CN108047328A - 一种GnRH多肽抗原及其用于制备去势疫苗的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种GnRH多肽抗原及其用于制备去势疫苗的应用，该技术方案针对大分子载体蛋白存在空间位阻大、化学偶联质控难和副作用大等缺点，将GnRH改构物与Th表位全合成，形成分子量适中、免疫原性显著、质量可控的全合成多肽抗原，在此基础上根据抗原特性设计了适宜的疫苗制备方法。本发明所制备的去势疫苗在动物体内能够产生较高的免疫原性，副作用小，不会致组织损伤，代谢产物无毒，注射剂量小、效果好，在新型治疗性疫苗领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及合成肽技术领域，同时涉及抗原的分子结构优化及及其疫苗应用，具体涉及一种GnRH多肽抗原及其用于制备去势疫苗的应用。
背景技术
合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)是用化学合成抗原表位氨基酸序列制备具有保护性作用的类似天然抗原决定簇的多肽疫苗。这种疫苗不含核酸，是理想的安全新型疫苗，随着合成肽制备技术的创新与完善，其生产成本显著降低，使得合成肽作为畜禽疫苗抗原主动免疫动物成为现实。
GnRH(促性腺激素释放激素Gonadotropin releasing hormone,GnRH 14-64)是下丘脑神经内分泌细胞合成的十肽，通过垂体门脉系统呈脉冲式释放。与垂体前叶具有特异性GnRH受体(Gonadotropin releasing hormone receptor,GnRHR)的促性腺细胞结合，调节垂体黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(Follicle stimulatinghormone,FSH)的合成和分泌。LH、FSH释放进入血循环，作用于性腺，调节生殖细胞成熟及性激素合成分泌，GnRH在控制、调节哺乳动物生殖功能中发挥重要作用，是调节下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-Gonadal axis,HPG)的关键信号分子。
以人工合成GnRH或其类似物制成合成肽去势疫苗免疫动物，在动物体内形成GnRH抗体中和内源性GnRH。从而调控动物内分泌系统与性相关的睾酮及雌激素等激素的水平，抑制其性腺发育，使其丧失性行为和性功能，在实现温和去势的同时部分的保留性腺对动物生产性能的刺激作用，既能促进动物的生长还能改善动物的肉质风味(去膻味并使肉质鲜嫩)。合成肽去势疫苗临床应用的可行性及显著免疫效果已被国内外许多学者及专家证实并已实际生产应用。与传统手术去势相比，具有安全方便、适合畜禽集约化养殖、作用效果温和、应激性小、可有效防止手术去势导致的出血、感染等优点，是有望取代传统外科阉割的新技术。
去势疫苗具有免疫效率高、安全性高、副作用小、使用便捷等优点，对此一些研究团队针对抗原改造和免疫佐剂筛选进行了大量的研究工作。一种思路是将GnRH进行改构然后联接大分子载体蛋白以提高免疫原性。例如中国专利(申请号：201310557709)在改构的GnRH串联二聚体的C端至少一个氨基酸间隔插入Cys，然后通过二硫键搭桥形成并列二聚体，可以确保C端偶联大分子载体蛋白使之具有更好的抗原性；专利(申请号：200980144572)分别通过GnRH N基端和C基端连接载体蛋白或表位，形成GnRH氨基端突变体和羧基端突变体，2种突变体组合在油性佐剂里可形成协同免疫去势效果；专利(申请号：96194609)描述了为提高GnRH的免疫原性进行了改构，改构物为串联GnRH变体，每个GnRH6位甘氨酸被D-Lys取代，C端为Cys，可以通过Cys二聚体化，然后再与载体蛋白偶联，与双油佐剂等温和佐剂配合使用，低剂量亦可达到明显免疫效果。尽管现有技术的研究者在GnRH抗原的改构层面进行了诸多研究，但目前无论天然的GnRH抗原还是改构得到的类似物仍存在着免疫原性不突出、副作用大等技术问题。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种GnRH多肽抗原，以解决现有技术中常规GnRH抗原及其改构产物副作用大、安全性较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中常规GnRH抗原及其改构产物免疫原性有待提升。
本发明同时提供了上述GnRH多肽抗原用于制备动物去势疫苗的应用，以根据该特定GnRH多肽抗原的性质在疫苗制备工艺层面进行匹配设计。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种GnRH多肽抗原，其氨基酸序列具有以下结构：Th+J+(XGnRH+YGnRH)n；
其中，XGnRH+YGnRH是具有以下氨基酸序列的肽段：X-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Y-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；X选自Glu或Glu的r羧基；Y选自Gln或Asn；
Th选自具有以下氨基酸序列的肽段之一：
Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val或
Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Tyr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr或
