释是：随着雄性动物性成熟，睾酮分泌(睾酮是睾丸产生的雄性类固醇)，导致肌肉蛋白质沉积和脂肪减少。不胜枚举的研究已经证明，成长期雄性动物对饲料的利用较雌性动物更为有效(Field，R.A.，动物科学杂志(J.Animal Sci.)(1971)32:849-858)。这些差异在青春期阶段附近最为明显，而睾酮在调节这些变化中发挥着重要作用。
在雄性动物中，雄性类固醇一睾酮和雄甾烯酮参与调节两种不同的生物过程。一个作用是生理性的，增加肌肉沉积，减少脂肪合成，并且提高饲料利用效率。睾酮对性腺如精囊、前列腺和睾丸的发育具有类似的直接效应。这些作用包括该雄激素与靶组织上的受体直接相互作用。雄性激素的第二个通常作用是引起雄性的性和其它行为特点变化。这些作用是通过中枢神经系统来介导的。由于这些不同的作用发生在不同的组织，分子机制不同，因此，其中一些作用在低血浆浓度的雄性激素时得以保持，而其它作用则需要更高水平的雄性激素，这是可能的。
尽管通常假定在生命早期需要雄性激素来维持最适生长、肌肉沉积和饲料利用效率，但是此假定也许并非是事实，即使存在可测得的雄性激素。或者，雄激素-敏感组织如肌肉在生命早期较在青春期或青春期后对低水平的雄性激素更为敏感。Allrich等，动物科学杂志(J.Animal Sci.)(1982)55:1139-1146，猪体重增加和睾酮-敏感组织重量增加的相对速度是年龄和睾酮浓度的函数。
尤其是，不同年龄的不同组织生长相对速度显示出对睾酮的组织敏感性，以及睾酮浓度随着年龄而变化。举例来说，作者证实从40天到100天，血清睾酮浓度增加3.1倍，体重增加3.2倍，睾丸重量增加3.6倍，而精囊增加4.0倍。这些数据也表明：青春期前的睾酮水平是低的，但是已经能够检测得到，而且体重以大约与其它组织在低水平睾酮时的相同速度增加。猪大约在130到150日龄(体重65-85kg)时开始达到性成熟，同一时间血清睾酮浓度显著增加。从100天到190天，血清浓度增加4.0倍，而体重、睾丸重量和精囊重量则分别增加2.6倍、13.5倍和9.2倍。
另外，Knudson等在动物科学杂志(J.Animal Sci.)(1985)61:789-796中指出：直到90天日龄时去势雄性猪与未去势雄性猪的体重增加速度相同，但是，90天之后未去势雄性猪增长快于去势猪。该特性对于免疫绝育的群养动物来说特别重要，尤其是当需要免疫去势雄性猪仔以预防“公猪异味(boar taint)”时，所述公猪异味”是由于功能正常的雄性猪睾丸中性激素的合成而产生的。参见例如Meloen等人，疫苗(Vaccine)(1994)12(8):741-746。
利用猪和牛已经进行了大量研究，来探讨GnRH免疫作为改善动物生长速度和饲料利用效率的方法的用途。参见例如，Adams和Adams，动物科学杂志(J.Animal Sci.)(1992)70:1691-1698；Caraty和Bonneau，C.R.Acad.Sc.Paris(1986)303:673-676；Chaffaux等，Recueil de MedicineVeterinaire(1985)161:133-145；Finnerty等，生殖生育杂志(J.Repro.Fertil.)(1994)101:333-343。这些研究中，多数的目的是使动物象未去势雄性动物那样生长至肥育期末，然后将动物进行免疫去势。为了达到在肥育期末以及恰好在屠宰前免疫去势动物的目的，就得在生命早期对动物进行一次或多次接种来致敏免疫系统以便使动物对肥育期末的再次接种反应强烈。初次接种时，使用GnRH抗原来致敏免疫系统，但是要避免引发高的抗-GnRH抗体滴度，因为高的抗-GnRH抗体滴度将降低血清睾酮水平或者阻止睾酮水平随着动物青春期的来临而增加。这是因为，据信降低血清睾酮水平也将会降低年轻动物的生长速度或者饲料利用效率。
例如，Meloen等在疫苗(Vaccine)(1994)12:741-746中描述了GnRH串联(tandem)疫苗的应用，以两种剂量施用，来减少猪的公猪异味。并未出现睾丸减小，直至第二次免疫之后。也参见1990年10月4日公告的WO90/11298。Falvo等在动物科学杂志(J.Anim.Sci.)(1986)63:986-994中报道了使用GnRH疫苗研究猪的各种反应，包括公猪异味的出现和尸体特性。作者报道称，首次加强注射后2周血浆睾酮水平显著下降。类似地，5573767号美国专利涉及使用GnRH免疫改善肉的感官质量的方法。该方法限定两次免疫，一次免疫对生殖腺类固醇分泌无影响，在屠宰前进行第二次免疫以便消除雄性和非雄性类固醇的作用。
此外，前述在免疫去势方面的各种努力没有产生一致的结果，这是由于GnRH肽和/或相关载体系统没有足够的免疫原性，和现有各种基于GnGH的疫苗产物不能引发足够的针对内源性GnRH的免疫反应。参见例如，Robertson,Vet.Record(1981)108:381-382。因此，需要可靠的用于免疫去势产肉动物的方法。
发明公开
本发明基于一个可靠的、可再现的提高雄性产肉动物肉产量的方法。更具体而言，与盛行的观点相反，本发明基于本文描述的试验，认为：为了生产商业上可接受质地的肉而避免在生命早期显著降低睾酮的做法是不必要的，诱导对肥育期生殖类固醇分泌具有可检测得到的作用的抗体的初次GnRH免疫可以达到目的，而并不显著降低生长速度或者饲料利用效率。初次免疫后，在有生期可以进行消除雄性和/或非雄性类固醇作用的第二次免疫。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及提高肉产量的方法，包括在动物肥育期前或肥育期间用含有GnRH免疫原的第一疫苗组合物接种动物来降低循环中的睾酮水平，屠宰动物前约2～8周用含有GnRH免疫原的第二疫苗组合物接种动物来明显降低一种或多种雄性和/或非雄性类固醇水平。在一特别优选的实施方案中，第一和/或第二疫苗组合物含有免疫佐剂如含有油和二甲基二-十八烷基溴化铵的佐剂。另外，第一和第二疫苗组合物中的GnRH免疫原可以是含有通式为(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多体(multimer)，其中
GnRH是GnRH免疫原；
X是选自肽键、氨基酸间隔基团、载体分子和[GnRH]n的一个或多个分子，其中n是大于或者等于1的整数；和
y是大于或者等于1的整数。
在一些实施方案中，施用第一疫苗组合物产生与动物内源性GnRH相互作用的抗体，在抗体水平已经降低后再施用第二疫苗组合物。
在另一实施方案中，本发明涉及提高未去势雄性牛、羊或猪的肉产量的方法，包括在动物肥育期前或肥育期间用含有GnRH免疫原的第一疫苗组合物接种动物来降低循环中的睾酮水平，屠宰动物前约2～8周用含有GnRH免疫原的第二疫苗组合物接种动物来明显降低一种或多种雄性和/或非雄性类固醇水平。第一和/或第二疫苗组合物可以进一步含有免疫佐剂。
还有一实施方案，本发明涉及提高未去势雄性牛、羊或者猪的肉产量的方法，包括：
(a)用包括免疫佐剂和含有通式为(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多体的第一疫苗组合物接种动物，通式中
GnRH为GnRH免疫原；
X是选自肽键、氨基酸间隔基团、白细胞毒素多肽和[GnRH]n的一个或多个分子，其中n是大于或者等于1的整数；和
y是大于或者等于1的整数，其中所述第一疫苗组合物在动物肥育期前或肥育期施用以降低循环中的睾酮水平；和(b)用包括免疫佐剂和含有通式为(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多体的第二疫苗组合物接种动物，通式中
GnRH是GnRH免疫原；
X是选自肽键、氨基酸间隔团、白细胞毒素多肽和[GnRH]n的一个或多个分子，其中n是大于或者等于1的整数；和
y是大于或者等于1的整数，其中所述第二疫苗组合物在屠宰动物前约2～8周施用以明显降低一种或多种雄性和/或非雄性类固醇水平。
在另一实施方案中，本发明涉及提高未去势雄性牛、羊或者猪的肉产量的方法，包括：
(a)用包括免疫佐剂和GnRH多体的第一疫苗组合物给动物接种，所述GnRH多体含有图3A-3F(SEQ ID号：12和13)描述的氨基酸序列或者具有与其至少约75％序列同源性的氨基酸序列，其中第一疫苗组合物在动物肥育期前或肥育期施用以降低循环中的睾酮水平；和
(b)用包括免疫佐剂和GnRH多体的第二疫苗组合物给动物接种，所述GnRH多体含有图3A-3F(SEQ ID号：12和13)描述的氨基酸序列或者具有与其至少约75％序列同源性的氨基酸序列，其中第二疫苗组合物在屠宰动物前约2～8周施用以明显降低一种或多种雄性和/或非雄性类固醇水平。第一和/或第二疫苗组合物的佐剂可以包括轻矿物油和二甲基二-十八烷基溴化铵。
根据本文的公开，本领域技术人员将很容易地重现本发明的这些和其它实施方案。
附图简述
图1描述试验第35天、猪的日龄为63天时加强接种前和试验第49天、猪的日龄为77天时加强接种后14天的抗体滴度之间的关系，如实施例中所描述的。
图2A(SEQ ID号：8和9)和2B(SEQ ID号：10和11)显示本文嵌合的白细胞毒素-GnRH多肽基因融合中使用的GnRH构建体的核苷酸序列和氨基酸序列。图2A(SEQID号：8和9)描述单拷贝GnRH十肽。图2B(SEQID号：10和11)描述当n=1时的四拷贝GnRH十肽和n=2时八拷贝GnRH十肽分子等。
图3A-3F(SEQ ID号：12和13)显示来自质粒pCB122和pCB130的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和预计的氨基酸序列。
图4显示与去势雄性猪(barrows)和未去势雄性猪(boars)相比，接受本发明GnRH疫苗处理(免疫去势)的猪的体重是其日龄的函数。
发明详述
如未另外声明，则本发明实践将使用本领域分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术学和免疫学的常规技术。文献对这些技术作了充分的解释，参见例如Sambrook,Fritsch&Maniais，分子克隆：实验室手册；DNA克隆，第1、Ⅱ卷(D.N.Glover编写)；寡核苷合成(M.J.Gait编写)；核苷酸杂交(B.D.Hames&S.J.Higgins编写)；B.Perbal，分子克隆的实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)；丛书，酶学方法(Methods Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编写，学术出版社有限公司)；及实验免疫学手册(Hndbook ofExperimentalImmunology)，第Ⅰ-Ⅳ卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编写，Blackwell科学出版社)。
在详细描述本发明之前，应当认识到本发明并不局限于特定制剂和方法参数本身，制剂和方法当然可以变化。也应当懂得本文使用的术语仅旨在为描述本发明特定实施例的目的，而不受其限制。
1．定义
在描述本发明的过程中，将使用到下列术语，这些术语的定义如下：
术语“促性腺激素释放激素”或“GnRH”，是指脊椎动物下丘脑分泌的控制促黄体生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)释放的十肽(Fink,G.，英国医学公报(British Medical Bulletin)(1979)35:155-160)。在脊椎动物尤其是哺乳动物中，GnRH的氨基酸序列高度保守。在这方面，得自大多数哺乳动物包括人、牛、猪和羊的GnRH(以前曾称之为LHRH)的氨基酸序列为：焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(SEQID号：1)(Murad等人，在第六版(1980)的治疗学的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)中激素与激素拮抗剂(Hormones andHormone Antagonists)一章，和Seeburg等人，自然(Nature)(1984)311:666-668)。
这里使用的“GnRH多肽”，包括衍生自天然GnRH序列的分子，也包括重组产生的或化学合成的具有基本与天然GnRH同源的氨基酸序列并且保持如下所述免疫原性的GnRH多肽。因而，术语涵盖任何在肽内部或者在氨基-末端或羧基-末端发生单个或多个氨基酸添加、取代和/或缺失的GnRH衍生物和类似物。相应地，本发明中“GnRH多肽”包括具有GnRH天然序列的分子，也包括GnRH类似物。
代表性的GnRH类似物包括具有N-末端Gln或Glu残基而不是焦Glu残基的类似物，Asp在氨基酸2位上取代His的类似物(见图2A(SEQ ID号：8和9)和2B(SEQ ID号：10和11))；具有N-末端添加了诸如Cys-Gly-GnRH的GnRH类似物(参见例如，Prendiville等，动物科学杂志(J.Animal Sci.)(1995)73:3030-3037)；羧基末端含有GnRH的类似物(参见例如，Jago等，动物科学杂志(J.Animal Sci.)(1997)75:2609-2619；Brown等，生殖生育杂志(J.Reproduc.Fertil.)(1994)101:15-21)；GnRH类似物(D-Trp6-Pro9-乙基酰胺)GnRH(参见例如，Tilbrook等，激素和行为(Hormonesand Behavior)(1993)27:5-28)或者(D-Trp6)GnRH(参见例如，Chaffaux等，Recueil de Medecine Veterinaire(1985)161:133-145)；第一、第六和/或第十位正常出现的氨基酸被Cys取代和/或其N-末端是乙酰化的和/或C-末端是酰胺的GnRH类似物(参见例如，美国专利4608251和4975420)；GnRH类似物焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Gly-Y-Z(SEQ ID号：2)，其中X是Gly或D-氨基酸，Y是一个或多个相同或不相同的氨基酸残基，优选1-3个Gly残基，而Z是Cys或Tyr(参见UK专利公开号GB2196969)；美国专利5688506中描述的GnRH类似物，包括GnRH类似物Cys-Pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQ ID号：3)，焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID号：4)，焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(SEQ ID号：5)；可由Apeptech(澳大利亚)商购得到的称作Deslorelin的GnRH类似物，和OvuplantTM；伴有其它氨基酸添加、取代和/或缺失而又保持引发生成与天然存在的GnRH相互作用的抗体的能力的分子。
因此，术语“GnRH多肽”包括因有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而与参照序列不同并且与参照分子具有至少约50％氨基酸同源性的GnRH分子，更优选与正被讨论的天然多肽序列的相关部分约75-85％同源，最优选约90-95％或更多同源。氨基酸序列不超过约1-5个氨基酸取代，或者不超过约1-3个氨基酸取代。特别优选的取代通常在本质上是保守的，即，取代发生在同类(family)氨基酸中。在这方面，氨基酸一般分为四类：(1)酸性氨基酸一天门冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸一赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸一丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；(4)不带电荷的极性氨基酸一甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸分为芳香类氨基酸。举例来说，可以合理预见到下列取代将不会对活性产生大的影响：用异亮氨酸或缬氨酸孤立地取代亮氨酸，反之亦然；用谷氨酸取代天门冬氨酸或者相反取代；用丝氨酸取代苏氨酸或者相反取代；或者用结构相关的氨基酸进行相似的保守取代。因此，具有与参照分子基本上相同氨基酸序列但是有少数氨基酸取代并保持所需活性的蛋白质包括在GnRH多肽的定义之内。
“GnRH多肽”也包括参照GnRH分子的肽片段，只要分子保持所需的活性即可。GnRH的抗原决定基也包括在定义之内。
这里特别考虑的是GnRH多体包括重复序列的GnRH多肽，比如包括2、4、8、16、32拷贝等的一种或多种GnRH多肽，任选地包括间隔序列，诸如在国际申请公开WO98/06848和WO96/24675中描述的以及本文图2B(SEQ ID号：10和11)所示的那些间隔序列。下面将更加详细地描述这些多体。
为了本发明的目的，GnRH多肽可以衍生自任何已知的各种GnRH序列，如前面所述的，包括但不限于衍生自人、牛、羊、猪、犬、猫、鹿，啮齿类如仓鼠、天竺鼠、沙土鼠、ground hogs、衣囊鼠、兔形目动物、兔、白鼬、爬虫类和鸟类的GnRH多肽。
“GnRH肽”是GnRH多肽，如这里描述的，包括少于正在讨论的参照GnRH分子全长和包括至少一种下面定义的抗原决定基。因此，含有GnRH肽的疫苗组合物将包括正在讨论的GnRH肽分子全长的一部分而不是整个GnRH分子。这里使用的特定GnRH肽包括例如，具有5、6或7个氨基酸的GnRH肽，尤其是那些包括氨基末端或羧基末端的肽，比如包括天然序列的氨基酸1-5、1-6、1-7、2-8、3-8、3-10、4-10和5-10的GnRH肽(参加例如，国际申请公开WO88/05308)。
