JPH08503490A

JPH08503490A - リポ多糖結合性および中和能のあるペプチド

Info

Publication number: JPH08503490A
Application number: JP7506764A
Authority: JP
Inventors: ヘス，アドルフ; リディントン，ロバート・シー
Original assignee: モルフォシス・ゲゼルシャフト・フュア・プロタインオプティミールング・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1993-08-18
Filing date: 1994-08-18
Publication date: 1996-04-16
Also published as: US6384188B1; WO1995005393A2; EP0664814A1; WO1995005393A3; CA2146667A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、高親和性でエンドトキシン（リポ多糖［ＬＰＳ］）と結合し、例えば、グラム陰性およびグラム陽性細菌による敗血症の予防または治療、ヘパリンに関連した中和効果のみならず細菌および真菌感染の治療にも有用な物質に関する。該物質は、ＬＰＳ結合ドメインからなるＬＰＳ結合ペプチドである。さらに、本発明は、該ペプチドをコードしているＤＮＡ配列、該ＤＮＡを有する組み換え微生物、本発明ペプチドを含有する医薬組成物、および診断キットに関する。本発明はまた、溶液からの細菌性ＬＰＳの検出および除去方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】リポ多糖結合性および中和能のあるペプチド本発明は、高親和性でエンドトキシン（リポ多糖［ＬＰＳ］）に結合し、グラム陰性およびグラム陽性細菌敗血症のごとき種々の症状ならびに疾病、または細菌あるいは真菌感染の予防もしくは治療に有用な物質に関する。そのうえ、ヘパリン関連の中和効果に関して該物質を使用することができる。該物質は、ＬＰＳ結合ドメインからなるＬＰＳ結合ペプチドである。また本発明は、溶液から細菌ＬＰＳを検出および除去する方法を包含する。ヒトにおいて、グラム陰性細菌による感染の間に放出されるＬＰＳは、敗血性ショックに関連した重大な病理学的変化を引き起こす（デュマ（Duma），アメリカン・ジャーナル・オブ・メディシン（Am．J.Med．）第７８巻（１９８５年）１５４〜１６３頁；グラウサー（Glauser）ら，ランセト（Lancet）第３３８巻（１９９１年），７３２〜７３６頁）。米国において、敗血性ショックは、年間１００，０００ないし３００，０００人の死亡原因であり（ジーグラー（Ziegle r）ら，ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Eng．J.Med ．）第３２４巻（１９９１年），４２９〜４３６頁）、ドイツにおいては、７０，０００ないし１００，０００人の死亡原因である。ＬＰＳの中和またはインビボにおけるその除去を促進ために種々の薬剤が試験されているが、グラム陰性細菌敗血症については特異的な治療は存在していない。ＬＰＳは、グラム陰性細菌の外膜にあまねく存在する糖脂質である（レーツ（ Raetz），アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Annu．Rev．Bioc hem．）第５９巻（１９９０年），１２９〜１７０頁）。ＬＰＳは、オリゴ糖および脂質部分からなり、全体として負の電荷、熱安定性、および高分子量により特徴づけられる。大部分のＬＰＳの化学的構造は複雑で、多岐にわたり、一般的特徴はリピドＡ領域にある。ＬＰＳの膜への錨であるリピドＡは、７本までの脂肪酸鎖に結合した中央部のホスホジサッカライドからなる。ＬＰＳの生物学的活性の大部分は、リピドＡ部分にある（ガラノス（Galanos）ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur．J.Biochem．）第１４５巻（１９８５年），１〜５頁）。敗血性ショックは、微生物、とりわけグラム陰性細菌による感染の後に起こる分子および細胞に関する事象のカスケードから生じる。ショックの開始は、ＬＰＳまたはリピドＡと、マクロファージおよび単球上の膜結合受容体（クートリエ（Couturier）ら，ジャーナル・オブ・イミュノロジー（J.Immun．）第１４７巻（１９９１年），１８９９〜１９０４頁）、またはセプチンのごとき種々の血清蛋白（ライト（Wright）ら，ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Exp．Med．）第１７６巻（１９９２年，７１９〜７２７頁）との相互作用から生じる。これらの相互作用は、腫瘍壊死因子、ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびインターフェロンＣのごとき前炎症伝達物質のレベルの上昇を招く。内皮細胞も刺激されて、好中球を引き寄せる因子を産生する。活性化された好中球による酵素および他の因子の放出は、急速に死に至らしめうる局所的な脈管構造に対するダメージを引き起こす。敗血症の治療に対する１つのアプローチは、ＬＰＳに結合し、その毒性効果をインビトロで中和する物質の使用である。ＬＰＳに結合する多くの蛋白があるけれども、インビボにおいて有効にＬＰＳを中和する物質の数はきわめて少ない。かかる物質の数は確認されており、ポリミキシン類（モリソン（Morrison）ら，イミュノケミストリー（Immunochem.）第１３巻（１９７６年），８１３〜８１８頁）、ポリミキシン由来のペプチド（ルスティチ（Rustici）ら，サイエンス（Science）第２５９巻（１９９３年），３６１〜３６５頁）、ポリクローナル（ジーグラーら，ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン第３０７巻（１９８２年），１２２５〜１２３０頁）およびモノクローナル（シーグラーら，上記）抗体、殺細菌性／透過性上昇性蛋白（ＢＰＩ）（マラ（Marra）ら，ジャーナル・オブ・イミュノロジー第１４８巻（１９９２年），５３２〜５３７頁）、リポ多糖結合蛋白（ＬＢＰ）（シューマン（Schumann）ら，サイエンス第２４９巻（１９９０年），１４２９〜１４３１頁）、およびカブトガニ抗−ＬＰＳ因子（ＬＡＬＦ）（アカテガワ（Akategawa）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol．Chem．）第２６１巻（１９８６年），７３５７〜７３６５頁、ムタ（Muta）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Bi ochem．）第１０１巻（１９８７年），１３２１〜１３３０頁）が挙げられる。高親和性でＬＰＳのリピドＡ部分に結合する最も単純な分子は、ポリミキシン抗生物質である。これらは、脂質尾部に結合した、正に帯電した両親媒性環状オリゴペプチドである。ポリミキシンは、高親和性でＬＰＳ／リピドＡに結合するが、それらは、許容されない高毒性を有することにより治療の立場からは欠点を有する（クレイグ（Craig）ら，インフェクション・アンド・イミュニティー（I nfect．Immun．）第１０巻（１９７４年），２８７〜２９２頁）。ＬＰＳ結合モノクローナル抗体ＨＡ−１ＡおよびＥ５は、両方とも、グラム陰性菌による敗血性ショックの治療については積極的な臨床的効果を示さない。これらの抗体に関連する主な問題の１つは、非特異的であることである。例えば、ＨＡ−１Ａは、リピドＡは別として多くの疎水性構造に強く結合する（例えば、バウムガルトナー（Baumgartner）ら，ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J .Exp．Med．）第１７１巻（１９９０年），８８９〜８９６頁参照）。ヒト・蛋白であるＢＰＩおよびＬＢＰは、両方とも、グラム陰性敗血症の治療について検討されている（マラら，上記；ウレビッチ（Ulevitch）ら，（１９８６年），ＷＰ８６／０６２７９）。ＢＰＩは、多形核細胞の特別な顆粒中に貯蔵されており、膜結合ＬＰＳに結合し、透過性障壁を破壊することによりグラム陰性細菌を殺す。