JP2001512140A - 敗血症治療のための抗菌性及びエンドトキシン不活性化能を有する新規な合成ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチドは、両親媒性で、カチオン性で、安定したα−ヘリックスを形成し、少なくとも１２個のアミノ酸を含む以下のアミノ酸配列：Ｒ₁−Ｒ₂―Ａ₁−Ｂ₁−（Ａ₂−Ｂ₂−Ｃ₁−Ａ₃）_m−（Ｃ₂）_n−Ｒ₃、ただし、Ａは、塩基性アミノ酸であるリジン、アルギニン、及びヒスチジンから選択される１種のアミノ酸であり、Ｂは、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンのうちから選択される１種のアミノ酸であり、Ｃは、疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン及びアラニンから選択される１種のアミノ酸であり、当該ペプチドは、前記構造式と同方向あるいは前記構造式とは逆方向の配列のいずれかを有し、少なくとも０〜ｎの繰り返し配列モチーフ（Ａ₂−Ｂ₂−Ｃ₁−Ａ₃）が逆方向の配列を有し、残りの繰り返し配列モチーフが前記構造式中に示された方向の配列を有しており、Ｒ₁、Ｒ₂、及びＲ₃は、アミノ酸の数を示す、この数は、Ｒ₁とＲ₂の組合せ及びＲ₃については、それぞれ、好ましくは０〜１５であり、ｍは１〜１０であり、好ましくは２〜８であり、より好ましくは２〜５であり、ｎは、１〜３である、ペプチドである。このペプチドを含む薬剤組成物は、寄生虫感染、局所あるいは全身性腫瘍、及び敗血症性ショックの治療あるいは検査用に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 手術後の合併症、長期入院、事故、あるいは他の外傷の結果としての細菌感染
は、敗血症や、敗血症性ショック、不適切な臓器癒着、多臓器不全、及び急性呼
吸困難症（ＡＲＤＳ）を引き起こす可能性がある。過去における医学の進歩にも
かかわらず、敗血症を発症の増加は、死亡率が２０％から８０％に増加している
ことかも明らかである。敗血症は、微生物が、皮膚や粘膜等の身体の天然の防御
バリアを通過するときに発症する。もし、免疫系が、局所的にその感染を捕捉で
きないと、その微生物、もしくはその毒素は、循環系に侵入し、そして、そこで
、特異的な微生物産物が炎症性の応答を引き起こし、プラズマタンパク質の一つ
の配列部分や細胞性防護系を活性化する。宿主の防御系の活性化が、侵入する微
生物と戦うことにおいて重要な意味を有するにもかかわらず、カスケード工程が
同時に誘発され、不可逆的な組織の障害や臓器不全を引き起こす可能性がある。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．、ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｅｇｉｎｏｓａ、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、及びＢｏｒｄｅｌｌａ ｓｐｐ．の等のグラム
陰性菌や、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、及びＬｉｓｔｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ等の
グラム陽性菌による制御不可能な感染は、敗血症として一括される多様な臨床症
状を引き起こす。宿主の応答を開始させるグラム陰性細菌の成分は、エンドトキ
シンあるいはリポ多糖類（ＬＰＳ）と呼ばれている。これは、細菌の外膜の主要
なグリコリピッドの構成成分である。循環系において、ＬＰＳは、特異的な血液
細胞を刺激して、炎症の生体内伝達物質（メディエイター）であって、サイトカ
インと呼ばれる、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６
（ＩＬ−６）、及びインターロイキン−８（ＩＬ−８）などを合成させる。これ
らは、臓器や血管において、甚大な生理的な影響を有している。過剰なＬＰＳに
よる細胞性防御系の持続的な刺激は、サイトカインの過剰生成を引き起こし、二
次的な炎症伝達物質のカスケードを活性化し、結果的に血管障害や、循環系及び
代謝系の阻害を引き起こすことになる。ＬＰＳ分子の毒性成分は、敗血症に特異
的な病態生理上の変化を誘導するのに十分に、リピドＡ部位に高度に保持されて
いる。

【０００２】 敗血症の発症が、効果的な治療が可能な障害プロセスの十分に早い段階で検知
された場合には、エンドトキシンに感染した患者の予後はかなり改善される。循
環系中のエンドトキシンの直接的な分析は、感染症、敗血性ショック、及び死亡
等の臨床上重大な結果を予見するために重要である。臨床的に明らかなエンドト
キシン症は、現在利用できるエンドトキシン分析法である、カブトガニ遊走細胞
溶解物テスト（（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ａｓ ｓａｙ）、すなわち、ＬＡＬテストによっては、検知できないかもしれない。こ
の分析法は、感度ならびにプラズマ因子による妨害に関して重大な制限がある。

【０００３】 グラム陰性菌性の敗血症に対する、現在の治療上の選択肢は、抗生物質、敗血
症誘導性の臓器不全の血流力学的支援及び制御に限られている。抗生物質による
従来の治療は、感染している微生物の増殖を止めることに効果的ではあるものの
、傷ついた細菌からのＬＰＳの放出が敗血症の症状をさらに悪化させる可能性が
ある。しかしながら、グラム陰性菌性の敗血症性ショックにおいて、エンドトキ
シンの放出（エンドドキセミア）と細菌増殖（バクテレミア）の相対的な重要性
は、十分に解明されていない。ペニシリン、セファロスポリン等の従来の抗生物
質の、過去３０年間における細菌感染症治療における広範な臨床的使用により多
剤耐性菌の懸念されるべき増加をまねき、その結果、抗生物質治療の効果を激減
させることになっている。

【０００４】 敗血症性プロセスの基礎となる病態生理的機構に直接的に介入する努力は、矛
盾しかつ大きく落胆させるような結果しか得られていない。抗エンドトキシンモ
ノクローナル抗体、抗サイトカイン治療、及びその他の抗炎症戦略は、ヒトの敗
血症の標準的アジュバント治療法として、承認されるのに十分な効果を備えてい
ないとされている。敗血症の進行段階においてＬＰＳが中心的役割を果たすこと
から、エンドトキシンを除去を促進し、エンドトキシンの有害な作用を不活性化
するように設計される治療法は、効果的であるとされる可能性がある。ＬＰＳの
初期の相互作用をターゲットとする治療法は、広範な血管障害が発生する前の病
態の初期、あるいは、ハイリスクな患者に予防的に実施される場合に最も効果的
であろう。しかしながら、細菌性敗血症の進行段階において、炎症性細胞のさな
らる活性化を回避することが重要であるため、敗血症性ショックがおこってしま
った後においてもそのような治療の役割があるであろう。治療的使用に望ましい
とされている、抗エンドトキシン剤の特徴は、ＬＰＳ不活性化能、本来的な全身
性安定性と低い細胞毒性とともに、ＬＰＳ付随物に対する特異的で強い結合能を
有している。

【０００５】 エンドトキセミアの無い状態における、同じ炎症の生体内伝達物質を介した、
グラム陰性菌性敗血症性ショックと区別できない臨床的な症候は、グラム陽性菌
によって開始される。この場合、宿主の応答は、グラム陽性菌の外膜の主要構成
成分であるリポタイコ酸（ＬＴＡ）に起因する。グラム陰性菌とグラム陽性菌に
共通する細胞壁成分であって、インビトロでサイトカインを誘導することが示さ
れている他の成分が、ペプチドグリカン及び／又はこの巨大構造体の天然の分解
生成物である。ＬＰＳとＬＴＡは、ほとんど共通の構造的特徴を有していないが
、これらに共通する一つの物理的特徴は、両親媒性である。これは、マイナスに
荷電した親水性基と長鎖脂肪酸残基の親油性側鎖との特異的な配向によるもので
ある。最近の実験的証拠によれば、これらの毒性のある細胞壁成分によるサイト
カイン誘導経路の共通する多くのステップが提案されていいる。

【０００６】 抗細菌性ペプチドは一般的に、傷害や感染に応答して動物の体内で誘導される
。これらの内在性因子の合成あるいは非適合的な免疫系は、グラム陽性菌、グラ
ム陰性菌、カビ及びウイルスを含む多様な刺激によって誘導される。動物のペプ
チド抗生物質は、一般的に小さい線状あるいは環状の荷電した分子であり、哺乳
類や昆虫細胞に由来するセクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）、カエルの皮膚に由来
するマガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）、ハチの毒に由来するメリチチン（ｍｅｌ
ｔｉｔｉｎ）、及びカブトガニ由来のタチプレシン（tachyplesins)等であって 、動物に生息する天然の細菌にしばしば属する微生物に対して広い範囲の抗菌活
性スペクトラムを有している。線状のカチオン性ペプチド抗生物質の抗菌活性は
、ペプチドモノマーの自己集合によって脂質二重層にイオンチャンネルを形成す
ることにより、細菌の外膜（ＯＭ）の完全性を破壊することのできるα−ヘリカ
ル構造を形成できるか否かにかかっている。自己集合においては、親水性のアミ
ノ酸残基は細胞孔の内部に配向し、その外側の疎水性のアミノ酸残基は、細胞壁
のリン脂質と相互作用する。ＯＭの完全性の分子的基礎は、ＬＰＳに近接する、
マイナスに荷電したリピドＡ成分とＭｇ²⁺やＣａ²⁺等の２価のカチオンとの静電
気的結合に基づいている。これらのカチオンをＬＰＳに対して親和性の高いプラ
スに荷電した分子で置換することによる架橋構造の破壊は、膜の不安定化に帰着
するものと仮定されていた。しかしながら、従来の研究も、抗菌ペプチドのカチ
オン性だけが、ただ一つのＯＭの透過性の決定因子ではないが、ＬＰＳに対して
高い親和性で結合するためには、特別な構造が重要であることを示していた。加
えて、ＬＰＳのリピドＡ部分は、膜内に埋まっていて細胞外部からは容易に近接
できないため、効果的なＬＰＳリガンドは、有効な膜貫通性のある小さなサイズ
であることが必要であった。