“GnRH多体”是指具有多于一个拷贝选定GnRH多肽、GnRH免疫原、GnRH肽或抗原决定基的分子，或者具有多个串联重复的选定GnRH多肽、GnRH免疫原、GnRH肽或抗原决定基的分子。GnRH多体可以相当于具有重复单元通式(GnRH-X-GnRH)y的分子，通式中GnRH是GnRH多肽，X是一个或多个选自肽键、氨基酸间隔基团、载体分子和[GnRH]n的分子，其中n是大于或等于1的整数，y是大于或等于1的整数，而且其中的“GnRH”可进一步包括任何GnRH多肽。因此，y可以是限定1-40或更多个重复单元，更优选1-30个重复单元，最优选1-20个重复单元。此外，选定GnRH序列可以均相同，或者相当于GnRH的不同衍生物、类似物、变体或抗原决定基，只要它们仍保持引发免疫反应的能力即可。另外，如果GnRH单元化学性地或重组性地与载体相连接的话，GnRH分子既可与5’-端、3’-端连接，也可侧面与正在讨论的载体相接。而且，GnRH多体可以位于载体内部的位点上。下面将更加详细地讨论GnRH多体。
术语“GnRH免疫原”，指GnRH多肽，如前所述，不与免疫性载体、佐剂或免疫刺激剂联合时引发免疫反应的多肽，以及通过与载体分子、佐剂或免疫刺激剂联合或者通过天然序列突变和/或通过将含有至少一个GnRH分子抗原决定基的多个重复单元整合入分子中，而能够产生免疫原性的GnRH多肽。术语可以指单个大分子，或者指衍生自GnRH的抗原大分子的同源或异源群体。
通常，GnRH免疫原释入脊椎动物后，将引发生成与脊椎动物天然存在的内源性GnRH相互作用的抗体。术语“GnRH免疫原”也指核酸分子，如编码GnRH多肽的DNA和RNA分子，使用下面将进一步描述的核苷酸释放技术而将DNA和RNA分子施用时能够在体内表达所述GnRH多肽。
“同源”指两个多核苷酸或两个多肽组成部分之间相同的百分比。当序列相对于分子的一规定长度显示出至少约75-85％，优选至少约90％和最优选至少约95-98％序列同源时，则两个DNA或两个多肽序列彼此“基本同源”。这里使用的基本同源也指与特定DNA或多肽序列完全相同的序列。
通过下述步骤直接比较两分子之间的序列信息，可以测定两个氨基酸或多核苷酸序列之间“相同”的百分比：校准序列，计数两个校准序列之间相匹配的确切数字，除以最短序列长度，和将结果乘以100。可以使用已编好的计算机程序来帮助分析，如ALIGN，Dayhoff,M.O.在蛋白质序列和结构分析(Atlas of Protein Sequence and Structure)，M.O.Dayhoff编著，5 Suppl.3:353-358上发表的，国家生物医学研究基金会，华盛顿DC，它改编了Smith和Wisconsin(1981)在应用数学进展(Advancesin Appl.Math.)2:482-489上发表的肽分析用的局部同源性算法(localhomology algorithm)。测定核苷酸序列同源性的程序可以使用Wisconsin序列分析软件包，第8版(可购自基因计算机组，Madison,WI)，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也是建立在Smith和Waterman算法的基础上。这些程序可方便地使用制造商推荐的和上述在Wisconsin序列分析软件包中描述的缺省参数。举例来说，特定分子序列相对于参照序列的相同百分比可以使用Smith和Waterman的默认记分表和6个核苷酸位的缺口补偿(gap penalty)的同源性算法进行测定。
“抗原决定基”指具有引发GnRH-特异性抗体生成并且与GnRH-特异性抗体相结合的能力或潜能的分子的任何部分或区域。为了本发明的目的，多肽抗原决定基通常包括参照分子的至少约3个氨基酸，优选至少约5个氨基酸。对于片段长度而言，没有严格的上限，可以包括近乎蛋白质序列的全长，或者甚至含有正在讨论的蛋白质的两个或多个抗原决定基的融合蛋白。
由于GnRH分子非常小，因此，使用本领域众所周知的技术可以很方便地完成其能够引发抗体反应的抗原决定基的鉴定。例如，使用本领域熟知的许多抗原决定基测绘(map)技术中的任何一种，可以识别多肽分子的抗原决定基。参见例如分子生物学方法中抗原决定基测绘方案(Epitope Mapping Protoclos in Methods in Moleclar Biology)，第66卷(GlennE.Morris编著，1996),Humana Press,Totowa，新泽西。例如，线性抗原决定基可以通过例如如下步骤进行测定：在固体载体上并行地合成大量的肽，所述肽对应于蛋白质分子的各个部分，当肽仍然附着在载体上时使肽与抗体发生反应。该技术为本领域技术人员所公知并且在例如下列文献中作了描述：美国专利4708871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8l:3998-4002；Geysen等(1986)分子免疫学(Molec.Immunol.)23:709-715。类似地，通过测定氨基酸空间构象可以很方便地识别构象抗原决定基，氨基酸空间构象可以通过例如X-线晶体照相术和2-二维核磁共振进行测定。参见例如，抗原决定基测绘方案(Epitope MappingProtocols),supra。
按照例如Kyte等在分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1982)157:105-132；和Hopp和Woods在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:3824-3828上所描述的，利用每20个氨基酸的亲水和疏水特性而用公式表示蛋白质氨基酸序列的亲水性程度的计算机程序也可以用于测定给定分子的抗原部分。例如，Hopp和Woods技术给每个氨基酸赋予亲水性数值，然后沿着肽链重复平均这些数值。最高局部平均亲水性位点表示分子的抗原部分。
“免疫载体”指当与有关GnRH免疫原联合时赋予分子免疫性或增加分子免疫性的任何分子。适宜载体的实例包括大的、慢代谢的大分子如蛋白质；多糖，如琼脂糖、纤维素、纤维素珠等；聚合的氨基酸如聚谷氨酸、聚赖氨酸等；氨基酸共聚物；灭活病毒颗粒；细菌毒素如由白喉、破伤风、霍乱、白细胞毒素分子等提取的毒素。下面将对载体作更加详细的描述。
当免疫原与载体化学性偶合或联合时，或者当免疫原在编码免疫原和有关载体的嵌合DNA分子中表达时，GnRH免疫原与特定载体相“连接”。
“免疫联合体”是指与上述定义的载体分子相连接的GnRH免疫原如GnRH肽或多体。
术语“白细胞毒素多肽”或“LKT多肽”指衍生自以羧基末端共有氨基酸序列Gly-GIy-X-GIy-X-Asp(SEQ ID号：14)为特征的一类蛋白质分子的多肽(Highlander等(1989)DNA 8:15-28)，其中X是Lys、Asp、Val或Asn。这些蛋白质包括，除了别的之外(among others)，衍生自P.Haemolytica和放线杆菌属胸膜肺炎的白细胞毒素，以及大肠杆菌溶血素(Strathdee等，(1987)感染免疫学(Infect.Immun.)55:3233-3236；Lo(1990)Can.J.Vet.Res.54:S33-S35；Welch(1991)现代微生物学(Mol.Microbiol.)5:521-528)。此类毒素被称为“RTX”类毒素(Lo(1990)Can.J.Vet.Res.54:S35-S35)。另外，术语“白细胞毒素多肽”指化学合成的、由表达白细胞毒素的生物体中提取的或者重组产生的白细胞多肽。而且，术语指具有与在特定白细胞毒素分子中发现的邻接氨基酸序列基本同源的氨基酸序列的免疫原性蛋白质。由此，术语既包括全长序列也包括部分序列，以及类似物。尽管天然全长白细胞毒素显示细胞毒活性，术语“白细胞毒素”也指保持免疫原性而缺乏天然白细胞毒素的毒性特征的分子。
数种白细胞毒素的核苷酸序列和相应氨基酸序列是已知的。参见例如，美国专利4957739和5055400；Lo等(1985)感染免疫学(Infect.Immun.)50:667-67；Lo等(1987)感染免疫学(Infect.Immun.)55:1987-1996；Strathdee等(1987)感染免疫学(Infect.Immun.)55:3233-3236；Highlander等(1989)DNA 8:15-28；和Welch(1991)现代微生物学(Mol.Microbiol.)5:521-528。
在本发明一优选的实施方案中，白细胞毒素嵌合体具有特定的白细胞毒素多肽序列，所述序列赋予与之融合的一个或多个GnRH多体增强的免疫原性。
本发明中所用的免疫原性白细胞毒素多肽的特定实例是美国专利5476657和5837268中描述的截短了的白细胞毒素分子。这些截短的分子包括LKT 352、LKT 111和LKT 114。LKT352得自质粒pAA352(ATCC登录号为68283)中的1kta基因。美国专利5476657对该基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列作了描述。基因编码了一个有914个氨基酸和估计分子量约99kDa的截短的白细胞毒素。LKT 111得自质粒pCB111(ATCC登录号为69748)中1kta基因的的白细胞毒素多肽。美国专利5837268对该基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列作了描述。该基因编码了一个截短的白细胞毒素，所述白细胞毒素是由质粒pAA352(ATCC登录号为68283)中的重组白细胞毒素基因去掉大约1300bp长度的内部DNA片段而得来的。LKT 111多肽的分子量约52 kDa(LKT352多肽的分子量为99 kDa)，但是保留了含有T-细胞抗原决定基的LKT352 N-末端部分和含有用于产生本发明所用融合蛋白的适宜限制位置的LKT 352 C-末端部分，其中T-细胞抗原决定基对于足够的T-细胞免疫原性是必要的。LKT 114得自质粒pAA114(在美国专利5837268中描述)中的基因。LKT 114通过在分子内部有另外的氨基酸缺失而有别于LKT111。
“免疫佐剂”指以非特异方式增加对特定抗原的免疫反应从而降低任何指定疫苗所必需的抗原量和/或减少为产生对有关抗原的充分免疫反应所必需的注射频率的试剂。参见例如A.C.Allison J.Reticuloendothel.Soc.(1979)26:619-630。
“天然”蛋白质、多肽或肽是由天然含有蛋白质的源物质中提取出来的蛋白质、多肽或肽。“重组”多肽指由重组DNA技术产生的多肽；即，由编码所需多肽的外源性DNA构建体转化的细胞产生。“合成”多肽是指通过化学合成而制备的那些多肽。
“多核苷酸”指核苷酸序列，包括但不限于RNA如mRNA、cDNA、基因组DNA序列和甚至合成DNA序列。术语也涵盖包括任何已知DNA和RNA类碱基物的序列。
本文所用的术语“得自(derived from)”表示标题分子或免疫原的实际或理论来源或起源。例如，“得自”特定GnRH分子的免疫原将具有与参照分子的相关部分极为相近的序列。因此，“得自”特定GnRH分子的免疫原可以包括所有各种类型的GnRH序列，或者可以被氨基酸残基的插入、缺失或取代而改变，只要衍生的序列提供相当于靶GnRH分子的免疫原即可。得自标志分子的免疫原将含有对所述标志分子特异的至少一个抗原决定基。
“产生食物的动物”指产生人或家养宠物如猫和狗食用的食物的动物。这些动物包括但不限于哺乳动物如羊、牛、猪和鹿科动物，包括羊、牛、猪和鹿。“改善肉的感官质地”是指相对于未用本发明处理的同种属典型的未去势动物的肉而言，改善用本发明处理过的动物的肉的气味、味道和/或嫩感。在这方面，得自未去势雄性猪和羊的肉常常具有令人不快的味道和气味。举例来说，“公猪异味”指在烹调的未去势猪的肉中有种尿-样的气味。公猪异味是由具有正常功能睾丸的雄性猪的组织中储存的类固醇所产生的。参见例如Brooks等，动物科学杂志(J.Anim.Sci.)(1986)62:1279。公猪尸体中存在的雄甾烯酮是公猪异味的一个衡量指标，并且认为是衡量生殖腺类固醇产生的指标。此外，粪臭素(skatole)也在公猪异味中起作用。参见例如，Mortensen和Sorensen，第30届欧洲肉研究工作者会议会议论文集(Proc.30th European Meeting of Meat ResearchWorkers),Ghent，比利时(1986)，第394-396页，脂肪中粪臭素的分析方法。类似地，未去势公牛通过增加肌肉块而常常产生瘦的但咬不动的肉。因此，改善了感官质地的肉是指具有更宜人气味、嫩度和/或味道的肉。
“降低循环中睾酮”是指使用标准测定方法测得的血清睾酮水平较通常未去势的、未处理的同龄同种雄性动物的血清睾酮水平显著降低，所述方法例如本文描述的RIA。
“雄性”类固醇包括雄甾烯酮、雄甾烯二酮、雄甾烯二醇和睾酮。可以用已知的方法测定雄性类固醇。例如，使用本领域熟知的ELISAs和RIAs技术测定睾酮和其它雄性类固醇。使用市售检测试剂盒进行测定特别方便，如Coat-A-Count总睾酮KitTM(Diagnostic Products Corporation,Los Angeles,CA)。该试剂盒是基于将睾酮特异性抗体固定到聚氯乙烯管壁上而用于定量测定血清睾酮的固相RIA。也参见Schanbacher和D’Occhio，男科学杂志(J.Andrology)(1982)3:45-51，文章描述了测定睾酮水平的直接RIA。
测定雄甾烯酮水平的ELISAs在例如Abouzied等，J.Agri.FoodChem.(1990)38:331-335中作了描述。也参见Meloen等，疫苗(Vaccine)(1994)12(8):741-746；和Booth等，动物产品(Anim.Prod.)(1986)42:145-152，描述了ELISAs检测从脂肪中提取的雄甾烯酮。检测雄甾烯酮水平的RIAs也是已知的。参见例如Andersen,O.,Acta.Vet.Scand.(1979)20:343-350。
“非-雄性”类固醇包括16-雄甾烯衍生物，包括5α雄甾烯酮(5α雄甾-16烯-3-酮)。使用本领域熟知的技术如ELISAs和RIAs可以测定非-雄性类固醇。参见例如，Claus等，Archiv fuer Lebensmittelhygiene(1988)39:87-90。
“显著降低”一种或多种雄性和/或非-雄性类固醇水平，是指至少一种雄性或非-雄性类固醇的水平较通常未去势的、未处理的同龄同种属雄性动物的理论值至少下降约50％，更优选至少下降约80％～90％或者更低。
术语“肥育期”指从断奶到屠宰这一段时间，因而包括青春期前、青春期附近和青春期后期。典型的肥育期将因种属不同而异，甚至在相同种属内也有差异，这取决于食品制造者的偏好(preference)和动物被饲养的国家。因此，肥育期在很大程度上只是一个选择的问题，本领域普通技术人员可以方便地决定一个特定动物的适宜肥育期。
2．一般方法
在详述本发明之前，应当理解本发明不限于特定制剂或方法，因而参数等当然可以变化。还应当懂得本文的技术只是为了描述本发明特定实施方案的目的，而不是对所用技术的限定。
尽管大量类似或等同于本文描述的组合物和方法的组合物和方法可以用于本发明，但是优选本文所描述的物质和方法。
本发明的关键是发现通过调节生殖腺类固醇分泌来改善肉质地的方法。该方法包括在动物肥育期前或肥育期用GnRH制剂进行一次或多次初次免疫，所述GnRH制剂引起循环血中睾酮水平可测得的下降，但通常不导致完全的免疫去势。初次接种后，在屠宰之前较短时间内用相同或不同GnRH组合物加强接种，以显著降低一种或多种雄性和非雄性类固醇水平。
尽管GnRH通常被识别为“自体”而没有免疫原性，但是本文所述组合物令人惊奇地提供在用之免疫了的个体中产生足够免疫反应的方法。
接种的时间选择取决于正在讨论的动物，和食品-制造者的偏爱，所述动物通常是羊、牛或猪。然而，第一次接种在动物肥育期前或肥育期间进行。举例来说，对于猪和羊，初次免疫一般在动物出生到约15周的期间进行，优选出生至约10周的期间。对于牛，初次免疫一般在出生至约48周的期间进行。
屠宰之前进行一次或多次加强接种。加强接种的时间选择也取决于正在讨论的动物。例如，对于猪和羊，加强接种一般在屠宰动物前约1-约12周进行，优选在屠宰前约2～约8周进行，最优选屠宰前约4～约6周，甚至屠宰前约2～约3周进行。对于牛，优选在屠宰前数月施实第二次接种。
在一些实施方案中，后续免疫在初次免疫形成的GnRH抗体下降之后进行，即：检测到抗体水平至少低于最大抗体水平约50％时，优选下降至少低于最大抗体水平约75％时。
本发明疫苗组合物使用GnRH多肽(定义如上)，任选地与载体分子连接以增强其免疫原性。
GnRH免疫联合体
正如上面所解释的那样，GnRH是内源性分子，因此，需要将GnRH多肽与载体联合形成GnRH免疫联合体来进一步增加GnRH多肽(或下述的多体)的免疫原性。如果GnRH抗原要施用的动物与曾提取GnRH的动物属于同一种属的话，则这种GnRH免疫联合体的形成尤为必要。
适宜的载体通常是多肽类，多肽包括从感染物质如病毒表面蛋白提取的蛋白质的抗原区域或者载体肽序列。这些载体起到非-特异性刺激T-辅助细胞活性的作用并且帮助引导相关抗原到达抗原呈递细胞(APCs)，在细胞表面进行与主要组织相容性复合体(MHC)的分子有关的加工和呈递。
为了此目的，已经开发出数种载体系统。例如，小的肽半抗原常与蛋白载体如匙孔戚血蓝蛋白(Bittle等(1982)自然(Nature)298:30-33)、细菌毒素如破伤风毒素(Muller等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79:569-573)、卵白蛋白、白细胞毒素多肽和鲸肌红蛋白进行联结，产生免疫反应。这些联结反应通常导致每摩尔载体蛋白中整合入数摩尔的肽半抗原。