Val-Ala-Phe-Arg-Ala-Gly-Leu-Val-Met-Glu-Ala-Gly-Ser-Lys-Val-Thr；
J选自以下间隔连接：-AA-，-GG-，-AG-，-GA-，L-Lys(ε)或L-Glu(γ)；
1≤n≤3。
作为优选，所述GnRH多肽抗原的氨基酸序列中，N端连接有缀合物Z；
所述缀合物Z选自Palmitic acid，mPEG，Pam2Cys，Pam2Cys-S，Pam2Cys-SS或Pam2Cys-SS(K)n。
作为优选，所述GnRH多肽抗原的氨基酸序列具有以下结构之一：
Z+Th+J+(XGnRH+YGnRH)n或
Th+J+(Z)+(XGnRH+YGnRH)n或
Z+Th+J+(Z)+(XGnRH+YGnRH)n。
作为优选，所述GnRH多肽抗原的氨基酸序列选自以下SEQ No.1～SEQNo.20的任一项：
SEQNo.1:H-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.2:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.3:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.4:PEG-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.5:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.6:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.7:H-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam2Cys)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.8:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam2Cys)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.9:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam2Cys)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.10:H-LSEIKGVIHRLEGVKE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.11:Pam-LSEIKGVIHRLEGVE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.12:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.13:H-LSEIKGVIHRLEGVK【E(γ)-Pam】EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.14:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK【E(γ)-Pam】EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.15:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK【E(γ)-Pam】EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.16:H-LSEIKGVIHRLEGVK(PEG)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.17:PEG-LSEIKGVIHRLEGVK(PEG)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.18:PEG-LSEIKGVIHRLEGVKE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.19:PEG-LSEIKGVIHRLEGVKE(PEG)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.20：H-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2。
同时，本发明提供了上述GnRH多肽抗原的一种制备方法，包括以下步骤：
1)多肽抗原树脂的固相合成：
A)以氮-甲基吡咯烷酮溶胀氨基Linker树脂，所述氨基Linker树脂的特定代值为0.2-0.7mmol/g，交联度为1-2％；
B)脱保护反应：将氨基Linker树脂置于20％-50％哌啶/氮-甲基吡咯烷酮溶液中，在23-30℃条件下反应3-10分钟，用氮-甲基吡咯烷酮清洗，而后再以同样条件反应10～30分钟；
C)活化氨基酸：1-羟基苯并三氮唑、N,N’-二异丙基碳二亚胺、氮-甲基吡咯烷酮混合溶液活化带9-芴甲氧羰基保护基团的氨基酸，其中带9-芴甲氧羰基保护基团的氨基酸与N,N’-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑三者摩尔数比为1:1:1或1:1.5:1；
D)缩合反应：将步骤C)活化后的氨基酸溶液与步骤B)脱保护后的氨基Linker树脂加入多肽合成仪的反应器，在23-28℃条件下缩合反应30-180分钟；
E)循环反应直至完成：合成是从C端开始至N端，重复上述合成步骤，完成多肽抗原树脂的合成并清洗抽干；