【０００７】 多くの天然タンパク質及びポリペプチドが、ＬＰＳに結合し不活性化すること
が報告されている。これらには、ポリミキシンＢ（ＰｍＢ）、リムルス−アンチ
−ＬＰＳ因子（ＬＡＬＦ）、ヒト好中球由来ＣＡＰ１８、及び殺菌性／透過性−
増大タンパク質（ＢＰＩ）が含まれている。ＰｍＢとＬＡＬＦはインビトロでＬ
ＰＳを不活性化し、実験動物において、エンドトキシン媒介性の死亡に対する保
護を提供するが、毒性は、グラム陰性菌感染に対する臨床使用を妨げている。Ｃ
ＡＰ１８タンパク質は、インビトロでのＬＰＳ応答を阻害するが、現在利用でき
るデータは、敗血症治療に使用できる薬剤としての評価のためには十分でない。
臨床上のエンドトキシンショックにおけるＢＰＩタンパク質、及びその切り詰め
られた組換え誘導体であるｒＢＰＩ２３や、ｒｂＢＰＩ２１の治療的使用は、循
環系からの急速な消失と、複合的なエンドトキシン対する低い効果により制限さ
れる。ＬＡＬＦ、ＣＡＰ１８、及びＢＰＩの可能性あるＬＰＳ結合ドメインを取
り込んだ合成ペプチド誘導体のすべては、その親化合物に比較して、その抗菌活
性の低下やリピドＡに対する結合性の低下等の好ましくない特性を示している。

【０００８】 （発明の開示） 本出願人は、分子モデリング及び合理的なデザイン技術によって、殺菌性ペプ
チド（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）というＬＰＳ結合性ペプ
チドの新規な世代を確立した。このペプチドのデザインに含まれる一般的な特性
は、制限的なサイズ、独特の立体的化学的特徴、溶解性と低い細胞毒性、である
。ペプチドの構造における特異的な特徴は、ＬＰＳのリピドＡ部位の最適な結合
性（高い毒素抗毒素反応の親和性）を得るために特別な立体構造にあるＬＰＳ結
合性ドメインを構成する複数の配列部分である。このペプチドは、Ｆｍｏｃ（９
−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｙｌ）アミノ酸誘導体と、固相
化学反応によって合成され、逆相高速液体クロマトグラフィーによって均質に精
製され、分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、マススペクトロメトリーによって当業
者に知られた方法により確認される。ペプチド合成のいかなる公知の方法もこの
発明に適用でき、これらの方法はこの分野の当業者において容易に利用すること
ができる。

【０００９】 （発明の特徴） 合成ペプチドとそのビオチニル化誘導体の生化学的及び生物学的特徴が以下に
示される。 １）グラム陰性菌ならびにグラム陽性菌に対する強力な抗菌活性 ２）確立された高親和性エンドトキシンバインダーであるポリミキシンＢに比較
して、異種のエンドトキシンに対して相対的に高い親和度でのリピドＡ部分に対
する結合性 ３）ＬＰＳとの複合体形成能及び溶液からのＬＰＳ沈殿形成能 ４）希釈されたプラズマ中での＜０．１ｐｇ／ｍｌのエンドトキシン濃度でのエ
ンドトキシン検出能 ５）体外の全血中におけるエンドトキシン媒介性サイトカイン生成の不活性化能
６）エンドトキシン致死量投与のマウスにおける敗血症性ショックの回避能 ７）生きた病原バクテリアの致死量が投与されたマウスにおける敗血症性ショッ
クの回避能

【００１０】 （発明の用途） 新規なペプチドが特異的な特性を有する結果、この発明は、以下の用途を有す
る。 １）ペプチド担体、あるいは従来の抗生物質と組み合わせた、多剤耐性バクテリ
アによる局所性及び全身性感染の治療 ２）生理的溶液あるいは薬剤的溶液からの定量的なエンドトキシンの除去 ３）ビオチニル化ペプチド誘導体を利用した臨床検査用のエンドトキシンＥＬＩ
ＳＡ（ＥＩＥ）と称する、商業上での新規なエンドトキシン試験法の開発 ４）ハイリスク患者の術後における本発明のペプチドの予防的使用による敗血症
の回避 ５）ヒトを含む哺乳類における敗血症性ショック症候群の治療

【００１１】 両親媒性のα−ヘリカルペプチドの一般的な膜不安化特性と同様に、示された
抗腫瘍活性ならびに、予期される抗真菌性、抗ウイルス性、抗炎症性を考慮する
と、この発明のペプチドの他の可能性ある用途としては以下の各用途を含んでい
る。 ６）マラリア寄生虫ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．の全身性メレゾイト（ｍｅ ｒｅｚｏｉｔｅ）形態によって引き起こされる感染性疾患の治療 ７）トリパノゾーマ症のような他の寄生性疾患の治療 ８）局所的あるいは全身的な悪性腫瘍の治療 ９）真菌感染症の治療 １０）ウイルス感染症の治療 １１）炎症治療

【００１２】 （発明の目的） したがって、本発明の第一の目的は、臨床検査のための商業ベースでの新規な
エンドトキシン試験のさらなる開発においてこの新規ペプチドを用いることであ
る。 また、本発明の目的は、敗血症性ショックの回避のための予防ペプチドを提供
することである。また、本発明の目的は、敗血症性ショックの治療に用いる治療
用ペプチドを提供することである。また、本発明の目的は、薬剤溶液からの定量
的なエンドトキシンの除去に用いる新規ペプチドを提供することである。また、
本発明の目的は、一般的な感染症の治療に用いる新規な治療用ペプチドを提供す
ることである。

【００１３】 （発明の詳細な説明） 合成ペプチドのデザインプロセスにおいて用いられる典型例は、３工程を含ん
でいる。すなわち、ｉ）リピドＡ結合のためのアミノ酸側鎖（薬剤作用部位）を
同定、ｉｉ）これらの残基の空間的配置を決定、及びｉｉｉ）これらの残基が最
適なリガンド結合のための特異的空間配列を保持できるように配置されるような
ペプチドバックボーンのデザインである。

【００１４】 天然の抗ＬＰＳや、哺乳類、両生類、及び昆虫、由来の抗菌性のタンパク質／
ペプチドのＬＰＳ結合ドメインの分子モデリングとのアミノ酸の一次配列及び二
次構造上の比較、ならびに、生物学的活性に関する機能上の比較に基づくと、合
成ＬＰＳ結合性ペプチドの新規な世代が得られた。このペプチドのデザインに含
まれる対象は、制限されたサイズ、及びＬＰＳ結合性モチーフを縦列に配列を備
える、最適化された両親媒性のα−ヘリカル構造である。この構造は、リピドＡ
のマイナスに荷電したリン酸基あるいは疎水性基に最適に結合するために、その
ヘリックスについて特異的に配列したカチオン性及び疎水性の残基から構成され
ている。加えて、水性液に対する適切な溶解性が確保されるように、ペプチド組
成中に、おおよそ等しい比率の疎水性アミノ酸と塩基性アミノ酸残基が保持され
ることである。

【００１５】 （新規ペプチドの構造的特徴） この発明は、新規なペプチドの構造式を提供する。このペプチドは、両親媒性
で、カチオン性で、安定したα−ヘリックスを形成し、少なくとも１２個のアミ
ノ酸を含む以下のアミノ酸配列： Ｒ₁−Ｒ₂―Ａ₁−Ｂ₁−（Ａ₂−Ｂ₂−Ｃ₁−Ａ₃）_m−（Ｃ₂）_n−Ｒ₃、 ただし、Ａは、塩基性アミノ酸であるリジン、アルギニン、及びヒスチジンか
ら選択される１種のアミノ酸であり、Ｂは、芳香族アミノ酸であるフェニルアラ
ニン、トリプトファン、及びチロシンのうちから選択される１種のアミノ酸であ
り、Ｃは、疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン及びアラニン
から選択される１種のアミノ酸である、 当該ペプチドは、前記構造式と同方向あるいは前記構造式とは逆方向の配列の
いずれかを有し、少なくとも０〜ｎの繰り返し配列モチーフ（Ａ₂−Ｂ₂−Ｃ₁− Ａ₃）が逆方向の配列を有し、残りの繰り返し配列モチーフが前記構造式中に示 された方向の配列を有している、 Ｒ₁、Ｒ₂、及びＲ₃は、アミノ酸の数を示す、この数は、Ｒ₁とＲ₂の組合せ及 びＲ₃については、それぞれ、好ましくは０〜１５であり、ｍは１〜１０であり 、好ましくは２〜８であり、より好ましくは２〜５であり、ｎは、１〜３である
、 を有しているアミノ酸組成のペプチドである。

【００１６】 実施例によれば、ｎ＝３の場合が、明らかに適切な実施形態である。さらに好
ましいペプチドは、Ａ₄Ｃ₃Ａ₅Ａ₆からなる配列群から選択されるＲ₂（ただし、 Ａ及びＣは上記と同様に定義される）を含んでいる。Ｒ₁の他の好ましい意義は 、Ｇｌｙ_p（ｐ＝０〜１０）、及びＡｌａ_q（ｑ＝０〜１０）である。この発明の
ペプチドは、長すぎると効果が低減するために、長すぎるものであってはならな
い。適切なＲ₁−Ｒ₂−、及びＲ₃は、それぞれ１〜１０個のアミノ酸を含んでい る。Ｒ₁−Ｒ₂−、及びＲ₃のうちいずれか、あるいはこれら２種を含まない場合 もこの発明のペプチドに含まれる。Ｒ₁−Ｒ₂−、及びＲ₃（＝アミノ酸の数）が 、それぞれ１〜５個、好ましくは１〜３個のアミノ酸であるペプチドは、この発
明の適切な実施形態を構成する。実施例から明らかなように、Ｒ₁−Ｒ₂−、ある
いはＲ₃が、アミノ酸が１個の場合、試験された従来のペプチドならびに他の誘 導体よりも顕著に良好に機能を発揮した。Ｒ₁−Ｒ₂−、及びＲ₃におけるアミノ 酸の性質は、Ａ、Ｂ及びＣで指定される部分よりも臨界的ではない。しかしなが
ら、本ペプチドを構成するアミノ酸の組合せは、全体として、カチオン性で両親
媒性の分子である必要がある。Ｒ₁−Ｒ₂−、及びＲ₃の組成は、Ａ，Ｂ，及びＣ を構成するアミノ酸と異なるアミノ酸を含めるようにすることができる。また、
ペプチドは、Ａ，Ｂ，及びＣを構成するアミノ酸と異なるアミノ酸からなるＲ₁ −Ｒ₂−、及びＲ₃のみを含むようにすることもできる。ペプチドは、線状でもよ
く、環状でもよく、モノマー状あるいはポリマー状であってもよい。