本发明用的其它适宜载体包括轮状病毒的VP6多肽或其功能片段，如在美国专利5071651中所披露的。也适用于本发明的是病毒蛋白与一种或多种GnRH的抗原决定基的融合产物，所述融合产物按照美国专利4722840所披露的方法来制备。其它还适宜的载体包括细胞，如淋巴细胞，由于这种形式的呈递拟似在个体进行的天然呈递模式，因此产生免疫状态。或者，GnRH免疫原可以与红细胞联结，优选与个体自身的红细胞联结。肽与蛋白质或细胞联结的方法为本领域人员所公知。
适用于本发明的释放系统也可以使用微粒载体。例如，在形成颗粒前作为平台，而免疫原可以联结和整合到平台上。基于proteosomes的系统(Lowell等(1988)科学(Science)240:800-802)和免疫刺激复合物(Morein等(1984)自然(Nature)308:457-460)也为本领域所公知。
本发明也使用通过重组产生的自聚集形成颗粒的嵌合蛋白质载体系统。例如，酵母逆转录转座子，Ty，编码一系列象颗粒样聚集进入病毒的蛋白质(Ty-VLPs；Kingsman等(1988)疫苗(Vaccines)6:304-306)。因此，可以将编码有关GnRH免疫原的基因或其片段插入到TyA基因中并在酵母中以融合蛋白的形式表达。该融合蛋白保持自聚集成均匀大小颗粒的能力。另一有用的病毒样载体系统是基于HbsAg(Valenzuela等(1985)生物工程(Bio/Technol.)3:323-326；美国专利4722840；Delpeyroux等(1986)科学(Science)233:472-475)、乙型肝炎核心抗原(Clarke等(1988)疫苗(Vaccines)88(Ed.H.Ginsberg等)127-131)、脊髓灰质炎病毒(Burke等(1988)自然(Nature)332:81-82)和烟草花叶病病毒(Haynes等(1986)生物/工程(Bio/Technol.)4:637-641)的载体系统。
特别优选的载体包括前面曾描述的血清白蛋白、匙孔戚血蓝蛋白、卵白蛋白、鲸肌红蛋白、白细胞毒素分子，以及本领域公知的其它蛋白质。例如，使用白细胞毒素多肽的嵌合系统，定义同前，比如融合到有关抗原中的溶血性巴斯德氏菌白细胞毒素(LKT)多肽也可用于本发明。在这方面，用于数种白细胞毒素载体的核苷酸序列和相应氨基酸序列是已知的。参见例如，美国专利5422110、5708155、5723129和国际申请公开WO98/06848和WO96/24675。本文使用的免疫原性白细胞毒素多肽的特定实施例包括在前面引证的专利和出版物中描述的LKT 342、LKT352、LKT 111、LKT 326和LKT 101。特别优选LKT 111和LKT 114。编码LKT 111的基因是从质粒pAA352(ATCC登录号为68283)的重组白细胞毒素基因中去掉大约1300bp长度的内DNA片段而得来的。LKT 111多肽分子量大约为52 kDa(LKT 352的分子量为99 kDa)，但是保留了LKT352 N-末端部分和LKT 352的C-末端部分，所述N-末端部分含有对于足够的T-细胞免疫原性所必需的T-细胞抗原决定基，而C-末端则含有用于产生本发明融合蛋白的适宜限制位点。LKT 114通过从分子内部额外缺失氨基酸而有别于LKT 111。参见例如，美国专利5837268和国际申请公开WO98/06848、WO96/24675中描述的那些分子。
蛋白质载体可以使用它们的天然形式，或者它们的功能团可以被修饰，例如赖氨酸残基琥珀酰化或者与半胱氨酸-硫内酯(thiolactone)反应。也可以通过例如氨基酸功能基与3-(4-二吡啶基丙酸盐的2-亚氨基thiolane或N-羟基琥珀酰酯反应而将巯基引入载体(或抗原)中。适宜的载体也可以引入用于附着于肽免疫原的间隔臂(如亚乙基二胺或类似大小的其它双官能团分子)而被修饰。
使用标准的联结反应可以将载体与有关的GnRH完全偶合。或者，用重组方法制备用于本发明的嵌合分子，比如将编码适宜多肽载体的基因与编码特定GnRH免疫原的一个或多个拷贝的基因或基因片段融合。GnRH部分既可与载体分子的5’部分融合也可与3’部分融合，或者GnRH部分可以固定在载体分子的内部位点上。
GnRH免疫原也可以通过表达相同GnRH免疫原的载体病毒而被施用。可用于本发明的载体包括但不限于牛痘和其它痘病毒、腺病毒和肝炎病毒。举例来说，表达蛋白质的牛痘病毒重组体可以按照下述方法构建:首先将编码特定蛋白质的DNA插入到一个适宜载体中，使该DNA邻接牛痘病毒启动子和牛痘病毒旁侧DNA序列，如编码胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的序列。然后将载体用于转染细胞，细胞同时感染上牛痘。同源重组体起到将牛痘启动子连同编码所需免疫原的基因插入到病毒基因组中的作用。在含有5-溴脱氧尿苷的条件下培养细胞，挑选抗性病毒斑块，从而选择出产生的TK-重组体。
GnRH多体
通过产生含有多拷贝特定抗原决定基的免疫原性分子也可以显著提高GnRH免疫原的免疫原性。以这种方式，内源性GnRH可以产生有效的自身抗原。
相应地，本发明一个方面是提供含有GnRH免疫原多体的疫苗组合物，所述GnRH免疫原是核苷酸形式或者是肽的形式。GnRH多体具有一个以上拷贝的前述特定GnRH免疫原、肽或抗原决定基，或者多个串联重复的特定GnRH免疫原、肽或抗原决定基。因此，GnRH多体可以包括多个或串联重复的特定GnRH序列，多个或串联重复的特定GnRH抗原决定基，或者包括它们的任何方便组合。使用上面详述的技术，可以识别GnRH抗原决定基。
例如，GnRH多体可以相当于具有重复单元的通式(GnRH-X-GnRH)y的分子，其中GnRH是GnRH免疫原，X选自肽键、氨基酸间隔基团、载体分子和[GnRH]n，其中n是大于或等于l的整数，y是大于或等于1的整数，“GnRH”可以进一步含有GnRH免疫原。因此，GnRH多体可以含有2-64或更多的GnRH免疫原，更优选2-32或2-16GnRH免疫原。
此外，特定GnRH免疫原序列可以全部相同，或者可以是GnRH的不同衍生物、类似物、变体或抗原决定基，只要它们保持引发免疫反应的能力即可。而且，如果GnRH免疫原化学性地或重组性地与载体连接的话，GnRH免疫原可以与正在讨论的载体的5’-末端、3’-末端相连接，或者与载体侧连接。另外，GnRH多体可以位于载体内部的位点上。与本发明GnRH多体一起使用的一个特定载体是前面曾描述过的白细胞毒素多肽。
正如前面所解释的那样，GnRH分子之间可以存在间隔序列。例如，在GnRH多体中有Ser-Gly-Ser三聚体和Gly-Ser二聚体，此例证提供GnRH免疫原重复序列之间的间隔区。参见例如图2B(SEQ ID号:10和11)。在特定GnRH免疫原之间进行各种间隔序列的策略取代，用于在个体构造上产生更强的免疫原性。相应地，本发明中，特定间隔序列可以囊括广泛的各种分子，比如单个氨基酸连接或2～数个氨基酸序列。特定间隔基团可以优选提供酶裂解位点，以便于表达的多体可以在体内被蛋白酶解(被APCs等)加工而产生大量的肽，每一个肽含有至少一个衍生自载体部分的T-细胞抗原决定基，肽优选与基本上全长的GnRH多肽序列相融合。
可以构建间隔基团以使得特定GnRH分子之间的连接区含有对于被免疫个体而言的明显的外源序列，从而在联合的GnRH免疫原的基础上产生增强的免疫原性。另外，可以构建间隔序列以便于提供T-细胞抗原性，如编码两亲的和/或螺旋状肽序列的那些序列，所述序列通常被本领域认为是提供免疫辅助T-细胞抗原决定基。由间隔序列提供的对特定T-细胞抗原决定基的选择将依要被接种的脊椎动物的种属而异。尽管特定GnRH部分是包括间隔序列的例示，但是本发明的又一目的是提供一种或多种含有直接邻接GnRH序列(不插入间隔序列)的GnRH多体。
因此，本发明组合物中所用的GnRH多体序列产生高度免疫原性的GnRH抗原。
GnRH多肽、免疫联合体和多体可以使用下述方法产生，并且用于核苷酸免疫、基因治疗、基于蛋白质的免疫方法等等。
基于核酸的免疫方法
通常，本发明所用的基于核酸的疫苗包括编码GnRH免疫原的的相关区域、适宜控制序列和任选地辅助治疗的核苷酸序列。该核酸分子以载体的形式制备，所述载体包括引导在受体细胞中转录和翻译的必要元件。
为了增强在接受免疫的个体中的免疫反应，核酸分子可以与辅助物质如药剂、佐剂联合施用，或者与编码生物反应调节剂如细胞因子等的释放载体联合施用。其它辅助物质包括但不限于：增加体重、肌肉块或肌肉强度的物质，如生长激素、生长促进剂、β受体拮抗剂、分块剂(partitioning agent)和抗生素。
本发明所选用的核苷酸序列可以从已知的来源中得到，例如，使用标准技术从含有所需基因或核苷酸序列的细胞或组织中分离出来，或者使用重组或合成技术制备。
一旦制备或分离出编码GnRH免疫原的序列。则可以将此序列克隆入适宜的载体或复制子中。本领域技术人员已知大量的克隆载体，选用适宜克隆载体只是个选择的问题而已。使用本领域公知的标准方法完成与其它序列如辅助分子或载体分子的连接。嵌合体的一种或多种GnRH免疫原部分可以以其5’和/或3’末端与所需的辅助序列或载体分子融合。或者，一种或多种GnRH免疫原部分可以位于载体分子的内部位点上，或者这些免疫原部分位于嵌合体的两末端和内部位点。
或者，任选地与载体分子连接的编码有关GnRH的DNA序列可以通过合成而不是克隆来制备。DNA序列可被设计成具有特定序列的适宜密码子。然后由用标准方法制备的重叠寡核苷酸装配免疫原全序列并且装配成全编码序列。参见例如，Edge(1981)自然(Nature)292:756；Nambair等(1984)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)259:6311。
然后在控制操作下将编码序列放置于在适宜宿主组织体内表达的适宜控制元件中。控制元件的选择取决于接受处理的个体和所用制剂的类型。因此，如果要使用个体的内源性转录和翻译机器来表达免疫原的话，则使用与特定个体相适配的控制元件。在这方面，本领域技术人员公知数种用于哺乳动物系统的启动子。例如，用于哺乳动物细胞表达的代表性启动子包括SV40早期启动子(一种CMV启动子如CMV立即早期启动子)、小鼠乳腺癌病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)和单纯疱疹病毒启动子，等等。其它非病毒性启动子如来自小鼠金属硫蛋白基因的启动子也可用于哺乳动物表达。
通常，也存在3’末端连于转录终止密码子的转录终止和聚腺苷酸序列。优选地，也存在5’末端与密码子序列相连的最适转录起始序列。转录终止子/聚腺苷酸信号的实例包括那些衍生自SV40(如Sambrook等，Supra所描述的)以及牛生长激素终止子序列的信号。将本发明所用的构建体也可以设计成含有剪接供体和受体位点的内含子。
增强子元件也可用于本发明以增加构建体的表达水平。实例包括SV40早期基因增强在(Dijkema等(1985)EMBO J.4:761)、衍生自鲁斯氏肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)增强子/启动子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)和衍生自人CMV(Boshart等(1985)细胞(Cell)41:521)的元件，如包括在CMV内含子A序列中的元件。
一旦制备好核酸疫苗组合物，则可以使用已知方法将该核酸疫苗释放给个体。在这方面，对于使用编码DNAs抗原进行免疫的各种技术已有描述。参见例如，授予Felgner等的U.S.专利5589466；Tang等(1992)自然(Namre)358:152；Davis等(1993)人类分子遗传学(Hum.Molec.Genet)2:1847；Ulmer等(1993)科学(Science)258:1745；Wang等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4156；Eisenbraun等(1993)DNA细胞生物学(DNA CellBiol.)12:791；Fynan等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:12476；Fuller等(1994)AIDS Res.Human Retrovir.10:1433；和Taz等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9519。也可以使用将核酸分子释放给在体外细胞，接下来再引入宿主的常规方法，比如脂质体介导的基因转移。参见例如，Hazinski等(1991)美国呼吸细胞分子生物学(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.)4:206-209；Brigham等(1989)美国医学科学杂志(Am.J.Med.Sci.)298:278-281；Canonico等(1991)临床研究(Clin.Res.)39:219A；和Nabel等(1990)科学(Science)249:1285-1288。因此，使用已知技术可以将核酸疫苗组合物以液体或颗粒形式释放。下面将更加全面地描述代表性的疫苗组合物。
基于蛋白质的释放方法
使用本领域技术人员熟知的各种方法也可以制备基于蛋白质的组合物。特别是，使用标准纯化技术可以从天然来源的物质中直接分离GnRH多肽。或者，使用本领域熟知的和例如Sambrook等在supra中描述的核酸表达系统重组制备多肽。还可以使用化学聚合物合成法如固相肽合成法合成GnRH多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的。参见例如，J.M.Stewart和J.D.Young，《固相肽合成》(Solid Phase Synthesis)第二版，PierceChemical CO.,Rockford,IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield,《肽：分析、合成、生物学》(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology),E.Gross和J.Meienhofer编著，第2卷，学术出版社，纽约(1980)，第3-254页中有关固相肽合成技术部分。
本发明组合物中所用的GnRH多肽，也可以通过将所述GnRH多肽的编码序列克隆入任何适宜的表达载体和复制子中而制备。不胜枚举的克隆载体为本领域技术人员所公知，适宜克隆载体的选用仅是个选择问题而已。克隆用的重组DNA载体和能够转化的宿主细胞的实例包括噬菌体入(大肠杆菌),pBR322(大肠杆菌),pACYC1 77(大肠杆菌),pKT230(革兰氏阴性菌),pGV1106(革兰氏阴性菌),pLAFR1(革兰氏阴性菌),pME90(非大肠杆菌革兰氏阴性菌),pHV14(大肠杆菌和枯草杆菌),pBD9(枯草杆菌),pIJ61(链霉菌属),pUC6(链霉菌属),YIp5(酵母属),YCp19(酵母属)和牛乳头状瘤病毒(哺乳动物细胞)。一般参见DNA克隆(DNA Cloning)：第1&Ⅱ,supra；Sambrook等，supra；B.Perbal,supra。
例如，已经测定了猪、牛和羊的GnRH编码序列(Murad等(1980)第6版《治疗的药理学基础》中激素和激素拮抗剂章节)，已经克隆了人GnRH的cDNA并因而建立了其序列(Seeburg等(1984)自然(Nature)311:666-668)。也公开了已知序列的其它GnRH多肽，如鲑鱼和鸡中的GnRH分子(1986年12月18日公告的国际申请公开WO86/07383)。本发明使用的特定GnRH编码序列示于图2A(SEQ ID号：8和9)和2B(SEQ ID号：10和11)。该GnRH编码序列在脊椎动物尤其是哺乳动物高度保守，猪、牛、羊和人GnRH序列彼此相同。
使用本领域公知的重组技术可以将这些编码所需GnRH多肽的序列部分，和任选地编码载体蛋白的序列克隆、分离和联结在一起。参见例如Sambrook等，supra。
可以将基因放置于控制的启动子、核糖体结合位点(细菌表达用的)和任选地一个操纵基因中，由此通过适宜转录体将有关DNA序列转录为RNA。编码序列可以含有或不含有信号肽或前导序列。例如，可以使用大肠杆菌tac启动子或蛋白A基因(spa)启动子和信号序列表达多肽。在后-翻译过程中前导序列可以被细菌宿主除去。参见例如，美国专利4431739；4425437；4338397。也可以含有前面曾描述过的辅助序列。
除了控制序列外，期望加入能够调节涉及宿主细胞生长的多肽序列表达的调节序列。调节序列为本领域技术人员所公知，其实例包括使基因表达对化学或物理刺激应答而开或关的那些序列，所述刺激包括调节化合物的存在。其它类型的调节元件也可存在于载体中，例如增强子序列。
构建表达载体以使得特定编码序列位于具有适当调节序列的载体中，关于控制序列，编码序列的定位和方向是这样的：使编码序列在控制序列的“控制”下进行转录(即，与控制序列处DNA分子结合的RNA聚合酶转录编码序列)。为达到此目的，期望修饰编码特定GnRH多肽的序列。例如，有些情况下，对序列进行修饰是必要的，以便于序列能够以适当方向附着于控制序列上；即保持阅读框架。控制序列和其它调节序列可以在插入载体前与编码序列连接，所述载体如前述的克隆载体。或者，可以将编码序列直接克隆入已经含有控制序列和适当限制位点的表达载体中。