2)多肽抗原树脂的切割：
将切割试剂在-20℃条件下冷冻30分钟，然后和干燥多肽树脂转移到切割装置中，在室温下匀速搅拌反应2.5-4小时，砂板漏斗滤去树脂，收取滤液；减压或氮吹除去切割液中的三氟乙酸，加入冷冻的叔丁基甲基醚，析出多肽抗原后离心或过滤处理，反复洗涤后真空减压干燥得到多肽抗原。
作为优选，步骤2)完成后对所得的多肽抗原用超滤膜包或反相制备色谱进行纯化，纯化产物用0.22μm滤菌器过滤除菌。
同时，本发明提供了一种动物去势疫苗，所述动物去势疫苗中含有权利要求上述的GnRH多肽抗原。
同时，本发明提供了上述GnRH多肽抗原用于制备动物去势疫苗的应用，该应用包括以下步骤：
1)取所述GnRH多肽抗原，配制成浓度为100μg/ml的抗原溶液，用0.2μm过滤器过滤除菌，作为水相；
2)取油佐剂经121℃，灭菌30分钟，作为油相；
3)将所述油相和水相混合后经疫苗乳化机乳化，得到油包水型疫苗。
作为优选，所述油佐剂是SEPPIC MONTANIDE.ISA 61VG油佐剂。
作为优选，步骤3)中油相和水相的混合体积比为1:1。
在以上技术方案中，“+”表示两条序列收尾串联；所述SEPPIC 61VG油佐剂是指由法国赛比克公司出品的、产品型号为SEPPIC MONTANIDE.ISA 61VG的油佐剂。
本发明提供了一种GnRH多肽抗原及其用于制备去势疫苗的应用，该技术方案针对大分子载体蛋白存在空间位阻大、化学偶联质控难和副作用大等缺点，将GnRH改构物与Th表位全合成，形成分子量适中、免疫原性显著、质量可控的全合成多肽抗原，在此基础上根据抗原特性设计了适宜的疫苗制备方法。本发明所制备的去势疫苗在动物体内能够产生较高的免疫原性，副作用小，不会致组织损伤，代谢产物无毒，注射剂量小、效果好，在新型治疗性疫苗领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中四种疫苗免疫大鼠后在试验周期内GnRH抗体水平变化趋势图；
图2是本发明具体实施方式中免疫后大鼠血清内睾酮浓度对比图；
图3是本发明具体实施方式中免疫结束后大鼠睾丸重量对比图；
图4是本发明具体实施方式中睾丸组织切片对比图，其中A部分为空白对照组实验结果，B部分为免疫组实验结果。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
氨基酸缩写简称如下：谷氨酰胺glnQ；甘氨酸glyG；丝氨酸serS；丙氨酸alaA；苏氨酸thrT；缬氨酸valV；异亮氨酸ileI；亮氨酸leuL；酪氨酸tyrY；苯丙氨酸pheF；组氨酸hisH；脯氨酸proP；天冬酰胺asnN；甲硫氨酸metM；谷氨酸gluE；色氨酸trpW；赖氨酸lysK；半胱氨酸cysC；精氨酸argR；天冬氨酸AspD。
一种GnRH多肽抗原，所述多肽抗原为下述结构中的一种
(1).Th+J+(XGnRH+YGnRH)n
(2).Z+Th+J+(XGnRH+YGnRH)n
(3)Th+J+(Z)+(XGnRH+YGnRH)n
(4).Z+Th+J+(Z)+(XGnRH+YGnRH)n；
XGnRH+YGnRH为改造GnRH串联序列：
X-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Y-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2其中X为Glu或Glu(r)，Y为Gln或Asn
GnRH(14-64)十肽基本序列：
PGlu1-His2-Trp3-Ser4-Tyr5-Gly6-Leu7-Arg8-Pro9-Gly10-NH2，PGlu1指焦谷氨酸，
Th为混杂辅助T细胞表位；
J为间隔连接：-AA-，-GG-，-AG-，-GA-，L-Lys(ε)，L-Glu(γ)；
Z为氨基酸序列N端添加的缀合物：Palmitic acid,mPEG，Pam2Cys，Pam2Cys-S，Pam2Cys-SS，Pam2Cys-SS(K)n。
其中1≤n≤3。
为保证不同肽段间的分子间距，我们利用两个Ala或者Gly又或者Ala和Gly组合以及天然氨基酸L-Lys的ε氨基和L-Glu的γ羧基作为连接间隔，但并不局限于这些构建基团。
进一步，所述混杂辅助T细胞表位是：
Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val
(Measle Virus F Protein aa288-302)
Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Tyr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr
(Influenza haemagglutininHA307-319)
Val-Ala-Phe-Arg-Ala-Gly-Leu-Val-Met-Glu-Ala-Gly-Ser-Lys-Val-Thr
(Mycobacterium tuberculosis Mce protein P3aa49-64)。
T细胞表位指被TCR识别的抗原表位，表位成分为蛋白质降解后的多肽，多存在于抗原分子内部。本申请选择相关混杂辅助T细胞表位，以解决MHC高度遗传多态性问题。
进一步，所述多肽抗原的序列是：