【００１７】 一般的に、この発明のペプチドの長さは、５０アミノ酸を超えない。この発明
のペプチドとして、好ましいサイズは、１２〜２４個、好ましくは、１２〜３０
個のアミノ酸の長さである。また、実施例において示されるアミノ酸配列のいか
なる長さであっても、好ましい。１５〜２５個のアミノ酸長さは、本定義に含ま
れるものとする。

【００１８】 上述したように、ペプチドは、上記記載の構造式における方向の配列を有して
いてもよいし、全体あるいは部分的に逆方向の配列を有していてもよい。したが
って、前記繰り返し配列のいくつかが、逆方向の配列、すなわち、Ａ₃−Ｃ₁−Ｂ ₂ −Ａ₂の配列、あるいは前記構造式の方向の配列を有し、残存する配列部分が、
前記構造式で示される方向の配列とすることもできる。好ましい実施形態におい
ては、実施例から明らかであるように、ペプチドは、構造式に記載された方向の
くり返し配列（Ａ₂−Ｂ₂−Ｃ₁−Ａ₃）よりも、逆方向での配列をより多く有して
いる。 両親媒性のカチオン性ペプチドの構造式の例を以下に示す。 ＢＰ１：Gly-Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌ
ａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ｃｙｓ（配列番号１） ＢＰ２：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−
Ａｌａ−Ｃｙｓ（配列番号２） ＢＰ２．３：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ala−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ −Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３） ＢＰ２．４：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号４） ＢＰ２．５：Ｃｙｓ−（Ｇｌｙ）₉−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ −Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号５） ＢＰ１．１：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙ
ｓ−Ｓｅｒ（配列番号６） ＢＰ１．２：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙ
ｓ−Ｓｅｒ（配列番号７） ＢＰ２．２：Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号８）

【００１９】 必要あれば、ペプチド合成後Ｃ末端のＣｙｓに、あるいはペプチド合成の最終
サイクル中にＮ末端においてその場でビオチン標識を導入した。ペプチドＢＰ１
とＢＰ２は、ビオチン−ＨＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ、 Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、 ＩＬ）を用いてＣ末端のＣｙｓのチオール基をビオ
チニル化し、ペプチドＢＰ２．１と２．２については、Ｎ末端のＧｌｙ残基にお
いてビオチニル化した。

【００２０】 本合成ペプチドは、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌の除去、１０^-15モルレベルのエ ンドトキシンの検出、生物学的液体あるいは薬剤用調製物、及びヒトを含む哺乳
類における敗血症性ショックの予防及び治療におけるエンドトキシンの不活性化
のための、新規な抗生物質として使用できる。 細菌感染によって発症する敗血症性ショックの予防あるいは治療のための好ま
しい用量は、感染の危険性や症状の重症度により、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体
重の範囲とされる。化合物は、周知の製剤用担体あるいは、不活性な希釈剤を用
いて非経口的に投与される。化合物は、乾燥状態で保存することができ、希釈剤
、好ましくは、パイロジェンフリーの生理食塩液に、投与の直前に溶解する。こ
の新規なペプチドは、この分野で周知の自動化技術あるいは手作業を用いたペプ
チド化学の古典的手法によって合成することができる。例として、Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ Synthesis あるいはＰＥＰＳＣＡＮを用いることができる。以下の実 施例は、好ましく用いることのできる合成工程の説明を提供するものである。

【００２１】 （好ましい実施形態の記載） この発明のペプチドを合成するのに用いた方法は、従来のＦｍｏｃ（９−フル
オレニルメトキシカルボニル）固相化学反応を採用するものであった。自動化さ
れた操作において、ＭＩＬＬＩＧＥＮ モデル９０５０ペプチド合成装置（ＭＩ
ＬＬＩＰＯＲＥ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｐｎ， ＭＡ）に０．０５ｍｍｏｌの、Ｎｏ
ｖａＳｙｎＴＧＡレジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ａ
Ｇ，Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で置換したＮ−α―
Ｆｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸を負荷した。必要とされるアミノ酸のＮ−α―Ｆｍｏｃ
−Ｌ−アミノ酸−Ｏ−ペンタフルオロフェニルレジン置換体（Ｆｍｏｃ−ａａ）
を、ペプチドの配列順の合成に用いた。Ｎ−α―Ｆｍｏｃ保護アミノ酸の側鎖の
保護基は、以下の通りであった。すなわち、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｌｙ
ｓ、Ｔｒｐ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（
Ａｒｇ）、及びｔ−ブチル（Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）であった。固定化したＣ末端のＦ
ｍｏｃ保護アミノ酸を、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）で処理して、α−アミノ基
からＦｍｏｃを除去した。各Ｎ保護アミノ酸の４当量を活性化して、５倍モル量
過剰のＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール１−ｙｌ）−１，
１，３，３０−テトラメチルロニウム テトラフルオロボレート／Ｎ−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール）とカップリングさせた。 合成終了後、ペプチドは同時に樹脂から分離され、除去剤として、２％（ｗ／
ｖ）のフェノール、２％（ｖ／ｖ）の水、２％（ｖ／ｖ）のエタンジチオール、
及び２％（ｖ／ｖ）のチオアニソールの存在下の９２％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを用
いて保護基を外した。遊離のペプチドを、ろ過によって樹脂から分離し、エチル
エーテルで繰り返して抽出し、Ｃ１８カラム（Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ，Ｗａｔｅｒ
ｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、０．０５％ＴＦＡ中、０〜６０％アセト
ニトリルグラジエントをかけた逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し
た。合成ペプチドの純度は、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣと、Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ メソ
ッド（Ｗａｔｅｒｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によるアミノ酸分析により決定し
た。精製したアミノ酸は、−７０℃下、脂肪親和化した形態あるいは２ｍｇ／ｍ
ｌのパイロジェンフリーの水中のいずれかで保存した。

【００２２】 （実験的観察） （抗菌活性） 本発明のペプチドの抗菌活性は、代表的なグラム陰性菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ０１１１：Ｂ４）とグラム陽性菌（Ｓｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の液体培養中での生存率における効果 を測定することにより示された。バクテリシダル（殺菌性）／透過性 増加性タ
ンパク質（ｂａｃｔｒｉｃｉｄａｌ／ｐｅｒａｍｉａｂｏｌｉｔｙ ｉｎｃｒｅ
ａｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＰＩ）として特徴付けられるヒト抗エンドトキ
シンタンパク質から選択したＬＰＳ結合ドメインを含むペプチド（ＢＰＩの８５
番目から１０２番目のアミノ酸、（ＢＰＩ_(85-102)と称す。）を、天然のタンパ
ク質と本発明の合成ペプチドのエンドトキシン結合ドメインの有効性の直接的な
比較のために含んでいる。 ＢＰＩ_(85-102)のアミノ酸配列は、 Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−
Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
（Ｃｙｓ） であった。

【００２３】 ＢＰＩ_(85-102)標準ペプチドは、この発明のペプチドについてすでに記載した
ように合成し、すでに記載したように、ビオチニル化のためにＣｙｓ残基をＣ末
端に導入した。投与量に依存する、グラム陰性菌とグラム陽性菌との両方の細胞
培養における細胞密度の低下がＢＰＩ及びＢＰ２において明らかであった。これ
に対して、ＢＰＩ_(85-102)では、グラム陽性菌においてわずかに効果を示したも
のの、グラム陰性菌においては全く効果がなかった（表１）。両方のタイプの細
菌の生存率に対する、本発明のペプチドの各種濃度での限定された期間のインキ
ュベーションの効果は、また、これらのペプチドの強力な抗菌活性を示し、天然
のＢＰＩタンパク質のＬＰＳ結合ドメインのアミノ酸配列に対応する配列を有す
るＢＰＩ_(85-102)ペプチドとその反対の結果を示した（図１）。このことは、線
状の両親媒性αヘリカルペプチドを有する普遍的な殺菌性特性を伴った、本発明
のペプチドの広範囲な特異性を示している。抗菌特性における、この発明の構造
式において定義されるペプチド配列の効果を示すために、この発明の代表的なペ
プチドであるＢＰ１とＢＰ２ペプチドと対比して、微細な配列上の相違を有する
ように類似体を設計した。疎水性のＣ末端ドメイン（Ｃ₂）_nに隣接する、繰り返
しモチーフである（Ａ₂−Ｂ₂−Ｃ₁−Ａ₃）_mを２又はそれ以上を有するタンデム 配列についての絶対的な必要条件を、ＢＰ１．１とＢＰ２．１誘導体を用いて示
した。各例における、繰り返し配列のＮ末端側のＢ₂残基は、本発明の構造式に おいて示されるように芳香族アミノ酸の代わりに、Ａｌａ残基で置換し、疎水性
の（Ｃ₂）部分はＬｙｓとＣｙｓで置換して親水性とした。これらの誘導体と、 本発明のペプチドであるこれら親ペプチドとの相同性は高かったものの、試験さ
れたうちで最も高濃度（２０μｇ／ｍｌ）の場合においてさえ、これら誘導体の
抗菌活性は見出されなかった。本発明のＢＰ２．３、ＢＰ２．４、及びＢＰ２．
５ペプチドは、同様の条件下でＢＰ２ペプチドと同様の抗菌活性を示した（デー
タは示されていない）。

【００２４】 追加の一連の実験を、生体外で、全血に近似させた生理的条件下で、臨床上意
義のある病原性グラム陰性細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｅｒｏ
ｔｙｐｅ０１８：Ｋ１：７：Ｂｏｒｔ）に対する本発明のペプチドの抗菌活性を
確認するために実施した。典型的な実験例において、５μｇ／ｍｌ（２μＭ）の
ＢＰ２ペプチドは、クエン酸化（ｃｉｔｒａｔｅｄ）した全血中において、当初
１０⁶コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの生菌を、３７℃、２０分以内のイン キュベーションで、ペプチドを加えていないコントロールに対して９５％低下さ
せ、１時間後には、９９％以上低下させた（データは示されていない）。これら
の結果は、全血中における細菌性毒素に対する本発明のペプチドの強力な抗菌活
性を示しており、臨床上の細菌性症の治療に対する高い治療可能性を示唆してい
る。