有些情况下，期望加入使宿主生物体分泌多肽的序列，接下来将分泌信号分裂掉。也期望产生多肽的突变体或类似物。突变体或类似物可以这样来制备：将编码参照多肽的序列部分删除，或者如果编码参照多肽的序列部分存在的话，则在序列内插入和/或取代一种或多种核苷酸序列。修饰核苷酸序列的技术，比如定点诱变的突变等，是本领域技术人员众所周知的。参见例如，Sambrook等，supra；DNA克隆(DNA Cloning)，第1和Ⅱ卷，supra；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)，supra；Kunkel,T.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1 985)82:448；Geisselsoder等，生物技术(BioTechniques)(1987)5:786；Zoller和Smith，酶学方法(Methods Enzymol.)(1983)100:468；Dalbie-McFarland等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1982)79:6409。
GnRH多肽可以在各种系统中表达，包括昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统，所有这些系统均为本领域所熟知。例如，昆虫细胞表达系统，如杆状病毒系统，是本领域技术人员所已知的并且例如Summers和Smith在德克萨斯农业试验站公报(Texas AgriculturalExperiment Station Bullein)1555号(1987)中作了描述。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法是市售的试剂盒形式，购自Invitrogen，圣地亚哥CA(“MaxBac”试剂盒)。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统是本领域所公知的并且例如Sambrook等在supra上作了描述。酵母表达系统也是本领域所公知的并且在例如《酵母基因工程》(Barr等编著，1989,Butterworths，伦敦)上作了描述。
使用上述系统的大量适宜宿主细胞也是已知的。例如，哺乳动物细胞株是本领域技术人员所公知的，包括购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的无限增殖细胞株，例如但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾脏细胞(COS)、人肝细胞肉瘤细胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞，以及其它细胞。类似地，细菌宿主如大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌可以用于本发明表达构建体中。适用于本发明的酵母宿主包括尤其是啤酒糖酵母，白色假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、多形汉逊酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母、季也蒙氏毕赤氏酵母、巴斯德毕氏酵母、粟酒裂殖糖酵母和Yarrowialipolytica。使用杆状病毒表达载体的昆虫细胞包括，尤其是，埃及伊蚊、Autographa califomica、家蚕、果蝇、spodoptera frugiperda和Trichoplusiani。
取决于选择的表达系统和宿主，用上述表达载体转化了的生长宿主细胞在能够表达多肽的条件下产生GnRH多肽。然后从宿主细胞中分离和纯化表达的多肽。如果表达系统将多肽分泌到生长介质中，那么可以直接从生长介质中纯化多肽。如果多肽不是被分泌的，那么可以从细胞溶胞产物中纯化多肽。适宜生长条件和回收方法的选择是本领域公知常识。
一旦得到GnRH多肽，联合或不联合载体，GnRH多肽即可用于制备成组合物，比如下面将要进一步描述的疫苗组合物，以引发抗体产生。
抗体产生
标题GnRH免疫原可用于生成被动免疫方法所使用的抗体。通常，适用于产生抗体的肽一般在长度上要有至少约3-5个氨基酸，优选7-10个氨基酸长度的肽。
抗标题免疫原的抗体包括多克隆和单克隆抗体制剂、单特异抗血清，以及含有对正在讨论的靶分子保持特异性的杂合抗体、变化的(altered)抗体、F(ab’)2片段、Fab片段、Fv片段、单个结构域抗体、嵌合抗体、人源化抗体和它们的功能片段的制剂。例如，抗体可以包括对正在讨论的靶分子保持特异性可变区或者可变区片段。其它的抗体可以衍生自将要对其施用此抗体的种属。因此，如果抗体将要施用于人，那么可以将抗体“人源化”以便减少免疫原性而仍保存抗体活性。对于嵌合抗体的描述，参见例如Winter,G.和Milstein,C.(1991)自然(Nature)349:293-299；Jones,P.T.等(1988)332:323-327；和Carter,P.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-4289。此类嵌合抗体可以不仅含有靶分子结合位点，而且也含有其它蛋白质的结合位点。这样，就可以生成既对外源性抗原也对内源性抗原具有靶向特异性的双功能反应物。
如果需要多克隆抗体，那么，就按照前面所描述的那样，用所需的抗原或其片段或者突变抗原对选定的哺乳动物(如鼠、兔、羊、马等)进行免疫。免疫前，可以期望进一步增加特定免疫原的免疫原性，使用本领域已知的数种方式中的任何一种即可实现。
例如，为产生抗体而进行的免疫通常通过如下步骤来完成：将蛋白质和适宜赋形剂混合或乳化，将混合物或乳剂进行非肠道注射(一般为皮下或肌内注射)，其中所述赋形剂如生理盐水，优选在佐剂如Freund’s完全佐剂，或者下述的任何佐剂中。在2-6周后通常用在生理盐水中的蛋白质，优选使用Freund’s不完全佐剂给等动物进行加强免疫。使用本领域已知的技术，通过体外免疫也可以产生抗体。然后从免疫了的动物中按照已知的方法得到多克隆抗血清。参见例如Jurgens等(1985)色谱杂志(J.Chrom.)348:363-370。如果要使用含有多克隆抗体的血清，则可以用已知的方法通过免疫亲合色谱法来纯化多克隆抗体。
通常使用Kohler和Milstein(自然(Nature)(1975)256:495-96)或其改良法制备单克隆抗体。具有代表性的是按如上所述对小鼠或大鼠进行免疫。然而，与其通过使动物出血来提取血清，不如切除脾脏(和任选地数个大的淋巴结节)并分散成单个细胞来制备。如果需要，在包被了蛋白抗原的培养皿或培养孔上加入一种细胞悬浮液，可以筛选脾细胞(去除了非特异粘附细胞之后)。表达对抗原特异的膜-结合免疫球蛋白的B-细胞将结合在培养皿上，而且不被剩余的悬浮液漂洗下来。然后，将得到的B-细胞或者所有分散的脾细胞用于与来自杂交瘤的骨髓瘤进行融合，并在选择的培养基(例如，次黄嘌呤、氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷培养基，“HAT”)中培养。将得到的杂交瘤进行有限的稀释后制板，并分析特异结合于免疫抗原(不与未处理抗原结合)的抗体的产生。然后体外(例如，在组织培养瓶或者空纤维反应器中)或体内(如小鼠腹水)培养选出的单克隆抗体-分泌型杂交瘤。参见例如，M.Schreier等，杂交瘤技术(Hybridoma Techniques)(1980)；Hammerling等，单克隆抗体和T-细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas)(1981)；Kennett等，单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)(1980)；也参见下列美国专利：4341761；4399121；4427783；4444887；4452570；4466917；4472500,4491632；和4493890。产生的抗有关GnRH免疫原的一系列单克隆抗体或其片段，可以按其各种特性来筛选；即，按照同位型、抗原决定基、亲和力等。
也可以制备抗有关GnRH免疫原的抗体的功能性片段，而且可以通过从抗体分子上裂解掉不负责与抗原结合的恒定区来制备，例如使用胃蛋白酶来产生F(ab’)2片段。这些片段含有两种结合位点，但是每条重链缺乏恒定区。类似地，如果需要，可以制备含有单抗原结合位点的Fab片段，例如，通过用胃蛋白酶消化多克隆或单克隆抗体。使用标准的技术，也可以制备仅包括重链可变区和轻链的功能性片段。这些片段被称为Fv。
使用标题免疫原也可以制备嵌合的和人源化的抗体。这些抗体可以被设计成将不需要的免疫反应降至最小，所述不需要的免疫反应通常归因于单克隆和多克隆抗体中所含的异源性恒定区和种属特异性构架可变区。例如，如果要将抗体施用于人，则使用本领域普遍知晓的技术，通过用人的恒定区置换非-人恒定区，无论非-人恒定区位于重链还是位于轻链亦或是既位于重链也位于轻链，可以制备嵌合的抗体。参见例如，Winter,G.和Milstein,C.(1991)自然(Nature)349:293-299；Jones,P.T.等(1988)332:323-327；和Carter,P.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-4289。
GnRH组合物
一旦制备出上述GnRH多肽或抗体，那么即可以把GnRH多肽或抗体制成用于释放给脊椎动物体的组合物。有关的GnRH分子是单独给药，或者与可药用载体或赋形剂混合给药。适宜的载体是，例如水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，和它们的联合。另外，载体可以含有小量辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，或者当组合物为疫苗组合物时含有佐剂，佐剂增加疫苗的效力。适宜的佐剂将在下面更加详细地描述。本发明组合物也可以含有辅助物质，诸如药理试剂、细胞因子或者其它生物反应调节剂。
正如上面所阐述的那样，本发明疫苗组合物可以含有佐剂以进一步增加GnRH免疫原的免疫原性。佐剂可以包括例如，乳化剂、胞壁酰二肽、阿夫立定、含水佐剂如氢氧化铝和各种皂甙中的任何一个、壳聚糖-基佐剂、油和本领域已知的其它物质。例如，这里用作乳化剂的化合物包括天然和合成的乳化剂，以及阳离子、阴离子和非离子化合物。在合成的化合物中，阳离子乳化剂包括例如月桂酸和油酸的钾、钠和铝盐，脂肪酸的钙、镁和铝盐(即，金属皂)，和有机磺酸盐如十二烷基硫酸钠。合成的阴离子剂包括例如，溴化十六烷基三甲铵，而合成的非离子剂的实例是甘油酯(如，单甘油酯)、聚氧乙烯乙二醇酯和醚，以及脱水山梨醇脂肪酸酯(如，脱水山梨醇一棕榈酸酯)和其聚氧乙烯衍生物(如，聚氧乙烯脱水山梨醇一棕榈酸酯)。天然乳化剂包括阿拉伯胶、明胶、卵磷脂和胆固醇。
其它适宜的佐剂可以用油性组分形成，如单个油、油的混合物、油包水乳液或者水包油乳液。油可以是矿物油、蔬菜油或动物油。优选矿物油或者油性组分为矿物油的水包油乳液。在这方面，这里将“矿物油”定义为通过蒸馏技术从石油中得到的液态烃混合物；该术语与“液态石蜡”、“液态石油”和“白色矿物油”同义。术语也包括“轻矿物油”，即类似地通过蒸馏石油而得到的油，但是较白色矿物油具有稍小的比重。参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,supra。一个特别优选的油性组分是以商品名EMULSIGEN PLUSTM(含有轻矿物油和0.05％福尔马林，和作为防腐剂的30 mcq/mL庆大霉素)出售的水包油乳液，可购自MVP实验室，Ralston,Nebraska。适宜的动物油包括例如，鳕鱼肝油、大比目鱼油、鲱油、柑橘粗制油(orange roughy oil)和鲨鱼肝油，所有这些动物油均可商购得到。适宜的蔬菜油包括但不限于，canola油、杏仁油、棉籽油、玉米油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、大豆油等。
或者，大量脂肪族含氮碱可用作疫苗制剂的佐剂。例如，已知的免疫原性佐剂包括氨、季铵盐化合物、胍、苄脒和硫脲(thiouroniums)(Gall,D.(1966)免疫学(Immunology)11:369-386)。特异化合物包括二甲基双十八烷基溴(DDA)(可以从Kodak商购)和N,N-双十八烷基烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺(“avridine”)。也描述了使用DDA作为免疫佐剂；参见例如，KodakLaboratory Chemicals Bulletin 56(1):1-5(1986)；Adv.Drug Deliv.Rev.5(3):163-187(1990)；控释杂志(J.Controlled Release)7:123-132(1988)；临床实验免疫学杂志(Clin.Exp.Immunol.)78(2):256-262(1989)；免疫方法学杂志(J.Immunol.Methods)97(2):159-164(1987)；免疫学(Immunology)58(2):245-250(1986)；和Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.68(3):201-208(1982)。Avridine也是众所周知的佐剂。参见例如，授予Wolff,Ⅲ等的4310550号美国专利，其中描述了一般使用N,N-高级烷烃基烃基-N,N’-双(2-羟乙基)丙二胺，尤其使用avridine作为疫苗佐剂。授予Babiuk的5151267号美国专利和Babiuk等(1986)病毒学(Virology)159:57-66中也涉及使用阿夫立定作为疫苗佐剂。
特别优选用于本发明的是称为“VSA-3”的佐剂，它是EMULSIGENPLUSTM佐剂的改良型，所述EMULSIGEN PLUSTM佐剂包括DDA(参见例如序号为08/463837的美国专利申请)。
对于本领域技术人员而言，制备此剂型的实际方法是已知的或显而易见的。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCompany,Easton,Pennsylvania，第18版，1990。将要施用的组合物或制剂包括足以使接受处理的个体达到所需状态的大量GnRH多肽。
通常，本发明组合物被制备成可注射的剂型，或者液态溶液或悬浮液形式，或者适宜于在注射前在液体载体中配制成溶液或悬浮液的固态形式。也可以将制剂乳化或者将活性组分包裹在脂质体载体或使用的其它微粒载体中。
组合物也可以制成固体形式。例如，可以制备成能够从市售无针注射器设备释放的固体微粒制剂。或者，提供植入个体的固体剂型的植入体。也可以使用控释或持续释放制剂，而且通过将GnRH多肽掺入到载体或赋形剂中而制得，所述载体或赋形剂如脂质体、非再吸收性不渗透性聚合物如醋酸乙烯基乙烯酯共聚物和Hytrel共聚物、可膨胀的聚合物如水凝胶，或者再吸收聚合物如胶原和特定聚酸或聚酯如用于制作再吸收缝线的那些聚酸或聚酯。
此外，多肽可以以中性或盐的形式掺入到组合物中。可药用盐包括酸加成盐(与活性肽的自由氨基形成的盐)和与无机酸如盐酸或磷酸或者与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等形成的盐。由自由羧基形成的盐也可以衍生自无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和衍生自有机碱如异丙胺、三甲胺、乙氨基乙醇、组织胺、普鲁卡因等。
制备含有有效量GnRH多肽的组合物，确切的量是本领域技术人员很容易决定的，如果是疫苗组合物，则所述量取决于要接受处理的动物、动物免疫系统对合成抗体的承受量，和所需的GnRH免疫中和程度。为了本发明的目的，以每mL注射溶液中包含约1μg～约2mg，更优选约5μg～约800μg，甚至更优选约10μg～约400μg GnRH多肽的制剂给药，将足以唤起免疫反应。如果使用肽载体嵌合体，则疫苗制剂中免疫原与载体的比值将依构建此分子所选用的特定载体和免疫原而异。
举例来说，如果使用的是白细胞毒素嵌合体，那么疫苗制剂中GnRH与白细胞毒素的比值将依构建分子所选用的特定白细胞毒素和GnRH多肽分子而异。一个优选的疫苗组合物含有白细胞毒素-GnRH嵌合体，其每个融合分子中具有约1～90％GnRH，优选约3～80％和最优选约10～70％GnRH多肽。增加LKT-GnRH融合分子中GnRH含量百分比，则降低为了引发对GnRH的足够免疫反应而必须施用于个体的总抗原量。
在肥育期，以至少单次剂量，任选地2次或更多次剂量对个体施用上述组合物中的一种，例如在初次免疫中。初次免疫后，在屠宰之前不久时间，用相同或不同的GnRH组合物进行一次或多次加强免疫，以显著降低循环中一种或多种雄性和非雄性类固醇的水平。
任何适宜的药物释放手段均可用于将本发明组合物释放给脊椎动物个体。例如，传统的带针注射器、喷雾或压缩气体(空气)注射器(授权Smoot的1605763号美国专利；授权给Laurens的3788315号美国专利；授权Clark等的3853125号美国专利；授权Morrow等的4596556号美国专利；授权Dunlap的5062830号美国专利)、液体喷射注射器(授权Scherer的2754818号美国专利；授权Gordon的3330276号美国专利；和授权Lindmayer等的4518385号美国专利)和颗粒注射器(授权McCabe等的5149655和授权Sanford等的5204253号美国专利)均适宜释放本发明组合物。
优选地，通过肌内、皮下、静脉内、皮下、皮内、经眼或经粘膜途径施用于个体。如果使用的是喷射注射器，则液态疫苗组合物的单次喷射是在高压和高速下喷射出来的，例如1200-1400 PSI，从而在皮肤上制造裂口并穿透到适宜免疫的深度。
下面是完成本发明特定实施方案的实施例。提供的实施例仅仅是为了阐述的目的，而不以任何方式来限定本发明的范围。
3．试验
                      实施例1
                构建pCB122和pCB130