SEQNo.1:H-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.2:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.3:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.4:PEG-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.5:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.6:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.7:H-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam2Cys)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.8:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam2Cys)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.9:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam2Cys)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.10:H-LSEIKGVIHRLEGVKE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.11：Pam-LSEIKGVIHRLEGVE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.12：Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.13：H-LSEIKGVIHRLEGVK【E(γ)-Pam】EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.14：Pam-LSEIKGVIHRLEGVK【E(γ)-Pam】EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.15:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK【E(γ)-Pam】EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.16:H-LSEIKGVIHRLEGVK(PEG)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.17:PEG-LSEIKGVIHRLEGVK(PEG)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.18:PEG-LSEIKGVIHRLEGVKE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.19:PEG-LSEIKGVIHRLEGVKE(PEG)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.20：H-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2。
进一步，使用固相合成方法，所述固相合成方法包括如下步骤：
(一)多肽抗原树脂的固相合成
(1)以氮-甲基吡咯烷酮溶胀特定代值和交联度的氨基Linker树脂，特定代值为0.2-0.7mmol/g，交联度为1-2％；
(2)脱保护反应：将氨基Linker树脂置于20％-50％哌啶/氮-甲基吡咯烷酮溶液中，在23-30℃条件下反应两次，一次3-10分钟，一次10-30分钟脱除氨基Linker树脂的9-芴甲氧羰基氨基保护基团，中间用氮-甲基吡咯烷酮清洗一次；
(3)活化氨基酸：将合成用的带9-芴甲氧羰基保护基团的氨基酸按合成序列依次活化，活化条件为特定比例(氨基酸:DIC:HOBT＝1:1:1或1:1.5:1)的N,N’-二异丙基碳二亚胺,1-羟基苯并三氮唑,氮-甲基吡咯烷酮溶液；
(4)缩合反应：将活化好的氨基酸溶液及脱完保护的氨基Linker树脂加入多肽合成仪的反应器，按编制好的合成程序在23-28℃条件下缩合反应30-180分钟；
(5)循环反应直至完成：合成是从C端开始至N端，依照给定的顺序，依次不断地重复上述合成步骤，完成多肽抗原树脂的合成并清洗抽干。
(二)多肽抗原树脂的切割
将切割试剂(成分及配比为三氟乙酸：80％苯酚溶液：三异丙基硅烷＝90％：5％：5％)在-20℃条件下冷冻30分钟，然后和干燥多肽树脂按比例转移到切割装置中，在室温下匀速搅拌反应2.5-4小时，砂板漏斗滤去树脂，收取滤液；减压或氮吹除去切割液中的三氟乙酸，加入冷冻的叔丁基甲基醚，析出多肽抗原后离心或过滤处理，反复洗涤后真空减压干燥得到多肽抗原。
(三)多肽抗原的纯化
用超滤膜包或者反相制备色谱纯化多肽抗原；
(四)除菌保存
0.22微米滤菌器过滤除菌。
一种GnRH去势疫苗，所述GnRH去势疫苗包括GnRH多肽抗原。
进一步，所述GnRH去势疫苗还包括一种佐剂。
进一步，所述佐剂是SEPPIC MONTANIDE.ISA 61VG油佐剂。
GnRH去势疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)用注射用超纯水将多肽抗原溶解为100ug/ml溶液并用0.2微米过滤器过滤除菌，作为水相；
(2)将SEPPIC 61VG油佐剂经121摄氏度30分钟高温灭菌，作为油相；
(3)用高速搅拌乳化机将油相和水相按比例在无菌条件下进行乳化制成油包水疫苗。优选的按照1：1比例进行乳化制成油包水疫苗。
以下选取SEQ No.1，SEQ No.2，SEQ No.3，SEQ No.4按以上方法制得合成肽去势疫苗G1，G2，G3，G4进行以下实验操作进行实施例的验证。