ＬＢＰも、ＬＰＳに強固に結合する噛乳動物の血清蛋白である。ＬＢＰは、ＢＰＩと相同的な配列を分配しているが（シューマンら，上記）、それは直接的にグラム陰性細菌に対して細胞毒性があるのではなく、その正確な機能は不明である。最も最近になって、敗血症における使用に関してＬＡＬＦが検討された（ワレン（Warren）ら，インフェクション・アンド・イミュニティー第６０巻（１９９２年），２５０６〜２５１３頁；ワインライト（Wainwright）ら，（１９９２年），ＷＯ９２／２０７１５）。この蛋白は、ヒトの治療に関しては、他の外来蛋白に関連した欠点があることはほとんど確実である。それは免疫原性で、循環系において非常に短い半減期しか有していない。これらの物質のうち、グラム陰性細菌の感染に関連した重大な症状の治療に効果的であると証明された物質はない。よって、本発明の根底にある技術的問題は、グラム陰性細菌により放出されたＬＰＳに結合し、その毒性効果を中和し、かつ毒性を示さない物質を提供することである。上記技術的問題の解決は、ＬＰＳに固く結合するペプチドに関連しており、それゆえ、グラム陰性細菌による症状および他の敗血性の症状の診断ならびに治療に有用な物質の提供により達成された。よって、本発明は、少なくとも：（ａ）アミノ酸配列１−２−３−４−５−６−７−８［式中、番号は以下のアミノ酸：１＝極性または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹ；２＝疎水性アミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＶまたはＷ；３＝塩基性アミノ酸、好ましくは、Ｈ、ＫまたはＲ；４＝疎水性または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、ＶまたはＷ５＝疎水性、極性、または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ；６＝正に帯電したアミノ酸、好ましくは、ＫまたはＲ；７＝疎水性、極性、または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ；８＝疎水性または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、ＶまたはＷのいずれかを表す］；（ｂ）対応する逆向きのアミノ酸配列；または（ｃ）有効にＬＰＳに結合しうる上記アミノ酸配列（ａ）もしくは（ｂ）の変種からなるＬＰＳ結合ドメインよりなるＬＰＳ結合ペプチドに関する。本発明ペプチドは、ＬＰＳに効果的に結合する。すなわち、それらは、１０⁵ Ｍ^-1よりも大きい会合定数でもって、ＬＰＳと特異的に相互作用する。したがって、ＬＰＳ結合ペプチドは、ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸の鎖である。ＬＰＳ結合ドメインは、効果的にＬＰＳに結合するＬＰＳ結合ペプチドのうち、最短の可能なアミノ酸鎖である。開示するすべてのペプチドの構造にはアミノ酸の１文字標記を用いる。図面は以下のことを示す。図１：ＬＢＰおよびＢＰＩにおける側鎖の方向および対応残基の推定位置を示すＬＡＬＦループのスキーム図である。それぞれの位置における３文字は、ＬＡＬＦ、ＬＢＰおよびＢＰＩ中のアミノ酸残基にそれぞれ対応する。実線の結合／破線の結合は、図の面から上／下に出ていることを示す。図２は、ＬＡＬＦにおける最小のＬＰＳ結合ドメインを決定するために用いるペプチドを示す。２個のシステイン残基はジスルフィド結合により結合している。図３は、ＬＢＰにおける最小のＬＰＳ結合ドメインを決定するために用いるペプチドを示す。２個のシステイン残基はジスルフィド結合により結合している。図４は、ＢＰＩにおける最小のＬＰＳ結合ドメインを決定するために用いるペプチドを示す。２個のシステイン残基はジスルフィド結合により結合している。図５は、ＬＡＬＦ、ＬＢＰおよびＢＰＩの配列を並べたものであり、ＬＢＰおよびＢＰＩ配列はＣ末端からＮ末端へと記載され、一方、ＬＡＬＦ配列はＮ末端からＣ末端へと記載されている。図６は、ＬＰＳ結合活性を決定するのに用いる逆向きのペプチドを示す。２個のシステイン残基はジスルフィド結合により結合している。図７は、点突然変異がペプチド中に導入されているＬＢＰの最小ＬＰＳ結合ドメインに類似のペプチドの一覧を示す。２個のシステイン残基はジスルフィド結合により結合している。図８は、ＬＡＬＦ由来のペプチドのリピドＡに対する結合に関するＥＬＩＳＡのデータを示す。４種のビオチン化ペプチドは固定化リピドＡに結合可能であり、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体を用いて結合ペプチドを検出する。実施例１参照。図９は、ＬＡＬＦ由来のペプチドとの比較における、ＬＢＰ、ＢＰＩ、および本図に記載した一般化されたモチーフ由来のペプチドに関するＥＬＩＳＡによるリピドＡ結合データを示す。ビオチン化ペプチドは固定化リピドＡに結合可能であり、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体を用いて結合ペプチドを検出する。実施例１参照。図１０は、ＬＡＬＦ由来のペプチドてあるＬＡＬＦ１４の、異なる形態のリポ多糖への結合に関するＥＬＩＳＡデータを示す。ビオチン化ペプチドは固定化リピドＡまたはＬＰＳに結合可能であり、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体を用いて結合ペプチドを検出する。より詳細には実施例２参照。図１１は、リピドＡに対する結合における、環状および直鎖状ペプチドの間の相違を示すＥＬＩＳＡデータを示す。ビオチン化ペプチドは固定化リピドＡに結合可能であり、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体を用いて結合ペプチドを検出する。より詳細には実施例３参照。図１２は、ストレプトアビジンとの相互作用によりＥＬＩＳＡプレートに固定化されている、ＬＡＬＦ、ＬＢＰ、ＢＰＩ、および比較のために本図に記載した一般化されたモチーフ由来のペプチドに対する蛍光標識ＬＰＳの結合に関するＥＬＩＳＡによる結合データを示す。り詳細には実施例４参照。図１３は、リピドＡに対する結合に関するＬＡＬＦとＬＡＬＦ由来のペプチドとの間の競争についてのＥＬＩＳＡデータを示す。固定化リピドＡに対する結合に関して、ペプチド濃度を増加させていって一定のＬＡＬＦ濃度との競争を行う。アルカリホスファターゼに抱合した抗−ウサギ抗体を用いて結合ＬＡＬＦを検出する。より詳細には実施例５参照。図１４は、単一のペプチド濃度における、固定化リピドＡに対する結合についての、ＬＡＬＦと種々のペプチドとの間の競争に関するＥＬＩＳＡデータを示す。ペプチドが、リピドＡに対するＬＡＬＦの結合を阻害する程度を、１００μｇ／ｍｌのペプチド濃度において決定する（抗−ウサギ抗体により測定）。より詳細には実施例５参照。図１５は、単一のペプチド濃度における、固定化リピドＡに対する結合についての、ＬＢＰと種々のペプチドとの間の競争に関するＥＬＩＳＡデータを示す。ペプチドがリピドＡに対するＬＢＰの結合を阻害する程度を、１００μｇ／ｍｌのペプチド濃度において決定する（抗−ウサギ抗体により測定）。より詳細には実施例６参照。図１６は、単一のペプチド濃度における、固定化リピドＡに対する結合についての、ペプチドＬＢＰ−１４と種々のペプチドとの間の競争に関するＥＬＩＳＡデータを示す。ビオチン化ＬＢＰ−１４がペプチドまたは蛋白のリピドＡへの結合を阻害する程度を、ペプチド濃度１μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌにおいて決定する（ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体を用いて測定）。より詳細には実施例７参照。図１７は、固定化リピドＡに対するペプチドの結合に対する血清濃度増加の影響を示すＥＬＩＳＡデータを示す。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体を用いてビオチン化ペプチドを検出する。より詳細には実施例８参照。