【００２５】 （ＬＰＳ−結合特性） 分離された異なるＬＰＳのリピドＡ部分に対する、本発明のペプチドの特異的
な結合性を、二重免疫拡散法（Ｄｏｕｂｌｅ−ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ
）、濁度及びＥＬＩＳＡミクロプレートエンドトキシン結合試験により示した。
二重免疫拡散法は、’ラフ’Ｒ−タイプＥ．ｃｏｌｉ Ｄ３１ｍ４Ｒｅ−ＬＰＳ （Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＣＡ ）あるいは構造的により複雑な’スムース’ＳタイプＥ．ｃｏｌｉ ０１１１： Ｂ４ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ．，ＩＬ
）に対して、５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）と０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ１００、ｐＨ７．５を含む０．８％（ｗ／ｖ）アガロース中で、２０℃で１ ６時間実施した。ＰｍＢとＢＰＩ_(85-102)を、比較のために、コントロールとし
てインキュベートした。形成した微少な沈殿をクマシンブリリアントブルー染色
により視覚化した。結果は、本発明のペプチドによるＲｅと０１１１ＬＰＳの濃
度依存性の沈殿形成を明瞭に示した（データは示さず）。ペプチドとＬＰＳとが
同じモル比のときに、ペプチドによってＲｅＬＰＳと形成された沈殿の量は、Ｐ
ｍＢで形成した沈殿の量に相当した。このことは、リピドＡに対する本発明のペ
プチドの同様な親和性を示している。しかしながら、ＰｍＢは、この系において
は、０１１１ＬＰＳとは沈殿を形成しなかった。ＢＰＩ_(85-102)ペプチドがＲｅ
あるいは０１１１ＬＰＳと非常に少量の沈殿しか形成しなかったことは、ＢＰＩ _(85-102) に比較して、本発明のペプチドがエンドトキシンに対して顕著に高い親
和性を有していることを示している。形成された沈殿の量は、価数と相関関係に
あるので、本発明のペプチドは、リピドＡ部分を介してＬＰＳ分子と高度な分子
間結合が可能であるようである。ペプチドとエンドトキシンとのモル比を異なら
せて得た不溶性の沈殿の染色強度の比較によって、エンドトキシン複合体の量を
測定したところ、本発明の合成ペプチドによる最適なエンドトキシン複合体形成
のための化学量数は、２モルのエンドトキシンに対して１モルのペプチドであっ
た。

【００２６】 濁度分析は、本発明によって選択的に合成されたペプチドのエンドトキシン結
合活性あるいは毒素抗毒素反応性を直接的に対比するために、ラフ分泌型のＥ．
ｃｏｌｉＲｅあるいはＲｃ（１５）ＬＰＳを用いて行った。ＰｍＢとＢＰＩ_{(85- 102)} を、比較のためにコントロールとしてインキュベートした。この発明の合成
ペプチドによるエンドトキシンの沈殿の形成程度は、不溶性の複合体の３４０ｎ
ｍにおける吸光度を測定することにより決定した。多くの例において、本発明の
合成ペプチドによるＲｅあるいはＪ５ＬＰＳの最適な複合体形成は、エンドトキ
シンに対するペプチドのモル比が、２：１（エンドトキシン：ペプチド）の時で
あった。コントロールのＢＰＩ_(85-102)ペプチドは、ほぼ同程度の複合体形成の
ためには４倍モル以上が必要であった。この方法の条件下で合成ペプチドの２倍
モル過剰でのペプチド−エンドトキシン不溶性複合体の形成程度で表される毒素
抗毒素反応性は、ＢＰ２．１＞ＢＰ２．２＞ＢＰ２＞ＢＰ１＞ＰｍＢ＞ＢＰＩ_{(8 5-102)} であった。合成ペプチドによるＲｅあるいはより構造的に複雑なＪ５ Ｌ ＰＳの複合体形成能間には、大きな差はなかった。沈殿形成反応のタイムコース
の測定は、室温で５分以内に最大量のＬＰＳ沈殿形成がおこることを示した（デ
ータは示さず）。

【００２７】 合成ペプチドのリピドＡ結合親和性を、固相エンドトキシン−結合試験で直接
的に比較した。合成ペプチドＢＰ１、ＢＰ２、及びＢＰ２．１とコントロールペ
プチドＢＰＩ_(85-102)のビオチニル化誘導体の結合特性を、Ｅ．ｃｏｌｉＤ３１
ｍ４リピドＡで被覆したＥＬＩＳＡのミクロタイタープレートで測定した。固定
化したリピドＡに対するビオチニル化ペプチドの特異的結合性を、ストレプトア
ビジン−ＨＲＰ及び３，５，３’５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質
で発色させて測定し、補正した４５０ｎｍでの吸光度で表した。Ｓｃａｔｃｈａ
ｒｄプロットの方法により計算した各種ペプチドの明白なはっきりとした結合親
和性は、ＢＰ２（Ｋ_a＝１．９×１０⁸Ｍ^-1）、ＢＰ１（Ｋ_a＝０．９×１０⁸Ｍ^-1 ）、ＢＰ２．１（Ｋ_a＝０．４×１０⁸Ｍ^-1）及びＢＰＩ_(85-102)（Ｋ_a＝０．２ ×１０⁸Ｍ^-1）であった。これらの結合親和性を比較すると、リピドＡに対する 親和性において、ＢＰ２＞ＢＰ１＞ＢＰ２．１＞ＢＰＩ_(85-102)の順で顕著な相
違がある（図３）。加えて、ＢＰ２ペプチドは、公知の高ＬＰＳ結合親和性分子
であるＰｍＢ（Ｋ_a＝１０⁷Ｍ^-1）に比較して、リピドＡに対する親和性はおおよ
そ２０倍である。ＬＰＳ溶液の濁度分析では、その他のペプチドよりも強い分子
間結合性を示したのとは対照的に、この例においては、ＢＰ２ペプチドは、固定
化したリピドＡに対して最も高い親和性を示した。

【００２８】 複雑さを増大させたエンドトキシンに対する新規合成ＢＰ２ペプチドの親和性
ならびに結合におけるプラズマの影響について、ＥＬＩＳＡミクロプレート法で
実験した。結果（図４）は、ＢＰ２の結合の程度は、固定化したＬＰＳの複雑性
の増加に伴って減少し、長いポリサッカライド鎖と、固定化の条件下におけるよ
り複雑なエンドトキシンのＯ−抗原の側鎖とによる立体障害を反映しているよう
であった。５％（ｖ／ｖ）まで加熱処理し清澄化したプラズマを増加しても、複
雑さを増大させたエンドトキシンに対する新規ペプチドＢＰ２の結合性にはほと
んど影響はなく、その結合が特異的でかつ高い親和性を有することを示していた
。

【００２９】 リピドＡに対する最も高い結合親和性（Ｋ_a＝１．９×１０⁸Ｍ^-1）を示した、
新規合成ペプチドＢＰ２を固定化したときの結合能力を測定するために、ビオチ
ニル化したＢＰ２ペプチドで飽和したストレプトアビジン被覆超磁性ポリスチレ
ンビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０，Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ、 Ｎｏｒｗａｙ）を各種濃度の、ルテニウム（II）トリス−バイピリジンキレート
のＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステルで標識（ＴＡＧ−ＮＨＳ−エステル）
した、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ＬＰＳとともにインキュベートした。固定化した新規 合成ペプチドＢＰ２によるＴＡＧ標識Ｊ５ ＬＰＳの捕捉を、過剰の非結合のＬ ＰＳを取り除くために０．１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含有する リン酸バッファによる洗浄工程を経た後に、電気化学ルミネッセンス検出法で測
定した。結果は、ペプチド：ＬＰＳが１：２までの範囲において、固定化したペ
プチドによる直線的な濃度依存性のＴＡＧ−ＬＰＳ捕捉能力を示し、８倍モル過
剰のエンドトキシンで飽和に達した。このことは、固定化した本発明の合成ペプ
チドが溶液中のエンドトキシンに対して高い捕捉能力を有することを明確にした
。これらの実験は、本発明のペプチドが、高い親和性で異なるＬＰＳに対して結
合し、普遍的なリピドＡ結合性リガンドであることを示している。

【００３０】 上記のミクロプレート法は、新規合成ペプチドのエンドトキシン結合活性と特
異性とを測定するために採用され、新規な高感度エンドトキシン分析法を開発の
基礎を形成した。ＥＬＩＳＡミクロプレートリピドＡ結合試験においてビオチン
ニル化したＢＰ２ペプチドを使用する実験は、１ｐｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ０ １１１：Ｂ４ ＬＰＳが、固定化したリピドＡに対する合成ペプチドの結合を６ ５％阻害できることを示した（図６）。この競争的結合阻害は、１〜５派（ｖ／
ｖ）の加熱処理、清澄化プラズマの存在下、０１１１：Ｂ４ ＬＰＳの濃度が＜ ０．１から１０００ｐｇ／ｍｌの範囲で直線性があり、この新規なエンドトキシ
ン分析法の検出限界が、フェムトモラー（１０^-15モル）レベルであることがわ かった（図７）。各種量のエンドトキシンを添加してプラズマ溶液中で直接測定
した時においても、同じ程度の濃度依存性阻害が観察された。これらの結果は、
エンドトキシン阻害ＥＬＩＳＡ（ＥＩＥ）ミクロプレート法による、生理的溶液
あるいは薬剤調製物中における微量のＬＰＳを検出可能な高度に選択的でかつ感
度の高い試薬の調製を示すものである。

【００３１】 （ＬＰＳ−不活性化特性） インビトロ無毒化 この発明の合成ペプチドのエンドトキシン不活性化能力を、インビトロヒト全
血バイオアッセイ系のウエル中での、前炎症性サイトカインである、腫瘍壊死因
子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びインターロイキン
−８（ＩＬ−８）のＬＰＳ刺激性放出における影響を研究することにより評価し
た。一つの実験系においては、Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ＬＰＳの０．２〜 １ｎｇ／ｍｌの希釈液を、１０μｇ／ｍｌの合成ペプチドとともに、ＲＰＭＩ培
地中、２０℃で３０分間プレインキュベートし、希釈した全血液を添加した。上
清中のサイトカイン濃度は、５％ＣＯ₂の存在下、３７℃で１６時間さらにイン キュベート後に、特異的で感受性のあるＥＬＩＳＡキット（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で測定した。他の一つの実験系で は、１ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４ＬＰＳによるＩＬ−６誘導にお
ける、２．５，５及び１０μｇ／ｍｌの合成ペプチドの効果を、合成ペプチドと
ＬＰＳとの希釈全血に対する同時添加後に測定した。