一、实验动物的分组及免疫
A、将九周龄雄性SD大鼠分成五组，每组6只，颈背皮下三点注射，单次免疫，每只注射0.5ml。
B、于免疫前和免疫后每两周采血一次，分离血清，检测血清中GnRH抗体滴度、睾酮浓度，于首免后18周分两批处死，摘取两侧睾丸，称重、测量。
表1实验动物分组及免疫注射表：
| 组别 | 对应疫苗 | 样本数量(只) | 剂量(ml) |
| I | G1 | 6 | 0.5 |
| II | G2 | 6 | 0.5 |
| III | G3 | 6 | 0.5 |
| IV | G4 | 6 | 0.5 |
| V | 空白 | 6 | 0.5 |
表2对照组、免疫组大鼠睾丸重量
注：上角标表示差异极显著(P<0.01)。附图3
二、间接ELISA方法检测大鼠血清GnRH抗体
GnRH合成肽抗原以常规方法包被，随后以2％BSA进行封闭，待检的阴性和阳性血清分别倍比稀释后加样置37℃温育，然后加HRP-羊抗大鼠二抗，置37℃温育，洗涤后加TMB避光显色，终止反应，室温放置3min后测量各孔吸光度值A450nm。绘制抗体滴度-A450nm曲线，计算样品血清的抗体滴度。
免疫后第4周，免疫组大鼠血清抗体滴度迅速上升，6周后趋于平稳，到免疫后第18周滴度在2.5以上。整个实验期间空白组大鼠血清的抗体滴度几乎接近零，与空白对照组比较，四种合成肽疫苗免疫组大鼠的血清抗体滴度均极显著升高(P<0.01)，在免疫后第6、10周差异显著(P<0.05)，在免疫后第10、12、16、18周差异极显著(P<0.01)(图1)。
三、大鼠血清睾酮检测
采用碘125睾酮放射免疫分析法。
免疫后第4周，免疫组与空白对照组的相比较，睾酮含量极显著下降(P<0.01)，首次免疫后第10周仍维持在较低水平(图2)。11-18周后数据几乎一直为零，图中就未做统计。如果以血清睾酮含量≤0.1ng/mL作为免疫去势效果显著的判定标准，统计显示，去势效果显著，与抗体检测结果相符。
四、睾丸外观及组织学观察
首次免疫后第18周，摘取SD大鼠两侧睾丸，测量睾丸的重量(除去附睾后)，然后置于10％福尔马林缓冲液中固定，待用。常规脱水、透明、浸蜡进行组织包埋，切片，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，H.E染色)后镜检。
睾丸称重结果显示，所有免疫组大鼠睾丸重量均极显著低于空白对照组(P<0.01)(图3)。
组织染色结果显示，空白对照组(图4中A部分)大鼠睾丸组织结构完整，曲细精管内的精原细胞逐渐向管腔发育，明显分化成初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。免疫组的大鼠睾丸明显萎缩，曲细精管管径变小，精原细胞脱落，管腔中仅有少量精原细胞，无成熟精子细胞(图4中B部分)。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种GnRH多肽抗原，其氨基酸序列具有以下结构：Th+J+(XGnRH+YGnRH)n；
其中，XGnRH+YGnRH是具有以下氨基酸序列的肽段：X-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Y-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；X选自Glu或Glu的r羧基；Y选自Gln或Asn；
Th选自具有以下氨基酸序列的肽段之一：
Leu-Ser-Glu-Ile-Lys-Gly-Val-Ile-Val-His-Arg-Leu-Glu-Gly-Val或
Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Tyr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr或
Val-Ala-Phe-Arg-Ala-Gly-Leu-Val-Met-Glu-Ala-Gly-Ser-Lys-Val-Thr；
J选自以下间隔连接：-AA-，-GG-，-AG-，-GA-，L-Lys(ε)或L-Glu(γ)；
1≤n≤3。
2.根据权利要求1所述的一种GnRH多肽抗原，其特征在于所述GnRH多肽抗原的氨基酸序列中，N端连接有缀合物Z；
所述缀合物Z选自Palmitic acid，mPEG，Pam2Cys，Pam2Cys-S，Pam2Cys-SS或Pam2Cys-SS(K)n。
3.根据权利要求2所述的一种GnRH多肽抗原，其特征在于所述GnRH多肽抗原的氨基酸序列具有以下结构之一：Z+Th+J+(XGnRH+YGnRH)n或Th+J+(Z)+(XGnRH+YGnRH)n或Z+Th+J+(Z)+(XGnRH+YGnRH)n。
4.根据权利要求1所述的一种GnRH多肽抗原，其特征在于所述GnRH多肽抗原的氨基酸序列选自以下SEQ No.1～SEQ No.20的任一项：