図１８は、ＬＡＬＦと競争して固定化リピドＡに結合するペプチドの能力に対する血清濃度増加の影響を示すＥＬＩＳＡデータを示す。リピドＡに対するＬＡＬＦの結合を阻害する程度を、０％および１０％ウシ胎児血清存在下、ペプチド濃度１００μｇ／ｍｌにおいて決定した。より詳細には実施例９参照。図１９は、ペプチドによるカブトガニ・アメーバ様細胞溶解物ゲル化阻害および色素原アッセイのデータを示す。ＬＰＳにより媒介されるカブトガニ・アメーバ様細胞溶解物のゲル化阻害能または色素原性カブトガニ・アメーバ様細胞溶解物アッセイにおけるＬＰＳ−色素反応を阻害する能力についてペプチドを試験する。より詳細には実施例１０参照。図２０は、一定濃度の４種のペプチドによる、単球による腫瘍壊死因子のＬＰＳ媒介性放出に対する阻害に関するデータを示す。市販ＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦを検出する。より詳細には実施例１１参照。驚くべきことに、ＬＡＬＦの結晶構造は、特徴的な形態および両親媒性を有する新規ではあるが単純な３次元折り畳み構造を示すことが本発明者らによって見いだされた。ＬＡＬＦ構造における表面に伸長したループ（ＬＡＬＦのループまたはＬＡＬＦ−ループ）は、正に帯電し、両親媒性であり、いくつかの疎水性および芳香族性残基を有することにより、ポリミキシンＢと同様の特徴を有する。そのうえ、ＬＡＬＦのループは、正に帯電した疎水性／芳香族性残基の交互の並びにより識別される。該ループは、広範囲にわたるβ−コンホーメーションにより反対方向に向き、さらに一対の正電荷は、β−ターンコンホーメーションによって同意地方向に向き、両親媒性を維持する。該ループは負電荷アミノ酸を有していない。同様の両親媒性ループは、ＬＰＳに結合する３種の他の蛋白に存在する：すなわち、ウサギおよびヒトのリポ多糖結合蛋白（ＬＢＰ）およびヒト・殺細菌性／透過性増大蛋白（ＢＰＩ）である（図１）。ＬＢＰおよびＢＰＩ配列の調査により、両親媒性ループを生成しうる交互の残基の同様のパターンが明らかとなる。１９残基からなる配列は、６個の塩基性アミノ酸を含み、酸性アミノ酸を含まない。ループの頂上付近において、１組の両親媒性残基ペアー（Ｓｅｒ／Ａｒｇ９６およびＰｈｅ９７）が逆転しているが、ヘアピンターンの異なるコンホーメーションが、ＢＰＩおよびＬＰＢにおけるループの両親媒性を維持することは可能である。この組のＬＰＳ結合蛋白の範囲内の推定配列および構造相同性は、本発明の主題であるペプチドの設計を可能にする。本発明により包含されるすべてのＬＰＳ結合ペプチドを、例えば、エス・ディー・エイチ・ケント（S.D.H.Kent），アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Annu．Rev．Biochem．）第５７巻（１９８８年），９５７頁により記載されたようなペプチド合成の標準的方法を用いて合成することができ、かかる標準的方法は当業者に明らかである。別法として、遺伝子操作されペプチドをコードする配列を有している組み換え微生物を用いて、生物学的にペプチドを合成することもできる（サムブルック（Sambrook）ら，モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual），ＣＳＨプレス（CSH Press）（１９８９年））。別の態様において、本発明は、ＬＰＳ結合ペプチド由来の逆向きのアミノ酸配列を有し、さらにＬＰＳに効果的に結合するペプチドに関する。よって、本発明は、かかるペプチドをも包含する。それゆえ、逆向きのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端へと読む場合、親の配列をＣ末端からＮ末端へと読んだ配列と同じ配列を有する。ＬＢＰ／ＢＰＩ配列をＣ末端からＮ末端へと読んだ場合、アミノ酸９０ないし９７由来のＬＢＰ／ＢＰＩ配列と、残基３８ないし４５由来のＬＡＬＦ配列との間の相同性が存在する（図５）。これを根拠に、「逆向き」のペプチドを合成し、そのＬＰＳ結合能について試験した。ＥＬＩＳＡにより示されたように、ＬＰＳに効果的に結合する、図６に示すペプチドが特に好ましい。さらに別の具体例において、本発明は、上記ペプチドと共通の構造モチーフを共有し、ＬＰＳに結合しうるペプチドに関する。よって、本発明はさらに、アミノ酸配列が変種を包含しているＬＰＳ結合ドメインからなるＬＰＳ結合ペプチドを提供する。それゆえ、アミノ酸配列の変種とは、１個またはそれ以上のアミノ酸の挿入または欠失により誘導された配列の何等かの変更をいう。変異が親ペプチド構造中に誘導されている、図７に示すペプチドが、特に好ましい。これらの変異したペプチドは、ＥＬＩＳＡにより示されるように、いずれもＬＰＳに結合する。好ましい具体例において、本発明は、ＬＰＳ結合ペプチドを提供する。該ペプチド中、アミノ酸配列（ａ）は、ＬＡＬＦ、ＬＢＰまたはＢＰＩのＬＰＳ結合ループにおいて見られるアミノ酸のいずれかの組み合わせである。すなわち、１＝ＴまたはＲあるいはＫ２＝ＦまたはＷ３＝ＲまたはＫ４＝ＲまたはＶあるいはＡ５＝ＬまたはＲあるいはＱ６＝Ｋ７＝ＷまたはＳあるいはＲ８＝ＫまたはＦである。さらなる好ましい具体例において、本発明は、−２および−１と標記される２個またはそれ以上のアミノ酸によりＮ末端が伸長されており、アミノ酸−２は新たなＮ末端であって、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＮおよびＱの組から選択され、アミノ酸−１はいかなるアミノ酸であってもよいというさらなる特徴を有する上記一般的モチーフのペプチドを提供する。さらなる好ましい具体例において、本発明は、システイン付加によりＣ末端が伸張されており、さらに−２および−１と標記される２個またはそれ以上のアミノ酸によりＮ末端が伸長されており、アミノ酸−２は新たなＮ末端であって、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＮおよびＱの組から選択され、アミノ酸−１はシステインであり、該２つのシステインはジスルフィド結合により結合しているというさらなる特徴を有する上記一般的モチーフのペプチドを提供する。さらに好ましい具体例において、ＬＰＳ結合ペプチドは、アミノ酸配列ＴＦＲＲＬＫＷＫ、ＲＷＫＶＲＫＳＦＦＫＬＱまたはＫＷＫＡＱＫＲＦＬＫＭＳを有する。さらなる好ましい具体例において、本発明は、ＬＰＳに効果的に結合しうる直鎖状ペプチドを提供する。ＬＡＬＦ由来のペプチドが特に好ましい。ＬＡＬＦのアミノ酸３１ないし５２およびアミノ酸３８ないし４５を範囲とするジスルフィドにより束縛された環状ペプチド（下記参照）をＤＴＴとともにインキュベーションしてジスルフィド結合を還元する。アミノ酸３１ないし５２を範囲とするペプチドは、ＥＬＩＳＡにより示されるように、効果的にリピドＡに結合する。残基３８ないし４５を範囲とするペプチドは、ＥＬＩＳＡにより示されるように、微弱にしかりピドＡと相互作用しない。さらなる好ましい具体例において、本発明は、ＬＰＳに効果的に結合し、分子内架橋により束縛されて環状コンホーメーションとなるペプチドを提供する。それゆえ、該環状コンホーメーションは、多くの分子内架橋のうちのいずれか１つにより形成されうる。好ましくは、ペプチドは、酸化反応によりジスルフィド結合が形成される２個のシステイン残基を含んでいてもよい。別法として、２個のシステインを、ビス−マレイミドのごとき２つの同じ官能基を有する架橋剤を介して結合させてもよい。ＬＡＬＦのアミノ酸３１ないし５２およびアミノ酸３８ないし４５からなるペプチドであって、それぞれが２個のシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合により安定化されており、環状コンホーメーション（図２）を形成している環状ペプチドが特に好ましい。両方ともがリピドＡに結合し、さらに、ＥＬＩＳＡにより示されるように、２種の異なる形態のＬＰＳ分子（イー・コリ（E.coli ）Ｊ５−ＬＰＳおよびイー・コリＥＨ１００ＬＰＳ）にも結合する。このことにより、最小ＬＰＳ結合ドメインは、ＬＡＬＦのアミノ酸３８ないし４５を範囲とするペプチドであることがわかる。２個の単独のシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合により環状コンホーメーションとなっている図１の配列によるＬＢＰ由来のペプチドもまた、ＥＬＩＳＡにより示されるように、ＬＰＳに結合することができる。