【００３２】 結果は、本発明の合成ペプチドとのプレインキュベーションによる高度に効果
的なＬＰＳの不活性化によって、前炎症性サイトカインのＴＮＦ−α、ＩＬ−６
、あるいはＩＬ−８の合成は全体的に阻害されたことを示した（図８）。合成ペ
プチドとＬＰＳの同時添加実験は、１μＭの濃度のＢＰ１あるいはＢＰ２が、全
血の複雑な環境下においてＩＬ−６の合成を完全に阻害できることを示した（図
９）。コントロールペプチドのＢＰＩ_(85-102)は、これらの実験条件下において
、４倍高濃度であっても、サイトカイン合成を低減させる効果を示さなかった。
このことは、おそらく、ＢＰ１及びＢＰ２のリピドＡ結合親和性が、ＢＰＩ_{(85- 102)} と比較して、それぞれ５倍、及び１０倍相違することを反映している。エン
ドトキシンに対するコントロールペプチドの結合性に影響を及ぼす他の因子とし
ては、このアッセイ系において１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌの濃度で抗凝集剤として使
用したヘパリンが考えられる。多くのヘパリン結合性タンパク質に由来する共通
の結合ドメインが、合成ペプチドのＬＰＳ結合性ドメインに部分的に重複するこ
とが見出されており、このことは、ヘパリンが十分に高い濃度で存在するときに
は、ヘパリンは合成ペプチドに対する結合をエンドトキシンと競争でき、それに
よりエンドトキシン不活性化能を低下させることを示している。このことに基づ
けば、エンドトキシン不活性化能の低下は、エンドトキシンとヘパリンに対する
ペプチド間の親和性の相違に相関するであろうことが予期された。

【００３３】 この仮説を立証するために、合成ペプチドとＥ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４ＬＰ
Ｓとのプレインキュベーション期間中におけるエンドトキシン不活性化効果に対
するヘパリン濃度の増大の影響を測定する実験を実施した。図１０は、合成ペプ
チドのエンドトキシン不活性化能力の抑制率のヘパリン濃度依存性を、ＩＬ−６
合成阻害の低下で例示して示す。コントロールとしたＰｍＢのＬＰＳ不活性化能
力には、使用したヘパリン濃度範囲内においては何ら影響がなかった。ＢＰ２の
ＬＰＳに対する結合能を５０％低下させるヘパリン濃度の計算結果（ＩＣ₅₀＝０
．４０Ｕ／ｍｌ）は、ＬＰＳに対して、おおよそ１０，０００倍モル過剰のヘパ
リンがＢＰ２ペプチドと同程度の競争的阻害のためには必要であることを示して
いる。この観察結果は、合成ペプチドＢＰ２の親和性は、ヘパリンよりもずっと
ＬＰＳに対して高いことを示している。合成ペプチドＢＰ１とコントロールペプ
チドＢＰＩ_(85-102)のＬＰＳ不活性化能は、同じ濃度のヘパリンによってぞれぞ
れ７５％及び８５％低下され、エンドトキシンよりもヘパリンに対して相対的に
高い親和性を有することを示した。

【００３４】 加えて、選択的合成ペプチドのＬＰＳ不活性化能を、無毒化効果に対するプラ
ズマタンパク質や赤血球等の生理学的濃度の血液成分の影響を測定するために、
生体外の全血のより複雑な環境下で比較した。プレインキュベーション実験にお
いて、１〜１０μｇ／ｍｌの合成ペプチド、コントロールペプチド、あるいはＰ
ｍＢを１ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ＬＰＳと、パイロジェンフ リーの生理食塩液中で２３℃で３０分間、プレインキュベートし、抗凝集剤とし
て２Ｉ．Ｕ．／ｍｌのヘパリンを含む静脈血に添加し、その後、３７℃で４時間
インキュベートした。前記したようにして、ＴＮＦ−αを、適当に希釈した細胞
を含まない上清液中で測定した。結果（図１１）は、最も低い濃度である１μｇ
／ｍｌにおいても、合成ペプチドＢＰ１、ＢＰ２、あるいはコントロールペプチ
ドＢＰＩならびＢＰＩ_(85-102)によってほとんど完全にＴＮＦ−αの合成は阻害
されたことを示す。この結果は、１０倍に希釈した全血での結果と本質的に同じ
であった。ＢＰ２．１及びＢＰ２．２ペプチド類似体は、それぞれ、親ペプチド
であるＢＰ２ペプチドに対して８０％及び７０％の相同性を有しているが、ＴＮ
Ｆ−αの合成の有意な減少を示さず、これらの条件下では、エンドトキシンの無
毒化に有効でなかった。このことは、エンドトキシン結合性以外の他の合成ペプ
チドの特性が、全血のような複雑系におけるＬＰＳの不活性化においては本質的
であることを示している。

【００３５】 サイトカイン合成として測定されるエンドトキシンの不活性化において、エン
ド添加前の生体外の全血に対する合成ペプチドの添加が有効かどうかを確認する
ために、この発明の合成ペプチドＢＰ２、とのその類似体のＢＰ２．１及びＢＰ
２．２を、２．５〜２０μｇ／ｍｌの濃度で、全血に添加して、３７℃で１０分
間インキュベートし、その後、１ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４ＬＰ
Ｓを添加した。ＴＮＦ−α濃度を前記したように測定した。結果は、この発明の
ペプチドＢＰ２によってのみ、ＴＮＦ−α合成の濃度依存性の阻害を示し、２０
μｇ／ｍｌのペプチド濃度でサイトカイン合成を５７％阻害した（図１２）。構
造的に類似するＬＰＳ結合性合成ペプチドの類似体のＢＰ２．１及びＢＰ２．２
は、これらの条件下では、エンドトキシン不活性化に効果を有していなかった。

【００３６】 （インビボ無毒化） この発明のペプチドのＬＰＳの毒性あるいは生の病原菌に対する実験動物の保
護効果を、致死的なエンドトキセミアと腹膜炎のマウスモデルで検討した。高用
量のエンドトキシンに通常は耐性があり、致死量（ＬＤ₁₀₀）として約１ｍｇ／ ｍｌを要する実験用マウスを、アクチノマイシンＤで致死量の１００００分の１
以下のエンドトキシン致死量に感受性化した。このモデルにおいては、感受性化
した動物あたり、Ｅ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４ＬＰＳから精製したＬＰＳ１００
ｎｇの投与で、２４〜７２時間以内で１００％の死亡率が得られることがわかっ
た。予備的実験では、合成ペプチドＢＰ２は、パイロジェンフリーの生理食塩液
中、２．５及び５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、非近交系スイス種のマウスに腹腔内
注射で投与した際には、２週間の観察期間中、何ら有害な影響もなく良く許容さ
れた。一つの実験系では、７〜８週令で２８〜３０ｇの４〜６匹のスイスマウス
の群を、ｐ．ｆ．（パイロジェンフリー）生理食塩液に溶解した合成ペプチドＢ
Ｐ２を５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で腹腔内注射して処理した。２０分後、そのマ
ウスを、アクチノマイシンＤを８００μｇ／ｋｇ体重及びＥ．ｃｏｌｉ ０１１ １：Ｂ４ ＬＰＳを５μｇ／ｋｇ体重の投与量で腹腔内注射処理した。ネガティ ブコントロール群には、アクチノマイシンＤとエンドトキシンのみを投与した。
処理した動物の生存は、７日間の観察期間中、２４時間間隔で記録し、コントロ
ール群と比較した。３つの独立した実験を総合した結果は、コントロール群では
７２時間で生存率は０％であり、本発明のペプチドで処理後７日後で７５％の生
存率であった（図１３）。

【００３７】 実験動物における腹膜炎の治療についての本発明のペプチドの有効性を、臨床
上意義のあるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１８：Ｋ１：Ｈ７ Ｂｏｒｔ を用いて検討した。第２の実験系では、７〜８週令で非近交系の６〜７匹のスイ
ス−ウエブスターマウスを、パイロジェンフリーの生理食塩液０．５ｍｌ中予め
決定された致死量の生菌（１０⁴ＣＦＵ）を腹腔内注射した。１時間後、処理し た群を、０．５ｍｌのパイロジェンフリーの生理食塩液中に１００μｇ／マウス
（４ｍｇ／ｋｇ）の用量で合成ペプチドを投与し、ネガティブコントロール群に
は、生理食塩液のみを投与した。動物の生存を、７日間の観察期間中１２時間あ
るいは２４時間毎に記録し、コントロール群と比較した。二つの独立した実験を
総合した結果は、コントロール群では３日後に７％の生存率であったのに対し、
本発明の合成ペプチドで処理した群は、処理後７日で７８％の生存率を示した（
図１４）。本発明のペプチドは、致死的なエンドトキセミアあるいは腹膜炎に対
して高度に有意な個体数の実験動物を安全かつ効果的に保護することができた。

【００３８】 この発明は、新規なペプチドのみでなく、有効成分としてそのようなペプチド
やその組み合わせを含む薬剤組成物を提供する。薬剤組成物は、前記ペプチドを
哺乳類に適用可能な形態で含有する必要がある。このことは、無菌で毒性成分あ
るいは不純物を含有しないということを意味する。組成物は、溶液、あるいは薬
剤の用途に適したその他の薬剤形態とされる。投与形態と、薬剤組成物の組成、
すなわち、その性質から認識される薬剤上の適用に一般的な添加剤は、有効成分
としてペプチドを含む類似の適用についての分野の当業者には明らかである。ま
た、製薬学上適合する担体が必要である。この発明の薬剤組成物は、一又はそれ
以上の局所あるいは全身性の細菌、あるいは寄生虫感染、局所あるいは全身性の
腫瘍、炎症、あるいは敗血症性ショックの治療に用いることができる。