SEQNo.1:H-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.2:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.3:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.4:PEG-LSEIKGVIHRLEGVK(ε)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.5:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.6:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.7:H-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam2Cys)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.8:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam2Cys)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.9:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam2Cys)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.10:H-LSEIKGVIHRLEGVKE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.11:Pam-LSEIKGVIHRLEGVE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.12:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.13:H-LSEIKGVIHRLEGVK【E(γ)-Pam】EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.14:Pam-LSEIKGVIHRLEGVK【E(γ)-Pam】EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.15:Pam2Cys-LSEIKGVIHRLEGVK【E(γ)-Pam】EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.16:H-LSEIKGVIHRLEGVK(PEG)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.17:PEG-LSEIKGVIHRLEGVK(PEG)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.18:PEG-LSEIKGVIHRLEGVKE(γ)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.19:PEG-LSEIKGVIHRLEGVKE(PEG)HWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2
SEQNo.20：H-LSEIKGVIHRLEGVK(Pam)EHWSYGLRPGQHWSYGLKPG-NH2。
5.权利要求1所述GnRH多肽抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)多肽抗原树脂的固相合成：
A)以氮-甲基吡咯烷酮溶胀氨基Linker树脂，所述氨基Linker树脂的特定代值为0.2-0.7mmol/g，交联度为1-2％；
B)脱保护反应：将氨基Linker树脂置于20％-50％哌啶/氮-甲基吡咯烷酮溶液中，在23-30℃条件下反应3-10分钟，用氮-甲基吡咯烷酮清洗，而后再以同样条件反应10～30分钟；
C)活化氨基酸：1-羟基苯并三氮唑、N,N’-二异丙基碳二亚胺、氮-甲基吡咯烷酮混合溶液活化带9-芴甲氧羰基保护基团的氨基酸，其中带9-芴甲氧羰基保护基团的氨基酸与N,N’-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑三者摩尔数比为1:1:1或1:1.5:1；
D)缩合反应：将步骤C)活化后的氨基酸溶液与步骤B)脱保护后的氨基Linker树脂加入多肽合成仪的反应器，在23-28℃条件下缩合反应30-180分钟；
E)循环反应直至完成：合成是从C端开始至N端，重复上述合成步骤，完成多肽抗原树脂的合成并清洗抽干；
2)多肽抗原树脂的切割：
将切割试剂在-20℃条件下冷冻30分钟，然后和干燥多肽树脂转移到切割装置中，在室温下匀速搅拌反应2.5-4小时，砂板漏斗滤去树脂，收取滤液；减压或氮吹除去切割液中的三氟乙酸，加入冷冻的叔丁基甲基醚，析出多肽抗原后离心或过滤处理，反复洗涤后真空减压干燥得到多肽抗原。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤2)完成后对所得的多肽抗原用超滤膜包或反相制备色谱进行纯化，纯化产物用0.22μm滤菌器过滤除菌。
7.一种动物去势疫苗，其特征在于所述动物去势疫苗中含有权利要求1～4任一项所述的GnRH多肽抗原。
8.权利要求1～4任一项所述GnRH多肽抗原用于制备动物去势疫苗的应用，其特征在于该应用包括以下步骤：
1)取所述GnRH多肽抗原，配制成浓度为100μg/ml的抗原溶液，用0.2μm过滤器过滤除菌，作为水相；
2)取油佐剂经121℃，灭菌30分钟，作为油相；
3)将所述油相和水相混合后经疫苗乳化机乳化，得到油包水型疫苗。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述油佐剂是SEPPIC MONTANIDE.ISA 61VG油佐剂。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于步骤3)中油相和水相的混合体积比为1:1。
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