よって、ＬＢＰのアミノ酸９０ないし１０１および９０ないし９７を範囲とするペプチド（図３）も、特に好ましい。対照的に、ＬＢＰのアミノ酸９２ないし９９を範囲とするペプチドはＬＰＳに結合しない。このことにより、第２の最小ＬＰＳ結合ドメインは、ＬＢＰのアミノ酸９０ないし９７を範囲とするペプチドであることがわかる。そのうえ、アミノ酸９２ないし９９を範囲とするペプチドは、正に帯電していて両親媒性であるけれどもリピドＡと結合しないという事実は、これらの特徴だけではＬＰＳ結合構造を提供するには不十分であることを示すものであり、さらに本発明の新規性を示すものである。２個の独自のシステイン残基間に形成されたジスルフィド結合により環状コンホーメーションとなっている図１の配列によるＢＰＩ由来のペプチドもまた、ＥＬＩＳＡにより示されるように、ＬＰＳに結合することができる。ＢＰＩのアミノ酸９０ないし９７および９０ないし１０１を範囲とするペプチド（図４）が特に好ましい。このことにより、第３の最小ＬＰＳ結合ドメインは、ＢＰＩのアミノ酸９０ないし９７を範囲とするペプチドであることがわかる。さらなる好ましい態様において、本発明は、生物学的試料中のＬＰＳの検出のためのアッセイに用いることのできる、検出可能なように標識されたペプチドを提供する。それゆえ、検出可能に標識されたペプチドは、容易に検出されうる基質に共有結合したペプチドである。最も通常には、標識は酵素、蛍光基質、または放射性核種である。例えば、ペプチドが、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのごとき酵素に結合してもよく、該酵素は適当な基質の存在下で、容易に検出される着色物質または蛍光物質を生成しうるものである。別法として、ペプチドが、検出のために、フルオレセイン、ローダミンまたはアウラミンのごとき蛍光基質に直接結合していてもよい。通常に使用される標識放射性核種としては、¹⁴Ｃ、¹³¹Ｉ、³Ｈ、¹²⁵Ｉおよび³⁵Ｓが挙げられる。標識物の多くの種類が想像できる。例えば、ペプチドが、ビオチンのごとき媒介基質を介して、それ自体慣用的方法により検出可能な基質に結合するストレプトアビジンのごとき別の基質に結合してもよい。好ましい具体例において、本発明は、それぞれが１個またはそれ以上のＬＰＳ結合ドメインからなるＬＰＳ結合ペプチドの組を提供する。さらに本発明は、本発明ペプチドのＤＮＡ配列を含んでいるプラスミド、ファージミドおよびコスミドのごときベクターのみならず本発明ペプチドをコードするＤＮＡ配列を包含する。さらに、本発明は、これらのベクターで形質転換されたウイルス、細菌および酵母のごとき微生物を包含する。本発明において提供されるＤＮＡ配列を、自動ＤＮＡ合成という標準的方法を用いて容易に得ることができるが、慣用的な分子クローニングによっても得ることができる。例えば、天然蛋白ＬＢＰ、ＢＰＩまたはＬＡＬＦ由来のそれらのＤＮＡ配列を、当業者に明らかな（サムブルックら，上記）ポリメラーゼ連鎖反応を用いることによるクローニングに適した形態で得ることができる。そのうえ、本発明は、本発明ＬＰＳ結合ペプチドの製造方法であって、本発明ペプチドをコードしているＤＮＡからなる組み換えベクターで形質転換した微生物を培養し、ついで、培地より該ペプチドまたは該ペプチドを含んでいる融合蛋白を回収することからなる方法に関する。好ましい具体例において、本発明は、医薬上許容される担体および／または希釈剤と混合された有効量の上記いずれかのペプチドからなる医薬組成物を提供する。該医薬組成物を、ＬＰＳの放出に関連した種々の症状、特にグラム陰性敗血症の治療に用いることができる。それゆえ、敗血症なる語は、最も通常には感染または外傷により導入あるいは蓄積される毒素により誘発される病的状態をいう。敗血症の初期症状は、典型的には寒気、多汗、不規則な弛張性発熱、衰弱等であり、ついで、持続性発熱、ショックにつながる低血圧、好中球減少、白血球減少、散在性血管内凝固、成人の呼吸困難症候群および多発性器官不全が起こる。本発明の主題であるペプチドは、それらの治療特性（例えば、リトル（Little ）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol．Chem．）第２６９巻（１９９４年）１８６５〜１８７２頁参照）のため本発明の主題であったＢＰＩ由来の多くのペプチドと構造的に類似である。ＢＰＩ由来の蛋白と比較すると、それらのエンドトキシン結合および中和能力に加えて、本明細書記載のペプチドは、殺細菌およびヘパリン結合活性を示すことが期待される。したがって、本発明はさらに、抗凝固、血管形成および増殖因子により誘導される腫瘍および内皮細胞の増殖のごときヘパリンに関連した特性を中和する能力のある医薬組成物のみならず細菌（グラム陰性およびグラム陽性両方）および真菌を殺すことのできる医薬組成物を提供する。さらなる好ましい具体例において、本発明は、診断キットも包含する。かかるキットは、少なくとも、上記ペプチドまたは標識ペプチドからなり、さらに、標準的な競争的またはサンドウィッチアッセイを行うのに必要な試薬ならびに材料からなるであろう。該診断キットを、ＬＰＳの検出または敗血症状の診断に使用することができる。さらなる好ましい具体例において、本発明は、固体担体に固定化された本明細書開示のペプチドを提供する。最も便利には、セルロース、アガロース、ポリアクリルアミド等のごとき固体担体であって、イミダート、活エステル、活性ジスルフィド、エポキシド等のごとき反応性官能基を生じるように改変された担体にペプチドが共有結合する。蛋白化学において通常用いられる多くの方法のうちのいずれか１つにより、ペプチドを結合させることができる。例えば、ペプチド合成中に、Ｎ末端またはＣ末端システインを容易にペプチドに導入することができる。このシステイン残基のチオール官能基を用いて、マレイミド基を有するように誘導された固体担体にペプチドを結合させることができる。本発明はまた、溶液を本発明固定化ペプチドに通すことによる、溶液からＬＰＳを除去する方法を提供する。この方法は、ＬＰＳ混入がしばしば問題となる医薬標品の精製において特に興味深い。本発明を一般的に記載したので、以下の実施例により本発明を説明する。実施例は、説明の目的のためだけのものであって、本発明の範囲を何等限定するものではない。実施例１：リピドＡに対するペプチドの結合ＡＢＩＭＥＤＡＭＳ４２２合成機による標準的なＦｍｏｃ化学を用いてペプチドを合成する。開裂されたペプチドを、室温で一晩ＤＭＳＯ中で酸化させ、アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸のグラジエントを伴うＣ−１８逆相カラムで精製し、質量分析により特徴づける。ＬＡＬＦのループ配列がリピドＡおよびＬＰＳに結合するという仮説を確証するために、８ないし１２個のアミノ酸の長さの範囲のＬＡＬＦループの部分からなるペプチドを合成する。ＬＡＬＦのアミノ酸３６ないし４７からなるペプチド（ＬＡＬＦ−１４）、およびＬＡＬＦのアミノ酸３８ないし４５からなるペプチド（ＬＡＬＦ−１０）を、ペプチドのＮ末端およびＣ末端においてシステイン残基を導入してジスルフィド結合により安定化させ、かくして環状コンホーメーションを生じさせる。アミノ酸３７がシステインに置き換わっているアミノ酸３６ないし４５からなるペプチド（ＬＡＬＦ−１１）も、ペプチドのＣ末端に第２のシステイン残基を導入することにより環化させる。すべてのペプチドを、Ｎ末端においてビオチン標識する。ペプチドのリピドＡ結合活性を、下記ＥＬＩＳＡ法において示す。ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製，ポリソープ（Polysorp）９６Ｕ）を、ＰＢＳ中のリピドＡ１００μｌ（０．２５〜１μｇ／ｍｌ）で、３７℃、９０分間コーティングする。すべてのさらなるステップを室温で行う。ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄およびブロッキング（１０分間）後、Ｎ末端をビオチン標識した精製ペプチド１００μｌ（ＰＢＳＴに溶解，０．１μｇ／ｍｌから１０ｐｇ／ｍｌまで増量していく）とともに固相を１時間インキュベーションする。ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄後、ペプチドを、アルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム（ Boehringer Mannheim）ＧｍｂＨ製；ＰＢＳ／０．１％ツイン中１：１００００希釈）に結合したストレプトアビジン１００μｌとともにインキュベーションし、ついで、ＰＢＳ／０．１％ツインおよび１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）で再度洗浄する。ｐ−ニトロフェニルリん酸（１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）中２ｍｇ／ｍｌ）を、アルカリホスファターゼ基質として用いる。固定化リピドＡに添加するペプチド量を増加させていく。ＬＡＬＦ−１４、ＬＡＬＦ−１１およびＬＡＬＦ−１０はリピドＡに高活性で結合する。（図８参照）。アミノ酸３８〜４５由来の逆向きの配列からなる環状ペプチドＲＥＴＬ−１０は、対照ペプチドによるバックグラウンドレベルよりわずかに強くリピドＡに結合する。この結果は、ＲＥＴＬ−１０は正に帯電しており、両親媒性であるが、これらの特徴だけでは高親和性ＬＰＳ結合を起こすには十分でないことを示すものである。アミノ酸９０ないし１０１（ＬＢＰ−１４）、アミノ酸９２ないし９９（ＬＢＰ−１０−１）およびアミノ酸９０ないし９７（ＬＢＰ−１０−２）からなるＬＢＰ由来のペプチド、アミノ酸９０ないし１０１からなるＢＰＩ由来のペプチド（ＢＰＩ−１４）、ならびに本明細書で定義されたモチーフから無作為に選択されたアミノ酸配列からなる２個のペプチド（ＭＳ−２１（ビオチン−Ｚ−Ｋ−Ｃ −Ｆ−Ｔ−Ｒ−Ｒ−Ａ−Ｋ−Ｗ−Ｒ−Ｃ（Ｚ＝β−アラニン））、ＭＳ− ２２（ビオチン−Ｚ−Ｃ−Ｋ−Ｗ−Ｋ−Ｉ−Ｒ−Ｋ−Ｆ−Ｓ−Ｃ−Ｎ（Ｚ＝β− アラニン））を、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に導入したシステイン残基の酸化により生成されたジスルフィド結合の形成により安定化させ、環状ペプチドを得る。それぞれのペプチドを、ビオチンでＮ末端標識する。ペプチドのリピドＡ結合活性を、上記ＥＬＩＳＡ法で試験する。固定化リピドＡに添加するペプチド量を増加させていく（図９参照）。ＬＡＬＦ−１４を高活性結合の対照して用い、無関係なペプチドＮｏｒ（Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｄ−Ｌ −Ｎ−Ｔ−Ｌ）をバックグラウンドの結合を測定するために用いる。ＬＢＰに基づく新たなペプチドのうち、ＬＢＰ−１４は、ＬＡＬＦ−１４と同様にリピドＡに結合する。ＬＢＰ−１０−１は、上記バックグラウンド以上の最も高濃度（１０μｇ／ｍｌ）においてのみリピドＡに結合するが、ＬＢＰ−１０−２は、バックグラウンドよりもわずかに高濃度でしかりピドＡに結合しない。ＢＰＩに基づくＢＰＩ−１４は、上記バックグラウンド以上でリピドＡに結合するが、ＬＡＬＦ−１４およびＬＢＰ−１４より有意に結合が弱い。ＬＰＳ結合モチーフに基づくペプチドＭＳ−２１およびＭＳ−２２のうち、ＭＳ−２１はＬＡＬＦ−１４およびＬＢＰ−１４よりも弱くリピドＡに結合するが、ＢＰＩ−１４よりわずかに強く結合する。ＭＳ−２２は、明らかに上記バックグラウンドレベル以上であり、ＬＢＰ−１０−１と同様の活性であるが、ＭＳ−２１より弱い。実施例２：リピドＡおよびＬＰＳへのＬＡＬＦ−１４の結合ＬＡＬＦのアミノ酸３６ないし４７からなる環状ペプチド（ＬＡＬＦ−１４）を、リピドＡとの比較において、異なる種類のリポ多糖との結合について、ＥＬＩＳＡ法で試験する。固定化リピドＡおよびＬＰＳに添加するペプチド量を増加させていく。用いるリポ多糖の形態は、イー・コリＲｅＦ５１５；クレブシエラ（Klebsiella）ｐ；サルモネラ（Salmonella）ｅ；シゲラ（Shigella）ｆ；およびイー・コリ０１２７：Ｂ８である。ＬＡＬＦ−１４はすべての種のリポ多糖と、バックグラウンド以上に結合するが、活性は異なる（図１０参照）。よって、ＬＡＬＦ−１４は、リピドＡに結合するのと同様にサルモネラｅとも結合するが、イー・コリＲｅＦ５１５およびシゲラｆとの結合活性は、リピドＡとの結合活性より低く、クレブシエラｐおよびイー・コリ０１２７：Ｂ８より高い。実施例３：ペプチドーリピドＡ結合のためのコンホーメーションの重要性高親和性のペプチド−リピドＡ結合のための束縛されたコンホーメーションの重要性を検討するために、環状および対応する直鎖状ペプチドの結合活性を比較する。この比較を、（ｉ）ペプチドＬＡＬＦ−１４、ＬＢＰ−１４およびＢＰＩ −１４をＤＴＴで還元してジスルフィド結合を破壊することにより、および（ii ）ＬＡＬＦ−１１との比較のために、アミノ酸３６ないし４５からなる直鎖状ペプチド（ＬＬ−１０）を合成することにより行った。ペプチドのリピドＡ結合活性を、ＥＬＩＳＡ法で試験する（上記参照）。固定化リピドＡに添加するペプチド量を増加させていく。すべての場合において、酸化されたペプチドＬＡＬＦ− １４、ＬＢＰ−１４およびＢＰＩ−１４は、還元されたペプチドＬＡＬＦ−１４／ＤＴＴ、ＬＢＰ−１４／ＤＴＴおよびＢＰＩ−１４／ＤＴＴと比較して、より高いリピドＡ結合活性を示す。このことは、束縛された環状形態が、高いリピドＡ結合活性について優れていることを示すものである（図１１参照）。環状ペプチドＬＡＬＦ−１１のリピドＡ結合活性が、その直鎖状対応物であるＬＬ−１０よりも高いという観察結果により、この結果は確認される。実施例４：ビオチン化ペプチドに対するフルオレセイン標識ＬＰＳの結合ＬＰＳに対する結合を増強させるための多量体ペプチド（multimeric peptide s）の有効な使用について調べるために、個々のペプチドをＥＬＩＳＡプレート上に高表面濃度になるまででコーティングする。ストレプトアビジンでのプレートの最初のコーティング、ついで、Ｎ末端ビオチン基を介してペプチドを結合させることにより固定化を行う。すなわち、１００μｌのストレプトアビジン（ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ；ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）をコーティングに用い、ついで、ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄、ブロッキング（１０分間）を行い、ビオチンでＮ末端標識した精製合成ペプチド１００μ１（ＰＢＳＴ中１μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベーションする。ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄後、ＦＩＴＣ標識ＬＰＳ（シグマ（SIGMA）社製；サルモネラ・エンテリデイテイス（Salmonella enteriditis）由来；ＰＢＳ／０．１％ツイン中０．５μｇ／ｍｌ）とともにペプチドを１時間インキュベーションする。ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄後、ＥＬＩＳＡプレートを、アルカリホスファターゼに抱合した抗ＦＩＴＣ抗体１００μ１（シグマ社製；ＰＢＳ／０．１％ツイン中１：２５００希釈）とともにインキュベーションし、ついで、ＰＢＳ／０．１％ツインおよび１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）で洗浄する。ｐ−ニトロフェニルリん酸（１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）中２ｍｇ／ｍｌ）をアルカリホスファターゼ基質として用いる。ＥＬＩＳＡを４０５ｎｍにおいて読む。すべてのステップを室温で行う。予想したように、ＬＡＬＦ−１４、ＬＡＬＦ−１１、ＬＡＬＦ−１０、ＬＢＰ −１４およびＭＳ−２１は、ＬＰＳに対して最も高い結合活性を示す（図１２参照）。ＲＥＴＬ−１０、ＬＢＰ−１０−１またはＬＢＰ−１０−２のごとき別のＥＬＩＳＡ法において測定されるバックグラウンドレベルよりわずかに高い濃度でリピドＡに結合するペプチドは、このＥＬＩＳＡ法においては、バックグラウンドよりも高い結合性（２〜３倍）を示す。