质粒pCB122和pCB130用于制备下面描述的实施例中使用的GnRH融合蛋白。两种质粒产生相同氨基酸序列的蛋白质。两种质粒中的GnRH构建体含有与编码载体白细胞毒素多肽的DNA序列的5’和3’末端均融合的8个GnRH串接重复序列。每一个改变的GnRH序列所发生的变化是序列中的第4个碱基由胞嘧啶变成鸟嘌呤。此变化导致GnRH分子第二个氨基酸由组氨酸变为天冬氨酸的单个氨基酸的变化。参见图2A(SEQID号：8和9)和2B(SEQ ID号：10和11)。构建体的白细胞毒素部分编码截短的白细胞毒素，截短的白细胞毒素是从质粒pAA352(ATCC登陆号68283，在美国专利5476657中作了描述)所含的重组白细胞毒素基因中通过去除大约1300bp长度的内部DNA片段而得来的。白细胞毒素多肽估计分子量52kDa，含有用于产生本发明融合蛋白的常规的限制位点。嵌合构建体在Tac启动子控制之下，而通过Lac I的使用来控制诱导。由质粒pCB122和pCB130产生的GnRH-白细胞毒素融合蛋白示于图3A～图3F(SEQ ID号：12和13)。
质粒pCB122如下制备。按照美国专利5476657和5837268所描述的方法分离白细胞毒素基因。尤其是，为了分离白细胞毒素基因，使用标准技术构建p.Haemolytica A1(菌株B122)的基因文库。参见Lo等，感染免疫学(Infect.Immun.),supra；DNA克隆(DNA CLONING)：第Ⅰ和Ⅱ卷，supra；和Sambrook等，supra。在质粒载体pUC13中建立基因组文库，在入噬菌体gtll中构建DNA文库。产生的克隆用于转染大肠杆菌，汇聚并筛选与曾感染过p.Haemolytica并用浓缩的p.Haemolytica培养物上清液加强免疫过以提高抗白细胞毒素抗体水平的牛血清反应的单个的克隆。通过将细胞溶解产物与牛中性白细胞一起孵育，接下来测定从中性白细胞中释放出的乳酸盐脱氢酶，从而筛选阳性克隆产生白细胞毒素的能力。
鉴定了数种阳性克隆，并使用限制性核酸内切酶绘图分析这些重组体。一个克隆似乎与前面克隆的白细胞毒素基因相同。参见Lo等感染免疫学(Infect.Immun.)supra。为了确认是否如此，重新克隆了较小的片段并进行了限制图谱的比较。检测表明已克隆了DNA的大约4千个碱基对。通过染色体步移(从5’到3’方向)分离出进行性变大的克隆以便分离大约8kb的全长重组体。最终的构建体称为pAA114。该构建体含有完整的白细胞毒素基因序列。
1ktA，得自含有完整白细胞基因pAA114的MaeⅠ限制性内切酶片段，用DNA聚合酶的克列诺片段加上核苷酸三磷酸进行处理，并且连接到克隆载体pUC13的SmaⅠ位点中。该质粒命名为pAA179。从该质粒，在用SmaⅠ消化的ptac-基载体pGH432:lacⅠ中制备两个表达构建体。一个是pAA342，由lktA基因的5’-AhaⅢ片段组成，而另一个pAA345，含有上述完整的MaeⅠ片段。克隆pAA342高水平表达截短的白细胞毒素多肽，而pAA345在特别低的水平表达全长白细胞毒素。因此，lktA基因(从pAA345得到的StyⅠ BamHⅠ片段)的3’端连接到StyⅠ BamHⅠ消化的pAA 342上，得到质粒pAA352。此后把由pAA352构建体p.Haemolytica产生的白细胞毒素称作LKT 352。
然后，质粒pAA352用于制备截短的重组白细胞毒素多肽。该截短的LKT基因是通过从重组LKT基因中缺失大约1300bp长度的内部DNA片段而产生的，方法如下：用限制性酶BstB1(New England Biolabs)消化包括LKT 352多肽的质粒pCB113(ATCC登录号为69749，并在美国专利5837268中作了描述)。然后，用绿豆核酸酶(Pharmacia)消化生成的线性质粒以除去由BstBl消化产生的单条突出末端。接着，用限制性酶Nael(New England Biolabs)消化平头DNA，并将消化的DNA加样到1％琼脂糖凝胶上，通过电泳分离DNA片段。使用基因洁净试剂盒(gene cleankit)(Bio 101)从琼脂糖凝胶中分离纯化出大约6190bp的较大DNA片段，并且使用噬菌体T4 DNA连接酶(Pharmacia)使纯化的片段自身相连接。产生的连接混合物用于转染感受态(competent)大肠杆菌JM105细胞，通过其产生具有适宜分子量的聚集蛋白质的能力来鉴定阳性克隆。如此形成的重组质粒是设计的pCB111(ATCC登录号为69748)，并且产生与四拷贝GnRH多肽融合的截短的白细胞毒素多肽(此后称之为LKT111)。质粒pCB114具有2次插入的多拷贝GnRH序列(相当于图2B(SEQID号：10和11)的寡聚物)。这两种质粒均在美国专利5837268中描述过，并且分别产生称为LKT 111和LKT 114的截短的白细胞毒素多肽。
通过在LKT 114编码序列的5’末端2次连接多拷贝GnRH序列(相当于图2B(SEQ ID号：10和11)的寡聚物)，由得自pCB114质粒的LKT-GnRH融合序列构建具有两个8拷贝GnRH多体的重组LKT-GnRH融合分子，一个安排在LKT 114的N’-末端，而另一个安排在LKT 114的C，-末端。将具有如下序列的合成核苷酸序列：5’-ATGGCTACTGTTATAGATCGATCT-3’(SEQID号：6)连接到多拷贝GnRH序列的5’末端。该合成核苷酸序列编码8个氨基酸序列(Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser)(SEQ ID号：7)。因此，产生的重组分子按照从5’到3’的方向含有：合成的核酸分子；编码第一个8拷贝GnRH多体的核苷酸序列；编码截短的LKT肽(LKT 114)的序列；和编码第二个8拷贝GnRH多体的核苷酸序列。
重组分子成环形，产生的分子用于转化感受态大肠杆菌JM105细胞。通过其产生具有约74kDa分子量的聚集蛋白质的能力来鉴定阳性克隆。如此形成的重组质粒是设计的pCB122，其产生与16拷贝GnRH多肽融合的截短的LKT 114。
对于质粒pCB130，其中ampr基因或pCB122被tetr基因置换。因而，质粒属于四环素选择性。pCB122和pCB130质粒的重组LKT-GnRH融合体的核苷酸序列示于图3A至3F(SEQ ID号：12和13)。
                      实施例2
                LKT-抗原融合体的纯化
使用下述方法纯化实施例1制备的重组LKT-GnRH。5～10克隆的转化的大肠杆菌株接种到10mL含有100μg/mL氨苄青霉素的TB肉汤上清液中，于37℃在220 rpm的G10摇床上培养6小时。4mL培养物加入到2个含有400mL TB肉汤+氨苄青霉素的带挡板的Fembach摇瓶的每一个瓶中进行稀释，并如上培养过夜。在500mL容积的聚丙烯瓶中，使用Sorvall GS3转子，以4000rpm离心10分钟来收集细胞。用已经预热到37℃的等体积(即2×400mL)含有氨苄青霉素的TB肉汤重新悬浮沉淀，按照上述条件培养细胞2小时。
在每个培养物中加入500mM异丙基-B,D-硫吡喃半乳糖苷(IPTG,Gibco/BRL)水溶液3.2mL，以诱导重组蛋白的合成。培养物孵育2小时。按照上述方法离心收取细胞，在30mL pH 8.0的50mM Tris-盐酸、25％(w/v)蔗糖溶液中重新悬浮，并于-70℃冷冻。-70℃60分钟后室温下解冻冷冻细胞，并加入5mL溶菌酶(Sigma，在250mM Tris-HCL中20mg/mL,pH8.0)。将混合物高速涡流10秒钟后，置入冰中15分钟。接着将细胞加入到盛有500mL溶胞缓冲液的1000mL烧瓶中，用2mL移液管搅拌混合。把盛有溶解的细胞悬浮液的烧瓶放在冰上，用大探头、设定在100瓦特功率的Braun超声器总共超声2.5分钟(每5-30秒脉冲串之间冷却1分钟)。等体积溶液置入特氟隆SS34离心管中，用SS34转子以10000rpm离心20分钟。通过高速涡流在总共100mL的无菌双蒸水中重新悬浮沉淀，重复离心步骤。弃掉上清液，沉淀收集在20mL pH8.0 10mM Tris-HCL、150mM NaCl(Tris-缓冲的生理盐水)中，-20℃冷冻过夜。
室温下解冻重组悬浮液，加入到100mL Tris-缓冲盐水的8M盐酸胍(Sigma)中，剧烈混合。在瓶中放置磁力搅拌棒，室温下搅拌混合溶解的样本30分钟。溶液转移至2000mL Erlenmeyer烧瓶中，快速加入1200mLTris-缓冲盐液。室温下再搅拌该混合物2小时。500mL等份液置入透析袋中(光谱，直径63.7mm,6000-8000 MW截止，#132670，购自Fisherscientific)，并把透析袋放入盛有3500mL Tris-缓冲盐水+0.5M盐酸胍的4000mL烧瓶中。把烧瓶放在4℃场所中磁棒搅拌过夜，然后，用Tris-缓冲盐水+0.1M盐酸胍替换透析缓冲液，继续透析12小时。再用Tris-缓冲盐水+0.05M盐酸胍替换缓冲液，继续透析过夜。接着用Tris-缓冲盐水(不含盐酸胍)替换缓冲液，继续透析12小时。重复此过程3遍。把最终的溶液倾入2000mL塑料滚筒瓶(Corning)中，加入13mL 100mMPMSF(在乙醇中)以抑制蛋白酶活性。以每份100mL的等份溶液形式贮存在-20℃。
为了确定融合蛋白已被分离出来，用双蒸水将每份制剂稀释20倍，与等体积SDS-PAGE样本缓冲液混合，置入沸水浴中5分钟，通过12％聚丙酰凝胶。重组白细胞毒素对照物也通过12％聚丙酰凝胶。作为包涵体，融合蛋白高水平表达。
                        实施例3
                GnRH给猪免疫后的抗体滴度
该试验是为了评价包括注射体积、第二次注射相对于第一次注射的位点和初次接种注射次数(一次和两次相比)的变量。为了此次研究，体重3～4kg、28天日龄的160只猪分成8个处理组(见表1)。每组中有10只雌性猪和10只去势雄性猪。每围栏中10只猪，由Saskatchewan大学分支机构的试验基地Prairie Swine Centre,Inc.使用标准操作方法饲养，，并得到加拿大动物保护委员会检验。
对于1～7组，GnRH疫苗是按照上述方法使用来自质粒pCB122的GnRH免疫原制备的。特别是，GnRH免疫原在8 M尿素中溶解为20mg/mL浓度。配制疫苗的佐剂是VSA-3，它是包含DDA的EMULSIGENPLUSTM的一种改良形式(参见，序号为08/463837的美国专利申请)。
通过将GnRH免疫原的贮存原液与磷酸缓冲盐水合并并且以1∶1(v/v)的比值与VSA-3混合形成稳定的乳液来制备GnRH疫苗。1、2、3、4和6组的GnRH免疫原的剂量为40μg，然而一些制剂的体积不同。表1给出每个处理组的详细情况。5组和7组的GnRH疫苗每0.25mL含有30μg GnRH免疫原，而8组接受在0.4mL佐剂中的40μg GnRH免疫原，所述GnRH免疫原得自质粒pCB130。在所有情况下，VSA-3佐剂与水相(磷酸缓冲盐水)的比值保持1∶1(v/v)。通过改变贮存免疫原溶液的体积进行调整。
    表1：第一次和第二次注射所施用的GnRH疫苗的剂量、位点和体积
组号 只数 剂量(μg) 首次注射 首次注射体积(mL) 第二次注射 第二次注射体积(mL)
    1     20     40     L*     0.15     R*     0.15
    2     20     40     L     0.25     R     0.25
    3     20     40     L     0.35     R     0.35
    4     20     40     L     0.25     L     0.25
    5     20     60  L+R     0.25**     R     0.25
    6     20     40  L+R     0.15**     R     0.30
    7     20     60  L+R     0.25**     颈     0.25
    8     20     40     L     0.25     R     0.25
*L和R指左耳和石耳**该体积是对每个耳朵给药的体积。因此，5、6和7组在初次注射时接受的总量分别为0.5、0.3和0.5mL。
所有的疫苗是使用美国在波兰俄勒冈的Bioject公司生产的Biojector2000型无针注射装置给药的。该装置使用气体圆筒在高压下通过一个小的开口进行疫苗注射。疫苗穿透皮肤并沉积在皮下。对于每个处理组来说，首次注射在猪28天日龄时进行，第二次注射在35天之后进行。
所有注射位点是耳朵的耳廓外表皮，除第7组第2次注射之外，后者的注射位点是距头后部10-15cm的背侧中线上。于试验第35、49和63天(相对于试验开始(0天)计)经颈静脉静脉穿刺采集血液。血液在室温下凝结，收集血清，将血清贮存于-20℃直至分析GnRH抗体滴度时。
使用改良的放免分析法测定GnRH抗体滴度。用I125(Amersham,Oakville,Ontario)标记合成的GnRH(Bachem,Inc.)。把稀释血清加入到试验试管中，接着加入标准量的I125标记的GnRH，使孵育物终体积为0.7mL。于2-6℃孵育24小时结束时加入在分析缓冲液中的木炭悬浮液，以吸收非-抗体结合的I125-GnRH。离心后，测定木炭部分的放射活性。数据以标准剂量(大约12000cpm)的I125-GnRH与特定血清稀释液中抗体结合的百分数值表示。
描述性统计，使用1996年出版的第1版《学生版统计学》(StudentVersion of Statistix)进行变量分析和“t”检验。
在1、2组中分别评价了单个注射位点给药0.15、0.25和0.35ml的情况。图1显示实验第35天(动物63日龄)加强接种前的抗体滴度与加强注射后14天也即实验第49天(动物77日龄)时抗体滴度之间的关系。在35天时稀释度为1∶5000时滴度高于10％结合的动物较那些对初次接种具有弱的反应的动物能够对加强接种产生更大的反应。基于其它试验，我们知道了在1∶5000稀释度时大约20％的结合将部分抑制睾酮分泌。
这些结果表明：对初次免疫强烈反应的利用对生长或饲料利用效率无影响。
                      实施例4
              GnRH免疫对睾酮水平的影响
下面的试验利用免疫研究来证明对青春期前动物的睾酮浓度没有影响。60只完整无伤猪分成3个处理组。1组动物在出生时进行手术去势，2组和3组保持完整无伤。大约21天日龄时，给3组动物用含有连接在含38-378个氨基酸的内部有缺失的白细胞毒素和815-951个氨基酸的天然白细胞毒素上的8拷贝GnRH免疫原进行免疫。该免疫原用VSA-3佐剂如上述配制。免疫导致抗体产生增加足以引起可检测得到的睾酮分泌降低。整个试验中2组动物保持完整无伤并且不被免疫。
前面的研究证明：用佐剂免疫的动物其GnRH抗体滴度中度、持续增加，从而降低睾酮浓度，但是降低的浓度仍在可测得到的水平。试验期间测定了食物消耗和尸体(carcass)成分，以比较在不同年龄时的各种参数。
一直到大约90天日龄时，用GnRH疫苗处理(免疫去势)的动物与去势的雄性动物(barrows)和未去势雄性动物(公猪)相似。而且，所有3组动物具有相似的体重增加。见图4。
                        实施例5
                用GnRH疫苗免疫去势性成熟猪
该研究目的是测定GnRH疫苗是否将性成熟猪的血清睾酮和脂肪雄甾烯酮浓度降低至与手术去势猪中的同等水平，并且测定初次免疫和第二次免疫后GnRH抗体反应动力学、血清睾酮浓度和脂肪雄甾烯酮水平。
按照表2在试验0天之前将24只完整无伤的雄性猪随机分成3个处理组(组1、2和3)。把小于1周龄时被手术去势的6只日龄-和litter匹配的猪分配为第4组(组4一早期去势)。以每围栏10只动物饲养至体重大约60kg，此时按每围栏2只动物进行饲养。猪自由进食和水，使用Saskatchewan大学的分支机构动物试验基地Prairie Swine Centre记载的标准操作方法饲养，并得到了加拿大动物保护委员会的检验。
GnRH疫苗是使用来自质粒pCB122的GnRH免疫原，在4M盐酸胍中溶解为28mg/mL浓度而制备的。配制GnRH疫苗的佐剂是VSA-3。通过将GnRH免疫原的贮存原液与磷酸缓冲盐水合并并且以1∶1(v/v)的比值与VSA-3混合形成稳定的乳液来制备GnRH疫苗。每0.5ml含有40μg GnRH免疫原的疫苗经IM给药。安慰剂含有磷酸缓冲盐水和VSA-3佐剂。
给猪在颈部IM注射疫苗或者安慰剂2次。首次注射在试验0天时进行，此时猪的日龄为21天。第二次注射在猪接近性成熟时进行，此时猪的体重约100kg(110天-120天)(见表2)。2组(迟去势)动物在达到性成熟时进行手术去势，性成熟在很大程度上受体重的影响，性成熟出现在大约110kg体重时(115～125天)。在对2组的动物实施手术去势前约一周时，1组动物接受第二次免疫。这样做的目的是：使第二次免疫产生的GnRH抗体滴度在大致相同的时间达到2组手术去势动物GnRH抗体滴度的生物活性水平。
    表2：手术去势或免疫去势的动物只数、处理和时间
组号#     n     处理 疫苗或安慰剂     手术或免疫去势的时间
    1     10     免疫     疫苗     100kg(约120天)
    2     6     迟去势     安慰剂     110kg(约120天)
    3     8 完整无伤 安慰剂     不进行去势
    4     6     早去势     安慰剂     2-3kg(＜1周龄)
为了使数据分析简单化和具有代表性，120天指“事件”的时间，即当动物接受第二次注射(所有组)或者接受手术去势(组2)时的时间。“事件”后采集的所有数据均相对于“事件”来描述，即“事件”后7天是指127天，“事件”后14天指134天等。