【００３９】 この組成物は、有機体あるいは有機体の化合物によって引き起こされる感染症
の治療に適しており、この有機体は、細菌、真菌、ウイルス及び寄生虫を含む群
から選択される。特に、実施例から明らかなように、薬剤組成物は、細菌によっ
て引き起こされる感染症の治療用とされる。多剤耐性（ＭＤＲ）菌によって引き
起こされる感染症のような多くの種類の細菌による感染症を治療できる。グラム
陽性菌によって引き起こされるような他の細菌のタイプによる感染症も治療でき
る。グラム陰性菌によって引き起こされる感染症もまた、本発明の薬剤組成物に
よって治療できる。この発明は、また、寄生虫性マラリアやトリパノゾーマ症の
ような寄生虫によって引き起こされる感染症の治療用の薬剤組成物も包含してい
る。本発明の薬剤組成物は、少なくとも２以上の本発明のペプチド、好ましくは
同じ分子量のペプチドを、等モル量含有することができる。本発明の薬剤組成物
は、本発明のペプチドを少なくとも一つと、ペニシリン類、セファロスポリン類
、β−ラクタム類、アミノグリコシド類、キノロン類、テトラサイクリン類、マ
クロライド類、グリコペプチド類又はリポペプチド類、疎水性抗生物質、リボソ
ームインヒビター、大きな脂質状ラクトン環を有する抗生物質、又はこれらの誘
導体あるいは類似体からなる群から選択される抗生物質、とを含むことができる
。ペプチドと抗生物質は、多剤耐性菌によって引き起こされる感染症を治療する
のに有効量で投与される。ペプチドと抗生物質は、協働的に作用する。

【００４０】 薬剤組成物が使用される治療は、治療的あるいは予防的とすることができる。
これは、その組成物が投与される患者の病状のステージによって決まるであろう
。 治療方法は、また、この発明の範囲に包含されている。そのような方法は、ヒ
トを含む哺乳類の治療を含み、薬剤組成物それ自体のあるいは他の薬剤を組み合
わせた場合に定められる目的のために、前記哺乳類に対してペプチド含有薬剤組
成物を適用するための公知の方法での本発明の薬剤組成物の使用を包含する。本
治療は、外傷後、あるいは予期される感染があるかあるいは発生後に適用される
。この治療は、手術後に好ましく適用される。

【００４１】 この発明には、検査方法も包含する。検査方法は、例えば、哺乳類の身体材料
の試料におけるエンドトキシントキシンの存在を、この発明のペプチドを用いて
リピドＡに対する結合程度を検出可能な公知の分析法で検出する工程を含む。こ
のような分析法は、実施例に説明するものであり、固相のリピドＡ結合試験とす
ることもできる。他の適切な実施形態は、哺乳類の身体材料の試料を、本発明の
ペプチドと接触させる工程と、前記材料とペプチドとの間で複合体の形成の有無
を評価する工程、とを含み、さらに、任意に、その複合体形成量を公知の方法で
測定する工程、を含んでいる。この方法は、実施例に説明されており、固相のエ
ンドトキシン阻害リピドＡ結合試験とされる。この発明による方法は、好ましく
は、感度が、前記試料に対してリムルス試験で得られる感度よりも高い。感度は
、好ましくは、プラズマ中＜１０ｐｇ／ｍｌである。現在のところ、プラズマ中
＜０．１ｐｇ／ｍｌの感度を得ることができる。

【００４２】 この発明の他の用途は、試料からのエンドトキシンの除去方法にある。この方
法は、前記試料と本発明のペプチドとを接触させる工程と、結果として得られる
エンドトキシンとペプチドとの複合体を、固定化ペプチドによる方法等の公知の
方法で除去する工程、とを含む。好ましい実施形態としては、エンドトキシンは
実質的なレベルまでに除去される。実質的とは、９５％以上を意味し、好ましく
は、９８％以上を意味する。

【００４３】 試料からのＬＰＳを除去する方法は、前記試料を本発明のペプチドと接触させ
る工程と、結果として得られるＬＰＳとペプチドとの複合体を、固定化したペプ
チドを用いる方法等の公知方法で除去する工程、とを含んでいる。 治療方法及び以上の説明において開示されたこの発明による他の方法は、移植
あるいはインプラントのための提供体材料由来の試料、あるいは、当該提供体材
料からなる試料において実施されることもできる。血液あるいはプラズマ試料を
、このような方法で処理することに大きな利点があることは明らかである。

【００４４】 （参考文献） Ammons et al.,1994. Protective effects of an N-terminal fragment of bact
ericidal/permeability increasing protein in rodent models: role of bacte
ricidal properties. J. Infect. Dis. 170, 1473-1482 Andreu et al.,1992. Shortened cecropin A-melittin hybrids. FEBS Lett. 2
96,190-194 Appelmelk et al. 1995. Diversity in lipid A binding ligands: comparison
of lipid A and monoclonal antibodies with rBPI23. Prog. Clin. Biol. Res
. 392, 453-463 Arditi et al., 1994. Bactericidal/permeability-increasing protein prote
cts vascular endothelial cells from lipopolysaccharide-induced activatio
n and injury. Infect. Immun. 62, 3930-3936 Battafarano et al.,1995. Peptide derivatives of three distinct lipopoly
saccharide binding proteins inhibit tumor necrosis factor-alpha secretio
n in vitro. Surgery 118, 318-324 Bessalle et al., 1993. Structure-function studies of amphiphilic antiba
cterial peptides. J. Med. Chem.36, 1203-1209 Bhakdi et al., 1991. Stimulation of monokine production by lipoteichoic
acids. Infect. Immun. 59,4614-4620 Blackburn et al. 1991. Electrochemiluminescence detection for developmen
t of immunoassays and DNA probe assays for clinical diagnostics. Clin. Chem.
37, 1534- 1539 Blondelle et al., 1992. Design of model amphipathic peptides having pot
ent antimicrobial activities. Biochemistry. 31, 12688-12694 Boman et al., 1989. Antibacterial and antimalarial properties of peptid
es that are cecropin-melittin hybrids. FEBS Lett. 259, 103-106 Boman, 1995. Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Ann
u. Rev. Immunol. 13,61-92 Brade et al.,1990. A 28 kDa protein of normal mouse serum binds lipopol
ysaccharide of gram-negative and lipoteichoic acids of gram-positive bac
teria. Microb. Pathog. 9, 355-362 Capodici et al.,1994. Effect of lipopolysaccharide (LPS) chain-length o
n interactions of bactericidal/permeability-increasing protein and its b
ioactive 23-kilodalton NH2-terminal fragment with isolated LPS and intac
t Proteus mirabilis and Escherichia coli. Infect. Immun.62,259-265 Cardin et al. 1989. Molecular modeling of protein-glycosaminoglycan int
eractions. Arteriosclerosis 9,21-31 Cuervo et al., 1988. The magainins: Sequence factors relevant to increa
sed anti- microbial activity and decreased hemolytic activity. Pep. Res. l, 81-86 Dokter et al., 1994. G(Anh) tetra, a natural bacterial cell wall breakd
own product, induces interleukin-1α#and interleukin-6 expression. J.B.C
269,4201-4206 Evans et al., 1995. Protective effects of a recombinant amino-terminal
fragment of human bactericidal/permeability-increasing protein in an ani
mal model of gram- negative sepsis. J. Infect. Dis. 171, 153-160 Fink et al., 1989. Design, synthesis and antibacterial activity of cecr
opin-like model peptides. Int. J. Peptide Protein Res.33,412-421 Freudenberg et al., 1991. Tumor necrosis factor alpha mediates lethal a
ctivity of killed gram-negative and gram-positive bacteria in D-galactos
amine-treated mice. Infect. Immun. 59, 2110-2115 Gray et al.,1994. Bactericidal activity of synthetic peptides based on
the structure of the 55-kilodalton bactericidal protein from human neutr
ophils. Infect. Immun. 62,2732-2739 Heuman et al., 1994. Gram-positive cell walls stimulate synthesis of tu
mor necrosis factor alpha and interleukin-6 by human monocytes. Infect.
Immun.62,2715-2721 Hoess et al. 1993. Crystal structure of an endotoxin-neutralizing prote
in from the horseshoe crab Limulus anti-LPS factor at 1.5Å resolution.
EMBO J. 12, 3351-3356 Iwata et al., 1994. Design and synthesis of amphipathic 310-helical pep
tides and their interactions with phospholipid bilayers and ion-channel
formation. J. Biol. Chem. 269,4928-4933 Kloczewiak et al., 1994. Synthetic peptides that mimic the binding site
of Horseshoe crab anti-lipopolysaccharide factor. J. Infect. Dis. 170,1
490-1497 Kohn et al., 1993. Protective effect of a recombinant amino-terminal fr
agment of bactericidal/permeability-increasing protein in experimental e
ndotoxemia J. Infect. Dis. 168, 1307-1310 Larrick et al., 1993. Antimicrobial activity of rabbit CAP18-derived pe
ptides. Antimicrob. Agents Chemother.37, 2534-2539 Lee et al., 1989. Antibacterial peptides from pig intestine: Isolation
of a mammalian cecropin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86,9159-9162 Leeson et al., 1994. Evidence for lipopolysaccharide as the predominant
proinflammatory mediator in supernatants of antibiotic-treated bacteria.
Infect. Immun. 62, 4975-4980 Little et al., 1994. Functional domains of recombinant bactericidal/per
meability-increasing protein (rBPI23). J. Biol. Chem.21, 1865-1872 Novitsky et al., 1994. Limulus amoebocyte lysate (LAL) detection of end
otoxin in human blood. J. Endotox. Res. l, 253-263 Pieroni et al., 1970. A simple method for quantitation of submicrogram
amounts of bacterial endotoxin. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 133,790-794 Piers et al., 1994. Improvement of outer membrane permeability and lipo
polysaccharide-binding activities of an antimicrobial cationic peptide b
y C-terminal modification. Antimicrob. Agents Chemother. 38,2311-2316 Rustici et al., 1993. Molecular mapping and detoxification of the lipid
A binding site by synthetic peptides. Science 259,361-365 Saberwal et al.,1994. Cell-lytic and antibacterial peptides that act by
perturbing the barrier function of membranes: facets of their conformat
ional features, structure-function correlations and membrane-perturbing
abilities. Biochim. Biophys. Acta. 1197,109-131 Storici et al., 1994. Chemical synthesis and biological activity of a n
ovel antibacterial peptide deduced from pig myeloid cDNA. FEBS Lett. 337
,303-307 Tossi et al., 1994.Identification and characterization of a primary ant
ibacterial domain in CAP18, a lipopolysaccharide binding protein from ra
bbit leukocytes. FEBS Lett. 339, 108-ll2 Wade et al., 1990. All D-containing amino acid containing channel-formi
ng antibiotic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87,4761-4765 Weiss et al., 1992. Human bactericidal/permeability-increasing protein
and a recombinant NH2-terminal fragment cause killing of serum-resistant gram-
negative bacteria in whole blood and inhibit tumor necrosis factor release induce
d by the bacteria. J Clin. Invest. 90, 1122-l130 これらの引用した文献の内容は、ここに、その全体が、本明細書に含まれると
みなされる。