このことは、ＬＰＳに関するオリゴマー結合部位（oligomeric binding sites）は、より高い結合活性を提供しうることを示すものである。実施例５：ＬＡＬＦに対する競争：ペプチドによるリピドＡ結合リピドＡおよびＬＰＳへの結合におけるペプチドの特異性を調べるために、ＬＡＬＦおよびＬＢＰならびにポリミキシンＢのごとき既知のエンドトキシン結合蛋白を用いる比較実験を行う。すなわち、ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク（NUNC）社製、ポリソープ９６Ｕ）を、ＰＢＳ中のリピドＡ１００μｌ（０．２５〜０．３μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳ中のリポ多糖（０．２５〜０．３μｇ／ｍｌ）で、３７℃において９０分間コーティングする。さらなるステップを室温で行う。ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄およびブロッキング（１０分間）後、エンドトキシン結合性蛋白（ＬＡＬＦまたはＬＢＰ；ＰＢＳ／０．１％ツイン中０．２μｇ／ｍｌ）と混合した未標識またはビオチン標識ペプチド１００μ ｌ（０．０１μ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌまでペプチド量を増加させていく）とともに固相を１時間インキュベーションする。ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄後、ＬＡＬＦまたはＬＢＰに対するウサギ・抗血清それぞれ１００μｌとともにＥＬＩＳＡプレートを４５分間インキュベーションする。ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄後、ＥＬＩＳＡプレートを、アルカリホスファターゼ（シグマ社製；ＰＢＳ／０．１％ツイン中１：１００００希釈）に抱合した抗ウサキ抗体１００μｌとともにインキュベーションし、ＰＢＳ／０．１％ツインおよび１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）で洗浄する。ｐ−ニトロフェニルリん酸（１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）中２ｍｇ／ｍｌ）をアルカリホスファターゼ基質として用いる。ＥＬＩＳＡを４０５ｎｍにおいて読む。ＬＡＬＦ−リピドＡ結合をアッセイする場合には、ペプチド量を増加させるとリピドＡに結合した検出可能なＬＡＬＦが減少するはずである（図１３参照）。ポリミキシンＢは正の対照として用いられ、十分高濃度において、固定化リピドＡからＬＡＬＦを駆逐して完全にこれと置き換わることができる。やはりリピドＡおよびＬＰＳに結合することが知られている対照ペプチドおよびリゾチームは、ＬＡＬＦと競争することができない。ＬＡＬＦ配列に基づくペプチドのうち、ＬＡＬＦ−１４、ＬＡＬＦ−１１およびＬ−１０は、ＬＡＬＦ／リピドＡ結合の競争においてポリミキシンＢと同様の能力を有し、ポリミキシンＢと同様のＬＰＳ結合活性を示すが、ＲＥＴＬ−１０は、ＬＡＬＦとごく弱い競争しか示さない。１００μｇ／ｍｌの濃度において、ポリミキシンＢは、リピドＡへの結合に関し、９５％までＬＡＬＦと競争する。ＬＢＰに基づくペプチドのうち、Ｈ−１４は、リピドＡへの結合に関してＬＡＬＦ−１４と同様に効果的にＬＡＬＦと競争するが、ＬＢＰ−１０−１およびＨ−１０は、最も高濃度においてのみ、ＬＡＬＦ−リピドＡ結合を阻害する。ＢＰＩ−１４は、ＬＡＬＦ−１４、Ｈ−１４またはポリミキシンＢと比較すると、競争の程度がより小さい。一般化されたリピドＡ結合モチーフに基づくペプチドのうち、ＭＳ−２１は、リピドＡへの結合に関し、約８０％までＬＡＬＦと競争するが、一方、ＭＳ−２２はＢＰＩ−１４と同様である。ポリミキシンＢに基づくペプチドＰｏｌＰ−１（Ｉ−Ｋ−Ｔ−Ｋ−Ｋ −Ｆ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｔ）は、リポ多糖への結合、およびその毒性の中和が示されているが（ルスティチら，サイエンス第２５９巻（１９９３年），３６１〜３６５頁）、リピドＡ結合に関してはＬＡＬＦとほとんど競争しない。これらのデータを、一定のペプチド濃度について、図１４において棒グラフで示す。実施例６：ＬＢＰに対する競争：ペプチドによるリピドＡへの結合ＬＰＳへの結合に関してＬＢＰと競争するペプチドの能力を、ＬＡＬＦの代わりにＬＢＰを用いること以外は実施例５と同じやり方で決定する（図１５参照）。この実験結果は、１つの例外があるが、図１４の結果と酷似している。図１５に示すように、ＬＡＬＦ−１４、Ｌ−１０およびＨ−１４は、ＬＢＰ−リピドＡ結合の最も有効な阻害剤である。ＬＡＬＦについて得られた結果とは対照的に、この場合、ポリミキシンＢは、リピドＡへの結合に関し、ＬＢＰと競争することができない。実施例７：ＬＢＰ−１４に対する競争：ペプチドおよび蛋白によるリピドＡへの結合ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製，ポリソープ９６Ｕ）を、ＰＢＳ中のリピドＡ１００μｌ（０．２〜０．３μｇ／ｍｌ）で、３７℃において９０分間コーティングする。すべてのさらなるステップを室温で行う。ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄およびブロッキング（１０分）した後、ビオチン標識ペプチド（ＰＢＳ／０．１％ツイン中１μｇ／ｍｌ）と混合した未標識ペプチドまたは蛋白（１００μｌ，０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌまで増量していく）で固相を１時間インキュベーションする。ＰＢＳ／０．１％ツインで洗浄後、アルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジン（ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ製，ＰＢＳ／０．１％ツイン中１：１００００希釈）をウェルに添加する。このインキュベーションの後、ＰＢＳ／０．１％ツインおよび１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）で洗浄する。ｐ−ニトロフェニルリん酸（１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）中２ｍｇ／ｍｌ）をアルカリホスファターゼ基質として用いる。ＥＬＩＳＡを４０５ｎｍにおいて読む。ペプチド−リピドＡ結合と競争させるためにＣＤ１４を用いる。かかる結合アッセイの原理は、一定量の検出可能なペプチドまたは蛋白を、別のペプチドまたは蛋白の量を増加させていくことにより競争させるというもので、ＬＡＬＦ−またはＬＢＰ−リピドＡ競争に関するアッセイと同じである。ＬＡＬＦを検出するかわりに、結合したビオチン標識ペプチドを、アルカリホスファターゼに抱合したストレプトアビジンでもって検出し、未標識ペプチドまたは蛋白の量を増加させつつ標識ペプチド濃度を一定に保つ。リピドＡに対するＬＢＰ−１４の結合は、ＬＡＬＦおよびＣＤ１４により強力に競争されるが、ポリミキシンＢは、使用する最高濃度においても弱い競争しか示さない（図１６参照）。ＰｏｌＰ−１の競争は、競争物質としてのリゾチームにより決定されたバックグラウンドよりわずかに強い。ＬＢＰ−１４のかわりにＬＡＬＦ−１４を用いた場合、酷似した結果が得られる。実施例８：ペプチド−リピドＡ結合に対する血清の影響ペプチド−リピドＡ結合に対する血清蛋白の影響を決定するために、標識ペプチドの相互作用を、１％および１０％濃度の血清の存在下においてＥＬＩＳＡ法で測定し、バッファーまたは培地中での結合と比較する。すべての試験ペプチドＬＡＬＦ−１４、ＬＡＬＦ−１０、ＬＢＰ−１４、ＬＢＰ−１０−１およびＢＰＩ−１４については、血清濃度の増加とともにリピドＡ結合活性が低下するが、該ペプチドは、１０％血清濃度においてもリピドＡに結合することができる（図１７参照）。対照として、ＬＡＬＦ−リピドＡ結合に対する血清の影響を調べると、ＬＡＬＦ−リピドＡ結合の血清依存的減少が観察される。