在28天与120天的期间，按照约28天的间隔经颈静脉穿刺采集所有猪的血液样本。此后，以1周的间隔采集所有猪的血液，直至在试验第162天(“事件”后42天)时处死动物。血液在室温下凝结，离心得到血清并在24小时内冷冻血清。
从0天至“事件”期间每个月测量所有动物中每一只动物的体重增加情况，“事件”后每周测量体重直到动物被屠宰。
检测雄甾烯酮所用的皮下脂肪样本(大约5g)是这样获取的：在“事件”的时间和以每周的间隔直至动物被屠宰(162天)的期间内，在局部麻醉下，从所有猪的颈部两侧交替取出脂肪组织。立即冷冻脂肪标本并且在活组织检查后4小时内冷冻。
屠宰时测量指标包括尸体(carcass)重量、在第10肋水平背部脂肪的厚度、睾丸重量和球-尿道腺的长度。
使用改良的放免分析法测定GnRH抗体滴度。用I125(Amersham,Oakville,Ontario)标记合成的GnRH(Bachem,Inc.)。把稀释血清加入到试验试管中，接着加入标准量的I125标记的GnRH，使孵育物终体积为0.7mL。于2-6℃孵育24小时结束时加入在分析缓冲液中的木炭悬浮液，以吸收非-抗体结合的I125-GnRH。离心后，测定木炭部分的放射活性。数据以标准剂量(大约12000cpm)的I125-GnRH与特定血清稀释液中抗体结合的百分数值表示。
使用Coat-A-Count总睾酮试剂盒(DPS，洛杉矶，CA)测定血清睾酮。此试验是建立在I125-睾酮和对睾酮具有高特异性的抗体的基础上的。
使用比色法测定脂肪雄甾烯酮的浓度。
初次测量结果包括GnRH抗体滴度，它是在1组血清稀释度为1∶5000时，和2、3、4组稀释度为1∶100时测得的结合百分率。也测定血清睾酮浓度、脂肪雄甾烯酮、体重、背部脂肪、睾丸重量和球尿道长度。
初次免疫后，在血清稀释度为1∶100时1组中所有猪产生的GnRH抗体滴度很容易被检测到(见表3)。另外，在21天和约140天日龄时免疫的猪产生的GnRH抗体滴度对血清睾酮和脂肪雄甾烯酮浓度的降低程度与早期和晚期去势猪中的血清睾酮和脂肪雄甾烯酮浓度相当。与完整无伤雄性猪相比，免疫去势猪的睾丸和球尿道腺的大小也见明显减小。
表3：初次免疫后1组雄性猪的抗-GnRH抗体滴度动力学(稀释度为1∶100)
    1∶100稀释度时的抗-GnRH抗体滴度(初次免疫后)
    动物     28天     56天     84天     112天     116天
    1     22.90     31.40     13.70     11.80     37.00
    5     0.60     21.50     17.00     11.40     9.20
    6     61.5     52.40     27.90     15.10     14.20
    9     28.10     19.00     7.90     5.30     36.80
    10     75.50     77.60     75.10     71.40     74.40
    13     4.20     4.70     2.60     6.10     18.40
    14     3.06     22.90     30.90     30.10     57.40
    17     34.70     50.70     57.00     56.00     52.60
    18     42.10     36.40     28.30     44.40     14.90
    21     39.50     39.60     27.10     19.50     15.40
    22     38.00     60.10     51.00     37.50     72.70
                                实施例6
                         公牛的GnRH免疫
用58头青春期前的公牛仔进行试验。Ⅰ组的28头公牛仔皮下接种疫苗组合物2次(0天和56天)，所述疫苗组合物含有在佐剂VSA-3中的得自质粒pCB122的GnRH免疫原200μg，对2组的30头对照公牛接种安慰剂。Ⅰ组的接种，到42天时产生显著的抗GnRH滴度，到84天时阴囊周长明显减小，到98天时睾酮水平显著降低(表4)。尽管有显著的抗-GnRH滴度和睾酮水平下降，但是，在0天～84天的期间内，动物每日体重增加或者饲料利用效率未见差异(表5)。
表4：GnRH疫苗对1组和2组公牛仔的抗-GnRH滴度、阴囊周长和血清睾酮的影响
试验天数     GnRH滴度* 血清睾酮(ng/ml)          阴囊周长
 1组     2组     1组    2组     1组     2组
    0  3.3     3.8     2.7    3.7     23.0     23.3
    14  3.5     0.5
    27  2.7     0.6     26.6     26.0
    42  6.6a     0.4b
    56  10.4a     1.6a     28.0     28.3
    70  62.1a     1.2b     5.8    5.2
    84  63.1a     2.1b     28.4a     29.8b
    98  55.8a     8.7b     2.9a    7.7b     29.2a     30.9b
    112  50.7a     5.3b
    126     5.4a    9.1b     29.3a     32.2b
*在血清稀释度为1∶1000时测得的GnRH-I125结合百分比。在用GnRH免疫的组和对照组之间进行统计学比较。不同上标(a对b)的值不同(p＜0.5)。
表5：GnRH疫苗对0～84天动物平均每日体重增加、摄食和饲料利用效率的影响。变量分析表明测定的所有参数之间没有统计学差异。
    变量     1组GnRH免疫的     2组对照
    每日体重增加(kg/天)     1.24     1.24
    食物摄取     7.32     7.50
饲料利用效率(kgDM/kg增加)     5.90     6.06
这些新发现表明：利用GnRH疫苗是非常重要的，所述GnRH疫苗在初次免疫后产生足够强的免疫反应，产生的抗体滴度能够使血清睾酮发生可检测得到的下降而不会显著减慢生长或降低饲料利用效率。这些发现特别具有新颖性，因为这些发现显示：在生长早期短暂抑制雄性激素分泌并不抑制机体生长或者饲料利用效率。当使用疫苗方案时特别具有实用性，所述方案需要在生命后期继续免疫以达到强的继发反应的目的。
          菌株保藏物在本发明实践中的应用
下列菌株的生物纯培养物保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801 Univercity Boulevard,Manassas,V.A。标明的登录号是在成功地进行了活性检测和交付了所需的费用后才给出的。保藏是根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款和其规则(布达佩斯条约)而进行的。这确保自保藏日起30年(30)期限内和在保藏中心最近一次请求提供保藏物后至少5年(5)保持培养物的活性。根据布达佩斯条约的规定，可以由ATCC得到微生物，条约确保根据35 U.S.C.§122授权的U.S.专利和商标委员和委员会细则(包括37 C.F.R.§1.12)决定的个体对培养物的永久性和不受限制的可利用性。授予专利后，对于公众得到保藏培养物的所有限制将永久性取消。
这些保藏是为了方便本领域技术人员而进行的，不是35 U.S.C.§112所需求的保藏。这些质粒的核苷酸序列以及它们编码的多肽的氨基酸序列在此引入参考，并且如果与本说明书中的描述有出入的话，以此为准。制造、使用或者销售保藏的材料需要许可证，这里不授权这样的许可。菌株号                     保藏日期    ATCCpAA352在大肠杆菌W1485中    1990.3.30   68283pAA113在大肠杆菌JM105中    1995.2.1    69749pAA111在大肠杆菌JM105中    1995.2.1    69748
因此，公开了免疫抗GnRH的方法。尽管本发明优选的实施方案在某些细节上作了描述，但是应当懂得，可以进行不背离本发明权利要求限定的实质和范围的显而易见的变更。
                          序列表<110>生物星公司<120>提高动物肉产量的方法<130>08-883393WO<140>PCT/CA99/00360<141>1999-05-05<150>uS 60/084,217<151>1998-05-05<160>14<170>patentIn Ver.2.0<210>1<211>10<212>PRT<213>GnRH<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>xaa是焦谷氨酸<400>1Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro G1y1               5                  10<210>2<211>12<212>PRT<213>GnRH<220><221>MOD_RES<222>(6)<223>xaa是Gly或D-氨基酸<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>Xaa是一个或多个相同或不同的氨基酸
残基，优选1-3个Gly残基<220><221>MOD_RES<222>(12)<223>xaa是Cys或Tyr<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa是焦谷氨酸<400>2Xaa His Trp Ser Tyr Xaa Leu Arg Pro Gly Xaa Xaa1               5                  10<210>3<211>17<212>PRT<213>GnRH<400>3Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro1               5                  10                  15Gly<210>4<211>17<212>PRT<213>GnRH<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa<400>4Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Ser Pro Pro Pro Pro1               5                  10                  15Cys<210>5<211>16<212>PRT<213>GnRH<220><221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa是焦谷氨酸<400>5Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Arg Pro Pro Pro Pro Cys1               5                  10                  15<210>6<211>24<212>DNA合成构建体<213><400>6atggctactg ttatagatcg atct                       24<210>7<211>8<212>PRT<213>GnRH<400>7Met Ala Thr Val Ile Asp Arg Ser1               5<210>8<211>30<212>DNA<213>GnRH<220><221>CDS<222>(1)..(30)<400>8cag cat tgg agc tac ggc ctg cgc cct ggc            30Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1               5                  10<210>9<211>10<212>PRT<213>GnRH<400>9Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1               5                  10<210>10<211>147<212>DNA<213>GnRH<220><221>CDS<222>(1)..(147)<400>10cag cat tgg agc tac ggc ctg cgc cct ggc agc ggt tct caa gat tgg   48Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp1               5                  10                  15agc tac ggc ctg cgt ccg ggt ggc tct agc cag cat tgg agc tac ggc   96Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly
         20                  25                  30ctg cgc cct ggc agc ggt agc caa gat tgg agc tac ggc ctg cgt ccg   144Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro
     35                  40                  45ggt                                                          147Gly<210>11<211>49<212>PRT<213>GnRH<400>11Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu.Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp1               5                  10                  15Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly
         20                  25                  30Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro
     35                  40                  45Gly<210>12<211>2088<212> DNA<213> GnRH<220><221> CDS<222> (1)..(2088)<400> 12atg gct act gtt ara gat cga tct cag cat tgg agc tac ggc ctg cgc    48Met Ala Thr Val Ile Asp Arg Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg1               5                  10                  15cct ggc agc ggt tct caa gat tgg agc tac ggc ctg cgt ccg ggt ggc    96Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly
         20                  25                  30tct agc cag cat tgg agc tac ggc ctg cgo cct ggc agc ggt agc caa    144Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln
     35                 40                   45gat tgg agc tac ggc ctg cgt ccg ggt gga tct cag cat tgg agc tac    192Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Gln His Trp Ser Tyr
 50                  55                  60ggc ctg cgc cct ggc agc ggt tct caa gat tgg agc tac ggc ctg cgt    240Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg65                  70                  75                  80ccg ggt ggc tct agc cag cat tgg agc tac ggc ctg cgc cct ggc agc    288Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser
             85                  90                  95ggt agc caa gat tgg agc tac ggc ctg cgt ccg ggt gga tct agc ttc   336G1y Ser Gln Asp Trp Ser Tyr G1y Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Phe
        100                 105                 110cca aaa act ggg gca aaa aaa att atc ctc tat att ccc caa aat tac   384Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys Ile Ile Leu Tyr Ile Pro Gln Asn Tyr
    115                 120                 125caa tat gat act gaa caa ggt aat ggt tta cag gat tta gtc aaa gcg   432Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly Asn Gly Leu Gln Asp Leu Val Lys Ala
130                 135                 140gcc gaa gag ttg ggg att gag gta caa aga gaa gaa cgc aat aat att   480Ala Glu Glu Leu Gly Ile Glu Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn Asn Ile145                 150                 155                 160gca aca gct caa acc agt tta ggc acg att caa acc gct att ggc tta   528Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu Gly Thr Ile Gln Thr Ala Ile Gly Leu
            165                 170                 175act gag cgt ggc att gtg tta tcc gct cca caa att gat aaa ttg cta   576Thr Glu Arg Gly Ile Val Leu Ser Ala Pro Gln Ile Asp Lys Leu Leu
        180                 185                 190cag aaa act aaa gca ggc caa gca tta ggt tct gcc gaa agc att gta   624Gln Lys Thr Lys Ala Gly Gln Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser Ile Val
    195                 200                 205caa aat gca aat aaa gcc aaa act gta tta tct ggc att caa tct att   672Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys Thr Val Leu Ser Gly Ile Gln Ser Ile
210                 215                 220tta ggc tca gta ttg gct gga atg gat tta gat gag gcc tta cag aat   720Leu Gly Ser val Leu Ala Gly Met Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gln Asn225                 230                 235                 240aac agc aac caa cat gct ctt gct aaa gct ggc ttg gag cta aca aat   768Asn Ser Asn Gln His Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn
            245                 250                 255tca tta att gaa aat att gct aat tca gta aaa aca ctt gac gaa ttt   816Ser Leu Ile Glu Asn Ile Ala Ash Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe
        260                 265                 270ggt gag caa att agt caa ttt ggt tca aaa cta caa aat atc aaa ggc   864Gly Glu Gln Ile Ser Gln Phe Gly Ser Lys Leu Gln Asn Ile Lys Gly
275                     280                 285tta ggg act tta gga gac aaa ctc aaa aat atc ggt gga ctt gat aaa   912Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Asn Ile Gly Gly Leu Asp Lys
290                 295                 300gct ggc ctt ggt tta gat gtt atc tca ggg cta tta tcg ggc gca aca   960Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr305                 310                 315                 320gct gca ctt gta ctt gca gat aaa aat gct tca aca gct aaa aaa gtg   1008Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp Lys Ash Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val
            325                 330                 335ggt gcg ggt ttt gaa ttg gca aac caa gtt gtt ggt aat att acc aaa   1056Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala Asn Gln Va1 Val Gly Asn Ile Thr Lys
        340                 345                 350gcc gtt tct tct tac att tta gcc caa cgt gtt gca gca ggt tta tct   1104Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser
    355                 360                 365tca act ggg cct gtg gct gct tta att gct tct act gtt tct ctt gcg   1152Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala Leu Ile Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala
370                 375                 380att agc cca tta gca ttt gcc ggt att gcc gat aaa ttt aat cat gca   1200Ile Ser Pro Leu Ala Phe Ala Gly Ile Ala Asp Lys Phe Asn His Ala385                 390                 395                 400aaa agt tta gag agt tat gcc gaa cgc ttt aaa aaa tta ggc tat gac   1248Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp
            405                 410                 415gga gat aat tta tta gca gaa tat cag cgg gga aca ggg act att gat   1296Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr Ile Asp
        420                 425                 430gca tcg gtt act gca att aat acc gca ttg gcc gct att gct ggt ggt   1344Ala Ser Val Thr Ala Ile Asn Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Gly Gly
    435                 440                 445gtg tct gct gct gca gcc gat tta aca ttt gaa aaa gtt aaa cat aat   1392Val Ser Ala Ala Ala Ala Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn
450                 455                 460ctt gtc atc acg aat agc aaa aaa gag aaa gtg acc att caaaac tgg    1440Leu Val Ile Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr Ile Gln Ash Trp465                 470                 475                 480ttc cga gag gct gat ttt gct aaa gaa gtg cct aat tat aaa gca act   1488Phe Arg Glu Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr
            485                 490                 495aaa gat gag aaa atc gaa gaa atc atc ggt caa aat ggc gag cgg atc   1536Lys Asp Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ile Gly Gln Asn Gly Glu Arg Ile
        500                 505                 510acc tca aag caa gtt gat gat ctt atc gca aaa ggt aac ggc aaa att   1584Thr Ser Lys Gln Val Asp Asp Leu Ile Ala Lys Gly Asn Gly Lys Ile
    515                 520                 525acc caa gat gag cta tca aaa gtt gtt gat aac tat gaa ttg ctc aaa   1632Thr Gln Asp Glu Leu Ser Lys Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys
530                 535                 540cat agc aaa aat gtg aca aac agc tta gat aag tta atc tca tct gta   1680His Ser Lys Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu Ile Ser Ser Val545                 550                 555                 560agt gca ttt acc tcg tct aat gat tcg aga aat gta tta gtg gct cca   1728Ser Ala Phe Thr Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro
            565                 570                 575act tca atg ttg gat caa agt tta tct tct ctt caa ttt gct agg gga   1776Thr Ser Met Leu Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly
        580                 585                 590tct cag cat tgg agc tac ggc ctg cgc cct ggc agc ggt tct caa gat   1824Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp
    595                 600                 605tgg agc tac ggc ctg cgt ccg ggt ggc tct agc cag cat tgg agc tac   1872Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr
610                 615                 620ggc ctg cgc cct ggc agc ggt agc caa gat tgg agc tac ggc ctg cgt   1920Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg625                 630                 635                 640ccg ggt gga tct cag cat tgg agc tac ggc ctg cgc cct ggc agc ggt   1968Pro Gly Gly Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly
            645                 650                 655tct caa gat tgg agc tac ggc ctg cgt ccg ggt ggc tct agc cag cat   2016Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His
        660                 665                 670tgg agc tac ggc Ctg cgc cct ggc agc ggt agc caa gat tgg agc tac   2064Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr
    675                 680                 685ggc ctg cgt ccg ggt gga tcc tag                                   2088Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser
690                 695<210>13<211>695<212>PRT<213>GnRH<400>13Met Ala Thr Val Ile Asp Arg Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg1               5                  10                  15Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly
         20                  25                  30Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln
     35                  40                  45Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Gln His Trp Ser Tyr
 50                  55                  60Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg65                  70                  75                  80Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser
             85                  90                  95Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Phe
        100                 105                 110Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys Ile Ile Leu Tyr Ile Pro Gln Asn Tyr
    115                 120                 125Gln Tyr Asp Thr Glu Gln Gly Asn Gly Leu Gln Asp Leu Val Lys Ala
130                 135                 140Ala Glu Glu Leu Gly Ile Glu Val Gln Arg Glu Glu Arg Asn Asn Ile145                 150                 155                 160Ala Thr Ala Gln Thr Ser Leu Gly Thr Ile Gln Thr Ala Ile Gly Leu
            165                 170                 175Thr Glu Arg Gly Ile Val Leu Ser Ala Pro Gln Ile Asp Lys Leu Leu
        180                 185                 190Gln Lys Thr Lys Ala GIy Gln Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser Ile Val
    195                 200                 205Gln Asn Ala Asn Lys Ala Lys Thr Val Leu Ser Gly Ile Gln Ser Ile
210                 215                 220Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly Met Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gln Asn225                 230                 235                 240Asn Ser Asn Gln His Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn
            245                 250                 255Ser Leu Ile Glu Asn Ile Ala Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe
        260                 265                 270Gly Glu Gln Ile Ser Gln Phe Gly Ser Lys Leu Gln Asn Ile Lys Gly
    275                280                285Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Asn Ile Gly Gly Leu Asp Lys
290                 295                 300Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr305                 310                     315             320Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val
            325                 330                 335Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala Asn Gln Val Val Gly Asn Ile Thr Lys
        340                 345                 350Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser
    355                 360                 365Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala Leu Ile Ala Ser Thr Val Ser Leu Ala
370                 375                 380Ile Ser Pro Leu Ala Phe Ala Gly Ile Ala Asp Lys Phe Asn His Ala385                 390                 395                 400Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp
            405                 410                 415Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Gln Arg Gly Thr Gly Thr Ile Asp
        420                 425                 430Ala Ser Val Thr Ala Ile Asn Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Gly Gly
    435                 440                 445Val Ser Ala Ala Ala Ala Asp Leu Thr Phe Glu Lys Val Lys His Asn
450                 455                 460Leu Val Ile Thr Asn Ser Lys Lys Glu Lys Val Thr Ile Gln Asn Trp465                 470                 475                 480Phe Arg Glu Ala Asp Phe Ala Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr
            485                 490                 495Lys Asp Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ile Gly Gln Asn Gly Glu Arg Ile
        500                 505                 510Thr Ser Lys Gln Val Asp Asp Leu Ile Ala Lys Gly Asn Gly Lys Ile
    515                 520                 525Thr Gln Asp Glu Leu Ser Lys Val Val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys
530                 535                 540His Ser Lys Asn Val Thr Asn Ser Leu Asp Lys Leu Ile Ser Ser Val545                 550                 555                 560Ser Ala Phe Thr Ser Ser Asn Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro
            565                 570                 575Thr Ser Met Leu Asp Gln Ser Leu Ser Ser Leu Gln Phe Ala Arg Gly
        580                 585                 590Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp
    595                 600                 605Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr
610                 615                 620Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg625                 630                 635                 640Pro Gly Gly Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly
            645                 650                 655Ser Gln Asp Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Ser Gln His
        660                 665                 670Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gln Asp Trp Ser Tyr
    675                 680                 685Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser
690                 695<210>14<211>6<212>PRT<213>RTX共有序列<220><221>MOD_RES<222>(3)<223>Xaa is Lys,Asp,Va1 or Asn<220><221>MOD_RES<222>(5)<223>Xaa is Lys,Asp,Val or Asn<400>1Gly Gly Xaa Gly Xaa Asp1               5

Claims (28)

1．第一和第二GnRH免疫原在制备提高未去势雄性产食动物肉产量方法中应用的第一和第二疫苗组合物中的应用，所述方法包括在所述动物的肥育期前或肥育期用所述第一疫苗组合物接种所述动物以降低循环睾酮的水平，和在屠宰动物前约2～约8周用所述第二疫苗组合物接种所述动物以显著降低一种或多种雄性和/或非雄性类固醇的水平。
2．权利要求1所述的应用，其中所述第一疫苗组合物在所述动物出生到约10周龄的期间施用。
3．权利要求1所述的应用，其中第一和第二疫苗组合物进一步包括免疫佐剂。
4．权利要求3所述的应用，其中所述第一和/或第二疫苗组合物中的佐剂包括油和二甲基二-十八烷基溴化铵。
5．权利要求3所述的应用，其中第一和第二疫苗组合物中的GnRH免疫原是相同的。
6．权利要求3所述的应用，其中第一和第二疫苗组合物中的GnRH免疫原是不同的。
7．权利要求1所述的应用，其中第一疫苗组合物的施用导致与所述动物内源性GnRH发生交叉反应的抗体产生，和在抗体水平已经下降后施用第二疫苗组合物。
8．权利要求3所述的应用，其中在所述第一和/或第二疫苗组合物中的GnRH免疫原是含有通式为(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多体，其中GnRH是GnRH免疫原；
X是选自肽键、氨基酸间隔基团、载体分子和[GnRH]n的一个或多个分子，其中n是大于或者等于1的整数；和
y是大于或者等于1的整数。
9．权利要求8所述的应用，其中载体分子是白细胞毒素多肽。
10．权利要求1所述的应用，其中所述GnRH免疫原是核酸分子。
11．权利要求1所述的应用，其中所述第二疫苗组合物在屠宰动物前约4～约6周施用。
12．权利要求11所述的应用，其中在所述第二疫苗组合物中的免疫佐剂是含水佐剂。
13．第一和第二GnRH免疫原在制备提高未去势雄性牛、羊或猪肉产量的方法中应用的第一和第二疫苗组合物中的应用，所述方法包括在所述动物的肥育期前或肥育期用所述第一疫苗组合物接种所述动物以降低循环睾酮的水平，和在屠宰动物前约2～约8周用所述第二疫苗组合物接种所述动物以显著降低一种或多种雄性和/或非雄性类固醇的水平。
14．权利要求13所述的应用，其中第一和第二疫苗组合物进一步包括免疫佐剂。
15．权利要求14所述的应用，其中第一和第二疫苗组合物中的GnRH免疫原是相同的。
16．权利要求14所述的应用，其中第一和第二疫苗组合物中的GnRH免疫原是不同的。
17．权利要求13所述的应用，其中在所述第一和/或第二疫苗组合物中的所述GnRH免疫原是含有通式为(GnRH-X-GnRH)y的GnRH多体，其中
GnRH是GnRH免疫原；
X是选自肽键、氨基酸间隔基团、载体分子和[GnRH]n的一个或多个分子，其中n是大于或者等于1的整数；和
y是大于或者等于1的整数。
18．权利要求17所述的应用，其中载体分子是白细胞毒素多肽。
19．权利要求13所述的应用，其中所述第二疫苗组合物在屠宰动物前约4～约6周施用。
20．第一和第二GnRH多体在制备提高未去势雄性牛、羊或猪肉产量的方法中应用的第一和第二疫苗组合物中的应用，所述第一和第二疫苗组合物包括佐剂，所述第一和第二GnRH多体含有通式(GnRH-X-GnRH)y，通式中
GnRH为GnRH免疫原；
X是选自肽键、氨基酸间隔基团、白细胞毒素多肽和[GnRH]n的一个或多个分子，其中n是大于或者等于1的整数；和
y是大于或者等于1的整数，其中所述第一疫苗组合物在动物肥育期前或肥育期施用以降低循环中的睾酮水平，和所述第二疫苗组合物在屠宰动物前约2～约8周施用以显著降低一种或多种雄性和/或非雄性类固醇的水平。
21．权利要求20所述的应用，其中所述第一和第二疫苗组合物含有相同的GnRH多体。
22．权利要求20所述的应用，其中所述第一和第二疫苗组合物中的所述GnRH多体含有图3A-3F(SEQ ID号：12和13)描绘的氨基酸序列，或者与其序列具有至少约75％序列同源性的氨基酸序列。
23．权利要求22所述的应用，其中所述GnRH多体含有图3A-3F(SEQID号：12和13)描绘的氨基酸序列。
24．权利要求20所述的应用，其中第二疫苗组合物在屠宰动物前约4～约6周施用。
25．第一和第二GnRH多体在制备提高未去势雄性牛、羊或猪肉产量的方法中应用的第一和第二疫苗组合物中的应用，所述第一和第二疫苗组合物包括佐剂，所述第一和第二GnRH多体含有图3A-3F(SEQ ID号：12和13)描绘的氨基酸序列，或者与其序列具有至少约75％序列同源性的氨基酸序列，其中所述第一疫苗组合物在动物肥育期前或肥育期施用以降低循环中的睾酮水平，和所述第二疫苗组合物在屠宰动物前约2～约8周施用以显著降低一种或多种雄性和/或非雄性类固醇的水平。
26．权利要求25所述的应用，其中所述第一和第二疫苗组合物中的所述GnRH多体含有图3A-3F(SEQID号：12和13)描绘的氨基酸序列。
27．权利要求25所述的应用，其中第二疫苗组合物在屠宰动物前约4～约6周施用。
28．权利要求25所述的应用，其中所述第一和/或第二疫苗组合物中的免疫佐剂含有轻矿物油和二甲基二-十八烷基溴化铵。
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