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４の生存率に対する合成ペプチドの効果（パネル
Ａ）とＳ．ａｕｒｅｕｓの生存率に対する合成ペプチドの効果（パネルＢ）を示
す。ルリアベルタニ（ＬＢ）培地中細胞濃度が１０⁷細胞／ｍｌの対数増殖期の 細胞を３、５、７μｇ／ｍｌ（１、２、及び３μＭ）の濃度の合成ペプチドと３
７℃で１時間インキュベートし、残存する細胞濃度を、ペプチドを添加していな
い細胞培養から得られた濃度に対するパーセンテージ（％）で表した。

【図２】 合成ペプチドのエンドトキシンの複合体形成活性を示す。１００〜６００μｇ
／ｍｌの濃度のペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ３１ｍ４ＲｅあるいはＪ５のＬＰ Ｓ（１００μｇ／ｍｌ）とともに、プラスチック製のＥＬＩＳＡミクロタイター
プレート内で、全量で１００μｌのパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩液
（ＰＢＳ）中で、２３℃で３０分間インキュベートした。不溶性のペプチド−エ
ンドトキシン複合体による濁度を、３４０ｎｍで測定した。数値は、３回の測定
の平均値であり、同濃度のエンドトキシンあるいはペプチドを含むコントロール
によって補正されている。

【図３】 合成ペプチドのリピドＡ結合親和性を示す。プラスチック製のミクロタイター
プレートを精製した１μｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉＤ３１ｍ４リピドＡで被覆した
。合成ペプチドＢＰ１、ＢＰ２、ＢＰ２．１あるいはコントロールペプチドＢＰ
Ｉ_(85-102)を示したインキュベート濃度で２０分間インキュベートし、２０００
０倍希釈でストレプトアヴィジン−ＨＲＰを添加した。過剰のペプチドとストレ
プトアヴィジンを除去する洗浄工程を、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０
を含有する５０ｍＭトリスバッファ（ｐＨ７．４）を用いて行った。次いでＴＭ
Ｂ基質で１０分間発色させた。４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）をミクロプレ
ートリーダーで測定し、５〜１０％の一般的な非特異性結合を補正した。プロッ
トした値は、３回の測定の補正された平均値である。

【図４】 固定化したＬＰＳへの本発明のＢＰ２合成ペプチドの結合活性における、エン
ドトキシンの複雑さとプラズマ濃度の影響を示す。Ｅ．ｃｏｌｉＤ３１ｍ４リピ
ドＡ、Ｒｅ、Ｊ５、又は０１１１：Ｂ４ＬＰＳを含んで被覆したＥＬＩＳＡミク
ロタイタープレートを１０％（ｖ／ｖ）にまで希釈したプラズマ中４０ｎｇ／ｍ
ｌの濃度の合成ペプチドとインキュベートした。結合活性は、前述のように、Ｅ
ＬＩＳＡミクロプレートリピドＡ結合試験によって測定した。

【図５】 固定化した合成ペプチドによる標識したエンドトキシンの捕捉を示す。２０μ
ｇのストレプトアヴィジンを被覆した超磁性のポリスチレンビーズ（Ｄｙｎａｂ
ｅａｄｓ Ｍ−２８０，Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上に固
定化した２ｎｇのビオチニル化した合成ペプチドＢＰ２を、表示した濃度の化学
ルミネセンスＴＡＧで標識したＥ．ｃｏｌｉＪ５ＬＰＳで２０分間、２３℃でイ
ンキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含むリン酸緩衝
液で洗浄後、捕捉したエンドトキシンの量を、Ｏｒｉｇｅｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｉｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ）を用いてエレクトロルミネ センス検出（ＥＣＬ）によって測定した。パネルＡは、ＬＰＳが８倍モルより多
い濃度で、合成ペプチドのリピドＡ結合活性が飽和したことを示す。パネルＢは
、ＬＰＳが２倍モル濃度まで範囲で直線性のある結合性の応答を示す。数値は、
非特異性結合を補正した３回の測定の平均値である。

【図６】 エンドトキシンによる固定化したリピドＡに対する合成ペプチドＢＰ２の結合
の競争的阻害を示す。表示された濃度範囲のビオチニル化したＢＰ２ペプチドを
、１ｐｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４ＬＰＳと、２３℃で２０分間プレ
インキュベートし、残存したエンドトキシン結合活性をリピドＡ結合ＥＬＩＳＡ
ミクロプレート試験で測定した。個々の数値は、非特異性結合を補正した３回の
測定の平均値である。

【図７】 溶液中のリピドＡ結合試験によるエンドトキシンの検出及びエンドトキシン阻
害ＥＬＩＳＡ（ＥＩＥ）ミクロプレート試験によるエンドトキシン検出を示す。
パネルＡ及びＢは、それぞれ、０．１〜１０００ｐｇ／ｍｌ、及び０．１〜１０
０ｐｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ＬＰＳとのプレインキュベーショ ン後の８ｎｇ／ｍｌの合成ペプチドＢＰ２の残存ＬＰＳ結合活性の投与量応答を
示す。

【図８】 １０倍希釈の全血中のサイトカイン合成における、合成ペプチドＢＰ１、ＢＰ
２、及びコントロールペプチドＢＰＩ_(85-102)とＥ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４Ｌ
ＰＳのプレインキュベーションの効果を示す。表示された量のＥ．ｃｏｌｉ ０ １１１：Ｂ４ＬＰＳ（０．１〜１ｎｇ／ｍｌ）を合成ペプチドＢＰ１、ＢＰ２及
びコントロールペプチドＢＰＩ_(85-102)１０μｇ／ｍｌと３７℃で３０分間プレ
インキュベートし、次いで３７℃で１６時間インキュベート後に、ヘパリン１０
０Ｉ．Ｕ．／ｍｌを含む希釈した全血中でＬＰＳのサイトカイン誘導活性を測定
した。各数値は、３回の測定の平均値である。コントロールは、ＬＰＳのみを含
んでいた。

【図９】 １０倍希釈の全血中でのＩＬ−６合成における、Ｅ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４
ＬＰＳと合成ペプチドの同時添加の効果を示す。表示された濃度の合成ペプチド
ＢＰ１，ＢＰ２、及びコントロールペプチドＢＰ１_(85-102)を、１ｎｇ／ｍｌの
Ｅ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４ＬＰＳとともに、ヘパリン１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌを
含む希釈した全血中に添加した。ＩＬ−６濃度を、３７℃、１６時間のインキュ
ベート後に測定した。各数値は、３回の測定の平均値である。コントロールには
、ペプチドは添加されていない。

【図１０】 １０倍希釈した全血中の合成ペプチドあるいはポリミキシンＢによる、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ＬＰＳのＩＬ−６誘導活性の不活性化効果におけるヘパ リンの効果を示す。２μｇ／ｍｌの合成ペプチドあるいは１μｇ／ｍｌのポリミ
キシンＢを、１ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ０１１１：Ｂ４ＬＰＳとともに、０．
１〜１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌの濃度範囲のヘパリン含有ＲＰＭＩ培地中で３７℃で
３０分間インキュベートした。処理したエンドトキシンの残留サイトカイン誘導
活性を、３７℃で１６時間のインキュベート後に、２Ｉ．Ｕ．／ｍｌのヘパリン
を含む希釈した全血中で測定した。各数値は、バックグラウンド値を補正した３
回の測定値の平均値である。コントロールは、ＬＰＳのみを含んでいた。

【図１１】 生体外での全血中でのＴＮＦ−α濃度に対する、Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ ４ＬＰＳと合成ペプチドあるいはポリミキシンＢとのプレインキュベーションの
効果を示す。表示された量の合成ペプチド、コントロールペプチド、又はＰｍＢ
を１ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ＬＰＳとともに２３℃で、１０ 分間プレインキュベートし、ヘパリン２Ｉ．Ｕ．／ｍｌを含む全血に添加し、３
７℃で４時間インキュベート後にＴＮＦ−α濃度を測定した。各数値は、３回の
測定値の平均値である。コントロールはＬＰＳのみ含んでいた。

【図１２】 生体外の全血中においてＥ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ＬＰＳによって誘導さ れるＴＮＦ−α濃度に対する、合成ペプチドの予備投与の効果を示す。ヘパリン
２Ｉ．Ｕ．／ｍｌを含む全血に合成ペプチドＢＰ２、ＢＰ２．１、及びＢＰ２．
２を表示された濃度で添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。１ｎｇ／
ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ＬＰＳの添加に次いで３７℃で４時間イン キュベート後に、ＴＮＦ−α濃度を測定した。各数値は、３回の測定値の平均値
である。コントロールはＬＰＳのみ含んでいた。

【図１３】 致死的なエンドトキシン症（ｌｅｔｈａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｍｉａ）のマ ウスモデルの生存率における合成ペプチドＢＰ２の効果を示す。７〜８週令、体
重２８〜３０ｇの非近交系のメスのスイス−ウエブスターマウスに、パイロジェ
ンフリーの生理食塩液中、５ｍｇ／ｋｇの投与量で、腹腔内投与によって、ＢＰ
２ペプチドで処理した。２０分後、５あるいは１１μｇ／ｋｇの致死濃度のＥ．
ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ＬＰＳに加えて、感受性化薬剤であるアクチノマイシ ンＤを８００μｇ／ｋｇの投与量で腹腔内投与した。コントロール群は、アクチ
ノマイシンＤとＬＰＳを投与されただけであった。７日間の観察期間中、２４時
間毎に生存数を記録した。示した値は、３回の独立した実験の平均値である。