実施例９：ＬＡＬＦに対する競争への血清の影響：ペプチドによるリピドＡへの結合ペプチド−リピドＡ結合の特異性が血清により影響を受けるかどうかを調べるために、ＬＡＬＦ−リピドＡ結合につきＰＢＳ／０．１％ツインおよび血清中で比較する競争実験を行う。すべての場合において、０％血清の場合と比較すると、１０％血清の存在下ではペプチドの競争能力のわずかな低下（約５％）のみが観察される（図１８参照）。しかしながら、対照として使用された、ＬＡＬＦ− １４、ＬＢＰ−１４およびポリミキシンＢのごとき、バッファー中においてリピドＡ結合に関してＬＡＬＦと有効に競争するペプチドも、１０％血清存在下で阻害を示す。ＢＰＩ−１４は、リピドＡへの結合に関する競争の程度が比較的小さく、ＲＥＴＬ−１０またはポリミキシン由来の蛋白ＰｏｌＰ１は、バックグラウンドよりわずかに大きい阻害を示すにすぎない。実施例１０：カブトガニ・アメーバ様細胞溶解物アッセイカブトガニ・アメーバ様細胞溶解物試験（ゲル化アッセイ；感度０．１２５ＥＵ／ｍｌ）および色素原カブトガニ・アメーバ様細胞溶解物試験（感度０．０６ＥＵ／ｍｌ）を、イー・コリ０５５：Ｂ５リポ多糖を用い、製造者（メリーランド州ウォーカーズビルのバイオ^*ワイテイカー（Bio^*Whittaker））の指示に従って行う。ＬＰＳの中和のために、ペプチド（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）およびＬＰＳを３７℃で１５分インキュベーションし、ついで、カブトガニ・溶解物を添加する。ゲル化アッセイにおいて、正の対照であるＬＡＬＦおよびポリミキシンＢはアッセイを阻害するが、対照ペプチド（対照）は阻害しない（図１９参照）。Ｌ−１０、ＬＡＬＦ−１４、ＬＢＰ−１４およびＢＰＩ−１４も、溶解物アッセイを阻害することができ、中和活性を示す（図１９）。色素原アッセイにより、ペプチドのリポ多糖中和能力の定量が可能になる。ＬＡＬＦおよびポリミキシンＢは、反応を９５％まで阻害する。ペプチドのうち、Ｌ−１０、ＬＡＬＦ−１４およびＬＬＢＰ−１４は最高の阻害を示す（７９％）。ＢＰＩ−１４は、色素原アッセイを６３％まで阻害し、ＬＡＬＦ−およびＬＢＰ−リピドＡ結合の弱い競争剤であるＬＢＰ−１０−１は、該アッセイを５０％まで阻害するが、ゲル化アッセイを阻害することが知られているＰｏｌＰ１は、色素原アッセイを２５％までしか阻害しない。実施例１１：ペプチドによる、単球によるＬＰＳ媒介性ＴＮＦ放出の阻害単球を、全血から、フィコールのグラジエント（ｄ＝１．０７７）を用いて遠心分離（２２００ｒｐｍ，２０分、室温）により精製する。ＰＢＳで３回洗浄することによりフィコールを除去する。精製単球を計数し、培地（ＲＰＭＩ＋）または０．１％〜１０ヒト・血清含有培地中２ｘ１０⁶個／９００μｌになるよう希釈する。ＴＮＦ誘導には、２ｘ１０⁶個の単球（媒質または血清含有培地９００μｌ中）およびＬＰＳ（Ｒｅ−ＬＰＳＦ５１５；０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＬＰＳとペプチド（１０μｇ／ｍｌ）との混合物（３７℃で１５分プレインキュベーション）を、２４ウェルプレート（ＮＵＮＣ社製）中、２ないし５時間インキュベーションする。上清を取り、１５００ｒｐｍで２回、１５０００ｒｐｍで１回遠心分離し、ＴＮＦ測定のために−２０℃で貯える。融解上清試料５０μｌを用い、製造者（カリフォルニア州のバイオソース・インターナショナル（BioSource International）の指示に従ってＥＬＩＳＡにより、誘導されたＴＮＦをアッセイする。Ｌ−１０およびＬＢＰ−１４は、ポリミキシンＢがＴＮＦ放出を９５％阻害する条件下で、ＴＮＦ放出を５５％阻害する（図２０参照）。配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：モルフォシス・ゲゼルシャフト・フュア・プロタインオプティミールング・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング（Ｂ）通り名：フランクフルター・リング１９３アー番（Ｃ）都市名：ミュンヘン（Ｅ）国名：ドイツ連邦共和国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：８０８０７（Ａ）名称：ヘス，アドルフ（Ｂ）通り名：ヴィルツブライテ２１番（Ｃ）都市名：ヴァルンガウ（Ｅ）国名：ドイツ連邦共和国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：８３６７２（Ａ）名称：リディントン，ロバート・シー（Ｂ）通り名：ピンクニー・ストリート１４５番、アパートメント・ナンバー７１８（Ｃ）都市名：ボストン（Ｄ）州名：マサチューセッツ（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：０２１１４（ii）発明の名称：リポ多糖結合性および中和能のあるペプチド（iii）配列の数：２２（iv）コンピューター読み取り可能形態：（Ａ）媒体タイプ：フロッピーデイスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃１．０，バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）（ｖ）現在の出願データ：出願番号：ＰＣＴ／ＥＰ９４／０２７４７（vi）先の出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／１０８，４１５（Ｂ）出願日：１９９３年８月１８日（vi）先の出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／１１１，６２５（Ｂ）出願日：１９９３年８月２５日（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：８アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１（２）配列番号：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：２（２）配列番号：３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：３（２）配列番号：４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（ix）特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ペプチド（Ｂ）位置：１（Ｄ）他の情報：／注＝「１の位置におけるＸａａはベータアラニンである」（xi）配列の記載：配列番号：４：（２）配列番号：５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１２アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（ix）特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ペプチド（Ｂ）位置：１（Ｄ）他の情報：／注＝「１の位置におけるＸａａはベータアラニンである」（xi）配列の記載：配列番号：５：（２）配列番号：６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：６（２）配列番号：７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：７（２）配列番号：８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２２アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：８（２）配列番号：９に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：９（２）配列番号：１０に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１４アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１０（２）配列番号：１１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１１（２）配列番号：１２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１４アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１２（２）配列番号：１３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１３（２）配列番号：１４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１４（２）配列番号：１５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１５（２）配列番号：１６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１６（２）配列番号：１７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１７（２）配列番号：１８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１８（２）配列番号：１９に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：１９（２）配列番号：２０に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：２０（２）配列番号：２１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：２１（２）配列番号：２２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号：２２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺＣ０７Ｋ 7/08 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＧ０１Ｎ 33/50 Ｔ 8310−2ＪＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＡ 9281−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも、（ａ）アミノ酸配列１−２−３−４−５−６−７−８［式中、番号は以下のアミノ酸：１＝極性または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹ；２＝疎水性アミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＶまたはＷ；３＝塩基性アミノ酸、好ましくは、Ｈ、ＫまたはＲ；４＝疎水性または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、ＶまたはＷ５＝疎水性、極性、または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹ；６＝正に帯電したアミノ酸、好ましくは、ＫまたはＲ；７＝疎水性、極性、または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ；８＝疎水性または正に帯電したアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、ＶまたはＷのいずれかを表す］；（ｂ）対応する逆向きのアミノ酸配列；または（ｃ）有効にＬＰＳに結合しうる上記アミノ酸配列（ａ）もしくは（ｂ）の変種からなるＬＰＳ結合ドメインからなるＬＰＳ結合ペプチド。２．該アミノ酸配列（ａ）が、ＬＡＬＦ、ＬＢＰまたはＢＰＩのＬＰＳ結合ループにおいて見られるアミノ酸のいずれかの組み合わせ、すなわち、１＝ＴまたはＲあるいはＫ２＝ＦまたはＷ３＝ＲまたはＫ４＝ＲまたはＶあるいはＡ５＝ＬまたはＲあるいはＱ６＝Ｋ７＝ＷまたはＳあるいはＲ８＝ＫまたはＦである請求項１記載のＬＰＳ結合ペプチド。３．−２および−１と標記される２個またはそれ以上のアミノ酸によりＮ末端が伸長されており、アミノ酸−２は新たなＮ末端であって、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＮおよびＱの組から選択され、アミノ酸−１はいかなるアミノ酸であってもよいというさらなる特徴を有する請求項１または２記載のＬＰＳ結合ペプチド。４．システイン付加によりＣ末端が伸張されており、さらに−２および−１と標記される２個またはそれ以上のアミノ酸によりＮ末端が伸長されており、アミノ酸−２は新たなＮ末端であって、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ＮおよびＱの組から選択され、アミノ酸−１はシステインであり、該２つのシステインはジスルフィド結合により結合しているというさらなる特徴を有する請求項１ないし３のいずれか１つに記載のＬＰＳ結合ペプチド。５．該アミノ酸配列（ａ）が配列ＴＦＲＲＬＫＷＫである請求項１または２記載のＬＰＳ結合ペプチド。６．該アミノ酸配列（ａ）が配列ＲＷＫＶＲＫＳＦＦＫＬＱである請求項１または２記載のＬＰＳ結合ペプチド。７．該アミノ酸配列（ａ）が配列ＫＷＫＡＱＫＲＦＬＫＭＳである請求項１または２記載のＬＰＳ結合ペプチド。８．直鎖状ペプチドである請求項１ないし７のいずれか１つに記載のＬＰＳ結合ペプチド。９．分子内相互作用により束縛されて環状コンホーメーションとなる請求項１ないし７のいずれか１つに記載のＬＰＳ結合ペプチド。１０．該相互作用がジスルフィド結合である請求項９記載のＬＰＳ結合ペプチド。１１．アミノ酸配列ＣＨＹＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷＣ、ＣＴＦＲＲＬＫＷＫＣ、ＣＲＷＫＶＲＫＳＦＦＫＬＱＣ、ＣＲＷＫＶＲＫＳＦＣ、ＣＫＷＫＡＱＫＲＦＬＫＭＳＣまたはＣＫＷＫＡＱＫＲＦＣを有し、ペプチドが末端システイン残基間に形成されるジスルフィド結合により安定化される請求項１０記載のＬＰＳ結合ペプチド。１２．検出可能なように標識されている請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のＬＰＳ結合ペプチド。１３．それぞれが、請求項１ないし１２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列のうちの１つを有する１個またはそれ以上のＬＰＳ結合ドメインからなるＬＰＳ結合ペプチドの組。１４．請求項１ないし１１のいずれか１つに記載のペプチドをコードしているＤＮＡ配列。１５．請求項１４記載のＤＮＡ配列を有している組み換えベクター。１６．請求項１５記載の組み換えベクターを有している微生物。１７．請求項１ないし１２のいずれか１つに記載のＬＰＳ結合ペプチドの製造方法であって、請求項１６記載の微生物を培養し、ついで、該ペプチドまたはそれを含んでいる融合蛋白を培地から回収することからなる方法。１８．所望により医薬上許容される担体および／または希釈剤と混合されていてもよい、有効量の請求項１ないし１１記載のＬＰＳ結合ペプチドまたは請求項１３記載のＬＰＳ結合ペプチドの組からなる医薬組成物。１９．グラム陰性敗血症の治療のための請求項１８記載の医薬組成物。２０．グラム陽性敗血症の治療のための請求項１８記載の医薬組成物。２１．細菌感染の治療のための請求項１８記載の医薬組成物。２２．真菌感染の治療のための請求項１８記載の医薬組成物。２３．ヘパリンにより媒介される抗凝固の治療のための請求項１８記載の医薬組成物。２４．血管形成の阻害のための請求項１８記載の医薬組成物。２５．腫瘍細胞増殖の阻害のための請求項１８記載の医薬組成物。２６．内皮細胞増殖の阻害のための請求項１８記載の医薬組成物。２７．請求項１ないし１２のいずれか１つに記載のＬＰＳ結合ペプチドまたは請求項１３記載のＬＰＳ結合ペプチドの組を含む診断キット。２８．ＬＰＳの測定または敗血性症状の診断のための請求項２７記載の診断キット。２９．固体担体に固定化された請求項１ないし１２記載のペプチドまたは請求項１３記載のＬＰＳ結合ペプチドの組。３０．請求項２９の固定化ペプチドを用いて、溶液からＬＰＳを除去する方法。３１．該固定化ペプチドを、溶液からの細菌の除去に用いる請求項３０記載の方法。