【図１４】 致死的な腹膜炎のマウスモデルの生存率における合成ペプチドＢＰ２の効果を
示す。７〜８週令、体重２８〜３０ｇの非近交系のメスのスイス−ウエブスター
マウスに、致死濃度のＥ．ｃｏｌｉ ０１１８：Ｋ１：Ｈ７ Ｂｏｒｔの病原性株
１０⁴ＣＦＵを、０．５ｍｌのパイロジェンフリーの生理食塩液０．５ｍｌで腹 腔内投与した。感染から１時間遅れて、処理群に、パイロジェンフリーの生理食
塩液で、１００μｇ／マウス（おおよそ４ｍｇ／ｋｇ）の投与量で、合成ペプチ
ドＢＰ２を投与し、陰性コントロール群は、食塩液のみ投与した。７日間の観察
期間中、１２時間毎あるいは２４時間毎に生存数を記録した。示した値は、２回
の独立した実験の平均値である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アブラハム・フィリップ・リチャード オランダ国 ＮＬ−1115、ジーエス・ディ ヴェンドレヒト、イン・デ・パピエモレン 30 (72)発明者 サンダー・ジャン・ヘンドリック オランダ国 ＮＬ−2012、シーエイチ・ハ ーレム、クライン・ハウツヴェグ ６ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA18 DA42 MA02 ZA362 ZB112 ZB332 ZB352 ZB372 ZB382 4H045 AA10 AA30 BA17 EA28 EA29 FA33

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】両親媒性及びカチオン性で、安定したα−ヘリックスを形成し
   、少なくとも１２個のアミノ酸を含む以下のアミノ酸配列： Ｒ₁−Ｒ₂―Ａ₁−Ｂ₁−（Ａ₂−Ｂ₂−Ｃ₁−Ａ₃）_m−（Ｃ₂）_n−Ｒ₃、 ただし、Ａは、塩基性アミノ酸であるリジン、アルギニン、及びヒスチジンか
   ら選択される１種のアミノ酸であり、Ｂは、芳香族アミノ酸であるフェニルアラ
   ニン、トリプトファン、及びチロシンのうちから選択される１種のアミノ酸であ
   り、Ｃは、疎水性アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン及びアラニン
   から選択される１種のアミノ酸である； 当該ペプチドは、前記構造式と同方向あるいは前記構造式とは逆方向の配列の
   いずれかを有するものであって、少なくとも０〜ｎの繰り返し配列モチーフ（Ａ ₂ −Ｂ₂−Ｃ₁−Ａ₃）が逆方向の配列を有し、残りの繰り返し配列モチーフ（Ａ₂ −Ｂ₂−Ｃ₁−Ａ₃）が前記構造式中に示された方向の配列を有している； Ｒ₁−Ｒ₂−及びＲ₃は、アミノ酸の数を示し、この数は、Ｒ₁とＲ₂の組合せ及 びＲ₃については、それぞれ、０〜１５である、及び ｍは１〜１０であり、好ましくは２〜８であり、より好ましくは２〜５であり
   、及びｎは、１〜３である、ペプチド。
2. 【請求項２】Ｒ₁が、 配列Ａ₄Ｃ₃Ａ₅Ａ₆（Ａ及びＣは請求項１と同様に定義される）、 Ｇｌｙ_p（ｐ＝０〜１０）、及び Ａｌａ_q（ｑ＝０〜１０） からなる配列群から選択される、請求項１記載のペプチド。
3. 【請求項３】前記Ｒ₁は、配列Ａ₄Ｃ₃Ａ₅Ａ₆である、請求項２記載のペプチ ド。
4. 【請求項４】前記Ｒ₁は、Ｇｌｙ_p（ｐ＝０〜１０）である、請求項２記載の
   ペプチド。
5. 【請求項５】前記Ｒ₁−Ｒ₂−あるいはＲ₃が、１〜１０のアミノ酸である、 請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
6. 【請求項６】前記Ｒ₁−Ｒ₂−及び／又はＲ₃が、１〜５のアミノ酸、好まし くは１〜３のアミノ酸である、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
7. 【請求項７】前記Ｒ₁−Ｒ₂−及び／又はＲ₃が、１のアミノ酸である、請求 項１〜６のいずれかに記載のペプチド。
8. 【請求項８】前記Ｒ₁−Ｒ₂−及び／又はＲ₃が、請求項１で定義されるＡ、 Ｂ及びＣのアミノ酸群のアミノ酸を含んでいない、請求項１〜７のいずれかに記
   載のペプチド。
9. 【請求項９】前記Ｒ₁−Ｒ₂−及び／又はＲ₃が、請求項１で定義されるＡ、 Ｂ及びＣのアミノ酸群と異なるアミノ酸を含んでいる、請求項１〜７のいずれか
   に記載のペプチド。
10. 【請求項１０】前記くり返し配列（Ａ₂−Ｂ₂−Ｃ₁−Ａ₃）は、前記構造式に
    おける方向と同方向よりも逆方向でより多く存在している、請求項１〜９のいず
    れかに記載のペプチド。
11. 【請求項１１】前記ｎが３である、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプ
    チド。
12. 【請求項１２】配列番号１で特定されるＢＰ１。
13. 【請求項１３】配列番号２で特定されるＢＰ２。
14. 【請求項１４】配列番号３で特定されるＢＰ２．３。
15. 【請求項１５】配列番号４で特定されるＢＰ２．４。
16. 【請求項１６】配列番号５で特定されるＢＰ２．５。
17. 【請求項１７】局所あるいは全身性の細菌性及び／又は寄生虫性感染症の治
    療用の有効成分として、請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチドと、薬剤上
    適用可能な担体とを、薬剤上適用可能な形態で含む薬剤組成物。
18. 【請求項１８】前記感染症は、有機体又は有機体由来の化合物によって引き
    起こされるものであり、前記有機体は、細菌、真菌、ウイルス及び寄生虫から選
    択される、請求項１７記載の薬剤組成物。
19. 【請求項１９】前記感染症は、細菌によって引き起こされる、請求項１７又
    は１８記載の薬剤組成物。
20. 【請求項２０】前記感染症は、多剤耐性細菌によって引き起こされる、請求
    項１７〜１９のいずれかに記載の薬剤組成物。
21. 【請求項２１】前記感染症は、グラム陽性細菌によって引き起こされる、請
    求項１７〜２０のいずれかに記載の薬剤組成物。
22. 【請求項２２】前記感染症は、グラム陰性細菌によって引き起こされる、請
    求項１７〜２１のいずれかに記載の薬剤組成物。
23. 【請求項２３】少なくとも２以上の請求項１〜１６のいずれかに記載のペプ
    チドを等モル量含有する、請求項１７〜２２記載の薬剤組成物。
24. 【請求項２４】少なくとも１の本発明のペプチドと、ペニシリン類、セファ
    ロスポリン類、β−ラクタム類、アミノグリコシド類、キノロン類、テトラサイ
    クリン類、マクロライド類、グリコペプチド類又はリポペプチド類、疎水性抗生
    物質、リボソームインヒビター、及び大きな脂質状ラクトン環を有する構成物質
    類、又はこれらの誘導体又は類似体から選択される抗生物質、とを含む、請求項
    １７〜１９のいずれかに記載の薬剤組成物。
25. 【請求項２５】少なくとも２以上の本発明のペプチドを等モル量含有し、こ
    のペプチドは、等しい分子量である、請求項１７〜２４記載の薬剤組成物。
26. 【請求項２６】前記感染症は、マラリア感染による感染症あるいはトリパノ
    ゾーマ症のような、寄生虫によって引き起こされる、請求項１７記載の薬剤組成
    物。
27. 【請求項２７】局所あるいは全身性の腫瘍の治療用の有効成分として、請求
    項１〜１６のいずれかに記載のペプチドと、薬剤上適用可能な担体とを、薬剤上
    適用可能な形態で含む薬剤組成物。
28. 【請求項２８】炎症治療用の有効成分として、請求項１〜１６のいずれかに
    記載のペプチドと、薬剤上適用可能な担体とを、薬剤上適用可能な形態で含む薬
    剤組成物。
29. 【請求項２９】敗血症性ショックの治療用の有効成分として、請求項１〜１
    ６のいずれかに記載のペプチドを含む薬剤組成物。
30. 【請求項３０】請求項１７〜２６の少なくとも２つの薬剤組成物。
31. 【請求項３１】前記治療は、予防的である、請求項１７〜２７のいずれかに
    記載の薬剤組成物。
32. 【請求項３２】ヒトを含む哺乳類の治療であって、請求項１７〜２８のいず
    れかに記載の薬剤組成物を、ペプチド含有薬剤組成物の投与における公知の方法
    によって、前記哺乳類に、前記請求項のいずれかあるいはこれらを組み合わせた
    目的のために、投与する工程を含む、治療。
33. 【請求項３３】前記治療は、外傷後、あるいは感染が予期されるか、あるい
    は感染が起こりうる際に適用される、請求項２９記載の治療。
34. 【請求項３４】前記治療は、手術後に適用される、請求項２９又は３０に記
    載の治療。
35. 【請求項３５】哺乳類の身体材料試料におけるエンドトキシントキシンの存
    在を、請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチドとを用いて、固相のリピドＡ
    結合試験等のリピドＡに対する結合程度を検出可能な公知の分析法で検出する工
    程を含む、検査方法。
36. 【請求項３６】哺乳類の身体材料試料と、請求項１〜１６のいずれかに記載
    のペプチドとを接触させる工程と、前記材料とペプチドとの間で複合体の形成の
    有無を評価する工程、とを含み、さらに、任意に、その複合体形成量を、固相の
    リピドＡ結合試験等の公知の方法で測定する工程、を含む、検査方法。
37. 【請求項３７】感度が、前記試料においてリムルス試験で得られる感度より
    も高い、請求項３２あるいは３３記載の方法。
38. 【請求項３８】感度は、プラズマ中で１０ｐｇ／ｍｌである、請求項３２〜
    ３４記載の方法。
39. 【請求項３９】試料と請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチドとを接触
    させる工程と、結果として得られるエンドトキシンとペプチドとの複合体を、固
    定化ペプチドによる方法等の公知の方法で除去する工程、とを含む、試料からの
    エンドトキシンの除去方法。
40. 【請求項４０】前記エンドトキシンは実質的なレベルにまで除去され、実質
    的とは、９５％以上を意味し、好ましくは、９８％以上を意味する、請求項３２
    〜３６記載の方法。
41. 【請求項４１】試料を請求項１〜１６のいずれかに記載のペプチドと接触さ
    せる工程と、結果として得られるＬＰＳとペプチドとの複合体を、固定化したペ
    プチドを用いる方法等の公知方法で除去する工程、とを含む、試料からのＬＰＳ
    の除去方法。
42. 【請求項４２】前記試料は、移植あるいはインプラントのための提供体材料
    由来の、あるいは、当該材料からなる、請求項３２〜３８のいずれかに記載の方
    法。
43. 【請求項４３】前記試料は、血液試料である、請求項３２〜３９記載の方法
    。